ES2198552T3 - Anticuerpos humanos que se unen al tnfalfa humano. - Google Patents

Anticuerpos humanos que se unen al tnfalfa humano.

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ES2198552T3
ES2198552T3 ES97906572T ES97906572T ES2198552T3 ES 2198552 T3 ES2198552 T3 ES 2198552T3 ES 97906572 T ES97906572 T ES 97906572T ES 97906572 T ES97906572 T ES 97906572T ES 2198552 T3 ES2198552 T3 ES 2198552T3
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ES
Spain
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seq
human
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baselineskip
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Application number
ES97906572T
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English (en)
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Jochen G. Salfeld
Deborah J. Allen
Zehra Kaymakcalan
Boris Labkovsky
John A. Mankovich
Brian T. Mcguiness
Andrew J. Roberts
Paul Sakorafas
Hendricus R. J. M. Hoogenboom
David Schoenhaut
Tristan J. Vaughan
Michael White
Alison J. Wilton
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Abbott Laboratories Bermuda Ltd
Abbott Laboratories
Original Assignee
Abbott Laboratories Bermuda Ltd
Abbott Laboratories
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Publication date
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE ANTICUERPOS HUMANOS, PREFERIBLEMENTE ANTICUERPOS HUMANOS RECOMBINANTES, QUE SE UNEN ESPECIFICAMENTE AL FACTOR AL DE NECROSIS TUMORAL HUMANO (HTNF AL ). DICHOS ANTICUERPOS TIENEN ELEVADA AFINIDAD POR TAL FACTOR (POR EJ. K D = 10 -8 M O INFERIOR A ESTA CIFRA), UNA BAJA VELOCIDAD DE DISOCIACION DE DICHO FACTOR (POR EJ. K OFF = 10 -3 SEG -1 O INFERIOR) Y, ADEMAS, NEUTRALIZAN LA ACTIVIDAD DE DICHO FACTOR IN VITRO E IN VIVO. UN ANTICUERPO DE LA INVENCION PUEDE SER UN ANTICUERPO EN SU EXTENSION TOTAL O UNA PORCION ANTIGENO-ENLAZANTE DE DICHO ANTICUERPO. DICHOS ANTICUERPOS O DICHAS PORCIONES DE LA INVENCION SON UTILES PARA DETECTAR DICHO FACTOR Y PARA INHIBIR LA ACTIVIDAD DEL MISMO, POR EJ. EN UN SUJETO QUE SUFRE UN TRASTORNO EN EL QUE LA ACTIVIDAD DE DICHO FACTOR ES PERJUDICIAL. LA INVENCION ABARCA ACIDOS NUCLEICOS, VECTORES, Y CELULAS HUESPED PARA EXPRESAR DICHOS ANTICUERPOS Y TAMBIEN PROCEDIMIENTOS PARA SINTETIZAR DICHOS ANTICUERPOS HUMANOS RECOMBINANTES.

Description

Anticuerpos humanos que se unen al TNF\alpha humano.
Antecedentes de la invención
El factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha) es una citoquina producida por diversos tipos de células, incluyendo monocitos y macrófagos, que se identificó originalmente basándose en su capacidad de inducir la necrosis de ciertos tumores de ratón (véase, por ejemplo, Old, L. (1985) Science 230: 630- 632). Posteriormente, se demostró que un factor denominado caquectina, asociado con la caquexia, era la misma molécula que el TNF\alpha. El TNF\alpha se ha implicado en la mediación del choque (véase, por ejemplo, Beutler, B. y Cerami, A. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57: 505-518; Beutler, B. y Cerami, A. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7: 625-655). Además, el TNF\alpha se ha implicado en la patofisiología de una diversidad de otras enfermedades y trastornos humanos, incluyendo sépsis, infecciones, enfermedades autoinmunes, rechazo de transplantes y enfermedad del hospedador frente al injerto (véase, por ejemplo, Moeller, A., et al. (1990) Cytokine 2: 162-169; Patente de Estados Unidos Nº 5.231.024 a Moeller et al.; Publicación de Patente Europea Nº 260 610 B1 por Moeller, A., et al. Vasilli, P. (1992) Annu. Rev. Immunol. 10:411-452; Tracey, K. J. y Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45:491-503).
Debido al papel perjudicial del TNF\alpha humano (hTNF\alpha) en una diversidad de trastornos humanos, se han diseñado estrategias terapéuticas para inhibir o contrarrestar la actividad del hTNF\alpha. En particular, se han buscado anticuerpos que se unen y neutralizan el hTNF\alpha como medio para inhibir la actividad del hTNF\alpha. Algunos de los primeros de estos anticuerpos eran anticuerpos monoclonales de ratón (mAb), secretados por hibridomas preparados a partir de linfocitos de ratones inmunizados con hTNF\alpha (véase, por ejemplo, Hahn T; et al., (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82: 3814-3818; Liang, C-M., et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 137: 847-854; Hirai, M., et al. (1987) J. Immunol. Methods 96: 57-62; Fendly, B. M., et al. (1987) Hybridoma 6: 359-370; Moeller, A., et al. (1990) Cytokine 2: 162-169; Patente de Estaods Unidos Nº 5.231.024 a Moeler et al.; Publicación de Patente Europea Nº 186 833 B1 por Wallach, D.; Publicación de Solicitud de Patente Europea Nº 218 868 A1 por Old et al.; Publicación de Patente Europea Nº 260 610 B1 por Moeller, A., et al.). Aunque estos anticuerpos anti-hTNF\alpha de ratón a menudo presentaba alta afinidad para el hTNF\alpha (por ejemplo, Kd \leq10^{-9} M) y fueron capaces de neutralizar la actividad del hTNF\alpha, su uso in vivo puede limitarse por problemas asociados con la administración de anticuerpos de ratón a seres humanos, tales como una vida media en suero corta, la incapacidad de inducir ciertas funciones efectoras humanas y la inducción de una respuesta inmune indeseada contra el anticuerpo de ratón en un ser humano (el "anticuerpo anti-ratón humano" (HAMA)).
Con la intención de solucionar los problemas asociados con el uso de anticuerpos completamente murinos en seres humanos, se han obtenido por ingeniería genética anticuerpos anti-hTNF\alpha para que sean más ``parecidos a los de humano''. Por ejemplo, se han preparado anticuerpos quiméricos en los que las regiones variables de las cadenas de anticuerpo proceden de ratón y las regiones constantes de las cadenas de anticuerpo proceden de ser humano (Knight, D. M. et al. (1993) Mol. Immunol. 30: 1443-1453; Publicación PCT Nº WO 92/16553 por Daddona, P. E., et al.). Además, también se han preparado anticuerpos humanizados, en los que los dominios hipervariables de las regiones variables de anticuerpo proceden de ratón pero el resto de las regiones variables y las regiones constantes de anticuerpo proceden de ser humano (Publicación PCT Nº WO 92/11383 por Adair, J. R., et al.). Sin embargo, como estos anticuerpos quiméricos y humanizados retienen algunas secuencias murinas, pueden inducir una reacción inmune indeseada, la reacción anti-anticuerpo quimérico humana (HACA), especialmente cuando se administran durante periodos prolongados, por ejemplo, para indicaciones crónicas, tales como la artritis reumatoide (véase, por ejemplo, Elliott, M. J. et al. (1994) Lancet 344: 1125-1127; Elliot, M. J. et al. (1994) Lancet 344: 1105-1110).
Un agente inhibidor de hTNF\alpha preferido contra mAb murinos o derivados de los mismos (por ejemplo, anticuerpos quiméricos o humanizados) sería un anticuerpo anti-hTNF\alpha completamente humano, de tal forma que un agente no induzca la reacción HAMA, aunque se use durante periodos prolongados. Se han preparado autoanticuerpos monoclonales humanos contra hTNF\alpha usando técnicas de hibridoma humano (Boyle, P., et al. (1993) Cell. Immunol. 152:556-568; Boyle P., et al. (1993) Cell. Immunol. 152: 569- 581; Publicación de Solicitud de Patente Europea Nº 614 984 A2 por Boyle, et al.). Sin embargo, se notificó que estos autoanticuerpos monoclonales derivados de hibridoma tenían una afinidad por hTNF\alpha que era demasiado baja como para poder calcularse por métodos convencionales, no podían unirse al hTNF\alpha soluble, y no podían neutralizar la citotoxicidad inducida por el hTNF\alpha (véase Boyle, et al.; supra). Además, el éxito de la técnica de hibridoma humano depende de la presencia natural en sangre periférica humana de linfocitos productores de autoanticuerpos específicos para el hTNF\alpha. Ciertos estudios han detectado autoanticuerpos en suero contra hTNF\alpha en seres humanos (Fomsgaard, A., et al. (1989) Scand. J. Immunol. 30: 319-223; Bendtzen, K., et al. (1990) Prog. Leukocyte Biolj. 10B:447-452), mientras que otros no lo han hecho (Leusch, H-G., et al. (1991) J. Immunol. Methods 139:145-147).
Una alternativa a los anticuerpos anti-hTNF\alpha humanos naturales sería un anticuerpo contra hTNF\alpha recombinante. Se han descrito anticuerpos humanos recombinantes que se unen a hTNF\alpha con una afinidad relativamente baja (es decir, K_{d} \sim10^{-7} M) y una velocidad de disociación rápida (es decir, K_{off} \sim10^{-2}seg^{-1}) (Griffiths, A.D. et al (1993) EMBO J. 12:725-734). Sin embargo, debido a su cinética de disociación relativamente rápida, estos anticuerpos pueden no ser adecuados para uso terapéutico. Además, se ha descrito un anti-hTNF\alpha humano recombinante que no neutraliza la actividad del hTNF\alpha, sino que en su lugar aumenta la unión del hTNF\alpha a la superficie de las células y potencia la internalización del hTNF\alpha (Lidbury, A., et al. (1994) Biotechnol. Ther. 5:27-45; Publicación PCT Nº WO 92/03145 por Aston, R. et al.).
Por consiguiente, aún se necesitan anticuerpos humanos, tales como anticuerpos humanos recombinantes, que se unen al hTNF\alpha soluble con alta afinidad y una lenta cinética de disociación y que tienen la capacidad de neutralizar la actividad de hTNF\alpha, incluyendo la citotoxicidad inducida por hTNF\alpha (in vitro e in vivo) y la activación de células inducida por hTNF\alpha.
Sumario de la invención
Esta invención proporciona anticuerpos humanos, preferiblemente anticuerpos humanos recombinantes que se unen específicamente al TNF\alpha humano. Los anticuerpos de la invención se caracterizan por la unión al hTNF\alpha con alta afinidad y una lenta cinética de disociación y por la neutralización de la actividad del hTNF\alpha, incluyendo la citotoxicidad inducida por hTNF\alpha (in vitro e in vivo) y la activación celular inducida por hTNF\alpha. Los anticuerpos de la invención se caracterizan adicionalmente por la unión al hTNF\alpha, pero no al hTNF\beta (linfotoxina) y por tener la capacidad de unirse a otros TNF\alpha de primate y TNF\alpha de no primate además del TNF\alpha humano.
Los anticuerpos de la invención pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender sólo una proteína de unión a antígenos (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')_{2} o scFv). El anticuerpo recombinante más preferido de la invención, denominado D2E7, tiene un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3 y un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4. Preferiblemente, el anticuerpo D2E7 tiene una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.
En una realización, la invención proporciona un anticuerpo humano aislado, o una porción de unión a antígenos del mismo, que se disocia desde el TNF\alpha humano con una K_{d} de 1 x 10^{-8} M o menor y una constante de velocidad K_{off} de 1 x 10^{-3} s^{-1} o menor, ambas determinadas por resonancia de plasmón superficial y neutraliza la citotoxicidad del TNF\alpha humano en un ensayo L929 convencional in vitro con una CI_{50} de 1 x 10^{-7} M o menor. Más preferiblemente, el anticuerpo humano aislado, o la porción de unión a antígenos del mismo, se disocia desde el TNF\alpha humano con una K_{off} de 5 x 10^{-4} s^{-1} o menor, o incluso más preferiblemente con una K_{off} de 1 x 10^{-4} s^{-1} o menor. Más preferiblemente, el anticuerpo humano aislado, o la porción de unión a antígenos del mismo, neutraliza la citotoxicidad del TNF\alpha humano en un ensayo L929 convencional in vitro con una CI_{50} de 1 x 10^{-8} M o menor, o incluso más preferiblemente con una CI_{50} de 1 x 10^{-9} M o menor y aún más preferiblemente con un CI_{50} de 5 x 10^{-10} M o menor.
En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo humano, o una porción de unión a antígenos del mismo, con las siguientes características:
a) se disocia del TNF\alpha humano con una K_{off} de 1 x 10^{-3} s^{-1} o menor, determinada por resonancia de plasmón superficial;
b) tiene un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3, o modificada a partir de la SEC ID Nº:3 por una sola sustitución de alanina en la posición 1, 4, 5, 7 u 8 o por una a cinco sustituciones de aminoácidos conservativas en las posiciones 1, 3, 4, 6, 7, 8 y/o 9.
c) tiene un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4, o modificada a partir de la SEC ID Nº: 4 por una sola sustitución de alanina en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 u 11 o por una a cinco sustituciones de aminoácidos conservativas en las posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y/o 12.
Más preferiblemente, el anticuerpo o la porción de unión de unión a antígenos del mismo, se disocia del TNF\alpha humano con una K_{off} de 5 x 10^{-4} s^{-1} o menor. Aún más preferiblemente, el anticuerpo, o la porción de unión a antígenos del mismo, se disocia del TNF\alpha humano con una K_{off} de 1 x 10^{-4} s^{-1} o menor.
En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo humano, o una porción de unión a antígenos del mismo, con una LCVR que tiene un dominio CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:3, o modificada a partir de la SEC ID Nº: 3 por una sola sustitución de alanina en la posición 1, 4, 5, 7 u 8, y con una HCVR que tiene un dominio CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4, o modificada a partir de la SEC ID Nº: 4 por una sola sustitución de alanina en la posición, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 u 11. Más preferiblemente, la LCVR tiene además un dominio CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5 y la HCVR además tiene un dominio CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6. Aún más preferiblemente, la LCVR tiene además un dominio CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 7 y la HCVR tiene un dominio CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8.
En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo humano aislado, o una porción de unión de antígenos del mismo, con un LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2. En ciertas realizaciones, el anticuerpo tiene una región constante de cadena pesada de IgG1 o una región constante de cadena pesada de IgG4. En otras realizaciones, el anticuerpo es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')_{2} o un fragmento Fv monocatenario.
En otras realizaciones, la invención proporciona anticuerpos, o porciones de unión a antígenos de los mismos, con una LCVR que tiene un dominio CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13; SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26 o con una HCVR que tiene un dominio CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº:28, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 31, SEC ID Nº: 32, SEC ID Nº: 33, SEC ID Nº: 34 y SEC ID Nº: 35.
En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo humano aislado, o una porción de unión a antígenos del mismo, que neutraliza la actividad del TNF\alpha humano pero no del TNF\beta humano (linfotoxina). En una realización preferida, el anticuerpo humano, o la porción de unión a antígenos del mismo, neutraliza la actividad del TNF\alpha humano, del TNF\alpha de chimpancé y al menos un TNF\alpha de primate adicional seleccionado entre el grupo compuesto por TNF\alpha de mandril, TNF\alpha de tití, TNF\alpha de mono cynomolgus y TNF\alpha de rhesus. Preferiblemente, el anticuerpo también neutraliza la actividad de al menos un TNF\alpha que no es de primate. Por ejemplo, en una subrealización, el anticuerpo humano aislado, o la porción de unión a antígenos del mismo, también neutraliza la actividad del TNF\alpha canino. En otra subrealización, el anticuerpo humano aislado, o la porción de unión a antígenos del mismo, también neutraliza la actividad del TNF\alpha de cerdo. En otra subrealización, el anticuerpo humano aislado, o la porción de unión a antígenos del mismo, también neutraliza la actividad del TNF\alpha de ratón.
Otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que modifican los anticuerpos, o porciones de unión a antígenos, de la invención. Un ácido nucleico preferido de la invención, que codifica un D2E7 LCVR, tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 7 y la SEC ID Nº 36. Otro ácido nucleico preferido de la invención, que codifica un D2E7 HCVR, tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 8 y la SEC ID Nº 37. La invención también incluye vectores de expresión recombinantes que llevan los ácidos nucleicos que codifican anticuerpos de la invención, y células hospedadores en las que se han introducido tales vectores, así como métodos para obtener los anticuerpos de la invención por medio del cultivo de las células hospedadoras de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a métodos para inhibir la actividad del TNF\alpha humano usando un anticuerpo, o una porción de unión a antígenos del mismo, de la invención. En una realización, el método comprende poner en contacto el TNF\alpha humano con el anticuerpo de la invención, o la porción de unión a antígenos del mismo, de tal forma que se inhiba la actividad del TNF\alpha humano. En otra realización, el método comprende administrar un anticuerpo de la invención, o una porción de unión a antígenos del mismo, a un ser humano que sufra un trastorno en el que la actividad del TNF\alpha es perjudicial, de tal forma que se inhiba la actividad del TNF\alpha humano en el sujeto humano. El trastorno puede ser, por ejemplo, sépsis, una enfermedad autoinmune (por ejemplo, artritis reumatoide, alergia, esclerosis múltiple, diabetes autoinmune, uveítis autoinmune y síndrome nefrótico), una enfermedad infecciosa, una malignidad, el rechazo de un transplante o la enfermedad del hospedador contra un injerto, un trastorno pulmonar, un trastorno óseo, un trastorno intestinal o un trastorno cardíaco.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A y 1B muestran las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de D2E7 (D2E7 VL; también mostrada en la SEC ID Nº: 1), mutantes de exploración de alanina de D2E7 VL (LD2E7*.A1, LD2E7*.A3, LD2E7*.A4, LD2E7*.A5, LD2E7*.A7 y LD2E7*.A8), la región variable de cadena ligera del anticuerpo 2SD4 relacionado con D2E7 (2SD4 VL; también mostrado en la SEC ID Nº: 9) y otras regiones variables de cadena ligera relacionadas con D2E7 (EP B12, VL10E4, VL100A9, VL100D2, VL10F4, LOE5, VLLOF9, VLL0F10, VLLOG7, VLLOG9, VLLOH1, VLLOH10, VL1B7, VL1C1, VL1C7, VL0.1F4, VL0.1H8, LOE7, LOE7.A y LOE7. T). La Figura 1A muestra los dominios FR1, CDR1, FR2 y CDR2. La Figura 1B muestra los dominios FR3, CDR3 y FR4. Los dominios CDR1 (``CDR L1''), CDR2 (``CDR L2'') y CDR3 (``CDR L3'') de la cadena ligera están recuadrados.
Las Figuras 2A y 2B muestran las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de D2E7 VH; también mostrada en la SEC ID Nº: 2), mutantes de exploración de alanina de D2E7 VH (HD2E7*.A1, HD2E7*.A2, HD2E7*.A3, HD2E7*.A4, HD2E7*.A5, HD2E7*.A6, HD2E7*.A7, HD2E7*.A8 y HD2E7*.A9), la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 2SD4 relacionado con D2E7 (2SD4 VH; también mostrada en la SEC ID Nº: 10) y otras regiones variables de cadena pesada relacionadas con D2E7 (VH1B11, VH1D8, VH1A11, VH1B12, VH1-D2, VH1E4, VH1F6, VH1G1, 3C-H2, VH1-D2.N y VH1-D2.Y). La Figura 2A muestra los dominios FR1, CDR1, FR2 y CDR2. La Figura 2B muestra los dominios FR3, CDR3 y FR4. Los dominios CDR1 (``CDR H1''), CDR2 (``CDR H2'') y CDR3 (``CDR H3'') de la cadena pesada están recuadrados.
La Figura 3 es un gráfico que representa la inhibición de la citotoxicidad de L929 inducida por TNF\alpha por el anticuerpo D2E7 anti-hTNF\alpha humano, en comparación con el anticuerpo MAK 195 anti-hTNF\alpha murino.
La Figura 4 es un gráfico que representa la inhibición de la unión de rhTNF\alpha a receptores de hTNF\alpha en células U-937 o el anticuerpo D2E7 anti-hTNF\alpha, en comparación con el anticuerpo MAK 195 anti-hTNF\alpha.
La Figura 5 es un gráfico que representa la inhibición de la expresión de ELAM-1 inducida por TNF\alpha en HUVEC por el anticuerpo D2E7 anti- hTNF\alpha, en comparación con el anticuerpo MAK 191 anti-hTNF\alpha.
La Figura 6 es un gráfico de barras que representa la protección de la letalidad inducida por TNF\alpha en ratones sensibilizados a D-galactosamina por medio de la administración del anticuerpo D2E7 anti-hTNF\alpha (barras negras), en comparación con el anticuerpo MAK 195 anti-hTNF\alpha murino (barras rayadas).
La Figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de D2E7, con la secuencia de aminoácidos prevista debajo de la secuencia de nucleótidos. Las regiones CDR L1, CDR L2 y CDR L3 están subrayadas.
La Figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada de D2E7, con la secuencia de aminoácidos prevista debajo de la secuencia de nucleótidos. Las regiones CDR H1, CDR H2 y CDR H3 están subrayadas.
La Figura 9 es un gráfico que representa el efecto del tratamiento del anticuerpo D2E7 sobre el tamaño medio de la articulación de ratones transgénicos Tg197 como un modelo de poliartritis.
Descripción detallada de la invención
Esta invención se refiere a anticuerpos humanos aislados, o a porciones de unión a antígenos de los mismos, que se unen al TNF\alpha humano con alta afinidad, una baja velocidad de disociación y una alta capacidad de neutralización. Diversos aspectos de la invención se refieren a anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, y composiciones farmacéuticas de los mismos, así como a ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante y células hospedadoras para obtener tales anticuerpos y fragmentos. La invención también incluye métodos para usar los anticuerpos de la invención para detectar el TNF\alpha humano o para inhibir la actividad del TNF\alpha humano in vitro o in vivo.
Para que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, primero se definen ciertos términos.
La expresión "TNF\alpha humano" (abreviada en este documento como hTNF\alpha o símplemente hTNF), como se usa en este documento, pretende hacer referencia a una citoquina humana que existe como una forma secretada de 17 kD y una forma asociada a la membrana de 26 kD, cuya forma biológicamente activa se compone de un trímero de moléculas de 17 kD unidas de forma no covalente. La estructura del hTNF\alpha se describe adicionalmente, por ejemplo, en Pennica, D., et al. (1894) Nature 312:724-729; Davis, J. M., et al. 81987) Biochemistry 26:1322-1326; y Jones, E. Y., et al. (1989) Nature 338:225-228. La expresión TNF\alpha humano pretende incluir el TNF\alpha humano recombinante (rhTNF\alpha) que puede prepararse por métodos de expresión recombinante convencionales o adquirirse en el mercado (R y D Systems, Nº de catálogo 210-TA, Minneapolis, MN).
El término "anticuerpo", como se usa en este documento, pretende hacer referencia a moléculas de inmunoglobulina compuestas de cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada (abreviada en este documento como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en este documento como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), separadas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
La expresión "porción de unión a antígenos" de un anticuerpo (o símplemente "porción de anticuerpo"), como se usa en este documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, hTNF\alpha). Se ha demostrado que la función de unión a antígenos de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión incluidos dentro de la expresión ``porción de unión a antígenos'' de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consta de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) u n fragmento F(ab')_{2}, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un enlace disulfuro a la región de visagra; (iii) un fragmento Fd que consta de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consta de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al.,(1989) Nature 341: 544-546), que consta de un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, por un engarce sintético que permita que se obtengan como una sola cadena proteica en la que las regiones VL y VH están emparejadas para formar moléculas monovalentes (conocido como Fv monocatenario (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Aca. Sci. USA 85:5879-5883). Se pretende que tales anticuerpos monocatenarios también se incluyan dentro de la expresión ``porción de unión a antígenos'' de un anticuerpo. También se incluyen otras formas de anticuerpos monocatenarios, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los que se expresan dominios VH y VL en una sola cadena polipeptídica, pero usando un engarce que es demasiado corto como para permitir la formación de parejas entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de esta manera a que los dominios formen parejas con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígenos (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121- 1123).
Además, un anticuerpo o una porción de unión a antígenos del mismo puede formar parte de moléculas de inmunoadhesión mayores, formadas por la asociación covalente o no covalente del anticuerpo o la porción de anticuerpo con una o más proteínas o péptidos distintos. Los ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región del núcleo de estreptavidina para obtener una molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101) y el uso de un resto de cisteína, un péptido marcador y una cola de polihistidina C-terminal para obtener moléculas de scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S. M., et al., (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Pueden prepararse porciones de anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F(ab')_{2} a partir de anticuerpos enteros usando técnicas convencionales, tales como digestión con papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos enteros. Además, pueden obtenerse anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión usando técnicas de ADN recombinante convencionales, como se describe en este documento.
La expresión "anticuerpo humano", como se usa en este documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos aminoacídicos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o de localización específica in vitro ,o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular en la CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en este documento, no pretende incluir anticuerpos en los que se han injertado secuencias de CDR procedentes de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, en secuencias estructurales humanas.
La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en este documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como los anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora (descrito adicionalmente en la Sección II mostrada más adelante), anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatoria recombinante (descritos adicionalmente en la Sección III, mostrada más adelante), anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica el empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y de esta manera, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden y están relacionadas con las secuencias VH y VL de la línea general humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la línea general de anticuerpos humanos in vivo.
Un "anticuerpo aislado", como se usa en este documento, pretende hacer referencia a un anticuerpo que está sustancialmente exento de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a hTNF\alpha está sustancialmente exento de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de hTNF\alpha). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a hTNF\alpha puede presentar reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de TNF\alpha de otras especies (como se discute con más detalle más adelante). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente exento de otros materiales celulares y/o agentes químicos.
Un "anticuerpo neutralizador", como se usa en este documento (o un "anticuerpo que neutraliza la actividad de hTNF\alpha"), pretende hacer referencia a un anticuerpo cuya unión a hTNF\alpha ocasiona la inhibición de la actividad biológica de hTNF\alpha. Esta inhibición de la actividad biológica de hTNF\alpha puede evaluarse midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de hTNF\alpha, tal como la citotoxicidad inducida por hTNF\alpha (in vitro o in vivo), la activación celular inducida por hTNF\alpha y la unión de hTNF\alpha a receptores de hTNF\alpha. Estos indicadores de la actividad biológica de hTNF\alpha pueden evaluarse por uno o más de varios ensayos convencionales in vitro o in vivo conocidos en la técnica (véase el Ejemplo 4). Preferiblemente, la capacidad de un anticuerpo para neutralizar la actividad de hTNF\alpha se evalúa por medio de la inhibición de la citotoxicidad de células L929 inducida por hTNF\alpha. Como parámetro adicional o alternativo de la actividad de hTNF\alpha, puede evaluarse la capacidad de un anticuerpo de inhibir la expresión de ELAM-1 inducida por hTNF\alpha en HUVEC, como una medida de la activación celular inducida por hTNF\alpha.
La expresión "resonancia de plasmón superficial", como se usa en este documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas a tiempo real por la detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweeden y Piscataway, NJ). Como descripciones adicionales, véase el Ejemplo 1 y Jönsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jönsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125- 131; y Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:286-277.
El término "K_{off}", como se usa en este documento, pretende hacer referencia a la constante de velocidad para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno.
El término "K_{d}", como se usa en este documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular.
El término "molécula de ácido nucleico", como se usa en este documento, pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es un ADN bicatenario.
La expresión "molécula de ácido nucleico aislada", como se usa en este documento haciendo referencia a ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpo (por ejemplo, VH, VL, CDR3) que se unen a hTNF\alpha, pretende hacer referencia a una molécula de ácido nucleico en la que las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo o la porción de anticuerpo carecen de otras secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpo que se unen a antígenos distintos de hTNF\alpha, pudiendo flanquear dichas otras secuencias de forma natural el ácido nucleico en un ADN genómico humano. De esta manera, por ejemplo, un ácido nucleico aislado de la invención que codifica una región VH de un anticuerpo anti-TNF\alpha no contiene ninguna otra secuencia que codifique otra región VH que se una a antígenos distintos de TNF\alpha.
El término "vector", como se usa en este documento, pretende hacer referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular al que pueden unirse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, donde pueden unirse segmentos de ADN adicionales al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora, y de esta manera se replican junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Tales vectores se denominan en este documento ``vectores de expresión recombinante'' (o símplemente ``vectores de expresión''). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, ``plásmido'' y ``vector'' pueden usarse indistintamente, ya que el plásmido es la forma de vector usada más comúnmente. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus y virus asociados a adenovirus), que tienen funciones equivalentes.
La expresión "célula hospedadora recombinante" (o símplemente "célula hospedadora"), como se usa en este documento, pretende hacer referencia a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que tales términos pretenden hacer referencia no sólo a la célula objeto particular, sino a la progenie de tal célula. Como pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones posteriores debido a mutaciones o a influencias ambientales, de hecho, tal progenie puede no ser idéntica a la célula parental, pero se incluye dentro del alcance de la expresión "célula hospedadora" como se usa en este documento.
En las siguientes subsecciones se describen con más detalle diversos aspectos de la invención.
I. Anticuerpos humanos que se unen a TNF\alpha humano
Esta invención proporciona anticuerpos humanos aislados, o porciones de unión a antígenos de los mismos, que se unen al TNF\alpha humano con alta afinidad, una baja velocidad de disociación y una alta capacidad de neutralización. Preferiblemente, los anticuerpos humanos de la invención son anticuerpos anti- hTNF\alpha humanos neutralizadores recombinantes. El anticuerpo neutralizador recombinante más preferido de la invención se denomina en este documento D2E7 y tiene las secuencias VL y VH mostradas en la Figura 1A, 1B y en la Figura 2A, 2B, respectivamente (la secuencia de aminoácidos de la región VL de D2E7 también se muestra en la SEC ID Nº:1; la secuencia de aminoácidos de la región VH de D2E7 también se muestra en la SEC ID Nº:2). Las propiedades de unión de D2E7, en comparación con el mAb MAK 195 anti-hTNF\alpha murino que presenta alta afinidad y baja cinética de disociación y otro anticuerpo anti-hTNF\alpha humano relacionado en secuencia con D2E7, 2SD4, se resumen a continuación:
Anticuerpo K_{off} seg^{-1} K_{on} M^{-1} seg^{-1} K_{D} M Estequiometría
D2E7 IgG1 8,81 x 10^{-5} 1,91 x 10^{5} 6,09 x 10^{-10} 1,2
2SD4 IgG4 8,4 x 10^{-3} 4,20 x 10^{5} 2,00 x 10^{-8} 0,8
MAK 195 8,70 x 10^{-5} 1,90 x 10^{5} 4,60 x 10^{-10} 1,4
F(ab')_{2}
El anticuerpo D2E7, y los anticuerpos relacionados, también presentan una fuerte capacidad de neutralizar la actividad de hTNF\alpha, como se evalúa por varios ensayos in vitro e in vivo(véase el Ejemplo 4). Por ejemplo, estos anticuerpos neutralizan la citotoxicidad inducida por hTNF\alpha de células L929 con valores de CI_{50} en el intervalo de aproximadamente 10^{-7} M a aproximadamente 10^{-10} M. D2E7, cuando se expresa como un anticuerpo IgG1 de longitud completa, neutraliza la citotoxicidad inducida por hTNF\alpha de células L929 con una CI_{50} de aproximadamente 1,25 x 10^{-10} M. Además, la capacidad de neutralización de D2E7 se mantiene cuando el anticuerpo se expresa como un fragmento Fab, F(ab')_{2} o scFv. D2E7 también inhibe la activación celular inducida por TNF\alpha, medida por la expresión de ELAM-1 inducida por hTNF\alpha en HUVEC (CI_{50} = aproximadamente 1,85 x 10^{-10} M) y la unión de hTNF\alpha a receptores de hTNF\alpha en células U-937 (CI_{50} = aproximadamente 1,56 x 10^{-10} M). Independientemente de esto último, D2E7 inhibe la unión de hTNF\alpha a receptores de hTNF\alpha tanto de tipo p55 como de tipo p75. Además, el anticuerpo inhibe la letalidad inducida por hTNF\alpha in vivo en ratones (DE_{50} = 1-2,5 \mug/ratón).
Con respecto a la especificidad de unión de D2E7, este anticuerpo se une al TNF\alpha humano en diversas formas, incluyendo hTNF\alpha soluble, hTNF\alpha transmembrana y hTNF\alpha unido a receptores celulares. D2E7 no se une específicamente a otras citoquinas tales como linfotoxina (TNF\beta), IL- 1\alpha, IL-1\beta, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IFN\gamma y TGF\beta. Sin embargo, D2E7 presenta reactividad cruzada con factores de necrosis tumoral de otras especies. Por ejemplo, el anticuerpo neutraliza la actividad de al menos cinco TNF\alpha de primate (chimpancé, babuíno, tití, mono cynomolgus y mono rhesus), con valores de CI_{50} aproximadamente equivalentes a la neutralización de hTNF\alpha (véase el Ejemplo 4 subsección E). D2E7 también neutraliza la actividad del TNF\alpha de ratón, aunque aproximadamente 1000 veces peor que el TNF\alpha humano (véase el Ejemplo 4, subsección E). D2E7 también se une al TNF\alpha canino y porcino.
En un aspecto, la invención se refiere a anticuerpos y porciones de anticuerpos D2E7, a anticuerpos y porciones de anticuerpos relacionados con D2E7, y a otros anticuerpos y porciones de anticuerpos humanos, con propiedades equivalentes a D2E7, tales como una alta afinidad de unión a hTNF\alpha con baja cinética de disociación y alta capacidad de neutralización. En una realización, la invención proporciona un anticuerpo humano aislado, o una porción de unión a antígenos del mismo, que se disocia del TNF\alpha humano con una K_{d} de 1 x 10^{-8} M o menor y una constante de velocidad K_{off} de 1 x 10^{-3} s^{-1} o menor, determinada por resonancia de plasmón superficial, y neutraliza la citotoxicidad del TNF\alpha humano en un ensayo de L929 in vitro convencional con una CI_{50} de 1 x 10^{-7} M o menor. Más preferiblemente, el anticuerpo humano aislado, o la porción de unión a antígenos del mismo, se disocia del TNF\alpha humano con una K_{off} de 5 x 10^{-4} s^{-1} o menor, o incluso más preferiblemente con una K_{off} de 1 x 10^{-4} s^{-1} o menor. Más preferiblemente, el anticuerpo humano aislado, o la porción de unión a antígenos del mismo, neutraliza la citotoxicidad del TNF\alpha humano en un ensayo de L929 in vitro convencional con una CI_{50} de 1 x 10^{-8} M o menor, incluso más preferiblemente con una CI_{50} de 1 x 10^{-9} M o menor, y aún más preferiblemente con una CI_{50} de 5 x 10^{-10} M o menor. En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante humano aislado, o una porción de unión a antígenos del mismo. En otra realización preferida, el anticuerpo también neutraliza la activación celular inducida por TNF\alpha, evaluada usando un ensayo in vitro convencional para la expresión de ELAM-1 inducida por TNF\alpha en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC).
El análisis de resonancia de plasmón superficial para determinar la K_{d} y K_{off} puede realizarse como se describe en el Ejemplo 1. En el Ejemplo 4, subsección A, se describe un ensayo de L929 in vitro convencional para determinar los valores de CI_{50}. En el Ejemplo 4, subsección C, se describe un ensayo in vitro convencional para la expresión de ELAM-1 inducida por TNF\alpha en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Los ejemplos de anticuerpos humanos recombinantes que satisfacen, o que se prevé que satisfagan, los criterios de cinética y neutralización mencionados anteriormente incluyen anticuerpos que tienen los siguientes pares [VH/VL], cuyas secuencias se muestran en las Figuras 1A, 1B, 2A y 2B (véanse también los Ejemplos 2, 3 y 4 para los análisis de cinética y neutralización): [D2E7 VH/D2E7 VL]; [HD2E7*.A1/D2E7 VL], [HD2E7*.A2/D2E7 VL], [HD2E7*.AE/D2E7 VL], [D2E7*.A4/D2E7 VL], [D2E7*.A5/D2E7 VL], [HD2E7*.A6/D2E7 VL], [HD2E7*.A7/D2E7 VL], [HD2E7*.A8/D2E7 VL], [HD2E7*.
\break
A9/D2E7 VL], [D2E7 VH/LD2E7*.A1], [D2E7 VH/LD2E7*.A4], [D2E7 VH/LD2E7*.A5], [D2E7 VH/LD2E7*.A7], [D2E7 VH/LD2E7*.A8], [D2E7* .A9/LD2E7*.A1], [VH1-D2/LOE7], [VH1-D2.N/LOE7.T], [VH1-D2.Y/LOE7.A], [VH1-D2.N/LOE7.A], [VH1- D2/EP B12] y [3C-H2/LOE7].
Es bien conocido en la técnica que los dominios CDR3 de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos juegan un papel importante en la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo a un antígeno. Por consiguiente, en otro aspecto, la invención se refiere a anticuerpos humanos que tienen bajas cinéticas de disociación para la asociación con hTNF\alpha y que tienen dominios de CDR3 de cadena ligera y pesada que son estructuralmente idénticos o están relacionados con los de D2E7. Como se demuestra en el Ejemplo 3, la posición 9 de la CDR3 de VL de D2E7 puede ocuparse por Ala o Thr sin que se vea afectada sustancialmente la K_{off}. Por consiguiente, un motivo consenso para la CDR3 de VL de D2E7 comprende la secuencia de aminoácidos: Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEC ID nº: 3). Además, la posición 12 de la CDR3 de VH de D2E7 puede ocuparse por Tyr o Asn, sin que se vea afectada sustancialmente la K_{off}. Por consiguiente, un motivo consenso para la CDR3 de VH de D2E7 comprende la secuencia de aminoácidos: V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEC ID Nº: 4). Además, como se demuestra en el Ejemplo 2, el dominio de CDR3 de las cadenas pesada y ligera de D2E7 es susceptible de sustitución con un solo resto de alanina (en posición 1, 4, 5, 7 u 8 dentro de la CDR3 de VL o en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 u 11 dentro de la CDR3 de VH) sin que se vea afectada sustancialmente la K_{off}. Además, el especialista en la técnica apreciará que, dada la susceptibilidad de los dominios de CDR3 de VL y VH de D2E7 a las sustituciones por alanina, es posible la sustitución de otros aminoácidos dentro de los dominios CDR3 mientras se retiene al mismo tiempo la baja constante de velocidad de disociación del anticuerpo, en particular sustituciones con aminoácidos conservativos. Una ``sustitución de aminoácido conservativo'', como se usa en este documento, es una en la que un resto aminoacídico se reemplaza por otro resto aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificaciones beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Preferiblemente, no se realizan más de una a cinco sustituciones de ácidos conservativas dentro de los dominios CDR3 de VL y/o VH de D2E7. Más preferiblemente, no se realizan más de una a tres sustituciones de ácidos conservativas dentro de los dominios CDR3 de VL y/o VH de D2E7. Además, no deben realizarse sustituciones de aminoácidos conservativas en posiciones de aminoácidos críticas para la unión a hTNF\alpha. Como se muestra en el Ejemplo 3, las posiciones 2 y 5 de la CDR3 de VL de D2E7 y las posiciones 1 y 7 de la CDR3 de VH de D2E7 parecen ser críticas para la interacción con hTNF\alpha y, de esta manera, preferiblemente no se realizan sustituciones de aminoácidos conservativas en estas posiciones (aunque es aceptable una sustitución de alanina en la posición 5 de la CDR3 de VL de D2E7, como se ha descrito anteriormente).
Por consiguiente, en otra realización, la invención proporciona un anticuerpo humano aislado, o una porción de unión a antígenos del mismo, con las siguientes características:
a) se disocia del TNF\alpha humano con una constante de velocidad K_{off} de 1 x 10^{-3} s^{-1} o menor, determinada por resonancia de plasmón superficial;
b) tiene un dominio de CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3, o modificada a partir de la SEC ID Nº: 3 por una sola sustitución de alanina en la posición 1, 4, 5, 7 u 8 o por una a cinco sustituciones de aminoácidos conservativas en las posiciones 1, 3, 4, 6, 7, 8 y/o 9;
c) tiene un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4, o modificada a partir de la SEC ID Nº: 4 por una sola sustitución de alanina en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 u 11 o por una a cinco sustituciones de aminoácidos conservativas en las posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y/o 12.
Más preferiblemente, el anticuerpo, o la porción de unión a antígenos del mismo, se disocia del TNF\alpha humano con una K_{off} de 5 x 10^{-4} s^{-1} o menor. Incluso más preferiblemente, el anticuerpo, o la porción de unión a antígenos del mismo, se disocia del TNF\alpha humano con una K_{off} de 1 x 10^{-4} s^{-1} o menor.
En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo humano aislado, o una porción de unión a antígenos del mismo, con una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene un dominio CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3, o modificada a partir de la SEC ID Nº:3 por una sola sustitución de alanina en la posición 1, 4, 5, 7 u 8 y con una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene un dominio CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4, o modificada a partir de la SEC ID Nº: 4 por una sola sustitución de alanina en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 u 11. Preferiblemente, la LCVR tiene además un dominio CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5 (es decir, la CDR2 de VL de D2E7) y la HCVR tiene además un dominio CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6 (es decir, la CDR2 de VH de D2E7). Incluso más preferiblemente, la LCVR tiene además un dominio CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 7 (es decir, la CDR1 de VL de D2E7) y la HCVR tiene un dominio CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8 (es decir, la CDR1 de VH de D2E7). Las regiones estructurales para la VL, preferiblemente proceden de la familia de la línea germinal humana V_{\kappa}I, más preferiblemente del gen V\kappa de la línea germinal humana A20 y aún más preferiblemente de las secuencias estructurales de VL de D2E7 mostradas en las Figuras 1A y 1B. Las regiones estructurales para VH preferiblemente proceden de la familia de la línea germinal humana V_{H}3, más preferiblemente del gen VH de la línea germinal humana DP-31 y aún más preferiblemente de las secuencias estructurales de VH de D2E7 mostradas en las Figuras 2A y 2B.
En otra realización la invención proporciona un anticuerpo humano aislado, o una porción de unión a antígenos del mismo, con una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 (es decir, la VL de D2E7) y una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 (es decir, la VH de D2E7). En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada, tal como una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD. Preferiblemente, la región constante de cadena pesada es una región constante de cadena pesada de IgG1 o una región constante de cadena pesada de IgG4. Además, el anticuerpo puede comprender una región constante de cadena ligera, una región constante de cadena ligera kappa o una región constante de cadena ligera lambda. Preferiblemente, el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera kappa. Como alternativa, la porción de anticuerpo puede ser, por ejemplo, un fragmento Fab o un fragmento Fv monocatenario.
En otras realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo humano aislado, o una porción de unión a antígenos del mismo, que tiene dominios CDR3 de VL y VH relacionados con D2E7, por ejemplo, anticuerpos o porciones de unión a antígenos de los mismos, con una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene un dominio CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº:11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19 SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25 y SEC ID Nº: 26 o con una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene un dominio CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por la SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº:28, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 31, SEC ID Nº: 32, SEC ID Nº: 33, SEC ID Nº: 34 y SEC ID Nº: 35.
En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo humano recombinante, o una porción de unión a antígenos del mismo, que neutraliza la actividad del TNF\alpha humano pero no del TNF\beta humano. Preferiblemente, el anticuerpo, o la porción de unión a antígenos del mismo, también neutraliza la actividad del TNF\alpha de chimpancé y al menos un TNF\alpha de primate adicional seleccionado entre el grupo compuesto por TNF\alpha de babuíno, TNF\alpha de tití, TNF\alpha de mono cynomolgus y TNF\alpha de mono rhesus. Preferiblemente, el anticuerpo, o la porción de unión a antígenos del mismo, neutraliza al TNF\alpha humano, de chimpancé y/o de otro primate en un ensayo de L929 in vitro convencional con una CI_{50}de 1 x 10^{-8} M o menor, más preferiblemente de 1 x 10^{-9} M o menor e incluso más preferiblemente de 5 x 10^{-10} M o menor. En una subrealización, el anticuerpo también neutraliza la actividad del TNF\alpha canino, preferiblemente en un ensayo de L929 in vitro convencional con una CI_{50} de 1 x 10^{-7} M o menor, más preferiblemente de 1 x 10^{-8} M o menor e incluso más preferiblemente de 5 x 10^{-9} M o menor. En otra subrealización, el anticuerpo también neutraliza la actividad del TNF\alpha de cerdo preferiblemente en un ensayo de L929 in vitro convencional con una CI_{50} de 1 x 10^{-5} M o menor, más preferiblemente de 1 x 10^{-6} M o menor e incluso más preferiblemente de 5 x 10^{-7} M o menor. En otra realización, el anticuerpo también neutraliza la actividad del TNF\alpha de ratón preferiblemente en un ensayo de L929 in vitro convencional con una CI_{50} de 1 x 10^{-4} M o menor, más preferiblemente de 1 x 10^{-5} M o menor e incluso más preferiblemente de 5 x 10^{-6} M o menor.
Un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede modificarse o unirse a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína. Por consiguiente, los anticuerpos y las porciones de anticuerpo de la invención pretenden incluir formas derivatizadas y modificadas de otra forma de los anticuerpos anti-hTNF\alpha humanos descritos en este documento, incluyendo moléculas de inmunoadhesión. Por ejemplo, un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención puede unirse funcionalmente (por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra forma) a una o más entidades moleculares distintas, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o diacuerpo), un agente detectable, un agente citotóxido, un agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que puede mediar la asociación del anticuerpo o de la porción de anticuerpo con otra molécula (tal como la región de núcleo de estreptavidina o una señal de polihistidina).
Un tipo de anticuerpo modificado se produce por el entrecruzamiento de dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de tipos diferentes, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos). Los entrecruzamientos adecuados incluyen los que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos con reactividad distinta separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil- N-hidroxisuccinimida) u homobifuncional (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo). Tales engarces están disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, IL.
Los agentes detectables útiles con los que puede modificarse un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención incluyen compuestos fluorescentes. Los agentes fluorescentes detectables ilustrativos incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de cinc o de metilamina-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina y similares. Un anticuerpo también puede modificarse con enzimas detectables, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, glucosa, oxidasa y similares. Cuando un anticuerpo se modifica con una enzima detectable, se detecta por la adición de reactivos adicionales de forma que la enzima se use para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando está presente el agente detectable peroxidasa de rábano picante, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción coloreado, que es detectable. Un anticuerpo también puede modificarse con biotina, y detectarse por medio de la medición indirecta de la unión de avidina o estreptavidina.
II. Expresión de anticuerpos
Un anticuerpo, o una porción de anticuerpo, de la invención puede prepararse por la expresión recombinante de genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina en una célula hospedadora. Para expresar un anticuerpo de forma recombinante, una célula hospedadora se transfecta con uno o más vectores de expresión recombinantes que llevan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina del anticuerpo de tal forma que las cadenas ligera y pesada se expresen en la célula hospedadora y, preferiblemente, se secreten en el medio en el que se cultivan las células hospedadoras, pudiendo recuperarse los anticuerpos a partir de dicho medio. Se usan metodologías de ADN recombinante convencionales para obtener genes de cadena pesada y ligera de anticuerpos, incorporar estos genes en vectores de expresión recombinantes e introducir los vectores en células hospedadoras, tales como las descritas en Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) y en la Patente de Estados Unidos Nº 4.816.397 de Boss et al.
Para expresar D2E7 o un anticuerpo relacionado con D2E7, primero se obtienen fragmentos de ADN que codifican las regiones variables de cadena ligera y pesada. Estos ADN pueden obtenerse por amplificación y modificación de las secuencias variables de cadena ligera y pesada de la línea germinal usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la técnica se conocen genes de la región variable de cadena pesada y ligera humana (véase, por ejemplo, la base de datos de la secuencia de la línea germinal humana "Vbase"; véase también Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH Nº 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline V_{H} Sequences Reveals about Fifty Groups of V_{H} Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line V_{\kappa} Segments Reveals a Strong Bials in ther Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-839; cuyos contenidos se incorporan expresamente en este documento como referencia. Para obtener un fragmento de ADN que codifique la región variable de la cadena pesada de D2E7, o un anticuerpo relacionado con D2E7, se amplifica un miembro de la familia V_{H}3 de genes VH de la línea germinal humana por PCR convencional. Más preferiblemente, se amplifica la secuencia de la línea germinal VH de DP-31. Para obtener un fragmento de ADN que codifique la región variable de cadena ligera de D2E7, o un anticuerpo relacionado con D2E7, se amplifica un miembro de la familia V_{\kappa}I de genes VL de la línea germinal humana por PCR convencional. Más preferiblemente, se amplifica la secuencia de la línea germinal A20 VL. Pueden diseñarse cebadores de PCR adecuados para uso en la amplificación de las secuencias de VL de la línea general A20 y VH de la línea germinal DP-31 basándose en las secuencias de nucleótidos descritas en las referencias citadas anteriormente, usando métodos convencionales.
Una vez obtenidos los fragmentos VH y VL de la línea germinal, estas secuencias pueden mutarse para codificar las secuencias de aminoácidos de D2E7 o relacionadas con D2E7 descritas en este documento. Las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de ADN de VH y VL de la línea germinal primero se comparan con las secuencias de aminoácidos de VH y VL de D2E7 o relacionadas con D2E7 para identificar restos aminoacídicos en la secuencia de D2E7 o relacionada con D2E7 que difiere de la línea germinal. Después, los nucleótidos apropiados de las secuencias de ADN de la línea germinal se mutan de tal forma que la secuencia de la línea germinal mutada codifique la secuencia de aminoácidos de D2E7 o relacionada con D2E7, usando el código genético para determinar los cambios de nucleótidos que deben realizarse. La mutagénesis de las secuencias de la línea germinal se realiza por métodos convencionales, tales como mutagénesis mediada por PCR (en la que los nucleótidos mutados se incorporan en los cebadores de PCR de tal forma que el producto de PCR contenga las mutaciones) o mutagénesis de localización dirigida.
Además, debe indicarse que si las secuencias de ``línea germinal'' obtenidas por amplificación por PCR codifican diferencias de aminoácidos en las regiones estructurales a partir de la configuración de la línea germinal verdadera (es decir, diferencias en la secuencia amplificada en comparación con la secuencia de la línea germinal verdadera, por ejemplo, como resultado de una mutación somática), puede ser deseable cambiar estas diferencias de aminoácidos de nuevo a las secuencias de la línea germinal verdadera (es decir, "retromutación" de restos estructurales a la configuración de la línea germinal).
Una vez que se han obtenido fragmentos de ADN que codifican segmentos VH y VL de D2E7 o relacionados con D2E7 (por amplificación y mutagénesis de los genes VH y VL de la línea germinal, como se ha descrito anteriormente), estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente por técnicas de ADN recombinante convencionales, por ejemplo para convertir los genes de la región variable en genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, en genes de fragmentos Fab o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se une operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un engarce flexible. La expresión "unido operativamente", como se usa en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN se unen de tal forma que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanezcan en fase.
El ADN aislado que codifica la región VH puede convertirse en un gen de cadena pesada de longitud completa por medio de la unión operativa del ADN que codifica VH con otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de genes de región constante de cadena pesada humanas se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH Nº 91-3242) y pueden obtenerse fragmentos de ADN que incluyen estas regiones por amplificación por PCR convencional. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero más preferiblemente es una región constante de IgG1 o IgG4. Para un gen de cadena pesada de un fragmento Fab, el ADN que codifica VH puede unirse operativamente a otra molécula de ADN que codifica sólo la región constante CH1 de cadena pesada.
El ADN aislado que codifica la región VL puede convertirse en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como un gen de cadena ligera Fab) por medio de la unión operativa del ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de regiones constantes de cadena ligera humana se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH Nº 91-3242) y pueden obtenerse fragmentos de ADN que comprenden estas regiones por amplificación de PCR convencional. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero más preferiblemente es una región constante kappa.
Pare crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y Vl se unen operativamente a otro fragmento que codifica un enlace flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly_{4}-Ser)_{3}, de tal forma que las secuencias VH y VL puedan expresarse como una proteína monocatenaria contigua, con las regiones VL y VH unidas por el engarce flexible (véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554).
Para expresar los anticuerpos o porciones de anticuerpo de la invención, se insertan ADN que codifican cadenas ligera y pesada de longitud completa o parcial, obtenidas como se ha descrito anteriormente, en vectores de expresión de tal forma que los genes se unan operativamente a secuencias de control, de la transcripción y la traducción. En este contexto, la expresión ``unido operativamente'' pretende significar que un gen de anticuerpo se une a un vector de tal forma que las secuencias de control de la transcripción y la traducción dentro del vector realicen su función deseada de regular la transcripción y la traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen de manera que sean compatibles con la célula hospedadora de expresión usada. El gen de cadena ligera de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo pueden insertarse en vectores separados o, más típicamente, los dos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión por métodos convencionales (por ejemplo, unión de sitios de restricción complementarios en el fragmento génico del anticuerpo y el vector, o unión de extremos romos si no están presentes sitios de restricción). Antes de la inserción de las secuencias de cadena ligera o pesada de D2E7 o relacionadas con D2E7, el vector de expresión puede llevar secuencias de región constante de anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia para convertir las secuencias de VH y VL de D2E7 o relacionadas con D2E7 en genes de anticuerpos de longitud completa es insertarlas en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y de cadena ligera, respectivamente, de tal forma que el segmento VH se una operativamente al segmento o los segmentos CH dentro del vector y el segmento VL se una operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicionalmente o como alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula hospedadora. El gen de la cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de tal forma que el péptido señal se une en fase al extremo amino del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína que no es una inmunoglobulina).
Además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula hospedadora. La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos del control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de la cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Los especialistas en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células hospedadoras de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador de CMV), el Virus Simiano 40 (SV40) (tal como promotor/potenciador de SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Para una descripción adicional de elementos reguladores virales y sus secuencias, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.168.062 de Stinski, la Patente de Estados Unidos Nº 4.510.245 de Bell et al. y la Patente de Estados Unidos Nº 4.968.615 de Schaffner et al.
Además de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante de la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores selectivos. El gen marcador selectivo facilita la selección de las células hospedadoras en las que se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, típicamente el gen marcador selectivo confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedadora en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores selectivos preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células hospedadoras dhfr^{-} con selección de metotrexato/amplificación) y el gen neo (para la selección de G418).
Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, el vector o vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se utilizan para transfectar una célula hospedadora por técnicas convencionales. Las diversas formas del término "transfección" pretenden incluir una amplia diversidad de técnicas usadas comúnmente para la introducción de ADN exógenos en una célula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, transfección con DEAE-dextrano y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en células hospedadoras procariotas o eucariotas, lo más preferido es la expresión de anticuerpos en células eucariotas, y aún más preferiblemente en células hospedadoras de mamífero, porque tales células eucariotas y en particular las células de mamífero tienen mayor probabilidad que las células procariotas de montar y secretar un anticuerpo inmunológicamente activo plegado de manera apropiada. Se ha notificado que la expresión procariota de genes de anticuerpo es ineficaz para la producción de altos rendimientos de anticuerpo activo (Boss, M. A. y Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
Las células hospedadoras de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de Ovario de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador selectivo DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NS0, células COS y células SP2. Cuando se introducen vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpo en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente como para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadora o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que crecen las células hospedadoras. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales.
También pueden usarse células hospedadoras para producir porciones de anticuerpos intactos, tales como fragmentos Fab o moléculas de scFv. Se entenderá que dentro del alcance de la presente invención se encuentran variaciones del procedimiento anterior. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula hospedadora con ADN que codifica la cadena ligera o la cadena pesada (pero no las dos) de un anticuerpo de esta invención. También puede usarse la tecnología de ADN recombinante para retirar algunos o todos los ADN que codifican la cadena ligera y la cadena pesada, o ambas, que no son necesarios para la unión al hTNF\alpha. Las moléculas expresadas a partir de tales moléculas de ADN truncadas también se incluyen por los anticuerpos de la invención. Además, pueden producirse anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una cadena ligera son un anticuerpo de la invención y la otra cadena pesada y ligera son específicas para un antígeno distinto de hTNF\alpha por medio del entrecruzamiento de un anticuerpo de la invención con un segundo anticuerpo por métodos de entrecruzamiento químico convencionales.
En un sistema preferido para la expresión recombinante de un anticuerpo, o porción de unión a antígenos del mismo, de la invención, se introduce un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada de anticuerpo como la cadena ligera de anticuerpo en células CHO dhfr- por transfección mediada por fosfato cálcico. Dentro del vector de expresión recombinante, cada uno de los genes de cadena pesada y de cadena ligera del anticuerpo se unen operativamente a elementos reguladores potenciadores/promotores (por ejemplo, los derivados de SV40, CMV, adenovirus y similares, tal como el elemento regulador potenciador de CMV/promotor de AdMLP o un elemento regulador de potenciador de SV40/promotor de AdMLP) para dirigir altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también lleva un gen DHFR, que permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector usando selección con metotrexato/amplificación. Las células hospedadoras transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo y se recupera un anticuerpo intacto del medio de cultivo. Se usan técnicas de biología molecular convencionales para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo.
En vista de lo anterior, otro aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico, a un vector y a composiciones de células hospedadoras que pueden usarse para la expresión recombinante de los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención. La secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena ligera de D2E7 se muestra en la Figura 7 y en la SEC ID Nº: 36. El dominio CDR1 de LCVR incluye los nucleótidos 70-102, el dominio CDR2 incluye los nucleótidos 148-168 y el dominio CDR3 incluye los nucleótidos 265-291. La secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena pesada de D2E7 se muestra en la Figura 8 y en la SEC ID Nº: 37. El dominio CDR1 de HCVR incluye los nucleótidos 91-105, el dominio CDR2 incluye los nucleótidos 148-198 y el dominio CDR3 incluye los nucleótidos 295-330. El especialista en la técnica apreciará que pueden obtenerse secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos relacionados con D2E7, o porciones de las mismas (por ejemplo, un dominio CDR tal como un dominio CDR3) a partir de las secuencias de nucleótidos que codifican LCVR y HCVR de D2E7 usando el código genético y técnicas de biología molecular convencionales.
En una realización, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3 (es decir, la CDR3 de VL de D2E7), o modificada a partir de la SEC ID Nº: 3 por una sola sustitución de alanina en la posición 1, 4, 5, 7 u 8 o por una a cinco sustituciones de aminoácidos conservativas en las posiciones 1, 3, 4, 6, 7, 8 y/o 9. Este ácido nucleico puede codificar sólo la región CDR3 o, más preferiblemente, codifica una región variable de cadena ligera de un anticuerpo entero (LCVR). Por ejemplo, el ácido nucleico puede codifica runa LCVR que tiene un dominio CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5 (es decir, la CDR2 de VL de D2E7) y un dominio CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 7 (es decir, la CDR de VL de D2E7).
En otra realización, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4 (es decir, la CDR3 de VH de D2E7) o modificada a partir de la SEC ID Nº: 4 por una sola sustitución de alanina en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 u 11 o por una a cinco sustituciones de aminoácidos conservativas en las posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y/o 12. Este ácido nucleico puede codificar sólo la región CDR3 o, más preferiblemente, codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo entero (HCVR). Por ejemplo, el ácido nucleico puede codificar una HCVR que tiene un dominio CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6 (es decir, la CDR2 de VH de D2E7) y un dominio de CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8 (es decir, la CDR1 de VH de D2E7).
En otra realización adicional, la invención proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican un dominio CDR3 relacionado con D2E7, por ejemplo, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por: SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 31, SEC ID Nº: 32, SEC ID Nº: 33, SEC ID Nº: 34 y SEC ID Nº: 35.
En otra realización adicional, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 (es decir, la LCVR de D2E7). Preferiblemente, este ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 36, aunque el especialista en la técnica apreciará que debido a la degeneración del código genético, otras secuencias de nucleótidos pueden codificar la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1. El ácido nucleico puede codificar sólo la LCVR o también puede codificar una región constante de cadena ligera de anticuerpo, unido operativamente a la LCVR. En una realización, este ácido nucleico está en un vector de expresión recombinante.
En otra realización, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 (es decir, la HCVR de D2E7). Preferiblemente, este ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 37, aunque el especialista en la técnica apreciará que debido a la degeneración del código genético, otras secuencias de nucleótidos pueden codificar la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2. El ácido nucleico puede codificar sólo la HCVR o también puede codificar una región constante de cadena pesada, unida operativamente a la HCVR. Por ejemplo, el ácido nucleico puede comprender una región constante de IgG1 o IgG4. En una realización, este ácido nucleico está en un vector de expresión recombinante.
La invención también proporciona vectores de expresión recombinante que codifican tanto una cadena pesada de anticuerpo como una cadena ligera de anticuerpo. Por ejemplo, en una realización, la invención proporciona un vector de expresión recombinante que codifica:
a) una cadena ligera de anticuerpo que tiene una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 (es decir, la LCVR de D2E7); y
b) una cadena pesada de anticuerpo que tiene una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 (es decir, la HCVR de D2E7).
La invención también proporciona células hospedadoras en las que se han introducido uno o más de los vectores de expresión recombinantes de la invención. Preferiblemente, la célula hospedadora es una célula hospedadora de mamífero, más preferiblemente, la célula hospedadora es una célula CHO, una célula NS0 o una célula COS.
Además, la invención proporciona un método para sintetizar un anticuerpo humano recombinante de la invención cultivando una célula hospedadora de la invención en un medio de cultivo adecuado hasta que se sintetice un anticuerpo humano recombinante de la invención. El método puede comprende además aislar el anticuerpo humano recombinante del medio de cultivo.
III. Selección de anticuerpos humanos recombinantes
Los anticuerpos humanos recombinantes de la invención, además de los anticuerpos D2E7 o relacionados con D2E7 descritos en este documento, pueden aislarse por selección de una biblioteca de anticuerpos combinatoria recombinante, preferiblemente una biblioteca de presentación de fagos de scFv, preparada usando ADNc de VL y VH humanos preparados a partir de ARNm derivado de linfocitos humanos. En la técnica se conocen las metodologías para preparar y seleccionar tales bibliotecas. Además de kits disponibles en el mercado para generar bibliotecas de presentación de fagos (por ejemplo, el Recombinant Phage Antibody System de Pharmacia, nº de catálogo 27-9400-1; y el kit de presentación de fagos SurfZAP(tm) de Stratagene, nº de catálogo 240612), pueden encontrarse ejemplos de métodos y reactivos particularmente adecuados para uso en la generación y selección de bibliotecas de presentación de anticuerpos en, por ejemplo, Ladner et al. Patente de Estados Unidos Nº 5.223.409; Kang et al. Publicación PCT Nº WO 92/18619; Dower et al. Publicación PCT Nº WO 91/17271,Winter et al. Publicación PCT Nº WO 92/20791; Markland et al. Publicación PCT Nº WO 92/15679; Breitling et al. Publicación PCT Nº WO 93/01288; McCafferty et al. Publicación PCT Nº WO 92/01047; Garrard et al. Publicación PCT Nº WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al.(1989) Science 246: 1275-1281: McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; hAWKINS et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; y Barbas et al.(1991)PNAS 88:7978-7982.
En una realización preferida, para aislar anticuerpos humanos con alta afinidad y una baja constante de velocidad de separación para el hTNF\alpha, primero se usa un anticuerpo anti-hTNF\alpha murino que tiene alta afinidad y una baja constante de velocidad de separación para el hTNF\alpha (por ejemplo, MAK 195, el hibridoma para el que tiene el número de depósito ECACC 87 050801) para seleccionar secuencias de cadena pesada y ligera humanas que tengan una actividad de unión similar hacia hTNF\alpha, usando la impresión de epítopo, o una selección guiada, métodos descritos en Hoogenboom et al. Publicación PCT Nº WO 93/06213. Las bibliotecas de anticuerpo usadas en este método preferiblemente son bibliotecas de scFv preparadas y seleccionadas como se describe en McCafferty et al., Publicación PCT Nº WO 92/01047, McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; y Griffiths et al., (1993) EMBO J 12:725-734. Las bibliotecas de anticuerpo de scFv preferiblemente se seleccionan usando TNF\alpha humano recombinante como antígeno.
Una vez seleccionados los segmentos VL y VH humanos iniciales, se seleccionan experimentos de ``mezcla y emparejamiento'', en los que se seleccionan diferentes pares de los segmentos VL y VH seleccionados inicialmente para la unión de hTNF\alpha, para seleccionar combinaciones de pares VL/VH preferidas. Además, para mejorar adicionalmente la afinidad y/o reducir la constante de la velocidad de separación para la unión del hTNF\alpha, los segmentos VL y VH del o de los pares VL/VH preferidos pueden mutarse aleatoriamente, preferiblemente dentro de la región CDR3 de VH y/o VL, en un proceso análogo al proceso de mutación somática in vivo responsable de la maduración de afinidad de anticuerpos durante una respuesta inmune natural. Esta mutación de afinidad in vitro puede realizarse amplificando regiones VH y VL usando cebadores de PCR complementarios a la CDR3 de VH o CDR3 de VL, respectivamente, cebadores a los que se ha "añadido" una mezcla aleatoria de las cuatro bases nucleotídicas en ciertas posiciones de tal forma que los productos de PCR resultantes codifiquen segmentos de VH y VL dentro de los que se han introducido mutaciones aleatorias en las regiones CDR3 de VH y/o VL. Estos segmentos de VH y VL mutados aleatoriamente pueden volverse a seleccionar con respecto a la unión a hTNF\alpha y pueden seleccionarse secuencias que presenten una alta afinidad y una baja velocidad de separación para la unión de hTNF\alpha.
Las secuencias de aminoácidos de cadenas pesada y ligera de anticuerpos seleccionados pueden compararse con secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera de la línea germinal. En casos en los que ciertos restos estructurales de las cadenas VL y/o VH seleccionadas difieren de la configuración de la línea germinal (por ejemplo, como resultado de la mutación somática de los genes de inmunoglobulina usados para preparar la biblioteca de fagos), puede ser deseable "retromutar" los restos estructurales alterados de los anticuerpos seleccionados a la configuración de la línea germinal (es decir, cambiar las secuencias de aminoácidos estructurales de los anticuerpos seleccionados de forma que sean iguales que las secuencias de aminoácidos estructurales de la línea germinal). Tal "retromutación" (o "alineación germinal") de restos estructurales puede realizarse por métodos de biología molecular convencionales para introducir mutaciones específicas (por ejemplo, mutagénesis de localización dirigida; mutagénesis mediada por PCR y similares).
Después de la selección y el aislamiento de un anticuerpo anti-hTNF\alpha de la invención a partir de una biblioteca de presentación de inmunoglobulinas recombinantes, puede recuperarse el ácido nucleico que codifica el anticuerpo seleccionado a partir del paquete de presentación (por ejemplo, del genoma del fago) y subclonarse en otros vectores de expresión por técnicas de ADN recombinante convencionales. Si se desea, el ácido nucleico puede manipularse adicionalmente para crear otras formas de anticuerpo de la invención (por ejemplo, unirse a un ácido nucleico que codifique dominios de inmunoglobulina adicionales tales como regiones constantes adicionales). Para expresar un anticuerpo humano recombinante aislado por la selección de una biblioteca combinatoria, el ADN que codifica el anticuerpo se clona en un vector de expresión recombinante y se introduce en una célula hospedadora de mamífero, como se describe con más detalle en la sección II anterior.
IV. Composiciones farmacéuticas y administración farmacéutica
Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en este documento, ``vehículo farmacéuticamente aceptable'' incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y para retrasar la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de los siguientes agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden contener además cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que aumentan el periodo de validez o la eficacia del anticuerpo o de la porción de anticuerpo.
Las composiciones de esta invención pueden estar en una diversidad de formas. Éstas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración deseado y de la aplicación terapéutica. Las composiciones preferidas típicas están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las usadas para la inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal o intramuscular). En una realización preferida, el anticuerpo se administra por infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, el anticuerpo se administra por inyección intramuscular o subcutánea.
Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles por medio de la incorporación del compuesto activo (es decir, un anticuerpo o una porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, cuando sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado al vacío y liofilización, que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada de forma estéril previamente del mismo. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, por medio del uso de un recubrimiento tal como lecitina, por medio del mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede realizarse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales monoestearato y gelatina.
Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la presente invención pueden administrarse por una diversidad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la vía/modo de administración preferido es inyección o infusión intravenosa. Como se apreciará por los especialistas en la técnica, la vía y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En ciertas realizaciones, el compuesto activo puede prepararse con un vehículo que proteja al compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de liberación microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables biocompatibles tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o se conocen en general por los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también puede encerrarse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda. Comprimirse en comprimidos o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para la administración terapéutica oral, los compuestos pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un compuesto de la invención por una administración distinta de la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto o co- administrar el compuesto con un material para prevenir su inactivación.
En las composiciones también pueden incorporarse compuestos activos suplementarios. En ciertas realizaciones, se coformula un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención y/o se coadministra con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para tratar trastornos en los que es perjudicial la actividad del TNF\alpha. Por ejemplo, un anticuerpo una porción de anticuerpo anti-hTNF\alpha puede coformularse y/o coadministrarse con uno o más anticuerpos adicionales que se unan a otras dianas (por ejemplo, anticuerpos que se unen a otra citoquinas o que se unen a moléculas de la superficie celular), una o más citoquinas, receptor de TNF\alpha soluble (véase, por ejemplo, la Publicación PCT Nº WO 94/06476) y/o uno o más agentes químicos que inhiban la producción o la actividad de hTNF\alpha (tales como derivados de ciclohexano- ilideno como se describe en la Publicación PCT Nº WO 93/19751). Además, pueden usarse uno o más anticuerpos de la invención en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Tales terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosis inferiores del agente terapéutico administrado, evitando de esta manera las posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para la artritis reumatoide con los que puede combinarse un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención incluyen los siguientes: fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID); fármacos antiinflamatorios supresores de citoquinas (CSAID); CDP-571/BAY-10-3356 (anticuerpo anti-TNF\alpha humanizado); Celltech/Bayer); cA2 (anticuerpo anti-TNF\alpha quimérico; Centocor); 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión receptor de TNF-IgG de 75 kD; Immunex; véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTNFR-IgG (proteína de fusión receptor de TNF-IgG de 55 kD; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 210396 (anticuerpo anti-CD4 primatizado no reductor; IDEC/SmithKline; véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1995) Vol. 38, S185); DAB 486-IL-2 y/o DAB 389-IL-2 (proteínas de fusión IL-2; Seragen; véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223); Anti- Tac (anti-IL-2R\alpha humanizado; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (citoquina antiinflamatoria; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; IL-10 recombinante, citoquina antiinflamatoria; DNAX/Schering); IL-4; agonistas de IL-10 y/o IL-4 (por ejemplo, anticuerpos agonistas); IL-1RA (antagonistas de receptor de IL-1; Synergen/Amgen); TNF -bp/s-TNFR (proteína de unión a TNF soluble; véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39 Nº 9 (suplemento), S284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol. 268, pp. 37-42); R973401 (inhibidor de fosfodiesterasa de Tipo IV; véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, Nº 9 (suplemento), S282); MK-966 (inhibidor de COX-2, véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, Nº 9 (suplemento), S81); Iloprost (véase, por ejemplo Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39 Nº 9 (suplemento), S82); metotrexato, talidomida (véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39 Nº 9 (suplemento), S282) y fármacos relacionados con talidomida (por ejemplo, Celgen); leuflunomida (antiinflamatorio e inhibidor de citoquina, véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39 Nº 9 (suplemento), S131; Inflammation Research (1996) Vol. 45, pp. 103-107); ácido tranexámico (inhibidor de la activación de plasminógeno; véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, Nº 9 (suplemento), S284); T-614 (inhibidor de citoquina, véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, Nº 9 (suplemento), S282); prostaglandina E1 (véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, Nº 9 (suplemento), S282); Tendinap (fármaco antiinflamatorio no esteroideo; véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, Nº 9 (suplemento), S280); Naproxen (fármaco antiinflamatorio no esteroideo; véase, por ejemplo, Neuro Report (1996) Vol. 7, pp. 1209- 1213); Meloxicam (fármaco antiinflamatorio no esteroideo); Ibuprofeno (fármaco antiinflamatorio no esteroideo); Piroxicam (fármaco antiinflamatorio no esteroideo); Diclofenaco (fármaco antiinflamatorio no esteroideo); Indometacina (fármaco antiinflamatorio no esteroideo); Sulfasalazina (véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, Nº 9 (suplemento), S281); Azatioprina (véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, Nº 9 (suplemento), S281), inhibidor de ICE (inhibidor de la enzima convertidora de interleuquina- 1\beta); zap-70 y/o inhibidor de lck (inhibidor de la tirosina kinasa zap-70 o lck); inhibidor de VEGF y/o inhibidor de VEGF-R (inhibidores del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares o del receptor del factor de crecimiento de células endoteliales; inhibidores de la angiogénesis); fármacos antiinflamatorios corticosteroides (por ejemplo, SB203580); inhibidores de TNF-convertasa; anticuerpos anti-IL-12, interleuquina-11 (véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, Nº 9 (suplemento) S296); interleuquina-13 (véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, Nº 9 (suplemento), S308); inhibidores de interleuquina-17 (véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, Nº 9 (suplemento), S120); oro, penicilamina; cloroquina; hidroxicloroquina; clorambucilo; ciclofosfamida; ciclosporina; irradiación total de linfoides; globulina anti-timocitos; anticuerpos anti-CD4; toxinas CD5; péptidos administrados por vía oral y colágeno; lobenzarit disódico; Agentes Reguladores de Citoquinas (CRA) HP228 y HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); oligodexoxinucleótidos de fosforotioato antisentido de ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor 1 del complemento soluble (TP10; T Cell Sciences, Inc.); prednisona; orgoteína; glicosaminoglicano polisulfato; minociclina; anticuerpos anti-IL2R; lípidos marinos y botánicos (ácidos grasos de semillas vegetales y de peces; véase, por ejemplo, DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. Nort Am. 21:759-777); auranofin; fenilbutazona, ácido meclofenámico; ácido flufenámico; inmunoglobulina intravenosa; zileutón; ácido micofenólico (RS- 61443); tracrolimus (FK-506); sirolimus (rapamicina); amiprilosa (terafectina); cladribina (2-clorodeoxiadenosina); y azaribina.
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para la enfermedad inflamatoria del intestino con los que puede combinarse un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención incluyen los siguientes: bidenosida; factor de crecimiento epidérmico; corticosteroides; ciclosporina, sulfasalazina; aminosalicilatos; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inhibidores de lipoxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inhibodres de tromboxano; antagonistas del receptor de IL-1; anticuerpos monoclonales anti-IL- 1\beta; anticuerpos monoclonales anti-IL-6; factores de crecimiento; inhibidores de elastasa; compuestos de piridinil-imidazol; CDP-571/BAY-10-3356 (anticuerpo anti-TNF\alpha humanizado; Celltech/Bayer); cA2 (anticuerpo anti-TNF\alpha quimérico; Centocor); 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión receptor de TNF-IgG de 75 kD; Immunex,; véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTNFR-IgG (proteína de fusión del receptor de TNF-IgG de 55 kD; Hoffmann-LaRoche); interleuquina-10 (SCH 52000; Schering Plough); IL-4; agonistas de IL-10 y/o IL-4 (por ejemplo, anticuerpos agonistas); interleuquina-11; profármacos conjugados con glucurónido o dextrano de prednisolona, dexametaxona o budesonida; oligodesoxinucleótidos de fosforotioato antisentido ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor 1 del complemento soluble (TP10; T Cell Sciences, Inc.); mesalazina de liberación lenta; metotrexato; antagonistas del Factor Activador de Plaquetas (PAF); ciprofloxacina; y lignocaína.
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para la esclerosis múltiple con los que puede combinarse un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención incluyen los siguientes: corticosteroides; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4- aminopiridina; tizanidina; interferón-\beta1a (Avonex(tm); Biogen); interferón- \beta1b (Betaseron(tm); Chiron/Berlex); Copolímero 1 (Cop-1; Copaxone(tm); Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); oxígeno hiperbárico; inmunoglobulina intravenosa; clabribina; CDP-571/BAY-10-3356 (anticuerpo anti-TNF\alpha humanizado; Celltech/Bayer); cA2 (anticuerpo anti-TNF\alpha quimérico; Centocor); 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión receptor de TNF-IgG de 75 kD; Immunex; véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTNFR-IgG (proteína de fusión receptor de TNF-IgG de 55 kD; Hoffmann, LaRoche); IL-1; IL-4; y agonistas de IL-10 y/o IL-4 (por ejemplo, anticuerpos agonistas).
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para sépsis con los que pueden combinarse un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención incluyen los siguientes: soluciones salinas hipertónicas; antibióticos; gamma globulina intravenosa; hemofiltración continua; carbapenems (por ejemplo, meropenem); antagonistas de citoquinas tales como TNF\alpha, IL-1\beta, IL-6 y/o IL-8; CDP-571/BAY-10-3356 (anticuerpo anti-TNF\alpha humanizado; Celltech/Bayer); cA2 (anticuerpo anti-TNF\alpha quimérico; Centocor); 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión del receptor de TNF-IgG de 75 kD; Immunex; véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTNFR-IgG (proteína de fusión del receptor de TNF-IgG de 55 kD; Hoffmann, LaRoche); Agentes Reguladores de Citoquina (CRA) HP228 y HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); SK&F 107647 (péptido de bajo peso molecular; SmithKline Beecham); guanilhidrazona tetravalente CNI-1493 (Picower Institute); Inhibidor de la Ruta del Factor Tisular (TFPI; Chiron; PHP (hemoglobina modificada químicamente; APEX Bioscience); quelantes de hierro y quelatos, incluyendo complejo de ácido dietilentriaminapentaacético-hierro (III) (DTPA hierro (III); Molichem Medicines); lisofilina (metilxantina de molécula pequeña sintética; Cell Therapeutics, Inc.); PGG-Glucano (\beta1,3glucano soluble en agua; Alpha-Beta Technology); polipoproteína A-1 reconstituida con lípidos; ácidos hidroxámicos quirales (antibacterianos sintéticos que inhiben la biosíntesis del lípido A); anticuerpos anti-endotoxina; E5531 (antagonista sintético del lípido A; Eisai America, Inc.); rBPI_{21} (fragmento recombinante N-terminal de la Proteína Bactericida/de Aumento de la Permeabilidad humana); y Péptidos Anti-Endotoxina Sintéticos (SAEP; BiosYnth Research Laboratories).
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para el síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos (ARDS) con los que puede combinarse un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención incluyen los siguientes: anticuerpos anti-IL-8; terapia de reemplazo de tensioactivos; CDP-571/BAY-10- 3356 (anticuerpo anti-TNF\alpha humanizado; Celltech/Bayer); cA2 (anticuerpo anti-TNF\alpha quimérico; Centocor); 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión receptor de TNF-IgG de 75 kD; Immunex; véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTNFR-IgG (proteína de fusión receptor de TNF-IgG de 55 kD; Hoffmann, LaRoche).
El uso de los anticuerpos o porciones de anticuerpo de la invención en combinación con otros agentes terapéuticos se describe adicionalmente en la subsección IV.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o de la porción de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo de inducir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o de la porción de anticuerpo se compensa por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una ``cantidad profilácticamente eficaz'' se refiere a una cantidad eficaz a dosificaciones y durante periodos necesarios como para conseguir el resultado profiláctico deseado. Típicamente, como se usa una dosis profiláctica en los sujetos antes de una enfermedad o en las primeras fases de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica. Por ejemplo, puede administrarse una sola inyección en embolada, o pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente cuando se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en formas de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. Las formas de dosificación unitarias, como se usan en este documento, se refieren a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitarias de la invención se dicta y es directamente dependiente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular a conseguir y (b) las limitaciones intrínsecas en la técnica de la composición de tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.
Un intervalo ilustrativo no limitante para una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es de 0,1 a 20 mg/kg, más preferiblemente de 1 a 10 mg/kg. Debe indicarse que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y gravedad de la afección a aliviar. Se entenderá que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse a lo largo del tiempo de acuerdo con las necesidades del individuo y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación indicados en este documento son sólo ilustrativos y no pretenden limitar el alcance o práctica de la composición reivindicada.
IV. Usos de los anticuerpos de la invención
Dada su capacidad de unirse al hTNF\alpha, los anticuerpos anti-hTNF\alpha, o porciones de los mismos, de la invención, pueden usarse para detectar hTNF\alpha (por ejemplo, en una muestra biológica, tal como suero o plasma) usando un inmunoensayo convencional, tal como ensayos de inmunoabsorbente con enzima unida (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica de tejidos. La invención proporciona un método para detectar hTNF\alpha en una muestra biológica que comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo, o una porción de anticuerpo, de la invención y detectar el anticuerpo, o porción de anticuerpo unido al hTNF\alpha o el anticuerpo no unido (o porción de anticuerpo) para detectar de esta forma el hTNF\alpha en la muestra biológica. El anticuerpo se marca directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de materiales radiactivos incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.
Como alternativa al marcaje del anticuerpo, el hTNF\alpha puede ensayarse en fluidos biológicos por inmunoensayos competitivos utilizando patrones de rhTNF\alpha marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti- hTNF\alpha no marcado. En este ensayo, la muestra biológica, los patrones de rhTNF\alpha marcados y el anticuerpo anti-hTNF\alpha se combinan y se determina la cantidad de patrón de rhTNF\alpha marcado unida al anticuerpo no marcado. La cantidad de hTNF\alpha en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de patrón de rhTNF\alpha marcado unido al anticuerpo anti-hTNF\alpha.
También pueden usarse un anticuerpo D2E7 de la invención para detectar TNF\alpha de especies distintas de seres humanos, en particular TNF\alpha de primates (por ejemplo, chimpancé, mandril, tití, mono cynomolgus y mono rhesus), cerdo y ratón, ya que D2E7 puede unirse a cada uno de estos TNF\alpha (como se describe adicionalmente en el Ejemplo 4, subsección E).
Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención pueden neutralizar la actividad del hTNF\alpha tanto in vitro como in vivo (véase el Ejemplo 4). Además, algunos de los anticuerpos de la invención, tales como D2E7, pueden neutralizar la actividad de TNF\alpha de otras especies. Por consiguiente, los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención pueden usarse para inhibir la actividad del TNF\alpha, por ejemplo, en un cultivo de células que contienen hTNF\alpha, en seres humanos o en otros mamíferos que tienen TNF\alpha con los que presenta reacción cruzada un anticuerpo de la invención (por ejemplo, chimpancé, mandril, tití, mono cynomolgus y rhesus, cerdo o ratón). En una realización, la invención proporciona un método para inhibir la actividad del TNF\alpha que comprende poner en contacto el TNF\alpha con un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención de tal forma que se inhiba la actividad del TNF\alpha. Preferiblemente, el TNF\alpha es TNF\alpha humano. Por ejemplo, en un cultivo celular que contiene o que se sospecha que contiene hTNF\alpha, puede añadirse un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención al medio de cultivo para inhibir la actividad el hTNF\alpha del cultivo.
En otra realización, la invención proporciona un método para inhibir la actividad de TNF\alpha en un sujeto que sufre un trastorno en el que es perjudicial la actividad de TNF\alpha. El TNF\alpha se ha implicado en la patofisiología de una amplia diversidad de trastornos (véase, por ejemplo, Moeller, A., et al. (1990) Cytokine 2:162-169; Patente de Estados Unidos Nº 5.231.024 a Moeller et al.; Publicación de Patente Europea Nº 260 610 B1 de Moeler, A.). La invención proporciona métodos para comprobar la actividad del TNF\alpha en un sujeto que sufre tal trastorno, comprendiendo el método administrar al sujeto un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención de tal forma que se inhiba la actividad del TNF\alpha en el sujeto. Preferiblemente el TNF\alpha es TNF\alpha humano y el sujeto es un ser humano. Como alternativa, el sujeto puede ser un mamífero que expresa un TNF\alpha con el que se entrecruza un anticuerpo de la invención. Además, el sujeto puede ser un mamífero en el que se ha introducido hTNF\alpha (por ejemplo, por la administración de hTNF\alpha o por la expresión de un transgen de hTNF\alpha). Un anticuerpo de la invención puede administrarse a un ser humano para fines terapéuticos (discutidos con más detalle más adelante). Además, un anticuerpo de la invención puede administrarse a un mamífero no humano que expresa un TNF\alpha con el que se entrecruza el anticuerpo (por ejemplo, un primate, cerdo o ratón) para fines veterinarios o como un modelo animal de enfermedad humana. Con respecto a esto último, tales modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de anticuerpos de la invención (por ejemplo, para ensayar dosificaciones y cursos de tiempo de administración).
Como se usa en este documento, la expresión "un trastorno en el que la actividad de TNF\alpha es perjudicial" pretende incluir enfermedades y otros trastornos en los que se ha demostrado que la presencia de TNF\alpha en un sujeto que sufre el trastorno es o se sospecha que es responsable de la patofisiología del trastorno o un factor que contribuye a una empeoramiento del trastorno. Por consiguiente, un trastorno en el que la actividad de TNF\alpha es perjudicial es un trastorno en el que se espera que la inhibición de la actividad de TNF\alpha alivie los síntomas y/o progresión del trastorno. Tales trastornos pueden evidenciarse, por ejemplo, por un aumento en la concentración de TNF\alpha en un fluido biológico de un sujeto que sufre el trastorno (por ejemplo, un aumento en la concentración de TNF\alpha en suero, plasma, líquido sinovial, etc. del sujeto, que puede detectarse, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-TNF\alpha como se ha descrito anteriormente. Hay numerosos ejemplos de trastornos en los que la actividad de TNF\alpha es perjudicial. El uso de anticuerpos y de porciones de anticuerpo de la invención en el tratamiento de trastornos específicos se describe con más detalle más adelante.
A. Sépsis
El factor de necrosis tumoral tiene un papel establecido en la patofisiología de la sépsis, con efectos biológicos que incluyen hipotensión, supresión de miocardio, síndrome de fuga vascular, necrosis de órganos, estimulación de la liberación de mediadores tóxicos secundarios y activaciones de la cascada de la coagulación (véase, por ejemplo, Moeller, A., et al. (1990) Cytokine 2:162-169; Patente de Estados Unidos Nº 5.231.024 a Moeller et al.; Publicación de Patente Europea Nº 260 610 B1 por Moeller, A.; Tracey, K. J. y Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45:491-503; Russell, D y Thompson, R. C. (1993) Curr. Opin. Biotech. 4:714-721). Por consiguiente, los anticuerpos humanos y las porciones de anticuerpo de la invención pueden usarse para tratar sépsis en cualquiera de sus situaciones clínicas, incluyendo el choque séptico, el choque endotóxico, la sépsis Gram negativa y el síndrome de choque tóxico.
Además, para tratar la sépsis, un anticuerpo anti-hTNF\alpha, o porción de anticuerpo, de la invención puede coadministrarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales que pueden aliviar adicionalmente la sépsis, tal como un inhibidor de interleuquina-1 (tales como los descritos en las publicaciones PCT Nº WO 92/16221 y WO 92/17583), la citoquina interleuquina-6 (véase, por ejemplo, la Publicación PCT Nº WO 93/11793) o un antagonista del factor de activación de plaquetas (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente Europea Nº EP 374 510). Otras terapias de combinación para el tratamiento de sépsis se discuten adicionalmente en la subsección III.
Además, en una realización preferida, un anticuerpo anti-TNF\alpha o porción de anticuerpo de la invención se administra a un ser humano dentro de un subgrupo de pacientes con sépsis que tienen una concentración en suero o en plasma de IL-6 superior a 500 pg/ml, y más preferiblemente de 1000 pg/ml, en el momento del tratamiento (véase la Publicación PCT Nº WO 95/20978 por Dauman, L., et al.).
B. Enfermedades autoinmunes
El factor de necrosis tumoral se ha implicado en la patofisiología de una diversidad de enfermedades autoinmunes. Por ejemplo, el TNF\alpha se ha implicado en la activación de la inflamación de tejidos y en la producción de destrucción de articulaciones en la artritis reumatoide (véase, por ejemplo, Moeller, A., et al. (1990) Cytokine 2:162-169; Patente de Estados Unidos Nº 5.231.024 a Moeller et al.; Publicación de Patente Europea Nº 260 610 B1 por Moeller, A.; Tracey y Cerami, supra; Arend, W. P. y Dayer, J-M. (1995) Arth. Rheum. 38:151-160; Fava, R. A., et al.(1993) Clin. Exp. Immunol. 94:261-266). El TNF\alpha también se ha implicado en la promoción de la muerte de las células de los islotes y en la mediación de la resistencia a la insulina en la diabetes (véase, por ejemplo, Tracey y Cerami, supra; Publicación PCT Nº WO 94/08609). El TNF\alpha también se ha implicado en la mediación de la citotoxicidad a oligodendrocitos y a la inducción de placas inflamatorias en la esclerosis múltiple (véase, por ejemplo, Tracey y Cerami, supra). Los anticuerpos anti- hTNF\alpha quiméricos y murinos humanizados han experimentado un ensayo clínico para el tratamiento de la artritis reumatoide (véase, por ejemplo, Elliott, M. J., et al. (1994) Lancet 344:1125-1127; Elliot, M. J., et al. (1994) Lancet 344: 1105-1110; Rankin, E. C., et al. (1995) Br. J. Rheumatol. 34:334- 342).
Los anticuerpos humanos y las porciones de anticuerpo de la invención pueden usarse para tratar enfermedades autoinmunes, en particular las asociadas con la inflamación, incluyendo la artritis reumatoide, espondilitis reumatoide, osteoartritis y artritis gotosa, alergia, esclerosis múltiple, diabetes autoinmune, uveítis autoinmune y síndrome nefrótico. Típicamente, el anticuerpo o la porción de anticuerpo se administra sistémicamente, aunque para ciertos trastornos, puede ser beneficiosa la administración local del anticuerpo o de la porción de anticuerpo en un sitio de inflamación (por ejemplo, la administración local en las articulaciones en la artritis reumatoide o la aplicación tópica en úlceras diabéticas, solo o en combinación con derivados de ciclohexano-ilideno como se describe en la publicación PCT Nº WO 93/19751). Un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención también puede administrarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, como se describe adicionalmente en la subsección III.
C. Enfermedades infecciosas
El factor de necrosis tumoral se ha implicado en la mediación de efectos biológicos observados en una diversidad de enfermedades infecciosas. Por ejemplo, el TNF\alpha se ha implicado en la mediación de la inflamación cerebral y en la trombosis capilar e infarto en la malaria. El TNF\alpha también se ha implicado en la mediación de la inflamación cerebral, induciendo la ruptura de la barrera hematoencefálica, induciendo el síndrome de choque séptico y activado el infarto venoso en la meningitis. El TNF\alpha también se ha implicado en la inducción de la caquexia, la estimulación de la proliferación viral y la mediación de lesiones del sistema nervioso central en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Por consiguiente, los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención pueden usarse en el tratamiento de enfermedades infecciosas, incluyendo meningitis bacteriana (véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de Patente Europea Nº EP 585 705), malaria cerebral, SIDA y complejo relacionado con el SIDA (ARC) (véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de Patente Europea Nº EP 230 574), así como la infección por citomegalovirus secundaria a un transplante (véase, por ejemplo, Fietze, E., et al. (1994) Transplantation 58:675-680). Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención también pueden usarse para aliviar síntomas asociados con enfermedades infecciosas, incluyendo fiebre y mialgias debidas a una infección (tal como influenza) y caquexia secundaria a una infección (por ejemplo, secundaria al SIDA o ARC).
D. Transplante
El factor de necrosis tumoral se ha implicado como mediador clave del rechazo de aloinjertos y de la enfermedad del hospedador contra un injerto (GVHD) y en la mediación de una reacción adversa que se ha observado cuando el anticuerpo de rata OKT3, dirigido contra el complejo receptor de células T CD3 se usa para inhibir el rechazo de transplantes renales (véase, por ejemplo, Eason, J. D., et al. (1995) Transplantation 59:300-305; Suthanthiran, M. y Strom, T. B. (1994) New Engl. J. Med. 331:365-375). Por consiguiente, los anticuerpos, y porciones de anticuerpo, de la invención, pueden usarse para inhibir el rechazo de transplantes, incluyendo rechazos de aloinjertos y xenoinjertos y para inhibir GVHD. Aunque el anticuerpo o porción de anticuerpo puede usarse solo, más preferiblemente se usa en combinación con uno o más agentes distintos que inhiben la respuesta inmune contra el aloinjerto o inhiben GVHD. Por ejemplo, en una realización, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se usa en combinación con OKT3 para inhibir reacciones inducidas por OKT3. En otra realización, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se usa en combinación con uno o más anticuerpos dirigidos a otras dianas implicadas en la regulación de las respuestas inmunes, tales como las moléculas de la superficie celular CD25 (receptor \alpha de interleuquina-2), CD1 1a (LFA-1), CD54 (ICAM- 1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (B7-1) y/o CD86 (B7-2). En otra realización, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se usa en combinación con uno o más agentes inmunosupresores generales, tales como ciclosporina A o FK506.
E. Malignidad
El factor de necrosis tumoral se ha implicado en la inducción de la caquexia, en la estimulación del crecimiento tumoral, en el aumento del potencial metastático y en la mediación de la citotoxicidad en malignidades. Por consiguiente, los anticuerpos y las porciones de anticuerpo de la invención pueden usarse en el tratamiento de malignidades para inhibir el crecimiento tumoral o la metástasis y/o para aliviar la caquexia secundaria a la malignidad. El anticuerpo o porción de anticuerpo puede administrarse sistémicamente o localmente en el sitio del tumor.
F. Trastornos pulmonares
El factor de necrosis tumoral se ha implicado en la patofisiología del síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos (ARDS), incluyendo la estimulación de la activación endotelial de leucocitos, dirigiendo la citotoxicidad a los neumocitos e induciendo el síndrome de fuga vascular. Por consiguiente, los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención pueden usarse para tratar diversos trastornos pulmonares, incluyendo el síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos (véase, por ejemplo, la Publicación PCT Nº WO 91/04054), choque pulmonar, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, sarcoidosis pulmonar, fibrosis pulmonar y silicosis. El anticuerpo, o la porción de nticuerpo, puede administrarse sistémicamente o localmente a la superficie del pulmón, por ejemplo con un aerosol. Un anticuerpo, o una porción de anticuerpo de la invención, también puede administrarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales útiles en el tratamiento de trastornos pulmonares, como se describe adicionalmente en la subsección III.
G. Trastornos intestinales
El factor de necrosis tumoral se ha implicado en la patofisiología de trastornos inflamatorios del intestino (véase, por ejemplo, Tracy, K. J., et al. (1986) Science 234: 470-474; Sun, X-M, et al. (1988) J. Clin. Invest. 81: 1328-1331; MacDonald, T. T., et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81: 301-305). Se han sometido a un ensayo clínico anticuerpos anti-hTNF\alpha murinos quiméricos para el tratamiento de la enfermedad de Crohn (van Dullemen, H. M., et al. (1995) Gastroenterology 109: 129-135). Los anticuerpos humanos, y porciones de anticuerpo, de la invención, también pueden usarse para tratar trastornos intestinales, tales como la enfermedad inflamatoria del intestino idiopática, que incluye dos síndromes. La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Un anticuerpo, o porción de anticuerpo de la invención también puede administrarse con un o más agentes terapéuticos adicionales útiles en el tratamiento de trastornos intestinales, como se describe adicionalmente en la subsección III.
H. Trastornos cardíacos
Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención también pueden usarse para tratar diversos trastornos cardíacos, incluyendo la isquemia del corazón (véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de Patente Europea Nº EP 453 898) y la insuficiencia cardiaca (debilidad del músculo cardíaco) (véase, por ejemplo, la Publicación PCT Nº WO 94/20139).
I. Otros
Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención también pueden usarse para tratar otros diversos trastornos en los que es perjudicial la actividad de TNF\alpha. Los ejemplos de otras enfermedades y trastornos en los que se ha implicado la actividad del TNF\alpha en la patofisiología y de esta manera que pueden tratarse usando un anticuerpo y una porción de anticuerpo de la invención, incluyen trastornos inflamatorios óseos y enfermedades de reabsorción (véase, por ejemplo, Bertolini, et al. (1986) Nature 319: 516-518; Konig, A., et al. (1988) J. Bone Miner. Res. 3: 621-627; Lerner, U. H y Ohlin, A. (1993) J. Bone Miner. Res. 8: 147-155; y Shankar, G. y Stern, P. H. (1993) Bone 14: 871-876), hepatitis, incluyendo hepatitis alcohólica (véase, por ejemplo, McClain, C. J. y Cohen, D. A. (1989) Hepatology 9: 349-351; Felver, M. E., et al. (1990) Alcohol. Clin. Exp. Res. 14: 255-259; y Hansen, J., et al. 81994) Hepatology 20: 461-474), hepatitis viral (Sheron N., et al. (1991) J. Hepatol. 12: 241-245; y Hussain, M. J., et al. (1994) J. Clin. Pathol. 47¿: 1112-1115) y hepatitis fulminante; alteraciones de la coagulación (véase, por ejemplo, van der Poll, T., et al. (1990) N. Engl. J. Med. 322: 1622-1627; y van der Poll, T., et al. (1991) Prog. Clin. Biol. Res. 367: 55-60), quemaduras (véase, por ejemplo, Giroir, B. P., et al. (1994) Am. J. Physiol. 267: H118-124; y Liu X. S., et al. 81994) Burns 20: 40-44), lesión de reperfusión (véase, por ejemplo, Scales, W. E., et al. (1994) Am. J. Physiol. 267: G1122-1127; Serrick, C., et al. (1994) Transplantation 58: 1158-1162; y Yao, Y. M., et al. (1995) Rhesuscitation 29: 157-168), formación de queloides (véase, por ejemplo, McCauley, R. L., et al. (1992) J. Clin. Immunol. 12: 300-308), formación de tejido cicatrizado; pirexia; enfermedad periodontal; obesidad y toxicidad a la radiación.
Esta invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos que no deben considerarse limitantes. El contenido de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a lo largo de esta memoria descriptiva se incorporan en el presente documento como referencia.
Ejemplo 1 Análisis cinético de la unión de anticuerpos humanos a hTNF\alpha
Se midieron interacciones de unión a tiempo real entre un ligando (TNF\alpha humano recombinante (rhTNF\alpha) biotinilado inmovilizado en una matriz de biosensor) y analito (anticuerpos en solución) por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). El sistema utiliza las propiedades ópticas del SPR para detectar alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensor de dextrano. Las proteínas se unen covalentemente a la matriz de dextrano a concentraciones conocidas. Se inyectan anticuerpos a través de la matriz de dextrano y la unión específica entre los anticuerpos inyectados y el ligando inmovilizado produce un aumento de la concentración de proteína de la matriz y un cambio resultante en la señal de SPR. Estos cambios en la señal de SPR se registran como unidades de resonancia (RU) y se representan con respecto al tiempo a lo largo del eje y de un sensorgrama.
Para facilitar la inmovilización del rhTNF\alpha biotinilado en la matriz del biosensor, se une estreptavidina covalentemente a través de grupos amina libres a la matriz de dextrano activando primero los grupos carboxilo en la matriz con N-hidroxisuccinimida (NHS) 100 mM y clorhidrato de N-etil-N'-(3- dietilaminopropil)carbodiimida (EDC) 400 mM. A continuación, se inyecta estreptavidina a través de la matriz activada. Se inyectan 35 \mul de estreptavidina (25 \mug/ml), diluida en acetato sódico, pH 4,5, a través del biosensor activado y las aminas libres de la proteína se unen directamente a los grupos carboxilo activados. Los ésteres de EDC de la matriz sin reaccionar se desactivan por una inyección de etanolamina 1 M. También se dispone en el mercado de chips biosensores acoplados a estreptavidina (Pharmacia BR-1000-16, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ).
El rhTNF\alpha biotinilado se preparó disolviendo primero 5,0 mg de biotina (éster de N-hidroxisuccinimida de ácido D-biotinil-\epsilon-aminocaproico; Boehringer Mannheim Cat. Nº 1008 960) en 500 \mul de dimetilsulfóxido para obtener una solución de 10 mg/ml. Se añadieron 10 \mul de biotina por ml de rhTNF\alpha (a 2,65 mg/ml) para una relación molar de 2:1 entre biotina y rhTNF\alpha. La reacción se mezcló suavemente y se incubó durante dos horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Una columna PD-10, Sephadex G-25M (Pharmacia Nº de catálogo 17-0851-01) se equilibró con 25 ml de PBS frío y se cargó con 2 ml de rhTNF\alpha-biotina por columna. La columna se eluyó con 10 x 1 ml de PBS frío. Se recogieron las fracciones y se leyeron a DO280 (1,0 DO = 1,25 ml/ml). Las fracciones apropiadas se reunieron y se almacenaron a -80ºC hasta el uso. El rhTNF\alpha biotinilado también está disponible en el mercado (R & D Systems Nº de catálogo FTA00, Minneapolis, MN).
El rhTNF\alpha biotinilado para inmovilizarse en la matriz a través de la estreptavidina, se diluyó con tampón de ensayo PBS (Gibco Nº de catálogo 14190-144, Gibco BRL, Grand Island, NY) suplementado con un 0,05% (BIAcore) de tensioactivo P20 (Pharmacia BR-1000-54, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Para determinar la capacidad de los anticuerpos específicos a rhTNF\alpha de unir rhTNF\alpha inmovilizado, se realizó un ensayo de unión como se indica a continuación. Se inyectaron alícuotas de rhTNF\alpha biotinilado (25 nM; alícuotas de 10 \mul) a través de la matriz de dextrano acoplada a estreptavidina a un caudal de 5 \mul/min. Antes de la inyección de la proteína e inmediatamente después, fluyó tampón PBS solo a través de cada celda de flujo. La diferencia neta en la señal entre el valor inicial y aproximadamente 30 segundos después de terminar la inyección e rhTNF\alpha se tomó para representar el valor de unión (aproximadamente 500 RU). Se midió la unión directa del anticuerpo específico a rhTNF\alpha al rhTNF\alpha biotinilado. Se diluyeron anticuerpos (20 \mug/ml) en PBS y se inyectaron alícuotas de 25 \mul a través de las matrices de proteína inmovilizada a un caudal de 5 \mul/min. Antes de la inyección de anticuerpo, e inmediatamente después, fluyó tampón PBS solo a través de cada celda de flujo. La diferencia neta en la señal inicial y en la señal después de terminar la inyección de anticuerpo se tomó para representar el valor de unión de la muestra particular. Se generaron matrices de biosensores usando HCl 100 mM antes de la inyección de la siguiente muestra. Para determinar la velocidad de desactivación (K_{off}), la velocidad de activación (K_{on}), la velocidad de asociación (K_{a}) y la velocidad de disociación (K_{d}), se usó un software de evaluación cinética BIAcore (versión 2.1).
En la Tabla 1 presentada a continuación se muestran resultados representativos de D2E7 (anticuerpo IgG4 de longitud completa) que se une al rhTNF\alpha biotinilado, en comparación con el mAb de ratón MAK 195 (fragmento F(ab')_{2}).
TABLA 1 Unión de la IgG4 D2E7 o MAK 195 a rhTNF\alpha biotinilado
Anticuerpo [Ab], nM rhTNF\alpha, Ab, unido, rhTNF\alpha/Ab K_{off}, seg^{-1},
unido, RU RU (promedio)
D2E7 267 373 1215 1,14 8,45 x 10^{-5}
133 420 1569 1,30 5,42 x 10^{-5}
67 434 1633 1,31 4,75 x 10^{-5}
33 450 1532 1,19 4,46 x 10^{-5}
17 460 1296 0,98 3,47 x 10^{-5}
8 486 936 0,67 2,63 x 10^{-5}
4 489 536 0,38 2,17 x 10^{-5}
2 470 244 0,18 3,68 x 10^{-5}
(4,38 x 10^{-5})
MAK 195 400 375 881 1,20 5,38 x 10^{-5}
200 400 1080 1,38 4,54 x 10^{-5}
100 419 1141 1,39 3,54 x 10^{-5}
50 427 1106 1,32 3,67 x 10^{-5}
TABLA 1 (continuación)
Anticuerpo [Ab], nM rhTNF\alpha, Ab, unido, rhTNF\alpha/Ab K_{off}, seg^{-1},
unido, RU RU (promedio)
25 446 957 1,09 4,41 x 10^{-5}
13 464 708 0,78 3,66 x 10^{-5}
6 474 433 0,47 7,37 x 10^{-5}
3 451 231 0,26 6,95 x 10^{-5}
(4,94 x 10^{-5})
En una segunda serie de experimentos, se analizaron cuantitativamente las interacciones cinéticas moleculares entre una forma de longitud completa de IgG1 de D2E7 y rhTNF\alpha biotinilado, usando la tecnología BIAcore, como se ha descrito anteriormente, y se obtuvieron las constantes de velocidad cinética, resumidas más adelante en las Tablas 2, 3 y 4.
TABLA 2 Constantes de velocidad de disociación aparente de la interacción entre D2E7 y rhTNF\alpha biotinilado
Experimento K_{d}(s^{-1})
1 9,58 x 10^{-5}
2 9,26 x 10^{-5}
3 7,60 x 10^{-5}
Promedio 8,81\pm1,06 x 10^{-5}
TABLA 3 Constantes de velocidad de asociación aparente de la interacción entre D2E7 y rhTNF\alpha biotinilado
Experimento K_{a}(M^{-1}, s^{-1})
1 1,33 x 10^{5}
2 1,05 x 10^{5}
3 3,36 x 10^{5}
Promedio 1,91\pm1,26 x 10^{5}
TABLA 4 Velocidad cinética aparente y constantes de actividad de D2E7 y rhTNF biotinilado
Experimento K_{a}(M^{-1}, s^{-1}) K_{d}(s^{-1}) K_{d}(M)
1 1,33 x 10^{5} 9,58 x 10^{-5} 7,20 x 10^{-10}
2 1,05 x 10^{5} 9,26 x 10^{-5} 8,82 x 10^{-10}
3 3,36 x 10^{5} 7,60 x 10^{-5} 2,26 x 10^{-10}
Promedio 1,91\pm1,26 x 10^{5} 8,81\pm1,06 x 10^{-5} 6,09\pm3,42 x 10^{-10}
Las constantes de velocidad de disociación y de asociación se calcularon analizando las regiones de disociación y asociación de los sensorgramas por un software der análisis BIA. Se asumieron las cinéticas de reacción química convencionales para la interacción entre D2E7 y la molécula de rhTNF biotinilada: una disociación de orden cero y una cinética de asociación de primer orden. Para el análisis, se consideró la interacción sólo entre un brazo del anticuerpo D2E7 bivalente y una unidad del rhTNF\alpha biotinilado trimérico. En la elección de los modelos moleculares para el análisis de los datos cinéticos. Se realizaron tres experimentos independientes y los resultados se analizaron por separado. La constante de velocidad de disociación aparente media (k_{d}) de la interacción entre D2E7 y rhTNF\alpha biotinilado fue 8,81 \pm 1,06 x 10^{-5} s^{-1}, y la constante de velocidad de asociación aparente media, k_{a}, fue de 1,91 \pm 1,26 x 10^{5} M^{-1} s^{-1}. Después se calculó la constante de disociación intrínseca aparente (K_{d}) por la fórmula: K_{d} = k_{d}/k_{a}. De esta manera, la K_{d} media del anticuerpo D2E7 para rhTNF obtenido a partir de los parámetros cinéticos fue de 6,09 \pm 3,42 x 10^{- 10} M. Las diferencias minoritarias en los valores cinéticos para la forma de IgG1 de D2E7 (presentada en las Tablas 2, 3 y 4) y la forma de IgG4 de D2E7 (presentada en la Tabla 1 y en los Ejemplos 2 y 3) no se consideran diferencias verdaderas resultantes de la presencia de ninguna de las regiones constantes de IgG1 o IgG4, sino que más bien se consideran atribuibles a las mediciones de la concentración de anticuerpo más precisas usadas para el análisis cinético de IgG1. Por consiguiente, los valores cinéticos para la forma IgG1 de D2E7 presentados en este documento se consideran los parámetros cinéticos más exactos para el anticuerpo D2E7.
Ejemplo 2 Mutagénesis de exploración de alanina de dominios CDR3 de D2E7
Se introdujo una serie de mutaciones individuales de alanina por métodos convencionales a lo largo del dominio CDR3 de las regiones VL de D2E7 y VH de D2E7. Las mutaciones de cadena ligera se ilustran en la Figura 1B (LD2E7*.A1, LD2E7*.A3, LD2E7*.A4, LD2E7*.A5, LD2E7*.A7, y LD2E7*.A8, que tenía una mutación de alanina en la posición 1, 3, 4, 5, 7 u 8, respectivamente, del dominio CDR3 de VL de D2E7). Las mutaciones de cadena pesada se ilustran en la Figura 2B (HD2E7*.A1, HD2E7*.A2, HD2E7*.A3, HD2E7*.A4, HD2E7*.A5, HD2E7*.A6, HD2E7*.A7 y HD2E7*.A9, que tienen una mutación de alanina en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 u 11, respectivamente, del dominio CDR3 de VH de D2E7). La cinética de la interacción de rhTNF\alpha con un anticuerpo compuesto por VL y VH de D2E7 de tipo silvestre se comparó con la de anticuerpos compuestos de 1) una VL de D2E7 de tipo silvestre emparejada con una VH de D2E7 sustituida con alanina; 2) una VH de D2E7 de tipo silvestre emparejada con una VL de D2E7 sustituida con alanina; o 3) una VL de D2E7 sustituida con alanina emparejada con una VH de D2E7 sustituida con alanina. Todos los anticuerpos se ensayaron como moléculas de IgG4 de longitud completa.
La cinética de interacción de anticuerpos con rhTNF\alpha se determinó por resonancia de plasmón superficial como se describe en el Ejemplo 1. Las velocidades de K_{off} para los diferentes pares de VH/VL se resumen a continuación en la Tabla 5.
TABLA 5 Unión de mutantes de exploración de alanina D2E7 a rhTNF\alpha biotinilado
VH VL K_{off} (seg^{-1})
D2E7 VH D2E7 VL 9,65 x 10^{-5}
HD2E7*.A1 D2E7 VL 1,4 x 10^{-4}
HD2E7*.A2 D2E7 VL 4,6 x 10^{-4}
HD2E7*.A3 D2E7 VL 8,15 x 10^{-4}
HD2E7*.A4 D2E7 VL 1,8 x 10^{-4}
HD2E7*.A5 D2E7 VL 2,35 x 10^{-4}
HD2E7*.A6 D2E7 VL 2,9 x 10^{-4}
HD2E7*.A7 D2E7 VL 1,0 x 10^{-4}
HD2E7*.A8 D2E7 VL 3,1 x 10^{-4}
HD2E7*.A9 D2E7 VL 8,1 x 10^{-4}
TABLA 5 (continuación)
VH VL K_{off} (seg^{-1})
D2E7 VH LD2E7*.A1 6,6 x 10^{-5}
D2E7 VH LD2E7*.A3 NO DETECTABLE
D2E7 VH LD2E7*.A4 1,75 x 10^{-4}
D2E7 VH LD2E7*.A5 1,8 x 10^{-4}
D2E7 VH LD2E7*.A7 1,4 x 10^{-4}
D2E7 VH LD2E7*.A8 3,65 x 10^{-4}
HD2E7*.A9 LD2E7*.A1 1,05 x 10^{-4}
Estos resultados demuestran que la mayoría de las posiciones de los dominios CDR3 de la región VL y la región VH de D2E7 son susceptibles de sustitución con un solo resto de alanina. La sustitución de un solo resto de alanina en la posición 1, 4, 5 ó 7 del dominio CDR3 de VL de D2E7 o en la posición 2, 5, 6, 8, 9 ó 10 del dominio CDR3 de VH de D2E7 no afecta significativamente a la velocidad de inactivación de la unión de hTNF\alpha en comparación el anticuerpo D2E7 parental de tipo silvestre. La sustitución de alanina en la posición 8 de la CDR3 de VL de D2E7 o en la posición 3 de CDR3 de VH de D2E7 proporciona una K_{off} 4 veces más rápida y una sustitución de alanina en la posición 4 u 11 de la CDR3 de VH de D2E7 proporciona una K_{off} 8 veces más rápida, indicando que estas posiciones son más críticas para la unión a hTNF\alpha. Sin embargo, una sola sustitución de alanina en la posición 1, 4, 5, 7 u 8 del dominio CDR3 de VL de D2E7 o en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 u 11 del dominio CDR3 de VH de D2E7 da como resultado un anticuerpo anti-hTNF\alpha que tiene una K_{off} de 1 x 10^{-3} seg^{-1} o menor.
Ejemplo 3 Análisis de unión de anticuerpos relacionados con D2E7
Una serie de anticuerpos relacionados en secuencia con D2E7 se analizaron con respecto a su unión a rhTNF\alpha, en comparación con D2E7, por resonancia de plasmón superficial como se describe en el Ejemplo 1. Las secuencias de aminoácidos de las regiones VL ensayadas se muestran en las Figuras 1A y 1B. Las secuencias de aminoácidos de las regiones VH ensayadas se muestran en las Figuras 2A y 2B. Las velocidades K_{off} para diversos pares VH/VL (en el formato indicado, como anticuerpo IgG1 o IgG4 de longitud completa o como un scFv) se resumen a continuación en la Tabla 6.
TABLA 6 Unión de anticuerpos relacionados con D2E7 a rhTNF\alpha biotinilado
VH VL Formato K_{off} (seg^{-1})
D2E7 VH D2E7 VL IgG1/IgG4 9,65 x 10^{-5}
VH1-D2 LOE7 IgG1/IgG4 7,7 x 10^{-5}
VH1-D2 LOE7 scFv 4,6 x 10^{-4}
VH1-D2.N LOE7.T IgG4 2,1 x 10^{-5}
VH1-D2.Y LOE7.A IgG4 2,7 x 10^{-5}
VH1-D2.N LOE7.A IgG4 3,2 x 10^{-5}
TABLA 6 (continuación)
VH VL Formato K_{off} (seg^{-1})
VH1-D2 EP B12 scFv 8,0 x 10^{-4}
VH1-D2 2SD4 VL scFv 1,94 x 10^{-3}
3C-H2 LOE7 scFv 1,5 x 10^{-3}
2SD4 VH LOE7 scFv 6,07 x 10^{-3}
2SD4 VH 2SD4 VL scFv 1,37 x 10^{-2}
VH1A11 2SD4 VL scFv 1,34 x 10^{-2}
VH1B12 2SD4 VL scFv 1,01 x 10^{-2}
VH1B11 2SD4 VL scFv 9,8 x 10^{-3}
VH1E4 2SD4 VL scFv 1,59 x 10^{-2}
VH1F6 2SD4 VL scFv 2,29 x 10^{-2}
VH1D8 2SD4 VL scFv 9,5 x 10^{-3}
VH1G1 2SD4 VL scFv 2,14 x 10^{-2}
2SD4 VH EP B12 scFv 6,7 x 10^{-3}
2SD4 VH VL10E4 scFv 9,6 x 10^{-3}
2SD4 VH VL100A9 scFv 1,33 x 10^{-2}
2SD4 VH VL100D2 scFv 1,41 x 10^{-2}
2SD4 VH VL10F4 scFv 1,11 x 10^{-2}
2SD4 VH VLLOE5 scFv 1,16 x 10^{-2}
2SD4 VH VLLOF9 scFv 6,09 x 10^{-3}
2SD4 VH VLLOF10 scFv 1,34 x 10^{-2}
2SD4 VH VLLOG7 scFv 1,56 x 10^{-2}
2SD4 VH VLLOG9 scFv 1,46 x 10^{-2}
2SD4 VH VLLOH1 scFv 1,17 x 10^{-2}
2SD4 VH VLLOH10 scFv 1,12 x 10^{-2}
2SD4 VH VL1B7 scFv 1,3 x 10^{-2}
2SD4 VH VL1C1 scFv 1,36 x 10^{-2}
2SD4 VH VL1C7 scFv 2,0 x 10^{-2}
2SD4 VH VL0.1F4 scFv 1,76 x 10^{-2}
2SD4 VH VL0.1H8 scFv 1,14 x 10^{-2} 
\newpage
Las lentas velocidades de inactivación (es decir, K_{off} \leq 1 x 10^{-4} seg^{-1}) para los anticuerpos de longitud completa (es decir, formato IgG) que tenían una VL seleccionada entre D2E7, LOE7, LOE7.T y LOE7.A, que tienen una treonina o una alanina en la posición 9, indican que la posición 9 de la CDR3 de VL de D2E7 puede ocuparse por cualquiera de estos dos restos sin afectar sustancialmente a la K_{off}. Por consiguiente, un motivo consenso para la CDR3 de VL de D2E7 comprende la secuencia de aminoácidos: Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEC ID Nº: 3). Además, las lentas velocidades de inactivación (es decir, K_{off} \leq 1 x 10^{-4} seg^{-1}) para anticuerpos que tienen una VH seleccionada entre D2E7, VH1-D2.N y VY1-D2.Y, que tienen una tirosina o una asparagina en la posición 12, indican que la posición 12 de la CDR3 de VH de D2E7 puede ocuparse por cualquiera de estos dos restos sin afectar sustancialmente a la K_{off}. Por consiguiente, un motivo consenso para la CDR3 de VH de D2E7 comprende la secuencia de aminoácidos: V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEC ID Nº: 4).
Los resultados mostrados en la Tabla 6 demuestran que, en el formato scFv, los anticuerpos que contienen la región CDR3 de VL o VH de 2SD4 presentan una K_{off}más rápida (es decir, K_{off} \leq 1 x 10^{-3} seg^{-1}) en comparación con los anticuerpos que contienen la región CDR3 de VL o VH de D2E7. Dentro de la CDR3 de VL, 2SD4 difiere de D2E7 en las posiciones 2, 5 y 9. Como se ha descrito anteriormente, sin embargo, la posición 9 puede ocuparse por Ala (como en 2SD4) o Thr (como en D2E7) sin afectar sustancialmente a la K_{off}. De esta manera, por la comparación de 2SD4 y D2E7, pueden identificarse las posiciones 2 y 5 de la CDR3 de VL de D2E7, ambas argininas, como posiciones críticas para la asociación del anticuerpo con el hTNF\alpha. Estos restos podrían implicarse directamente como restos de contacto en el sitio de unión del anticuerpo o podrían contribuir críticamente a mantener la arquitectura de andamiaje de la molécula de anticuerpo en esta región. Con respecto a la importancia de la posición 2, el reemplazo de Arg (en LOE7, que tiene la misma CDR3 de VL que D2E7) por Lys (en EP B12) acelera la velocidad de inactivación en un factor de dos. Con respecto a la importancia de la posición 5, el reemplazo de Arg (en D2E7) por Ala (en LD2E7*.A5), como se describe en el Ejemplo 2, también acelera la velocidad de inactivación dos veces. Además, sin Arg en las posiciones 2 y 5 (en 2SD4), la velocidad de inactivación es cinco veces más rápida. Sin embargo, debe indicarse que aunque la posición 5 es importante para mejorar la unión a hTNF\alpha, puede negarse un cambio en esta posición por cambios en otras posiciones, como se ve en VLLOE4, VLLOH1 o VL0.1H8.
Dentro de la CDR 3 de VH, 2SD4 difiere de D2E7 en las posiciones 1, 7 y 12. Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, la posición 12 puede ocuparse por Asn (como en 2SD4) o Tyr (como en D2E7) sin afectar sustancialmente a la K_{off}. De esta manera, por medio de la comparación de 2SD4 y D2E7, las posiciones 1 y 7 de la CDR3 de VH de D2E7 pueden identificarse como posiciones críticas para la unión al hTNF\alpha. Como se ha descrito anteriormente, estos restos podrían implicarse directamente como restos de contacto en el sitio de unión del anticuerpo o podrían contribuir críticamente a mantener la arquitectura de andamiaje de la molécula de anticuerpo en esta región. Las dos posiciones son importantes para la unión al hTNF\alpha, ya que cuando se usa la CDR3 de VH de 3C-H2 (que tiene un cambio de valina a alanina en la posición 1 con respecto a la CDR3 de VH de D2E7), el scFv tiene una velocidad de inactivación 3 veces más rápida que cuando se usa la CDR3 de VH de D2E7, pero esta velocidad de inactivación aún es cuatro veces más lenta que cuando se usa la CDR3 de VH de 2SD4 (que tiene cambios en las posiciones 1 y 7 con respecto a la CDR3 de VH de D2E7).
Ejemplo 4 Actividad Funcional de D2E7
Para examinar la actividad funcional de D2E7, el anticuerpo se usó en varios ensayos que miden la capacidad del anticuerpo de inhibir la actividad de hTNF\alpha, in vitro o in vivo.
A. Neutralización de citotoxicidad inducida por TNF\alpha en células L929
El TNF\alpha recombinante humano (rhTNF\alpha) produce citotoxicidad celular en células L929 murinas después de un periodo de incubación de 18-24 horas. Se evaluaron los anticuerpos anti-hTNF\alpha humanos en ensayos de L929 por coincubación de anticuerpos con rhTNF\alpha y las células que se indican a continuación. Una placa de microtitulación de 96 pocillos que contenía 100 \mul de Ab anti-hTNF\alpha se diluyó en serie 1/3 por duplicado usando medio RPMI que contenía un 10% de suero bovino fetal (FBS). Se añadieron 50 \mul de rhTNF\alpha para una concentración final de 500 pg/ml en cada pocillo de muestra. Las placas después se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 50 \mul de células de fibroblasto de ratón L929 sensibles a TNF\alpha para una concentración final de 5 x 10^{4} células por pocillo, incluyendo 1 \mug/ml de Actinomicina-D. Los controles incluían medio más células y rhTNF\alpha más células. Estos controles, y una curva patrón de TNF\alpha, que varía de 2 ng/ml a 8,2 pg/ml, se usaron para determinar la calidad del ensayo y proporcionar una ventana de neutralización. Las placas después se incubaron durante una noche (18-24 hors) a 37ºC en CO_{2} al 5%.
Se retiraron 100 \mul de medio de cada pocillo y se añadieron 50 \mul de bromuro de 3-(4,4-dimetiltiazol-2-il)2,5-difenil-tetrazolio (MTT; disponible en el mercado en Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a una concentración de 5 mg/ml en PBS. Las placas después se incubaron durante 4 horas a 37ºC. Después se añadieron 50 \mul de dodecilsulfato sódico (SDS) al 20% a cada pocillo y las placas se incubaron durante una noche a 37ºC. Se midió la densidad óptica a 570/630 nm, se representaron curvas para cada muestra y los valores de CI_{50} se determinaron por métodos convencionales.
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En la Figura 3 y en la Tabla 7 mostrada a continuación se muestran resultados representativos para anticuerpos humanos que tienen diversos pares de VL y VH, en comparación con el mAb murino MAK 195.
TABLA 7 Neutralización de la citotoxicidad de L929 inducida por TNF\alpha
VH VL Estructura CI_{50}, M
D2E7 D2E7 scFv 1,1 x 10^{-10}
D2E7 D2E7 IgG4 4,7 x 10^{-11}
2SD4 2SD4 scFv/IgG1/IgG4 3,0 x 10^{-7}
2SD4 LOE7 scFv 4,3 x 10^{-8}
VH1-D2 2SD4 scFv 1,0 x 10^{-8}
VH1-D2 LOE7 scFv/IgG1/IgG4 3,4 x 10^{-10}
VH1-D2.Y LOE7.T IgG4 8,1 x 10^{-11}
VH1-D2.N LOE7.T IgG4 1,3 x 10^{-10}
VH1-D2.Y LOE7.A IgG4 2,8 x 10^{-11}
VH1-D2.N LOE7.A IgG4 6,2 x 10^{-11}
MAK 195 MAK 195 scFv 1,9 x 10^{-8}
MAK 195 MAK 195 F(ab')_{2} 6,2 x 10^{-11}
Los resultados de la Figura 3 y la Tabla 7 demuestran que el anticuerpo D2E7 humano anti-hTNF\alpha, y diversos anticuerpos relacionados con D2E7, neutralizan la citotoxicidad de L929 inducida por TNF\alpha con una capacidad aproximadamente equivalente a la del mAb anti-hTNF\alpha MAK 195.
En otra serie de experimentos, se examinó la capacidad de la forma IgG1 de D2E7 de neutralizar la citotoxicidad de L929 inducida por TNF\alpha como se ha descrito anteriormente. Los resultados de tres experimentos independientes, y el promedio de los mismos, se resumen a continuación en la Tabla 8:
TABLA 8 Neutralización de la citotoxicidad de L929 inducida por TNF\alpha por IgG1 de D2E7
Experimento CI_{50} [M]
1 1,26 x 10^{-10}
2 1,33 x 10^{-10}
3 1,15 x 10^{-10}
Promedio 1,25 \pm 0,01 x 10^{-10}
Esta serie de experimentos confirmó que D2E7, en la forma de IgG1 de longitud completa, neutraliza la citotoxicidad de L929 inducida por TNF\alpha con una CI_{50} media [M] de 1,5 \pm 0,01 x 10^{-10}.
\newpage
B. Inhibición de la unión de TNF\alpha a receptores de TNF\alpha en células U-937
La capacidad de anticuerpos anti-hTNF\alpha humanos de inhibir la unión de hTNF\alpha a receptores de hTNF\alpha en la superficie de las células se examinó usando la línea celular U-937 (ATCC Nº CRL 1593), una línea de histiocitos humanos que expresa receptores de hTNF\alpha. Se cultivaron células U-937 en medio RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero bovino fetal (Hyclone A-1111, Hyclone Laboratories, Logan, UT), L-glutamina (4 nM), solución tampón HEPES (10 mM), penicilina (100 \mug/ml) y estreptomicina (100 \mug/ml). Para examinar la actividad de los anticuerpos IgG de longitud completa, las células U-937 se preincubaron con PBS suplementado con 1 mg/ml de IgG humana (Sigma I-4506, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) durante 45 minutos en hielo y después las células se lavaron 3 veces con tampón de unión. Para el ensayo de unión al receptor, las células U-937 (5 x 10^{6} células/pocillo) se incubaron en un tampón de unión (PBS suplementado con albúmina de suero bovino al 0,2%) en placas de microtitulación de 96 pocillos (Costar 3799, Costar Corp., Cambridge, Ma) junto con rhTNF\alpha marcado con ^{125}I (3 x 10^{-10} M; 25 \muCi/ml; obtenido a partir de NEN Research Products, Wilmington, De), con o sin anticuerpos anti- hTNF\alpha, en un volumen total de 0,2 ml. Las placas se incubaron en hielo durante 1,5 horas. Después, se transfirieron 75 \mul de cada muestra a tubos de ensayo de 1,0 ml (Sarstedt 72.700, Sarstedt Corp., Princeton, NJ) que contenían ftalato de dibutilo (Sigma D-2270, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y ftalato de dinonilo (ICN 210733, ICN, Irvine, CA). Los tubos de ensayo contenían una mezcla de 300 \mul de ftalato de dibutilo y ftalato de dinonilo, en una relación en volumen 2:1, respectivamente. El rhTNF\alpha marcado con ^{125}I libre (es decir, no unido) se retiró por microcentrifugación durante 5 minutos. Entonces, se cortó el extremo de cada tubo de ensayo que contenía un sedimento celular con la ayuda de una tijera de microtubos (Bel-Art 210180001, Bel-Art Products, Pequannock, NJ). El sedimento celular contiene rhTNF\alpha marcado con^{125}I unido al receptor de TNF\alpha p60 o p80, mientras que la fase acuosa por encima de la mezcla oleosa contiene un exceso de rhTNF\alpha marcado con ^{125}I libre. Todos los sedimentos celulares se recogieron en un tubo de recuento (Falcon 2052, Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) y se contaron en un contador de centelleo.
En la Figura 4 se muestran los resultados representativos. El valor de CI_{50} para la inhibición por D2E7 de la unión de hTNF\alpha a los receptores de hTNF\alpha en células U-937 es de aproximadamente 3 x 10^{-10} M en estos experimentos. Estos resultados demuestran que el anticuerpo anti-hTNF\alpha humano D2E7 inhibe la unión de rhTNF\alpha a receptores de hTNF\alpha en células U-937 a concentraciones aproximadamente equivalentes a las del mAb anti-hTNF\alpha MAK 195.
En otra serie de experimentos, se examinó la capacidad de la forma IgG1 de D2E7 de inhibir la unión de rhTNF\alpha a receptores de hTNF\alpha en células U-937 como se ha descrito anteriormente. Los resultados de tres experimentos independientes, y el promedio de los mismos, se resumen a continuación en la Tabla 9.
TABLA 9 Inhibición de la unión del receptor de TNF en células U-937 por la IgG1 D2E7
Experimento CI_{50} [M]
1 1,70 x 10^{-10}
2 1,49 x 10^{-10}
3 1,50 x 10^{-10}
Promedio 1,56\pm0,12 x 10^{-10}
Esta serie de experimentos confirmó que D2E7, en la forma de IgG1 de longitud completa, inhibe la unión al receptor de TNF en células U-937 con una CI_{50} media [M] de 1,56 \pm 0,12 x 10^{-10}.
Para investigar la potencia inhibidora de D2E7 en la unión de ^{125}I-rhTNF a receptores p55 y p75 individuales, se realizó un radioinmunoensayo en fase sólida. Para medir los valores de CI_{50} de D2E7 para receptores de TNF distintos, se incubaron concentraciones variables del anticuerpo con una concentración de 3 x 10^{-10} de ^{125}I-rhTNF. La mezcla después se ensayó en placas separadas que contenían los receptores de TNF p55 o p75 de una manera dependiente de la dosis. Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 10.
TABLA 10 Inhibición de la unión del receptor de TNF al TNFR p55 y p75 por la IgG1 D2E7
CI_{50}[M]
Reactivo p55 TNFR p 75TNFR
D2E7 1,47 x 10^{-9} 1,26 x 10^{-9}
rhTNF 2,31 x 10^{-9} 2,70 x 10^{-9}
La inhibición de la unión de ^{125}I-rhTNF a los receptores de TNF p55 y p75 en células U937 por D2E7 siguió una curva sigmoidea sencilla, indicando valores de CI_{50} similares para cada receptor. En los experimentos de radioinmunoensayo de fase sólida (RIA) con receptores de TNF recombinantes, se calcularon valores de CI_{50} para la inhibición de la unión de ^{125}I-rhTNF a los receptores p55 y p75 por D2E7 de 1,47 x 10^{-9} y 1,26 x 10^{-9} M, respectivamente. La reducción en los valores de CI_{50} en la fase sólida probablemente se debía a la mayor densidad de receptores en el formato RIA, ya que el rhTNF\alpha no marcado también inhibía con valores de CI_{50} similares. Los valores de CI_{50} para la inhibición de la unión de ^{125}I-rhTNF a los receptores p55 y p75 por el rhTNF no marcado fueron de 2,31 x 10^{-9} y 2,70 x 10^{-9} M, respectivamente.
C. Inhibición de la expresión de ELAM-1 en HUVEC
Pueden inducirse células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) para expresar la molécula de adhesión a leucocitos 1 de células endoteliales (ELAM-1) en su superficie por tratamiento con rhTNF\alpha, que puede detectarse por reacción de HUVEC tratadas con rhTNF\alpha con un anticuerpo de ratón anti-HELAM-1 humano. La capacidad de los anticuerpos anti-hTNF\alpha humanos para inhibir esta expresión inducida por TNF\alpha de ELAM-1 en HUVEC se examinó como se indica a continuación: se cultivaron HUVEC (ATCC Nº CRL 1730) en placas de 96 pocillos (5 x 10^{4} células/pocillo) y se incubaron durante una noche a 37ºC. Al día siguiente, se prepararon diluciones en serie de anticuerpo anti- hTNF\alpha humano (1:10) en una placa de microtitulación, partiendo con 20-100 \mug/ml de anticuerpo. Se preparó una solución madre de rhTNF\alpha a 4,5 ng/ml, se añadieron alícuotas de rhTNF\alpha a cada pocillo que contenía anticuerpo y el contenido se mezcló bien. Los controles incluían medio solo, medio más anticuerpo anti-hTNF\alpha y medio más rhTNF\alpha. Las placas HUVEC se retiraron de su incubación durante una noche a 37ºC y se aspiró suavemente el medio de cada pocillo. Se transfirieron 200 \mul de la mezcla de anticuerpo- rhTNF\alpha a cada pocillo de las placas HUVEC. Las placas HUVEC después se incubaron adicionalmente a 37ºC durante 4 horas. A continuación, una solución de anticuerpo murino anti-ELAM-1 se diluyó 1:1000 en RPMI. Se aspiró suavemente el medio de cada pocillo de la placa HUVEC, se añadieron 50 \mul/pocillo de la solución de anticuerpo anti-ELAM-1 y las placas HUVEC se incubaron 60 minutos a temperatura ambiente. Se preparó una solución de anticuerpo Ig anti-ratón marcado con ^{125}I en RPMI (aproximadamente 50.000 cpm en 50 \mul. Se aspiró suavemente el medio de cada pocillo de las placas HUVEC, los pocillos se lavaron dos veces con RPMI y se añadieron a cada pocillo 50 \mul de la solución de Ig anti-ratón marcada con ^{125}I. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y después cada pocillo se lavó 3 veces con RPMI. Se añadieron a cada pocillo ciento ochenta microlitros de SDS al 5% para lisar las células. El lisado celular de cada pocillo después se transfirió a un tubo y se contó en un contador de centelleo.
En la Figura 5 se muestran resultados representativos. El valor de CI_{50} para la inhibición por D2E7 de la expresión de ELAM-1 inducida por hTNF\alpha en HUVEC es de aproximadamente 6 x 10^{-11} M en estos experimentos. Estos resultados demuestran que el anticuerpo anti-hTNF\alpha humano D2D7 inhibe la expresión de ELAM-1 inducida por hTNF\alpha en HUVEC a concentraciones aproximadamente equivalentes a las del mAb anti-hTNF\alpha murino MAK 195.
En otra serie de experimentos, se examinó la capacidad de la forma IgG1 de D2E7 para inhibir la expresión de ELAM-1 inducida por hTNF\alpha en HUVEC como se ha descrito anteriormente. Los resultados de tres experimentos independientes, y el promedio de los mismos, se resumen a continuación en la Tabla 11
TABLA 11 Inhibición de la expresión de ELAM-1 inducida por TNF\alpha por el receptor de la IgG1 D2E7
Experimento CI_{50}[M]
1 1,95 x 10^{-10}
2 1,69 x 10^{-10}
3 1,90 x 10^{-10}
Promedio 1,85\pm0,14 x 10^{-10}
Esta serie de experimentos confirmó que D2E7, en la forma de IgG1 de longitud completa, inhibe la expresión de ELAM-1 inducida por TNF\alpha en HUVEC con una CI_{50} media [M] de 1,85 \pm 0,14 x 10^{-10}.
También se examinó la potencia de neutralización de la IgG1 D2E7 para la expresión de otras dos moléculas de adhesión, ICAM-1 y VCAM-1 inducida por rhTNF. Como la curva de trituración de rhTNF para la expresión de ICAM-1 a las 16 hora fue muy similar a la curva de expresión de ELAM-1, se usó la misma concentración de rhTNF en los experimentos de neutralización de anticuerpos. Las HUVEC se incubaron con rhTNF en presencia de concentraciones variables de D2E7 en un incubador de CO_{2} a 37ºC durante 16 horas, y la expresión de ICAM-1 se midió por anticuerpo de ratón anti-ICAM-1 seguido de anticuerpo de oveja anti-ratón marcado con ^{125}I. Se realizaron dos experimentos independientes y se calcularon los valores de CI_{50}. Un anticuerpo IgG1 humano no relacionado no inhibía la expresión de ICAM-1.
El procedimiento experimental para ensayar la inhibición de la expresión de VCAM-1 fue el mismo que el procedimiento para la expresión de ELAM-1, con la excepción de que se usó el mAb anti-VCAM-1 en lugar del mAb anti-ELAM-1. Se realizaron tres experimentos independientes y se calcularon los valores de CI_{50}. Un anticuerpo IgG1 humano no relacionado no inhibía la expresión de VCAM-1.
Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 12.
TABLA 12 Inhibición de la expresión de ICAM-1 y VCAM-1 por la IgG1 D2E7
Inhibición de ICAM-1 CI_{50}[M]
Experimento CI_{50}[M] Experimento CI_{50}[M]
1 1,84 x 10^{-10} 1 1,03 x 10^{-10}
2 2,49 x 10^{-10} 2 9,26 x 10^{-11}
3 1,06 x 10^{-10}
Promedio 2,17\pm0,46 x 10^{-10} Promedio 1,01\pm0,01 x 10^{-10}
Estos experimentos demuestran que el tratamiento de células endoteliales de vena endotelial humana primarias con rhTNF condujo a una expresión óptima de moléculas de adhesión: ELAM-1 y VCAM-1 a las cuatro horas, y la expresión máxima regulada positivamente de ICAM-1 a las 16 horas. D2E7 pudo inhibir la expresión de las tres moléculas de adhesión de una manera dependiente de la dosis. Los valores de CI_{50}para la inhibición de 
\hbox{ELAM-1,}
ICAM-1 y VCAM-1 fueron 1,85 x 10^{-10}, 2,17 x 10^{-10} y 1,01 x 10^{-10}, respectivamente. Estos valores son muy similares, indicando requisitos similares para la dosis de la señal de activación de rhTNF para inducir la expresión de 
\hbox{ELAM-1,}
ICAM-1 y VCAM-1. De forma interesante, D2E7 fue similarmente eficaz en el ensayo de inhibición mayor de la expresión de ICAM-1. El ensayo de inhibición de ICAM-1 requirió 16 horas de incubación de rhTNF y D2E7 con HUVEC en lugar de las 4 horas requeridas para los ensayos de inhibición de ELAM-1 y VCAM-1. Como D2E7 tiene una velocidad de inactivación lenta para el rhTNF, es concebible que durante el periodo de coincubación de 16 horas no hubo una competición significativa por los receptores de TNF en las HUVEC. 
\newpage
D. Neutralización in vivo de hTNF\alpha
Se usaron tres sistemas in vivo diferentes para demostrar que D2E7 es eficaz en la inhibición de hTNF\alpha in vivo.
I. Inhibición de la letalidad inducida por TNF en ratones sensibilizados con D-Galactosamina
La inyección de TNF\alpha humano recombinante (rhTNF\alpha) a ratones sensibilizados con D-galactosamina produce letalidad en un periodo de tiempo de 24 horas. Se ha demostrado que los agentes neutralizadores de TNF\alpha previenen la letalidad en este modelo. Para examinar la capacidad de los anticuerpos anti-hTNF\alpha humanos de neutralizar el hTNF\alpha in vivo en este modelo, a ratones C57B1/6 se les inyectaron concentraciones variables de D2E7- IgG1 o una proteína de control en PBS por vía intraperitoneal (i.p.). Los ratones se expusieron 30 minutos después a 1 \mug de rhTNF\alpha y 20 mg de D- galactosamina en PBS i.p., y se observaron 24 horas después. Estas cantidades de rhTNF\alpha y D-galactosamina, como se determinó previamente, conseguían una letalidad del 80-90% en estos ratones.
En la Figura 6 se muestran los resultados representativos, representados como un gráfico de barras del % de supervivencia frente a la concentración de anticuerpo. Las barras negras representan D2E7, mientras que las barras rayadas representan MAK 195. La inyección de 2,5-25 \mug de anticuerpo D2E7 por ratón protegió a los animales de la letalidad inducida por TNF\alpha. El valor de DE_{50} es aproximadamente 1-2,5 \mug/ratón. El anticuerpo de control positivo, MAK 195, fue similar en su capacidad protectora. La inyección de D2E7 en ausencia de rhTNF\alpha no tuvo ningún efecto perjudicial sobre los ratones. La inyección de un anticuerpo IgG1 humano no específico no ofreció ninguna protección de la letalidad inducida por TNF\alpha.
En un segundo experimento, cuarenta y nueve ratones se dividieron en 7 grupos iguales. Cada grupo recibió dosis variables de D2E7 30 minutos antes de recibir una dosis DL_{80} de una mezcla de rhTNF/D-galactosamina (1,0 \mug de rhTNF y 20 mg de D-galactosamina por ratón). El grupo de control 7 recibió el anticuerpo kappa IgG1 normal a una dosis de 25 \mug/ratón. Los ratones se examinaron 24 horas después. La supervivencia de cada grupo se resume más adelante en la Tabla 13.
TABLA 13 Supervivencia de 24 horas después del tratamiento con D2E7
Grupo Supervivencia Supervivencia (%)
(vivos/total)
1 (sin anticuerpo) 0/7 0
2 (1 \mug) 1/7 14
3 (2,6 \mug) 5/7 71
4 (5,2 \mug) 6/7 86
5 (26 \mug) 6/7 86
6 (26 \mug; sin rhTNF) 7/7 100
7 (25 \mug Hu IgG1) 1/7 14
II. Inhibición de la pirexia en conejos inducida por TNF
Se examinó la eficacia de D2E7 en la inhibición de la respuesta de pirexia inducida por rhTNF en conejos. A grupos de tres conejos hembra NZW que pesaban aproximadamente 2,5 kg cada uno, se les inyectó por vía intravenosa D2E7, rhTNF y complejos inmunes de D2E7 y rhTNF. Las temperaturas rectales se midieron por sondas thermistor en un registrador de la temperatura Kaye cada minuto durante aproximadamente 4 horas. El TNF humano recombinante en solución salina, inyectado a una dosis de 5 \mug/kg, indujo una elevación en la temperatura mayor de 0,4ºC a aproximadamente 45 minutos después de la inyección. La propia preparación de anticuerpo, en solución salina a una dosis de 138 \mug/kg, no indujo un aumento en la temperatura en los conejos hasta 140 minutos después de la administración. En todos los experimentos adicionales, se inyectaron D2E7 o reactivos de control (IgG1 humana o un vehículo salino) i.v. a los conejos seguido, 15 minutos después, de una inyección de rhTNF en solución salina a 5 \mug/kg i.v. En la Tabla 14 presentada a continuación se resumen los resultados representativos de varios experimentos:
TABLA 14 Inhibición de la pirexia inducida por rhTNF con D2E7 en conejos
Elevación de la Relación Temperatura
temperatura*, ºC Molar máxima
Dosis de rhTNF rhTNF + % de D2E7: Minutos
D2E7 D2E7 Inhib.** rhTNF después de
(\mug/kg) rhTNF
14 0,53 0,25 53 1 60
24 0,43 0,13 70 1,6 40
48 0,53 0,03 94 3,3 50
137 0,53 0,00 100 9,5 60
792 0,80 0,00 100 55 60
* = Temperatura máxima
** = % de inhibición = (1-{aumento de la temperatura con rhTNF y D2E7/aumento de la temperatura con rhTNF
solo}) x 100.
El pretratamiento intravenoso con D2E7 a una dosis de 14 \mug/kg inhibió parcialmente la respuesta pirogénica, en comparación con conejos pretratados con solución salina sola. D2E7 administrado a 137 \mug/kg suprimió totalmente la respuesta pirogénica de rhTNF en el mismo experimento. En un segundo experimento, D2E7 administrado a 24 \mug/kg también suprimió parcialmente la respuesta pirogénica, en comparación con los conejos pretratados con solución salina sola. La relación molar entre D2E7 y rhTNF fue de 1/6:1 en este experimento. En un tercer experimento, D2E7 inyectado i.v. a 48 \mug/kg (relación molar D2E7:rhTNF = 3,3:1) suprimió totalmente la respuesta pirogénica en comparación con conejos pretratados con la IgG1 humana de control en solución salina a 30 \mug/kg. En el experimento final, los conejos pretratados con D2E7 (792 \mug/kg) a una relación muy alta en relación con rhTNF (55:1) no desarrolló ningún aumento en la temperatura en ningún momento hasta las 4 horas de observación. El tratamiento de conejos con complejos inmunes generados a partir de una mezcla de D2E7 y rhTNF incubada a 37ºC durante 1 hora a una relación molar de 55:1, sin la posterior administración de rhTNF, tampoco indujo ningún aumento en la temperatura en el mismo experimento.
III. Prevención de la poliartritis en ratones transgénicos Tg197
Se investigó el efecto de D2E7 sobre el desarrollo de la enfermedad en un modelo murino transgénico de artritis. Se han generado ratones transgénicos (Tg197) que expresan TNF de tipo silvestre humano (modificado en la región 3' más allá de las secuencias codificantes) y estos ratones desarrollan poliartritis crónica con una incidencia del 100% a 4-7 semanas de edad (véase EMBO J (1991) 10: 4025-4031 como descripción adicional del modelo Tg197 de poliartritis).
Los animales transgénicos se identificaron por PCR a los 3 días de edad. Se dividieron en seis grupos camadas de ratones transgénicos. Los ratones transgénicos se verificaron por análisis de hibridación slot-blot a los 15 días de edad. Los protocolos de tratamiento para los seis grupos fueron los siguientes: Grupo 1 = sin tratamiento; Grupo 2 = solución salina (vehículo); Grupo 3 = D2E7 a 1,5 \mug/g; Grupo 4 = D2E7 a 15 \mug/g; Grupo 5 = D2E7 a 30 \mug/g; y Grupo 6 = control de isotipo de IgG1 a 30 \mug/g. En el estudio también se incluyó una camada sin ratones transgénicos para servir como control (Grupo 7 - no transgénicos; sin tratamiento). Cada grupo recibió tres inyecciones i.p. por semana de los tratamientos indicados. Las inyecciones se continuaron durante 10 semanas. Cada semana, se registraron cambios macroscópicos en la morfología de las articulaciones para cada animal. A las 10 semanas, todos los ratones se sacrificaron y se recogió el tejido del ratón en formalina. Se realizó un examen microscópico del tejido.
Se tomó el peso en gramos para cada ratón al principio de cada semana. Al mismo tiempo también se tomaron mediciones del tamaño de la articulación (en mm), como una medida de la gravedad de la enfermedad. El tamaño de la articulación se estableció como un promedio de tres medidas en el tobillo derecho de la pata trasera usando un dispositivo micrométrico. Las puntuaciones artríticas se registraron semanalmente como se indica a continuación: 0 = Sin artritis (aspecto normal y flexión); + = artritis leve (distorsión de la articulación); ++ = artritis moderada (hinchazón, deformación de la articulación) y +++ = artritis fuerte (anquilosis detectada en la flexión y el movimiento gravemente impedido). Las puntuaciones histopatológicas basadas en la tinción con hematoxilina/eosina de secciones de la articulación fue como se indica a continuación; 0 = Sin enfermedad detectable; 1 = proliferación de la membrana sinovial; 2 = espesamiento sinovial fuerte; 3 = destrucción del cartílago y erosión ósea.
\newpage
El efecto del tratamiento con D2E7 sobre el tamaño medio de la articulación del ratón artrítico transgénico Tg197 se muestra en el gráfico de la Figura 9. Las puntuaciones histopatológicas y artríticas del ratón transgénico Tg197, a las 11 semanas de edad, se resumen a continuación en la Tabla 15.
TABLA 15 Efecto de D2E7 sobre la histopatología y puntuación artrítica en ratones Tg197:
Grupo Tratamiento Puntuación Puntuación
Histopatológica Artrítica
1 ninguno 3 (7/70) +++ (7/7)
2 solución salina 3 (8/8) +++ (8/8)
6 control de IgG1 3 (9/9) +++ (7/9)
3 D2E7 a 1,5 \mug/g 0 (6/8) 0 (8/8)
4 D2E7 a 15 \mug/g 0 (7/8) 0 (8/8)
5 D2E7 a 30 \mug/g 0 (8/8) 0 (8/8)
Este experimento demostró que el anticuerpo D2E7 tiene un efecto beneficioso definido sobre ratones transgénicos que expresan el TNF humano de tipo silvestre (Tg197) sin artritis evidente después del periodo de estudio.
E. Neutralización de TNF\alpha de otras especies por D2E7
La especificidad de unión de D2E7 se examinó midiendo su capacidad de neutralizar factores de necrosis tumoral de diversas especies de primate y de ratón, usando un ensayo de citotoxicidad de L929 (como se describe en el Ejemplo 4, subsección A, anterior). Los resultados se resumen en la Tabla 16 presentada a continuación:
TABLA 16 Capacidad de D2E7 de neutralizar TNF de diferentes especies en el ensayo de L929
TNF\alpha* Fuente CI_{50} para la
Neutralización por D2E7
(M)**
Humano Recombinante 7,8 x 10^{-11}
Chimpancé PBMC estimulado con 5,5 x 10^{-11}
LPS
mandril Recombinante 6,0 x 10^{-11}
tití PBMC estimulado con 4,0 x 10^{-10}
LPS
cynomolgus PBMC estimulado con 8,0 x 10^{-11}
LPS
rhesus PBMC estimulado con 3,0 x 10^{-11}
LPS
canino WBC estimulado con 2,2 x 10^{-10}
LPS
porcino Recombinante 1,0 x 10^{-7}
murino Recombinante >1,0 x 10^{-7}
Los resultados de la Tabla 16 demuestran que D2E7 puede neutralizar la actividad de cinco TNF\alpha de primate aproximadamente de forma equivalente al TNF\alpha humano y, además, puede neutralizar la actividad del TNF\alpha canino (aproximadamente diez veces peor que el TNF\alpha humano) y del TNF\alpha porcino y de ratón (aproximadamente \sim1000 veces peor que el TNF\alpha humano). Además, la unión de D2E7 a rhTNF\alpha en fase de solución no se inhibió por otras citoquinas, tales como linfotoxinas (TNF\beta), IL-1\alpha, IL-1\beta, IL- 2, IL-4, IL-6, IL-8, IFN\gamma y TGF\beta, lo que indica que D2E7 es muy específico por su ligando TNF\alpha.
F. Ausencia de liberación de citoquinas por sangre entera humana incubada con D2E7
En este ejemplo, se examinó la capacidad de D2E7 para inducir, por sí mismo, células sanguíneas humanas normales para secretar citoquinas o moléculas superficiales de la célula separada. D2E7 se incubó con sangre entera diluida de tres donantes normales diferentes a concentraciones variables durante 24 horas. Al mismo tiempo se procesó un control positivo de LPS, a una concentración determinada previamente para estimular las células sanguíneas inmunocompetentes para secretar citoquinas. Los sobrenadantes se recogieron y se ensayaron en un panel de diez kits ELISA de citoquina soluble, receptor y molécula de adhesión: IL-1\alpha, IL-1\beta, antagonista del receptor de IL- 1, IL-6, IL-8, TNF\alpha, receptor 1 de TNF soluble, receptor 2 de TNF soluble, ICAM-1 soluble y E-selectina soluble. No se midió ninguna cantidad significativa de citoquina o de moléculas de la superficie de células separadas como resultado de la coincubación de anticuerpos D2E7, a concentraciones de hasta 343 \mug/ml. Los cultivos de control sin la adición del anticuerpo tampoco produjeron ninguna cantidad medible de citoquinas, mientras que el control de cocultivo de LPS produjo valores elevados en el intervalo de muchos picogramos a pocos nanogramos. Estos resultados indican que D2E7 no inducía la secreción de citoquinas o proteínas de la superficie de células separadas por células sanguíneas enteras por encima de los niveles normales en cultivo ex vivo.
Formando parte de la presente descripción, se presenta la Lista de Secuencias adjunta, cuyo contenido se resume en la siguiente tabla:
SEC ID Nº: CADENA DE REGIÓN TIPO DE
ANTICUERPO SECUENCIA
1 D2E7 VL aminoácido
2 D2E7 VH aminoácido
3 D2E7 CDR3 de VL aminoácido
4 D2E7 CDR3 de VH aminoácido
5 D2E7 CDR2 de VL aminoácido
6 D2E7 CDR2 de VH aminoácido
7 D2E7 CDR1 de VL aminoácido
8 D2E7 CDR1 de VH aminoácido
9 2SD4 VL aminoácido
10 2SD4 VH aminoácido
11 2SD4 CDR3 de VL aminoácido
12 EP B12 CDR3 de VL aminoácido
13 VL10E4 CDR3 de VL aminoácido
14 VL100A9 CDR3 de VL aminoácido
15 VLL100D2 CDR3 de VL aminoácido 
\newpage
(Continuación)
SEC ID Nº: CADENA DE REGIÓN TIPO DE
ANTICUERPO SECUENCIA
16 VLLOF4 CDR3 de VL aminoácido
17 LOE5 CDR3 de VL aminoácido
18 VLLOG7 CDR3 de VL aminoácido
19 VLLOG9 CDR3 de VL aminoácido
20 VLLOH1 CDR3 de VL aminoácido
21 VLLOH10 CDR3 de VL aminoácido
22 VL1B7 CDR3 de VL aminoácido
23 VL1C1 CDR3 de VL aminoácido
24 VL0 . 1F4 CDR3 de VL aminoácido
25 VL0 . 1H8 CDR3 de VL aminoácido
26 LOE7 .A CDR3 de VL aminoácido
27 2SD4 CDR3 de VL aminoácido
28 VH1B11 CDR3 de VL aminoácido
29 VH1D8 CDR3 de VL aminoácido
30 VH1A11 CDR3 de VH aminoácido
31 VH1B12 CDR3 de VH aminoácido
32 VH1E4 CDR3 de VH aminoácido
33 VH1F6 CDR3 de VH aminoácido
34 3C-H2 CDR3 de VH aminoácido
35 VH1-D2 .N CDR3 de VH aminoácido
36 D2E7 VL ácido nucleico
37 D2E7 VH ácido nucleico
Equivalentes
Los especialistas en la técnica reconocerán, o podrán averiguar más que una experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descrita en este documento. Tales equivalentes pretenden incluirse en las siguientes reivindicaciones.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: BASF Aktiengesellschaft
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: Carl-Bosch Str. 38
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: 67056 Ludwigshafen
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: Rheinland-Pfalz
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: República Federal de Alemania
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpos Humanos que se Unen al TNF\alpha Humano
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 37
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DIRECCIÓN: LAHIVE & COCKFIELD
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 60 State Street, suite 510
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Boston
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: Massachusetts
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
ZIP: 02109-1875
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatenIn Release Nº. 1.0, Versión Nº. 1.25
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/599,226
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-FEB-1996
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NUMERO DE SOLICITUD: US 60/031,476
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 25-NOV-1996
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: DeConti, Giulio A., Jr.
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 31,503
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO: BBI-043CPPC
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (617)227-7400
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FAX: (617) 227-5941
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 107 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
1 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 121 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
2 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 9
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Xaa es Thr o Ala"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 12
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
OTRA INFORMACIÓN: /nota = ``Xaa es Tyr o Asn''
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Tyr Ala Met His}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 107 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
3 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 121 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
4 
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Ala}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Lys Tyr Gln Arg Ala Pro Tyr Thr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Lys Tyr Ser Ser Ala Pro Tyr Thr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Thr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Asn}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Lys Tyr Thr Ser Ala Pro Tyr Thr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Asn}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Ala Tyr Ser}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Pro Asp Thr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Lys Tyr Asn Ser Asp Pro Tyr Thr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Lys Tyr Ile Ser Ala Pro Tyr Thr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Lys Tyr Asn Arg Pro Pro Tyr Thr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asn}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Lys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 29:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 30:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asp}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 31:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Phe Ser Leu Asp Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 32:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu His Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 33:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ser Phe Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Glu Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Glu Tyr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 35:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Asn}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 36:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 321 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 36:
5 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 37:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 363 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 37:
6

Claims (63)

1. Un anticuerpo humano aislado, o una porción de unión a antígenos del mismo, con las siguientes características:
a) se disocia del TNF\alpha humano con una constante de velocidad K_{off} de 1 x 10^{-3} s^{-1} o menor, como se determina por resonancia de plasmón superficial;
b) tiene un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3, o modificada de la SEC ID Nº: 3 por una sola sustitución de alanina en posición 1, 4, 5, 7 u 8 o por una a cinco sustituciones de aminoácidos conservativas en posición 1, 3, 4, 6, 7, 8 y/o 9;
c) tiene un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4, o modificada de la SEC ID Nº: 4 por una sola sustitución de alanina en posición 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 u 11 o por una a cinco sustituciones de aminoácidos conservativas en posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y/o 12;
2. El anticuerpo humano aislado, o una porción de unión a antígenos del mismo, de la reivindicación 1, que se disocia del TNF\alpha humano con una K_{d} de 1 x 10^{-8} M o menor y una constante de velocidad K_{off} de 1 x 10^{-3} s^{-1} o menor, ambas determinadas por resonancia de plasmón superficial, y neutraliza la citotoxicidad del TNF\alpha en un ensayo convencional in vitro de L929 con una CI_{50} de 1 x 10^{-7} M o menor.
3. El anticuerpo humano aislado, o porción de unión a antígenos del mismo, de la reivindicación 2, que neutraliza la citotoxicidad de TNF\alpha humano en un ensayo convencional in vitro de L929 con una CI_{50} de 1 x 10^{-8} M o menor.
4. El anticuerpo humano aislado, o porción de unión a antígenos del mismo, de la reivindicación 2, que neutraliza la citotoxicidad de TNF\alpha humano en un ensayo convencional in vitro de L929 con una CI_{50} de 1 x 10^{-9} M o menor.
5. El anticuerpo humano aislado, o porción de unión a antígenos del mismo, de la reivindicación 2, que neutraliza la citotoxicidad de TNF\alpha humano en un ensayo convencional in vitro de L929 con una CI_{50} de 1 x 10^{-10} M o menor.
6. El anticuerpo humano aislado, o porción de unión a antígenos del mismo, de la reivindicación 2, que es un anticuerpo recombinante, o una porción de unión a antígenos del mismo.
7. El anticuerpo humano aislado, o porción de unión a antígenos del mismo, de la reivindicación 2, que inhibe la expresión de ELAM-1 inducida por TNF\alpha humano en células endoteliales de vena umbilical humana.
8. El anticuerpo humano aislado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o una porción de unión a antígenos del mismo, que se disocia del TNF\alpha humano con una constante de velocidad K_{off} de 5 x 10^{-4} s^{-1} o menor.
9. El anticuerpo humano aislado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o una porción de unión a antígenos del mismo, que se disocia del TNF\alpha humano con una constante de velocidad K_{off} de 1 x 10^{-4} s^{-1} o menor.
10. Un anticuerpo humano aislado, o una porción de unión a antígenos del mismo, de la reivindicación 1, con una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene un domino CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3, o modificada a partir de la SEC ID Nº: 3 por una sola sustitución de alanina en posición 1, 4, 5, 7 u 8 y con una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene un dominio CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4, o modificada a partir de la SEC ID Nº: 4 con una sola sustitución de alanina en posición 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 u 11.
11. El anticuerpo humano aislado, o una porción de unión a anticuerpos del mismo, de la reivindicación 10, donde la LCVR tiene además un dominio CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5 y la HCVR tiene además un dominio CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6.
12. El anticuerpo humano aislado, o una porción de unión a anticuerpos del mismo, de la reivindicación 11, donde la LCVR tiene además un dominio CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 7 y la HCVR tiene además un dominio CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8.
13. Un anticuerpo humano aislado, o una porción de unión a antígenos del mismo, con una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.
14. El anticuerpo humano aislado de la reivindicación 13, que tiene una región constante de cadena pesada de IgG1.
15. El anticuerpo humano aislado de la reivindicación 13, que tiene una región constante de cadena pesada de IgG4.
16. El anticuerpo humano aislado de la reivindicación 13, que es un fragmento Fab.
17. El anticuerpo humano aislado de la reivindicación 13, que es un fragmento Fv monocatenario.
18. Un anticuerpo humano aislado, o una porción de unión a antígenos del mismo, de la reivindicación 1, con una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene un dominio CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26 o con una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene un dominio CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 31, SEC ID Nº: 32, SEC ID Nº: 33 y SEC ID Nº: 34.
19. Un anticuerpo humano recombinante, o porción de unión a antígenos del mismo, que neutraliza la actividad del TNF\alpha humano pero no del TNF\beta humano y tiene las características de identificación de un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
20. El anticuerpo humano recombinante, o porción de unión a antígenos del mismo, de la reivindicación 19, que también neutraliza la actividad del TNF\alpha de chimpancé y al menos un TNF\alpha de primate adicional seleccionado entre el grupo compuesto por TNF\alpha de mandril, TNF\alpha de tití, TNF\alpha de cynomolgus y TNF\alpha de rhesus.
21. El anticuerpo humano recombinante, o una porción de unión a antígenos del mismo, de la reivindicación 20, que también neutraliza la actividad del TNF\alpha canino.
22. El anticuerpo humano recombinante, o una porción de unión a antígenos del mismo, de la reivindicación 20, que también neutraliza la actividad del TNF\alpha de cerdo.
23. Un ácido nucleico aislado que codifica la cadena ligera de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, donde el dominio CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3, o modificada a partir de la SEC ID Nº: 3 por una sola sustitución de alanina en posición 1, 4, 5, 7 u 8 o por una a cinco sustituciones de aminoácidos conservativas en posiciones 1, 3, 4, 6, 7, 8 y/o 9.
24. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 23, que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo (LCVR).
25. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 24, donde el dominio CDR2 de la LCVR del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6.
26. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 25, donde el dominio CDR1 de la LCVR del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 7.
27. Un ácido nucleico aislado que codifica la cadena ligera de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, donde el dominio CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4, o modificada a partir de la SEC ID Nº: 4 por una sola sustitución de alanina en posición 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 u 11 o por una a cinco sustituciones de aminoácidos conservativas en posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y/o 12.
28. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 27, que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo (HCVR).
29. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 28, donde el domino CDR2 de la HCVR del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6.
30. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 29, donde el dominio CDR1 de la HCVR del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8.
31. Un ácido nucleico aislado que codifica la cadena ligera o pesada del anticuerpo de la reivindicación 1, donde el dominio CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por:
a) cadena ligera SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 11-26
b) cadena pesada SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 27-34
32. Un ácido nucleico aislado que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1.
33. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 32, que codifica la región variable de la cadena ligera de anticuerpo y una región constante de cadena ligera de anticuerpo.
34. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 33, que es un vector de expresión recombinante.
35. Un ácido nucleico aislado que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.
36. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 35, que codifica la región variable de cadena pesada de anticuerpo y una región constante de cadena pesada de anticuerpo.
37. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 36, donde la región constante de cadena pesada de anticuerpo es una región constante de IgG1.
38. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 36, donde la región constante de cadena pesada de anticuerpo es una región constante de IgG4.
39. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 37, que es un vector de expresión recombinante.
40. Un vector de expresión recombinante que codifica:
a) una cadena ligera de anticuerpo que tiene una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1; y
b) una cadena pesada de anticuerpo que tiene una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.
41. Una célula hospedadora en la que se ha introducido el vector de expresión recombinante de la reivindicación 40.
42. Un método para sintetizar un anticuerpo humano que se une al TNF\alpha humano, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 1 en un medio de cultivo hasta que se sintetice por la célula un anticuerpo humano que se una al TNF\alpha humano.
43. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, o porción de unión a antígenos, de cualquiera de las reivindicaciones 1-22, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
44. La composición farmacéutica de la reivindicación 43, que comprende además al menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno en el que es perjudicial la actividad del TNF\alpha.
45. Un método para inhibir la actividad del TNF\alpha humano in vitro que comprende poner en contacto el TNF\alpha humano con el anticuerpo, o una porción de unión a antígenos del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1- 22 de tal forma que se inhiba la actividad del TNF\alpha humano.
46. El anticuerpo, o porción de unión a antígenos del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1-22 para uso de la inhibición de la actividad del TNF\alpha humano en un ser humano que sufre un trastorno en el que es perjudicial la actividad del TNF\alpha.
47. El uso del anticuerpo, o porción de unión a antígenos del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1-22 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno en el que es perjudicial la actividad del TNF\alpha.
48. El uso de la reivindicación 46 ó 47, donde el trastorno es sépsis.
49. El uso de la reivindicación 46 ó 47, donde el anticuerpo se administra al ser humano junto con la citoquina interleuquina-6 (IL-6) o se administra a un ser humano con una concentración en suero o en plasma de IL-6 por encima de 500 pg/ml.
50. El uso de la reivindicación 46 ó 47, donde el trastorno es una enfermedad autoinmune.
51. El uso de la reivindicación 46 ó 47, donde la enfermedad autoinmune se selecciona entre el grupo compuesto por artritis reumatoide, espondilitis reumatoide, osteoartritis y artritis gotosa.
52. El uso de la reivindicación 46 ó 47, donde la enfermedad autoinmune se selecciona entre el grupo de una alergia, esclerosis múltiple, diabetes autoinmune, uveítis autoinmune y síndrome nefrótico.
53. El uso de la reivindicación 46 ó 47, donde el trastorno es una enfermedad infecciosa.
54. El uso de la reivindicación 46 ó 47, donde el trastorno es un rechazo de un trasplante o la enfermedad del hospedador frente a un injerto.
55. El uso de la reivindicación 46 ó 47, donde el trastorno es una malignidad.
56. El uso de la reivindicación 46 ó 47, donde el trastorno es un trastorno pulmonar.
57. El uso de la reivindicación 46 ó 47, donde el trastorno es un trastorno intestinal.
58. El uso de la reivindicación 46 ó 47, donde el trastorno es un trastorno cardíaco.
59. El uso de la reivindicación 46 ó 47, donde el trastorno se selecciona entre el grupo compuesto por trastornos inflamatorios óseos, enfermedad de reabsorción ósea, hepatitis alcohólica, hepatitis viral, hepatitis fulminante, alteraciones de la coagulación, quemaduras, lesión de reperfusión, formación de queloides, formación de tejido cicatrizado, pirexia, enfermedad periodontal, obesidad y toxicidad a la radiación.
60. La composición farmacéutica de la reivindicación 44, donde el agente terapéutico adicional se selecciona entre el grupo compuesto por fármacos antiinflamatorios no esteroideos, fármacos antiinflamatorios supresores de citoquina, CDP-571/BAY-10-3356, cA2, 75 kdTNFR-IgG, 55 kdTNFR-IgG, IDEC-C39.1/SB 210396, DAB 386-IL-2, DAB 386-IL-2, Anti-Tac, IL-4, IL-10, agonistas de IL-4, agonistas de IL-10, IL 1RA, TNF-bp/s-TNFR, S284, R973401, MK-966, Iloprost, metotrexato, talidomida, fármacos relacionados con talidomida, leflunomida, ácido tranexámico, T-614, prostaglandina E1, Tenidap, Naproxeno, Meloxicam, Piroxicam, Diclofenaco, Indometacina, Sulfasalazina, Azatioprina, inhibidores de ICE, inhibidores de zap-70, inhibidores de 1ck, inhibidores de VEGF, inhibidores de VEGF-R, corticosteroides, inhibidores de TNF-convertasa, anticuerpos anti-IL-12, interleuquina-11, interleuquina-13, inhibidores de interleuquina-17, oro, penicilamina, cloroquina, hidroxicloroquina, cloranbucilo, ciclofosfamida, ciclosporina, globulina anti-timocito, anticuerpos anti-CD4, toxinas CD5, péptidos administrados por vía oral, colágeno, lobenzarit disódico, Agentes Reguladores de Citoquina HP228 y HP466, oligodesoxinucleótidos de fosforotiolato antisentido ICAM-1, receptor 1 del complemento soluble, prednisona, orgoteína, polisulfato de glicosaminoglicano, minociclina, anticuerpos anti-IL2R, lípidos marinos, lípidos botánicos, auranofin, fenilbutazona, ácido meclofenámico, ácido flufenámico, inmunoglobulina intravenosa, zileuton, ácido micofenólico, tacrolimus, sirolimus, amiprilosa, cladribina, azaribina, budenosida, factor de crecimiento epidérmico, aminosalicilatos, 6-mercaptopurina, metronidazol, inhibidores de lipoxigenasa, mesalamina, olsalazina, balsalazida, antioxidantes, inhibidores de tromboxan, antagonistas del receptor de IL-1, anticuerpos monoclonales anti-IL-1\beta, anticuerpos monoclonales anti-IL-6, factores de crecimiento, inhibidores de elastasa, compuestos de piridinil- imidazol, profármacos conjugados con glucurónido de prednisolona, dexametasona o budesonida, profármacos conjugados con dextrano de perdnisolona, dexametasona o budesonida, receptor del complemento soluble 1, mesalazina de liberación lenta, antagonistas del Factor Activador de Plaquetas (PAF), eciprofloxacina, lignocaína, prednisolona, metilprednisolona, ciclofosfamida, 4- aminopiridina, tizanidina, interferón-\beta1a, interferón-\beta1b, Copolímero 1, oxígeno hiperbárico, inmunoglobulina intravenosa, clabribina, soluciones salinas hipertónicas, antibióticos, hemofiltración continua, carbapenems, antagonistas de citoquinas tales como TNF\alpha, IL-1\beta, IL-6 y/o IL-8, SK&F 107647, guanilhidrazona tetravalente CNI-1493, Inhibidor de la Ruta del Factor de Tejidos, PHP, quelantes de hierro y quelatos, incluyendo complejo de ácido dietilentriaminapentaacético-hierro (III), lisofilina, PGG-Glucano, apolipoproteína A-1 reconstituida con lípidos, ácidos hidroxámicos quirales, anticuerpos anti- endotoxina, E5531, rBPI_{21}, Péptidos Anti-Endotoxina Sintéticos, terapia de reemplazo de tensioactivos y anticuerpos anti-IL-8.
61. El anticuerpo, o porción de unión a antígenos del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1-22 para uso en un método de terapia.
62. El anticuerpo, o porción de unión a antígenos del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-22 en combinación con al menos un agente terapéutico adicional para uso en el tratamiento de un trastorno en el que es perjudicial la actividad del TNF\alpha.
63. El uso de la reivindicación 62, donde el agente terapéutico adicional se selecciona entre el grupo compuesto por fármacos antiinflamatorios no esteroideos, fármacos antiinflamatorios supresores de citoquina, CDP-571/BAY-10- 3356, cA2, 75 kdTNFR-IgG, 55 kdTNFR-IgG, IDEC-C39.1/SB 210396, DAB 386-IL-2, DAB 386-IL-2, Anti-Tac, IL-4, IL-10, agonistas de IL-4, agonistas de IL-10, IL 1RA, TNF-bp/s-TNFR, S284, R973401, MK-966, Iloprost, metotrexato, talidomida, fármacos relacionados con talidomida, leflunomida, ácido tranexámico, T-614, prostaglandina E1, Tenidap, Naproxeno, Meloxicam, Piroxicam, Diclofenaco, Indometacina, Sulfasalazina, Azatioprina, inhibidores de ICE, inhibidores de zap-70, inhibidores de 1ck, inhibidores de VEGF, inhibidores de VEGF-R, corticosteroides, inhibidores de TNF-convertasa, anticuerpos anti-IL-12, interleuquina-11, interleuquina-13, inhibidores de interleuquina-17, oro, penicilamina, cloroquina, hidroxicloroquina, cloranbucilo, ciclofosfamida, ciclosporina, globulina anti-timocito, anticuerpos anti-CD4, toxinas CD5, péptidos administrados por vía oral, colágeno, lobenzarit disódico, Agentes Reguladores de Citoquina HP228 y HP466, oligodesoxinucleótidos de fosforotiolato antisentido ICAM-1, receptor 1 del complemento soluble, prednisona, orgoteína, polisulfato de glicosaminoglicano, minociclina, anticuerpos anti-IL2R, lípidos marinos, lípidos botánicos, auranofin, fenilbutazona, ácido meclofenámico, ácido flufenámico, inmunoglobulina intravenosa, zileuton, ácido micofenólico, tacrolimus, sirolimus, amiprilosa, cladribina, azaribina, budenosida, factor de crecimiento epidérmico, aminosalicilatos, 6-mercaptopurina, metronidazol, inhibidores de lipoxigenasa, mesalamina, olsalazina, balsalazida, antioxidantes, inhibidores de tromboxan, antagonistas del receptor de IL-1, anticuerpos monoclonales anti-IL-1\beta, anticuerpos monoclonales anti-IL-6, factores de crecimiento, inhibidores de elastasa, compuestos de piridinil-imidazol, profármacos conjugados con glucurónido de prednisolona, dexametasona o budesonida, profármacos conjugados con dextrano de perdnisolona, dexametasona o budesonida, receptor del complemento soluble 1, mesalazina de liberación lenta, antagonistas del Factor Activador de Plaquetas (PAF), ciprofloxacina, lignocaína, prednisolona, metilprednisolona, ciclofosfamida, 4-aminopiridina, tizanidina, interferón- \beta1a, interferón-\beta1b, Copolímero 1, oxígeno hiperbárico, inmunoglobulina intravenosa, clabribina, soluciones salinas hipertónicas, antibióticos, hemofiltración continua, carbapenems, antagonistas de citoquinas tales como TNF\alpha, IL-1\beta, IL-6 y/o IL-8, SK&F 107647, guanilhidrazona tetravalente CNI-1493, Inhibidor de la Ruta del Factor de Tejidos, PHP, quelantes de hierro y quelatos, incluyendo complejo de ácido dietilentriaminapentaacético-hierro (III), lisofilina, PGG-Glucano, apolipoproteína A-1 reconstituida con lípidos, ácidos hidroxámicos quirales, anticuerpos anti-endotoxina, E5531, rBPI_{21}, Péptidos Anti-Endotoxina Sintéticos, terapia de reemplazo de tensioactivos y anticuerpos anti-IL-8.
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