CN102459299B - N-[(2′r)-2′-脱氧-2′-氟-2′-甲基-p-苯基-5′-尿苷酰基]-l-丙氨酸1-甲基乙基酯及其制备方法 - Google Patents

N-[(2′r)-2′-脱氧-2′-氟-2′-甲基-p-苯基-5′-尿苷酰基]-l-丙氨酸1-甲基乙基酯及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本文公开式4的核苷氨基磷酸酯以及它们作为用于治疗病毒性疾病的药剂的用途。这些化合物是RNA-依赖性5RNA病毒复制的抑制剂，并且可用作HCV NS5B聚合酶的抑制剂、HCV复制的抑制剂、以及用于在哺乳动物中治疗丙型肝炎感染。还公开一种由式4表示的化合物的制备方法：(式4)其中P*表示手性磷原子，该方法包括：a)使丙氨酸异丙酯，(式A)，二-X′-苯基磷酸酯，(式B)，2′-脱氧-2′-氟-2′-C-甲基尿苷，(式3)和碱反应以获得包含4的第一混合物；其中X是酸的缀合碱，n是0或1，并且X′是卤素，b)使所述第一混合物和保护化合物反应以获得包含4的第二混合物；以及c)任选地，使所述第二混合物进行结晶、色谱分析或萃取以获得4。

Description

N-[(2′R)-2′-脱氧-2′-氟-2′-甲基-P-苯基-5′-尿苷酰基]-L-丙氨酸1-甲基乙基酯及其制备方法
本申请是下列名称的申请人于2010年5月20日提交的PCT国际专利申请：美国企业Pharmasset,Inc.，其是指定除了美国之外的所有国家的申请人；Michael Joseph Sofia和Bruce S.Ross，都是美国公民；Ganapati ReddyPamulapati和Suguna Rachakonda，都是印度公民；Hai-Ren Zhang，美国公民；Byoung-Kwon Chun，韩国公民；以及Peiyuan Wang，中国公民，他们是仅仅指定美国的申请人，并且该申请要求于2009年5月20号提交的美国临时专利申请序列No.61/179,923和于2010年3月31日提交的美国临时专利申请序列No.61/319,513的优先权，它们的主题全部通过引用的方式并入。
技术领域
本文公开核苷氨基磷酸酯和它们作为用于治疗病毒性疾病的药剂的用途。这些化合物是RNA-依赖性RNA病毒复制的抑制剂，并且可用作HCV NS5B聚合酶的抑制剂、HCV复制的抑制剂、以及用于在哺乳动物中治疗丙型肝炎感染。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)感染是导致慢性肝脏疾病的主要健康问题，例如肝硬化和肝细胞癌，在基本上大量感染的个体中，估计为2-15%的世界人口。根据美国疾病控制中心的数据，单美国就估计有450万的感染人口。根据世界卫生组织的数据，全世界有超过2亿的感染人口，并且每年有至少300-400万人口被感染。一旦被感染，约20%的人清除病毒，但其余的人可能在其余下的生命中将携带HCV。10-20%的慢性感染个体最终发展为肝破坏性肝硬化或癌症。病毒疾病是通过被污染的肠外血液和血液制品，受污染的针头经胃肠外传播，或通过性行为和从被感染的母亲或携带者母亲垂直传播至其后代。HCV感染的现有治疗局限于单用重组干扰素α或联合使用核苷类似物利巴韦林的免疫治疗，该治疗取得有限的临床益处。而且，尚未建立用于HCV的疫苗。因此，急切需要一种可有效对抗慢性HCV感染的改善的治疗药剂。
HCV病毒体是具有约9600个碱基的单寡核糖核苷酸基因序列的有包膜正链RNA病毒，编码约3,010个氨基酸的多聚蛋白。HCV基因的蛋白产物包括结构蛋白C、E1和E2，以及非结构蛋白NS2、NS3、NS4A与NS4B、NS5A和NS5B。据信非结构(NS)蛋白提供病毒复制的催化作用。NS3蛋白酶释放NS5B，多聚蛋白链的RNA依赖性RNA聚合酶。HCV NS5B聚合酶是从单链病毒RNA合成双链RNA所必需的，单链病毒RNA在HCV的复制循环中作为模板。因此，认为NS5B聚合酶是HCV复制复合体中的必要组分(K.Ishi,等,Heptology（肝脏病学）,1999,29:1227-1235;V.Lohmann,等.,Virology（病毒学）,1998,249:108-118)。HCV NS5B聚合酶的抑制防止形成双链HCV RNA，因而构成开发HCV特异性抗病毒疗法的具有吸引力的方法。
HCV属于具有许多共性的很大的病毒科。
黄病毒科
病毒的黄病毒科包括至少三种不同的属：瘟病毒属，它导致牛和猪的疾病；黄病毒属，它是导致例如登革热和黄热病的疾病的主要原因；和丙型肝炎病毒属(hepaciviruses)，其唯一成员是HCV。基于血清学相关性分组，黄病毒属包括多于68个成员(Calisher等.,J.Gen.Virol（遗传病毒学杂志）,1993,70,37-43)。临床症状各不相同，包括发热、脑炎和出血热(FieldsVirology（费氏病毒学）,编辑:Fields,B.N.,Knipe,D.M.,和Howley,P.M.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,PA,1996,Chapter31,931-959)。全球关注的与人类疾病相关的黄病毒属包括登革出血热病毒(DHF)、黄热病病毒、休克综合症和日本脑炎病毒(Halstead,S.B.,Rev.Infect.Dis.,1984,6,251-264;Halstead,S.B.,Science（科学）,239:476-481,1988;Monath,T.P.,New Eng.J.Med,（新英格兰医学杂志）1988,319,641-643)。
瘟病毒属包括牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪瘟病毒(CSFV，也称为猪霍乱病毒)和绵羊瘟病毒(BDV)(Moennig,V.等.Adv.Vir.Res.1992,41,53-98)。家畜(牛、猪和羊)的瘟病毒感染造成世界范围内巨大的经济损失。BVDV导致牛的粘膜病且对于家畜产业具有显著的经济重要性(Meyers,G.和Thiel,H.J.,Advances in Virus Research（病毒研究进展）,1996,47,53-118;Moennig V.,等,Adv.Vir.Res.1992,41,53-98)。尚未像动物瘟病毒那样全面了解人瘟病毒。然而，血清学研究显示人类中有相当多的瘟病毒接触。
瘟病毒和丙型肝炎病毒是黄病毒科内密切相关的病毒属。该科内其它密切相关的病毒包括GB病毒A、GB病毒A-类似物、GB病毒-B和GB病毒-C(也称为G型肝炎病毒，HGV)。丙型肝炎病毒属(丙型肝炎病毒；HCV)由许多可感染人体的密切相关但不同基因型的病毒组成。至少有6种HCV基因型和大于50种亚型。由于瘟病毒和丙型肝炎病毒的相似性，加上丙型肝炎病毒在细胞培养中很难有效生长，所以，在HCV病毒研究中常常使用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)作为代用品。
瘟病毒和丙型肝炎病毒的遗传组构非常相似。这些正链RNA病毒具有单个大的开放式读码框(ORF)，编码所有病毒复制所需的病毒蛋白。这些蛋白表达为多聚蛋白，多聚蛋白被细胞和病毒编码的蛋白酶同时翻译加工或翻译后加工，产生成熟的病毒蛋白。负责病毒基因组RNA复制的病毒蛋白位于大致羧基末端之内。ORF的三分之二称为非结构(NS)蛋白。瘟病毒和丙型肝炎病毒的ORF非结构蛋白部分的基因组构和多聚蛋白加工非常相似。对于瘟病毒和丙型肝炎病毒，从非结构蛋白编码区域的氨基末端到ORF的羧基末端的连续顺序，成熟非结构(NS)蛋白由p7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A和NS5B组成。
瘟病毒和丙型肝炎病毒的NS蛋白共有具有特殊蛋白质功能特征的序列结构域。例如，两种病毒属中病毒的NS3蛋白都含有具有丝氨酸蛋白酶和解旋酶特征的氨基酸序列基序(Gorbalenya等.,Nature（自然）,1988,333,22;Bazan和Fletterick Virology（病毒学）,1989,171,637-639;Gorbalenya等.,Nucleic Acid Res.（核酸研究）,1989,17,3889-3897)。类似地，瘟病毒和丙型肝炎病毒的NS5B蛋白都具有以针对RNA的RNA聚合酶为特征的基序(Koonin,E.V.和Dolja,V.V.,Crir.Rev.Biochem.Molec.Biol.1993,28,375-430)。
瘟病毒和丙型肝炎病毒的NS蛋白在病毒生命周期中的实际作用和功能是直接类似的。在两种情况下，NS3丝氨酸蛋白酶负责ORF中其位置下游的多聚蛋白前体的所有蛋白水解加工(Wiskerchen和Collett,Virology（病毒学）,1991,184,341-350;Bartenschlager等.,J.Virol（病毒学杂志）.1993,67,3835-3844;Eckart等.Biochem.Biophys.Res.Comm.生物化学和生物物理学研究评论1993,192,399-406;Grakoui等.,J.Virol（病毒学杂志）.1993,67,2832-2843;Grakoui等.,Proc.Natl.Acad Sci.USA（美国国家科学院院刊）1993,90,10583-10587;Hijikata等.,J.Virol.（病毒学杂志）1993,67,4665-4675;Tome等.,J.Virol.（病毒学杂志）,1993,67,4017-4026)。在两种情况下，NS4A蛋白起NS3丝氨酸蛋白酶的辅因子的作用(Bartenschlager等.,J.Virol.（病毒学杂志）1994,68,5045-5055;Failla等.,J.Virol.（病毒学杂志）1994,68,3753-3760;Xu等.,J.Virol.（病毒学杂志）,1997,71:5312-5322)。两种病毒的NS3蛋白还都作为解旋酶起作用(Kim等.,Biochem.Biophys.Res.Comm.（生物化学和生物物理学研究评论）,1995,215,160-166;Jin和Peterson,Arch.Biochem.Biophys.,1995,323,47-53;Warrener和Collett,J.Virol.（病毒学杂志）1995,69,1720-1726)。最后，瘟病毒和丙型肝炎病毒的NS5B蛋白都具有预见的针对RNA的RNA聚合酶的活性(Behrens等.,EMBO,1996,15,12-22;Lechmann等.,J.Virol.（病毒学杂志）,1997,71,8416-8428;Yuan等.,Biochem.Biophys.Res.Comm（生物化学和生物物理学研究评论）.1997,232,231-235;Hagedorn,PCT WO97/12033;Zhong等,J.Virol.（病毒学杂志）,1998,72,9365-9369)。
目前，对于感染丙型肝炎病毒的个体具有有限的治疗选择。目前批准的治疗选择是单用重组干扰素α或联合使用核苷类似物利巴韦林的免疫治疗。该疗法的局限在于其临床有效性，并且仅50%的治疗的患者对于疗法有反应。因此，非常需要更有效和新颖的疗法来解决HCV感染所面临的未满足的医疗需要。
现在已经鉴定了用于直接作用抗病毒剂的药物开发的许多潜在的分子靶作为抗-HCV疗法，包括但不限于NS2-NS3自身蛋白酶、N3蛋白酶、N3解旋酶和NS5B聚合酶。RNA-依赖性RNA聚合酶是单链正义RNA基因组的复制所绝对必需的，并且该酶已经在药物化学师中引起极大的兴趣。
作为HCV感染的潜在疗法的HCV NS5B抑制剂已经在下列文献中综述：Tan,S.-L.,等.,Nature Rev.Drug Discov.（药物开发自然评论）,2002,1,867-881;Walker,M.P.等.,Exp.Opin.Investigational Drugs（研究药物实验观点）,2003,12,1269-1280;Ni,Z-J.,等.,Current Opinion in Drug Discoveryand Development（现代药物发现和开发观点）,2004,7,446-459;Beaulieu,P.L.,等.,Current Opinion in Investigational Drugs（现代研究药物观点）,2004,5,838-850;Wu,J.,等.,Current Drug Targets-Infectious Disorders（现代药物靶-感染性病症）,2003,3,207-219;Griffith,R.C.,等,Annual Reports inMedicinal Chemistry（药物化学年度报告）,2004,39,223-237;Carrol,S.,等.,Infectious Disorders-Drug Targets（感染性病症-药物靶）,2006,6,17-29。出现抗性HCV菌株的可能性和需要鉴定具有广泛基因型覆盖度的药剂支持继续努力来鉴定新颖和更有效的核苷作为HCV NS5B抑制剂的需要。
NS5B聚合酶的核苷抑制剂可起到导致链终止的非天然底物的作用或和核苷酸竞争结合聚合酶的竞争性抑制剂的作用。为了起到链终止剂的作用，核苷类似物必须被细胞所摄取并且体内转化为三磷酸酯以竞争聚合酶核苷酸的结合位点。该转化至三磷酸酯通常受到细胞激酶的介导，所述细胞激酶赋予潜在核苷聚合酶抑制剂另外的结构要求。不幸的是，这限制了作为HCV复制的抑制剂的核苷直接演变为能够原位磷酰化的基于细胞的测定。
在一些情况下，核苷的生物活性受到其较差的底物特性的妨碍，所述特性用于一种或多种需要将其转化为活性三磷酸酯形式的激酶。通过核苷激酶形成单磷酸酯通常被认为是三个磷酰化事件的限速步骤。为了避免下列需要，已经报道制备稳定的磷酸酯前药：在核苷的代谢中初始磷酰化步骤至活性三磷酸酯类似物。核苷氨基磷酸酯前药已经显示为活性三磷酸核苷的前体，并且当施用至病毒感染的全细胞时抑制病毒的复制(McGuigan,C.,等.,J.Med.Chem.（医学和化学杂志）,1996,39,1748-1753;Valette,G.,等.,J.Med.Chem.（医学和化学杂志）,1996,39,1981-1990;Balzarini,J.,等.,Proc.National Acad Sci USA（美国国家科学院院刊）,1996,93,7295-7299;Siddiqui,A.Q.,等.,J.Med.Chem.（医学和化学杂志）,1999,42,4122-4128;Eisenberg,E.J.,等.,Nucleosides,Nucleotides and Nucleic Acids（核苷、核苷酸和核酸）,2001,20,1091-1098;Lee,W.A.,等.,AntimicrobialAgents and Chemotherapy（抗微生物剂和化学治疗）,2005,49,1898);US2006/0241064和WO2007/095269。
此外限制核苷用作可行病毒治疗剂的效用是它们有时较差的物理化学和药物动力学性质。这些较差的性质可限制药剂的肠吸收并且限制摄取到靶组织或细胞中。为了改善它们的性质，已经使用核苷的前药。已经证实核苷氨基磷酸酯的制备改善了核苷的全身吸收，而且这些"前核苷酸(pronucleotide)"的氨基磷酸酯部分被中性亲脂性基团所掩蔽以获得合适的分配系数，从而优化至细胞中的摄取和转运，进而相对于仅施用母体核苷，显著地提高核苷单磷酸酯类似物的细胞内浓度。磷酸酯部分的酶介导的水解产生核苷单磷酸酯，其中限速性初始磷酰化是不需要的。为此，美国专利申请12/053,015，对应于WO2008/121634和US2010/0016251，公开了多种核苷氨基磷酸酯前药，其中许多在丙型肝炎检测中显示出活性。US2010/0016251中披露的一些化合物被测试为FDA批准的潜在的临床候选物。
发明概述
本文中公开由式4表示的化合物及其由式SP-4和RP-4表示的相应基于磷的非对映体。
附图简述
图1.4的高分辨率XRD衍射图。
图2.RP-4的高分辨率XRD衍射图。
图3.SP-4(形式1)的高分辨率XRD衍射图
图4.SP-4(形式1)的高分辨率XRD衍射图。
图5.SP-4·CH2Cl2(形式2)的高分辨率XRD衍射图。
图6.SP-4·CHCl3(形式3)的高分辨率XRD衍射图。
图7.SP-4(形式4)的高分辨率XRD衍射图。
图8.SP-4(形式5)的高分辨率XRD衍射图。
图9.SP-4(无定形的)的高分辨率XRD衍射图。
图10.SP-4(形式1)的X-射线晶体结构。
图11.SP-4·CH2Cl2(形式2)的X-射线晶体(各向同性)结构。
图12.SP-4·CH2Cl2(形式2)的X-射线晶体(各向异性)结构。
图13.SP-4·CHCl3(形式3)的X-射线晶体结构。
图14.4的FT-IR光谱。
图15.RP-4的FT-IR光谱。
图16.SP-4的FT-IR光谱。
图17.4的TGA和DSC分析。
图18.RP-4的TGA和DSC分析。
图19.SP-4的TGA和DSC分析。
图20A.8(SP-异构体)(不对称单元的分子no.1)的X-射线晶体结构。
图20B.8(SP-异构体)(不对称单元的分子no.2)的X-射线晶体结构。
发明详述
定义
本文中使用的措词“一个(种)”实体指的是一或多个实体；举例来说，化合物指的是一或多种化合物或至少一种化合物。因而，术语“一个(种)”、“一个(种)或多个(种)”以及“至少一个(种)”在本文中可互换使用。
本文中使用的术语“任选的”或“任选地”意指后续描述的事件或事项可能但未必发生，且这一描述包括事件或事项发生的情况以及事件或事项不发生的情况。举例来说，“任选的键”意指所述键可能存在或不存在，且这一描述包括单键、双键或三键。
术语"P*"是指磷原子是手性的，并且其具有对应的"R"或"S"的Cahn-Ingold-Prelog命名，其具有它们公认的平常含义。
本文中所述的术语"纯化的"是指给定化合物的纯度。例如，当给定化合物是组合物的主要组分时，所述化合物是"纯化的"，即，至少50%w/w纯度。因此，"纯化的"包括至少50%w/w纯度、至少60%w/w纯度、至少70%纯度、至少80%纯度、至少85%纯度、至少90%纯度、至少92%纯度、至少94%纯度、至少96%纯度、至少97%纯度、至少98%纯度、至少99%纯度、至少99.5%纯度和至少99.9%纯度、其中"基本上纯的"包括至少97%纯度、至少98%纯度、至少99%纯度、至少99.5%纯度和至少99.9%纯度。
本文中所述的术语"代谢物"是指在施用至需要的受试者后体内产生的化合物。
术语"约"(也由～表示)是指引用的数值是在标准试验误差内变化的范围的一部分。
表述"基本上如…中所示"的特定XRPD图谱是指XRPD图谱中峰的位置在目视检查或借助于被选择的峰列表(±0.2°2θ)的范围内基本上相同。普通技术人员理解，强度可以随着样品而改变。
术语“基本上无水”意指物质包含至多10重量%水、优选至多1重量%水、更优选至多0.5重量%水及最优选至多0.1重量%水。
溶剂或反溶剂(如反应、结晶等或晶格和/或吸收的溶剂中使用的)包括C1至C8醇,C2至C8醚,C3至C7酮,C3至C7酯,C1至C2氯烃,C2至C7腈,混杂溶剂,C5至C12饱和烃，和C6至C12芳香烃中的至少一种。
C1至C8醇是指具有多个碳的直链/支链和/或环/非环醇。C1至C8醇包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、异丁醇、辛醇和环己醇。
C2至C8醚是指具有多个碳的直链/支链和/或环/非环醚。C2至C8醚包括但不限于二甲基醚、二乙基醚、二-异丙基醚、二-n-丁基醚、甲基-叔丁基醚(MTBE)、四氢呋喃和二噁烷。
C3至C7酮是指具有多个碳的直链/支链和/或环/非环酮。C3至C7酮包括但不限于丙酮、甲基乙基酮、丙酮、丁酮、甲基异丁基酮、甲基丁基酮和环己酮。
C3至C7酯是指具有多个碳的直链/支链和/或环/非环酯。C3至C7酯包括但不限于乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸正丁酯等。
C1至C2氯烃是指具有多个碳的氯烃。C1至C2氯烃包括但不限于氯仿、二氯甲烷（DCM）、四氯化碳、1,2-二氯乙烷和四氯乙烷。
C2至C7腈是指具有多个碳的腈。C2至C7腈包括但不限于乙腈，丙腈等。
混杂溶剂是指通常用在有机化学中的溶剂，其包括但不限于二甘醇、二乙二醇二甲醚（二甘醇二甲醚）、1,2-二甲氧基乙烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙二醇、甘油、六甲基磷酰胺、六甲基磷三胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、硝基甲烷、吡啶、三乙胺和醋酸。
术语C5至C12饱和烃是指直链/支链和/或环/非环烃。C5至C12饱和烃包括但不限于正戊烷、石油醚（ligroine）、正己烷、正庚烷、环己烷和环庚烷。
术语C6至C12芳族烃是指具有苯基作为它们的骨架的取代或未取代的烃。优选的烃包括苯、二甲苯、甲苯、氯苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、二甲苯，更优选甲苯。
本文中使用的术语"卤代"或"卤素"包括氯、溴、碘和氟。
术语"保护基团"是指显示出下列特性的化学基团。所述"基团"衍生自"保护化合物"。较之仲羟基，对于伯羟基更具选择性的基团可以存在于和氨基磷酸酯稳定(pH2-8)一致的条件下，并且赋予所得产物基本上不同的物理性能，从而允许3'-氨基磷酸酯-5'-新基团产物更容易地从未反应的期望化合物中分离。所述基团必须选择性地在良好收率的条件下反应，从而提供保护的底物，所述底物对于预计反应是稳定的(参见Protective Groups inOrganic Synthesis（有机合成中的保护集团）,第三版，T.W.Greene和P.G.M.Wuts,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,1999)。基团的例子包括但不限于：苯甲酰基、乙酰基、苯基-取代的苯甲酰基、四氢吡喃基、三苯甲基、DMT(4,4'-二甲氧基三苯甲基)、MMT(4-单甲氧基三苯甲基)、三甲氧基三苯甲基、pixyl(9-苯基呫吨-9-基)基、thiopixyl(9-苯基噻吨-9-基)或9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)等;C(O)-烷基,C(O)Ph,C(O)芳基,CH2O-烷基,CH2O-芳基,SO2-烷基,SO2-芳基,叔丁基二甲基甲硅烷基,叔丁基二苯基甲硅烷基。缩醛例如MOM或THP等被认为是可行的基团。氟化化合物也被这样考虑，因为它们可连接所述化合物并且可通过穿过氟固相萃取介质而选择性地除去。特定例子包括氟化三苯甲基类似物、三苯甲基类似物1-[4-(1H,1H,2H,2H-全氟癸基)苯基)-1,1-二苯基甲醇。还涵盖三苯甲基、BOC、FMOC、CBz等的其他氟化类似物。磺酰氯例如对甲苯磺酰氯可在5'位选择性反应。可以选择性形成酯，例如乙酸酯和苯甲酸酯。二元羧酸酸酐例如琥珀酸酐及其衍生物可用于和游离羧酸产生酯键，这些例子包括但不限于草酰基、丙二酰基、琥珀酰基、戊二酰基、己二酰基、庚二酰基、superyl、壬二酰基、癸二酰基、邻苯二甲酰基、间苯二甲酰基、对苯二甲酰等。游离羧酸显著增强了极性，并且还可以用作处理手段以使反应产物萃取到弱碱性水相中，例如碳酸氢钠溶液。氨基磷酸酯基团在酸性介质中是相对稳定的，还可以使用这样的基团，该基团要求酸性反应条件，例如四氢吡喃基。
术语"保护基"(衍生自"保护化合物")具有其平常和普通含义，即，至少一个保护基或保护基团结合至少一个官能团(例如–OH、–NH2等)，这允许对至少一个其他官能团的化学修饰。保护基的例子包括但不限于苯甲酰基、乙酰基、苯基-取代的苯甲酰基、四氢吡喃基、三苯甲基、DMT(4,4'-二甲氧基三苯甲基)、MMT(4-单甲氧基三苯甲基)、三甲氧基三苯甲基、pixyl(9-苯基呫吨-9-基)基、thiopixyl(9-苯基噻吨-9-基)或9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)等;C(O)-烷基,C(O)Ph,C(O)芳基,C(O)O(低级烷基),C(O)O(低级烯基)芳基(例如–C(O)OCH2Ph),C(O)O芳基,CH2O-烷基,CH2O-芳基,SO2-烷基,SO2-芳基,包含至少一个硅原子的保护基例如：叔丁基二甲基甲硅烷基,叔丁基二苯基甲硅烷基,Si(低级烷基)2OSi(低级烷基)2OH(例如,–Si(iPr)2OSi(iPr)2OH。
除非另外定义，本文中使用的术语"保护化合物"是指这样的化合物，其含有"保护基"并且能够和含有能够被保护的官能团的化合物进行反应。
本文中使用的术语"离去基团"具有对于本领域技术人员而言相同的意思(Advanced Organic Chemistry:reactions，mechanisms and structure(高等有机化学：反应、机制和结构)–第4版，由Jerry March，John Wiley和Sons编；1992，第351-357页)，并且表示是底物分子的一部分并与之连接的基团；在底物分子进行取代反应的反应中(例如亲核试剂)，离去基团随后被取代。离去基团的例子包括但不限于：卤素(F,Cl,Br和I),优选Cl,Br或I;甲苯磺酸酯基,甲磺酸酯基,三氟甲基磺酸酯基,乙酸酯基,樟脑磺酸酯基,芳氧基和被至少一个吸电子基团取代的芳氧基(例如对硝基苯氧基,2-氯苯氧基,4-氯苯氧基,2,4-二硝基苯氧基,五氟苯氧基等)等。术语"吸电子基团"此处具有其通常含义。吸电子基团的例子包括但不限于卤素,–NO2,–C(O)(低级烷基),–C(O)(芳基),–C(O)O(低级烷基),–C(O)O(芳基)等。
本文中使用的术语"碱性试剂"是能够使羟基去质子化的化合物。碱性试剂的例子包括但不限于(低级烷)氧化物((低级烷基)OM)并联合醇溶剂,其中(低级烷)氧化物包括但不限于MeO-,EtO-,nPrO-,iPrO-,tBuO-,iAmO-(异戊氧化物)等，和其中M是碱金属阳离子，例如Li+,Na+,K+等。醇溶剂包括(低级烷基)OH，诸如，例如MeOH,EtOH,nPrOH,iPrOH,tBuOH,iAmOH,等。还可以使用非-烷氧基碱，例如氢化钠、六甲基二甲硅基胺钠、六甲基二甲硅基胺锂、二异丙基酰胺锂、氢化钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、DBU、DBN、Grignard试剂例如(低级烷基)Mg(卤素)，其包括但不限于MeMgCl,MeMgBr,tBuMgCl,tBuMgBr等。
术语"碱"包括术语"碱性试剂"，并且是指能够将含质子的化合物去质子化的化合物，即Bronsted碱。除了上述例子，碱的其他例子包括但不限于吡啶、三甲基吡啶、2,6-(低级烷基)-吡啶、二甲基-苯胺、咪唑、N-甲基-咪唑、吡唑、N-甲基-吡唑、三乙胺、二-异丙基乙基胺等。
术语"吸电子基团"具有其平常含义。吸电子基团的例子包括但不限于卤素(F,Cl,Br或I),–NO2,–C(O)(低级烷基),–C(O)(芳基),–C(O)O(低级烷基),–C(O)O(芳基)等。
术语"共结晶体(co-crystallate)"包括4,RP-4或SP-4联合盐的共结晶体，所述盐包括药学上可接受的盐。
本文中所述的术语"盐"是指包含阳离子和阴离子的化合物，其可通过下列方式产生：使质子接受部分质子化和/或使质子供给部分去质子化。应该注意，质子接受部分质子化导致形成阳离子类物质，其中该电荷通过生理阴离子的存在而平衡，而质子供给部分去质子化导致形成阴离子类物质，其中该电荷通过生理阳离子的存在而平衡。
措词"药学上可接受的盐"是指盐是药学上可接受的。药学上可接受的盐的例子包括但不限于：(1)酸加成盐，和无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成；或和有机酸形成，例如羟基乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙烷磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4对甲苯磺酸、樟脑酸、十二烷基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、水杨酸、粘康酸等；或(2)碱加成盐，和上述无机酸的任一种的共轭碱形成，其中共轭碱包含选自Na+,K+,Mg2+,Ca2+,NHgR″′4-g +中的阳离子组分，其中R″′是C1-3烷基，g是选自0,1,2,3或4的整数。应该理解，所有涉及药学上可接受的盐都包括相同酸加成盐的本文中所定义的溶剂加成形式(溶剂化物)或晶体形式(多晶型物)。
术语"烷基"是指含有1至30个碳原子的未支链或支链、饱和、单价烃基。术语"C1-M烷基"是指包含1至M个碳原子的烷基，其中M是具有下列数值的整数：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。术语"C1-4烷基"是指含有1至4个碳原子的烷基。术语"低级烷基"表示包含1至6个碳原子的直链或支链烃基。本文中使用的"C1-20烷基"是指包含1至20个碳原子的烷基。本文中使用的"C1-10烷基"是指包含1至10个碳原子的烷基。烷基的例子包括但不限于低级烷基，包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基或戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基和辛基。术语(芳)烷基或(杂芳基)烷基是指烷基任选地分别被芳基或杂芳基取代。
术语"烯基"是指具有一个或两个烯属双键、优选一个烯属双键、具有2至10个碳原子的不饱和烃链基团。术语"C2-N烯基"是指包含2至N个碳原子的烯基，其中N是具有下列数值的整数：：3、4、5、6、7、8、9或10。术语"C2-10烯基"是指包含2至10个碳原子的烯基。术语"C2-4烯基"是指包含2至4个碳原子的烯基，例如包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)或2-丁烯基(巴豆基)。
除非另外说明，否则本文中使用的术语“芳基”指的是取代或未取代的苯基(Ph)、联苯基或萘基，术语芳基优选指的是取代或未取代的苯基。芳基可被一或多个选自以下的部分取代：羟基、F、Cl、Br、I、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸基、硫酸酯基、膦酸基、磷酸酯基以及膦酸酯基，其根据需要不受保护或受保护，如本领域的技术人员所知，例如，如T.W.Greene及P.G.M.Wuts，"Protective Groupsin Organic Synthesis（有机合成中的保护基团）"第三版，John Wiley&Sons，1999中所教导。
除非另有说明，本文中使用的术语"芳氧基"是指取代或未取代的苯氧基(PhO–)、对苯基-苯氧基(p-Ph-PhO–)或萘氧基，优选术语芳氧基是指取代或未取代的苯氧基。芳氧基可被选自下列的一个或多个部分所取代：羟基、F、Cl、Br、I、–C(O)(低级烷基)、–C(O)O(低级烷基)、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸基、硫酸酯基、膦酸基、磷酸酯基以及膦酸酯基,根据需要不受保护或受保护，这是本领域技术人员已知的，例如在T.W.Greene and P.G.M.Wuts,"Protective Groups inOrganic Synthesis（有机合成中的保护基团）"第三版，John Wiley&Sons,1999中所教导。
术语“制剂”或“剂型”意图包括活性化合物的固体和液体配方且本领域的技术人员将了解活性成分可以不同制剂形式存在，这取决于所需剂量及药代动力学参数。
本文所用的术语“赋形剂”指的是用于制备药物组合物且一般安全无毒且非生物学或其他领域中不合需要的化合物，且包括为兽医使用以及人类药用所接受的赋形剂。
术语“结晶的”指的是SP-4或RP-4的固体样品当通过X射线粉末衍射或单晶X射线技术测定时具有结晶特征的情况。
术语“晶体样”指的是SP-4或RP-4的固体样品当通过一种手段(例如肉眼或通过光学或偏振显微镜)测定时具有结晶特征但当通过另一手段(例如X射线粉末衍射)测定时不具有结晶特征的情况。通过肉眼或通过光学或偏振显微镜肉眼确定固体样品的结晶度的方法公开于USP<695>和<776>中，两篇文献皆以引用方式并入。呈“晶体样”的SP-4或RP-4的固体样品在某些条件下可为结晶的，但当经受其他条件时可变成非结晶的。
术语"无定形的"是指其中SP-4或RP-4的固体样品既不是结晶的也不是晶体样的情况。
实施方案
第一实施方案涉及由式4表示的化合物：
其中P*表示手性磷原子。由于手性磷原子，由式4表示的化合物包含两种非对映体表示为RP-4和SP-4。由式4表示的化合物还可以是溶剂化物、水合物或混合的溶剂化物/水合物的一部分。溶剂化物表示为4·nS，而水合物表示为4·mH2O，其中S是晶格溶剂，n变化约0至约3的整数或非整数量，并且m变化约0至约5的整数或非整数量。最后，由式4表示的化合物可能不作为溶剂化物或水合物存在，但具有某些有利量的吸收的溶剂(S)或水。在该情况下，S或水的量可从由式4表示的化合物的重量的约0重量%变化至约10重量%。由式4表示的化合物及其溶剂化物和水合物是结晶的、晶体样或无定形的。
第二实施方案涉及由式RP-4表示的化合物：
由式RP-4表示的化合物还可以是溶剂化物、水合物或混合的溶剂化物/水合物的一部分。溶剂化物表示为RP-4·nS，而水合物表示为SP-4·mH2O，其中S是晶格溶剂，n变化约0至约3的整数或非整数量，并且m变化约0至约5的整数或非整数量。最后，由式RP-4表示的化合物可能不作为溶剂化物、水合物或混合的溶剂化物/水合物存在，但具有某些有利量的吸收的溶剂(S)、水、或S和水。在该情况下，S或水的量可从由式RP-4表示的化合物的重量的约0重量%变化至约10重量%。由式RP-4表示的化合物及其溶剂化物和水合物是结晶的、晶体样或无定形的。
第二实施方案的第一方面涉及结晶的RP-4。
第二实施方案的第二方面涉及结晶的RP-4，其具有的XRPD2θ-反射角(°)在约:6.6,7.1,9.0,11.6,17.9,20.7,24.1,24.4和26.2。
第二实施方案的第三方面涉及结晶的RP-4，其具有的XRPD2θ-反射角(°)在约:6.6,7.1,9.0,11.0,11.6,12.0,16.0,17.9,19.6,20.7,21.0,21.7,21.9,22.2,23.1,24.1,24.4,26.1,27.3,27.7和28.2。
第二实施方案的第四方面涉及结晶的RP-4，其具有的XRPD衍射图谱基本上如图2中所示。
第二实施方案的第五方面涉及RP-4，其具有下列FT-IR峰(cm-1):1742,1713,1679,1460,1377,1259,1157和1079。
第二实施方案的第六方面涉及RP-4，其具有的FT-IR光谱基本上如图15中所示。
第二实施方案的第七方面涉及基本上纯的RP-4。
第二实施方案的第八方面涉及基本上纯的结晶的RP-4。
第二实施方案的第九方面涉及基本上纯的无定形的RP-4。
第三实施方案涉及由式SP-4表示的化合物：
由式SP-4表示的化合物还可以是溶剂化物、水合物或混合的溶剂化物/水合物的一部分。溶剂化物表示为SP-4·nS，而水合物表示为SP-4·mH2O，其中S是晶格溶剂，n变化约0至约3的整数或非整数量，并且m变化约0至约5的整数或非整数量。最后，由式SP-4表示的化合物可能不作为溶剂化物或水合物存在，但具有某些有利量的吸收的溶剂(S)或水。在该情况下，S或水的量可从由式SP-4表示的化合物的重量的约0重量%变化至约10重量%。由式SP-4表示的化合物及其溶剂化物和水合物是结晶的、晶体样或无定形的。
第三实施方案的第一方面涉及结晶的SP-4。
第三实施方案的第二方面涉及单斜结晶的SP-4，优选具有下列晶胞参数：和β～92.05°。
第三实施方案的第三方面涉及单斜结晶的SP-4，优选具有下列晶胞参数：和β～112.29°。
第三实施方案的第四方面涉及单斜结晶的SP-4，优选具有下列晶胞参数：和β～91.75°。
第三实施方案的第五方面涉及单斜结晶的SP-4，优选具有下列晶胞参数：和β～96.40°。
第三实施方案的第六方面涉及结晶的SP-4，其具有的XRPD2θ-反射角(°)在约:5.2,7.5,9.6,16.7,18.3,22.2。
第三实施方案的第七方面涉及结晶的SP-4，其具有的XRPD2θ-反射角(°)在约:5.0,7.3,9.4和18.1。
第三实施方案的第八方面涉及结晶的SP-4，其具有的XRPD2θ-反射角(°)在约:4.9,6.9,9.8,19.8,20.6,24.7和26.1。
第三实施方案的第九方面涉及结晶的SP-4，其具有的XRPD2θ-反射角(°)在约:6.9,9.8,19.7,20.6和24.6。
第三实施方案的第九方面涉及结晶的SP-4，其具有的XRPD2θ-反射角(°)在约:5.0,6.8,19.9,20.6,20.9和24.9。
第三实施方案的第十方面涉及结晶的SP-4，其具有的XRPD2θ-反射角(°)在约:5.2,6.6,7.1,15.7,19.1和25.0。
第三实施方案的第十一方面涉及结晶的SP-4，其具有的XRPD衍射图谱基本上如图3,图4,图5,图6,图7和图8中的任一者所示。
第三实施方案的第十二方面涉及SP-4，其具有的下列FT-IR峰(cm-1)在约:1743,1713,1688,1454,1378,1208和1082。
第三实施方案的第十三方面涉及SP-4，其具有的FT-IR谱基本上如图7中所示。
第三实施方案的第十四方面涉及基本上纯的SP-4。
第三实施方案的第十五方面涉及基本上纯的结晶的SP-4。
第三实施方案的第十六方面涉及基本上纯的无定形的SP-4。
剂量、施用和用途
第四实施方案涉及使用化合物4,RP-4或SP-4中的任一种来治疗和/或预防任何病毒剂的组合物。可能的病毒剂包括但不限于：丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、登革热病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、日本脑炎病毒或属于瘟病毒属(Pestiviruses)、丙型肝炎病毒属(hepaciviruses)或黄病毒属(flavaviruses)的群组的那些病毒。
该实施方案的方面涉及用于治疗本文中公开的任一病毒剂的组合物，所述组合物包含：选自赋形剂、载体、稀释剂和等同介质中的药学上可接受的介质；和化合物4,RP-4或SP-4中的任一种，这旨在包括化合物4,RP-4或SP-4中的任一种的其水合物、溶剂化物和任何结晶形式、或其水合物和溶剂化物。
化合物4,RP-4或SP-4可独立地配制成各种口服施用剂型和载体。口服给药可以是片剂、包衣片剂、硬和软明胶胶囊、溶液剂、乳剂、糖浆剂或混悬剂。当采用栓剂给药等其它给药途径施用时，化合物4,RP-4或SP-4也是有效的。最方便的给药方式一般是采用方便的每日给药方案的口服给药，该方案可根据疾病的严重程度及患者对抗病毒药物的反应而调整。
可将化合物4,RP-4或SP-4与一种或多种常规赋形剂、载体或稀释剂一起配制成药物组合物和单位剂量的形式。所述药物组合物和单位剂型可以包含惯用比例的常规成分，可以含或不含其它活性化合物，单位剂型可包含与要使用的所需每日剂量范围相当的任何合适有效量的活性成分。对于口服使用，所述药物组合物可以是固体，例如片剂或填充的胶囊，半固体、粉末、缓释制剂，或液体，例如混悬液、乳液或填充胶囊的形式；或者对于直肠或阴道给药，可以是栓剂形式。典型的制剂含有约5%到约95%的一种或多种活性化合物(w/w)。
化合物4,RP-4或SP-4可单独施用，但通常混合一种或多种合适的药物赋形剂、稀释剂或载体来施用，所述赋形剂、稀释剂或载体针对施用的预期途径和标准药学实践来进行选择。
固体形式的制剂包括例如粉末、片剂、丸剂、胶囊、栓剂和可分散粒剂。固体载体可以是还可用作稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、混悬剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包囊材料的一种或多种物质。在粉末剂中，载体通常是微细的固体，其是含微细的活性组分的混合物。在片剂中，活性组分通常与适当比例的具有所需结合能力的载体混合，并压紧成所需形状和大小。合适的载体包括但不限于碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低融点蜡、可可脂等。除了活性组分，固体形式的制剂还含有着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人工和天然增甜剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。固体制剂的例子例如在下列文献中：EP0524579;US2002/0142050;US2004/0224917;US2005/0048116;US2005/0058710;US2006/0034937;US2006/0057196;US2006/0188570;US2007/0026073;US2007/0059360;US2007/0077295;US2007/0099902;US2008/0014228;US6,267,985;US6,294,192;US6,383,471;US6,395,300;US6,569,463;US6,635,278;US6,645,528;US6,923,988;US6,932,983;US7,060,294;和US7,462,608,其均通过引用的方式并入。
液体制剂也适合于口服给药，液体制剂包括乳液、糖浆剂、酏剂和水性混悬液。这些制剂包括在使用前不久转换成液体形式制品的固体形式制剂。液体制剂的例子例如在下列文献中：美国专利No.3,994,974;5,695,784;和6,977,257。乳液可在溶液中制备，例如丙二醇水溶液或可含有乳化剂，例如卵磷脂、失水山梨糖醇酐单油酸酯或阿拉伯胶。可将微细的活性组分分散在含粘性物质，例如天然或合成的胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其它熟知混悬剂的水中来制备水性混悬液。
化合物4,RP-4或SP-4可独立地配制用于作为栓剂施用。低熔点蜡(例如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物)首先熔融，然后活性成分例如通过搅拌而均匀地分散。然后熔融的均匀混合物倒入合宜尺寸的模具中，并使之冷却和固化。
化合物4,RP-4或SP-4可独立地配制成用于阴道施用。含有除活性成分外的阴道栓剂、棉塞、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂的这类载体在所属技术领域中被认为是适当的。这些制剂中的某些也可以与含有或不含有杀精剂的避孕套结合使用。
Remington:The Science and Practice of Pharmacy（雷明顿：制药科学和实践）1995,由E.W.Martin,Mack Publishing Company,19th edition,Easton,Pennsylvania编写(其通过引用的方式并入)描述了含药物载体、稀释剂和赋形剂的合适制剂。有经验的制剂学家可以在本说明书的教导内对制剂进行修改，以提供用于特定给药途径的许多制剂，而不会使包含本文中涵盖的化合物的组合物不稳定或损害它们的治疗活性。
另外，纯化化合物4,RP-4或SP-4可独立地结合脂质体或胶束来配制。对于脂质体，涵盖可以下列美国专利中公开的方法来配制的纯化化合物：美国专利No.4,797,285;5,013,556;5,077,056;5,077,057;5,154,930;5,192,549;5,213,804;5,225,212;5,277,914;5,316,771;5,376,380;5,549,910;5,567,434;5,736,155;5,827,533;5,882,679;5,891,468;6,060,080;6,132,763;6,143,321;6,180,134;6,200,598;6,214,375;6,224,903;6,296,870;6,653,455;6,680,068;6,726,925;7,060,689;和7,070,801，其均通过引用的方式并入。对于胶束，涵盖可以美国专利第5,145,684号和第5,091,188号中公开的方法来配制的纯化化合物，两个专利均通过引用的方式并入。
第五实施方案涉及化合物4,RP-4或SP-4中的任一种在制备治疗任何病症的药物中的用途，所述病症源自下列病毒剂中的任一种的感染：丙型肝炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、登革热病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和日本脑炎病毒。
术语“药物”意指用于治疗和/或预防有需要的受试者的方法中的物质，其中所述物质包括但不限于包含化合物4,RP-4或SP-4中的任一种的组合物、制剂、剂型等。涵盖化合物4,RP-4或SP-4中的任一种单独或联合本文中公开的另一化合物在制备治疗本文中公开的抗病毒病症的任一种的药物中的用途。药物包括但不限于本文中公开的第四实施方案所涵盖的组合物中的任一种。
第六实施方案涉及对有需要的受试者进行治疗和/或预防的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的化合物4,RP-4或SP-4中的任一种。
有需要的受试者意指患有由本文公开的任一种病毒剂感染所引起的任何病症的受试者，所述病毒剂包括但不限于丙型肝炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、登革热病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、牛病毒性腹泻病毒或日本脑炎病毒、黄病毒属或瘟病毒属或丙型肝炎病毒属或引起与上文所列的任何病毒等效或相当的症状的病毒剂。
术语“受试者”意指哺乳动物，包括但不限于牛、猪、羊、鸡、火鸡、水牛、美洲驼(llama)、鸵鸟、犬、猫和人，受试者优选是人。涵盖在第九实施方案的治疗受试者的方法中的可以是单独或与本文中公开的另一化合物联合的本文中涵盖的任何化合物。
本文所用的术语“治疗有效量”意指减轻个体的疾病症状所需的量。调节剂量以适应各特定病例中的个体需求。剂量可取决于许多因素而大幅度变化，所述因素是诸如所治疗的疾病的严重性、患者的年龄和一般健康状况、正用于治疗患者的其他药物、给药途径和形式以及所参与的执业医生的偏好和经验。对于口服给药而言，在每日约0.001g与约10g之间的日剂量，包括其间的所有数值，诸如每日0.001、0.0025、0.005、0.0075、0.01、0.025、0.050、0.075、0.1、0.125、0.150、0.175、0.2、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9和9.5g，将适于单一疗法和/或联合疗法。特定的日剂量是在每日约0.01g至约1g之间，包括其间为0.01g(即，10mg)的所有增值，优选日剂量是每日在约0.01至约0.8g之间，更优选每日约0.01至约0.6g之间且最优选每日约0.01至约0.25g之间，每一剂量都包括其间为0.01g的所有增值。通常，治疗是以大的初始“负荷剂量”开始以快速地减少或除去病毒，接着减小剂量到足以防止感染复发的水平。治疗本文所述疾病的一般技术人员将能够在没有过多实验的情况下并依赖个人的学识、经验以及本申请的公开内容来确定用于给定疾病和患者的本文中公开的化合物的治疗有效量。
治疗效力可由肝功能和肝代谢功能测试来确定，所述肝功能包括但不限于蛋白水平，诸如血清蛋白(例如，白蛋白、凝血因子、碱性磷酸酶、转氨酶(例如，丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶)、5'-核苷酶、γ-谷氨酰胺酰基转肽酶等等)、胆红素合成、胆固醇合成和胆汁酸合成；所述肝代谢功能包括但不限于碳水化合物代谢、氨基酸代谢和氨代谢。备选地，治疗有效性可能通过测量HCV-RNA来监控。这些测试的结果使剂量得以最佳化。
第六实施方案的第一方面涉及治疗和/或预防有需要的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的由化合物4,RP-4或SP-4中的任一种表示的化合物和治疗有效量的另一抗病毒剂；其中所述施用是同时发生的或交替的。应理解，交替施用之间的时间可以为1-24小时，这包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22和23小时之间的任何子范围。
"另一抗病毒剂"的例子包括但不限于：HCV NS3蛋白酶抑制剂(参见EP1881001,US2003187018,US2005267018,WO2003006490,WO200364456,WO2004094452,WO2005028502,WO2005037214,WO2005095403,WO2007014920,WO2007014921,WO2007014922,WO2007014925,WO2007014926,WO2007015824,WO2008010921和WO2008010921);HCV NS5B抑制剂(参见US2004229840,US2005154056,US2005-98125,US20060194749,US20060241064,US20060293306,US2006040890,US2006040927,US2006166964,US2007275947,US6784166,US20072759300,WO2002057287,WO2002057425,WO2003010141,WO2003037895,WO2003105770,WO2004000858,WO2004002940,WO2004002944,WO2004002977,WO2004003138,WO2004041201,WO2004065367,WO2004096210,WO2005021568,WO2005103045,WO2005123087,WO2006012078,WO2006020082,WO2006065335,WO2006065590,WO2006093801,WO200702602,WO2007039142,WO2007039145,WO2007076034,WO2007088148,WO2007092000和WO2007095269);HCV NS4抑制剂(参见WO2005067900和WO2007070556);HCV NS5a抑制剂(参见US2006276511,WO2006035061,WO2006100310,WO2006120251和WO2006120252);Toll-样受体激动剂(参见WO2007093901);和其他抑制剂(参见WO2000006529,WO2003101993,WO2004009020,WO2004014313,WO2004014852和WO2004035571);以及美国专利申请No.12/053,015,2008年3月21日提交(US2010/0016251)(其内容通过引用的方式并入)中公开的化合物,干扰素-α,干扰素-β,聚乙二醇化干扰素-α、利巴韦林(ribavirin)、左旋韦林(levovirin)、viramidine、另一核苷HCV聚合酶抑制剂、HCV非核苷聚合酶抑制剂、HCV蛋白酶抑制剂、HCV解旋酶抑制剂或HCV融合抑制剂。
当化合物4,RP-4或SP-4中的任一种和另一抗病毒剂联合施用时，活性可能较母化合物而言增加。当治疗是联合疗法时，相对于核苷衍生物的施用而言，这类施用可以是同时发生的或序贯的。因此，本文所用的“同时施用”包括在相同时间或在不同时间施用药剂。可通过含有两种或更多种活性成分的单一制剂或通过基本上同时施用两种或更多种含有单一活性成分的剂型来同时施用两种或更多种药剂。
应理解本文述及治疗应延伸至对己有疾病的预防以及治疗。此外，本文所用的术语HCV感染的“治疗”还包括治疗或预防HCV感染有关或由其介导的疾病或病症或其临床症状。
制备
第七实施方案涉及制备化合物4,RP-4或SP-4中任一种的方法，该方法包括:a)使丙氨酸异丙酯A、二-LG-苯基磷酸酯B、2'-脱氧-2'-氟-2'-C-甲基尿苷3和碱反应以获得包含SP-4和RP-4中的至少一种的第一混合物
其中X是酸的共轭碱，n,是0或1，并且LG是离去基团;b)使第一混合物和保护化合物反应以获得包含保护的SP-4和保护的RP-4中的至少一种的第二混合物；以及c)任选地使第二混合物进行结晶、色谱分析或萃取以获得4,SP-4或RP-4。
在第七实施方案的第一方面，丙氨酸异丙酯作为其盐酸盐存在，其优选基本上无水。
在第七实施方案的第二方面，碱是N-甲基咪唑。
在第七实施方案的第三方面，A-B-3的摩尔比为约1.6:1.3:1。
在第七实施方案的第四方面，保护化合物是叔丁基-二甲基-甲硅烷基-氯化物。
第八实施方案涉及制备SP-4或RP-4的方法，该方法包括：a)使丙氨酸异丙酯A、二-LG-苯基磷酸酯B、2'-脱氧-2'-氟-2'-C-甲基尿苷3和碱反应以获得包含SP-4和RP-4中的至少一种的第一混合物
其中X是酸的共轭碱，n,是0或1，并且LG是离去基团;b)任选地使第二混合物进行结晶、色谱分析或萃取以获得纯化的SP-4或RP-4。
制备RP-4的第八实施方案的第一方面另外包括通过下列方式来进一步纯化第二混合物或纯化的RP-4：使第二混合物或纯化的RP-4混合物溶解或混悬在溶剂中；任选地使用结晶的RP-4引晶；以及加入足够的反溶剂以获得结晶的RP-4。
制备SP-4的第八实施方案的第二方面另外包括通过d)来进一步纯化第二混合物或纯化的SP-4：使第二混合物或纯化的SP-4溶解或混悬在溶剂中，然后使用结晶SP-4在约室温引晶；收集第一固体，所述第一固体的大部分包含SP-4；在溶剂中在其回流温度下使第一固体溶解；以及冷却或加入反溶剂以获得第二固体。
制备SP-4的第八实施方案的第三方面另外包括通过d)来进一步纯化SP-4：使第二混合物或纯化的SP-4混合物溶解或混悬在第一溶剂中，接着加入反溶剂以获得第一组合物，其中通过倾析除去残余溶剂/反溶剂以获得残渣；使用含有第一溶剂和反溶剂的溶液来处理残渣以产生第二组合物，从而在减压后提供第一固体；使用第二溶剂使第一固体溶解或混悬，以获得第三组合物；向第三组合物中加入SP-4晶种；收集第二固体；使第二固体溶解或混悬在第三溶剂中，任选地加热至第三溶剂的回流温度以获得第四组合物，如果需要，冷却第四组合物以获得包含SP-4的第三固体，其通过过滤收集。
在制备SP-4的第八实施方案的第四方面，SP-4通过d)由第二混合物或纯化的SP-4来进一步纯化：向第二混合物或纯化的SP-4中加入硅胶，接着通过溶剂蒸发以提供干浆料；在第一溶剂/反溶剂组合中搅拌干浆料以获得第一湿浆料；从第一湿浆料倾析第一溶剂/反溶剂组合以获得第二湿浆料和第一组合物；向第二湿浆料中加入第二溶剂/反溶剂组合，接着搅拌；从第二湿浆料倾析第二溶剂/反溶剂组合以获得第三湿浆料和第二组合物；对于第三湿浆料或另外的湿浆料任选地重复步骤g)–h)；从第二组合物和通过任选的步骤i)获得的任选的任何另外的组合物中蒸发溶剂以获得第一固体；使第一固体溶解或混悬在含有第三溶剂和任选的第四溶剂的溶液中，以获得第三组合物；任选地向第三组合物中加入SP-4的晶种；从第三组合物获得包含SP-4的第二固体；以及任选地使用第三溶剂重结晶第二固体以获得包含SP-4的第三固体。
普通技术人员将意识到，化合物可通过传统的萃取、传统的结晶或传统的色谱技术来分离。传统的色谱技术包括但不限于在硅胶上色谱分析(使用例如在DCM中的3-5%甲醇或在DCM中的4-6%异丙醇)以产生增加含量的一种异构体(50-100%)，然后使其结晶。或者，人们可使用反向色谱分析(使用例如1-30%乙腈-水性流动相)。而且，化合物可使用超临界流体色谱分析来分离，其使用二氧化碳作为主要溶剂并且使用醇例如甲醇作为改性剂，优选使用合适的手性介质例如Daicel Chiralpack IA。或者，SMB色谱分析可利用合适的手性介质例如Daicel ChiralPack IA、使用溶剂混合物(例如己烷/异丙醇)或单一溶剂(例如乙酸乙酯)来进行。
第九实施方案涉及制备SP-4的方法，该方法包括：a)使异丙基-丙氨酰基-氨基磷酸酯和3'-O-保护或未保护的3以及碱性试剂反应，以获得包含保护或未保护的SP-4的组合物
其中异丙基-丙氨酰基-氨基磷酸酯包含由下列结构表示的非对映体的混合物：
其中C:C'的比率为约1:1。
在第一方面，碱性试剂是叔丁基氯化镁，并且C:C'的比率大于或等于约1:1。
在第二方面，碱性试剂是叔丁基氯化镁，并且C:C'的比率大于约1:1。
在第三方面，碱性试剂是叔丁基氯化镁，并且C:C'的比率至少约1.5:1、约2.3:1、约4:1、约5.7:1、约9:1、约19:1、约32.3:1、约49:1或约99:1。
在第四方面，LG'是对硝基苯氧基，碱性试剂是叔丁基氯化镁，C:C'的比率为至少约1.5:1,约2.3:1,约4:1,约5.7:1,约9:1,约19:1,约32.3:1,约49:1或约99:1。
制备SP-4的第五方面包括：a)使异丙基-丙氨酰基-氨基磷酸酯(C)与3'-O-保护或未保护的3和碱性试剂反应，以获得包含保护或未保护的SP-4的组合物
其中Z是保护基或氢;LG'是离去基团;以及b)任选地使获得的保护或未保护的SP-4进行色谱分析、萃取或结晶以获得纯化的保护或未保护的SP-4。在子-实施方案中，LG'是甲苯磺酸酯基、樟脑磺酸酯基或被至少一个吸电子基团取代的芳氧基；更优选地LG'选自对硝基苯氧基,2,4-二硝基苯氧基和五氟苯氧基。在另外的子-实施方案中，当SP-4被保护时，即Z不是氢时，第九实施方案的方法还涉及使保护的SP-4脱保护。在另外的子-实施方案中，反应在极性非质子溶剂例如四氢呋喃或另一醚溶剂中进行，所述溶剂单独或彼此联合或联合C2至C7腈例如乙腈。
第九实施方案的方法还包括：1)使(LG')P(O)(LG)2和下列物质进行反应，其中独立于LG'，LG是离去基团：(i)丙氨酸异丙酯和第一碱以获得(LG')P(O)(LG)(Ala-iPr)，接着使(LG')P(O)(LG)(Ala-iPr)和苯酚与第二碱反应以获得包含C和C'的混合物；(ii)苯酚和第一碱以获得(LG')P(O)(LG)(OPh)，接着使(LG')P(O)(LG)(OPh)和丙氨酸异丙酯与第二碱反应以获得包含C和C'的混合物；或(iii)联合丙氨酸异丙酯、苯酚和至少一种碱以获得包含C和C'的混合物；或2)使(PhO)P(O)(LG)2和下列物质进行反应，其中独立于LG，LG'是离去基团：(i)丙氨酸异丙酯和第一碱以获得(PhO)P(O)(LG)(Ala-iPr)，接着使(PhO)P(O)(LG)(Ala-iPr)和离去基团前体与第二碱反应以获得包含C和C'的混合物，
并且使混合物进行色谱分析或使混合物结晶以获得C。在第九实施方案的方面，丙氨酸异丙酯存在为其盐酸盐的形式，其优选基本上无水。
第十实施方案涉及制备RP-4的方法，该方法包括：a)使异丙基-丙氨酰基-氨基磷酸酯和3'-O-保护或未保护的3以及碱性试剂反应，以获得包含保护或未保护的RP-4的组合物
其中异丙基-丙氨酰基-氨基磷酸酯包含由下列结构表示的非对映体的混合物：
其中C':C的比率为约1:1。
在第一方面，碱性试剂是叔丁基氯化镁，并且C':C的比率大于或等于约1:1。
在第二方面，碱性试剂是叔丁基氯化镁，并且C':C的比率大于约1:1。
在第三方面，碱性试剂是叔丁基氯化镁，并且C':C的比率为至少约1.5:1、约2.3:1、约4:1、约5.7:1、约9:1、约19:1、约32.3:1、约49:1或约99:1。
在第四方面，LG'是对硝基苯氧基，碱性试剂是叔丁基氯化镁，并且C':C的比率为至少约1.5:1、约2.3:1、约4:1、约5.7:1、约9:1、约19:1、约32.3:1、约49:1或约99:1。
制备RP-4的第五方面包括：a)使异丙基-丙氨酰基-氨基磷酸酯(C')和3'-O-保护或未保护的3与碱性试剂反应，以获得包含保护或未保护的RP-4的组合物
其中Z是保护基或氢;LG'是离去基团;以及b)任选地使获得的保护或未保护的RP-4进行色谱分析、萃取或结晶以获得纯化的保护或未保护的RP-4。在子-实施方案中，LG'是甲苯磺酸酯基、樟脑磺酸酯基或被至少一个吸电子基团取代的芳氧基；更优选地LG'选自对硝基苯氧基、2,4-二硝基苯氧基和五氟苯氧基。在另外的子-实施方案中，当RP-4被保护时，即Z不是氢时，第九实施方案的方法还涉及使保护的RP-4脱保护。在另外的子-实施方案中，反应在极性非质子溶剂例如四氢呋喃或另一醚溶剂中进行，所述溶剂单独或彼此联合或联合C2至C7腈例如乙腈。
第十实施方案的方法还包括：1)使(LG')P(O)(LG)2和下列物质进行反应，其中独立于LG'，LG是离去基团：(i)丙氨酸异丙酯和第一碱以获得(LG')P(O)(LG)(Ala-iPr)，接着使(LG')P(O)(LG)(Ala-iPr)与苯酚和第二碱反应以获得包含C和C'的混合物；(ii)苯酚和第一碱以获得(LG')P(O)(LG)(OPh)，接着使(LG')P(O)(LG)(OPh)与丙氨酸异丙酯和第二碱反应以获得包含C和C'的混合物；或(iii)联合丙氨酸异丙酯、苯酚和至少一种碱以获得包含C和C'的混合物；或2)使(PhO)P(O)(LG)2和下列物质进行反应，其中独立于LG，LG'是离去基团：(i)丙氨酸异丙酯和第一碱反应以获得(PhO)P(O)(LG)(Ala-iPr)，接着使(PhO)P(O)(LG)(Ala-iPr)与离去基团前体和第二碱反应以获得包含C和C'的混合物，
并且使混合物进行色谱分析或使混合物结晶以获得C'。在第九实施方案的方面，丙氨酸异丙酯作为其盐酸盐存在，其优选基本上无水。
第十一实施方案涉及通过第七实施方案、第八实施方案、第九实施方案或第十实施方案以及它们的各个方面中引用的方法获得的组合物。第十一实施方案的方面涉及通过下面公开的示例性实施方案中的任一种获得的组合物。这样获得的组合物可以是结晶的、晶体样、无定形的或其组合。
第十二实施方案涉及化合物3
其中Z是保护基或氢；其用于制备RP-4或SP-4。
第十二实施方案的第一方面选自具有下列结构的化合物：
第十三实施方案涉及由下列结构表示的化合物，其盐、水合物、溶剂化物或它们的组合
其中LG'是离去基团，其用于制备RP-4或SP-4。
在第十三实施方案的第一方面，LG'是甲苯磺酸酯基,樟脑磺酸酯基,芳氧基或被至少一个吸电子基团取代的芳氧基。
在第十三实施方案的第二方面，LG'选自对硝基苯氧基,2,4-二硝基苯氧基和五氟苯氧基。
第十四实施方案涉及RP-4或SP-4的同位素-标记的类似物。术语"同位素-标记的"类似物是指RP-4或SP-4的类似物，其是"氘代类似物"、"13C-标记的类似物"或"氘代/13C-标记的类似物"。术语"氘代类似物"是指本文中所述的化合物，从而1H-同位素即氢(H)被2H-同位素即氘(D)取代。氘取代可以是部分或完全的。部分氘取代是指至少一个氢被至少一个氘取代。例如，对于RP-4或SP-4，普通技术人员可预计至少下列部分氘代的类似物(其中"dn"表示n-数个氘原子，例如对于异丙基n=1-7，而对于苯基n=1-5)、以及下面所示的那些。
尽管上述甲基被示出为完全氘代，但是人们将认识到，部分氘代变体形式也是可能的，例如–CDH2和–CD2H。还涵盖呋喃糖和碱基上的同位素标记。同样，术语"13C-标记的类似物"和"氘代/13C-标记的类似物"是指本文中所述的化合物，从而碳原子富含13C-同位素，这意味着富集程度超过约1.1%的通常天然丰度。
实施例
并非限定发明范围，下述实施例是为了更好的理解发明。
合成方面
为制备尿苷核苷，可以利用在以中试规模已经有效制备的3的某些3',5'-二酰化类似物（参见下文）的合成中(见WO2006/031725或US2006/0122146，两者通过引用并入本文中)的高级三苯甲酰化胞苷中间体。下述方法是可规模化、低成本的。
3',5'-O-二苯甲酰基-2'-脱氧-2'-氟-2'-C-甲基-N4-苯甲酰基胞苷(1)可以由WO2006/031725和WO2008/045419报道的方法得到，它们的全部内容通过引用并入本文。1通过70%乙酸乙酯处理得到3',5'-O-二苯甲酰基-2'-脱氧-2'-氟-2'-C-甲基-尿苷(2)。苯甲酸酯可以通过许多方法水解，例如，溶解于醇溶剂的醇盐，例如溶于甲醇中的甲醇钠、溶于甲醇中的碳酸钾、或乙醇类似物，烷基胺类，例如，溶于甲醇的甲基胺、丁基胺等。为工业规模化筛选出甲醇胺。由三苯甲酰化胞苷(1)结晶纯化获得的尿苷产物（3），收率为70%。
众多文献步骤详细说明了使用几倍当量的试剂生产氨基磷酸酯的不同路线和条件。参见，例如McGuigan等J.Med.Chem.（药物化学杂志）2005,48,3504-3515和McGuigan等J.Med.Chem.（药物化学杂志）2006,49,7215。对具有工业规模的来说，目前知道的仅有一例，由Lehsten等,Org.Process Res.Dev.（有机方法研究进展）2002,6,819-822("Lehsten")所公开。在该文献中，作者介绍了"一锅法"的观念，由氨基酸盐酸盐和二氯磷酸苯酯和N-甲基咪唑在二氯甲烷中反应。过后加入核苷形成所需的5'－O-氨基磷酸酯产物，其在本例中将产生式4代表的化合物。不幸的是，Lehsten程序存在一些缺点。例如，Lehsten程序使用大大过量于必要的试剂，增加了色谱纯化的成本和难度。此外，Lehsten建议，与参考文献相比，通过使用较低的温度和缓慢添加核苷可以控制对5'－羟基相对于3'-羟基的反应选择性。
利用Lehsten程序为本文中所公开的化合物提供约1-5%的单取代的3'-O-氨基磷酸酯非对映体(5)和约10-30%的双取代产物(6)。由于3'-非对映体的极性非常类似于所需的5'－非对映体(4),因此色谱分离非常富于挑战性。除去极性较弱的5'-非对映体(4)的大部分或者接受3'－非对映体(5)的较高水平污染使扩大工艺规模几乎无法实现。在最初的50g规模扩大中，得到的产物包含约3%的3'-非对映体(5)污染物，所述3'-非对映体(5)与极性较弱的5'-非对映体(4)共洗脱。
本文公开了使用较少量的试剂的反应条件和使用较容易的色谱分离选择性地去除杂质3'-O-氨基磷酸酯非对映体(5)从而得到所需的非常高纯度的5'-O-氨基磷酸酯非对映体(4)的方法。
为了计量试剂，进行了一项研究，其中试剂的剂计量系统性地被改变并且如Lehsten报道的那样通过粗反应物的磷NMR监测结果。在成为成功的实验中，比较了所需产物的分离收率和纯度。观察到，伯5'-羟基具有比仲3'-羟基更快的反应速率。这就造成了消耗所有初始核苷和5'-和3'-单取代产物(4和5)转化成5',3'-双取代产物(6)的反应进程之间的竞争。3'-取代产物比5'-取代产物转换成双取代产物的速率更高，所以能够推动反应更多地生成双取代产物以减少3'-非对映体污染。然而，采用去除3'-非对映体的有效方式，可以优化反应以产出更多的所需的5'-非对映体，而不会以较多的5'-非对映体转化为双取代产物（6）为代价。还观察到，氨基酸盐酸盐具有较强的吸湿性。由于存在的任意量的水会消耗等量的二氯磷酸苯酯试剂，因此必须小心地保持氨基酸基本无水，或者应当使其在使用前基本无水。简言之，Lehsten已经报道了氨基酸与二氯磷酸苯酯以及核苷的最佳比率分别为3.5:2.5:1。发现在其中3'-非对映体可以被有效地去除的条件下且当氨基酸盐酸盐基本无水时，氨基酸与二氯磷酸苯酯以及核苷的最佳比率为约1.6：约1.3：约1是最佳的。通过使用较少量的试剂，加上简化从试剂副产物和从低水平的双非对映体中色谱分离所需的产物实现了成本的节约。
在一种可选择的程序中，在二个步骤中，应用叔丁基二甲基甲硅烷基保护基团制备了3的3'-羟基-保护的衍生物。上述衍生物然后转变成它的5'-氨基磷酸酯衍生物。期望然后能够将甲硅烷基去除，并且没有3'异构体(5)或3',5'-双氨基磷酸酯(6)。一种相似的方式由Borch和Fries(美国专利5,233,031)证实，其对氨基磷酸烷基酯的总收率较低。
另外一种可选择的方式是通过直接合成，然后借助化学方法帮助区别3'-非对映体杂质5和期望的5'-非对映体4，从而帮助分离。期望这样的基团，相对于期望的5'-O-氨基磷酸酯4的游离仲羟基，该基团选择性地和3'-O-氨基磷酸酯杂质5的游离伯羟基进行反应。还期望保护基团显著改变所得的5'-O-保护的3'-O-氨基磷酸酯产物(来自期望的5'-O-氨基磷酸酯4)的极性。不需要多余的步骤去除保护基团，因为期望的5'-非对映体4不会改变。化学改变的3'-非对映体然后允许通过特殊清除载体或通过萃取而更容易地色谱分离或分离。
具体讲，保护基团叔丁基二甲基甲硅烷基(tBDMS)满足这些标准，并且首先被证实，然后被用于千克规模。在例如吡啶作为溶剂和碱的某些条件下，相对于3'仲羟基位，tBDMS基团高选择性地在伯羟基位反应。氨基磷酸酯反应使用N-甲基咪唑(NMI)作为碱。在NMI存在的情况下，甲硅烷化选择性较差。优选地，NMI的量应该减少。氨基磷酸酯反应后，通过使用1N盐酸洗涤反应溶液即可轻松完成。NMI和剩余的初始核苷被清除，留下单和双取代产物以及试剂副产物的粗混合物。然后将其溶于吡啶中，用叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物进行处理。3'-单取代产物5在几小时或更短时间转化成5'-O-tBDMS-3'-O-氨基磷酸酯7。反应进程可以通过HPLC监测。此甲基硅烷化产物7的极性弱于双-氨基磷酸酯6，并且通过色谱分离轻易除去。使用上述方法，相比于无甲硅烷基处理的1-3%，可使3'-单氨基磷酸酯5的水平减少到小于0.1%的5'-产物4。类似地，在相同条件下用二甲氧基三苯基甲基氯化物(DMT-Cl)处理也良好地进行。还较容易地通过TLC法鉴别DMT反应产物，因为含DMT的分子在加热或暴露于酸时呈鲜橙色。通过上述的描述，也可以设想多种其它的保护基团。
反应条件和清除3'-杂质的方法均是常规方法，可以应用于大多数含有游离3'羟基的核苷氨基磷酸酯。氨基磷酸酯部分可以是氨基酸酯和芳香醇的任意组合。核苷部分可以是任意核苷，其中5'-氨基磷酸酯将产生5'-单磷酸酯，并且可进一步代谢为5'-三磷酸酯形式。
下述方案是主要反应路线，其图示用于制备2'-脱氧-2'-氟-2'-C-甲基尿苷的L-丙氨酸异丙酯氨基磷酸苯酯，主要产物为期望的5'-O-氨基磷酸酯(4,两种非对映体)，次要产物为3'-O-氨基磷酸酯(5,两种非对映体)和3',5'–双-O-氨基磷酸酯(6,四种非对映体)。试剂加入的计量比率如在制备章节的方法中所描述。反应可以进展到保持约5%初始原料，这通过在薄层色谱分析(TLC)上UV肉眼观察来判断。此外UPLC/MS显示与期望的5'产物相比，形成约10%的3',5'双-氨基磷酸酯6。在淬灭和酸性水溶液后处理后，从有机层得到的粗残渣制备用于进行甲硅烷化。在所述的反应条件下，甲硅烷基优先与3'-O-氨基磷酸酯的游离5'-羟基反应生成7。反应继续进行，直至UPLC/MS检测不到3'-O-氨基磷酸酯。
在甲硅烷化反应后，期望产物进行硅胶柱色谱分离，用在二氯甲烷中的甲醇梯度(1-4%)进行洗脱。期望5'-单氨基磷酸酯4被最后洗脱下来。
制备方法
实施例1.2'-脱氧-2'-氟-2'-C-甲基尿苷(3)的制备
在10L烧瓶中，加入3',5'-O-二苯甲酰基-2'-脱氧-2'-氟-2'-C-甲基-N4-苯甲酰基胞苷(500g,0.874mol)和70%醋酸水溶液(7.5L)。溶液加热回流(110℃)20小时。TLC表明反应完全(在二氯甲烷（DCM)中5%的甲醇中，Rf0.6)。混合物被冷却到环境温度并且用水(2L)稀释。搅拌2小时后，所得沉淀被过滤收集，并且固体以水(5L)冲洗，在环境温度的气氛中干燥12小时，得360克(88%)。通过在0摄氏度下全部添加到新配制的甲醇氨中(5.4L,约25%)，这种二苯甲酰基尿苷中间体直接应用于下一步。该温度下保持3小时，然后24小时内升至15℃。TLC表明反应完全(在二氯甲烷中的10%的甲醇中，Rf0.4)。反应混合物通过Celite床过滤并且减压浓缩以得到粗产物(216g)。粗产物在环境温度下用乙酸乙酯(325ml)搅拌3小时。所得固体过滤收集并用乙酸乙酯(216mL)洗涤。固体在环境温度下真空干燥4小时，得160g(78%)的期望产物，HPLC纯度98.7%。1H-NMR(DMSO-d6)δ11.44(br s,1H,NH),7.95(d,1H,C-6H),5.97(d,1H,C-1'H),5.64(d,1H,C-5H),3.84-3.77(m,3H,C-5'-Ha,C-3'H.C-4'H),3.63-3.60(m,1H,C5'-Hb),1.23(d,3H,C-2'-CH3).ES-MS M-1259.
实施例2.(S)-2-{[(1R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢-2H-嘧啶-1-基)-4-(R)-氟-3-羟基-4-甲基-四氢-呋喃-2-基甲氧基]-苯氧基-磷酰基氨基}-丙酸异丙基酯(4)的制备
同义词：5'-O-(异丙基-L-丙氨酸酯,苯基磷酰胺基)-2'-脱氧-2'-氟-2'-C-甲基-尿苷非对映体混合物
5L3-颈烧瓶装有机械搅拌器、盐水冰浴、内部温度计和氮气气氛。烧瓶中装有L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(82.0g,0.490摩尔)和无水二氯甲烷(0.80L)。搅拌时，一批加入二氯磷酸苯酯(85.0克，0.40摩尔)并搅动。保持内部温度在-5到5℃之间，在半个小时的时间内加入在二氯甲烷(250mL)中的N-甲基咪唑(NMI,250g,3.07摩尔)的溶液。在这个温度范围下搅拌溶液1小时。在0℃一批加入2'-脱氧-2'-氟-2'-C-甲基-尿苷(3,80.0g,0.307摩尔)，然后反应烧瓶在盐水浴中慢慢升温。在1小时，内部温度达到-2℃。在1小时TLC(在DCM中5%甲醇)显示超过50%的核苷被消耗。移去盐水浴，1小时多的时间内反应烧瓶达到环境温度。3小时后和在5小时TLC全部显示95%的初始核苷被消耗。反应混合物通过加甲醇(100ml)淬灭，搅拌反应物5分钟。
反应混合物用1N HCl(2X500mL)、然后用饱和碳酸氢钠溶液(2X500ml)洗涤。分离的有机层经无水硫酸钠(50克)干燥，过滤。溶液在减压和然后在高真空下蒸发至干，以得到粘性油状粗产物(170g)。进行粗产物的NMR(31P和1H)。31P-NMR表明，由于存在3'异构体5，总磷积分为约1%。
在粗产物中加入无水吡啶(1700ml)。溶剂在减压和然后在高真空下蒸发，以通过共蒸发来降低粗混合物的含水量。将所得油重新溶于无水吡啶(500ml)，然后加入过量的叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物(9.0g,60mM)。在环境温度下搅拌反应。通过UPLC/MS监控反应过程。在3个小时之后，3'杂质5不再能被检测，通过加入甲醇(50mL)来淬灭反应。
反应减压蒸发成油。残留物溶于乙酸乙酯(1.5L)，用1N HCl(2X500ml)洗涤，随后用饱和碳酸氢钠溶液(2X500ml)洗涤。有机层经无水硫酸钠(50克)干燥，过滤，减压蒸发以得到浅黄色油状物的粗产物。
粗油状物用相同体积的二氯甲烷稀释，上样到2.5千克硅胶柱中，在100磅/平方英寸气压的径向加压模块内。使用梯度泵、压力60磅/平方英寸、400ml/分钟流速，以二氯甲烷(4L)、然后用在二氯甲烷(48L)中的1-4%甲醇梯度洗涤柱。大多数主要杂质(二-(异丙基丙氨酰基)磷酸苯酯,3',5'-双氨基磷酸酯(6),3'-氨基磷酸酯-5'-TBDMS加合物(7))用～3%梯度被洗脱。在3和4%的甲醇之间洗脱期望产物。包含产物的部分被分为两批。第1种包含少量的上层杂质，后者是纯产物。第一组部分包含少量极性较低的杂质(上层杂质)，例如3',5'-双氨基磷酸酯和磷酸二-丙氨酰基苯酯，主要是Rp非对映体，并且需要第二次柱纯化。（相关术语，上层与下层相比(uppervs.lower)是指正常相硅胶色谱法洗脱，"上层异构体"表示第一洗脱异构体）。第二组部分没有大量杂质，只保留RP和大部分SP非对映体。过后合并经过两次柱色谱的级分。减压蒸发溶剂，所得白色泡沫进一步干燥(0.20mmHg)1小时，得42克不纯批次(4:1上层vs下层异构体，基于31P-NMR)和38克纯净批次(1:3上层vs下层异构体)。不纯批次以相似的方式再次柱色谱，得到3.8g的97%纯的上层异构体(保留的级分)和36g的4:1的纯产物。两个主要批次溶于二氯甲烷，合并，减压蒸发并干燥(50℃,0.2mmHg,24h)，得74g(45.7%)的纯产物4，非对映体比率为48:51，其为白色泡沫，mp约75-85℃。
为了制备非对映体混合物的无定形固体，74g的白色泡沫搅拌于叔丁基甲基醚(750mL)，导致部分溶液和胶状固体残渣。搅拌时，缓慢加入庚烷(750ml)，机械搅拌混悬液1小时，至大部分胶转化为白色固体。固体用铲子进行收集，所得浆料过滤。固体以庚烷(4X50ml)洗涤，真空干燥(50℃,0.2mmHg,24h)得白色无定形粉末(64g)，其具有约70-80℃的较宽熔点范围。1H和31P NMR与结构相符，且HPLC显示纯度为99.8%，非对映体比率为46:54(也由31P NMR证实)。
制备4的固体混合物的备选方法。色谱分析后，残渣与二氯甲烷共蒸发两次(5ml/g克)，在35-40℃、35-45mTorr干燥24小时。泡沫残渣过250微米筛，在相同条件下进一步干燥，直至通过顶空GC测定残余二氯甲烷低于400ppm。所得微细灰白色至白色无定形粉末，其玻璃化转变温度为53.7至63.5℃。
异构体(4)混合物的表征:1H-NMR(CDCl3)δ10.05(br s,1H,NH,SP),10.00(br s,1H,NH,RP),7.49(d,1H,C6-H,SP),7.36(m,5H,C6-H,RP,芳香族),7.23-7.14(m,6H,RP/SP,芳香族),6.18(br d,2H,C1'-H,RP/SP),5.63(d,1H,C5-H,SP),5.58(d,1H,C5-H,RP),5.01(m,2H,CH-(CH3)2,RP/SP),4.46-4.33(m,8H,C-5'-H2,ala-NH,C3'-OH,RP/SP),4.12(m,2H,ala-CH-CH3,RP/SP),4.01-3.85(m,4H,C3'-H,C4'-H,RP/SP),1.39-1.22(m,12H,全部CH3,RP/SP).
31P-NMR(CDCl3)δ3.60(RP),3.20Sp相对于三苯基磷酸酯在-17.80ppm.ES-MS M+1530.2.元素分析:计算%(包括0.29%的水，由Karl Fisher分析测定)C,49.75;H,5.54;N,7.90,F,3.58,P,5.84.实测%:C,49.50;H,5.44;N,7.85;F,3.62;P,6.05.
关于异构体分离的讨论
化合物4由于在磷处的手性而包含两种非对映体，表示为SP-4和RP-4。基于SP-4的单晶X-射线分析进行立体化学归属。RP-4和SP-4都提供结晶产物。
结晶过程概述如下。
实施例3.RP-4异构体的结晶
含有第1次洗脱的低极性的RP-4异构体(3.8g,97%纯度)的色谱级分溶于异丙醇(36g)，用庚烷稀释至浑浊（72g）。溶液种晶并在环境温度下搅拌5小时。真空过滤收集所得固体，以庚烷(2x20mL)洗涤，干燥(50℃,0.2mm,24h)至2.3g的非常少的白色针状物，mp136.2-137.8℃。所得物质的HPLC纯度实测为99.02%。
RP-4:1H-NMR(CDCl3)δ9.10(br s,1H,NH),7.36(m,2H,o-芳香族),7.26-7.16(m,4H,C6-H,m,p-芳香族),6.16(br d,1H,C1'-H),5.58(d,1H,C5-H),5.01(sept,1H,CH-(CH3)2),4.52-4.47(m,2H,C-5'-H2),4.10(d,1H,C3'-H),4.02-3.76(m,4H,ala-NH,C3'-OH,C4'-H,ala-CH-CH3),1.37-1.20(m,12H,所有CH3).
实施例4.SP-4的制备和结晶
方法1:粗产物4直接沉淀：在室温下，向L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(10.5g,61.5mmol,沸腾干燥，两次，每次加甲苯50mL)在二氯甲烷(100mL)中的搅拌的溶液中加入二氯磷酸苯酯(7.5mL,50mmol)。混合物冷却至-10℃，而后在30分钟内加入NMI(30.5mL,384.3mmol)在30mL的二氯甲烷中的溶液。添加完成后，混合物在-10和-15℃之间搅拌1小时。向上述混合物中一批加入2'-脱氧-2'-氟-2'-C-甲基尿苷(3)(10g,38.4mmol)，混合物在-10℃之下搅拌3小时，然后缓慢升温至20℃(6h)。混合物在上述温度下搅拌过夜（15h），而后以10ml甲醇淬灭。溶剂蒸发，残渣重新溶于乙酸乙酯（200ml）。乙酸乙酯层用水（100ml），1N HCl(3x75mL),2%碳酸氢钠水溶液（50ml）和盐水（50ml）洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤，浓缩。残渣在高真空下干燥2小时，得白色泡沫(22g)。
上述白色泡沫溶于33ml二氯甲烷，然后加入65ml IPE(异丙基醚)，制成饱和溶液。溶液用Celite小垫过滤，滤液与SP-4晶种在环境温度(约22℃–注意，冷却混悬液至0℃，导致产生油状粗产物)搅拌72小时。白色固体过滤，用IPE(20mL)洗涤，干燥得到4.58g(由31P NMR确定SP-4:RP-4的分别～85:15混合物)白色粉末。上述固体悬浮于23mL的DCM，回流3小时。混合物冷却至室温，搅拌15小时。白色固体过滤，用4.5mL的冷DCM洗涤，在高真空下在45℃干燥得纯SP-4,mp93.9-104.7℃,HPLC纯度99.74%(3.11g,15.2%来自尿苷核苷)。
SP-41H-NMR(CDCl3)δ8.63(br s,1H,NH),7.47(d,1H,C6-H),7.30(m,2H,o-芳香族),7.26-7.18(m,3H,m,p-芳香族),6.18(br d,1H,C1'-H),5.70(d,1H,C5-H),5.02(sept,CH-(CH3)2),4.53(m,2H,C-5'-H2),4.11(d,1H,C3'-H),3.97(m,3H,C3'-OH,C4'-H,ala-CH-CH3),3.77(br s,1H,ala-NH),1.39(d,3H,C2'-CH3),1.37(d,3H,ala-CH3),1.24(d,6H,CH-(CH3)2).
方法2:从粗产物4形成油状物：在室温下，向L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(20.6g,123mmol,沸腾干燥，两次，每次加甲苯75mL)在二氯甲烷(200mL)中的搅拌的溶液中加入二氯磷酸苯酯(14.9mL,100mmol)。混合物冷却至-10℃，而后在30分钟内加入NMI(61.3mL,769mmol)在60mL的二氯甲烷中的溶液。添加完成后，混合物在-10和-15℃之间搅拌1小时。向上述混合物中一批加入2'-脱氧-2'-氟-2'-C-甲基尿苷(3)(20g,76.9mmol)，混合物在-10℃之下搅拌3小时，然后缓慢升温至20℃(6h)。混合物在上述温度下搅拌过夜（15h），而后以10ml甲醇淬灭。溶剂蒸发，残渣重新溶于乙酸乙酯（400ml）。乙酸乙酯层用水（200ml），1N HCl(3x100mL),2%碳酸氢钠水溶液（100ml）和盐水（50ml）洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤，浓缩。残渣在高真空下干燥2小时，得白色泡沫(43g)。在装有机械搅拌器的双颈圆底瓶中，上述泡沫溶于86mL的EtOAc。在搅拌时，缓慢加入100mL庚烷，将混悬液搅拌1小时。倒出上层，残渣和50mL的2:3EtOAc/庚烷溶液再次搅拌10分钟，然后倒出。残渣在高真空下干燥，得白色泡沫（31g）。
上述白色泡沫溶于46ml二氯甲烷，然后加入95ml IPE，制成饱和溶液。溶液用Celite小垫过滤，滤液与SP-4晶种在环境温度搅拌72小时。白色固体过滤，用IPE(30mL)洗涤，干燥得到7.33g(由31P NMR确定SP-4:RP-4的分别～85:15混合物)白色粉末。上述固体悬浮于36mL的DCM，回流3小时。混合物冷却至室温，搅拌15小时。白色固体过滤，用7.5mL的冷DCM洗涤，在高真空下在45℃干燥，得>99%纯度的SP-4,(4.78g,11.6%来自尿苷核苷)。
方法3：粗产物4的硅胶上样法：以和在柱色谱分析步骤前即刻的非对映体混合物类似的方式以约2.5g的2'-脱氧-2'-氟-2'-C-甲基尿苷(3)起始制备5.0g的粗产物4。粗产物溶于10mL的DCM，加入10g硅胶至溶液。溶剂蒸发得到干浆料。浆料和40mL的50%EtOAc/己烷搅拌15分钟，过滤。硅胶用另外10mL的50%EtOAc/己烷洗涤。硅胶然后用15%MeOH/DCM(100mL)洗涤，单独收集。溶剂在高真空下蒸发和干燥，以得到4.0g的残渣（泡沫）。残渣溶于DCM(6mL)，然后加入～9mL的IPE以制成饱和溶液。然后混合物和SP-4晶种在环境温度下温和地搅拌过夜。白色固体过滤，用IPE(5mL)洗涤，得1.28g的产物。31P NMR显示，上述产物含有SP-4:RP-4分别77:23的混合物。从20mL的DCM重结晶以获得0.75g的>99%纯度的SP-4(约12%来自尿苷核苷)。SP-4的上述制备不需要如对混合物那样的甲硅烷化步骤，整个的反应过程如上所述。SP-4的单晶和多晶形式展现在下面。
方法4：40.0g4的1:1的混合物溶于90mL的二氯甲烷。向上述溶液中加入二异丙基醚（70ml），制成饱和溶液。(二异丙基醚的量可基于产物纯度而改变)。上述溶液用纯SP-4(>99%)作晶种，混合物用搅拌棒在室温下温柔地搅拌20小时（观察到2小时后形成固体）。固体过滤，用40mL二异丙基醚/二氯甲烷(1:1)的混合物洗涤，干燥得到白色固体(16.6g,89.35%纯度SP-4，通过NMR)。上述固体悬浮于83mL二氯甲烷中，回流3小时。悬浮液冷却至室温，搅拌过夜。固体过滤，用10mL的冷DCM洗涤。固体真空干燥，得SP-4(13.1g,99.48%纯度，通过HPLC)。11g的该固体在加热条件下重新溶解于330mL的DCM。溶液冷却至室温，并在该温度下放置过夜。结晶产物过滤、干燥得10.5g的SP-4(99.74%，通过HPLC)。
依照第九或第十实施方案，通过使核苷（保护或未保护的）3与异丙基-丙氨酰基-氨基磷酸酯(C和C'的混合物,C或C')反应，可备选地制备化合物SP-4和RP-4，如下列等式所示。
P.D.Howes等Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids（核苷、核苷酸和核酸）2003,Vol.22,Nos.5-8,pp.687-689("Howes")公开通过和叔丁基氯化镁反应而获得的2'-和5'-氨基磷酸酯。此处，Howes公开了当3'-脱氧-胞苷核苷和(S)-2-[氯-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸甲酯在1.2当量的叔丁基氯化镁存在下反应时，发生在2'-位的选择性磷酰化，但是采用另外等量的叔丁基氯化镁发生在5'-位的选择性磷酰化。该公开相反于路线1中公开的那些。
实施例5-1.(S)-2-[(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯的制备
在-78℃下，在20min内向二氯磷酸4-硝基苯酯12.8g,50mmol)在二氯甲烷(100mL)的搅拌的溶液中加入苯酚和三乙胺(7.7mL,55mmol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液。混合物在上述温度下搅拌30分钟，然后在0℃转移至另一含有在二氯甲烷(100mL)中的L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(8.38g,50mmol)的圆底烧瓶中。在15分钟内向混合物中加入第二部分三乙胺(14.6mL,105mmol)。混合物在0℃搅拌1小时，蒸发溶剂。残渣用乙酸乙酯(150mL)磨碎，过滤白色固体。滤液减压浓缩得浅黄色油状物。粗化合物用0-20%乙酸乙酯/己烷梯度进行色谱分离，得产物(17g,83%收率)，其为约1:1比率的非对映体混合物。31P NMR(162MHz,DMSO-d6):δ-0.31,-0.47;1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.31-8.27(m,2H),7.51-7.37(m,4H),7.27-7.19(m,3H),6.70-6.63(m,1H),4.85-4.78(m,1H),3.97-3.86(m,1H),1.21-1.19(m,3H),1.11-1.09(m,6H);MS(ESI)m/z407(M-1)+.31P NMR(162MHz,CDCl3):δ-2.05,-2.10;1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.22(d,J=9.2Hz,2H),7.41-7.33(m,4H),7.26-7.18(m,3H),5.05-4.96(m,1H),4.14-4.05(m,1H),3.93-3.88(m,1H),1.38(d,J=6.8Hz,3H),1.22(dd,J=6.2&3.0Hz,6H);MS(ESI)m/z407(M-1)+.
实施例5-2.SP-4/RP-4的制备
在室温下，在5min内向1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(130mg,0.5mmol)在无水THF(1.5mL)的搅拌的溶液中加入叔丁基氯化镁的1.0M溶液(1.05mL,1.05mmol,2.1当量))。30分钟后，5分钟内逐滴添加(S)-2-[(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(异构体的1:1混合物,408mg,1mmol)在THF(1.5mL)中的溶液。混合物室温下搅拌48小时，而后用NH4Cl饱和水溶液(20mL)淬灭。混合物在乙酸乙酯(50mL)和水(20mL)之间分配。合并的有机萃取物经无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得浅黄色残渣。使用0-2%MeOH/二氯甲烷梯度柱色谱法纯化上述残渣，得白色泡沫状固体(125mg,47%收率,约3.05:1.0比率的SP-4/RP-4混合物)。
实施例6.(S)-2-[(S)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯制备和非-色谱分离
L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(330g,1.97mol)和甲苯(2x400mL)减压共蒸发来预干燥，然后在真空烘箱(50℃,0.2mmHg,17h)干燥。在-60℃内部温度下，在3小时内向二氯磷酸4-硝基苯酯(500.0g,1.953mol)在无水二氯甲烷(3.0L)的搅拌的溶液中加入苯酚(183.8g,1.953mol)和三乙胺(300mL,2.15mol)在二氯甲烷(900mL)中的溶液。混合物在上述温度下再搅拌30分钟，而后在2.5小时内升温至-5℃。在-5～0℃氮气气氛下、在10min内加入预干燥的氨基酸酯。在加料烧瓶中的氨基酯盐残渣通过用二氯甲烷(2x100mL)冲洗而转移到反应混合物中。混合物在0℃搅拌40分钟，在0℃在40分钟内加入第二部分的三乙胺(571mL,4.10mol)。混合物在0～10℃搅拌3小时，然后白色固体(三乙胺盐酸盐)过滤，用二氯甲烷(3x300mL)冲洗。滤液减压浓缩，残渣用甲基叔丁基醚(MTBE,4L)研磨。这样形成的另外的固体盐过滤，用MTBE(3x150mL)冲洗。滤液减压浓缩，得澄清浅褐色油状物。残渣与己烷(2x140mL)共蒸发以去除任何残留MTBE，在40℃进一步真空干燥2小时。干燥残渣与二异丙基醚(IPE,1.1L)混合，在5℃下在冰水浴中搅拌。产物的期望SP-异构体的少量晶种加入到溶液中，混合物在5℃下在22h内搅拌以形成中厚浆料。使其在冷冻器(-10℃)44小时。过滤收集沉淀物，用IPE和己烷(1:1,3x190mL)的预冷却的混合溶剂冲洗。固体在环境温度下真空干燥(0.5mm Hg)至获得恒重，得到227.23g（收率28.5%）白色固体粉末。两种非对映体SP:RP的比率为9.65/1，基于31P NMR(162MHz,DMSO-d6,δ-0.31(SP),-0.47)。产物通过60℃水浴加热下溶于IPE(840mL)进行重结晶。上述溶液在室温下搅拌1小时，而后加入少量的晶体Sp异构体晶种。2小时内形成白色粉末固体，并且将烧瓶置于冷冻器(-10℃)中16小时。获得的白色和微细结晶固体过滤，以预冷却的IPE(3x50mL)洗涤，真空干燥(环境压力,0.5mm Hg)至恒重，得白色松散固体(177.7g,22%总收率，或44%总收率，基于SP异构体的理论收率)，基于31P-NMR，非对映体比率48/1。Mp62-66℃。
31P NMR(162MHz,DMSO-d6):δ-0.31;1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.30-8.27(m,2H),7.49(d,J=8.8Hz,2H),7.41-7.37(m,2H),7.23-7.19(m,3H),6.66(dd,J=13.6,10.0Hz,1H),4.86-4.78(m,1H),3.97-3.86(m,1H),1.19(d,J=7.2Hz,3H),1.10(d,J=6.4Hz,6H);
31P NMR(162MHz,CDCl3):δ-2.05;(162MHz,DMSO-d6):δ-0.31;1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.22(d,J=9.2Hz,2H),7.41-7.33(m,4H),7.26-7.18(m,3H),5.05-4.96(m,1H),4.14-4.05(m,1H),3.93-3.88(m,1H),1.38(d,J=6.8Hz,3H),1.22(dd,J=6.2&3.0Hz,6H);1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.30-8.27(m,2H),7.49(d,J=8.8Hz,2H),7.41-7.37(m,2H),7.23-7.19(m,3H),6.66(dd,J=13.6,10.0Hz,1H),4.86-4.78(m,1H),3.97-3.86(m,1H),1.19(d,J=7.2Hz,3H),1.10(d,J=6.4Hz,6H)
MS(ESI)m/z407(M-1)+.
8(SP-异构体)的立体化学通过单晶X-射线结晶学测量法证实，参见下面提供的细节。
实施例7.通过SFC分离非对映体混合物(S)-2-[(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯
富集RP-异构体的非对映体混合物(4.8g)的样品进行SFC，其使用ChiralPak AD-H(2x15cm)柱，用在100bar的二氧化碳中的35%异丙醇洗脱。使用在甲醇浓度17mg/mL下的4mL样品的注射上样量。RP-异构体[(S)-2-[(R)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯]首先洗脱。多个实验的合适级分合并，并且减压浓缩以得到：2.9g的RP-异构体[(S)-2-[(R)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯]，其为浅黄色粘性油状物；和1.9g的SP-异构体[(S)-2-[(S)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯]，其为白色固体。RP-异构体的分析数据类似于通过上述结晶方法分离的产物的数据。
(S)-2-[(R)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(8,RP-异构体)的分析数据:31P NMR(162MHz,DMSO-d6):δ-0.47;1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.30-8.27(m,2H),7.46-7.38(m,4H),7.27-7.20(m,3H),6.68(dd,J=13.8,10.2Hz,1H),4.86-4.77(m,1H),3.97-3.86(m,1H),1.20(d,J=7.2Hz,3H),1.10(dd,J=6.2,2.2Hz,6H);MS(ESI)m/z407(M-1)+.
实施例8-1.外消旋2-[(4-氯-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(±)的制备：
在-78℃下，在20min内向二氯磷酸4-氯-苯酯(2.45g,10.0mmol)在二氯甲烷(20mL)中的搅拌的溶液中加入苯酚(0.94g,10mmol)和三乙胺(1.56mL,11mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液。混合物在上述温度下搅拌30分钟，然后在0℃下转移至另一含有在二氯甲烷(50mL)中的L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(1.67g,10mmol)的圆底烧瓶。在15分钟内向混合物中加入第二批的三乙胺(2.92mL,21mmol)。混合物在0℃下搅拌1小时，蒸发溶剂。残渣用乙酸乙酯(30mL)磨碎，过滤得白色固体。滤液减压浓缩得浅黄色油状物。粗化合物使用10-20%乙酸乙酯/己烷梯度进行色谱分离，得产物(2.0g,50%收率)，其为比率为约1:1非对映体混合物。31P NMR(162MHz,CDCl3):δ-1.58,-1.62;1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.06-7.51(m,8H),7.15-7.28(m,2H),7.29-7.47(m,2H),4.0-4.10(m,1H),3.82-3.88(m,3H),1.35-1.36(dd,6H);1.19-1.22(m,3H).MS(ESI)m/z398(M-1)+.如上所述，所得产物通过萃取、结晶或色谱分析纯化。
实施例8-2.2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2基)甲氧基)(苯氧基)-磷酰基氨基)丙酸(S)-异丙酯(4)的制备
在室温下，在15min内向1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(3,2.6g,10mmol)在无水THF(50mL)的搅拌的溶液中加入叔丁基氯化镁(12.4mL,21mmol,2.1当量))的1.7M溶液。在30min后，在10min内逐滴添加外消旋(2-[(4-氯-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(4.08g,10mmol)在THF(15mL)中的溶液。混合物室温下搅拌72小时。真正产物的TLC共斑显示，与起始核苷相比约5%的期望产物已经形成。
实施例9-1.外消旋2-[(2-氯-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(±)的制备.
在-78℃下，在20min内向二氯磷酸2-氯-苯酯(9.8g,40mmol)在二氯甲烷(80mL)中的搅拌的溶液中加入苯酚(3.76g,40mmol)和三乙胺(6.16mL,44mmol)在二氯甲烷(80mL)中的溶液。混合物在上述温度下搅拌30分钟，然后在0℃下转移至另一含有在二氯甲烷(150mL)中的L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(6.7g,40mmol)的圆底烧瓶。在15分钟内向混合物中加入第二部分的三乙胺(11.6mL,84mmol)。混合物在0℃下搅拌1小时，蒸发溶剂。残渣用乙酸乙酯(100mL)磨碎，过滤得白色固体。滤液减压浓缩得浅黄色油状物。粗化合物使用10-20%乙酸乙酯/己烷梯度进行色谱分离，得产物(11.3g,72%收率)，其为比率为约1:1非对映体混合物。31PNMR(162MHz,CDCl3):δ-1.58,-1.61;1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.06-7.51(m,8H),5.02-5.94(m,1H),4.10-4.16(m,1H),3.31-3.94(m,1H),1.18-1.35(m,3H),1.38-1.40(dd,6H);MS(ESI)m/z398(M-1)+.如上所述，所得产物通过萃取、结晶或色谱分析纯化。
实施例9-2.2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2基)甲氧基)(苯氧基)-磷酰基氨基)丙酸(S)-异丙酯的制备
在室温下，在15min内向1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(3,2.6g,10mmol)在无水THF(50mL)的搅拌的溶液中加入叔丁基氯化镁(12.4mL,21mmol,2.1equiv))的1.7M溶液。在30min后，在10min内逐滴添加(2-[(2-氯-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(外消旋4.08g,10mmol)在THF(15mL)中的溶液。混合物室温下搅拌72小时。真正产物的TLC共斑显示，与起始核苷相比约5-10%的期望产物已经形成。
实施例10-1.外消旋2-[(2,3,4,5,6-五氟-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(±)的制备.
在-78℃下，在20min内向二氯磷酸五氟苯酯(6.0g,20mmol)在二氯甲烷(40mL)中的搅拌的溶液中加入苯酚和三乙胺(3.08mL,22mmol)在二氯甲烷(40mL)中的溶液。混合物在上述温度下搅拌30分钟，然后在0℃下转移至另一含有在二氯甲烷(100mL)中的L-丙氨酸异丙酯盐酸盐(3.35g,20mmol)的圆底烧瓶。在15分钟内向混合物中加入第二批的三乙胺(5.84mL,42mmol)。混合物在0℃下搅拌1小时，蒸发溶剂。残渣用乙酸乙酯(60mL)磨碎，过滤得白色固体。滤液减压浓缩得浅黄色油状物，其为比率为约1:1非对映体混合物。31P NMR(162MHz,CDCl3):δ-0.49,-0.58.如上所述，所得产物通过萃取、结晶或色谱分析纯化。
实施例10-2.2-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2基)甲氧基)(苯氧基)-磷酰基氨基)丙酸(S)-异丙酯的制备
在室温下，在15min内向1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(3,2.6g,10mmol)在无水THF(50mL)的搅拌的溶液中加入叔丁基氯化镁(12.4mL,21mmol,2.1equiv))的1.7M溶液。在30min后，在10min内滴加粗制外消旋(2-[(2,3,4,5,6-五氟苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(4.08g,10mmol)在THF(15mL)中的溶液。混合物室温下搅拌72小时。真正产物的TLC共斑显示，与起始核苷相比约40-50%的期望产物已经形成。
C或C'的制备和纯化提供至SP-4或RP-4的直接途径，如下列实施例中所描述。
实施例11.SP-4(32mg-规模)的制备:在室温下在3min的时间内向1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮3(32mg,0.12mmol)在无水THF(1mL)的搅拌溶液中加入叔丁基氯化镁的1M溶液(0.26mL,0.26mmol,2.1当量))。在30min后，在3min的时间内逐滴添加(S)-2-[(S)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(8,SP-异构体)在THF(0.5mL)中的溶液。使混合物在室温下搅拌42h，然后用饱和NH4Cl水溶液(10mL)淬灭。混合物在乙酸乙酯和水之间分配。合并的有机萃取物经无水硫酸钠干燥并浓缩。使用0-4%甲醇/二氯甲烷梯度法对残渣进行层析，以得到SP-4的泡沫状固体(29mg,44.5%收率)。1H和31P NMR和本文公开的情况一致。
实施例12.SP-4(2.6g-规模,未进行层析)的制备:在室温下在15min的时间内向1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(2.6g,10mmol)在无水THF(50mL)的搅拌溶液内加入叔-丁基氯化镁的1.7M溶液(12.4mL,21mmol,2.1当量))。在30min后，在10min的时间内逐滴添加(S)-2-[(S)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(8,SP-异构体,4.08g,10mmol)在THF(15mL)中的溶液。使混合物在室温下搅拌60h，然后用饱和NH4Cl水溶液(20mL)淬灭。混合物在乙酸乙酯(150mL)和依次的10%水性Na2CO3(3x20mL)与水(20mL)之间分配。合并的有机萃取物经无水硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩，以得到浅黄色残渣(3.8g)。将残渣溶解于二氯甲烷(7.6mL)，然后在室温下搅拌20h。将白色固体过滤，并且用1:1IPE/二氯甲烷(5mL)洗涤，真空干燥以得到纯的产物的白色固体(1.85g,35%收率)。
实施例13.使用NaHMDS制备SP-4:在-78℃下在2min的时间内向1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(71mg,0.27mmol)在无水THF(2.0mL)的搅拌溶液中加入双(三甲基甲硅烷基)酰胺钠(NaHMDS)在THF(270μL,0.54mmol)中的2.0M溶液。在30min后，将(S)-2-[(S)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]-丙酸异丙酯(8,SP-异构体,111mg,0.27mmol)在THF(1mL)中的溶液加入混合物中。使反应混合物在该温度下搅拌2h，然后加热至-20℃，在该温度下将其搅拌另外20h。TLC表明～30%的未反应的核苷初始物质。因此，将另外0.5当量的在THF(0.5mL)中的试剂(55mg,0.14mmol)加入反应混合物，并且搅拌另外6h。将反应混合物用饱和水性氯化铵溶液淬灭，然后分配在乙酸乙酯和水之间。合并的有机萃取物经无水硫酸钠干燥并浓缩，以得到浅褐色残渣。使用0-5%甲醇/二氯甲烷梯度进行粗产物的柱层析，以得到SP-4(22mg,15%收率),3'-氨基磷酸酯(5,SP-异构体,11.5mg,16%收率)和双氨基磷酸酯(6,SP,SP-异构体,12.6mg)。
实施例14.RP-4(260mg-规格)的制备:在室温下在5min的时间内向1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2,4-二酮(260mg,1mmol)在无水THF(6mL)的搅拌溶液中加入叔-丁基氯化镁的1.7M溶液(1.23mL,2.1mmol,2.1当量)。在30min后，在3min的时间内逐滴添加(S)-2-[(R)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(8,RP-异构体)在THF(3mL)中的溶液。使混合物在室温下搅拌96h，然后使用饱和NH4Cl水溶液(10mL)淬灭。混合物在乙酸乙酯(50mL)和水(2x20mL)之间分配。合并的有机萃取物经无水硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩，以得到浅黄色残渣(490mg)。使用0-5%甲醇/二氯甲烷梯度对残渣进行层析，以得到产物的白色固体(160mg,30%收率)。
SP-4或RP-4的制备还可以通过下列方式来实现：使3'-保护的3和合适的试剂C或C'、或者含有C和C'的混合物进行反应，如下列实施例中所描述。
实施例15.使用作为合成中间体的3a制备SP-4
实施例15-1.5'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2'-脱氧-2'-氟-2'-C-甲基尿苷(9)的合成:
在环境温度下，在45min内向2'-脱氧-2'-氟-2'-C-甲基尿苷(3,81.1g,312mmol)在无水吡啶(750mL)的搅拌的溶液滴加TBDMSCl(103.19g,685.6mmol)在无水吡啶(500mL)中的溶液。反应在环境温度下搅拌24小时。加入甲醇（85ml）至反应混合物中，搅拌10分钟，然后减压蒸馏溶剂。加入热水(45℃)(1L)至反应物中，混合物用乙酸乙酯(2x500mL)萃取，用水(1x500mL)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥。蒸馏出乙酸乙酯，所得残渣和甲苯(2x500mL)共蒸发，得到白色泡沫状粗产物9。收率=116.9g(定量).1H NMR(CDCl3,300MHz):δ0.1(s,6H),0.91(s,9H),1.22(d,3H,J=21Hz),2.50(s,2H),3.75-4.05(m,4H),5.54(d,1H,J=9Hz),5.73(s,1H),6.0(d,1H,J=18Hz),7.81(d,1H,J=9Hz),8.57(br,s,1H),11.1(s,1H).
实施例15-2.5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3'-O-乙酰丙酰基-2'-脱氧-2'-氟2'-C-甲基-尿苷(10)的合成:
向核苷9(116.9g,312.1mmol)在DCM(1L)的搅拌的溶液中加入DMAP(30.5g,249.7mmol)，使其在室温下搅拌20min。乙酰酐(133.6g,642.3mmol)在DCM(200mL)中的溶液加入混合物，并搅拌24h。混合物的TLC表明反应完全。加入冷水（500ml），混合物搅拌20分钟。分层，有机层用饱和碳酸氢钠溶液(2x250mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后溶剂减压蒸馏，得黄色油状物。粗产物收率：197.6g(135%)。原料用于以下步骤。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ0.11(s,6H),0.94(s,9H),1.34(d,3H,J=21Hz),2.22(s,3H),2.6-2.89(m,4H),3.72(m,1H),4.01(d,1H,J=12Hz),4.23(d,1H,J=9Hz),5.33(dd,1H,J=15Hz),5.73(d,1H,J=6Hz),6.26(d,1H,J=15Hz),8.12(d,1H,J=12Hz),8.72(br,s,1H).
实施例15-3.3'-O-乙酰丙酰基-2'-脱氧-2'-氟2'-C-甲基-尿苷(3a)的合成:
粗产物10(197.6g,～312.1mmol)溶于DCM(1L)，其中加入TEA.3HF(50.3g,312.1mmol)，使它们在环境温度搅拌过夜。混合物的TLC表明约50%反应完全。加入另外相等的TEA.3HF(50.3g,312.1mmol)，搅拌6h。此时TLC表明约10%未反应的初始物质，加入另外0.25eq的TEA.3HF(12.5g,78.0mmol)，反应混合物搅拌过夜。反应混合物浓缩至干，得到黄色油状物。所有批次的粗产物用柱色谱分析在硅胶上纯化(0-2%MeOH，在DCM中)，得到124.1g的3'-乙酸酯，其为白色泡沫固体(90%纯化收率，相对于来自2'-脱氧-2'-氟-2'-C-甲基尿苷的三个步骤)。1H NMR:(CDCl3,400MHz)δ1.55(d,3H,CH3,J=20Hz),2.36(s,3H,CH3),2.8-3.03(m,5H,CH2CH3),3.91-3.96(dd,1H,CH″),4.2-4.25(m,1H,CH'),4.34(dd,1H,CH,J=8Hz),5.25(dd,1H,J=16Hz),5.93(d,1H,J=8Hz),8.20(d,1H,J=8Hz),9.18(s,1H).
实施例15-4.立体选择合成(S)-2-{[(1R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢-2H-嘧啶-1-基)-4-(R)-氟-3-(4-氧代戊酰基)-4-甲基-四氢-呋喃-2-基甲氧基]-苯氧基-磷酰基氨基}-丙酸(S)-异丙酯(11):
向核苷(3a,1.00mmol,358mg)在5ml无水THF(冷却至0℃)的溶液中加入tBuMgCl(1.7M，在THF中,2eq)，使其加热至环境温度，搅拌半小时。向混合物中一批加入试剂(约97%手性纯度)(S)-2-[(S)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]丙酸异丙酯(8,SP-异构体)(408mg,1.00mmol,1.00eq.)，在室温搅拌。在16h后，剩余～30%起始物质。反应混合物用NH4Cl饱和水溶液10ml淬灭，水相用乙酸乙酯(3x25ml)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥，蒸发至干，得到浅黄色泡沫(500mg)。其通过硅胶色谱分析使用在二氯甲烷2-5%甲醇来纯化，得到白色泡沫产物(275mg)，约97%P手性纯度，以及未反应的起始物质(162mg)。基于消耗的起始物质，收率为76%。31P NMR(CDCl3,162MHz):3.7ppm;1H NMR(CDCl3,400MHz):δ1.22(dd,6H,J=6.4Hz),1.37(s,3H),1.58(s,3H),2.18(s,3H),2.63-2.9(m,4H),4.0(d,1H,J=8Hz),4.2-4.33(m,1H),4.57(d,1H,J=8Hz),4.96-5.00(sept,1H),5.2(dd,1H,J=9Hz),5.42(d,1H,J=8Hz),6.19(d,1H,J=18Hz),7.15-7.35(m,5H),7.5(d,1H,J=5.6Hz),8.2(br,s,1H).
实施例15-5.合成(S)-2-{[(1R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢-2H-嘧啶-1-基)-4-(R)-氟-3-羟基-4-甲基-四氢-呋喃-2-基甲氧基]-苯氧基-磷酰基氨基}-丙酸(S)-异丙酯(SP-4)
通过将Na2S2O3(1.51g)和Na2S2O5(0.57g)加入水(25mL)中制备亚硫酸钠溶液。向乙酰丙酸酯(11,250mg,0.40mmol)在无水THF(2.5mL)中的溶液中加入1.0ml的亚硫酸钠溶液。室温搅拌4h。反应混合物倒入水(15mL)中，用乙酸乙酯(3x25mL)萃取，干燥，蒸发，得到定量白色固体产物，约97%P手性纯度，这与直接从未保护的核苷制备的SP-4的物理和光谱性质相匹配。
实施例16.从3a制备SP-4的备选方法
在室温下，在2min内向4-氧代-戊酸(2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢-2H-嘧啶-1-基)-4-氟-2-羟基甲基-4-甲基-四氢-呋喃-3-基酯(3a,210mg,0.59mmol)在无水THF(1.5mL)的搅拌的溶液中加入叔丁基氯化镁(1.07mL,1.82mmol)的1.7M溶液。起初观察到白色沉淀，在10min后，反应混合物转为暗黄色溶液。在30min后，在3min内逐滴添加(S)-2-[(S)-(4-硝基苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]-丙酸异丙酯(8(SP-异构体),382mg,0.94mmol)在THF(1.5mL)中的溶液。混合物在40℃加热5h，此时TLC和1H NMR表明少于2%的未反应的起始物质。反应用饱和氯化铵水溶液淬灭，然后分配在乙酸乙酯和水之间。合并的有机层用10%Na2CO3水溶液(3x10mL)、接着用水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，浓缩得到褐色残渣(410mg)。粗产物溶于四氢呋喃(1.0mL)，然后加入亚硫酸钠(37mg,0.295mmol)和焦亚硫酸钠(224mg,1.18mmol)的混合物在1mL水中的水溶液。混合物在45℃加热20h，此时通过TLC观察到仅转化约10%，因此，加入另外的亚硫酸钠(74mg)和焦亚硫酸钠(448mg)，持续加热另外的52h。此时，通过TLC观察到约40%转化。反应混合物分配在水和乙酸乙酯之间。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，浓缩得到褐色残渣(210mg)。使用0-5%MeOH/DCM梯度的残渣的柱色谱分析提供未反应的起始物质(89mg)和SP-4(57mg,18%收率,24%，基于回收的起始物质)。
实施例17.以3c作为合成中间体的制备
实施例17-1.制备1-[(2R,3R,4R,5R)-4-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-3-氟-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮,12。
向3(10.0g,38.43mmol)在吡啶(50mL)的溶液中加入二氯甲烷(50mL)。溶液冷却至0℃。向溶液中加入4,4'-二甲氧基三苯甲基氯化物(14.32g,42.27mmol)，溶液在0℃搅拌5h。甲醇(5mL)加入以淬灭反应。溶液减压浓缩至干，残渣分配在乙酸乙酯(500mL)和水(50mL)之间。有机溶液用盐水(50mL)洗涤，干燥(硫酸钠,4g)。溶剂减压除去，残渣溶于二氯甲烷(100mL)。向溶液中加入咪唑(7.83g,115mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物(8.68g,57.6mmol)。溶液在环境温度搅拌16h。甲醇加入以淬灭反应(5mL)，溶剂减压除去，残渣分配在乙酸乙酯(500mL)和水(50mL)之间。有机溶液干燥(硫酸钠,4g)，减压蒸发。残渣通过柱色谱分析(10-40%EtOAc，在己烷中)纯化，得到5'-O-DMT-3'-O-tBDMS中间体产物。这进而用在二氯甲烷(200mL)中的1%三氟乙酸来处理。溶液在环境温度搅拌1h。加入水(20mL)，溶液在环境温度搅拌另外1h。缓慢加入甲醇(5mL)，溶液在环境温度搅拌另外1h。加入氢氧化铵以调节溶液pH至7。有机溶液分离，干燥(硫酸钠,4g)，减压蒸发至干。残渣通过硅胶柱色谱分析(1-5%甲醇，在二氯甲烷中)纯化，得到白色固体127.5g，50%收率，相对于三个步骤。1H NMR(DMSO-d6)δ(ppm)11.48(br s,1H,NH),7.94(d,1H,H-6),6.00(d,1H,H-1’),5.69(d,1H,H-5),4.06(dd,1H,3’-H),3.85(m,2H,H-5’a,H-4’),3.58(br d,1H,H-5’b),1.27(d,3H,2-CH3),0.89(s,9H,C(CH3)3),0.12(s,6H,Si(CH3)2).
实施例17-2.使用1-[(2R,3R,4R,5R)-4-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-3-氟-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮(3c)制备SP-4
在室温下，在2min内向1-[(2R,3R,4R,5R)-4-(叔丁基二甲基硅烷基氧基)-3-氟-5-羟基甲基-3-甲基-四氢-呋喃-2-基]-1H-嘧啶-2,4-二酮(12,374mg,1mmol)在无水THF(3mL)的搅拌的溶液中加入叔丁基氯化镁(1.8mL,3.1mmol))的1.7M溶液。起初观察到白色沉淀，在10min后，反应混合物转为清澈暗黄色溶液。在30min后，在3min内逐滴添加(S)-2-[(S)-(4-硝基苯氧基)-苯氧基-磷酰基氨基]-丙酸异丙酯(8,SP-异构体,653mg,1.6mmol)在THF(2.5mL)中的溶液。混合物在40℃加热20h，此时TLC和1HNMR表明少于5%的未反应的起始物质。反应混合物用饱和氯化铵水溶液淬灭，然后分配在乙酸乙酯和水之间。有机层用10%Na2CO3水溶液(3x10mL)、接着用水(20mL)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，浓缩得到含有3c的褐色残渣(850mg)。粗产物溶于四氢呋喃(2mL)，然后在室温下加入0.8mL的80%甲酸水溶液。反应混合物在50℃加热96h。通过TLC观察到转化约70%。反应混合物倒入冷的饱和碳酸氢钠水溶液，分配在乙酸乙酯和水之间。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，浓缩以得到褐色残渣(220mg)。使用0-5%MeOH/DCM梯度的残渣的柱色谱分析提供未反应的起始物质(21mg)和SP-4(77mg,35%收率,39%收率，基于回收的起始物质)。
实施例18.以3d作为合成中间体制备SP-4
实施例18-1.3d的制备
在0℃下，在15min内向3在吡啶(20mL)的搅拌的溶液中逐滴添加TIPDS-Cl。混合物缓慢加热至室温，在该温度搅拌16小时。蒸发吡啶，残渣和甲苯(50mL)共蒸发，然后残渣用己烷研磨，使用Celite垫过滤白色沉淀。滤液减压浓缩，得到泡沫状固体(12.97g)。粗产物(13)重新溶于四氢呋喃(75mL)，在0℃下在20min内加入TFA(75mL,1:1TFA/水)水溶液。混合物在该温度搅拌6h。TLC表明～5%的起始物质。反应混合物用NaHCO3饱和水溶液淬灭，直到pH8，然后用乙酸乙酯萃取。合并的有机萃取物用水洗涤，浓缩得到白色结晶固体。用己烷(30mL)对固体进行另外的研磨，得到白色固体，其过滤和高真空干燥得到3d(10.1g,84%收率，相对于2个步骤).1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.83(bs,1H),7.94(bd,J=6.0Hz,1H),6.10(bd,J=18.4Hz,1H),5.71(d,J=8.2Hz,1H),4.43(bs,1H),4.36(dd,J=22.6,9.0Hz,1H),4.27(bs,1H),4.10(d,J=13.2Hz,1H),4.03(d,J=9.2Hz,1H),3.92(d,J=13.2Hz,1H),1.39(d,J=22.0Hz,3H),1.11-0.92(m,28H).
实施例18-2.SP-4的制备
在室温下，在15min内向3d(520mg,1mmol)在无水THF(5mL)的搅拌的溶液中加入叔丁基氯化镁(1.8mL,3.1mmol,3.1当量))的1.7M溶液。在30min后，在3min内逐滴添加(S)-2-[(S)-(4-硝基-苯氧基)-苯氧基磷酰基氨基]丙酸异丙酯(8,SP-异构体,653mg,1.6mmol)在THF(1mL)中的溶液。混合物在室温搅拌60h。粗样品的1H和31P NMR表明约1:0.76的非对映体混合物。反应混合物用NH4Cl饱和水溶液(20mL)淬灭。混合物分配在乙酸乙酯(150mL)和随后10%Na2CO3水溶液(3x20mL)与(20mL)之间。合并的有机萃取物用水洗涤，过滤，减压浓缩得到浅黄色残渣(14,878mg)。
上述化合物14重新溶于四氢呋喃(3mL)，然后加入80%甲酸水溶液。混合物在55℃加热20h。反应混合物冷却至0℃，然后用碳酸氢钠饱和水溶液(pH7.0)淬灭。然后反应混合物分配在乙酸乙酯和水之间。合并的有机层经硫酸钠干燥，浓缩得到560mg的残渣。使用0-5%甲醇/二氯甲烷梯度的残渣的色谱分离提供未反应的起始物质(14,242mg)和SP-4(80mg,15%收率)白色固体。
实施例19.制备同位素标记的SP-4
实施例19-1.制备1-((6aR,8R,9R,9aS)-9-羟基-2,2,4,4-四异丙基四氢-6H-氟[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧杂二硅-8-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮,16
尿苷(15,100.0g,409.5mmol)和无水吡啶(600mL)共蒸发至干，重新混悬到无水吡啶(700mL)。在环境温度下在60min内向该搅拌的微细混悬液中加入1,3-二氯-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷(135.7g,482.5mmol)。在环境温度下搅拌微细混悬液17h后，反应通过加入甲醇(20mL)来淬灭，然后减压浓缩。残渣分配在乙酸乙酯(1.5L)和水(2L)之间。有机层进一步用5%盐酸(2x1L),盐水(500mL)洗涤，经固体硫酸钠(50g)干燥，过滤，减压浓缩至粗产物,约250g。使用硅胶(1.75kg)和乙酸乙酯在己烷中的梯度20-65%使残渣进行过滤柱色谱。纯产物级分通过均匀TLC(Rf0.55，在1:1己烷-乙酸乙酯中)判断，合并，减压浓缩，干燥(40℃,0.2mm Hg,24h)以提供145.5g(76%)的16白色泡沫固体。还收集另外级分(35g)少量杂质16。1H NMR(DMSO-d6)δ(ppm)11.35(s,1H,NH),7.66(d,1H,J=7.6Hz,H-6),5.57(d,1H,J=4.8Hz,2'-OH),5.50-5.49(m,2H,1'-H和H-5),4.14-4.18(m,3H,2',3',4'-H),3.97-3.87(m,2H,5'-Ha和Hb),1.02-0.95(m,28H,CH(CH3)2).
实施例19-2.制备1-((6aR,8R,9aR)-2,2,4,4-四异丙基-9-氧代四氢-6H-氟[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧杂二硅-8-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮,17
向干燥三颈圆底烧瓶中加入无水DCM(600mL)和DMSO(30.82g,394.5mmol)。溶液在干冰/丙酮浴中在氮气气氛下冷却至-78℃。三氟乙酸酐(纯,77.7g,369.8mmol)通过注射器在40min内加入，得到浑浊混合物。在-78℃下，在75min内通过加料漏斗向混合物中逐滴添加尿苷衍生物16在DCM(600mL)中的溶液。均匀混合物在-78～-65℃下搅拌2h，然后无水三乙胺(92mL)通过注射器快色加入以形成清澈亮黄色溶液。在低温1小时后，通过TLC(30%EtOAc，在己烷中)示出反应完全。除去冷却浴，反应混合物在1h内缓慢加热至环境温度。反应通过加入NH4Cl饱和水溶液(180mL)来淬灭。加入水(200mL)，并且分离有机层。水层再次用DCM(300mL)萃取。合并的有机层用水(3x400mL),盐水(150mL)洗涤，经Na2SO4干燥。除去溶剂得到粘性褐色残渣。
粗油状产物残渣(含痕迹量的DCM)在冷冻器中储存过夜。在过夜后，在油中观察到一些晶体固体。在环境温度下油溶于500ml己烷。溶液在冷冻器中储存24小时，形成更多固体。通过过滤收集固体，用在己烷(1L)中的冷10%DCM冲洗，以除去大部分橙色。固体(17)真空干燥2h，然后空气干燥24h。在50℃下真空干燥后固体称重21g。滤液浓缩，残渣通过柱色谱分析(10-70%乙酸乙酯，在己烷中)纯化，以提供另外37g(合并收率97%)17亮橙色固体。
实施例19-3.制备1-((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)-3-13C-全氘甲基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮,18
镁(3.53g,147mmol)用5%盐酸水溶液洗涤和干燥(50℃,0.2mm Hg,24h)，然后置于装有机械搅拌器和冷凝管的两颈圆底烧瓶中。烧瓶填充氩气，加入无水醚(80mL)。向醚中的镁缓慢加入全氘-13C甲基碘化物(15.06g,110.3mmol)，其产生放热反应。在反应混合物冷却后，在-50℃下在20min内将上清转移至干燥化合物17(50℃,0.2mm Hg,15h)(10.0g,20.63mmol)在无水THF(1L)的溶液。温度升至-40℃，混合物在-40至-25℃搅拌4h。在反应完成后，在-50℃混合物用EtOAc(1L)稀释，然后缓慢加入盐水(300mL)。有机层分离，然后用氯化铵饱和水溶液(300mL x2)洗涤，经硫酸钠干燥。在过滤和减压浓缩后，残渣溶于MeOH(250mL)。加入氟化铵(12g)和TBAF(400mg)。所得混合物在90℃下搅拌7h，然后用硅胶(20g)减压浓缩。在彻底真空干燥后，所得残渣通过快速硅胶柱色谱(MeOH:CH2Cl2=1:20至1:10)纯化，得到化合物18(5g,46%)白色固体。1H NMR(DMSO-d6)δ(ppm)11.26(s,1H,NH),7.65(d,1H,J=8.4Hz,H-6),5.77(d,1H,J=2.4Hz,H-1'),5.57(d,1H,J=8.0Hz,H-5),5.46(d,1H,J=5.2Hz,HO-3'),5.24(d,1H,J=2.4Hz,HO-2'),5.14(t,1H,J=5.6Hz,HO-5'),3.74-3.56(m,4H,H-3',4',5',5″).
实施例19-4.制备((2R,3R,4S,5R)-3-乙酰氧基-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-羟基-4-13C-全氘甲基四氢呋喃-2-基)甲基乙酸酯,19
在环境温度下向化合物18(5.00g,19.1mmol)在无水吡啶(100mL)的溶液中加入乙酸酐(3mL)。所得混合物在环境温度搅拌15h，用EtOAc(250mL)稀释，用水(50mL x3)洗涤，并经硫酸钠干燥。在过滤和浓缩后，残渣通过快速硅胶柱色谱(MeOH0至5%，在CH2Cl2中)纯化，得到化合物19(4.0g,68%)灰色固体。
实施例19-5.制备((2R,3R,4R,5R)-3-乙酰氧基-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-4-13C-全氘甲基四氢呋喃-2-基)甲基乙酸酯,20
在-78℃下缓慢向化合物19(2.33g,6.73mmol)在无水CH2Cl2(60mL)的溶液中加入DAST(1.33mL,10.1mmol)。在接触环境温度后，所得混合物搅拌30min。精确地按照相同方式进行另外两个2.33g级别反应和一个1.00g级别反应。所有四种反应混合物合并，用CH2Cl2(300mL)稀释，用冰水(100mL x2)和冷NaHCO3水溶液(100mL x2)洗涤。在干燥后，过滤和浓缩，残渣通过快速硅胶柱色谱分析(EtOAc0%至50%，在己烷中，化合物析出约48%)纯化，得到化合物20(2.0g,24%，来自总7.99g化合物19)白色固体。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)8.27(s,1H,NH),7.55(d,1H,J=8.4Hz,H-6),6.17(d,1H,J=18.8Hz,H-1'),5.78(dd,1H,J=1.2,8.4Hz,H-5),5.12(dd,1H,J=9.6,21.6Hz,H-3'),4.40-4.31(m,3H,H-4',5',5″),2.19(s,3H,CH3),2.15(s,3H,CH3).
实施例19-6.制备1-((2R,3R,4R,5R)-3-氟-4-羟基-5-(羟基甲基)-3-13C-全氘甲基四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮,21
向化合物20(2g,5.74mmol)在甲醇(20mL)的溶液中加入正丁基胺(6mL)。所得混合物室温搅拌15h，硅胶真空浓缩。所得残渣通过快速硅胶柱色谱(MeOH0至10%，在CH2Cl2中)纯化，得到化合物21(1.3g,85%)白色固体。1H NMR(CD3OD)δ(ppm)8.08(d,1H,J=8.0Hz,H-6),6.13(d,1H,J=18.4Hz,H-1'),5.70(d,1H,J=8.0Hz,H-5),3.99(d,1H,J=13.6Hz,H-5'),3.97-3.91(m,2H,H-3',4'),3.80(dd,1H,J=2.0,12.8Hz,H-5″),ESMS(M+1)估计265,观察到265。
实施例19-7.制备2-((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-13C-全氘甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基氨基)丙酸(S)-异丙酯,22
在0℃下，向未保护的核苷21(207mg,0.783mmol)和N-甲基咪唑(0.4ml,5mmol)在THF(4mL)的溶液中逐滴添加在THF(1.0M,2.35ml,2.35mmol)中的预制的氯磷酸酯。1小时内反应缓慢加热至环境温度，然后加入水(1mL)和EtOAc(5mL)。有机溶液用饱和柠檬酸一钠饱和水溶液(2x2ml)、NaHCO3饱和水溶液(1x2ml)洗涤，干燥(MgSO4)，减压浓缩。粗产物通过硅胶柱色谱使用0至5%iPrOH(在CH2Cl2中)作为洗脱液来纯化，得到氨基磷酸酯22(216mg,52%,P-非对映体的1:1混合物)白色固体:1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.54(s,1H),7.56(d,J=6.8Hz,1H),7.40-7.35(m,2H),7.23-7.18(m,3H),6.14-5.96(m,2H),5.89(dd,J=5.6,25.6Hz,1H),5.55(t,J=8.4Hz,1H),4.85(dq,J=1.6,6.0Hz,1H),4.44-4.32(m,1H),4.25(m,1H),4.06-3.98(m,1H),3.86-3.70(m,2H),1.30-1.08(m,9H);31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ4.90,4.77;LRMS(ESI)[M+H]+计算C21 13CH27D3FN3O9P534.5,测得534.4.
实施例19-8.制备(2S)-2-(((((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基-4-13C-全氘甲基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(羟基)磷酰基)氨基)丙酸,23
氨基磷酸酯22(147mg,0.276mmol)悬浮于三乙胺(2mL)和水(0.5mL)，在60℃加热30h。然后，减压蒸发挥发性成分。粗产物通过硅胶柱色谱使用50-70%iPrOH(在CH2Cl2)洗脱、然后用0至20%NH4OH(在iPrOH)洗脱来纯化，得到23白色固体(95mg,83%):1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.00(d,J=8.4Hz,1H),5.98(d,J=19.2Hz,1H),5.52(d,J=8.4Hz,1H),4.02-3.81(m,4H),1.10(d,J=6.8Hz,3H);31P NMR(162MHz,DMSO-d6)δ8.12;LRMS(ESI)[M+H]+计算C12 13CH17D3FN3O9P416.3,测得416.4.
样品RP-4,4和SP-4的性质
样品RP-4,4和SP-4通过下列进行分析：X-射线粉末衍射(XRPD),核磁共振(NMR)光谱法,傅立叶变换红外(FT-IR)光谱法,差示扫描量热法(DSC),热重量测定分析法(TGA),重量测定蒸气吸附(GVS),热动力学水溶解度和高效液相色谱法(HPLC)。
实施例20.X-射线粉末衍射
RP-4,4和SP-4的样品通过X-射线粉末衍射(XRPD)以下列方案进行分析。
a.Bruker AXS/Siemens D5000
X-射线粉末衍射图谱在下列设备上进行收集：Siemens D5000衍射仪，所述衍射仪使用Cu Kα辐射(40kV,40mA),θ-θ测角器,V20的发散度，接收缝隙，石墨次级单色器和闪烁计数器。所述装置使用认证的刚玉标准(NIST1976)来进行性能检查。用于数据收集的软件是Diffrac Plus XRPDCommander v2.3.1，并且数据使用Diffrac Plus EVA v11.0.0.2或v13.0.0.2来进行分析和呈现。
环境条件
在环境条件下运行的样品被使用原样粉末制备为平板样本。约35mg的样品被轻轻地挤进腔室中，被切成抛光、零背景(510)硅晶片。在分析过程中样品沿其自身平面进行旋转。数据收集的细节为：角度范围:2至42°2θ;步长:0.05°2θ;以及收集时间:4s.步-1。
b.Bruker AXS C2GADDS
X-射线粉末衍射图谱在下列设备上进行收集：Bruker AXS C2GADDS衍射仪，所述衍射仪使用Cu Kα辐射(40kV,40mA),自动XYZ行程,用于自动样品定位的激光视频显微镜和HiStar2-维区域检测器。X-射线光学仪器包括耦合0.3mm的针孔型准直器的单多层镜。
光束发散度，即X-射线光束在样品上的有效尺寸，为约4mm。θ-θ连续扫描模式用于样品-检测器距离为20cm，其提供3.2°–29.7°的有效的2θ范围。典型地，样品暴露于X-射线光束120秒。用于数据收集的软件是GADDS(WNT4.1.16)，并且数据使用Diffrac Plus EVA v9.0.0.2或v13.0.0.2来进行分析和呈现。
环境条件
在环境条件下运行的样品被使用原样粉末制备为平板样本，而无需研磨。约1-2mg的样品被轻微地挤压在载玻片上以获得平坦表面。
X-射线粉末衍射(XRPD)
4通过XRPD确定为无定形的(参见图1)。根据实施例3制备的RP-4的高分辨率XRPD分析证实结晶固体，其表现出和SP-4(根据实施例4方法4制备)不同的粉末图谱，所述SP-4也证实是结晶固体。对于RP-4和SP-4的XRPD结果列表示于表1，其中排除所有显现出强度≤5%(RP-4)和≤3%(SP-4)的峰。
表1.RP-4和SP-4的XRPD数据
SP-4的样品用杵和钵研磨，并且然后连续地穿过500和250μm的筛，从而产生微细粉末的样品。将该样品通过高分辨率XRPD重新分析，证实没有发生形式改变。
实施例21.SP-4的结晶研究.
结晶SP-4显现出多晶型。因此，该方面涉及结晶SP-4及其个体多晶型形式。SP-4可存在为至少5种多晶型形式，表示为形式1-5。而且，还可以制备无定形的SP-4。典型结晶提供：溶解约100mg的SP-4在合适体积的结晶溶剂(乙腈(5vol),氯仿(5vol),乙酸正丁酯(7vol),二氯甲烷(50vol),苯甲醚(7vol)和1:1MTBE/庚烷(50vol))中，然后使溶液在5℃下蒸发。获得各种结晶形式，但是在过滤和/或干燥时，各种形式得到形式1。
形式1、2和3分别是非-溶剂化物形式、1:1DCM溶剂化物和1:1氯仿溶剂化物，这通过单晶X-射线和XRPD分析来证实。形式4和5分别得自SP-4从乙腈和苯甲醚的溶液的结晶。不能收集足够的数据来确定形式4和5是未溶剂化物、水合物还是溶剂化物，因为无法获得足够量的单晶。形式4和5在过滤时转化为形式1。在SP-4从乙酸正丁酯(nBuAc)和含有甲基-叔丁基醚(MTBE)与庚烷的溶液中结晶时获得两种另外的结晶形式；在过滤时这两种结晶形式转化为形式1。形式2和3在分离时也转化为形式1。形式1是非-溶剂化物形式，其显现出较宽的熔融吸热性，起始温度为94.3℃，并且ΔHfus为24.0kJ mol-1。SP-4形式1的另外XRPD图谱示于图4。
实施例21-1.SP-4形式1
SP-4形式1的峰列表展示在表2中。
角 强度%
2-θ° %
5.0 74.8
7.3 100.0
7.8 2.2
8.2 6.8
8.8 9.3
9.4 23.5
10.0 8.4
11.4 4.2
13.3 3.0
14.2 6.1
14.9 3.5
16.1 7.9
角 强度%
2-θ° %
16.6 13.2
17.3 15.4
17.7 10.1
18.1 42.6
18.4 7.6
18.7 11.4
18.9 5.7
19.3 5.0
19.6 2.9
20.2 8.5
20.5 11.5
20.8 3.6
21.8 7.2
22.0 14.5
22.4 9.6
23.2 5.3
23.4 5.8
23.5 4.6
23.8 7.4
24.0 3.1
24.7 2.5
25.0 13.0
25.5 3.1
26.6 4.5
27.2 3.2
27.5 2.2
28.1 2.9
30.0 3.2
实施例21-2.SP-4形式2
SP-4形式2的XRPD图谱示于图5。
SP-4形式2的峰列表展现在表3中。
角 强度%
2-θ° %
4.9 44.1
5.1 19.1
6.9 62.1
8.7 6.8
角 强度%
2-θ° %
9.8 28.6
10.1 10.4
13.7 7.0
16.7 3.1
19.5 8.9
19.8 45.5
20.1 18.6
20.4 3.6
20.6 25.6
20.9 15.9
21.1 10.9
22.1 3.4
24.6 38.7
24.7 100.0
25.1 61.2
26.1 53.3
39.0 6.3
实施例21-3.SP-4形式3
SP-4形式3的XRPD图谱示于图6。
SP-4形式3的峰列表展现在表4中。
角 强度%
2-θ° %
5.0 10.0
6.9 23.3
9.8 22.6
19.7 34.8
20.6 100.0
21.8 10.5
24.6 65.3
34.7 4.1
实施例21-4.SP-5形式4
SP-4形式4的XRPD图谱示于图7。
SP-4形式4的峰列表展现在表5中。
角 强度%
2-θ° %
5.0 29.8
6.8 100.0
8.2 4.8
8.7 5.2
9.9 3.8
13.7 1.7
14.9 4.8
19.9 22.5
20.4 2.1
20.6 20.0
20.9 20.0
24.7 3.4
24.9 29.9
25.1 1.5
36.8 3.1
实施例21-5.SP-4形式5
SP-4形式5的XRPD图谱示于图8。
SP-4形式5的峰列表展示在表6中。
角 强度%
2-θ° %
5.2 52.9
6.6 100.0
7.1 25.9
9.7 12.1
10.4 16.4
13.4 11.4
15.7 25.8
19.1 31.1
19.9 12.9
20.0 9.0
21.3 3.5
25.0 22.3
25.6 2.3
26.3 5.9
26.9 2.0
31.7 2.1
实施例21-6.SP-4(无定形的)
无定形的SP-4的XRPD图谱示于图9。
实施例22.SP-4及其溶剂化物的单晶X-射线结晶学测量
实施例22-1.SP-4(形式1)的单晶X-射线结晶学测量
图10示出SP-4形式1的X-射线晶体结构。此处，图示出形式1的晶体结构的分子视图，其显示了使用的编号图。对于非-氢原子，各向异性原子位移椭球体在50%置信水平处示出。显示具有任意小半径的氢原子。
通过下列方式获得结构解析：直接方法，对F2用加权w-1=σ2(Fo 2)+(0.0592P)2+(0.6950P)进行全矩阵最小二乘法修正，其中P=(Fo 2+2Fc 2)/3，各向异性位移参数，使用球谐函数(以SCALE3ABSPACK定标算法的方式来实施)进行经验吸收校正。最后对所有数据wR2={Σ[w(Fo 2-Fc 2)2]/Σ[w(Fo 2)2]1/2}=0.0871，对7090的F值常规R1=0.0329，反映对所有数据Fo>4σ(Fo),S=1.016和870个参数。最后Δ/σ(max)0.001,Δ/σ(平均),0.000。+0.534和之间产生最终差异图谱。
表7.形式1的单晶参数
实施例22-2.SP-4(形式2)的单晶X-射线结晶学测量
图11示出SP-4形式2的X-射线晶体结构。此处，该图示出形式2的来自晶体结构的分子视图，其显示了使用的编号图。由于非常弱的数据，各向同性地解析杂原子。未显示氢原子。
通过下列方式获得结构解析：直接方法，对F2用加权w-1=σ2(Fo 2)+(0.0975P)2+(10.6969P)进行全矩阵最小二乘法修正，其中P=(Fo 2+2Fc 2)/3，各向异性位移参数，使用球谐函数(以SCALE3ABSPACK scaling算法的方式来实施)进行经验吸收校正。最后对所有数据wR2={Σ[w(Fo 2-Fc 2)2]/Σ[w(Fo 2)2]1/2}=0.1883，对2525的F值常规R1=0.0741，对所有数据Fo>4σ(Fo),S=1.05和158个参数。最后Δ/σ(max)0.000,Δ/σ(平均),0.000。+1.388和之间产生最终差异图谱。
表8.形式2的单晶参数
实施例22-3.SP-4(形式2)的单晶X-射线结晶学测量
图12示出X-射线晶体结构(ORTEP–各向异性)SP-4(形式2)。SP-4(形式2)的二氯甲烷溶剂化物C23H31N3PO9FCl2的晶体结构产生单斜晶架群P21(系统缺0k0:k=奇数)，其中 β=92.045(3)°,Z=2和dcalc=1.449g/cm3。在RigakuMercury CCD区域检测器上收集X-射线强度数据，其使用温度为143K的石墨-单色Mo-Kα辐射从一系列12个0.5°旋转图像(曝光30秒)进行初步索引。收集总共648个旋转图像，其中晶体与检测器的距离为35mm,摆角为-12°，旋转宽度为0.5°，曝光30秒：扫描no.1为以ω=10°和χ=20°从315°φ-扫描至525°；扫描no.2为以χ=-90°和φ=315°从-20°ω-扫描至5°；扫描no.3为以χ=-90°和φ=135°从-20°ω-扫描至4°；扫描no.4为以χ=-90°和φ=225°从-20°ω-扫描至5°；扫描no.5为以χ=-90°和φ=45°从-20°ω-扫描至20°。旋转图像使用CrystalClear(CrystalClear:Rigaku Corporation,1999)处理，产生未平均的F2和σ(F2)值的列表，然而其传递至CrystalStructure(CrystalStructure:Crystal Structure AnalysisPackage,Rigaku Corp.Rigaku/MSC(2002))程序包以用于在Dell PentiumIII计算机上进行进一步处理和结构解析。在 -19≤l≤21的范围内测量总共7707个反射，从而产生4253个独特反射角(Rint=0.0180)。强度数据被校正用于Lorentz和偏振效应，并使用REQAB(最小和最大透射率0.824,1.000)用于吸收。
结构通过直接方法(SIR97,SIR97:Altomare,A.,M.Burla,M.Camalli,G.Cascarano,C.Giacovazzo,A.Guagliardi,A.Moliterni,G.Polidori&R.Spagna(1999).J.Appl.Cryst.,32,115-119)进行解析。基于F2使用SHELXL-97(SHELXL-97:Sheldrick,G.M.(2008)Acta Cryst.,A64,112-122)通过全矩阵最小二乘法修正。在修正过程使用全反射。加权方案使用 w = 1 / [ &sigma; 2 ( F o 2 ) + 0.0472 P 2 + 0.4960 P ] , 其中 P = ( F o 2 + 2 F c 2 ) / 3 . 非-氢原子各向异性地修正，氢原子使用"波束"模型进行修正。修正集中至R1=0.0328和wR2=0.0817，4046反射角，为F>4σ(F)和R1=0.0348,wR2=0.0838与GOF=1.056对于所有4253独特非-零反射角和358个变量(R1=∑||Fo|-|Fc||/∑|Fo|; wR 2 = { &Sigma;w ( F o 2 - F c 2 ) 2 / &Sigma;w ( F o 2 ) 2 } 1 / 2 ; GOF = { &Sigma;w ( F o 2 - F c 2 ) 2 / ( n - p ) } 1 / 2 ; 其中n=反射角数和p=修正的参数数)。最小方差的最终周期的最大Δ/σ是0.000，两个最显著峰在最终差异Fourier中是+0.312和Flack绝对结构参数修正至-0.06(6)，因此对应标题化合物的立体化学。
表1列出晶胞信息、数据收集参数和修正数据。最终位置和等同各向同性热参数提供在表2中。各向异性热参数在表3中。("ORTEP-II:AFortran Thermal Ellipsoid Plot Program for Crystal Structure Illustrations".C.K.Johnson(1976)ORNL-5138.)表示分子具有30%概率热椭球体显示。
表9.化合物SP-4·CH2Cl2的结构确定概述
实施例22-4.SP-4(形式3)的单晶X-射线结晶学测量
图13示出SP-4形式3的X-射线晶体结构。此处，图示出形式3的来自晶体结构的分子视图，其显示了使用的编号图。对于非-氢原子，各向异性原子位移椭球体在50%置信水平处示出。显示具有任意小半径的氢原子。
通过下列方式获得结构解析：直接方法，对F2用加权w-1=σ2(Fo 2)+(0.0512P)2+(0.6810P)进行全矩阵最小二乘法修正，其中P=(Fo 2+2Fc 2)/3，各向异性位移参数，使用球谐函数(以SCALE3ABSPACK scaling算法的方式来实施)进行经验吸收校正。最后对所有数据wR2={Σ[w(Fo 2-Fc 2)2]/Σ[w(Fo 2)2]1/2}=0.0796，对2486的F值常规R1=0.0294，反映对所有数据Fo>4σ(Fo),S=1.068和377个参数。最后Δ/σ(max)0.001,Δ/σ(平均),0.000。+0.211和之间产生最终差异图谱。
表10.形式3的单晶参数
实施例23.在提高温度和相对湿度下的稳定性
RP-4的样品储存在40℃和75%相对湿度的湿度室中一周，并且所述样品通过XRPD再分析。获得用于RP-4的粉末图谱在试验过程中显示没有显著性改变，这意味着没有观察到固体形式的改变。这应该相反于4的样品，其储存在40℃和75%相对湿度时在约16小时内潮解。实际上，4的潮解性质的描述通过下列来描述。4的样品穿过250μm的筛然后样品储存在40℃/75%RH和25℃/53%相对湿度，并且以固定的间隔来进行肉眼观察。结果提供在表4中。
表11.对于提高的相对湿度的4的稳定性
当储存在40℃和75%相对湿度时SP-4的样品在16小时内潮解。例如，SP-4的样品用杵和钵研磨，并且然后连续地穿过500和250μm的筛，从而产生微细粉末的样品。将该样品储存在40℃/75%RH和25℃/53%相对湿度，并且以固定的间隔来进行肉眼观察。结果提供在表5中。
表12.对于提高的相对湿度的SP-4的稳定性
在储存在25℃和53%RH下104小时后样品的XRPD分析表明产生的衍射图没有显著性改变，这表明没有发生形式改变。
实施例24.傅立叶变换–红外(FT-IR)光谱
在Perkin-Elmer光谱仪(Perkin-Elmer Spectrum One)上收集数据，该光谱仪装有通用Attenuated Total Reflectance(ATR)抽样附件。数据使用光谱v5.0.1软件来收集和分析。
获得用于4,RP-4和SP-4的IR光谱分别示于图5-7中。选择的峰，单位为波长(cm-1)如下所示：
4:～1680,～1454,～1376,～1205,～1092,～1023(图14);
RP-4:～1742,～1713,～1679,～1460,～1377,～1259,～1157,～1079(图15);和
SP-4(形式1):～1743,～1713,～1688,～1454,～1378,～1208,～1082(图16)。
实施例25.差示扫描量热法(DSC)热重量测定分析法(TGA)
DSC数据收集在TA Instruments Q2000上，其装有50位置自动取样器。热容的校准使用蓝宝石进行，并且能量和温度的校准使用公认的铟进行。
调节温度DSC通常对0.8-1.2mg的各样品进行，在销孔铝盘中，使用下面：加热速度2℃.min-1，温度调节参数±0.2℃.min-1和40秒。以50ml.min-1吹扫干燥氮气保持在样品上。
仪器控制软件是Advantage for Q Series v2.8.0.392和ThermalAdvantage v4.8.3，数据使用Universal Analysis v4.3A来分析。
DSC数据收集在Mettler DSC823e，其装有34位置自动取样器。能量和温度的校准使用公认的铟进行。通常对0.8-1.2mg的各样品，在销孔铝盘中，以10℃.min-1从25℃加热至250℃。以50ml.min-1吹扫干燥氮气保持在样品上。仪器控制和数据分析软件是STARe v9.20。
TGA数据收集在Mettler TGA/SDTA851e，其装有34位置自动取样器。仪器温度的校准使用公认的铟进行。典型地8-12mg的各样品上载到预称重的铝坩埚，并且以10℃.min-1从环境温度加热至350℃。以50ml.min-1吹扫氮气保持在样品上。仪器控制和数据分析软件是STARe v9.20。
4的DSC分析显示出单一较宽吸热曲线，起始于58.7℃(ΔH14J.g-1)，证实由于通过进一步调节的DSC分析(图17)在玻璃化转变过程中的分子驰豫。4的TGA分析显示在240℃之上分解之前没有重量损失，从而证实物质是非-溶剂化物。由于4的XRPD分析证实物质是无定形的，调节的DSC分析在这样的尝试下进行，该尝试为计算玻璃化转变温度，其发现为57℃。
DSC分析显示出单一跃升吸热曲线，起始于136.2℃(ΔH76J.g-1)，这通过热台显微镜的熔融来证实。参见图18。RP-4的TGA分析显示在240℃之上分解之前没有重量损失，从而证实物质是非-溶剂化物。
SP-4的DSC分析显示出单一较宽吸热曲线，起始于93.9℃(ΔH43J.g-1)，这通过热台显微镜的熔融来证实。参见图19。SP-4的TGA分析显示在240℃之上分解之前没有重量损失，从而证实物质是非-溶剂化物。
实施例26.重量测定蒸气吸附(GVS)
SMS DVS Intrinsic
使用SMS DVS Intrinsic水分吸附分析器获得吸附等温线，其由SMSAnalysis Suite软件控制。通过仪器控制样品温度保持为25℃。水分通过下列方式来控制：混合干燥和湿润氮气的蒸汽，总流速为200ml.min-1。相对湿度通过位于样品附近的校准的Rotronic探针(动态范围1.0-100%RH)来测量。作为%RH函数的样品的重量变化(质量驰豫)通过微量天平(精度±0.005mg)恒定地监控。
典型地5-20mg的样品置于周围条件下的配衡网不锈钢篮中。将样品在40%RH和25℃(典型地房间条件)下上载和下载。吸湿等温线的进行概括如下(2次扫描提供1个完全周期)。标准等温线在25℃、10%RH(在0.5-90%RH范围内的间隔)下进行。
表13.SMS DVS Intrinsic试验的方法参数
参数 值
吸收–扫描1 40-90
解吸/吸收-扫描2 90-0,0-40
间隔(%RH) 10
扫描数 2
流速(ml.min-1) 200
温度(℃) 25
稳定性(℃.min-1) 0.2
吸收时间(小时) 6小时时暂停
在完成等温线后回收样品并通过XRPD再分析。
GVS分析显示出RP-4非-吸湿性，这表现出可逆地吸收约0.2重量%的水(从0至90%相对湿度)。在GVS试验后通过XRPD再分析样品显示出形式没有改变。
SP-4的样品用杵和钵研磨，并且然后连续地穿过500和250μm的筛，从而产生微细粉末的样品，然后该样品通过改进的单周期法来进行分析。将样品从40%RH(大致环境)变至60%RH而不是90%(对于标准方法)，然后循环至0%并回到40%RH。该分析显示出SP-4直到60%RH还是非-吸湿性，可逆地吸收～0.2重量%的水(从0至60%RH)。
实施例27.热动力学水溶解度
通过下列方式测定水溶解度：使足够量的化合物混悬在水中以得到母体游离形式的化合物的最大最终浓度≥10mg.ml-1。使混悬液在25℃下平衡24小时，然后测量pH。然后将混悬液通过玻璃纤维C过滤器过滤到96孔板中。然后将滤液稀释101倍。通过HPLC进行定量，参照在DMSO中约0.1mg.ml-1的标准溶液。不同体积的标准、稀释和未稀释样品溶液被注射。使用峰面积来计算溶解度，所述峰面积通过在和标准注射中的主峰相同保留时间处发现的峰的积分来确定。
表14.溶解度测量的HPLC方法参数
在上述条件下在Agilent HP1100系列系统上进行分析，所述系统装配二极管阵列检测器，使用ChemStation软件vB.02.01-SR1。
表15.RP-4,4和SP-4的水溶解度结果
实施例28.通过HPLC的化学纯度测定
各种HPLC条件可用于测定本文中公开的化合物的化学纯度。一种这样的例子涉及热动力学水溶解度研究而在上面公开。另一例子在下面公开。
HPLC条件:
在这些条件下，4,RP-4和SP-4的纯度分别测定为～99.6,～99%和～99.5%。应注意，通过优化上述方法可以实现更高的纯度。
XRPD衍射图的检查示出两种结晶单一非对映立体异构体，其提供清晰的不同XRPD图谱。另外，在两种结晶非对映立体异构体的熔点之间存在明显区别，RP-4比SP-4具有显著更好的起始温度(136℃vs.94℃)。
实施例29.另外的分离方法
下列SFC分离(下列条件)产生非对映体RP-4和SP-4的混合物的足够分离。
制备方法: 分析方法:
Chiralpak AS-H(2x25cm)SN#07-8656 Chiralpak AS-H(25x0.46cm)
20%甲醇/CO2(100bar) 20%甲醇/CO2(100bar)
50ml/min,220nm. 3ml/min,220nm.
浓度:260mg/30ml甲醇,注射体积.:1.5ml
下列SFC分离(下列条件)产生非对映体RP-4和SP-4的混合物的足够分离。
制备方法: 分析方法:
Chiralpak IA(2x15cm)802091 Chiralpak IA(15x0.46cm)
30%异丙醇(0.1%DEA)/CO2,100bar 40%甲醇(DEA)/CO2,100bar
60mL/min,220nm. 3mL/min,220nm.
注射体积:2mL,20mg/mL甲醇
表16.RP-4,4和SP-4批次表征的结果概述
实施例308(SP-异构体)的X-射线结晶学测量
化合物8(SP-异构体),C18H21N2PO7,结晶为单斜晶空间群P21(系统缺0k0:k=奇数)，其中β=92.891(3)°,Z=4和dcalc=1.397g/cm3。在Bruker APEXIICCD区域检测器上收集X-射线强度数据，其使用温度为100(1)K的石墨-单色Mo-Kα辐射图20A和20B分别示出不对称单元的分子编号1和2。
从一系列36个0.5°旋转帧(曝光30秒)进行初步索引。收集总共3608个帧，其中晶体与检测器的距离为70.00mm，旋转宽度为0.5°，曝光20秒：
旋转帧使用SAINT(Bruker(2009)SAINT.Bruker AXS Inc.,Madison,Wisconsin,USA.)积分，产生未平均的F2和σ(F2)值的列表，然而其传递至SHELXTL(Bruker(2009)SHELXTL.Bruker AXS Inc.,Madison,Wisconsin,USA.)程序包以用于在Dell Pentium4计算机上进行进一步处理和结构解析。在1.58≤θ≤25.09°,-6≤h≤6,-18≤k≤18,-28≤l≤28的范围内测量总共6909个反射，从而产生6909个独特反射角(Rint=0.0581)。强度数据被校正用于Lorentz和偏振效应，并使用SADABS(Sheldrick,G.M.(2007)SADABS.University of Gottingen,Germany.)(最小和最大透射率0.6093,0.7452)用于吸收。
结构通过直接方法(SHELXS-97(Sheldrick,G.M.(2008)Acta Cryst.A64,112-122.))进行解析。基于F2使用SHELXL-97(Sheldrick,G.M.(2008)Acta Cryst.A64,112-122.)通过全矩阵最小二乘法修正。在修正过程中使用全反射。加权方案使用w=1/[σ2(Fo 2)+(0.0000P)2+14.0738P]，其中P=(Fo 2+2Fc 2)/3。非-氢原子各向异性地修正，氢原子使用波束模型进行修正。修正集中至R1=0.0847和wR2=0.1899，对6173观察的反射角，为F>4σ(F)和R1=0.0963,wR2=0.1963与GOF=1.119对于所有6909独特非-零反射角和512个变量(R1=Σ||Fo|-|Fc||/Σ|Fo|;wR2=[Σw(Fo 2-Fc 2)2/Σw(Fo 2)2]1/2;GOF=[Σw(Fo 2-Fc 2)2/(n-p)]1/2;其中n=反射角数和p=修正的参数数)。最小方差的最终周期的最大Δ/σ是0.000，两个最显著峰在最终差异Fourier中是+0.402和
表17.化合物8(SP-异构体)的结构确定概述
实施例31.生物活性
将含有复制子的细胞以3,000细胞/孔(50μL)接种到96-孔白色/不透明板或以1,500细胞/孔(25μL)接种到384-孔白色/不透明板。50μL的2X化合物加入96孔板，或25μL的2X化合物加入384孔板，将板在37℃下在加湿的5%CO2气氛下温育4天。在温育后，将Bright-Glo试剂(50μL，96-孔板或25μL，384-孔板)加入以测量用于HCV复制的萤火虫荧光素酶报告基因。计算针对无药物的对照的抑制百分率。
RP-4和SP-4证实具有较宽的基因型覆盖。例如，两者都显示对于丙型肝炎病毒基因型1-4具有活性。
2009年5月20日提交的美国专利申请No.12/053,015和美国临时专利申请No.61/179,923与2010年3月31日提交的美国临时专利申请No.61/319,513的主题的全部内容通过引用并入本文。所有引用的参考文献的主题通过引用并入本文。在引入术语的意思和本文中定义的术语的意思想冲突的情况下，本公开中含有的术语的意思优于引入的术语的意思。

Claims (7)

1.一种制备由式4表示的化合物的方法：
其中P*表示手性磷原子，
该方法包括：
a)使丙氨酸异丙酯A,二-X'-苯基磷酸酯B,2'-脱氧-2'-氟-2'-C-甲基尿苷3和碱反应以获得包含4的第一混合物；
其中X是酸的缀合碱,n是0或1,并且X'是卤素，以及
b)使所述包含4的第一混合物和保护化合物反应以获得包含4和被保护的副产物的第二混合物，其中所述保护化合物是叔丁基-二甲基-甲硅烷基-氯化物。
2.权利要求1所述的方法，其中X是氯化物并且n是1。
3.权利要求2所述的方法，其中A包含至多10重量％的水。
4.权利要求1所述的方法，其中所述碱是N-甲基咪唑。
5.权利要求1所述的方法，其中A-比-B-比-3的摩尔比为1.6-比-1.3-比-1。
6.权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述包含4的第二混合物进行结晶、色谱分析或萃取以获得RP-4，
7.权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述包含4的第二混合物进行结晶、色谱分析或萃取以获得SP-4：
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