CN105541799B - 含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN3类阳离子脂质、转基因载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN3类阳离子脂质以及含有该阳离子脂质的转基因载体。本发明还公开了所述阳离子脂质和转基因载体的制备方法。本发明提供的阳离子脂质同时含有靶向基团胆酸和荧光基团萘酰亚胺，阳离子脂质形成的转基因载体细胞毒性较低，对肝癌细胞具有一定的靶向性，不仅能够在同一个细胞内监测载体/DNA复合物在细胞内的转运以及释放，而且对肝癌细胞具有一定的选择性，以促进基因治疗的发展，同时具有较高的转染效率；阳离子脂质和转基因载体的制备方法简单、成熟、易于掌控。

Description

含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN3类阳离子脂质、转基因 载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及阳离子脂质以及转基因载体，具体涉及一种同时含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN3类阳离子脂质、含该类阳离子脂质的转基因载体及其制备方法。
背景技术
基因治疗是将外源正常的基因通过一定的方法导入靶细胞，代替或者补偿一些缺陷或者异常的基因以达到治疗的目的。基因治疗为很多疾病的治疗提供了可能性，如：癌症、糖尿病、囊胞性纤维症、艾滋病、心血管疾病等。
基因治疗的关键是是要把治疗基因高效地导入细胞内，然而裸露的DNA 一般以舒展的线型螺旋形式存在，体积较大，并且DNA分子本身为带负电的阴离子，进入细胞时会与细胞膜外层的阴离子之间产生静电排斥作用。这些不利因素都使得DNA分子在不借助其它技术手段的情况下，无法独立穿过细胞膜，因此发展有效的基因载体是基因治疗成功的前提条件。
基因载体包括病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体是一种高效的转染试剂，但是它存在缺点，如免疫原性、致癌性，基因的大小容易受到病毒所容纳的大小限制、同时存在变异的可能性，因此其安全性令人担忧。非病毒载体无免疫原性、便于大规模生产。但是，由于目前的大部分基因载体缺乏荧光标记基团，所以，非病毒载体在细胞内分布以及运输途径还不清楚，而且非病毒载体的跨膜水平、内化途径以及内涵体地逃离机制也不是很清楚，同时，由于目前的大多数载体缺乏靶向基团，对细胞的选择性比较差且转染效率低。因此开发低毒高效具有荧光基团和靶向基团的非病毒基因载体具有重要意义。
发明内容
作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，在大环多胺[12]aneN3类阳离子脂质中同时引入靶向基团胆酸和荧光基团萘酰亚胺，之后形成的转基因载体不仅能够在同一个细胞内监测载体/DNA复合物在细胞内的转运以及释放，而且对肝癌细胞具有一定的选择性。基于这种发现，完成了本发明。
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种具有多功能的大环多胺[12]aneN3阳离子脂质的转基因载体，不仅能够在同一个细胞内监测载体/DNA复合物在细胞内的转运以及释放，而且对肝癌细胞具有一定的选择性，以促进基因治疗的发展。
本发明还有一个目的是提供含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN3类阳离子脂质的制备方法以及含有该阳离子脂质的转基因载体的制备方法。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN3类阳离子脂质，所述阳离子脂质的结构式如下：
本发明的目的还可以进一步由含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN3类阳离子脂质的制备方法来实现，该方法的合成路线如下：
所述方法具体步骤包括：
步骤一、按比例称取式3化合物、式2化合物、催化剂、缩合剂和有机碱，加入溶剂溶解，在氮气氛围下反应8～10小时，反应结束后，减压浓缩，柱层析分离得到式4化合物；
步骤二、所述步骤一得到的式4化合物与癸二胺在乙二醇单甲醚溶剂中回流，反应结束后，冷却、过滤、洗涤与柱层析分离得到式5化合物；
步骤三、将所述步骤二得到的式5化合物、催化剂、缩合剂、式6化合物与有机碱加入无水N,N-二甲基甲酰胺溶剂，在氮气氛围下反应8～10小时，反应结束后，减压浓缩，柱层析分离得到式7化合物；
步骤四、将所述步骤三得到的式7化合物、式8化合物溶于四氢呋喃溶剂中得四氢呋喃溶液，将溶有硫酸铜和维生素C的水溶液加入所述四氢呋喃溶液中，室温下反应8～10小时，反应结束后，加入水，二氯甲烷萃取，柱层析分离得到式9化合物；
步骤五、将所述步骤四得到的式9化合物加入到氯化氢的饱和乙酸乙酯溶液中，室温搅拌反应，析出固体，然后将固体过滤，得到式1化合物阳离子脂质。
优选的是，其中，在所述步骤一中，所述式2化合物和所述式3化合物的物质的量的比为1:1，所述催化剂为1-羟基苯并三唑，所述缩合剂为1-乙基 -(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸，所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺，柱层析分离中采用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，二氯甲烷和甲醇的体积比为 20:1。
优选的是，其中，在所述步骤二中，所述式4化合物与所述癸二胺的摩尔比为1:5.3，回流时间为20小时，所述柱层析分离中采用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1。
优选的是，其中，在所述步骤三中，所述催化剂为1-羟基苯并三唑，所述缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸，所述有机碱为N,N- 二异丙基乙胺，柱层析分离中采用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1。
优选的是，其中，在所述步骤四中，所述四氢呋喃溶液中的四氢呋喃和所述水溶液中的水的体积比为2:1，柱层析分离中采用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，还提供了一种转基因载体，所述转基因载体由含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN3类阳离子脂质、二油酰磷脂酰乙醇胺和高纯灭菌缓冲液组成。
优选的是，其中，所述阳离子脂质的摩尔浓度为1.0mM，所述阳离子脂质与所述二油酰磷脂酰乙醇胺的摩尔比为1:2。
本发明的目的还可以进一步由转基因载体的制备方法来实现，该方法具体包括步骤：将所述阳离子脂质、二油酰磷脂酰乙醇胺与无水氯仿加入到高温灭菌的烧瓶中，溶解后减压浓缩得到脂质体膜，将所述脂质体膜真空干燥去除残留氯仿，干燥后的脂质体膜与预先预热到70℃的三羟甲基氨基甲烷- 盐酸缓冲液混合配成所需浓度的溶液，超声得到所述转基因载体。
本发明的目的还可以进一步由含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN3类阳离子脂质在制备转基因载体中的应用来实现。
本发明至少包括以下有益效果：
1、提供含有靶向基团和荧光基团的阳离子脂质，因此能够提高阳离子脂质形成转基因载体的靶向性和监测跟踪性能；
2、转基因载体细胞毒性较低，对肝癌细胞具有一定的靶向性，可以在同一个细胞内检测DNA的跨膜、转运以及释放过程，同时具有较高的转染效率；
3、阳离子脂质和转基因载体的制备方法简单、成熟、易于掌控；
4、转基因载体与Cy5标记的DNA的复合物几乎能够百分之百的进入到肝癌细胞HepG2中，对肝癌细胞具有很好的选择性；
5、转基因载体转染效率均超过市售转基因载体Lipofectamine2000，其中在细胞U2OS中的转染效率为Lipofectamine2000的4倍；
6、转基因载体能全部包裹DNA，可作为DNA跨膜、转运的良好载体；
7、脂质体与DNA凝聚后的粒径。形成的凝聚试剂均可与DNA形成 200-450nm大小的颗粒，利用扫描电镜技术，可以看到形成复合物的形状为带棱的多边形，这为成功穿入细胞膜实现基因转染具有重要的意义；
8、通过荧光检测，可以清楚地监测基因载体1与Cy5-DNA在细胞内的转运以及释放过程。对于转运机理的研究具有非常重要的意义。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的转基因载体与DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳实验结果示意图；
图2为本发明所述转基因载体与质粒DNA的复合物在A549、HepG2、 HeLa、U2OS和CCC-HPF-1细胞中的细胞毒性图；
图3为本发明所述转基因载体与质粒DNA的复合物的粒径形貌图；
图4为本发明所述转基因载体与Cy5标记的DNA的复合物在细胞内的运输以及释放过程图；
图5是本发明所述转基因载体与Cy5标记的DNA的复合物对不同细胞靶向性图片以及不同抑制条件对细胞吸收的抑制效果图；
图6是本发明所述转基因载体与pGL-3DNA复合物在A549、HepG2、 HeLa、U2OS和CCC-HPF-1细胞中的转染示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
<实例1>
一种含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN3类阳离子脂质，所述阳离子脂质的结构式如下：
阳离子脂质的方法，其合成路线如下：
所述方法具体步骤包括：
步骤一、按比例称取式3化合物(1.28g,3.13mmol)、式2化合物(1.0 g,3.13mmol)、1-羟基苯并三唑催化剂(1.15g,0.57mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸缩合剂(0.60g,3.13mmol)与N,N-二异丙基乙胺(0.80g,6.26mmol)，加入二甲基亚砜溶剂40mL溶解，在氮气氛围下反应8～10小时，反应结束后，减压蒸掉溶剂，加入35mL水，二氯甲烷(40 mL x 2)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，去除溶剂，硅胶柱层析分离(二氯甲烷/甲醇＝20/1)得黄色固体得到式4化合物1.2g (54％)；
步骤二、所述步骤一得到的式4化合物(1.0g,1.41mmol)与癸二胺(1.3 g,7.5mmol)在乙二醇单甲醚溶剂20mL中回流20小时后，反应结束后，冷却至室温，加入冰水，将固体过滤，乙醇洗涤，柱层析分离(二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得黄色固体式5化合物0.45g(40％)；
步骤三、将所述步骤二得到的式5化合物(0.4g,0.5mmol)、1-羟基苯并三唑催化剂(0.18g,0.5mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸缩合剂(0.1g,0.5mmol)、式6化合物3,5-二甲叠氮苯甲酸(0.12g,0.5mmol) 与N,N-二异丙基乙胺(0.13g,1.0mmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺溶剂，在氮气氛围下反应8～10小时，反应结束后，减压蒸掉溶剂，加入15mL水，二氯甲烷(20mL x 2)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，去除溶剂，硅胶柱层析分离(二氯甲烷/甲醇＝10/1)得黄色固体式7化合物0.4g(79％)；
步骤四、将所述步骤三得到的式7化合物(0.2g,0.2mmol)、式8化合物炔丙基[12]N3(0.16g,0.4mmol)5mL水中，然后再加入五水硫酸铜(5.0mg, 0.02mmol)与Vc-Na(7.9mg,0.04mmol)，室温搅拌过夜，减压蒸掉溶剂，加入20mL水，二氯甲烷(20mL x 2)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，去除溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝10:1)分离得黄色固体式9化合物150mg(41％)；
步骤五、将所述步骤四得到的式9化合物(150mg,0.08mmol)加入到氯化氢的饱和乙酸乙酯溶液5mL中，室温搅拌反应，析出固体，然后将固体过滤，得到黄色固体式1化合物阳离子脂质100mg(71％)。
式4化合物的结构式、核磁(1H-NMR，13C NMR)及质谱(ESI-MS) 表征如下：
核磁1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.66(d,J＝7.2Hz,1H),8.58(d,J＝8.5Hz, 1H),8.42(d,J＝7.9Hz,1H),8.06(d,J＝7.9Hz,1H),7.87(t,J＝7.9Hz,1H), 6.34(s,1H),4.40(t,J＝5.5Hz,2H),3.87–3.80(m,2H),3.71–3.64(m,2H), 3.45(s,1H),2.35–2.13(m,6H),2.08–1.82(m,4H),1.72–1.55(m,7H),1.48– 1.25(m,6H),1.20–0.94(m,4H),0.92–0.87(m,6H),0.55(s,3H).
核磁13C NMR(101MHz,CDCl3)δ174.66,163.85,163.80,133.24,132.07, 131.21,131.03,130.42,130.29,128.64,128.03,122.50,121.64,72.93,71.80, 68.31,53.46,46.45,46.27,41.48,39.76,39.42,38.57,35.31,34.71,33.14,31.57, 30.38,28.05,27.40,26.23,26.23,23.17,22.43,17.35,12.34.IR(KBr,cm-1): 3398.57,2927.94,2856.56,1643.35,1633.71,1573.91,13875.25,1247.94, 1166.93,775.38.
质谱ESI-MS:m/z＝709.5([M+H]+).
式5化合物的结构式、核磁(1H-NMR，13C NMR)及质谱(ESI-MS) 表征如下：
核磁1H NMR(400MHz,二甲基亚砜)δ8.70(d,J＝8.4Hz,1H),8.41(d,J＝ 7.3Hz,1H),8.25(d,J＝8.5Hz,1H),7.78(d,J＝6.0Hz,1H),7.73(d,J＝5.2Hz, 1H),7.66(t,J＝7.9Hz,1H),6.75(d,J＝8.7Hz,1H),4.15–3.94(m,4H),3.70(s, 1H),3.59(s,1H),3.31(s,2H),3.27–3.21(m,1H),3.20–3.02(m,1H),2.54(d, J＝6.8Hz,1H),2.27–2.10(m,2H),2.04–1.91(m,2H),1.88–1.59(m,10H), 1.54–1.00(m,30H),0.87(s,1H),0.83(d,J＝6.2Hz,3H),0.80(s,3H),0.46(s, 3H).
核磁13C NMR(101MHz,二甲基亚砜)δ172.75,163.95,163.06,150.55,134.10,130.43,129.57,128.50,123.92,121.92,120.12,107.59,103.47,70.98,70.43, 66.24,46.05,45.63,42.87,41.53,41.25,41.06,36.65,35.31,34.97,34.86,34.33, 32.46,32.01,31.49,30.38,29.04,28.89,28.49,27.86,27.17,26.69,26.34,26.16, 22.72,22.53,17.01,12.15.IR(KBr,cm-1):3398.57,2927.94,2856.58,1643.35, 1633.71,1573.91,1375.25,1247.96,1166.93,775.38.
质谱ESI-MS:m/z＝801.9([M+H]+)
式7化合物的结构式、核磁(1H-NMR，13C NMR)及质谱(ESI-MS) 表征如下：
核磁1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.46(d,J＝7.2Hz,1H),8.35(d,J＝8.4Hz, 1H),8.13(d,J＝8.3Hz,1H),7.69(s,2H),7.48(t,J＝7.9Hz,1H),7.38(s,1H), 6.62(d,J＝8.6Hz,2H),6.52(s,1H),4.41(s,4H),4.35(s,2H),3.80(s,1H),3.76 (s,1H),3.63(s,2H),3.48–3.30(m,6H),2.38(s,2H),2.25–1.95(m,5H),1.88– 1.68(m,6H),1.55–1.21(m,27H),0.98-0.92(m,2H),0.88–0.81(m,7H),0.50 (s,3H).
核磁13C NMR(101MHz,CDCl3)δ174.67,166.79,165.37,164.65,150.56, 136.86,136.20,130.23,129.94,128.89,128.79,126.59,125.16,122.13,120.26, 109.51,108.64,85.18,72.97,71.91,68.40,54.26,46.68,46.42,43.84,41.64, 40.40,39.52,39.20,35.46,34.80,29.79,29.70,29.50,29.41,29.33,28.78,27.27, 27.06,22.55,17.44,12.4IR(KBr,cm-1):3427.51,2926.01,2098.55,1637.56, 1579.70,1381.03,1249.87,1074.35,775.38.
质谱ESI-MS:m/z＝1015.9([M+H]+).
式9化合物的结构式、核磁(1H-NMR，13C NMR)及质谱(ESI-MS) 表征如下：
核磁1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.49(d,J＝8.3Hz,1H),8.45(d,J＝7.4Hz, 1H),8.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.90(s,2H),7.71(s,2H),7.57(d,J＝7.4Hz,1H), 7.41(s,1H),6.74(d,J＝8.4Hz,1H),5.62(s,4H),4.27(s,2H),3.73(s,4H),3.57 –3.52(m,1H),3.44–3.38(m,2H),3.32–3.29(m,16H),2.38(t,J＝5.9Hz,8H), 2.28–2.09(m,3H),2.03–1.74(m,20H),1.72–1.51(m,10H),1.49–1.39(m, 48H),1.32(s,10H),1.06–0.91(m,3H),0.91-0.85(m,6H),0.45(s,3H).
核磁13C NMR(101MHz,CD3OD)δ176.58,168.36,166.08,165.44,157.70, 157.56,152.26,144.70,138.20,137.36,135.77,131.99,131.24,131.10,129.17, 127.88,125.16,123.07,121.52,108.96,104.82,81.03,80.66,79.61,79.29,78.96, 73.69,72.67,68.81,54.09,50.84,47.86,47.26,46.98,46.72,46.54,44.83,43.00, 42.72,41.05,40.86,40.33,36.54,35.77,34.18,32.93,31.10,31.59,30.56,30.47, 30.39,30.35,29.48,28.83,28.72,28.27,28.02,27.66,27.13,24.11,23.27,17.77, 13.00.IR(KBr,cm-1):3425.58,2929.87,2364.73,1722.43,1641.42,1581.63, 1546.91,1382.96,1247.94,1047.35,773.46.
质谱ESI-MS:m/z＝1834.2([M+H]+).
式1化合物的结构式、核磁(1H-NMR，13C NMR)及质谱(ESI-MS) 表征如下：
核磁1H NMR(400MHz,二甲基亚砜)δ11.27(s,1H),9.53(s,9H),8.73(d,J＝8.4Hz,1H),8.63(t,J＝4.9Hz,1H),8.50(s,2H),8.38(d,J＝7.2Hz,1H),8.22 (d,J＝8.5Hz,1H),7.79(s,3H),7.63(t,J＝7.8Hz,1H),7.35(s,1H),6.73(d,J＝ 8.7Hz,1H),5.69(s,4H),4.40(s,2H),4.08(s,4H),3.72–3.17(m,32H),3.07(s, 4H),2.28–1.91(m,18H),1.79–1.15(m,36H),0.92–0.75(m,6H),0.72-0.40 (m,3H).
核磁13C NMR(101MHz,二甲基亚砜)δ173.08,165.32,164.07,163.18,150.68,136.53,135.73,134.28,130.65,129.96,129.63,128.78,128.00,126.91,124.08,121.91,120.17,107.50,103.59,71.07,70.50,66.32,52.57,48.30,46.11,45.66, 42.90,41.28,36.77,34.99,34.42,32.59,31.44,30.36,29.12,28.95,27.93,27.93, 27.17,26.76,26.62,26.16,22.73,22.58,20.32,19.05,17.67,17.07,12.20.IR(KBr, cm-1):3425.58,2929.87,2364.73,1641.42,1581.63,1546.91,1382.96,1247.94, 1047.35,773.46.
质谱HR-MS:1433.9930
<实例2>
含实施例1中阳离子脂质式1化合物的转基因载体的制备
原料包括实施1制备的阳离子脂质式1化合物、二油酰磷脂酰乙醇胺 DOPE(dioleoylphosphotidylethanolamine)和无水氯仿。于高温灭菌的烧瓶中将合成的阳离子脂质式1化合物(0.005mmol)与DOPE以摩尔比1:2溶于2.5mL 无水氯仿中，充分混合溶解后将溶剂室温下减压旋干得到脂质体膜，混合物放入真空干燥箱中干燥(干燥时间12小时，温度25℃)去除残留氯仿，干燥后的脂质体膜与提前预热到70℃，三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris–HCl) 缓冲液(10mM,pH 7.4)混合，加入缓冲溶液的量使得脂质的最终浓度为1.0mM。最后将混合物于60℃超声中超声20分钟，置于4℃冰箱内保存备用。
<实例3>
实施例2制备得到的转基因载体，对其进行下述几方面的检测：
(1)转基因载体与pUC18-DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳实验
转基因载体与pUC18-DNA复合物的制备
室温下，在PE管里分别加入转基因载体，其中转基因载体物质的量浓度为0，1，5，10，20，50μM,pUC18-DNA浓度为9μg/mL，加入相应体积的超纯水，使反应液的最终体积保持在20μL，离心混合均匀。放入37℃恒温水浴中，保温1个小时后，加入2μL的10×LoadingBuffer上样缓冲液终止反应。
琼脂糖凝胶的制备
称取280mg琼脂糖，加入40mL 1×TAE(Tris-乙酸)缓冲溶液，微波加热使琼脂糖颗粒完全溶解，得到无色透明液体。待温度降至60℃左右，加入2μL GoldviewⅡ核酸显色剂，混合均匀后趁热倒入带有梳子的制胶槽中。冷却40分钟待凝胶完全凝固后，小心拔出梳子，并将带有凝胶的制胶槽放入电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液稍微没过胶面。
复合物的琼脂糖凝胶电泳实验
分别取上述制备的转基因载体与pUC18-DNA复合物10μL加入凝胶上的加样孔内。盖上电泳盖，电压80V条件下电泳40分钟后停止，取出凝胶在凝胶电泳成相系统中曝光采样。
如图1所示，利用琼脂糖凝胶电泳实验，我们观察了转基因载体与 pUC18-DNA的作用情况。转基因载体在浓度为10μM时所有pUC18-DNA 都滞留在上样孔，表明转基因载体能全部包裹DNA，凝聚效果良好。
(2)转基因载体细胞毒性实验
转基因载体与pUC18-DNA复合物的制备
室温下，在PE管里分别加入转基因载体，其中转基因载体的浓度分别为 0,1,5,10,20,50μM，DNA的浓度为9μg/mL，加入相应体积的DMEM，使反应液的最终体积保持在300μL。放入37℃恒温水浴中，保温1个小时。
细胞毒性实验
用胰酶消化收取对数生长期的A549,HeLa,HepG2,U2OS和 CCC-HPF-1细胞将大约每孔7000个细胞种入96孔板中，于37℃含5％CO2的培养箱培养24个小时，使细胞的生长至70％-80％的融合。弃去孔内原有培养基，用PBS缓冲液洗1-2次，在每孔中分别加入上述配好的不同浓度的转基因载体与pUC18-DNA复合物100μL，每个浓度设置三个平行孔；采用不含转基因载体的DMEM培养基作为空白对照，采用商业化Lipofectamine 2000作为阳性对照，不含细胞只有DMEM作为空白对照。4小时后将所有培养基吸出，向其中每孔加入200μL含10％胎牛血清的DMEM，于培养箱中培养24小时后，向每孔加入10μL MTT溶液，4小时后吸出所有加入液，生成的紫蓝色结晶用150μL二甲基亚砜溶解，于摇床上震荡10分钟后用酶标仪测定每一孔在490nm处的吸光度值。按如下公式计算细胞存活率(％)＝ [A490test-空白]/[A490control-空白]×100。
如图2所示，经过在A549,HeLa,HepG2,U2OS和CCC-HPF-1细胞中测定转基因载体的细胞毒性，发现在这五种细胞中的毒性都比较低。细胞的成活率基本都在90％以上。
(3)转基因载体与pUC18-DNA复合物的粒径以及形貌实验
转基因载体与pUC18-DNA复合物的制备
室温下，在PE管里分别加入转基因载体，其中转基因载体的浓度分别为 0，1，5，10，20，50μM，DNA的浓度为9μg/mL，加入相应体积的超纯水，使反应液的最终体积保持在50μL，离心混合均匀。放入37℃恒温水浴中，保温5分钟，然后再稀释到500μL(扫描电镜实验中，不需要稀释，直接把转基因载体与DNA的复合物滴加到硅片上，室温自然晾干)。
粒径以及形貌测试
用反应液反复润洗比色皿，最后将500μL反应液转移至比色皿中进行测定。设定测试温度为25.00℃，每次测定收集10组平行数据取平均值。
如图3所示，利用动态激光光散射技术，我们研究了转基因载体与DNA 凝聚后的粒径。形成的凝聚试剂均可与DNA形成200-450nm大小的颗粒，利用扫描电镜技术，可以看到形成复合物的形状为带棱的多边形，这为成功穿入细胞膜实现基因转染具有重要的意义。
(4)基因载体与Cy5标记的DNA的复合物在细胞内的运输以及释放过程实验
转基因载体与Cy5-DNA质粒复合物的制备
室温下，在PE管里加入转基因载体与Cy5-DNA，浓度分别为20μM 和9μg/mL，加入相应体积的DMEM，使反应液的最终体积保持在200μL，轻轻吹打混匀，放入37℃恒温水浴中，保温5分钟。
监测复合物在细胞内的运输实验
用胰酶消化收取对数生长期的HepG2细胞将大约每孔7.0×104-9.0×104个细胞种入共聚焦培养皿中，于37℃含5％CO2的培养箱培养24个小时，使细胞的生长至70％-80％的融合。弃去孔内原有培养基，用PBS缓冲液洗 1-2次，在每孔中分别加入上述配好的转基因载体与Cy5-DNA复合物200μ L,并加入细胞核染色剂2μL DAPI。半小时后将所有培养基吸出，用PBS缓冲液洗3-4次，然后加入100μLDMEM，在倒置荧光显微镜下观察随着时间变化转基因载体与Cy5-DNA在细胞内的运输情况。
如图4所示，通过荧光显微镜图可以看出：转基因载体与Cy5-DNA的复合物半小时已经进入细胞，一小时后到达了细胞核附近，三小时后在细胞核内逐渐释放DNA。可以清楚地监测转基因载体与Cy5-DNA在细胞内的转运以及释放过程。对于转运机理的研究具有非常重要的意义。
(5)转基因载体与Cy5-DNA的复合物对不同细胞靶向性及不同抑制剂对HepG2细胞内吞的抑制作用实验
转基因载体与Cy5-DNA质粒复合物的制备
室温下，在PE管里加入转基因载体与Cy5-DNA，浓度分别为20μM和 9μg/mL，加入相应体积的DMEM，使反应液的最终体积保持在200μL，轻轻吹打混匀，放入37℃恒温水浴中，保温5分钟。
转基因载体与Cy5-DNA质粒复合物对细胞的选择项吸收实验
用胰酶消化收取对数生长期的HepG2,A549,HeLa,U2OS和 CCC-HPF-1细胞将大约每孔7.0×104-9.0×104个细胞种入共聚焦培养皿中，于37℃含5％CO2的培养箱培养24个小时，使细胞的生长至70％-80％的融合。弃去孔内原有培养基，用PBS缓冲液洗1-2次，在每孔中分别加入上述配好的转基因载体与Cy5-DNA复合物200μL，4小时后将所有培养基吸出，用PBS缓冲液洗3-4次，胰酶消化细胞，然后加入1mL含10％血清的DMEM，吹打均匀后吸入2mLPE管，用细胞流失仪分析Cy5-DNA进入细胞的个数。
在HepG2细胞中，不同种类抑制剂对转基因载体与Cy5-DNA质粒复合物跨膜的影响。
用胰酶消化收取对数生长期的HepG2细胞将大约每孔7.0×104-9.0×104个细胞种入共聚焦培养皿中，于37℃含5％CO2的培养箱培养24个小时，使细胞的生长至70％-80％的融合。弃去孔内原有培养基，用PBS缓冲液洗 1-2次，加入上述配好的转基因载体与Cy5-DNA复合物200μL，在4℃条件下作用4个小时。或者先加入细胞内吞抑制剂氯丙嗪(20μg/mL)、细胞松弛素D(10μg/mL)、金雀异黄酮(200μM)和诺考达唑(33μM)作用半小时后，把培养基吸出，加入上述配好的转基因载体与Cy5-DNA复合物200μL。用PBS缓冲液洗3-4次，胰酶消化细胞，然后加入1mL含10％血清的DMEM，吹打均匀后吸入2mL PE管，用细胞流失仪分析Cy5-DNA进入细胞的个数。
如图5所示，通过细胞流失实验可以看出：在HepG2,A549,HeLa,U2OS 和CCC-HPF-1中(图5B)，肝癌细胞HepG2可以100％的吸入转基因载体与Cy5-DNA复合物，说明转基因载体对肝癌细胞具有很好的选择性。细胞在 4℃条件下，只有25％左右细胞得到了抑制，说明转基因载体与Cy5-DNA 复合物主要通过非能量依赖的方式或非内吞的方式进入细胞；在细胞内吞方式中，细胞松弛素D和金雀异黄酮可以抑制细胞内吞10％左右，其它抑制剂没有明显的抑制作用，说明转基因载体与Cy5-DNA复合物主要通过巨胞饮或小窝介导的内吞方式进入细胞(图5A)。对于细胞内动力学的研究具有非常重要的意义。
(6)转基因载体与pGL-3DNA的复合物体外转染实验
转基因载体与pGL-3DNA复合物的制备
室温下，在PE管里加入转基因载体与pGL-3DNA，转基因载体的浓度分别为20，30，40，50μM，pGL-3DNA的浓度为9μg/mL，加入相应体积的DMEM，使反应液的最终体积保持在200μL，轻轻吹打混匀，放入37℃恒温水浴中，保温5分钟。
体外转染实验
用胰酶消化收取对数生长期的HepG2细胞将大约每孔7.0×104-9.0×104个细胞种入24孔细胞培养板，于37℃含5％CO2的培养箱培养24个小时，使细胞的生长至70％-80％的融合。弃去孔内原有培养基，用PBS缓冲液洗1-2次，在每孔中分别加入上述配好的不同浓度的转基因载体与pGL-3DNA质粒复合物200μL。4小时后将所有培养基吸出，向其中每孔加入200μL含10％胎牛血清的DMEM，于培养箱中培养24小时后，取出24孔板，用PBS洗液洗涤两次。加入120μL细胞裂解液，常温震荡15min，将充分裂解产物转入1.5 mL EP管，12000rpm离心30s，将离心好的上清液移入新的EP管进行后续检测。取裂解样品20μL加入96孔白板，另外加入100μL Luciferase Assay Reagent吹打两到三次混匀，放到酶标仪上测定。
按照上述的方法制备转基因载体Lipofectamine2000与pGL-3DNA的复合物，按照上述的方法将转基因载体Lipofectamine2000与pGL-3DNA以及转基因载体(30μM)与pGL-3DNA复合物加入到A549,HeLa,HepG2,U2OS 和CCC-HPF-1细胞中进行体外转染实验。
如图6所示，通过细胞转染实验可以得出：转基因载体的浓度为30μM 时，在HepG2细胞中转染效率最高，约为lipofectamine 2000的1.6倍，在此浓度下，研究了转基因载体在A549,HeLa,U2OS和CCC-HPF-1细胞中的，结果显示转染效率都要高于lipofectamine2000，其中在U2OS中的转染效率为lipofectamine 2000的4倍。是一种高效低毒是转基因载体
综上所述，本发明中的转基因载体细胞毒性较低，对肝癌细胞具有一定的靶向性，可以在同一个细胞内检测DNA的跨膜、转运以及释放过程，同时具有较高的转染效率，以促进基因治疗的发展，其制备方法简单、成熟、易于掌控。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN3类阳离子脂质，所述阳离子脂质的结构式如下：
2.一种制备权利要求1所述的阳离子脂质的方法，其合成路线如下：
所述方法具体步骤包括：
步骤一、按比例称取式3化合物、式2化合物、催化剂1-羟基苯并三唑、缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸和有机碱，加入溶剂二甲基亚砜溶解，在氮气氛围下反应8～10小时，反应结束后，减压浓缩，柱层析分离得到式4化合物；
步骤二、所述步骤一得到的式4化合物与癸二胺在乙二醇单甲醚溶剂中回流，反应结束后，冷却、过滤、洗涤与柱层析分离得到式5化合物；
步骤三、将所述步骤二得到的式5化合物、催化剂1-羟基苯并三唑、缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸、式6化合物与有机碱加入无水N,N-二甲基甲酰胺溶剂，在氮气氛围下反应8～10小时，反应结束后，减压浓缩，柱层析分离得到式7化合物；
步骤四、将所述步骤三得到的式7化合物、式8化合物溶于四氢呋喃溶剂中得四氢呋喃溶液，将溶有硫酸铜和Vc-Na的水溶液加入所述四氢呋喃溶液中，室温下反应8～10小时，反应结束后，加入水，二氯甲烷萃取，柱层析分离得到式9化合物；
步骤五、将所述步骤四得到的式9化合物加入到氯化氢的饱和乙酸乙酯溶液中，室温搅拌反应，析出固体，然后将固体过滤，得到式1化合物阳离子脂质。
3.如权利要求2所述的方法，其中，在所述步骤一中，所述式2化合物和所述式3化合物的物质的量的比为1:1，所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺，柱层析分离中采用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1。
4.如权利要求2所述的方法，其中，在所述步骤二中，所述式4化合物与所述癸二胺的摩尔比为1:5.3，回流时间为20小时，所述柱层析分离中采用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1。
5.如权利要求2所述的方法，其中，在所述步骤三中，所述有机碱为N,N-二异丙基乙胺，柱层析分离中采用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1。
6.如权利要求2所述的方法，其中，在所述步骤四中，所述四氢呋喃溶液中的四氢呋喃和所述水溶液中的水的体积比为2:1，柱层析分离中采用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1。
7.一种转基因载体，由权利要求1所述的阳离子脂质、二油酰磷脂酰乙醇胺和高纯灭菌缓冲液组成。
8.如权利要求7所述的转基因载体，其中，所述阳离子脂质的摩尔浓度为1.0mM，所述阳离子脂质与所述二油酰磷脂酰乙醇胺的摩尔比为1:2。
9.一种制备权利要求7所述的转基因载体的方法，所述方法具体包括步骤：将所述阳离子脂质、二油酰磷脂酰乙醇胺与无水氯仿加入到高温灭菌的烧瓶中，溶解后减压浓缩得到脂质体膜，将所述脂质体膜真空干燥去除残留氯仿，干燥后的脂质体膜与预先预热到70℃的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液混合配成所需浓度的溶液，超声得到所述转基因载体。
10.权利要求1所述的阳离子脂质在制备转基因载体中的应用。
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