CN116887812A - 用于气溶胶形成的制剂以及用于递送核酸的气溶胶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于气溶胶形成的水性悬浮制剂，所述悬浮制剂包含悬浮在水性载体溶液中的脂质或类脂质纳米颗粒，其中脂质或类脂质纳米颗粒包含以下组分(a)和(b)：(a)核酸和(b)可离子化脂质或可离子化类脂质；并且其中水性载体溶液包含三嵌段共聚物，其包含一个聚(环氧丙烷)嵌段和两个聚(环氧乙烷)嵌段。此外，本发明涉及由用于气溶胶形成的制剂获得的气溶胶。

Description

用于气溶胶形成的制剂以及用于递送核酸的气溶胶
技术领域
本发明涉及用于气溶胶形成的水性悬浮制剂以及可有利地用于向受试者施用核酸的气溶胶。
背景技术
脂质制剂(诸如包括脂质体的脂质囊泡)和脂质或类脂质纳米颗粒(LNP)经常用于在患者中递送活性药物成分。特别地，核酸的脂质或类脂质制剂对于将核酸引入细胞是非常有用且有效的。几十年来，核酸的脂质或类脂质制剂的这种有利性质已用于生物学和医学研究以及治疗方法中，以i)过表达基因或补充靶细胞中的遗传缺陷，或ii)下调或上调细胞中的内源性基因表达，或iii)修复遗传缺陷(突变)。
为了过表达基因和补充遗传缺陷，将含有编码蛋白质的序列的核酸引入细胞。这些或者是在合适的启动子控制下的包含编码区的DNA构建体，其在细胞核中转录成mRNA。mRNA异位到细胞质，在这里其被翻译成蛋白质。可选地，可以使用脂质制剂将体外转录的mRNA引入到细胞质中，以达到相同的效果。在基因疗法和mRNA转录疗法中，将外源遗传信息引入患者细胞的概念被采用以诱导患者细胞产生具有治疗效果的蛋白质。
对于内源性基因表达的下调，可以使用全合成核酸，诸如合成的(反义)寡核苷酸或siRNA或核酶，或在细胞中转录成RNA的(质粒)DNA构建体适合下调内源性基因表达。为了敲低内源性基因表达，可以使用编码核酸酶诸如锌指核酸酶、TALE核酸酶或CRISPR-Cas系统的核酸。类似地，内源性基因表达的上调可以通过各种机制用某些寡核苷酸来实现(Khorkova O,Hsiao J,Wahlestedt C.Oligonucleotides for upregulating geneexpression.Pharm Pat Anal.2013；2(2):215-29；Sargent RG,Kim S,GruenertDC.Oligo/polynucleotide-based gene modification:strategies and therapeuticpotential.Oligonucleotides.2011；21(2):55-75)，这是一种也称为治疗性基因调节的方法。治疗性基因调节的特殊情况是用含有CpG基序的寡核苷酸进行免疫刺激(Krieg AM.CpGmotifs in bacterial DNA and their immune effects.Annu Rev Immunol.2002；20:709-60)。
为了在mRNA水平上修复遗传缺陷，可以使用影响剪接反应的核酸构建体，诸如但不限于，用于外显子跳跃的寡核苷酸。对于基因组水平的基因修复，可以使用编码可以改变染色体中核酸序列的核酸酶的核酸，所述核酸酶诸如锌指核酸酶、TALE核酸酶或CRISPR-Cas系统。
在核酸疗法的三个概念(过表达基因补充/内源性基因的下调或上调/基因修复)中的任一个中，核酸的脂质制剂需要以对患者可耐受并且适合核酸在靶细胞或靶器官中或在整个患者体内发挥其所期望作用的方式引入患者体内。经常使用的施用途径包括局部(诸如皮内、皮下、眼内、肌内、心肌内、肿瘤内)注射，或直接施用于其他靶组织或器官，以及此外全身施用(通常为静脉内)。
较少使用的是通过吸入施用活性药物成分——特别是核酸的脂质或类脂质制剂的气溶胶。虽然这种施用途径对于将活性药物成分(特别是核酸)递送到呼吸道中的靶细胞似乎是最方便且有用的，但这种施用途径与许多挑战相关，特别是在核酸的脂质或类脂质制剂的情况下，如下所述。
这些挑战一方面源于医学应用的要求。必须确保，当通过吸入施用时，治疗有效剂量在合理的时间段内沉积在患者呼吸道的那些区域中，在该区域中其可以产生所需的治疗效果。根据医学应用，这可以是，例如，上呼吸道或肺泡区域。此外，就所关心的必要剂量沉积所需的时间而言，必须考虑患者的依从性。一小时或更长的吸入时间肯定会给患者造成很大负担，而30分钟或更短的吸入时间显然更方便。
进一步的挑战来自名称为“脂质体药物产品化学、制造和控制；人体药代动力学和生物利用度；和标签文档(Liposome Drug Products Chemistry,Manufacturing,andControls；Human Pharmacokinetics and Bioavailability；and LabelingDocumentation)”(Liposome Drug Products Chemistry,Manufacturing,and Controls；Human Pharmacokinetics and Bioavailability；and Labeling Documentation-Guidance for Industry,(2018))的FDA行业指南以及EMA指南EMEA/CHMP/QWP/49313/2005Corr,“吸入和鼻腔产品药品质量指南(Guideline on the Pharmaceutical Qualityof Inhalation and Nasal Products)”，2006中列出的监管要求。两份指南都强调了药品完整性的重要性。物理化学性质，诸如囊泡/颗粒尺寸和尺寸分布，以及形态，被列为关键质量属性。“开发研究应包括与其对产品功能性的影响相关的药物和赋形剂的物理特性(Development studies should include physical characterisation of drugsubstance and excipients,relevant to their effect on the functionality of theproduct)”(Guideline on the Pharmaceutical Quality of Inhalation and NasalProducts,(2006))。EMEA/CHMP/QWP/49313/2005Corr指出，“药物和/或赋形剂的物理特性诸如溶解度、尺寸、形状、密度、粗糙度(rugosity)、电荷和结晶度等可能影响成品的均匀性和再现性”。该指南要求在患者流速范围内保证递送的剂量均匀性和细颗粒质量。对储存期间所含药物的融合(即，较小脂质体的不可逆结合形成较大脂质体)、聚集(即，两个或多个脂质体的可逆聚结或汇集而不融合)和泄漏的易感性会影响药品的稳定性(Liposome DrugProducts Chemistry,Manufacturing,and Controls；Human Pharmacokinetics andBioavailability；and Labeling Documentation-Guidance for Industry,(2018))。换句话说，待雾化液体中存在的药品在雾化期间不应改变，即其组成、(在颗粒药品的情况下)药物的颗粒尺寸和包封效率以及其效率应保持不变。
对于吸入施用，活性药物成分的脂质制剂需要被雾化。本领域技术人员已知的各种类型的雾化器可用于医疗用途。无论雾化器的设计如何，液体的雾化都需要向液体中引入相当大的能量。已经观察到，药物活性成分的脂质或类脂质制剂在雾化时确实改变了药物的尺寸、形态和包封(Elhissi AM,Faizi M,Naji WF,Gill HS,Taylor KM.Physicalstability and aerosol properties of liposomes delivered using an air-jetnebulizer and a novel micropump device with large mesh apertures.Int JPharm.2007；334(1-2):62-70；Li Z,Zhang Y,Wurtz W,Lee JK,Malinin VS,Durwas-Krishnan S,et al.Characterization of nebulized liposomal amikacin(Arikace)asa function of droplet size.J Aerosol Med Pulm Drug Deliv.2008；21(3):245-54)。此外，已经观察到mRNA的脂质制剂在雾化期间会堵塞雾化器，并且该制剂在雾化时失去效力。
因此，本发明的任务是提供一种包含核酸的组合物，该组合物适合于在雾化和吸入所述组合物时将核酸递送到受试者呼吸道中的细胞，使得核酸在吸入后有效地发挥其预期功能，诸如导致肺细胞中蛋白质的产生、导致内源性基因表达的下调或上调或导致基因修复。此外，应该可以在合理的时间段内雾化有效剂量的组合物，并且组合物的组分在雾化期间应该保持完整。
发明内容
在本发明的背景下，发现包含核酸和可离子化脂质或可离子化类脂质并且悬浮在包含聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物的水性载体溶液中的脂质或脂质纳米颗粒(LNP)的悬浮制剂可以被有效地雾化，同时可以防止雾化过程对纳米颗粒以及其中所含核酸的完整性的负面影响。特别地，该制剂用于制备气溶胶的用途允许在雾化过程期间显著提高颗粒对聚集的抵抗力，并在雾化过程后实现核酸转染效率的有益保持。
在以下条目中提供了本发明各方面的概述。
1.一种用于气溶胶形成的水性悬浮制剂，所述悬浮制剂包含悬浮在水性载体溶液中的脂质或类脂质纳米颗粒，
其中所述脂质或类脂质纳米颗粒包含以下组分(a)和(b)：
(a)核酸和
(b)可离子化脂质或可离子化类脂质；
并且其中所述水性载体溶液包含三嵌段共聚物，其含有一个聚(环氧丙烷)嵌段和两个聚(环氧乙烷)嵌段。
2.根据条目1所述的悬浮制剂，其中所述核酸选自RNA和质粒DNA。
3.根据条目1或2所述的悬浮制剂，其中所述核酸选自mRNA、siRNA、miRNA、反义RNA、tRNA和非编码RNA，并且更优选地为mRNA。
4.根据条目1至3中任一项所述的悬浮制剂，其中基于所述悬浮制剂的总体积，所述核酸在所述悬浮制剂中的浓度在0.01至10mg/mL，更优选地0.02至10mg/mL，并且最优选地0.05至5mg/mL范围内。
5.根据条目1至4中任一项所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒在所述水性悬浮液中的重量与体积比(以克/升计)在0.5g/L至100g/L，优选地10g/L至100g/L、更优选地10g/L至50g/L并且最优选地10g至75g/L范围内。
6.根据条目1至5中任一项所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒具有如通过动态光散射所测定的在10至500nm范围内，更优选地在10至250nm范围内，仍更优选地在20至200nm范围内的Z-平均直径。
7.根据条目1至6中任一项所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒具有如通过动态光散射所测定的在0.05至0.4范围内，更优选在0.05至0.2范围内的多分散性指数。
8.根据条目1至7中任一项所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒进一步包含以下组分(c1)至(c6)中的一种或多种：
(c1)具有甾醇结构的不可离子化脂质；
(c2)磷酸甘油酯脂质；
(c3)PEG缀合的脂质；
(c4)聚肌氨酸缀合的脂质；
(c5)PAS化的脂质；和
(c6)阳离子聚合物。
9.根据条目1-8中任一项所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒包含：
30至65mol％的可离子化脂质或可离子化类脂质(b)，以及以下组分中的一种或多种：
10至50mol％的具有甾醇结构的脂质(c1)，
4至50mol％的磷酸甘油酯脂质(c2)，
0.5至10mol％的PEG缀合的脂质(c3)、聚肌氨酸缀合的脂质(c4)和PAS化的脂质(c5)中的一种或其任意组合，
0.5至10mol％的阳离子聚合物(c6)，
使得(b)和(c1)至(c6)的总和等于100mol％。
10.根据条目1至9中任一项所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒进一步包含以下组分(c1)至(c3)：
(c1)具有甾醇结构的不可离子化脂质；
(c2)磷酸甘油酯脂质；和
(c3)PEG缀合的脂质。
11.根据条目10所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒包括：
30至65mol％的可离子化脂质或可离子化类脂质(b)，
10至50mol％的具有甾醇结构的脂质(c1)，
4至50mol％的磷酸甘油酯脂质(c2)，和
0.5至10mol％的PEG缀合的脂质(c3)，
使得(b)和(c1)至(c3)的总和等于100mol％。
12.根据条目1至11中任一项所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒进一步包含不同于所述核酸的聚阴离子组分。
13.根据条目1至12中任一项所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒的组成使得所述纳米颗粒中除所述核酸以外的组分的重量的总和与所述核酸的重量的重量比在30:1至1:1，更优选地20:1至2:1，并且最优选地15:1至3:1的范围内。
14.根据条目1至13中任一项所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒包含下式(b-1)的可离子化类脂质(b)，
其中：
a是1并且b是2至4的整数；或者a是2至4的整数并且b是1，
p是1或2，
m是1或2；n是0或1，且m+n≥2；和
R1A至R6A彼此独立地选自：氢；-CH2-CH(OH)R7A、-CH(R7A)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7A、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7A；-CH2-R7A；-C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；和受体配体；其中R7A选自C3-C18烷基和具有一个C-C双键的C3-C18烯基；
条件是R1A至R6A中的至少两个残基选自-CH2-CH(OH)-R7A、-CH(R7A)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7A、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7A和-CH2-R7A，其中R7A选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；
或其质子化形式，其中包含在式(b-1)的化合物中的氮原子中的一个或多个被质子化以提供携带正电荷的化合物。
15.根据条目1至14中任一项所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒包含下式(b-1b)的可离子化类脂质(b-1)，
其中R1A至R6A如条目14中所定义，
或其质子化形式，其中包含在式(b-1b)的化合物中的氮原子中的一个或多个被质子化以提供携带正电荷的化合物。
16.根据条目14或15所述的悬浮制剂，其中R1A至R6A独立地选自氢和-CH2-CH(OH)-R7A，其中R7A选自C8-C18烷基和具有一个C-C双键的C8-C18烯基，条件是R1A至R6A中的至少两个残基，优选地至少三个残基并且更优选地至少四个残基，为-CH2-CH(OH)-R7A，其中R7A选自C8-C18烷基和具有一个C-C双键的C8-C18烯基。
17.根据条目8-16中任一项所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒包含式(c1-1)的具有甾醇结构的不可离子化脂质(c1)：
其中R1K是C3-C12烷基。
18.根据条目8-17中任一项所述的悬浮制剂，其中所述具有甾醇结构的不可离子化脂质(c1-1)包含胆固醇。
19.根据条目8-18中任一项所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒包含式(c2-1)的磷酸甘油酯脂质(c2)
其中
R1F和R2F独立地为C8-C18烷基或C8-C18烯基、优选地为C12-C18烷基或C12-C18烯基，
或其药学上可接受的盐；
或式(c2-2)的磷酸甘油酯脂质(c2)
其中
R1G和R2G独立地为C8-C18烷基或C8-C18烯基、优选地为C12-C18烷基或C12-C18烯基，
或其药学上可接受的盐。
20.根据条目8至19中任一项所述的悬浮制剂，其中所述磷酸甘油酯脂质(c2)包含1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)或其药学上可接受的盐。
21.根据条目8至20中任一项所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒包含式(c3-1)的PEG缀合的脂质(c3)
其中R1H和R2H独立地为C8-C18烷基或C8-C18烯基，优选为C12-C18烷基或C12-C18烯基，并且p为5至200，优选地为10至100，并且更优选地为20至60的整数；
或式(c3-2)的PEG缀合的脂质(c3)
其中
R1J和R2J独立地为C8-C18烷基或C8-C18烯基，优选地为C12-C18烷基或C12-C18烯基，并且q为5至200，优选地10至100，并且更优选地20至60的整数，或其药学上可接受的盐。
22.根据条目21所述的悬浮制剂，其中所述PEG缀合的脂质(c3)包含1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油甲氧基(聚乙二醇)-2000(DMG-PEG2k)。
23.根据条目1-22中任一项所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒中的N/P比在0.5-20的范围内，更优选地在0.5-10的范围内。
24.根据条目1-23中任一项所述的悬浮制剂，其中所述三嵌段共聚物是A-B-A三嵌段共聚物，其包含一个式(p-1)的聚(环氧丙烷)嵌段B：
其中s是15至67，优选地20至40的整数，和
两个式(p-2)的聚(环氧乙烷)嵌段A：
其中，对于每个嵌段，r独立地为2-130，优选地50-100，并且更优选地60-90的整数。
25.根据条目24所述的悬浮制剂，其中所述三嵌段共聚物具有以下结构：
其中r和t彼此独立地为2至130，优选地50至100，并且更优选地60至90的整数，并且s为15至67，优选地20至40的整数。
26.根据条目24或25所述的悬浮制剂，其中所述三嵌段共聚物是泊洛沙姆P188。
27.根据条目1-26中任一项所述的悬浮制剂，其包含基于所述悬浮制剂的总体积为0.05至5％(w/v，在25℃的温度下)，优选地0.1至2％的浓度的所述三嵌段共聚物。
28.根据条目1-27中任一项所述的悬浮制剂，其中所述载体溶液进一步包含蔗糖或NaCl中的至少一种，更优选地蔗糖和NaCl。
29.一种制备用于气溶胶形成的水性悬浮制剂的方法，所述水性悬浮制剂包含根据条目1-28的悬浮在水性载体溶液中的脂质或类脂质纳米颗粒，所述方法包括将含有所述核酸(a)的溶液与含有所述可离子化脂质或可离子化类脂质(b)的溶液混合以形成包含所述脂质或类脂质纳米颗粒的悬浮液的步骤；
将如先前条目中所限定的含有一个聚(环氧丙烷)嵌段和两个聚(环氧乙烷)嵌段的所述三嵌段共聚物添加到所述悬浮液中的步骤；和
对所述悬浮液进行切向流过滤的步骤。
30.根据条目1至28中任一项所述的用于气溶胶形成的水性悬浮制剂，其通过条目29所述的方法获得。
31.一种雾化器，其包括隔室，其中包含根据条目1至28或30中任一项所述的用于气溶胶形成的水性悬浮制剂。
32.根据条目31所述的雾化器，其选自喷射式雾化器、软雾吸入器和筛孔雾化器，并且更优选地为软雾吸入器或振动筛孔雾化器。
33.一种气溶胶，其包含分散在气相中的气溶胶液滴，其中所述气溶胶液滴包含脂质或类脂质纳米颗粒和用于所述纳米颗粒的水性载体溶液，
其中所述脂质或类脂质纳米颗粒包含以下组分(a)和(b)：
(a)核酸和
(b)可离子化脂质或可离子化类脂质；
并且其中所述水性载体溶液包含三嵌段共聚物，所述三嵌段共聚物包含一个聚(环氧丙烷)嵌段和两个聚(环氧乙烷)嵌段。
34.根据条目33所述的气溶胶，其中所述气相是空气。
35.根据条目33或34所述的气溶胶，其中所述气溶胶液滴的质量中值空气动力学直径(MMAD)的范围为2至10μm，优选地为3至8μm。
36.根据条目33至35中任一项所述的气溶胶，其中所述核酸选自RNA和质粒DNA。
37.根据条目33至36中任一项所述的气溶胶，其中所述核酸选自mRNA、siRNA、miRNA、反义RNA、tRNA和非编码RNA，并且更优选地为mRNA。
38.根据条目33至37中任一项所述的气溶胶，其中所述纳米颗粒具有如通过动态光散射所测定的在10至500nm范围内，更优选地在10至250nm范围内，仍更优选地在20至200nm范围内的Z平均直径。
39.根据条目33至38中任一项所述的气溶胶，其中所述纳米颗粒具有如通过动态光散射所测定的在0.05至0.4范围内，更优选地在0.05至0.2范围内的多分散性指数。
40.根据条目33至39中任一项所述的气溶胶，其中所述纳米颗粒进一步包含以下组分(c1)至(c6)中的一种或多种：
(c1)具有甾醇结构的不可离子化脂质；
(c2)磷酸甘油酯脂质；
(c3)PEG缀合的脂质；
(c4)聚肌氨酸缀合的脂质
(c5)PAS化的脂质；和
(c6)阳离子聚合物。
41.根据条目33至40中任一项所述的气溶胶，其中所述纳米颗粒包含：
30至65mol％的可离子化脂质或可离子化类脂质(b)，以及以下组分中的一种或多种：
10至50mol％的具有甾醇结构的脂质(c1)，
4至50mol％的磷酸甘油酯脂质(c2)，
0.5至10mol％的PEG缀合的脂质(c3)、聚肌氨酸缀合的脂质(c4)和PAS化的脂质(c5)中的一种或其任意组合，
0.5至10mol％的阳离子聚合物(c6)，
使得(b)和(c1)至(c6)的总和等于100mol％。
42.根据条目33至39中任一项所述的气溶胶，其中所述纳米颗粒进一步包含以下组分(c1)至(c3)：
(c1)具有甾醇结构的不可离子化脂质；
(c2)磷酸甘油酯脂质；和
(c3)PEG缀合的脂质。
43.根据条目42所述的气溶胶，其中所述纳米颗粒包含：
30至65mol％的可离子化脂质或可离子化类脂质(b)，
10至50mol％的具有甾醇结构的脂质(c1)，
4至50mol％的磷酸甘油酯脂质(c2)，和
0.5至10mol％的PEG缀合的脂质(c3)，
使得(b)和(c1)至(c3)的总和等于100mol％。
44.根据条目33至43中任一项所述的气溶胶，其中所述纳米颗粒进一步包含不同于所述核酸的聚阴离子组分。
45.根据条目33至44中任一项所述的气溶胶，其中所述纳米颗粒的组成使得所述纳米颗粒中除所述核酸以外的组分的重量的总和与所述核酸的重量的重量比在30:1至1:1，更优选地20:1至2:1，并且最优选地15:1至3:1的范围内。
46.根据条目33至45中任一项所述的气溶胶，其中所述纳米颗粒包含下式(b-1)的可离子化类脂质(b)，
其中：
a是1并且b是2至4的整数；或者a是2至4的整数并且b是1，
p是1或2，
m是1或2；n是0或1，且m+n≥2；和
R1A至R6A彼此独立地选自：
氢；-CH2-CH(OH)-R7A、-CH(R7A)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7A、-CH2-CH2-(C＝
O)-NH-R7A；-CH2-R7A；-C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；和受体配体；其中R7A选自C3-C18烷基和具有一个C-C双键的C3-C18烯基；
条件是R1A至R6A中的至少两个残基选自-CH2-CH(OH)-R7A、-CH(R7A)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-OR7A、-CH2-CH2-(C＝
O)-NH-R7A和-CH2-R7A，其中R7A选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；
或其质子化形式，其中包含在式(b-1)的化合物中的氮原子中的一个或多个被质子化以提供携带正电荷的化合物。
47.根据条目46所述的气溶胶，其中所述纳米颗粒包含下式(b-1b)的可离子化类脂质(b)，
其中R1A至R6A如条目46中所定义，
或其质子化形式，其中包含在所述式(Ia)的化合物中的氮原子中的一个或多个被质子化以提供携带正电荷的化合物。
48.根据条目46或47所述的气溶胶，其中R1A至R6A独立地选自氢和-CH2-CH(OH)-R7A，其中R7A选自C8-C18烷基和具有一个C-C双键的C8-C18烯基，条件是R1A至R6A中的至少两个残基，优选地至少三个残基，并且更优选地至少四个残基，为-CH2-CH(OH)-R7A，其中R7A选自C8-C18烷基和具有一个C-C双键的C8-C18烯基。
49.根据条目40至48中任一项所述的气溶胶，其中所述纳米颗粒包含式(c1-1)的具有甾醇结构的不可离子化脂质(c1)：
其中R1K是C3-C12烷基。
50.根据条目40至49中任一项所述的气溶胶，其中所述具有甾醇结构的不可离子化脂质(c1)包含胆固醇。
51.根据条目40至50中任一项所述的气溶胶，其中所述纳米颗粒包含式(c2-2)的磷酸甘油酯脂质(c2)
其中
R1F和R2F独立地为C8-C18烷基或C8-C18烯基、优选地为C12-C18烷基或C12-C18烯基，
或其药学上可接受的盐；
或式(c2-2)的磷酸甘油酯脂质(c2)
其中
R1G和R2G独立地为C8-C18烷基或C8-C18烯基、优选地为C12-C18烷基或C12-C18烯基，
或其药学上可接受的盐。
52.根据条目40至51中任一项所述的气溶胶，其中所述磷酸甘油酯脂质(c2)包含1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)或其药学上可接受的盐。
53.根据条目40至52中任一项所述的气溶胶，其中所述纳米颗粒包含式(c3-1)的PEG缀合的脂质(c3)
其中
R1H和R2H独立地为C8-C18烷基或C8-C18烯基，优选地为C12-C18烷基或C12-C18
烯基，并且p是5至200，优选地10至100，并且更优选地20至60的整数；
或式(c3-2)的PEG缀合的脂质(c3)
其中
R1J和R2J独立地为C8-C18烷基或C8-C18烯基，优选地C12-C18烷基或C12-C18烯
基，并且q是5至200，优选地10至100，并且更优选地20至60的整数，或其药学上可接受的盐。
54.根据条目53所述的气溶胶，其中所述PEG缀合的脂质(c3)包含1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油甲氧基(聚乙二醇)-2000(DMG-PEG2k)。
55.根据条目33至54中任一项所述的气溶胶，其中所述纳米颗粒中的N/P比在0.5至20的范围内。
56.根据条目33至55中任一项所述的气溶胶，其中所述三嵌段共聚物是A-B-A三嵌段共聚物，其含有一个式(p-1)的聚(环氧丙烷)嵌段B：
其中s是15至67，优选地20至40的整数，并且
两个式(p-2)的聚(环氧乙烷)嵌段A：
其中，对于每个嵌段，r独立地是2-130，优选地50-100，并且更优选地60-90的整数。
57.根据条目56所述的气溶胶，其中所述三嵌段共聚物具有以下结构：
其中r和t彼此独立地是2至130，优选地50至100，并且更优选地60至90的整数，并且s是15至67、优选地20至40的整数。
58.根据条目56或57所述的气溶胶，其中所述三嵌段共聚物是泊洛沙姆P188。
59.根据条目33至58中任一项所述的气溶胶，其中所述载体溶液进一步包含蔗糖或NaCl中的至少一种，更优选地蔗糖和NaCl。
60.根据条目33至59中任一项所述的气溶胶，其可通过雾化根据条目1至28和30中任一项所述的水性悬浮制剂而获得。
61.一种制备气溶胶的方法，所述方法包括雾化根据条目1至28和30中任一项所述的用于气溶胶形成的水性悬浮制剂的步骤。
62.根据条目61所述的方法，其中所述气溶胶是根据条目33至60中任一项所述的气溶胶。
63.根据条目61或62所述的方法，其中所述雾化通过选自喷射式雾化器、软雾吸入器和筛孔雾化器的吸入器来实现，更优选地通过软雾吸入剂或振动筛孔雾化器来实现。
64.根据条目1至28和30中任一项所述的水性悬浮制剂，其用作药物，其中所述悬浮制剂将被雾化，并且通过雾化提供的气溶胶将被施用至受试者。
65.根据条目33至60中任一项所述的气溶胶，其用作药物。
66.根据条目1至28和30中任一项所述的水性悬浮制剂，其用于通过基于核酸的疗法治疗或预防疾病或病症，其中所述治疗或预防包括雾化所述水性悬浮制剂以及将通过雾化提供的气溶胶施用至受试者的呼吸道或经由受试者的呼吸道施用，优选地经由肺部施用或鼻腔施用。
67.根据条目33至60中任一项所述的气溶胶，其用于经由基于核酸的疗法来治疗或预防疾病或病症，其中所述治疗或预防包括将所述气溶胶施用至受试者的呼吸道或经由受试者的呼吸道施用，优选地经由肺部施用或鼻腔施用。
68.根据条目66使用的水性悬浮制剂或根据条目67使用的气溶胶，其中待治疗或预防的疾病或病症是肺病。
69.一种治疗方法，其包括雾化根据条目1-28和30中任一项所述的水性悬浮制剂，以及将通过雾化提供的气溶胶施用至受试者的呼吸道或经由受试者的呼吸道施用，优选地经由肺部施用或鼻腔施用。
70.一种治疗方法，其包括将条目33至60中任一项所述的气溶胶施用至受试者的呼吸道或经由受试者的呼吸道施用，优选经由肺部施用或鼻腔施用。
71.根据条目69或70所述的方法，其用于治疗肺部疾病。
应当理解，以上条目中的概述形成了本发明的一般公开内容的一部分，使得在以下详细描述中提供的信息，例如，关于进一步的优选实施方式或任选特征，也适用于以上条目，反之亦然。
在下文中，将提供本发明的详细描述。如本领域技术人员将理解，并且除非在特定上下文中另有指示，否则在该上下文中提供的信息适用于本发明的所有方面，包括根据本发明的用于气溶胶形成的水性悬浮制剂(其在本文中可称为“水性悬浮制剂”或简称为“悬浮制剂”)、根据本发明的气溶胶以及涉及悬浮制剂或气溶胶的方法和用途。
首先，将解释纳米颗粒及其组分。根据本发明的用于气溶胶形成的水性悬浮制剂和气溶胶包含脂质纳米颗粒或类脂质纳米颗粒。因此，除非明确指出相反，否则本文中提及的“纳米颗粒”或“LNP”包括脂质纳米颗粒以及类脂质纳米颗粒。此外，由于根据本发明的气溶胶可以使用水性悬浮制剂方便地制备，因此应该理解，本文提供的关于纳米颗粒组分的信息适用于包含在根据本发明用于气溶胶形成的制剂中的纳米颗粒，并且适用于包含在根据本发明的气溶胶中的纳米颗粒。
作为组分(a)，包含在根据本发明的用于气溶胶形成的制剂中的纳米颗粒和包含在根据本发明的气溶胶中的纳米颗粒包含核酸，其通常提供纳米颗粒的药物活性成分。
核酸的性质没有特别限制。原则上，在本发明的上下文中可以使用任何类型的核酸。核酸是本领域技术人员已知的，并且是指由核苷酸组成的生物聚合物或小生物分子，该核苷酸是由以下三种组分组成的单体：5-碳糖、磷酸基团和含氮碱基。
术语核酸是DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)的统称，即，上述生物聚合物家族的成员。如果糖是复合核糖，则聚合物是RNA；如果糖是以脱氧核糖的形式从核糖衍生而来，则聚合物为DNA。术语“核酸”包括寡核苷酸或多核苷酸。由于核酸是由核苷酸组成的生物聚合物，术语“核酸”也经常被称为“核苷酸序列”，因此，如本领域技术人员所理解，术语“核酸”和“核酸序列”经常可互换使用。
在一个优选的实施方式中，根据本发明的水性悬浮制剂和根据本发明的气溶胶的纳米颗粒包含核糖核酸(RNA)作为核酸，更优选地单链RNA，并且最优选地是mRNA。
术语“核酸”包括所有形式的天然存在类型的核酸以及化学和/或酶合成的核酸，并且还包括核酸类似物和核酸衍生物。该术语特别包括任何主链修饰、糖修饰或碱基修饰的单链或双链核酸，诸如，例如，锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、寡核苷硫代磷酸酯和磷酸三酯、吗啉基寡核苷酸、阳离子寡核苷酸(US6017700A，WO/2007/09092)、取代的核糖寡核苷酸或硫代磷酸酯。此外，术语“核酸”还指包含核苷酸或核苷酸类似物的任何分子。关于包含在本发明的纳米颗粒中的核酸的序列或尺寸没有限制。核酸主要由在本发明的纳米颗粒递送到的生物靶标处要实现的生物效应来定义。例如，如下文将更详细地概述的，在应用于基因或核酸疗法的情况下，核酸或核酸序列可由待表达的基因或基因片段或由缺陷基因或任何基因靶序列的预期取代或修复或由待抑制、敲低、下调或上调的基因的靶序列定义。
根据本发明的悬浮液和气溶胶的纳米颗粒可以包括为DNA分子的核酸。这种DNA分子的优选实施方式是可以转录成mRNA分子的DNA分子。转录是基因表达的第一步，其中通过酶RNA聚合酶将DNA分子的特定片段拷贝到mRNA分子中。在转录期间，DNA序列由RNA聚合酶读取，其产生称为初级转录物的互补的、反平行RNA链。
根据本发明的DNA分子可以通过标准分子生物学技术引入载体中，优选地引入表达载体中(参见，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning,A laboratory manual,2ndEd,1989)。术语“载体”，诸如本发明意义上的“表达载体”或“克隆载体”被理解为DNA的环状双链单元，其优选能够在细胞内独立于染色体DNA进行复制，并且用作将遗传物质携带到细胞中的运载体，在那里它可以被(复制和/或)表达(即，转录成RNA并翻译成氨基酸序列)。含有外源DNA的载体被称为重组DNA。载体本身通常是DNA序列，其通常由插入物(例如，本发明的核酸分子/DNA分子)和用作载体“主链”的较大序列组成。本发明意义上的质粒最常在细菌中发现，并用于重组DNA研究以在细胞之间转移基因，并且是本发明意义上使用的“载体”的亚群。
本领域技术人员显而易见的是，可以将进一步的调控序列添加到本发明的DNA分子中。例如，可以使用允许诱导表达的转录增强子和/或序列。合适的诱导系统是，例如，四环素调节的基因表达，例如，如Gossen and Bujard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992),5547-5551)and Gossen,Trends Biotech.12(1994),58-62所述，或者地塞米松诱导型基因表达系统，例如，如Crook,EMBO J.8(1989),513-519所述。本发明还可以使用包含DNA分子的载体，优选地表达载体。载体可以是，例如，质粒、粘粒、病毒、噬菌体或例如常规用于基因工程的另一种载体，并且可以包括进一步的基因，诸如标记基因，其允许在合适的宿主细胞中和在合适的条件下选择所述载体。
如果在本发明的上下文中使用的核酸是DNA分子，则它可以是质粒DNA(pDNA)分子。
如上所述，根据本发明的水性悬浮制剂和根据本发明的气溶胶的纳米颗粒优选地包含核糖核酸(RNA)作为核酸，更优选地单链RNA，并且最优选地是mRNA。
关于RNA，原则上在本发明的上下文中可以采用任何类型的RNA。在优选的实施方式中，RNA是单链RNA。术语“单链RNA”是指核糖核苷酸的单个连续链，这与两个或更多个单独的链由于单独链的杂交而形成双链分子的RNA分子相反。术语“单链RNA”并不排除单链分子本身形成双链结构，诸如二级结构(如环和茎环)或三级结构。实例是tRNA和mRNA，但也包括任何其它类型的单链RNA，如反义RNA、siRNA等。
术语“RNA”包括编码氨基酸序列的RNA以及不编码氨基酸序列的RNA。已建议超过80％的基因组含有不编码蛋白质的功能性DNA元件。这些非编码序列包括调控DNA元件(转录因子、调节因子和辅助调节因子(coregulator)等的结合位点)和编码从未翻译成蛋白质的转录物的序列。这些由基因组编码并转录成RNA但不会被翻译成蛋白质的转录物被称为非编码RNA(ncRNA)。因此，在一个实施方式中，RNA是非编码RNA。优选地，非编码RNA是单链分子。研究表明，ncRNA在基因调控、维持基因组完整性、细胞分化和发育方面发挥着关键作用，并且在各种人类疾病中其被错误调控。存在不同类型的ncRNA：短(20-50nt)、中(50-200nt)和长(>200nt)ncRNA。短ncRNA包括微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)和转录起始RNA(tiRNA)。中ncRNA的实例是小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、转移RNA(tRNA)、转录起始位点相关RNA(TSSaRNA)、启动子相关小RNA(PASR)和启动子上游转录物(PROMPT)。长非编码RNA(lncRNA)包括长基因间非编码RNA(lincRNA)、反义IncRNA、内含子IncRNA和转录的超保守RNA(T-UCR)等(Bhan A,Mandal SS,ChemMedChem.2014Mar 26.doi:10.1002/cmdc.201300534)。在上述非编码RNA中，只有siRNA是双链的。因此，由于在优选实施方式中，非编码RNA是单链的，因此优选的是，非编码RNA不是siRNA。在另一个实施方式中，RNA是编码RNA，即，编码氨基酸序列的RNA。这种RNA分子也称为mRNA(信使RNA)，并且是单链RNA分子。RNA可以通过本领域普通技术人员已知的化学合成和酶法制成，或通过使用重组技术来制成，或可以从天然来源分离，或通过其组合来制成。
信使RNA(mRNA)是由主要以腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷为核苷的磷酸核苷构建块组成的共聚物，其作为中间载体，将细胞核中DNA的遗传信息带入细胞质，在细胞质中其被翻译成蛋白质。因此，它们适合作为基因表达的替代品。
在本发明的上下文中，mRNA应理解为指任何多核糖核苷酸分子，如果其进入细胞，则其适合于蛋白质或其片段的表达或可翻译为蛋白质或其片段。这里的术语“蛋白质”包括任何种类的氨基酸序列，即，两个或更多个氨基酸的链，其每个氨基酸通过肽键连接并且还包括肽和融合蛋白。
mRNA包含核糖核苷酸序列，其编码在细胞中或细胞附近其功能是必需的或有益的蛋白质或其片段，例如，其缺乏或有缺陷的形式是疾病或病症诱因的蛋白质，提供该蛋白质可以缓和或预防疾病或病症，或可促进在细胞中或其附近对身体有益的过程的蛋白质。mRNA可以包含完整蛋白质或其功能变体的序列。进一步地，核糖核苷酸序列可以编码作为因子、诱导物、调节因子、刺激物或酶的蛋白质，或其功能片段，其中该蛋白质如此蛋白质，其功能是必需的，以治疗病症，特别是代谢病症，或启动体内过程，诸如形成新血管、组织等。可以由mRNA编码的蛋白质的实例包括抗体、细胞因子或趋化因子。在此，功能变体被理解为指在细胞中可以承担蛋白质功能的片段，该蛋白质在细胞中的功能是必需的，或者其缺乏或有缺陷的形式是致病的。此外，mRNA还可以具有进一步的功能区和/或3'或5'非编码区，特别地3'和/或5'UTR。3'和/或5'非编码区可以是天然位于蛋白质编码序列或人工序列两侧的区域，例如，有助于RNA稳定的序列。本领域技术人员可以通过常规实验在每种情况下确定适合于此的序列。
在优选的实施方式中，mRNA包含5′-帽(五-引物-帽；cap-0)，其由通过5′至5′三磷酸键连接到mRNA的m7GpppG、从mRNA的5′-端倒数第二个核苷酸上的附加甲基(cap-1，抗反向帽类似物(ARCA))和/或内部核糖体进入位点(IRES)和/或3′-端的polyA尾部组成，特别地，以便改进翻译。mRNA可以具有促进翻译的进一步区域，诸如，例如，cap-2结构或组蛋白茎环结构。
可以存在于根据本发明的悬浮制剂和气溶胶中的RNA可以含有未修饰和修饰的核苷酸。本文中使用的术语“未修饰核苷酸”是指A、C、G和U核苷酸。本文中使用的术语“修饰的核苷酸”是指A、C、G和U核苷酸的任何天然存在或非天然存在的异构体，以及具有例如化学修饰或取代残基的任何天然出现或天然存在的类似物、替代或修饰的核苷酸或其异构体。修饰的核苷酸可以具有碱基修饰和/或糖修饰。修饰的核苷酸也可以具有磷酸基团修饰，例如，相对于mRNA分子的5'-引物帽。修饰的核苷酸也包括通过共价修饰核苷酸在转录后合成的核苷酸。进一步地，任何合适的非修饰核苷酸和修饰核苷酸的混合物都是可能的。修饰核苷酸的非限制性数量的实例可在文献中找到(例如，US2013/0123481A1；Cantara et al.,Nucleic Acids Res,2011,39(Issue suppl_1):D195-D201；Helm and Alfonzo,ChemBiol,2014,21(2):174-185；or Carell et al.,Angew Chem Int Ed Engl,2012,51(29):7110-31)，并且一些优选的修饰核苷酸基于它们各自的核苷残基在下文中示例性地提及：1-甲基腺苷、2-甲基硫代-N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰腺苷、2-甲基腺苷、2'-O-核糖基磷酸腺苷、N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、N6-乙酰腺苷、N6-缩水甘油基氨基甲酰腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-甲基腺苷、N6苏氨酰氨基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基腺苷、1,2'-O-二甲基腺苷、N6,2'-O-二甲基腺苷、2'-O-甲基腺苷、N6,N6,2'-O-三甲基腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-甲基腺苷、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺苷、2-甲基硫代-N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、N6-2-甲基硫代-N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、7-甲基腺苷、2-甲基硫代-腺苷、2-甲氧基腺苷、2'-氨基-2'-脱氧腺苷、2'-叠氮-2'-脱氧腺苷、2”-氟-2'-脱氧腺苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺苷、7-脱氮-8-氮杂-腺苷、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤；2-硫胞苷、3-甲基胞苷、N4-乙酰胞苷、5-甲酰胞苷、N4-甲基胞苷、5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羟基胞苷、赖西丁(lysidine)、N4-乙酰基-2'-O-甲基胞苷、5-甲酰基-2'-O-甲基胞苷、5,2'-O-二甲基胞苷、2-O-甲基胞苷、N4,2'-O-二甲基胞苷、N4,N4,2'-O-三甲基胞苷、异胞苷、假胞苷、假异胞苷、2-硫代-胞苷、2'-甲基-2'-脱氧胞苷、2'-氨基-2'-脱氧胞苷、2'-氟-2'-脱氧胞苷、5-碘代胞苷、5-溴代胞苷、2'-叠氮-2'-脱氧胞苷、2'-氨基-2'-脱氧胞苷、2'-氟-2'-脱氧胞苷、5-氮杂-胞苷、3-甲基-胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-l-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-l-脱氮-假异胞苷、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-l-甲基-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林；1-甲基鸟苷、N2,7-二甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、2'-O-核糖基磷酸鸟苷、7-甲基鸟苷、羟基怀丁苷、7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷、7-氰基-7-脱氮鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、N2,7,2'-O-三甲基鸟苷、N2,2'-O-二甲基鸟苷、1,2'-O-二甲基鸟苷、2'-O-甲基鸟苷、N2,N2,2'-O-三甲基鸟苷、N2,N2J-三甲基鸟苷、异鸟苷、4-去甲基丫苷(demethylwyosine)、环氧辫苷(epoxyqueuosine)、修饰不足的(undermodified)羟基怀丁苷、甲基化的修饰不足的羟基怀丁苷、异丫苷、过氧怀丁苷、半乳糖-辫苷、甘露糖基-辫苷、辫苷、古嘌苷、怀丁苷、甲基丫苷、丫苷、7-氨基羧丙基去甲基丫苷、7-氨基羧丙基丫苷、7-氨基羧丙基丫苷甲酯、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、N1-甲基鸟苷、2'-氨基-3'-脱氧鸟苷、2'-叠氮-2'-脱氧鸟苷、2'-氟-2'-脱氧鸟苷、2-硫代尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷、3-甲基尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-羧甲基尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基尿苷、5-(羧羟甲基)尿苷甲酯、二氢尿苷、5-甲基二氢尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-(羧羟甲基)尿苷、5-(羧羟甲基)-2'-O-甲基尿苷甲酯、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代尿苷、3,2'-O-二甲基尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-氨基甲酰基羟甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基-2-硫代尿苷、5-甲氧羰基甲基-2'-O-甲基尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基尿苷、5,2'-O-二甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、2'-O-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代-2'-O-甲基尿苷、尿苷5-氧乙酸、5-甲氧羰基甲基尿苷、尿苷5-氧乙酸甲酯、5-甲氧基尿苷、5-氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硒代尿苷、5-甲氧羰基甲基-2-硫代尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷、假尿苷、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷，1-甲基假尿苷、3-甲基假尿苷、2'-O-甲基假尿苷、5-甲酰基尿苷、5-氨基甲基-2-香叶基尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、5-碘代尿苷、5-溴代尿苷、2'-甲基-2'-脱氧尿苷、2'-氨基-2'-脱氧尿苷、2'-叠氮-2'-脱氧尿苷、2'-氟-2'-脱氧尿苷、肌苷、1-甲基肌苷、1,2'-O-二甲基肌苷、2'-O-甲基肌苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、1-甲基-l-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-l-脱氮-假尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、1,2'-O-二甲基腺苷、1,2'-O-二甲基鸟苷、1,2'-O-二甲基肌苷、2,8-二甲基腺苷、2-甲基硫代亚甲基硫代-N6-异戊烯基-腺苷、2-香叶基硫代尿苷、2-赖西丁、2-甲基硫代环N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基腺苷、2-甲基硫代-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、2-硒代尿苷、2-硫代-2′-O-甲基尿苷、2′-O-甲基腺苷、2′-O-甲基胞苷、2′-O-甲基鸟苷、2′-O-甲基肌苷、2′-O-甲基假尿苷、2′-O-甲基尿苷、2′-O-甲基尿苷5-氧乙酸甲酯、2′-O-核糖基腺苷磷酸酯、2′-O-核糖基鸟苷磷酸酯、3,2′-O二甲基尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)-5,6-二氢尿苷、3(3-氨基3-羧丙基)假尿苷、5,2′-O-二甲基胞苷、5,2’-O-二甲基尿苷、5-(羧羟甲基)-2′-O-甲基尿苷甲酯、55-(异戊烯基氨基甲基)-2'-O-甲基尿苷、5-氨基甲基-2-香叶基硫代尿苷、5-氨基甲基-2-硒代尿苷、5-氨基甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基-2′-O-甲基尿苷、5-羧羟甲基尿苷、5-羧甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-香叶基硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硒代尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2′-O-甲基尿苷、5-氰基甲基尿苷、5-甲酰基-2′-O-甲基胞苷、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基尿苷、5-甲基氨基甲基-2-香叶基硫代尿苷、7-氨基羧丙基-去甲基丫苷、7-甲基鸟苷、8-甲基腺苷、N2,2'-O-二甲基鸟苷、N2,7,2'-O-三甲基鸟苷、N2,7-二甲基鸟苷、N2,N2,2′-O-三甲基鸟苷、N2,N2,7-三甲基鸟苷、N2,N2,7-三甲基鸟苷、N4,2′-O-二甲基胞苷、N4,N4,2′-O-三甲基胞苷、N4,N4-二甲基胞苷、N4-乙酰基-2′-O-甲基胞苷、N6,2′-O-二甲基腺苷、N6,N6,2′-O-三甲基腺苷、N6-甲酰腺苷、N6-羟甲基腺苷、胍丁胺基胞苷(agmatidine)、2-甲基硫代环N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、谷氨酰-辫苷、添加到任何核苷酸的鸟苷、鸟苷基化的5′端、羟基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷；最优选为假-尿苷、N1-甲基-假尿苷、2′-氟-2′-脱氧胞苷、5-碘代胞苷、5-甲基胞苷、2-硫代尿苷、5-碘代尿苷和/或5-甲基-尿苷。
此外，术语“修饰核苷酸”包括含有诸如氘等同位素的核苷酸。术语“同位素”是指具有相同数量质子但不同数量中子从而导致不同的质量数的元素。因此，例如，氢的同位素不限于氘，还包括氚。此外，多核糖核苷酸还可以含有其他元素的同位素，其包括，例如，碳、氧、氮和磷。修饰核苷酸被氘化或含有氢或氧、碳、氮或磷的另一同位素也是可能的。
在U、C、A和G核苷酸中，它们中没有、一个、两个、三个或全部可以被修饰。因此，在一些实施方式中，一种核苷酸类型的至少一个核苷酸，例如，至少一个U核苷酸，可以是修饰的核苷酸。在一些实施方式中，总共两种核苷酸类型中的至少一个核苷酸，例如，至少一个U核苷酸和至少一个C核苷酸，可以是修饰的核苷酸。在一些实施方式中，总共三种核苷酸类型中的至少一个核苷酸，例如，至少一个G核苷酸、至少一个U核苷酸和至少一个C核苷酸，可以是修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所有四种核苷酸类型中的至少一个核苷酸可以是修饰的核苷酸。在所有这些实施方式中，每种核苷酸类型的一个或多个核苷酸可以被修饰，每种核苷酸类型的所述修饰的核苷酸的百分比为0％、2.5％、5％、7.5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或100％。
在一些实施方式中，包含在mRNA分子中的修饰的核苷酸的总百分比为0％、2.5％、5％、7.5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或100％。
在优选的实施方式中，mRNA是含有修饰的和未修饰的核苷酸的组合的mRNA。优选地，它是含有修饰的和未修饰的核苷酸的组合的mRNA，如WO2011/012316中所述。据报道，其中所述的mRNA显示出增加的稳定性和降低的免疫原性。在优选的实施方式中，在这种修饰的mRNA中，5-50％的胞苷核苷酸和5-50％的尿苷核苷酸被修饰。含有腺苷和鸟苷的核苷酸可以是未修饰的。腺苷和鸟苷核苷酸可以是未修饰的或部分修饰的，并且它们优选地以未修饰的形式存在。
在前述任一项的某些实施方式中，给定核苷酸的类似物的百分比是指输入百分比(例如，在起始反应，例如起始体外转录反应中的类似物百分比)。在前述任一项的某些实施方式中，给定核苷酸的类似物的百分比是指输出(例如，合成或转录的化合物中的百分比)。这两种选择被同等地考虑。
本发明的RNA，优选地mRNA分子可以通过本领域技术人员已知的方法在体内系统中重组产生。
可选地，修饰的RNA，优选地，本发明的mRNA分子，可以在体外系统中使用例如本领域技术人员已知的体外转录系统来生产。能够产生RNA(优选地mRNA)的体外转录系统需要修饰和未修饰的三磷酸核苷的输入混合物，以产生具有本发明所需性质的修饰RNA(优选地mRNA)分子。在某些实施方式中，在这种输入混合物中，5至50％的胞苷是胞苷的类似物，并且在这种输入混合物中，5至50％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，在这种输入混合物中，5至40％的胞苷是胞苷的类似物，并且在这种输入混合物中，5至40％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，在这种混合物中，5至30％的胞苷是胞苷的类似物，并且在这种输入混合物中，5至30％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，在这种混合物中，5至30％的胞苷是胞苷的类似物，并且在这种混合物中，10至30％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，在这种输入混合物中，5至20％的胞苷是胞苷的类似物，并且这种输入混合液中，5至20％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，在这种输入混合物中，5至10％的胞苷是胞苷的类似物，并且在这种输入混合物中，5至10％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，在这种输入混合物中，25％的胞苷是胞苷的类似物，并且在这种输入混合物中，25％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，输入混合物不包含腺苷和/或鸟苷的类似物。在其他实施方式中，任选地，输入混合物包含腺苷和/或鸟苷的一种或多种类似物(或两者中没有一种或两者)。
在某些实施方式中，为胞苷类似物的输入混合物中胞苷的百分比与为尿苷类似物的输入混合物中尿苷的百分比不同。在某些实施方式中，输入混合物中胞苷类似物的百分比低于输入混合物中尿苷类似物的百分比。如上所述，这可以是在输入混合物中存在或不存在腺苷和鸟苷的类似物的情况下，但在某些实施方式中，是在输入混合物中不存在腺苷的类似物和鸟苷的类似物的情况下。
在某些实施方式中，用于产生RNA(优选地，本发明的mRNA)的体外转录系统的核苷酸的输入混合物包括胞苷的类似物和尿苷的类似物，并且输入混合物中5％至20％的胞苷是胞苷的类似物，并且输入混合物中25％至45％的尿苷是尿苷的相似物。换言之，输入混合物包括修饰和未修饰的胞苷以及修饰和未修饰的尿苷，并且输入混合物的5至20％的胞苷包括胞苷的类似物，而输入混合物的25至45％的尿苷包括尿苷的类似物。在其他实施方式中，输入混合物包含5至10％的胞苷类似物和30至40％的尿苷的类似物，诸如7至9％的胞苷类似物，诸如7％、7.5％或8％，以及诸如32至38％的尿苷的类似物，诸如33％、34％、35％、36％。
在某些实施方式中，可以使用本文所述的尿苷的类似物和胞苷的类似物中的任一种，任选地不包括假尿苷。在某些实施方式中，胞苷的类似物包含5-碘代胞苷或由5-碘代胞苷组成(例如，它是所用的单一C类似物类型)，并且尿苷的类似物包含5-碘代尿苷或由5-碘代尿苷组成(例如，它是所用的单一U类似物类型)。
上面描述了示例性类似物。应该理解，对于编码所需多肽的修饰的多核糖核苷酸，除非另有说明，否则在编码所需多肽的整个多核糖核苷酸——包括5'和3'未翻译区(例如，修饰水平基于体外转录反应中类似物的输入比率，使得类似物可以在转录的位置处并入)中考虑类似物和修饰水平。
此外，修饰的RNA，优选地mRNA分子可以被化学合成，例如，通过使用固相支持物和标准技术在自动核苷酸序列合成仪上进行常规化学合成，或者通过化学合成相应的DNA序列并随后进行其体外或体内转录。
在另一个优选实施方式中，mRNA可以与靶结合位点、靶向序列和/或与微RNA结合位点结合，以便仅在相关细胞中允许所需mRNA的活性。在进一步优选的实施方式中，RNA可以与未翻译区中的微小RNA或shRNA结合。
一般来说，治疗效果可以通过核糖核酸与细胞分子和细胞器的相互作用来实现。例如，这种相互作用单独可以激活先天性免疫系统，就像设计用于与toll样受体和其他细胞外或细胞内受体特异性相互作用的某些CpG寡核苷酸和序列的情况。此外，在细胞中摄取或引入核酸(优选地，核糖核酸，更优选地mRNA)可旨在导致核苷酸序列——诸如核酸(优选地核糖核苷酸，更优选地mRNA)中包含的基因的表达，可旨在由于引入的外源性核酸在细胞内的存在而导致下调、沉默或敲低内源性基因表达，或者可旨在修饰内源性核酸序列，诸如修复、切除、插入或交换内源性核酸序列的所选碱基或整个片段，或者可以旨在由于引入的外源性核糖核酸(优选地，mRNA)在细胞内的存在和相互作用而导致干扰几乎任何细胞过程。引入的外源性核酸(优选地核糖核酸，更优选地mRNA)的过表达可旨在补偿或补充内源性基因表达，特别是在内源性基因有缺陷或沉默，导致无基因表达、基因表达不足或基因表达的有缺陷或功能失调产物的情况下，诸如，许多代谢和遗传性疾病，如囊性纤维化、血友病或肌营养不良等的情况。引入的外源性核酸(优选地核糖核酸，更优选地mRNA)的过表达也可以旨在使表达产物与任何内源性细胞过程相互作用或干扰任何内源性细胞过程，诸如基因表达、信号转导和其他细胞过程的调节。引入的外源性核酸(优选地核糖核酸，更优选地mRNA)的过表达也可以旨在在转染或转导的细胞存在或使其存在的生物体的背景中引起免疫反应。实例是抗原呈递细胞诸如树突细胞的基因修饰，以使它们呈递抗原用于疫苗接种目的。其他实例是细胞因子在肿瘤中过表达以便引发肿瘤特异性免疫反应。此外，引入的外源性核糖核酸(优选地mRNA)的过表达也可旨在生成用于细胞治疗的体内或离体瞬时遗传修饰细胞，诸如修饰的T细胞、NK细胞和其他淋巴细胞或用于再生医学的前体细胞或干细胞或其他细胞。
例如，用于治疗目的的内源性基因表达的下调、沉默或敲低可以通过使用核酶、反义寡核苷酸、tRNA、长双链RNA的RNA干扰(RNAi)来实现，其中这种下调可以是序列特异性的或非特异性的，并且还可以导致细胞死亡，就像将长双链RNA引入细胞时的情况。内源性或预先存在的基因表达的下调、沉默或敲低在获得性、遗传性或自发引起的疾病(包括病毒感染和癌症)的治疗中是有用的。还可以设想，将核酸引入细胞可以作为预防措施来实践，以预防，例如，病毒感染或肿瘤。内源性基因表达的下调、沉默或敲低可以在转录水平和翻译水平上发挥作用。多种机制是本领域技术人员已知的，并且包括，例如，表观遗传学修饰，染色质结构的变化，通过引入的核酸选择性结合转录因子，通过碱基配对——其包括非常规碱基配对机制诸如三螺旋形成将引入的核酸与基因组DNA、mRNA或其他RNA中的互补序列杂交。类似地，基因修复、碱基或序列改变可以在基因组水平和mRNA水平(包括外显子跳跃)上实现。例如，碱基或序列的改变可以通过RNA引导的位点特异性DNA裂解，通过利用反式剪接、反式剪接核酶、嵌合体、剪接体介导的RNA反式剪接的剪切和粘贴机制，或通过利用第二组或重定向内含子，或通过利用病毒介导的插入突变或利用原核、真核或病毒整合酶系统靶向基因组插入来实现。由于核酸是生命系统构建计划的载体，并且由于它们以直接和间接的方式参与许多细胞过程，因此理论上任何细胞过程都可以通过从外部将核酸引入细胞而受到影响。值得注意的是，这种引入可以直接地在体内和体外细胞或器官培养物中进行，然后将如此修饰的器官或细胞移植到受体中。在本发明的上下文中与核酸一起用作治疗活性剂的颗粒可用于上述所有目的。
如上所述，RNA，优选地mRNA，可以包含核糖核苷酸序列，其编码在细胞中或细胞附近其功能是需要的或有益的蛋白质或其片段，例如，其缺乏其或有缺陷的形式是疾病或病症诱因的蛋白质，提供这种蛋白质可以缓和或预防疾病或病症，或可促进在细胞或其附近对身体有益的过程的蛋白质。
事实上，近年来，RNA(尤其是mRNA)作为一种新的药物实体变得越来越重要。与基于DNA的基因疗法相反，mRNA不需要运输到细胞核中，而是直接在细胞质中翻译成蛋白质(JControl Release,2011,150:238-247,and Eur J Pharm Biopharm,2009,71:484-489)。
此外，由单个基因突变引起的许多遗传疾病是已知的，并且是RNA(优选地，mRNA)治疗方法的候选对象。单基因突变引起的疾病，如囊性纤维化、血友病和许多其他疾病，就某种性状在后代中出现的可能性而言，可以是显性的或隐性的。虽然显性等位基因在只有一个等位基因拷贝的个体中表现出表型，但对于隐性等位基因，个体必须有两个拷贝，来自父母各一个拷贝才能表现出来。相比之下，多基因疾病是由两个或更多个基因引起的，并且各自疾病的表现往往很顺畅，并与环境因素有关。多基因疾病的实例是高血压、胆固醇水平升高、癌症、神经退行性疾病、精神疾病等。同样在这些病例中，代表这些基因中的一种或多种的治疗性RNA，优选地mRNA，可能对这些受试者有益。此外，遗传病症不一定是由父母的基因遗传下来的，也可能是由新的突变引起的。同样在这些病例中，代表正确基因序列的治疗性RNA，优选地mRNA，可能对受试者有益。
目前有22993个人类基因和遗传性病症条目及其各自的基因和表型描述的在线目录可在ONIM(Online Mendelian Inheritance in Man)网页(http://onim.org)上获得；每个序列都可以从Uniprot数据库(http://www.uniprot.org)中获得。作为非限制性实例，以下表A列出了一些先天性疾病和病症以及相应的基因(一个或多个)。由于细胞信号传导通路的高度相互作用，某个基因的突变会导致多种致病症状，表A中只列出了其中特征性症状。
在本发明的一些实施方式中，可存在于本发明的悬浮制剂和气溶胶中的RNA，优选地mRNA编码的治疗性蛋白质选自表A中列出的细胞蛋白质。因此，RNA，优选地mRNA分子可编码治疗性细胞蛋白质，其中编码的治疗性蛋白是表A中列出的治疗性蛋白或其同源物。
在本发明的另一个实施方式中，由RNA，优选地mRNA编码的治疗性蛋白选自表A中列出的分泌蛋白。因此，RNA，优选地mRNA，可以编码治疗性融合蛋白，其中编码的治疗性蛋白或其同源物是表A中列出的一种，并且第二蛋白是允许分泌治疗性蛋白的信号肽。信号肽是存在于所述治疗性蛋白的N末端处的短的、通常为5-30个氨基酸长的序列，并通过某些细胞器(即，内质网、高尔基体或内体)将融合蛋白引向细胞的分泌途径。因此，这种融合蛋白从细胞或细胞器分泌，或插入到细胞隔室或细胞表面处的细胞膜(例如，多跨膜跨膜蛋白)。
因此，在本发明的优选实施方式中，RNA，优选地mRNA，可以编码一种或多种(但不限于)以下引起、易感或预防疾病的基因的蛋白质。可以治疗(或预防)的这种疾病或病症的非限制性实例包括其中所述多肽、蛋白质或肽选自以下表A中概述的那些。
在一些实施方式中，RNA(优选地mRNA)的编码序列，可以被转录并翻译成部分或全长蛋白质，其包含等于或大于天然蛋白质水平的细胞活性。在一些实施方式中，RNA(优选地mRNA)，编码具有治疗或预防作用的治疗或药物活性多肽、蛋白质或肽，其中所述多肽、蛋白质或肽选自以下表A中概述的那些。RNA，优选地mRNA，更具体地其编码序列可用于表达具有等于或小于天然蛋白质水平的细胞活性的部分或全长蛋白质。这可以允许治疗可以指示施用RNA分子的疾病。
表A：人类基因和遗传性疾病或病症的非限制性实例
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上表A显示了其中缺陷导致疾病的基因的实例，该疾病可以用本发明的悬浮制剂和气溶胶中可能存在的RNA，优选地mRNA治疗，其中RNA，优选地mRNA，包含核糖核苷酸序列，其编码上述公开的缺陷基因的蛋白质的完整版本或其功能片段。在特别优选的实施方式中，可以解决遗传性疾病，该遗传性疾病例如，影响肺部，诸如SPB(表面活性蛋白B)缺乏、ABCA3缺乏、囊性纤维化和α1-抗胰蛋白酶缺乏，或者该遗传性疾病影响血浆蛋白(例如，先天性血色素沉着症(铁调素缺乏)、血栓性血小板减少性紫癜(TPP，ADAMTS13缺乏))并且引起凝血缺陷(例如，血友病a和b)和补体缺陷(例如，蛋白质C缺乏)，免疫缺陷诸如，例如SCID(由不同基因中的突变引起，诸如：RAG1、RAG2、JAK3、IL7R、CD45、CD3δ、CD3ε)或由缺乏腺苷脱氨酶引起的缺陷例如(ADA-SCID)、脓毒性肉芽肿病(例如由gp-91-phox基因、p47-phox基因、p67phox基因或p33-phox基因的突变引起)和储存性疾病，如戈谢病、法布里病、克拉布病、MPS I、MPS II(亨特综合征)、MPS VI、糖原储存性疾病II型或粘多糖病。
本发明的RNA，优选地mRNA可用于的其他病症包括以下病症，诸如SMN1相关的脊髓性肌萎缩症(SMA)；肌萎缩侧索硬化症(ALS)；GALT相关的半乳糖血症；囊性纤维化(CF)；SLC3A1相关的病症，包括胱氨酸尿症；COL4A5相关的病症，包括阿尔波特(Alport)综合征；半乳糖脑苷脂酶缺乏；X连锁肾上腺脑白质营养不良和肾上腺脊髓神经病(adrenomyeloneuropathy)；弗里德里希共济失调症；佩里泽斯-默茨巴赫(Pelizaeus-Merzbacher)病；TSC1和TSC2相关结节性硬化症；Sanfilippo B综合征(MPS IIIB)；CTNS相关的胱氨酸病；FMR1相关疾病，其包括脆性X综合征、脆性X相关震颤/共济失调综合征和脆性X卵巢早衰综合征；普拉德-威利综合征；遗传性出血性毛细血管扩张症；尼曼-皮克病C1型；神经元类蜡样脂褐素沉积症相关疾病，包括青少年神经元蜡样质脂褐质沉积症(JNCL)、青少年巴滕病、Santavuori Haltia病、Jansky-Bielschowsky病以及PTT-1和TPP1缺乏症；EIF2B1、EIF2B2、EIF2B3、EIF2B4和EIF2B5相关的儿童共济失调伴中枢神经系统髓鞘不足/白质消失；CACNA1A和CACNB4相关的2型发作性共济失调；MECP2相关病症，包括经典雷特氏综合征、MECP2相关严重新生儿脑病和PPM-X综合征；CDKL5相关非典型雷特氏综合征；肯尼迪病(SBMA)；Notch-3相关大脑常染色体显性遗传性脑动脉病伴皮质下梗死和白质脑病(CADASIL)；SCN1A和SCN1B相关的癫痫发作性病症；聚合酶G相关疾病，包括阿尔伯斯-胡滕罗彻综合征(Alpers-Huttenlocher Sydrome)、POLG相关感觉共济失调性神经病、构音障碍和眼麻痹(ophthalmoparesis)，以及线粒体DNA缺失的常染色体显性和隐性进行性外眼肌麻痹；X连锁肾上腺发育不全；X连锁无丙种球蛋白血症；法布里病；以及威尔逊氏病。
在所有这些疾病中，蛋白质，例如，酶，是有缺陷的，其可以用编码本发明的任何上述蛋白质的RNA，优选地mRNA处理，这使得由缺陷基因编码的蛋白质或其功能片段可用。转录物替代疗法/蛋白质替代疗法不会影响潜在的遗传缺陷，但会增加受试者缺乏的蛋白质的浓度。例如，在庞贝病中，转录物替代疗法/酶替代疗法替代了缺陷型溶酶体酶酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)。
因此，可由本发明的mRNA编码的蛋白质的非限制性实例是红细胞生成素(EPO)、生长激素(促生长素，hGH)、囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)、生长因子诸如GM-SCF、G-CSF、MPS、蛋白质C、铁调素、ABCA3和表面活性蛋白B。可以用根据本发明的RNA治疗的疾病的进一步实例是血友病A/B、法布里病、CGD、ADAMTS13、赫勒病、X染色体介导的A-γ-球蛋白血症、腺苷脱氨酶相关免疫缺陷和新生儿呼吸窘迫综合征，其与SP-B相关。特别优选地，根据本发明的RNA，优选地mRNA包含表面活性蛋白B(SP-B)或红细胞生成素的编码序列。可由根据本发明的本发明的RNA，优选地mRNA编码的蛋白质的进一步实例是生长因子，诸如人生长激素hGH、BMP-2或血管生成因子。
尽管以上实施方式是在本发明中使用的纳米颗粒中可能存在的RNA，优选地mRNA分子的背景下描述的，但是如上所述，本发明不限于使用RNA，优选地mRNA，而是可以采用其他核酸分子，诸如DNA分子。
所述DNA分子可以编码上述RNA，优选地上述mRNA，并且相应地，包含相应转录的RNA分子的遗传信息。
因此，就优选实施方式而言，如上文和下文在可存在于本发明中使用的纳米颗粒中的RNA分子，优选地mRNA分子的上下文中所述，在必要的修改后，同样适用于本发明的DNA分子。
可选地，RNA，优选地mRNA，可以包含编码全长抗体或较小的抗体(例如，重链和轻链)的核糖核苷酸序列，其可以在治疗环境中使用，例如，以赋予受试者免疫力。相应的抗体及其治疗应用(一种或多种)在本领域是已知的。抗体可以由单个mRNA链编码，或者可以由多于一个mRNA链编码。
在另一个实施方式中，RNA，优选地，mRNA可编码功能性单克隆或多克隆抗体，其可用于靶向和/或灭活生物靶标(例如，刺激性细胞因子诸如肿瘤坏死因子)。类似地，RNA，优选地mRNA序列可编码，例如，可用于治疗膜增殖性肾小球肾炎II型或急性溶血性尿毒症综合征的功能性抗肾病因子抗体，或者可选地可编码可用于治疗VEGF介导的疾病诸如癌症的抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体。
在另一个实施方式中，RNA，优选地mRNA，可编码功能性单克隆或多克隆抗体，其可用于中和或以其他方式抑制病毒或病毒复制。
可选地，RNA，优选地mRNA，可以包含编码优选可用于预防或治疗环境中的抗原的核糖核苷酸序列。
在另一个实施方式中，mRNA可编码可诱导免疫调节的一种或多种蛋白质，诸如细胞因子，包括趋化因子、干扰素(诸如干扰素λ)、白细胞介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。
在另一个实施方式中，RNA，优选地mRNA，可以包含编码多肽或蛋白质的核糖核苷酸序列，其可以用于基因组编辑技术。基因组编辑是一种利用核酸酶在生物体基因组中插入、缺失或替换DNA的基因工程。这些核酸酶在基因组中所需的位置处产生位点特异性断裂。诱导的断裂通过非同源末端连接或同源重组修复，导致基因组中的靶向突变，从而“编辑”基因组。断裂可以是单链断裂或双链断裂(DSB)，而双链断裂(DSB)是优选的。本领域已知许多利用不同多肽或蛋白质的基因组编辑系统，即，例如，CRISPR-Cas系统、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)和基于转录激活物样效应子的核酸酶(TALEN)。基因组工程方法在Trends in Biotechnology,2013,31(7),397-405中综述。
因此，在一个优选实施方式中，RNA，优选地mRNA，可以包含核糖核苷酸序列，其编码Cas(CRISPR相关蛋白)蛋白家族——优选Cas9(CRISPR相关蛋白9)的多肽或蛋白。Cas蛋白家族的蛋白质，优选地Cas9，可以用于基于CRISPR/Cas9的方法和/或CRISPR/Cas9基因组编辑技术。用于基因组编辑、调节和靶向的CRISPR-Cas系统在Nat.Biotechnol.,2014,32(4):347-355中综述。
在另一个优选实施方式中，RNA，优选地mRNA，可以包含编码大范围核酸酶的核糖核苷酸序列。大范围核酸酶是脱氧核糖核酸内切酶，与“传统”脱氧核糖核酸内切酶相比，其识别大的识别位点(例如，12-40个碱基对的双链DNA序列)。结果，在任何给定的基因组中，相应的位点只出现几次，优选地只出现一次。因此，大范围核酸酶被认为是最特异性的天然存在的限制性酶，因此是基因组编辑技术中合适的工具。
在另一个优选实施方式中，RNA，优选地mRNA，包含编码锌指核酸酶(ZFN)的核糖核苷酸序列。ZFN是通过将锌指DNA结合结构域与DNA裂解结构域融合而产生的人工限制性酶。锌指结构域可以被工程化以靶向特定的所需DNA序列，并且这使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组中的独特序列。通过利用内源性DNA修复机器，ZFN可以用于精确改变高等生物的基因组，因此是基因组编辑技术中的合适工具。
在另一个优选实施方式中，RNA，优选地mRNA，可以包含编码转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)的核糖核苷酸序列。TALEN是一种限制性酶，其可以被工程化来切割特定序列的DNA。TALEN是融合蛋白，其中TAL效应子DNA结合结构域与DNA核酸酶的裂解结构域融合。转录激活物样效应子(TALE)可以被工程化以实际结合任何所需的DNA序列。因此，当与核酸酶结合时，DNA可以在特定的所需位置处被切割。
尽管以上实施方式是在RNA，优选地mRNA分子的背景下描述的，但是如上所述，本发明不仅限于RNA，优选地mRNA的使用，而且可以使用任何核酸分子，诸如DNA分子。
所述DNA分子可以编码上述RNA，优选地上述mRNA，并且相应地，包含相应转录的RNA分子的遗传信息。
因此，就优选实施方式而言，如上文和下文在本发明中使用的纳米颗粒中可能存在的RNA分子，优选地mRNA分子的上下文中所阐述，在必要的修改后，同样适用于DNA分子。
除此之外，RNA含有核糖核苷酸序列，其不作为蛋白质或多肽表达。因此，术语RNA不应仅被理解为指任何多核苷酸分子，其如果被引入细胞中，则可翻译为多肽/蛋白质或其片段。相反，也可以设想RNA包含未翻译成蛋白质的核糖核苷酸序列。在这种背景下，设想，RNA包含核糖核苷酸序列，其优选地提供反义RNA、siRNA或miRNA序列或另一种所需的非编码核糖核苷酸序列的遗传信息。
因此，RNA也可以是反义RNA、siRNA或miRNA序列。反义RNA、siRNA或miRNA序列可用于在一些阶段沉默某些RNA分子的作用。这在某些医疗环境和某些疾病的治疗中，特别是在本文上文和下文所述的基于RNA的治疗中可能是期望的和有用的。
沉默RNA分子的作用可以通过使用与某些RNA序列互补的核酸链来利用RNAi(RNA干扰)机制来实现。术语“RNA干扰”或“抑制性RNA”(RNAi/iRNA)描述了使用双链RNA靶向特定的mRNA进行降解，从而沉默其翻译。优选的抑制性RNA分子可以选自双链RNA(dsRNA)、siRNA、shRNA和stRNA。可以在体外合成与基因序列匹配的dsRNA并将其引入细胞中。dsRNA也可以以表达有义和反义定向的靶基因序列的载体的形式，例如以发夹mRNA的形式，引入细胞中。有义和反义序列也可以从单独的载体表达，由此单个反义和有义分子在其表达后形成双链RNA。本领域已知，在一些情况下，由于细胞中的内部扩增机制，有义定向序列或甚至启动子序列的表达足以产生dsRNA并随后产生siRNA。因此，根据本发明，将使用导致由编码区编码的多肽或蛋白质的活性降低的所有手段和方法。例如，有义构建体、反义构建体、发夹构建体、有义和反义分子及其组合可用于产生/引入这些siRNA。dsRNA进入一个自然过程，其包括高度保守的核酸内切酶(dicer)，该核酸内切酶将dsRNA前体分子切割成短干扰RNA(siRNA)。siRNA(一个或多个)的产生和制备以及抑制靶基因表达的方法特别描述于WO02/055693,Wei(2000)Dev.Biol.15:239-255；La Count(2000)Biochem.Paras.111:67-76；Baker(2000)Curr.Biol.10:1071-1074；Svoboda(2000)Development 127:4147-4156orMarie(2000)Curr.Biol.10:289-292。这些siRNA然后构建RNA诱导沉默复合物(RISC)的序列特异性部分，该RISC是一种多复合物核酸酶，其破坏与沉默触发器(trigger)同源的信使RNA。Elbashir(2001)EMBO J.20:6877-6888表明，21个核苷酸RNA的双链体可以在细胞培养物中用于干扰哺乳动物细胞中的基因表达。
推导和构建siRNA的方法是本领域已知的，并且在Elbashir(2002)Methods 26:199-213中，在siRNA的商业供应商的互联网网站上，例如Qiagen GmbH(https://www1.qiagen.com/GeneGlobe/Default.aspx)；Dharmacon(www.Dharmacon.com)；XeragonInc.(http://www.dharmacon.com/Default.aspx)，和Ambion(www.Ambion.com)，或在TomTuschl研究小组的网站(http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html)上描述。此外，程序在线可用于从给定的mRNA序列推断siRNA(例如，http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html或http://katahdin.cshl.org:9331/RNAi/html/ rnai.html)中描述。2-nt 3'悬突中的尿苷残基可以被2'脱氧胸苷取代而不丧失活性，这显著降低了RNA合成的成本，并且当应用于哺乳动物细胞时，还可以增强siRNA双链体的抗性(Elbashir(2001)loc.cit)。siRNA也可以使用T7或其他RNA聚合酶酶促合成(Donze(2002)Nucleic Acids Res 30:e46)。介导有效RNA干扰(esiRNA)的短RNA双链体也可以通过用大肠杆菌RNase III水解产生(Yang(2002)PNAS 99:9942-9947)。此外，已经开发了表达载体以在真核细胞中表达通过小发夹RNA环连接的双链siRNA(例如(Brummelkamp(2002)Science 296:550-553)。所有这些构建体都可以在上述程序的帮助下开发。此外，并入序列分析程序中或单独出售的市售序列预测工具，例如www.oligoEngine.com(Seattle，WA)提供的siRNA设计工具，可用于siRNA序列预测。
微小RNA(miRNA)类似于上述的小干扰RNA(siRNA)。微小RNA(miRNA)是一种在植物、动物和一些病毒中发现的小型非编码RNA分子(含有约22个核苷酸)，其在RNA沉默和基因表达的转录后调控中起作用。miRNA通过与mRNA分子内互补序列的碱基配对起作用。因此，这些mRNA分子通过以下过程中的一个或多个沉默：(1)mRNA链裂解成两段，(2)通过缩短其poly(A)尾部使mRNA不稳定，以及(3)通过核糖体将mRNA较低效率地翻译成蛋白质。如前所述，miRNA类似于RNA干扰(RNAi)途径中的小干扰RNA(siRNA)，不同之处在于miRNA来源于RNA转录物的折回其自身上以形成短发夹的区域，而siRNA来源于双链RNA的较长区域。
在本发明的悬浮制剂和气溶胶中使用的DNA分子也可以是编码上述RNA的DNA分子，例如上述siRNA或miRNA，相应地，含有相应转录的RNA分子的遗传信息。因此，就优选实施方式而言，如上文在本发明中使用的纳米颗粒中可能存在的RNA分子，优选地mRNA分子的上下文中所述，在必要的修改后，同样适用于DNA分子。
应当理解，在本发明的上下文中，纳米颗粒可以包括单一类型的核酸，优选地RNA，诸如mRNA，但是可以可选地包括两种或更多种类型的核酸的组合，优选地例如以包含两种或更多种类型的核酸的颗粒形式的RNA，优选单个颗粒中的RNA，或者以其中所含核酸类型(优选地RNA，诸如mRNA)不同的颗粒的混合物形式的RNA。
如上所解释，根据本发明的水性悬浮制剂和根据本发明的气溶胶的纳米颗粒进一步包括作为组分(b)的可离子化脂质或可离子化类脂质。应当理解，这包括纳米颗粒包括不同可离子化脂质的组合、不同可离子化类脂质的组合、或一种或多种可离子化脂质和一种或多种可离子化类脂质的组合的可能性。在本发明的上下文中使用的纳米颗粒通常包括核酸(a)和可离子化脂质或可离子化类脂质(b)——以这些组分的混合物形式。
术语“可离子化脂质”和“可离子化类脂质”用于脂质纳米颗粒和类脂质纳米颗粒领域，以指代被质子化以携带阳离子电荷的脂质或类脂质，或者可以被质子化以携带阳离子电荷的脂质或类脂质。因此，可离子化脂质和类脂质也被分别称为“可质子化脂质”和“可质子化类脂质”，或者也被分别称为可滴定脂质或可滴定类脂质。如有技术的读者所理解的，对“可离子化脂质”或“可离子化类脂质”的提及包括质子化或非质子化形式的可离子化脂质或类脂质。如将进一步理解的，脂质或类脂质的质子化状态或非质子化状态通常由脂质或类脂质周围的介质的pH值确定，例如，通过包含在根据本发明的水性悬浮制剂中和由根据本发明的气溶胶包含的水性载体溶液的pH值确定。
在本发明的上下文中，带正电的可离子化脂质或可离子化类脂质的正电荷的反离子(阴离子)通常由核酸中包含的阴离子部分提供。如果与核酸中的阴离子部分相比，带正电荷的基团过量存在，则可以通过其他药学上可接受的阴离子，诸如氯化物、溴化物或碘化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、碳酸盐或碳酸氢盐，或通过不同于核酸的聚阴离子组分——其可以作为任选的组分存在于纳米颗粒中来平衡正电荷。
众所周知，可离子化脂质和可离子化类脂质是脂质纳米颗粒或类脂质纳米颗粒的组分。在本发明的上下文中，对包含在纳米颗粒中的可离子化脂质或可离子化类脂质的类型没有特别的限制。
通常，可离子化脂质或类脂质分别包括伯、仲或叔氨基，其可以作为质子受体，并且其因此可以被质子化或非质子化。可离子化类脂质通常包括多个这种氨基，诸如两个或更多个，优选地，三个或更多个。
优选地，可由根据本发明的悬浮制剂和气溶胶中使用的纳米颗粒所包含的可离子化脂质是如此脂质，其包含可质子化的头部基团，该可质子化的头部基团包含一个或多个，优选地一个伯、仲或叔氨基作为可质子化或质子化的基团，以及连接到该头部基团的一个或多个，优选地一个或两个疏水性部分。
这些优选的可离子化脂质的实例是
i)脂质，其包含可质子化的头部基团和一个与该头部基团连接的疏水部分，该可质子化的头部基团包含一个或多个，优选地一个伯、仲或叔氨基作为可质子化或质子化的基团；
ii)脂质，其包含一个仲氨基或叔氨基作为可质子化或质子化的头部基团，以及与该头部基团连接的两个疏水部分。
包含在这些优选脂质中的疏水部分优选地包含一个或多个直链脂族残基，例如，包含8至18个碳原子的直链残基，支链脂族残基，例如，包含8-18碳原子的支链残基，或可以是稠环结构的脂环结构，例如，包含10至18个碳原子的脂环结构。此外，疏水部分可以包括一个或多个连接基团，该连接基团促进该部分与头部基团的连接，或者允许两个或更多个上述脂族残基彼此结合。此外，它可以包含一个或多个取代基，但以保持该部分的疏水特性为限。
优选地，可包含在根据本发明的悬浮制剂和气溶胶中使用的纳米颗粒中的可离子化类脂质是低聚胺，更优选地低聚烷基胺，其包含至少两个，优选地至少三个选自可质子化或质子化的仲氨基和叔氨基的氨基，其每个可以携带附接至其的疏水部分。除了携带疏水残基的氨基之外，类脂质可以进一步包括选自伯氨基、仲氨基和叔氨基的可质子化或质子化的氨基。优选地，氨基的总数为3至10个，更优选地为3至6个。优选地，附接到氨基的疏水部分的总数为3至6。优选地，附接到氨基的疏水部分的数量与低聚烷基胺中氨基的总数的比率为0.75至1.5。
包含在这种优选的类脂质中的疏水部分优选包含一个或多个直链脂族残基，例如，包含8至18个碳原子的直链残基，以及支链脂族残基，例如，包含8至18个碳原子的支链残基。此外，疏水部分可以包括一个或多个连接基团，该连接基团促进该部分与氨基的连接，或者允许上述脂族残基中的两个或更多个彼此结合。此外，它可以包含一个或多个取代基，但以保持该部分的疏水特性为限。
例如，在WO2006/138380A2、EP2476756A1、US2016/0114042A1、US 8,058,069 B2、US 8,492,359 B2、US 8,822,668 B2、US 8,969,535、US 9,006,417B2、US 9,018,187 B2、US 9,345,780 B2、US 9,352,042 B2、US 9,364,435 B2、US 9,394,234 B2、US 9,492,386B2、US 9,504,651 B2、US 9,518,272 B2、DE 19834683 A1、WO 2010/053572 A2、US 9,227,917 B2、US 9,556,110 B2、US 8,969,353 B2、US10,189,802 B2、WO 2012/000104 A1、WO2010/053572、WO 2014/028487或WO 2015/095351中，或由Akinc,A.,et al.,NatureBiotechnology,26(5),2008,561-569；Sabnis,S.et al.,Molecular Therapy,26(6),2018,Vol.26 No 6June 2018,1509-1519；Kowalski,P.S.,et al.,Molecular Therapy,27(4),2019,710-728；Kulkarni,J.A.et al,Nucleic Acid Therapeutics,28(3),2018,146-157；以及Li,B.et al.,Nano Letters,15,2015,8099-8107公开了可作为组分(b1)包含在本发明的上下文中使用的纳米颗粒中的合适的示例性可离子化脂质或可离子化类脂质。
优选地，纳米颗粒的组分(b)包括下式(Ia)的可离子化类脂质或其质子化形式或更优选由其组成。在PCT申请WO 2014/207231A1中详细描述了可以用作本发明的上下文中的优选组分(b)的下式(Ia)的可离子化类脂质或其质子化形式。
因此，组分(b)优选地包含下式(b-1)的类脂质或由下式(b-1)的类脂组成
其中变量a、b、p、m、n和R1A至R6A被定义如下：
a是1并且b是2至4的整数；或者a是2至4的整数并且b是1，
p是1或2，
m是1或2；n是0或1，且m+n≥2；和
R1A至R6A彼此独立地选自氢；-CH2-CH(OH)-R7A、-CH(R7A)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7A、-CH2-CH2(C＝O)-NH-R7A；-CH2-R7A；-C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；和受体配体；其中R7A选自C3-C18烷基和具有一个C-C双键的C3-C18烯基；
条件是R1A-R6A中的至少两个残基选自-CH2-CH(OH)-R7A、-CH(R7A)CH2-OH、-CH2-CH2(C＝O)-O-R7A、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7A和-CH2-R7A，其中R7A选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；
或其质子化形式，其中包含在式(I)化合物中的氮原子中的一个或多个被质子化以提供携带正电荷的化合物。
优选地，R1A至R6A独立地选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7A、-CH(R7A)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7A、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7A；和-CH2-R7A，其中R7A选自C3-C18烷基和具有一个C-C双键的C3-C18烯基；条件是R1A-R6A中的至少两个残基，更优选地R1A-R6A中的至少三个残基并且仍更优选地R1A至R6A中至少四个残基是选自-CH2-CH(OH)-R7A、-CH(R7A)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7A、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7A和-CH2-R7A的基团，其中R7A选自C3-C18烷基和具有一个C-C双键的C3-C18烯基。更优选地，R1A-R6A独立地选自氢和基团-CH2-CH(OH)-R7A，其中R7A选自C3-C18烷基和具有一个C-C双键的C3-C18烯基；条件是R1A至R6A中的至少两个残基，更优选地R1A至R6A中的至少三个残基并且仍更优选地R1A至R6A中的至少四个残基是基团-CH2-CH(OH)-R7A，其中R7A选自C3-C18烷基和具有一个C-C双键的C3-C18烯基。
优选地，R7A选自C8-C18烷基和具有一个C-C双键的C8-C18烯基，并且更优选地选自C8-C12烷基和具有1个C-C氢键的C8-C12烯基。通常，作为R7A，烷基优于烯基。
就基团R1A至R6A中的任何一个是氨基的保护基而言，诸如，在WO2006/138380中所描述的，其优选实施方式是叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或碳苄氧基(Cbz)。
就基团R1A至R6A中的任何一个是受体配体而言，Philipp和Wagner在“Gene andCell Therapy-Therapeutic Mechanisms and Strategy”,3rd Edition,Chapter 15.CRCPress,Taylor&Francis Group LLC,Boca Raton 2009中给出了有用的实例。用于肺组织的优选受体配体描述于Pfeifer et al.2010,Ther Deliv.1(1):133-48中。优选的受体配体包括合成的环状或线性肽，诸如源自筛选肽库与特定细胞表面结构或特定细胞类型结合的，环状或线性RGD肽，合成或天然碳水化合物，诸如唾液酸、半乳糖或甘露糖，或源自碳水化合物例如与肽反应的合成配体、特异性识别细胞表面结构的抗体，叶酸，表皮生长因子及其衍生肽、转铁蛋白，抗转铁蛋白受体抗体，纳米体(nanobody)和抗体片段，或与已知细胞表面分子结合的经批准的药物。
就基团R1A至R6A中的任何一个是聚(乙二醇)链而言，聚(乙二醇)链的优选分子量为100-20000g/mol，更优选地为1000-10000g/mol，并且最优选地为1000-5000g/mol。
式(b-1)中的变量p优选地为1。
在式(b-1)中，m是1或2；n是0或1，并且m+n≥2。换句话说，如果m是1，则n也必须是1，并且如果m是2，则n可以是0或1。如果n是0，则m必须是2。如果n是1，则m可以是1或2。
式(b-1)中的变量n优选地是1。更优选的是，m是1并且n是1。
因此，p＝1、m＝1和n＝1的组合是同样优选的。
对于式(Ia)中的变量a和b，优选地是，a和b中的一个是1，另一个是2或3。更优选的是，a是1并且b是2，或者a是2并且b是1。最优选地，a是1并且b是2。
鉴于上述情况，进一步优选的是，式(b-1)的化合物是式(b-1a)的化合物，并且组分(b)包括下式(b-1a)的类脂质或由下式(b-1a)的类脂质组成：
R1A-NR2A-CH2-(CH2)a-NR3A-CH2-(CH2)b-NR4A-CH2-(CH2)a-NR5A-R6A (b-1a)，
其中a、b和R1A至R6A如式(b-1)中所定义，包括其优选实施方式；
或其质子化形式，其中式(b-1a)中所示的氮原子中的一个或多个被质子化以提供携带正电荷的化合物。
根据仍进一步优选的实施方式，式(b-1)的化合物是式(b-1b)的化合物，并且组分(b)包括下式(b-1b)的类脂化合物或由下式(b-1b)的类脂化合物组成，
其中R1A至R6A如式(Ia)中所定义，其包括其优选实施方式；
或其质子化形式，其中式(b-1b)中所示的氮原子中的一个或多个被质子化以提供携带正电荷的化合物。
因此，根据特别优选的实施方式，组分(b)包含上式(b-1b)的类脂质化合物或其质子化形式或由上式(b-1b)的类脂质化合物或其质子化形式组成，并且R1A至R6A独立地选自氢和-CH2-CH-(OH)R7A，其中R7A选自C8-C18烷基和具有一个-C-C双键的C8-C18烯基，条件是R1A至R6A中的至少两个残基是-CH2-CH(OH)-R7A，更优选地R1A至R16A中的至少三个残基，并且仍更优选R1A至R6A中的至少四个残基是-CH2-CH(OH)-R7A，其中R7A选自C8-C18烷基和具有一个C-C双键的C8-C18烯基。
根据进一步的示例性实施方式，组分(b)包括式(b-2)的可离子化脂质或由式(b-2)的可离子化脂质组成
其中R1B是包含一个或多个伯氨基、仲氨基或叔氨基的有机基团，或其质子化形式，其中R1B所包含的伯、仲或叔氨基中所含的氮原子中的一个或多个被质子化以提供携带正电荷的化合物。
优选地，式(b-2)的化合物具有以下结构：
根据另一个示例性实施方式，组分(b)包括式(b-3)的可离子化脂质或由式(b-3)的可离子化脂质组成
其中
R1C和R2C独立地选自C8-C18烷基和C8-C18烯基，优选地选自C12-C18烷基和C12-C18烯基，
R3C是C1-C6烷二基(alkanediyl group)，优选地C2或C3烷二基，并且
R4C和R5C独立地为氢或C1-C3烷基，并且优选地为甲基；
或其质子化形式，其中包含在式(b-3)的化合物中的氮原子中的一个或多个被质子化以提供携带正电荷的化合物。作为式(b-3)的可离子化脂质的实例，可参考DLin-MC3-DMA(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷(heptatriacont)-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯)。
根据仍另一个示例性实施方式，组分(b)包括式(b-4)的可离子化脂质或由式(b-4)的可离子化脂质组成
其中
R1D和R2D独立地选自C8-C18烷基和C8-C18烯基，优选地选自C12-C18烷基和C12-C18烯基，
R3D是C1-C6烷二基，优选地C2烷二基基团，和
R4D和R5D独立地为氢或C1-C3烷基，并且优选地为甲基；
或其质子化形式，其中包含在式(b-4)的化合物中的氮原子中的一个或多个被质子化以提供携带正电荷的化合物。
根据仍另一个示例性实施方式，组分(b)包括式(b-5)的可离子化类脂质或由式(b-5)的可离子化类脂质组成
其中R1E至R5E彼此独立地选自氢、-CH2-CH(OH)-R7E、-CH(R7E)-CH2-OH、
-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7E、-CH2-CH2(C＝O)-NH-R7E和-CH2-R7E，其中R7E选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基，条件是R1E至R5E中的至少两个残基选自-CH2-CH(OH-)-R7E、-CH(R7E)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7E、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7E和-CH2-R7E，其中R7E选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；
或其质子化形式，其中包含在式(b-5)的化合物中的氮原子中的一个或多个被质子化以提供携带正电荷的化合物。
在式(b-5)中，R1E至R5E优选独立地为-CH2-CH(OH)-R7E，其中R7E选自C8-C18烷基或具有一个C-C双键的C8-C18烯基。
适用于本发明的可包含在组分(b)中或组分(b)可由其组成的仍另一种示例性可离子化脂质是PCT申请WO2012/001004A1中公开的“式I的阳离子脂质”，其起始于该文件第104页，并包括该文件中也讨论的其所有具体实施方式。
适用于本发明的可包含在组分(b)中或组分(b)可由其组成的进一步示例性可离子化类脂质是PCT申请WO 2010/053572A2中公开并作为“氨基醇类脂质”要求保护的可离子化类脂质，其包括在该文件第4页的发明内容中所示并且在其余申请中进一步定义的所有通式的化合物。
适用于本发明的可包含在组分(b)中或组分(b)可由其组成的仍进一步示例性可离子化类脂质是PCT申请WO 2014/028487A1中公开为式I至V的含胺类脂质的可离子化类脂质，包括其具体实施方式。
作为除了核酸和可离子化脂质或可离子化类脂质之外的优选任选组分，本发明的水性悬浮制剂和气溶胶中的纳米颗粒可以包含以下组分(c1)至(c6)中的一种或多种：
(c1)具有甾醇结构的不可离子化脂质；
(c2)磷酸甘油酯脂质；
(c3)PEG缀合的脂质；
(c4)聚肌氨酸缀合的脂质；
(c5)PAS化的脂质；和
(c6)阳离子聚合物。
组分(c1)是具有甾醇结构的脂质。因此，合适的脂质是具有类固醇核心结构的在A环的3-位具有羟基的化合物。
由组分(c1)包含或组分(c1)可由其组成的示例性的具有甾醇结构的不可离子化脂质具有式(c1-1)的结构
其中R1K是C3-C12烷基。
由组分(c1)包含或组分(c1)可由其组成的进一步示例性的具有甾醇结构的不可离子化脂质包括S.Patel et al.,Naturally-occurring cholesterol analogues inlipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellulardelivery of mRNA,Nature Communications,2020,11:983中公开的那些，特别是该出版物图2中所示出的那些。
优选地，组分(c1)包括胆固醇或由胆固醇组成。
组分(c2)是磷酸甘油酯。
优选地，组分(c2)包含选自下述的磷脂或由其组成
式(c2-1)的化合物
其中
R1F和R2F独立地选自C8-C18烷基和C8-C18烯基，优选地选自C12-C18烷基和C12-C18烯基，
或其药学上可接受的盐；
和式(c2-2)的磷脂
其中
R1G和R2G独立地选自C8-C18烷基和C8-C18烯基，优选地选自C12-C18烷基和C12-C18烯基，
或其药学上可接受的盐。
更优选地，组分(c2)包含1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)或其药学上可接受的盐或由其组成。
式(c2-1)化合物的示例性盐形式包括由酸性-OH基团与碱形成的盐，或由氨基基团与酸形成的盐。作为与碱形成的盐，可以提及碱金属盐，诸如钠盐或钾盐；碱土金属盐诸如钙或镁盐和铵盐。作为与酸形成的示例性盐，可以提及与核酸的酸性基团形成的盐，但不排除其他盐，并且可以提及矿物酸盐，诸如氯化物、溴化物或碘化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐或磷酸二氢盐、碳酸盐和碳酸氢盐作为实例。
式(c2-2)化合物的示例性盐形式包括由附接到P原子上的酸性-OH基团与碱形成的盐，或由季氨基与阴离子形成的盐。作为与碱形成的盐，可以提及碱金属盐，诸如钠盐或钾盐；碱土金属盐诸如钙或镁盐和铵盐。作为与阴离子形成的示例性盐，可以提及与核酸的酸性基团形成的盐，但不排除其他盐，并且可以提及矿物酸盐，诸如氯化物、溴化物或碘化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐或磷酸二氢盐、碳酸盐和碳酸氢盐作为实例。
组分(c3)是PEG缀合的脂质，即，与聚乙二醇链共价连接的脂质。
优选地，组分(c3)包括选自下述的PEG缀合的脂质或由其组成
式(c3-1)的化合物
其中
R1H和R2H独立地选自C8-C18烷基和C8-C18烯基，优选地选自C12-C18烷基或C12-C18烯基，并且p是5至200，优选地10至100，更优选地20至60的整数；
和式(c3-2)的化合物
其中
R1J和R2J独立地选自C8-C18烷基和C8-C18烯基，优选地选自C12-C18烷基或C12-C18烯基，并且q是5至200，优选地10至100，并且更优选地20至60的整数或其药学上可接受的盐。
式(c3-2)化合物的示例性盐形式包括通过附接到P原子上的酸性-OH基团与碱形成的盐。作为与碱形成的盐，可以提及碱金属盐，诸如钠盐或钾盐；碱土金属盐诸如钙或镁盐和铵盐。
更优选地，组分(c3)包含1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油甲氧基(聚乙二醇)(DMG-PEG)或由其组成，并且仍更优选地组分d)包含1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油甲氧基(聚乙二醇)-2000(DMG-PEG2k)或由其组成。
组分(c4)是聚肌氨酸缀合的脂质，即，与式(c4-1)的聚合部分共价连接的脂质：
-[C(O)-CH2-N(CH3)]r-(c4-1)
其中r表示重复单元的数量，并且优选地为10至100。
组分(c5)是PAS化的脂质，即，与由脯氨酸(pro)/丙氨酸(ala)/丝氨酸(ser)重复残基形成的聚合部分共价连接的脂质。
组分(c6)是阳离子聚合物。这种适合用于形成包含核酸的纳米颗粒的聚合物在本领域中是已知的。示例性的合适的阳离子聚合物在A.C.Silva et al.,Current DrugMetabolism,16,2015,3-16中以及其中涉及的文献中，在J.C.Kasper et al.,J.Contr.Rel.151(2011),246-255中，在WO 2014/207231中以及其中涉及的文献中，在WO2016/097377中以及其中涉及的文献中讨论。
合适的阳离子低聚物或聚合物具体包括包含其中含有氨基的多个单元的阳离子聚合物。氨基可以被质子化以提供聚合物的阳离子电荷。
聚合物是优选的，其包含独立地选自以下(1)、(2)、(3)和(4)的多个单元：
-CH2-CH2-NH-(1)
-CH2-CH2-CH2-NH-(3)
其中重复单元(1)、(2)、(3)和/或(4)的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供聚合物的阳离子电荷。
作为阳离子聚合物，特别优选的是包含其中含有氨基的多个单元的以下四类聚合物。
作为第一个优选类别，提及聚(乙烯亚胺)(“PEI”)，其包括支链聚(乙烯亚胺)(“brPEI”)。
第二优选类别的阳离子聚合物是包含多个下式(c6-1)的基团作为侧链和/或作为端基的聚合物，如它们在WO 2014/207231(申请人ethris GmbH)中作为式(II)基团所公开的：
其中对于多个这种基团中的式(c6-1)的每个基团，变量a、b、p、m、n和R2至R6独立地定义如下：
a是1并且b是2至4的整数；或者a是2至4的整数并且b是1，
p是1或2，
m是1或2；n是0或1，且m+n≥2；和
R2至R5彼此独立地选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基的保护基；和聚(乙二醇)链；
R6选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基的保护基；-C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；和受体配体，
并且其中式(c6-1)中指示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供式(c6-1)的阳离子基团。
关于这些聚合物和上述式(c6-1)中包含的变量的进一步优选定义，WO2014/207231中关于其式(II)基团的相应公开内容也适用于本文所述的发明。
第三优选类别的阳离子聚合物是包含多个下式(c6-2)基团作为重复单元的聚合物，如它们在WO 2014/207231(申请人ethris GmbH)中作为式(III)基团所公开的：
/>
其中对于多个这种基团中的式(c6-2)的每个基团，变量a、b、p、m、n和R2至R5独
立地定义如下：
a是1并且b是2至4的整数；或者a是2至4的整数并且b是1，
p是1或2，
m是1或2；n是0或1，且m+n≥2；和
R2至R5彼此独立地选自氢；基团-CH2-CH(OH)-R7、-CH(R7)-CH2-OH、
-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7、CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7或-CH2-R7，其中R7选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；氨基的保护基；C(NH)-NH2；和聚(乙二醇)链；
并且其中式(c6-2)中指示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供式(c6-2)的阳离子基团。
关于这些聚合物和上述式(c6-2)中包含的变量的进一步优选定义，WO2014/207231中关于其式(III)的重复单元的相应公开内容也适用于本文所述的发明。
第四优选类别的阳离子聚合物由统计共聚物提供，如在WO2016/07377(申请人ethris GmbH)中公开的。它包括独立地选自下式(a1)和(a2)的重复单元的多个重复单元(a)：
-CH2-CH2-NH-(a1)
和独立地选自下式(b1)至(b4)的重复单元的多个重复单元(b)：
-CH2-CH2-CH2-NH-(b1)
-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-(b3)
并且重复单元(a)的总和与重复单元(b)的总和的摩尔比在0.7/1.0至1.0/0.7的范围内，并且共聚物中包含的重复单元(a)和/或(b)的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供阳离子共聚物。
关于该共聚物的进一步优选定义，WO2016/07377中的相应公开内容也适用于本文所述的发明。如其中所述，特别优选的共聚物是包含重复单元(a1)和(b1)或由重复单元(a1)和(b1)组成的线性共聚物。
作为纳米颗粒的任选组分，还可以包括不同于核酸的聚阴离子组分。这种聚阴离子的实例是聚谷氨酸和硫酸软骨素。如果在纳米颗粒中使用这种不同于核酸的聚阴离子组分，则优选限制其量，使得由聚阴离子组份提供的阴离子电荷的量不高于由核酸提供的阴离子电荷的量。
如上所述，存在于根据本发明的悬浮制剂和气溶胶中的脂质或类脂质纳米颗粒包括(a)核酸和(b)可离子化脂质或可离子化类脂质。如果包含类脂质，则纳米颗粒在本文中应称为类脂质纳米颗粒。
优选地，纳米颗粒优选包括以下组分，更优选地由其组成，
核酸(a)，
可离子化脂质或可离子化类脂质(b)，
以及任选地以下中的一种或多种：
具有甾醇结构的不可离子化的脂质(c1)；
磷酸甘油酯脂质(c2)；
PEG缀合的脂质(c3)；
聚肌氨酸缀合的脂质(c4)；
PAS化的脂质(c5)；和
阳离子聚合物(c6)。
包含由以上列出的组分形成的纳米颗粒的示例性悬浮制剂，其也适用于本发明的上下文，包括S.Patel et al.,Naturally-occurring cholesterol analogues in lipidnanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery ofmRNA,Nature Communications,2020,11:983中公开的那些。
应当理解，纳米颗粒的组分，特别是组分(a)和(b)，以及任选的(c1)至(c6)中的一种或多种，通常作为混合物包含在纳米颗粒中。
就这些组分的量而言，进一步优选的是，纳米颗粒包含以下组分，更优选由以下组分组成：
核酸，以及
30至65mol％的可离子化脂质或可离子化类脂质(b)，
以及以下组分中的一种或多种：
10至50mol％的具有甾醇结构的脂质(c1)，
4至50mol％的磷酸甘油酯脂质(c2)，
0.5至10mol％的PEG缀合的脂质(c3)、聚肌氨酸缀合的脂质(c4)和PAS化的脂质(c5)中的一种或其任意组合，
0.5至10mol％的阳离子聚合物(c6)，
使得(b)和(c1)至(c6)的总和等于100mol％。如将理解的，组分(c1)至(c6)的摩尔百分比被指示，条件是并非所有这些组分都需要存在于纳米颗粒中。因此，例如，在该优选实施方式的上下文中，阳离子聚合物可以存在或不存在，但如果存在，则以0.5-10mol％的量使用。如上述进一步指示的，在优选实施方式的上下文中，组分(c1)、(c2)、(c3)、(c4)、(c5)和/或(c6)的量使得(b)和(c1)至(c6)的总和等于100mol％。
仍进一步优选的是，纳米颗粒包括以下组分或由其组成：
核酸(a)，
可离子化脂质或可离子化类脂质(b)，
具有甾醇结构的不可离子化脂质(c1)，
磷酸甘油酯脂质(c2)，和
PEG缀合的脂质(c3)。
就这些组分的量而言，仍进一步优选的是，纳米颗粒包括以下组分，更优选地由以下组分组成：
核酸(a)，
30至65mol％的可离子化脂质或可离子化类脂质(b)，
10至50mol％的具有甾醇结构的脂质(c1)，
4至50mol％的磷酸甘油酯脂质(c2)，和
0.5至10mol％的PEG缀合的脂质(c3)，
使得(b)和(c1)至(c3)的总和等于100mol％。
根据与优选核酸相关的和与脂质组合物的除核酸以外的优选组分相关的上述信息，包含在根据本发明的悬浮制剂和根据本发明的气溶胶中的脂质纳米颗粒分别优选地包含
(a)作为核酸的mRNA；
(b)式(b-1b)的可离子化类脂质
其中R1A至R6A独立地选自氢和-CH2-CH(OH)-R7A，其中R7A选自C8-C18烷基和具有一个C-C双键的C8-C18烯基，条件是R1A至R1A中的至少两个残基是-CH2-CH(OH)-R7A，更优选地R1A至R6A中的至少四个残基为-CH2-CH(OH)-R7A，其中R7A选自C8-C18烷基和具有一个C-C双键的C8-C18烯基；
或其质子化形式，其中式(b-1b)中所示的氮原子中的一个或多个被质子化以提供阳离子类脂质；
(c1)式(c1-1)的具有甾醇结构的不可离子化脂质
其中R1K是C3-C12烷基；
(c2)式(c2-2)的磷酸甘油酯
其中R1G和R2G独立地选自C8-C18烷基和C8-C18烯基，优选地选自C12-C18烷基和C12-C18烯基，
或其药学上可接受的盐；和
(c3)式(c3-1)的PEG缀合的脂质
其中R1H和R2H独立地选自C8-C18烷基和C8-C18烯基，优选地选自C12-C18烷基或C12-C18烯基，并且p是5至200，优选地10至100，并且更优选地20至60的整数。
在根据本发明的悬浮制剂和气溶胶中所包含的纳米颗粒中，纳米颗粒的组成优选地使得在纳米颗粒中除核酸以外的组分的重量总和与核酸重量的重量比在30:1至1:1的范围内，更优选地在20:1至2:1的范围内，以及最优选地15:1至3:1的范围内。
N/P比，即由可离子化脂质或可离子化类脂质提供的胺氮原子的数目与由纳米颗粒的核酸提供的磷酸基团的数目的比率，优选地在0.5至20的范围内，更优选地在0.5至10的范围内。
根据本发明的悬浮制剂和气溶胶中所包含的脂质或类脂质纳米颗粒优选地具有在10至500nm范围内，更优选地在10至250nm范围内，仍更优选在20至200nm范围内的Z平均直径。指示的颗粒直径是通过动态光散射(DLS)确定的颗粒的流体动力学直径。测量通常在25℃下进行。
根据本发明的悬浮制剂和气溶胶中所包含的纳米颗粒的多分散性指数优选在0.05至0.4的范围内，更优选地在0.05至0.2的范围内。多分散性指数可以通过动态光散射(DLS)来确定。测量通常在25℃下进行。
可以提供含有如上所定义的不同脂质或类脂质纳米颗粒——即，在其组分方面不同的颗粒的悬浮制剂或气溶胶。然而，优选地，在根据本发明的悬浮制剂中或在根据本发明的气溶胶中包含的纳米颗粒由相同的组分组成。
脂质纳米颗粒可以通过将例如，在含有缓冲液(诸如pH为4.5的柠檬酸盐缓冲液)以及任选地含有盐，诸如氯化钠的水性溶剂中含有核酸的溶液与例如，在乙醇中含有可离子化脂质或可离子化类脂质的溶液混合来方便地制备。可以将进一步的任选组分并入，例如通过将其添加到两种溶液中的一种中。以这种方式产生的脂质纳米颗粒可以通过色谱和/或透析和/或切向流过滤进一步处理，以便获得所需液体组合物中的脂质纳米微粒。在这些下游加工步骤之前或期间，可以添加进一步的赋形剂，诸如冷冻保护剂和其他赋形剂以获得所需的药物组合物。如果对纳米颗粒进行切向流过滤，出于稳定性原因，优选的是对包含三嵌段共聚物的纳米颗粒悬浮液进行过滤，如本文的载体溶液的组分所定义的，该三嵌段共聚物包含一个聚(环氧丙烷)嵌段和两个聚(环氧乙烷)嵌段。
为此，本发明进一步提供了一种制备用于气溶胶形成的水性悬浮制剂的方法，该悬浮制剂包括悬浮在水性载体溶液中的脂质或类脂质纳米颗粒，所述方法包括混合含有核酸(a)的溶液和含有可离子化脂质或可离子化类脂质(b)的溶液，以形成包含脂质或类脂质纳米颗粒的悬浮液的步骤。进一步的组分，诸如组分(c1)至(c6)中的一种或多种，可以方便地并入纳米颗粒中，例如，通过将其添加到含有可离子化脂质或可离子化类脂质的溶液中。
作为优选实施方式，本发明提供了一种制备用于气溶胶形成的水性悬浮制剂的方法，该水性悬浮制剂包括悬浮在水性载体溶液中的脂质或类脂质纳米颗粒，所述方法包括
混合含有核酸(a)的溶液和含有可离子化脂质或可离子化类脂质(b)的溶液以形成包含脂质或类脂质纳米颗粒的悬浮液的步骤；
将如本文所定义的含有一个聚(环氧丙烷)嵌段和两个聚(环氧乙烷)嵌段的三嵌段共聚物添加到该悬浮液中的步骤；和
对悬浮液进行切向流过滤以得到根据本发明的水性悬浮制剂的步骤。
用于气溶胶形成的水性悬浮制剂包括以上讨论的脂质或类脂质纳米颗粒以及水性载体溶液。如参考悬浮制剂所示，纳米颗粒悬浮在载体溶液中。
载体溶液是水性溶液，即，其中以溶剂(一种或多种)总体积计的主要溶剂是水的溶液，优选地含有70％以上的水，更优选地含有90％以上的水作为溶剂的溶液，表示为水在载体溶液中所包含的溶剂(一种或多种)的总体积中的体积百分比(在25℃的温度下)。最优选地，水是载体溶液中唯一的溶剂。因此，载体溶液在室温(例如25℃)下为液体。
组合物中载体溶液中的纳米颗粒的重量/体积比优选地为在0.5g/L至100g/L的范围内，优选地在10g/L至100g/L的范围内，更优选地在10g/L至50g/L的范围内，并且最优选地在10g至75g/L的范围内。
基于悬浮制剂的总体积，由脂质或类脂质纳米颗粒提供的核酸在悬浮制剂中的浓度优选地在0.01至10mg/ml范围内，更优选地在0.02至5mg/ml范围内，并且最优选地在0.1至5mg/ml范围内。
如上所述，根据本发明的悬浮制剂和气溶胶中所包含的脂质或类脂质纳米颗粒优选地具有在10至500nm范围内，更优选地在10至250nm范围内，仍更优选地在20至200nm范围内的Z平均直径。指示的颗粒直径是通过动态光散射(DLS)确定的颗粒的流体动力学直径。测量通常在25℃下进行。
根据本发明的悬浮制剂和气溶胶中所包含的纳米颗粒的多分散性指数优选地在0.05至0.4的范围内，更优选地在0.05至0.2的范围内。多分散性指数可以通过动态光散射(DLS)来确定。测量通常在25℃下进行。
载体溶液包括三嵌段共聚物，其包含一个聚(环氧丙烷)嵌段和两个聚(环氧乙烷)嵌段。
优选地，三嵌段共聚物是A-B-A三嵌段共聚物，其包含一个式(p-1)的聚(环氧丙烷)嵌段B：
其中s是15至67，优选地20至40的整数，以及
两个式(p-2)的聚(环氧乙烷)嵌段A：
/>
其中，对于每个嵌段，r独立地为2至130，优选地50至100，更优选地60至90的整数。
更优选地，三嵌段共聚物具有以下结构：
其中r和t彼此独立地为2至130，优选地50至100，并且更优选地60至90的整数，
并且s是15至67，优选地20至40的整数。
最优选地，使用泊洛沙姆P188作为三嵌段共聚物。
载体溶液通常包括溶解在其中的三嵌段共聚物。然而，如有技术的读者所理解的，这并不排除一定量的共聚物分子被吸附到组合物中所包含的脂质或类脂质纳米颗粒上的可能性。
优选地，基于组合物的总体积，用于气溶胶形成的组合物包含浓度为0.05至5％w/v(即，克/100毫升)，优选地为0.1至2％的三嵌段共聚物。
除了三嵌段共聚物之外，载体溶液中还可以存在其他赋形剂。优选地，载体溶液进一步包含蔗糖和NaCl中的至少一种，更优选地包含蔗糖和NaCl。
根据本发明的悬浮制剂可以方便地制备，例如，通过包括将三嵌段共聚物添加到包含载体溶液和脂质或类脂质纳米颗粒的悬浮液中，或者包括将脂质或类脂质纳米颗粒添加到包含三嵌段共聚物的载体溶液中的方法。
根据本发明的用于气溶胶形成的水性悬浮制剂可以被雾化以提供根据本发明的气溶胶。有利地，雾化步骤对水性悬浮制剂中所包含的纳米颗粒和核酸的负面影响可以以这种方式最小化或者甚至避免。此外，对于给定剂量的mRNA，雾化可以在例如60min或更短，优选地30min或更短的合理时间段内以有效的方式完成。
因此，可通过雾化根据本发明的用于气溶胶形成的水性悬浮制剂获得的气溶胶包括分散在气相中的气溶胶液滴。气溶胶液滴包括如上所讨论的脂质或类脂质纳米颗粒，包括其任何优选实施方式，以及用于纳米颗粒的水性载体溶液。水性载体溶液包括三嵌段共聚物，其包含一个聚(环氧丙烷)嵌段和两个聚(环氧乙烷)嵌段，其由本发明的水性悬浮制剂的载体溶液提供，并且在上文中对此进行了讨论。
如上文所解释，已经发现，三嵌段共聚物的存在允许保留有利的纳米颗粒特性，其是在雾化之前由上文讨论的水性悬浮制剂的纳米颗粒表现出的。
因此，根据本发明的气溶胶的气溶胶液滴中所包含的脂质或类脂质纳米颗粒优选地具有在10至500nm范围内，更优选地在10至250nm范围内，仍更优选地20至200nm范围内的Z平均直径。指示的颗粒直径是通过动态光散射(DLS)确定的颗粒的流体动力学直径。测量通常在25℃下进行。
根据本发明的气溶胶的气溶胶液滴中所包含的脂质或类脂质纳米颗粒的多分散性指数优选地在0.05至0.4的范围内，更优选地在0.05至0.2的范围内。多分散性指数可以通过动态光散射(DLS)来确定。测量通常在25℃下进行。
源自悬浮制剂的气溶胶的气溶胶液滴中的载体溶液是水性溶液，即其中以溶剂(一种或多种)的总体积计主要溶剂是水的溶液。优选地，载体溶液含有超过70％的水，更优选地超过90％的水作为溶剂，表示为水在载体溶液中所包含的溶剂(一种或多种)总体积中的体积百分比(在25℃的温度下)。最优选地，水是载体溶液中唯一的溶剂。
如上所述，根据本发明的气溶胶包括分散在气相中，通常分散在空气中的液滴。液滴可通过雾化根据本发明的用于气溶胶形成的组合物获得。它们包括源自上文详细描述的组合物的载体溶液的液相，以及脂质或类脂质纳米颗粒。通常，脂质或类脂质纳米颗粒分散在载体溶液中。此外，气溶胶液滴通常包括分散在单一液滴中的多个脂质或类脂质纳米颗粒。
如上文所进一步解释的，根据本发明的气溶胶可以施用于受试者，特别是施用于受试者的呼吸道或经由受试者的呼吸道，优选地经由肺部施用或鼻腔施用。通常，施用是通过受试者吸入气溶胶来完成的。
气溶胶液滴可以通过考虑到它们的密度和形状的其空气动力学直径来表征。空气动力学直径被定义为密度为1g/cm3的球形颗粒或液滴的直径，其在空气中的下沉速度与所考虑的液滴相同(Luftbeschaffenheit-Festlegung von enverteilungen fürdie gesundheitsbezogene Schwebstaubprobenahme,(1995)；Vincent JH.AerosolSampling-Science,Standards,Instrumentation and Applications.Chichester,England:John Wiley&Sons,Ltd.；2007)。空气动力学直径的尺寸分布通常通过质量中值空气动力学直径(MMAD)即，中值质量相关空气动力学直径进行参数化。因此，MMAD是小于或大于该值的颗粒各自贡献总质量50％的直径，因此是颗粒平均尺寸的量度。MMAD可以用级联冲击器或下一代冲击器进行测量(Preparations for inhalation:Aerodynamicassessment of fine particles；European Pharmacopoeia 90；Volume I:EDQM Councilof Europe；2019)。气溶胶液滴的质量中值空气动力学直径(MMAD)对气溶胶颗粒在呼吸道中的沉积位置有影响。虽然MMAD为10μm或更大的颗粒由于其惯性而倾向于已经沉积(撞击)在喉部，但0.1μm至1.0μm之间的颗粒倾向于太轻，并且可能由于布朗运动引起的扩散过程而再次呼出。
根据本发明的气溶胶的气溶胶液滴优选地具有2至10μm，更优选地3至8μm的MMAD，如通过使用级联冲击器或下一代冲击器的测量所确定的。
用于由包括在载体溶液中包含的颗粒的悬浮制剂形成气溶胶的雾化装置(雾化器)是本领域已知的，并且是可商业上获得的。雾化器是一种将液体转化为适合吸入的分散在气相中的细液滴雾——即气溶胶的仪器。在本发明的上下文中可使用的用于产生气溶胶的合适的雾化器的实例为以下等：
喷射式雾化器，例如Pari Boy(Pari)；
振动筛孔雾化器，例如Pari eFlow(Pari)、Aeroneb(Aerogen)、Fox(Vectura)或Innospire GO(Philips)；
无源筛孔雾化器，例如，MicroAir U22(Omron)或Smarty(Flaem)；
超声波雾化器，例如，My-520A(Fish)或Aerosonic Combineb(Flores)
软雾吸入器，例如，Trachospray(MedSpray)、Pulmospray(MedSpray)或Respimat(Boehriner Ingelheim)。
在本发明的上下文中，用于气溶胶形成的悬浮制剂优选地使用振动筛孔雾化器或软雾吸入器，更优选地使用软雾吸入剂进行雾化。
在仍进一步的方面，本发明提供了如上所讨论的用于制备根据本发明的气溶胶的方法，所述方法包括雾化根据本发明的用于气溶胶形成的悬浮制剂的步骤。
已经发现，根据本发明的悬浮制剂可以在延长的时间段内有效且连续地雾化，而不会损失悬浮制剂和气溶胶液滴中包含的纳米颗粒的质量(例如，通过颗粒的聚集)。因此，可以提供有效剂量的核酸作为包含在纳米颗粒中的活性剂，并以气溶胶的形式在合理的时间量内施用，诸如60分钟或更短，优选地30分钟或更短。
存在于用于本发明的上下文中的脂质或类脂质纳米颗粒中的核酸，诸如RNA，优选地mRNA，在医学环境以及疾病和病症的治疗中特别有用，特别是在基于核酸的疗法中。因此，用于气溶胶形成的悬浮制剂和根据本发明的气溶胶通常作为药物或作为药物组合物提供或使用。
特别地，用于气溶胶形成的悬浮制剂和根据本发明的气溶胶适用于施用至受试者。以这种方式，悬浮制剂和气溶胶的纳米颗粒中所包含的核酸，诸如RNA，优选地mRNA，也可以施用至受试者。组合物的优选施用途径是施用气溶胶，该气溶胶是通过将根据本发明的悬浮制剂雾化至呼吸道或经由呼吸道——特别地，肺部施用或鼻腔施用——提供的。通常，气溶胶由被施用气溶胶的受试者吸入。
通过施用至受试者的，脂质或类脂质纳米颗粒中所包含的核酸可以在呼吸道中或通过呼吸道递送到靶细胞。术语“递送到靶细胞”优选地是指将核酸转移到细胞中。
因此，本发明还提供了用作药物的水性悬浮制剂，其中悬浮制剂将被雾化，并且通过雾化提供的气溶胶将被施用至受试者。同样地，本发明提供了根据本发明的气溶胶用作药物。
水性悬浮制剂或气溶胶可以以合适的剂量施用至受试者。剂量方案将由主治医师和临床因素决定。如医学领域中众所周知的，任何一个受试者的剂量取决于许多因素，包括受试者大小、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、总体健康情况以及同时施用的其他药物。治疗活性物质的典型剂量可以是，例如，在1ng至几克的范围内。用于表达或用于抑制表达的核酸的剂量应当对应于该范围；然而，特别是考虑到上述因素，设想低于或高于该示例性范围的剂量。通常，作为药物组合物的定期施用的方案应在每天每公斤体重0.01μg至10mg单位的范围内。可以通过定期评估来监测进展。剂量会有所不同，但作为本发明组合物组分的核酸施用的优选剂量是核酸分子的大约1010-1019个拷贝。
本发明还可用的是一种治疗方法，其包括根据本发明的水性悬浮制剂的雾化，以及将通过雾化提供的气溶胶施用到受试者的呼吸道或经由受试者呼吸道施用通过雾化提供的气溶胶，优选地经由肺部施用或鼻腔施用。因此，包含在所述悬浮制剂中的核酸可以引起预防或治疗效果。值得注意的是，术语“受试者”包括动物和人类。同样地，本发明提供了一种治疗方法，其包括将根据本发明的气溶胶施用到受试者至受试者的呼吸道或者经由受试者的呼吸道施用根据本发明的气溶胶到受试者，优选地经由肺部施用或鼻腔施用。如上所述，气溶胶通常由被施用气溶胶的受试者吸入。
通过向受试者施用本发明的水性悬浮制剂或气溶胶，可以治疗或预防疾病或病症。术语“疾病”是指可以通过使用本发明的水性悬浮制剂或气溶胶来治疗、预防或接种疫苗的任何可能的病理状况。优选地，待治疗或预防的疾病是肺部疾病。所述疾病可以例如是遗传性的、获得性的、感染性的或非感染性的、年龄相关的、心血管的、代谢性的、肠道的、肿瘤性的(特别是癌症)或基因的。例如，疾病可以基于生物体内生理过程、分子过程、生化反应的不规则性，而这些又可以基于例如生物体的遗传设备、行为、社会或环境因素，诸如暴露于化学品或辐射。
因此，本发明进一步提供了本发明的水性悬浮制剂用于通过基于核酸的疗法来治疗或预防疾病或病症，其中治疗或预防包括悬浮制剂的雾化和将通过雾化提供的气溶胶施用到呼吸道或经由呼吸道施用通过雾化提供的气溶胶，优选地通过肺部施用或鼻腔施用。同样地，本发明提供了本发明的气溶胶用于通过基于核酸的疗法来治疗或预防疾病或病症，其中治疗或预防包括将气溶胶施用到呼吸道或经由呼吸道施用气溶胶，优选地经由肺部施用或鼻腔施用。如上所述，气溶胶通常由被施用气溶胶的受试者吸入。
在优选的实施方式中，本发明进一步提供了本发明的水性悬浮制剂用于治疗或预防肺部疾病，其中治疗或预防包括悬浮制剂的雾化和将雾化提供的气溶胶施用到呼吸道或经由呼吸道施用雾化提供的气溶胶，优选地通过肺部施用或鼻腔施用。同样地，本发明提供了如上所公开的气溶胶，包括其优选实施方式，用于治疗或预防肺部疾病，其中治疗或预防包括将气溶胶施用到呼吸道或经由呼吸道施用气溶胶，优选地经由肺部施用或鼻腔施用。如上所述，气溶胶通常由被施用气溶胶的受试者吸入。
本文中使用的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”通常是指在人体或动物体内获得所需的药理学和/或生理学效果。因此，本发明的治疗可以涉及某种疾病的(急性)状态的治疗，但也可以涉及在完全或部分预防疾病或其症状方面的预防性治疗。优选地，术语“治疗”应理解为在部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的不良影响和/或症状方面是有治疗性的。在这方面，“急性”是指受试者显示疾病症状。换言之，待治疗的受试者实际需要治疗，本发明上下文中的术语“急性治疗”涉及在疾病发作或疾病爆发后实际治疗疾病所采取的措施。治疗也可以是预防性或防治性治疗，即，为疾病预防而采取的措施，例如，为了预防感染和/或疾病的发作。治疗进展可以通过定期评估进行监测。
通常地，核酸以有效量包含在根据本发明的悬浮制剂和气溶胶中。术语“有效量”是指足以在待施用药物组合物的受试者中诱导可检测的治疗反应的量。根据上述，核酸的含量不受限制，只要其可用于如上所述的治疗。如上所述，用于气溶胶形成的组合物或气溶胶——其中含有包含核酸的颗粒，优选地含有一定量的颗粒，以便提供基于组合物的总体积浓度为0.01至50mg/ml，更优选地0.02至30mg/ml，并且最优选地0.05至10mg/ml的包含在颗粒中的核酸。
示例性受试者包括哺乳动物，诸如狗、猫、猪、牛、绵羊、马、啮齿动物，例如，大鼠、小鼠和豚鼠，或者灵长类动物，例如，大猩猩、黑猩猩和人类。在最优选的实施方式中，受试者是人。
如上所述，根据本发明的悬浮制剂和气溶胶可用于通过基于核酸的疗法进行治疗或预防。例如，基于核酸的疗法用于治疗或预防上表A中所述的疾病或病症。
本发明的悬浮制剂和气溶胶特别适合用于治疗或预防肺部疾病。作为示例性疾病，哮喘、表面活性剂代谢功能障碍、表面活性蛋白B(SPB)缺乏、ATP结合盒亚家族A成员3(ABCA3)缺乏、囊性纤维化、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏；肺癌、表面活性蛋白C(SPC)缺乏、肺泡蛋白沉积症、结节病、急性和慢性支气管炎、肺气肿、麦氏综合征、慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管哮喘、支气管扩张、尘肺病、石棉肺、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、婴儿呼吸窘迫综合征(IRDS)、肺水肿、肺嗜酸性粒细胞增多症、Loffler肺炎、Hamman-Rich综合征、特发性肺纤维化、间质性肺部疾病、原发性纤毛运动障碍、肺动脉高压(PAH)和STAT5b缺乏、凝血缺陷，尤其是血友病A和B；补体缺陷，尤其是蛋白C缺乏、血栓性血小板减少性紫癜和先天性血色素沉着症，尤其是铁调素缺乏；肺部传染病，优选地呼吸道合胞病毒(RSV)感染、副流感病毒(PIV)感染、流感病毒感染、鼻病毒感染、严重急性呼吸综合征、冠状病毒(SARS-CoV)感染、肺结核、铜绿假单胞菌感染、洋葱伯克霍尔德菌感染、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染以及流感嗜血杆菌感染。
然而，应当理解，用于气溶胶制剂的水性悬浮制剂可以从呼吸组织异位到身体中的其他组织或器官，并且可以转染所述远处组织或器官中的细胞。类似地，用于气溶胶制剂的悬浮制剂中包含的由mRNA编码的蛋白质可以从呼吸组织异位到身体中的其他组织或器官，并且可以在所述远处组织或器官中具有治疗作用。
在其他示例性实施方式中，本发明的组合物和气溶胶可用于基于核酸的疗法治疗或预防溶酶体疾病，如戈谢病、法布里病、MPS I、MPS II(亨特综合征)、MPS VI和糖原储存性疾病，例如糖原储存病I型(冯-吉尔克氏(von Gierecke)病)、II型(庞贝氏病)、III型(科里氏病)、IV型(安德森病)、V型(麦卡德尔病)、VI型(赫氏病)、VII型(陶里病)、VII型、IX型、X型、XI型(范可尼-比克尔综合征)、XI型或0型。转录物替代疗法/酶替代疗法有益地不会影响潜在的遗传缺陷，但会增加受试者缺乏的酶的浓度。例如，在庞贝氏病中，转录物替代疗法/酶替代疗法替代了有缺陷的溶酶体酶酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)。
根据进一步的实例，根据本发明的基于核酸的疗法可用于治疗癌症、心血管疾病、病毒感染、免疫功能障碍、自身免疫性疾病、神经系统疾病、遗传性代谢紊乱或遗传性疾病或细胞中产生的蛋白质或蛋白质片段可能对患者具有有益效应的任何疾病。癌症的实例包括头颈癌、乳腺癌、肾癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、骨癌、脑癌、宫颈癌、肛门癌、结肠癌、结直肠癌、阑尾癌、眼癌、胃癌、白血病、淋巴瘤、肝癌、皮肤癌、卵巢癌、阴茎癌、胰腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、阴道癌、外阴癌、子宫内膜癌、心脏癌症和肉瘤。心血管疾病的实例包括动脉粥样硬化、冠心病、肺心病和心肌病。免疫功能障碍和自身免疫性疾病的实例包括但不限于风湿病、多发性硬化症和哮喘。病毒感染的实例包括但不限于人类免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒以及乙型和丙型肝炎病毒感染。神经系统疾病的实例包括但不限于帕金森病、多发性硬化症和痴呆症。遗传性代谢紊乱的实例包括但不限于戈谢病和苯丙酮尿症。
在本说明书中，引用了包括专利申请和制造商手册在内的许多文件。这些文件的公开虽然被认为与本发明的专利性无关，但通过引用将其全部并入本文。更具体地说，所有引用的文件都是通过引用并入的，就好像每个单独的文件都被明确和单独地指示通过引用并入一样。
实施例
缩写 描述
LNP 脂质纳米颗粒或类脂质纳米颗粒
mRNA 信使核糖核酸
N/P 载体胺氮与mRNA磷酸比率
P188 泊洛沙姆188
RT 室温
稳定的非免疫原性信使核糖核酸
w/o 无
PdI 多分散性指数
eGFP 增强绿色荧光蛋白
1.实验1-不同赋形剂雾化后的纳米颗粒质量
1.1材料和方法
1.1.1纳米颗粒制备
类脂质纳米颗粒由阳离子类脂质(dL_05(R)，方案1)、辅助脂质DPPC(1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，Avanti Polar Lipids)和胆固醇(Avanti Polar Lipids)以及PEG脂质DMG-PEG2k(1,2-双肉豆蔻酰-sn-甘醇甲氧基(聚乙二醇)-2000，Avanti PolarLipids)分别以摩尔比8/5.29/4.41/0.88配制。合并浓度分别为50、20、20和20mg/mL的在HPLC级乙醇中的适当体积的脂质储备溶液。配制过程通过快速溶剂交换进行。使用NanoAssembler台式机(Precision NanoSystems)将乙醇中的脂质混合物与柠檬酸盐缓冲液(10mM柠檬酸，150mM NaCl，pH 4.5)中的mRNA以1:4的体积比混合。所得制剂的mRNA浓度为0.2mg/mL，N/P比为8。在RT下温育30分钟后，通过切向流过滤(KR2i-TFF系统，Repligen)使用50kDa过滤模块(mPES，Repliger)纯化和浓缩制剂，其中50mM NaCl作为稀释和渗滤缓冲液。使用0.8μm和0.2μm注射器过滤器进行生物负载减少和最终无菌过滤。
方案1：dL_05(R)的化学结构
1.1.2纳米颗粒与赋形剂的混合
表3列出了本实验中使用的赋形剂。赋形剂的稀释液以2％(w/v)赋形剂在10％(w/w)蔗糖、50mM NaCl中制备。随后在蔗糖/NaCl缓冲液中连续稀释产生0.2％、0.02％和0.002％(w/v)的赋形剂浓度。就在雾化之前立即将纳米颗粒与相应赋形剂以相等体积混合。
表1：筛选实验中使用的赋形剂列表
材料 供应商
吐温20 Sigma(Merck)
吐温80 Sigma(Merck)
泊洛沙姆188(Pluronic F-68) Sigma-Aldrich
泰洛沙泊 Sigma(Merck)
VitE-PEG1000(D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯) Sigma(Merck)
1.1.3雾化
纳米颗粒的雾化是在eFlow雾化器(Pari)中进行的。在RT下进行完全雾化，并且测量直到完全雾化的时间。通过在室温下允许在样品管中冷凝来收集气溶胶。
1.1.4复合物尺寸和PdI的测量
使用带有自动衰减器的Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)通过动态光散射(DLS)测量纳米颗粒的流体动力学直径(Z平均值，尺寸)和多分散性指数(PdI)，并报告为强度颗粒尺寸分布。在25℃下在未稀释的情况下测量样品。
1.2结果
该实验组旨在比较不同类别的添加剂在雾化后提高纳米颗粒的颗粒质量的能力。如参考文献中的数据(不含赋形剂，图1“w/o”)所示，纳米颗粒的雾化导致尺寸(流体动力学直径，Z平均值)和多分散性指数(PdI)的不希望的增加。通过添加某些赋形剂实现了颗粒总体尺寸和PdI的显著改善。图1显示了在1％赋形剂、10％(w/v)蔗糖、50mM NaCl中以0.5mg/mL的mRNA浓度雾化1mL之前和之后的纳米颗粒制剂的尺寸和PdI。
2.实验2-在赋形剂存在下的纳米颗粒稳定性
2.1材料和方法
2.1.1纳米颗粒制备
见1.1.1
2.1.2纳米颗粒与赋形剂的混合
表4列出了本实验中使用的赋形剂。赋形剂的稀释液以20％(w/v)赋形剂在10％(w/w)蔗糖、50mM NaCl中制备。
表2：赋形剂清单
材料 供应商
吐温20 Sigma(Merck)
吐温80 Sigma(Merck)
泊洛沙姆188(Pluronic F-68) Sigma-Aldrich
泰洛沙泊 Sigma(Merck)
VitE-PEG1000(D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯) Sigma(Merck)
2.1.3包封效率的测量
为了测定包封效率，将所有样品在注射用水中稀释至4μg/mL。对于“处理的样品”，将50μL的每个样品和作为空白对照的水与在2％(v/v)Triton-X-100中2.67mg/mL肝素在70℃下在96孔板中温育15分钟，然后冷却至室温。对于“未处理的样品”，用50μL注射用水稀释50μL的每个样品和作为空白对照的水。将100μL在1x TE缓冲液(在二乙基焦碳酸酯(DEPC)处理水中的10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH 7.5)中的100倍稀释的RiboGreen(Quant iTTM RNA测定试剂盒，ThermoFisher)试剂加入每个孔中，并在RT下避光温育5min。分别在785/535nm的激发/发射波长下，在Tecan平板读取器上测量荧光强度。包封效率表示为(100％-([发射“未处理的样品”]-[发射“未处理的空白”])/([发射“处理的样品”]-[发射“处理的空白”])*100％)。
2.2结果
为了允许使用赋形剂作为雾化过程的稳定剂，它应该对纳米颗粒本身没有负面影响。为了测试在存在不同赋形剂浓度的情况下进行使用稳定性研究。为此，将悬浮液在室温下储存6小时。测量包封效率，表明颗粒完整性。数据如图2所呈现，该图显示了在x％(w/v)赋形剂、10％(w/w)蔗糖、50mM NaCl中mRNA浓度为2.5mg/mL的纳米颗粒制剂的包封效率。在混合后6小时记录数据。
2.3讨论和结论
在泰洛沙泊、吐温20和吐温80存在的情况下，包封效率随着赋形剂浓度的增加而降低，表明纳米颗粒完整性的丧失。相比之下，泊洛沙姆被该制剂很好地接受。在所有测试的泊洛沙姆浓度下，颗粒在6h时间段内保持完整。
3.实验3-在泊洛沙姆存在下以2.5mg/mL的纳米颗粒雾化
3.1材料和方法
3.1.1纳米颗粒制备
参见第1.1.10节。
3.1.2赋形剂的添加
就在雾化前立即加入泊洛沙姆(储备浓度：在50mM NaCl中的10％(w/v)蔗糖中的20％(w/v)P188)。
3.1.3雾化
参见第1.1.3节。
3.1.4复合物尺寸和PdI的测量
参见第1.1.4节
3.1.5包封效率的测量
参见第2.1.3节
3.1.6mRNA完整性的测量
使用片段分析仪(Agilent Technologies)通过毛细管凝胶电泳测定纳米颗粒中mRNA的完整性。在6μg/μL肝素(Sigma-Aldrich)、0.2％(v/v)Triton-X-100和50％(v/v)甲酰胺中，在0.05mg/mL的mRNA浓度下进行mRNA从纳米颗粒的释放。将样品在70℃、300rpm下温育15min(Thermomixer，Eppendorf)。对mRNA参照物进行相应处理。对于样品分析，将处理的纳米颗粒和mRNA在稀释剂标记(标准灵敏度RNA稀释剂标记(15nt)，Agilenttechnologies)中以1:4稀释。
3.2结果
在实验1中，已经证明1％(w/v)的赋形剂能够在雾化期间稳定纳米颗粒。实验2表明，与其他测试的赋形剂相比，泊洛沙姆对纳米颗粒的稳定性没有负面影响。在该实验中，评估了稳定具有2.5mg/mL的mRNA浓度的纳米颗粒溶液所需的泊洛沙姆浓度，测试了范围为1％至5％(w/v)的P188浓度。为此目的，制备相应浓度的1mL样品，通过eFlow雾化器(Pari)雾化，并与相同浓度的未处理样品进行比较。图3显示了在不同泊洛沙姆浓度情况下雾化前(未处理)和雾化后2.5mg/mL的1mL纳米颗粒悬浮液的生物物理特性：(a)尺寸，(b)：包封效率，(c)相对mRNA完整性。
3.3讨论和结论
结果表明，在1-5％(w/v)赋形剂的宽浓度范围内，泊洛沙姆将在2.5mg/mL的核酸浓度下制剂稳定。颗粒尺寸、包封效率以及mRNA完整性这三个最关键的质量属性不受雾化过程的影响。
4.实验4-25mg的雾化
4.1材料和方法
4.1.1纳米颗粒制备
参见第1.1.1节。
4.1.2添加泊洛沙姆
参见第3.1.2节。
4.1.3雾化
参见第1.1.3节。
4.1.4复合物尺寸和PdI的测量
参见第1.1.4节。
4.1.5包封效率的测量
参见第2.1.3节。
4.1.6mRNA完整性的测量
参见第3.1.6节。
4.2结果
在这个实验期间，测试了更大体积的纳米颗粒溶液的雾化，因为这对药物的雾化来说是一个额外的挑战。以5％(w/v)的泊洛沙姆浓度雾化浓度为2.5mg/mL的10mL体积(装置的最大填充)配制的mRNA。每5分钟收集气溶胶并进行分级。对馏分进行生物物理性质分析。以大约0.3mL/min的平均输出速率雾化该体积。最后，大约500μL的制剂保留在雾化器的储液器中。图4显示了在5％泊洛沙姆(缓冲液：5％(w/v)P188，10％(w/v)蔗糖，50mM NaCl)存在下，mRNA浓度为2.5mg/mL的10mL制剂的分级气溶胶的生物物理表征结果：(a)尺寸，(b)PdI，(c)包封效率和(d)相对mRNA完整性随雾化时间的变化。
4.3讨论和结论
在收集的馏分中，颗粒尺寸以及PdI保持稳定(图4a和b)。包封效率始终高于95％(图4c)，mRNA完整性保持未受影响(图4d)。因此，添加5％(w/v)的泊洛沙姆能够在30min内雾化10mL浓缩制剂(2.5mg/mL)，这在没有泊洛沙姆的情况下是无法实现的。
5.实验5-泊洛沙姆对气溶胶制剂体外功能的影响
5.1材料和方法
5.1.1纳米颗粒制备
参见第1.1.1节，使用eGFP编码mRNA
5.1.2添加泊洛沙姆
参见第3.1.2节。
5.1.3雾化
参见第1.1.3节。
5.1.4复合物尺寸和PdI的测量
参见第1.1.4节。
5.1.5包封效率的测量
参见第2.1.3节。
5.1.6mRNA完整性的测量
参见第3.1.6节。
5.1.7细胞培养和转染
将16HBE14o-细胞在I型胶原(Corning)包被的烧瓶(Corning)中在补充有热灭活的胎牛血清(FBS，Thermo FisherScientific)和青霉素/链霉素(Pen/Strep,GibcoTM,Thermo Fisher Scientific)的MEM+(Thermo Fisher Scientific)GlutaMaxTM(GibcoTM，Thermo Fisher Science)中在37℃、5％ CO2下培养。为了产生气液界面培养物(ALI)，将细胞在24孔板中I型胶原(Corning)包被的插入物顶端侧以250μL接种(2.4x105个细胞/mL)。在基底侧添加500μL培养基，并且将细胞温育72小时以允许附着。转染前24小时，交换基底孔中的培养基，并去除顶端侧的培养基。用注射用水洗涤后进行转染，在ALI培养物的顶端侧添加25μL的相应LNP剂量，并在37℃、5％CO2下温育6小时。转染完成后，用200μL PBS(-/-，GibcoTM，Thermo Fisher Scientific)洗涤细胞层，并进一步保持为ALI培养物。
5.1.8ALI裂解物中eGFP的定量
转染后24小时，裂解细胞以定量细胞内EGFP。ALI插入物用200μL PBS(-/-，GibcoTM，Thermo Fisher Scientific)从顶端侧洗涤，500μL从基底侧洗涤。吸取PBS，并用补充有蛋白酶抑制剂(cOmpleteTM，不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物，Roche)的100μLTriton X-100裂解缓冲液(0.25M TRIS-HCl(Carl Roth),1％Triton-X-100(Sigma-Aldrich),pH 7.8)代替。将插入物在室温下在600rpm的摇动平台上温育20分钟。通过向上和向下移液数次收集裂解物，并在-80℃下储存，直到进行分析。GFP SimpleStep 试剂盒(Abcam ab171581)用于量化细胞裂解物中的eGFP水平。
5.2结果
作为稳定纳米颗粒的赋形剂，赋形剂不应对其将mRNA转运到细胞中导致编码蛋白表达的效率产生负面影响。因此，在雾化前后在泊洛沙姆和吐温-80存在下测试纳米颗粒的转染效率。在制剂中使用编码eGFP蛋白的mRNA，允许定量产生的蛋白质。结果如图5所呈现，其显示了在5％(w/v)赋形剂(泊洛沙姆或吐温-80)存在下雾化之前(未处理)和雾化之后，用包封eGFP mRNA的纳米颗粒转染16HBEo-ALIs后24小时细胞裂解物中的eGFP水平。虚线：用不含赋形剂的纳米颗粒转染后的参考eGFP水平。
5.3讨论和结论
添加吐温-80作为雾化赋形剂导致转染效率的强烈降低。这种作用与雾化过程无关，因此可归因于赋形剂本身的存在。相反，泊洛沙姆的添加对转染效率没有影响。雾化之前和之后的蛋白质水平与在不存在赋形剂的情况下用相同纳米颗粒转染后的水平相当。
6.实验6-泊洛沙姆对mRNA纳米颗粒的体内效率的影响
6.1材料和方法
6.1.1纳米颗粒制备
参见第1.1.1节。
6.1.2添加泊洛沙姆
参见第3.1.2节。
6.1.3雾化
参见第1.1.3节。
6.1.4复合物尺寸和PdI的测量
参见第3.1.4节。
6.1.5包封效率的测量
参见第2.1.3节。
6.1.6mRNA完整性的测量
参见第3.1.6节。
6.1.7动物安置
小鼠在特定的无病原体条件下(根据2017年年度健康和卫生调查，设施对任何FELSA列出的病原体的检测结果均为阴性)被安置在单独通风的笼子里，处于昼夜节律的光照周期下(从早上7点到晚上7点开灯)。随意提供食物和饮用水。到达后，给动物至少7天的适应期，直到它们进入研究。
6.1.8气管内灌注
通过吸入含有4％异氟醚(Isohesia，Henry Shine)的纯氧来麻醉动物。使用缩短至37mm的20G导管对无意识的动物进行插管。将最终体积为50μL的制剂作为一滴施加在导管近端，从而在动物的生理吸气运动中吸入。最后，施加150μL的空气，以完全排空导管。
6.1.9安乐死和尸检
通过腹膜内注射芬太尼/咪唑安定/美托咪定(0.05/5.0/0.5mg/kg体重)使动物处于完全麻醉状态。随后，小鼠通过颈椎脱位杀死。从中轴线处打开腹腔。为了肺的移出，通过右心室注射5mL PBS冲洗小循环。随后，从心肺块中解剖出心脏。移出肺，并在干冰上快速冷冻。
6.1.10肺匀浆中eGFP的定量
为了定量eGFP，称重冷冻肺并将整个器官匀浆。使用填充有500μL裂解缓冲液(0.25MTRIS(Carl Roth)，0.1％Triton X-100(Carl Roth)，pH 7.8)的裂解基质D(MPBiomedicals)均化管。在组织匀浆器(MP FastPrep-24组织和细胞匀浆器)中进行3x20秒的匀浆。随后，将裂解物在冰上温育10min，并在4℃(Mikro 22R离心机，HettichZentrifugen)以20.000x g离心10min。使用GFP SimpleStep 试剂盒(Abcamab171581)对eGFP进行定量。eGFP水平与肺重量相关，并以ng蛋白/g组织报道。
6.2结果
为了用作用于稳定用作药物的纳米颗粒的赋形剂，赋形剂不应负面影响这些纳米颗粒在体内的转染效率。在该研究期间，在赋形剂存在下，在小鼠体内i.t.应用后测量纳米颗粒的转染效率。通过在处理后24小时对mRNA编码的eGFP进行定量来确定效率。图6显示了在存在和不存在泊洛沙姆的情况下用三种不同剂量处理的结果，特别是在不含(w/o)和含有赋形剂的情况下的10％(w/v)蔗糖、50mM NaCl中的纳米颗粒i.t.滴注时的eGFP水平。
6.3讨论和结论
在存在和不存在相应剂量水平的泊洛沙姆的情况下，在小鼠肺中测量的eGFP水平是相等的。对生成的数据的分析得出结论：泊洛沙姆对体内纳米颗粒的转染效率没有负面影响。
7.实验7-在纳米颗粒下游加工期间添加泊洛沙姆提高纳米颗粒质量
7.1材料和方法
7.1.1纳米颗粒制备
参见第1.1.1节。
7.1.2复合物尺寸和PdI的测量
参见第1.1.4节。
7.2结果
在通过溶剂交换形成络合物之后，必须去除该步骤所需的缓冲组分(EtOH和柠檬酸)。该步骤以及制剂浓度调节的标准程序是切向流过滤。在该处理期间，纳米颗粒经历导致颗粒质量损失(例如，聚集)的应力条件。在该实验期间，在该工艺步骤期间使用泊洛沙姆来稳定纳米颗粒。为此目的，在标准条件下配制纳米颗粒。在TFF处理之前，在一组中以0.5％(w/v)的浓度添加泊洛沙姆。颗粒的质量通过测量混合后和处理后的颗粒尺寸来确定。图7显示了在存在或不存在泊洛沙姆的情况下雾化处理之前和之后纳米颗粒制剂的尺寸和PdI。
7.3讨论和结论
如图7所示，在不存在泊洛沙姆的情况下，TFF处理期间，颗粒尺寸以及多分散性增加，表明颗粒聚集。在泊洛沙姆存在的情况下，颗粒尺寸以及多分散性在处理期间保持稳定。因此，在纳米颗粒的处理期间，泊洛沙姆的添加明显改善了颗粒质量。
8.实验8-在不存在和存在泊洛沙姆的情况下雾化后基于ICE的纳米颗粒的纳米颗 粒质量
8.1材料和方法
8.1.1纳米颗粒制备
脂质纳米颗粒由阳离子脂质(ICE(咪唑胆固醇酯))、辅助脂质DOPE(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，Avanti Polar lipids)和PEG脂质DMG-PEG2k(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油甲氧基(聚乙二醇)-2000，Avanti Polar lipids)分别以摩尔比60/35/5配制。合并在10mg/mL的HPLC级乙醇中的适当体积的脂质储备溶液。配制过程通过快速溶剂交换进行。使用NanoAssembler台式机(Precision NanoSystems)将乙醇中的脂质混合物与柠檬酸盐缓冲液(10mM柠檬酸，150mM NaCl，pH 4.5)中的mRNA以1:4的体积比混合。所得制剂的mRNA浓度为0.2mg/mL，N/P比为4。在RT下温育30min后，通过切向流过滤(KR2i-TFF系统，Repligen)使用100kDa过滤模块(mPES，Repliger)纯化和浓缩制剂，其中25mM NaCl作为稀释和渗滤缓冲液。使用0.8μm和0.2μm注射器过滤器进行生物负载减少和最终无菌过滤。
8.1.2赋形剂的添加
就在雾化前立即添加泊洛沙姆(储备浓度：在25mM NaCl中的20％(w/v)泊洛沙姆188)，产生在5％(w/v)泊洛沙姆188、25mM NaCl中浓度为0.5mg/mL的mRNA。
8.1.3雾化
参见第1.1.3节。
8.1.4复合物尺寸和PdI的测量
参见第1.1.4节。
8.2结果
实验1和3已表明，泊洛沙姆在雾化期间稳定了基于阳离子类脂质dL_05(R)的纳米颗粒。该实验组旨在测试添加泊洛沙姆是否也能在雾化期间保持基于不同的阳离子脂质(ICE)的其他常用纳米颗粒的颗粒质量。参考文献中的数据(不含赋形剂，图8“w/o”)表明，纳米颗粒的雾化导致尺寸(流体动力学直径，Z平均值)和多分散性指数(PdI)的增加。添加5％(w/v)的泊洛沙姆防止这种影响并保持颗粒质量。图8显示了在使用或不使用泊洛沙姆雾化之前和之后，mRNA浓度为0.5mg/mL的1mL纳米颗粒悬浮液的尺寸和PdI。
8.3讨论和结论
泊洛沙姆的存在在雾化期间也稳定基于阳离子脂质ICE的脂质纳米颗粒，并防止尺寸(流体动力学直径，Z平均值)和多分散性指数(PdI)的增加。
9.实验9-在不存在和存在泊洛沙姆的情况下雾化之后基于DLin-MC3-DMA的纳米 颗粒的纳米颗粒质量
9.1材料和方法
9.1.1纳米颗粒制备
脂质纳米颗粒由阳离子脂质(DLin-MC3-DMA)、辅助脂质DSPC(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，Avanti Polar Lipids)和胆固醇(Avanti Polar Lipids)以及PEG脂质DMPE-PEG2k(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇2000、Avanti PolarLipids)分别以摩尔比50/10/38.5/1配制。合并10mg/mL的HPLC级乙醇中的适当体积的脂质储备溶液。配制过程通过快速溶剂交换进行。使用NanoAssembler台式机(PrecisionNanoSystems)将乙醇中的脂质混合物与柠檬酸盐缓冲液(50mM柠檬酸，160mM NaCl，pH 3)中的mRNA以1:3的体积比混合。所得制剂的mRNA浓度为0.2mg/mL，N/P比为3。在RT下温育30min后，通过切向流过滤(KR2i-TFF系统，Repligen)使用100kDa过滤模块(mPES，Repliger)纯化并浓缩制剂，其中PBS作为稀释液和渗滤缓冲液。使用0.8μm和0.2μm注射器过滤器进行生物负载减少和最终无菌过滤。
9.1.2赋形剂的添加
就在雾化之前立即添加泊洛沙姆(储备浓度：在PBS中的20％(w/v)泊洛沙姆188)，产生PBS中5％(w/v)泊洛沙姆188中浓度为0.5mg/mL。
9.1.3雾化
参见第1.1.3节。
9.1.4复合物尺寸和PdI的测量
参见第1.1.4节。
9.2结果
实验1和3已表明，泊洛沙姆在雾化期间稳定了基于阳离子类脂质dL_05(R)的纳米颗粒。该实验组旨在测试添加泊洛沙姆是否也能在雾化期间保持其他常用纳米颗粒的颗粒质量。选择基于阳离子脂质DLin-MC3-DMA的描述良好的纳米颗粒作为模型。在不存在赋形剂的情况下(不存在泊洛沙姆，图9“w/o”)，纳米颗粒的雾化导致尺寸(流体动力学直径，Z平均值)和多分散性指数(PdI)的增加。添加5％(w/v)的泊洛沙姆防止这种影响并保持颗粒质量。图9显示了在使用或不使用泊洛沙姆雾化之前和之后，0.5mg/mL的1mL纳米颗粒悬浮液的尺寸和PdI。
9.3讨论和结论
泊洛沙姆的存在在雾化期间稳定了基于阳离子脂质DLin-MC3-DMA的脂质纳米颗粒。泊洛沙姆的添加防止了尺寸(流体动力学直径，Z平均值)和多分散性指数(PdI)的增加。
附图说明
图1显示了在1％赋形剂、10％(w/v)蔗糖、50mM NaCl中以0.5mg/mL的mRNA浓度雾化1mL之前和之后的纳米颗粒制剂的尺寸和PdI。
图2显示了在x％(w/v)赋形剂、10％(w/v)蔗糖和50mM NaCl中mRNA浓度为2.5mg/mL的纳米颗粒制剂的包封效率。在混合后6小时记录数据。
图3显示了在不同泊洛沙姆浓度情况下雾化前(未处理)和雾化后2.5mg/mL的1mL纳米颗粒悬浮液的生物物理特性：(a)尺寸，(b)：包封效率，(c)相对mRNA完整性。
图4显示了在5％泊洛沙姆(缓冲液：5％(w/v)P188，10％(w/v)蔗糖，50mM NaCl)存在下，mRNA浓度为2.5mg/mL的10mL制剂的分级气溶胶的生物物理表征结果：(a)尺寸，(b)PdI，(c)包封效率和(d)相对mRNA完整性随雾化时间的变化。
图5显示了在5％(w/v)赋形剂(泊洛沙姆或吐温-80)存在下雾化之前(未处理)和雾化之后，用包封eGFP mRNA的纳米颗粒转染16HBEo-ALIs后24小时细胞裂解物中的eGFP水平。虚线：用不含赋形剂的纳米颗粒转染后的参考eGFP水平。
图6显示了在不含(w/o)和含有赋形剂的情况下的10％(w/v)蔗糖、50mM NaCl中的纳米颗粒i.t.滴注时的eGFP水平。
图7显示了在存在或不存在泊洛沙姆的情况下雾化处理之前和之后纳米颗粒制剂的尺寸和PdI。
图8显示了在存在或不存在5％(w/v)泊洛沙姆的情况下，以0.5mg/mL的mRNA浓度雾化1mL之前和之后纳米颗粒制剂(其中ICE作为阳离子脂质)的尺寸和性质。
图9显示了在存在或不存在5％(w/v)泊洛沙姆的情况下，以0.5mg/mL的mRNA浓度雾化1mL之前和之后的纳米颗粒制剂(其中DLin-MC3-DMA作为阳离子脂质)的尺寸和PdI。

Claims (16)

1.一种用于气溶胶形成的水性悬浮制剂，所述悬浮制剂包含悬浮在水性载体溶液中的脂质或类脂质纳米颗粒，
其中所述脂质或类脂质纳米颗粒包含以下组分(a)和(b)：
(a)核酸；和
(b)可离子化脂质或可离子化类脂质；
并且其中所述水性载体溶液包含三嵌段共聚物，所述三嵌段共聚物包含一个聚(环氧丙烷)嵌段和两个聚(环氧乙烷)嵌段。
2.根据权利要求1所述的悬浮制剂，其中基于所述悬浮制剂的总体积，所述核酸在所述悬液制剂中的浓度为0.01至10mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒具有如通过动态光散射所测定的在10至500nm范围内的Z平均直径。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒进一步包含以下组分(c1)至(c6)中的一种或多种：
(c1)具有甾醇结构的不可离子化脂质；
(c2)磷酸甘油酯脂质；
(c3)PEG缀合的脂质；
(c4)聚肌氨酸缀合的脂质
(c5)PAS化的脂质；和
(c6)阳离子聚合物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒包含：
30至65mol％的所述可离子化脂质或可离子化类脂质(b)以及以下组分中的一种或多种：
10至50mol％的具有甾醇结构的脂质(c1)，
4至50mol％的所述磷酸甘油酯脂质(c2)，
0.5至10mol％的所述PEG缀合的脂质(c3)、所述聚肌氨酸缀合的脂质(c4)和所述PAS化的脂质(c5)中的一种或其任意组合，
0.5至10mol％的所述阳离子聚合物(c6)，
使得(b)和(c1)至(c6)的总和等于100mol％。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的悬浮制剂，其中所述纳米颗粒包含以下式(b-1)的可离子化类脂质(b)，
其中：
a是1并且b是2至4的整数；或者a是2至4的整数并且b是1，
p是1或2，
m是1或2；n是0或1，且m+n≥2；和
R1A至R6A彼此独立地选自：氢；-CH2-CH(OH)-R7A、-CH(R7A)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7A、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7A；-CH2-R7A；-C(NH)-NH2；聚(乙二醇)链；和受体配体；其中R7A选自C3-C18烷基和具有一个C-C双键的C3-C18烯基；
条件是R1A至R6A中的至少两个残基选自-CH2-CH(OH)-R7A、-CH(R7A)-CH2-OH、-CH2-CH2-(C＝O)-O-R7A、-CH2-CH2-(C＝O)-NH-R7A和-CH2-R7A，其中R7A选自C3-C18烷基或具有一个C-C双键的C3-C18烯基；
或其质子化形式，其中包含在式(b-1)的化合物中的氮原子中的一个或多个被质子化以提供携带正电荷的化合物。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的悬浮制剂，其中所述三嵌段共聚物是A-B-A三嵌段共聚物，其包含一个式(p-1)的聚(环氧丙烷)嵌段B：
其中s是15至67，优选地20至40的整数，和
两个式(p-2)的聚(环氧乙烷)嵌段A：
其中，对于每个嵌段，r独立地为2至130，优选地50至100，并且更优选地60至90的整数。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的悬浮制剂，其包含基于所述悬浮制剂的总体积浓度为0.05至5％(w/v，在25℃的温度下)的所述三嵌段共聚物。
9.一种喷雾器，其包括隔室，其中包含根据权利要求1至8中任一项所述的用于气溶胶形成的水性悬浮制剂。
10.一种气溶胶，所述气溶胶包含分散在气相中的气溶胶液滴，其中所述气溶胶液滴包含脂质或类脂质纳米颗粒和用于所述纳米颗粒的水性载体溶液，
其中所述脂质或类脂质纳米颗粒包含以下组分(a)和(b)：
(a)核酸；和
(b)可离子化脂质或可离子化类脂质；
并且其中所述水性载体溶液包含三嵌段共聚物，其包含一个聚(环氧丙烷)嵌段和两个聚(环氧乙烷)嵌段。
11.根据权利要求10所述的气溶胶，其中所述气溶胶液滴的质量中值空气动力学直径(MMAD)在2至10μm的范围内。
12.根据权利要求11或12所述的气溶胶，其中所述纳米颗粒具有如通过动态光散射测定的在10至500nm范围内，更优选在10至250nm范围内，仍更优选在20至200nm范围内的Z-平均直径。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的气溶胶，其可通过雾化根据权利要求1至8中任一项所述的水性悬浮液制剂而获得。
14.根据权利要求1-8中任一项所述的水性悬浮液制剂，其用作药物，其中所述水性悬浮制剂将被雾化，并且通过雾化提供的所述气溶胶将被施用至受试者。
15.根据权利要求1-8中任一项所述的水性悬浮制剂，其用于通过基于核酸的疗法来治疗或预防疾病或病症，其中所述治疗或预防包含雾化所述水性悬浮制剂和将通过雾化提供的所述气溶胶施用至受试者的呼吸道或经由受试者的呼吸道施用通过雾化提供的所述气溶胶，优选地通过肺部施用或鼻腔施用。
16.根据权利要求15所述使用的水性悬浮制剂，其中所述待治疗或预防的疾病或病症是肺部疾病。
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