BR122023027721A2 - Composição - Google Patents

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Ludwig Weiss
Mehrije Ferizi
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Abstract

composição. polinucleotídeos codificando peptídeos, proteínas, enzimas, e fragmentos funcionais dos mesmos são descritos. os polinucleotídeos da descrição podem ser eficazmente liberados a um órgão, tal como o pulmão, e expressos dentro das células do órgão. os polirribonucleotídeos da descrição podem ser usados para tratar uma doença ou condição associada com um gene da família do cassete de ligação de atp (abc), tal como abca3.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício da EP15174677.3 depositada em 30 de junho de 2015 sob 35 U.S.C. § 119, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
FUNDAMENTOS
[002] RNAs mensageiros (mRNA) são polímeros contendo vários nucleotídeos ligados, cada um composto de um açúcar, um fosfato, e uma base. Cada polímero de mRNA armazena informação genética ao longo da cadeia de nucleotídeo. Os polímeros de RNA mensageiro carregam a informação genética do DNA no núcleo da célula para o citoplasma onde proteínas são fabricadas. Cada tripleto de nucleotídeos no mRNA é chamado de um códon, e cada códon especifica a identidade de um aminoácido na proteína traduzida.
[003] Uma célula também pode aprisionar e traduzir um RNA exógeno, mas muitos fatores influenciam a absorção e tradução eficientes. Por exemplo, o sistema imune reconhece muitos RNAs exógenos como estranhos e deflagra uma resposta que é intencionada para inativar os RNAs. Além disso, muitos RNAs exógenos não são suficientemente estáveis para serem adequadamente expressos dentro de uma célula hospedeira.
SUMÁRIO
[004] A presente descrição fornece uma composição compreendendo um polirribonucleotídeo modificado para tratar um indivíduo tendo ou suspeito de ter uma doença associada com um gene da família do cassete de ligação de ATP (ABC), tal como ABCA3 que pode estar associado como uma síndrome da angústia respiratória. O polirribonucleotídeo modificado pode incluir uma sequência de códon que é otimizada para a tradução dentro das células do indivíduo exposto ao polirribonucleotídeo modificado, em que na tradução o polirribonucleotídeo modificado produz um polipeptídeo que melhora um sintoma da doença. O gene na família do cassete de ligação de ATP pode ser selecionado do grupo consistindo em ABCA1, ABCA3, ABCA4, ABCA12, ABCB4, ABCB7, ABCB11, ABCC2, ABCC6, ABCC8, ABCC9, ABCD1, ABCG5, ABCG8, e CFTR. Em alguns casos, o gene na família do cassete de ligação de ATP é ABCA3 ou pelo menos 70% homólogo ao ABCA3 humano. Em alguns casos, a composição compreende uma razão de moles de grupos amina de polímeros catiônicos para moles de grupos fosfato do polirribonucleotídeo modificado de pelo menos cerca de 8. Em alguns casos, a composição é selecionada da TABELA 8. Em alguns casos, a sequência de códon optimizada é traduzida pelo menos 20% mais eficazmente dentro de uma célula de um indivíduo do que uma sequência de códon não otimizado. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo modificado compreende uma combinação de nucleotídeos não modificados e modificados. Uma composição da descrição pode ser usada para tratar uma doença, e a doença pode ser selecionada do grupo consistindo em degeneração macular relacionada com a idade, colestase intra-hepática recorrente benigna, síndrome de Cantu, ausência bilateral congênita do canal deferente, hiperinsulinismo congênito, fibrose cística, síndrome de Dubin- Johnson, cardiomiopatia dilatada familiar, deficiência de HDL familiar, calcificação arterial generalizada da infância, ictiose arlequim, pancreatite hereditária, colestase intra-hepática da gravidez, ictiose lamelar, diabete melito neonatal permanente, colestase intra-hepática familiar progressiva, pseudoxantoma elástico, retinite pigmentosa, sitosterolemia, degeneração macular de Stargardt, disfunção de tensoativo, doença de Tangier, adrenoleucodistrofia ligada a X, anemia e ataxia sideroblástica ligada a X. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo modificado fornece expressão do polipeptídeo durante um período de tempo na célula do indivíduo tendo o polirribonucleotídeo modificado, em que o período de tempo é de até 4 semanas, em que a expressão é intensificada quando comparada com a expressão em uma célula de controle que foi exposta a um polirribonucleotídeo não modificado codificando o polipeptídeo. O período de tempo pode ser de pelo menos cerca de 30 segundos e até 5 dias. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo modificado compreende uma região não codificadora 3’ ou 5’ flanqueada pela sequência de códon que codifica o polipeptídeo, em que a região não codificadora ajuda na expressão intensificada do polipeptídeo nas células. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo modificado é formulado em uma nanopartícula, nanocápsula, lipídeo catiônico, polímero catiônico, nanoemulsão. Em alguns casos o polirribonucleotídeo modificado compreende análogos de uridina ou análogos de citidina. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo modificado compreende 5% a 50% de análogos de uridina ou 5% a 50% de análogos de citidina. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo modificado compreende 15% a 30% de análogos de uridina ou 15% a 30% de análogos de citidina. Em alguns casos os análogos de uridina são selecionados do grupo consistindo em pseudouridina, 2-tiouridina, 5-iodouridina, e 5-metiluridina. Em alguns casos os análogos de citidina são selecionados do grupo consistindo em 5- metilcitidina, 2’-amino-2’-desoxicitidina, 2’-fluoro-2’-desoxicitidina, e 5- iodocitidina. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo modificado compreende 5-metilcitidina ou pseudouridina. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo modificado compreende (i) uridina e citidina; e (ii) análogos da uridina e citidina. Em alguns casos o polirribonucleotídeo modificado compreende análogos de adenosina ou análogos de guanosina. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo modificado compreende (i) adenosina ou guanosina; e (ii) análogos da adenosina ou guanosina. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo modificado compreende menos do que 50% de análogos de adenosina ou guanosina. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo modificado compreende (i) adenosina e guanosina; e (ii) análogos da adenosina e guanosina. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo modificado tem uma eficiência de transfecção maior do que 80% entre as células expostas ao polirribonucleotídeo modificado. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo modificado não induz substancialmente nenhuma mudança em um nível de pelo menos um marcador inflamatório expresso pelas células mononucleares de sangue periférico expostas ao polirribonucleotídeo modificado. Em alguns casos (i) a sequência de códon é um gene ou fragmento cujo defeito ou deficiência estão associados como uma presença da doença, ou (ii) uma falta ou deficiência do polipeptídeo está associada como a presença da doença. Por exemplo, uma deficiência no gene ABCA3 pode ser uma causa de síndrome da angústia respiratória. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo modificado diminui uma resposta imune do indivíduo quando comparado a um polirribonucleotídeo não modificado codificando o polipeptídeo, resposta imune está que é como determinada por um nível de pelo menos um marcador inflamatório selecionado de TNF-a, IL-2 e IL-8 expresso pelas células mononucleares de sangue periférico expostas ao polirribonucleotídeo modificado quando comparado a um nível do pelo menos um marcador inflamatório nas células mononucleares de sangue periférico em um controle que foi exposto ao polirribonucleotídeo não modificado.
[005] Os aspectos e vantagens adicionais da presente descrição tornar-se-ão facilmente evidentes para aqueles habilitados nesta técnica a partir da seguinte descrição detalhada, em que apenas as modalidades ilustrativas da presente descrição são apresentadas e descritas. Como será entendido, a presente descrição é capaz de outras e diferentes modalidades, e seus vários detalhes são capazes de modificações em vários aspectos óbvios, todos sem divergir da descrição. Consequentemente, os desenhos e descrição devem ser considerados como ilustrativos por natureza, e não como restritivos.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[006] Todas as publicações, patentes, e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência no mesmo grau como se cada publicação, patente, ou pedido patente individuais fossem específica e individualmente indicado a ser incorporado por referência.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS
[007] As novas características da invenção são apresentadas com particularidade nas reivindicações anexas. Um melhor entendimento das características e vantagens da presente invenção será obtido por referência à seguinte descrição detalhada que apresenta modalidades ilustrativas, em que os princípios da invenção são utilizados, e os desenhos anexos dos quais: a FIGURA 1 ilustra um exemplo de administração aerossol de polirribonucleotídeos engenheirados da descrição aos camundongos.
[008] A FIGURA 2 é um western blot ilustrando a tradução de ABCA3 mRNAs como UTRs diferentes nas células A549 6 horas após a transfecção.
[009] A FIGURA 3 é um western blot ilustrando a expressão da proteína ABCA3 a partir de mRNAs compreendendo várias modificações de nucleotídeo em células HEK-293.
[0010] A FIGURA 4 é um western blot ilustrando a expressão da proteína ABCA3 a partir de mRNAs compreendendo várias modificações de nucleotídeo nas células A549.
[0011] A FIGURA 5 é um western blot ilustrando a expressão da proteína ABCA3 a partir de mRNAs compreendendo várias modificações de nucleotídeo em células MLE-15.
[0012] A FIGURA 6 ilustra uma comparação dos níveis de expressão da proteína ABCA3 medidos pelo Western Blot 6 horas após a transfecção do mRNA em células HEK-293, células A549, e células MLE-15.
[0013] A FIGURA 7 ilustra a indução de IL-6 em células A549 traduzindo a proteína ABCA3 de ABCA3-FLAG mRNAs compreendendo várias modificações de nucleotídeo.
[0014] A FIGURA 8 ilustra a indução de IP-10 em células HepG2 traduzindo a proteína ABCA3 de ABCA3-FLAG mRNAs compreendendo várias modificações de nucleotídeo.
[0015] A FIGURA 9 ilustra a viabilidade da célula de células A549 depois da transfecção como mRNAs compreendendo várias modificações químicas.
[0016] A FIGURA 10 ilustra a viabilidade da célula de células HEP G2 depois da transfecção como mRNAs compreendendo várias modificações químicas.
[0017] A FIGURA 11 ilustra os resultados de um ensaio de ELISA medindo os níveis de IL-6 a partir de células A549 depois transfectadas com mRNAs compreendendo várias modificações químicas.
[0018] A FIGURA 12 ilustra os resultados de um ensaio de ELISA medindo os níveis de IP-10 a partir de células A549 depois transfectadas como mRNAs compreendendo várias modificações químicas.
[0019] A FIGURA 13 é um western blot ilustrando o curso de tempo de tradução do polipeptídeo ABCA3 expresso a partir da SEQ ID NO: 17 em células pulmonares in vitro.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0020] Embora várias modalidades da invenção tenham sido apresentadas e aqui descritas, estará óbvio para aqueles habilitados na técnica que tais modalidades são fornecidas apenas por via de exemplo. Numerosas variações, mudanças, e substituições podem ocorrer para aqueles habilitados na técnica sem divergir da invenção. Deve ser entendido que várias alternativas para as modalidades da invenção aqui descritas podem ser utilizadas.
[0021] O termo “indivíduo”, como aqui usado geralmente se refere a um ser humano. Em alguns casos, um indivíduo também pode ser um animal, tal como um camundongo, um rato, um porquinho da Índia, um cão, um gato, um cavalo, um coelho, e vários outros animais. Um indivíduo pode ser de qualquer idade, por exemplo, um indivíduo pode ser um bebê, uma criança jovem, uma criança, um pré-adolescente, um adolescente, um adulto, ou um indivíduo idoso.
[0022] O termo “doença”, como aqui usado, geralmente se refere a uma condição fisiológica anormal que afeta parte ou todo de um indivíduo, tal como uma enfermidade (por exemplo, asma) ou um câncer.
[0023] O termo “câncer”, como aqui usado, geralmente se refere a qualquer crescimento resultante da divisão anormal de células. Um câncer pode ser um crescimento maligno ou benigno ou tumor resultante da divisão de células anormais. Um câncer pode ser um câncer hematológico ou um câncer pode ser um câncer sólido. Um câncer pode ser doença pode ser uma divisão descontrolada benigna ou maligna de células anormais em qualquer parte do corpo de um indivíduo. Os exemplos não limitantes de cânceres abrangidos incluem câncer mamário e câncer pulmonar. Os exemplos de cânceres pulmonares são câncer pulmonar de célula não pequena, câncer pulmonar de célula pequena, e tumor carcinóide pulmonar. Os exemplos de cânceres mamários incluem câncer mamário metastático, câncer mamário inflamatório, câncer mamário triplo negativo (negativo para os receptores de progesterona, estrogênio, e HER2/neu), carcinoma dutal invasivo, e carcinoma dutal in situ.
[0024] O termo “polinucleotídeo” ou “ácido nucléico” como aqui usado se refere a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos, que compreendem bases de purina e pirimidina, bases de nucleotídeo química ou bioquimicamente modificadas, naturais ou não naturais, ou derivatizadas. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo compreende análogos de purina e/ou pirimidina. Os polinucleotídeos incluem sequências de ácido desoxirribonucléico (DNA), ácido ribonucléico (RNA), ou cópias de DNA de ácido ribonucléico (cDNA), todos os quais podem ser recombinantemente produzidos, artificialmente sintetizados, ou isolados e purificados a partir de fontes naturais. Os polinucleotídeos e ácido nucléicos podem existir como de filamento único ou de filamento duplo. A cadeia principal do polinucleotídeo pode compreende açúcares e grupos fosfatos, como pode ser tipicamente encontrado no RNA ou DNA, ou açúcar ou grupos fosfato modificados ou substituídos. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, incluindo nucleotídeos de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo (ou análogos). A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos.
[0025] O termo “polirribonucleotídeo”, como aqui usado, geralmente se refere aos polímeros de polinucleotídeo que contêm mais do que 50% de bases de ribose, incluindo ribonucleotídeos não modificados e/ou modificados. O termo também se refere aos polímeros de polinucleotídeo que compreendem ácidos ribonucléicos, tais como que contêm mais do que 50% de bases de ribose, incluindo ribonucleotídeos não modificados e/ou modificados. O termo também se refere aos polímeros de polinucleotídeo que compreendem ribonucleotídeos quimicamente modificados, tais como análogos. Um polirribonucleotídeo pode ser formado de D-ribose, que pode ser encontrada na natureza, e L-ribose , que não é encontrada na natureza.
[0026] O termo “polipeptídeos”, como aqui usado, geralmente se refere às cadeias poliméricas compreendidas de monômeros de resíduo de aminoácido que são unidos entre si através de ligações de amida (ligações peptídicas). Os aminoácidos podem ser o isômero ótico L ou o isômero ótico D. Um polipeptídeo pode ser uma cadeia de pelo menos três aminoácidos, miméticos de peptídeo, uma proteína, uma proteína recombinante, um anticorpo (monoclonal ou policlonal), um fragmento de anticorpo, um fragmento variável de cadeia única (scFv), um antígeno, um epítopo, uma enzima, um receptor, uma vitamina, ou um análogo estrutural ou combinações dos mesmos. Como aqui usadas, as abreviações para os aminoácidos L- enantioméricos e D-enantioméricos que formam um polipeptídeo são como segue: alanina (A, Ala); arginina (R, Arg); asparagina (N, Asn); ácido aspártico (D, Asp); cisteína (C, Cys); ácido glutâmico (E, Glu); glutamina (Q, Gln); glicina (G, Gly); histidina (H, His); isoleucina (I, Ile); leucina (L, Leu); lisina (K, Lys); metionina (M, Met); fenilalanina (F, Phe); prolina (P, Pro); serina (S, Ser); treonina (T, Thr); triptofano (W, Trp); tirosina (Y, Tyr); valina (V, Val). X ou Xaa podem indicar qualquer aminoácido.
[0027] O termo “engenheirado”, como aqui usado, geralmente se refere aos polinucleotídeos, vetores, e construtos de ácido nucléico de ocorrência não natural, geneticamente modificados que foram geneticamente planejados e manipulados para fornecer um polinucleotídeo intracelularmente. Em algumas modalidades, engenheirado se refere aos polinucleotídeos, vetores, e construtos de ácido nucléico que foram geneticamente planejados e manipulados para fornecer um polinucleotídeo intracelularmente. Um polinucleotídeo engenheirado pode ser parcial ou totalmente sintetizado in vitro. Um polinucleotídeo engenheirado também pode ser clonado. Um polirribonucleotídeo engenheirado pode conter uma ou mais bases modificadas ou análogos de base ou açúcar, tais como ribonucleotídeos não naturalmente encontrados em RNA mensageiros. Um polirribonucleotídeo engenheirado pode conter nucleotídeos modificados ou análogos de nucleotídeo que existem em RNAs de transferência (tRNAs), RNAs ribossômicos (rRNAs), RNAs guias (gRNAs), RNA nucleares pequenos (snRNA), RNA nucleolar pequeno (snoRNA), SmY RNA, Líder de RNA unido (SL RNA), CRISPR RNA, RNA não codificador longo (lncRNA), microRNA (miRNA), ou um outro RNA adequado.
Vista Geral
[0028] A presente descrição fornece composições e métodos para o tratamento de condições com ácidos nucléicos estáveis codificando uma proteína ou fragmento(s) de proteína. A presente descrição também fornece métodos para liberar um polirribonucleotídeo que pode ser traduzido dentro de uma célula envolvida na produção de tensoativo a um indivíduo. Por exemplo, o gene ABCA3 fornece instruções para fabricar uma proteína envolvida na produção de tensoativo. O tensoativo pode ser uma mistura de certas gorduras (chamadas de fosfolipídeos) e proteínas que revestem o tecido pulmonar e facilita a expansão e contração dos pulmões e respiração de um indivíduo. Sem tensoativo normal, o tecido que circunda os sacos de ar nos pulmões (os alvéolos) gruda entre si depois da exalação (por causa de uma força chamada tensão superficial), fazendo com que os alvéolos sofram colapso. Como um resultado, encher os pulmões com ar em cada respiração pode ser difícil, e a liberação de oxigênio para o corpo pode ser prejudicada. Isto pode levar à síndrome da angústia respiratória em indivíduos, tais como bebês.
[0029] A proteína ABCA3 é tipicamente encontrada na membrana que circunda os corpos lamelares, que são as estruturas celulares nas quais os fosfolipídeos e proteínas que compõem o tensoativo são empacotados. A proteína ABCA3 pode transportar fosfolipídeos para dentro dos corpos lamelares onde eles interagem como proteínas tensoativas para formar o tensoativo. A proteína ABCA3 também parece estar envolvida na formação de corpos lamelares normais. Além de empacotamento, os corpos lamelares podem ser importantes para o processamento correto de proteínas tensoativas, que é necessário para as proteínas amadurecerem e se tornarem funcionais. Um polirribonucleotídeo engenheirado da descrição pode ser liberado e traduzido dentro de uma célula de um indivíduo para produzir uma proteína ABCA3, um fragmento funcional da mesma, ou um homólogo funcional para tratar uma condição que está associada com, por exemplo, um defeito na produção de tensoativo.
[0030] Em alguns casos, o polirribonucleotídeo engenheirado compreende o código genético das regiões não traduzidas 5’ (UTRs) e 3’- UTRS apresentadas na Tabela 1:
[0031] O polinucleotídeo engenheirado pode compreender a sequência de mRNA do gene ABCA3 (SEQ ID NO: 8), a sequência de DNA de ABCA3 (SEQ ID NO: 9), uma sequência de DNA de ABCA3 nativa como uma 5’ CYBA UTR e uma 3’ CYBA UTR (SEQ ID NO: 10), uma sequência de mRNA de ABCA3 nativa como uma 5’ CYBA UTR e uma 3’ CYBA UTR (SEQ ID NO: 11), uma sequência de DNA de ABCA3 otimizada no códon como uma 5’ CYBA UTR e uma 3’ CYBA UTR (SEQ ID NO: 12), ou uma sequência de mRNA de ABCA3 otimizada no códon como uma 5’ CYBA UTR e uma 3’ CYBA UTR (SEQ ID NO: 13).
[0032] Em alguns casos o polirribonucleotídeo engenheirado compreende pelo menos uma porção da sequência de um gene na família do cassete de ligação de ATP (ABC). O gene na família do cassete de ligação de ATP pode ser ABCA1, ABCA3, ABCA4, ABCA12, ABCB4, ABCB7, ABCB11, ABCC2, ABCC6, ABCC8, ABCC9, ABCD1, ABCG5, ABCG8, ou CFTR. O polirribonucleotídeo engenheirado pode compreender uma sequência que seja pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% homóloga a uma sequência de um gene na família do cassete de ligação de ATP (ABC).
Polinucleotídeos Engenheirados
[0033] A presente descrição fornece moléculas de ácido nucléico, tais como polinucleotídeos, que codificam um ou mais polipeptídeos de interesse. O termo ácido nucléico inclui qualquer composto e/ou substância que compreendem um polímero de nucleotídeos. Os polímeros de nucleotídeo que contêm mais do que 50% de bases de ribose ou ribonucleotídeos modificados ou análogos de ribonucleotídeo são aludidos como polirribonucleotídeos. A sequência dos polinucleotídeos engenheirados pode ser derivada, por exemplo, de DNA, RNA, transcritos de mRNA, DNA genômico, DNA mitocondrial, RNA mitocondrial, ou um outro ácido nucléico adequado que compreende a informação genética de um gene de interesse. Os construtos de ácido nucléico, vetores, polinucleotídeos ou polirribonucleotídeos engenheirados, ou composições pode ser derivada de genes mutados que carregam ácidos nucléicos e polimorfismos.
[0034] Além dos quatro ribonucleotídeos clássicos/canônicos, a saber, adenosina, guanosina, citidina e uridina, vários RNAs celulares também contêm vários ribonucleotídeos estruturalmente diversos. Cerca de uma centena de nucleotídeos estruturalmente diferentes, nucleotídeos modificados, ou análogos de nucleotídeo foram identificados em RNAs de transferência (tRNAs), RNAs ribossômicos (rRNAs), RNA mensageiros (mRNAs) e RNAs nucleares pequenos (snRNAs). Nos tRNAs, alguns nucleotídeos ou nucleotídeos modificados podem ser determinantes importantes da especificidade e eficiência de aminoacilação e reconhecimento de códon. tais ribonucleotídeos estruturalmente diversos podem ser um ribonucleotídeo modificado ou um análogo de nucleotídeo. Em alguns casos um polinucleotídeo da descrição é engenheirado para compreender um ribonucleotídeo modificado ou análogo de ribonucleotídeo.
[0035] Os ácidos nucléicos exemplares que podem formar um polinucleotídeo da descrição incluem, mas não são limitados aos, ácidos ribonucléicos (RNAs), ácidos desoxirribonucléicos (DNAs), ou seus híbridos. Os nucleotídeos modificados exemplares que podem formar pelo menos uma fração de um polinucleotídeo da descrição incluem, mas não são limitados a, pseudouridina (^), 5-iodouridina (I5U), 5-iodocitidina (I5C), 2-tiouridina (s2U), 5-metilcitidina (m5C).
[0036] Uma modificação, tal como uma modificação química, pode estar localizada em um ou mais nucleosídeo(s) ou na cadeia principal da molécula de ácido nucléico. Ela pode estar localizada tanto em um nucleosídeo quanto em uma ligação da cadeia principal. Uma modificação pode ser engenheirada dentro de um polinucleotídeo in vitro. Ribonucleotídeos modificados e análogos do ácido nucléico também podem ser sintetizados pós-transcricionalmente pela modificação covalente dos ribonucleotídeos clássicos.
[0037] Um polirribonucleotídeo engenheirado da descrição pode compreender purinas e pirimidinas modificadas ou análogos de purina e pirimidina. Em alguns casos, um polirribonucleotídeo da descrição compreende uma pirimidina modificada, tal como uma uridina modificada e/ou uma citidina modificada. Em alguns casos uma uridina modificada ou análogo de uridina são selecionados de pseudouridina (^), 2-tiouridma (s2U), 5-metiluridina (m5U), 5-metiluridina (m5U), 5-iodouridina (I5U), 4-tiouridina (s4U), 5-bromouridina (Br5U), 2’O-metiluridina (U2’m), 2’-amino-2’- desoxiuridina (U2’NH2), 2’-azido-2’-desoxiuridina (U2’N3), e 2’-fluoro-2’- desoxiuridina (U2’F). Em alguns casos, uma citidina modificada é selecionada de 5-metilcitidina (m5C), 3-metilcitidina (m3C), 2-tiocitidina (s2C), 2’-O-metilcitidina +(C2’m), 2’-amino-2’-desoxicitidina (C2’NH2), 2’- fluoro-2’-desoxicitidina (C2’F), 5-iodocitidina (I5C), 5-bromocitidina 5’- trifosfato (Br5C) e 2’-azido-2’-desoxicitidina 5’-trifosfato (C2’N3). Observe que quando da alusão aos análogos, o precedente (ou os análogos listados nas tabelas abaixo) também se refere aos análogos na sua forma de 5’ trifosfato.
[0038] Em alguns casos o polirribonucleotídeo engenheirado compreende pelo menos um ribonucleotídeo modificado. Em alguns casos, o ribonucleotídeo modificado é pelo menos 25% mais estável no indivíduo quando comparado a um ribonucleotídeo não modificado (ou não modificados). Em alguns casos, o nucleotídeo modificado pode ser pelo menos 30% mais estável, pelo menos 35% mais estável, pelo menos 40% mais estável, pelo menos 45% mais estável, pelo menos 50% mais estável, pelo menos 55% mais estável, pelo menos 60% mais estável, pelo menos 65% mais estável, pelo menos 70% mais estável, pelo menos 75% mais estável, pelo menos 80% mais estável, pelo menos 85% mais estável, pelo menos 90% mais estável, ou pelo menos 95% mais estável no indivíduo quando comparado a um ribonucleotídeo não modificado.
[0039] Um polirribonucleotídeo pode ter nucleotídeos que foram modificados na mesma forma ou ainda uma mistura de diferentes nucleotídeos modificados. Os nucleotídeos modificados podem ter modificações que são de ocorrência natural ou não natural no RNA mensageiro. Uma mistura de vários nucleotídeos modificados pode ser usada. Por exemplo um ou mais nucleotídeos modificados dentro de um polinucleotídeo podem ter modificações naturais, enquanto uma outra parte tem modificações que não são naturalmente encontradas no mRNA. Em alguns casos, a estabilidade do RNA pode ser seletivamente otimizada mudando-se a natureza das bases modificadas dentro do polirribonucleotídeo modificado.
[0040] Os exemplos não limitantes de modificações de uridina que têm um efeito sobre a estabilidade ou imunogenicidade do polinucleotídeo são apresentados na TABELA 2.
[0041] Os exemplos não limitantes de modificações de citidina que têm um efeito sobre a estabilidade ou imunogenicidade do polinucleotídeo são apresentados na TABELA 3.
[0042] Os exemplos não limitantes de modificações de adenosina que têm um efeito sobre a estabilidade ou imunogenicidade do polinucleotídeo são apresentados na TABELA 4.
[0043] Os exemplos não limitantes de modificações de guanosina que têm um efeito sobre a estabilidade ou imunogenicidade do polinucleotídeo são apresentados na TABELA 5.
[0044] Um nucleotídeo modificado pode ser selecionado do grupo compreendendo piridin-4-ona ribonucleosídeo, 5-aza-uridina, 2-tio-5-aza- uridina, 2-tiouridina, 4-tio-pseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5- hidroxiuridina, 3-metiluridina, 5-carboximetil-uridina, 1-carboximetil- pseudouridina, 5-propinil-uridina, 1-propinil-pseudouridina, 5- taurinometiluridina, 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tio- uridina, 1-taurinometil-4-tio-uridina, 5-metil-uridina, 1-metil-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-desaza- pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-desaza-pseudouridina, di-idrouridina, di- idropseudouridina, 2-tio-di-idrouridina, 2-tio-di-idropseudouridina, 2- metoxiuridina, 2-metóxi-4-tio-uridina, 4-metóxi-pseudouridina, 4-metóxi-2- tio-pseudouridina, 5-aza-citidina, pseudoisocitidina, 3-metil-citidina, N4- acetilcitidina, 5-formilcitidina, N4-metilcitidina, 5-hidroximetilcitidina, 1- metil-pseudoisocitidina, pirrolo-citidina, pirrolo-pseudoisocitidina, 2-tio- citidina, 2-tio-5-metil-citidina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil- pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-1-desaza-pseudoisocitidina, 1-metil-1-desaza- pseudoisocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5-aza-2- tio-zebularina, 2-tio-zebularina, 2-metóxi-citidina, 2-metóxi-5-metil-citidina, 4-metóxi-pseudoisocitidina, 4-metóxi-1-metil-pseudoisocitidina, 2-amino- purina, 2, 6-diaminopurina, 7-desaza-adenina, 7-desaza-8-aza-adenina, 7- desaza-2-aminopurina, 7-desaza-8-aza-2-aminopurina, 7-desaza-2,6-diamino- purina, 7-desaza-8-aza-2,6- diaminopurina, 1-metiladenosina, N6-metil- adenosina, N6-isopenteniladenosina, N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina, 2- metiltio-N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina, N6-glicinilcarbamoil- adenosina, N6-treonilcarbamoiladenosina, 2-metiltio-N6-treonilcarbamoil- adenosina, N6,N6-dimetiladenosina, 7-metiladenina, 2-metiltio-adenina, 2- metóxi-adenina, inosina, 1-metil-inosina, viosina, vibutosina, 7-desaza- guanosina, 7-desaza-8-aza-guanosina, 6-tio-guanosina, 6-tio-7-desaza- guanosina, 6-tio-7-desaza-8-aza-guanosina, 7-metil-guanosina, 6-tio-7-metil- guanosina, 7-metilinosina, 6-metóxi-guanosina, 1-metilguanosina, N2- metilguanosina, N2,N2-dimetilguanosina, 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo- guanosina, 1-metil-6-tio-guanosina, N2-metil-6-tio-guanosina, e N2,N2- dimetil-6-tio-guanosina.
[0045] Em alguns casos, pelo menos cerca de 5 % do polirribonucleotídeo engenheirado inclui uracila, adenina, guanina, ou citosina de ocorrência não natural (por exemplo, modificadas ou engenheiradas), tais como os nucleotídeos modificados aqui descritos. Em alguns casos, pelo menos cerca de 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % do polirribonucleotídeo engenheirado inclui uracila, adenina, guanina, ou citosina de ocorrência não natural. Em alguns casos, no máximo cerca de 99 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 1 %, do polirribonucleotídeo engenheirado inclui uracila, adenina, guanina, ou citosina de ocorrência não natural.
[0046] Um polirribonucleotídeo engenheirado da descrição pode compreender uma ou mais sequências promotoras e qualquer sequência reguladora associada. Uma sequência promotora e/ou uma sequência reguladora associada pode compreender qualquer número de nucleotídeos modificados ou não modificados. As sequências promotoras e/ou qualquer sequência reguladora associada pode compreender, por exemplo, pelo menos 150 bases ou pares de base, 200 bases ou pares de base, 300 bases ou pares de base, 400 bases ou pares de base, 500 bases ou pares de base, 600 bases ou pares de base, 700 bases ou pares de base, 800 bases ou pares de base, 900 bases ou pares de base, 1000 bases ou pares de base, 2000 bases ou pares de base, 3000 bases ou pares de base, 4000 bases ou pares de base, 5000 bases ou pares de base, ou pelo menos 10000 bases ou pares de base. Uma sequência promotora e/ou uma sequência reguladora associada pode compreender qualquer número de nucleotídeos modificados ou não modificados, por exemplo, no máximo 10000 bases ou pares de base, 5000 bases ou pares de base, 4000 bases ou pares de base, 3000 bases ou pares de base, 2000 bases ou pares de base, 1000 bases ou pares de base, 900 bases ou pares de base, 800 bases ou pares de base, 700 bases ou pares de base, 600 bases ou pares de base, 500 bases ou pares de base, 400 bases ou pares de base, 300 bases ou pares de base, 200 bases ou pares de base, ou 100 bases ou pares de base.
[0047] Em alguns casos, menos do que todos dos nucleotídeos na sequência promotora ou região reguladora associada são modificadas. Por exemplo, em alguns casos, menos do que ou igual a 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, ou 5% dos nucleotídeos em uma região promotora ou reguladora associada. Em alguns casos, todos dos nucleotídeos em uma região promotora ou reguladora associada são modificados.
[0048] Um polirribonucleotídeo engenheirado da descrição pode compreender um capuz 5’ engenheirado, ou um capuz 5’ pode ser adicionado a um polirribonucleotídeo intracelularmente. A estrutura de capuz 5’ de um mRNA pode estar envolvida na ligação à Proteína de Ligação de Capuz (CBP) do mRNA, que é responsável pela estabilidade do mRNA na célula e competência de tradução através da associação de CBP como a proteína de ligação de poli(A) para formar a espécie de mRNA cíclica madura. A estrutura de capuz 5’ também pode estar envolvida na exportação nuclear, aumentos na estabilidade do mRNA, e no auxílio da remoção de introns proximais 5’ durante a junção do mRNA.
[0049] Um polirribonucleotídeo engenheirado pode ser encapuzado na extremidade 5 gerando uma ligação 5-ppp-5’-trifosfato entre um resíduo de capuz de guanosina terminal e o nucleotídeo de sentido transcrito de terminal 5 da molécula de mRNA. A estrutura de capuz pode compreender um 7- metilguanosina modificada ou não modificadas ligada ao primeiro nucleotídeo via uma ponte de trifosfato 5’-5’. Este capuz de 5-guanilato pode ser depois metilado para gerar um resíduo de N7-metil-guanilato. Os açúcares de ribose dos nucleotídeos transcritos terminais e/ou anteterminais da extremidade 5’ do mRNA opcionalmente também podem ser 2’-O-metilados. O desencapuzamento 5’ através da hidrólise e clivagem da estrutura de capuz de guanilato pode alvejar uma molécula de ácido nucléico, tal como uma molécula de mRNA, para a degradação.
[0050] Em alguns casos, um capuz pode compreender ainda modificações, incluindo a metilação dos grupos 2’ hidróxi dos primeiros açúcares de 2 ribose da extremidade 5’ do mRNA. Por exemplo, um capuz-1 eucariótico tem um grupo 2’-hidróxi metilado no primeiro açúcar de ribose, enquanto que um capuz-2 tem grupos 2’-hidróxi metilados nos primeiros dois açúcares de ribose. Tal modificação dupla pode fornecer resistência significante às 5’ exonucleases. Os exemplos não limitantes de estruturas de capuz 5’ que podem ser usadas como um polirribonucleotídeo engenheirado incluem, mas não são limitados a, m7G(5’)ppp(5’)N (Capuz-0), m7G(5’)ppp(5’)N1mpNp (Capuz-1), e 7mG(5’)-ppp(5’)N1mpN2mp (Capuz- 2).
[0051] As modificações para o mRNA modificado da presente descrição pode gerar uma estrutura de capuz não hidrolisável impedindo o desencapuzamento e assim aumentando a meia-vida do mRNA. Porque a hidrólise da estrutura de capuz requer a clivagem das ligações de 5’-ppp- 5’fosforodiéster, nucleotídeos modificados podem ser usados durante a reação de encapuzamento. Por exemplo, uma Enzima de Encapuzamento da Varíola da New England Biolabs (Ipswich, MA) pode ser usada como nucleotídeos de a-tio-guanosina de acordo com as instruções do fabricante para criar uma ligação de fosforotioato no 5’-ppp-capuz 5’. Nucleotídeos de guanosina modificados adicionais podem ser usados tais como a-metil-fosfonato e nucleotídeos de seleno-fosfato. As modificações adicionais incluem, mas não são limitadas a, 2’-O-metilação dos açúcares de ribose dos nucleotídeos do terminal 5’ e/ou anteterminal 5’ do mRNA no grupo 2’-hidroxila do anel de açúcar. Estruturas de capuz 5’ distintas múltiplas podem ser usadas para gerar o capuz 5’ de um polirribonucleotídeo.
[0052] O mRNA modificado pode ser pós-transcricionalmente encapuzado, De acordo com a presente descrição, os capuzes de terminal 5’ podem incluir capuzes endógenos ou capuzes análogos. De acordo com a presente descrição, um capuz de terminal 5’ pode compreender um análogo de guanina. Os análogos de guanina úteis incluem, mas não são limitados a, inosina, N1-metil-guanosina, 2’fluoro-guanosina, 7-desaza-guanosina, 8-oxo- guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina, e 2-azido-guanosina.
[0053] Além disso, um polirribonucleotídeo engenheirado pode conter um ou mais sítios de entrada de ribossoma interno (IRES). As sequências IRES podem iniciar a síntese de proteína na ausência da estrutura do capuz 5’. Uma sequência IRES também pode ser o único sítio de ligação de ribossoma, ou pode servir como um dos sítios de ligação de ribossoma múltiplos de um mRNA. Polirribonucleotídeos engenheirados contendo mais do que um sítio de ligação de ribossoma funcional pode codificar vários peptídeos ou polipeptídeos que são traduzidos pelos ribossomas (“polinucleotídeos policistrônicos ou multicistrônicos”). Um polinucleotídeo engenheirado aqui descrito pode compreender pelo menos 1 sequência IRES, duas sequências IRES, três sequências IRES, quatro sequências IRES, cinco sequências IRES, seis sequências IRES, sete sequências IRES, oito sequências IRES, nove sequências IRES, dez sequências IRES, ou um outro número adequado estão presentes em um polirribonucleotídeo engenheirado. Os exemplos de sequências IRES que podem ser usadas de acordo com a presente descrição incluem sem limitação, aquelas de picornavírus (por exemplo, FMDV), pestvírus (CFFV), poliovírus (PV), vírus da encefalomiocardite (ECMV), vírus da febre aftosa (FMDV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da febre suína clássica (CSFV), vírus da leucemia de murino (MLV), vírus da imunodeficiência símia (SIV) ou vírus da paralisia do grilo (CrPV). Uma sequência IRES pode ser derivada, por exemplo, de vetores comercialmente disponíveis tais como as sequências IRES disponíveis da Clontech®, GeneCopoeia®, Sigma-Aldrich®. As sequências IRES podem ter, por exemplo, pelo menos 150 bases ou pares de base, 200 bases ou pares de base, 300 bases ou pares de base, 400 bases ou pares de base, 500 bases ou pares de base, 600 bases ou pares de base, 700 bases ou pares de base, 800 bases ou pares de base, 900 bases ou pares de base, 1000 bases ou pares de base, 2000 bases ou pares de base, 3000 bases ou pares de base, 4000 bases ou pares de base, 5000 bases ou pares de base, ou 10000 bases ou pares de base. As sequências IRES podem ter no máximo 10000 bases ou pares de base, 5000 bases ou pares de base, 4000 bases ou pares de base, 3000 bases ou pares de base, 2000 bases ou pares de base, 1000 bases ou pares de base, 900 bases ou pares de base, 800 bases ou pares de base, 700 bases ou pares de base, 600 bases ou pares de base, 500 bases ou pares de base, 400 bases ou pares de base, 300 bases ou pares de base, 200 bases ou pares de base, 100 bases ou pares de base, 50 bases ou pares de base, ou 10 bases ou pares de base.
[0054] Um polirribonucleotídeo engenheirado da descrição pode compreender uma ou mais regiões não traduzidas. Uma não traduzida pode compreender qualquer número de nucleotídeos modificados ou não modificados. As regiões não traduzidas (UTRs) de um gene são transcritas mas não traduzidas dentro de um polipeptídeo. Em alguns casos, uma sequência não traduzida pode aumentar a estabilidade da molécula de ácido nucléico e a eficiência de tradução. As traços reguladores de uma UTR podem ser incorporados dentro das moléculas de mRNA modificadas da presente descrição, por exemplo, para aumentar a estabilidade da molécula. Os traços específicos também podem ser incorporados para garantir infrarregulagem controlada do transcrito no caso eles são mal direcionados para sítios de órgãos não desejados. Algumas 5’-UTRs desempenham papéis no início de tradução. Uma 5’-UTR pode compreender uma sequência Kozak que esteja envolvida no processo pelo qual o ribossoma inicia a tradução de muitos genes. As sequências Kozak podem ter a CCR(A/G)CCAUGG de consenso, onde R é uma purina (adenina ou guanina) que está localizada três bases a montante do códon de início (AUG). As 5’-UTRs podem formar estruturas secundárias que estão envolvidos na ligação do fator de alongamento de tradução. Em alguns casos, pode-se aumentar a estabilidade e produção de proteína das moléculas de polinucleotídeo engenheirado da descrição, pelo engenheiramento dos traços tipicamente descobertos em genes abundantemente expressos de órgãos alvo específicos. Por exemplo, a introdução de 5’UTR de mRNA expresso no fígado, tal como albumina, amilóide sérico A, Apolipoproteína A/B/E, transferrina, alfa fetoproteína, eritropoietina, ou Fator VIII, podem ser usadas para aumentar a expressão de um polinucleotídeo engenheirado em um fígado. Do mesmo modo, o uso de 5’-UTR de proteínas musculares (MyoD, Miosina, Mioglobina, Miogenina, Herculina), para células endoteliais (Tie-1, CD36), para células mielóide (C/EBP, AML1, G-CSF, GM-CSF, CD1 lb, MSR, Fr-1, i-NOS), para leucócitos (CD45, CD18), para tecido adiposo (CD36, GLUT4, ACRP30, adiponectina) e para células epiteliais pulmonares (SP-A/B/C/D) podem ser usadas para aumentar a expressão de um polinucleotídeo engenheirado em uma célula ou tecido desejados. Em alguns casos uma UTR da descrição pode ser derivada da sequência de um polipeptídeo de citocromo b-245 alfa (CYBA), um gene da a-globina, ou um gene da família do cassete de ligação de ATP (ABC), tal como o gene ABCA3.
[0055] Assim, em modalidades, a composição compreendendo um polirribonucleotídeo modificado da presente invenção compreende uma ou mais regiões não traduzidas (UTR) derivadas da sequência de um polipeptídeo de citocromo b-245 alfa (CYBA). Em modalidades mais preferidas, a composição compreendendo um polirribonucleotídeo modificado compreendendo uma ou mais regiões não traduzidas (UTR) derivadas da sequência de um polipeptídeo de citocromo b-245 alfa (CYBA) é uma composição em que o polirribonucleotídeo modificado codifica um gene da família do cassete de ligação de ABC como descrito aqui acima e abaixo.
[0056] No seguinte, modalidades preferidas da(s) região/regiões não traduzida(s) (UTR(s)) derivada(s) da sequência de um polipeptídeo de citocromo b-245 alfa (CYBA) são descritas: Na Tabela 1 acima, as sequências de DNA demonstrando as 5’- e 3’-UTRs do gene CYBA humano são apresentadas como SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente.
[0057] Em vista do fato de que a presente invenção predominantemente se refere a uma molécula de RNA (isto é, uma molécula de polirribonucleotídeo modificado em termos da presente invenção) referência é feita no seguinte às sequências de RNA correspondentes das ditas UTRs.
[0058] Derivada da sequência de DNA acima, a SEQ ID NO: 1 corresponde à seguinte sequência de UTR ao nível de RNA: 5’-CGCGCCUAGCAGUGUCCCAGCCGGGUUCGUGUC GCC-3’ (SEQ ID NO: 14).
[0059] Esta sequência de 5’UTR imediatamente precede o códon de início do gene CYBA humano.
[0060] Derivada da sequência de DNA acima, a SEQ ID NO: 2 corresponde à seguinte sequência de UTR ao nível de RNA: 5’-CCUCGCCCCGGACCUGCCCUCCCGCCAGGUGCAC CCACCUGCA AUAAAUGCAGCGAAGCCGGGA-3’ (SEQ ID NO: 15)).
[0061] A SEQ ID NO: 5 corresponde, ao nível de RNA à sequência apresentada na SEQ ID NO: 16.
[0062] O termo “região não traduzida” ou “UTR” como usado de acordo como a presente invenção se refere a seções do mRNA a montante do códon de início e a jusante do códon de parada que não são traduzidas, e são, portanto, chamadas de região não traduzida cinco linha (5’-UTR) e a região não traduzida três linha (3’-UTR), respectivamente. Estas regiões são transcritas como a região codificadora e assim são exônicas vista que elas estão presentes no mRNA maduro.
[0063] Como usada na presente invenção, a região não traduzida 3’ (3’-UTR) se refere à seção de RNA mensageiro (mRNA) que imediatamente segue o códon de término de tradução. Uma molécula de mRNA é transcrita a partir da sequência de DNA e é mais tarde traduzida em proteína. Várias regiões da molécula de mRNA não são traduzidas em proteína incluindo o capuz 5’, 5’-UTR, 3’-UTR, e a cauda poli-A.
[0064] Como usada na presente invenção, a região não traduzida 5’ (5’-UTR) (também conhecida como uma sequência Líder ou RNA Líder) é a região de um mRNA que está diretamente a montante do códon de início. A 5’-UTR começa no sítio de início de tradução e termina em um nucleotídeo (nt) antes do códon de início (usualmente AUG) da região codificadora. Nos procariotas, o comprimento da 5’-UTR tende a ter 3 a 10 nucleotídeos de comprimento enquanto que nos eucariotas a mesma tende a ser mais longa, geralmente de 100 a vários milhares de nucleotídeos de comprimento, mas algumas vezes também UTRs mais curtas ocorrem nos eucariotas.
[0065] Como usada na presente invenção, a 3’-UTR pode compreender regiões reguladoras dentro da região não traduzida 3’ que são conhecidas influenciar a poliadenilação e a estabilidade do mRNA. Muitas 3’- UTRs também contêm elementos ricos em AU (AREs). Além disso, a 3’- UTR contém a sequência AAUAAA que direciona a adição de várias centenas de resíduos de adenina chamadas a cauda poli(A) à extremidade do transcrito de mRNA.
[0066] Assim, uma molécula de RNA como usada de acordo como a presente invenção também pode conter uma cauda poli-A. Uma cauda poli-A é uma sequência de nucleotídeos de adenina longa (frequentemente várias centenas) adicionada à extremidade 3’ do pré-mRNA por um processo chamado de poliadenilação. Esta cauda promove a exportação e tradução a partir do núcleo, e protege o mRNA da degradação. A poliadenilação é a adição de uma cauda poli(A) a um RNA mensageiro. A cauda poli(A) consiste de monofosfatos de adenosina múltiplos; em outras palavras, a mesma é um trecho de RNA que tem apenas bases de adenina. Nos eucariotas, a poliadenilação é parte do processo que produz RNA mensageiro (mRNA) maduro para a tradução. Como aqui usada, uma cauda poli-A se refere a uma sequência de nucleotídeos de adenina localizada na extremidade 3’ do RNA. Uma cauda poli-A é habitualmente adicionada à extremidade 3’ do RNA por um processo chamado de poliadenilação. Assim, a presente invenção se refere a qualquer um dos RNA descritos acima, em que a molécula de RNA compreende uma cauda poli-A na extremidade 3’.
[0067] O comprimento da cauda poli-A não é particularmente limitada. Todavia, em modalidades preferidas, a molécula de RNA da presente invenção compreende uma cauda poli-A na extremidade 3’ em que a cauda poli-A tem um comprimento de pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou 110 nucleotídeos. Em uma modalidade mais preferida, a molécula de RNA da presente invenção compreende uma cauda poli-A na extremidade 3’ em que a cauda poli-A tem um comprimento de pelo menos 120 nucleotídeos. Em outras modalidades preferidas, a molécula de RNA da presente invenção compreende uma cauda poli-A na extremidade 3’ em que a cauda poli-A tem um comprimento de pelo menos 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 nucleotídeos.
[0068] Em uma modalidade preferida, a composição compreendendo um polirribonucleotídeo/molécula de RNA modificados da presente invenção compreendendo uma ou mais regiões não traduzidas (UTR) derivadas da sequência de um polipeptídeo de citocromo b-245 alfa (CYBA) é uma composição em que a um ou mais UTR(s) compreende(m) a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 14 ou uma sequência que apresenta de 1 a 4 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 14 e que resulta em uma molécula de RNA tendo a mesma ou uma eficiência de tradução mais alta como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 14.
[0069] “Um ou mais” neste contexto significa que a molécula de RNA pode abrigar uma UTR compreendendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 14 ou uma sequência que apresenta 1 a 4 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 14 e que resulta em uma molécula de RNA tendo a mesma ou uma eficiência de tradução mais alta como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 14 da presente invenção. A molécula de RNA também pode abrigar duas, três ou quatro destas UTRs da presente invenção. Alternativamente, a molécula de RNA também pode abrigar cinco ou ainda mais destas UTRs da presente invenção.
[0070] Em uma outra modalidade preferida, a composição compreendendo um polirribonucleotídeo/molécula de RNA modificados da presente invenção compreendendo uma ou mais regiões não traduzidas (UTR) derivadas da sequência de um polipeptídeo de citocromo b-245 alfa (CYBA) é uma composição em que a um ou mais UTR(s) compreende(m) a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 15 ou uma sequência que apresenta 1 a 7 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 15 e que resulta em uma molécula de RNA tendo a mesma ou uma eficiência de tradução mais alta como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 15.
[0071] “Um ou mais” neste contexto significa que a molécula de RNA pode abrigar uma UTR compreendendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 15 ou uma sequência que apresenta 1 a 7 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 15 e que resulta em uma molécula de RNA tendo a mesma ou uma eficiência de tradução mais alta como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 15 da presente invenção. A molécula de RNA também pode abrigar duas, três ou quatro destas UTRs da presente invenção. Alternativamente, a molécula de RNA também pode abrigar cinco ou ainda mais destas UTRs da presente invenção.
[0072] Entretanto, as UTRs derivadas do polipeptídeo do gene de citocromo b-245 alfa como usadas na presente invenção não são particularmente limitadas à sequência específica acima da SEQ ID NO: 14 mas também podem ser uma sequência de UTR que compreende uma sequência que apresenta 1 a 4 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 14. Alternativamente, a sequência de UTR também pode ser uma sequência que compreende uma sequência que apresenta 1 a 3 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 14. A sequência de UTR também pode ser uma sequência que compreende uma sequência que apresenta 1 a 2 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 14. Mais preferivelmente, a sequência de UTR também pode ser uma sequência que compreende uma sequência que apresenta 1 substituição, em comparação com a SEQ ID NO: 14.
[0073] Preferivelmente, a posição da substituição de nucleotídeo acima em comparação com a SEQ ID NO: 14 é realizada na posição 32 na sequência da SEQ ID NO: 14. Preferivelmente, o nucleotídeo “U” nesta posição é substituído por um “C”. Esta substituição é preferida visto que a mesma leva o elemento de Kozak de CYBA que está (parcialmente) presente na SEQ ID NO: 1 mais próximo da sequência de consenso de Kozak de vertebrados. A sequência de consenso de Kozak de vertebrados tem a sequência de GCCRCCAUGG (o códon de início é sublinhado enquanto “R” indica qualquer purina) enquanto que o elemento de Kozak de CYBA tem a sequência de GuCGCCAUGG (o códon de início é sublinhado enquanto o desvio da sequência de consenso de vertebrado é indicada pela letra minúscula “u”).
[0074] A(s) sequência(s) de UTR que tem/têm uma ou mais das substituições acima em comparação com a SEQ ID NO: 14 pode resultar em uma molécula de RNA na mesma ou capacidade similar em termos da eficiência de tradução como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 14, preferivelmente uma capacidade mais alta em termos da eficiência de tradução como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 14. A propriedade/capacidade de uma dada sequência de UTR modificada em comparação em termos da eficiência de tradução com uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 14 com respeito à eficiência de tradução podem ser determinadas pela pessoa habilitada pelos métodos conhecidos na técnica e como esboçado nos exemplos anexos.
[0075] A eficiência de tradução é a taxa de tradução de mRNA em polipeptídeos ou proteínas dentro das células. A eficiência de tradução de um dado mRNA é medida como o número de proteínas ou polipeptídeos que são traduzidos por mRNA por unidade de tempo. A tradução é o processo em que ribossomas celulares criam proteínas e é bem conhecido pela pessoa habilitada. Em resumo, na tradução, o RNA mensageiro (mRNA) que é produzido pela transcrição de DNA é descodificado por um ribossoma para produzir uma cadeia de aminoácido específica ou um polipeptídeo ou uma proteína.
[0076] Assim, a eficiência de tradução de uma dada molécula de RNA da presente invenção abrigando uma sequência de UTR modificada é preferivelmente mais alta em comparação com uma eficiência de tradução do mesmo RNA dado mas abrigando uma UTR da SEQ ID NO: 14. Consequentemente, o número de proteínas ou polipeptídeos codificados pelo gene do membro da família do cassete de ligação de ABC da molécula de RNA abrigando uma sequência de UTR modificada que é traduzido por RNA por unidade de tempo é mais alto do que o número de proteínas ou polipeptídeos codificados pelo gene do membro da família do cassete de ligação de ABC da molécula de RNA abrigando uma UTR da SEQ ID NO: 14 que é traduzido por RNA por unidade de tempo.
[0077] No caso a eficiência de tradução de uma dada molécula de RNA abrigando uma sequência de UTR modificada é similar ou a mesma em comparação com uma eficiência de tradução do mesmo RNA dado mas abrigando uma UTR da SEQ ID NO: 14, o número de proteínas ou polipeptídeos codificados pelo gene do membro da família do cassete de ligação de ABC da molécula de RNA abrigando uma sequência de UTR modificada que é traduzido por RNA por unidade de tempo é similar a ou o mesmo como o número de proteínas ou polipeptídeos codificados pelo gene do membro da família do cassete de ligação de ABC da molécula de RNA abrigando uma UTR da SEQ ID NO: 14 que é traduzido por RNA por unidade de tempo. A “eficiência de tradução”, por exemplo, pode ser determinada pelos métodos descritos nos exemplos anexos e como esboçado no seguinte.
[0078] Eficiência de tradução, no contexto da presente invenção, é a taxa de mRNA traduzido em proteína dentro de uma célula em um certo ponto de tempo em relação à quantidade de mRNA codificando a respectiva proteína na dita célula no mesmo ponto de tempo. Assim, a eficiência de tradução é o quociente do mRNA traduzido em proteína dentro de uma célula em um certo ponto de tempo e a quantidade de mRNA codificando a respectiva proteína. Ambos os parâmetros, isto é, o mRNA traduzido dentro de uma proteína assim como a quantidade de mRNA codificando a respectiva proteína, podem ser determinados pelos métodos conhecidos na técnica. Como foi feito nos exemplos anexos, como os exemplos não limitantes, a quantidade de mRNA traduzido em proteína dentro de uma célula pode, por exemplo, ser determinada como determinado pela citometria de fluxo (FC) enquanto a quantidade de mRNA codificando a respectiva proteína pode, por exemplo, ser medida pela qPCR.
[0079] A(s) UTR(s) compreendendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 14 ou uma sequência que apresenta 1 a 4 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 14 e que resulta em uma molécula de RNA tendo a mesma ou uma eficiência de tradução mais alta como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 14 como usada na presente invenção não é/são particularmente limitadas às sequências específicas acima e às substituições descritas acima mas também podem se referir a (uma) sequência(s) de UTR(s) que compreende(m) uma sequência que apresenta (uma) adição(ões) de nucleotídeo(s) em comparação com a SEQ ID NO: 14. A adição de (um) nucleotídeo(s) pode ser flanqueada. Assim, o(s) nucleotídeo(s) adicional(is) pode(m) ser adicionado(s) na extremidade 3’ ou extremidade 5’ da(s) UTR(s) da presente invenção. O(s) nucleotídeo(s) adicional(is) compreende(m) cadeias de polinucleotídeo de até 0 (nenhuma mudança), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos, preferivelmente de até 20 nucleotídeos ou ainda mais preferivelmente de até 30 nucleotídeos. À luz do raciocínio que a adição de nucleotídeos provavelmente não é para mudar as propriedades funcionais acima da(s) UTR(s) da invenção a adição dos nucleotídeos também pode ter um comprimento de até 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou mesmo 100 nucleotídeos ou ainda mais, até 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos contanto que estas sequências tenham uma capacidade similar (em termos da eficiência de tradução descrita acima) como a SEQ ID NO: 14, preferivelmente eficiência de tradução mais alta como a SEQ ID NO: 14 como definida acima.
[0080] Alternativamente, ou além destas adições flanqueadas de (um) nucleotídeo(s) a adição de (um) nucleotídeo(s) pode ser intercalada. Assim, o(s) nucleotídeo(s) adicional(is) pode(m) ser adicionado(s)/inserido(s) dentro da sequência de nucleotídeo da(s) UTR(s) da presente invenção. Esta(s) inserção(ões) de nucleotídeo(s) compreende(m) 1, 2, ou 3 nucleotídeos contanto que estas sequências têm uma capacidade similar (em termos da eficiência de tradução descrita acima) como a SEQ ID NO: 14, preferivelmente eficiência de tradução mais alta como a SEQ ID NO: 14 como definida acima.
[0081] As UTRs como usadas na presente invenção não são particularmente limitadas à sequência específica acima da SEQ ID NO: 14 e suas modificações. Ao invés, a sequência específica da SEQ ID NO: 14 e suas modificações meramente definem a região de núcleo 5’ de CYBA. Assim, em uma modalidade preferida, a UTR como apresentada na SEQ ID NO: 14 é prolongada na extremidade 5’ (isto é, a montante) em pelo menos 1 nucleotídeo. Em uma outra modalidade preferida, a UTR como apresentada na SEQ ID NO: 14 é prolongada na extremidade 5’ (isto é, a montante) em 1 a 20 nucleotídeos. Consequentemente, em uma modalidade preferida, a sequência da SEQ ID NO: 14 se estende em 20 nucleotídeos na extremidade 5’ (isto é, a montante). Em outras modalidades preferidas, a sequência da SEQ ID NO: 14 se estende em 18, 15, 13, 10, 7 ou 5 nucleotídeos na extremidade 5’ (isto é, a montante). Em outras modalidades preferidas, a sequência da SEQ ID NO: 14 se estende em 4, 5 ou 2 nucleotídeos na extremidade 5’ (isto é, a montante). Em outra modalidade preferida, a sequência da SEQ ID NO: 14 se estende em 1 nucleotídeo na extremidade 5’ (isto é, a montante).
[0082] Estas sequências de UTR que são prolongadas na extremidade 5’ (isto é, a montante) também podem ser modificadas como definido aqui acima para a SEQ ID NO: 14. Consequentemente, o mesmo se aplica, mutatis mutandis, às UTRs que são prolongadas na extremidade 5’ como definido acima como foi apresentado acima no contexto da UTR da SEQ ID NO: 14.
[0083] Além disso, as UTRs como usadas na presente invenção também não são particularmente limitadas à sequência específica acima da SEQ ID NO: 15, mas também pode ser uma sequência de UTR que compreende uma sequência que apresenta 1 a 7 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 15. Alternativamente, a sequência de UTR também pode ser uma sequência que compreende uma sequência que apresenta 1 a 6 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 15. A sequência de UTR também pode ser uma sequência que compreende uma sequência que apresenta 1 a 5 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 15. A sequência de UTR também pode ser uma sequência que compreende uma sequência que apresenta 1 a 4 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 15. A sequência de UTR também pode ser uma sequência que compreende uma sequência que apresenta 1 a 3 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 15. A sequência de UTR também pode ser uma sequência que compreende uma sequência que apresenta 1 a 2 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 15. A sequência de UTR também pode ser uma sequência que compreende uma sequência que apresenta 1 a 3 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 15. Mais preferivelmente, a sequência de UTR também pode ser uma sequência que compreende uma sequência que apresenta 1 substituição, em comparação com a SEQ ID NO: 15.
[0084] A(s) sequência(s) de UTR que têm uma ou mais das substituições acima em comparação com a SEQ ID NO: 15 pode(m) resultar em uma molécula de RNA na mesma ou capacidade similar em termos da eficiência de tradução como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 15, preferivelmente uma capacidade mais alta em termos da eficiência de tradução como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 15. A propriedade/ capacidade de uma dada sequência de UTR modificada em comparação com em termos da eficiência de tradução visto que uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 15 com respeito à eficiência de tradução pode ser determinada pela pessoa habilitada pelos métodos conhecidas na técnica e como esboçado nos exemplos anexos.
[0085] A eficiência de tradução é a taxa de tradução de mRNA nos polipeptídeos ou proteínas dentro das células. A eficiência de tradução de um dado mRNA é medida como o número de proteínas ou polipeptídeos que são traduzidos por mRNA por unidade de tempo. Tradução é o processo em que ribossomas celulares criam proteínas e é bem conhecida pela pessoa habilitada. Em resumo, na tradução, o RNA mensageiro (mRNA) que é produzido pela transcrição do DNA é descodificado por um ribossoma para produzir uma cadeia de aminoácido específica ou um polipeptídeo ou uma proteína.
[0086] Assim, a eficiência de tradução de uma dada molécula de RNA abrigando uma sequência de UTR modificada é preferivelmente mais alta em comparação com uma eficiência de tradução do mesmo RNA dado, mas abrigando uma UTR da SEQ ID NO: 15. Consequentemente, o número de proteínas ou polipeptídeos codificados pelo gene do membro da família do cassete de ligação de ABC da molécula de RNA abrigando uma sequência de UTR modificada que é traduzido por RNA por unidade de tempo é mais alto do que o número de proteínas ou polipeptídeos codificados pela região codificadora da molécula de RNA abrigando uma UTR da SEQ ID NO: 15 que é traduzido por RNA por unidade de tempo.
[0087] No caso a eficiência de tradução de uma dada molécula de RNA abrigando uma sequência de UTR modificada é similar ou a mesma em comparação com uma eficiência de tradução do mesmo RNA dado mas abrigando uma UTR da SEQ ID NO: 15, o número de proteínas ou polipeptídeos codificada pela região codificadora da molécula de RNA abrigando uma sequência de UTR modificada que é traduzido por RNA por unidade de tempo é similar a ou o mesmo como o número de proteínas ou polipeptídeos codificados pelo gene membro da família do cassete de ligação de ABC da molécula de RNA abrigando uma UTR da SEQ ID NO: 15 que é traduzido por RNA por unidade de tempo.
[0088] A “eficiência de tradução” pode, por exemplo, ser determinada pelos métodos descritos nos exemplos anexos e como esboçados acima.
[0089] A(s) UTR(s) compreendendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 15 ou uma sequência que apresenta 1 a 7 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 15 e que resulta em uma molécula de RNA tendo a mesma ou uma eficiência de tradução mais alta como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 15 como usada na presente invenção não é/são particularmente limitada(s) às sequências específicas acima e as substituições descritas acima mas também pode(m) se referir a (uma) sequência(s) de UTR que compreende(m) uma sequência que apresenta (uma) adição(ões) de nucleotídeo(s) em comparação com a SEQ ID NO: 15. A adição de nucleotídeo(s) pode ser flanqueada ou intercalada. Assim, o(s) nucleotídeo(s) adicional(is) pode(m) ser adicionado(s) na extremidade 3’ ou extremidade 5’ da(s) UTR(s) da presente invenção. Alternativamente, ou além deste(s) nucleotídeo(s) adicional(is) flanqueado(s), o(s) nucleotídeo(s) adicional(is) também pode(m) estar dentro da sequência de nucleotídeo da(s) UTR(s) da presente invenção. O(s) nucleotídeo(s) adicional(is) compreende(m) cadeias de polinucleotídeo de até 0 (nenhuma mudança), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos, preferivelmente de até 20 nucleotídeos ou ainda mais preferivelmente de até 30 nucleotídeos. À luz do raciocínio que a adição de nucleotídeos provavelmente não é para mudar as propriedades funcionais acima da(s) UTR(s) da invenção a adição dos nucleotídeos também pode ter um comprimento de até 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou mesmo 100 nucleotídeos ou ainda mais, até 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos contanto que estas sequências tenham uma capacidade similar (em termos da eficiência de tradução descrita acima) como a SEQ ID NO: 15, preferivelmente eficiência de tradução mais alta como SEQ ID NO: 15 como definido acima.
[0090] A(s) UTR(s) da presente invenção assim como moléculas de RNA contendo tal/tais UTR(s) pode(m) ser recombinantemente (por exemplo, em um sistema in vivo ou um in vitro) ou sinteticamente gerada(s)/sintetizada(s) pelos métodos conhecidos pela pessoa habilitada na técnica.
[0091] Mais especificamente, as UTRs da presente invenção e moléculas de RNA contendo tal/tais UTR(s) pode(m) ser produzida(s) recombinantemente em sistemas in vivo pelos métodos conhecidos pela pessoa habilitada na técnica.
[0092] Alternativamente, as UTRs da presente invenção e moléculas de RNA contendo tal/tais UTR(s) pode(m) ser produzida(s) em um sistema in vitro usando, por exemplo, um sistema de transcrição in vitro. Sistemas de transcrição in vitrosão habitualmente conhecidos e usualmente requerem um padrão de DNA linear purificado contendo uma sequência de DNA “codificando” o módulo (b) e/ou módulo (c) como esboçado em detalhes mais abaixo em que a dita sequência de DNA está sob o controle de um promotor apropriado. Além disso, um sistema de transcrição in vitrotambém habitualmente requer trifosfatos de ribonucleosídeo, um sistema tampão que inclui DTT e íons magnésio, e uma RNA polimerase apropriada que fornece a atividade enzimática para a transcrição in vitro da sequência de DNA “codificando” a(s) dita(s) UTR(s) na(s) UTR(s) da presente invenção.
[0093] Além disso, as UTRs da presente invenção e moléculas de RNA contendo tais UTR(s) podem ser quimicamente sintetizadas, por exemplo, pela síntese química convencional em um sintetizador de sequência de nucleotídeo automatizada usando um suporte de fase sólida e técnicas padrão ou pela síntese química das respectivas sequências de DNA e subsequente transcrição in vitro ou in vivo da mesma.
[0094] Na biologia molecular e genéticas, a montante e a jusante ambas se referem a uma posição relativa em uma molécula de RNA. No contexto da presente invenção, a montante é na direção da extremidade 5’ da molécula de RNA e a jusante é na direção da extremidade 3’ da molécula.
[0095] Consequentemente, em uma modalidade, a UTR compreendendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 14 ou uma sequência que tem 1 a 4 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 14 e que resulta em uma molécula de RNA tendo a mesma ou uma eficiência de tradução mais alta como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 14 como definida acima (no seguinte aludido como “módulo (b)”) está localizada a montante do polirribonucleotídeo modificado codificando o membro da família do cassete de ligação de ABC como descrito aqui acima e abaixo (no seguinte aludido como “módulo (a)”). Além disso, em uma modalidade, a UTR compreendendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 15 ou uma sequência que apresenta 1 a 7 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 15 e que resulta em uma molécula de RNA tendo a mesma ou uma eficiência de tradução mais alta como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 15 como definida acima (no seguinte aludido como “módulo (c)”) está localizado a jusante do polirribonucleotídeo modificado codificando o membro da família do cassete de ligação de ABC como descrito aqui acima e abaixo (no seguinte aludido como “módulo (a)”). Todavia, preferivelmente, o gene codificando membro da família do cassete de ligação de ABC (“módulo (a)”) está localizado entre o módulo (b) da UTR e o módulo (c) da UTR e, consequentemente, a molécula de RNA preferivelmente tem o arranjo de 5’-(b)-(a)-(c)-3’.
[0096] No caso a molécula de RNA abriga apenas um módulo de UTR (isto é, o módulo (b) (isto é, a uma ou mais UTR(s) compreendendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 14 ou uma sequência que apresenta 1 a 4 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 14 e que resulta em uma molécula de RNA tendo a mesma ou uma eficiência de tradução mais alta como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 14 como definida acima) ou módulo (c) (isto é, a uma ou mais UTR(s) compreendendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 15 ou uma sequência que apresenta 1 a 7 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 15 e que resulta em uma molécula de RNA tendo a mesma ou uma eficiência de tradução mais alta como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 15 como definida acima)) a molécula de RNA preferivelmente tem o arranjo de 5’-(b)- (a)-3’ ou 5’-(a)-(c)-3’.
[0097] No seguinte, arranjos preferidos dos módulos (b) e/ou (c) da UTR da presente invenção em relação ao polirribonucleotídeo modificado codificando o membro da família do cassete de ligação de ABC (“módulo (a)”) são descritos em que o módulo (b) da UTR (correspondendo ao fragmento 5’-UTR definido acima do mRNA de CYBA) está localizado a montante da região codificadora (isto é, na extremidade 5’ da região codificadora) e/ou o módulo (c) da UTR (correspondendo à 3’-UTR definida acima do mRNA de CYBA) está localizada a jusante da região codificadora (isto é, na extremidade 3’ da região codificadora).
[0098] Assim, em uma modalidade preferida, e de acordo como o precedente, a presente invenção se refere a uma molécula de RNA compreendendo (a) um polirribonucleotídeo modificado, isto é, uma região codificadora codificando o membro da família do cassete de ligação de ABC; e (b) uma ou mais UTR(s) compreendendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 14 ou uma sequência que apresenta 1 a 4 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 14 e que resulta em uma molécula de RNA tendo a mesma ou uma eficiência de tradução mais alta como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 14, e em que as ditas UTRs como definidas em (b) está/estão localizada(s) na extremidade 5’ da região codificadora como definida em (a).
[0099] Em uma modalidade preferida, e de acordo como o precedente, a presente invenção se refere a uma molécula de RNA compreendendo (a) uma região codificadora codificando um membro da família do cassete de ligação de ABC; e (c) uma ou mais UTR(s) compreendendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 15 ou uma sequência que apresenta 1 a 7 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 15 e que resulta em uma molécula de RNA tendo a mesma ou uma eficiência de tradução mais alta como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 15, em que a(s) dita(s) UTR(s) como definida(s) em (c) está/estão localizada(s) na extremidade 3’ da região codificadora como definida em (a).
[00100] Em uma modalidade preferida, e de acordo como o precedente, a presente invenção se refere a uma molécula de RNA compreendendo (a) uma região codificadora codificando um membro da família do cassete de ligação de ABC; e (b) uma ou mais UTR(s) compreendendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 14 ou uma sequência que apresenta 1 a 4 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 14 e que resulta em uma molécula de RNA tendo a mesma ou uma eficiência de tradução mais alta como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 14; e (c) uma ou mais UTR(s) compreendendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 15 ou uma sequência que apresenta 1 a 7 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 15 e que resulta em uma molécula de RNA tendo a mesma ou uma eficiência de tradução mais alta como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 15, em que a(s) dita(s) UTR(s) como definida(s) em (b) está/estão localizada(s) na extremidade 5’ da região codificadora como definido em (a) e em que a(s) dita(s) UTR(s) como definida(s) em (c) está/estão localizada(s) na extremidade 3’ da região codificadora como definida em (a).
[00101] Em uma modalidade preferida, e de acordo como o precedente, a presente invenção se refere a uma molécula de RNA compreendendo (a) uma região codificadora codificando um membro da família do cassete de ligação de ABC; e (b) uma UTR compreendendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 14 ou uma sequência que apresenta 1 a 4 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 14 e que resulta em uma molécula de RNA tendo a mesma ou uma eficiência de tradução mais alta como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 14; e (c) duas UTRs compreendendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 15 ou uma sequência que apresenta 1 a 7 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 15 e que resulta em uma molécula de RNA tendo a mesma ou uma eficiência de tradução mais alta como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 15; em que adita molécula de RNA compreende a dita uma UTR como definida em (b) na extremidade 5’ da região codificadora como definida em (a) e que compreende as ditas duas UTRs como definidas em (c) na extremidade 3’ da região codificadora como definida em (a).
[00102] Em uma modalidade preferida, e de acordo como o precedente, a presente invenção se refere a uma molécula de RNA compreendendo (a) uma região codificadora codificando um membro da família do cassete de ligação de ABC; e (c) duas UTRs compreendendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 15 ou uma sequência que apresenta 1 a 7 substituições em comparação com a SEQ ID NO: 15 e que resulta em uma molécula de RNA tendo a mesma ou uma eficiência de tradução mais alta como uma molécula de RNA compreendendo uma UTR compreendendo a SEQ ID NO: 15, em que a dita molécula de RNA compreende as ditas duas UTRs como definidas em (c) na extremidade 3’ da região codificadora como definida em (a).
[00103] O construto de acordo com a presente invenção pode não apenas compreender os três módulos principais (a), (b) e/ou (c) acima. Preferivelmente, pode ser desejável que entre os módulos individuais (uma) porção/porções ligadora(s) e/ou (um) sítio(s) de clonagem múltipla é/são colocado(s) que pode(m), por exemplo, facilitar a construção do construto. As porções ligadoras e sítios de clonagem múltipla adequados são conhecidos pela pessoa habilitada.
[00104] A posição dos módulos (b) e/ou (c) da UTR dentro da molécula de RNA da presente invenção em relação ao módulo (a) (isto é, a região codificadora codificando um membro da família do cassete de ligação de ABC), não é particularmente limitada e, consequentemente, entre os módulos individuais da molécula de RNA da presente invenção pode haver um espaçamento ou um intervalo cheio com um ou mais nucleotídeos G, A, U e/ou C que não são parte dos módulos principais (a), (b) e/ou (c).
[00105] “Um ou mais nucleotídeos G, A, U e/ou C” neste contexto significa que o espaçamento ou intervalo entre os módulos individuais da molécula de RNA da presente invenção é/são cheios com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos G, A, U e/ou C. Em outras modalidades preferidas, o espaçamento ou intervalo entre os módulos individuais da molécula de RNA da presente invenção são cheios como 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou 110 ou mais nucleotídeos G, A, U e/ou C.
[00106] Todavia, em uma modalidade preferida, o módulo (b) ou (c) da UTR, dentro da molécula de RNA da presente invenção em relação ao módulo (a) (isto é, a região codificadora codificando um membro da família do cassete de ligação de ABC), é diretamente colocado adjacente ao códon de início da região codificadora do módulo (a) sem qualquer espaçamento ou intervalo entre eles, isto é, diretamente a montante do códon de início da região codificadora do módulo (a).
[00107] Em uma outra modalidade preferida, o módulo (b) ou (c) da UTR, dentro da molécula de RNA da presente invenção em relação ao módulo (a) (isto é, a região codificadora), é diretamente colocada adjacente ao códon de terminação (isto é, o códon de parada) da região codificadora do módulo (a) codificando um membro da família do cassete de ligação de ABC sem qualquer espaçamento ou intervalo entre eles, isto é, diretamente a jusante do códon de terminação/códon de parada da região codificadora do módulo (a) codificando um membro da família do cassete de ligação de ABC.
[00108] Em uma modalidade preferida, o módulo (b) da UTR, dentro da molécula de RNA da presente invenção em relação ao módulo (a) (isto é, a região codificadora codificando um membro da família do cassete de ligação de ABC), é diretamente colocado adjacente ao códon de início da região codificadora do módulo (a) codificando um membro da família do cassete de ligação de ABC sem qualquer espaçamento ou intervalo entre eles, isto é, diretamente a montante do códon de início da região codificadora do módulo (a) codificando um membro da família do cassete de ligação de ABC e o módulo (c) da UTR, dentro da molécula de RNA da presente invenção em relação ao módulo (a) (isto é, a região codificadora codificando um membro da família do cassete de ligação de ABC), é diretamente colocado adjacente ao códon de terminação (isto é, o códon de parada) da região codificadora do módulo (a) codificando um membro da família do cassete de ligação de ABC sem qualquer espaçamento ou intervalo entre eles, isto é, diretamente a jusante do códon de terminação/códon de parada da região codificadora do módulo (a) codificando um membro da família do cassete de ligação de ABC.
[00109] Em modalidades ainda mais preferidas, a composição compreendendo um polirribonucleotídeo modificado da presente invenção compreendendo uma ou mais regiões não traduzidas (UTRs) derivadas da sequência de um polipeptídeo de citocromo b-245 alfa (CYBA) como definido aqui acima é uma composição em que o polinucleotídeo modificado codifica a proteína 3 (ABCA3) do cassete de ligação de ABC (ABC), preferivelmente codifica a proteína ABCA3 humana, em que o dito polinucleotídeo modificado inclui uma sequência de códon que é otimizado para a tradução dentro das células do indivíduo exposto ao polirribonucleotídeo modificado.
[00110] Em uma modalidade mais preferida, a composição compreendendo um polirribonucleotídeo modificado da presente invenção compreendendo uma ou mais regiões não traduzidas (UTRs) derivadas da sequência de um polipeptídeo de citocromo b-245 alfa (CYBA) como definido aqui acima é a sequência de mRNA de uma sequência de DNA de ABCA3 otimizada no códon como uma 5’ CYBA UTR e uma 3’ CYBA UTR (SEQ ID NO: 12), ou uma sequência de mRNA de ABCA3 otimizada no códon como uma 5’ CYBA UTR e uma 3’ CYBA UTR (SEQ ID NO: 13).
[00111] Outras sequências não UTR podem ser incorporadas nas 5’ (ou 3’-UTR) UTRs dos polirribonucleotídeos da presente descrição. A 5’ e/ou 3’- UTRs podem fornecer a estabilidade e/ou eficiência de tradução de polirribonucleotídeos. Por exemplo, introns ou porções de sequências de intron podem ser incorporados nas regiões flanqueadas de um polirribonucleotídeo engenheirado. A incorporação de sequências intrônicas também pode aumentar a taxa de tradução do polirribonucleotídeo.
[00112] As 3’-UTRs podem ter trechos de Adenosinas e Uridinas embutidas nelas. Estas assinaturas ricas em AU são particularmente prevalecentes em genes como altas taxas de metabolização. Com base nos seus traços de sequência e propriedades funcionais, os elementos ricos em AU (AREs) podem ser separados em classes: AREs da Classe I contêm várias cópias dispersas de um motivo AUUUA dentro de regiões ricas em U. C-Myc e MyoD contêm AREs classe I. AREs da classe II possuem dois ou mais nonâmeros UUAUUUA(U/A)(U/A) sobrepostos. Moléculas contendo este tipo de AREs incluem GM-CSF e TNF-a. ARES da classe III são menos bem definidos. Estas regiões ricas em U não contêm um motivo AUUUA c-Jun e Miogenina são dois exemplos bem estudados desta classe. A ligação de proteínas aos AREs pode desestabilizar o mensageiro, ao passo que membros da família ELAV, tais como HuR, podem aumentar a estabilidade do mRNA. HuR pode ligar aos AREs de todas as três classes. O engenheiramento dos sítios de ligação específicos de HuR na 3’-UTR de moléculas de ácido nucléico pode levar à ligação de HuR e assim, a estabilização da mensagem in vivo.
[00113] O engenheiramento de elementos 3’-UTR ricos em AU (AREs) pode ser usado para modular a estabilidade de um polirribonucleotídeo engenheirado. Uma ou mais cópias de um ARE podem ser engenheiradas dentro de um polirribonucleotídeo para modular a estabilidade de um polirribonucleotídeo. AREs podem ser identificados, removidos ou mutados para aumentar a estabilidade intracelular e assim aumentar a tradução e produção da proteína resultante. Experimentos de transfecção podem ser conduzidos em linhagens de célula relevantes, usando polirribonucleotídeos engenheirados e a produção de proteína pode ser ensaiada em vários pontos de tempo após a transfecção. Por exemplo, as células podem ser transfectadas como moléculas de engenheiramento de ARE diferentes e usando-se um kit de ELISA para a proteína relevante e ensaiando a proteína produzida em 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, e 7 dias após a transfecção.
[00114] Uma região não traduzida pode compreender qualquer número de nucleotídeos. Uma região não traduzida pode compreender um comprimento de cerca de 1 a cerca de 10 bases ou pares de base, cerca de 10 a cerca de 20 bases ou pares de base, cerca de 20 a cerca de 50 bases ou pares de base, cerca de 50 a cerca de 100 bases ou pares de base, cerca de 100 a cerca de 500 bases ou pares de base, cerca de 500 a cerca de 1000 bases ou pares de base, cerca de 1000 a cerca de 2000 bases ou pares de base, cerca de 2000 a cerca de 3000 bases ou pares de base, cerca de 3000 a cerca de 4000 bases ou pares de base, cerca de 4000 a cerca de 5000 bases ou pares de base, cerca de 5000 a cerca de 6000 bases ou pares de base, cerca de 6000 a cerca de 7000 bases ou pares de base, cerca de 7000 a cerca de 8000 bases ou pares de base, cerca de 8000 a cerca de 9000 bases ou pares de base, ou cerca de 9000 a cerca de 10000 bases ou pares de base no comprimento. Uma região não traduzida pode compreender um comprimento de por exemplo, pelo menos 1 base ou par de base, 2 bases ou pares de base, 3 bases ou pares de base, 4 bases ou pares de base, 5 bases ou pares de base, 6 bases ou pares de base, 7 bases ou pares de base, 8 bases ou pares de base, 9 bases ou pares de base, 10 bases ou pares de base, 20 bases ou pares de base, 30 bases ou pares de base, 40 bases ou pares de base, 50 bases ou pares de base, 60 bases ou pares de base, 70 bases ou pares de base, 80 bases ou pares de base, 90 bases ou pares de base, 100 bases ou pares de base, 200 bases ou pares de base, 300 bases ou pares de base, 400 bases ou pares de base, 500 bases ou pares de base, 600 bases ou pares de base, 700 bases ou pares de base, 800 bases ou pares de base, 900 bases ou pares de base, 1000 bases ou pares de base, 2000 bases ou pares de base, 3000 bases ou pares de base, 4000 bases ou pares de base, 5000 bases ou pares de base, 6000 bases ou pares de base, 7000 bases ou pares de base, 8000 bases ou pares de base, 9000 bases ou pares de base, ou 10000 bases ou pares de base no comprimento.
[00115] Um polirribonucleotídeo engenheirado da descrição pode compreender um ou mais introns. Um intron pode compreender qualquer número de nucleotídeos modificados ou não modificados. Um intron pode compreender, por exemplo, pelo menos 1 base ou par de base, 50 bases ou pares de base, 100 bases ou pares de base, 150 bases ou pares de base, 200 bases ou pares de base, 300 bases ou pares de base, 400 bases ou pares de base, 500 bases ou pares de base, 600 bases ou pares de base, 700 bases ou pares de base, 800 bases ou pares de base, 900 bases ou pares de base, 1000 bases ou pares de base, 2000 bases ou pares de base, 3000 bases ou pares de base, 4000 bases ou pares de base, ou 5000 bases ou pares de base. Em alguns casos, um intron pode compreender, por exemplo, no máximo 10000 bases ou pares de base, 5000 bases ou pares de base, 4000 bases ou pares de base, 3000 bases ou pares de base, 2000 bases ou pares de base, 1000 bases ou pares de base, 900 bases ou pares de base, 800 bases ou pares de base, 700 bases ou pares de base, 600 bases ou pares de base, 500 bases ou pares de base, 400 bases ou pares de base, 300 bases ou pares de base, 200 bases ou pares de base, ou 100 bases ou pares de base.
[00116] Em alguns casos, uma porcentagem dos nucleotídeos em um intron é modificada. Por exemplo, em alguns casos, menos do que 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ou 1% dos nucleotídeos em um intron são modificadas. Em alguns casos, todos os nucleotídeos em um intron são modificados.
[00117] Um polirribonucleotídeo engenheirado da descrição pode compreender uma sequência poliA. Uma sequência poliA (por exemplo, cauda poliA) pode compreender qualquer número de nucleotídeos. Uma sequência poliA pode compreender um comprimento de cerca de 1 a cerca de 10 bases ou pares de base, cerca de 10 a cerca de 20 bases ou pares de base, cerca de 20 a cerca de 50 bases ou pares de base, cerca de 50 a cerca de 100 bases ou pares de base, cerca de 100 a cerca de 500 bases ou pares de base, cerca de 500 a cerca de 1000 bases ou pares de base, cerca de 1000 a cerca de 2000 bases ou pares de base, cerca de 2000 a cerca de 3000 bases ou pares de base, cerca de 3000 a cerca de 4000 bases ou pares de base, cerca de 4000 a cerca de 5000 bases ou pares de base, cerca de 5000 a cerca de 6000 bases ou pares de base, cerca de 6000 a cerca de 7000 bases ou pares de base, cerca de 7000 a cerca de 8000 bases ou pares de base, cerca de 8000 a cerca de 9000 bases ou pares de base, ou cerca de 9000 a cerca de 10000 bases ou pares de base no comprimento. Em alguns exemplos, uma sequência poliA tem pelo menos cerca de 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou 200 nucleotídeos no comprimento. Uma sequência poliA pode compreender um comprimento de por exemplo, pelo menos 1 base ou par de base, 2 bases ou pares de base, 3 bases ou pares de base, 4 bases ou pares de base, 5 bases ou pares de base, 6 bases ou pares de base, 7 bases ou pares de base, 8 bases ou pares de base, 9 bases ou pares de base, 10 bases ou pares de base, 20 bases ou pares de base, 30 bases ou pares de base, 40 bases ou pares de base, 50 bases ou pares de base, 60 bases ou pares de base, 70 bases ou pares de base, 80 bases ou pares de base, 90 bases ou pares de base, 100 bases ou pares de base, 200 bases ou pares de base, 300 bases ou pares de base, 400 bases ou pares de base, 500 bases ou pares de base, 600 bases ou pares de base, 700 bases ou pares de base, 800 bases ou pares de base, 900 bases ou pares de base, 1000 bases ou pares de base, 2000 bases ou pares de base, 3000 bases ou pares de base, 4000 bases ou pares de base, 5000 bases ou pares de base, 6000 bases ou pares de base, 7000 bases ou pares de base, 8000 bases ou pares de base, 9000 bases ou pares de base, ou 10000 bases ou pares de base no comprimento. Uma sequência poliA pode compreender um comprimento de no máximo 100 bases ou pares de base, 90 bases ou pares de base, 80 bases ou pares de base, 70 bases ou pares de base, 60 bases ou pares de base, 50 bases ou pares de base, 40 bases ou pares de base, 30 bases ou pares de base, 20 bases ou pares de base, 10 bases ou pares de base, ou 5 bases ou pares de base.
[00118] Em alguns casos, uma porcentagem dos nucleotídeos em uma sequência poli-A é modificada. Por exemplo, em alguns casos, menos do que 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ou 1% dos nucleotídeos em uma sequência poli-A são modificados. Em alguns casos, todos os nucleotídeos em uma poli-A são modificados.
[00119] Uma sequência ligadora pode compreender qualquer número de nucleotídeos. Um ligador pode ser ligado à nucleobase modificada em uma posição N-3 ou C-5. O ligador ligado à nucleobase pode ser dietileno glicol, dipropileno glicol, trietileno glicol, tripropileno glicol, tetraetileno glicol, tetraetileno glicol, porção alquila bivalente, alquenila, alquinila, éster, amida, ou uma porção éter. Uma sequência ligadora pode compreender um comprimento de cerca de 1 a cerca de 10 bases ou pares de base, cerca de 10 a cerca de 20 bases ou pares de base, cerca de 20 a cerca de 50 bases ou pares de base, cerca de 50 a cerca de 100 bases ou pares de base, cerca de 100 a cerca de 500 bases ou pares de base, cerca de 500 a cerca de 1000 bases ou pares de base, cerca de 1000 a cerca de 2000 bases ou pares de base, cerca de 2000 a cerca de 3000 bases ou pares de base, cerca de 3000 a cerca de 4000 bases ou pares de base, cerca de 4000 a cerca de 5000 bases ou pares de base, cerca de 5000 a cerca de 6000 bases ou pares de base, cerca de 6000 a cerca de 7000 bases ou pares de base, cerca de 7000 a cerca de 8000 bases ou pares de base, cerca de 8000 a cerca de 9000 bases ou pares de base, ou cerca de 9000 a cerca de 10000 bases ou pares de base no comprimento. Uma sequência ligadora pode compreender um comprimento de por exemplo, pelo menos 1 base ou par de base, 2 bases ou pares de base, 3 bases ou pares de base, 4 bases ou pares de base, 5 bases ou pares de base, 6 bases ou pares de base, 7 bases ou pares de base, 8 bases ou pares de base, 9 bases ou pares de base, 10 bases ou pares de base, 20 bases ou pares de base, 30 bases ou pares de base, 40 bases ou pares de base, 50 bases ou pares de base, 60 bases ou pares de base, 70 bases ou pares de base, 80 bases ou pares de base, 90 bases ou pares de base, 100 bases ou pares de base, 200 bases ou pares de base, 300 bases ou pares de base, 400 bases ou pares de base, 500 bases ou pares de base, 600 bases ou pares de base, 700 bases ou pares de base, 800 bases ou pares de base, 900 bases ou pares de base, 1000 bases ou pares de base, 2000 bases ou pares de base, 3000 bases ou pares de base, 4000 bases ou pares de base, 5000 bases ou pares de base, 6000 bases ou pares de base, 7000 bases ou pares de base, 8000 bases ou pares de base, 9000 bases ou pares de base, ou pelo menos 10000 bases ou pares de base no comprimento. Um ligador no máximo 10000 bases ou pares de base, 5000 bases ou pares de base, 4000 bases ou pares de base, 3000 bases ou pares de base, 2000 bases ou pares de base, 1000 bases ou pares de base, 900 bases ou pares de base, 800 bases ou pares de base, 700 bases ou pares de base, 600 bases ou pares de base, 500 bases ou pares de base, 400 bases ou pares de base, 300 bases ou pares de base, 200 bases ou pares de base, ou 100 bases ou pares de base no comprimento.
[00120] Em alguns casos, uma porcentagem dos nucleotídeos em uma sequência ligadora é modificada. Por exemplo, em alguns casos, menos do que 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ou 1% dos nucleotídeos em uma sequência ligadora são modificados. Em alguns casos, todos os nucleotídeos em uma sequência ligadora são modificados.
[00121] Em alguns casos, um polirribonucleotídeo engenheirado pode incluir pelo menos um códon de parada antes da região 3’ não traduzida (UTR). Em alguns casos, um polirribonucleotídeo engenheirado inclui códons de parada múltiplos. O códon de parada pode ser selecionado de TGA, TAA e TAG. O códon de parada pode ser modificado ou não modificado. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo engenheirado inclui o códon de parada TGA e um códon de parada adicional. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo engenheirado inclui a adição do códon de parada TAA. Polipeptídeos Codificados
[00122] Os polipeptídeos codificados são cadeias poliméricas compreendidas de monômeros de resíduo de aminoácido que são unidos entre si através de ligações de amida (ligações peptídicas). Os aminoácidos podem ser o isômero óptico L ou o isômero óptico D. Um polipeptídeo pode ser uma cadeia de pelo menos três aminoácidos, miméticos de peptídeo, uma proteína, uma proteína recombinante, um anticorpo (monoclonal ou policlonal), um antígeno, um epítopo, uma enzima, um receptor, uma vitamina, ou uma estrutura análoga ou combinações dos mesmos. Um polirribonucleotídeo que é traduzido dentro do corpo de um indivíduo pode gerar um amplo fornecimento de peptídeos ou proteínas específicos dentro de uma célula, um tecido, ou através de muitas células e tecidos de um indivíduo. Em alguns casos, um polirribonucleotídeo pode ser traduzido in vivo dentro do citossol de uma tipo de célula(s) alvo(s) específica(s) ou tecido alvo. Em alguns casos, um polirribonucleotídeo pode ser traduzido in vivo para fornecer uma proteína ABCA3, um fragmento funcional da mesma, ou uma proteína que é pelo menos 70% homóloga a uma proteína ABCA3 humana. Em alguns casos, um polirribonucleotídeo pode ser traduzido in vivo em vários tipos de célula não alvo ou tecido(s) alvo(s). Os exemplos não limitantes de células que ser células alvo ou não alvo incluem: a) células da pele, por exemplo: queratinócitos, melanócitos, células uroteliais; b) células neurais, por exemplo: neurônios, células de Schwann, oligodendrócitos, astrócitos; c) células hepáticas, por exemplo: hepatócitos; d) células intestinais, por exemplo: célula caliciforme, enterócitos; e) células sanguíneas; por exemplo: células linfóides ou mielóides. Os exemplos não limitantes de tecidos incluem tecido conectivo, tecido muscular, tecido nervoso, ou tecido epitelial. Em alguns casos, uma célula alvo ou um tecido alvo é uma célula, tecido, ou órgão cancerosos.
[00123] Uma sequência de polinucleotídeo pode ser derivada de uma ou mais espécies. Por exemplo, uma sequência de polinucleotídeo pode ser derivada de um ser humano (Homo sapiens), um camundongo (por exemplo, Mus musculus), um rato (por exemplo, Rattus norvegicus ou Rattus rattus), um camelo (por exemplo, Camelus dromedarius ou Camelus bactrianus), um lhama (Lama vicugna), ou qualquer outra criatura adequada. Uma sequência de polinucleotídeo pode ser uma combinação quimérica da sequência de uma ou mais espécies.
[00124] Em alguns casos, o mecanismo traducional endógeno pode adicionar uma modificação pós-translacional ao peptídeo codificado. Uma modificação pós-translacional pode envolver a adição de grupos hidrofóbicos que pode alvejar o polipeptídeo para a localização de membrana, a adição de cofatores para a atividade enzimática aumentada, ou a adição de grupos químicos menores. O polipeptídeo codificado também pode ser pós- traducionalmente modificada para receber a adição de outros peptídeos ou porções de proteína. Por exemplo, a ubiquitinação pode levar à ligação covalente de ubiquitina ao polipeptídeo codificado, a SUMOilação pode levar à ligação covalente de SUMO (MOdificador relacionado com a Ubiquitina Pequena) ao polipeptídeo codificado, a ISGuilação pode levar à ligação covalente de ISG15 (Gene 15 Estimulado pelo Interferon).
[00125] Em alguns casos, o polipeptídeo codificado pode ser pós- traducionalmente modificado para sofrer outros tipos de mudanças estruturais. Por exemplo, o polipeptídeo codificado pode ser proteoliticamente clivado, e um ou mais fragmentos proteolíticos podem modular a atividade de um caminho intracelular. O polipeptídeo codificado pode ser dobrado intracelularmente. Em alguns casos, o polipeptídeo codificado é dobrado na presença de cofatores e chaperonas molecular. Um polipeptídeo dobrado pode ter uma estrutura secundária e uma estrutura terciária. Um polipeptídeo dobrado pode associar-se como outros peptídeos dobrados para formar uma estrutura quaternária. Um peptídeo dobrado pode folio um complexo funcional de subunidade múltipla, tal como uma molécula de anticorpo, que tem uma estrutura quaternária tetramérica. Vários polipeptídeos que formam classes ou isótipos de anticorpos podem ser expressos a partir de um polirribonucleotídeo.
[00126] O polipeptídeo codificado pode ser pós-traducionalmente modificado para mudar a natureza química dos aminoácidos codificados. Por exemplo, o polipeptídeo codificado pode sofre a citrulinação ou desiminação pós-traducional, a conversão de arginina para citrulina. O polipeptídeo codificado pode sofrer desamidação pós-traducional; a conversão de glutamina para ácido glutâmico ou asparagina para ácido aspártico. O polipeptídeo codificado pode sofrer eliminilação, a conversão de um alqueno pela beta-eliminação de fosfotreonina e fosfosserina, ou desidratação de treonina e serina, assim como pela descarboxilação de cisteína. O peptídeo codificado também pode sofrer carbamilação, a conversão de lisina para homocitrulina. Um peptídeo codificado também pode sofrer racemização, por exemplo, racemização de prolina pela prolil isomerase ou racemização de serina pela proteína-serina epimerase.
[00127] A atividade de uma pluralidade de biomoléculas pode ser modulada por uma molécula codificada por um polirribonucleotídeo. Os exemplos não limitantes de moléculas cujas atividades podem ser moduladas por um polinucleotídeo codificado incluem: aminoácidos, peptídeos, miméticos de peptídeo, proteínas, anticorpos de proteínas recombinantes (monoclonais ou policlonais), fragmentos de anticorpo, antígenos, epítopos, carboidratos, lipídeos, ácidos graxos, enzimas, produtos naturais, ácidos nucléicos (incluindo DNA, RNA, nucleosídeos, nucleotídeos, análogos estruturais ou combinações dos mesmos), nutrientes, receptores, e vitaminas.
[00128] Os exemplos não limitantes de sequências de nucleotídeo que podem ser uma parte de um polinucleotídeo da descrição são descritos na TABELA 6.
[00129] Uma sequência de polipeptídeo pode compartilhar uma % de homologia para uma sequência de aminoácido de um polipeptídeo endógeno. Uma sequência de polipeptídeo pode compartilhar no máximo 10% de homologia, no máximo 20% de homologia, no máximo 30% de homologia, no máximo 40% de homologia, no máximo 50% de homologia, no máximo 60% de homologia, no máximo 70% de homologia, no máximo 80% de homologia, no máximo 90% de homologia, ou no máximo 99% de homologia como uma sequência de aminoácido de um polipeptídeo endógeno. Vários métodos e programas de software podem ser usados para determinar a homologia entre dois ou mais peptídeos, tais como NCBI BLAST, Clustal W, MAFFT, Clustal Omega, AlignMe, Praline, ou um outro método ou algoritmo adequados.
Imunogenicidade
[00130] Muitos agentes farmacêuticos, incluindo composições compreendendo moléculas de vários tamanhos (polinucleotídeos, proteínas, ou enzimas) podem deflagrar uma resposta imune quando administrados a um indivíduo. Em muitos casos, o sistema imune reconhece a composição como um corpo estranho e neutraliza a sua ação farmacêutica. Um polirribonucleotídeo e uma composição da presente descrição pode ter imunogenicidade baixa ou ser não imunogênica, deflagrando deste modo uma resposta pequena pelo sistema imune, ou não deflagrando nenhuma resposta imune de modo nenhum.
[00131] A imunogenicidade também pode ser determinada pela medição, por exemplo, dos níveis de TNF-a e IL-8 e da capacidade de ligação a TLR-3, TLR-7, TLR-8 e helicase RIG-1. De modo a estabelecer deste modo se um polirribonucleotídeo tem uma imunogenicidade baixa desejada, a quantidade de um ou mais dos fatores pode ser medida depois da administração do polirribonucleotídeo a um indivíduo. A imunogenicidade de um polipeptídeo pode ser determinada em relação a um aumento no número de células sanguíneas brancas na administração do polipeptídeo ao indivíduo. Em alguns casos, na administração da composição ao indivíduo, o indivíduo exibe um aumento no número de células sanguíneas brancas que é menor do que 90%, menor do que 80%, menor do que 70%, menor do que 60%, menor do que 50%, menor do que 40%, menor do que 30%, menor do que 20%, ou menor do que 10%. Um polirribonucleotídeo da descrição pode deflagrar reações inflamatórias ou imunológicas mínimas ou insignificantes.
[00132] Para a determinação da imunogenicidade de um polirribonucleotídeo, vários métodos podem ser usados. Um método muito adequado é a determinação de marcadores inflamatórios nas células ou uma simples contagem de célula sanguínea branca, como uma reação à administração do polirribonucleotídeo. Um tal método é descrito nos exemplos. As citocinas que são associadas com inflamação, tais como, por exemplo TNF-a, IFN-a, IFN-ß, IL-8, IL-6, e/ou IL-12, podem ser medidas. A expressão de marcadores da ativação de célula dendrítica também pode ser usada para a estimativa de imunogenicidade. Uma outra indicação de uma reação imunológica pode ser a detecção de ligação aos receptores tipo Toll TLR-3, TLR-7 e TLR-8 e à helicase RIG-1.
[00133] A imunogenicidade de um polirribonucleotídeo pode ser determinada como um aumento global no nível de marcador inflamatório ou contagem de célula sanguínea branca quando comparado a um nível antes da administração do polirribonucleotídeo. Por exemplo, um polirribonucleotídeo engenheirado que não é modificado ou modificado pode ser administrado às células, ou a um indivíduo, e a secreção de marcadores inflamatórios em um intervalo de tempo definido como uma reação à administração do polirribonucleotídeo pode ser medida.
Composições
[00134] Composições de polinucleotídeo “nu” podem ser administradas com êxito a um indivíduo, e absorvidas por uma célula do indivíduo, sem o auxílio de carregadores, estabilizantes, diluentes, agentes de dispersão, agentes de suspensão, agentes espessantes, e/ou excipientes (Wolff et al. 1990, Science, 247, 1465-1468). Entretanto, em muitos casos, a encapsulação de polinucleotídeos como formulações que podem aumentar a absorção endocitótica pode aumentar a eficácia de uma composição da descrição.
[00135] Um outro desafio técnico subjacente à liberação de polirribonucleotídeos aos organismos multicelulares é identificar uma composição que forneça uma liberação de alta eficiência de polirribonucleotídeos que são traduzidos dentro de uma célula ou um tecido de um indivíduo. Foi reconhecido que a administração de ácidos nucléicos nus pode ser altamente ineficiente e pode não fornecer um método adequado para a administração de um polinucleotídeo a um organismo multicelular.
[00136] Para solucionar este desafio, uma composição compreendendo um polirribonucleotídeo engenheirado pode ser encapsulada ou formulada como um carregador farmacêutico. A formulação pode ser, mas não é limitada a, nanopartículas, poli(ácido láctico-co-glicólico)(PLGA) microesferas, lipidóides, lipoplexo, lipossoma, polímeros, carboidratos (incluindo açúcares simples), lipídeos catiônicos, gel de fibrina, hidrogel de fibrina, cola de fibrina, selante de fibrina, fibrinogênio, trombina, nanopartículas de lipídeo rapidamente eliminada (reLNPs) e combinações dos mesmos. Uma composição compreendendo um polirribonucleotídeo engenheirado aqui descrita pode compreender de cerca de 1% a cerca de 99% em peso em volume de um sistema carregador. A quantidade de carregador presente em um sistema carregador está fundamentada em vários fatores diferentes ou escolhas feitas pelo formulador, por exemplo, a concentração final do polirribonucleotídeo e a quantidade de agente solubilizante. Vários carregadores foram mostrados serem úteis na liberação de diferentes classes de agentes terapêuticos. Entre estes carregadores, nanopartículas biodegradáveis formuladas a partir de polímeros biocompatíveis poli(D, L- lactídeo-co-glicolídeo) (PLGA) e polilactídeo (PLA) têm mostrado o potencial para a liberação intracelular prolongada de diferentes agentes terapêuticos.
[00137] A porcentagem em peso de carga do polinucleotídeo engenheirado em uma composição pode ser de pelo menos 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 1%, 2%, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, ou 10 %. A eficiência de encapsulação do mRNA modificada na microesfera de PLGA pode ser de pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%.
[00138] A presente descrição descreve nanopartículas, oligômeros, polímeros ou lipidóides compreendendo oligo(alquileno aminas) contendo unidades de alquileno amina alternadas, não idênticas que são úteis para liberar um polinucleotídeo, em alguns casos um polirribonucleotídeo engenheirados, dentro de uma célula ou dentro de um tecido. Uma composição aqui descrita pode ser estável durante pelo menos cerca de 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 2 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, ou um ano. Uma formulação aqui descrita pode ser estável, por exemplo, em uma temperatura de pelo menos cerca de 0°C, 5°C, 10°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 60°C, 70°C, ou 80°C. Uma composição da descrição pode ter uma densidade desejada. A densidade de uma composição pode melhorar uma propriedade da composição, tal como a reologia da composição.
Nanopartículas
[00139] A presente descrição também fornece formulações com base em nanopartícula de polirribonucleotídeos engenheirados que são capazes de translocar a seguir da administração a um indivíduo. Em alguns casos, a administração é pulmonar e os polirribonucleotídeos engenheirados podem se mover intactos ativa ou passivamente do sítio de administração para o fornecimento de sangue sistêmico e subsequentemente ser depositado em diferentes células ou tecidos, tais como, por exemplo, nas mamas. Esta translocação da nanopartícula compreendendo um polirribonucleotídeo engenheirado codificando uma proteína terapêutica, tal como, por exemplo, ABCA3 ou um fragmento funcional da mesma, constitui liberação sistêmica não invasiva de um ingrediente farmacêutico ativo além dos pulmões para resultar na produção de uma proteína para as células ou tecidos não pulmonares sistemicamente acessíveis.
[00140] Uma nanopartícula pode ser uma partícula de tamanho de partícula de cerca de 10 nanômetros (nm) a 5000 nm, 10 nm a 1000 nm, ou 60 nm a 500 nm, ou 70 nm a 300 nm. Em alguns exemplos, uma nanopartícula tem um tamanho de partícula de cerca de 60 nm a 225 nm. A nanopartícula pode incluir um agente de encapsulação (por exemplo, revestimento) que encapsule um ou mais polirribonucleotídeos, que podem ser polirribonucleotídeo engenheirados. A nanopartícula pode incluir polirribonucleotídeos engenheirados e/ou de ocorrência natural. O agente de encapsulação pode ser um material polimérico, tal como PEI ou PEG.
[00141] Um lipidóide ou nanopartícula de lipídeo que podem ser usados como um agente de liberação podem incluir um lipídeo que pode ser selecionado do grupo consistindo em C12-200, MD1, 98N12-5, DLin-DMA, DLin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA, PLGA, PEG, PEG- DMG, lipídeos PEGuilados e análogos dos mesmos. Uma nanopartícula adequada pode compreender um ou mais lipídeos em várias razões. Por exemplo, uma composição da descrição pode compreender uma razão 40:30:25:5 de C12-200:DOPE:Colesterol:DMG-PEG2000 ou uma razão 40:20:35:5 de HGT5001:DOPE:Colesterol:DMG-PEG2000. Uma nanopartícula pode incluir pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 lipídeos ou um outro número adequado de lipídeos. Uma nanopartícula pode ser formada de qualquer razão adequada de lipídeos selecionados do grupo consistindo em C12-200, MD1, 98N12-5, DLin-DMA, DLin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA, PLGA, PEG, PEG-DMG.
[00142] O tamanho médio da formulação de nanopartícula pode compreender o mRNA modificado entre 60 nanômetros (nm) e 225 nm. O índice de polidispersividade PDI da formulação de nanopartícula compreendendo o mRNA modificado pode estar entre 0,03 e 0,15. O potencial zeta da formulação de nanopartícula pode ser de -10 a +10 em um pH de 7,4. As formulações de mRNA modificado podem compreender um lipídeo fusogênico, colesterol e um lipídeo de PEG. A formulação pode ter uma razão molar de 50:10:38,5:1,5-3,0 (lipídeo catiônico:lipídeo fusogênico:colesterol:lipídeo de polietileno glicol (PEG)). O lipídeo de PEG pode ser selecionado de, mas não é limitado a PEG-c-DOMG, PEG-DMG. O lipídeo fusogênico pode ser DSPC. Uma nanopartícula lipídica da presente descrição pode ser formulada em um selante tal como, mas não limitado a, um selante de fibrina. Oligo(grupos alquileno amina)
[00143] Também foi reconhecido que embora a encapsulação de polinucleotídeos com algumas formulações possa aumentar a absorção endocitótica de uma composição, o polinucleotídeo que é absorvido por uma célula pode não ser eficazmente traduzido dentro da célula. Algumas formulações podem ser eficazmente usadas para a liberação de DNA plasmídico e/ou siRNA, embora não práticas para o uso na liberação de polirribonucleotídeos. A presente descrição fornece formulações que podem estar utilizadas para a liberação e tradução eficazes de composições de polirribonucleotídeo a um indivíduo.
[00144] Uma composição da descrição pode ser planejada para fornecer um polirribonucleotídeo que seja eficazmente traduzido dentro de uma célula. Uma composição da descrição pode compreender um arranjo de unidades de alquileno amina de comprimento alternado em grupos de três ou mais unidades e contendo uma unidade de etilenoamina em composições para transfectar uma célula com qualquer polinucleotídeo, tal como um polirribonucleotídeo engenheirado. Uma composição da descrição pode fornecer uma liberação mais eficaz de um polirribonucleotídeo a uma célula do que arranjos análogos de unidades de alquileno amina de comprimento não alternado.
[00145] Oligômeros, polímeros ou lipidóides podem ser fornecidos que compartilham uma entidade estrutural comum que é ilustrada na fórmula (I):
[00146] Uma composição da descrição pode compreender uma oligo(alquileno amina) que é selecionada de: a) um oligômero ou polímero compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (II) como uma cadeia lateral e/ou como um grupo terminal: em que as variáveis a, b, p, m, n, e R2 a R6são definidas como segue, independentemente para cada grupo da fórmula (II) em uma pluralidade de tais grupos: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m + n é > 2; e R2 a R5 são, independentemente um do outro, selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH,-CH2-CH2-C=O)- O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7, ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; e uma cadeia de poli(etileno glicol); R6 é selecionado de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, - CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7, ou - CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; - C(NH)-NH; uma cadeia de poli(etileno glicol); e um ligante receptor, e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (II) podem ser protonados para fornecer um grupo catiônico da fórmula (II).
[00147] b) um oligômero ou polímero compreendendo uma pluralidade de grupos da fórmula (III) como unidades de repetição: em que as variáveis a, b, p, m, n, e R2 a R5são definidos como segue, independentemente para cada grupo da fórmula (III) em uma pluralidade de tais grupos: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m + n é > 2; e R2 a R5 são, independentemente um do outro, selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2- (C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7, -CH2-R7 ou -CH2- em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; e uma cadeia de poli(etileno glicol); e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (III) podem ser protonados para fornecer um grupo catiônico da fórmula (III).
[00148] c) um lipidóide tendo a estrutura da fórmula (IV): em que as variáveis a, b, p, m, n, e R2 a R6 são definidos como segue: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m + n é > 2; e R2 a R6 são, independentemente um do outro, selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2- (C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7, ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; e uma cadeia de poli(etileno glicol); e um ligante receptor; contanto que pelo menos dois resíduos entre R1 a R6 são um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, - CH2-CH2-(C=O)-NH-R7, ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3 C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IV) podem ser protonados para fornecer um grupo catiônico da fórmula (IV).
[00149] Os exemplos não limitantes de grupos alquenila e alquenileno incluem grupos alquenila retos, ramificados, e cíclicos. A olefina ou olefinas de um grupo alquenila podem ser, por exemplo, E, Z, cis, trans, terminal, ou exo-metileno. Um grupo alquenileno pode ser, por exemplo, um grupo C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, C26, C27, C28, C29, C30, C31, C32, C33, C34, C35, C36, C37, C38, C39, C40, C41, C42, C43, C44, C45, C46, C47, C48, C49, ou C50 que é substituído ou não substituído.
[00150] As estruturas de oligo(alquileno amina) das fórmulas (II), (III) e (IV) são caracterizadas em que elas podem combinar unidades de etileno amina mais curtas (também aludidas para ilustração como “S”) (isto é, a ou b é 1) com unidades de alquileno amina mais longas (também aludido para ilustração como “L”) (isto é, o outro um de a ou b é um número inteiro de 2 a 4) em uma maneira alternada. Um tal arranjo das unidades protonáveis pode fornecer vantagens em termos da adequabilidade do grupo resultante para fornecer um veículo para liberar polirribonucleotídeos dentro de uma célula.
[00151] Uma composição da descrição pode compreender uma pluralidade de grupos de oligo(alquileno amina) da fórmula (II) como uma cadeia lateral ou como um grupo terminal: em que as variáveis a, b, p, m, n, e R2 a R6são definidas como segue, independentemente para cada grupo da fórmula (II) em uma pluralidade de tais grupos: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m + n é > 2; e R2 a R5 são, independentemente um do outro, selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2- (C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7, ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; -C(NH)-NH2-; e uma cadeia de poli(etileno glicol); R6 é selecionado de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, - CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7, ou - CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C16 ou alquenila C3-C16 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; - C(NH)-NH; uma cadeia de poli(etileno glicol); e um ligante receptor.
[00152] Em alguns casos, R2 a R5 são hidrogênio e R6 é selecionado de hidrogênio, um grupo de proteção para um grupo amino; -C(NH)-NH2 e uma cadeia de poli(etileno glicol). Em alguns casos, R2 a R6 são hidrogênio. Em alguns casos, R7 é selecionado de alquila C8-C18 ou alquenila C8-C18 tendo uma ligação dupla C-C, ou de alquila C8-C12 ou alquenila C8-C12 tendo uma ligação dupla C-C, ou de alquila C10-C12 ou alquenila C10-C12 tendo uma ligação dupla C-C. Uma composição da descrição pode compreender um, ou múltiplos grupos alquileno das fórmulas (II) a (IV).
[00153] Em alguns casos, os oligômeros ou polímeros que podem ser usados nas composições de acordo como a presente descrição compreendem uma pluralidade de grupos oligo (alquileno amina) da fórmula (III) como unidades de repetição: em que as variáveis a, b, p, m, n, e R2 a R5são definidas como segue, independentemente para cada grupo da fórmula (III) em uma pluralidade de tais grupos: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou a é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m + n é > 2; e R2 a R5 são, independentemente um do outro, selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2- (C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7, -CH2-R7 ou -CH2- em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; -C(NH)-NH2; uma cadeia de poli(etileno glicol); e efetores de escape endossômico e um ligante receptor. Em alguns casos, R2 a R5 são hidrogênio. Em alguns casos, R7 é selecionado de alquila C8-C18 ou alquenila C8-C18 tendo uma C-C. R7 pode ser selecionado de alquila C8-C12 ou alquenila C8-C12 tendo uma C-C. Como uma alternativa, R7 pode ser selecionado de alquila C10-C12 ou alquenila C10-C12 tendo uma C-C.
[00154] Um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (III) pode ser protonado para fornecer um grupo catiônico da fórmula (III).
[00155] Opcionalmente, os oligômeros ou polímeros que compreendem uma pluralidade de grupos da fórmula (III) como unidades de repetição podem compreender, além disso, um ou mais grupo(s) oligo(alquileno amina) da fórmula (II) como uma cadeia lateral e/ou como um grupo terminal.
[00156] Em uma pluralidade de grupos da fórmula (III) como unidades de repetição, dois, três ou mais dos grupos da fórmula (III) podem estar contidos nos oligômeros ou polímeros. Geralmente, substâncias compreendendo 2 a 9 unidades de repetição são aqui aludidas como oligômeros, aquelas compreendendo 10 e mais unidades de repetição como polímeros. Assim, nos polímeros contendo uma pluralidade de grupos da fórmula (III) como unidades de repetição, 10 ou mais grupos da fórmula (III) podem estar presentes. Será entendido que os grupos da fórmula (III) podem ter a mesma estrutura dentro de um polímero ou oligômero, ou podem ter duas ou mais estruturas diferentes dentro do escopo da fórmula (III). Em alguns casos, os oligômeros ou polímeros contendo uma pluralidade de grupos da fórmula (III) como unidades de repetição podem ser fornecidos na forma de uma biblioteca de polímeros definidos pela sequência que são preparados a partir de grupos diferentes da fórmula (III) em uma polimerização controlada, escalonada.
[00157] Em linha com as fórmulas (II) e (III) acima, uma unidade de alquileno amina pode ser repetida uma vez em uma cadeia alternada tal que as porções de oligo(alquileno amina) do tipo -S-L-L-S- ou -L-S-S-L podem resultar, em que S representa uma unidade de etileno amina mais curta, e L representa uma unidade de alquileno amina mais longa. Em alguns casos, os grupos da fórmula (II) e (III) são aqueles em que nenhuma repetição ocorre, isto é, em que p é 1, tal que as unidades mais curtas ou mais longas não aparecem em pares. O grupo da fórmula (II) pode ser um grupo oligo(alquileno amina) da fórmula (IIa) e o grupo da fórmula (III) pode ser um grupo oligo(alquileno amina) de (IIIa): em que a, b, m, n, e R2 a R6são definidos como na fórmula (II), e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIa) podem ser protonados para fornecer um oligômero catiônico ou estrutura polimérica; - em que a, b, m, n, e R2 a R5são definidos como na fórmula (III), e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIIa) pode ser protonada para fornecer um oligômero catiônico ou estrutura polimérica.
[00158] Além disso, em alguns casos, o grupo oligo(alquileno amina) das fórmulas (II) e (III) pode ter um n de 1. Em alguns casos, m é 1 e n é 1. Em alguns casos, o grupo da fórmula (II) é um grupo oligo(alquileno amina) da fórmula (IIb), e o grupo da fórmula (III) é um grupo oligo(alquileno amina) da fórmula (IIIb): em que a, b, e R2 a R6são definidos como na fórmula (II), e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIb) podem ser protonados para fornecer um oligômero catiônico ou estrutura polimérica; em que a, b, e R2 a R5são definidos como na fórmula (III) e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIIb) podem ser protonados para fornecer um oligômero catiônico ou estrutura polimérica.
[00159] Com respeito ao comprimento da unidades de alquileno amina nos grupos oligo(alquileno amina) das fórmulas (II), (IIa), (IIb) e (III), (IIIa), (IIIb), uma das unidades alternantes pode ser uma unidade de etileno amina (isto é, a ou b é 1). A outra unidade alternada pode ser uma unidade de propileno amina, uma unidade de butileno amina ou uma unidade de pentileno amina (isto é, o outro um de a ou b pode ser um número inteiro de 2 a 4. Em alguns casos, o outro de a ou b pode ser 2 ou 3, e em alguns casos, a é 1 e b é 2, ou a é 2 e b é 1. Em alguns casos, um grupo oligo(alquileno amina) da fórmula (IIc) é utilizado ao invés de ou além do grupo (II), e/ou um grupo oligo(alquileno amina) da fórmula (IIIc) é utilizado ao invés do ou além do grupo (III). As fórmulas do grupo (IIc) e grupo (IIIc) são como segue: em que R2 a R6são como definidos na fórmula (II), e em que R2 a R6são hidrogênio, e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIc) podem ser protonados para fornecer um oligômero catiônico ou estrutura polimérica; em que R2 a R5são como definidos na fórmula (III), e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIIc) podem ser protonados para fornecer um oligômero catiônico ou estrutura polimérica.
[00160] Em alguns casos, os grupos R2 a R6 nas fórmulas (II), (IIa), (IIb) e (IIc) ou os grupos R2 a R5 nas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb) e (IIIc) podem ser grupos de proteção para um grupo amino. Os exemplos não limitantes de grupos de proteção incluem t-butoxicarbonila (Boc), 9- fluorenilmetóxi-carbonila (Fmoc), ou carbobenzilóxi (Cbz).
[00161] Em alguns casos, os grupos R1 a R6 nas fórmulas (II), (IIa), (IIb) e (IIIc) ou os grupos R2 a R5 nas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb) e (IIIc) são um ligante receptor, tais como os ligantes receptores descritos em Philipp e Wagner em “Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy”, 3a Edição, Capítulo 15, CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009. Os exemplos de ligantes receptores que alvejam o tecido pulmonar são descritos em Pfeifer et al. 2010, Ther. Deliv. 1 (1): 133-48. Os ligantes receptores podem incluir peptídeos sintéticos cíclicos ou lineares tais como derivados de bibliotecas de triagem de peptídeo para ligação a uma estrutura de superfície celular particular ou tipo de célula particular, peptídeos RGD cíclicos ou lineares, carboidratos sintéticos ou naturais tais como ácido siálico, galactose ou manose ou ligantes sintéticos derivados da reação de um carboidrato por exemplo com um peptídeo, anticorpos especificamente reconhecendo as estruturas de superfície celular, ácido fólico, fator de crescimento epidérmico e peptídeos derivados dos mesmos, transferrina, anticorpos do receptor antitransferrina, nanocorpos e fragmentos de anticorpos, drogas aprovadas que podem se ligar às moléculas de superfície celular (por exemplo, receptores de superfície celular), etc.
[00162] Na medida em que qualquer um dos grupos R1 a R6 nas fórmulas (II), (IIa), (IIb) e (IIc) ou os grupos R2 a R5 nas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb) e (IIIc) são uma cadeia de poli(etileno glicol), o peso molecular da cadeia de poli(etileno glicol) pode ser de cerca de 100 g/mol a 20.000 g/mol, de cerca de 1.000 g/mol a 10.000 g/mol ou de cerca de 1.000 g/mol a 5.000 g/mol.
[00163] Em alguns casos, o grupo (II) pode ser um grupo oligo(alquileno amina) da fórmula (IId): -em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IId) podem ser protonados para fornecer um polímero catiônico ou estrutura dendrimérica. Em alguns casos, o grupo (III) é um grupo oligo(alquileno amina) da fórmula (IIId): em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IIId) podem ser protonados para fornecer um polímero catiônico ou estrutura dendrimérica.
Lipidóides
[00164] Um polirribonucleotídeo engenheirado pode ser encapsulado em uma formulação lipidóide. Uma formulação lipidóide pode ser qualquer material que tenha características de um lipídeo, tais como gorduras, ceras, esteróis, vitaminas solúveis em gordura (tais como vitaminas A, D, E, e K), monoglicerídeos, diglicerídeos, triglicerídeos, fosfolipídeos, e outros. Por exemplo, uma formulação lipídeo ou lipidóide pode incluir lipídeos tais como colesterol, DOPE, DOPC ou DSPC que são aludidos como lipídeos auxiliares na literatura científica, e/ou lipídeos PEGuilados ou qualquer outro lipídeo útil para preparar lipoplexos. A formulação compreendendo o polirribonucleotídeo engenheirado pode ser uma nanopartícula que pode compreender pelo menos um lipídeo. Uma formulação lipidóide pode ser uma nanopartícula lipídica. O lipídeo pode ser selecionado de, mas não é limitado a, DOPE, DOPC, DSPC, colesterol, DLin-DMA, DLin-K-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA, PLGA, PEG, PEG- DMG e lipídeos PEGuilados. Em um outro aspecto, o lipídeo pode ser um lipídeo catiônico tal como, mas não limitado a, DLin-DMA, DLin-D-DMA, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA e DODMA.
[00165] A composição contendo um lipidóide pode ser de cerca de 40 60% de lipidóide, cerca de 40 a 60 % de colesterol, e cerca de 5 a 20% de PEG-lipídeo (em porcentagem em peso, com base no peso total da composição). A composição contendo um lipidóide pode ser de cerca de 50 a 60% de lipidóide, cerca de 40 a 50 % de colesterol, e cerca de 5 a 10% de PEG-lipídeo. A composição contendo um lipidóide pode ser de cerca de 50 a 75% de lipidóide, cerca de 20 a 40% de colesterol, e cerca de 1 a 10% de PEG-lipídeo. A composição contendo um lipidóide pode ser de cerca de 60 a 70% de lipidóide, cerca de 25 a 35% de colesterol, e cerca de 5 a 10% de PEG-lipídeo. A composição pode ser fornecida com técnicas descritas, por exemplo, em Akinc et al, 2007, Nat Biotech, 26, 561-569; Akinc et al, 2009, Mol Ther, 17, 872-9; Love et al, 2010, PNAS, 107, 1864-9; US 8.450.298, O2006/138380). Os complexes de RNA/lipidóide podem formar partículas que são úteis na liberação de RNA, tais como RNAs de filamento único ou mRNAs, dentro das células.
[00166] Uma composição da descrição pode ser um polirribonucleotídeo engenheirado encapsulado por um lipidóide da fórmula (IV) em que as variáveis a, b, p, m, n e R1 a R6 são definidas como segue: a é 1 e b é um número inteiro de 2 a 4; ou um é um número inteiro de 2 a 4 e b é 1, p é 1 ou 2, m é 1 ou 2; n é 0 ou 1 e m + n é > 2; e R1 a R6 são independentemente um do outro selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-CH(OH)-R7,-CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2- (C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; -C(NH)-NH2; uma cadeia de poli(etileno glicol); e um ligante receptor; contanto que pelo menos dois resíduos entre R1 a R6 sejam um grupo -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 ou -CH2-R7 em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C.
[00167] Em alguns casos, R1 a R6são independentemente selecionados de hidrogênio; um grupo -CH2-C(OH)H-R7 ou -CH(R7)-CH2-OH, em que R7 é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; um grupo de proteção para um grupo amino; e uma cadeia de poli(etileno glicol); contanto que pelo menos dois resíduos entre R1 a R6 sejam um grupo -CH2-C(OH)H-R7 ou -CH(R7)-CH2-OH, em que R7é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C. Em alguns casos, R1 a R6são independentemente selecionados de hidrogênio; e um grupo -CH2-CH(OH)-R7 ou -CH(R7)-CH2-OH em que R7é selecionado de alquila C3-C16 ou alquenila C3-C16 tendo uma ligação dupla C-C; contanto que pelo menos dois resíduos entre R1 a R6 sejam um grupo - CH2-CH(OH)-R7 ou -CH(R7)-CH2-OH, em que R7é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C. Em alguns casos, R1 e R6são independentemente selecionados de hidrogênio; e um grupo -CH2- CH(OH)-R7 ou -CH(R7)-CH2-OH em que R7é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C; e R2 a R5são todos um grupo -CH2-CH(OH)-R7 ou -CH(R7)-CH2-OH em que R7é selecionado de alquila C3-C18 ou alquenila C3-C18 tendo uma ligação dupla C-C. Em alguns casos, R7é selecionado de alquila C8-C16 ou alquenila C8-C18 tendo uma ligação dupla C-C, ou de alquila C8-C12 ou alquenila C8-C12 tendo uma ligação dupla C-C, ou de alquila C10-C12 ou alquenila C10-C12 tendo uma ligação dupla C-C.
[00168] Um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IV) podem ser protonados para fornecer um lipidóide catiônico da fórmula (IV).
[00169] Em linha como a fórmula (IV) acima, uma unidade de alquileno amina pode ser repetida uma vez em uma cadeia alternada tal que porções de oligo(alquileno amina) do tipo -S-L-L-S- ou -L-S-S-L- podem resultar, em que S representa uma unidade de etileno amina mais curta, e L representa uma unidade de alquileno amina mais longa. Em alguns casos, um lipidóide da fórmula (IV) é um em que nenhuma repetição ocorre, isto é, em que p é 1, tal que as unidades mais curtas ou mais longas não aparecem em pares. O lipidóide da fórmula (IV) pode ser um lipidóide de (IVa): em que a, b, m, n, e R1 a R6são definidos como na fórmula (IV) e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IVa) podem ser protonados para fornecer um lipidóide catiônico; Em alguns casos, o lipidóide é um lipidóide da fórmula (IV). Em alguns casos ‘n’ é 1 em um lipidóide da fórmula (IV). Em alguns casos, ‘m’ é 1 e n é 1 em um lipidóide da fórmula (IV). Em alguns casos, o lipidóide da fórmula (IV) é um lipidóide da fórmula (IVb): em que a, b, e R1 a R6são definidos como na fórmula (IV) em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IVb) podem ser protonados para fornecer um lipidóide catiônico.
[00170] Com respeito ao comprimento das unidades de alquileno amina no lipidóide das fórmulas (IV), (IVa) e (IVb), será entendido que uma das unidades alternadas precisa ser uma unidade de etileno amina (isto é, a ou b é 1). A outra unidade alternada pode ser uma unidade de propileno amina, uma unidade de butileno amina, uma unidade de pentileno amina, ou uma outra unidade adequada (isto é, o outro um de a ou b é um número inteiro de 2 a 4. Em alguns casos, um lipidóide da fórmula (N) é um lipidóide da fórmula (IVc): em que R1 a R6são como definidos na fórmula (IV) e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio indicados na fórmula (IVc) podem ser protonados para fornecer um lipidóide catiônico; Em alguns casos, os grupos R1 a R6 nas fórmulas (IV), (IVa), (IVb) e (IVc) são um grupo de proteção para um grupo amino. Os exemplos não limitantes de grupos de proteção incluem t-butoxicarbonila (Boc), 9- fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), ou carbobenzilóxi (Cbz).
[00171] Na medida em que os grupos R1 a R6 nas fórmulas (IV), (IVa), (IVb) e (IVc) são um ligante receptor, tais como os ligantes receptores descritos em Philipp e Wagner em “Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy”, 3a Edição, Capítulo 15, CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009. Os exemplos de ligantes receptores que alvejam o tecido pulmonar são descritos em Pfeifer et al. 2010, Ther. Deliv. 1 (1): 133-48. Os ligantes receptores podem incluir peptídeos sintéticos cíclicos ou lineares tais como derivados de bibliotecas de triagem de peptídeo para ligação a uma estrutura de superfície celular particular ou tipo de célula particular, peptídeos RGD cíclicos ou lineares, carboidratos sintéticos ou naturais tais como ácido siálico, galactose ou manose ou ligantes sintéticos derivados da reação de um carboidrato por exemplo como um peptídeo, anticorpos que reconhecem especificamente as estruturas de superfície celular, ácido fólico, fator de crescimento epidérmico e peptídeos derivados do mesmo, transferrina, anticorpos do receptor antitransferrina, nanocorpos e fragmentos de anticorpo, drogas aprovadas que podem se ligar às moléculas de superfície celular (por exemplo, receptores de superfície celular), etc.
[00172] Na medida em que os grupos R1 a R6 nas fórmulas (IV), (IVa), (IVb) e (IVc) são uma cadeia de poli(etileno glicol), o peso molecular da cadeia de poli(etileno glicol) pode ser de cerca de 100 g/mol a 20.000 g/mol, de cerca de 1.000 g/mol a 10.000 g/mol ou de cerca de 1.000 g/mol a 5.000 g/mol. Em alguns casos, um peso molecular da cadeia de PEG pode fornecer uma composição com uma densidade desejada.
[00173] As moléculas lipidóides múltiplas podem estar associadas com um polirribonucleotídeo engenheirado. Por exemplo, uma composição pode compreender 1 polirribonucleotídeo engenheirado para 100 moléculas lipidóides, 1 polirribonucleotídeo engenheirado para 1.000 moléculas lipidóides, 10 polirribonucleotídeos engenheirados para 1.000 moléculas lipidóides, ou 100 polirribonucleotídeos engenheirados para 10.000 moléculas lipidóides. O complexo de polirribonucleotídeo engenheirado e lipidóide pode formar uma partícula. O diâmetro das partículas pode variar, por exemplo, de 10 nanômetros a 1,200 nanômetros. Em alguns casos o diâmetro das partículas varia de 10 nanômetros a 500 nanômetros. Em alguns casos, os diâmetros das partículas são de 20 nanômetros a 150 nanômetros.
Administração a um indivíduo
[00174] São ainda aqui descritos métodos para a administração de um polinucleotídeo (por exemplo, polirribonucleotídeo) a um indivíduo. O polirribonucleotídeo pode ser fornecido ao indivíduo via um agente de liberação, tal como uma partícula ou cápsula com um agente de encapsulação que encapsula o polirribonucleotídeo. O agente de liberação pode ser um agente terapêutico. O indivíduo pode ser um ser humano, tal como um ser humano afligido com câncer. O agente de liberação pode ser administrado ao indivíduo (por exemplo, autoadministração ou administração por uma terceira parte, tal como um prestador de serviço de saúde) em uma dada dosagem, e a dosagem pode ser aumentada com o tempo, diminuída com o tempo, ou mantida constante. A dosagem pode ser trocada com base em uma progressão ou regressão de uma doença no indivíduo, tal como uma doença rara ou um câncer.
[00175] Um polirribonucleotídeo da descrição pode ser formulado com um ou mais carregador(es) farmaceuticamente aceitável(is) para ser administrado a um indivíduo. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo pode ser formulado para a liberação alvejada a uma célula alvo ou população de célula. Em alguns casos, o polirribonucleotídeo pode ser formulado para a liberação não alvejada a uma célula ou população de célula. O produto codificado pelo polipeptídeo do polirribonucleotídeo é depois transcrito e o mesmo se acumula dentro da célula receptora.
[00176] Uma composição pode ser uma combinação de qualquer polirribonucleotídeo engenheirado aqui descrito com outros componentes químicos, tais como carregadores, estabilizantes, diluentes, agentes de dispersão, agentes de suspensão, agentes espessantes, e/ou excipientes. A composição facilita a administração do composto a um organismo. As composições farmacêuticas podem ser administradas em quantidades terapeuticamente eficazes como composições farmacêuticas em várias formas e vias incluindo, por exemplo, administração intravenosa, subcutânea, intramuscular, oral, retal, aerossol, parenteral, oftálmica, pulmonar, transdérmica, vaginal, ótica, nasal, e tópica.
[00177] Uma composição pode ser administrada em um local ou maneira sistêmica, por exemplo, via injeção do composto diretamente dentro de um órgão, opcionalmente em uma formulação de depósito ou de liberação prolongada. As composições farmacêuticas podem ser fornecidas na forma de uma formulação de liberação rápida, na forma de uma formulação de liberação prolongada, ou na forma de uma formulação de liberação intermediária. Uma forma de liberação rápida pode fornecer uma liberação imediata. Uma formulação de liberação prolongada pode fornecer uma liberação controlada ou uma liberação retardada prolongada.
[00178] Para a administração pela inalação, os compostos ativos podem estar em uma forma como um aerossol, uma névoa, um vapor, uma pulverização, ou um pó. As composições farmacêuticas são convenientemente liberadas na forma de uma apresentação de pulverização por aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou um nebulizador, com o use de um propelente adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo-se uma válvula para liberar uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos, por exemplo, de gelatina para o uso em um inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo uma mistura de pó dos compostos e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido.
[00179] O olho compreende vários leitos vasculares estrutural e funcional\ distintos que fornecem componentes oculares críticos para a manutenção da visão. Estes leitos incluem as vasculaturas retinais e coroidais, que fornecem as porções internas e externas da retina, respectivamente, e a vasculatura limbal localizada na periferia da córnea.
[00180] Uma composição farmacêutica compreendendo um polirribonucleotídeo engenheirado pode ser administrada ao olho via qualquer forma ou via adequada incluindo, por exemplo, a administração tópica, oral, sistêmica, intravítrea, intracameral, subconjuntival, subtenoniana, retrobulbar, intraocular, justaescleral posterior, periocular, subretinal, e supracoroidal. As composições podem ser administradas injetando-se a formulação em qualquer parte do olho incluindo a câmara anterior, câmara posterior, câmara vítrea (intravítrea), na própria retina, e/ou espaço subretinal. As composições também podem ser liberadas via um método não invasivo. Os modos não invasivos de administrar a formulação podem incluir usar um dispositivo de injeção sem agulha. As vias de administração múltiplas podem ser utilizadas para a liberação eficiente das composições farmacêuticas.
[00181] Um polinucleotídeo engenheirado da descrição pode ser liberado a qualquer célula ocular adequada incluindo por exemplo, células endoteliais tais como células endoteliais vasculares, células da retina tais como epitélio pigmentar retinal (RPE), células corneais, fibroblastos, astrócitos, células gliais, perícitos, células epiteliais da íris, células de origem neural, células epiteliais ciliares, células de mueller, células musculares que circundam e ligadas ao olho tais como as células do músculo reto lateral, células da gordura orbital, células da esclera e episclera, células da malha trabecular, e células do tecido conectivo.
[00182] Uma composição que é aqui descrita, na administração a um indivíduo, pode ter uma eficiência de transfecção de pelo menos cerca de 80%, 90%, ou 95% pela célula do indivíduo. Em alguns casos, a eficiência de transfecção de uma composição encapsulada, na administração a um indivíduo, é de pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 450%, ou 500% em relação a um polirribonucleotídeo não encapsulado. Em algumas situações, a eficiência de transfecção de uma composição compreendendo um polirribonucleotídeo modificado (em alguns casos também compreendendo um polirribonucleotídeo não modificado), na administração a um indivíduo, é de pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 450%, ou 500% em relação à composição unicamente contendo um polirribonucleotídeo não modificado. A eficiência de transfecção de uma composição pode ser aumentada pela adição de um carregador, tal como um peptídeo que penetra a célula ou um revestimento catiônico para a camada externa da composição. A eficiência de transfecção de uma composição pode ser modulada pela densidade de uma composição.
[00183] Métodos para a preparação das composições compreendendo os polirribonucleotídeos engenheirados aqui descritos incluem formular os compostos com um ou mais excipientes ou carregadores inertes, farmaceuticamente aceitáveis para formar uma composição sólida, semissólida, ou líquida. As composições sólidas incluem, por exemplo, pós, tabletes, grânulos dispersáveis, cápsulas, comprimido, e supositórios. As composições líquidas incluem, por exemplo, soluções em que um composto é dissolvido, emulsões compreendendo um composto, ou uma solução contendo lipossomas, micelas, ou nanopartículas compreendendo um composto como aqui descritas. As composições semissólidas incluem, por exemplo, géis, suspensões e cremes. As composições podem estar em soluções ou suspensões líquidas, nas formas sólidas adequadas para a solução ou suspensão em um líquido antes do uso, ou como emulsões. Estas composições também podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes de umectação ou emulsificação, agentes tamponantes de pH, e outros aditivos farmaceuticamente aceitáveis.
[00184] Os exemplos não limitantes de excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem ser encontrados, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Décima nona Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pensilvânia 1975; Liberman, H.A. e Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Form, Marcel Decker, Nova Iorque, N.Y., 1980; e Pharmaceutical Dosage Form and Drug Liberation Systems, Sétima Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999), cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade.
[00185] Uma composição compreendendo um polinucleotídeo (por exemplo, polirribonucleotídeo) pode ser fornecido em várias dosagens. Uma dose de um polinucleotídeo, ou um polirribonucleotídeo, pode ser de cerca de 1 µg a cerca de 1000 µg, cerca de 1 µg a cerca de 500 µg, cerca de 1 µg a cerca de 1000 µg, cerca de 10 µg a cerca de 500 µg, cerca de 20 µg a cerca de 500 µg, cerca de 25 µg a cerca de 500 µg, cerca de 30 µg a cerca de 500 µg, cerca de 40 µg a cerca de 500 µg, cerca de 50 µg a cerca de 500 µg, cerca de 10 µg a cerca de 250 µg, cerca de 20 µg a cerca de 250 µg, cerca de 30 µg a cerca de 250 µg, cerca de 40 µg a cerca de 250 µg, cerca de 50 µg a cerca de 250 µg, cerca de 1 µg a cerca de 200 µg, cerca de 10 µg a cerca de 200 µg, cerca de 20 µg a cerca de 200 µg, cerca de 30 µg a cerca de 200 µg, cerca de 40 µg a cerca de 200 µg, cerca de 50 µg a cerca de 200 µg, cerca de 25 µg a cerca de 50 µg, cerca de 25 µg a cerca de 100 µg, cerca de 25 µg a cerca de 150 µg, cerca de 25 µg a cerca de 200 µg, cerca de 25 µg a cerca de 250 µg, cerca de 25 µg a cerca de 300 µg, cerca de 25 µg a cerca de 350 µg, cerca de 25 µg a cerca de 400 µg, cerca de 25 µg a cerca de 450 µg, cerca de 25 µg a cerca de 500 µg, cerca de 50 µg a cerca de 750 µg, ou cerca de 25 µg a cerca de 1000 µg do polirribonucleotídeo engenheirado. Em alguns casos, uma dose de um polinucleotídeo é de cerca de 1 mg a cerca de 100 mg, cerca de 1 mg a cerca de 50 mg, cerca de 10 mg a cerca de 50 mg, cerca de 20 mg a cerca de 50 mg, cerca de 25 mg a cerca de 50 mg, cerca de 30 mg a cerca de 50 mg, cerca de 40 mg a cerca de 50 mg, cerca de 50 mg a cerca de 100 mg, cerca de 1 mg a cerca de 25 mg, cerca de 2 mg a cerca de 25 mg, cerca de 3 mg a cerca de 25 mg, cerca de 4 mg a cerca de 25 mg, cerca de 5 mg a cerca de 25 mg, cerca de 1 mg a cerca de 20 mg, cerca de 1 mg a cerca de 20 mg, cerca de 2 mg a cerca de 20 mg, cerca de 3 mg a cerca de 20 mg, cerca de 4 mg a cerca de 20 mg, ou cerca de 5 mg a cerca de 20 mg de um polirribonucleotídeo engenheirado.
[00186] A porcentagem de um polirribonucleotídeo em uma formulação (por exemplo, dentro de um agente encapsulado) pode ser maior polirribonucleotídeo, 0,75 % de polirribonucleotídeo, 1 % de polirribonucleotídeo, 1,25 % de polirribonucleotídeo, 1,5 % de polirribonucleotídeo, 1,75 % de polirribonucleotídeo, 2 % de polirribonucleotídeo, 2,25 % de polirribonucleotídeo, 2,5 % de polirribonucleotídeo, 2,75 % de polirribonucleotídeo, 3 % de polirribonucleotídeo, 3,25 % de polirribonucleotídeo, 3,5 % de polirribonucleotídeo, 3,75 % de polirribonucleotídeo, 4 % de polirribonucleotídeo, 4,25 % de polirribonucleotídeo, 4,5 % de polirribonucleotídeo, 4,75 % de polirribonucleotídeo, 5 % de polirribonucleotídeo, 5,25 % de polirribonucleotídeo, 5,5 % de polirribonucleotídeo, 5,75 % de polirribonucleotídeo, 6 % de polirribonucleotídeo, 6,25 % de polirribonucleotídeo, 6,5 % de polirribonucleotídeo, 6,75 % de polirribonucleotídeo, 7 % de polirribonucleotídeo, 7,25 % de polirribonucleotídeo, 7,5 % de polirribonucleotídeo, 7,75 % de polirribonucleotídeo, 8 % de polirribonucleotídeo, 8,25 % de polirribonucleotídeo, 8,5 % de polirribonucleotídeo, 8,75 % de polirribonucleotídeo, 9 % de polirribonucleotídeo, 9,25 % de polirribonucleotídeo, 9,5 % de polirribonucleotídeo, 9,75 % de polirribonucleotídeo, 10 % de polirribonucleotídeo, 10,25 % de polirribonucleotídeo, 10,5 % de polirribonucleotídeo, 10,75 % de polirribonucleotídeo, 11 % de polirribonucleotídeo, 11,25 % de polirribonucleotídeo, 11,5 % de polirribonucleotídeo, 11,75 % de polirribonucleotídeo, 12 % de polirribonucleotídeo, 12,25 % de polirribonucleotídeo, 12,5 % de polirribonucleotídeo, 12,75 % de polirribonucleotídeo, 13 % de polirribonucleotídeo, 13,25 % de polirribonucleotídeo, 13,5 % de polirribonucleotídeo, 13,75 % de polirribonucleotídeo, 14 % de polirribonucleotídeo, 14,25 % de polirribonucleotídeo, 14,5 % de polirribonucleotídeo, 14,75 % de polirribonucleotídeo, 15 % de polirribonucleotídeo, 15,25 % de polirribonucleotídeo, 15,5 % de polirribonucleotídeo, 15,75 % de polirribonucleotídeo, 16 % de polirribonucleotídeo, 16,25 % de polirribonucleotídeo, 16,5 % de polirribonucleotídeo, 16,75 % de polirribonucleotídeo, 17 % de polirribonucleotídeo, 17,25 % de polirribonucleotídeo, 17,5 % de polirribonucleotídeo, 17,75 % de polirribonucleotídeo, 18 % de polirribonucleotídeo, 18,25 % de polirribonucleotídeo, 18,5 % de polirribonucleotídeo, 18,75 % de polirribonucleotídeo, 19 % de polirribonucleotídeo, 19,25 % de polirribonucleotídeo, 19,5 % de polirribonucleotídeo, 19,75 % de polirribonucleotídeo, 20 % de polirribonucleotídeo, 20,5 % de polirribonucleotídeo, 21 % de polirribonucleotídeo, 21,5 % de polirribonucleotídeo, 22 % de polirribonucleotídeo, 22,5 % de polirribonucleotídeo, 23 % de polirribonucleotídeo, 23,5 % de polirribonucleotídeo, 24 % de polirribonucleotídeo, 24,5 % de polirribonucleotídeo, ou 25% de polirribonucleotídeo em peso. Alternativamente, a porcentagem do polirribonucleotídeo na formulação (por exemplo, dentro de um agente encapsulado) pode ser menor do que cerca de 25 % de polirribonucleotídeo, 24,5 % de polirribonucleotídeo, 24 % de polirribonucleotídeo, 23,5 % de polirribonucleotídeo, 23 % de polirribonucleotídeo, 22,5 % de polirribonucleotídeo, 22 % de polirribonucleotídeo, 21,5 % de polirribonucleotídeo, 21% de polirribonucleotídeo, 20,5 % de polirribonucleotídeo, 20 % de polirribonucleotídeo, 19,5 % de polirribonucleotídeo, 19% de polirribonucleotídeo, 18,5 % de polirribonucleotídeo, 18 % de polirribonucleotídeo, 17,5 % de polirribonucleotídeo, 17 % de polirribonucleotídeo, 16,5 % de polirribonucleotídeo, 16 % de polirribonucleotídeo, 15,5 % de polirribonucleotídeo, 15% de polirribonucleotídeo, 14,5 % de polirribonucleotídeo, 14 % de polirribonucleotídeo, 13,5 % de polirribonucleotídeo, 13 % de polirribonucleotídeo, 12,5 % de polirribonucleotídeo, 12 % de polirribonucleotídeo, 11,5 % de polirribonucleotídeo, 11 % de polirribonucleotídeo, 10,5 % de polirribonucleotídeo, 10 % de polirribonucleotídeo, 9,5 % de polirribonucleotídeo, 9 % de polirribonucleotídeo, 8,5 % de polirribonucleotídeo, 8 % de polirribonucleotídeo, 7,5 % de polirribonucleotídeo, 7 % de polirribonucleotídeo, 6,5 % de polirribonucleotídeo, 6 % de polirribonucleotídeo, 5,5 % de polirribonucleotídeo, 5 % de polirribonucleotídeo, 4,5 % de polirribonucleotídeo, 4% de polirribonucleotídeo, 3,5 % de polirribonucleotídeo, 3% de polirribonucleotídeo, 2,5 % de polirribonucleotídeo, 2 % de polirribonucleotídeo, 1,5 % de polirribonucleotídeo, 1% de polirribonucleotídeo, 0,5% de polirribonucleotídeo, ou 0,1 % de polirribonucleotídeo.
[00187] Em alguns casos, uma composição encapsulada da descrição pode produzir uma concentração plasmática, sérica ou sanguínea do polirribonucleotídeo, carregador farmacêutico, agente de encapsulação, ou material polimérico (por exemplo: polietileno glicol ou polietilenimina) em um indivíduo dentro de cerca de 1 segundo a cerca de 30 minutos, cerca de 1 segundo a 20 minutos, cerca de 1 segundo a 10 minutos, cerca de 1 segundo a 5 minutos, cerca de 1 segundo a 2 minutos, cerca de 1 segundo a 1 minuto, cerca de 1 segundo a cerca de 30 segundos, cerca de 30 segundos a 30 minutos, cerca de 30 segundos a 20 minutos, cerca de 30 segundos a 10 minutos, cerca de 30 segundos a 5 minutos, cerca de 30 segundos a 2 minutos, cerca de 30 segundos a cerca de 1 minuto, cerca de 1 minuto a cerca de 30 minutos, cerca de 1 minuto a cerca de 25 minutos, cerca de 1 minuto a cerca de 20 minutos, cerca de 1 minuto a cerca de 15 minutos, cerca de 1 minuto a cerca de 10 minutos, cerca de 5 minutos a cerca de 30 minutos, cerca de 5 minutos a cerca de 25 minutos, cerca de 5 minutos a cerca de 20 minutos, cerca de 5 minutos a cerca de 15 minutos, cerca de 5 minutos a cerca de 10 minutos, cerca de 10 minutos a cerca de 30 minutos, cerca de 10 minutos a cerca de 25 minutos, cerca de 10 minutos a cerca de 20 minutos, ou cerca de 10 minutos a cerca de 15 minutos de uso do dispositivo. A concentração plasmática, sérica ou sanguínea do polirribonucleotídeo, carregador farmacêutico, agente de encapsulação, ou concentração do material polimérico (por exemplo: polietileno glicol ou polietilenimina) pode ser uma concentração de pico ou uma concentração média.
Tratamentos e Condições
[00188] Os métodos, polirribonucleotídeos, e composições farmacêuticas desta descrição fornecem um método para tratar uma condição. O tratamento pode compreender tratar um indivíduo (por exemplo, um paciente com uma doença e/ou um animal de laboratório como uma condição). Em alguns casos a condição é um câncer. Em alguns casos, a condição é câncer pulmonar. Em alguns casos, a condição é câncer mamário. Em alguns casos, o indivíduo é um ser humano. O tratamento pode ser fornecido ao indivíduo antes do início clínico da doença. O tratamento pode ser fornecido ao indivíduo depois do início clínico da doença. O tratamento pode ser fornecido ao indivíduo em ou depois de 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas, 1 dia, 1 semana, 6 meses, 12 meses, ou 2 anos depois do início clínico da doença. O tratamento pode ser fornecido ao indivíduo durante um período de tempo que é maior do que ou igual a 1 minuto, 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas, 1 dia, 1 semana, 1 mês, 6 meses, 12 meses, 2 anos ou mais depois do início clínico da doença. O tratamento pode ser fornecido ao indivíduo durante um período de tempo que seja menor do que ou igual a 2 anos, 12 meses, 6 meses, 1 mês, 1 semana, 1 dia, 12 horas, 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora, 30 minutos, 10 minutos, ou 1 minuto depois do início clínico da doença. O tratamento também pode incluir tratar um ser humano em um teste clínico.
[00189] As composições contendo os polirribonucleotídeos engenheirados aqui descritos podem ser administrados para os tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Em aplicações terapêuticas, os polirribonucleotídeos engenheirados podem ser administrados a um indivíduo que já sofre de uma doença, tal como um câncer pulmonar ou um mamário, na quantidade suficiente para fornecer a quantidade do polirribonucleotídeo codificado que cure ou pelo menos melhore os sintomas da doença. Os polirribonucleotídeos engenheirados também podem ser administrados para diminuir uma probabilidade de desenvolver, contrair, ou piorar uma doença. As quantidades eficazes para este uso podem variar com base na severidade e curso da doença ou condição, a eficiência de transfecção de um polinucleotídeo engenheirado, a afinidade de um polipeptídeo codificado para uma molécula alvo, terapia anterior, a situação de saúde do indivíduo, peso, resposta às drogas, e o julgamento do médico tratador.
[00190] Os polirribonucleotídeos da descrição podem ser usados, por exemplo, para tratar uma condição associada como um defeito ou má função de um gene na família do cassete de ligação de ATP (ABC). Os exemplos não limitantes de condições associada com um gene na família do cassete de ligação de ATP (ABC) incluem: degeneração macular relacionada com a idade, colestase intra-hepática recorrente benigna, síndrome de Cantu, ausência bilateral congênita do canal deferente, hiperinsulinismo congênito, fibrose cística, síndrome de Dubin-Johnson, cardiomiopatia dilatada familiar, deficiência de HDL familiar, calcificação arterial generalizada da infância, ictiose arlequim, pancreatite hereditária, colestase intra-hepática da gravidez, ictiose lamelar, diabete melito neonatal permanente, colestase intra-hepática familiar progressiva, pseudoxantoma elástica, retinite pigmentosa, sitosterolemia, degeneração macular de Stargardt, disfunção de tensoativo, doença de Tangier, adrenoleucodistrofia ligada a X, anemia sideroblástica ligada a X e ataxia.
[00191] Um polirribonucleotídeo, um método, e uma composição farmacêutica da descrição podem ser usados, por exemplo, para tratar um câncer. Os exemplos não limitantes de cânceres podem incluir: leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielóide aguda, carcinoma adrenocortical, cânceres relacionados com a AIDS, linfoma relacionado com a AIDS, câncer anal, câncer do apêndice, astrocitomas, carcinoma de célula basal, câncer do duto biliar, câncer vesical, cânceres ósseos, tumores cerebrais, tais como astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, caminho visual e glioma hipotalâmico, câncer mamário, adenomas brônquicos, linfoma de Burkitt, carcinoma de origem primária desconhecida, linfoma do sistema nervoso central, astrocitoma cerebelar, câncer cervical, cânceres infantis, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica, distúrbios mieloproliferativos crônicos, câncer colônico, linfoma de célula T cutâneo, tumor de célula redonda pequena desmoplástica, câncer endometrial, ependimoma, câncer esofágico, sarcoma de Ewing, tumores da célula germinativa, câncer da vesícula biliar, câncer gástrico, tumor carcinóide gastrointestinal, tumor estrômico gastrointestinal, gliomas, leucemia de célula pilosa, câncer da cabeça e pescoço, câncer cardíaco, câncer hepatocelular (fígado), linfoma de Hodgkin, câncer hipofaríngeo, melanoma intraocular, carcinoma da célula da ilhota, sarcoma de Kaposi, câncer renal, câncer laríngeo, câncer dos lábios e cavidade oral, lipossarcoma, câncer hepático, cânceres pulmonares, tais como câncer pulmonar de célula não pequena e célula pequena, linfomas, leucemias, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno ósseo/osteossarcoma, meduloblastoma, melanomas, mesotelioma, câncer do pescoço escamoso metastático com câncer bucal oculto primário, síndrome da neoplasia endócrina múltipla, síndromes mielodisplásticas, leucemia mielóide, câncer da cavidade nasal e sino paranasal, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma de não Hodgkin, câncer pulmonar de célula não pequena, câncer oral, câncer orofaríngico, osteossarcoma/histiocitoma fibroso maligno do osso, câncer ovariano, câncer epitelial ovariano, tumor de célula germinativa ovariano, câncer pancreático, câncer da célula da ilhota pancreática, câncer do sino paranasal e cavidade nasal, câncer paratireoidal, câncer peniano, câncer faríngeo, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, adenoma pituitário, blastoma pleuropulmonar, neoplasia de célula plasmática, linfoma do sistema nervoso central primário, câncer prostático, câncer retal, carcinoma de célula renal, câncer de célula transicional da pélvis renal e uréter, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer da glândula salivar, sarcomas, cânceres de pele, carcinoma da célula de merkel da pele, câncer do intestino delgado, sarcoma de tecido mole, carcinoma de célula escamosa, câncer estomacal, linfoma de célula T, câncer da garganta, timoma, carcinoma tímico, câncer da tireóide, tumor trofoblástico (gestacional), cânceres de sítio primário desconhecido, câncer uretral, sarcoma uterino, câncer vaginal, câncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom, e tumor de Wilms. Em alguns casos, um polirribonucleotídeo engenheirado é administrado a um indivíduo para tratar um câncer pulmonar. Em alguns casos, um polirribonucleotídeo engenheirado é administrado a um indivíduo para tratar um câncer mamário.
[00192] Em alguns casos, um polinucleotídeo da descrição pode codificar um polipeptídeo que é pelo menos 80% homólogo a uma proteína do cassete de ligação de ATP, subfamília A, tal como ABCA3.
[00193] Os polirribonucleotídeos engenheirados múltiplos podem ser administrados em qualquer ordem ou simultaneamente. Os polirribonucleotídeos engenheirados podem ser empacotados juntos ou separadamente, em uma única embalagem compreendendo polirribonucleotídeos que alvejam a mesma molécula alvo ou em uma pluralidade de embalagens. Um ou todos dos polirribonucleotídeos engenheirados podem ser dados em doses múltiplas. Se não simultâneo, a cronometragem entre as doses múltiplas pode variar.
[00194] Os polirribonucleotídeos engenheirados podem ser administrados a um indivíduo tão logo quanto possível depois do início dos sintomas. Um polirribonucleotídeo engenheirado pode ser administrado tão logo quanto seja prático depois que o início de uma doença ou condição seja detectado ou suspeito, e durante um espaço de tempo necessária para o tratamento da doença, tal como, por exemplo, durante cerca de 1 mês, durante cerca de 6 meses, durante cerca de 12 meses, durante cerca de 18 meses, durante cerca de 24 meses, ou qualquer apropriada espaço de tempo. A duração de tratamento pode variar para cada indivíduo.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: Formulação de uma Composição Compreendendo um Polirribonucleotídeo Engenheirado para o Tratamento de Indivíduos Humanos Afligidos como um Distúrbio Pulmonar
[00195] As composições são formuladas como segue: Um polinucleotídeo engenheirado codificando a sequência do gene ABCA3, Sequência de Referência NCBI: NM_001089.2, é preparada como descrito na WO2011012316, WO2014207231, WO2014153052, WO2013185069. Polietilenimina ramificada (PEI, MW médio = 25 kDa) é adquirida da Sigma-Aldrich® (Schnelldorf, Alemanha) e usada sem outra purificação. PEI é diluída em água isenta de endotoxina e ajustada ao pH 7,4 com HC1. A água isenta de endotoxina é adquirida da B. Braun (Melsungen, Alemanha).
[00196] O polirribonucleotídeo engenheirado e PEI podem ser diluídos em 4,0 ml de água destilada dupla resultando em concentrações de 250 µg/ml de mRNA e 326,3 µg/ml de PEI, respectivamente (aproximadamente em uma razão de polinucleotídeo para PEI de 10). A solução de polirribonucleotídeo engenheirado pode ser pipetada na solução PEI, misturada pipetando-se para cima e para baixo, para produzir uma concentração de polirribonucleotídeo final de 125 µg/ml. Os complexos podem ser incubados durante 20 min na temperatura ambiente antes de serem administrados a um indivíduo.
EXEMPLO 2: Planejamento, Síntese, Formulação, e Caracterização Com Base em Célula de Polirribonucleotídeos Engenheirados para a Síntese de ABCA3 Humano
[00197] Oito versões diferentes de polirribonucleotídeos engenheirados codificando variações do ABCA3 humano são preparados compreendendo as seguintes sequências
[00198] Os construtos são subclonados dentro de um vetor e amplificados com procedimentos padrão (por exemplo: maxi prep). A sequência de ácido nucléico de cada construto é confirmada com técnicas de sequenciamento.
EXEMPLO 3: Expressão de Polirribonucleotídeos Engenheirados nas Linhagens de Célula Epitelial Alveolar Humana
[00199] Diferentes construtos expressando as sequências descritas na TABELA 6 são administrados às linhagens de célula epitelial alveolar humanas A549, HepG2, e células HEK293. Cada construto é incorporado dentro de uma formulação compreendendo uma razão N/P de cerca de 8 (N/P = as razões de moles dos grupos amina de polímeros catiônicos para aqueles do fosfato de DNA). Os exemplos das formulações e a razão molar dos componentes são apresentados na TABELA 8.
[00200] Como aqui usado dL_01 é
[00201] Como aqui usado dL_05 é
[00202] O tamanho do poliplex e o potencial zeta de cada formulação é medido. A estabilidade de cada formulação é medida em vários pHs, temperaturas e depois agitação vigorosa.
[00203] A meia vida, absorção de RNA, e imunogenicidade de cada formulação de polirribonucleotídeo é medida em todos as três linhagens de célula epitelial pulmonar (A549, HepG2 e HEK293).
EXEMPLO 4: Absorção, Expressão e Distribuição de um Polirribonucleotídeo Engenheirado Codificando um Gene Repórter
[00204] Os polirribonucleotídeos engenheirados codificando uma luciferase de vagalume (FFL, 1,64 kb), um Vermelho Tomate (TR, 1,86 kb), uma Proteína Fluorescente Verde Intensificada (EGFP, 0,94 kb), e um repórter LacZ (3,3 kb). Este estudo também descreve uma comparação entre formulações de polietilenoimina (“PEI”) e EPE (um polímero estatístico de unidades de aminoetila e aminopropila; ver EP-A1 3034539, que é aqui incorporada por referência), distribuição celular (por exemplo, células epiteliais alveolares tipo II, células epiteliais alveolares tipo I, células endoteliais microvasculares pulmonares) e variabilidade em faixas de dose para a absorção, expressão e distribuição ideais de diferentes polirribonucleotídeos engenheirados codificando um gene repórter. A TABELA 9 ilustra diferentes regimes de dosagem que são testadas em um modelo de camundongo.
[00205] Via de administração: inalação (aerossol). A FIGURA 1 ilustra um exemplo de administração aerossol de polirribonucleotídeo engenheirados aos camundongos. O experimento pode ser conduzido em qualquer camundongos, tal como camundongos C57B16 do tipo selvagem. A expressão de uma luciferase de vagalume (FFL, 1,64 kb), um Vermelho Tomate (TR, 1,86 kb), uma Proteína Fluorescente Verde Intensificada (EGFP, 0,94 kb), e um repórter LacZ (3,3 kb) é medida em um número total de 54 camundongos. EXEMPLO 5: Absorção, Expressão e Distribuição In Vivo de um Polirribonucleotídeo Engendrado Codificando uma Proteína ABCA3
[00206] Um total de 36 camundongos C57B16 do tipo selvagem são administrados com um ou mais construtos compreendendo os polirribonucleotídeos da TABELA 7 preparados com uma ou mais formulações listadas na TABELA 8. Um tubo endotraqueal é usado como a via de administração.
[00207] O tecido pulmonar de cada camundongo é coletado em cerca de 24 horas depois da administração endotraqueal de cada peptídeo. O tecido de um pulmão por camundongo é congelado rapidamente e analisado pela qPCR, western blot, e ELISA quanto à expressão da proteína ABCA3. O tecido de um pulmão por camundongo é fixado em formalina e analisado quanto à presença in situ do polirribonucleotídeo engenheirado e análise histológica. Fluido de Lavagem Broncoalveolar (BALF) é coletado e os níveis de expressão dos marcadores IL-10, MIP-la, INF-a, TNF-a, IL-12, e IL-6 são analisados para determinar a imunogenicidade de cada polirribonucleotídeo engenheirado.
EXEMPLO 6: Estudo de Dosagem In Vivo de um Polirribonucleotídeo Engendrado Codificando uma Proteína ABCA3
[00208] Camundongos C57B16 do tipo selvagem são administrados com um ou mais construtos compreendendo os polirribonucleotídeos da TABELA 7 preparados em uma ou mais formulações listadas na TABELA 8. Um tubo endotraqueal é usado para administrar os polirribonucleotídeos engenheirados a cada camundongo. Diferentes dosagens de cada polirribonucleotídeo engenheirado são testadas, incluindo dosagens variando de 0,1 mg/kg a 1 mg/kg e 1 mg/kg a 10 mg/kg.
[00209] O tecido pulmonar de cada camundongo é coletado em cerca de 24 horas depois da administração endotraqueal de cada peptídeo. O tecido de um pulmão por camundongo é congelado rapidamente e analisado pela qPCR, western blot, e ELISA quanto à expressão de proteína ABCA3. O tecido de um pulmão por camundongo é fixado em formalina e analisado quanto à presença in situ do polirribonucleotídeo engenheirado e análise histológica. O Fluido de Lavagem Broncoalveolar (BALF) é coletado e os níveis de expressão dos marcadores IL-10, MIP-1a, INF-a, TNF-a, IL-12, e IL-6 são analisados para determinar a imunogenicidade de cada polirribonucleotídeo engenheirado.
[00210] As métricas determinadas a partir do pulmão e amostras biológicas são usadas para avaliar a segurança e eficácia de cada dosagem.
EXEMPLO 7: Estudo de Dosagem In Vivo de um Polirribonucleotídeo Engendrado Codificando uma Proteína ABCA3
[00211] Camundongos C57B16 do tipo selvagem repetidamente inalaram um aerossol compreendendo um ou mais construtos como os polirribonucleotídeos listados na TABELA 7. Dosagens diferentes de cada polirribonucleotídeo engenheirado são testadas, incluindo dosagens variando de 0,1 mg/kg a 1 mg/kg e 1 mg/kg a 10 mg/kg.
[00212] Camundongos diferentes receberam dosagens repetidas em 8 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, e 120 horas depois de uma dosagem inicial. Tecido pulmonar e amostra biológica de diferentes camundongos é coletada a cerca de 8 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, e 120 horas depois da administração de cada peptídeo. Em cada tempo especificado, o tecido de um pulmão por camundongo é congelado rapidamente e analisado pela qPCR, western blot, e ELISA quanto à expressão de proteína ABCA3. O tecido de um pulmão por camundongo é fixado em formalina e analisado quanto à presença in situ do polirribonucleotídeo engenheirado e análise histológica. Fluido de Lavagem Broncoalveolar (BALF) é coletado e os níveis de expressão dos marcadores IL-10, MIP-1a, INF-a, TNF-a, IL-12, e IL-6 são analisados para determinar a imunogenicidade de cada polirribonucleotídeo engenheirado. Sangue, fígado e baço também são coletados, congelados rapidamente, e processados para a análise histológica.
[00213] As métricas determinadas a partir do pulmão e amostras biológicas são usadas para avaliar a segurança e eficácia de administrações repetidas de polirribonucleotídeos engenheirados aerossolizados.
EXEMPLO 8: Expressão de Ácido Ribonucléico de ABCA3 em Células de Mamífero
[00214] Este experimento demonstra a expressão (tradução) de dois mRNAs ABCA3-FLAG in vitro. Para este experimento, o DNA de ABCA3- FLAG carecendo de uma 5’-UTR (SEQ ID NO: 17) (FIGURA 2: ABCA3- FLAG-PoliA~30 depois poliadenilado 20 minutos; fabricado de um padrão com uma cauda poliA 30A que foi depois poliadenilado durante 20 minutos para prolongar a cauda) e DNA de ABCA3-FLAG compreendendo uma UTR de a-globina 5’ humana (SEQ ID NO: 18) (FIGURA 2: ABCA3-FLAG- PoliA~120, compreendendo uma 5’-UTR da SEQ ID NO: 5 ao nível de DNA e a SEQ ID NO: 16 ao nível de RNA) foram usados para transcrever os mRNAs correspondentes in vitro com os quatro nucleotídeos canônicos, encapuzados como uma estrutura cap1, e poliadenilados. Estes dois mRNAs ABCA3-FLAG, ABCA3-FLAG-PoliA~30 depois poliadenilado e ABCA3- FLAG-PoliA~100, foram transfectados em células A549. A FIGURA 2 é um western blot ilustrando a tradução de mRNAs ABCA3 em células A549 6 horas após a transfecção. Triplicatas biológicas são apresentadas na figura.
[00215] Para este experimento, 2 x 106 células A549 (p7) foram transfectadas como 7,5 µg de ABCA3-FLAG-PoliA~30 ou ABCA3-FLAG- PoliA~100 e colhidas 6 horas após a transfecção. As células foram raspadas dos poços, granuladas, e o grânulo foi lisado em tampão RIPA. 75 µg de proteína total foi carregada no gel. A mancha foi sondada com M2 anti flag- HRP conjugada 1:10000 O/N, e desenvolvida usando substrato de sinal Femto Super. Resultados de western blot similares foram obtidos para células MLE- 15.
[00216] Experimentos adicionais demonstrando expressão bem- sucedida da proteína ABC3A a partir de mRNA transfectada em células A549 foram conduzidas (dados não apresentados). Em resumo, as células A549 foram transfectadas como mRNA codificando ABC3A humano. 6 horas a seguir da transfecção, as células foram colhidas e lisadas, e a expressão da proteína ABC3A foi detectada pelo Western blot. Para este experimento, ABCA3-DNA otimizado no códon tendo um CYBA 5’-UTR e CYBA 3’- UTR foi usado para transcrever os mRNAs correspondentes in vitro.
EXEMPLO 9: expressão de mRNA de ABCA3 In Vitro
[00217] O seguinte experimento foi conduzido para comparar o efeito de incorporar nucleotídeos quimicamente modificados específicos, em razões e combinações variáveis, sobre a eficiência de tradução em diferentes tipos de célula. O experimento aqui descrito avaliou a tradução in vitro de mRNAs de ABCA3 (SEQ ID NO: 17) que foram preparados pelas reações de transcrição in vitrocompreendendo: 1) 50% de T; 2) 100% de T; 3) 25% de s2U + 25% de m5C (Mod 1); 4) 50% de I5U (Mod 2); ou 5) 35% de I5U + 7,5% de I5C (Mod 3). O padrão de mRNA de ABCA3 usado neste experimento incluiu uma matriz de leitura aberta otimizada no códon para ABCA3 em seres humanos uma poliA de cerca de 30 A’s no comprimento, uma estrutura cap1, e o mesmo não incluiu uma UTR (SEQ ID NO: 17).
[00218] A expressão de mRNA de ABCA-FLAG a partir de células HEK-293 (triplicatas biológicas): Em resumo, 1 x 106 células A549 (triplicatas biológicas) foram transfectadas como 7,5 µg de ABCA3-FLAG /11,25 µl de Messenger Max e colhidas depois de 6 horas. 50 µg de proteína total foi carregada no gel. Para a detecção de ABCA3-FLAG: WB foi sondado como conjugado M2 anti flag-HRP 1:10000 durante a noite, e desenvolvido usando substrato de sinal Femto Super. A FIGURA 3 é um western blot ilustrando a expressão de proteína de diferentes mRNAs ABCA- FLAG transcritos pelas reações de transcrição in vitro compreendendo: 1) 50% de T; 2) 100% de T; 3) 25% de s2U + 25% de m5C (Mod 1); 4) 50% de I5U (Mod 2); 5) 35% de I5U + 7,5% de I5C (Mod 3); ou um controle nas células HEK-293. Como apresentado na FIGURA 3, NTC = células transfectadas simulado (nenhum mRNA ou plasmídeo).
[00219] A FIGURA 4 é um western blot ilustrando o resultado de um experimento similar nas células A549. A FIGURA 4 ilustra a expressão de proteína de diferentes mRNAs ABCA-FLAG transcritos pelas reações de transcrição in vitrocompreendendo: 1) 50% de T; 2) 100% de T; 3) 25% de s2U + 25% de m5C (Mod 1); 4) 50% de I5U (Mod 2); ou 5) 35% de I5U + 7,5% de I5C (Mod 3) em células A549.
[00220] Similarmente, a FIGURA 5 é um western blot ilustrando os resultados da expressão de mRNA de ABCA3 in vitro em células MLE-15. A FIGURA 5 ilustra a expressão de proteína de diferentes mRNAs ABCA- FLAG transcritos pelas reações de transcrição in vitro compreendendo: 1) 50% de T; 2) 100% de T; 3) 25% de s2U + 25% de m5C (Mod 1); 4) 50% de I5U (Mod 2); ou 5) 35% de I5U + 7,5% de I5C (Mod 3) em células MLE-15.
[00221] A FIGURA 6 ilustra uma comparação dos níveis de expressão da proteína ABCA3 medidos pela Western Blot 6 horas após a transfecção do mRNA em células HEK-293, células A549, e células MLE-15. Os resultados são normalizados para tingimento de proteína total (SYPRO Ruby). Cada ponto de dados é a média de 3 réplicas biológicas (transfecção), as barras de erro +/- desvio padrão. Todos os mRNAs de ABCA3 apresentados nesta figura têm a mesma sequência e foram fabricados do mesmo plasmídeo. O padrão de mRNA de ABCA3 usado neste experimento não incluiu nenhuma das UTRs, o mesmo teve uma matriz de leitura aberta otimizada no códon para ABCA3, um poliA de cerca de 30 A’s no comprimento, e uma estrutura cap1.
EXEMPLO 10: Imunogenicidade de mRNAs de ABCA3 in vitro
[00222] A imunogenicidade dos mRNAs ABCA-FLAG acima mencionados foi testada em duas linhagens de célula medindo-se a produção de citocina, a saber, células epiteliais basais alveolares humanas adenocarcinômicas A549 e células do carcinoma hepático humano HepG2. A produção de IL-6 em resposta aos transcritos foi medida em células A549, enquanto que a produção de IP-10 foi medida em células HepG2. Cada linhagem de célula foi transfectada em triplicata com uma titulação de cada RNA. Em resumo, 20.000 (A549) ou 40.000 (HepG2) células por poço foram plaqueadas 24 horas antes da transfecção em placas de 96 poços. As células foram depois transfectadas com uma titulação de cada transcrito, de 250 ng a 7 ng por poço, usando reagente MessengerMax em uma razão de RNA:MessengerMax de 1:1,5.
[00223] Os sobrenadantes de cultura foram colhidos em 18 horas após a transfecção. A viabilidade celular foi medida imediatamente a seguir da remoção de sobrenadante usando o kit de ensaio Cell-Titer-Glo (Promega) que mede os níveis de ATP como uma indicação das células metabolicamente ativa. Para a detecção de IL-6, sobrenadantes de cultura de célula A549 foram diluídos 1:20 em tampão de ensaio e os níveis de IL-6 foram medidos usando o kit IL-6 High Sensitivity Human ELISA (Abcam ab46042). IP-10 foi detectado nos sobrenadantes de cultura de célula HepG2 não diluídos usando o Kit Human IP-10 ELISA SimpleStep (Abcam ab173194).
[00224] A FIGURA 7 ilustra a indução de IL-6 em células A549 traduzindo a proteína ABCA3 de mRNAs de ABCA3-FLAG compreendendo várias modificações de nucleotídeo. A expressão de IL-6 foi induzida pelas várias quantidades de cada mRNA de ABCA-FLAG medidas pelo ELISA. A FIGURA 7 ilustra a viabilidade de célula depois da transfecção com várias quantidades de cada mRNA ABCA-FLAG medidas usando o ensaio Cell- Titer-Glo. A FIGURA 8 ilustra a indução de IP-10 em células HepG2 traduzindo a proteína ABCA3 a partir de mRNAs ABCA3-FLAG compreendendo várias modificações de nucleotídeo. A expressão de IP-10 foi induzida pelas várias quantidades de cada mRNA de ABCA-FLAG medidas pelo ELISA. A FIGURA 8 ilustra a viabilidade de célula depois da transfecção com várias quantidades de cada mRNA DNAI1 medidas usando o ensaio Cell-Titer-Glo.
EXEMPLO 11: Viabilidade Celular e Indução de Citocina
[00225] AS FIGURAS 9 A 12 ilustram os resultados de uma Viabilidade celular e indução de Citocina in vitro.
[00226] MÉTODO: células A549 (2 x 10 4/poço) ou células HEPG2 (4 X 10 4/poço) foram plaqueadas 24 horas antes da transfecção em placas de 96 poços. Uma transfecção foi realizada como MAX mensageiro, com uma razão de RNA para reagente de transfecção de 1:1,5. Este experimento usa os seguintes controles: Controles positivos: 1. poli I:C foi usado como snim e transfectado nas mesmas concentrações; e 2. mRNA eGFP (trilink). Controles negativos: 1. A549/HEP G2 tratada com mistura de reagente Opti Mem+Max; e 2. células A549/ HEP G2 nas tratadas. Duplicatas biológicas foram plaqueadas em 3 placas de 96 poços diferentes.
[00227] O sobrenadante foi colhido 18 horas após a transfecção e a viabilidade celular foi avaliada imediatamente depois da remoção de sobrenadante. A FIGURA 9 e FIGURA 10 ilustram a viabilidade celular das células A549 e HEP G2 respectivamente. A FIGURA 11 e FIGURA 12 ilustram os resultados dos ensaios de ELISA medindo os níveis de IL-6 e IP- 10. Para IL-6 ELISA, a amostra foi diluída em tampão de ensaio foi 1:20 por todo o ensaio. Para IP-10 uma amostra não diluída foi testada.
EXEMPLO 12: Curso de Tempo para a Tradução de mRNA de ABCA3 em Células Pulmonares
[00228] 1 x 10 6 células A549 (células pulmonares humanas), passagem 10, foram transfectadas com 7,5 µg de RNA/11,5 Messenger Max em duplicatas. O meio de transfecção foi trocado em 4 horas após a transfecção e as células foram colhidas em pontos de tempo diferentes após a transfecção: 6 horas, 18 horas, 24 horas, 32 horas e 48 horas. As células foram subsequentemente lavadas como PBS e tripsinizadas durante 5 min na temperatura ambiente. A reação de tripsina foi interrompida pela adição de meio contendo FBS, as células foram coletadas, centrifugadas e o grânulo foi lavado duas vezes como PBS frio. O grânulo foi depois congelado. Uma vez que todas as amostras foram coletadas, os grânulos congelados foram descongelados sobre gelo e lisados em tampão RIPA de acordo com o protocolo TTX. 50 µg de proteína foram adicionados à SDS-PAGE. A FIGURA 13 é um western blot ilustrando o curso de tempo de tradução do polipeptídeo ABCA3 expresso a partir da SEQ ID NO: 17 em células pulmonares in vitro. Para a detecção de ABCA3-FLAG : WB foi sondado como conjugado M2 anti flag-HRP 1:10000 O/N , e desenvolvido usando substrato de sinal Femto Super.
[00229] Embora as modalidades preferidas da presente invenção tenham sido apresentadas e aqui descritas, estará óbvio para aqueles habilitados na técnica que tais modalidades são fornecidas apenas por via de exemplo. Não é intencionado que a invenção seja limitada pelos exemplos específicos fornecidos dentro do relatório descritivo. Embora a invenção tenha sido descrita com referência ao relatório descritivo mencionado acima, as descrições e ilustrações das modalidades aqui não são intencionadas a serem interpretadas em um sentido limitante. Numerosas variações, mudanças, e substituições agora ocorrerão para aqueles habilitados na técnica sem divergir da invenção. Além disso, deve ser entendido que todos os aspectos da invenção não são limitados às descrições, configurações ou proporções relativas específicas aqui apresentadas que dependem de uma variedade de condições e variáveis. Deve ser entendido que várias alternativas para as modalidades da invenção aqui descritas podem ser utilizadas na prática da invenção. É, portanto, considerado que a invenção também deve abranger qualquer uma de tais alternativas, modificações, variações ou equivalentes. É intencionado que as seguintes reivindicações definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas dentro do escopo destas reivindicações e seus equivalentes sejam assim abrangidas.
[00230] As sequências exemplares descritas no pedido são fornecidas abaixo. A descrição fornece, em algumas modalidades, polinucleotídeos compreendendo, por exemplo, a sequência apresentada na SEQ ID NO: 17, 18, ou 19, ou uma sequência pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a tais sequências, ou uma sequência de polirribonucleotídeo, tal como um mRNA, correspondendo a ou codificada por qualquer um dos precedentes. Em algumas modalidades, a descrição fornece polinucleotídeos compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 17 ou 18, mas na ausência de uma etiqueta FLAG e/ou myc. Em algumas modalidades, uma 5’- UTR para o uso como parte de um polinucleotídeo que codifica um membro da família ABC, compreende uma região não traduzida derivada de um gene do polipeptídeo de citocromo b-245 alfa ou uma região não traduzida derivada de um gene do polipeptídeo de alfa-globina, tal como de um gene humano. Em algumas modalidades, uma 5’-UTR para o uso como parte de um polinucleotídeo que codifica um membro da família ABC, compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 16. Em certas modalidades de qualquer um dos precedentes, o polinucleotídeo ou polirribonucleotídeo são modificados (por exemplo, compreende análogos de nucleotídeo, como aqui descritos). LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1
[00231] Sumário: CYBA 5’ CGCGCCTAGCAGTGTCCCAGCCGGGTTCGTGTCGCC CGCGCCTAGCAGTGTCCCAGCCGGGTTCGTGTCGCC SEQ ID NO: 2
[00232] Sumário: CYBA 3’ CCTCGCCCCGGACCTGCCCTCCCGCCAGGTGCACCCA CCTGCAATAAATGCAGCGAAGCCGGGA CCTCGCCCCGGACCTGCCCTCCCGCCAGGTGCACCCA CCTGCAATAAATGCAGCGAAGCCGGGA SEQ ID NO: 3
[00233] Sumário: 5’-UTR de a-globina (HBA1) CATAAACCCTGGCGCGCTCGCGGCCCGGCACTCTTCT GGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACC CATAAACCCTGGCGCGCTCGCGGCCCGGCACTCTTCT GGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACC SEQ ID NO: 4
[00234] Sumário: 5’-UTR de a-globina (HBA2) CATAAACCCTGGCGCGCTCGCGGGCCGGCACTCTTCT GGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACC (SEQ ID NO: 4) CATAAACCCTGGCGCGCTCGCGGGCCGGCACTCTTCT GGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACC (SEQ ID NO: 4) SEQ ID NO: 5
[00235] Sumário: 5’-UTR ET de a -globina TCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAAC TCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAAC SEQ ID NO: 6
[00236] Sumário: ABCA3 5’ GCGGCCGCTGCGTCCGCCAGTAGCGGGTTGCAGGCG CACCCTCCCCTCCAGGGCGGCCACGCAGCTGTCAGTGCCGCCGCC ACTGCGAGGCTGGAGCGGAGCCCGGGTGGCCGAGGGAGGGGACC CCGCGAGAGGGCCGCGCGCCGGCCGCCGCCGCCCCGGCGCCCAGG CTCGGTGCTGGAGAGTCATGCCTGTGAGCCCTGGGCACCTCCTGAT GTCCTGCGAGGTCACGGTGTTCCCAAACCTCAGGGTTGCCCTGCCC CACTCCAGAGGCTCTCAGGCCCCACCCCGGAGCCCTCTGTGCGGA GCCGCCTCCTCCTGGCCAGTTCCCCAGTAGTCCTGAAGGGAGACCT GCTGTGTGGAGCCTCTTCTGGGACCCAGCCATGAGTGTGGAGCTG AGCAACTGAACCTGAAACTCTTCCACTGTGAGTCAAGGAGGCTTTT CCGCACATGAAGGACGCTGAGCGGGAAGGACTCCTCTCTGCCTGC AGTTGTAGCGAGTGGACCAGCACCAGGGGCTCTCTAGACTGCCCC TCCTCCATCGCCTTCCCTGCCTCTCCAGGACAGAGCAGCCACGTCT GCACACCTCGCCCTCTTTACACTCAGTTTTCAGAGCACGTTTCTCCT ATTTCCTGCGGGTTGCAGCGCCTACTTGAACTTACTCAGACCACCT ACTTCTCTAGCAGCACTGGGCGTCCCTTTCAGCAAGACG GCGGCCGCTGCGTCCGCCAGTAGCGGGTTGCAGGCG CACCCTCCCCTCCAGGGCGGCCACGCAGCTGTCAGTGCCGCCGCC ACTGCGAGGCTGGAGCGGAGCCCGGGTGGCCGAGGGAGGGGACC CCGCGAGAGGGCCGCGCGCCGGCCGCCGCCGCCCCGGCGCCCAGG CTCGGTGCTGGAGAGTCATGCCTGTGAGCCCTGGGCACCTCCTGAT GTCCTGCGAGGTCACGGTGTTCCCAAACCTCAGGGTTGCCCTGCCC CACTCCAGAGGCTCTCAGGCCCCACCCCGGAGCCCTCTGTGCGGA GCCGCCTCCTCCTGGCCAGTTCCCCAGTAGTCCTGAAGGGAGACCT GCTGTGTGGAGCCTCTTCTGGGACCCAGCCATGAGTGTGGAGCTG AGCAACTGAACCTGAAACTCTTCCACTGTGAGTCAAGGAGGCTTTT CCGCACATGAAGGACGCTGAGCGGGAAGGACTCCTCTCTGCCTGC AGTTGTAGCGAGTGGACCAGCACCAGGGGCTCTCTAGACTGCCCC TCCTCCATCGCCTTCCCTGCCTCTCCAGGACAGAGCAGCCACGTCT GCACACCTCGCCCTCTTTACACTCAGTTTTCAGAGCACGTTTCTCCT ATTTCCTGCGGGTTGCAGCGCCTACTTGAACTTACTCAGACCACCT ACTTCTCTAGCAGCACTGGGCGTCCCTTTCAGCAAGACG SEQ ID NO: 7
[00237] Sumário: ABCA3 5’ GGGGTGGCGGCTGTCTCGCCATCAGGCAGGGACAGG ACGGGCAAGCAGGGCCCATCTTACATCCTCTCTCTCCAAGTTTATC TCATCCTTTATTTTTAATCACTTTTTTCTATGATGGATATGAAAAAT TCAAGGCAGTATGCACAGAATGGACGAGTGCAGCCCAGCCCTCAT GCCCAGGATCAGCATGCGCATCTCCATGTCTGCATACTCTGGAGTT CACTTTCCCAGAGCTGGGGCAGGCCGGGCAGTCTGCGGGCAAGCT CCGGGGTCTCTGGGTGGAGAGCTGACCCAGGAAGGGCTGCAGCTG AGCTGGGGGTTGAATTTCTCCAGGCACTCCCTGGAGAGAGGACCC AGTGACTTGTCCAAGTTTACACACGACACTAATCTCCCCTGGGGAG GAAGCGGGAAGCCAGCCAGGTTGAACTGTAGCGAGGCCCCCAGGC CGCCAGGAATGGACCATGCAGATCACTGTCAGTGGAGGGAAGCTG CTGACTGTGATTAGGTGCTGGGGTCTTAGCGTCCAGCGCAGCCCGG GGGCATCCTGGAGGCTCTGCTCCTTAGGGCATGGTAGTCACCGCG AAGCCGGGCACCGTCCCACAGCATCTCCTAGAAGCAGCCGGCACA GGAGGGAAGGTGGCCAGGCTCGAAGCAGTCTCTGTTTCCAGCACT GCACCCTCAGGAAGTCGCCCGCCCCAGGACACGCAGGGACCACCC TAAGGGCTGGGTGGCTGTCTCAAGGACACATTGAATACGTTGTGA CCATCCAGAAAATAAATGCTGAGGGGACACAGTC GGGGTGGCGGCTGTCTCGCCATCAGGCAGGGACAGG ACGGGCAAGCAGGGCCCATCTTACATCCTCTCTCTCCAAGTTTATC TCATCCTTTATTTTTAATCACTTTTTTCTATGATGGATATGAAAAAT TCAAGGCAGTATGCACAGAATGGACGAGTGCAGCCCAGCCCTCAT GCCCAGGATCAGCATGCGCATCTCCATGTCTGCATACTCTGGAGTT CACTTTCCCAGAGCTGGGGCAGGCCGGGCAGTCTGCGGGCAAGCT CCGGGGTCTCTGGGTGGAGAGCTGACCCAGGAAGGGCTGCAGCTG AGCTGGGGGTTGAATTTCTCCAGGCACTCCCTGGAGAGAGGACCC AGTGACTTGTCCAAGTTTACACACGACACTAATCTCCCCTGGGGAG GAAGCGGGAAGCCAGCCAGGTTGAACTGTAGCGAGGCCCCCAGGC CGCCAGGAATGGACCATGCAGATCACTGTCAGTGGAGGGAAGCTG CTGACTGTGATTAGGTGCTGGGGTCTTAGCGTCCAGCGCAGCCCGG GGGCATCCTGGAGGCTCTGCTCCTTAGGGCATGGTAGTCACCGCG AAGCCGGGCACCGTCCCACAGCATCTCCTAGAAGCAGCCGGCACA GGAGGGAAGGTGGCCAGGCTCGAAGCAGTCTCTGTTTCCAGCACT GCACCCTCAGGAAGTCGCCCGCCCCAGGACACGCAGGGACCACCC TAAGGGCTGGGTGGCTGTCTCAAGGACACATTGAATACGTTGTGA CCATCCAGAAAATAAATGCTGAGGGGACACAGTC SEQ ID NO: 8
[00238] Sumário: ABCA3 mRNA AUGGCUGUGCUCAGGCAGCUGGCGCUCCUCCUCUG GAAGAACUACACCCUGCAGAAGCGGAAGGUCCUGGUGACGGUCC UGGAACUCUUCCUGCCAUUGCUGUUUUCUGGGAUCCUCAUCUGG CUCCGCUUGAAGAUUCAGUCGGAAAAUGUGCCCAACGCCACCAU CUACCCGGGCCAGUCCAUCCAGGAGCUGCCUCUGUUCUUCACCU UCCCUCCGCCAGGAGACACCUGGGAGCUUGCCUACAUCCCUUCU CACAGUGACGCUGCCAAGACCGUCACUGAGACAGUGCGCAGGGC ACUUGUGAUCAACAUGCGAGUGCGCGGCUUUCCCUCCGAGAAGG ACUUUGAGGACUACAUUAGGUACGACAACUGCUCGUCCAGCGUG CUGGCCGCCGUGGUCUUCGAGCACCCCUUCAACCACAGCAAGGA GCCCCUGCCGCUGGCGGUGAAAUAUCACCUACGGUUCAGUUACA CACGGAGAAAUUACAUGUGGACCCAAACAGGCUCCUUUUUCCUG AAAGAGACAGAAGGCUGGCACACUACUUCCCUUUUCCCGCUUUU CCCAAACCCAGGACCAAGGGAACCUACAUCCCCUGAUGGCGGAG AACCUGGGUACAUCCGGGAAGGCUUCCUGGCCGUGCAGCAUGCU GUGGACCGGGCCAUCAUGGAGUACCAUGCCGAUGCCGCCACACG CCAGCUGUUCCAGAGACUGACGGUGACCAUCAAGAGGUUCCCGU ACCCGCCGUUCAUCGCAGACCCCUUCCUCGUGGCCAUCCAGUACC AGCUGCCCCUGCUGCUGCUGCUCAGCUUCACCUACACCGCGCUC ACCAUUGCCCGUGCUGUCGUGCAGGAGAAGGAAAGGAGGCUGAA GGAGUACAUGCGCAUGAUGGGGCUCAGCAGCUGGCUGCACUGGA GUGCCUGGUUCCUCUUGUUCUUCCUCUUCCUCCUCAUCGCCGCC UCCUUCAUGACCCUGCUCUUCUGUGUCAAGGUGAAGCCAAAUGU AGCCGUGCUGUCCCGCAGCGACCCCUCCCUGGUGCUCGCCUUCCU GCUGUGCUUCGCCAUCUCUACCAUCUCCUUCAGCUUCAUGGUCA GCACCUUCUUCAGCAAAGCCAACAUGGCAGCAGCCUUCGGAGGC UUCCUCUACUUCUUCACCUACAUCCCCUACUUCUUCGUGGCCCC UCGGUACAACUGGAUGACUCUGAGCCAGAAGCUCUGCUCCUGCC UCCUGUCUAAUGUCGCCAUGGCAAUGGGAGCCCAGCUCAUUGGG AAAUUUGAGGCGAAAGGCAUGGGCAUCCAGUGGCGAGACCUCCU GAGUCCCGUCAACGUGGACGACGACUUCUGCUUCGGGCAGGUGC UGGGGAUGCUGCUGCUGGACUCUGUGCUCUAUGGCCUGGUGACC UGGUACAUGGAGGCCGUCUUCCCAGGGCAGUUCGGCGUGCCUCA GCCCUGGUACUUCUUCAUCAUGCCCUCCUAUUGGUGUGGGAAGC CAAGGGCGGUUGCAGGGAAGGAGGAAGAAGACAGUGACCCCGAG AAAGCACUCAGAAACGAGUACUUUGAAGCCGAGCCAGAGGACCU GGUGGCGGGGAUCAAGAUCAAGCACCUGUCCAAGGUGUUCAGGG UGGGAAAUAAGGACAGGGCGGCCGUCAGAGACCUGAACCUCAAC CUGUACGAGGGACAGAUCACCGUCCUGCUGGGCCACAACGGUGC CGGGAAGACCACCACCCUCUCCAUGCUCACAGGUCUCUUUCCCCC CACCAGUGGACGGGCAUACAUCAGCGGGUAUGAAAUUUCCCAGG ACAUGGUUCAGAUCCGGAAGAGCCUGGGCCUGUGCCCGCAGCAC GACAUCCUGUUUGACAACUUGACAGUCGCAGAGCACCUUUAUUU CUACGCCCAGCUGAAGGGCCUGUCACGUCAGAAGUGCCCUGAAG AAGUCAAGCAGAUGCUGCACAUCAUCGGCCUGGAGGACAAGUGG AACUCACGGAGCCGCUUCCUGAGCGGGGGCAUGAGGCGCAAGCU CUCCAUCGGCAUCGCCCUCAUCGCAGGCUCCAAGGUGCUGAUAC UGGACGAGCCCACCUCGGGCAUGGACGCCAUCUCCAGGAGGGCC AUCUGGGAUCUUCUUCAGCGGCAGAAAAGUGACCGCACCAUCGU GCUGACCACCCACUUCAUGGACGAGGCUGACCUGCUGGGAGACC GCAUCGCCAUCAUGGCCAAGGGGGAGCUGCAGUGCUGCGGGUCC UCGCUGUUCCUCAAGCAGAAAUACGGUGCCGGCUAUCACAUGAC GCUGGUGAAGGAGCCGCACUGCAACCCGGAAGACAUCUCCCAGC UGGUCCACCACCACGUGCCCAACGCCACGCUGGAGAGCAGCGCU GGGGCCGAGCUGUCUUUCAUCCUUCCCAGAGAGAGCACGCACAG GUUUGAAGGUCUCUUUGCUAAACUGGAGAAGAAGCAGAAAGAG CUGGGCAUUGCCAGCUUUGGGGCAUCCAUCACCACCAUGGAGGA AGUCUUCCUUCGGGUCGGGAAGCUGGUGGACAGCAGUAUGGACA UCCAGGCCAUCCAGCUCCCUGCCCUGCAGUACCAGCACGAGAGG CGCGCCAGCGACUGGGCUGUGGACAGCAACCUCUGUGGGGCCAU GGACCCCUCCGACGGCAUUGGAGCCCUCAUCGAGGAGGAGCGCA CCGCUGUCAAGCUCAACACUGGGCUCGCCCUGCACUGCCAGCAA UUCUGGGCCAUGUUCCUGAAGAAGGCCGCAUACAGCUGGCGCGA GUGGAAAAUGGUGGCGGCACAGGUCCUGGUGCCUCUGACCUGCG UCACCCUGGCCCUCCUGGCCAUCAACUACUCCUCGGAGCUCUUC GACGACCCCAUGCUGAGGCUGACCUUGGGCGAGUACGGCAGAAC CGUCGUGCCCUUCUCAGUUCCCGGGACCUCCCAGCUGGGUCAGC AGCUGUCAGAGCAUCUGAAAGACGCACUGCAGGCUGAGGGACAG GAGCCCCGCGAGGUGCUCGGUGACCUGGAGGAGUUCUUGAUCUU CAGGGCUUCUGUGGAGGGGGGCGGCUUUAAUGAGCGGUGCCUUG UGGCAGCGUCCUUCAGAGAUGUGGGAGAGCGCACGGUCGUCAAC GCCUUGUUCAACAACCAGGCGUACCACUCUCCAGCCACUGCCCU GGCCGUCGUGGACAACCUUCUGUUCAAGCUGCUGUGCGGGCCUC ACGCCUCCAUUGUGGUCUCCAACUUCCCCCAGCCCCGGAGCGCCC UGCAGGCUGCCAAGGACCAGUUUAACGAGGGCCGGAAGGGAUUC GACAUUGCCCUCAACCUGCUCUUCGCCAUGGCAUUCUUGGCCAG CACGUUCUCCAUCCUGGCGGUCAGCGAGAGGGCCGUGCAGGCCA AGCAUGUGCAGUUUGUGAGUGGAGUCCACGUGGCCAGUUUCUGG CUCUCUGCUCUGCUGUGGGACCUCAUCUCCUUCCUCAUCCCCAG UCUGCUGCUGCUGGUGGUGUUUAAGGCCUUCGACGUGCGUGCCU UCACGCGGGACGGCCACAUGGCUGACACCCUGCUGCUGCUCCUG CUCUACGGCUGGGCCAUCAUCCCCCUCAUGUACCUGAUGAACUU CUUCUUCUUGGGGGCGGCCACUGCCUACACGAGGCUGACCAUCU UCAACAUCCUGUCAGGCAUCGCCACCUUCCUGAUGGUCACCAUC AUGCGCAUCCCAGCUGUAAAACUGGAAGAACUUUCCAAAACCCU GGAUCACGUGUUCCUGGUGCUGCCCAACCACUGUCUGGGGAUGG CAGUCAGCAGUUUCUACGAGAACUACGAGACGCGGAGGUACUGC ACCUCCUCCGAGGUCGCCGCCCACUACUGCAAGAAAUAUAACAU CCAGUACCAGGAGAACUUCUAUGCCUGGAGCGCCCCGGGGGUCG GCCGGUUUGUGGCCUCCAUGGCCGCCUCAGGGUGCGCCUACCUC AUCCUGCUCUUCCUCAUCGAGACCAACCUGCUUCAGAGACUCAG GGGCAUCCUCUGCGCCCUCCGGAGGAGGCGGACACUGACAGAAU UAUACACCCGGAUGCCUGUGCUUCCUGAGGACCAAGAUGUAGCG GACGAGAGGACCCGCAUCCUGGCCCCCAGCCCGGACUCCCUGCUC CACACACCUCUGAUUAUCAAGGAGCUCUCCAAGGUGUACGAGCA GCGGGUGCCCCUCCUGGCCGUGGACAGGCUCUCCCUCGCGGUGC AGAAAGGGGAGUGCUUCGGCCUGCUGGGCUUCAAUGGAGCCGGG AAGACCACGACUUUCAAAAUGCUGACCGGGGAGGAGAGCCUCAC UUCUGGGGAUGCCUUUGUCGGGGGUCACAGAAUCAGCUCUGAUG UCGGAAAGGUGCGGCAGCGGAUCGGCUACUGCCCGCAGUUUGAU GCCUUGCUGGACCACAUGACAGGCCGGGAGAUGCUGGUCAUGUA CGCUCGGCUCCGGGGCAUCCCUGAGCGCCACAUCGGGGCCUGCG UGGAGAACACUCUGCGGGGCCUGCUGCUGGAGCCACAUGCCAAC AAGCUGGUCAGGACGUACAGUGGUGGUAACAAGCGGAAGCUGA GCACCGGCAUCGCCCUGAUCGGAGAGCCUGCUGUCAUCUUCCUG GACGAGCCGUCCACUGGCAUGGACCCCGUGGCCCGGCGCCUGCU UUGGGACACCGUGGCACGAGCCCGAGAGUCUGGCAAGGCCAUCA UCAUCACCUCCCACAGCAUGGAGGAGUGUGAGGCCCUGUGCACC CGGCUGGCCAUCAUGGUGCAGGGGCAGUUCAAGUGCCUGGGCAG CCCCCAGCACCUCAAGAGCAAGUUCGGCAGCGGCUACUCCCUGC GGGCCAAGGUGCAGAGUGAAGGGCAACAGGAGGCGCUGGAGGA GUUCAAGGCCUUCGUGGACCUGACCUUUCCAGGCAGCGUCCUGG AAGAUGAGCACCAAGGCAUGGUCCAUUACCACCUGCCGGGCCGU GACCUCAGCUGGGCGAAGGUUUUCGGUAUUCUGGAGAAAGCCAA GGAAAAGUACGGCGUGGACGACUACUCCGUGAGCCAGAUCUCGC UGGAACAGGUCUUCCUGAGCUUCGCCCACCUGCAGCCGCCCACC GCAGAGGAGGGGCGA AUGGCUGUGCUCAGGCAGCUGGCGCUCCUCCUCUG GAAGAACUACACCCUGCAGAAGCGGAAGGUCCUGGUGACGGUCC UGGAACUCUUCCUGCCAUUGCUGUUUUCUGGGAUCCUCAUCUGG CUCCGCUUGAAGAUUCAGUCGGAAAAUGUGCCCAACGCCACCAU CUACCCGGGCCAGUCCAUCCAGGAGCUGCCUCUGUUCUUCACCU UCCCUCCGCCAGGAGACACCUGGGAGCUUGCCUACAUCCCUUCU CACAGUGACGCUGCCAAGACCGUCACUGAGACAGUGCGCAGGGC ACUUGUGAUCAACAUGCGAGUGCGCGGCUUUCCCUCCGAGAAGG ACUUUGAGGACUACAUUAGGUACGACAACUGCUCGUCCAGCGUG CUGGCCGCCGUGGUCUUCGAGCACCCCUUCAACCACAGCAAGGA GCCCCUGCCGCUGGCGGUGAAAUAUCACCUACGGUUCAGUUACA CACGGAGAAAUUACAUGUGGACCCAAACAGGCUCCUUUUUCCUG AAAGAGACAGAAGGCUGGCACACUACUUCCCUUUUCCCGCUUUU CCCAAACCCAGGACCAAGGGAACCUACAUCCCCUGAUGGCGGAG AACCUGGGUACAUCCGGGAAGGCUUCCUGGCCGUGCAGCAUGCU GUGGACCGGGCCAUCAUGGAGUACCAUGCCGAUGCCGCCACACG CCAGCUGUUCCAGAGACUGACGGUGACCAUCAAGAGGUUCCCGU ACCCGCCGUUCAUCGCAGACCCCUUCCUCGUGGCCAUCCAGUACC AGCUGCCCCUGCUGCUGCUGCUCAGCUUCACCUACACCGCGCUC ACCAUUGCCCGUGCUGUCGUGCAGGAGAAGGAAAGGAGGCUGAA GGAGUACAUGCGCAUGAUGGGGCUCAGCAGCUGGCUGCACUGGA GUGCCUGGUUCCUCUUGUUCUUCCUCUUCCUCCUCAUCGCCGCC UCCUUCAUGACCCUGCUCUUCUGUGUCAAGGUGAAGCCAAAUGU AGCCGUGCUGUCCCGCAGCGACCCCUCCCUGGUGCUCGCCUUCCU GCUGUGCUUCGCCAUCUCUACCAUCUCCUUCAGCUUCAUGGUCA GCACCUUCUUCAGCAAAGCCAACAUGGCAGCAGCCUUCGGAGGC UUCCUCUACUUCUUCACCUACAUCCCCUACUUCUUCGUGGCCCC UCGGUACAACUGGAUGACUCUGAGCCAGAAGCUCUGCUCCUGCC UCCUGUCUAAUGUCGCCAUGGCAAUGGGAGCCCAGCUCAUUGGG AAAUUUGAGGCGAAAGGCAUGGGCAUCCAGUGGCGAGACCUCCU GAGUCCCGUCAACGUGGACGACGACUUCUGCUUCGGGCAGGUGC UGGGGAUGCUGCUGCUGGACUCUGUGCUCUAUGGCCUGGUGACC UGGUACAUGGAGGCCGUCUUCCCAGGGCAGUUCGGCGUGCCUCA GCCCUGGUACUUCUUCAUCAUGCCCUCCUAUUGGUGUGGGAAGC CAAGGGCGGUUGCAGGGAAGGAGGAAGAAGACAGUGACCCCGAG AAAGCACUCAGAAACGAGUACUUUGAAGCCGAGCCAGAGGACCU GGUGGCGGGGAUCAAGAUCAAGCACCUGUCCAAGGUGUUCAGGG UGGGAAAUAAGGACAGGGCGGCCGUCAGAGACCUGAACCUCAAC CUGUACGAGGGACAGAUCACCGUCCUGCUGGGCCACAACGGUGC CGGGAAGACCACCACCCUCUCCAUGCUCACAGGUCUCUUUCCCCC CACCAGUGGACGGGCAUACAUCAGCGGGUAUGAAAUUUCCCAGG ACAUGGUUCAGAUCCGGAAGAGCCUGGGCCUGUGCCCGCAGCAC GACAUCCUGUUUGACAACUUGACAGUCGCAGAGCACCUUUAUUU CUACGCCCAGCUGAAGGGCCUGUCACGUCAGAAGUGCCCUGAAG AAGUCAAGCAGAUGCUGCACAUCAUCGGCCUGGAGGACAAGUGG AACUCACGGAGCCGCUUCCUGAGCGGGGGCAUGAGGCGCAAGCU CUCCAUCGGCAUCGCCCUCAUCGCAGGCUCCAAGGUGCUGAUAC UGGACGAGCCCACCUCGGGCAUGGACGCCAUCUCCAGGAGGGCC AUCUGGGAUCUUCUUCAGCGGCAGAAAAGUGACCGCACCAUCGU GCUGACCACCCACUUCAUGGACGAGGCUGACCUGCUGGGAGACC GCAUCGCCAUCAUGGCCAAGGGGGAGCUGCAGUGCUGCGGGUCC UCGCUGUUCCUCAAGCAGAAAUACGGUGCCGGCUAUCACAUGAC GCUGGUGAAGGAGCCGCACUGCAACCCGGAAGACAUCUCCCAGC UGGUCCACCACCACGUGCCCAACGCCACGCUGGAGAGCAGCGCU GGGGCCGAGCUGUCUUUCAUCCUUCCCAGAGAGAGCACGCACAG GUUUGAAGGUCUCUUUGCUAAACUGGAGAAGAAGCAGAAAGAG CUGGGCAUUGCCAGCUUUGGGGCAUCCAUCACCACCAUGGAGGA AGUCUUCCUUCGGGUCGGGAAGCUGGUGGACAGCAGUAUGGACA UCCAGGCCAUCCAGCUCCCUGCCCUGCAGUACCAGCACGAGAGG CGCGCCAGCGACUGGGCUGUGGACAGCAACCUCUGUGGGGCCAU GGACCCCUCCGACGGCAUUGGAGCCCUCAUCGAGGAGGAGCGCA CCGCUGUCAAGCUCAACACUGGGCUCGCCCUGCACUGCCAGCAA UUCUGGGCCAUGUUCCUGAAGAAGGCCGCAUACAGCUGGCGCGA GUGGAAAAUGGUGGCGGCACAGGUCCUGGUGCCUCUGACCUGCG UCACCCUGGCCCUCCUGGCCAUCAACUACUCCUCGGAGCUCUUC GACGACCCCAUGCUGAGGCUGACCUUGGGCGAGUACGGCAGAAC CGUCGUGCCCUUCUCAGUUCCCGGGACCUCCCAGCUGGGUCAGC AGCUGUCAGAGCAUCUGAAAGACGCACUGCAGGCUGAGGGACAG GAGCCCCGCGAGGUGCUCGGUGACCUGGAGGAGUUCUUGAUCUU CAGGGCUUCUGUGGAGGGGGGCGGCUUUAAUGAGCGGUGCCUUG UGGCAGCGUCCUUCAGAGAUGUGGGAGAGCGCACGGUCGUCAAC GCCUUGUUCAACAACCAGGCGUACCACUCUCCAGCCACUGCCCU GGCCGUCGUGGACAACCUUCUGUUCAAGCUGCUGUGCGGGCCUC ACGCCUCCAUUGUGGUCUCCAACUUCCCCCAGCCCCGGAGCGCCC UGCAGGCUGCCAAGGACCAGUUUAACGAGGGCCGGAAGGGAUUC GACAUUGCCCUCAACCUGCUCUUCGCCAUGGCAUUCUUGGCCAG CACGUUCUCCAUCCUGGCGGUCAGCGAGAGGGCCGUGCAGGCCA AGCAUGUGCAGUUUGUGAGUGGAGUCCACGUGGCCAGUUUCUGG CUCUCUGCUCUGCUGUGGGACCUCAUCUCCUUCCUCAUCCCCAG UCUGCUGCUGCUGGUGGUGUUUAAGGCCUUCGACGUGCGUGCCU UCACGCGGGACGGCCACAUGGCUGACACCCUGCUGCUGCUCCUG CUCUACGGCUGGGCCAUCAUCCCCCUCAUGUACCUGAUGAACUU CUUCUUCUUGGGGGCGGCCACUGCCUACACGAGGCUGACCAUCU UCAACAUCCUGUCAGGCAUCGCCACCUUCCUGAUGGUCACCAUC AUGCGCAUCCCAGCUGUAAAACUGGAAGAACUUUCCAAAACCCU GGAUCACGUGUUCCUGGUGCUGCCCAACCACUGUCUGGGGAUGG CAGUCAGCAGUUUCUACGAGAACUACGAGACGCGGAGGUACUGC ACCUCCUCCGAGGUCGCCGCCCACUACUGCAAGAAAUAUAACAU CCAGUACCAGGAGAACUUCUAUGCCUGGAGCGCCCCGGGGGUCG GCCGGUUUGUGGCCUCCAUGGCCGCCUCAGGGUGCGCCUACCUC AUCCUGCUCUUCCUCAUCGAGACCAACCUGCUUCAGAGACUCAG GGGCAUCCUCUGCGCCCUCCGGAGGAGGCGGACACUGACAGAAU UAUACACCCGGAUGCCUGUGCUUCCUGAGGACCAAGAUGUAGCG GACGAGAGGACCCGCAUCCUGGCCCCCAGCCCGGACUCCCUGCUC CACACACCUCUGAUUAUCAAGGAGCUCUCCAAGGUGUACGAGCA GCGGGUGCCCCUCCUGGCCGUGGACAGGCUCUCCCUCGCGGUGC AGAAAGGGGAGUGCUUCGGCCUGCUGGGCUUCAAUGGAGCCGGG AAGACCACGACUUUCAAAAUGCUGACCGGGGAGGAGAGCCUCAC UUCUGGGGAUGCCUUUGUCGGGGGUCACAGAAUCAGCUCUGAUG UCGGAAAGGUGCGGCAGCGGAUCGGCUACUGCCCGCAGUUUGAU GCCUUGCUGGACCACAUGACAGGCCGGGAGAUGCUGGUCAUGUA CGCUCGGCUCCGGGGCAUCCCUGAGCGCCACAUCGGGGCCUGCG UGGAGAACACUCUGCGGGGCCUGCUGCUGGAGCCACAUGCCAAC AAGCUGGUCAGGACGUACAGUGGUGGUAACAAGCGGAAGCUGA GCACCGGCAUCGCCCUGAUCGGAGAGCCUGCUGUCAUCUUCCUG GACGAGCCGUCCACUGGCAUGGACCCCGUGGCCCGGCGCCUGCU UUGGGACACCGUGGCACGAGCCCGAGAGUCUGGCAAGGCCAUCA UCAUCACCUCCCACAGCAUGGAGGAGUGUGAGGCCCUGUGCACC CGGCUGGCCAUCAUGGUGCAGGGGCAGUUCAAGUGCCUGGGCAG CCCCCAGCACCUCAAGAGCAAGUUCGGCAGCGGCUACUCCCUGC GGGCCAAGGUGCAGAGUGAAGGGCAACAGGAGGCGCUGGAGGA GUUCAAGGCCUUCGUGGACCUGACCUUUCCAGGCAGCGUCCUGG AAGAUGAGCACCAAGGCAUGGUCCAUUACCACCUGCCGGGCCGU GACCUCAGCUGGGCGAAGGUUUUCGGUAUUCUGGAGAAAGCCAA GGAAAAGUACGGCGUGGACGACUACUCCGUGAGCCAGAUCUCGC UGGAACAGGUCUUCCUGAGCUUCGCCCACCUGCAGCCGCCCACC GCAGAGGAGGGGCGA SEQ ID NO: 9
[00239] Sumário: ABCA3 DNA ORF (do tipo selvagem) ATGGCTGTGCTCAGGCAGCTGGCGCTCCTCCTCTGGA AGAACTACACCCTGCAGAAGCGGAAGGTCCTGGTGACGGTCCTGG AACTCTTCCTGCCATTGCTGTTTTCTGGGATCCTCATCTGGCTCCGC TTGAAGATTCAGTCGGAAAATGTGCCCAACGCCACCATCTACCCG GGCCAGTCCATCCAGGAGCTGCCTCTGTTCTTCACCTTCCCTCCGC CAGGAGACACCTGGGAGCTTGCCTACATCCCTTCTCACAGTGACGC TGCCAAGACCGTCACTGAGACAGTGCGCAGGGCACTTGTGATCAA CATGCGAGTGCGCGGCTTTCCCTCCGAGAAGGACTTTGAGGACTA CATTAGGTACGACAACTGCTCGTCCAGCGTGCTGGCCGCCGTGGTC TTCGAGCACCCCTTCAACCACAGCAAGGAGCCCCTGCCGCTGGCG GTGAAATATCACCTACGGTTCAGTTACACACGGAGAAATTACATG TGGACCCAAACAGGCTCCTTTTTCCTGAAAGAGACAGAAGGCTGG CACACTACTTCCCTTTTCCCGCTTTTCCCAAACCCAGGACCAAGGG AACCTACATCCCCTGATGGCGGAGAACCTGGGTACATCCGGGAAG GCTTCCTGGCCGTGCAGCATGCTGTGGACCGGGCCATCATGGAGT ACCATGCCGATGCCGCCACACGCCAGCTGTTCCAGAGACTGACGG TGACCATCAAGAGGTTCCCGTACCCGCCGTTCATCGCAGACCCCTT CCTCGTGGCCATCCAGTACCAGCTGCCCCTGCTGCTGCTGCTCAGC TTCACCTACACCGCGCTCACCATTGCCCGTGCTGTCGTGCAGGAGA AGGAAAGGAGGCTGAAGGAGTACATGCGCATGATGGGGCTCAGC 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SEQ ID NO: 10
[00240] Sumário: uma sequência de DNA de ABCA3 nativa com uma 5’ CYBA UTR e uma 3’ CYBA UTR (SEQ ID NO: 10) CGCGCCTAGCAGTGTCCCAGCCGGGTTCGTGTCGCCG CCACCATGGCTGTGCTCAGGCAGCTGGCGCTCCTCCTCTGGAAGAA CTACACCCTGCAGAAGCGGAAGGTCCTGGTGACGGTCCTGGAACT CTTCCTGCCATTGCTGTTTTCTGGGATCCTCATCTGGCTCCGCTTGA AGATTCAGTCGGAAAATGTGCCCAACGCCACCATCTACCCGGGCC AGTCCATCCAGGAGCTGCCTCTGTTCTTCACCTTCCCTCCGCCAGG AGACACCTGGGAGCTTGCCTACATCCCTTCTCACAGTGACGCTGCC AAGACCGTCACTGAGACAGTGCGCAGGGCACTTGTGATCAACATG CGAGTGCGCGGCTTTCCCTCCGAGAAGGACTTTGAGGACTACATTA GGTACGACAACTGCTCGTCCAGCGTGCTGGCCGCCGTGGTCTTCGA GCACCCCTTCAACCACAGCAAGGAGCCCCTGCCGCTGGCGGTGAA ATATCACCTACGGTTCAGTTACACACGGAGAAATTACATGTGGAC CCAAACAGGCTCCTTTTTCCTGAAAGAGACAGAAGGCTGGCACAC TACTTCCCTTTTCCCGCTTTTCCCAAACCCAGGACCAAGGGAACCT ACATCCCCTGATGGCGGAGAACCTGGGTACATCCGGGAAGGCTTC CTGGCCGTGCAGCATGCTGTGGACCGGGCCATCATGGAGTACCAT GCCGATGCCGCCACACGCCAGCTGTTCCAGAGACTGACGGTGACC ATCAAGAGGTTCCCGTACCCGCCGTTCATCGCAGACCCCTTCCTCG TGGCCATCCAGTACCAGCTGCCCCTGCTGCTGCTGCTCAGCTTCAC 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GAGGTGCTCGGTGACCTGGAGGAGTTCTTGATCTTCAGGGCTTCTG TGGAGGGGGGCGGCTTTAATGAGCGGTGCCTTGTGGCAGCGTCCT TCAGAGATGTGGGAGAGCGCACGGTCGTCAACGCCTTGTTCAACA ACCAGGCGTACCACTCTCCAGCCACTGCCCTGGCCGTCGTGGACA ACCTTCTGTTCAAGCTGCTGTGCGGGCCTCACGCCTCCATTGTGGT CTCCAACTTCCCCCAGCCCCGGAGCGCCCTGCAGGCTGCCAAGGA CCAGTTTAACGAGGGCCGGAAGGGATTCGACATTGCCCTCAACCT GCTCTTCGCCATGGCATTCTTGGCCAGCACGTTCTCCATCCTGGCG GTCAGCGAGAGGGCCGTGCAGGCCAAGCATGTGCAGTTTGTGAGT GGAGTCCACGTGGCCAGTTTCTGGCTCTCTGCTCTGCTGTGGGACC TCATCTCCTTCCTCATCCCCAGTCTGCTGCTGCTGGTGGTGTTTAAG GCCTTCGACGTGCGTGCCTTCACGCGGGACGGCCACATGGCTGAC ACCCTGCTGCTGCTCCTGCTCTACGGCTGGGCCATCATCCCCCTCA TGTACCTGATGAACTTCTTCTTCTTGGGGGCGGCCACTGCCTACAC GAGGCTGACCATCTTCAACATCCTGTCAGGCATCGCCACCTTCCTG ATGGTCACCATCATGCGCATCCCAGCTGTAAAACTGGAAGAACTTT CCAAAACCCTGGATCACGTGTTCCTGGTGCTGCCCAACCACTGTCT GGGGATGGCAGTCAGCAGTTTCTACGAGAACTACGAGACGCGGAG GTACTGCACCTCCTCCGAGGTCGCCGCCCACTACTGCAAGAAATAT AACATCCAGTACCAGGAGAACTTCTATGCCTGGAGCGCCCCGGGG GTCGGCCGGTTTGTGGCCTCCATGGCCGCCTCAGGGTGCGCCTACC TCATCCTGCTCTTCCTCATCGAGACCAACCTGCTTCAGAGACTCAG GGGCATCCTCTGCGCCCTCCGGAGGAGGCGGACACTGACAGAATT ATACACCCGGATGCCTGTGCTTCCTGAGGACCAAGATGTAGCGGA CGAGAGGACCCGCATCCTGGCCCCCAGCCCGGACTCCCTGCTCCA CACACCTCTGATTATCAAGGAGCTCTCCAAGGTGTACGAGCAGCG GGTGCCCCTCCTGGCCGTGGACAGGCTCTCCCTCGCGGTGCAGAA AGGGGAGTGCTTCGGCCTGCTGGGCTTCAATGGAGCCGGGAAGAC CACGACTTTCAAAATGCTGACCGGGGAGGAGAGCCTCACTTCTGG GGATGCCTTTGTCGGGGGTCACAGAATCAGCTCTGATGTCGGAAA GGTGCGGCAGCGGATCGGCTACTGCCCGCAGTTTGATGCCTTGCTG GACCACATGACAGGCCGGGAGATGCTGGTCATGTACGCTCGGCTC CGGGGCATCCCTGAGCGCCACATCGGGGCCTGCGTGGAGAACACT CTGCGGGGCCTGCTGCTGGAGCCACATGCCAACAAGCTGGTCAGG ACGTACAGTGGTGGTAACAAGCGGAAGCTGAGCACCGGCATCGCC CTGATCGGAGAGCCTGCTGTCATCTTCCTGGACGAGCCGTCCACTG GCATGGACCCCGTGGCCCGGCGCCTGCTTTGGGACACCGTGGCAC GAGCCCGAGAGTCTGGCAAGGCCATCATCATCACCTCCCACAGCA TGGAGGAGTGTGAGGCCCTGTGCACCCGGCTGGCCATCATGGTGC AGGGGCAGTTCAAGTGCCTGGGCAGCCCCCAGCACCTCAAGAGCA AGTTCGGCAGCGGCTACTCCCTGCGGGCCAAGGTGCAGAGTGAAG GGCAACAGGAGGCGCTGGAGGAGTTCAAGGCCTTCGTGGACCTGA CCTTTCCAGGCAGCGTCCTGGAAGATGAGCACCAAGGCATGGTCC ATTACCACCTGCCGGGCCGTGACCTCAGCTGGGCGAAGGTTTTCGG TATTCTGGAGAAAGCCAAGGAAAAGTACGGCGTGGACGACTACTC CGTGAGCCAGATCTCGCTGGAACAGGTCTTCCTGAGCTTCGCCCAC CTGCAGCCGCCCACCGCAGAGGAGGGGCGAACGCGTACGCGACCG CTCGAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGGCAGCAAATGAT ATCCTGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGTTTGACCTCGCCCC GGACCTGCCCTCCCGCCAGGTGCACCCACCTGCAATAAATGCAGC GAAGCCGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AATT
SEQ ID NO: 11
[00241] Sumário: uma sequência de mRNA de ABCA3 nativa com uma 5’ CYBA UTR e uma 3’ CYBA UTR (SEQ ID NO: 11) CGCGCCUAGCAGUGUCCCAGCCGGGUUCGUGUCGCC GCCACCAUGGCUGUGCUCAGGCAGCUGGCGCUCCUCCUCUGGAA GAACUACACCCUGCAGAAGCGGAAGGUCCUGGUGACGGUCCUGG AACUCUUCCUGCCAUUGCUGUUUUCUGGGAUCCUCAUCUGGCUC CGCUUGAAGAUUCAGUCGGAAAAUGUGCCCAACGCCACCAUCUA CCCGGGCCAGUCCAUCCAGGAGCUGCCUCUGUUCUUCACCUUCC CUCCGCCAGGAGACACCUGGGAGCUUGCCUACAUCCCUUCUCAC AGUGACGCUGCCAAGACCGUCACUGAGACAGUGCGCAGGGCACU UGUGAUCAACAUGCGAGUGCGCGGCUUUCCCUCCGAGAAGGACU UUGAGGACUACAUUAGGUACGACAACUGCUCGUCCAGCGUGCUG GCCGCCGUGGUCUUCGAGCACCCCUUCAACCACAGCAAGGAGCC CCUGCCGCUGGCGGUGAAAUAUCACCUACGGUUCAGUUACACAC GGAGAAAUUACAUGUGGACCCAAACAGGCUCCUUUUUCCUGAAA GAGACAGAAGGCUGGCACACUACUUCCCUUUUCCCGCUUUUCCC AAACCCAGGACCAAGGGAACCUACAUCCCCUGAUGGCGGAGAAC CUGGGUACAUCCGGGAAGGCUUCCUGGCCGUGCAGCAUGCUGUG GACCGGGCCAUCAUGGAGUACCAUGCCGAUGCCGCCACACGCCA GCUGUUCCAGAGACUGACGGUGACCAUCAAGAGGUUCCCGUACC CGCCGUUCAUCGCAGACCCCUUCCUCGUGGCCAUCCAGUACCAG CUGCCCCUGCUGCUGCUGCUCAGCUUCACCUACACCGCGCUCACC AUUGCCCGUGCUGUCGUGCAGGAGAAGGAAAGGAGGCUGAAGG AGUACAUGCGCAUGAUGGGGCUCAGCAGCUGGCUGCACUGGAGU GCCUGGUUCCUCUUGUUCUUCCUCUUCCUCCUCAUCGCCGCCUCC UUCAUGACCCUGCUCUUCUGUGUCAAGGUGAAGCCAAAUGUAGC CGUGCUGUCCCGCAGCGACCCCUCCCUGGUGCUCGCCUUCCUGCU GUGCUUCGCCAUCUCUACCAUCUCCUUCAGCUUCAUGGUCAGCA CCUUCUUCAGCAAAGCCAACAUGGCAGCAGCCUUCGGAGGCUUC CUCUACUUCUUCACCUACAUCCCCUACUUCUUCGUGGCCCCUCG GUACAACUGGAUGACUCUGAGCCAGAAGCUCUGCUCCUGCCUCC UGUCUAAUGUCGCCAUGGCAAUGGGAGCCCAGCUCAUUGGGAAA UUUGAGGCGAAAGGCAUGGGCAUCCAGUGGCGAGACCUCCUGAG UCCCGUCAACGUGGACGACGACUUCUGCUUCGGGCAGGUGCUGG GGAUGCUGCUGCUGGACUCUGUGCUCUAUGGCCUGGUGACCUGG UACAUGGAGGCCGUCUUCCCAGGGCAGUUCGGCGUGCCUCAGCC CUGGUACUUCUUCAUCAUGCCCUCCUAUUGGUGUGGGAAGCCAA GGGCGGUUGCAGGGAAGGAGGAAGAAGACAGUGACCCCGAGAA AGCACUCAGAAACGAGUACUUUGAAGCCGAGCCAGAGGACCUGG UGGCGGGGAUCAAGAUCAAGCACCUGUCCAAGGUGUUCAGGGUG GGAAAUAAGGACAGGGCGGCCGUCAGAGACCUGAACCUCAACCU GUACGAGGGACAGAUCACCGUCCUGCUGGGCCACAACGGUGCCG GGAAGACCACCACCCUCUCCAUGCUCACAGGUCUCUUUCCCCCCA CCAGUGGACGGGCAUACAUCAGCGGGUAUGAAAUUUCCCAGGAC AUGGUUCAGAUCCGGAAGAGCCUGGGCCUGUGCCCGCAGCACGA CAUCCUGUUUGACAACUUGACAGUCGCAGAGCACCUUUAUUUCU ACGCCCAGCUGAAGGGCCUGUCACGUCAGAAGUGCCCUGAAGAA GUCAAGCAGAUGCUGCACAUCAUCGGCCUGGAGGACAAGUGGAA CUCACGGAGCCGCUUCCUGAGCGGGGGCAUGAGGCGCAAGCUCU CCAUCGGCAUCGCCCUCAUCGCAGGCUCCAAGGUGCUGAUACUG GACGAGCCCACCUCGGGCAUGGACGCCAUCUCCAGGAGGGCCAU CUGGGAUCUUCUUCAGCGGCAGAAAAGUGACCGCACCAUCGUGC UGACCACCCACUUCAUGGACGAGGCUGACCUGCUGGGAGACCGC AUCGCCAUCAUGGCCAAGGGGGAGCUGCAGUGCUGCGGGUCCUC GCUGUUCCUCAAGCAGAAAUACGGUGCCGGCUAUCACAUGACGC UGGUGAAGGAGCCGCACUGCAACCCGGAAGACAUCUCCCAGCUG GUCCACCACCACGUGCCCAACGCCACGCUGGAGAGCAGCGCUGG GGCCGAGCUGUCUUUCAUCCUUCCCAGAGAGAGCACGCACAGGU UUGAAGGUCUCUUUGCUAAACUGGAGAAGAAGCAGAAAGAGCU GGGCAUUGCCAGCUUUGGGGCAUCCAUCACCACCAUGGAGGAAG UCUUCCUUCGGGUCGGGAAGCUGGUGGACAGCAGUAUGGACAUC CAGGCCAUCCAGCUCCCUGCCCUGCAGUACCAGCACGAGAGGCG CGCCAGCGACUGGGCUGUGGACAGCAACCUCUGUGGGGCCAUGG ACCCCUCCGACGGCAUUGGAGCCCUCAUCGAGGAGGAGCGCACC GCUGUCAAGCUCAACACUGGGCUCGCCCUGCACUGCCAGCAAUU CUGGGCCAUGUUCCUGAAGAAGGCCGCAUACAGCUGGCGCGAGU GGAAAAUGGUGGCGGCACAGGUCCUGGUGCCUCUGACCUGCGUC ACCCUGGCCCUCCUGGCCAUCAACUACUCCUCGGAGCUCUUCGA CGACCCCAUGCUGAGGCUGACCUUGGGCGAGUACGGCAGAACCG UCGUGCCCUUCUCAGUUCCCGGGACCUCCCAGCUGGGUCAGCAG CUGUCAGAGCAUCUGAAAGACGCACUGCAGGCUGAGGGACAGGA GCCCCGCGAGGUGCUCGGUGACCUGGAGGAGUUCUUGAUCUUCA GGGCUUCUGUGGAGGGGGGCGGCUUUAAUGAGCGGUGCCUUGU GGCAGCGUCCUUCAGAGAUGUGGGAGAGCGCACGGUCGUCAACG CCUUGUUCAACAACCAGGCGUACCACUCUCCAGCCACUGCCCUG GCCGUCGUGGACAACCUUCUGUUCAAGCUGCUGUGCGGGCCUCA CGCCUCCAUUGUGGUCUCCAACUUCCCCCAGCCCCGGAGCGCCCU GCAGGCUGCCAAGGACCAGUUUAACGAGGGCCGGAAGGGAUUCG ACAUUGCCCUCAACCUGCUCUUCGCCAUGGCAUUCUUGGCCAGC ACGUUCUCCAUCCUGGCGGUCAGCGAGAGGGCCGUGCAGGCCAA GCAUGUGCAGUUUGUGAGUGGAGUCCACGUGGCCAGUUUCUGGC UCUCUGCUCUGCUGUGGGACCUCAUCUCCUUCCUCAUCCCCAGU CUGCUGCUGCUGGUGGUGUUUAAGGCCUUCGACGUGCGUGCCUU CACGCGGGACGGCCACAUGGCUGACACCCUGCUGCUGCUCCUGC UCUACGGCUGGGCCAUCAUCCCCCUCAUGUACCUGAUGAACUUC UUCUUCUUGGGGGCGGCCACUGCCUACACGAGGCUGACCAUCUU CAACAUCCUGUCAGGCAUCGCCACCUUCCUGAUGGUCACCAUCA UGCGCAUCCCAGCUGUAAAACUGGAAGAACUUUCCAAAACCCUG GAUCACGUGUUCCUGGUGCUGCCCAACCACUGUCUGGGGAUGGC AGUCAGCAGUUUCUACGAGAACUACGAGACGCGGAGGUACUGCA CCUCCUCCGAGGUCGCCGCCCACUACUGCAAGAAAUAUAACAUC CAGUACCAGGAGAACUUCUAUGCCUGGAGCGCCCCGGGGGUCGG CCGGUUUGUGGCCUCCAUGGCCGCCUCAGGGUGCGCCUACCUCA UCCUGCUCUUCCUCAUCGAGACCAACCUGCUUCAGAGACUCAGG GGCAUCCUCUGCGCCCUCCGGAGGAGGCGGACACUGACAGAAUU AUACACCCGGAUGCCUGUGCUUCCUGAGGACCAAGAUGUAGCGG ACGAGAGGACCCGCAUCCUGGCCCCCAGCCCGGACUCCCUGCUCC ACACACCUCUGAUUAUCAAGGAGCUCUCCAAGGUGUACGAGCAG CGGGUGCCCCUCCUGGCCGUGGACAGGCUCUCCCUCGCGGUGCA GAAAGGGGAGUGCUUCGGCCUGCUGGGCUUCAAUGGAGCCGGGA AGACCACGACUUUCAAAAUGCUGACCGGGGAGGAGAGCCUCACU UCUGGGGAUGCCUUUGUCGGGGGUCACAGAAUCAGCUCUGAUGU CGGAAAGGUGCGGCAGCGGAUCGGCUACUGCCCGCAGUUUGAUG CCUUGCUGGACCACAUGACAGGCCGGGAGAUGCUGGUCAUGUAC GCUCGGCUCCGGGGCAUCCCUGAGCGCCACAUCGGGGCCUGCGU GGAGAACACUCUGCGGGGCCUGCUGCUGGAGCCACAUGCCAACA AGCUGGUCAGGACGUACAGUGGUGGUAACAAGCGGAAGCUGAGC ACCGGCAUCGCCCUGAUCGGAGAGCCUGCUGUCAUCUUCCUGGA CGAGCCGUCCACUGGCAUGGACCCCGUGGCCCGGCGCCUGCUUU GGGACACCGUGGCACGAGCCCGAGAGUCUGGCAAGGCCAUCAUC AUCACCUCCCACAGCAUGGAGGAGUGUGAGGCCCUGUGCACCCG GCUGGCCAUCAUGGUGCAGGGGCAGUUCAAGUGCCUGGGCAGCC CCCAGCACCUCAAGAGCAAGUUCGGCAGCGGCUACUCCCUGCGG GCCAAGGUGCAGAGUGAAGGGCAACAGGAGGCGCUGGAGGAGU UCAAGGCCUUCGUGGACCUGACCUUUCCAGGCAGCGUCCUGGAA GAUGAGCACCAAGGCAUGGUCCAUUACCACCUGCCGGGCCGUGA CCUCAGCUGGGCGAAGGUUUUCGGUAUUCUGGAGAAAGCCAAGG AAAAGUACGGCGUGGACGACUACUCCGUGAGCCAGAUCUCGCUG GAACAGGUCUUCCUGAGCUUCGCCCACCUGCAGCCGCCCACCGC AGAGGAGGGGCGAACGCGUACGCGACCGCUCGAGCAGAAACUCA UCUCAGAAGAGGAUCUGGCAGCAAAUGAUAUCCUGGAUUACAAG GAUGACGACGAUAAGGUUUGACCUCGCCCCGGACCUGCCCUCCC GCCAGGUGCACCCACCUGCAAUAAAUGCAGCGAAGCCGGGAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUU CGCGCCUAGCAGUGUCCCAGCCGGGUUCGUGUCGCC GCCACCAUGGCUGUGCUCAGGCAGCUGGCGCUCCUCCUCUGGAA GAACUACACCCUGCAGAAGCGGAAGGUCCUGGUGACGGUCCUGG AACUCUUCCUGCCAUUGCUGUUUUCUGGGAUCCUCAUCUGGCUC CGCUUGAAGAUUCAGUCGGAAAAUGUGCCCAACGCCACCAUCUA CCCGGGCCAGUCCAUCCAGGAGCUGCCUCUGUUCUUCACCUUCC CUCCGCCAGGAGACACCUGGGAGCUUGCCUACAUCCCUUCUCAC AGUGACGCUGCCAAGACCGUCACUGAGACAGUGCGCAGGGCACU UGUGAUCAACAUGCGAGUGCGCGGCUUUCCCUCCGAGAAGGACU UUGAGGACUACAUUAGGUACGACAACUGCUCGUCCAGCGUGCUG GCCGCCGUGGUCUUCGAGCACCCCUUCAACCACAGCAAGGAGCC CCUGCCGCUGGCGGUGAAAUAUCACCUACGGUUCAGUUACACAC GGAGAAAUUACAUGUGGACCCAAACAGGCUCCUUUUUCCUGAAA GAGACAGAAGGCUGGCACACUACUUCCCUUUUCCCGCUUUUCCC AAACCCAGGACCAAGGGAACCUACAUCCCCUGAUGGCGGAGAAC CUGGGUACAUCCGGGAAGGCUUCCUGGCCGUGCAGCAUGCUGUG GACCGGGCCAUCAUGGAGUACCAUGCCGAUGCCGCCACACGCCA GCUGUUCCAGAGACUGACGGUGACCAUCAAGAGGUUCCCGUACC CGCCGUUCAUCGCAGACCCCUUCCUCGUGGCCAUCCAGUACCAG CUGCCCCUGCUGCUGCUGCUCAGCUUCACCUACACCGCGCUCACC AUUGCCCGUGCUGUCGUGCAGGAGAAGGAAAGGAGGCUGAAGG AGUACAUGCGCAUGAUGGGGCUCAGCAGCUGGCUGCACUGGAGU GCCUGGUUCCUCUUGUUCUUCCUCUUCCUCCUCAUCGCCGCCUCC UUCAUGACCCUGCUCUUCUGUGUCAAGGUGAAGCCAAAUGUAGC CGUGCUGUCCCGCAGCGACCCCUCCCUGGUGCUCGCCUUCCUGCU GUGCUUCGCCAUCUCUACCAUCUCCUUCAGCUUCAUGGUCAGCA CCUUCUUCAGCAAAGCCAACAUGGCAGCAGCCUUCGGAGGCUUC CUCUACUUCUUCACCUACAUCCCCUACUUCUUCGUGGCCCCUCG GUACAACUGGAUGACUCUGAGCCAGAAGCUCUGCUCCUGCCUCC UGUCUAAUGUCGCCAUGGCAAUGGGAGCCCAGCUCAUUGGGAAA UUUGAGGCGAAAGGCAUGGGCAUCCAGUGGCGAGACCUCCUGAG UCCCGUCAACGUGGACGACGACUUCUGCUUCGGGCAGGUGCUGG GGAUGCUGCUGCUGGACUCUGUGCUCUAUGGCCUGGUGACCUGG UACAUGGAGGCCGUCUUCCCAGGGCAGUUCGGCGUGCCUCAGCC CUGGUACUUCUUCAUCAUGCCCUCCUAUUGGUGUGGGAAGCCAA GGGCGGUUGCAGGGAAGGAGGAAGAAGACAGUGACCCCGAGAA AGCACUCAGAAACGAGUACUUUGAAGCCGAGCCAGAGGACCUGG UGGCGGGGAUCAAGAUCAAGCACCUGUCCAAGGUGUUCAGGGUG GGAAAUAAGGACAGGGCGGCCGUCAGAGACCUGAACCUCAACCU GUACGAGGGACAGAUCACCGUCCUGCUGGGCCACAACGGUGCCG GGAAGACCACCACCCUCUCCAUGCUCACAGGUCUCUUUCCCCCCA CCAGUGGACGGGCAUACAUCAGCGGGUAUGAAAUUUCCCAGGAC AUGGUUCAGAUCCGGAAGAGCCUGGGCCUGUGCCCGCAGCACGA CAUCCUGUUUGACAACUUGACAGUCGCAGAGCACCUUUAUUUCU ACGCCCAGCUGAAGGGCCUGUCACGUCAGAAGUGCCCUGAAGAA GUCAAGCAGAUGCUGCACAUCAUCGGCCUGGAGGACAAGUGGAA CUCACGGAGCCGCUUCCUGAGCGGGGGCAUGAGGCGCAAGCUCU CCAUCGGCAUCGCCCUCAUCGCAGGCUCCAAGGUGCUGAUACUG GACGAGCCCACCUCGGGCAUGGACGCCAUCUCCAGGAGGGCCAU CUGGGAUCUUCUUCAGCGGCAGAAAAGUGACCGCACCAUCGUGC UGACCACCCACUUCAUGGACGAGGCUGACCUGCUGGGAGACCGC AUCGCCAUCAUGGCCAAGGGGGAGCUGCAGUGCUGCGGGUCCUC GCUGUUCCUCAAGCAGAAAUACGGUGCCGGCUAUCACAUGACGC UGGUGAAGGAGCCGCACUGCAACCCGGAAGACAUCUCCCAGCUG GUCCACCACCACGUGCCCAACGCCACGCUGGAGAGCAGCGCUGG GGCCGAGCUGUCUUUCAUCCUUCCCAGAGAGAGCACGCACAGGU UUGAAGGUCUCUUUGCUAAACUGGAGAAGAAGCAGAAAGAGCU GGGCAUUGCCAGCUUUGGGGCAUCCAUCACCACCAUGGAGGAAG UCUUCCUUCGGGUCGGGAAGCUGGUGGACAGCAGUAUGGACAUC CAGGCCAUCCAGCUCCCUGCCCUGCAGUACCAGCACGAGAGGCG CGCCAGCGACUGGGCUGUGGACAGCAACCUCUGUGGGGCCAUGG ACCCCUCCGACGGCAUUGGAGCCCUCAUCGAGGAGGAGCGCACC GCUGUCAAGCUCAACACUGGGCUCGCCCUGCACUGCCAGCAAUU CUGGGCCAUGUUCCUGAAGAAGGCCGCAUACAGCUGGCGCGAGU GGAAAAUGGUGGCGGCACAGGUCCUGGUGCCUCUGACCUGCGUC ACCCUGGCCCUCCUGGCCAUCAACUACUCCUCGGAGCUCUUCGA CGACCCCAUGCUGAGGCUGACCUUGGGCGAGUACGGCAGAACCG UCGUGCCCUUCUCAGUUCCCGGGACCUCCCAGCUGGGUCAGCAG CUGUCAGAGCAUCUGAAAGACGCACUGCAGGCUGAGGGACAGGA GCCCCGCGAGGUGCUCGGUGACCUGGAGGAGUUCUUGAUCUUCA GGGCUUCUGUGGAGGGGGGCGGCUUUAAUGAGCGGUGCCUUGU GGCAGCGUCCUUCAGAGAUGUGGGAGAGCGCACGGUCGUCAACG CCUUGUUCAACAACCAGGCGUACCACUCUCCAGCCACUGCCCUG GCCGUCGUGGACAACCUUCUGUUCAAGCUGCUGUGCGGGCCUCA CGCCUCCAUUGUGGUCUCCAACUUCCCCCAGCCCCGGAGCGCCCU GCAGGCUGCCAAGGACCAGUUUAACGAGGGCCGGAAGGGAUUCG ACAUUGCCCUCAACCUGCUCUUCGCCAUGGCAUUCUUGGCCAGC ACGUUCUCCAUCCUGGCGGUCAGCGAGAGGGCCGUGCAGGCCAA GCAUGUGCAGUUUGUGAGUGGAGUCCACGUGGCCAGUUUCUGGC UCUCUGCUCUGCUGUGGGACCUCAUCUCCUUCCUCAUCCCCAGU CUGCUGCUGCUGGUGGUGUUUAAGGCCUUCGACGUGCGUGCCUU CACGCGGGACGGCCACAUGGCUGACACCCUGCUGCUGCUCCUGC UCUACGGCUGGGCCAUCAUCCCCCUCAUGUACCUGAUGAACUUC UUCUUCUUGGGGGCGGCCACUGCCUACACGAGGCUGACCAUCUU CAACAUCCUGUCAGGCAUCGCCACCUUCCUGAUGGUCACCAUCA UGCGCAUCCCAGCUGUAAAACUGGAAGAACUUUCCAAAACCCUG GAUCACGUGUUCCUGGUGCUGCCCAACCACUGUCUGGGGAUGGC AGUCAGCAGUUUCUACGAGAACUACGAGACGCGGAGGUACUGCA CCUCCUCCGAGGUCGCCGCCCACUACUGCAAGAAAUAUAACAUC CAGUACCAGGAGAACUUCUAUGCCUGGAGCGCCCCGGGGGUCGG CCGGUUUGUGGCCUCCAUGGCCGCCUCAGGGUGCGCCUACCUCA UCCUGCUCUUCCUCAUCGAGACCAACCUGCUUCAGAGACUCAGG GGCAUCCUCUGCGCCCUCCGGAGGAGGCGGACACUGACAGAAUU AUACACCCGGAUGCCUGUGCUUCCUGAGGACCAAGAUGUAGCGG ACGAGAGGACCCGCAUCCUGGCCCCCAGCCCGGACUCCCUGCUCC ACACACCUCUGAUUAUCAAGGAGCUCUCCAAGGUGUACGAGCAG CGGGUGCCCCUCCUGGCCGUGGACAGGCUCUCCCUCGCGGUGCA GAAAGGGGAGUGCUUCGGCCUGCUGGGCUUCAAUGGAGCCGGGA AGACCACGACUUUCAAAAUGCUGACCGGGGAGGAGAGCCUCACU UCUGGGGAUGCCUUUGUCGGGGGUCACAGAAUCAGCUCUGAUGU CGGAAAGGUGCGGCAGCGGAUCGGCUACUGCCCGCAGUUUGAUG CCUUGCUGGACCACAUGACAGGCCGGGAGAUGCUGGUCAUGUAC GCUCGGCUCCGGGGCAUCCCUGAGCGCCACAUCGGGGCCUGCGU GGAGAACACUCUGCGGGGCCUGCUGCUGGAGCCACAUGCCAACA AGCUGGUCAGGACGUACAGUGGUGGUAACAAGCGGAAGCUGAGC ACCGGCAUCGCCCUGAUCGGAGAGCCUGCUGUCAUCUUCCUGGA CGAGCCGUCCACUGGCAUGGACCCCGUGGCCCGGCGCCUGCUUU GGGACACCGUGGCACGAGCCCGAGAGUCUGGCAAGGCCAUCAUC AUCACCUCCCACAGCAUGGAGGAGUGUGAGGCCCUGUGCACCCG GCUGGCCAUCAUGGUGCAGGGGCAGUUCAAGUGCCUGGGCAGCC CCCAGCACCUCAAGAGCAAGUUCGGCAGCGGCUACUCCCUGCGG GCCAAGGUGCAGAGUGAAGGGCAACAGGAGGCGCUGGAGGAGU UCAAGGCCUUCGUGGACCUGACCUUUCCAGGCAGCGUCCUGGAA GAUGAGCACCAAGGCAUGGUCCAUUACCACCUGCCGGGCCGUGA CCUCAGCUGGGCGAAGGUUUUCGGUAUUCUGGAGAAAGCCAAGG AAAAGUACGGCGUGGACGACUACUCCGUGAGCCAGAUCUCGCUG GAACAGGUCUUCCUGAGCUUCGCCCACCUGCAGCCGCCCACCGC AGAGGAGGGGCGAACGCGUACGCGACCGCUCGAGCAGAAACUCA UCUCAGAAGAGGAUCUGGCAGCAAAUGAUAUCCUGGAUUACAAG GAUGACGACGAUAAGGUUUGACCUCGCCCCGGACCUGCCCUCCC GCCAGGUGCACCCACCUGCAAUAAAUGCAGCGAAGCCGGGAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUU
SEQ ID NO: 12
[00242] Sumário: uma sequência de DNA de ABCA3 otimizada no códon com uma 5’ CYBA UTR e uma 3’ CYBA UTR (SEQ ID NO: 12) AGACCGCGCCTAGCAGTGTCCCAGCCGGGTTCGTGTC GCCGCCACCATGGCCGTGCTGAGACAGCTGGCTCTGCTGCTGTGG AAGAACTACACCCTGCAGAAACGGAAGGTGCTCGTGACCGTGCTG GAACTGTTCCTGCCCCTGCTGTTCAGCGGCATCCTGATCTGGCTGC GGCTGAAGATCCAGAGCGAGAACGTGCCCAACGCCACCATCTACC CCGGCCAGAGCATCCAGGAACTGCCCCTGTTCTTCACCTTCCCCCC ACCCGGCGATACCTGGGAGCTGGCCTATATCCCTAGCCACAGCGA CGCCGCCAAGACCGTGACAGAGACAGTGCGGAGAGCCCTCGTGAT CAACATGAGAGTGCGGGGCTTCCCCAGCGAGAAGGACTTCGAGGA CTACATCAGATACGACAACTGCAGCAGCAGCGTGCTGGCCGCCGT GGTGTTTGAGCACCCCTTCAACCACAGCAAAGAGCCCCTGCCTCTG GCCGTGAAGTACCACCTGAGATTCAGCTACACCCGGCGGAACTAC ATGTGGACCCAGACCGGCTCATTCTTCCTGAAAGAGACAGAGGGC TGGCACACCACCAGCCTGTTCCCTCTGTTCCCCAACCCTGGCCCCA GAGAGCCTACATCTCCTGACGGCGGCGAGCCCGGCTATATCAGAG AAGGATTCCTGGCCGTGCAGCACGCCGTGGACAGAGCCATCATGG AATACCACGCCGATGCCGCCACCCGGCAGCTGTTTCAGAGACTGA CCGTGACCATCAAGCGGTTCCCTTACCCCCCCTTTATCGCCGACCC TTTCCTGGTGGCCATCCAGTACCAGCTGCCACTCCTCCTGCTGCTG AGCTTTACCTACACCGCCCTGACAATCGCCAGAGCCGTGGTGCAG GAAAAAGAGCGGCGGCTGAAAGAGTACATGCGGATGATGGGCCT GTCCAGCTGGCTGCATTGGAGCGCCTGGTTTCTGCTGTTCTTCCTGT TCCTGCTGATCGCCGCCAGCTTCATGACACTGCTGTTTTGCGTGAA AGTGAAGCCCAACGTGGCAGTGCTGAGCCGCAGCGATCCTAGCCT GGTGCTGGCCTTCCTGCTGTGCTTCGCCATCAGCACCATCAGCTTC AGCTTTATGGTGTCCACCTTCTTCAGCAAGGCCAACATGGCCGCTG CCTTCGGCGGCTTCCTGTACTTCTTTACCTATATTCCCTACTTCTTC GTGGCCCCTCGGTACAACTGGATGACCCTGAGCCAGAAGCTGTGC AGCTGCCTGCTGAGCAACGTGGCCATGGCTATGGGAGCCCAGCTG ATCGGCAAGTTCGAGGCCAAGGGCATGGGCATCCAGTGGCGGGAT CTGCTGAGCCCCGTGAACGTGGACGACGACTTCTGCTTCGGCCAG GTGCTGGGCATGCTGCTGCTGGACTCCGTGCTGTATGGCCTCGTGA CCTGGTATATGGAAGCCGTGTTCCCTGGCCAGTTCGGCGTGCCCCA GCCCTGGTACTTCTTCATCATGCCTAGCTATTGGTGCGGCAAGCCC AGGGCCGTGGCCGGCAAAGAGGAAGAGGATAGCGACCCCGAGAA GGCCCTGCGGAACGAGTACTTTGAGGCCGAGCCCGAGGATCTGGT GGCCGGAATCAAGATCAAGCACCTGAGCAAGGTGTTCCGCGTGGG CAACAAGGATAGAGCCGCTGTGCGGGACCTGAACCTGAATCTGTA CGAGGGCCAGATCACCGTGCTGCTGGGCCATAATGGCGCCGGAAA GACCACCACCCTGAGCATGCTGACCGGCCTGTTTCCCCCAACAAGC GGCAGGGCCTACATCAGCGGCTACGAGATCAGCCAGGACATGGTG CAGATCCGGAAGTCCCTGGGCCTGTGCCCCCAGCACGACATCCTGT TCGACAACCTGACCGTGGCCGAGCACCTGTACTTTTACGCTCAGCT GAAGGGCCTGAGCCGGCAGAAATGCCCCGAGGAAGTGAAGCAGA TGCTGCACATCATCGGCCTGGAAGATAAGTGGAACAGCCGGTCCC GGTTCCTGTCCGGCGGAATGAGAAGAAAGCTGAGCATCGGAATCG CCCTGATTGCCGGCAGCAAGGTGCTGATCCTGGACGAGCCTACCA GCGGCATGGACGCCATCTCCAGAAGGGCCATCTGGGACCTGCTGC AGCGGCAGAAGTCCGACAGAACCATCGTGCTGACCACCCACTTCA TGGACGAGGCCGACCTGCTGGGCGACCGGATCGCTATTATGGCCA AGGGGGAGCTGCAGTGCTGCGGCAGCAGCCTGTTTCTGAAGCAGA AATACGGCGCTGGCTACCACATGACCCTCGTGAAAGAGCCTCACT GCAACCCCGAGGACATCTCCCAGCTGGTGCACCACCACGTGCCAA ATGCCACCCTGGAAAGCTCTGCCGGCGCTGAGCTGAGCTTCATCCT GCCCAGAGAGAGCACCCACAGATTCGAGGGCCTGTTCGCCAAGCT GGAAAAGAAACAGAAAGAGCTGGGCATTGCCAGCTTCGGCGCCA GCATCACAACAATGGAAGAGGTGTTCCTGAGAGTGGGCAAGCTGG TGGACAGCTCCATGGACATCCAGGCTATCCAGCTGCCCGCCCTGCA GTATCAGCACGAGAGAAGGGCTAGCGACTGGGCCGTGGACTCCAA TCTGTGCGGCGCCATGGATCCCTCCGATGGAATCGGCGCCCTGATC GAAGAGGAACGGACCGCCGTGAAGCTGAACACAGGACTGGCCCT GCACTGCCAGCAGTTCTGGGCCATGTTCCTGAAGAAAGCCGCCTA CAGCTGGCGCGAGTGGAAAATGGTGGCCGCACAGGTGCTGGTGCC CCTGACCTGTGTGACACTGGCACTGCTGGCCATCAACTACAGCAGC GAGCTGTTCGACGACCCCATGCTGAGACTGACACTGGGCGAGTAC GGCAGGACCGTGGTGCCTTTTTCTGTGCCCGGCACCTCACAGCTGG GCCAGCAGCTGTCTGAACACCTGAAGGATGCCCTGCAGGCCGAAG GCCAGGAACCCAGAGAAGTGCTGGGCGATCTGGAAGAGTTCCTGA TCTTCCGGGCCAGCGTGGAAGGCGGCGGATTCAACGAGAGATGCC TGGTGGCTGCCTCCTTCCGGGATGTGGGCGAGAGAACAGTCGTGA ACGCCCTGTTCAACAATCAGGCCTACCACAGCCCCGCCACCGCTCT GGCTGTGGTGGACAACCTGCTGTTTAAGCTGCTGTGTGGCCCCCAC GCCTCCATCGTGGTGTCCAATTTCCCCCAGCCCAGAAGCGCTCTGC AGGCTGCCAAGGACCAGTTCAACGAGGGCCGGAAGGGCTTCGACA TTGCTCTGAATCTGCTGTTTGCCATGGCCTTTCTGGCCTCCACCTTC AGCATCCTGGCTGTGTCCGAGAGAGCCGTGCAGGCCAAGCACGTG CAGTTTGTGTCTGGCGTGCACGTGGCCAGCTTTTGGCTGTCTGCCC TGCTGTGGGACCTGATCAGCTTCCTGATCCCCAGCCTCCTGCTGCT GGTGGTGTTCAAGGCCTTCGACGTGCGGGCCTTCACCAGGGATGG ACACATGGCCGACACCTTGTTGTTGCTGCTGCTGTACGGCTGGGCC ATCATCCCCCTGATGTACCTGATGAACTTCTTCTTCCTGGGCGCTG CCACCGCCTACACCAGACTGACCATCTTCAACATCCTGAGCGGGAT CGCCACCTTCCTGATGGTCACAATCATGCGGATCCCTGCCGTGAAA CTGGAAGAACTGAGCAAGACCCTGGACCATGTGTTTCTGGTGCTG CCCAACCACTGCCTGGGCATGGCCGTGTCTAGCTTCTACGAGAACT ACGAGACACGGCGGTACTGCACCTCCAGCGAAGTGGCCGCCCACT ACTGCAAGAAGTATAACATCCAGTATCAGGAAAACTTCTACGCTT GGAGCGCACCCGGCGTGGGCAGATTTGTGGCCTCTATGGCCGCCA GCGGCTGCGCCTATCTGATCCTGCTGTTCCTGATCGAGACTAACCT GCTGCAGAGACTGAGAGGCATCCTGTGCGCCCTGCGGCGGAGAAG AACACTGACCGAGCTGTACACCCGGATGCCCGTGCTGCCTGAGGA CCAGGATGTGGCCGACGAGCGGACAAGAATCCTGGCCCCTAGCCC CGATAGCCTGCTGCACACCCCCCTGATCATCAAAGAACTGTCCAA GGTGTACGAGCAGCGGGTGCCACTGCTGGCTGTGGACAGACTGAG TCTGGCTGTGCAGAAAGGCGAGTGCTTCGGACTGCTGGGCTTCAA CGGCGCAGGCAAGACCACAACCTTCAAGATGCTGACAGGCGAGGA AAGCCTGACCTCCGGCGACGCCTTTGTGGGCGGACACAGGATCTC TTCCGATGTGGGCAAAGTGCGGCAGCGGATCGGCTACTGCCCTCA GTTCGACGCCCTGCTGGATCACATGACCGGCAGGGAAATGCTCGT GATGTACGCCCGGCTGAGGGGCATCCCCGAGAGACACATTGGCGC CTGCGTGGAAAACACCCTGCGGGGCCTGCTGCTGGAACCCCACGC TAACAAACTCGTGCGGACCTACAGCGGCGGCAACAAGAGAAAGCT GTCTACCGGCATTGCACTGATCGGCGAGCCAGCCGTGATCTTTCTG 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[00243] Sumário: uma sequência de mRNA de ABCA3 otimizada no códon com uma 5’ CYBA UTR e uma 3’ CYBA UTR (SEQ ID NO: 13).
[00244] AGACCGCGCCUAGCAGUGUCCCAGCCGGGUUCGUG UCGCCGCCACCAUGG CCGUGCUGAGACAGCUGGCUCUGCUGCUG UGGAAGAACUACACCCUGCAGAAACGGAAGGUGCUCGUGACCGU GCUGGAACUGUUCCUGCCCCUGCUGUUCAGCGGCAUCCUGAUCU GGCUGCGGCUGAAGAUCCAGAGCGAGAACGUGCCCAACGCCACC AUCUACCCCGGCCAGAGCAUCCAGGAACUGCCCCUGUUCUUCAC CUUCCCCCCACCCGGCGAUACCUGGGAGCUGGCCUAUAUCCCUA GCCACAGCGACGCCGCCAAGACCGUGACAGAGACAGUGCGGAGA GCCCUCGUGAUCAACAUGAGAGUGCGGGGCUUCCCCAGCGAGAA GGACUUCGAGGACUACAUCAGAUACGACAACUGCAGCAGCAGCG UGCUGGCCGCCGUGGUGUUUGAGCACCCCUUCAACCACAGCAAA GAGCCCCUGCCUCUGGCCGUGAAGUACCACCUGAGAUUCAGCUA CACCCGGCGGAACUACAUGUGGACCCAGACCGGCUCAUUCUUCC UGAAAGAGACAGAGGGCUGGCACACCACCAGCCUGUUCCCUCUG UUCCCCAACCCUGGCCCCAGAGAGCCUACAUCUCCUGACGGCGG CGAGCCCGGCUAUAUCAGAGAAGGAUUCCUGGCCGUGCAGCACG CCGUGGACAGAGCCAUCAUGGAAUACCACGCCGAUGCCGCCACC CGGCAGCUGUUUCAGAGACUGACCGUGACCAUCAAGCGGUUCCC UUACCCCCCCUUUAUCGCCGACCCUUUCCUGGUGGCCAUCCAGU ACCAGCUGCCACUCCUCCUGCUGCUGAGCUUUACCUACACCGCCC UGACAAUCGCCAGAGCCGUGGUGCAGGAAAAAGAGCGGCGGCUG AAAGAGUACAUGCGGAUGAUGGGCCUGUCCAGCUGGCUGCAUUG GAGCGCCUGGUUUCUGCUGUUCUUCCUGUUCCUGCUGAUCGCCG CCAGCUUCAUGACACUGCUGUUUUGCGUGAAAGUGAAGCCCAAC GUGGCAGUGCUGAGCCGCAGCGAUCCUAGCCUGGUGCUGGCCUU CCUGCUGUGCUUCGCCAUCAGCACCAUCAGCUUCAGCUUUAUGG UGUCCACCUUCUUCAGCAAGGCCAACAUGGCCGCUGCCUUCGGC GGCUUCCUGUACUUCUUUACCUAUAUUCCCUACUUCUUCGUGGC CCCUCGGUACAACUGGAUGACCCUGAGCCAGAAGCUGUGCAGCU GCCUGCUGAGCAACGUGGCCAUGGCUAUGGGAGCCCAGCUGAUC GGCAAGUUCGAGGCCAAGGGCAUGGGCAUCCAGUGGCGGGAUCU GCUGAGCCCCGUGAACGUGGACGACGACUUCUGCUUCGGCCAGG UGCUGGGCAUGCUGCUGCUGGACUCCGUGCUGUAUGGCCUCGUG ACCUGGUAUAUGGAAGCCGUGUUCCCUGGCCAGUUCGGCGUGCC CCAGCCCUGGUACUUCUUCAUCAUGCCUAGCUAUUGGUGCGGCA AGCCCAGGGCCGUGGCCGGCAAAGAGGAAGAGGAUAGCGACCCC GAGAAGGCCCUGCGGAACGAGUACUUUGAGGCCGAGCCCGAGGA UCUGGUGGCCGGAAUCAAGAUCAAGCACCUGAGCAAGGUGUUCC GCGUGGGCAACAAGGAUAGAGCCGCUGUGCGGGACCUGAACCUG AAUCUGUACGAGGGCCAGAUCACCGUGCUGCUGGGCCAUAAUGG CGCCGGAAAGACCACCACCCUGAGCAUGCUGACCGGCCUGUUUC CCCCAACAAGCGGCAGGGCCUACAUCAGCGGCUACGAGAUCAGC CAGGACAUGGUGCAGAUCCGGAAGUCCCUGGGCCUGUGCCCCCA GCACGACAUCCUGUUCGACAACCUGACCGUGGCCGAGCACCUGU ACUUUUACGCUCAGCUGAAGGGCCUGAGCCGGCAGAAAUGCCCC GAGGAAGUGAAGCAGAUGCUGCACAUCAUCGGCCUGGAAGAUAA GUGGAACAGCCGGUCCCGGUUCCUGUCCGGCGGAAUGAGAAGAA AGCUGAGCAUCGGAAUCGCCCUGAUUGCCGGCAGCAAGGUGCUG AUCCUGGACGAGCCUACCAGCGGCAUGGACGCCAUCUCCAGAAG GGCCAUCUGGGACCUGCUGCAGCGGCAGAAGUCCGACAGAACCA UCGUGCUGACCACCCACUUCAUGGACGAGGCCGACCUGCUGGGC GACCGGAUCGCUAUUAUGGCCAAGGGGGAGCUGCAGUGCUGCGG CAGCAGCCUGUUUCUGAAGCAGAAAUACGGCGCUGGCUACCACA UGACCCUCGUGAAAGAGCCUCACUGCAACCCCGAGGACAUCUCC CAGCUGGUGCACCACCACGUGCCAAAUGCCACCCUGGAAAGCUC UGCCGGCGCUGAGCUGAGCUUCAUCCUGCCCAGAGAGAGCACCC ACAGAUUCGAGGGCCUGUUCGCCAAGCUGGAAAAGAAACAGAAA GAGCUGGGCAUUGCCAGCUUCGGCGCCAGCAUCACAACAAUGGA AGAGGUGUUCCUGAGAGUGGGCAAGCUGGUGGACAGCUCCAUGG ACAUCCAGGCUAUCCAGCUGCCCGCCCUGCAGUAUCAGCACGAG AGAAGGGCUAGCGACUGGGCCGUGGACUCCAAUCUGUGCGGCGC CAUGGAUCCCUCCGAUGGAAUCGGCGCCCUGAUCGAAGAGGAAC GGACCGCCGUGAAGCUGAACACAGGACUGGCCCUGCACUGCCAG CAGUUCUGGGCCAUGUUCCUGAAGAAAGCCGCCUACAGCUGGCG CGAGUGGAAAAUGGUGGCCGCACAGGUGCUGGUGCCCCUGACCU GUGUGACACUGGCACUGCUGGCCAUCAACUACAGCAGCGAGCUG 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UGCACCUCCAGCGAAGUGGCCGCCCACUACUGCAAGAAGUAUAA CAUCCAGUAUCAGGAAAACUUCUACGCUUGGAGCGCACCCGGCG UGGGCAGAUUUGUGGCCUCUAUGGCCGCCAGCGGCUGCGCCUAU CUGAUCCUGCUGUUCCUGAUCGAGACUAACCUGCUGCAGAGACU GAGAGGCAUCCUGUGCGCCCUGCGGCGGAGAAGAACACUGACCG AGCUGUACACCCGGAUGCCCGUGCUGCCUGAGGACCAGGAUGUG GCCGACGAGCGGACAAGAAUCCUGGCCCCUAGCCCCGAUAGCCU GCUGCACACCCCCCUGAUCAUCAAAGAACUGUCCAAGGUGUACG AGCAGCGGGUGCCACUGCUGGCUGUGGACAGACUGAGUCUGGCU GUGCAGAAAGGCGAGUGCUUCGGACUGCUGGGCUUCAACGGCGC AGGCAAGACCACAACCUUCAAGAUGCUGACAGGCGAGGAAAGCC UGACCUCCGGCGACGCCUUUGUGGGCGGACACAGGAUCUCUUCC GAUGUGGGCAAAGUGCGGCAGCGGAUCGGCUACUGCCCUCAGUU CGACGCCCUGCUGGAUCACAUGACCGGCAGGGAAAUGCUCGUGA UGUACGCCCGGCUGAGGGGCAUCCCCGAGAGACACAUUGGCGCC UGCGUGGAAAACACCCUGCGGGGCCUGCUGCUGGAACCCCACGC UAACAAACUCGUGCGGACCUACAGCGGCGGCAACAAGAGAAAGC UGUCUACCGGCAUUGCACUGAUCGGCGAGCCAGCCGUGAUCUUU CUGGAUGAGCCCAGCACAGGCAUGGACCCCGUGGCUCGGAGACU GCUGUGGGAUACAGUGGCCAGAGCCAGAGAGUCCGGCAAGGCCA UCAUUAUCACCAGCCACAGCAUGGAAGAGUGCGAGGCCCUGUGU ACAAGACUGGCAAUUAUGGUGCAGGGACAGUUCAAGUGUCUGG 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CAGCAGCCUGUUUCUGAAGCAGAAAUACGGCGCUGGCUACCACA UGACCCUCGUGAAAGAGCCUCACUGCAACCCCGAGGACAUCUCC CAGCUGGUGCACCACCACGUGCCAAAUGCCACCCUGGAAAGCUC UGCCGGCGCUGAGCUGAGCUUCAUCCUGCCCAGAGAGAGCACCC ACAGAUUCGAGGGCCUGUUCGCCAAGCUGGAAAAGAAACAGAAA GAGCUGGGCAUUGCCAGCUUCGGCGCCAGCAUCACAACAAUGGA AGAGGUGUUCCUGAGAGUGGGCAAGCUGGUGGACAGCUCCAUGG ACAUCCAGGCUAUCCAGCUGCCCGCCCUGCAGUAUCAGCACGAG AGAAGGGCUAGCGACUGGGCCGUGGACUCCAAUCUGUGCGGCGC CAUGGAUCCCUCCGAUGGAAUCGGCGCCCUGAUCGAAGAGGAAC GGACCGCCGUGAAGCUGAACACAGGACUGGCCCUGCACUGCCAG CAGUUCUGGGCCAUGUUCCUGAAGAAAGCCGCCUACAGCUGGCG CGAGUGGAAAAUGGUGGCCGCACAGGUGCUGGUGCCCCUGACCU GUGUGACACUGGCACUGCUGGCCAUCAACUACAGCAGCGAGCUG UUCGACGACCCCAUGCUGAGACUGACACUGGGCGAGUACGGCAG GACCGUGGUGCCUUUUUCUGUGCCCGGCACCUCACAGCUGGGCC AGCAGCUGUCUGAACACCUGAAGGAUGCCCUGCAGGCCGAAGGC CAGGAACCCAGAGAAGUGCUGGGCGAUCUGGAAGAGUUCCUGAU CUUCCGGGCCAGCGUGGAAGGCGGCGGAUUCAACGAGAGAUGCC UGGUGGCUGCCUCCUUCCGGGAUGUGGGCGAGAGAACAGUCGUG AACGCCCUGUUCAACAAUCAGGCCUACCACAGCCCCGCCACCGCU CUGGCUGUGGUGGACAACCUGCUGUUUAAGCUGCUGUGUGGCCC 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SEQ ID NO: 14
[00245] Sumário: Contraparte do mRNA da SEQ ID NO: 1 CGCGCCUAGCAGUGUCCCAGCCGGGUUCGUGUCGCC CGCGCCUAGCAGUGUCCCAGCCGGGUUCGUGUCGCC
SEQ ID NO: 15
[00246] Sumário: Contraparte do mRNA da SEQ ID NO: 2 CCUCGCCCCGGACCUGCCCUCCCGCCAGGUGCACCC ACCUGCAAUAAAUGCAGCGAAGCCGGGA CCUCGCCCCGGACCUGCCCUCCCGCCAGGUGCACCC ACCUGCAAUAAAUGCAGCGAAGCCGGGA
SEQ ID NO: 16
[00247] Sumário: Contraparte do mRNA da SEQ ID NO: 5 UCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAAC UCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAAC
SEQ ID NO: 17
[00248] Sumário: Transcrito TTX-ABCA3-RNA-018 Preto - sequências flanqueadas itálico, sublinhado - sequência de Kozak Azul - ABCA3 otimizado no códon Vermelho - etiqueta c-myc Verde - etiqueta FLAG Vermelho salientado - códon de parada Laranja - cauda poli(A) gggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggcaatccggtactgttggtaaa gccaccatggccgtgctgagacagctggctctgctgctgtggaagaactacaccctgcagaaacggaaggtg ctcgtgaccgtgctggaactgttcctgcccctgctgttcagcggcatcctgatctggctgcggctgaagatccag agcgagaacgtgcccaacgccaccatctaccccggccagagcatccaggaactgcccctgttcttcaccttcc ccccacccggcgatacctgggagctggcctatatccctagccacagcgacgccgccaagaccgtgacagag acagtgcggagagccctcgtgatcaacatgagagtgcggggcttccccagcgagaaggacttcgaggacta catcagatacgacaactgcagcagcagcgtgctggccgccgtggtgtttgagcaccccttcaaccacagcaa agagcccctgcctctggccgtgaagtaccacctgagattcagctacacccggcggaactacatgtggaccca gaccggctcattcttcctgaaagagacagagggctggcacaccaccagcctgttccctctgttccccaaccctg gccccagagagcctacatctcctgacggcggcgagcccggctatatcagagaaggattcctggccgtgcagc 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SEQ ID NO: 18
[00249] Sumário: Transcrito TTX-ABCA3-RNA-019 Black - sequências flanqueadas Cinza - 5’-UTR alfa globina humana itálico, sublinhado - sequência de Kozak Azul - ABCA3 otimizado no códon Vermelho - etiqueta c-myc Verde - etiqueta FLAG Vermelho salientado - códon de parada Laranja - cauda poli(A) GGGAGACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAA CGCCACCATG GCCGTGCTGAGACAGCTGGCTCTGCTGCTGTGGAAG AACTACACCCTGCAGAAACGGAAGGTGCTCGTGACCGTGCTGGAA CTGTTCCTGCCCCTGCTGTTCAGCGGCATCCTGATCTGGCTGCGGC TGAAGATCCAGAGCGAGAACGTGCCCAACGCCACCATCTACCCCG GCCAGAGCATCCAGGAACTGCCCCTGTTCTTCACCTTCCCCCCACC CGGCGATACCTGGGAGCTGGCCTATATCCCTAGCCACAGCGACGC CGCCAAGACCGTGACAGAGACAGTGCGGAGAGCCCTCGTGATCAA CATGAGAGTGCGGGGCTTCCCCAGCGAGAAGGACTTCGAGGACTA CATCAGATACGACAACTGCAGCAGCAGCGTGCTGGCCGCCGTGGT GTTTGAGCACCCCTTCAACCACAGCAAAGAGCCCCTGCCTCTGGCC GTGAAGTACCACCTGAGATTCAGCTACACCCGGCGGAACTACATG TGGACCCAGACCGGCTCATTCTTCCTGAAAGAGACAGAGGGCTGG CACACCACCAGCCTGTTCCCTCTGTTCCCCAACCCTGGCCCCAGAG AGCCTACATCTCCTGACGGCGGCGAGCCCGGCTATATCAGAGAAG 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AATCAAGATCAAGCACCTGAGCAAGGTGTTCCGCGTGGGCAACAA GGATAGAGCCGCTGTGCGGGACCTGAACCTGAATCTGTACGAGGG CCAGATCACCGTGCTGCTGGGCCATAATGGCGCCGGAAAGACCAC CACCCTGAGCATGCTGACCGGCCTGTTTCCCCCAACAAGCGGCAG GGCCTACATCAGCGGCTACGAGATCAGCCAGGACATGGTGCAGAT CCGGAAGTCCCTGGGCCTGTGCCCCCAGCACGACATCCTGTTCGAC AACCTGACCGTGGCCGAGCACCTGTACTTTTACGCTCAGCTGAAGG GCCTGAGCCGGCAGAAATGCCCCGAGGAAGTGAAGCAGATGCTGC ACATCATCGGCCTGGAAGATAAGTGGAACAGCCGGTCCCGGTTCC TGTCCGGCGGAATGAGAAGAAAGCTGAGCATCGGAATCGCCCTGA TTGCCGGCAGCAAGGTGCTGATCCTGGACGAGCCTACCAGCGGCA TGGACGCCATCTCCAGAAGGGCCATCTGGGACCTGCTGCAGCGGC AGAAGTCCGACAGAACCATCGTGCTGACCACCCACTTCATGGACG AGGCCGACCTGCTGGGCGACCGGATCGCTATTATGGCCAAGGGGG AGCTGCAGTGCTGCGGCAGCAGCCTGTTTCTGAAGCAGAAATACG GCGCTGGCTACCACATGACCCTCGTGAAAGAGCCTCACTGCAACC CCGAGGACATCTCCCAGCTGGTGCACCACCACGTGCCAAATGCCA CCCTGGAAAGCTCTGCCGGCGCTGAGCTGAGCTTCATCCTGCCCAG AGAGAGCACCCACAGATTCGAGGGCCTGTTCGCCAAGCTGGAAAA GAAACAGAAAGAGCTGGGCATTGCCAGCTTCGGCGCCAGCATCAC AACAATGGAAGAGGTGTTCCTGAGAGTGGGCAAGCTGGTGGACAG CTCCATGGACATCCAGGCTATCCAGCTGCCCGCCCTGCAGTATCAG CACGAGAGAAGGGCTAGCGACTGGGCCGTGGACTCCAATCTGTGC GGCGCCATGGATCCCTCCGATGGAATCGGCGCCCTGATCGAAGAG GAACGGACCGCCGTGAAGCTGAACACAGGACTGGCCCTGCACTGC CAGCAGTTCTGGGCCATGTTCCTGAAGAAAGCCGCCTACAGCTGG CGCGAGTGGAAAATGGTGGCCGCACAGGTGCTGGTGCCCCTGACC TGTGTGACACTGGCACTGCTGGCCATCAACTACAGCAGCGAGCTG TTCGACGACCCCATGCTGAGACTGACACTGGGCGAGTACGGCAGG ACCGTGGTGCCTTTTTCTGTGCCCGGCACCTCACAGCTGGGCCAGC AGCTGTCTGAACACCTGAAGGATGCCCTGCAGGCCGAAGGCCAGG AACCCAGAGAAGTGCTGGGCGATCTGGAAGAGTTCCTGATCTTCC GGGCCAGCGTGGAAGGCGGCGGATTCAACGAGAGATGCCTGGTGG CTGCCTCCTTCCGGGATGTGGGCGAGAGAACAGTCGTGAACGCCC TGTTCAACAATCAGGCCTACCACAGCCCCGCCACCGCTCTGGCTGT GGTGGACAACCTGCTGTTTAAGCTGCTGTGTGGCCCCCACGCCTCC ATCGTGGTGTCCAATTTCCCCCAGCCCAGAAGCGCTCTGCAGGCTG CCAAGGACCAGTTCAACGAGGGCCGGAAGGGCTTCGACATTGCTC TGAATCTGCTGTTTGCCATGGCCTTTCTGGCCTCCACCTTCAGCATC CTGGCTGTGTCCGAGAGAGCCGTGCAGGCCAAGCACGTGCAGTTT GTGTCTGGCGTGCACGTGGCCAGCTTTTGGCTGTCTGCCCTGCTGT GGGACCTGATCAGCTTCCTGATCCCCAGCCTCCTGCTGCTGGTGGT GTTCAAGGCCTTCGACGTGCGGGCCTTCACCAGGGATGGACACAT GGCCGACACCTTGTTGTTGCTGCTGCTGTACGGCTGGGCCATCATC CCCCTGATGTACCTGATGAACTTCTTCTTCCTGGGCGCTGCCACCG CCTACACCAGACTGACCATCTTCAACATCCTGAGCGGGATCGCCAC CTTCCTGATGGTCACAATCATGCGGATCCCTGCCGTGAAACTGGAA GAACTGAGCAAGACCCTGGACCATGTGTTTCTGGTGCTGCCCAACC ACTGCCTGGGCATGGCCGTGTCTAGCTTCTACGAGAACTACGAGA CACGGCGGTACTGCACCTCCAGCGAAGTGGCCGCCCACTACTGCA AGAAGTATAACATCCAGTATCAGGAAAACTTCTACGCTTGGAGCG CACCCGGCGTGGGCAGATTTGTGGCCTCTATGGCCGCCAGCGGCT GCGCCTATCTGATCCTGCTGTTCCTGATCGAGACTAACCTGCTGCA GAGACTGAGAGGCATCCTGTGCGCCCTGCGGCGGAGAAGAACACT GACCGAGCTGTACACCCGGATGCCCGTGCTGCCTGAGGACCAGGA TGTGGCCGACGAGCGGACAAGAATCCTGGCCCCTAGCCCCGATAG CCTGCTGCACACCCCCCTGATCATCAAAGAACTGTCCAAGGTGTAC GAGCAGCGGGTGCCACTGCTGGCTGTGGACAGACTGAGTCTGGCT GTGCAGAAAGGCGAGTGCTTCGGACTGCTGGGCTTCAACGGCGCA GGCAAGACCACAACCTTCAAGATGCTGACAGGCGAGGAAAGCCTG ACCTCCGGCGACGCCTTTGTGGGCGGACACAGGATCTCTTCCGATG TGGGCAAAGTGCGGCAGCGGATCGGCTACTGCCCTCAGTTCGACG CCCTGCTGGATCACATGACCGGCAGGGAAATGCTCGTGATGTACG CCCGGCTGAGGGGCATCCCCGAGAGACACATTGGCGCCTGCGTGG AAAACACCCTGCGGGGCCTGCTGCTGGAACCCCACGCTAACAAAC TCGTGCGGACCTACAGCGGCGGCAACAAGAGAAAGCTGTCTACCG GCATTGCACTGATCGGCGAGCCAGCCGTGATCTTTCTGGATGAGCC CAGCACAGGCATGGACCCCGTGGCTCGGAGACTGCTGTGGGATAC AGTGGCCAGAGCCAGAGAGTCCGGCAAGGCCATCATTATCACCAG CCACAGCATGGAAGAGTGCGAGGCCCTGTGTACAAGACTGGCAAT TATGGTGCAGGGACAGTTCAAGTGTCTGGGCAGCCCTCAGCACCT GAAGTCCAAGTTCGGCTCCGGCTACAGCCTGCGGGCCAAGGTGCA GTCTGAAGGGCAGCAGGAAGCCCTGGAAGAATTCAAAGCCTTCGT GGACCTGACCTTCCCCGGCTCTGTGCTGGAAGATGAGCACCAGGG AATGGTGCACTACCATCTGCCTGGCAGGGACCTGTCCTGGGCCAA AGTGTTTGGCATCCTGGAAAAGGCCAAAGAGAAGTACGGCGTGGA CGATTACAGCGTGTCCCAGATCAGCCTGGAACAGGTGTTCCTGTCC TTTGCCCATCTGCAGCCCCCTACCGCCGAAGAGGGAAGAacgcgtacgc ggccgctcgagcagaaactcatctcagaagaggatctggcagcaaatgatatcctggattacaaggatgacga cgataaggtttaagaattctgcagAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAGC GGGAGACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAA CGCCACCATG GCCGTGCTGAGACAGCTGGCTCTGCTGCTGTGGAAG AACTACACCCTGCAGAAACGGAAGGTGCTCGTGACCGTGCTGGAA CTGTTCCTGCCCCTGCTGTTCAGCGGCATCCTGATCTGGCTGCGGC TGAAGATCCAGAGCGAGAACGTGCCCAACGCCACCATCTACCCCG GCCAGAGCATCCAGGAACTGCCCCTGTTCTTCACCTTCCCCCCACC CGGCGATACCTGGGAGCTGGCCTATATCCCTAGCCACAGCGACGC CGCCAAGACCGTGACAGAGACAGTGCGGAGAGCCCTCGTGATCAA CATGAGAGTGCGGGGCTTCCCCAGCGAGAAGGACTTCGAGGACTA CATCAGATACGACAACTGCAGCAGCAGCGTGCTGGCCGCCGTGGT GTTTGAGCACCCCTTCAACCACAGCAAAGAGCCCCTGCCTCTGGCC GTGAAGTACCACCTGAGATTCAGCTACACCCGGCGGAACTACATG TGGACCCAGACCGGCTCATTCTTCCTGAAAGAGACAGAGGGCTGG CACACCACCAGCCTGTTCCCTCTGTTCCCCAACCCTGGCCCCAGAG AGCCTACATCTCCTGACGGCGGCGAGCCCGGCTATATCAGAGAAG GATTCCTGGCCGTGCAGCACGCCGTGGACAGAGCCATCATGGAAT ACCACGCCGATGCCGCCACCCGGCAGCTGTTTCAGAGACTGACCG TGACCATCAAGCGGTTCCCTTACCCCCCCTTTATCGCCGACCCTTTC CTGGTGGCCATCCAGTACCAGCTGCCACTCCTCCTGCTGCTGAGCT TTACCTACACCGCCCTGACAATCGCCAGAGCCGTGGTGCAGGAAA AAGAGCGGCGGCTGAAAGAGTACATGCGGATGATGGGCCTGTCCA GCTGGCTGCATTGGAGCGCCTGGTTTCTGCTGTTCTTCCTGTTCCTG CTGATCGCCGCCAGCTTCATGACACTGCTGTTTTGCGTGAAAGTGA AGCCCAACGTGGCAGTGCTGAGCCGCAGCGATCCTAGCCTGGTGC TGGCCTTCCTGCTGTGCTTCGCCATCAGCACCATCAGCTTCAGCTTT ATGGTGTCCACCTTCTTCAGCAAGGCCAACATGGCCGCTGCCTTCG GCGGCTTCCTGTACTTCTTTACCTATATTCCCTACTTCTTCGTGGCC CCTCGGTACAACTGGATGACCCTGAGCCAGAAGCTGTGCAGCTGC CTGCTGAGCAACGTGGCCATGGCTATGGGAGCCCAGCTGATCGGC AAGTTCGAGGCCAAGGGCATGGGCATCCAGTGGCGGGATCTGCTG AGCCCCGTGAACGTGGACGACGACTTCTGCTTCGGCCAGGTGCTG GGCATGCTGCTGCTGGACTCCGTGCTGTATGGCCTCGTGACCTGGT ATATGGAAGCCGTGTTCCCTGGCCAGTTCGGCGTGCCCCAGCCCTG GTACTTCTTCATCATGCCTAGCTATTGGTGCGGCAAGCCCAGGGCC GTGGCCGGCAAAGAGGAAGAGGATAGCGACCCCGAGAAGGCCCT GCGGAACGAGTACTTTGAGGCCGAGCCCGAGGATCTGGTGGCCGG AATCAAGATCAAGCACCTGAGCAAGGTGTTCCGCGTGGGCAACAA GGATAGAGCCGCTGTGCGGGACCTGAACCTGAATCTGTACGAGGG CCAGATCACCGTGCTGCTGGGCCATAATGGCGCCGGAAAGACCAC CACCCTGAGCATGCTGACCGGCCTGTTTCCCCCAACAAGCGGCAG GGCCTACATCAGCGGCTACGAGATCAGCCAGGACATGGTGCAGAT CCGGAAGTCCCTGGGCCTGTGCCCCCAGCACGACATCCTGTTCGAC AACCTGACCGTGGCCGAGCACCTGTACTTTTACGCTCAGCTGAAGG GCCTGAGCCGGCAGAAATGCCCCGAGGAAGTGAAGCAGATGCTGC ACATCATCGGCCTGGAAGATAAGTGGAACAGCCGGTCCCGGTTCC TGTCCGGCGGAATGAGAAGAAAGCTGAGCATCGGAATCGCCCTGA TTGCCGGCAGCAAGGTGCTGATCCTGGACGAGCCTACCAGCGGCA TGGACGCCATCTCCAGAAGGGCCATCTGGGACCTGCTGCAGCGGC AGAAGTCCGACAGAACCATCGTGCTGACCACCCACTTCATGGACG AGGCCGACCTGCTGGGCGACCGGATCGCTATTATGGCCAAGGGGG AGCTGCAGTGCTGCGGCAGCAGCCTGTTTCTGAAGCAGAAATACG GCGCTGGCTACCACATGACCCTCGTGAAAGAGCCTCACTGCAACC CCGAGGACATCTCCCAGCTGGTGCACCACCACGTGCCAAATGCCA CCCTGGAAAGCTCTGCCGGCGCTGAGCTGAGCTTCATCCTGCCCAG AGAGAGCACCCACAGATTCGAGGGCCTGTTCGCCAAGCTGGAAAA GAAACAGAAAGAGCTGGGCATTGCCAGCTTCGGCGCCAGCATCAC AACAATGGAAGAGGTGTTCCTGAGAGTGGGCAAGCTGGTGGACAG CTCCATGGACATCCAGGCTATCCAGCTGCCCGCCCTGCAGTATCAG CACGAGAGAAGGGCTAGCGACTGGGCCGTGGACTCCAATCTGTGC GGCGCCATGGATCCCTCCGATGGAATCGGCGCCCTGATCGAAGAG GAACGGACCGCCGTGAAGCTGAACACAGGACTGGCCCTGCACTGC CAGCAGTTCTGGGCCATGTTCCTGAAGAAAGCCGCCTACAGCTGG CGCGAGTGGAAAATGGTGGCCGCACAGGTGCTGGTGCCCCTGACC TGTGTGACACTGGCACTGCTGGCCATCAACTACAGCAGCGAGCTG TTCGACGACCCCATGCTGAGACTGACACTGGGCGAGTACGGCAGG ACCGTGGTGCCTTTTTCTGTGCCCGGCACCTCACAGCTGGGCCAGC AGCTGTCTGAACACCTGAAGGATGCCCTGCAGGCCGAAGGCCAGG AACCCAGAGAAGTGCTGGGCGATCTGGAAGAGTTCCTGATCTTCC GGGCCAGCGTGGAAGGCGGCGGATTCAACGAGAGATGCCTGGTGG CTGCCTCCTTCCGGGATGTGGGCGAGAGAACAGTCGTGAACGCCC TGTTCAACAATCAGGCCTACCACAGCCCCGCCACCGCTCTGGCTGT GGTGGACAACCTGCTGTTTAAGCTGCTGTGTGGCCCCCACGCCTCC ATCGTGGTGTCCAATTTCCCCCAGCCCAGAAGCGCTCTGCAGGCTG CCAAGGACCAGTTCAACGAGGGCCGGAAGGGCTTCGACATTGCTC TGAATCTGCTGTTTGCCATGGCCTTTCTGGCCTCCACCTTCAGCATC CTGGCTGTGTCCGAGAGAGCCGTGCAGGCCAAGCACGTGCAGTTT GTGTCTGGCGTGCACGTGGCCAGCTTTTGGCTGTCTGCCCTGCTGT GGGACCTGATCAGCTTCCTGATCCCCAGCCTCCTGCTGCTGGTGGT GTTCAAGGCCTTCGACGTGCGGGCCTTCACCAGGGATGGACACAT GGCCGACACCTTGTTGTTGCTGCTGCTGTACGGCTGGGCCATCATC CCCCTGATGTACCTGATGAACTTCTTCTTCCTGGGCGCTGCCACCG CCTACACCAGACTGACCATCTTCAACATCCTGAGCGGGATCGCCAC CTTCCTGATGGTCACAATCATGCGGATCCCTGCCGTGAAACTGGAA GAACTGAGCAAGACCCTGGACCATGTGTTTCTGGTGCTGCCCAACC ACTGCCTGGGCATGGCCGTGTCTAGCTTCTACGAGAACTACGAGA CACGGCGGTACTGCACCTCCAGCGAAGTGGCCGCCCACTACTGCA AGAAGTATAACATCCAGTATCAGGAAAACTTCTACGCTTGGAGCG CACCCGGCGTGGGCAGATTTGTGGCCTCTATGGCCGCCAGCGGCT GCGCCTATCTGATCCTGCTGTTCCTGATCGAGACTAACCTGCTGCA GAGACTGAGAGGCATCCTGTGCGCCCTGCGGCGGAGAAGAACACT GACCGAGCTGTACACCCGGATGCCCGTGCTGCCTGAGGACCAGGA TGTGGCCGACGAGCGGACAAGAATCCTGGCCCCTAGCCCCGATAG CCTGCTGCACACCCCCCTGATCATCAAAGAACTGTCCAAGGTGTAC GAGCAGCGGGTGCCACTGCTGGCTGTGGACAGACTGAGTCTGGCT GTGCAGAAAGGCGAGTGCTTCGGACTGCTGGGCTTCAACGGCGCA GGCAAGACCACAACCTTCAAGATGCTGACAGGCGAGGAAAGCCTG ACCTCCGGCGACGCCTTTGTGGGCGGACACAGGATCTCTTCCGATG TGGGCAAAGTGCGGCAGCGGATCGGCTACTGCCCTCAGTTCGACG CCCTGCTGGATCACATGACCGGCAGGGAAATGCTCGTGATGTACG CCCGGCTGAGGGGCATCCCCGAGAGACACATTGGCGCCTGCGTGG AAAACACCCTGCGGGGCCTGCTGCTGGAACCCCACGCTAACAAAC TCGTGCGGACCTACAGCGGCGGCAACAAGAGAAAGCTGTCTACCG GCATTGCACTGATCGGCGAGCCAGCCGTGATCTTTCTGGATGAGCC CAGCACAGGCATGGACCCCGTGGCTCGGAGACTGCTGTGGGATAC AGTGGCCAGAGCCAGAGAGTCCGGCAAGGCCATCATTATCACCAG CCACAGCATGGAAGAGTGCGAGGCCCTGTGTACAAGACTGGCAAT TATGGTGCAGGGACAGTTCAAGTGTCTGGGCAGCCCTCAGCACCT GAAGTCCAAGTTCGGCTCCGGCTACAGCCTGCGGGCCAAGGTGCA GTCTGAAGGGCAGCAGGAAGCCCTGGAAGAATTCAAAGCCTTCGT GGACCTGACCTTCCCCGGCTCTGTGCTGGAAGATGAGCACCAGGG AATGGTGCACTACCATCTGCCTGGCAGGGACCTGTCCTGGGCCAA AGTGTTTGGCATCCTGGAAAAGGCCAAAGAGAAGTACGGCGTGGA CGATTACAGCGTGTCCCAGATCAGCCTGGAACAGGTGTTCCTGTCC TTTGCCCATCTGCAGCCCCCTACCGCCGAAGAGGGAAGAacgcgtacgc ggccgctcgagcagaaactcatctcagaagaggatctggcagcaaatgatatcctggattacaaggatgacga cgataaggtttaagaattctgcagAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAGC
SEQ ID NO: 19
[00250] Sumário: Sequência de ABCA3 otimizado no códon sem nenhum das etiquetas (etiquetas -FLAG e Myc) gggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggcaatccggtactgttggtaaa gccaccatggccgtgctgagacagctggctctgctgctgtggaagaactacaccctgcagaaacggaaggtg ctcgtgaccgtgctggaactgttcctgcccctgctgttcagcggcatcctgatctggctgcggctgaagatccag agcgagaacgtgcccaacgccaccatctaccccggccagagcatccaggaactgcccctgttcttcaccttcc ccccacccggcgatacctgggagctggcctatatccctagccacagcgacgccgccaagaccgtgacagag acagtgcggagagccctcgtgatcaacatgagagtgcggggcttccccagcgagaaggacttcgaggacta catcagatacgacaactgcagcagcagcgtgctggccgccgtggtgtttgagcaccccttcaaccacagcaa agagcccctgcctctggccgtgaagtaccacctgagattcagctacacccggcggaactacatgtggaccca gaccggctcattcttcctgaaagagacagagggctggcacaccaccagcctgttccctctgttccccaaccctg gccccagagagcctacatctcctgacggcggcgagcccggctatatcagagaaggattcctggccgtgcagc acgccgtggacagagccatcatggaataccacgccgatgccgccacccggcagctgtttcagagactgacc gtgaccatcaagcggttcccttaccccccctttatcgccgaccctttcctggtggccatccagtaccagctgcca ctcctcctgctgctgagctttacctacaccgccctgacaatcgccagagccgtggtgcaggaaaaagagcggc ggctgaaagagtacatgcggatgatgggcctgtccagctggctgcattggagcgcctggtttctgctgttcttcc tgttcctgctgatcgccgccagcttcatgacactgctgttttgcgtgaaagtgaagcccaacgtggcagtgctga gccgcagcgatcctagcctggtgctggccttcctgctgtgcttcgccatcagcaccatcagcttcagctttatggt gtccaccttcttcagcaaggccaacatggccgctgccttcggcggcttcctgtacttctttacctatattccctactt cttcgtggcccctcggtacaactggatgaccctgagccagaagctgtgcagctgcctgctgagcaacgtggcc atggctatgggagcccagctgatcggcaagttcgaggccaagggcatgggcatccagtggcgggatctgctg agccccgtgaacgtggacgacgacttctgcttcggccaggtgctgggcatgctgctgctggactccgtgctgt atggcctcgtgacctggtatatggaagccgtgttccctggccagttcggcgtgccccagccctggtacttcttca tcatgcctagctattggtgcggcaagcccagggccgtggccggcaaagaggaagaggatagcgaccccga gaaggccctgcggaacgagtactttgaggccgagcccgaggatctggtggccggaatcaagatcaagcacc tgagcaaggtgttccgcgtgggcaacaaggatagagccgctgtgcgggacctgaacctgaatctgtacgagg gccagatcaccgtgctgctgggccataatggcgccggaaagaccaccaccctgagcatgctgaccggcctgt ttcccccaacaagcggcagggcctacatcagcggctacgagatcagccaggacatggtgcagatccggaag tccctgggcctgtgcccccagcacgacatcctgttcgacaacctgaccgtggccgagcacctgtacttttacgc tcagctgaagggcctgagccggcagaaatgccccgaggaagtgaagcagatgctgcacatcatcggcctgg aagataagtggaacagccggtcccggttcctgtccggcggaatgagaagaaagctgagcatcggaatcgcc ctgattgccggcagcaaggtgctgatcctggacgagcctaccagcggcatggacgccatctccagaagggc catctgggacctgctgcagcggcagaagtccgacagaaccatcgtgctgaccacccacttcatggacgaggc cgacctgctgggcgaccggatcgctattatggccaagggggagctgcagtgctgcggcagcagcctgtttct gaagcagaaatacggcgctggctaccacatgaccctcgtgaaagagcctcactgcaaccccgaggacatctc ccagctggtgcaccaccacgtgccaaatgccaccctggaaagctctgccggcgctgagctgagcttcatcctg cccagagagagcacccacagattcgagggcctgttcgccaagctggaaaagaaacagaaagagctgggcat tgccagcttcggcgccagcatcacaacaatggaagaggtgttcctgagagtgggcaagctggtggacagctc catggacatccaggctatccagctgcccgccctgcagtatcagcacgagagaagggctagcgactgggccgt ggactccaatctgtgcggcgccatggatccctccgatggaatcggcgccctgatcgaagaggaacggaccg ccgtgaagctgaacacaggactggccctgcactgccagcagttctgggccatgttcctgaagaaagccgccta cagctggcgcgagtggaaaatggtggccgcacaggtgctggtgcccctgacctgtgtgacactggcactgct ggccatcaactacagcagcgagctgttcgacgaccccatgctgagactgacactgggcgagtacggcagga ccgtggtgcctttttctgtgcccggcacctcacagctgggccagcagctgtctgaacacctgaaggatgccctg caggccgaaggccaggaacccagagaagtgctgggcgatctggaagagttcctgatcttccgggccagcgt ggaaggcggcggattcaacgagagatgcctggtggctgcctccttccgggatgtgggcgagagaacagtcg tgaacgccctgttcaacaatcaggcctaccacagccccgccaccgctctggctgtggtggacaacctgctgttt aagctgctgtgtggcccccacgcctccatcgtggtgtccaatttcccccagcccagaagcgctctgcaggctg ccaaggaccagttcaacgagggccggaagggcttcgacattgctctgaatctgctgtttgccatggcctttctgg cctccaccttcagcatcctggctgtgtccgagagagccgtgcaggccaagcacgtgcagtttgtgtctggcgtg cacgtggccagcttttggctgtctgccctgctgtgggacctgatcagcttcctgatccccagcctcctgctgctg gtggtgttcaaggccttcgacgtgcgggccttcaccagggatggacacatggccgacaccttgttgttgctgct gctgtacggctgggccatcatccccctgatgtacctgatgaacttcttcttcctgggcgctgccaccgcctacac cagactgaccatcttcaacatcctgagcgggatcgccaccttcctgatggtcacaatcatgcggatccctgccgt gaaactggaagaactgagcaagaccctggaccatgtgtttctggtgctgcccaaccactgcctgggcatggcc gtgtctagcttctacgagaactacgagacacggcggtactgcacctccagcgaagtggccgcccactactgca agaagtataacatccagtatcaggaaaacttctacgcttggagcgcacccggcgtgggcagatttgtggcctct atggccgccagcggctgcgcctatctgatcctgctgttcctgatcgagactaacctgctgcagagactgagag gcatcctgtgcgccctgcggcggagaagaacactgaccgagctgtacacccggatgcccgtgctgcctgag gaccaggatgtggccgacgagcggacaagaatcctggcccctagccccgatagcctgctgcacacccccct gatcatcaaagaactgtccaaggtgtacgagcagcgggtgccactgctggctgtggacagactgagtctggct gtgcagaaaggcgagtgcttcggactgctgggcttcaacggcgcaggcaagaccacaaccttcaagatgctg acaggcgaggaaagcctgacctccggcgacgcctttgtgggcggacacaggatctcttccgatgtgggcaaa gtgcggcagcggatcggctactgccctcagttcgacgccctgctggatcacatgaccggcagggaaatgctc gtgatgtacgcccggctgaggggcatccccgagagacacattggcgcctgcgtggaaaacaccctgcgggg cctgctgctggaaccccacgctaacaaactcgtgcggacctacagcggcggcaacaagagaaagctgtctac cggcattgcactgatcggcgagccagccgtgatctttctggatgagcccagcacaggcatggaccccgtggct cggagactgctgtgggatacagtggccagagccagagagtccggcaaggccatcattatcaccagccacag catggaagagtgcgaggccctgtgtacaagactggcaattatggtgcagggacagttcaagtgtctgggcagc cctcagcacctgaagtccaagttcggctccggctacagcctgcgggccaaggtgcagtctgaagggcagca ggaagccctggaagagttcaaagccttcgtggacctgaccttccccggctctgtgctggaagatgagcaccag ggaatggtgcactaccatctgcctggcagggacctgtcctgggccaaagtgtttggcatcctggaaaaggcca aagagaagtacggcgtggacgattacagcgtgtcccagatcagcctggaacaggtgttcctgtcctttgcccat ctgcagccccctaccgccgaagagggaaga

Claims (18)

1. Composição, caracterizadapelo fato de que compreende um polirribonucleotídeo modificado para tratar um indivíduo tendo ou suspeito de ter uma doença associada com um gene da família do cassete de ligação de ATP (ABC), em que o polirribonucleotídeo modificado codifica o referido membro da família do cassete de ligação ABC (ABC) e compreende uma região não traduzida derivada de um gene do polipeptídeo alfa do citocromo b-245 que consiste na sequência SEQ ID NO: 14 e/ou SEQ ID NO 15, em que o polirribonucleotídeo modificado codifica um membro da família do cassete de ligação de ATP (ABC) e compreende uma região não traduzida derivada de um gene do polipeptídeo de citocromo b-245 alfa, em que na tradução o polirribonucleotídeo modificado produz um polipeptídeo que melhora um sintoma da doença, em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em degeneração macular relacionada à idade, colestase intra-hepática recorrente benigna, síndrome de Cantú, ausência bilateral congênita dos canais deferentes, hiperinsulinismo congênito, fibrose cística, síndrome de Dubin-Johnson, cardiomiopatia dilatada familiar, deficiência de HDL familiar, calcificação arterial generalizada da infância, ictiose arlequim, pancreatite hereditária, colestase intra-hepática da gravidez, ictiose lamelar, diabetes mellitus neonatal permanente, colestase intra-hepática familiar progressiva, pseudoxantoma elástico, retinite pigmentosa, sitosterolemia, disfunção macular de Stargard, disfunção macular adrenoleucodistrofia ligada ao X, anemia sideroblástica ligada ao X e ataxia, e em que o polirribonucleotídeo modificado compreende uma combinação de nucleotídeos não modificados e modificados ou compreende análogos de uridina ou análogos de citidina.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polirribonucleotídeo modificado inclui uma sequência de códon que é otimizada para tradução dentro das células do indivíduo expostas ao polirribonucleotídeo modificado.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o gene na família do cassete de ligação de ATP é selecionado do grupo consistindo em ABCA1, ABCA3, ABCA4, ABCA12, ABCB4, ABCB7, ABCB11, ABCC2, ABCC6, ABCC8, ABCC9, ABCD1, ABCG5, ABCG8 e CFTR.
4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o gene na família do cassete de ligação de ATP é ABCA3.
5. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o gene na família do cassete de ligação de ATP é pelo menos 70% homólogo ao ABCA3 humano.
6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende uma razão de moles de grupos amina de polímeros catiônicos para moles de grupo fosfatos do polirribonucleotídeo modificado de pelo menos 8.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a sequência de códon otimizada é traduzida pelo menos 20% mais efetivamente dentro de uma célula de um sujeito do que uma sequência de códon não otimizada.
8. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polirribonucleotídeo modificado fornece a expressão do polipeptídeo durante um período de tempo na célula do indivíduo tendo o polirribonucleotídeo modificado, em que o período de tempo é de até 4 semanas, em que a expressão é intensificada quando comparada com a expressão em uma célula de controle que foi exposta a um polirribonucleotídeo não modificado codificando o polipeptídeo.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o período de tempo é de pelo menos 30 segundos, ou em que o período de tempo é de até 5 dias.
10. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o polirribonucleotídeo modificado compreende a referida região não traduzida derivada de um citocromo b-245 polipeptídeo alfa 3’ ou 5’ flanqueando a sequência de códon que codifica o polipeptídeo, em que a região não codificadora ajuda na expressão intensificada do polipeptídeo nas células; ou é formulado em uma nanopartícula ou nanocápsula; ou é formulado em um lipídeo catiônico, polímero catiônico, ou nanoemulsão.
11. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polirribonucleotídeo modificado compreende de 5% a 50% de análogos de uridina e/ou de 5% a 50% de análogos de citidina, ou de 15% a 30% de análogos de uridina e/ou de 15% a 30% de análogos de citidina.
12. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os análogos de uridina são selecionados do grupo consistindo em pseudouridina, 2-tiouridina, 5-iodouridina, e 5- metiluridina; e/ou em que os análogos de citidina são selecionados do grupo consistindo em 5-metilcitidina, 2’-amino-2’-desoxicitidina, 2’-fluoro-2’- desoxicitidina, e 5-iodocitidina.
13. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polirribonucleotídeo modificado compreende 5-metilcitidina ou pseudouridina, ou (i) uridina e citidina; e (ii) análogos da uridina e citidina.
14. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polirribonucleotídeo modificado compreende análogos de adenosina e/ou análogos de guanosina.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o polirribonucleotídeo modificado compreende (i) adenosina ou guanosina; e (ii) análogos da adenosina ou guanosina.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polirribonucleotídeo modificado compreende menos de 50% de análogos de adenosina ou guanosina; ou tem uma eficiência de transfecção superior a 80% entre as células expostas ao polirribonucleótido modificado; ou não induz nenhuma alteração em um nível de pelo menos um marcador inflamatório expresso por células mononucleares de sangue periférico expostas ao polirribonucleotídeo modificado.
17. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que (i) a sequência de códon é um gene cujo defeito ou deficiência estão associados com uma presença da doença, ou (ii) uma falta ou deficiência do polipeptídeo estão associadas com a presença da doença.
18. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polirribonucleotídeo modificado diminui uma resposta imune do indivíduo quando comparado a um polirribonucleotídeo não modificado codificando o polipeptídeo, resposta imune esta que é como determinada por um nível de pelo menos um marcador inflamatório selecionado de TNF-α, IL-2 e IL-8 expresso pelas células mononucleares de sangue periférico expostas ao polirribonucleotídeo modificado quando comparado a um nível do pelo menos um marcador inflamatório nas células mononucleares de sangue periférico em um controle que foi exposto ao polirribonucleotídeo não modificado.
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