ES2646630T3 - Lipidoides aminoalcohólicos y usos de los mismos - Google Patents

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Kevin Thomas Love
Christopher G. Levins
Kathryn Ann Whitehead
Robert S. Langer
Daniel Griffith Anderson
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Massachusetts Institute of Technology
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Abstract

A compuesto of formula:**Fórmula** en el que: p y m are cada uno 1; RA es hidrógeno; un grupo alifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido; un grupo heteroalifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido; arilo sustituido o no sustituido arilo; heteroarilo sustituido o no sustituido;**Fórmula** RF es cada presencia de R5 es independientemente hidrógeno; un grupo alifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido; un grupo heteroalifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido; arilo sustituido o no sustituido; o heteroarilo sustituido o no sustituido;**Fórmula** en donde al menos uno de RY y RZ es cada presencia de x es un número entero entre 1 y 10, inclusive; preferiblemente en donde x es 1, 2 o 3; y es un número entero entre 1 y 10, inclusive; preferiblemente en donde y es 1, 2 o 3 preferiblemente en donde x es 1, e y es 2; o preferiblemente en donde x es 1 e y es 3; cada presencia de RY es hidrógeno; un grupo alifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido; un grupo heteroalifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido;**Fórmula** arilo sustituido o no sustituido; heteroarilo sustituido o no sustituido; cada presencia de RZ es hidrógeno; un grupo alifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido; un grupo heteroalifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido;**Fórmula** arilo sustituido o no sustituido; heteroarilo sustituido o no sustituido; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.**Fórmula**

Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Lipidoides aminoalcohólicos y usos de los mismos
Apoyo gubernamental
Esta invención se realizó con el apoyo del Gobierno de los EE. UU. bajo los números de concesión 2-R375 EB000244-29, 5-U54-CA119349-03 y 5-R01-EB000244-27, adjudicados por the National Institutes of Health. El Gobierno de los EE. UU. tiene ciertos derechos en esta invención.
Antecedentes de la invención
A pesar de las esperanzas del laboratorio, el potencial de las terapias genéticas para el tratamiento de la enfermedad no se ha cumplido todavía. Intentos iniciales de traducir materiales genéticos en curaciones condujo a
10 cáncer y, en algunos casos, a la muerte de pacientes implicados en las pruebas clínicas. Estos resultados negativos no se atribuyeron al material genético, sino a los sistemas de aporte virales utilizados en estas pruebas. Como resultado, ha existido un interés intenso en el desarrollo de materiales sintéticos que tengan las eficacias de aporte de los vectores virales pero sorteen la mutagénesis que conduce a los efectos secundarios observados (p. ej., cáncer).
15 Los materiales sintéticos, o vectores de aporte avirales, tienen una variedad de formas que funcionan de modos únicos. Se ha mostrado que materiales poliméricos tales como la polietilenimina o el poli(beta-aminoéster) o los poli(beta-aminoésteres) complejan eficazmente el ADN para el aporte a la célula. Los polímeros dentro de estas clases de agentes de aporte contienen típicamente funcionalidades amina que sirven para unirse electrostáticamente a ADN para formar nanopartículas que son recogidas por la célula a través de endocitosis. Una
20 vez en la célula, estos grupos amina sirven para tamponar el endosoma y provocan un aflujo de iones debido al mecanismo de esponja protónica. El estallido resultante de la vesícula endocítica conduce a la liberación de la carga de la partícula, que entonces es libre de trasladarse al núcleo donde se expresa el ADN.
Aunque el mecanismo de las terapias basadas en ARN es diferente, el objetico del sistema de aporte sigue siendo el
25 mismo. El ARN se puede ser complejado e internalizado por la célula a fin de exhibir actividad. En muchos casos, los materiales poliméricos no funcionan tan eficazmente para el aporte de ARN. Esto se debe probablemente a la diferencia en la estructura química del ARN terapéutico que se aporta, que generalmente son fragmentos lineales cortos que contienen restos hidroxilo adicionales en cada anillo de ribosa. Estas diferencias necesitan un enfoque aviral alternativo que sea adecuado para la complejación con hebras de ARN cortas. Se han conseguido resultados
30 esperanzadores con materiales que forman liposomas o lipopléx que atrapan al ARN o forman nanopartículas, que son eficazmente internalizados por la célula.
Los materiales utilizados para formar un sistema de aporte basado en lípidos consisten generalmente en grupo de cabeza cargado positivamente y una cola hidrófoba. La porción cargada sirve para unir electrostáticamente el ARN
35 cargado negativamente, mientras que la cola hidrófoba conduce a un autoensamblaje en partículas lipófilas. Estos lípidos catiónicos son esperanzadores pero todavía están lejos de la eficacia de transfección conseguida por los vectores virales.
Se han hecho pocos avances en el ámbito, en parte debido a la diversidad estructural limitada de estas moléculas
40 pseudolipídicas, que es un resultado de los difíciles procedimientos sintéticos requeridos para acceder a estas estructuras. Por lo tanto, a fin de hacer avanzar el área de los sistemas de aporte de partículas lipídicas avirales, es necesario investigar transformaciones químicas que puedan conducir a diversas moléculas capaces de complejar ARN y transportar el material a través de la membrana celular. El enfoque más satisfactorio hasta la fecha ha sido la contribución de Anderson y colaboradores, que generaron una biblioteca de materiales pseudolipídicos usando
45 transformaciones químicas simples directas. Este grupo de materiales se basaba en la reacción bien conocida y eficaz conocida como la reacción de Michael de una amina en una acrilamida o un acrilato para dar una betaaminoamida o un beta-aminoéster, respectivamente. Estas estructuras consisten en un núcleo amínico ligado a cadenas alquílicas hidrófobas largas. Partiendo de un grupo de aminas y aceptores de Michael, el equipo generó más de 1000 compuestos que se probaron con respecto a su capacidad para complejar y aportar ARN en un ensayo
50 de alto rendimiento. Este cribado condujo a la identificación de un número de compuestos importantes que eran más eficaces in vitro que el patrón industrial actual, Lipofectamine 2000, y que actualmente se están probando in vivo con respecto al uso potencial en aplicaciones terapéuticas (Akinc y cols., Nat. Biotech. 2008, (26) 561).
Existe una necesidad irresoluta de un nuevo grupo de moléculas pseudolipídicas que presenten propiedades
55 similares a los materiales lipidoides que contienen amina existentes, pero a las que se accede a través de una reacción química totalmente diferente y que tienen la capacidad de aportar ARN así como otros ácidos nucleicos y otros agentes diagnósticos, terapéuticos y profilácticos a las células.
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Sumario de la invención
La presente invención se origina a partir del descubrimiento de que se pueden preparar compuestos lipidoides aminoalcóholicos para el aporte de fármacos al hacer reaccionar una amina con epóxido terminal o un aldehído.
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Los compuestos lipidoides de la invención son particularmente útiles en la administración de polinucleótidos. Los
10 compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la presente invención se pueden someter a síntesis combinatoria y cribado para generar bibliotecas de compuesto para el uso como agentes de aporte de fármacos avirales. Los compuestos de la invención se pueden usar con otros propósitos así como, por ejemplo, revestimiento, aditivos, excipientes.
15 En un aspecto, la presente invención proporciona nuevos compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la fórmula:
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Estos compuestos lipidoides aminoalcohólicos se pueden preparar al hacer reaccionar una amina con un compuesto terminado en epóxido. En ciertas realizaciones, el epóxido es estereoquímicamente puro (p. ej., enantiómeramente puro). En ciertas realizaciones, la amina es estereoquímicamente pura (p. ej., enantiómeramente pura). En ciertas
20 realizaciones, el lipidoide se prepara a partir de la aminación reductiva de una imina que se deriva de la condensación de una amina y un aldehído. En ciertas realizaciones, una amina y un compuesto terminado en epóxido se hacen reaccionar a temperaturas elevadas en ausencia de disolvente para preparar los lipidoides aminoalcohólicos mostrados en la Figure 1. En ciertas realizaciones, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos incluyen una porción hidrófila resultante de la apertura del epóxido por la amina y una cola alifática hidrófoba.
25 Típicamente, las aminas elegidas contienen entre dos y cinco restos amina y los compuestos terminados en epóxido incluyen una cola de longitudes de cadena variables y opcionalmente presentan diversos grupos funcionales y grados de saturación variables. Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención se pueden usar en el aporte de agentes terapéuticos (p. ej., un polinucleótido, una molécula pequeña, una proteína, un péptido) a un
30 sujeto. Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención son particularmente útiles para aportar agentes cargados negativamente dadas las aminas terciarias disponibles para la protonación, formando así un resto catiónico. Por ejemplo, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos se pueden usar para aportar ADN, ARN u otros polinucleótidos a un sujeto o una célula. Como será apreciado por un experto en la técnica, la reacción anterior puede dar como resultado una mezcla con compuestos lipidoides que tienen una cola, algunos que tienen dos colar,
35 algunos que tienen tres colar y también otros que tienen cuatro o más colas. Además, se pueden usar dos compuestos epoxídicos diferentes en la mezcla de reacción para preparar un compuesto lipidoide aminoalcohólico con dos colas diferentes.
Se pueden preparar compuestos lipidoides aminoalcohólicos para el aporte de fármacos al hacer reaccionar una 40 poliamina con un epóxido terminal.
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en donde R1 representa cadenas alquílicas de longitudes variables, mientras que de R2 a R4 representan
5 generalmente diversas combinaciones de cadenas alquílicas, poliaminas y átomos de hidrógeno. Las reacciones se establecen al añadir [N -1] equivalentes de epóxido a poliamina (donde N es el número de aminas 2° más 2 × el número de aminas 1° en la materia prima de poliamina). Esto genera una mezcla enriquecida en compuestos con [N -1] colas. Típicamente, estos compuestos son una mezcla de diversos isómeros constituyentes, habitualmente son aislables mediante cromatografía sobre gel de sílice; la identidad y la pureza de los productos se pueden confirmar a
10 través de espectroscopía 1H/13C NMR y/o mediante MALDI-MS (con matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico). Según se describe en la presente, el epóxido, la amina o tanto el epóxido como la amina pueden ser estereoquímicamente puros.
Estos compuestos lipidoides también son particularmente útiles en la administración de polinucleótidos. Los
15 compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la presente invención se pueden someter a síntesis combinatoria y cribado para generar bibliotecas de compuestos para el uso como agentes de aporte de fármacos avirales. Los compuestos de la invención se pueden usar con otros propósitos así como revestimientos, aditivos, materiales y excipientes.
20 En un aspecto, la presente invención proporciona un nuevo compuesto lipidoide aminoalcohólico de la fórmula:
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según se describe en la presente.
En un aspecto, la presente invención proporciona nuevos compuestos lipidoides aminoalcohólicos basados en hacer reaccionar una poliamina con un epóxido terminal adecuado según se describe anteriormente. En ciertas realizaciones, la poliamina es la "amina 200" de la fórmula:
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En ciertas realizaciones, la poliamina es la "amina 205" de la fórmula:
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35 En un aspecto de la invención, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención se combinan con un agente que se va a aportar a una célula o un sujeto para formar micropartículas, nanopartículas, liposomas o micelas. El agente que va a ser aportado por las partículas, los liposomas o las micelas pueden estar en forma de un gas, un líquido o un sólido, y el agente puede ser un polinucleótido, una proteína, un péptido o una molécula pequeña. Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención se pueden combinar con otros compuestos
40 lipidoides aminoalcohólicos, polímeros (sintéticos o naturales), tensioactivos, colesterol, carbohidratos, proteínas, lípidos, etc. para formar las partículas. A continuación, estas partículas se pueden combinar opcionalmente con un excipiente farmacéutico para formar una composición farmacéutica.
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La invención también proporciona métodos para preparar los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención. Uno o más equivalentes de una amina se dejan reaccionar con uno o más equivalentes de un compuesto terminado en epóxido bajo condiciones adecuadas para formar un compuesto lipidoide aminoalcohólico de la 5 presente invención. En ciertas realizaciones, todos los grupos amino de la amina se hacen reaccionar totalmente con el compuesto terminado en epóxido para formar aminas terciarias. En otras realizaciones, todos los grupos amino de la amina no se hacen reaccionar totalmente con el compuesto terminado en epóxido para formar aminas terciarias, dando como resultado de ese modo aminas primarias o secundarias en el compuesto lipidoide aminoalcohólico. Estas aminas primarias o secundarias se dejan como tal o se pueden hacer reaccionar con otro electrófilo tal como un compuesto terminado en epóxido diferente. Como será apreciado por un experto en la técnica, hacer reaccionar una amina con menos que un exceso de compuesto terminado en epóxido dará como resultado una pluralidad de diferentes compuestos lipidoides aminoalcohólicos con diversos números de colas. Ciertas aminas se pueden funcionalizar totalmente con dos colas de compuesto derivado de epóxido mientras que otras moléculas no se funcionalizarán completamente con colas de compuesto derivado de epóxido. Por ejemplo, 15 una diamina o poliamina puede incluir uno, dos, tres o cuatro colas de compuesto derivado de epóxido fuera de los diversos restos amino de la molécula dando como resultado aminas primarias, secundarias y terciarias. En ciertas realizaciones, todos los grupos amino no están totalmente funcionalizados. En ciertas realizaciones, se usan dos de los mismos tipos de compuestos terminados en epóxido. En otras realizaciones, se usan dos o más compuestos terminados en epóxido diferentes. La síntesis de los compuestos lipidoides aminoalcohólicos se realiza con o sin disolvente, y la síntesis se puede realizar a temperaturas superiores que varían de 30°C -100°C, preferiblemente a aproximadamente 50°C -90°C. Opcionalmente, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos preparados se pueden purificar. Por ejemplo, la mezcla de compuestos lipidoides aminoalcohólicos se pueden purificar para dar un compuesto lipidoide aminoalcohólico con un número particular de colas de compuesto derivado de epóxido. O la mezcla se puede purificar para dar un estereo-o regioisómero particular. Los compuestos lipidoides
25 aminoalcohólicos también se pueden alquilar usando un haluro de alquilo (p. ej., yoduro de metilo) u otro agente alquilante, y/o se pueden acilar.
Se pueden preparar bibliotecas de compuestos lipidoides aminoalcohólicos mediante los métodos de la invención. Estos compuestos lipidoides aminoalcohólicos se pueden preparar y/o cribar usando técnicas de alto rendimiento que implican manipuladores de líquidos, robots, placas de microvaloración, ordenadores, etc. Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos se pueden cribar con respecto a su capacidad para transfectar polinucleótidos u otros agentes (p. ej., proteínas, péptidos, moléculas pequeñas) a la célula.
Definiciones
Se describen posteriormente con más detalle grupos funcionales y términos químicos específicos. Para los
35 propósitos de esta invención, los elementos químicos identifican según la Tabla Periódica de los Elementos, versión CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75ª Ed., cubierta interior, y los grupos funcionales específicos se definen generalmente según se describe en la presente. Adicionalmente, principios generales de la química orgánica, así como restos funcionales y reactividad específicos, se describen en Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999.
Ciertos compuestos de la presente invención pueden existir en formas geométricas o estereoisómeras particulares. La presente invención contempla todos estos compuestos, incluyendo isómeros cis y trans, enantiómeros R y S, diastereoisómeros, isómeros (D), isómeros (L), las mezclas racémicas de los mismos, y otras mezclas de los mismos, que estén dentro del ámbito de la invención. Átomos de carbono asimétricos adicionales pueden estar
45 presentes en un sustituyente tal como un grupo alquilo. Todos estos isómeros, así como mezclas de los mismos, están destinados a estar incluidos en esta invención.
Mezclas isómeras que contienen cualquiera de una variedad de relaciones de isómeros se pueden utilizar según la presente invención. Por ejemplo, cuando solo se combinan dos isómeros, mezclas que contienen relaciones de isómeros 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2, 99:1 o 100:0 son todas contempladas por la presente invención. Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que se contemplan relaciones análogas para mezclas de isómeros más complejas.
Si, a modo de ejemplo, se desea un enantiómero particular de un compuesto de la presente invención, se puede
55 preparar mediante síntesis asimétrica, o mediante la derivación con un adyuvante quiral, donde la mezcla diastereoisómera resultante se separa y el grupo auxiliar se escinde para proporcionar enantiómeros deseados puros. Alternativamente, cuando la molécula contenga un grupo funcional básico, tal como amino, o un grupo funcional ácido, tal como carboxilo, se forman sales diastereoisómeras con un ácido o una base ópticamente activos apropiados, seguido por la resolución de los diastereoisómeros así formados mediante cristalización fraccionada o medios cromatográficos muy conocidos en la técnica, y posteriormente recuperación de los enantiómeros puros.
El "exceso enantiómerico" de una sustancia es una medida de cuán puro es un enantiómerico deseado con relación al enantiómero no deseado. El exceso enantiómerico se define como la diferencia absoluta entre la fracción molar de cada enantiómero que se expresa lo más a menudo como un porcentaje de exceso enantiómero. Para mezclas de diastereoisómeros, existen definiciones y usos análogos para "exceso diastereoisómerico" y porcentaje de exceso diastereoisómerico.
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5 Por ejemplo, una muestra con 70% de isómero R y 30% de S tendrá un exceso enantiómerico de 40%. Esto también se puede concebir como una mezcla de 40% de R puro con 60% de una mezcla racémica (que aporta 30% de R y 30% de S a la composición global).
Un experto normal en la técnica apreciará que los métodos sintéticos, que se describen en la presente, utilizan una variedad de grupos protectores. Por el término "grupo protector", según se usa en la presente, se entiende que un resto funcional particular, p. ej., O, S o N, está temporalmente bloqueado de modo que una reacción se pueda llevar a cabo selectivamente en otro punto reactivo en un compuesto multifuncional. En ciertas realizaciones, un grupo protector reacciona selectivamente con buen rendimiento para dar un sustrato protegido que es estable a las reacciones proyectadas; el grupo protector debe ser selectivamente retirable con buen rendimiento mediante 15 reactivos fácilmente disponibles, preferiblemente atóxicos, que no ataquen a los otros grupos funcionales; el grupo protector forma un derivado fácilmente separable (más preferiblemente sin la generación de nuevos centros estereogénicos); y el grupo protector tiene un mínimo de funcionalidad adicional para evitar puntos de reacción adicionales. Según se detalla en la presente, se pueden utilizar grupos protectores de oxígeno, azufre, nitrógeno y carbono. Grupos protectores de hidroxilo incluyen metilo, metoxilmetilo (MOM), metiltiometilo (MTM), t-butiltiometilo, (fenildimetilsilil)metoximetilo (SMOM), benciloximetilo (BOM), p-metoxibenciloximetilo (PMBM), (4metoxifenoxi)metilo (p-AOM), guayacolmetilo (GUM), t-butoximetilo, 4-penteniloximetilo (POM), siloximetilo, 2metoxietoximetilo (MEM), 2,2,2-tricloroetoximetilo, bis(2-cloroetoxi)metilo, 2-(trimetilsilil)etoximetilo (SEMOR), tetrahidropiranilo (THP), 3-bromotetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, 1-metoxiciclohexilo, 4metoxitetrahidropiranilo (MTHP), 4-metoxitetrahidrotiopiranilo, S,S-dióxido de 4-metoxitetrahidrotiopiranilo, 1-[(225 cloro-4-metil)fenil]-4-metoxipiperidin-4-ilo (CTMP), 1,4-dioxan-2-ilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofuranilo, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-octahidro-7,8,8-trimetil-4,7-metanobenzofuran-2-ilo, 1-etoxietilo, 1-(2-cloroetoxi)etilo, 1-metil-1metoxietilo, 1-metil-1-benciloxietilo, 1-metil-1-benciloxi-2-fluoroetilo, 2,2,2-tricloroetilo, 2-trimetilsililetilo, 2(fenilselenil)etilo, t-butilo, alilo, p-clorofenilo, p-metoxifenilo, 2,4-dinitrofenilo, bencilo, p-metoxibencilo, 3,4dimetoxibencilo, o-nitrobencilo, p-nitrobencilo, p-halobencilo, 2,6-diclorobencilo, p-cianobencilo, p-fenilbencilo, 2picolilo, 4-picolilo, 3-metil-2-picolilo N-oxido, difenilmetilo, p,p'-dinitrobenzhidrilo, 5-dibenzosuberilo, trifenilmetilo, αnaftildifenilmetilo, p-metoxifenildifenilmetilo, di(p-metoxifenil)fenilmetilo, tri(p-metoxifenil)metilo, 4-(4'bromofenaciloxifenil)difenilmetilo, 4,4',4"-tris(4,5-dicloroftalimidofenil)metilo, 4,4',4"-tris(levulinoiloxifenil)metilo, 4,4',4"tris(benzoiloxifenil)metilo, 3-(imidazol-1-il)bis(4',4"-dimetoxifenil)metilo, 1,1-bis(4-metoxifenil)-1'-pirenilmetilo, 9-antrilo, 9-(9-fenil)xantenilo, 9-(9-fenil-10-oxo)antrilo, 1,3-benzoditiolan-2-ilo, S,S-dióxido de bencisotiazolilo, trimetilsililo 35 (TMS), trietilsililo (TES), triisopropilsililo (TIPS), dimetilisopropilsililo (IPDMS), dietilisopropilsililo (DEIPS), dimetilhexilsililo, t-butildimetilsililo (TBDMS), t-butildifenilsililo (TBDPS), tribencilsililo, tri-p-xililsililo, trifenilsililo, difenilmetilsililo (DPMS), t-butilmetoxifenilsililo (TBMPS), formiato, benzoilformiato, acetato, cloroacetato, dicloroacetato, tricloroacetato, trifluoroacetato, metoxiacetato, trifenilmetoxiacetato, fenoxiacetato, pclorofenoxiacetato, 3-fenilpropionato, 4-oxopentanoato (levulinato), 4,4-(etileneditio)pentanoato (levulinoilditioacetal), pivaloato, adamantoato, crotonato, 4-metoxicrotonato, benzoato, p-fenilbenzoato, 2,4,6-trimetilbenzoato (mesitoato), alquilmetilcarbonato, 9-fluorenilmetilcarbonato (Fmoc), alquiletilcarbonato, alquil-2,2,2-tricloroetilcarbonato (Troc), 2(trimetilsilil)etilcarbonato (TMSEC), 2-(fenilsulfonil)etilcarbonato (Psec), 2-(trifenilfosfonio)etilcarbonato (Peoc), alquilisobutilcarbonato, alquilvinilcarbonato alquilalilcarbonato, alquil-p-nitrofenilcarbonato, alquilbencilcarbonato, alquil-p-metoxibencilcarbonato, alquil-3,4-dimetoxibencilcarbonato, alquil-o-nitrobencilcarbonato, alquil-p45 nitrobencilcarbonato, alquil-S-benciltiocarbonato, 4-etoxi-1-naftilcarbonato, metilditiocarbonato, 2-yodobenzoato, 4azidobutirato, 4-nitro-4-metilpentanoato, o-(dibromometil)benzoato, 2-formilbencenosulfonato, 2-(metiltiometoxi)etilo, 4-(metiltiometoxi)butirato, 2-(metiltiometoximetil)benzoato, 2,6-dicloro-4-metilfenoxiacetato, 2,6-dicloro-4-(1,1,3,3tetrametilbutil)fenoxiacetato, 2,4-bis(1,1-dimetilpropil)fenoxiacetato, clorodifenilacetato, isobutirato, monosuccinoato, (E)-2-metil-2-butenoato, o-(metoxicarbonil)benzoato, α-naftoato, nitrato, alquil-N,N,N',N'-tetrametilfosforodiamidato, alquil-N-fenilcarbamato, borato, dimetilfosfinotioilo, alquil-2,4-dinitrofenilsulfenato, sulfato, metanosulfonato (mesilato), bencilsulfonato y tosilato (Ts). Para proteger 1,2-o 1,3-dioles, los grupos protectores incluyen metilenacetal, etilidenacetal, 1-t-butiletilidencetal, 1-feniletilidencetal, (4-metoxifenil)etilidenacetal, 2,2,2tricloroetilidenacetal, acetónido, ciclopentilidencetal, ciclohexilidencetal, cicloheptilidencetal, bencilidenacetal, pmetoxibencilidenacetal, 2,4-dimetoxibencilidencetal, 3,4-dimetoxibencilidenacetal, 2-nitrobencilidenacetal, 55 metoximetilenacetal, etoximetilenacetal, dimetoximetilen-orto-éster, 1-metoxietiliden-orto-éster, 1-etoxietilidin-ortoéster, 1,2-dimetoxietiliden-orto-éster, α-metoxibenciliden-orto-éster, un derivado de 1-(N,N-dimetilamino)etilideno, αun derivado de (N,N'-dimetilamino)bencilideno, 2-oxaciclopentiliden-orto-éster, el grupo di-t-butilsilileno (DTBS), un derivado de 1,3-(1,1,3,3-tetraisopropildisiloxanilideno) (TIPDS), un derivado de tetra-t-butoxidisiloxano-1,3-diilideno (TBDS), carbonatos cíclicos, boronatos cíclicos, etilboronato y fenilboronato. Grupos protectores de amino incluyen metilcarbamato, etilcarbamato, 9-fluorenilmetilcarbamato (Fmoc), 9-(2-sulfo)fluorenilmetilcarbamato, 9-(2,7dibromo)fluoroenilmetilcarbamato, 2,7-di-t-butil-[9-(10,10-dioxo-10,10,10,10-tetrahidrotioxantil)]metilcarbamato (DBD-Tmoc), 4-metoxifenacilcarbamato (Phenoc), 2,2,2-tricloroetilcarbamato (Troc), 2-trimetilsililetilcarbamato (Teoc), 2feniletilcarbamato (hZ), 1-(1-adamantil)-1-metiletilcarbamato (Adpoc), 1,1-dimetil-2-haloetilcarbamato, 1,1-dimetil-2,2dibromoetilcarbamato (DB-t-BOC), 1,1-dimetil-2,2,2-tricloroetilcarbamato (TCBOC), 1-metil-1-(465 bifenilil)etilcarbamato (Bpoc), 1-(3,5-di-t-butilfenil)-1-metiletilcarbamato (t-Bumeoc), 2-(2'-y 4'-piridil)etilcarbamato (Pyoc), 2-(N,N-diciclohexilcarboxamido)etilcarbamato, t-butilcarbamato (BOC), 1-adamantilcarbamato (Adoc), vinilcarbamato (Voc), alilcarbamato (Alloc), 1-isopropilalilcarbamato (Ipaoc), cinamilcarbamato (Coc), 4nitrocinamilcarbamato (Noc), 8-quinolilcarbamato, N-hidroxipiperidinilcarbamato, alquilditicarbamato, bencilcarbamato (Cbz), p-metoxibencilcarbamato (Moz), p-nitobencilcarbamato, p-bromobencilcarbamato, pclorobencilcarbamato, 2,4-diclorobencilcarbamato, 4-metilsulfinilbencilcarbamato (Msz), 9-antrilmetilcarbamato, 5 difenilmetilcarbamato, 2-metiltioetilcarbamato, 2-metilsulfoniletilcarbamato, 2-(p-toluenosulfonil)etilcarbamato, [2-(1,3ditianil)]metilcarbamato (Dmoc), 4-metiltiofenilcarbamato (Mtpc), 2,4-dimetiltiofenilcarbamato (Bmpc), 2fosfonioetilcarbamato (Peoc), 2-trifenilfosfonioisopropilcarbamato (Ppoc), 1,1-dimetil-2-cianoetilcarbamato, m-cloro-paciloxibencilcarbamato, p-(dihidroxiboril)bencilcarbamato, 5-bencisoxazolilmetilcarbamato, 2-(trifluorometil)-6cromonilmetilcarbamato (Tcroc), m-nitrofenilcarbamato, 3,5-dimetoxibencilcarbamato, o-nitrobencilcarbamato, 3,4dimetoxi-6-nitrobencilcarbamato, fenil(o-nitrofenil)metilcarbamato, un derivado de fenotiacinil-(10)-carbonilo, un derivado de N'-p-toluenosulfonilaminocarbonilo, un derivado de N'-fenilaminotiocarbonilo, t-amilcarbamato, Sbenciltiocarbamato, p-cianobencilcarbamato, ciclobutilcarbamato, ciclohexilcarbamato, ciclopentilcarbamato, ciclopropilmetilcarbamato, p-deciloxibencilcarbamato, 2,2-dimetoxicarbonilvinilcarbamato, o-(N,Ndimetilcarboxamido)bencilcarbamato, 1,1-dimetil-3-(N,N-dimetilcarboxamido)propilcarbamato, 1,115 dimetilpropinilcarbamato, di(2-piridil)metilcarbamato, 2-furanilmetilcarbamato, 2-yodoetilcarbamato, isobornilcarbamato, isobutilcarbamato, isonicotinilcarbamato, p-(p'-metoxifenilazo)bencilcarbamato, 1metilciclobutilcarbamato, 1-metilciclohexilcarbamato, 1-metil-1-ciclopropilmetilcarbamato, 1-metil-1-(3,5dimetoxifenil)etilcarbamato, 1-metil-1-(p-fenilazofenil)etilcarbamato, 1-metil-1-feniletilcarbamato, 1-metil-1-(4piridil)etilcarbamato, fenilcarbamato, p-(fenilazo)bencilcarbamato, 2,4,6-tri-t-butilfenilcarbamato, 4(trimetilamonio)bencilcarbamato, 2,4,6-trimetilbencilcarbamato, formamida, acetamida, cloroacetamida, tricloroacetamida, trifluoroacetamida, fenilacetamida, 3-fenilpropanamida, picolinamida, 3-piridilcarboxamida, un derivado de N-benzoilfenilalanilo, benzamida, p-fenilbenzamida, o-nitofenilacetamida, o-nitrofenoxiacetamida, acetoacetamida, (N'-ditiobenciloxicarbonilamino)acetamida, 3-(p-hidroxifenil)propanamida, 3-(onitrofenil)propanamida, 2-metil-2-(o-nitrofenoxi)propanamida, 2-metil-2-(o-fenilazofenoxi)propanamida, 425 clorobutanamida, 3-metil-3-nitrobutanamida, o-nitrocinamida, un derivado de N-acetilmetionina, o-nitrobenzamida, o(benzoiloximetil)benzamida, 4,5-difenil-3-oxazolin-2-ona, N-ftalimida, N-ditiasuccinimida (Dts), N-2,3difenilmaleimida, N-2,5-dimetilpirrol, aducto de N-1,1,4,4-tetrametildisililazaciclopentano (STABASE), 1,3-dimetil1,3,5-triazaciclohexan-2-ona sustituida en 5, 1,3-dibencil-1,3,5-triazaciclohexan-2-ona sustituida en 5, 3,5-dinitro-4piridona sustituida en 1, N-metilamina, N-alilamina, N-[2-(trimetilsilil)etoxi]metilamina (SEM), N-3-acetoxipropilamina, N-(1-isopropil-4-nitro-2-oxo-3-piroolin-3-il)amina, sales de amonio cuaternario, N-bencilamina, N-di(4metoxifenil)metilamina, N-5-dibenzosuberilamina, N-trifenilmetilamina (Tr), N-[(4-metoxifenil)difenilmetil]amina (MMTr), N-9-fenilfluorenilamina (PhF), N-2,7-dicloro-9-fluorenilmetilenamina, N-ferrocenilmetilamino (Fcm), N-2picolilamino-N'-óxido, N-1,1-dimetiltiometilenamina, N-bencilidenamina, N-p-metoxibencilidenamina, Ndifenilmetilenamina, N-[(2-piridil)mesitil]metilenamina, N-(N',N'-dimetilaminometilen)amina, N,N'-isopropilidendiamina, 35 N-p-nitrobencilidenamina, N-salicilidenamina, N-5-clorosalicilidenamina, N-(5-cloro-2-hidroxifenil)fenilmetilenamina, N-ciclohexilidenamina, N-(5,5-dimetil-3-oxo-1-ciclohexenil)amina, un derivado de N-borano, un derivado de ácido Ndifenilborínico, N-[fenil(pentacarbonilcromo-o volframio)carbonil]amina, un quelato de N-cobre, un quelato de N-cinc, N-nitroamina, N-nitrosoamina, N-óxido de amina, difenilfosfinamida (Dpp), dimetiltiofosfinamida (Mpt), difeniltiofosfinamida (Ppt), dialquilfosforamidatos, dibencilfosforamidato, difenilfosforamidato, bencenosulfenamida, onitrobencenosulfenamida (Nps), 2,4-dinitrobencenosulfenamida, pentaclorobencenosulfenamida, 2-nitro-4metoxibencenosulfenamida, trifenilmetilsulfenamida, 3-nitropiridinosulfenamida (Npys), p-toluenosulfonamida (Ts), bencenosulfonamida, 2,3,6,-trimetil-4-metoxibencenosulfonamida (Mtr), 2,4,6-trimetoxibencenosulfonamida (Mtb), 2,6-dimetil-4-metoxibencenosulfonamida (Pme), 2,3,5,6-tetrametil-4-metoxibencenosulfonamida (Mte), 4metoxibencenosulfonamida (Mbs), 2,4,6-trimetilbencenosulfonamida (Mts), 2,6-dimetoxi-4-metilbencenosulfonamida
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45 (iMds), 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonamida (Pmc), metanosulfonamida (Ms), β-trimetilsililetanosulfonamida (SES), 9-antracenosulfonamida, 4-(4',8'-dimetoxinaftilmetil)bencenosulfonamida (DNMBS), bencilsulfonamida, trifluorometilsulfonamida y fenacilsulfonamida. Se detallan en la presente grupos protectores ejemplares, sin embargo, se apreciará que la presente invención no pretende limitarse a estos grupos protectores; en cambio, una variedad de grupos protectores equivalentes adicionales se puede identificar fácilmente usando los criterios anteriores y utilizados en el método de la presente invención. Adicionalmente, una variedad de grupos protectores se describe en Protective Groups in Organic Synthesis, Tercera Ed. Greene, T.W. y Wuts, P.G., Eds., John Wiley & Sons, Nueva York: 1999.
Se apreciará que los compuestos, según se describen en la presente, pueden estar sustituidos con cualquier
55 número de sustituyentes o restos funcionales. En general, el término "sustituido", esté o no precedido por el término "opcionalmente", y los sustituyentes contenidos en las fórmulas de esta invención se refieren a la sustitución de radicales hidrógeno en una estructura dada por un radical de un sustituyente especificado. Cuando más de una posición en cualquier estructura dada puede estar sustituida con uno o más sustituyentes seleccionados de un grupo especificado, el sustituyente puede ser bien igual o bien diferente en cada posición. Según se usa en la presente, se contempla que el término "sustituido" incluya todos los sustituyentes permisibles de los compuestos orgánicos. En un aspecto amplio, los sustituyentes permisibles incluyen sustituyentes acíclicos y cíclicos, ramificados y no ramificados, carbocíclicos y heterocíclicos, aromáticos y no aromáticos de compuestos orgánicos. Para los propósitos de esta invención, heteroátomos tales como nitrógeno pueden tener sustituyentes hidrógeno y/o cualesquiera sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos descritos en la presente que satisfagan las
65 valencias de los heteroátomos. Por otra parte, la invención no se pretende limitar de ningún modo a los sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos. Las combinaciones de sustituyentes y variables previstas por esta invención
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son preferiblemente las que dan como resultado la formación de compuestos estables útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos. El término "estable", según se usa en la presente, se refiere preferiblemente a compuestos que poseen una estabilidad suficiente para permitir la fabricación y que mantienen la integridad del compuesto durante un período suficiente para ser detectado y preferiblemente durante un período suficiente para ser útil para los propósitos detallados en la presente.
El término "alifático", según se usa en la presente, incluye hidrocarburos alifáticos tanto saturados como insaturados, de cadena lineal (es decir, no ramificados), ramificados, acíclicos, cíclicos o policíclicos, que están opcionalmente sustituidos con uno o más grupos funcionales. Como se apreciará por un experto normal en la técnica, "alifático" está destinado en la presente a incluir, pero no se limita a, restos alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo y cicloalquinilo. Así, según se usa en la presente, el término "alquilo" incluye grupos alquilo lineales, ramificados y cíclicos. Una convención análoga se aplica a otros términos genéricos tales como "alquenilo”, "alquinilo" y similares. Por otra parte, según se usa en la presente, los términos "alquilo”, "alquenilo”, "alquinilo" y similares abarcan grupos tanto sustituidos como no sustituidos. En ciertas realizaciones, según se usa en la presente, se usa "alquilo inferior" para indicar los grupos alquilo (cíclicos, acíclicos, sustituidos, no sustituidos, ramificados o no ramificados) que tienen 1-6 átomos de carbono.
En ciertas realizaciones, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo empleados en la invención contienen 1-20 átomos de carbono alifáticos. En ciertas otras realizaciones, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo empleados en la invención contienen 1-10 átomos de carbono alifáticos. En otras realizaciones más, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo empleados en la invención contienen 1-8 átomos de carbono alifáticos. En otras realizaciones adicionales, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo empleados en la invención contienen 1-6 átomos de carbono alifáticos. En otras realizaciones más, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo empleados en la invención contienen 1-4 átomos de carbono. Grupos alifáticos ilustrativos incluyen así, pero no se limitan a, por ejemplo, restos metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, ciclopropilo, -CH2-ciclopropilo, vinilo, alilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, ciclobutilo, -CH2ciclobutilo, n-pentilo, sec-pentilo, isopentilo, terc-pentilo, ciclopentilo, -CH2-ciclopentilo, n-hexilo, sec-hexilo, ciclohexilo, -CH2-ciclohexilo y similares, que, de nuevo, pueden soportar uno o más sustituyentes. Los grupos alquenilo incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, etenilo, propenilo, butenilo, 1-metil-2-buten-1-ilo y similares. Grupos alquinilo representativos incluyen, pero no se limitan a, etinilo, 2-propinilo (propargilo), 1-propinilo y similares.
El término "alquilo" según se usa en la presente se refiere a radicales hidrocarbonados saturados de cadena lineal o ramificada derivados de un resto hidrocarbonado que contiene entre uno y veinte átomos de carbono mediante la retirada de un solo átomo de hidrógeno. Ejemplos de radicales alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, terc-butilo, n-pentilo, neopentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-decilo, n-undecilo y dodecilo.
El término "alquenilo" indica un grupo monovalente derivado de un resto hidrocarbonado que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono mediante la retirada de un solo átomo de hidrógeno. Grupos alquenilo incluyen, por ejemplo, etenilo, propenilo, butenilo, 1-metil-2-buten-1-ilo y similares.
El término "alquinilo" según se usa en la presente se refiere a un grupo monovalente derivado de un hidrocarburo que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono mediante la retirada de un solo átomo de hidrógeno. Grupos alquinilo representativos incluyen etinilo, 2-propinilo (propargilo), 1-propinilo y similares.
El término "alcoxi" o "tioalquilo" según se usa en la presente se refiere a un grupo alquilo, según se define previamente, ligado a la molécula original a través de un átomo de oxígeno o a través de un átomo de azufre. En ciertas realizaciones, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo contienen 1-20 átomos de carbono alifáticos. En ciertas otras realizaciones, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo contienen 1-10 átomos de carbono alifáticos. En otras realizaciones más, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo empleados en la invención contienen 1-8 átomos de carbono alifáticos. En otras realizaciones adicionales, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo contienen 1-6 átomos de carbono alifáticos. En otras realizaciones más, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo contienen 1-4 átomos de carbono alifáticos. Ejemplos de alcoxi incluyen, pero no se limitan a, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, tercbutoxi, neopentoxi y n-hexoxi. Ejemplos de tioalquilo incluyen, pero no se limitan a, metiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio, n-butiltio y similares.
El término "alquilamino" se refiere a un grupo que tiene la estructura -NHR', en la que R' es alifático, según se define en la presente. En ciertas realizaciones, el grupo alifático contiene 1-20 átomos de carbono alifáticos. En ciertas otras realizaciones, el grupo alifático contiene 1-10 átomos de carbono alifáticos. En otras realizaciones más, el grupo alifático empleado en la invención contiene 1-8 átomos de carbono alifáticos. En otras realizaciones adicionales, el grupo alifático contiene 1-6 átomos de carbono alifáticos. En otras realizaciones más, el grupo alifático contiene 1-4 átomos de carbono alifáticos. Ejemplos de grupos alquilamino incluyen, pero no se limitan a, metilamino, etilamino, n-propilamino, iso-propilamino, ciclopropilamino, n-butilamino, terc-butilamino, neopentilamino, n-pentilamino, hexilamino, ciclohexilamino y similares.
El término "ácido carboxílico" según se usa en la presente se refiere a un grupo de fórmula -CO2H.
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El término "dialquilamino" se refiere a un grupo que tiene la estructura -NRR', en la que R y R' son cada uno un grupo alifático, según se define en la presente. R y R' pueden ser iguales o diferentes en un resto dialquilamino. En ciertas realizaciones, los grupos alifáticos contiene 1-20 átomos de carbono alifáticos. En ciertas otras realizaciones, los grupos alifáticos contiene 1-10 átomos de carbono alifáticos. En otras realizaciones más, los grupos alifáticos empleados en la invención contienen 1-8 átomos de carbono alifáticos. En otras realizaciones adicionales, los grupos alifáticos contiene 1-6 átomos de carbono alifáticos. En otras realizaciones más, los grupos alifáticos contiene 1-4 átomos de carbono alifáticos. Ejemplos de grupos dialquilamino incluyen, pero no se limitan a, dimetilamino, metiletilamino, dietilamino, metilpropilamino, di(n-propil)amino, di(iso-propil)amino, di(ciclopropil)amino, di(n-butil)amino, di(terc-butil)amino, di(neopentil)amino, di(n-pentil)amino, di(hexil)amino, di(ciclohexil)amino y similares. En ciertas realizaciones, R y R' están conectados para formar una estructura cíclico. La estructura cíclico resultante puede ser aromática o no aromática. Ejemplos de grupos diaminoalquilo cíclicos incluyen, pero no se limitan a, aziridinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, pirrolilo, imidazolilo, 1,3,4-trianolilo y tetrazolilo.
Algunos ejemplos de sustituyentes de los restos alifáticos (y otros) descritos anteriormente de compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a, grupos alifáticos; grupos heteroalifáticos; arilo; heteroarilo; arilalquilo; heteroarilalquilo; alcoxi; ariloxi; heteroalcoxi; heteroariloxi; alquiltio; ariltio; heteroalquiltio; heteroariltio; F; Cl; Br; I; -OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHCl2; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; -C(O)Rx; -CO2(Rx) -CON(Rx)2;-OC(O)Rx; -OCO2Rx; -OCON(Rx)2; -N(Rx)2; -S(O)2Rx; -NRx(CO)Rx en donde cada presencia de Rx incluye independientemente, pero no se limita a, un grupo alifático, un grupo heteroalifático, arilo, heteroarilo, arilalquilo o heteroarilalquilo, en donde cualquiera de los sustituyentes alifáticos, heteroalifáticos, arilalquilo o heteroarilalquilo descritos anteriormente y en la presente pueden estar sustituidos o no sustituidos, ser ramificados o no ramificados, cíclicos o acíclicos, y en donde cualquiera de los sustituyentes arilo o heteroarilo descritos anteriormente y en la presente puede estar sustituido o no sustituido. Ejemplos adicionales de sustituyentes generalmente aplicables son ilustrados por las realizaciones específicas mostradas en los Ejemplos que se describen en la presente.
En general, los términos "arilo" y "heteroarilo", según se usan en la presente, se refieren a restos insaturados mono
o policíclicos, heterocíclicos, policíclicos y poliheterocíclicos estables que tienen preferiblemente 3-14 átomos de carbono, cada uno de los cuales puede estar sustituido o no sustituido. Los sustituyentes incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los sustituyentes mencionados previamente, es decir, los sustituyentes citados para restos alifáticos
o para otros restos según se divulga en la presente, que den como resultado la formación de un compuesto estable. En ciertas realizaciones de la presente invención, "arilo" se refiere a un sistema anular carbocíclico mono-o bicíclico que tiene uno o dos anillos aromáticos incluyendo, pero no limitado a, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, indenilo y similares. En ciertas realizaciones de la presente invención, el término "heteroarilo", según se usa en la presente, se refiere a un radical aromático cíclico que tiene de cinco a diez átomos de anillo de los que un átomo de anillo se selecciona de S, O y N; cero, uno o dos átomos de anillo son heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de S, O y N; y los restantes átomos de anillo son carbono, estando enlazado el radical al resto de la molécula a través de cualquiera de los átomos de anillo, tales como, por ejemplo, piridilo, piracinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isooxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo y similares.
Se apreciará que los grupos arilo y heteroarilo pueden estar no sustituidos o sustituidos, en donde la sustitución incluye el reemplazo de uno, dos, tres o más de los átomos de hidrógeno de los mismos independientemente por uno cualquiera o más de los siguientes restos incluyendo, pero no limitados a: grupos alifáticos; grupos heteroalifáticos; arilo; heteroarilo; arilalquilo; heteroarilalquilo; alcoxi; ariloxi; heteroalcoxi; heteroariloxi; alquiltio; ariltio; heteroalquiltio; heteroariltio; -F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHCl2; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2;-CH2SO2CH3; -C(O)Rx; -CO2(Rx); -CON(Rx)2; -OC(O)Rx; -OCO2Rx; -OCON(Rx)2; -N(Rx)2;-S(O)2Rx; -NRx(CO)Rx, en donde cada presencia de Rx incluye independientemente, pero no se limita a, un grupo alifático, un grupo heteroalifático, arilo, heteroarilo, arilalquilo o heteroarilalquilo, en donde cualquiera de los sustituyentes alifáticos, heteroalifáticos, arilalquilo o heteroarilalquilo descritos anteriormente y en la presente puede estar sustituido o no sustituido, ser ramificado o no ramificado, cíclico o acíclico, y en donde cualquiera de los sustituyentes arilo o heteroarilo descritos anteriormente y en la presente puede estar sustituido o no sustituido. Ejemplos adicionales de sustituyentes generalmente aplicables se ilustran mediante las realizaciones específicas mostradas en los Ejemplos que se describen en la presente.
El término "cicloalquilo”, según se usa en la presente, se refiere específicamente a grupos que tienen de tres a siete, preferiblemente de tres a diez átomos de carbono. Cicloalquilos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y similares, como en el caso de otros restos alifáticos, heteroalifáticos o heterocíclicos, pueden estar opcionalmente sustituidos con sustituyentes que incluyen, pero no se limitan a, un grupo alifático; un grupo heteroalifático; arilo; heteroarilo; arilalquilo; heteroarilalquilo; alcoxi; ariloxi; heteroalcoxi; heteroariloxi; alquiltio; ariltio; heteroalquiltio; heteroariltio; -F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHCl2; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; -C(O)Rx; -CO2(Rx); -CON(Rx)2; -OC(O)Rx;-OCO2Rx; -OCON(Rx)2; -N(Rx)2; -S(O)2Rx; -NRx(CO)Rx, en donde cada presencia de Rx incluye independientemente, pero no se limita a, un grupo alifático, un grupo heteroalifático, arilo, heteroarilo, arilalquilo o heteroarilalquilo, en donde cualquiera de los sustituyentes alifático, heteroalifático, arilalquilo o heteroarilalquilo descrito anteriormente y en la presente puede estar sustituido o no sustituido, ser ramificado o no ramificado, cíclico o acíclico, y en donde cualquiera de los sustituyentes arilo o heteroarilo descritos anteriormente y en la presente puede estar sustituido o no sustituido. Ejemplos adicionales de sustituyentes generalmente aplicables se ilustran mediante las realizaciones específicas mostradas en los Ejemplos que se describen en la presente.
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El término "heteroalifático", según se usa en la presente, se refiere a restos alifáticos que contienen uno o más
5 átomos de oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio, p. ej., en lugar de átomos de carbono. Los restos heteroalifáticos pueden estar ramificados, no ramificados, ser cíclicos o acíclicos e incluyen heterociclos saturados e insaturados tales como morfolino, pirrolidinilo, etc. En ciertas realizaciones, los restos heteroalifáticos están sustituido mediante el reemplazo independiente de uno o más de los átomos de hidrógeno de los mismos por uno o más restos que incluyen, pero no limitados a, un grupo alifático; un grupo heteroalifático; arilo; heteroarilo; arilalquilo; heteroarilalquilo; alcoxi; ariloxi; heteroalcoxi; heteroariloxi; alquiltio; ariltio; heteroalquiltio; heteroariltio; -F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHCl2; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3;-C(O)Rx; -CO2(Rx); -CON(Rx)2; -OC(O)Rx; -OCO2Rx; -OCON(Rx)2; -N(Rx)2; -S(O)2Rx;-NRx(CO)Rx, en donde cada presencia de Rx incluye independientemente, pero no se limita a, un grupo alifático, un grupo heteroalifático, arilo, heteroarilo, arilalquilo o heteroarilalquilo, en donde cualquiera de los sustituyentes alifático, heteroalifático, arilalquilo o heteroarilalquilo
15 descritos anteriormente y en la presente puede estar sustituido o no sustituido, ser ramificado o no ramificado, cíclico
o acíclico, y en donde cualquiera de los sustituyentes arilo o heteroarilo descritos anteriormente y en la presente puede estar sustituido o no sustituido. Ejemplos adicionales de sustituyentes generalmente aplicables se ilustran mediante las realizaciones específicas mostradas en los Ejemplos que se describen en la presente.
El término "haloalquilo" indica un grupo alquilo, según se define anteriormente, que tiene uno, dos o tres átomos de halógeno ligados al mismo y se ejemplifica mediante grupos tales como clorometilo, bromoetilo, trifluorometilo y similares.
El término "heterocicloalquilo" o "heterociclo", según se usa en la presente, se refiere a un anillo no aromático de 5,
25 6, o 7 miembros o un grupo policíclico, incluyendo, pero no limitado a, un grupo bi-o tricíclico que comprende anillos de seis miembros condensados que tienen entre uno y tres heteroátomos seleccionados independientemente de oxígeno, azufre y nitrógeno, en donde (i) cada anillo de 5 miembros tiene de 0 a 1 dobles enlaces y cada anillo de 6 miembros tiene de 0 a 2 dobles enlaces, (ii) los heteroátomos nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados, (iii) el heteroátomo nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado, y (iv) cualquiera de los anillos heterocíclicos anteriores puede estar condensado a un anillo de benceno. Heterociclos representativos incluyen, pero no se limitan a, pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperacinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo y tetrahidrofurilo. En ciertas realizaciones, se utiliza un grupo "heterocicloalquilo o heterociclo sustituido" y, según se usa en la presente, se refiere a un grupo heterocicloalquilo o heterociclo, según se define anteriormente, sustituido mediante el reemplazo independiente de
35 uno, dos o tres de los átomos de hidrógeno del mismo por, pero no limitados a un grupo alifático; un grupo heteroalifático; arilo; heteroarilo; arilalquilo; heteroarilalquilo; alcoxi; ariloxi; heteroalcoxi; heteroariloxi; alquiltio; ariltio; heteroalquiltio; heteroariltio; -F; -Cl; -Br; -I;-OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHCl2; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; -C(O)Rx; -CO2(Rx); -CON(Rx)2; -OC(O)Rx; -OCO2Rx; -OCON(Rx)2; -N(Rx)2; -S(O)2Rx;-NRx(CO)Rx, en donde cada presencia de Rx incluye independientemente, pero no se limita a, un grupo alifático, un grupo heteroalifático, arilo, heteroarilo, arilalquilo o heteroarilalquilo, en donde cualquiera de los sustituyentes alifático, heteroalifático, arilalquilo o heteroarilalquilo descritos anteriormente y en la presente puede estar sustituido o no sustituido, ser ramificado o no ramificado, cíclico o acíclico, y en donde cualquiera de los sustituyentes arilo o heteroarilo descritos anteriormente y en la presente puede estar sustituido o no sustituido. Ejemplos adicionales de sustituyentes generalmente aplicables se ilustran mediante las realizaciones específicas mostradas en los Ejemplos
45 que se describen en la presente.
"Carbociclo": El término "carbociclo", según se usa en la presente, se refiere a un anillo aromático o no aromático en el que cada átomo del anillo es un átomo de carbono.
"Seleccionado independientemente": El término "seleccionado independientemente" se usa en la presente para indicar que los grupos R pueden ser idénticos o diferentes.
"Marcado": Según se usa en la presente, el término "marcado" está destinado a significar que un compuesto tiene al menos un elemento, isótopo o compuesto químico ligado para permitir la detección del compuesto. En general, los 55 marcadores típicamente pertenecen a tres clases: a) marcadores isotópicos, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados, incluyendo, pero no limitados a, 2H, 3H, 32P, 35S, 67Ga, 99mTc (Tc-99m), 111In, 123I, 125I, 169Yb y 186Re; b) marcadores inmunitarios, que pueden ser anticuerpos o antígenos, que se pueden unir a enzimas (tales como peroxidasa de rábano picante) que producen agentes detectables; y c) tintes coloreados, luminiscentes, fosforescentes o fluorescentes. Se apreciará que los marcadores se pueden incorporar en el compuesto en cualquier posición que no interfiera con la actividad biológica o la característica del compuesto que se está detectando. En ciertas realizaciones de la invención, se utiliza marcaje de fotoafinidad para la elucidación directa de interacciones intermoleculares en sistemas biológicos. Se puede emplear una variedad de fotóforos conocidos, basándose la mayoría en la fotoconversión de compuestos diazoicos, azidas o diazirinas en nitrenos o carbenos (Véase Bailey, H., Photogenerated Reagents in Biochemistry and Molecular Biology (1983), Elsevier, Ámsterdam). En ciertas
65 realizaciones de la invención, los marcadores de fotoafinidad empleados son o-, m-y p-azidobenzoílos, sustituidos con uno o más restos halógeno, incluyendo, pero no limitados a, ácido 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoico.
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Los términos "halo" y "halógeno", según se usan en la presente, se refieren a un átomo seleccionado de flúor, cloro, bromo y yodo.
5 El término "heterocíclico”, según se usa en la presente, se refiere a un sistema anular no aromática parcialmente insaturado o totalmente saturado de 3 a 10 miembros, que incluye anillos simples de 3 a 8 átomos de tamaño y sistemas anulares bi-y tricíclicos que pueden incluir arilo aromático de seis miembros o grupos heterocíclicos aromáticos condensados a un anillo no aromático. Estos anillos heterocíclicos incluyen los que tienen de uno a tres heteroátomos seleccionados independientemente de oxígeno, azufre y nitrógeno, en el que los heteroátomos nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados y el heteroátomo nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado.
El término "heteroarilo", según se usa en la presente, se refiere a un radical aromático cíclico que tiene de cinco a diez átomos de anillo de los que un átomo de anillo se selecciona de azufre, oxígeno y nitrógeno; cero, uno o dos
15 átomos de anillo son heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de azufre, oxígeno y nitrógeno; y los átomos de anillo restantes son carbono, estando el radical enlazado al resto de la molécula a través de cualquiera de los átomos de anillo, tal como, por ejemplo, piridilo, piracinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isooxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo y similares.
Grupos heterocíclicos y heterocíclicos aromáticos específicos que se pueden incluir en los compuestos de la invención incluyen: 3-metil-4-(3-metilfenil)piperacina, 3 metilpiperidina, 4-(bis-(4-fluorofenil)metil)piperacina, 4(difenilmetil)piperacina, 4-(etoxicarbonil)piperacina, 4-(etoxicarbonilmetil)piperacina, 4-(fenilmetil)piperacina, 4-(1feniletil)piperacina, 4-(1,1-dimetiletoxicarbonil)piperacina, 4-(2-(bis-(2-propenil)amino)etil)piperacina, 4-(225 (dietilamino)etil)piperacina, 4-(2-clorofenil)piperacina, 4-(2-cianofenil)piperacina, 4-(2-etoxifenil)piperacina, 4-(2etilfenil)piperacina, 4-(2-fluorofenil)piperacina, 4-(2-hidroxietil)piperacina, 4-(2-metoxietil)piperacina, 4-(2metoxifenil)piperacina, 4-(2-metilfenil)piperacina, 4-(2-metiltiofenil)piperacina, 4-(2-nitrofenil)piperacina, 4-(2nitrofenil)piperacina, 4-(2-feniletil)piperacina, 4-(2-piridil)piperacina, 4-(2-pirimidinil)piperacina, 4-(2,3dimetilfenil)piperacina, 4-(2,4-difluorofenil)piperacina, 4-(2,4-dimetoxifenil)piperacina, 4-(2,4-dimetilfenil)piperacina, 4(2,5-dimetilfenil)piperacina, 4-(2,6-dimetilfenil)piperacina, 4-(3-clorofenil)piperacina, 4-(3-metilfenil)piperacina, 4-(3trifluorometilfenil)piperacina, 4-(3,4-diclorofenil)piperacina, 4-3,4-dimetoxifenil)piperacina, 4-(3,4dimetilfenil)piperacina, 4-(3,4-metilendioxifenil)piperacina, 4-(3,4,5-trimetoxifenil)piperacina, 4-(3,5diclorofenil)piperacina, 4-(3,5-dimetoxifenil)piperacina, 4-(4-(fenilmetoxi)fenil)piperacina, 4-(4-(3, 1dimetiletil)fenilmetil)piperacina, 4-(4-cloro-3-trifluorometilfenil)piperacina, 4-(4-clorofenil)-3-metilpiperacina, 4-(4
35 clorofenil)piperacina, 4-(4-clorofenil)piperacina, 4-(4-clorofenilmetil)piperacina, 4-(4-fluorofenil)piperacina, 4-(4metoxifenil)piperacina, 4-(4-metilfenil)piperacina, 4-(4-nitrofenil)piperacina, 4-(4-trifluorometilfenil)piperacina, 4ciclohexilpiperacina, 4-etilpiperacina, 4-hidroxi-4-(4-clorofenil)metilpiperidina, 4-hidroxi-4-fenilpiperidina, 4hidroxipirrolidina, 4-metilpiperacina, 4-fenilpiperacina, 4-piperidinilpiperacina, 4-(2-furanil)carbonil)piperacina, 4-((1,3dioxolan-5-il)metil)piperacina, 6-fluoro-1,2,3,4-tetrahidro-2-metilquinolina, 1,4-diazacicloheptano, 2,3-dihidroindolilo, 3,3-dimetilpiperidina, 4,4-etilendioxipiperidina, 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina, 1,2,3,4-tetrahidroquinolina, azaciclooctano, decahidroquinolina, piperacina, piperidina, pirrolidina, tiomorfolina y triazol.
El término "sustituido”, esté o no precedido por el término "opcionalmente", y "sustituyente”, según se usa en la presente, se refieren a la capacidad, según se aprecia por un experto en la técnica, de cambiar un grupo funcional
45 por otro grupo funcional con la condición de que se mantenga la valencia de todos los átomos. Cuando más de una posición de cualquier estructura dada se puede sustituir con un sustituyente seleccionado de un grupo especificado, el sustituyente puede ser igual o diferente en cada posición. Los sustituyentes también pueden estar sustituidos adicionalmente (p. ej., un sustituyente grupo arilo puede tener otro sustituyente separado de él, tal como otro grupo arilo, que está sustituido además con flúor en una o más posiciones).
Los siguientes son términos más generales usados a lo largo de la presente solicitud:
"Animal": El término animal, según se usa en la presente, se refiere a seres humanos así como animales no humanos, incluyendo, por ejemplo, mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces. Preferiblemente, el animal no
55 humano es un mamífero (p. ej., un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, un primate o un cerdo). El animal puede ser un animal transgénico.
"Asociado con": Cuando dos entidades están "asociadas" entre sí según se describe en la presente, están conectadas mediante una interacción covalente o no covalente directa o indirecta. Preferiblemente, la asociación es covalente. Interacciones no covalente deseables incluyen enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones hidrófobas, interacciones magnéticas, interacciones electrostáticas, etc. En ciertas realizaciones, un compuesto lipidoide aminoalcohólico está asociado con un polinucleótido a través de interacciones electrostáticas.
"Biocompatible": El término "biocompatible”, según se usa en la presente, está destinado a describir compuestos que 65 son atóxicos para las células. Los compuestos son "biocompatibles" si su adición a las células in vitro da como
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resultado menos de o igual a 20% de muerte celular, y su administración in vivo no induce inflamación u otro de estos efectos adversos.
"Biodegradable": Según se usa en la presente, los compuestos "biodegradables" son los que, cuando se introducen en células, son descompuestos por la maquinaria celular o por hidrólisis en componentes que las células pueden bien reutilizar o bien desechar sin un efecto tóxico significativo sobre las células (es decir, menos de aproximadamente 20% de las células son destruidas cuando los componentes se añaden a las células in vitro). Preferiblemente, los componentes no inducen inflamación u otros efectos adversos in vivo. En ciertas realizaciones, las reacciones químicas utilizadas para descomponer los compuestos biodegradables no están catalizadas.
"Cantidad eficaz": En general, la "cantidad eficaz" de un agente activo o una composición se refiere a la cantidad necesaria para provocar la respuesta biológica deseada. Como se apreciará por los expertos normales en esta técnica, la cantidad eficaz de un agente o dispositivo puede variar dependiendo de factores tales como el efecto biológico deseado, el agente que se va a aportar, la composición de la matriz encapsulante, el tejido elegido, etc. Por ejemplo, la cantidad eficaz de micropartículas que contienen un antígeno que se van a aportar para inmunizar a un individuo es la cantidad que da como resultado una respuesta inmunitaria suficiente para evitar la infección con un organismo que tiene el antígeno administrado
"Péptido" o "proteína": Según la presente invención, un "péptido" o una "proteína" comprende una hebra de al menos tres aminoácidos conectados entre sí por enlaces peptídicos. Los términos "proteína" y "péptido" se pueden usar intercambiablemente. Péptido se puede referir a un péptido individual o un conjunto de péptidos. Los péptidos de la invención contienen preferiblemente solo aminoácidos naturales, aunque se pueden emplear alternativamente aminoácidos no naturales (es decir, compuestos que no se presentan en la naturaleza pero que se pueden incorporar en una cadena polipeptídica) y/o análogos de aminoácidos que son conocidos en la técnica. Además, uno
o más de los aminoácidos del péptido de la invención se pueden modificar, por ejemplo, mediante la adición de una entidad química tal como un grupo carbohidrato, un grupo fosfato, un grupo farnesilo, un grupo isofarnesilo, un grupo ácido graso, un conector para conjugación, funcionalización, u otra modificación, etc. En ciertas realizaciones, las modificaciones del péptido conducen a un péptido más estable (p. ej., mayor semivida in vivo). Estas modificaciones pueden incluir la ciclación del péptido, la incorporación de D-aminoácidos, etc. Ninguna de las modificaciones debe interferir sustancialmente con la actividad biológica deseada del péptido.
"Polinucleótido" u "oligonucleótido": Polinucleótido u oligonucleótido se refiere a un polímero de nucleótidos. Típicamente, un polinucleótido comprende al menos tres nucleótidos. El polímero puede incluir nucleósidos naturales (es decir, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina), análogos de nucleósidos (p. ej., 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metiladenosina, C5-propinilcitidina, C5-propiniluridina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5yodouridina, C5-metilcitidina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)metilguanina y 2-tiocitidina), bases químicamente modificadas, bases biológicamente modificadas (p. ej., bases metiladas), bases intercaladas, azúcares modificados (p. ej., 2'-fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa) o grupos fosfato modificados (p. ej., fosforotioatos y enlaces de 5' -N-fosforamidita).
"Molécula pequeña": Según se usa en la presente, el término "molécula pequeña" se refiere a compuestos orgánicos, ya estén presentes en la naturaleza o se creen artificialmente (p. ej., a través de síntesis química) que tienen un peso molecular relativamente bajo y que no son proteínas, polipéptidos o ácidos nucleicos. Típicamente, las moléculas pequeñas tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 1500 g/mol. En ciertas realizaciones, la molécula pequeña está descargada. En ciertas realizaciones, la molécula pequeña está cargada negativamente. Además, las moléculas pequeñas tienen típicamente múltiples enlaces carbono-carbono. Moléculas pequeñas presentes en la naturaleza conocidas incluyen, pero no se limitan a, penicilina, eritromicina, taxol, ciclosporina y rapamicina. Moléculas pequeñas sintéticas conocidas incluyen, pero no se limitan a, ampicilina, meticilina, sulfametoxazol y sulfonamidas.
Breve descripción del dibujo
La Figura 1 representa un esquema sintético general para preparar lipidoides aminoalcohólicos al combinar aminas y epóxidos, y hacerlos reaccionar a aproximadamente 90°C.
La Figura 2 representa aminas ejemplares que contienen entre dos y cinco funcionalidades amina y epóxidos racémicos de colas variables, grupos funcionales únicos y grados de insaturación variables que se pueden usar para preparar lipidoides aminoalcohólicos.
La Figura 3 representa datos de caracterización de lipidoides aminoalcohólicos derivados de la amina 114.
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La Figura 4 representa placas de cromatografía en capa fina (TLC) de compuestos seleccionados procedentes de la biblioteca de lipidoides aminoalcohólicos. La Placa "A" representa aminas totalmente sustituidas, mientras que la Placa "B" representa aminas sustituidas en n-1.
La Figura 5 representa resultados de la atenuación de luciferasa de luciérnaga con relación a células no tratadas a partir de ARN complejante (50 ng) con diversos lipidoides aminoalcohólicos (a diversas relaciones peso/peso) e incubadas con células HeLa.
La Figura 6 representa resultados del aporte del gen de luciferasa (Expresión de Luciferasa, "RLU") en células HepG2 para diversos compuestos lipidoides epoxídicos en suero al 10% y 0,3 µg de ADN por pocillo.
La Figura 7 representa resultados in vivo de la atenuación del Factor VII y la caracterización de ratones C57BL/6 48 horas después de la administración (a través de inyección en la vena caudal en un volumen de 0,01 ml/g) de (a) solución salina tamponada con fosfato; (b) 1,75 mg/kg de ARNsi atrapado en formulación lipidoide; y (c) 4 mg/kg de ARNsi atrapado en formulación lipidoide.
La Figura 8 representa resultados de la atenuación de luciferasa (medidos mediante expresión relativa de luceriferasa, % del control) para una biblioteca de compuestos lipidoides aminoalcohólicos en donde la relación de compuesto lipidoide aminoalcohólico a ARNsi es 2,5:1 (p/p).
La Figura 9 representa los resultados de la atenuación de luciferasa (medidos mediante expresión relativa de luceriferasa, % del control) para quince compuestos lipidoides aminoalcohólicos que tienen >90% de atenuación en donde la relación de compuesto lipidoide aminoalcohólico a ARNsi es 2,5:1 (p/p).
La Figura 10 representa: (a) resultados de respuesta a la dosis (mg/kg) (medidos mediante atenuación de Factor VII en ratones mediante un lipidoide aminoalcohólico C14-110 36 horas después de la inyección) en donde la relación de compuesto lipidoide aminoalcohólico a ARNsi es 10:1 (p/p), la relación de compuesto lipidoide aminoalcohólico:colesterol:PEG es 42:48:10 y el atrapamiento de 44% de partículas de 91 nm; y (b) media de % de peso corporal.
La Figura 11 representa resultados de cribado in vitro como atenuación de luciferasa en células HeLa mediante 25 lipidoides basados en epóxido con una relación 5:1 p/p.
La Figura 12 representa resultados de cribado in vitro como atenuación de Factor VII 48 horas después de la inyección de lipidoides epoxídicos formulados en ratones.
La Figura 13a representa resultados de respuesta a la dosis para C16-96B como atenuación de Factor VII 48 horas después de la inyección de la formulación C16-96-B en ratones.
La Figura 13b representa la pérdida y/o el aumento del peso corporal de ratones correspondiente durante el procedimiento experimental que proporcionaba los resultados de la Figura 13.
La Figura 14a representa resultados de respuesta a la dosis para C14-110B como atenuación de Factor VII 72 horas después de la inyección de la formulación C14-110-B en ratones.
La Figura 14b representa la pérdida y/o el aumento del peso corporal de ratones correspondiente durante el procedimiento experimental que proporcionaba los resultados de la Figura 14a.
La Figura 15 representa la optimización de la formulación C16-96-B como atenuación de Factor VII 48 horas después de la inyección de la formulación C16-96-B en ratones con una dosis de 1 mg/kg.
La Figura 16 representa la respuesta a la dosis de C16-96-B como atenuación de Factor VII 48 horas después de la inyección de la formulación C16-96-B en ratones.
La Figura 17a representa el cribado in vivo adicional y el descubrimiento de C12-200 y/o C12-205 como atenuación de Factor VII 48 horas después de la inyección de lipidoides formulados en ratones con una dosis de 0,25 mg/kg.
La Figura 17b representa el cribado in vivo adicional y el descubrimiento de C12-200 y/o C12-205 y la pérdida y/o el aumento del peso corporal de ratones correspondiente durante el procedimiento experimental que proporcionaba los resultados de la Figure 17a.
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La Figura 18a representa resultados de respuesta a la dosis para C12-200 y/o C12-205 y la comparación de ND98 como atenuación del Factor VII 48 horas después de la inyección de C12-200 y/o C12-205 formulados en ratones.
La Figura 18b representa la pérdida y/o el aumento del peso corporal de ratones correspondiente durante el procedimiento experimental que proporcionaba los resultados de la Figura 18a.
La Figura 19 representa la optimización de la formulación de C12-200 y/o C12-205 como atenuación del Factor VII 48 horas después de la inyección de C12-200 y/o C12-205 formulados en ratones con una dosis de 0,01 mg/kg.
La Figura 20a representa un espectro de masas de MALDI-TOF (intensidad frente a relación m/z) de la mezcla de reacción en bruto de amina 111 y epóxido C12 de calidad técnica.
La Figura 20b representa un espectro de masas de MALDI-TOF (intensidad frente a relación m/z) del producto "purificado" procedente de la mezcla de reacción en bruto de la amina 111 y el epóxido C12 de calidad técnica (de la Figura 20a).
La Figura 21a representa un espectro de masas de MALDI-TOF (intensidad frente a relación m/z) de la mezcla de reacción en bruto de la amina 111 y el epóxido C12 de calidad técnica.
La Figura 21b representa un espectro de masas de MALDI-TOF (intensidad frente a relación m/z) del producto "purificado" procedente de la mezcla de reacción en bruto de la amina 111 y el epóxido C12 de calidad técnica (de la Figura 21a).
La Figura 22 representa un espectro de 1H NMR (400 MHz) de C12-200 y/o C12-205 (cloroformo, temperatura ambiente).
Descripción detallada de ciertas realizaciones de la invención
La presente invención proporciona nuevos compuestos lipidoides aminoalcohólicos y sistemas de aporte de fármacos basados en el uso de estos compuestos lipidoides aminoalcohólicos. El sistema se puede usar en las técnicas de aporte de productos farmacéuticos/fármacos para aportar polinucleótidos, proteínas, moléculas pequeñas, péptidos, un antígeno, fármacos, etc. a un paciente, un órgano, una célula, etc. Estos nuevos compuestos también se pueden usar como materiales para revestimiento, aditivos, excipientes, materiales, bioingeniería, etc.
Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la presente invención proporcionan varios usos diferentes en la técnica del aporte de fármacos. La porción que contiene amina de los compuestos lipidoides aminoalcohólicos se puede usar para complejar polinucleótidos, mejorando de ese modo el aporte del polinucleótido y evitando su degradación. Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos también se pueden usar en la formación de picopartículas, nanopartículas, micropartículas, liposomas y micelas que contienen el agente que se va a aportar. Preferiblemente, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos son biocompatibles y biodegradables, y las partículas formadas también son biodegradables y biocompatibles y se pueden usar para proporcionar una liberación sostenida controlada del agente que se va a aportar. Los lipidoides y sus partículas correspondientes también pueden ser sensibles a cambios de pH dado que estos lipidoides están protonados a un pH inferior. Los lipidoides también pueden actuar como esponjas protónicas en el aporte de un agente a una células para provocar la lisis de endosomas.
1. Compuestos lipidoides aminoalcohólicos
Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la presente invención son compuestos lipidoides aminoalcohólicos que contienen aminas primarias, secundarias, terciarias y/o cuaternarias y sales de las mismas. Las aminas pueden ser aminas cíclicas o acíclicas. En ciertas realizaciones, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención son relativamente no citotóxicos. En otra realización, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención son biocompatibles y biodegradables. En ciertas realizaciones, los lipidoides aminoalcohólicos de la presente invención tienen pKas en el intervalo de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,5, más preferiblemente entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 7,0. En otra realización, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos se pueden diseñar para tener un pKa deseado entre aproximadamente 3,0 y aproximadamente 9,0, o entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,0. Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención son particularmente atractivos para el aporte de fármacos por varias razones: 1) contienen grupos amino para interactuar con ADN, ARN, otros polinucleótidos y otros agentes cargados negativamente, para tamponar el pH, para provocar endosomolisis, para proteger al agente que se va a aportar, etc.; 2) se pueden sintetizar a partir de materias primas disponibles comercialmente; y/o 3) son sensibles al pH y se pueden diseñar con un pKa deseado.
En ciertas realizaciones, el compuesto lipidoide aminoalcohólico o la composición que contiene el o los compuestos lipidoides aminoalcohólicos son los derivados de epóxidos terminados de 14 carbonos o más acoplados con monómeros de tres o más grupos funcionales amina. En ciertas realizaciones, la composición que contiene 5 compuesto lipidoide aminoalcohólico es alrededor de 40-60% de lipidoide, alrededor de 40-60% de colesterol y alrededor de 5-20% de PEG. En ciertas realizaciones, la composición que contiene un compuesto lipidoide aminoalcohólico es alrededor de 50-60% de lipidoide, alrededor de 40-50% de colesterol y alrededor de 5-10% de PEG. En ciertas realizaciones, la composición que contiene un compuesto lipidoide aminoalcohólico es 52% de lipidoide, 48% de colesterol y 10% de PEG. En ciertas realizaciones, la composición que contiene un lipidoide
10 aminoalcohólico es alrededor de 50-75% de lipidoide, alrededor de 20-40% de colesterol y alrededor de 1-10% de PEG. En ciertas realizaciones, la composición que contiene un compuesto lipidoide aminoalcohólico es alrededor de 60-70% de lipidoide, alrededor de 25-35% de colesterol y alrededor de 5-10% de PEG.
Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos se pueden preparar al hacer reaccionar una amina con un epóxido 15 terminal o un aldehído según los siguientes esquemas.
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En ciertas realizaciones, el epóxido es estereoquímicamente puro (p. ej., enantiómeramente puro). En ciertas realizaciones, la amina es estereoquímicamente puras (p. ej., enantiómeramente pura). En ciertas realizaciones, el lipidoide se prepara a partir de la aminación reductiva de una imina que se derivaba de la condensación de una
25 amina y un aldehído. Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la presente invención son de la fórmula:
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en donde cada presencia de RA, RF, m y p es como se define en la presente. Como será apreciado por un experto
30 en la técnica, una amina se puede hacer reaccionar con un exceso de epóxido para formar un compuesto lipidoide aminoalcohólico totalmente funcionalizado. O el lipidoide puede tener menos colas derivadas de epóxido que cuando está totalmente funcionalizado.
El compuesto lipidoide aminoalcohólico de la presente invención es de la fórmula: 35
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en la que: p es 1; m es 1 ;
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RA es hidrógeno; un grupo alifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido; un grupo heteroalifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido; arilo sustituido o no sustituido; heteroarilo sustituido o no sustituido;
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cada presencia de R5 es independientemente hidrógeno; un grupo alifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido; un grupo heteroalifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, 10 sustituido o no sustituido; arilo sustituido o no sustituido; o heteroarilo sustituido o no sustituido;
en donde al menos uno de RY y RZ es
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cada presencia de x es un número entero entre 1 y 10, inclusive; cada presencia de y es un número entero entre 1 y 10, inclusive; cada presencia de RY es hidrógeno; un grupo alifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o
arilo sustituido o no sustituido; heteroarilo sustituido o no sustituido;
cada presencia de RZ es hidrógeno; un grupo alifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido C1-20 alifático; cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido C1-20
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heteroalifático; sustituido o no sustituido arilo; sustituido o no sustituido heteroarilo;
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En ciertas realizaciones, RA es hidrógeno. En ciertas realizaciones, RA es un grupo alifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, RA es un grupo alifático C1-C6. En ciertas realizaciones, RA es alquilo C1-C6. En ciertas realizaciones, RA es un grupo heteroalifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, RA es arilo sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, RA es heteroarilo sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, RA es
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10 ciertas realizaciones, RA es En ciertas realizaciones, RA es En ciertas
En ciertas realizaciones, cada imagen24 imagen25es independientemente imagen26 imagen27o imagen28
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realizaciones RA es En ciertas realizaciones RA es
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En ciertas realizaciones RA es
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En ciertas realizaciones RF es En ciertas realizaciones RF es
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En ciertas realizaciones, RA es y RF es imagen37En
ciertas realizaciones, RA es imagen38o
y RF es
En ciertas realizaciones, cada
imagen39es
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En ciertas realizaciones, cada es imagen42 imagen43A es y RF
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En ciertas realizaciones, , cada
imagen48es imagen49ciertas realizaciones, RA es
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En ciertas realizaciones, cada
imagen51es imagen52En ciertas realizaciones, cada
imagen53es
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5 En ciertas realizaciones, R5 es hidrógeno. En ciertas realizaciones, R5 es un grupo alifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, R5 es un grupo alifático C8-C16. En ciertas realizaciones, R5 es alquilo C8-C16. En algunas realizaciones, Rimagen555 es un grupo alifático C10-12 no sustituido y no
imagen56ramificado. En algunas realizaciones, R5 es imagen57En algunas realizaciones, R5 es En algunas realizaciones, R5 es imagen58En 10 ciertas realizaciones, R5 se selecciona de las siguientes fórmulas:
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es un grupo heteroalifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido. En algunas realizaciones, R5 es un grupo heteroalifático C13 no sustituido y no ramificado. En algunas realizaciones, R5 es un grupo heteroalifático C14 no sustituido y no ramificado. En ciertas realizaciones, R5 es: Será apreciado por un experto normal en la técnica que los sustituyentes anteriores pueden tener múltiples sitios de insaturación, y así podrían estar en cualquier posición dentro del sustituyente.
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10 En ciertas realizaciones, R5 es arilo sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, R5 es o heteroarilo sustituido
o no sustituido.
En ciertas realizaciones, R5 está fluorado. En ciertas realizaciones R5 es un resto alifático fluorado. En ciertas
15 realizaciones R5 está perfluorado. En ciertas realizaciones R5 es un resto alifático perfluorado. En ciertas realizaciones, R5 es un grupo alquilo C1-20 perfluorado. En ciertas realizaciones, R5 se selecciona de las siguientes fórmulas:
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En ciertas realizaciones, R5 se selecciona de las siguientes fórmulas:
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En ciertas realizaciones, cada R5 es independientemente hidrógeno o alquilo C1-C6. En ciertas realizaciones, cada R5 es hidrógeno. En ciertas realizaciones, R1 y R3 cada R5 es alquilo C1-C6. En ciertas realizaciones, cada R5 es hidroxialquilo. En ciertas realizaciones, cada R5 es aminoalquilo. En ciertas realizaciones, dos variables de R5 son iguales. En ciertas realizaciones, tres variables de R5 son iguales. En ciertas realizaciones, cada variable de R5 es
10 diferente de las otras.
En ciertas realizaciones, x es 1. En ciertas realizaciones, x es 2. En ciertas realizaciones, x es 3. En ciertas realizaciones, x es 4. En ciertas realizaciones, x es 5. En ciertas realizaciones, x es 6. En ciertas realizaciones, x es
7. En ciertas realizaciones, x es 8. En ciertas realizaciones, x es 9. En ciertas realizaciones, x es 10.
15 En ciertas realizaciones, y es 1. En ciertas realizaciones, y es 2. En ciertas realizaciones, y es 3. En ciertas realizaciones, y es 4. En ciertas realizaciones, y es 5. En ciertas realizaciones, y es 6. En ciertas realizaciones, y es
7. En ciertas realizaciones, y es 8. En ciertas realizaciones, y es 9. En ciertas realizaciones, y es 10.
20 En ciertas realizaciones, x es 1 e y es 2. En ciertas realizaciones, x es 1 e y es 3. En ciertas realizaciones, x es 1 e y es 4. En ciertas realizaciones, x es 1 e y es 5. En ciertas realizaciones, x es 2 e y es 2. En ciertas realizaciones, x es 2 ey es 3.
En ciertas realizaciones, RY es hidrógeno. En ciertas realizaciones, RY es un grupo alifático C1-20 cíclico o acíclico,
25 ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, RY es alquilo C1-C6. En ciertas realizaciones, RY es un grupo heteroalifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, RY es arilo sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, RY es heteroarilo
sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, RY es imagen65En ciertas realizaciones, cada
imagen66
imagen67es independientemente
imagen68o imagen69Y es
30 En ciertas realizaciones, RZ es hidrógeno. En ciertas realizaciones, RZ es un grupo alifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, RY es alquilo C1-C6. En ciertas realizaciones, RZ es un grupo heteroalifático C1-20 alifático cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, RZ es arilo sustituido o no es
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heteroarilo sustituido o no sustituido. En ciertas realizaciones, RZ es En ciertas realizaciones,
imagen71
cada imagen72es independientemente
imagen73o
imagen74En ciertas realizaciones, RZ es
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Compuestos ejemplares particulares incluyen:
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En ciertas realizaciones, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la presente invención comprende una mezcla de las fórmulas:
imagen77
En ciertas realizaciones, cada es independientemente imagen78o
En ciertas realizaciones, un compuesto lipidoide aminoalcohólico o una composición que contiene un compuesto o 10 compuestos lipidoides aminoalcohólicos se prepara al hacer reaccionar una amina de una de las fórmulas:
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imagen81
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imagen83y/o con un compuesto que contiene
epóxido de la fórmula: imagen84En ciertas realizaciones, los compuestos terminados en epóxido es de la fórmula: imagen85. En ciertas realizaciones, el compuesto que contiene epóxido es de la fórmula:
15 El epóxido puede contener uno o más centros quirales, tales como los mostrados posteriormente para la amina C8b*:
imagen86
* No reivindicado
5 En ciertas realizaciones, un equivalente de una amina se hace reaccionar con un equivalente de un compuesto terminado en epóxido. En ciertas realizaciones, un equivalente de una amina se hace reaccionar con uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más equivalentes de un compuesto terminado en epóxido. En ciertas realizaciones, la cantidad de compuesto terminado en epóxido es limitativa para evitar la funcionalización de todos los grupos amino. El
10 lipidoide aminoalcohólico o la composición de lipidoide aminoalcohólico resultantes contienen en estos casos grupos amino secundarios y/o grupos aminos primarios. Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos que tienen aminas secundarias son particular útiles en ciertos casos. En ciertas realizaciones, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos que contienen amina que no se han funcionalizado totalmente se hacen reaccionar con otro electrófilo (p. ej., epóxido terminal, haluro de alquilo, etc.). Esta funcionalización adicional de las aminas del
15 compuesto lipidoide aminoalcohólico da como resultado compuestos lipidoides aminoalcohólicos con diferentes colas derivadas de compuesto epoxídico. Una, dos, tres, cuatro, cinco o más colas pueden ser diferentes de las otras colas de los compuestos lipidoides aminoalcohólicos.
En ciertas realizaciones, será apreciado por un experto en la técnica que la amina y el epóxido reaccionarán en el 20 carbono insaturado del epóxido dando como resultado un compuesto lipidoide aminoalcohólico como el mostrado en los siguientes esquemas.
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En ciertas realizaciones, le epóxido es estereoquímicamente puro (p. ej., enantiómeramente puro). En ciertas realizaciones, la amina es estereoquímicamente pura (p. ej., enantiómeramente pura). En ciertas realizaciones, el lipidoide se prepara a partir de la aminación reductiva de una imina que se deriva de la condensación de una amina y un aldehído. Los compuestos de la invención pueden tener un exceso enantiómerico o un exceso 30 diastereoisómerico hasta e incluyendo 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%,79%, 80%, 81%,
82%, 83%, 84%, 85%,86%, 87%, 88%, 89%,90%,90,5%,91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% o 100%.
En otras realizaciones, se apreciará por un experto en la técnica que la amina y el epóxido reaccionarán en el carbono sustituido del epóxido dando como resultado un compuesto lipidoide aminoalcohólico como el mostrado en el siguiente esquema.
imagen88
10 Aunque la reacción anterior se puede preferir menos, es probable que se produzca al menos hasta algún grado y puede estar más favorecida bajo ciertas condiciones. Un compuesto lipidoide aminoalcohólico puede tener aminas que han reaccionado de uno o ambos modos.
En ciertas realizaciones, la amina y el compuesto terminado en epóxido se hacen reaccionar entre sí netos. En otras
15 realizaciones, la reacción se realiza en un disolvente (p. ej., THF, CH2Cl2, MeOH, EtOH, CHCl3, hexanos, tolueno, benceno, CCl4, glime, éter dietílico, etc.). En ciertas realizaciones, la mezcla de reacción se calienta. En ciertas realizaciones, la mezcla de reacción se calienta hasta una temperatura que varía de 30°C-100°C. En otra realización, la mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente 90°C. La reacción también puede estar catalizada. Por ejemplo, la reacción se puede catalizar mediante la adición de un ácido, una base o un metal (p. ej.,
20 un ácido de Lewis). La reacción se puede dejar avanzar durante horas, días o semanas. En ciertas realizaciones, la reacción se deja avanzar durante 1-7 días. En ciertas realizaciones, las reacciones se realizaron durante de alrededor de 1 a alrededor de 3 días. La composición resultante se puede usar con o sin purificación. En ciertas realizaciones, los lipidoides se someten posteriormente a una etapa de alquilación (p. ej., reacción con yoduro de metilo) para formar sales de amina cuaternaria. Opcionalmente, se pueden preparar diversas formas salinas de los
25 lipidoides. En ciertas realizaciones, las sales son sales farmacéuticamente aceptables.
En ciertas realizaciones, el compuesto lipidoide aminoalcohólico o la composición que contiene una mezcla de se prepara al hacer reaccionar la amina 200
con un compuesto C-12 terminado en epóxido. En ciertas 30 realizaciones, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos derivados de amina 200 (es decir, C12-200) y sus diversos isómeros posibles son de las fórmulas posteriores:
5 colas 4 colas
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imagen92
3 colas 2 colas
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imagen94
imagen95
1 cola
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En ciertas realizaciones, cada es independientemente imagen98o
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En ciertas realizaciones, la composición de lipidoide aminoalcohólico es una composición que contiene uno o más de los compuestos lipidoides aminoalcohólicos anteriores.
En ciertas realizaciones, el compuesto lipidoide aminoalcohólico o la composición que contiene una mezcla de compuestos lipidoides aminoalcohólicos se prepara al hacer reaccionar la amina 205
imagen100
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con un compuesto terminado en epóxido C12. En ciertas realizaciones, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos derivados de la amina 205 (es decir, C12-205) y sus diversos posibles isómeros son de las fórmulas posteriores:
5 colas 3 colas 2 colas
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imagen103
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imagen105
imagen106
imagen107
1 cola
imagen108
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En ciertas realizaciones, cada es independientemente imagen111o
imagen112
En ciertas realizaciones, la composición de lipidoide aminoalcohólico es una composición que contiene uno o más de los compuestos lipidoides aminoalcohólicos anteriores.
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5 En ciertas realizaciones, el lipidoide aminoalcohólico es de la fórmula En ciertas realizaciones, el compuesto lipidoide aminoalcohólico es de la fórmula
10 En ciertas realizaciones, la composición de lipidoide aminoalcohólico es una composición que contiene uno o mas de los compuestos lipidoides aminoalcohólicos anteriores.
2. Síntesis de compuestos lipidoides aminoalcohólicos
Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención se pueden preparar mediante cualquier método conocidos en la técnica. Preferiblemente, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos se preparan a partir de 15 materias primas disponibles comercialmente, tales como compuestos con epóxido terminal, compuestos con epóxido interior y aminas. En otra realización, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos se preparan a partir de materias primas preparadas fácilmente y/o económicamente. Como sería apreciado por un experto en la técnica, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención se pueden preparar mediante síntesis total partiendo de materias primas disponibles comercialmente. Un compuesto lipidoide aminoalcohólico particular puede ser el
20 producto final de la síntesis, o una mezcla de compuestos lipidoides aminoalcohólicos puede ser el producto final deseado.
En ciertas realizaciones, el compuesto lipidoide aminoalcohólico de la invención se prepara al hacer reaccionar una amina con un compuesto terminado en epóxido. Un esquema de reacción ejemplar se muestra en la Figura 1.
25 Cualquier amina que contenga entre una, dos y cinco funcionalidades amina es útil para preparar compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención. Aminas útiles en esta invención incluyen, pero no se limitan a, metilamina, etilamina, isopropilamina, anilina, anilinas sustituidas, etanolamina, decilamina, undecilamina, dodecilamina, tetradecilamina, hexadecilamina y octadecilamina. La amina puede ser una bis(amina primaria)
30 incluyendo, pero no limitada a, etilendiamina, 1,3 diaminopropano, 1,4 diaminobutano, 1,5 diaminopentano, 1,6diaminohexano, 2,2'(etilendioxi)bis(etilamina). La amina puede ser una bis(amina secundaria). Aminas secundarias útiles en esta invención incluyen, pero no se limitan a, dipropilamina y metilpentilamina. La amina puede incluir aminas tanto primarias como secundarias incluyendo, pero no limitadas a, (2-aminoetil)etanolamina, dietilentriamina y trietilentetramina. Preferiblemente, la amina está disponible comercialmente. En ciertas realizaciones, la amina es
35 estereoquímicamente pura (p. ej., enantiómeramente puras).
imagen114
Las aminas usadas en el método de la invención para formar compuestos lipidoides aminoalcohólicos son de la fórmula:
imagen115
Compuestos terminados en epóxido incluyen cualesquiera compuestos terminados en epóxido que sean racémicos
o estereoisómeros de los mismos, todos de longitudes de cadena variables y presentan grupos funcionales únicos que tienen grados de saturación variables. En ciertas realizaciones, el epóxido es estereoquímicamente puro (p. ej., enantiómeramente puro). En ciertas realizaciones, el epóxido contiene uno o más centros quirales. el compuesto terminado en epóxido es de la fórmula:
imagen116
terminado en epóxido es de la fórmula:
.
En ciertas realizaciones, el compuestos terminado en epóxido es de la fórmula:
En ciertas realizaciones, el epóxido puede contener uno o más centros quirales, tal como se muestra 15 posteriormente:
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* No reivindicado 20
En ciertas realizaciones, el epóxido enantiómero
imagen118se resuelve de la mezcla racémica de epóxidos usando resolución cinética hidrolítica (HKR) catalizada con el catalizador de HKR (R,R) de la fórmula:
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En realizaciones adicionales, el epóxido enantiómero
imagen121se resuelve de la mezcla racémica de epóxidos usando resolución cinética hidrolítica (HKR) catalizada con el catalizador de HKR (S,S) de la fórmula:
imagen122
Los epóxidos quirales útiles en la invención se pueden obtener de una variedad de fuentes que son familiares para los expertos en la técnica de la síntesis orgánica. En algunas realizaciones, los epóxidos quirales útiles en la 5 invención se pueden obtener comercialmente. En algunas realizaciones, los epóxidos quirales útiles en la invención se pueden sintetizar según métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como, pero no limitadas a, la epoxidación de Sharpless de alcoholes alílicos primarios y secundarios en 2,3-epoxialcoholes (Katsuki, y cols., J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 5974; Hill y cols., Org. Syn., Coll. Vol. 7, p.461 (1990); Vol. 63, p.66 (1985) y Katsuki y cols., Org. React. 1996, 48, 1-300). En algunas realizaciones, los epóxidos quirales útiles en la invención se obtienen
10 a partir de la resolución de epóxidos racémicos. En algunas realizaciones, los epóxidos quirales útiles en la invención se obtienen mediante la separación de enantiómeros o diastereoisómeros en columnas quirales.
En ciertas realizaciones, la reacción se realiza neta sin el uso de un disolvente. En otras realizaciones, se usa un disolvente para la reacción. Ambos o uno de la amina de partida o el amina o el compuesto terminado en epóxido se 15 disuelve en un disolvente orgánico (p. ej., THF, CH2Cl2, MeOH, EtOH, CHCl3, hexanos, tolueno, benceno, CCl4, glime, éter dietílico, etc.). Las soluciones resultantes se combinan y la mezcla de reacción se calienta para dar el compuesto lipidoide aminoalcohólico deseado. En ciertas realizaciones, la mezcla de reacción se calienta hasta una temperatura que varía de 25°C a 100°C, preferiblemente a aproximadamente 90°C. La reacción también se puede catalizar. Por ejemplo, la reacción se puede catalizar mediante la adición de un ácido, una base o un metal. Los
20 reactivos se pueden dejar reaccionar durante horas, días o semanas. Preferiblemente, la reacción se deja avanzar desde durante la noche (p. ej., 8-12 horas) hasta 7 días.
Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos sintetizados se pueden purificar mediante cualquier técnica conocida en la especialidad incluyendo, pero no limitada a, precipitación, cristalización, cromatografía, destilación, etc. En ciertas 25 realizaciones, el compuesto lipidoide aminoalcohólico se purifica a través de precipitaciones repetidas en disolvente orgánico (p. ej., éter dietílico, hexano, etc.). En ciertas realizaciones, el compuesto lipidoide aminoalcohólico se aísla como una sal. El compuesto lipidoide aminoalcohólico se hace reaccionar con un ácido (p. ej., un ácido orgánico o un ácido inorgánico) para formar la sal correspondiente. En ciertas realizaciones, la amina terciaria se alquila para formar una sal de amonio cuaternario del compuesto lipidoide aminoalcohólico. Las aminas terciarias se pueden
30 alquilar con cualquier agente alquilante, por ejemplo, haluros de alquilo tales como yoduro de metilo se pueden usar para formar grupos amino cuaternario. El anión asociado con la amina cuaternaria puede ser cualquier anión orgánico o inorgánico. Preferiblemente, el anión es un anión farmacéuticamente aceptable.
En ciertas realizaciones, la mezcla de reacción da como resultado una mezcla de isómeros con números y
35 posiciones variables de colas de compuesto derivado de epóxido. Estas mezclas de productos o compuestos se pueden usar como tales, o un solo isómero, o compuesto, se puede purificar de la mezcla de reacción. Cuando una amina no se alquila exhaustivamente, las aminas primarias, secundarias o terciarias resultantes se pueden hacer reaccionar adicionalmente con otro compuesto lipidoide aminoalcohólico, compuesto terminado en epóxido u otro electrófilo. A continuación, el compuesto lipidoide aminoalcohólico resultante se puede purificar opcionalmente.
40 En ciertas realizaciones, un compuesto lipidoide aminoalcohólico deseado se prepara mediante síntesis total tradicional. En ciertas realizaciones, una amina disponible comercialmente es la materia prima. Uno o más grupos amino de la amina se protegen opcionalmente. Los grupos amino desprotegidos se hacen reaccionar con un compuesto terminado en epóxido. El producto se purifica opcionalmente. Los grupos protectores se retiran y los
45 grupos amino se hacen reaccionar opcionalmente con otro compuesto lipidoide aminoalcohólico, compuesto terminado en epóxido u otro electrófilo. Esta secuencia se puede repetir dependiendo de la complejidad deseada del producto de la invención que se prepare. A continuación, el producto final se puede purificar opcionalmente.
En una realización, se prepara en paralelo una biblioteca de diferentes compuestos lipidoides aminoalcohólicos. A
50 Se añade una amina y/o un compuesto terminado en epóxido diferentes a cada vial en un grupo de viales o a cada pocillo de una placa de múltiples pocillos usada para preparar la biblioteca. La serie de mezclas de reacción se incuba a una temperatura y una longitud de tiempo suficientes para permitir que se produzca la formación de los compuestos lipidoides aminoalcohólicos. En una realización, los viales se incuban a aproximadamente 90°C durante la noche. En ciertas realizaciones, los viales se incuban de 1 a 7 días a aproximadamente 90°C. En ciertas
55 realizaciones, los viales se incuban de 3 a 4 días a aproximadamente 90°C. En ciertas realizaciones, los viales se incuban de 1 a 2 días a aproximadamente 90°C. A continuación, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos se pueden aislar y purificar usando técnicas conocidas en la especialidad. A continuación, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos se pueden cribar usando técnicas de alto rendimiento para identificar compuestos lipidoides aminoalcohólicos con una característica deseada (p. ej., solubilidad en agua, solubilidad a diferente pH, capacidad para unirse a polinucleótidos, capacidad para unirse a heparina, capacidad para unirse a moléculas pequeñas, capacidad para unirse a proteína, capacidad para formar micropartículas, capacidad para incrementar la eficacia de transfección, etc.). En ciertas realizaciones, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos se pueden cribar con respecto a propiedades o características útiles en una terapia génica (p. ej., capacidad para unirse a polinucleótidos,
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5 incremento en la eficacia de transfección).
3. Complejos polinucleotídicos
La capacidad de los compuestos catiónicos para interactuar con polinucleótidos cargados negativamente a través de interacciones electrostáticas es muy conocida. Lípidos catiónicos tales como Lipofectamine se han preparado y estudiado con respecto a su capacidad para complejar y transfectar polinucleótidos. Se cree que la interacción del
10 lípido con el polinucleótido evita al menos parcialmente la degradación del polinucleótido. Al neutralizar la carga de la cadena principal del polinucleótido, el complejo neutro o ligeramente cargado positivamente también es capaz de atravesar más fácilmente las membranas hidrófobas (p. ej., citoplásmica, liposómica, endosómica, nuclear) de la célula. En ciertas realizaciones, el complejo está ligeramente cargado positivamente. En ciertas realizaciones, el complejo tiene un potencial ζ positivo, más preferiblemente el potencial ζ está entre 0 y +30.
15 Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la presente invención poseen aminas terciarias. Aunque estas aminas están impedidas, están disponibles para interactuar con un polinucleótido (p. ej., ADN, ARN, análogos sintéticos de ADN y/o ARN, híbridos de ADN/ARN, etc.). Los polinucleótidos o derivados de los mismos se ponen en contacto con los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención bajo condiciones adecuadas para formar
20 complejos de polinucleótido/lipidoide. El lipidoide preferiblemente está al menos parcialmente protonado a fin de formar un complejo con el polinucleótido cargado negativamente. En ciertas realizaciones, los complejos de polinucleótido/lipidoide forman partículas que son útiles en el aporte de polinucleótidos a células. En ciertas realizaciones, múltiples moléculas de lipidoide aminoalcohólico se pueden asociar con una molécula de polinucleótido. El complejo puede incluir 1-100 moléculas de lipidoide aminoalcohólico, 1-1000 moléculas de
25 lipidoide aminoalcohólico, 10-1000 moléculas de lipidoide aminoalcohólico o 100-10.000 moléculas de lipidoide aminoalcohólico.
En ciertas realizaciones, el complejo puede formar una partícula. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de 10-500 micrómetros. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de 10-1200 30 micrómetros. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de 50-150 micrómetros. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de 10-500 nm, más preferiblemente el diámetro de las partículas varía de 10-1200 nm y lo más preferiblemente de 50-150 nm. Las partículas se pueden asociar con un agente de elección de diana según se describe posteriormente. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de 10-500 pm, más preferiblemente el diámetro de las partículas varía de 10-1200 pm y lo más preferiblemente de 50
35 150 pm. Las partículas se pueden asociar con un agente de elección de diana según se describe posteriormente.
4. Polinucleótido
El polinucleótido que se va a complejar, encapsulado por los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención, o incluido en una composición con los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención, puede ser cualquier ácido nucleico incluyendo, pero no limitado a, ARN y ADN. En ciertas realizaciones, el polinucleótido es
40 ADN. En ciertas realizaciones, el polinucleótido es ARN.
En ciertas realizaciones, el polinucleótido es un ARN que lleva a cabo interferencia de ARN (iARN). El fenómeno de iARN se analiza con más detalle, por ejemplo, en las siguientes referencias: Elbashir y cols., 2001, Genes Dev., 15:188; Fire y cols., 1998, Nature, 391:806; Tabara y cols., 1999, Cell, 99:123; Hammond y cols., Nature, 2000,
45 404:293; Zamore y cols., 2000, Cell, 101:25; Chakraborty, 2007, Curr. Drug Targets, 8:469; y Morris y Rossi, 2006, Gene Ther., 13:553.
En ciertas realizaciones, el polinucleótido es un ARNds (ARN de doble hebra).
50 En ciertas realizaciones, el polinucleótido es un ARNsi (ARN interferente corto).
En ciertas realizaciones, el polinucleótido es un ARNsh (ARN de horquilla corto).
En ciertas realizaciones, el polinucleótido es un miARN (microARN). Los microARNs (miARNs) son ARNs no
55 codificantes codificados genómicamente de alrededor de 21 -23 nucleótidos de longitud que ayuda a regular la expresión génica, particularmente durante el desarrollo (véase, p. ej., Bartel, 2004, Cell, 116:281; Novina y Sharp, 2004, Nature, 430:161; y la Publicación de Patente de EE. UU. 2005/0059005; también revisado en Wang y Li, 2007, Front. Biosci., 12:3975; y Zhao, 2007, Trends Biochem. Sci., 32:189).
60 En ciertas realizaciones, el polinucleótido es un ARN antisentido.
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En algunas realizaciones, un ARNds, ARNsi, ARNsh, miARN y/o ARN antisentido se puede diseñar y/o predecir usando uno o más de un gran número de algoritmos disponibles. Por dar solo unos pocos ejemplos, se pueden utilizar los siguientes recursos para diseñar y/o predecir ARNds, ARNsi, ARNsh y/o miARN: algoritmos encontrados 5 en Alnilum en línea, Dharmacon en línea, OligoEngine en línea, Molecula en línea, Ambion en línea, BioPredsi en línea, RNAi Web en línea, Chang Bioscience en línea, Invitrogen en línea, LentiWeb en línea GenScript en línea, Protocol en línea; Reynolds y cols., 2004, Nat. Biotechnol., 22:326; Naito y cols., 2006, Nucleic Acids Res., 34:W448; Li y cols., 2007, RNA, 13:1765; Yiu y cols., 2005, Bioinformatics, 21:144; y Jia y cols., 2006, BMC Bioinformatics, 7:
271.
Los polinucleótidos pueden ser de cualquier tamaño o secuencia, y pueden ser de una sola hebra o de doble hebra. En ciertas realizaciones, el polinucleótido tiene una longitud de más de 100 pares de bases. En ciertas realizaciones, el polinucleótido tiene una longitud de más de 1000 pares de bases y puede tener una longitud de más de 10.000 pares de bases. El polinucleótido está opcionalmente purificado y es sustancialmente puro. Preferiblemente, el
15 polinucleótido es más de 50% puro, más preferiblemente más de 75% puro y lo más preferiblemente más de 95% puro. El polinucleótido se puede proporcionar mediante cualquier medio conocido en la técnica. En ciertas realizaciones, el polinucleótido se ha manipulado usando técnicas recombinantes (para una descripción más detallada de estas técnicas, por favor véase Ausubel y cols. Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1999); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989). El polinucleótido también se puede obtener a partir de fuentes naturales y purificarse de componentes contaminantes encontrados normalmente en la naturaleza. El polinucleótido también se puede sintetizar químicamente en un laboratorio. En ciertas realizaciones, el polinucleótido se sintetiza usando química en fase sólida estándar.
25 El polinucleótido se puede modificar por medios químicos o biológicos. En ciertas realizaciones, estas modificaciones conducen a un incremento de la estabilidad del polinucleótido. Modificaciones incluyen metilación, fosforilación, protección terminal, etc.
También se pueden usar en la presente invención derivados de polinucleótidos. Estos derivados incluyen modificaciones en las bases, los azúcares y/o los enlaces fosfato del polinucleótido. Bases modificadas incluyen, pero no se limitan a, las encontradas en los siguientes análogos nucleosídicos: 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5propiniluridina, C5-propinilcitidina, C5-metilcitidina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8oxoguanosina, O(6)-metilguanina y 2-tiocitidina. Azúcares modificados incluyen, pero no se limitan a, 2'
35 fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, 3'-azido-2',3'-didesoxirribosa, 2',3'-didesoxirribosa, arabinosa (el epímero 2' de ribosa), azúcares acíclicos y hexosas. Los nucleósidos pueden estar ensartados por enlaces distintos al enlace fosfodiéster encontrado en ADN y ARN presente en la naturaleza. Enlaces modificados incluyen, pero no se limitan a, enlaces fosforotioato y 5'-N-fosforamidita. Se pueden usar combinaciones de las diversas modificaciones en un solo polinucleótido. Estos polinucleótidos modificados se pueden proporcionar mediante cualquier medio conocido en la técnica; sin embargo, como será apreciado por los expertos en esta técnica, los polinucleótidos modificados se preparan preferiblemente usando química sintética in vitro.
Los polinucleótidos que se van a aportar pueden estar en cualquier forma. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser un plásmido circular, un plásmido linealizado, un cósmido, un genoma viral, un genoma viral modificado, un
45 cromosoma artificial, etc.
El polinucleótido puede ser de cualquier secuencia. En ciertas realizaciones, el polinucleótido codifica una proteína o un péptido. Las proteínas codificadas pueden ser enzimas, proteínas estructurales, receptores, receptores solubles, canales iónicos, proteínas farmacéuticamente activas, citocinas, interleucinas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, antígenos, factores de coagulación, albúmina, factores de crecimiento, hormonas, insulina, etc. El polinucleótido también pueden comprender regiones reguladoras para controlar la expresión de un gen. Estas regiones reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, promotores, elementos potenciadores, elementos represores, una secuencia TATA, sitios de unión ribosómica, un sitio de finalización para la transcripción, etc. En ciertas realizaciones, el polinucleótido no está destinado a codificar una proteína. Por ejemplo, el polinucleótido se
55 puede usar para fijar un error en el genoma de la célula que se transfecta.
El polinucleótido también se puede proporcionar como un agente antisentido o interferencia de ARN (iARN) (Fire y cols. Nature 391:806-811, 1998; incorporado en la presente mediante referencia). Se entiende que la terapia antisentido incluye, p. ej., la administración o el suministro in situ de oligonucleótidos de una sola hebra o de doble hebra o sus derivados que se hibridan específicamente, p. ej., se unen, bajo condiciones celulares, con ARNm celular y/o ADN genómico, o mutantes de loa mismos, a fin de inhibir la expresión de la proteína codificada, p. ej., al inhibir la transcripción y/o la traducción (Crooke "Molecular mechanisms of action of antisense drugs" Biochim. Biophys. Acta 1489(1):31-44, 1999; Crooke "Evaluating the mechanism of action of antiproliferative antisense drugs" Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10(2):123-126, análisis 127, 2000; Methods in Enzymology volúmenes 313-314, 65 1999). La unión puede ser por complementariedad de pares de bases convencional, o, por ejemplo, en el caso de la
5
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unión a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en la hendidura mayor de la doble hélice (es decir, formación de la triple hélice) (Chan y cols. J. Mol. Med. 75(4):267-282, 1997).
En ciertas realizaciones, el polinucleótido que se va a aportar comprende una secuencia que codifica un péptido o una proteína antigénicos. Nanopartículas que contienen estos polinucleótidos se pueden aportar a un individuo para inducir una respuesta inmunológica suficiente para disminuir la probabilidad de infección posterior y/o reducir los síntomas asociados con esta infección. El polinucleótido de estas vacunas se puede combinar con interleucinas, interferón, citocinas y adyuvantes tales como toxina del cólera, alumbre, adyuvante de Freund, etc. Se conoce un gran número de compuestos adyuvantes; un compendio útil se muchos de estos compuestos está preparado por the National Institutes of Health y se puede encontrar en Internet (www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendium.pdf ; véase además Allison Dev. Biol. Stand. 92:3-11, 1998; Unkeless y cols. Annu. Rev. Immunol. 6:251-281, 1998; y Phillips y cols. Vaccine 10:151-158, 1992).
La proteína o los péptidos antigénicos codificados por el polinucleótido se pueden derivar de organismos bacterianos tales como Streptococccus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphilococcus aureus, Streptococcus pirogenes, Corynebacterium diphtheria, Listeria monocytogenes, Bacillus antracis, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhocae, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Haemophilus parainfluenzae, Bordetella pertussis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Leptospirosis interrogans, Borrelia burgdorferi, Camphilobacter jejuni y similares; de virus como viruela, gripe A y B, virus sincitial respiratorio, paragripe, sarampión, VIH, varicela-zóster, herpes simple 1 y 2, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, rotavirus, rinovirus, adenovirus, papilomavirus, poliovirus, paperas, rabia, rubeola, virus de Coxsackie, encefalitis equina, encefalitis japonesa, fiebre amarilla, fiebre de Rift Valley, virus de la hepatitis A, B, C, D y E y similares; y de hongos, protozoos y organismos parasitarios tales como Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroids, Rickettsia ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis, Schistosoma mansoni y similares.
5. Partículas
Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la presente invención también se pueden usar para formar dispositivos de aporte de fármacos. Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención se pueden usar para encapsular agentes que incluyen polinucleótidos, moléculas pequeñas, proteínas, péptidos, metales, compuestos organometálicos, etc. Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención tienen varias propiedades que los hacen particularmente adecuados en la preparación de dispositivos de aporte de fármacos. Estos incluyen: 1) la capacidad del lípido para complejar y "proteger" agentes lábiles; 2) la capacidad para tamponar el pH en el endosoma; 3) la capacidad para actuar como una "esponja protónica" y provocar endosomolisis; y 4) la capacidad para neutralizar la carga en agentes cargados negativamente. En ciertas realizaciones, los compuestos lipidoides aminoalcohólicos se usan para formar partículas que contienen el agente que se va a aportar. Estas partículas pueden incluir otros materiales tales como proteínas, carbohidratos, polímeros sintéticos (p. ej., PEG, PLGA) y polímeros naturales.
En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de entre 1 micrómetro y 1.000 micrómetros. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de entre 1 micrómetro y 100 micrómetros. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de entre 1 micrómetro y 10 micrómetros. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de entre 10 micrómetro y 100 micrómetros. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de entre 100 micrómetros y 1.000 micrómetros. En ciertas realizaciones, las partículas varían de 1-5 micrómetros. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de entre 1 nm y 1,000 nm. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de entre 1 nm y 100 nm. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de entre 1 nm y 10 nm. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de entre 10 nm y 100 nm. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de entre 100 nm y 1,000 nm. En ciertas realizaciones, las partículas varían de 1-5 nm. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de entre 1 pm y 1.000 pm. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de entre 1 pm y 100 pm. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de entre 1 pm y 10 pm. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de entre 10 pm y 100 pm. En ciertas realizaciones, el diámetro de las partículas varía de entre 100 pm y 1.000 pm. En ciertas realizaciones, las partículas varían de 1-5 pm.
6. Métodos para preparar partículas
Las partículas de la invención se pueden preparar usando cualquier método conocido en esta técnica. Estas incluyen, pero no se limitan a, secado por pulverización, evaporación de disolvente de emulsión simple y doble, extracción con disolvente, separación de fases, coacervación simple y compleja y otros métodos muy conocidos por los expertos normales en la técnica. En ciertas realizaciones, métodos para preparar las partículas son el
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procedimiento de doble emulsión y secado por pulverización. Las condiciones usadas para preparar las partículas se pueden alterar para dar partículas de un tamaño o una propiedad deseados (p. ej., hidrofobia, hidrofilia, morfología externa, "adherencia", conformación, etc.). El método para preparar la partícula y las condiciones (p. ej., disolvente, temperatura, concentración, caudal de aire, etc.) usado también puede depender del agente que esté encapsulado y/o la composición de la matriz.
Métodos desarrollados para elaborar partículas para el aporte de los agentes encapsulados se describen en la bibliografía (por ejemplo, por favor, véase Doubrow, M., Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy”, CRC Press, Boca Raton, 1992; Matiowitz y Langer, J. Controlled Release 5:13-22, 1987; Matiowitz y cols. Reactive Polymers 6:275-283, 1987; Matiowitz y cols. J. Appl. Polymer Sci. 35:755-774, 1988).
Si las partículas preparadas mediante cualquiera de los métodos tienen un intervalo de tamaño fuera del intervalo deseado, las partículas se pueden dimensionar, por ejemplo, usando un tamiz. La partícula también se puede revestir. En ciertas realizaciones, las partículas se revisten con un agente de elección de diana. En otras realizaciones, las partículas se revisten para alcanzar propiedades superficiales deseadas (p. ej., una carga particular).
7. Micelas y liposomas
Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención se pueden usar para preparar micelas o liposomas. Se conocen en la especialidad muchas técnicas para preparar micelas y liposomas, y cualquier método se puede usar con los compuestos lipidoides aminoalcohólicos de la invención para elaborar micelas y liposomas. Además, cualquier agente incluyendo polinucleótidos, moléculas pequeñas, proteínas, péptidos, metales, compuestos organometálicos, etc. se pueden incluir en una micela o un liposoma. Las micelas y los liposomas son particularmente útiles para aportar agentes hidrófobos tales como moléculas pequeñas hidrófobas.
En ciertas realizaciones, los liposomas (vesículas de lípido o compuesto lipidoide aminoalcohólico) se forman a través de un ensamblaje espontáneo. En otras realizaciones, los liposomas se forman cuando películas lipídicas delgadas o tortas lipídicas se hidratan y pilas de bicapas cristalinas lipídicas se hacen fluidas u se hinchan. Las láminas lipídicas hidratadas se separan durante la agitación y se autocierran para formar vesículas multilaminares grandes (LMV). Esto impide la interacción de agua con el núcleo hidrocarbonado de las bicapas en los bordes. Una vez que se han formado estas partículas, la reducción del tamaño de la partícula se puede modificar a través de la introducción de energía sónica (ultrasónicos) o energía mecánica (extrusión). Véanse Walde, P. "Preparation of Vesicles (Liposomes)" en Encilopedia of Nanoscience and Nanotechnology; Nalwa, H. S. Ed. American Scientific Publishers: Los Angeles, 2004; Vol. 9, pp. 43-79; Szoka y cols. "Comparative Properties and Methods of Preparation of Lipid Vesicles (Liposomes)" Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467-508, 1980. La preparación de liposomas implica preparar los compuestos lipidoides aminoalcohólicos para la hidratación, hidratar los compuestos lipidoides aminoalcohólicos con agitación y dimensionar la vesículas para alcanzar una distribución homogénea de liposomas. Los compuestos lipidoides aminoalcohólicos se disuelven en primer lugar en un disolvente orgánicos para asegurar una mezcla homogénea de compuestos lipidoides aminoalcohólicos. A continuación, el disolventes se retira para formar una película lipidoide. Esta película se seca a fondo para retirar disolvente orgánico residual al poner el vial o el matraz en una bomba de vacío durante la noche. La hidratación de la película/torta lipidoide se efectúa al añadir una mezcla acuosa al recipiente de lipidoide seco y agitar la mezcla. La ruptura de dispersiones de LMV usando energía sónica produce típicamente vesículas unilaminares pequeñas (SUV) con diámetros en el intervalo de 15-50 nm. La extrusión de lípidos es una técnica en la que una suspensión de lípido se fuerza a través de una película de policarbonato con un tamaño de poro definido para dar partículas que tienen un diámetro cercano al tamaño de poro del filtro usado. La extrusión a través de filtros con poros de 100 nm da típicamente vesículas unilaminares grandes (LUV) con un diámetro medio de 120-140 nm.
En ciertas realizaciones, el polinucleótido es una molécula de ARN (p. ej., una molécula de ARNi). En otras realizaciones, el polinucleótido es una molécula de ADN. En ciertas realizaciones, el lipidoide aminoalcohólico es C14-120. En ciertas realizaciones, el lipidoide aminoalcohólico es C16-120. En ciertas realizaciones, el lipidoide aminoalcohólico es C14-98. En ciertas realizaciones, el lipidoide aminoalcohólico es C14-113. En ciertas realizaciones, el lipidoide aminoalcohólico es C18-96. En ciertas realizaciones, el lipidoide aminoalcohólico es C14
96. En ciertas realizaciones, el lipidoide aminoalcohólico es C14-110. En ciertas realizaciones, la cantidad de compuesto lipidoide aminoalcohólico en el liposoma varía de 30-80% en moles, preferiblemente 40-70% en moles, más preferiblemente 60-70% en moles. Estos liposomas se pueden preparar usando cualquier método conocido en la técnica. En ciertas realizaciones (p. ej., liposomas que contienen moléculas de ARNi), los liposomas se preparan mediante extrusión de lípidos.
Ciertos compuestos lipidoides aminoalcohólicos pueden autoensamblarse espontáneamente alrededor de ciertas moléculas, tales como ADN y ARN, para formar liposomas. En algunas realizaciones, la aplicación es el aporte de polinucleótidos. El uso de estos compuestos lipidoides aminoalcohólicos permite el ensamblaje simple de liposomas sin la necesidad de etapas o dispositivos adicionales tales como una extrusora.
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Los siguientes documentos científicos describían otros métodos para preparar liposomas y micelas: Narang y cols. "Cationic Lipids with Increased DNA Binding Affinity for Nonviral Gene Transfer in Dividing and Nondividing Cells" Bioconjugate Chem. 16:156-68, 2005; Hofland y cols. "Formation of stable cationic lipid/DNA complexes for gene transfer" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7305-7309, julio 1996; Byk y cols. "Synthesis, Activity, and Structure-Activity
5 Relationship Studies of Novel Cationic Lipids for DNA Transfer" J. Med. Chem. 41(2):224-235, 1998; Wu y cols. "Cationic Lipid Polymerization as a Novel Approach for Constructing New DNA Delivery Agents" Bioconjugate Chem. 12:251-57, 2001; Lukyanov y cols. "Micelles from lipid derivatives of water-soluble polymers as delivery systems for poorly soluble drugs" Advanced Drug Delivery Reviews 56:1273-1289, 2004; Tranchant y cols. "Physicochemical optimisation of plasmid delivery by cationic lipids" J. Gene Med. 6:S24-S35, 2004; van Balen y cols. "Liposome/Water Lipophilicity: Methods, Information Content, and Pharmaceutical Applications" Medicinal Research Rev. 24(3):299324, 2004.
8. Agente
Los agentes que van a ser aportados por el sistema de la presente invención pueden ser agentes terapéuticos, diagnósticos o profilácticos. Cualquier compuesto químico que se vaya a administrar a un individuo se puede aportar
15 usando los complejos, las picopartículas, las nanopartículas, las micropartículas, las micelas o los liposomas de la invención. El agente puede ser una molécula pequeña, un compuesto organometálico, un ácido nucleico, una proteína, un péptido, un polinucleótido, un metal, un compuesto químico isotópicamente marcado, un fármaco, una vacuna, un agente inmunológico, etc.
En ciertas realizaciones, los agentes son compuestos orgánicos con actividad farmacéutica. En otra realización de la invención, el agente es un fármaco clínicamente usado. En ciertas realizaciones, el fármaco es un antibiótico, un agente antiviral, un anestésico, un agente esteroideo, un agente antiinflamatorio, un agente antineoplástico, un antígeno, una vacuna, un anticuerpo, un descongestivo, un antihipertensivo, un sedante, un agente anticonceptivo, un agente progestacional, un anticolinérgico, un analgésico, un antidepresivo, un antipsicótico, un agente bloqueante
25 β-adrenérgico, un diurético, un agente cardiovascularmente activo, un agente vasoactivo, un agente antiinflamatorio no esteroideo, un agente nutricional, etc.
En ciertas realizaciones de la presente invención, el agente que se va a aportar puede ser una mezcla de agentes.
Los agentes diagnósticos incluyen gases; metales; pigmentos de formación de imágenes disponibles comercialmente usados en tomografía de emisión de positrones (PET), tomografía asistida por ordenador (CAT), tomografía digital de emisión de un solo fotón, rayos X, fluoroscopía y obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI); y agentes de contraste. Ejemplos de materiales adecuados para el uso como agentes de contraste en MRI incluyen quelatos de gadolinio, así como hierro, magnesio, manganeso, cobre y cromo. Ejemplos de
35 materiales útiles para CAT y obtención de imágenes por rayos X incluyen materiales basados en yodo.
Los agentes profilácticos incluyen, pero no se limitan a, antibióticos, complementos nutricionales y vacunas. Las vacunas pueden comprender proteínas o péptidos aislados, organismos y virus inactivados, organismos y virus muertos, organismos o virus genéticamente alterados y extractos celulares. Los agentes profilácticos se pueden combinar con interleucinas, interferón, citocinas y adyuvantes tales como toxina del cólera, alumbre, adyuvante de Freund, etc. Los agentes profilácticos incluyen antígenos de organismos bacterianos tales como Streptococccus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphilococcus aureus, Streptococcus pirogenes, Corynebacterium diphtheriae, Listeria monocytogenes, Bacillus antracis, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa, 45 Salmonella typhi, Haemophilus parainfluenzae, Bordetella pertussis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Leptospirosis interrogans, Borrelia burgdorferi, Camphilobacter jejuni y similares; antígenos de virus tales como viruela, gripe A y B, virus sincitial respiratorio, paragripe, sarampión, VIH, varicela-zóster, herpes simple 1 y 2, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, rotavirus, rinovirus, adenovirus, papilomavirus, poliovirus, paperas, rabia, rubeola, virus de Coxsackie, encefalitis equina, encefalitis japonesa, fiebre amarilla, fiebre de Rift Valley, virus de la hepatitis A, B, C, D y E y similares; antígenos de hongos, protozoos y organismos parasitarios tales como Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroids, Rickettsia ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis,
55 Schistosoma mansoni y similares. Estos antígenos pueden estar en la forma de organismos totalmente destruidos, péptidos, proteínas, glicoproteínas, carbohidratos o combinaciones de los mismos.
9. Agentes de elección de diana
Los complejos, los liposomas, las micelas, las micropartículas, las picopartículas y las nanopartículas de la invención se pueden modificar para incluir agentes de elección de diana ya que a menudo es deseable elegir como diana una célula, conjunto de células o tejido particular. Se conoce en la técnica una variedad de agentes de elección de diana
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que dirigen las composiciones farmacéuticas a células particulares (véase, por ejemplo, Cotten y cols. Methods Enzym. 217:618, 1993). Los agentes de elección de diana pueden estar incluidos en toda la partícula o pueden estar solamente sobre la superficie. El agente de elección de diana puede ser una proteína, un péptido, un carbohidrato, una glicoproteína, un lípido, una molécula pequeña, ácidos nucleicos, etc. El agente de elección de diana se puede 5 usar para elegir como diana células o tejidos específicos o se puede usar para promover la endocitosis o fagocitosis de la partícula. Ejemplos de agentes de elección de diana incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, lipoproteínas de baja densidad (LDLs), transferrina, asialicoproteínas, proteína de envuelta gp120 del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), carbohidratos, ligandos de receptores, ácido siálico, aptámeros, etc. Si el agente de elección de diana está incluido en toda la partícula, el agente de elección de diana puede estar incluido
10 en la mezcla que se usa para formar las partículas. Si el agente de elección de diana solo está sobre la superficie, el agente de elección de diana se puede asociar con (es decir, mediante interacciones covalentes, hidrófobas, por enlace de hidrógeno, de van der Waals u otras) las partículas formadas usando técnicas químicas estándar.
10. Composiciones farmacéuticas
Una vez que se han preparado los complejos, las micelas, los liposomas o las partículas, se pueden combinar con
15 uno o más excipientes farmacéuticos para formar una composición farmacéutica que sea adecuada para administrar a animales incluyendo seres humanos. Como será apreciado por un experto en esta técnica, los excipientes se pueden elegir basándose en la vía de administración que se describe posteriormente, el agente que se aporte, el transcurso del tiempo del aporte del agente, etc.
20 Las composiciones farmacéuticas de la presente invención y para el uso según la presente invención pueden incluir un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. Según se usa en la presente, el término "portador farmacéuticamente aceptable" significa una cargo, un diluyente, un material encapsulante o un auxiliar de la formulación de cualquier tipo, sólido, semisólido o líquido, atóxico inerte. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables son azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa;
25 almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de algodón; aceite de cártamo; aceite de sésamo; aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de soja; glicoles tales como propilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; detergentes tales como Tween 80;
30 agentes tamponadores tales como hidróxido magnésico e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; y soluciones tamponadoras de fosfato, así como otros lubricantes compatibles atóxicos tales como laurilsulfato sódico y estearato magnésico, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de revestimiento, agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en la composición, según el juicio del
35 formulador. Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar a seres humanos y/o a animales, oralmente, rectalmente, parenteralmente, intracisternalmente, intravaginalmente, intranasalmente, intraperitonealmente, tópicamente (como mediante polvos, cremas, pomadas o gotas), bucalmente o como un aerosol oral o nasal.
40 Las formas de dosificación líquidas para la administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los ingredientes activos (es decir, micropartículas, nanopartículas, liposomas, micelas, complejos de polinucleótido/lípido), las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes usados comúnmente en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de
45 etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácido graso de sorbitano, y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes.
50 Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, se pueden formular según la técnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable atóxico, por ejemplo, como una solución en 1,3
55 butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están agua, solución de Ringer, solución de cloruro sódico U.S.P. e isotónica. Además, aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como un disolvente o medio de suspensión. Con este propósito, se pueden emplear aceites fijos blandos incluyendo mono-o diglicéridos sintéticos. Además, se usan ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de productos inyectables. En ciertas realizaciones, las partículas se suspenden en un fluido portador que comprende
60 1% (p/v) de carboximetilcelulosa sódica y 0,1% (v/v) de Tween 80.
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Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, o al incorporar agentes esterilizantes en la forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes del uso.
5 Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que se pueden preparar al mezclar las partículas con excipientes o portadores no irritantes adecuados tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera para supositorios que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a la temperatura corporal y por lo tanto se funden en el recto o la cavidad vaginal y liberan las partículas.
10 Formas de dosificación sólidas para la administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En estas formas de dosificación sólidas, las partículas se mezclan con al menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable inerte tal como citrato sódico o fosfato dicálcico y/o a) cargas o extendedores tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa y goma arábiga, c) humectantes tales como
15 glicerol, d) agentes desintegrantes tales como agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato sódico, e) agentes retardadores de la disolución tales como parafina, f) aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales como caolín y arcilla bentonítica, y i) lubricantes tales como talco, estearato cálcico, estearato magnésico, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato sódico y
20 mezclas de los mismos. En el caso de las cápsulas, los comprimidos y las píldoras, la forma de dosificación también comprende agentes tamponadores.
Composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden emplear como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche así como polietilenglicoles de alto peso
25 molecular y similares.
Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos se pueden preparar con revestimientos y envueltas tales como revestimientos entéricos y otros revestimientos muy conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. Opcionalmente, pueden contener agentes opacificantes y también pueden ser de
30 una composición que solamente liberen el ingrediente o los ingredientes activos , o, preferentemente, en una cierta parte del tracto intestinal, opcionalmente de modo retardado. Ejemplos de composiciones de imbibición que se pueden usar incluyen sustancias poliméricas y ceras.
También se pueden emplear composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas
35 blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcar de la lecha así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de una composición farmacéutica de la invención incluyen pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, aerosoles, inhalantes o parches.
40 Las partículas se mezclan bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y cualesquiera conservantes o tampones necesarios que se puedan requerir. Una formulación oftálmica, gotas para los oídos y gotas oculares también se contemplan para estar dentro del alcance de esta invención.
Las pomadas, las pastas, las cremas y los geles pueden contener, además de las partículas de esta invención,
45 excipientes tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de cinc, o mezclas de los mismos.
Los polvos y los aerosoles pueden contener, además de las partículas de esta invención, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos cálcicos y polvo de poliamida, o mezclas de estas
50 sustancias. Los aerosoles pueden contener adicionalmente propelentes habituales tales como clorofluorohidrocarbonos.
Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar el aporte controlado de un compuesto al cuerpo. Estas formas de dosificación se pueden elaborar al disolver o distribuir las micropartículas o nanopartículas
55 en un medio apropiado. También se pueden usar potenciadores de la absorción para incrementar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad se puede controlar bien al proporcionar una membrana que controla la velocidad o bien al dispersar las partículas en una matriz de polímero o un gel.
Estos y otros aspectos de la presente invención se apreciarán adicionalmente al considerar los siguientes Ejemplos,
60 que están destinados a ilustrar ciertas realizaciones particulares de la invención pero no están destinados a limitar su alcances, que se define mediante las reivindicaciones. (Solamente las estructuras cubiertas por el alcance de las reivindicaciones forman parte de la invención)
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Ejemplos
Ejemplo 1
Síntesis y caracterización de 1,2-aminoalcoholes
Estos lipidoides se sintetizaron al combinar aminas y epóxidos en un vial de vidrio equipado con una barra de
5 agitación y se calentaron hasta 90°C, según se muestra en la Figura 1. Las aminas elegidas contienen entre dos y cinco funcionalidades amina, mientras que los epóxidos son racémicos, de longitudes de cadena variables y presentan grupos funcionales únicos y grados de saturación variables (Figura 2). Los tiempos de reacción variaban de 24 -72 horas a esta temperatura. Generalmente, las mezclas permanecían transparentes a lo largo de la reacción y se volvían notablemente viscosas a medida que avanzaba la reacción. Al enfriar, se convertían en sólidos cerosos.
10 El grado de la reacción se podía controlar mediante el número de equivalentes de epóxido añadido a la mezcla de reacción. Por ejemplo, en los ejemplos mostrados, la amina 114 tiene un máximo de cinco puntos para sustitución. La adición de cinco equivalentes de epóxido daría un núcleo de amina con cinco cadenas de alcano conectadas mediante un 1,2-aminoalcohol. La adición de cuatro equivalentes de epóxido daría solamente cuatro cadenas conectadas por la misma estructura. Esto se verificó mediante cromatografía en capa fina (TLC), que mostraba
15 principalmente un producto que existía en las mezclas de reacción en bruto establecidas según se describe.
Para verificar la identidad de las moléculas, una pocas reacciones de prueba se establecieron y se purificaron mediante cromatografía en gel de sílice. Los componentes de la mezcla de reacción en bruto se separaron y se probaron mediante NMR y espectrometría de masas. De nuevo, en el caso de la amina 114, se identificaron tres 20 productos: productos de tres, cuatro y cinco colas. El peso molecular se confirmó mediante espectrometría de masas, y la estructura se verificó mediante NMR (Figura 3, que muestra datos de caracterización de lipidoides epoxídicos derivados de la amina 114). A continuación, estos compuestos aislados se usaron como patrones frente a miembros seleccionados de la biblioteca para el análisis por TLC. Las reacciones establecidas para sustituir totalmente la amina tenían perfiles de Rf y tinción similares al patrón totalmente sustituido. Las reacciones
25 establecidas para ocupar las posiciones n-1 de la amina tenían perfiles de Rf y tinción similares al patrón n-1 (Figura4).
Ejemplo 2
Cribado in vitro para el aporte de ARN
Se probaron lipidoides epoxídicos con respecto a su capacidad para aportar ARNsi a una línea de células HeLa que
30 expresa establemente luciferasa tanto de luciérnaga como de Renilla. La eficacia se determinó al complejar el lipidoide con ARNsi específico para luciferasa de luciérnaga, añadir esta mezcla a las células y medir la relación posterior de la expresión de luciérnaga a Renilla. Este procedimiento se realizó en placas de microvaloración de 96 pocillos para permitir la prueba de alto rendimiento de los materiales. En este ensayo, la reducción de la expresión tanto de luciérnaga como de Renilla indica toxicidad, mientras que la reducción solamente de la expresión de
35 luciérnaga es una indicación de la atenuación específica debida a ARNsi. Resultados de cribado iniciales de miembros seleccionados de la biblioteca se muestran en la Figura 5. Muchos miembros de este muestreo mostraban alguna capacidad para transfectar células y dar lugar a alguna atenuación de luciferasa de luciérnaga. De estos, los que mejor se comportaban eran generalmente los lipidoides derivados de los epóxidos de 14 carbonos o más acoplados con monómeros de tres o más grupos funcionales amina. Unos pocos mostraban una supresión casi
40 completa de la expresión de luciérnaga, incluso a la dosis más baja de lipidoide probada.
Ejemplo 3
Eficacia de encapsulación de ARN
La formulación para experimentos in vitro es una mezcladura simple de ARN con lipidoide en una relación fija en tampón antes de la adición a células. La formulación in vivo requiere la adición de ingredientes adicionales para 45 facilitar la circulación por todo el cuerpo. Para probar la capacidad de estos lipidoides para formar partículas adecuadas para trabajar in vivo, se siguió un procedimiento de formulación estándar utilizado en el laboratorio. Estas partículas consistían en 42% de lipidoide, 48% de colesterol y 10% de PEG. Después de la formación de la partícula, se añadió ARN y se dejó que se integrara en el complejo. La eficacia de encapsulación se determinó usando un ensayo de Ribogreen estándar. Según se muestra en la tabla posterior, estas partículas eran del orden de 100 nm
50 después de la extrusión, alcanzando algunas una eficacia de encapsulación de más de 90%.
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Tamaño de partícula y eficacia de atrapamiento de lipidoides epoxídicos seleccionados
Compuesto
Tamaño (nm) Atrapamiento (%)
C14-120-B
95,2 92,75
C16-120-B
128,4 67,22
C14-98-B
126,9 44,84
C14-113-B
92,7 96,42
Ejemplo 4
Células HepG2 se sembraron a una densidad de 15.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos blancas opacas
5 (Corning-Costar, Kennebunk, ME) 24 horas antes de la transfección para permitir el crecimiento y la confluencia. Se realizaron diluciones de trabajo de los lipidoides en acetato sódico 25 mM (pH 5) a una concentración de 0,5 mg/ml. Para los experimentos de aporte génico, se usó ADN de luciferasa de luciérnaga pCMV-Luc (ElimBiopharmaceuticals, South San Francisco, CA). Se formaron complejos de lipidoide:ADN mediante interacción electrostática entre moléculas de lipidoide cargadas positivamente y ácidos nucleicos cargados negativamente. Al
10 variar el volumen de solución de lipidoide añadida a una cantidad constante de ADN, se probaban relaciones peso:peso variables de lipidoide a ADN. Se añadió solución de lipidoide (75 µl) a solución de ADN (75 µl) y se mezclaron bien. A continuación, las mezclas se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir la complejación. A continuación, estos complejos (30 µl) se añadieron a medio que contenía suero (200 µl) y se mezclaron bien. A continuación, el medio de crecimiento se retiró de las células y se añadió inmediatamente medio
15 que contenía complejo de lipidoide:ADN. La carga de ADN total era 300 ug de ADN por pocillo. Se realizó la transfección de Lipofectamine 2000 según se describe por el vendedor. Se dejó que los complejos se incubaran con células durante 48 horas. A continuación, la expresión de luciferasa se cuantificó mediante un ensayo Bright-Glo (Promega, Madison, WI). Brevemente, 48 horas después de la transfección, el medio de crecimiento que contenía complejo de lipidoide:ADN se retiró de las células usando una varilla de aspiración de 12 canales. 200 ul de una
20 mezcla 1:1 de reactivo Bright-Glo y DMEM que contenía rojo no fenólico se añadió a cada pocillo de la placa de 96 pocillos con células. Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, se midió la luminiscencia usando un luminómetro. (n=3). Resultados ejemplares se representan en la Figura 6.
Ejemplo 5
Las formulaciones de ARNsi basadas en lipidoides comprendían lipidoide, colesterol, polietilenglicol-lípido (PEG
25 lípido) y ARNsi. Se prepararon soluciones madre de lipidoide, mPEG2000-DMG PM 2660 (sintetizado por Alnylam) y colesterol PM 387 (Sigma-Aldrich) en etanol y se mezclaron para dar una relación molar de 42:10:48. Se añadieron lípidos mezclados a tampón de acetato sódico 200 mM pH 5,2 para dar una solución que contiene 35% de etanol, dando como resultado la formación espontánea de nanopartículas lipidoides vacías. Las nanopartículas resultantes se extruyeron a través de una membrana de 80 nm (tres pases). Se añadieron ARNsi en etanol al 35% y acetato
30 sódico 50 mM pH 5,2 a las nanopartículas a 10:1 (peso/peso) de lípidos totales : ARNsi y se incubaron a 37°C durante 30 min. La retirada del etanol y el intercambio de tampón de nanopartículas lipidoides que contienen ARNsi se consiguió mediante diálisis contra PBS usando una membrana de MWCO 3.500. El tamaño de partícula se determinó usando un Malvern Zetasizer NanoZS (Malvern). El contenido de ARNsi y la eficacia de atrapamiento se determinaron mediante un ensayo Ribogreen.
35 Ratones C57BL/6 (Charles River Labs) recibieron bien solución salina o bien ARNsi en formulaciones lipidoides a través de inyección en la vena caudal en un volumen de 0,01 ml/g. Los ratones fueron dosificados bien con 1,75 o bien con 4 mg/kg de ARNsi atrapado. A las 48 horas después de la administración, los animales fueron anestesiados mediante inhalación de isofluorano y se recogió sangre en tubos separadores de suero mediante sangrado
40 retroorbital. Se determinaron los niveles en suero de proteína de Factor VII en las muestras usando un ensayo cromogénico (Biofen FVII, Aniara Corporation) según los protocolos del fabricante. Se generó una curva estándar usando suero recogido de animales tratados con solución salina. Resultados ejemplares se representan en la Figura
7.
Ejemplo 6
45 Cribado in vitro de la biblioteca epoxídica
Compuestos de la biblioteca de lipidoides basados en epóxido se sintetizaron según los procedimientos descritos en la presente. A continuación, los compuestos se cribaron con respecto a la eficacia de aporte de ARNsi a una línea de células cancerosas, usando una línea celular derivada de Hela manipulada genéticamente para expresar proteínas indicadoras de luciferasa. En estos experimentos, la capacidad de cada material para facilitar la inactivación génica específica de secuencia se evaluó mediante la comparación de los niveles de proteína en grupos tratados con controles no tratados. Para cada compuesto, se realizaron experimentos de aporte usando relaciones en peso variables de lipidoide : ARNsi. En la divulgación original, se mostraban los resultados de la atenuación para
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5 toda la biblioteca. Un grupo de datos abreviado se muestra en la Figura 11 que demuestra los resultados para los 25 compuestos que mejor se comportan en el cribado in vitro, incluyendo C16-96-B, C14-200 y/o C14-205, y C12-200 y/o C12-205.
Ejemplo 7
10 Cribado in vivo de los mejores lipidoides epoxídicos
Para probar la eficacia de aporte de ARNsi in vivo, se usó un modelo de ratón para el aporte hepático. El Factor VII, un factor de coagulación sanguínea específico de hepatocitos, servía como una proteína modélica para estudios de
15 atenuación. Una vez producido por los hepatocitos, el Factor VII se libera a la corriente sanguínea, y un nivel de expresión de referencia se puede determinar mediante simple extracción de sangre y cuantificación de los niveles de proteína mediante un ensayo colorimétrico. Al aportar ARNsi anti-Factor VII a los hepatocitos, se puede alcanzar la atenuación de esta proteína modélica y se puede determinar un porcentaje de inactivación mediante la comparación con un control no tratado.
20 Después del cribado in vitro, los compuestos se purificaron según se detalla en la Parte 1 (véase el Ejemplo 14). Para la prueba in vivo, los compuestos se formularon con colesterol y un PEG-lípido para la estabilidad en suero y el empaquetamiento de ARNsi. En estos experimentos, los lipidoides se formularon en una relación molar de 42 : 48 : 10 de lipidoide : colesterol : PEG. La relación en peso de lípidos totales (lipidoide+colesterol+PEG) a ARNsi era 10 :
25 1. Después de cada formulación, las partículas se caracterizaron con respecto al tamaño y la eficacia de atrapamiento de ARNsi usando dispersión dinámica de luz y un ensayo de Ribogreen, respectivamente. La dosis total de ARNsi administrada en el cribado inicial varía de grupo en grupo debido a las diferencias en la eficacia de atrapamiento de las partículas lipidoides. En todos los experimentos, la dosis de ARNsi administrada a cada ratón es coherente con el peso corporal. Los resultados de atenuación procedentes del cribado in vivo se muestran en la
30 Figura 12. La nomenclatura B1 y B2 significa diferentes compuestos visualizados mediante TLC y aislados durante la purificación. Según se muestra, C14-11-B y C16-96-B eran los compuestos principales a partir del cribado inicial. Se debe apuntar que aunque algunos compuestos no mostraban eficacia en este cribado, un simple ajuste de la composición de la formulación puede mejorar mucho los resultados.
35 Ejemplo de referencia 8
Siguiendo los experimentos de cribado in vivo iniciales, se usaron dos compuestos para efectuar una respuesta a la dosis. En estos experimentos y todos los experimentos posteriores, la dosis de ARNsi se basa en el contenido de ARNsi total en la formulación, ARNsi no atrapado. Los resultados de respuesta a lo dosis se muestran en la Figura
40 13a y la Figura 14a. Además de la medida del Factor VII, se registra el cambio en el peso molecular del ratón y una pérdida en el peso se considera generalmente toxicidad inducida por la formulación (Véase la Figura 13b y la Figura 14b). Las Tablas 1 y 2 tabulan los parámetros de la formulación y los datos de caracterización procedentes de estos experimentos.
45 Tabla 1-Parámetros de la formulación y datos de caracterización para la formulación de respuesta a la dosis de C16-96-B
Formulación
Caracterización
Lipidoide
Lípido:Col:PEG Lípido Total:ARNsi Atrapamiento Tamaño
C16-96-B
65:29:6 10:1 81% 107,8 nm
Tabla 2-Parámetros de la formulación y datos de caracterización para la formulación de respuesta a la dosis de C14-110-B
Formulación
Caracterización
Lipidoide
Lípido:Col:PEG Lípido Total:ARNsi Atrapamiento Tamaño
C14-110-B
42:48:10 10:1 44% 115 nm
50 Ejemplo de referencia 9
Después de finalizar la respuesta a la dosis, C16-96-B se eligió para investigación adicional y optimización. En los siguientes experimentos, la composición porcentual de las formulaciones se varió para observar el efecto de la
55 composición sobre el tamaño de partícula, el atrapamiento y la eficacia. Las composiciones investigadas se muestran en la Tabla 3. La Figura 15 muestra los resultados de atenuación procedentes de las formulaciones probadas. Cuando la formulación en rojo era la mejor previa, se muestra que la eficacia se puede mejorar al formular partículas con diferentes composiciones.
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Tabla 3-Parámetros de la formulación y datos de caracterización para un experimento de optimización de C16-96-B
Parámetros de la Formulación
Formulación
Lipidoide Col PEG Lípido Total:ARNsi Atrapamiento
1
63 31 6 8,5:1 80%
2
65 29 6 8,5:1 80%
3
67 27 6 8,5:1 80%
4
69 25 6 8,5:1 84%
5
71 23 6 8,5:1 85%
6
63 33 4 8,5:1 85%
7
65 31 4 8,5:1 85%
8
67 29 4 8,5:1 84%
9
69 27 4 8,5:1 83%
10
71 25 4 8,5:1 85%
5
Ejemplo de referencia 10
Se interpretó una segunda respuesta a la dosis con los parámetros de la nueva composición porcentual. Los resultados de la atenuación y la formulación/las características de las partículas se muestran en la Figura 16 y la Tabla 4, respectivamente. Al formular con esta composición, se alcanzaba aproximadamente 40% de atenuación
10 con una dosis de 0,25 mg/kg. Usando este resultado como el nuevo punto de referencia, la biblioteca se revisitó y materiales previamente no probados se cribaron con 0,25 mg/kg en un intento de encontrar otros compuestos que pudieran dar resultados similares o mejores.
Tabla 4
Formulación
Caracterización
Lipidoide
Lípido:Col:PEG Lípido Total:ARNsi Atrapamiento Tamaño
C16-96-B
71:23:6 20:1 83% 205 nm
15
Ejemplos 11
En el cribado in vivo revisitado, se identificó que el compuesto C12-200 y/o C12-205 daba una inactivación casi completa con una dosis de 0,25 mg/kg. Según se representa en la Figura 12, la versión de colas ligeramente más largas de este compuesto C12-200 y/o C12-205 se identificó previamente como un agente de aporte muy eficaz, que
20 mostraba una inactivación completa a una dosis muy superior de 7,5 mg/kg de ARNsi total. Es bastante posible que este compuesto pueda facilitar la inactivación completa con dosis muy inferiores, pero esto todavía no se ha explorado totalmente ya que el foco se ha puesto sobre C12-200 y/o C12-205. Después del descubrimiento de la eficacia de este compuesto, se iniciaron los experimentos de caracterización detallados en la Parte 1 (véase el Ejemplo 14).
25 Los resultados de atenuación y cambio de peso corporal de este cribado se representan en la Figura 17b, y la Tabla 5 tabula los parámetros de la formulación y las características. La Figura 17a representa resultados de atenuación para un segundo lote de C16-96-B. En experimentos previos, este compuesto había dado como resultado aproximadamente 40% de atenuación con una dosis de 0,25 mg/kg. A partir de los análisis espectrales de masas, se
30 observó que este lote es de dos colar en oposición a la versión de tres colar más eficaz que se había usado en los estudios previos.
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Tabla 5-Parámetros de la formulación y datos de caracterización para el cribado in vivo revisitado
Parámetros de la Formulación
Formulación
Lípido Col PEG Lípido Total:ARNsi Atrapamiento (%) Tamaño (nm)
C14-96-B
73,1 21,3 5,6 8,5 87 81,7
C16-96-B
71,0 23,0 6,0 8,5 55 170,2
C12-200 y/o C12-205
45,0 45,5 9,5 8,5 36 167
C18-62-B
52,7 39,1 8,2 8,5 86 227,4
Ejemplo 12
Se interpretó una respuesta a dosis bajas sobre C12-200 y/o C12-205. Los resultados de la atenuación y la pérdida
5 de peso corporal se muestran en la Figura 18a y la Figura 18b. Los resultados muestran que se alcanza una atenuación eficaz y dosis extremadamente bajas de ARNsi. En comparación con ND98, el mejor compuesto previo procedente de la biblioteca de lipidoides original, se puede alcanzar una atenuación comparable con dosis 100 veces inferiores de ARNsi. Los parámetros de la formulación y los datos de caracterización se muestran en la Tabla
6.
10 Tabla 6-Parámetros de la formulación y datos de caracterización para formulaciones de C12-200 y/o C12-205 y ND 98
Parámetros de la Formulación
Formulación
Lípido Col PEG Lípido Total:ARNsi Atrapamiento(%) Tamaño (nm)
C12-200 y/o C12-205
48,2 42,8 8,9 8,5 45 154,1
ND98
42,0 48,0 10,0 8,5 99 83,9
Ejemplo 13
15 Para mejorar adicionalmente la eficacia de aporte, la composición porcentual de la formulación de C12-200 y/o C12205 se modificó incrementalmente. Estas formulaciones se cribaron a una dosis de 0,01 mg/kg para identificar cuál se puede comportar mejor que las composiciones previas. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 19 junto con los parámetros de la formulación y las características en la Tabla 7. Según se espera, se puede alcanzar un aporte más eficaz al ajustar la composición de la formulación. Este trabajo de optimización está
20 actualmente en marcha, junto con la síntesis de versiones de colas más largas y más cortas de la estructura C12200 y/o C12-205.
Tabla 7-Parámetros de la formulación y datos de caracterización para las formulaciones de C12-200 y/o C12-205 Ejemplo de referencia 14 Parte 1: Lipidoides basados en la amina 111 La amina 111 (tetraetilenpentamina, o TEPA) se representa como la poliamina lineal de la siguiente estructura:
Parámetros de la Formulación
Formulación
Lípido Col PEG Lípido Total:ARNsi Atrapamiento(%) Tamaño (nm)
1
65,0 25,0 10,0 8,5 0 129
2
60,0 30,0 10,0 8,5 1 128
3
55,0 35,0 10,0 8,5 16 156
4
50,0 40,0 10,0 8,5 30 136
5
45,0 45,0 10,0 8,5 46 140
6
40,0 50,0 10,0 8,5 44 168
7
35,0 55,0 10,0 8,5 40 154
8
50,0 45,0 5,0 8,5 29 157
9
45,0 50,0 5,0 8,5 34 154
10
40,0 55,0 5,0 8,5 27 159
11
35,0 60,0 5,0 8,5 34 155
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Los productos esperados de la reacción entre la amina 111 y el epóxido terminal de 12 carbonos C12 se ilustran como sigue.
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Esta reacción se realizó y la mezcla de reacción en bruto se separó basándose en la suposición de que el orden de
10 elución de producto del gel de sílice polar fuera: a) 7 colas (sustitución máxima en la amina 111); b) isómeros de 6 colas (los isómeros correspondientes a 6 epóxidos que han reaccionado con la amina 111); c) isómeros de 5 colas, etc. Se esperaba que los espectros de MALDI-MS de la mezcla de reacción en bruto revelaran picos correspondientes a las relaciones m z de estos compuestos ([M+H+] calculado para los productos de 7 colas, 6 colas y 5 colas esperados: 1481, 1295 y 1111, respectivamente). El material se aisló de la mezcla de reacción en bruto
15 que, basándose en el análisis de TLC, se suponía que era la mezcla de isómeros de 6 colas. El material "purificado" se comportaban bastante bien en el ensayo de transfección de anti-Factor VII in vivo.
Los espectros de MALDI-MS (véase la Figura 20a) de la mezcla de reacción en bruto y del material "de 6 colas” purificado sugerían compuestos (véase la Figura 20b). La tetraetilenpentamina (TEPA) de calidad técnica es una
20 mezcla de compuestos con puntos de ebullición similares; algunos de estos compuestos son de las siguientes fórmulas:
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La reacción del epóxido C12 con estos compuestos explica la mayoría de los picos intensos en los espectros de masas de MALDI de la mezcla de reacción en bruto (Figura 20a). Las relaciones  /z observadas para el material "purificado" (Figura 20b) están de acuerdo con que la amina 200 o 205 reacciones con 5 equivalentes de epóxido (m/z calculado para [M+H+] 1137, encontrado 1137) y que la amina 210 o 220 reaccione con 4 equivalentes de epóxido (m/z calculado para [M+H+] 910, encontrado 910). Las estructuras de estos compuestos se ilustran como sigue:
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Para determinar si este resultado era reproducible, se realizó una reacción de apertura del anillo epoxídico usando el
10 epóxido C12 y dos lotes diferentes de amina 111. Se realizó MALDI-MS sobre cada mezcla de reacción en bruto. En la reacción entre el epóxido C12 y la partida más antigua de la amina 111 se observó una serie de compuestos que también se observaban en la mezcla de reacción en bruto original (véase la Figura 20a). El espectro de MALDI de la mezcla de reacción en bruto que usaba el epóxido C12 y un lote más nuevo de la amina 111 (véase la Figura 21a) contiene picos predominantes con relaciones m/z de 1481 (amina lineal 111 y 7 colas epoxídicas) y 1137 (de
15 acuerdo con la amina 200 o 205 con 5 colas epoxídicas). El pico en m/z 910 en este espectro era pequeño. Esto podría ser un resultado de las diferencias de lote a lote en la amina 111. La purificación de la segunda reacción permitía el aislamiento de una muestra muy pura del material de m/z 1137; los presentes inventores han denominado este material "C12-200 y/o C12-205". El espectro de 1H NMR de C12-200 y/o C12-205 está de acuerdo con la estructura propuesta (véase la Figura 22).
20
Los presentes inventores están desarrollando una biblioteca de materiales basados en la reacción de las aminas 200, 205, 210 y 220 y estructuras amínicas relacionadas con epóxidos de longitud variable según se representa posteriormente:
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R1, R2 = alquilo, alquenilo, alquinilo, poliaminas, hidrógeno
Estas aminas se están preparando en forma pura usando técnicas familiares para el experto en la especialidad. Los presentes inventores también proponen una biblioteca de materiales derivados del pentahidrocloruro de la amina 111 disponible comercialmente según el siguiente esquema:
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30 disponible comercialmente en forma pura la pentamina lineal real que tiene la siguiente estructura:
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Ejemplo de referencia 15 Parte 2: Lipidoides basados en la amina 96 Este Ejemplo describe la síntesis de una biblioteca de estructuras que son variaciones del lipidoide aminoalcohólico
derivado de la reacción de la amina 96 con un epóxido C16 como sigue:
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basadas en la amina 96 nuclear. En primer lugar, las variaciones en la posición del grupo metilo se alcanzan según el siguiente esquema:
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al hacer reaccionar el epóxido terminal con una variedad de aminas disponibles comercialmente según se representa posteriormente.
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Basándose en esta estrategia, la biblioteca resultante contendría aproximadamente 800 posibles aminoalcoholes de estructura variable.
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Están disponibles materias primas amínicas similares en las que la longitud de la cadena de carbonos entre las dos aminas es más larga o más corta que la amina 96 que se representa posteriormente.
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10 Una biblioteca de compuestos resultantes de la reacción de estas aminas con los diversos epóxidos terminales proporcionaría ~700 lipidoides aminoalcohólicos.
Una estrategia sintética de protección / desprotección proporcionaría múltiples variaciones, donde las dos aminas nucleares están funcionalizadas con diferentes epóxidos de alquilo según el siguiente esquema:
Esta estrategia podría permitir la sustitución en una posición de amina con un grupo funcional distinto a un epóxido
(p. ej., haluro de alquilo, isotiocianato, cloroformiato, haluro de ácido) generando dos grupos funcionales en el mismo núcleo amínico como sigue:
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20 Lo siguiente es un esquema ejemplar ilustra procedimientos sintéticos para generar diversos compuestos que tienen dos grupos funcionales diferentes en el mismo núcleo amínico como sigue:
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en donde Y es un grupo arilo, heteroarilo, alquilo (no reactivo con epóxidos, isocianatos, isotiocianatos y/o haluros
de alquilo); y Z representa un fragmento de isocianato, isotiocianato, haluro de alquilo, que tiene las siguientes
estructuras ejemplares:
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Se podrían usar diversas secuencias de varias etapas para introducir grupos hidroxilo adicionales cerca del núcleo amínico en posiciones diferentes a las generadas a través de la apertura del anillo de epóxido como sigue:
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10 Rutas similares podrían proporcionar los medios para generar tanto grupos hidroxilo como insaturación adicional como sigue:
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La aminación reductiva como una primera etapa después de la protección diferencias del núcleo amínico
15 proporciona acceso a una multitud de aldehídos disponibles comercialmente y quizás a un modo de introducir múltiples grupos hidroxilo a través de aminación reductiva usando carbohidratos simples (un procedimiento conocidos) como sigue:
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por ejemplo
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Ejemplo 16
5 Síntesis de 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2-hidroxidodecil)amino)etil)piperacin-1il)etilazanodiil)didodecan-2-ol (C12-200 y/o C12-205)
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Un matraz de presión de vidrio de 250 ml se cargó con 2-deciloxirano (20,0 gramos, 109 mmoles), tetraetilenpentamina (calidad técnica de Sigma-Aldrich, 2,93 gramos, 15,5 mmoles) y una barra de agitación 10 magnética. El recipiente se cerró herméticamente y se sumergió en un baño de aceite de silicona a 90°C. La mezcla de reacción se agitó vigorosamente durante ∼72 horas a 90°C. A continuación, el recipiente de presión se retiró del baño de aceite, se dejó enfriar hasta temperatura ambiente y a continuación se abrió con precaución. ∼ 9 gramos del aceite ligeramente amarillo viscoso resultante se purificaron a través de cromatografía sobre gel de sílice (elución en gradiente desde diclorometano hasta diclorometano / metanol / hidróxido amónico acuoso 83,5:16,3:1,5). Las 15 fracciones que contenían el compuesto deseado se reunieron y se concentraron mediante evaporación giratoria. El aceite amarillo resultante se disolvió en ∼ ∼ 1,3 gramos de un aceite viscoso amarillo claro. La materia prima puede contener isómero
20 inseparable N1-(2-aminoetil)-N2-(2-(piperacin-1-il)etil)etano-1,2-diamina; y el producto puede contener un isómero inseparable 1,1'-(2-((2-hidroxidodecil)(2-((2-hidroxidodecil)(2-(4-(2-hidroxidodecil)piperacin-1-il)etil)amino)etil)amino)-etilazanodiil)-didodecan-2-ol.
Ejemplo 17
25 Lipidoides aminoalcohólicos preparados a partir de epóxidos quirales
Se pueden preparar lipidoides antimicrobianos (p. ej., C12-200) al hacer reaccionar epóxidos terminales racémicos lipófilos con poliaminas de bajo peso molecular. Este enfoque se ilustra directamente a continuación con la amina 200 y un epóxido terminal genérico. Existen dos problemas con este enfoque que complican el aislamiento de productos puros: el uso de epóxidos racémicos y la adición de aminas al segundo átomo de carbono (C2) en la
30 cadena epoxídica. En los siguientes Ejemplos, se presentaron: a) los problemas que pueden surgir del uso de epóxidos racémicos se pueden evitar a través del uso de epóxidos terminales estereoquímicamente puros; y b) productos secundarios que pueden surgir de adiciones en C2 del epóxido se pueden evitar a través de una ruta sintética alternativa que implica la aminación reductiva.
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Reacciones de epóxidos racémicos
Los epóxidos usados en la síntesis de la biblioteca inicial se adquirieron de fuentes comerciales como mezclas
5 racémicas: cada epóxido contenía una proporción igual del enantiómero R y S. Igualmente, es probable que las aminas aquirales reaccionen con cualquier estereoisómero. El efecto del uso de epóxidos racémicos se puede ilustrar al considerar el caso simple de la reacción entre una amina con un sitio reactivo (p. ej., piperidina) y un epóxido racémico (ilustrado directamente a continuación). En este caso, se generan dos productos lipidoides aminoalcohólicos: los enantiómeros R y S. En teoría, estos productos son separables a través de cromatografía en
10 una fase estacionaria quiral; en la práctica, desarrollar y aumentar a escala un método para realizar esta separación es difícil y costoso.
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La situación se hace más compleja cuando la amina de partida tiene múltiples sitios reactivos. Para N sitios reactivos de una materia prima amínica, se generan 2N estereoisómeros. Por ejemplo, la amina  (cinco sitios reactivos) 15 reacciona con un epóxido racémico generando 32 estereoisómeros. En la experiencia de los presentes inventores, estos productos son inseparables. Este problema se puede resolver al realizar la reacción con epóxidos que son estereoquímicamente puros (p. ej., un solo enantiómero de un epóxido). Esto se ilustra directamente a continuación.
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Unos pocos epóxidos terminales están disponibles comercialmente como enantiómeros individuales, pero el coste
20 de estos compuestos es prohibitivo. Los epóxidos racémicos se pueden resolver (separar en enantiómeros constituyentes) por varios medios, incluyendo cromatografía sobre una fase estacionaria quiral. Los presentes inventores resolvieron los epóxidos usando un método químico conocido como resolución cinética hidrolítica (HKR). Una HKR eficaz de epóxidos racémicos se puede alcanzar usando un procedimiento descrito por Jacobsen (Schaus, y cols., J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 1307-1315). El procedimiento se ilustra directamente a continuación. Se
25 añaden un catalizador quiral y agua a una solución que contiene el epóxido racémico. En presencia del catalizador quiral, la velocidad de hidrólisis de un enantiómero epoxídico es mucho mayor que la velocidad de hidrólisis para el otro enantiómero. Esto permite la hidrólisis selectiva del enantiómero epoxídico no deseado (hasta un 1,2-diol). El 1,2-diol se puede separar del epóxido al retirar el epóxido a través de destilación bajo presión reducida.
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Etapa 1. La resolución de epoxidodecano mediante HKR
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5 (R)-(+)-1,2-epoxidodecano. Un matraz de fondo redondo secado al horno que contenía una barra de agitación magnética se cargó con el catalizador de HKR (R,R) (Schaus, y cols., J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 1307-1315); Número CAS 176763-62-5, 1,31 g, 2,17 mmol. Se añadieron al matraz diclorometano (34 ml) y a continuación ácido acético glacial (1,30 ml). La solución resultante se agitó vigorosamente durante 1,5 h; durante este tiempo el color de la mezcla cambiaba de rojo oscuro a marrón. El disolvente se retiró mediante evaporación giratoria hasta que el
10 material parecía seco. Se añadieron 1,2-epoxidodecano (40,0 g, 217 mmol) y a continuación alcohol isopropílico (calidad para reactivos, 47 ml) al matraz que contenía el catalizador oxidado y una barra de agitación magnética. El matraz se sumergió en un baño de hielo. Se añadió H2O (2,15 ml, 119 mmol, 0,55 equiv, con relación al epóxido) gota a gota a la mezcla agitada. El matraz se cerró herméticamente con un tabique de caucho y se dejó que la solución se calentara hasta temperatura ambiente. Después de agitar durante 2 días, la mezcla de reacción se
15 diluyó con ∼ 200 ml de hexanos. La solución resultante se filtró a través de papel para retirar el precipitado blanco (1,2-diol). El filtrado se concentró mediante evaporación giratoria. El líquido oleoso rojo oscuro resultante se disolvió en ∼ 150 ml de hexanos y se filtró a fin de retirar una cantidad sustancial de precipitado cristalino blanco (diol). El filtrado se transfirió a un matraz de fondo redondo de 250 ml y se concentró mediante evaporación giratoria. El producto deseado se aisló mediante destilación bajo vacío (bibliografía: 124 °C / 15 mm Hg). El producto deseado
20 (14,3 gramos, 71,5% del rendimiento teórico) se recogió como un aceite transparente. Se determinó que el producto era 100% ee mediante la cromatografía quiral del derivado de 2-naftilentiol.
imagen163
Etapa 2. La síntesis de (R)-C12-200
imagen164
(R)-C12-200.  200 (640 mg, 2,97 mmol) y (R)-1,2-epoxidodecano (2,27 g, 12,1 mmol) se añadieron a un vial que contenía una barra de agitación magnética. El vial se cerró herméticamente y se calentó sobre un bloque de 5 reacción de 80°C durante 5 días. Se dejó que la mezcla de reacción se enfriara hasta temperatura ambiente y el producto deseado se aisló mediante cromatografía sobre gel de sílice (elución en gradiente de CH2Cl2 a 175:22:3 CH2Cl2/MeOH/NH4OH (ac.)). Las fracciones se reunieron y se concentraron proporcionando (R)-C12-200 (665 mg) como un aceite amarillo claro. 1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 4,37 (s ancho, -OH, 4H), 3,63 (s ancho ap., 3H), 3,56 (s ancho ap., 2H), 2,84-2,21 (m, 30H), 1,43-1,26 (m, 90H), 0,88 (t, J = 7,0 Hz, 15 H); m/z por MALDI-TOF-MS:
10 calculada para C70H146N5O5 [M + H+] 1137,1, encontrada 1137,6.
Ejemplo 18
Transfección in vivo con lipidoides aminoalcohólicos quirales
Se realizaron transfecciones in vivo preliminares usando ARNsi anti-Factor VII formulado con usando (R)-C12-200 y (S)-C12-200 en ratones. Con una dosificación de 0,01 mg/kg de ARNsi, se alcanzaba aproximadamente 50% de
15 reducción de Factor VII sistémico usando cualquiera de las formas R o S de C12-200; la diferencia entre estos resultados y los obtenidos usando C12-200 (el lipidoide preparado usando la amina 200 y el epóxido C12 racémico) eran insignificantes.
Ejemplo 19
Síntesis de lipidoides aminoalcohólicos mediante el enfoque de aminación reductiva
20 El primer átomo de carbono en un epóxido terminal es el sitio de ataque preferido durante la adición nucleófila. El análisis por 2D-NMR de lipidoides aminoalcohólicos muestra que la mayoría de la adición se produce en C1 del epóxido, según se ilustra directamente a continuación. No obstante, se produce una cantidad vestigial de adición en C2. El análisis por 2D-NMR de los compuestos (S)-C12-205 y (R)-C12-200 sugiere que alrededor de 10% de las "colas" lipídicas son el resultado del ataque de la amina en C2 del epóxido. Estas colas regioisómeras
25 probablemente están distribuidas aleatoriamente en toda la población de colas lipídicas en el material. Los esfuerzos para limitar esta reacción secundaria con los epóxidos no han sido satisfactorios. Para evitar esta reacción secundaria, los presentes inventores propusieron y ejecutaron una estrategia sintética alternativa.
imagen165
30 Una estrategia retrosintética de esta estrategia se presenta directamente posteriormente. El producto deseado es C (según se ilustra directamente a continuación), a partir de la adición de la amina A a C1 del epóxido B. D es el isómero constituyente no deseado formado cuando la amina A ataca C2 del epóxido B. La aminación reductiva del fragmento de aldehído E con la amina A y un agente reductor (dando F), seguido por la retirada del grupo protector del alcohol secundario, debe generar el producto C. Esta ruta no genera la estructura no deseada D. Este enfoque
35 tiene dos ventajas: no genera el producto secundario de la reacción en C2 del epóxido (p. ej., D, directamente a continuación), y evita la generación de una mezcla de estereoisómeros. Para demostrar que esta estrategia es factible, los presentes inventores prepararon un sustrato análogo a E e hicieron reaccionar este componente con una amina, generando finalmente el producto desead (análogo a C).
imagen166
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Síntesis de ( )-C12-205 mediante un enfoque de aminación reductiva
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Etapa 1. Síntesis del fragmento 404 para el enfoque de aminación reductiva
imagen169
(S)-2-((tritiloxi)metil)oxirano (401). Se preparó el derivado de glicidol protegido con tritilo 401 como se describe
10 previamente (Schweizer, y cols., Synthesis 2007, 3807-3814). Una solución de (R)-glicidol (5,0 g, 61 mmol) en CH2Cl2 (30 ml) se añadió mediante una jeringa a una solución agitada de cloruro de tritilo (18,6 g, 66,8 mmol) y trietilamina (16,9 ml, 122 mmol) en CH2Cl2 (67 ml) en un baño de hielo bajo argón, se añadió DMAP (742 mg, 6,08 mmol) a la mezcla de reacción después de la adición del glicidol. Se dejó que la reacción se calentara hasta temperatura ambiente. Después de 14 horas, la mezcla de reacción se diluyó con 300 ml de NH4Cl acuoso saturado.
15 La mezcla se diluyó adicionalmente hasta ∼1 l con agua para disolver las sales precipitadas. El producto se extrajo de la solución de desactivación con Et2O (3 ×); las capas etéreas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron a través de papel y se concentraron mediante evaporación giratoria hasta un sólido blanco. El producto en bruto se purificó mediante recristalización en MeOH (200 ml) a ebullición dando el producto deseado 401 (14,1 g, 73%) como cristales bancos. El análisis por NMR de este material estaba de acuerdo con el presentado
20 en la bibliografía. (Schweizer y cols., Synthesis 2007, 3807-3814.)
imagen170
(S)-2-(benciloxi)dodecan-1-ol (403). Se añadió una suspensión al 60% en peso de NaH en aceite mineral (2,01 g, 50,3 mmol) a un matraz de fondo redondo secado al horno que contenía una barra de agitación magnética. Se añadió al matraz THF (120 ml) mediante una jeringa bajo argón, y el matraz se sumergió en un baño de hielo. Se 25 disolvió 402 en bruto (14,9 g, 33,5 mmol) en THF anhidro (50 ml) y se añadió lentamente a la suspensión agitada de NaH. Se dejó que la mezcla de reacción se calentara hasta temperatura ambiente. Se añadió cloruro de bencilo (5,8 ml, 50 mmol) a la mezcla de reacción. El matraz se equipó con un condensador de reflujo y la mezcla se calentó hasta reflujo bajo Ar durante la noche. Después de que la mezcla de reacción se hubiera enfriado, se añadió lentamente NH4Cl (ac. sat., ∼ 300 ml) para desactivar el NaH residual. La suspensión se transfirió a un embudo
imagen171
separados usando H2O (300 ml) y Et2O (200 ml). La capa orgánica se extrajo con Et2O adicional; las capas etéreas se secaron sobre MgSO4, se filtraron a través de papel y se concentraron hasta un aceite amarillo. Este material se purificó mediante cromatografía sobre sílice (elución en gradiente desde hexanos hasta EtOAc); las fracciones deseada se reunieron y se concentraron proporcionando 15 g de un aceite ligeramente amarillo. Este aceite se disolvió en MeOH/THF 1:1 (100 ml). Se añadió p-TsOH·H2O (572 mg) a la mezcla; la solución se agitó durante 6 horas. La mezcla de reacción se concentró sobre Celite mediante evaporación giratoria y se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice (elución en gradiente desde hexanos hasta acetato de etilo). Las fracciones que contenían el producto deseado se reunieron y se concentraron proporcionando 403 (5,44 g, 66%) como un aceite transparente. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7,39-7,29 (m, 5H), 4,64 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 4,55 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 3,74-3,67 (m, 1H), 3,60-3,49 (m, 2H), 1,93-1,90 (m, 1H), 1,68-1,60 (m, 1H), 1,53-1,45 (m, 1H), 1,40-1,40 (m, 16H), 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H).
imagen172
(S)-2-(benciloxi)dodecanal (404). Se añadieron CH2Cl2 (10 ml) y cloruro de oxalilo (1,72 ml, 20,3 mmol) a un
15 matraz de fondo redondo de 2 bocas secado al horno que contenía una barra de agitación magnética bajo Ar. El matraz se sumergió en un baño de hielo seco / acetona. Se añadió lentamente una solución de DMSO (2,88 ml, 40,6 mmol) en CH2Cl2 (10 ml) a la solución agitada de cloruro de oxalilo. Se disolvió 403 (5,4 g, 18,5 mmol) en CH2Cl2 y se añadió lentamente, a lo largo de un período de 15 minutos, a la mezcla de reacción agitada fría. Después de agitar durante 2 horas, se añadió Et3N (12,9 ml, 18,46 mmol) a la mezcla de reacción, que a continuación se dejó calentar hasta temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con Et2O (∼300 ml) y agua. La capa etérea se lavó con NaHCO3 ac. sat., HCl ac. 1 M y salmuera. A continuación, la capa de Et2O se secó sobre MgSO4, se filtró a través de papel y se concentró mediante evaporación giratoria. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía sobre sílice (elución en gradiente desde hexanos hasta EtOAc/hexanos 1:1); las fracciones que contenían el producto deseado se reunieron y se concentraron proporcionando 404 (3,58 g, 67%) como un aceite ligeramente
25 viscoso transparente. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9,66 (d, J = 1,9 Hz, 1 H), 7,37-7,31 (m, 5H), 4,69 (d, J = 11,7 Hz, 1H), 4,55 (d, J = 11,7 Hz, 1H), 3,78-3,75 (m, 1H), 1,68 (dd, J = 14,3, 7,2 Hz, 2H), 1,49-1,35 (m, 2H), 1,25 (br s, 14H), 0,89 (t, J = 6,7, 3H)
Etapa 2. Aminación reductiva forma pura de (S)-C12-205
imagen173
Se añadió 1-(2-aminoetil)piperacina (205, 39 µl, 0,3 mmol) a un vial que contenía una barra de agitación magnética. Se añadieron al vial MeOH (10 ml) y el aldehído 404 (971 mg, 3,34 mmol). A continuación, se añadió a la mezcla NaCNBH3 (188 mg, 3 mmol). Se añadió gota a gota AcOH glacial a la solución agitada hasta que el pH (según se medía usando tiras indicadoras) era aproximadamente 5,5. La mezcla burbujeaba durante la adición del AcOH. La mezcla se agitó durante 4 días, después de lo cual se diluyó con NaOH (ac.) 1 M y CH2Cl2. La capa acuosa se
35 extrajo una vez adicional con CH2Cl2. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron a través de papel y se concentraron. El producto intermedio deseado se purificó mediante cromatografía sobre sílice (de CH2Cl2 a MeOH al 10%/CH2Cl2) proporcionando un aceite amarillo (83 mg). Este aceite se disolvió en 25 ml de MeOH/H2O/AcOH 7:2:1. Se añadió a la solución una porción de Pd al 10% en peso/C. La mezcla de reacción se agitó bajo H2 (ligeramente por encima de la presión atmosférica) durante 8 horas. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite para retirar el Pd/C y a continuación se concentró hasta una película. El análisis espectral de masas de este material indicaba que era el producto deseado puro (S)-C12-205. m/z por MALDI-TOF-MS: calculada para C42H88N3O3 [M + H+], 682,7; encontrada 682,9.
Habiendo descrito ahora algunas realizaciones ilustrativas de la invención, debe ser evidente para los expertos en la
45 técnica que lo precedente es meramente ilustrativo y no limitativo, habiendo sido presentado solamente a modo de ejemplo. Numerosas modificaciones y otras realizaciones ilustrativas están dentro del alcance de un experto normal en la técnica y se contempla que están dentro del alcance de la invención. En particular, aunque muchos de los ejemplos presentados en la presente implican modificaciones específicas de acciones del método o elementos del sistema, se debe entender que esas acciones y esos elementos se pueden combinar de otros modos para conseguir los mismos objetivos. Las acciones, los elementos y las característica analizados solamente en relación con una realización no pretender estar excluidos de un papel similar en otras realizaciones. Además, para las una o más
imagen174
limitaciones de medio más función citadas en las siguientes reivindicaciones, los medios no pretenden estar limitados a los medios divulgados en la presente para realizar la función citada, sino que pretenden cubrir el alcance de cualquier medio, conocido ahora o desarrollado más tarde, para realizar la función citada. El uso de términos ordinales tales como "primer", "segundo", "tercero", etc., en las reivindicaciones para modificar un elemento de la 5 reivindicación no debe implicar por sí mismo ninguna prioridad, precedencia u orden de un elemento de la reivindicación sobre otro o el orden temporal en el que se realizan las acciones de un método, sino que se usan meramente como marcas para distinguir un elemento de la reivindicación que tiene un cierto nombre de otro elemento que tiene el mismo nombre (pero para el uso del término ordinal) para distinguir los elementos de la reivindicación. De forma similar, el uso de a), b), etc., o i), ii), etc. no implica por sí mismo ninguna prioridad,
10 precedencia u orden de etapas en las reivindicaciones. De forma similar, el uso de estos términos en la memoria descriptiva no implica por sí mismo ninguna prioridad, precedencia u orden requeridos.
Se considera que la memoria descriptiva escrita precedente en suficiente para permitir que un experto en la técnica ponga en práctica la invención. La presente invención no se ha de limitar en el alcance por los ejemplos
15 proporcionados, ya que los ejemplos se consideran como una simple ilustración de un aspecto de la invención y otras realización funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Diversas modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en la presente se harán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción precedente y están dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Las ventajas y los objeticos de la invención no son necesariamente abarcado por cada realización de la invención.
20

Claims (20)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. A compuesto of formula:
    imagen2
    en el que: p y m are cada uno 1; RA es hidrógeno; un grupo alifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido; un
    grupo heteroalifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido; arilo sustituido o no sustituido arilo; heteroarilo sustituido o no sustituido;
    imagen3
    cada presencia de R5 es independientemente hidrógeno; un grupo alifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido; un grupo heteroalifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido; arilo sustituido o no sustituido; o heteroarilo sustituido o no sustituido;
    15 en donde al menos uno de RY y RZ es
    imagen4
    cada presencia de x es un número entero entre 1 y 10, inclusive; preferiblemente en donde x es 1, 2 o 3; y es un número entero entre 1 y 10, inclusive; preferiblemente en donde y es 1, 2 o 3 preferiblemente en donde x es 1, e y es 2; o preferiblemente en donde x es 1 e y es 3;
    imagen5
    cada presencia de RY es hidrógeno; un grupo alifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido; un grupo heteroalifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido;
    arilo sustituido o no sustituido; heteroarilo sustituido o no sustituido;
    cada presencia de RZ es hidrógeno; un grupo alifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido; un grupo heteroalifático C1-20 cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido;
    arilo sustituido o no sustituido; heteroarilo sustituido o no sustituido;
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
    imagen6
    imagen7
  2. 2. El compuesto según la reivindicación 1, en el que RF es
    imagen8
    10 3. El compuesto según la reivindicación 1, en el que RF es
  3. 4. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que RA es hidrógeno, alquilo C1-C6,
    imagen9
    imagen10
    imagen11
  4. 5. El compuesto según la reivindicación 1, en el que RA es y RF es
    o en el que RA es
    imagen12y RF es
    o en el que RAes imagen13
    imagen14y RF es
    imagen15
    imagen16
    imagen17
  5. 6.
    El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que R5 es un grupo alifático C8-C16 o alquilo C8-C16.
  6. 7. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que cada imagen18 imagen19
    imagen20es
    imagen21o en el
    10 que cada
    es
  7. 8. El compuesto según la reivindicación 1 de la fórmula: o de la fórmula:
    imagen22
    o de la fórmula:
    imagen23
  8. 9. Una mezcla que comprende el compuesto
    imagen24
    imagen25
  9. 10. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 4, 6 u 8 o la mezcla según la reivindicación 9, en los que imagen26 imagen27 imagen28 imagen29
    10 cada
    es o en los que cada es
  10. 11.
    El compuesto según la reivindicación 1 de la fórmula:
  11. 12.
    Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10 y 11 o una mezcla según la reivindicación 9 o 10; y un agente farmacéutico, preferiblemente en donde el agente farmacéutico se selecciona de los grupos que consisten en polinucleótidos, proteínas, péptidos y fármacos
    imagen30
    20 de molécula pequeña.
  12. 13.
    Un método para preparar un compuesto según la reivindicación 1, comprendiendo el métodos la etapa de hacer reaccionar uno o más equivalentes de una amina de la fórmula:
    con un compuesto que contiene
  13. 14.
    Una micropartícula, una nanopartícula, un liposoma o una micela que comprende un compuesto según una
    imagen31
    imagen32
    5 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10 y 11 o una mezcla según la reivindicación 9 o 10; y un agente que va a ser aportado.
  14. 15. La micropartícula, la nanopartícula, el liposoma o la micela según la reivindicación 14, en donde el agente es un polinucleótido, un fármaco, una proteína o un péptido, una molécula pequeña o un gas.
    10 16 El liposoma según la reivindicación 15 que comprende un agente, en donde el agentes un ARN; colesterol y PEG.
  15. 17. Un complejo que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10 y 11 o una 15 mezcla según la reivindicación 9 o 10; y un polinucleótido.
  16. 18. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 10 y 11 o una mezcla según la reivindicación 9 o 10; y un agente que va a ser aportado para el uso en un método para administrar un agente a un sujeto que lo necesite.
    20
  17. 19. La composición farmacéutica según la reivindicación 12, la micropartícula, la nanopartícula, el liposoma o la micela según la reivindicación 14 o la composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 18, en donde el agente es un polinucleótido.
    25 20. La composición farmacéutica según la reivindicación 19, la micropartícula, la nanopartícula, el liposoma o la micela según la reivindicación 19, la composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 19 o el complejo según la reivindicación 17, en donde el polinucleótido es ADN.
  18. 21. La composición farmacéutica según la reivindicación 19, la micropartícula, la nanopartícula, el liposoma o la
    30 micela según la reivindicación 19, la composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 19 o el complejo según la reivindicación 17, en donde el polinucleótido es ARN.
  19. 22. La composición farmacéutica según la reivindicación 21, la micropartícula, la nanopartícula, el liposoma o la micela según la reivindicación 21, la composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 21, el complejo
    35 según la reivindicación 21 o el liposoma según la reivindicación 16, en donde el ARN es ARNds, ARNsi, ARNsh, ARNmi o ARN antisentido.
  20. 23. La composición farmacéutica según la reivindicación 19, la micropartícula, la nanopartícula, el liposoma o la
    micela según la reivindicación 19, la composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 19 o el complejo 40 según la reivindicación 17, en donde el polinucleótido codifica una proteína o un péptido.
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