CN103087012B - 环氧化合物与阳离子聚合物及它们的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的环氧化合物与由其开环聚合得到的阳离子聚合物的结构式或结构通式如下：或

Description

环氧化合物与阳离子聚合物及它们的制备方法

技术领域

本发明属于环氧化合物和阳离子聚合物及其制备技术领域，具体涉及一种环氧化合物与阳离子聚合物及它们的制备方法。

背景技术

随着生物化学与分子生物学的不断发展，人们对核酸（DNA，RNA）功能认识不断加深，对引起各种疾病的分子机理也有了进一步的认识。在已知的人类疾病中有数千种疾病是与基因相关的，其主要原因是基因缺陷和基因缺失。现人们经过探索，通过将适当的外源基因引入人体细胞内来弥补基因的缺陷或缺失，表达出相应的蛋白质，以从根本上消除产生疾病症状的内在因素，由此而产生了一种新的治疗方法，称之为基因治疗。基因治疗为多种常见的疑难疾病带来了希望，如癌症，糖尿病，囊性纤维化病，艾滋病和心血管疾病等。

基因治疗成功的关键是要能把用于治疗的基因高效的导入细胞内，而将治疗基因高效的导入细胞则需要安全有效的基因载体，因为没有载体的裸基因进入血清或细胞内会被血清的网状内皮系统所吞噬或被细胞的内涵体中的核酸酶降解。因此，开发安全有效的基因载体是基因治疗成功的前提条件。

现已开发的基因载体包括病毒载体和非病毒载体，尽管病毒载体具有相对较高的转染效率，但是存在免疫原性、致癌性、宿主基因插入整合等弊端，从而限制了临床应用。非病毒载体虽无免疫原性，便于大规模生产，但转染效率低于病毒载体，并且大多非病毒载体也具有较高的细胞毒性。因此，开发细胞毒性低，转染效率高的非病毒基因载体是促进基因治疗发展的基础。

现在研究的非病毒载体主要包括阳离子脂质体和阳离子聚合物，阳离子聚合物载体具有优异的DNA结合及保护能力，便于进行靶向性及生物适用性改性，成为基因载体研究中的一个重要研究对象。文献中报道了很多合成阳离子聚合物基因载体如聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚酰胺基胺、聚氨基酯、聚脒、壳聚糖、带有阳离子侧基的聚烯烃等类型。其中聚乙烯亚胺（PEI）是广泛研究的一类阳离子聚合物基因载体，其分子量为25kDa的树枝状聚乙烯亚胺（bPEI 25KDa）虽转染效率较高，已经作为评估阳离子聚合物基因载体转染效率高低的参照标准，但是因该基因载体的细胞毒性较大，且在有血清条件下的转染效率还会降低到无血清条件下的1/2，从而限制了其在临床上的应用。

发明内容

本发明的首要目的是，提供一种可用于制备阳离子聚合物的环氧化合物。

本发明次要目的是提供一种制备上述环氧化合物的方法。

本发明的第三目的是针对现有技术存在的问题，提供一种阳离子聚合物，该阳离子聚合物作为基因载体，其细胞毒性低、在无血清和有血清条件下转染效率均较高。

本发明的第四目的是提供一种上述阳离子聚合物的制备方法。

本发明提供的环氧化合物，其特征在于该化合物的结构式如下：

。

本发明提供的上述环氧化合物的制备方法，其特征在于该方法的工艺步骤和条件如下：

（1）将N，N’-二羟乙基乙二胺和有机碱加入溶剂中，并于冰水浴内搅拌至其完全溶解，然后将完全溶解在溶剂中的二碳酸二叔丁酯以2~4s/滴的速度滴加，滴加完毕后，室温反应8~24h，减压蒸馏，再依次用乙酸乙酯重结晶、柱分离即得中间化合物N，N’-2Boc-N，N’-二羟乙基乙二胺，其中N，N’-二羟乙基乙二胺、二碳酸二叔丁酯和有机碱的摩尔比为1：2.1~2.5：2.1~2.5；

（2）在室温下，将N，N’-2Boc-N，N’-二羟乙基乙二胺、环氧氯丙烷、氢氧化钠、相转移催化剂、溶剂和水一起进行搅拌混合，待固体物质基本溶解后加热至35~45℃反应4~8h，抽滤，滤液减压蒸馏，并通过柱层析分离即可，其中N，N’-2Boc-N，N’-二羟乙基乙二胺、环氧氯丙烷、氢氧化钠、相转移催化剂和水的摩尔比为1： 3~10： 3~10： 0.05~0.1： 0.1~0.2，溶剂的量则以35~45℃能够基本溶解反应物N，N’-2Boc-N，N’-二羟乙基乙二胺为限。

以上方法中所用的有机碱为三乙胺或N，N’-二异丙基乙胺；相转移催化剂为四丁基溴化铵（TBAB）、四丁基氯化铵或四丁基碘化铵中的任一种，优选四丁基溴化铵；溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。

以上方法步骤（1）的反应时间优选12~16h；N，N’-二羟乙基乙二胺、二碳酸二叔丁酯和有机碱的摩尔比优选1：2.2~2.3：2.2~2.3。

以上方法步骤（2）中所用的氢氧化钠优选片状的。

以上方法步骤（1）和（2）中柱层析分离的固定相为硅胶（300~400目），方法步骤（1）中洗脱剂为体积比1∶30的甲醇与二氯甲烷溶液，方法步骤（2）洗脱剂为体积比1∶4的乙酸乙酯与石油醚溶液。

本发明提供的由上述环氧化合物开环聚合得到的阳离子聚合物，其特征在于该聚合物的结构通式如下：

式中n=30~75，R为如下结构化合物中的任一种：

。

本发明提供的上述阳离子聚合物的制备方法，其特征在于该方法的工艺步骤和条件如下：

（1）在室温下，将权利要求1所述环氧化合物和二胺按摩尔比1∶1加入无水乙醇中搅拌溶解，使其中环氧化合物的浓度为0.5~2mmol/mL，然后N₂氛围下于80~85℃反应60~80h，停止加热，继续搅拌冷却至室温；

（2）将HCl气体通入上述反应物中搅拌反应10~24h，减压蒸馏除去无水乙醇；

（3）先将所得白色或浅黄色固体用去离子水溶解后置于冰水浴中，然后将其pH调至10~14，再用截留分子量为3500~8000的透析袋透析2~4d，冻干即可。

以上方法中所用二胺为以下结构中的任一种：

。

以上方法步骤（1）中所用环氧化合物的浓度优选1~1.5mmol/mL，反应时间优选70~75h。

以上方法步骤（3）中所用透析袋优选截留分子量为3500~5000的透析袋。

本发明提供的环氧化合物和阳离子聚合物的制备方法，是按照下面的反应路线进行的：

本发明具有以下有益效果：

1、由于本发明提供的阳离子聚合物的结构中含有仲胺和叔胺，在生理条件下能够部分质子化而带上正电荷，因而能够与带负电的DNA静电结合，并压缩DNA形成适合于基因转染的纳米尺寸的带正电荷的复合物颗粒，可促进复合物通过内吞进入细胞。

2、由于本发明提供的阳离子聚合物是通过环氧开环聚合反应得到的，其上具有均匀分布的能部分屏蔽电荷的羟基，因而既增强了阳离子聚合物的水溶性和生物兼容性，又降低其作为基因载体的细胞毒性，使其与DNA形成的复合物与细胞培养后细胞的存活率均大于90%。

3、由于本发明提供的阳离子聚合物具有较好的DNA结合能力，与DNA形成的复合物具有适合于基因转染的粒径和电位，因而在U-2OS细胞无血清条件下其转染效率都明显高于bPEI 25KDa，为bPEI 25KDa的1.73~6.19倍，具有临床应用的潜能。

4、由于本发明提供的阳离子聚合物上均匀分布的羟基能够提高阳离子聚合物与DNA形成的复合物在血清中的稳定性，P2和P4不仅在U-2OS细胞无血清条件下其转染效率高，且在有血清条件的转染效率也明显高于bPEI 25KDa，分别为bPEI 25KDa的5.64和9.66倍，进一步提高了临床应用的可能。而P4在A549细胞和293T细胞中的定量转染效率，与现有的bPEI 25KDa差不多，也就是说提供的阳离子聚合物表现出了一定的细胞选择性，可为临床的靶向治疗提供可能性。

5、本发明提供的制备方法简单、成熟，易于掌握控制。

附图说明

图1为本发明实施例5、6、7和8所制备的阳离子聚合物P1、P2、P3和P4作为基因载体与pEGFP-N1质粒DNA形成的不同质量比（阳离子聚合物与DNA的质量比包括1、2、4、6、8）的复合物、以及以bPEI 25KDa与pEGFP-N1质粒DNA形成的质量比为1.4（因该质量比表现出了最佳转染效率）的复合物为阳性对照和空白对照样在U-2OS细胞毒性实验中的细胞存活率的结果图。

图2为本发明实施例5、6、7和8所制备的阳离子聚合物P1、P2、P3和P4作为基因载体与pUC19质粒DNA形成的不同质量比（阳离子聚合物与DNA的质量比包括0、0.25、0.5、1、2、4）的复合物的凝胶电泳阻滞实验照片。

图3为本发明实施例5、6、7和8所制备的阳离子聚合物P1、P2、P3、和P4与pUC19质粒形成的不同质量比（阳离子聚合物与DNA的质量比包括1、2、4、6）的复合物在水溶液中的粒径随质量比变化的结果图。

图4为本发明实施例5、6、7和8所制备的阳离子聚合物P1、P2、P3、和P4与pUC19质粒形成的不同质量比（阳离子聚合物与DNA的质量比包括1、2、4、6）的复合物在水溶液中的zeta电位随质量比变化的结果图。

图5为本发明实施例5、6、7和8所制备的阳离子聚合物P1、P2、P3、和P4与pGL-3质粒DNA形成的不同质量比（阳离子聚合物与DNA的质量比包括1、2、4、6、8）的复合物、以及以bPEI 25KDa与pGL-3质粒DNA形成的质量比为1.4（因该质量比表现出了最佳转染效率）的复合物为阳性对照样在U-2OS细胞中无血清条件下的定量转染结果图。

图6为本发明实施例5、6、7和8所制备的阳离子聚合物P1、P2、P3和P4与pEGFP-N1质粒DNA形成的转染效率最佳质量比（P1、P2、P3和P4分别与pEGFP质粒的质量比为2、6、6和2）的复合物、以及以bPEI 25KDa与pEGFP-N1质粒DNA形成的质量比为1.4（因该质量比表现出了最佳转染效率）的复合物为阳性对照样在U-2OS细胞中无血清条件下的转染实验照片。

图7为本发明实施例6和8所制备的阳离子聚合物P2、P4与pGL-3质粒DNA形成的不同质量比的复合物、以及以bPEI 25KDa与pGL-3质粒DNA形成的质量比为1.4（因该质量比表现出了最佳转染效率）的复合物为阳性对照样在U-2OS细胞中有血清条件下的定量转染结果图。

图8为本发明实施例6和8所制备的阳离子聚合物P2和P4与pEGFP-N1质粒形成的最佳质量比（P2与pEGFP质粒的质量比为3，P4与pEGFP质粒的质量比为2）的复合物在U-2OS细胞中有血清条件下的转染照片，同时以bPEI25KDa与pEGFP-N1质粒DNA形成的质量比为1.4（因该质量比表现出了最佳转染效率）的复合物为阳性对照。

图9为本发明实施例8所制备的阳离子聚合物P4与 pGL-3质粒DNA形成的不同质量比的复合物、以及以bPEI 25KDa与pGL-3质粒DNA形成的质量比为1.4（因该质量比表现出了最佳转染效率）的复合物为阳性对照样在U-2OS、A549和293T细胞中有血清条件下的定量转染结果图。

图10为本发明实施例8所制备的阳离子聚合物P4与pEGFP-N1质粒形成的最佳质量比2、6、4的复合物分别对应在U-2OS细胞、A549细胞和293T细胞中有血清条件下的转染照片，同时以bPEI 25KDa与pEGFP-N1质粒DNA形成的质量比为1.4（因该质量比也表现出了最佳转染效率）的复合物为阳性对照样。

具体实施方式

下面给出实施例以对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例，凡基于本发明上述内容的技术方案均属于本发明的保护范围。

值得说明的是，1）以下实施例1~4的步骤（2）中所用的氢氧化钠为片状的。2）以下实施例1~4的步骤（1）和（2）中柱层析分离采用300~400目的硅胶柱，步骤（1）洗脱剂为体积比1∶30的甲醇与二氯甲烷溶液；步骤（2）中洗脱剂为体积比1∶4的乙酸乙酯与石油醚溶液。3）以下实施例5~8中分别用下述a、b、c或d二胺时，其对应所得的阳离子聚合物就定义为P1、P2、P3、P4：

实施例1

（1）将0.02mmol（2.96g）N，N’-二羟乙基乙二胺和0.048mmol （4.84g）三乙胺加入100mL二氯甲烷中，并于冰水浴内搅拌至其完全溶解，然后将完全溶解在50mL二氯甲烷中的0.044mmol（8.72g）二碳酸二叔丁酯以3s/滴的速度滴加，滴加完毕后，室温反应12h，减压蒸馏，再依次用乙酸乙酯重结晶和柱分离即得纯白色如下结构的中间化合物N，N’-2Boc-N，N’-二羟乙基乙二胺3.56g，收率51%：

¹H NMR （400 MHz, DMSO, TMS）: δ = 1.39 （s, 18H,-Boc）, 3.18 （m, J = 4 Hz, 4H, -CH₂CH₂OH）, 3.29（m, J = 12Hz,  4H, -CH₂CH₂-）, 3.45 （m, J = 4Hz, 4H, -CH₂CH₂OH）, 4.66 （S,2H, -OH）。

¹³C NMR （DMSO , 100 MHz）: δ 28.02, 49.93, 55.99,58.95, 78.38, 154.55。

HR-MS （ESI）:Calcd for: C₁₆H₃₂N₂O₆: 371.2158[M+Na]⁺； Found: 371.2156[M+Na]⁺；

（2）在室温下,将10 mmol（3.5g）N,N’-2Boc-N,N’-二羟乙基乙二胺、30mmol（2.8g）环氧氯丙烷、30mmol（1.2g）氢氧化钠、0.75mmol（241mg）四丁基溴化铵、50ml二氯甲烷和1mmol（18mg）水一起进行搅拌混合,待固体物质基本溶解后加热至35℃反应4h,冷却至室温,抽滤,再用二氯甲烷洗涤滤饼并抽滤,合并滤液减压蒸馏,并用体积比为2∶1石油醚与乙酸乙酯组成的洗脱剂通过柱层析分离即可得到无色油状如下结构的环氧化合物1.38g,收率30%：

¹H NMR （400 MHz, CDCl₃, TMS）:δ = 1.45, （s, 18H,-Boc）, 2.60 （s, 2H, Epoxyresin -CH2-）, 2.77（m,J = 4 Hz, 2H, Epoxyresin -CH2-）, 3.12（m, J = 4Hz, 2H, Epoxyresin -CH-）, 3.38（m, 10H, Epoxyresin -CH-、-OCH₂CH₂N- and NCH₂CH₂N-）, 3.61（m, 4H, -OCH₂CH₂N-）, 3.72 （m, 4H, -OCH₂-）。

¹³C NMR （CDCl₃ , 100 MHz）: δ 28.40, 44.11, 47.20,50.71, 66.36, 69.85, 79.07, 155.35。

HR-MS （ESI）:Calcd for: C₂₂H₄₀N₂O₈: 483.2682[M+Na]⁺； Found: 483.2675[M+Na]⁺。

实施例2

（1）将0.02mmol（2.96g）N,N’-二羟乙基乙二胺和0.042mmol （4.25g）三乙胺加入100mL二氯甲烷中,并于冰水浴内搅拌至其完全溶解,然后将完全溶解在50mL二氯甲烷中的0.042mmol（9.16g）二碳酸二叔丁酯以2s/滴的速度滴加,滴加完毕后,室温反应16h,减压蒸馏,再依次用乙酸乙酯重结晶和柱分离即得纯白色的中间化合物N,N’-2Boc-N,N’-二羟乙基乙二胺3.22g,收率46%：

（2）在室温下,将6.3 mmol（2.2g）N,N’-2Boc-N,N’-二羟乙基乙二胺、37.9mmol（3.5g）环氧氯丙烷、37.9mmol（1.5g）氢氧化钠、0.31mmol（100mg）四丁基溴化铵、30ml二氯甲烷和1.1 mmol（20mg）水一起进行搅拌混合,待固体物质基本溶解后加热至40℃反应6h,冷却至室温,抽滤,再用二氯甲烷洗涤滤饼并抽滤,合并滤液减压蒸馏,并用体积比为2∶1石油醚与乙酸乙酯组成的洗脱剂通过柱层析分离即可得到无色油状如下结构的环氧化合物1.21g,收率42%：

实施例3

（1）将0.02mmol（2.96g）N,N’-二羟乙基乙二胺和0.05mmol （5.05g）三乙胺加入100mL二氯甲烷中,并于冰水浴内搅拌至其完全溶解,然后将完全溶解在50mL二氯甲烷中的0.05mmol（10.91g）二碳酸二叔丁酯以4s/滴的速度滴加,滴加完毕后,室温反应24h,减压蒸馏,再依次用乙酸乙酯重结晶和柱分离即得纯白色的中间化合物N,N’-2Boc-N,N’-二羟乙基乙二胺3.99g,收率57%：

（2）在室温下,将5 mmol（1.7g）N,N’-2Boc-N,N’-二羟乙基乙二胺、50mmol（4.6g）环氧氯丙烷、50mmol（2.0g）氢氧化钠、0.5mmol（160mg）四丁基溴化铵、20ml二氯甲烷和1mmol（18mg）水一起进行搅拌混合,待固体物质基本溶解后加热至45℃反应8h,冷却至室温,抽滤,再用二氯甲烷洗涤滤饼并抽滤,合并滤液减压蒸馏,并用体积比为2∶1石油醚与乙酸乙酯组成的洗脱剂通过柱层析分离即可得到无色油状如下结构的环氧化合物0.87g,收率38%：

实施例4

（1）将0.02mmol（2.96g）N,N’-二羟乙基乙二胺和0.046mmol （4.65g）三乙胺加入100mL二氯甲烷中,并于冰水浴内搅拌至其完全溶解,然后将完全溶解在50mL二氯甲烷中的0.046mmol（10.03g）二碳酸二叔丁酯以3s/滴的速度滴加,滴加完毕后,室温反应8h,减压蒸馏,再依次用乙酸乙酯重结晶和柱分离即得纯白色的中间化合物N,N’-2Boc-N,N’-二羟乙基乙二胺2.99g,收率43%：

（2）在室温下,将5mmol（1.7g）N,N’-2Boc-N,N’-二羟乙基乙二胺、40mmol（3.7g）环氧氯丙烷、40mmol（2.0g）氢氧化钠、0.5mmol（160mg）四丁基溴化铵、20ml二氯甲烷和1mmol（18mg）水一起进行搅拌混合,待固体物质基本溶解后加热至42℃反应8h,冷却至室温,抽滤,再用二氯甲烷洗涤滤饼并抽滤,合并滤液减压蒸馏,并用体积比为2∶1石油醚与乙酸乙酯组成的洗脱剂通过柱层析分离即可得到无色油状如下结构的环氧化合物1.01g,收率44%：

实施例5

在室温下,将实施例1制备的0.568mmol（261.3mg）环氧化合物、0.568mmol（48.9mg）无水哌嗪加入570 μL无水乙醇中搅拌溶解,其中环氧化合物的浓度为1mmol/mL,然后N₂氛围下于85℃反应60h,停止加热,继续搅拌冷却至室温；将HCl气体通入上述反应物中搅拌10h,减压蒸馏除去无水乙醇；先将所得白色固体用10mL去离子水溶解后置于冰水浴中,然后用1N的氢氧化钠溶液将其pH调至12,再用截留分子量为5000的透析袋透析3d,冻干即得如下结构聚合物P1 108mg,收率55%：

  （n=75）

¹H NMR （400 MHz, D₂O, TMS）: δ = 2.40~2.76 （m,16H, -N（CH₂CH₂）₂N-、-CH₂CHOHCH₂O-、-OCH₂CH₂NHCH₂-）, 3.38~3.64 （m, 12H, -CH₂CHOHCH₂O-、-OCH₂CH₂NHCH₂-）,3.96 （t, J = 12Hz, 2H, - NCH₂CHOHCH₂O-）。

GPC: Mw=26KDa, PDI=2.03

实施例6

在室温下,将实施例1制备的1.23mmol（566.3mg）环氧化合物、1.23mmol（210.3mg）1-异丙基-[1,4,7]三氮杂环壬烷（合成方法参照Hyun-soon Chong and MartinW。Brechbiel, Synth. Commun., 2003, 33, 1147,用异丙胺代替乙醇胺）加入2460 μL无水乙醇中搅拌溶解,其中环氧化合物的浓度为0.5mmol/mL,然后N₂氛围下于85℃反应80h,停止加热,继续搅拌冷却至室温；将HCl气体通入上述反应物中搅拌15h,减压蒸馏除去无水乙醇；先将所得白色固体用10mL去离子水溶解后置于冰水浴中,然后用1N的氢氧化钠溶液将其pH调至10,再用截留分子量为3500的透析袋透析3d,冻干即得如下结构聚合物P2 220mg,收率41%：

（n=30）

¹H NMR （400 MHz, D₂O, TMS）： δ = 0.97~1.25（m, 6H,-CH（CH₃）₂）, 2.61~3.05 （m, 20H, ring-H、-CH₂CHOHCH₂O-、-OCH₂CH₂NHCH₂-）, 3.40~3.60 （m, 11H, -CH（CH₃）₂、-CH₂CHOHCH₂O-、-OCH₂CH₂NHCH₂-）, 3.94 （m, 2H, - CH₂CHOHCH₂O-）。

GPC： Mw=13 KDa, PDI=3.28

实施例7

在室温下,将实施例1制备的1.037mmol （477.3mg）环氧化合物、1.037mmol（153.7 mg）N,N’-二羟乙基乙二胺加入690 μL无水乙醇中搅拌溶解,其中环氧化合物的浓度为1.5mmol/mL,然后N₂氛围下于82℃反应75h,停止加热,继续搅拌冷却至室温；将HCl气体通入上述反应物中搅拌18h,减压蒸馏除去无水乙醇；先将所得白色固体用10mL去离子水溶解后置于冰水浴中,然后用1N的氢氧化钠溶液将其pH调至11,再用截留分子量为8000的透析袋透析2d,冻干即得如下结构聚合物P3 120mg,收率28%：

（n=38）

¹H NMR （400 MHz, D₂O, TMS）: δ = 2.53~2.77 （m,16H, -CH₂CH₂OH、-NCH₂CH₂N-、-CH₂CHOHCH₂O-、-OCH₂CH₂NHCH₂-）, 3.35~3.61 （m, 16H, -CH₂CH₂OH、-CH₂CHOHCH₂O-、-OCH₂CH₂NHCH₂-）, 3.87 （m, 2H, -CH₂CHOHCH₂O-）。

GPC: Mw=16 KDa, PDI=1.56

实施例8

（1）在室温常压下将100 mL无水乙醇、3.6g（0.024mol）三乙烯四胺加入反应容器中进行搅拌混合并置于冰水浴中,然后将9.5g（0.049mol）1-叔丁氧羰基苯酚（合成方法参照Kozo Nakamura, Takero Nakajima,Hiroshi Kayahara, Eisaku Nomura And Hisaji Taniguchi,Tetrahedron Letters 45 （2004） 495–499）溶解在20 mL无水乙醇中,再滴加到反应器中,滴加完后加热至回流反应12h,反应结束后减压蒸馏,然后加入60mL冰水,在冰水浴下用柠檬酸（2N）调节pH至3,用30mL二氯甲烷洗涤5次,收集水相,用氢氧化钠溶液（1N）调节pH=14,用60mL二氯甲烷萃取5次,收集有机相,用无水硫酸钠干燥10h,减压蒸馏,用甲醇、二氯甲烷组成的洗脱剂（先用甲醇与二氯甲烷的体积比为1∶20洗脱,再换成甲醇洗脱）进行柱层析分离,然后减压蒸馏、放入真空干燥箱中干燥即得到以下结构的无色油状化合物d 2.4g,收率20%。

¹H NMR （400 MHz, CDCl₃, TMS）: δ = 1.45 （s, 18H, -Boc）, 2.73 （m, J = 4Hz, 8H, BocNHCH₂CH₂NHCH₂-）, 3.22 （d, 4H, BocNHCH₂CH₂NHCH₂-）。

¹³C NMR （CDCl₃ , 100 MHz）: δ 28.40, 40.24, 48.75,49.04, 79.13, 156.20。

HR-MS （ESI）:Calcd for: C₁₆H₃₄N₄O₄: 347.2658[M+H]⁺； Found: 347.2659 [M+H]⁺。

（2） 在室温下,将实施例1制备的1.211mmol（557.6mg）环氧化合物、本实施例制备的1.211mmol（419.7 mg）化合物d加入605μL无水乙醇中搅拌溶解,其中环氧化合物的浓度为2mmol/mL,然后N₂氛围下于80℃反应70h,停止加热,继续搅拌冷却至室温；将HCl气体通入上述反应物中搅拌24h,减压蒸馏除去无水乙醇；先将所得白色固体用10mL去离子水溶解后置于冰水浴中,然后用1N的氢氧化钠溶液将其pH调至14,再用截留分子量为3500的透析袋透析4d,冻干即得如下结构聚合物P4 163mg,收率33%：

（n=34）

¹H NMR （400 MHz, D₂O, TMS）: δ = 2.49~2.74 （m,20H, -CH₂CH₂NH₂、-NCH₂CH₂N-、-CH₂CHOHCH₂O-、-OCH₂CH₂NHCH₂-）, 3.36~3.61 （m, 12H,-CH₂CHOHCH₂O-、-OCH₂CH₂NHCH₂-）, 3.87 （m, 2H, -CH₂CHOHCH₂O-）。

GPC: Mw=14 KDa, PDI=1.84

应用例1

将实施例5~8所制备的阳离子聚合物分别溶于磷酸盐缓冲液（简称PBS,浓度为1×）使其浓度为2mg/mL,然后用220nm的除菌滤头过滤后放入冰箱待用。将pEGFP-N1质粒溶于PBS（1×）使其浓度为0.2mg/mL待用。将所配置的阳离子聚合物溶液与pEGFP-N1质粒溶液按质量比为0.25、0.5、1、2、4、6、8分别混合均匀,再用PBS（1×）稀释分别使pEGFP-N1质粒的浓度为0.05mg/mL,于37℃孵化0.5h得阳离子聚合物与pEGFP-N1质粒复合物。

应用例2

将实施例5~8所制备的阳离子聚合物分别溶于PBS（1×）使其浓度为2mg/mL,然后用220nm的除菌滤头过滤后放入冰箱待用。将PGL-3质粒溶于PBS（1×）使其浓度为0.2mg/mL待用。将所配置的阳离子聚合物溶液与PGL-3质粒溶液按质量比为0.25、0.5、1、2、4、6、8分别混合均匀,然后用PBS（1×）稀释分别使PGL-3质粒的浓度为0.05mg/mL,再于37℃孵化0.5h得阳离子聚合物与PGL-3质粒复合物。

应用例3

将实施例5~8所制备的阳离子聚合物分别溶于PBS（1×）使其浓度为2mg/mL,然后用220nm的除菌滤头过滤后放入冰箱待用。将pUC19质粒质粒溶于PBS（1×）使其浓度为0.2mg/mL待用。将所配置的阳离子聚合物溶液与pUC19质粒质粒溶液按质量比为0.25、0.5、1、2、4、6、8分别混合均匀,然后用PBS（1×）稀释分别使pUC19质粒的浓度为0.05mg/mL,再于37℃孵化0.5h得阳离子聚合物与pUC19质粒复合物。

为了考察以上应用例所得阳离子聚合物与不同质粒所形成的复合物的性能,本发明对其作了如下检测：

1、基因载体与pEGFP-N1质粒形成的复合物的细胞毒性

将上述应用例1制备的不同质量比的阳离子聚合物与pEGFP-N1质粒的复合物分别用DMEM（美国Gibico公司生产）稀释,使pEGFP-N1质粒的浓度为2μg/mL的不同溶液,溶液的体积为300μL；用胰酶（美国Amresco公司生产）消化收取对数生长期U-2OS细胞株【来源于美国标准生物品收藏中心（ATCC）】,调整细胞数量约为每孔5.0×10³个在96孔细胞培养板（美国Corning公司生产）上培养。37℃、5%CO₂条件下培养约24h,使细胞生长至70-80%汇合度,弃孔内原有培养基,用pH值7.4的缓冲液PBS（1×）冲洗1～2次,在每孔中分别加入预先制备好的pEGFP-N1质粒的浓度为2μg/mL的复合物溶液100μL,每个浓度梯度设置三个平行孔；采用不含转基因载体的DMEM培养基100μL作为空白对照,同时用树枝状PEI 25KDa作为阳性对照。在37℃、5% CO₂（法国JOUAN公司生产的培养箱）条件下继续培养24h后用pH值7.4的缓冲液PBS（1×）洗涤1～2次,再向每孔加入100μL无血清无抗生素DMEM培养基【含20μL MTT溶液（购于美国Sigma公司,浓度为5mg/mL,pH 7.4,经0.22μm滤膜过滤）】,孵育4h,移除培养基。生成的蓝紫色结晶用150μL DMSO（美国Sigma公司生产）溶解。在吸收波长490nm处用酶标仪（美国Bio-RAD公司生产）测定溶液吸光值。含有基因载体组细胞（测试孔）与空白对照组细胞的相对存活率按下式计算：

[A]test / [A]control ×100

上式中,[A]test为测试孔的吸光值,[A]control为空白对照孔的吸光值。

检测结果见图1。由图1可见,加入本发明所述基因载体后细胞存活率基本可达90%以上,而市售的bPEI 25KDa在达到最佳转染效率的质量比时细胞存活率只有70%,说明本发明提供的基因载体比市售的bPEI 25KDa的细胞毒性低很多,具有潜在开发价值。

2、基因载体与pUC19质粒形成的复合物的凝胶电泳实验

将上述应用例3制备的不同质量比的阳离子聚合物与pUC19质粒的复合物分别用PBS（1×）稀释,使pUC19质粒的浓度为12.5μg/mL的不同溶液,溶液的体积为10μL；将1.2g 琼脂糖（美国Amor公司生产）加入到250mL锥形瓶中,再加入120mL TAE缓冲液（由分析纯化学试剂配制）,加热使琼脂糖颗粒完全溶解,得无色透明液体。冷却至50℃~60℃,按照染料Goldview（上海赛百盛基因技术有限公司生产）：TAE缓冲液=1：20（体积比）的用量加入染料Goldview,混匀后缓慢倒入带有梳子并事先调节为水平的制胶槽中。室温静置,待凝胶完全凝固后小心拔出梳子,并将带有凝胶的制胶槽放入电泳槽中,加入TEA缓冲液,TEA缓冲液的量以没过胶面1mm为宜,令样品孔自然充满TEA缓冲液。分别取上述制备的转基因载体P1、P2、P3、P4与pUC19质粒形成不同质量比的复合物10μl与1.67μl 上样缓冲液（英文名loading buffer,浓度为6x,购买于上海拜力生物科技有限公司）混匀加入凝胶上的加样孔内。盖上电泳槽,室温（25℃）下100V电压电泳约30min后停止,取出凝胶在凝胶成像系统GelDoc 2000（美国BIO-RAD公司生产）中曝光后采集图片。

实验结果见图2。由图2可见这些阳离子聚合物基因载体与pUC19质粒的复合物在质量比为0.25～1的时候就能完全阻滞pUC19质粒的迁移,说明这些阳离子聚合物基因载体与质粒具有较好的结合能力,具备作为基因载体的前提条件。

3、基因载体与pUC19质粒形成的复合物的粒径和zeta电位

将上述应用例3制备的不同质量比的阳离子聚合物与pUC19质粒的复合物用纯净水稀释,使pUC19质粒的浓度为1μg/ mL,溶液的体积为1mL,轻柔吹打混匀。

用纳米粒度及电位分析仪ZEN 3600（Malvern Inc公司生产）测其粒径和Zeta电位。

结果见图3和图4。由图3可见,转基因载体与pUC19质粒形成的复合物随着质量比增大,粒径基本表现出先减小后趋于平衡的趋势,但P3与pUC19质粒形成的复合物在质量比为2的时候有较小的增大趋势,这可能是因为复合物在质量比为1时带有的电荷的绝对值大于质量比为2时的电荷绝对值,所以在质量比为1时电荷的排斥作用更大,使得复合物更稳定而不相互聚集,所以在质量比为1的时候粒径相对较小,但是当质量比持续增大,则复合物表面的正电荷持续增大,所以粒径又会减小；需要说明的是,因为纳米粒度分析仪测定粒径受干扰因素影响很大,因此不能用来衡量复合物粒径的绝对大小。由图4可见,转基因载体与pUC19质粒的复合物在随着质量比增大,zeta电位表现出先增大后趋于平衡的趋势,平衡时的电位在20~40mV,复合物带正电荷,有利于转染过程中复合物与细胞膜的静电结合,促进复合物进入细胞；同时可以看出转基因载体P3与pUC19质粒形成的复合物的zeta电位相对更低,这是因为P3含有更多的羟基,羟基部分屏蔽了复合物表面的正电荷。

4、基因载体P1、P2、P3和P4的体外pGL-3质粒无血清条件下的转染实验

将上述应用例2制备的不同质量比的阳离子聚合物与pGL-3质粒的复合物用opti-MEM（美国Gibico公司生产）稀释,使pGL-3质粒的浓度为10μg/mL溶液的体积为300μ,将以上溶液轻柔吹打混匀；用胰酶（美国Amresco公司生产）消化收取对数生长期U-2OS细胞株（来源于ATCC）,调整细胞数量约为每孔7.0×10⁴～8.0×10⁴个在24孔细胞培养板上（美国Corning公司生产）培养。37℃、5% CO₂（法国JOUAN公司生产）条件下培养24h,使细胞生长至70~80%汇合度,弃孔内原有培养基,用PBS缓冲液（浓度为1×）洗1～2次,分别加入上述复合物溶液100μl,使每种材料与pGL-3质粒同质量比的处理组均有三个复孔,再补充不含血清及抗生素的新鲜DMEM培养基使每孔内的总体积为500μl。37℃、5%CO₂条件下继续孵育4h后弃转染用培养基,用PBS缓冲液（浓度为1×）洗涤1～2次重新加入含有10%血清的新鲜DMEM培养基（美国Gibico公司生产）500μl在相同条件下培养24h,吸掉培养基,每孔都用500μl预先冷却的PBS缓冲溶液（浓度为1×）洗涤两次,按照荧光素酶试剂盒生产商（promega）提供的方法,将100 μL（浓度为1×）的细胞裂解液加入细胞中,室温下裂解30min后将细胞裂解物转移至EP管（购买于君科生物科技有限公司）中,14000转/min离心10min,将上层溶液再次转移至另外的EP管（购买于君科生物科技有限公司）中保存在冰块中,取20μl该裂解溶液到96孔板中,然后加入100μL荧光素酶底物中使它们发生复合作用,用酶标仪测（美国Bio-RAD公司生产）荧光活性,裂解液的蛋白浓度用Thermo Modified LowryProtein Assay（Thermo,Rockford,IL,USA）测定,转染效率用相对荧光活性（RLU）/mg蛋白表达,即RLU/mg protein；转染时是做的三个复孔,转染结果是三次的平均值。

由图5可以看出用环氧化合物与不同二胺聚合得到的基因载体都表现出很高的转染效率,结合细胞毒性实验的结果可以看出本发明制备出了一系列生物兼容性好,转染效率高的基因载体,为临床应用提供了可能。

5、基因载体P1、P2、P3和P4的体外pEGFP-N1质粒无血清条件下的转染实验

将上述应用例1制备的不同质量比的阳离子聚合物与pEGFP-N1质粒的复合物用opti-MEM（GIBICO公司生产）稀释,使pEGFP-N1质粒的浓度为10μg/mL,溶液的体积为300μL,将以上溶液轻柔吹打混匀；用胰酶消化收取对数生长期U-2OS细胞株（来源于ATCC）,调整细胞数量约为每孔7.0×10⁴～8.0×10⁴个在24孔细胞培养板（美国Corning公司生产）上培养。37℃、5% CO₂（法国JOUAN公司生产）条件下培养约24h,使细胞生长至70%~80%汇合度,弃孔内原有培养基,用PBS缓冲液（浓度为1×）洗1～2次,分别加入上述复合物溶液100μl,使每种材料与pEGFP-N1质粒同质量比的处理组均有三个复孔,再补充不含血清及抗生素的新鲜DMEM培养基（GIBICO公司生产）使每孔内的总体积为500μl。37℃、5% CO₂条件下继续孵育4h后弃转染用培养基,用PBS洗涤1～2次重新加入含有10%血清（购买于上海劲马生物科技有限公司）的新鲜DMEM培养基500μl在相同条件下培养24h,其后取出细胞板在倒置荧光显微镜（日本Olympus公司生产）下观察pEGFP蛋白的表达情况,并采图。

实验结果见图6（该图只给出P1、P2、P3和P4分别与pEGFP质粒的最佳质量比2、6、6和2的图片）。由图可见,基因载体P1、P2、P3、P4与pEGFP-N1质粒的复合物在U-2OS细胞中都有明显的绿色荧光蛋白表达,与市售的bPEI 25kDa相比,都表现出了比PEI更高的转染效率。

6、转基因载体P2和P4的体外pGL-3质粒有血清条件下的转染实验

将上述应用例2制备的不同质量比的阳离子聚合物P2和P4分别与pGL-3质粒形成的复合物用opti-MEM稀释,使pGL-3质粒的浓度为10μg/mL溶液的体积为300μL,将以上溶液轻柔吹打混匀；用胰酶（美国Amresco公司生产）消化收取对数生长期U-2OS细胞株（来源于ATCC）,调整细胞数量约为每孔7.0×10⁴～8.0×10⁴个在24孔细胞培养板上（美国Corning公司生产）培养。37℃、5% CO₂（法国JOUAN公司生产）条件下培养约24h,使细胞生长至70%~80%汇合度,弃孔内原有培养基,用PBS缓冲液（浓度为1×）洗1～2次,分别加入上述复合物溶液100μl,使每种材料与pGL-3质粒同质量比的处理组均有三个复孔,再补充含10%血清的新鲜DMEM培养基使每孔内的总体积为500μl。37℃、5% CO₂条件下继续孵育4h后弃转染用培养基,用PBS洗涤1～2次重新加入含有10%血清的新鲜DMEM培养基（美国Gibico公司生产）500μl在相同条件下培养24h,吸掉培养基,每孔都用500μl预先冷却的PBS缓冲溶液（浓度为1×）洗涤两次,按照荧光素酶试剂盒生产商（promega）提供的方法,将100μL（浓度为1×）的细胞裂解液加入细胞中,室温下裂解30min后将细胞裂解物转移至EP管中,14000转/min离心10min,将上层溶液再次转移至另外的EP管中保存在冰块中,取20μl该裂解溶液到96孔板（美国Corning公司生产）中,然后加入100μL荧光素酶底物中使它们发生复合作用,用酶标仪测（美国Bio-RAD公司生产）荧光活性,裂解液的蛋白浓度用Thermo Modified Lowry Protein Assay（Thermo,Rockford,IL,USA）测定,转染效率用相对荧光活性（RLU）/mg蛋白表达,即RLU/mg protein；转染时是做的三个复孔,转染结果是三次的平均值。

实验结果见图7。从图中可看出,与市售的PEI相比,阳离子聚合物基因载体P2和P4与pGL-3质粒形成的复合物在U-2OS细胞中有血清条件下都表现出更高的转染效率,分别为bPEI 25KDa转染效率的约5倍和10倍。由此说明这类通过环氧开环所得的聚合物基因载体具有较高的血清稳定性,这为临床应用进一步提供了可能。

7、转基因载体P2和P4的体外pEGFP-N1质粒有血清条件下的转染实验

将应用例1制备的不同质量比的阳离子聚合物P2和P4与pEGFP-N1质粒的复合物用opti-MEM稀释,使pEGFP-N1质粒的浓度为10μg/mL溶液的体积为300μL,将以上溶液轻柔吹打混匀； 用胰酶（美国Amresco公司生产）消化收取对数生长期U-2OS细胞株（来源于ATCC）,调整细胞数量约为每孔7.0×10⁴～8.0×10⁴个在24孔细胞培养板上（美国Corning公司生产）培养。37℃、5% CO₂（法国JOUAN公司生产）条件下培养约24h,使细胞生长至70%~80%汇合度,弃孔内原有培养基,用PBS缓冲液（浓度为1×）洗1～2次,分别加入上述复合物溶液100μl,使每种材料与pEGFP-N1质粒同质量比的处理组均有三个复孔,再补充含10%血清的新鲜DMEM培养基使每孔内的总体积为500μl。37℃、5% CO₂条件下继续孵育4h后弃转染用培养基,用PBS洗涤1～2次重新加入含有10%血清的新鲜DMEM培养基（美国Gibico公司生产）500μl在相同条件下培养24h,其后取出细胞板在倒置荧光显微镜（日本Olympus公司生产）下观察pEGFP蛋白的表达情况,并采图。

实验结果见图8（该图只给出P2、P4分别与pEGFP质粒的最佳质量比3、2的图片）。由图可见,转基因载体P2、P4与pEGFP-N1质粒的复合物在U-2OS细胞中有血清条件都有明显的绿色荧光蛋白表达,与市售的bPEI25kDa相比,都表现出了比PEI更高的转染效率。

8、转基因载体P4的体外pGL-3质粒有血清条件下的转染实验

将应用例2制备的不同质量比的阳离子聚合物P4与pGL-3质粒的复合物用opti-MEM稀释,使pGL-3质粒的浓度为10μg/mL溶液的体积为800μL,将以上溶液轻柔吹打混匀；分别用胰酶（美国Amresco公司生产）消化收取对数生长期U-2OS细胞株（来源于ATCC）,A549细胞株（来源于ATCC）和293T细胞株（来源于ATCC）,调整细胞数量约为每孔7.0×10⁴～8.0×10⁴个在24孔细胞培养板上（美国Corning公司生产）培养。37℃、5% CO₂（法国JOUAN公司生产）条件下培养约24h,使细胞生长至70%~80%汇合度,弃孔内原有培养基,用PBS缓冲液（浓度为1×）洗1～2次,分别加入上述复合物溶液100μl,使每种材料与pGL-3质粒同质量比的处理组均有三个复孔,再补充含10%血清的新鲜DMEM培养基使每孔内的总体积为500μl。37℃、5% CO₂条件下继续孵育4h后弃转染用培养基,用PBS洗涤1～2次重新加入含有10%血清的新鲜DMEM培养基（美国Gibico公司生产）500μl在相同条件下培养24h,,吸掉培养基,每孔都用500μl预先冷却的PBS缓冲溶液（浓度为1×）洗涤两次,按照荧光素酶试剂盒生产商（promega）提供的方法,将100 μL（浓度为1×）的细胞裂解液加入细胞中,室温下裂解30min后将细胞裂解物转移至EP管中,14000转/min离心10min,将上层溶液再次转移至另外的EP管中保存在冰块中,取20μl该裂解溶液到96孔板中,然后加入100μL荧光素酶底物中使它们发生复合作用,用酶标仪（美国Bio-RAD公司生产）测荧光活性,裂解液的蛋白浓度用Thermo Modified Lowry ProteinAssay（Thermo,Rockford,IL,USA）测定,转染效率用相对荧光活性（RLU）/mg蛋白表达,即RLU/mg protein；转染时是做的三个复孔,转染结果是三次的平均值。

实验结果见图9。从图中可看出,与市售的PEI相比,阳离子聚合物基因载体P4与pGL-3质粒形成的复合物在U-2OS细胞、293T细胞和A549细胞中有血清条件下都表现出较高的转染效率,其中在U-2OS细胞中转染效率是PEI的10倍,而在293T细胞和A549细胞中的转染效率与bPEI 25KD差不多。由此说明这种通过环氧开环的聚合物基因载体具有一定的细胞选择性,这为临床靶向治疗提供了可能性。

9、转基因载体P4的体外pEGFP-N1质粒有血清条件下的转染实验

将上述应用例1制备的不同质量比的阳离子聚合物P4与pEGFP-N1质粒的复合物用opti-MEM稀释,使pEGFP-N1质粒的浓度为10μg/mL溶液的体积为800μL,将以上溶液轻柔吹打混匀；分别用胰酶（美国Amresco公司生产）消化收取对数生长期U-2OS细胞株（来源于ATCC）,A549细胞株（来源于ATCC）和293T细胞株（来源于ATCC）,调整细胞数量约为每孔7.0×10⁴～8.0×10⁴个在24孔细胞培养板上（美国Corning公司生产）培养。37℃、5% CO₂（法国JOUAN公司生产）条件下培养约24h,使细胞生长至70%~80%汇合度,弃孔内原有培养基,用PBS缓冲液（浓度为1×）洗1～2次,分别加入上述复合物溶液100μl,使每种材料与pEGFP-N1质粒同质量比的处理组均有三个复孔,再补充含10%血清的新鲜DMEM培养基使每孔内的总体积为500μl。37℃、5% CO₂条件下继续孵育4h后弃转染用培养基,用PBS洗涤1～2次重新加入含有10%血清的新鲜DMEM培养基（美国Gibico公司生产）500μl在相同条件下培养24h,其后取出细胞板在倒置荧光显微镜（日本Olympus公司生产）下观察pEGFP蛋白的表达情况,并采图。

实验结果见图10（该图只给出P4与pEGFP-N1质粒的复合物在U-2OS细胞、A549细胞和293T细胞中转染效率分别最佳的质量比2、6和4的图片）。由图可见,转基因载体P4与pEGFP-N1质粒的复合物在U-2OS细胞、A549细胞和293T细胞中有血清条件都有明显的绿色荧光蛋白表达,与市售的bPEI 25kDa相比，都表现出了比bPEI 25kDa更高的转染效率。

Claims (7)

1.一种环氧化合物的制备方法，其特征在于制备的环氧化合物的结构式为：

制备该环氧化合物方法的工艺步骤和条件如下：

(1)将N,N’-二羟乙基乙二胺和有机碱加入溶剂中，并于冰水浴内搅拌至其完全溶解，然后将完全溶解在溶剂中的二碳酸二叔丁酯以2～4s/滴的速度滴加，滴加完毕后，室温反应8～24h，减压蒸馏，再依次用乙酸乙酯重结晶、柱分离即得中间化合物N,N’-2Boc-N,N’-2羟乙基乙二胺，其中N,N’-二羟乙基乙二胺、二碳酸二叔丁酯和有机碱的摩尔比为1:2.1～2.5:2.1～2.5；

(2)在室温下，将N,N’-2Boc-N,N’-二羟乙基乙二胺、环氧氯丙烷、氢氧化钠、相转移催化剂、溶剂和水一起进行搅拌混合，待固体物质基本溶解后加热至35～45℃反应4～8h，抽滤，滤液减压蒸馏，并通过柱层析分离即可，其中N,N’-2Boc-N,N’-二羟乙基乙二胺、环氧氯丙烷、氢氧化钠、相转移催化剂和水的摩尔比为1:3～10:3～10:0.05～0.1:0.1～0.2，溶剂的量则以在35～45℃能够基本溶解反应物N,N’-2Boc-N,N’-二羟乙基乙二胺为限。

2.如权利要求1所述环氧化合物的制备方法，其特征在于该方法中所用的有机碱为三乙胺或N,N’-二异丙基乙胺；相转移催化剂为四丁基溴化铵、四丁基氯化铵或四丁基碘化铵中的任一种；溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。

3.如权利要求1或2所述环氧化合物的制备方法，其特征在于该方法步骤(1)的反应时间为12～16h；N,N’-二羟乙基乙二胺、二碳酸二叔丁酯和有机碱的摩尔比为1:2.2～2.3:2.2～2.3。

4.如权利要求1或2所述环氧化合物的制备方法，其特征在于该方法步骤(2)中所用的氢氧化钠为片状。

5.一种阳离子聚合物的制备方法，其特征在于该阳离子聚合物是由权利要求1所制备的环氧化合物开环聚合得到的，其结构通式为：

式中n＝30～75，R为如下结构化合物中的任一种：

制备该阳离子聚合物方法的工艺步骤和条件如下：

(1)在室温下，将权利要求1所述环氧化合物和二胺按摩尔比1∶1加入无水乙醇中搅拌溶解，使其中环氧化合物的浓度为0.5～2mmol/mL，然后N2氛围下于80～85℃反应60～80h，停止加热，继续搅拌冷却至室温；

(2)将HCl气体通入上述反应物中搅拌10～24h，减压蒸馏除去无水乙醇；

(3)先将所得白色或浅黄色固体用去离子水溶解后置于冰水浴中，然后将其pH调至10～14，再用截留分子量为3500～8000的透析袋透析2～4d，冻干即可，

其中所用二胺为以下结构中的任一种：

6.如权利要求5所述的阳离子聚合物的制备方法，其特征在于该方法步骤(1)中所用环氧化合物的浓度为1～1.5mmol/mL，反应时间为70～75h。

7.如权利要求5或6所述的阳离子聚合物的制备方法，其特征在于该方法步骤(3)中所用透析袋为截留分子量3500～5000的透析袋。