CN115708818B - 一种用于雾化吸入脂质纳米粒的通用型处方 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于雾化吸入脂质纳米粒的通用型处方，属于生物医药领域，处方包括：脂质纳米粒(LNP)分散体系和加入在所述LNP分散体系中的表面张力下降调节剂；LNP的粒度范围为70～160nm；表面张力下降调节剂在LNP分散体系的质量体积百分比在0.01～30％；本发明意外的发现在LNP分散体系中加入表面张力下降调节剂能增加LNP雾化剪切的耐受能力，解决了雾化的剪切力使得LNP在雾化前后粒度、分散度(PDI)和包封率(EE)稳定性差的问题，确保雾化吸入减轻病人痛苦的同时，实现高效递送。

Description

一种用于雾化吸入脂质纳米粒的通用型处方

技术领域

本发明涉及核酸递送领域，特别是一种用于雾化吸入脂质纳米粒的通用型处方。

背景技术

核酸药物通过调节目标基因的表达，达到预防和治疗疾病的目的。核酸药物具有高特异性、高效性的优势，并有望攻克现有靶点的成药局限性，具备治疗“不可靶向”、“不可成药”疾病的巨大潜力。然而，要想实现核酸药物的巨大潜能，高效安全的递送载体技术必不可少，尤其是需要解决针对器官/细胞特异性递送核酸治疗分子的关键技术难题，在提高核酸药物稳定性的同时，改善核酸药物的生物利用度和体内药代动力学性质。

目前，最有效的核酸药物递送载体是脂质纳米粒(LNP)，由可离子化脂质化合物、中性助脂质、结构脂质和PEG脂质等自组装形成，其中起关键作用的是可离子化脂质，其pKa一般介于5.5～6.8之间，这个特性让它在血清的环境中表面电荷基本为中性，有利于细胞将带有核酸片段的LNP整个吞进细胞内，形成胞内体(endosome)。一旦进入细胞后，胞内体的酸性环境使可离子化脂质的头部质子化并带正电荷，从而与胞内体的内膜融合，使目标核酸药物从胞内体中逃逸出来，进而通过表达目的蛋白或抑制靶基因的表达来发挥药效。

目前，已有多款核酸药物使用LNP作为递送载体获批并上市，其中包括：用于递送siRNA的Onpattro，通过静脉注射给药，LNP富集于肝部进行RNAi治疗；通过肌肉注射给药，预防新型冠状病毒SARS-CoV-2的mRNA疫苗等。核酸药物正为新一代药物研发带来变革。面对全球肆虐的新冠疫情，人们逐步认识到研发针对呼吸道疾病的有效防治手段(尤其是核酸变革性药物的研发)的重要性和必要性。然而，由于目前的核酸药物缺乏肺组织特异性的递送系统，针对肺部的疾病，包括肺纤维化、肺癌、哮喘、支气管疾病等，还没有可有效递送到肺部的核酸药物上市。此外，研究发现，对于类似于新冠这样的呼吸道传播疾病，采用模拟病毒感染的给药路径，即肺部吸入给药，不仅可以形成有效的系统免疫(产生lgG抗体)，而且还可以形成局部粘膜免疫(产生lgA抗体)，形成联合交叉保护效力。因此，吸入式核酸递送载体对于研发针对呼吸系统疾病的疫苗和药物显得尤为重要。

吸入式雾化制剂可以将药物直接递送到肺部，可以大大提高药物在肺部的富集浓度并减少系统毒性，是呼吸系统给药的先天优势。然而，吸入制剂研发特别是吸入式核酸LNP制剂，面临着可雾化性差的挑战，即因无法耐受雾化过程中的剪切破坏作用而导致雾化时核酸药物泄露、雾化后粒度和分散度(PDI，polydispersity index)明显增加、雾化后转染效率明显下降等，因此，研发雾化吸入型LNP核酸药物的首要关键是克服雾化过程对LNP的破坏作用。无论哪种雾化形式，包括压缩式雾化、超声波雾化、网式雾化、软雾剂和压力定量气雾剂等，雾化过程中，LNP均要经历剪切力的破坏作用，该剪切破坏作用会导致LNP粒度增大、PDI增大和因核酸分子泄露而引起的包封率(EE，encapsulation efficiency)下降，最终影响其转染效果。目前关于雾化吸入型LNP核酸药物的专利和文献寥寥无几，而且大部分的报道是通过改变LNP的四个组分配比，以筛选出雾化前后粒度、PDI和EE变化较小的处方。但他们筛选出的最佳处方中，雾化后的粒度通常都会增加至少一倍以上，EE至少下降一倍，结果并不理想。如何保证LNP可以耐受雾化时的剪切作用，实现雾化前后其结构的一致性和完整性，是市场急需解决的技术问题。

本发明通过提供一种通用型的处方，实现制备得到的LNP能够耐受雾化剪切力，可以使得LNP在雾化前后粒度、PDI和EE保持不变，突破了市场雾化吸入LNP无法耐受雾化剪切力，稳定性差的技术壁垒。且本处方适用于不同种类的LNP及不同配比的LNP，是一种通用型的方法。通过体内小鼠成像实验验证，使用该处方的LNP核酸药物相比于未使用该处方的LNP而言，可以实现肺部的有效沉积，使肺部基因转染效率提高了多个数量级。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于雾化吸入脂质纳米粒(LNP)的通用型处方，使得LNP可以耐受雾化过程中的剪切破坏作用，提高LNP在雾化过程中的稳定性，实现高效递送。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种用于雾化吸入LNP的通用型处方，在LNP分散体系中加入表面张力下降调节剂能增强LNP对雾化剪切的耐受能力。需要说明的是：只要是将表面张力下降调节剂加入LNP分散体系中用于增加LNP雾化剪切耐受能力，提高雾化前后粒度、PDI和EE一致性的化合物或组合物均在本发明的保护范围内，且都受本发明的启发。

前述的一种用于雾化吸入LNP的通用型处方，作为一种优选，包括：LNP分散体系和加入在所述LNP分散体系中的表面张力下降调节剂；所述LNP的粒度范围为70～160nm；所述表面张力下降调节剂在LNP分散体系中的质量体积百分比范围为0.01％～30％；需要说明的是：粒度分布在70～160nm之间的LNP可以更好的耐受雾化过程的破坏作用。

前述的一种用于雾化吸入LNP的通用型处方，LNP分散体系包括：LNP、体系溶液；所述LNP在其分散体系中的质量体积百分比范围为0.0025％～10％，所述体系溶液的浓度范围为0～1000mM。

前述的一种用于雾化吸入LNP的通用型处方，所述LNP分散体系包括：LNP、体系溶液、冻存保护剂；所述LNP在其分散体系中的质量体积百分比范围为0.0025％～10％，所述体系溶液的浓度范围为0～1000mM，所述冻存保护剂的质量体积百分比浓度范围为0％～20％；需要说明的是：LNP分散体系中可以包含冻存保护剂也可以不包含冻存保护剂。

前述的一种用于雾化吸入LNP的通用型处方，所述LNP按照摩尔比包括：可离子化脂质化合物：助脂质：结构脂质：聚合物缀合脂质＝30～60：5～40：20～40：0.1～15。需要说明的是：本发明的纳米粒子可以克服肺部递送所面临的生物学屏障和细胞内屏障，大量积累在肺部；其中聚合物缀合脂质的含量对LNP渗透到肺部细胞内部具有更深的研究价值，基于本发明的处方做的研究也都受本发明的启发。生物学屏障指：气管及肺泡组织上皮细胞的黏液层、黏膜纤毛和肺泡的表面活性物质等；细胞内屏障指由核酸自身的高负电性和较大的相对分子质量所造成的细胞摄取困难和溶酶体逃逸不足。

前述的一种用于雾化吸入LNP的通用型处方，作为一种优选，体系溶液包括：生理盐水、4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPEs缓冲液、三羟甲基氨基甲烷Tris缓冲液、Tris-EDTA缓冲液、磷酸PB和磷酸盐PBS缓冲液、Dulbecco's磷酸盐DPBS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硫酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、含吐温的Tris缓冲液TBST、含EDTA及其钠盐的缓冲液中的一种或几种的组合；需要说明的是此处的体系溶液并非穷举，只是一种优选，只要对体系渗透压或pH起到调节或缓冲作用的溶液均在本发明的保护范围内。

前述的一种用于雾化吸入LNP的通用型处方，表面张力下降调节剂包括：乙醇、丙二醇、苯乙醇、泊洛沙姆188(Poloxamer 188)、吐温-80(Tween-80或Polysorbate 80)、甘油中一种或几种的混合物；以上并非穷举，无论已知或未知的表面张力下降调节剂，只要是能够让分散体系表面张力下降的调节剂均在本发明的保护范围内。

前述的一种用于雾化吸入LNP的通用型处方，作为一种优选，表面张力下降调节剂为乙醇，乙醇在LNP分散体系的质量体积百分比范围为0.05～30％。

前述的一种用于雾化吸入LNP的通用型处方，作为一种优选，表面张力下降调节剂为丙二醇，丙二醇在LNP分散体系的质量体积百分比范围为0.05～30％。

前述的一种用于雾化吸入LNP的通用型处方，作为一种优选，所述表面张力下降调节剂为丙二醇和乙醇的组合物，丙二醇在LNP分散体系的质量体积百分比范围为0.05～30％，乙醇在LNP分散体系的质量体积百分比范围为0.05～30％。

前述的一种用于雾化吸入LNP的通用型处方，作为一种优选，表面张力下降调节剂为泊洛沙姆188，泊洛沙姆188在LNP分散体系的浓度范围为0.5～10mg/mL。

前述的一种用于雾化吸入LNP的通用型处方，作为一种优选，所述表面张力下降调节剂为泊洛沙姆188和乙醇的混合物，泊洛沙姆188在LNP分散体系的浓度范围为0.5～10mg/mL，乙醇在LNP分散体系的质量体积百分比范围为0.05～30％。

前述的一种用于雾化吸入LNP的通用型处方，作为一种优选，表面张力下降调节剂为吐温-80，吐温-80在LNP分散体系的质量体积百分比范围为0.01～2％。

前述的一种用于雾化吸入LNP的通用型处方，作为一种优选，表面张力下降调节剂为吐温-80和乙醇的混合物，吐温-80在LNP分散体系的质量体积百分比范围为0.01～2％，乙醇在LNP分散体系的质量体积百分比范围为0.05～30％。

本发明的有益之处在于：

1、本发明通过在LNP的分散体系中引入可以降低水的表面张力的分子，意外的发现，使用这样的处方制备得到的LNP能够耐受雾化过程中的剪切力，在雾化前后粒度和分散度(PDI)保持不变；突破了市场雾化吸入LNP无法耐受雾化剪切力，稳定性差的技术壁垒；实现了意想不到的技术效果；

2、本发明通过在LNP的分散体系中引入可以降低水的表面张力的分子，意外的发现，LNP的核酸不会泄露，可以实现雾化前后LNP的包封率(EE)几乎保持不变。

3、本发明通过在LNP的分散体系中引入可以降低水的表面张力的分子，意外的发现，可以实现雾化前后的LNP在肺部具有较高的沉积率和较高的基因转染效果。

4、本发明的处方具有很高的通用性，当应用于不同LNP脂质成分或配方时，仍然可以保证其可以耐受雾化过程中的剪切力作用，实现其雾化前后粒度、PDI和EE的一致性；

5、在对可以降低水的表面张力的分子与LNP雾化稳定性的研究中发现，使用乙醇作为表面张力下降调节剂对提高雾化前后LNP的粒度、PDI和EE的稳定性具有优秀的效果；

6、在对可以降低水的表面张力的分子与LNP雾化稳定性的研究中发现，使用泊洛沙姆188和乙醇组合作为表面张力下降调节剂在提高雾化前后LNP的粒度、PDI和EE的稳定性具有进一步协同的效果。

7、在对可以降低水的表面张力的分子与LNP雾化稳定性的研究中发现，使用乙二醇和乙醇组合作为表面张力下降调节剂在提高雾化前后LNP的粒度、PDI和EE的稳定性具有进一步协同的效果。

8、通过体内小鼠成像实验验证，使用该处方的LNP核酸药物相比于未使用该处方的LNP而言，可以实现肺部的有效沉积，使肺部基因转染效率提高了数个数量级。

附图说明

图1是本发明实验一中LNP在不同乙醇含量的分散体系中雾化前后的粒度示意图；

图2是本发明实验一中在固定乙醇含量的分散体系中，不同粒度的LNP在雾化前后的粒度示意图；

图3是本发明实验二在7％的乙醇体系中，不同浓度的LNP雾化前后的粒度示意图；

图4是本发明实验三中C12 LNP在不含乙醇的分散体系和含8％乙醇的分散体系中进行小鼠雾化的成像结果；

图5是本发明实验四中各个LNP在不同含量乙醇的分散体系中雾化前后的粒度图；

图6是本发明实验四中当分散体系中含有2mg/mL的泊洛沙姆-188时，或2mg/mL泊洛沙姆及4％的乙醇时，LNP雾化前后的粒度图；

图7是本发明实验四中当分散体系中含有不同浓度的吐温-80时，LNP雾化前后的粒度图。

专业名词释义：

核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的总称，是由多个核苷酸单体组成的生物大分子；核酸由核苷酸组成，核苷酸单体由五碳糖、磷酸基、含氮碱基、或任何修饰基团组成。如果五碳糖是核糖，则形成的聚合物是RNA；如果五碳糖是脱氧核糖，则形成的聚合物是DNA。

需要递送的药物包括：核酸分子、小分子化合物、多肽、蛋白质等可以药用的成分。

核酸分子包括单链DNA、双链DNA、短异构体、mRNA、tRNA、rRNA、长链非编码RNA(lncRNA)、微小非编码RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、端粒酶RNA(Telomerase RNAComponent)、小分子RNA(snRNA和scRNA)、环状RNA(circRNA)、合成miRNA(miRNA mimics、miRNA agomir、miRNA antagomir)、反义DNA、反义RNA、核酶(ribozyme)、不对称干扰RNA(aiRNA)、Dicer～substrate RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、转移RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)、gRNA、sgRNA、crRNA或tracrRNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、吗啉反义寡核苷酸、吗啉代寡核苷酸或生物定制寡核苷酸等或其组合。这里的举例也并非穷举，只要是由核苷酸单体聚合成的都可以应用于本发明。

mRNA，信使RNA，中文译名：信使核糖核酸，是由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。mRNA可以是单顺反子mRNA也可以是多顺反子mRNA。mRNA也可以包含一种或多种功能性核苷酸类似物，功能性核苷酸类似物举例包括：假尿嘧啶核苷、1～甲基～假尿嘧啶核苷或5～甲基胞嘧啶等。这里的举例也并非穷举，任何修饰的mRNA或其衍生物都可以应用于本发明。

小干扰RNA(siRNA)，称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类双链RNA分子。siRNA由双链RNA(double strand RNA，dsRNA)在细胞内被RNase III(如Dicer)切割成20多bp大小的双链RNA，一般不超过30bp。dsRNA可以是外源的，如病毒RNA复制中间体或人工导入的dsRNA；也可以是内源的，如细胞中单链RNA在RNA依赖的RNA聚合酶的作用下形成的dsRNA。siRNA具有磷酸化5'末端和具有两个突出核苷酸的羟基化3'末端的短dsRNA。在细胞质内，siRNA与一种叫做RNA诱导沉默复合体(RISC)的核糖核蛋白结合，siRNA开始解链，其引导链(正义链)由RISC中的阿尔古(Argonaute)蛋白保留，随从链(反义链)被降解，从而形成单链结构。引导链和目标mRNA互补并引导RISC复合体与mRNA结合，诱导mRNA降解。由于原则上siRNA可以被设计合成，沉默任何基因，因此siRNA是在后基因组时代验证基因功能和药物靶向的重要工具，也标志着变革性生物医药时代的来临。

小分子化合物可以是用于治疗或预防的试剂中的有效成分，例如：抗肿瘤药、抗感染药、局部麻醉药、抗抑郁药、抗惊厥药、抗生素/抗菌剂、抗真菌药、抗寄生虫药、激素、激素拮抗剂、免疫调节剂、神经递质拮抗剂、抗青光眼剂、麻醉剂、或成像剂等，这里并非穷举。

多肽是α－氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，是蛋白质水解的中间产物。

蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质；蛋白质可以是干扰素、蛋白质激素、细胞因子、趋化因子或者酶类等。

稀释剂是本领域技术人员可知的任意可以药用的水溶性辅料，包括：氨基酸、单糖、二糖、三糖、四糖、五糖、其它寡聚糖、甘露醇、右旋糖苷、氯化钠、山梨醇、聚乙二醇、磷酸盐，或其衍生物等或其组合。

带电脂质化合物是指一类脂质化合物以带正电荷或带负电荷的形式存在；其所带电荷不依赖于生理学范围内的pH，例如pH 3～9，不受pH的影响。带电脂质可以是合成的或天然来源的。带电脂质的实例包括但不限于DOTAP、DOTMA、18PA。这里并非穷举，只要是采用本发明处方的LNP组合物均在本发明的保护范围内，均受本发明启示。

助脂质包括：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂(SM)、甾醇及其衍生物、神经酰胺、带电脂质中的一种或几种的组合；磷脂酰胆碱作为一种优选包括：DSPC，DPPC，DMPC，DOPC，POPC；磷脂酰乙醇胺作为一种优选为DOPE；甾醇作为一种优选为胆固醇；这里并非穷举，只要是采用本发明处方的LNP组合物均在本发明的保护范围内，均受本发明启示。

结构脂质包括：胆固醇、非甾醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、番茄碱、熊果酸、α～生育酚或皮质类固醇中的一种或几种。这里并非穷举，结构脂质的选择不受限制。

聚合物缀合脂质为聚乙二醇化脂质；作为一种实施例，聚乙二醇化脂质包括：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油或PEG修饰的二烷基甘油中的一种或多种。这里并非穷举，聚合物缀合脂质的选择不受限制。

DSPC：英文名称：distearoyl Phosphatidylcholine，1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine；中文名称：二硬脂酰基卵磷脂，CAS号:816-94-4。

DPPC：中文名称：二棕榈酸磷脂酰胆碱；英文名称：1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，CAS号:63-89-8。

DMPC：中文名称：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱；英文名称：1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，CAS号:18194-24-6。

DOPC：中文名称：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；英文名称：1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，CAS号:4235-95-4。

POPC：中文名称：2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱；英文名称：2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，CAS号:26853-31-6。

DOPE：中文名称：1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺；英文名称：1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，CAS号：4004-05-1。

DOTAP：中文名称：1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(氯盐)；英文名称：1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane(chloride salt)，CAS号：132172-61-3；；化学结构式如下所示：

DOTMA：中文名称：N,N,N-三甲基-2,3-双(十八碳-9-烯-1-基氧基)丙-1-铵氯化物，CAS号:1325214-86-5，化学结构式如下所示：

18PA：CAS号：108392-02-5，化学结构式如下所示：

SM：中文名称：鞘磷脂(SM)；英文名称：sphingomyelin。

PEG：中文名称：聚乙二醇；英文名称：Polyethylene glycol。

缓冲溶液：缓冲溶液指的是由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定；举例包括：磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、醋酸－醋酸钠、醋酸－醋酸铵、巴比妥酸、Tris、PBS、HEPEs、EDTA及其钠盐等，或其组合，此处并非穷举。

HEPEs缓冲液：中文名称：4-羟乙基哌嗪乙磺酸；英文名称：2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid；CAS号：7365-45-9。

Tris缓冲液：中文品名为三羟甲基氨基甲烷；氨基丁三醇；缓血酸胺；2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇；CAS号：77-86-1。

柠檬酸盐缓冲液：柠檬酸盐缓冲液主要成分为柠檬酸和磷酸氢钠。

DPBS：杜氏磷酸盐缓冲液。

TBST：由Tris-HCl，NaCl，tween20组成而成。

EDTA钠盐：其中EDTA二钠二水合物为乙二胺四乙酸二钠二水合物，英文名：EDTAdisodium salt dihydrate。

PBS缓冲液：主要成分为Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和KCl。

冻存保护剂：冻存保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质(常为溶液)；可以分为：糖、醇类、氨基酸类、盐类等；具体包括：蔗糖、甘露醇、海藻糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉。

除非特别说明，本申请中的术语“粒度”和“水动力学直径”、“水动力学粒径”可以互换使用，均指水动力学直径。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

本发明通过采用以下实验验证本发明通用型处方的技术效果：

实验材料：

实验一：乙醇作为表面张力下降调节剂加入脂质纳米粒(LNP)分散体系中对雾化前后LNP的粒度、分散度(PDI)和包封率(EE)变化的影响实验：

1.1LNP在不同乙醇含量的分散体系中雾化前后的粒度、PDI和EE变化实验：

实施例1LNP处方(摩尔比)：以下LNP的配比为可离子化脂质化合物C12：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝46.3：9.4：42.7：1.6。

实验方法：用微流控设备制备实施例1LNP，其中实施例1LNP处方用无水乙醇溶解，mRNA用醋酸钠buffer稀释，醇水相的体积比为1比3，通过调节流速，使制备出的LNP粒度分布在110～140nm。制备结束后，孵育20min，然后置于含10％蔗糖的pH＝6的20mM HEPEs缓冲溶液(buffer)中透析，然后分别取出50μL，用不同乙醇含量的上述buffer稀释3倍，用振动网筛式雾化装置雾化(型号Aerogen solo Nebulizer System)，测试雾化前后的粒度、PDI和EE。

实验结果如表1和图1所示：

表1LNP在不同乙醇含量的分散体系中雾化前后的粒度、PDI和EE变化

实验结论：对于实施例1LNP，若分散体系中不含乙醇，则雾化后粒度增大近一倍，PDI增大至0.5以上，且EE下降明显，若体系中包含乙醇，则可有效降低雾化的破坏作用，可保证LNP雾化前后粒度、PDI和EE变化较小，且随着乙醇含量的增加，变化的也更小。对于该处方，分散体系中含有0.01％～30％的乙醇均合适。

1.2对于实施例1LNP，我们选定分散体系中乙醇含量为6.5％，进一步研究了雾化前后粒度、PDI和EE没有变化的适用的粒度范围。

实验方法：用微流控设备制备实施例1LNP，其中实施例1LNP的脂质处方用无水乙醇溶解，mRNA用醋酸钠buffer稀释，醇水相的体积比为1比3，通过调节流速，制备出不同粒度大小的LNP。制备结束后，孵育20min，然后置于含10％蔗糖的pH＝6的20mM HEPEs buffer中透析，然后分别取出50μL，用含乙醇的buffer稀释3倍，雾化，测试雾化前后的粒度、PDI和EE。

实验结果如表2和图2所示：

表2在固定乙醇含量的分散体系中，不同粒度的LNP在雾化前后其粒度、PDI和EE变化

实验结论：不同粒度的LNP在乙醇含量为6.5％的HEPEs分散体系中雾化前后粒度、PDI和EE有差别，其中粒度在70～160nm之间各个参数变化较小，小于70nm时，例如65.3nm时，雾化后粒度增加近一倍，PDI增加至0.349，且EE降低明显，所以当LNP粒度分布在70～160nm之间时，可以更好的保持雾化后的稳定性。

1.3固定体系中乙醇含量，研究不同浓度的LNP在雾化前后的粒度、PDI和EE变化。

实验方法：用微流控设备制备实施例1LNP，其中实施例1LNP的脂质处方用无水乙醇溶解，mRNA用醋酸钠buffer稀释，醇水相的体积比为1比3，通过调节流速，制备出粒度大小分布在70～160nm的LNP。制备结束后，孵育20min，然后置于含10％蔗糖和7％乙醇的pH＝6的20mM HEPEs buffer中透析，然后分别取出150μL，不稀释雾化，或用含乙醇7％的buffer稀释不同的倍数雾化，测试雾化前后的粒度、PDI和EE。

实验结果如表3和图3所示：

表3在10％的乙醇体系中，不同浓度的LNP雾化前后的粒度、PDI和EE。

实验结论：在7％乙醇含量体系，在mRNA浓度高达2.5μg/μL(对应的LNP质量体积分数为10％)时雾化是稳定的，若稀释一下雾化会更稳定，其中在mRNA浓度为0.5μg/μL时和0.005μg/μL时一样稳定，其中mRNA浓度为0.005μg/μL对应的LNP的质量体积分数为0.0025％，即当分散体系中LNP的质量体积百分比为0.0025％～10％时雾化均是稳定的。

实验二：验证本发明处方的通用性实验

通过更换LNP组合物中的组分，但其分散体系仍然是添加了表面张力下降调节剂，研究LNP雾化的耐受性，证明本处方的通用性。

实验方法：更换可离子脂质化合物和组合物的配方如实施例2～4LNP所示，选择商业化的DLin-MC3-DMA(简写为MC3)作为对比实施例LNP，处方摩尔比如表4所示，微流控制备参数为：前端废液0.3ml，末端废液0.05mL，总体积0.75mL，总流速2～8mL/min，体积比：3比1。使其粒度分布在70～160nm，在HEPEs中透析，取出，各取50μL LNP，然后加入100μL含乙醇的HEPEs buffer稀释，使其体系中含有不同浓度的乙醇，雾化，测试雾化前后的粒度、PDI和EE。

表4各个实施例LNP的配方摩尔比

实验结果如表5和图5所示：

表5各个LNP在不同含量乙醇的分散体系中雾化前后的粒度、PDI和EE。

备注：^a代表分散体系中乙醇含量,^b代表未检测。

实验结论：对于不同种类的LNP或不同的LNP处方，只要粒度在70～160nm范围，都可以通过调节分散体系中乙醇的含量实现雾化前后粒度、PDI和EE保持不变；对于不同的LNP，保持雾化前后一致所需的乙醇含量不同，一般不超过30％。

实验三：小鼠雾化吸入LNP后肺部的表达情况

实验方法：用微流控的方法制备实施例1LNP，包载Luciferase mRNA，然后让小鼠雾化吸入，6小时候后腹腔注射荧光素钾底物，5分钟后将小鼠处死，取其心肝脾肺肾成像如图4所示。

实验结论：LNP在引入了乙醇的buffer中进行雾化其转染效果明显高于不含乙醇的buffer体系，含乙醇buffer的LNP的荧光定量值高于不含乙醇buffer的LNP多个数量级，说明该处方可以在肺部实现有效沉积且可以耐受雾化过程对其的剪切破坏，非常有效。

实验四：其他表面张力下降调节剂通过降低水的表面张力对LNP雾化前后粒度和PDI稳定性的影响。

实验方法：用微流控设备制备实施例1LNP，其中脂质处方用无水乙醇溶解，mRNA用醋酸钠buffer稀释，醇水相的体积比为1比3，通过调节流速，制备出粒度大小为130nm左右的LNP。制备结束后，孵育20min，然后置于含10％蔗糖的pH＝6的20mM HEPEs buffer中透析，然后分别取出50μL，通过用含泊洛沙姆188、吐温-80、苯乙醇、丙二醇、甘油或乙醇的HEPEs buffer的一种或两种组合稀释3倍，雾化，测试雾化前后的粒度和PDI，表面张力下降调节剂为泊洛沙姆188或乙醇时，实验结果如表6和图6，表面张力下降调节剂为吐温或乙醇时，实验结果如表7和图7。

表6当分散体系中添加泊洛沙姆188时，LNP雾化前后粒度和PDI的变化

实验结论：引入表面张力下降调节剂泊洛沙姆188可以提高雾化的稳定性，对于C12～LNP，当表面张力下降调节剂为泊洛沙姆188时，在浓度为0.5～10mg/mL范围内，粒度、PDI和EE均没有发生巨大变化，当泊洛沙姆188的浓度为5～10mg/mL时，雾化前后的LNP各个参数变化最小，且若体系中引入4％的乙醇，则浓度在5mg/mL和2mg/mL均是稳定的，所以乙醇和泊洛沙姆188的联用在提高雾化前后粒度和PDI的稳定性上具有意想不到的协同作用。

表7当分散体系中添加吐温-80时，LNP雾化前后粒度和PDI的变化

实验结论：作为表面张力下降调节剂加入LNP分散体系中的吐温-80，也会使雾化前后LNP粒度保持稳定，在吐温-80质量体积浓度为0.01％～2％范围内，雾化后粒度没有明显增大，由于本身吐温-80会自组装形成胶束，所以造成粒度仪检测的PDI较大，但LNP本身的PDI和雾化前相比几乎没有改变。另外，且随着吐温-80含量的增加，粒度增大的也越不明显。

表8当用4mL/min的总流速制备较大粒度的LNP时，在不同浓度的吐温-80或吐温-80与乙醇联用的体系雾化前后粒度、PDI和EE的表征

表9当用12mL/min的总流速制备较小粒度的LNP时，在不同浓度的吐温-80或吐温-80与乙醇联用的体系雾化前后粒度、PDI和EE的表征

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实验结论：对于两个不同粒度的LNP，例如表8中雾化前LNP的粒度为112.2nm，表9中LNP的粒度为64.5nm，加入吐温-80雾化前均发生粒度减少现象；对于较大粒度的LNP，即112.2nm的LNP，引入吐温或吐温与乙醇联用雾化后的结果相对于小粒度的LNP，即64.5nm，其雾化前后变化较小，所以粒度分布在70～160nm之间的LNP可以更好的耐受雾化过程的破坏作用，另外，乙醇和吐温-80的联用也可以起到增强雾化稳定性的作用。

实验五：在不含蔗糖的HEPEs分散体系，引入表面张力下降调节剂，看对其雾化稳定性的影响。

表10在不含蔗糖的HEPEs buffer中引入各个表面张力下降调节剂对LNP雾化稳定性的影响。

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实验结论：1)采用除了乙醇以外的其他表面张力下降调节剂，比如：泊洛沙姆188、吐温-80、丙二醇、苯乙醇、甘油，或者几种表面张力下降调节剂的组合也能够提高雾化前后LNP粒度和PDI稳定性的影响，当丙二醇的质量体积浓度在0.05％～30％的范围内，均可以保持雾化前后粒度、PDI和EE的较小变化。

2)若分散体系中不含蔗糖，可以降低分散体系的粘度，可以在更低的表面张力下降调节剂浓度下实现雾化前后粒度和EE的一致性。

本发明通过在LNP的分散体系中引入可以降低水的表面张力的分子，意外的发现，使用这样的处方制备得到的LNP能够耐受雾化过程中的剪切力，在雾化前后粒度和PDI保持不变，同时LNP的核酸不会泄露，可以实现雾化前后LNP的EE保持不变；雾化前后的LNP在肺部具有较高的沉积率和较高的基因转染效果，突破了市场雾化吸入LNP无法耐受雾化剪切力，稳定性差的技术壁垒；实现了意想不到的技术效果。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种用于雾化吸入脂质纳米粒的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物由以下组分构成：

脂质纳米粒分散体系，且所述脂质纳米粒分散体系是由以下组分组成的：脂质纳米粒、冻存保护剂、体系溶液；和加入在所述脂质纳米粒分散体系中的表面张力下降调节剂；

且所述表面张力下降调节剂选自下组：乙醇、丙二醇、苯乙醇、泊洛沙姆188、吐温-80、甘油，或其组合；

且在单独或共同使用时，所述表面张力下降调节剂在脂质纳米粒分散体系中的质量体积范围为：

乙醇在脂质纳米粒分散体系的质量体积百分比范围为0.05~30%；

丙二醇在脂质纳米粒分散体系中的质量体积百分比范围为0.05~30%；

苯乙醇在脂质纳米粒分散体系中的浓度范围为6.18~12.3 mg/mL；

泊洛沙姆188在脂质纳米粒分散体系的浓度范围为0.5~10 mg/mL；

吐温-80在脂质纳米粒分散体系的质量体积百分比范围为0.01~2%；

甘油在脂质纳米粒分散体系的质量体积百分比范围为2~5%；

所述脂质纳米粒在分散体系中的质量体积百分比范围为0.0025%~10%，所述体系溶液的浓度范围为0~1000 mM，所述冻存保护剂的质量体积百分比范围为0%~20%；

所述脂质纳米粒的粒度范围为70~160 nm；

所述脂质纳米粒按照摩尔比包括：可离子化脂质化合物：助脂质：结构脂质：聚合物缀合脂质 = 30~60：5~40：20~40：0.1~15；

所述体系溶液包括：生理盐水、4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPEs缓冲液、三羟甲基氨基甲烷Tris缓冲液、Tris-EDTA缓冲液、磷酸PB和磷酸盐PBS缓冲液、Dulbecco's磷酸盐DPBS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硫酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、含吐温的Tris缓冲液TBST、含EDTA及其钠盐的缓冲液，及上述中的一种或几种的组合。

2.根据权利要求1所述的一种用于雾化吸入脂质纳米粒的药物组合物，其特征在于，所述表面张力下降调节剂包括：乙醇。

3.根据权利要求1所述的一种用于雾化吸入脂质纳米粒的药物组合物，其特征在于，所述表面张力下降调节剂为乙醇，乙醇在脂质纳米粒分散体系的质量体积百分比范围为0.05~30%。

4.根据权利要求1所述的一种用于雾化吸入脂质纳米粒的药物组合物，其特征在于，所述表面张力下降调节剂为丙二醇，丙二醇在脂质纳米粒分散体系中的质量体积百分比范围为0.05~30%。

5.根据权利要求1所述的一种用于雾化吸入脂质纳米粒的药物组合物，其特征在于，所述表面张力下降调节剂为丙二醇和乙醇的组合物，丙二醇在脂质纳米粒分散体系的质量体积百分比范围为0.05~30%，乙醇在脂质纳米粒分散体系的质量体积百分比范围为0.05~30%。

6.根据权利要求1所述的一种用于雾化吸入脂质纳米粒的药物组合物，其特征在于，所述表面张力下降调节剂为泊洛沙姆188，泊洛沙姆188在脂质纳米粒分散体系的浓度范围为0.5 ~10 mg/mL。

7.根据权利要求1所述的一种用于雾化吸入脂质纳米粒的药物组合物，其特征在于，所述表面张力下降调节剂为泊洛沙姆188和乙醇的混合物，泊洛沙姆188在脂质纳米粒分散体系的浓度范围为0.5~10 mg/mL，乙醇在脂质纳米粒分散体系的质量体积百分比范围为0.05~30%。

8.根据权利要求1所述的一种用于雾化吸入脂质纳米粒的药物组合物，其特征在于，所述表面张力下降调节剂为吐温-80，吐温-80在脂质纳米粒分散体系的质量体积百分比范围为0.01~2%。

9.根据权利要求1所述的一种用于雾化吸入脂质纳米粒的药物组合物，其特征在于，所述表面张力下降调节剂为吐温-80和乙醇的混合物，吐温-80在脂质纳米粒分散体系的质量体积百分比范围为0.01~2%，乙醇在脂质纳米粒分散体系的质量体积百分比范围为0.05~30%。