BR112013026451A2 - equipamento para realização em tempo real da amplificação e detecção de ácido nucleico, sistema e métodos implementados em um ou mais processadores de computador para optimizar protocolos para a realização simultânea de pluralidade de reações de ciclos térmicos e para realizar simultaneamente pcr em tempo real numa pluralidade de câmaras de reação de pcr e meio não transitório legível por computador - Google Patents

equipamento para realização em tempo real da amplificação e detecção de ácido nucleico, sistema e métodos implementados em um ou mais processadores de computador para optimizar protocolos para a realização simultânea de pluralidade de reações de ciclos térmicos e para realizar simultaneamente pcr em tempo real numa pluralidade de câmaras de reação de pcr e meio não transitório legível por computador Download PDF

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Abstract

equipamento para realização em tempo real da amplificação e detecção de ácido nucleico, sistema e métodos implementados em um ou mais processadores de computador para optimizar protocolos para a realização simutânea de pluralidade de reações de ciclos térmicos e para realizar simultaneamente pcr em tempo real numa pluralidade de câmaras de reação de pcr e meio não transitório legível por computador sistemas e métodos para a realização simultânea da amplificação de ácidos nucleicos e detecção. os sistemas e métodos compreendem métodos para gerir uma pluralidade de protocolos em conjunto com o direcionamento de uma matriz de sensores através de cada uma de pluralidade de câmaras de reação. em certas modalidades, os protocolos compreendem perfis de termociclagem e os métodos podem desvios e extensões de duração nos perfis de termociclagem para conseguir um comportamento de detecção mais eficiente.

Description

“Equipamento Para Realização em Tempo Real da Amplificação e
Detecção de Ácido Nucléico, Sistema e Métodos Implementados em
Um ou Mais Processadores de Computador Para Optimizar
Protocolos Para a Realização Simultânea de Pluralidade de Reações de Ciclos Térmicos e Para Realizar Simultaneamente PCR em Tempo Real Numa Pluralidade de Câmaras de Reação de PCR e Meio Não Transitório Legível por Computador” Relatório Descritivo
REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Este pedido reivindica o benefício em 35 U.S.C. Seção 119(e) do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos de co-Pendência No. de Série 61/476.175, depositado em 15 de abril de 2011, intitulado “SOFTWARE CONTROL PROCESS TO SYNCHRONIZE TERMOCYCLING AND SCANNING OPTICAL DETECTION’ e Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos de co-Pendência No. de Série 61/476.167, depositado em 15 de abril de 2011, intitulado “6-COLOR SCANNING REAL-TIME MICROFLUIDIC THERMOCYCLER’ cujos pedidos estão incorporados por referência aqui em sua totalidade.
CAMPO TÉCNICO [0002] Os sistemas e métodos descritos aqui se referem geralmente à execução automatizada de ensaios de amplificação de ácido nucléico, tal como Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), e em alguns casos PCR em tempo real, em uma pluralidade de câmaras de reação microfluídica em um cartucho microfluídico. O sistema pode subsequentemente
2/68 detectar ácidos nucleicos alvos, por exemplo, amplicons alvos, dentro de cada das câmaras de reação.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0003] A indústria de diagnóstico médico é um elemento crítico de infraestrutura de saúde atual. Atualmente, entretanto, as análises de diagnóstico in vitro, não importa qual rotina, se tornaram um ponto de estrangulamento no cuidado com paciente. Há várias razões para isto. Primeiro, muitas análises de diagnóstico podem ser feitas somente com equipamento altamente especializado que é tanto caro quanto somente operável por médicos treinados. Tal equipamento pode ser encontrado somente em alguns locais— muitas vezes apenas um em qualquer determinada área urbana. Isto requer que os hospitais enviem as amostras para análises para esses locais, desse modo implicando em custos de envio e atrasos de transporte, e possivelmente até mesmo a perda ou mau uso da amostra. Segundo, o equipamento em questão tipicamente não está disponível “sob demanda”, porém, em vez disso é executado em bateladas, desse modo retardando o tempo de processamento para muitas amostras uma vez que elas devem esperar por uma máquina para atingir a capacidade antes que possam ser executadas.
[0004] Entendendo que os ensaios de diagnóstico nas amostras biológicas podem se dividir em várias etapas principais, é geralmente desejável automatizar uma ou mais etapas. Por exemplo, uma amostra biológica, tais como aquelas obtidas de um paciente, pode ser usada nos ensaios de amplificação de ácido nucleico, para amplificar um ácido nucleico alvo (por exemplo, DNA, RNA ou similares) de interesse. Uma vez amplificada, a presença de um ácido nucleico alvo ou produto de amplificação de um reator de ácido nucleico alvo (por exemplo, um amplicon alvo) pode ser detectada, sendo que a presença de um ácido nucleico alvo e/ou amplicon alvo é usado para identificar e/ou quantificar a presença de um alvo (por exemplo, um microrganismo alvo ou simila
3/68 res). Geralmente, os ensaios de amplificação de ácido nucleico envolvem as múltiplas etapas, que podem incluir extração de ácido nucleico, amplificação de ácido nucleico, e detecção. É desejável automatizar certas etapas desses processos.
[0005] Há uma necessidade de um método e mecanismo para realizar os ensaios de diagnóstico molecular em múltiplas amostras em paralelo, com ou sem a amplificação de ácidos nucleicos alvos, e detecção em uma amostra biológica preparada. O sistema pode ser configurado para um alto rendimento, e a operação em um laboratório de referência comercial ou no ponto de atendimento, desse modo eliminando a necessidade de enviar a amostra para um centro especializado.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0006] As modalidades descritas aqui se referem aos métodos e dispositivos para o teste simultâneo de múltiplas amostras. Certas modalidades contemplam um mecanismo para realizar a detecção e amplificação de ácido nucleico em tempo real. O mecanismo pode incluir uma cabeça do detector compreendendo uma pluralidade de pares de fonte de luz e fotodetectores. A cabeça do detector pode ser montada em um trilho, sendo que os pares de fonte de luz e detector são alinhados em uma primeira fileira e uma segunda fileira. O mecanismo pode incluir um receptáculo para um cartucho microfluídico que tem uma pluralidade de câmaras de reação independentes alinhadas em colunas adjacentes de uma primeira fileira e uma segunda fileira. O mecanismo também pode incluir uma placa perfurada que é configurada para estar posicionada sobre o cartucho microfluídico quando o cartucho está presente no receptáculo. A placa perfurada pode incluir uma pluralidade de aberturas que são cada alinhada com cada da pluralidade de câmaras de reação enquanto o receptáculo está segurando o cartucho microfluídico. A cabeça do detector pode estar localizada sobre a placa perfurada, e ser móvel ao longo do trilho, tal que cada da pluralidade de
4/68 fotodetectores e pares de fonte de luz na primeira fileira possa estar posicionado sobre cada abertura na primeira fileira da placa perfurada, e cada da pluralidade de fotodetectores e pares de fonte de luz na segunda fileira possa estar posicionado sobre cada abertura na segunda fileira da placa perfurada.
[0007] Em algumas modalidades, o mecanismo também inclui uma segunda cabeça do detector que tem uma pluralidade de fotodetectores e pares de fonte de luz alinhados em uma primeira fileira e uma segunda fileira. A segunda cabeça do detector pode ser montada no trilho. O mecanismo pode também incluir um segundo receptáculo para um cartucho microfluídico incluindo uma pluralidade de câmaras de reação independentes alinhadas em colunas adjacentes de uma primeira fileira e uma segunda fileira. O mecanismo pode também incluir uma segunda placa perfurada configurada para estar posicionada sobre o segundo cartucho microfluídico quando o segundo cartucho está presente no segundo receptáculo, e que pode incluir uma pluralidade de aberturas que estão cada alinhada em cada da pluralidade das câmaras de reação do segundo cartucho microfluídico enquanto o segundo receptáculo está segurando o segundo cartucho microfluídico. A segunda cabeça do detector pode estar localizada sobre a placa perfurada, e pode ser móvel ao longo do trilho tal que cada da pluralidade de fotodetectores e pares de fonte de luz na primeira fileira da segunda cabeça do detector possa estar posicionada sobre cada abertura na primeira fileira da segunda placa perfurada, e cada da pluralidade de fotodetectores e pares de fonte de luz na segunda fileira da segunda cabeça do detector possa estar posicionada sobre cada abertura na segunda fileira da segunda placa perfurada.
[0008] Em algumas modalidades, os fotodetectores e pares de fonte de luz podem incluir pelo menos seis diferentes fotodetectores e pares de fonte de luz operando em seis diferentes comprimentos de onda. Em
5/68 algumas modalidades, os seis diferentes comprimentos de onda compreendem uma fonte de luz emitindo uma luz de cor verde, uma fonte de luz emitindo uma luz de cor amarela, uma fonte de luz emitindo uma luz de cor laranja, uma fonte de luz emitindo uma luz de cor vermelha, e uma fonte de luz emitindo uma luz de cor carmesim. Em algumas modalidades, a cabeça do detector inclui pelo menos N fileiras de fotodetectores e pares de fonte de luz, e o detector é configurado para se mover para pelo menos as posições M+N-l sobre uma placa perfurada compreendendo as M fileiras de abertura.
[0009] Em algumas modalidades, a placa perfurada compreende aço, alumínio, níquel ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a placa perfurada pode ter uma espessura de aproximadamente 0,64 centímetro (0,25 polegada). Em algumas modalidades, pelo menos parte da placa perfurada é eletroquimicamente oxidada para ficar mais escura do que quando a placa perfurada não está eletroquimicamente oxidada. Em algumas modalidades, a placa perfurada fornece pressão substancialmente uniforme através da área do cartucho microfluídico, quando o cartucho está presente dentro do receptáculo. Em algumas modalidades, uma placa perfurada compreende pelo menos um dentre alumínio, zinco ou níquel, a placa perfurada também compreendendo um corante.
[0010] Em algumas modalidades, o mecanismo também compreende uma placa de aquecimento, sendo que a placa de aquecimento está posicionada debaixo do cartucho microfluídico quando um cartucho está presente no receptáculo. Em algumas modalidades a placa de aquecimento compreende pelo menos um dentre vidro ou quartzo. Em algumas modalidades, a placa perfurada fornece pressão substancialmente uniforme através da área do cartucho microfluídico quando um cartucho está presente no receptáculo. A pressão substancialmente uniforme pode facilitar o contato térmico substancialmente uniforme
6/68 entre as câmaras de reação micro fluídica e a placa de aquecimento. Como tal, em algumas modalidades, a placa perfurada fornece pressão uniforme que pode garantir que cada da pluralidade dos reatores ou câmaras de reação no cartucho microfluídico estejam em contato uniformemente térmico ou comunicação com uma respectiva pluralidade de elementos de aquecimento localizados dentro da placa de aquecimento.
[0011] Em algumas modalidades, o mecanismo também compreende um fotodetector, os fotodetectores localizados sobre a placa perfurada, sendo que a câmara micro-fluídica é configurada para receber luz em um ângulo de vista de uma fonte de luz relativa aos fotodetectores. Em algumas modalidades, a placa de aquecimento compreende uma pluralidade de elementos de aquecimento, sendo que cada da pluralidade de elementos de aquecimento está posicionada tal que quando o cartucho microfluídico esteja presente no receptáculo, a pluralidade de elementos de aquecimento esteja em conexão térmica com cada das pluralidades de câmaras de reação, respectivamente.
[0012] Certas modalidades contemplam um método implementado em um ou mais processadores de computador para otimizar os protocolos, tais como protocolos de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) ou similares, para simultaneamente realizar uma pluralidade de reações de ciclagem térmica, sendo que cada reação de ciclagem térmica compreende uma ou mais etapas de detecção, e sendo que as reações de ciclagem térmica são realizadas em uma pluralidade de reatores. O método pode incluir as etapas de determinar ou fornecer um tempo de ciclo de detecção para cada das pluralidades de reator; receber ou acessar uma etapa do protocolo, a etapa associada com uma duração da etapa, a etapa compreendendo um tempo para detecção; e determinar um primeiro ajuste à etapa tal que a duração da etapa seja um múltiplo do tempo de ciclo de detecção.
7/68 [0013] Em algumas modalidades o método também compreende determinar um segundo ajuste para a etapa, sendo que o tempo para detecção é um múltiplo do tempo de ciclo de detecção quando a etapa é ajustada pelo primeiro ajuste e pelo segundo ajuste. Em algumas modalidades o método também compreende determinar um ajuste de compensação inicial com base em uma posição de uma câmara de reação associada com o protocolo. Em algumas modalidades, o tempo de ciclo de detecção compreende a quantidade de tempo requerido para uma cabeça do detector realizar uma predeterminada pluralidade de detecções para um reator. Em algumas modalidades, o tempo de ciclo de detecção inclui um tempo requerido para o movimento da cabeça do detector para cada de uma pluralidade de reator e movimento da cabeça do detector para a posição inicial. Em algumas modalidades, o método também compreende iniciar o protocolo.
[0014] Certas modalidades contemplam um meio legível pelo computador não transitório compreendendo instruções, as instruções configuradas para fazer com que um ou mais processadores realizem as seguintes etapas: determinar ou fornecer ou acessar um tempo de ciclo de detecção; receber ou acessar uma etapa do protocolo, sendo que a etapa é associada com uma duração de etapa, e sendo que a etapa inclui um tempo para detecção; e determinar um primeiro ajuste para a etapa tal que a duração da etapa seja um múltiplo do tempo de ciclo de detecção.
[0015] Em algumas modalidades, a etapa de protocolo está associada com um protocolo de uma pluralidade de protocolos. Cada das pluralidades de protocolo pode estar associada com pelo menos uma de uma pluralidade de reações de ciclagem térmica, tais como protocolos de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), sendo que cada reação de ciclagem térmica compreende uma ou mais etapas de detecção, e sendo que a determinação de um primeiro ajuste é com base em pelo menos em parte em um tempo de uma ou mais etapas de detecção associadas
8/68 com as reações de ciclagem térmica de pelo menos duas ou mais das pluralidades de protocolo quando as duas ou mais das pluralidades de protocolo são simultaneamente executadas. Em algumas modalidades, o método também inclui a etapa de determinar um segundo ajuste para a etapa, sendo que o tempo para detecção é um múltiplo do tempo de ciclo de detecção quando a etapa é ajustada pelo primeiro ajuste e pelo segundo ajuste. Em algumas modalidades, o método também inclui a etapa de determinação de um ajuste de compensação inicial com base em uma posição de uma câmara de reação associada com o protocolo. Em algumas modalidades, o tempo de ciclo de detecção inclui uma quantidade de tempo requerido para uma cabeça do detector para realizar uma predeterminada pluralidade de detecções para uma câmara de reação. Em algumas modalidades, o tempo de ciclo de detecção também inclui um tempo requerido para o movimento da cabeça do detector para cada de uma pluralidade de posições de detecção da câmara de reação e movimento da cabeça do detector para uma posição inicial. Em algumas modalidades, o método também compreende iniciar o protocolo.
[0016] Certas modalidades contemplam um sistema para otimizar os protocolos para uma pluralidade de câmaras de reação. O sistema pode incluir um processador configurado para realizar o seguinte: determinar ou fornecer ou acessar um tempo de ciclo de detecção; receber ou acessar uma etapa de protocolo, sendo que a etapa pode estar associada com uma duração da etapa, e sendo que a etapa inclui um tempo para a detecção; e determinar um primeiro ajuste para a etapa tal que a duração da etapa seja um múltiplo do tempo de ciclo de detecção.
[0017] Em algumas modalidades, a etapa de protocolo está associada com um protocolo de uma pluralidade de protocolos. Cada da pluralidade de protocolos pode estar associada com pelo menos uma de uma pluralidade de reações de ciclagem térmica, tal como um protocolo de
9/68
Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), sendo que cada reação de ciclagem térmica compreende uma ou mais etapas de detecção, e sendo que a determinação de um primeiro ajuste é com base em pelo menos em parte em um tempo de uma ou mais etapas de detecção associadas com as reações de ciclagem térmica de pelo menos duas ou mais das pluralidades de protocolo quando as duas ou mais das pluralidades de protocolo são simultaneamente executadas. Em algumas modalidades, o processador é também configurado para determinar um segundo ajuste para a etapa, sendo que o tempo para detecção é um múltiplo do tempo de ciclo de detecção quando a etapa é ajustada pelo primeiro ajuste e pelo segundo ajuste. Em algumas modalidades, o processador é também configurado para determinar um ajuste de compensação inicial com base em uma posição de uma câmara de reação associada com o protocolo. Em algumas modalidades, o tempo de ciclo de detecção inclui uma quantidade de tempo requerido para uma cabeça do detector para realizar uma predeterminada pluralidade de detecções para uma câmara de reação. Em algumas modalidades, o tempo de ciclo de detecção também inclui um tempo requerido para o movimento da cabeça do detector para cada de uma pluralidade de posições de detecção da câmara de reação e movimento da cabeça do detector para a posição inicial. Em algumas modalidades, o processador é também configurado para iniciar o protocolo.
[0018] Certas modalidades contemplam um método para simultaneamente realizar PCR em tempo real em uma pluralidade de câmaras de reação de PCR, compreendendo: (a) fornecer um tempo de varredura suficiente para uma montagem de detector para realizar um ciclo de varredura durante o qual ele pode varrer cada da pluralidade das câmaras de reação de PCR para pelo menos um sinal detectável e tornar-se pronto para repetir a varredura; (b) fornecer um protocolo de reação para cada das câmaras de reação de PCR que inclui múltiplos ciclos, cada ciclo compreendendo um tempo de ciclo que inclui pelo
10/68 menos uma etapa de aquecimento, pelo menos uma etapa de resfriamento, e pelo menos um patamar de temperatura que inclui um período de ciclo de leitura durante o qual a montagem de detector é para varrer a câmara de reação para pelo menos um sinal detectável; (c) determinar, usando um processador, se o tempo do ciclo para esta câmara de reação é o mesmo ou um número inteiro múltiplo do tempo de varredura, e se não, ajustar o tempo de varredura ou o tempo do ciclo de modo que o tempo do ciclo seja o mesmo ou um número inteiro múltiplo do tempo de varredura; (d) realizar pelo menos as etapas (b) e (c) para o protocolo de reação para cada das pluralidades de câmara de reação de PCR de modo que o tempo do ciclo para cada protocolo de reação seja o mesmo ou um número inteiro múltiplo do tempo de varredura; e (e) sob a direção de um processador, realizar PCR em tempo real em cada das câmaras de reação usando o protocolo de reação para cada das câmaras de reação, incluindo realizar múltiplos ciclos de varredura com a montagem de detector, sendo que cada câmara de reação de PCR é varrida pela montagem de detector durante cada período do ciclo de leitura para aquela câmara de reação.
[0019] Em algumas modalidades o método também compreende a fase de ajuste do tempo de ciclo do protocolo de reação para pelo menos uma das câmaras de reação. Em algumas modalidades, pelo menos um referido protocolo de reação é diferente do outro referido protocolo de reação. Em algumas modalidades, pelo menos um tempo do ciclo em um protocolo de reação é diferente do tempo do ciclo em outro protocolo de reação. .
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0020] A Figura IA é uma visão plana frontal de um mecanismo de diagnóstico como usado em certas modalidades.
[0021] A Figura IB é uma visão em perspectiva da parte superior do
11/68 mecanismo de diagnóstico da Figura IA mostrando certos componentes internos do mecanismo.
[0022] A Figura 2 ilustra uma visão interna do mecanismo de diagnóstico das Figuras IA e 1B.
[0023] A Figura 3A ilustra uma visão plana da parte superior de uma possível disposição microfluídica em certas modalidades de um cartucho microfluídico como descrito aqui.
[0024] A Figura 3B ilustra o layout de um substrato aquecedor em relação à câmara de reação de certas modalidades.
[0025] A Figura 4A ilustra uma visão externa do módulo óptico incluindo a cabeça do detector de certas modalidades descritas aqui.
[0026] A Figura 4B ilustra uma visão do módulo óptico da Figura 4 A com uma cobertura lateral removida.
[0027] A Figura 4C ilustra uma visão de base do módulo óptico da Figura 4A.
[0028] A Figura 5 ilustra a cabeça do detector usada no módulo óptico de certas modalidades ao longo da linha 13 da Figura 4B.
[0029] A Figura 6 descreve o layout das fontes de luz e detectores ópticos como usado em certas modalidades da cabeça do detector descrita aqui.
[0030] A Figura 7 é um gráfico da fluorescência versus tempo do uso de PCR em tempo real de ácidos nucleicos alvos realizados em um mecanismo de certas modalidades como descrito aqui.
[0031] A Figura 8 é uma descrição abstrata de certas câmaras, abertura, e camadas de aquecimento encontradas em certas modalidades
12/68 como descrito aqui.
[0032] As Figuras 9A-H ilustram várias perspectivas de uma modalidade da placa perfurada.
[0033] A Figura 10 ilustra várias dimensões das perspectivas da placa perfurada das Figuras 9A-H.
[0034] A Figura 11 é um plote de uma parte de um perfil térmico para um possível protocolo implementado em certas modalidades.
[0035] A Figura 12 é um fluxograma descrevendo um processo para determinar as durações, compensações, e tempos de detecção do protocolo, para otimizar e organizar a eficiência do detector.
[0036] A Figura 13 ilustra uma parte de uma interface do usuário para selecionar as durações de certas etapas e sub-etapas de protocolo e determinação do ajuste intra-ciclo acompanhante.
[0037] A Figura 14 é um plote de um perfil térmico compreendendo um ajuste inter-ciclo.
[0038] As Figuras 15A-C plotam uma pluralidade de perfis térmicos para uma pluralidade de protocolos implementados em certas modalidades. As Figuras 15A e 15B ilustram o caráter dos perfis de protocolo antes do ajuste de compensação inicial. Figura 15C ilustra a pluralidade de perfis de protocolo relativos a um outro após aplicar os ajustes de compensação iniciais.
[0039] A Figura 16 é um plote de um perfil térmico sob resfriamento ativo quando implementado em certas modalidades.
DESCRIÇÃO DETALHADA [0040] Certas modalidades presentes contemplam um mecanismo,
13/68 referido aqui como um termociclizador, que pode consistentemente aquecer e analisar as câmaras microfluídicas. A amplificação de polinucleotídeo, tal como por PCR em tempo real, pode ser realizada nas câmaras fluídicas. Em algumas modalidades, o termociclizador pode ser configurado para realizar os protocolos de detecção e termociclagem individual em uma pluralidade de câmaras de reação microfluídicas em um cartucho microfluídico. A termociclagem pode ser usada para amplificar os ácidos nucléicos, por exemplo, DNA, RNA ou similares, por exemplo, por PCR em tempo real ou outros protocolos de amplificação de ácido nucleico descritos aqui, dentro das câmaras de reação microfluídicas. O termociclizador pode compreender uma cabeça do detector, compreendendo uma pluralidade de pares de detectores, por exemplo, seis ou mais pares de cabeça do detector, sendo que cada par de detectores compreende uma fonte de emissão de luz, por exemplo, uma LED ou similares, e um fotodiodo cognato. Em algumas modalidades, cada par de detectores individual é configurado para gerar e detectar a luz emitida de uma fração fluorescente, por exemplo, uma sonda fluorescente, para indicar a presença de um polinucleotídeo alvo.
[0041] Como usado aqui, o termo “microfluídico” se refere aos volumes de menos do que 1 ml, preferivelmente menos do que 0,9 ml, por exemplo , 0,8 ml, 0,7 ml, 0,6 ml, 0,5 ml, 0,4 ml, 0,3 ml, 0,2 ml, 0,1 ml, 90 pL, 80 pL, 70 pL, 60 pL, 50 pL, 40 pL, 30 pL, 20 pL, 10 pL, 5 pL, 4 pl,3 pL, 2 pL, 1 pL ou menos ou qualquer quantidade entre esses. Deve ser entendido que, a menos que especificamene deixado claro ao contrário, onde o termo PCR é usado aqui, qualquer variante de PCR incluindo, porém, sem limitação a PCR em tempo real e quantitativo, e qualquer outra forma de amplificação de polinucleotídeo é pretendida ser abrangida.
[0042] O processo de detecção usado no ensaio também pode ser multiplexado para permitir múltiplas medições concorrentes em múlti
14/68 pias reações concorrentemente. Em algumas modalidades, essas medições podem ser tomadas de câmaras de reação separadas. Certas dessas modalidades realizam uma pluralidade de reações de PCR simultaneamente em uma única câmara de reação de PCR, por exemplo, PCR multiplex. Um protocolo PCR pode compreender normas para a realização do recozimento e desnaturação sucessivos dos polinucleotídeos na câmara de reação antes da detecção. Tais normas, compreendendo um perfil de tempo para aquecimento da câmara, podem ser referidas como um protocolo”. Certas das modalidades descritas facilitam o aquecimento e/ou resfriamento consistentes através de uma pluralidade de câmaras de reação realizando PCR, ao mesmo tempo em que facilitando a detecção usando um conjunto de sensores. Em certas modalidades, o mecanismo pode compreender uma placa perfurada que facilita o aquecimento e resfriamento consistente das câmaras de reação aplicando-se pressão a um cartucho contendo uma pluralidade de câmaras de reação de PCR. Certos detalhes e métodos para processamento de polinucleotídeos podem ser encontrados em, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos 2009-0131650 e Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos 2010-0009351, incorporados aqui por referência.
[0043] O técnico versado apreciará que as modalidades descritas aqui sejam úteis para vários tipos de reações de amplificação de ácido nucleico. Por exemplo, os métodos de amplificação de ácido nucleico em conjunto com as modalidades descritas aqui podem incluir, porém, sem limitação: Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), amplificação de deslocamento de filamento (SDA), por exemplo, amplificação de múltiplos deslocamentos (MDA), amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), reação em cadeia de ligase (LCR), imuno-amplificação, e uma variedade de procedimentos de amplificação com base em transcrição, incluindo amplificação mediada por transcrição (TMA), amplificação com base em sequência de ácido nucleico (NASBA), replicação de se
15/68 quéncia auto-sustentada (3SR), e amplificação de círculo rodante. Veja, por exemplo, Mullis, “Process for Amplifying, Detecting, and/or Cloning Ácido nucleico Sequences,” Patente dos Estados Unidos No. 4.683.195; Walker, “Strand Displacement Amplificação”, Patente dos Estados Unidos No. 5.455.166; Dean e outros, “Multiple Displacement Amplificação”, Patente dos Estados Unidos No. 6.977.148; Notomi e outros, “Process for Synthesizing Ácido nucleico”, Patente dos Estados Unidos No. 6.410.278; Landegren e outros. Patente dos Estados Unidos No. 4.988.617 “Method of detecting a nucleotideo change in ácido nucleicos”; Birkenmeyer, “Amplificação of Target Ácido nucleicos Using Gap Filling ligase Chain Reaction”, Patente dos Estados Unidos No. 5.427.930; Cashman, “Blocked-Polimerase Polinucleotid Immunoassay Method and Kit’, Patente dos Estados Unidos No. 5.849.478; Kacian e outros, “Ácido nucleico Sequence Amplificação Methods”, Patente dos Estados Unidos No. 5.399.491; Malek e outros, “Enhanced Ácido nucleico Amplificação Process”, Patente dos Estados Unidos No. 5.130.238; Lizardi e outros, BioTechnology, 6: 1 197 (1988); Lizardi e outros, Patente dos Estados Unidos No. 5.854.033 “Rolling circle replication reporter systems”.
[0044] Em algumas modalidades descritas aqui, o ácido nucleico alvo, por exemplo, o amplicon alvo, pode ser detectado usando uma sonda de oligonucleotídeo. Preferivelmente, as sondas incluem uma ou mais frações detectáveis que podem ser detectadas pelos sistemas descritos aqui. O técnico versado apreciará que várias tecnologias de sonda sejam úteis nas modalidades descritas aqui. Por modo de exemplo, as modalidades descritas aqui podem ser usadas com sondas TAQMAN®, sondas beacon moleculares, sondas SCORPION™ e similares.
[0045] Os ensaios TaqMan® são ensaios homogêneos para detectar polinucleotídeos (veja, Patente dos Estados Unidos No. 5.723.591). Nos ensaios TAQMAN®, dois iniciadores PCR flanqueiam um oligonucleotídeo de sonda TAQMAN® central. O oligonucleotídeo de sonda contém
16/68 um fluorforo e extintor. Durante a etapa de polimerização do processo PCR, a atividade de nucleasse 5' da polimerase cliva o oligonucleotídeo de sonda, fazendo com que a fração de fluorforo se torne fisicamente separada do extintor, o que aumenta a emissão de fluorescência. Quanto mais produto PCR é criado, a intensidade de emissão no novo comprimento de onda aumenta.
[0046] Beacons moleculares são uma alternativa para as sondas TAQMAN® para a detecção de polinucleotídeos, e são descritos em, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Nos. 6.277.607; 6.150.097; e 6.037.130. Beacons moleculares são grampos de oligonucleotídeo que sofrem uma mudança conformacional ao se ligarem a um modelo perfeitamente combinado. A mudança conformacional do oligonucleotídeo aumenta a distância física entre uma fração de fluorforo e uma fração do extintor presente no oligonucleotídeo. Este aumento na distância física faz com que o efeito do extintor seja diminuído, desse modo aumentando o sinal derivado do fluorforo.
[0047] O método de sondas adjacentes amplifica a sequência alvo por Reação em Cadeia de Polimerase na presença de duas sondas de ácido nucleico que hibridizam para regiões adjacentes da sequência alvo, uma das sondas sendo rotulada com um fluorfloro receptor e a outra sonda rotulada com um fluorfloro doador de um par de transferência de energia de fluorescência. Sob hibridização das duas sondas com a sequência alvo, o fluorfloro doador interage com o fluorfloro receptor para gerar um sinal detectável. A amostra é em seguida estimulada com luz em um comprimento de onda absorvido pelo fluorfloro doador e a emissão fluorescente do par de transferência de energia de fluorescência é detectada para a determinação daquela quantidade alvo. A Patente dos Estados Unidos No. 6.174.670 descreve tais métodos.
[0048] Os iniciadores Sunrise utilizam uma estrutura de grampo de cabelo similar aos beacons moleculares, porém, presa a uma sequência
17/68 de ligação alvo que serve como um iniciador. Quando o filamento complementar do iniciador é sintetizado, a estrutura de grampo de cabelo é quebrada, desse modo eliminando a extinção. Esses iniciadores detectam o produto amplificado e não requerem o uso de uma polimerase com uma atividade de 5' exonuclease. Os iniciadores Sunrise são descritos por Nazarenko e outros. (Ácido nucleicos Res. 25:251621 (1997) e na Patente dos Estados Unidos No. 5.866.336.
[0049] As sondas SCORPION™ combinam um iniciador com uma estrutura de grampo de cabelo adicionada, similar aos iniciadores Sunrise. Entretanto, a estrutura de grampo de cabelo de sondas SCORPION™ não é aberta por síntese do filamento complementar, porém, por hibridização de parte da estrutura de grampo de cabelo com uma parte do alvo que está a jusante da parte que hibridiza para o iniciador.
[0050] DzyNA -PCR envolve um iniciador contendo a sequência de antissentido de uma DNAzima, um oligonucleotídeo capaz de clivar as ligações de fosfodiéster de RNA específicas. O iniciador se liga a uma sequência alvo e conduz uma reação de amplificação produzindo um amplicon que contém a DNAzima ativa. A DNAzima ativa em seguida cliva um substrato repórter genérico na mistura de reação. O substrato repórter contém um par de fluorforo-extintor e a divagem do substrato produz um sinal de fluorescência que aumenta com a amplificação da sequência alvo. DNAzy-PCR é descrito em Todd e outros., Clin. Chem. 46:625-30 (2000) e na Patente dos Estados Unidos No. 6.140.055.
[0051] Fiandaca e outros, descreve um método fluorgênico para análise de PCR utilizando uma sonda de ácido nucleico de peptídeo rotulado pelo extintor (Q-PNA) e um iniciador de oligonucleotídeo rotulado porfluorforo. Fiandaca e outros. Genome Research. 11 :609-613 (2001). Ο Q-PNA hibridiza para uma sequência rótulo na extremidade 5' do iniciador.
18/68 [0052] Li e outros, descrevem uma sonda de filamento duplo tendo um extintor e fluorforo em filamentos de oligonucleotídeo opostos. Li e outros. Nucleic Acids Research. 30(2): e5, 1-9 (2002). Quando não ligados ao alvo, os filamentos hibridizam para cada outro e a sonda é extinta. Entretanto, quando um alvo está presente pelo menos um filamento hibridiza para o alvo resultando em um sinal fluorescente.
[0053] As frações e rótulos de fluorforo úteis nas modalidades descritas aqui incluem, porém, sem limitação, tintas da família de fluoresceína, a família de carboxirodamina, a família de cianina, e a família de rodamina. Outras famílias de tintas que podem ser usadas na invenção incluem, por exemplo, tintas da família de polialofluoresceína, tintas da família de hexaclorofluoresceína, tintas da família de cumarina, tintas da família de oxazina, tintas da família de tiazina, tintas da família de esquaraína, tintas da família de lantanídeo queladas, a família de tintas disponíveis sob a designação comercial Alexa Fluor J, de Molecular Probes, e a família de tintas disponibiloizadas sob a designação comercial Bodipy J, de Invitrogen (Carlsbad, Calif). As tintas da família de fluoresceína incluem, por exemplo, 6-carboxifluoresceina (FAM), 2',4',1,4,-tetraclorofluoresceína (TET), 2',4',5',7', 1 ,4-hexaclorofluoresceína (HEX), 2',7'-dimetóxi-4',5'-dicloro-6-carboxirodamina (JOE), fenill,4-dicloro-6-carboxifluoresceína 2'-cloro-5'-fluor-7',8'-fundido (NED), 2'cloro-7'-fenil-l,4-dicloro-6-carboxifluoresceína (VIC), 6-carbóxi-Xrodamina (ROX), e 2',4',5',7'-tetracloro-5-carbóxi-fluoresceína (ZOE). As tintas da família de carboxirodamina incluem tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), tetrapropano-6-carboxirodamina (ROX), Texas Red, RI 10, e R6G. As tintas da família de cianina incluem Cy2, Cy3, Cy3,5, Cy5, Cy5,5, e Cy7. fluorforos estão facilmente disponibilizados comercialmente de, por exemplo, Perkin-Elmer (Foster City, Calif.), Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oreg.) e Amersham GE Healthcare (Piscataway, N.J.).
19/68 [0054] Como descrito acima, em algumas modalidades, as sondas úteis nas modalidades descritas aqui podem compreender um extintor. Os extintores podem ser extintores fluorescentes ou extintores não fluorescentes. Os extintores fluorescentes incluem, porém, sem limitação, TAMRA, ROX, DABCYL, DABSYL, tintas de cianina incluindo azul nitrotiazol (NTB), antraquinona, verde de malaquita, compostos de nitrotiazol, e nitroimidazol. Os extintores não fluorescentes exemplares que dissipam a energia absorvida de um fluorforo incluem aqueles disponibilizados pela designação comercial Black Hole™ de Biosearch Technologies, Inc. (Novato, Calif), aqueles disponibilizados pela designação comercial Eclipse™. Dark, de Epoch Biosciences (Bothell, Wash.), aqueles disponibilizados pela designação comercial Qxl J, de Anaspec, Inc. (San Jose, Calif.), e aqueles disponibilizados pela designação comercial Iowa Black™ de Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa).
[0055] Em algumas modalidades descritas acima, um fluorforo e um extintor são usados juntos, e podem ser iguais ou diferentes oligonucleotídeos. Quando colocados juntos, um extintor de fluorforo e fluorescente podem ser referidos como um fluorfloro doador e fluorfloro receptor, respectivamente. Vários pares de fluorforo/extintor convenientes são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Glazer e outros, Current Opinion in Biotechnology, 1997; 8:94-102; Tyagi e outros., 1998, Nat. Biotechnol., 16:49-53) e estão facilmente disponibilizadas comercialmente a partir de, por exemplo, Molecular Probes (Junction City, Oreg.), e Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Os exemplos de fluorfloros doadores que podem ser usados com vários fluorfloros receptores incluem, porém, sem limitação, fluoresceína, Amarelo Lucifer, Bficoeritrina, 9-acridineisotiocianato, Amarelo VS Lucifer, ácido 4acetamido-4'-isotio-cianatostilbeno-2,2'-dissulfônico, 7-dietilamino-3(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina, 1-pirenobutirato de sucinimidila e derivados de ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatostilbeno-2-,2'-dissulfônico. Os fluorfloros receptores tipicamente dependem do fluorfloro
20/68 doador usado. Os exemplos de fluorfloros receptores incluem, porém, sem limitação, LC-Vermelho 640, LC-Vermelho 705, Cy5, Cy5.5, cloreto de sulfonila de rodamina B de lissamina, isotiocianato de rodamina de tetrametila, rodamina x isotiocianato, isotiocianato de eritrosina, fluoresceína, pentaacetato de dietilenotriamina ou outros quelados de ions de Lantanídeo (por exemplo, Európio ou Térbio). Os fluorfloros doadores e receptores estão facilmente disponibilizados comercialmente de, por exemplo, Molecular Probes or Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.). Os pares de flouroforo/ extintor úteis nas composições e métodos descritos aqui são bem conhecidos na técnica, e podem ser encontrados, por exemplo, descritos em S. Marras, “Selection of fluoroforo and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes” disponível no site mundial molecular-beacons.org/ download/marras, mmb06%28335%293.pdf (a partir de 11 de abril de 2012).
[0056] O processo de detecção usado nos ensaios descritos aqui vantajosamente permite múltiplas medições concorrentes de múltiplas frações detectáveis, por exemplo, uma pluralidade de sondas contendo diferentes frações detectáveis etc. Em algumas modalidades, essas medições podem ser tomadas de câmaras de reação separadas em um cartucho microfluídico, por exemplo , compreendendo uma camada da câmara (a camada da câmara referindo-se aqui àquela parte do cartucho microfluídico contendo as câmaras de reação). Certas dessas modalidades realizam uma pluralidade de reações de amplificação simultaneamente em uma única câmara de reação, por exemplo, PCR multiplex. Um protocolo PCR pode compreender normas para realizar a desnaturação e o recozimento sucessivos dos polinucleotídeos na câmara de reação antes da detecção. Em certas modalidades, o mecanismo é configurado para facilitar o aquecimento e/ou resfriamento consistente através de uma pluralidade de câmaras de reação para realizar a amplificação de ácido nucleico, e para facilitar a detecção de amplicons alvos em câmaras de reação individuais, por exemplo, detec21/68 tando-se emissões fluorescentes, usando um conjunto de sensores.
[0057] Em certas modalidades, o mecanismo pode compreender uma placa perfurada que facilita o aquecimento e resfriamento consistente das câmaras de reação aplicando-se pressão a um cartucho contendo uma pluralidade de câmaras de reação através de múltiplos pares ópticos independentes. A placa perfurada é preferivelmente configurada para permitir e facilitar a geração e detecção de sinais fluorescentes de sondas em múltiplas câmaras de reação independentes. Em algumas modalidades, a placa perfurada é configurada tal que haja uma abertura individual (ou janelas), posicionada sobre cada das câmaras de reação individuais no cartucho microfluídico.
Mecanismo de Diagnóstico [0058] Figuras IA e 1B mostram um mecanismo de diagnóstico 10 de certas das presentes modalidades. Na modalidade ilustrada na Figura IA, o mecanismo de diagnóstico inclui um compartimento do mecanismo 30. O compartimento 30 pode garantir um ambiente controlado para o processamento das amostras microfluídicas e para prevenir a luz indesejável de entrar no espaço de detecção. O compartimento 30 pode compreender uma cobertura 16 que inclui um cabo 14 e uma janela translucente 12. A cobertura 16 pode ser abaixada para fechar a abertura na frente do mecanismo de diagnóstico 10 quando o mecanismo de diagnóstico 10 está em operação.
[0059] Como visto nas modalidades das Figuras IA e 1B, o mecanismo de diagnóstico 10 pode alojar duas prateleiras de espécime 24a, 24b na parte frontal do mecanismo de diagnóstico 10. O técnico versado apreciará, entretanto, que a descrição do mecanismo de diagnóstico nas Figuras IA e 1B é exemplar somente, e que em algumas modalidades, o mecanismo pode ser configurado para alojar mais do que duas prateleiras de espécimes, por exemplo, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove,
22/68 dez ou mais prateleiras de espécime. Preferivelmente, o mecanismo é configurado para alojar o mesmo número de prateleiras de espécime, por exemplo, duas, como cartuchos microfluídicos.
[0060] Em algumas modalidades, cada prateleira de espécime 24a, 24b pode incluir múltiplos cabos 26. Os cabos 26 podem incluir receptáculos para segurar os reagentes de diagnóstico, tais como reagentes para a amplificação de ácido nucleico, por exemplo, reagentes de PCR ou similares. As prateleiras 24 também podem incluir tubos de espécimes (não mostrados) e tubos de mistura (não mostrados) para preparar as amostras prontas para diagnóstico, tais como amostras prontas para amplificação. O mecanismo pode preparar os reagentes desejados nas prateleiras 24a, 24b usando o distribuidor 400. Outra descrição de vários distribuidores de fluido pode ser encontrada em, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos 2009-0130719 e Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos 2009-0155123, incorporadas aqui por referência.
[0061] Em algumas modalidades, as câmaras de reação no cartucho microfluídico(s) inclui um ou mais reagentes, tampões etc., usados no ensaio de amplificação de nucleico. Por exemplo, em algumas modalidades, as câmaras de reação do cartucho microfluídico pode incluir, por exemplo, iniciadores de amplificação, sondas, nucleotídeos, enzimas tais como polimerase, agentes de tamponamento ou similares. Por modo de exemplo, em algumas modalidades, as câmaras de reação podem incluir reagentes liofilizados, aos quais a amostra biológica processada (por exemplo, uma solução de ácidos nucleicos extraídos) é adicionada. Os fluidos preparados podem em seguida ser transferidos para um cartucho microfluídico e ser inserido no aquecedor/módulo ópticos 500a, 500b para processamento e análise.
[0062] A Figura IA é uma visão plana frontal do mecanismo de diagnóstico 10 de certas modalidades. Como visto na Figura IA, o meca
23/68 nismo de diagnóstico 10 pode incluir um fluido, distribuidor 400, montado em um trilho lateral 20. O trilho lateral 20 pode ser parte de um pórtico motorizado 18, que pode também incluir um trilho dianteiro-traseiro 22 (não mostrado). O trilho dianteiro-traseiro 22 pode ser conectado ao trilho lateral 20 e montado perpendicularmente ao trilho lateral 20 no mecanismo de diagnóstico 10.
[0063] A Figura IA também ilustra a cobertura 28 sobre o aquecedor/módulo óptico 500a, 500b. Os trilhos de recepção 520a e 520b podem estar localizados debaixo ou dentro do aquecedor/módulo óptico 500a, 500b. O trilho de recepção 520a é ilustrado em uma posição aberta, tornando-o disponível para receber um cartucho microfluídico 200. O trilho de recepção 520b é ilustrado em uma posição fechada. O fechamento do trilho não somente coloca os reagentes na posição apropriada para o processamento, porém também adicionalmente protege o interior do aquecedor/módulo óptico de receber qualquer luz indesejada. Onde a luz difusa foi introduzida na área de detecção, o sistema pode identificar níveis fluorescentes errôneos derivados de luz que não é emitida da câmara de reação.
[0064] A Figura IB é uma visão em perspectiva do mecanismo de diagnóstico 10 mostrando certos componentes internos encontrados em certas modalidades. Para melhor ilustrar certos aspectos, o compartimento de mecanismo 30, a cobertura 16, e o aquecedor/cobertura óptica 28 encontrados na Figura IA foram removidos a partir da visão na Figura 1B. Mostrado na Figura 1B é o pórtico 18, incluindo o trilho lateral 20, trilho dianteiro-traseiro 22. O distribuidor de fluido 400 pode ser montado no trilho lateral 20 e pode deslizar lateralmente ao longo do comprimento do trilho lateral 20. O trilho lateral 20 pode ser conectado ao trilho dianteiro-traseiro 22 que pode se mover na direção dianteira-traseira. Dessa maneira, o distribuidor de fluido 400 está disponível para se mover na direção X, Y em todo o dispositivo de
24/68 diagnóstico 10. Como descrito abaixo, o distribuidor de fluido 400 também pode ser capaz de se mover para cima e para baixo no plano z do trilho lateral 20, desse modo dando ao distribuidor 400 a capacidade de se mover em três graus direcionais em todo o dispositivo de diagnóstico 10.
[0065] Também mostrado na Figura 1B são os aquecedores/módulos ópticos 500a, 500b com a cobertura 28 dos aquecedores/módulos ópticos da Figura IA removida. Os trilhos de recepção 520a e 520b são descritos na posição aberta e estão cada segurando os cartuchos 200. Em algumas modalidades, os trilhos de recepção podem cada incluir um substrato aquecedor 600 (não mostrado) por baixo de cada dos cartuchos microfluídicos 200. Os aquecedores/módulos ópticos 500a, 500b também podem cada incluir uma cabeça do detector 700 descrita em maiores detalhes abaixo.
[0066] Como será descrito em maiores detalhes abaixo, o mecanismo de diagnóstico 10 pode ser capaz de conduzir os diagnósticos em tempo real em uma ou mais amostras. A amostra a ser testada pode primeiro ser colocada em um tubo de espécime (não mostrado) na prateleira 24a ou 24b. Os reagentes de diagnóstico podem estar localizados nos cabos 26 na prateleira 24a dentro do mecanismo de diagnóstico 10. O distribuidor de fluido 400 pode misturar e preparar a amostra para o teste de diagnóstico e pode em seguida liberar a amostra preparada para o cartucho microfluídico 200 para a ciclagem térmica e detecção de analisado nos aquecedores/módulos ópticos 500a, 500b. Alternativamente, o distribuidor de fluido 400 pode liberar amostras de ácido nucleico para as câmaras de reação do cartucho microfluídico, sendo que as câmaras de reação do cartucho microfluídico já contêm reagentes para uma reação de amplificação.
[0067] A FIGURA 2 ilustra uma visão interior do mecanismo de diagnóstico 10, mostrando a prateleira 24a que segura vários tubos de
25/68 amostra 32 e cabos de reagente 26, e um cartucho 200 situado no trilho de recepção 520a. O trilho de recepção 520a está em uma posição aberta que se estende do aquecedor/módulo óptico 500a que tem a cobertura 28 presa. O trilho de recepção 520b está em uma posição fechada. Vantajosamente, em algumas modalidades os trilhos de recepção 520a, b podem permitir fácil colocação do cartucho microfluídico 200, por um usuário ou por um dispositivo de auto-carregamento. Tal desenho pode também acomodar pipetagem multiplexada de amostras usando o distribuidor de fluido robótico 400.
Bandeja de Recepção [0068] Como ilustrado na Figura 2, a baía de recesso 524 pode ser uma “parte” do trilho de recepção 520 que é configurado para seletivamente receber o cartucho microfluídico 200. Por exemplo, a baía de recesso 524 e o cartucho microfluídico 200 podem ter uma borda 526 que é complementar na forma de modo que o cartucho microfluídico 200 seja seletivamente recebido em, por exemplo, uma única orientação. Por exemplo, o cartucho microfluídico 200 pode ter um membro de registro 202 que se ajusta em um aspecto complementar da baía. O membro de registro 202 pode ser, por exemplo, um corte em uma borda do cartucho 200 (como mostrado na Figura 3A) ou um ou mais entalhes que são feitos em um ou mais dos lados. O técnico versado facilmente apreciará que a complementariedade entre o cartucho e a baía de recepção pode ser facilmente obtida utilizando outras disposições adequadas, por exemplo, um poste ou protrusão que se ajusta em uma abertura. Ao seletivamente receber o cartucho 200, a baía de recesso 524 pode ajudar um usuário a colocar o cartucho 200 de modo que o módulo óptico 502 possa apropriadamente operar no cartucho 200. Desse modo, o alinhamento livre de erro dos cartuchos 200 pode ser obtido.
[0069] O trilho de recepção 520 pode ser alinhado de modo que vários componentes do mecanismo que podem operar no cartucho microíluídi26/68 co 200 (tal como, fontes de calor, detectores, membros de força, e similares) sejam posicionados para apropriadamente operar no cartucho microfluídico 200 ao mesmo tempo em que o cartucho 200 é recebido na baía de recesso 524 do trilho de recepção 520. Por exemplo, o contato das fontes e calor no substrato aquecedor 600 pode estar posicionado na baía de recesso 524 tal que as fontes de calor possam ser termicamente acopladas aos locais distintos no cartucho microfluídico 200 que é recebido no trilho de recepção 520.
Cartucho Microfluídico [0070] Certas modalidades contemplam um cartucho microfluídico configurado para realizar a amplificação, tal como por PCR, de um ou mais polinucleotídeos de uma ou mais amostras. Por cartucho é entendida uma unidade que pode ser descartável ou reutilizável no todo ou em parte, e que pode ser configurada para ser usada em conjunto com algum outro mecanismo que tenha sido adequadamente e complementarmente configurada para receber e operar (tal como liberar energia para) no cartucho.
[0071] Por microfluídico, como usado aqui, é entendido que os volumes da amostra, e/ou reagente, e/ou polinucleotídeo amplificado são de cerca de 0,1 pL a cerca de 999 pL, tal como de 1 -100 pL ou de 2-25 pL, como definido acima. Similarmente, quando aplicado a um cartucho, o termo microfluídico significa que vários componentes e canais do cartucho, como também descrito aqui, são configurados para aceitar, e/ou reter, e/ou facilitar a passagem dos volumes microfluídicos da amostra, reagente ou polinucleotídeo amplificado. Certas modalidades aqui também podem funcionar com volumes de nanolitro (na faixa de 10-500 nanolitros, tal como 100 nanolitros).
[0072] A Figura 3A é uma visão plana da parte superior de um cartucho microfluídico 200. O cartucho 200 pode compreender uma pluralidade
27/68 de faixas de amostra 1706a-c. As faixas podem levar às câmaras de PCR 1703 localizadas nos lados “esquerdo” e “direito” (isto é, fileiras) do cartucho. Como indicado na Figura 3a, as faixas podem fornecer orifícios de entrada 1705 em um local conveniente próximo do usuário. Entretanto, as faixas às quais os orifícios estão conectados podem em seguida tomar vias independentes para separar as câmaras 1703a-c. Na modalidade da Figura 3a, por exemplo, a primeira faixa 1706a está em comunicação com a primeira câmara 1703a do lado esquerdo, a segunda faixa 1706b está em comunicação com a primeira câmara do lado direito 1703b, a terceira faixa 1706c está em comunicação com a segunda câmara 1703c do lado esquerdo etc. Cada das faixas microfluídicas pode também compreender as válvulas de microfluídicas 1702, 1704, entradas de microfluídicos, e canais de microfluídico. Essas entradas e válvulas podem ser configuradas, por exemplo, por atuação térmica, para facilitar a liberação temporizada e difusão controlada de certos fluidos nas faixas 1706 do cartucho 200. O cartucho desta modalidade pode compreender furos de ventilação 1701 que previne o ar de bloquear a passagem de fluido no cartucho. Outra descrição de vários componentes de cartucho, tais como válvulas, pode ser encontrada em, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos 2009-0130719, incorporada aqui por referência.
[0073] O cartucho microfluídico 200 pode incluir um membro de registro 202, por exemplo, um corte, que corresponde a uma borda complementar na baía de recesso 524 do trilho de recepção 520a,b dos aquecedores/módulos ópticos 500a, 500b. O membro de registro 202 e a borda complementar 526 pode permitir a colocação segura e correta do cartucho microfluídico 200 no trilho de recepção 520a, b.
[0074] Em várias modalidades, os componentes de uma rede de microfluídicos nas faixas da amostra 1706 do cartucho 200 podem ser aquecidos termicamente acoplando-os com os aquecedores em um substrato
28/68 aquecedor 600. O substrato aquecedor 600 pode ser configurado para aquecer uma mistura da amostra compreendendo reagentes de amplificação e uma amostra de polinucleotídeo pronta para amplificação e faz com que ela passe por condições de ciclagem térmicas adequadas para criar amplicons da amostra pronta para amplificação. O substrato aquecedor 600 pode estar localizado no cartucho 200 em algumas modalidades ou na baía de recesso 524.
[0075] A rede de microfluídico em cada faixa pode ser configurada para realizar a amplificação de ácido nucleico, tal como por PCR, em uma amostra pronta para amplificação, tal como um contendo ácido nucleico extraído de uma amostra. Uma amostra pronta para amplificação pode compreender uma mistura de reagentes de amplificação e a amostra de polinucleotídeo extraída. A mistura pode ser adequada para se submeter às condições de ciclagem térmica par criar amplicons da amostra de polinucleotídeo extraída. Por exemplo, uma amostra pronta para amplificação, tal como uma amostra pronta para PCR, pode incluir uma mistura de reagente de PCR compreendendo uma enzima polimerase, um ácido nucleico de controle positivo, uma sonda de hibridização fluorgênica seletiva para pelo menos uma parte do ácido nucleico de controle positivo e uma pluralidade de nucleotídeos, e pelo menos uma sonda que é seletiva para uma sequência de polinucleotídeo alvo. A rede de microfluídico pode ser configurada para acoplar calor de uma fonte de calor externa com a mistura compreendendo o reagente de PCR e a amostra de polinucleotídeo extraída sob condições de ciclagem térmica adequadas para criar amplicons de PCR da amostra de polinucleotídeo extraída.
[0076] Em várias modalidades, a mistura de reagente pode compreender rótulos fluorescentes ou outros rótulos opticamente detectáveis para a detecção da geração de um amplicon desejado. Em algumas modalidades, múltiplos conjuntos de iniciadores e múltiplos rótulos
29/68 podem ser usados em um formato de ensaio multiplex, por exemplo, PCR multiplexado, onde cada de uma pluralidade de diferentes amplicons pode ser detectada em uma única câmara de reação, se presente. Por exemplo, uma câmara de ensaio pôde incluir ácidos nucleicos modelos de uma amostra de teste, ácidos nucleicos modelos de controle positivo, um ou mais pares de iniciadores para a amplificação de sequências alvo específicas, uma ou mais sondas para a detecção de amplicons alvos, e um ou mais pares de iniciadores e uma sonda para a detecção de amplicons de controle positivo. Adicionalmente, o técnico versado apreciará que em algumas modalidades, o cartucho microfluídico acomoda um polinucleotídeo de controle negativo que não produzirá um amplicon com pares de iniciadores usados para amplificar as sequências de controle positivo ou alvo.
[0077] Em certas das modalidades ilustradas, as câmaras 1703a-c respectivamente associadas com cada faixa 1706a-c de um cartucho de multi-faixa 200 podem realizar reações de amplificação independentes. Os resultados das reações para a primeira coluna de câmaras (1703a, 1703b) para as duas primeiras faixas (1706a, 1706b) podem então ser simultaneamente e independentemente medidos usando uma cabeça do detector que compreende um par de fonte de luz-fotodetectores esquerdo e direito. Isto é, cada câmara 1703a-b de cada faixa 1706a-b pode receber luz de uma fonte de luz separada e ser observada por um fotodetector separado simultaneamente. Dessa maneira, uma variedade de combinações de reações pode ser realizada no cartucho eficazmente. Por exemplo, em algumas modalidades, uma pluralidade de ensaios de amplificação para a detecção de uma pluralidade de ácidos nucleicos alvos pode ser realizada em uma faixa, um controle positivo e um controle negativo em duas outras faixas; ou um ou mais ensaios de amplificação para a detecção de um ou mais ácidos nucleicos alvos, respectivamente, em combinação com um controle positivo interno em uma faixa, com um controle negativo em uma faixa separada. Em uma
30/68 modalidade particular, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais ensaios são multiplexados em uma única faixa, com pelo menos aquele número de fluorforos fluorescentemente distintos na câmara de reação.
[0078] Um cartucho microfluídico 200 pode ser construído de várias camadas. Consequentemente, um aspecto da presente tecnologia se refere a um cartucho micro fluídico que compreende uma primeira, segunda, terceira, quarta e quinta camadas sendo que uma ou mais camadas definem uma pluralidade de redes de microfluídicos, cada rede tendo vários componentes configurados para realizar PCR em uma amostra na qual a presença ou ausência de um ou mais polinucleotídeos deve ser determinada. Em outra modalidade, o cartucho microfluídico 200 pode compreender uma pluralidade de faixas, cada incluindo uma câmara de reação, cauterizada ou moldada em um único plano, tal como em um substrato plástico moldado, com cada faixa sendo fechada por uma camada de cobertura, tal como uma camada de película plástica adesiva. As modalidades com 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30 ou mais faixas por cartucho são contempladas. Por exemplo, um desenho adequado é um único cartucho 200 tendo 24 câmaras de reação, dispostas em duas fileiras de 12 câmaras de reação, opcionalmente tendo orifícios de entrada relativamente alinhados. Outra descrição de vários cartuchos e seus componentes pode ser encontrada em, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos
2008- 0182301 e Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos
2009- 0130719, incorporadas aqui por referência.
Substrato Aquecedor [0079] Mostrada na Figura 3B é uma visão plana da parte superior de certas modalidades do substrato aquecedor 600. Qualquer tipo de aquecedor pode ser usado, incluindo aquecedores resistivos, Peltier ou de fluido móvel, com resfriamento passivo ou ativo contemplado. Uma das muitas possíveis modalidades inclui uma pluralidade de aquecedo
31/68 res resistivos em contato térmico com cada câmara de reação, preferivelmente também incluindo um ou mais sensores de temperatura. Porque os aquecedores resistivos também exibem algum efeito termistor, isto é, sua resistência muda com a temperatura, os aquecedores resistivos sozinhos podem dobrar como sensores de temperatura, permitindo o controle preciso da temperatura de cada câmara de reação ao mesmo tempo em que simplificando o desenho do produto. Embora os aquecedores possam ser controlados em conjunto com cada outro, em algumas modalidades cada câmara de reação pode ter um ou mais aquecedores individuais em contato térmico entre eles, tais que os aquecedores sejam separadamente controláveis e cada câmara de reação possa ser aquecida e permitida resfriar independentemente das outras câmaras de reação. Isso permite que diferentes ensaios sejam realizados simultaneamente em cada de uma pluralidade de câmaras de reação. Uma montagem de aquecedor resistivo particular para uso com uma câmara de reação individual é mostrada na Figura 3B. Na modalidade mostrada na Figura 3B, qualquer combinação de um aquecedor sensor /sensor superior 1604, um aquecedor/sensor de base 1603, um aquecedor/sensor lateral 1601 e um aquecedor/sensor central 1602 podem ser usados para aquecer a câmara de reação localizada acima. Para facilidade de compreensão, uma descrição da câmara PCR 1703 de certas modalidades é sobreposta no substrato aquecedor. Em certas modalidades, os aquecedores no substrato aquecedor 600 podem ser aquecedores de contato. Tais aquecedores de contato podem compreender (por exemplo) um aquecedor resistivo (ou rede do mesmo), um radiador, um permutador de calor fluídico e um dispositivo Peltier. A fonte de calor de contato pode ser configurada na baía de recesso 524 para ser termicamente acoplada a um ou mais locais distintos do cartucho microfluídico 200 recebido no trilho de recepção 520a, b por meio do qual os locais distintos são seletivamente aquecidos. As fontes de calor de contato podem cada ser configurada no substrato aquecedor 600 para ser independentemente termicamente acoplada a um local
32/68 distinto diferente em um cartucho microfluídico 200 recebido no trilho de recepção 520a,b por meio do qual os locais distintos são independentemente aquecidos. As fontes de calor de contato podem vantajosamente ser configuradas para estar em contato físico direto com locais distintos de um cartucho microfluídico 200 recebido no trilho de recepção 520a,b. Em várias modalidades, cada aquecedor de fonte de contato pode ser configurada para aquecer um local distinto tendo um diâmetro médio em 2 dimensões de cerca de 1 milímetro (mm) a cerca de 15 mm (tipicamente cerca de 1 mm a cerca de 10 mm) ou um local distinto tendo uma área de superfície dentre cerca de 1 mm cerca de 225 mm (em algumas modalidades entre cerca de 1 mm e cerca de 100 mm ou em algumas modalidades entre cerca de 5 mm e cerca de 50 mm).
[0080] O substrato aquecedor 600 pode ser organizado em “faixas” 1605a, b em paralelo com a estrutura das faixas 1706a-c do cartucho 200. Em algumas modalidades, o substrato aquecedor 600 pode incluir 24 faixas de aquecedor 1605a, 1605b correspondendo às faixas de amostra 1706 do cartucho 200. Quando o cartucho microfluídico 200 é colocado na baía de recesso 524 do trilho de recepção 520a,b, os componentes do cartucho 200 podem ser alinhados adjacentes a, e acima, dos aquecedores correspondentes no substrato aquecedor 600. Quando o cartucho microfluídico 200 é colocado na baía de recesso 524, os aquecedores podem estar em contato físico com os respectivos componentes. Em algumas modalidades os aquecedores permanecem termicamente acoplados aos seus respectivos componentes, por exemplo, através de um ou mais materiais ou camadas intermediárias, embora não em contato físico direto. Outra descrição de faixas pode ser encontrada, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos 2009-0130719, aqui incorporada por referência.
[0081] Em algumas modalidades, os múltiplos aquecedores podem ser
33/68 configurados para simultaneamente e uniformemente ativar para aquecer seus respectivos componentes de cartucho adjacentes da rede de microfluídico no cartucho microfluídico 200. Cada aquecedor pode ser independentemente controlado por um processador e/ou circuito de controle usado em conjunto com o mecanismo descrito aqui. Geralmente, o aquecimento de componentes microfluídicos (entradas, válvulas, câmaras etc.) no cartucho microfluídico 200, é controlado passando-se correntes através de aquecedores micro-fabricados adequadamente configurados, em controle de circuito adequado, as faixas 1706 de um cartucho de multi-faixa podem em seguida ser aquecidas independentemente, e desse modo controladas independentemente, uma da outra. Além disso, como descrito em maiores detalhes abaixo, os aquecedores individuais 1601-1604 podem ser aquecidos independentemente, e desse modo controlados independentemente, um do outro. Isto pode levar a um controle e eficiência de energia maior do mecanismo, porque nem todos os aquecedores estão aquecendo ao mesmo tempo, e um determinado aquecedor está recebendo corrente durante somente aquela fração de tempo quando é requerido aquecer.
[0082] O substrato aquecedor 600 pode também incluir um ou mais sensores de calor. Para reduzir o número de sensores ou aquecedores requerido para controlar os aquecedores em uma faixa de aquecedores 1605a, 1605b, os aquecedores podem ser usados para sentir a temperatura bem como calor, e desse modo evitar a necessidade de ter um sensor dedicado separado para cada aquecedor. Por exemplo, a impedância e/ou resistência de alguns materiais mudam com a temperatura circundante. Consequentemente, a resistência de aquecedor/sensores 1601 -1604 pode ser usada como uma indicação de temperatura enquanto os sensores não estão sendo ativamente aquecidos.
[0083] Em algumas modalidades, os aquecedores no substrato aquecedor 600 podem ser designados para ter voltagem suficiente para permi
34/68 tir que os aquecedores sejam agrupados em séries ou em paralelo para reduzir o número de elementos eletronicamente controláveis, desse modo reduzindo a carga do circuito eletrônico associado. Os aquecedores que são agrupados juntos desta maneira seriam operados em controle sincronizado e substancialmente simultâneo.
[0084] Em algumas modalidades, os aquecedores da câmara de reação em lados opostos dos aquecedores do segundo estágio podem ser agrupados e configurados para operar em controle sincronizado. Por exemplo, em algumas modalidades, os aquecedores de PCR/amplificação 1601 -1602 podem ser agrupados e configurados para operar em controle sincronizado. As configurações e agrupamentos alternativos podem ser aplicados a outros grupos de aquecedor dos aquecedores de PCR/amplificação 1601 -1604. Os Aquecedores de PCR/amplificação 1601 -1604 podem ser configurados para operar individualmente e independentemente ou eles podem ser configurados para operar em grupos de dois (pares), três (trios), quatro, cinco ou seis.
[0085] Em algumas modalidades, o aquecimento pode ser controlado periodicamente ligando e desligando a corrente para um respectivo aquecedor com modulação de largura de pulso variada (PWM), sendo que a modulação de largura de pulso se refere a relação de tempo ligado/tempo desligado para a corrente. A corrente pode ser fornecida conectando-se um micro aquecedor fabricado a uma fonte de alta voltagem (por exemplo, 30V), que pode ser bloqueada pelo sinal PWM. Em algumas modalidades, o dispositivo pode incluir geradores de sinal 48 PWM. Em algumas modalidades há dois geradores de sinal PWM associados com cada câmara de reação. A operação de um gerador PWM pode incluir a geração de um sinal com um período escolhido, programável (a contagem final) e granularidade. Por exemplo, o sinal pode ser 4000 us (micro-segundos) com uma granularidade de 1 us, em cujo caso o gerador de PWM pode manter um contador começando em
35/68 zero e avançando em incrementos de 1 us até alcançar 4000 us, quando ele retorna para zero. Desse modo, a quantidade de calor produzido pode ser ajustada ajustando-se a contagem final. Uma contagem final elevada corresponde a uma maior duração de tempo durante o qual o micro aquecedor fabricado recebe corrente e, portanto, uma maior quantidade de calor é produzida.
[0086] Em várias modalidades, a operação de um gerador de PWM pode também incluir uma contagem inicial programável além da granularidade e contagem final supracitada. Em tais modalidades, múltiplos geradores de PWM podem produzir sinais que podem ser seletivamente não sobrepostos (por exemplo, por multiplexação do tempo ligado dos vários aquecedores) tal que a capacidade da corrente de alta tensão não seja excedida.
[0087] Múltiplos aquecedores podem ser controlados por diferentes geradores de sinal PWM com contagens finais e iniciais variadas. Os aquecedores podem ser divididos em bancos, por meio dos quais um banco define um grupo de aquecedores da mesma contagem inicial. O controle de elementos de aquecimento, e elementos de resfriamento, se presente, em certas modalidades é descrito em detalhes adicionais abaixo.
Módulo Óptico [0088] As Figuras 4A-C ilustram o aquecedor/módulo óptico 500 do mecanismo de detecção 10 encontrado em certas modalidades. O aquecedor/módulo óptico 500 pode compreender um módulo óptico 502 e um trilho de recepção 520 ou uma parte do trilho de recepção. Figura 4A mostra uma modalidade do módulo óptico fechado 502 tendo um motor 504 externamente preso a ele para direcionar o movimento da cabeça do detector 700. A cabeça do detector 700 pode estar alojada dentro do módulo óptico 502. A Figura 4A ilustra o trilho de recepção
36/68
520 acoplado a um lado de base 506 do módulo óptico 502. O trilho de recepção 520 pode receber um cartucho 200 compreendendo amostras sob as quais a detecção deve ser realizada. Após receber as amostras, o trilho de recepção 520 pode ser movido (por exemplo, mecanicamente ou manualmente) nos trilhos 522 para uma posição debaixo do módulo óptico 502. Em algumas modalidades, descrito em maiores detalhes abaixo, o trilho de recepção pode compreender um dispositivo de autocarregamento, que automaticamente alinha o cartucho uma vez que posicionado debaixo do módulo óptico 502. Em algumas modalidades, uma baía de recesso 524 do trilho de recepção 520 pode conter um substrato aquecedor 600. Em algumas modalidades, o trilho de recepção pode subsequentemente ser elevado para colocar o cartucho em contato com o módulo óptico 502, tal como em contato com uma placa perfurada 540 na base do módulo óptico 502.
[0089] A Figura 4B ilustra uma modalidade do módulo óptico 502 com um painel frontal 508 removido para mostrar o interior do módulo óptico 502. Mostrada na Figura 4B é a cabeça do detector 700. Como descrito em detalhes abaixo, o movimento da cabeça do detector 700 pode ser direcionada pelo motor 504 para se mover lateralmente através do interior do módulo óptico 502 para fornecer detecção e varredura óptica no cartucho 200 quando o cartucho 200 está posicionado abaixo do módulo óptico 502 no trilho de recepção 520. Mostrada na Figura 4B é uma placa perfurada 540, posicionada no lado de base 506 do módulo óptico 502.
[0090] A Figura 4C fornece uma visão plana de base do módulo óptico 502. Mostrada na Figura 4C é a placa perfurada 540 e uma placa normalizadora 546 presa à base do 506 do módulo óptico 502. A placa normalizadora pode ser usada para calibrar a fonte de luz -pares de fotodetectores da cabeça do detector. A placa normalizadora 546 preferivelmente compreende um ou mais componentes tendo caracterís
37/68 ticas ópticas padronizadas, conhecidas, e é configurada para calibrar, padronizar ou confirmar a operação apropriada da cabeça do detector 700 e circuito associado. A placa normalizadora 546 pode se estender no módulo óptico e na cabeça do detector 700 pode estar posicionada sobre a placa normalizadora. Em algumas modalidades, antes do início das medições ópticas o cartucho da cabeça do detector 700 é calibrado usando as propriedades conhecidas da placa normalizadora 546. Se a cabeça do detector 700 não está trabalhando apropriadamente, ação corretiva pode ser tomada, tal com incluindo uma compensação nas medições ou notificar o usuário do erro. Em algumas modalidades, a placa normalizadora pode ser feita de material opticamente transparente tal como policarbonato misturado com uma tinta altamente fluorescente ou outro cromóforo ou fluorforo padronizado. Em uma modalidade, a placa normalizadora inclui um cromóforo ou fluorforo padronizado para cada canal ou cor na cabeça do detector 700.
[0091] Como mostrado na Figura 4C, a placa perfurada 540 contém as aberturas 557. As dimensões das aberturas 557 são tais que as fontes de luz do detector e fotodetectores possam ter acesso aos (opticamente excitar ou visualizar) teores nas câmaras de reação do cartucho 200 quando o detector é movido para uma pluralidade de posições no módulo óptico 502. Isto é, quando um par de fonte de luzfotodetectores do detector é localizado em uma posição sobre uma luz de abertura particular pode percorrer da fonte de luz e alcançar o reator da câmara através da abertura 557. Os reagentes fluorescentes na câmara de reação podem em seguida ser visíveis para os fotodetectores através da abertura 557.
Cabeça do Detector [0092] A Figura 5 mostra um perfil da cabeça do detector 700 tomado ao longo da linha 13 da Figura 4B. A cabeça do detector 700 pode ser configurada para opticamente excitar e/ou monitorar a fluorescência
38/68 emitida em conjunto com a detecção de um ou mais polinucleotídeos presentes nas câmaras de reação 1703. Notar que um resultado positivo (presença de um amplicon alvo) pode ser indicado por fluorescência aumentada ou fluorescência diminuída, dependendo do desenho do ensaio. Por exemplo, quando o ensaio envolve um fluorforo e um extintor, o extintor pode extinguir a fluorescência quando o alvo está presente ou em outros desenhos do ensaio, quando o alvo está ausente. O sistema pode compreender, por exemplo, uma pluralidade de pares de detectores, por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 ou mais, tal como o par de detectores 726. Cada par de detectores 726 pode ser compreendido de uma fonte de luz 726a, tal como um díodo de emissão de luz (LED), e um detector de luz correspondente 726b, tal como um fotodíodo. A fonte de luz 726a pode seletivamente emitir luz em uma banda de absorção de uma sonda fluorescente. O detector de luz 726b pode seletivamente detectar luz em uma banda de emissão da sonda fluorescente, sendo que a sonda fluorescente corresponde a uma sonda de polinucleotídeo ou um fragmento da mesma. Em certas modalidades a fonte de luz 726a pode compreender um díodo filtrado por passagem de banda que seletivamente emite luz na banda de absorção da sonda fluorescente. O detector de luz 726b pode compreender um fotodiodo filtrado por passagem de banda que seletivamente detecta luz na banda de emissão de uma fração fluorescente, por exemplo, emissão de uma sonda fluorescente. Em certas modalidades, um filtro 726al, tal como um filtro de passagem de banda pode ser aplicado à luz da fonte de luz 726a. A luz da fonte de luz 726a passa através de um filtro antes de passar através da amostra no canal microfluídico (300g de profundidade em certas modalidades). Em certas modalidades, o comprimento da via óptica para a luz da câmara de reação para o detector de luz 726b pode ser muito pequeno. A luz incidente de fonte de luz 726a gera fluorescência na câmara de reação. A luz da câmara de reação então percorre até o detector de luz 726b. Certas modalidades procuram mitigar a entrada
39/68 de qualquer luz indesejada no detector e desse modo adversamente afetar o sinal de luz da câmara de reação.
[0093] Em algumas modalidades, cada uma da pluralidade dos pares de detectores pode estar disposta ao longo do comprimento da cabeça do detector 700 nas fileiras. Isto é, atrás dos pares 726 e 727 ilustrados na Figura 5 pode estar outra coluna de pares em uma orientação similar ou igual. Por uma questão de explicação, uma coleção de cartuchos ou pares de detectores ao longo do comprimento do cartucho é referida como uma “fileira” e aqueles ao longo da largura como uma “coluna”. Desse modo, a direção vertical nas Figuras 3A e 6 indica uma “coluna” e a direção horizontal uma “fileira”. Certas modalidades contemplam seis ou mais colunas tais pares de detectores. Nessas modalidades, há 12 pares de detectores no total (duas fileiras d seis) com dois pares de detectores por coluna, permitindo 12 detecções separadas e simultâneas.
[0094] Cada fonte de luz, tal como, por exemplo, fonte de luz 726a, pode ser configurada para produzir luz de um comprimento de onda específico para uma fração fluorescente específica associada com, por exemplo, uma sonda, contida nas câmaras de reação. Cada detector de luz, tal como, por exemplo, 726b, pode ser configurada para detectar a luz emitida das sondas fluorescentes associadas com a luz produzida pelo emissor de luz no par de detectores. Os pares de detectores podem ser configurados para independentemente detectar uma pluralidade de frações fluorescentes, por exemplo, diferentes sondas fluorescentes, tendo diferentes espectros de emissão fluorescente, sendo que em cada câmara de reação, a emissão de cada sonda fluorescente é indicativa da presença ou ausência de um polinucleotídeo alvo particular ou um fragmento do mesmo. Embora trajetos de luz dobrados possam ser usadas, uma modalidade utiliza um par de detector e emissor onde cada está em contato óptico direto com a câmara de reação, preferível
40/68 mente simultaneamente em tal contato. Opcionalmente, o detector e emissor de um par são alinhados com a câmara de reação ao longo faz linhas que substancialmente intersectam-se em um ângulo agudo na câmara de reação. O ângulo pode ser, por exemplo, entre cerca de 5 e 70 graus, preferivelmente entre cerca de 8 e 60 graus, mais preferivelmente entre cerca de 10 e 50 graus.
[0095] Em algumas modalidades, a cabeça do detector inclui duas fileiras de pares de fotodetectores e fonte de luz que correspondem a duas fileiras de câmaras de reação de cartuchos microíluídicos, quando presente no mecanismo. Por exemplo, a cabeça do detector pode incluir uma primeira ou superficial fileira de seis fotodetectores e pares de fonte de luz, e uma segunda ou fileira de base de fotodetectores e pares de fonte de luz, que são configuradas para consultar a primeira e segunda fileiras de câmaras de reação em um cartucho microfluídico, respectivamente.
[0096] A Figura 6 ilustra um possível layout de fotodetector e da fonte de luz implementado em certas modalidades do detector. A primeira coluna compreende emissores de luz ROX 201a, 201b e detectores correspondentes 207a, 207b. A segunda coluna compreende emissores de luz HRM 201c, 20ld e detectores correspondentes 207c, 207d. A terceira coluna compreende emissores de luz CY5 20 le, 20 lf e detectores correspondentes 207e, 207f. A quarta coluna compreende emissores de luz FAM 20lg, 20lh e detectores correspondentes 207g, 207h. A quinta coluna compreende os emissores de luz Q705 20li, 20lj e detectores correspondentes 207i, 207j. A sexta coluna compreende emissores de luz VIC 20 Ik, 2011 e detectores correspondentes 207k, 2071. Em alguns casos, os detectores e emissores são selecionados com referência aos fluorforos particulares a serem usados em um ensaio. Na modalidade ilustrada na Figura 6, os pares de detector e fonte de luz da primeira ou fileira superficial compreendem uma pluralidade de
41/68 pares de fotodetectores e fonte de luz, por exemplo, emissores 201a, 201c, 201e, 201g, 201i, e 201k e detectores 207a, 207c, 207e, 207g, 207i, e 207k. Os pares de detector e fonte de luz da segunda ou fileira de base compreendem uma pluralidade de pares de fotodetectores e fonte de luz, por exemplo, emissores 201b, 20Id, 20If, 20lh, 20Ij, e 2011 e detectores 207b, 207d, 207f, 207h, 207j, e 2071. Um resumo das propriedades de emissores e detectores exemplares é mostrado na Tabela 1 abaixo.
TABELA 1
Cor (Spec) Tinta (Ensaio) Nome do Comprimento de Onda (Ex/Em) Software No. de CT
Verde FAM 470/510 FAM 4
Amarelo TET, VIC 530/555 VIC 6
Laranja Texas Red, ROX 585/610 Cal Red/ROX 1
Vermelho Cy5 625/660 Cy5 3
Carmesim Cy5.5 680/715 Cy5.5 5
ultravioleta nulo ultravioleta HRM 2
[0097] A disposição exemplar de fotodetectores e fontes de luz descrita na Figura 6 pode inibir a interferência entre as colunas de detecção. Isto é, a faixa de comprimento de onda parta cada par de emissores e detectores pode ser selecionada para possuir uma sobreposição mínima com seus pares de emissor-detectores vizinhos. Desse modo, por exemplo, onde No. de CT se refere à coluna de um par particular de emissor-detectores em uma cabeça do detector de 6 colunas, Ex é o comprimento de onda de excitação de um fluorforo, e Em é o comprimento de onda de emissão adjacente da emissão, será evidente que comprimentos de onda não estão adjacentes um ao outro na cabeça do detector. Que a tintura de HRM da fileira é nula meramente indica que uma variedade de tintas, não requeridas para este exemplo particular,
42/68 pode ser usada. Em algumas modalidades, HRM se refere a uma “Fusão de Alta Resolução” e uma fonte de luz correspondente para estes fotodetectores pode compreender um LED operando no espectro ultravioleta. Alguém reconhecerá que as colunas podem ser dispostas em variações alternativas e que as seleções alternativas de fontes de emissão de luz e detectores podem ser substituídas por aquelas mostradas.
[0098] Os pares de emissor de luz e fotodetectores de cada coluna podem ser calibrados usando a placa normalizadora. Após a calibração, a cabeça do detector pode ser movida para uma posição tal que uma primeira coluna de pares de emissor de luz e fotodetectores esteja localizada sobre um primeiro grupo de faixas tal que cada par de emissores de luz e fotodetectores tenha acesso a uma câmara de reação das faixas. A detecção das câmaras de reação no primeiro grupo de faixas então será realizada usando a primeira coluna de emissores/detectores. Em seguida, a cabeça do detector pode ser movida para uma segunda posição tal que a primeira coluna fique sobre um segundo grupo de faixas e a segunda coluna fique sobre o primeiro grupo de faixas. A detecção das câmaras de reação no segundo grupo de faixas em seguida será realizada usando a primeira coluna de emissores/detectores e a detecção das câmaras de reação no primeiro grupo de faixas então será realizada usando a segunda coluna de emissores/detectores. O processo pode continuar até que cada coluna tenha passado sobre cada faixa. Desse modo, Para as colunas N de detectores e colunas M de câmaras, o detector realizará as detecções de pelo menos M + N - 1 posições. Por exemplo, nas modalidades da Figura 11 há 6 colunas. Para um cartucho compreendendo 12 faixas, o detector precisaria se mover entre pelo menos 17 posições (18 se a posição da calibração for considerada).
[0099] A Figura 7 descreve os resultados finais após a operação de certas modalidades. Plotados são os níveis fluorescentes detectados para cada par de emissor de luz-fotodetectores 801-805 com o passar
43/68 do tempo para uma única câmara de reação (ou reator) associada com uma única faixa. Após um número suficiente de iterações (aproximadamente 30 neste exemplo) do protocolo de recozimento e desnaturação, os detectores identificam os níveis crescentes de fluorescência no reator.
Placa da Câmara [0100] Certas das presentes modalidades se referem ao revestimento circundante e incluindo a camada da câmara. Particularmente, certas modalidades contemplam a fabricação de uma camada de abertura compreendendo características que vantajosamente facilitam os resultados consistentes através de experiências do módulo de aquecimento/detecção, como descrito em detalhes adicionais abaixo.
[0101] A Figura 8 ilustra a disposição do revestimento encontrada em certas modalidades da varredura do módulo óptico do termociclizador e do trilho de recepção e cartucho associados. Quando o cartucho é levado em proximidade da camada de abertura 540 do módulo óptico 500a, a camada térmica 600, camada da câmara 200 (que pode compreender um substrato de câmara), e camada de abertura 540 podem ser situadas como descrito na modalidade da Figura 8. Como descrito acima, a camada da câmara 200 pode compreender uma pluralidade de câmaras de reação 1703a-d, que podem estar localizadas para serem termicamente controladas separadamente de uma outra ou em grupos. A camada térmica 600 pode compreender uma pluralidade de unidades térmicas 1605a, 1605b, 1605c. Figura 8 é um diagrama simplificado, abstrato da descrição acima, e certos aspectos da série de reação de microfluídico não são mostrados. Em certas modalidades as unidades térmicas podem ser ambas mecanicamente e termicamente desconectadas uma da outra (como ilustrado por sua separação física na Figura 4). Entretanto, em outras modalidades, as unidades térmicas podem ser cada colocadas com um mesmo material de substrato, porém, espaça
44/68 das tal que elas permaneçam termicamente desconectadas, como descrito acima. Desse modo, é possível para as unidades térmicas serem termicamente separadas, porém, não mecanicamente separadas.
[0102] Dessa maneira, cada unidade térmica pode estar associada com uma ou mais câmaras de reação 1703a-d, separadamente do restante das câmaras de reação. De acordo com o protocolo especificado para cada câmara de reação, as unidades térmicas podem sucessivamente esfriar e/ou aquecer sua câmera correspondente apropriadamente. Por exemplo, a unidade térmica 1605c pode resfriar e/ou aquecer a câmara 1703a tal que a temperatura da câmara 1703a seja substancialmente independente do resfriamento e estado térmico da câmara 1703a. Ao mesmo tempo em que o aquecimento pode ser realizado executando-se a corrente através de um circuito eletrônico ou microfluídico, o resfriamento pode ser “passivo” pelo fato de que somente a convecção entre a câmara de microfluídico é usada para reduzir a temperatura da câmara. As unidades térmicas 1605a, 1605b, 1605c podem ser controladas usando um sistema de controle de alça fechada.
[0103] Em algumas modalidades, a placa perfurada 540 pode estar localizada sobre a camada da câmara 200 e pode fornecer pressão a camada da câmara 200 para facilitar o aquecimento e resfriamento do cartucho microfluídico, por exemplo, a camada da câmara, por camada térmica 600. A placa perfurada pode incluir uma pluralidade de aberturas 557a-d para facilitar cada observação dos fotodetectores 726b de uma câmara de reação individual 1703a-d. Na ausência de placa perfurada 540, e dependendo da configuração da camada térmica 600 e camada da câmara 200, a camada da câmara 200 pode “deformar” e/ou ser suficientemente flexível que a comunicação térmica entre as câmaras e as respectivas unidades térmicas é inconsistente. O aquecimento e resfriamento inconsistente podem levar a execução menos precisa dos protocolos e resultados menos precisos e exatos. Como
45/68 descrito acima, deformação significante pode restringir a cabeça óptica do movimento lateral. Desse modo, a espessura da placa perfurada deve ser apropriadamente selecionada para facilitar uma via de luz apropriada entre cada câmara de reação e as fontes de luz e fotodetectores ao mesmo tempo em que ainda garantindo aquecimento e resfriamento apropriado da camada da câmara. Se a camada de abertura for muito grossa, a distância dos fotodetectores 726b para a câmara poderá ser muito grande, indesejavelmente atenuando a leitura de fluorescência da câmara de reação. Além de aumentar a distância para a câmara de reação, uma camada de abertura 540 que é muito espessa ou muito pesada colocará muito mais pressão sobre a câmara de reação, fazendo com que a convecção seja muito grande. Inversamente, se a camada de abertura 540 for muito fina ela não poderá prevenir a camada da câmara 200 de curvar e deformar, e a camada de abertura 540 pode dobrar e deformar-se. A deformação das aberturas 557a-d ou das câmaras 1703a-d pode desviar a luz da fonte de luz 726a e prevenir leituras exatas por fotodetectores 726b.
[0104] Consequentemente, as modalidades descritas aqui fornecem camadas de abertura que vantajosamente evitam os inconvenientes descritos acima. Em certas modalidades, a camada de abertura 540 é feita, pelo menos em parte, de aço. Nessas modalidades, o aço fornece a força, densidade e resistência apropriadas para deflexão desejada para operação. Além disso, o aço pode fornecer baixa autofluorescência e é, portanto, menos provável de adversamente afetar a leitura dos fotodetectores 726b. O aço pode também ser eletroquimicamente tratado para diminuir sua auto-fluorescência e desse modo ser menos provável de adversamente afetar a leitura dos fotodetectores. Em certas modalidades, a camada de abertura pode, em vez disso, compreender níquel preto (Ni), isto é, Ni com um corante adicionado a ele para reduzir a auto-fluorescência. Certas modalidades contemplam combinações desses tratamentos eletroquímicos e materiais diferentes.
46/68
Em certas modalidades, a camada de abertura 540 é feita de alumínio e quando presa pelos painéis de apoio adjacentes 500, 506, e 546, fornece a força apropriada. O alumínio pode ser eletroquimicamente revestido com um acabamento de óxido anódico, por exemplo, com um corante preto adicionado para reduzir a auto-fluorescência.
[0105] Os ópticos de iluminação podem ser designados de modo que a luz de excitação que cai sobre a câmara de reação ou reator, seja incidente ao longo de uma área que é similar à forma do reator. Quando o reator pode ser longo e estreito, o ponto de alumínio pode também ser longo e estreito, isto é, prolongado, também. Desse modo, a forma das aberturas 557a-d pode ser designada em consideração tanto às dimensões da câmara de reação abaixo, bem como às posições relativas do emissor de luz e fotodetectores correspondentes. O comprimento do ponto pode ser ajustado alterando-se vários fatores, incluindo: o diâmetro do buraco onde os fotodetectores 726b são colocados (o tubo que segura o filtro e as lentes pode ter um efeito de abertura); a distância dos fotodetectores 726b do reator PCR; e o uso de lentes apropriadas em fotodetectores 726b.
Membro de Força [0106] Em certas modalidades, o trilho de recepção 520 coloca a camada da câmara 200 em proximidade com a camada térmica 600 ou camada de abertura 540, porém, não mecanicamente se acopla e/ou desse modo coloca as camadas em contato com uma outra. Dessa maneira, a camada da câmara 200 pode ser termicamente, porém, não mecanicamente, acoplada à camada térmica 600. Em outras modalidades, o trilho de recepção coloca a camada térmica 600 tanto em contato mecânico quanto térmico com a camada da câmara 200 e a camada da câmara em contato mecânico com a camada de abertura 540. Em várias modalidades, o mecanismo pode incluir um ou mais membros de força (não mostrados) que são configurados para aplicar pressão ao
47/68 trilho de recepção 520 para termicamente acoplar as fontes de calor ao cartucho microfluídico 200 posicionado no trilho de recepção 520. A aplicação da pressão pode ser importante para garantir contato térmico consistente entre o substrato aquecedor e as câmaras de reação, entradas, e válvulas etc., no cartucho microfluídico 200. Quando o trilho de recepção 520 está em uma posição fechada, desse modo estando posicionado sob a placa perfurada 540 do módulo óptico 502, o membro da força, tal como uma montagem de motor, abaixo do trilho de recepção 520 pode começar a viajar ascendentemente em direção ao módulo óptico 502, desse modo trazendo o trilho de recepção 520 para mais perto do módulo óptico 502. Quando o trilho de recepção 520 viaja ascendentemente em direção ao módulo óptico 502, o cartucho 200 pode começar a entrar em contato com uma superfície de base da placa perfurada 540. O cartucho 200 pode continuar a viajar ascendentemente até que pressão suficiente seja recebida no cartucho 200. Como descrito acima, a placa perfurada 540 pode aplicar uma pressão igual através de todos os pontos da parte superior do cartucho 200 e desse modo, pressionar o cartucho 200 contra o substrato aquecedor 600 com pressão uniforme. Como descrito, a camada de abertura pode ser selecionada por possuir propriedades que facilitam esta operação. Por exemplo, a seleção de material da placa perfurada 540 pode fornecer muito pouca deflexão do cartucho 200, quando pressionado contra ela.
[0107] A aplicaçao de pressão uniforme do cartucho 200 contra o substrato aquecedor 600 pode permitir aquecimento uniforme para cada dos componentes do cartucho quando desejável. Embora pressão e contato uniformes possam ser obtidos entre os aquecedores no substrato aquecedor 600 e nos componentes (válvulas, entradas, câmaras etc.) das redes de microfluídico no cartucho 200, os aquecedores não são necessariamente ativados simultaneamente, como descrito acima. Em certas modalidades, a aplicação de pressão uniforme não necessariamente resulta em aquecimento igual de componentes diferentes do
48/68 cartucho 200. Em algumas modalidades, tanto a ativação de um aquecedor específico no substrato aquecedor 600 junto com a pressão aplicada pela placa perfurada 540 ao cartucho 200 ativam um componente particular de cartucho 200.
[0108] As Figuras 9A-H são diagramas das dimensões de uma possível modalidade da placa perfurada. Nesta modalidade, um revestimento de conversão química pode ser aplicado para ajustar as propriedades refletivas da camada de abertura. Algumas partes 9002 podem ser selecionadas para não receber o revestimento de conversão química. O revestimento pode ser aplicado à superfície da placa 540 ou depositado em todo seu material. Em algumas modalidades, o material da placa 540 pode compreender aço. Em outras modalidades, a placa 540 pode compreender alumínio. Em ainda outras modalidades, o material da placa 540 pode compreender níquel. Em algumas modalidades, o material da placa pode ser uma combinação de dois ou mais materiais, incluindo, por exemplo, alumínio, níquel ou aço.
(0109) Na modalidade mostrada nas Figuras 9A-H as dimensões da placa formas selecionadas para atender as restrições relativas à pressão da câmara e via óptica para os pares de detectores descritos acima. A espessura do material da placa 540 começa em 0,79 centímetro (0,3125 polegada) e é usinada para a espessura desejada. Como indicado, a maior parte da placa compreende uma espessura de aproximadamente 0,64 centímetros (0,25 polegada). Entretanto esta espessura pode variar, por exemplo, a espessura sobre as aberturas da abertura 557 podem ter 0,48 centímetro (0,19 polegada). Como descrito acima, a espessura das aberturas da abertura facilita uma via óptica livre entre os fotodetectores e a fonte de luz para os teores da câmara de reação.
[0110] Em geral as dimensões da placa perfurada 540 são selecionadas tais que em combinação com as propriedades dos materiais constituindo a placa perfurada 540, a placa 540 fornece pressão suficiente para a
49/68 placa de câmara subjacente para facilitar o aquecimento e resfriamento apropriado bem como rigidez suficiente para prevenir torção ou deformação da placa da câmara. Tal deformação pode resultar em obstruções para a via óptica de fonte de luz e fotodetectores para a câmara de reação. Simultaneamente, as dimensões da placa não devem impor uma distância desfavorável da câmara de reação da camada da câmara para o par de fonte de luz e fotodetectores através das aberturas 557. Tampouco devem as dimensões 540 da placa perfurada obstruírem a via óptica do par de fonte de luz e fotodetectores para os teores do reator de câmara.
[0111] Em algumas modalidades a placa normalizadora 546 pode ser presa à placa perfurada por inserção de parafusos nas posições 9001 ou outros meios de fixação através de uma abertura. Em outras modalidades, essas posições podem facilitar as técnicas de calibração mais amplas através das aberturas sobre as placas normalizadoras do que com respeito ao restante das aberturas.
[0112] A Figura 10 ilustra várias dimensões das perspectivas da placa perfurada das Figuras 9A-H. Como descrito acima, nesta modalidade, um revestimento de conversão química pode ser primeiro aplicado para prevenir os materiais de base, por exemplo, alumínio, níquel ou aço, de oxidação ao mesmo tempo em que também fornecendo aterramento elétrico melhorado para operação de eletrônicos apropriada. Somente as superfícies que podem ser expostas à operação óptica são em seguida seletivamente revestidas com anodização preta.
Consistência da Análise de Diagnóstico [0113] Certas das presentes modalidades contemplam os métodos para garantir análises de diagnóstico consistentes através de experiências no mesmo aquecedor/detector e através de diferentes aquecedores/detectores. Particularmente, as modalidades de um sistema e
50/68 processo para determinar a duração e compensações para uma pluralidade de protocolos PCR para sincronizar a detecção entre eles são descritos. Adicionalmente, os métodos para ajustar o tempo de resfriamento do reator para garantir resultados mais consistentes são descritos.
[0114] A Figura 11 é um perfil da temperatura para uma câmara de reação passando por um protocolo particular 2000. Como ilustrado acima, o sistema em operação pode compreender protocolos muito diferentes de muitas durações diferentes operando simultaneamente em diferentes câmaras de reação. O protocolo 2000 envolve uma pluralidade de ciclos idênticos de aquecimento/resfriamento, onde cada ciclo compreende patamar de desnaturação 2000B e patamar de recozimento 2000D onde a temperatura é mantida constante durante um período de tempo. Esses ciclos podem ser precedidos por um ciclo não periódico do protocolo, tal como um período de incubação. Em certas modalidades, o protocolo pode ser especificado como uma coleção de temperaturas e períodos de tempo. Isto é, o protocolo pode inicialmente especificar somente que a câmara deve ser mantida a 95°C por uma duração B e em seguida mantida a 61 °C pela duração D. Certas modalidades contemplam o agrupamento desses segmentos em “etapas” e “subetapas” para facilitar o controle automático e do usuário. Por exemplo, o ciclo de aquecimento e resfriamento 2000B e D pode ser referido como uma “etapa” com a duração B a 95°C e a duração D a 61 °C referida como “sub-etapas”. Em certas modalidades, um usuário pode especificar as durações das sub-etapas. Em outras modalidades, essas durações podem ser recuperadas de um banco de dados. Tipicamente, esses tempos são estabelecidos ou de um protocolo padrão ou por entrada do usuário, algumas vezes usando uma “receita” estabelecida de patamares de temperaturas e tempos. Além dessas sub-etapas, o perfil de temperatura do protocolo também compreenderá transições, tais como transição 2000A de 61 °C para 95°C e transição 2000C de 95°C para
51/68 °C. A duração dessas transições pode ser uma consequência dos materiais e ambiente sobre a câmara de reação e a natureza dos elementos de aquecimento empregados.
[0115] Em certas modalidades a trajetória térmica tanto para aquecimento quanto resfriamento pode ser determinada para a totalidade da reação antes do início da execução. Em alguns sistemas, o contorno de temperatura versus tempo é monitorado e ajustado durante toda a reação para minimizar as temperaturas de transição, e levar em conta as variações em eficiências de diferentes elementos de aquecimento. Em outras palavras, alguns sistemas utilizam alças de controle de retorno para conduzir para uma temperatura alvo, sendo que o contorno atual da relação de temperatura/tempo pode variar de ciclo para ciclo. Tais ajustes podem resultar em diferentes tempos de reação totais, e, de modo mais importante, diferentes eficiências de reação total. Consequentemente, em algumas modalidades, os sistemas e métodos descritos aqui vantajosamente fornecem sistemas sendo que o contorno da relação de temperatura versus tempo da reação completa para cada câmara de reação independente (ou grupo de câmaras) é predeterminado definido antes do início da execução. Isso não somente vantajosamente permite a sincronização das múltiplas etapas de detecção através de uma pluralidade de diferentes reatores, porém, também permite o controle mais rigoroso sobre os parâmetros que minimizam diferenças em eficiências de reação que podem surgir como um resultado de diferentes contornos de temperatura/tempo. Em algumas modalidades, os sistemas e métodos fornecidos aqui fornecem o relato de erros no final de uma reação se a temperatura medida for diferente do valor esperado quando uma execução é concluída.
[0116] Em vários pontos no perfil de temperatura do protocolo 2000, o usuário ou recipiente pode especificar que uma detecção ocorre. Por exemplo, para alguns protocolos uma detecção pode ser solicitada no
52/68 final do segmento 2000D. Onde detecções foram arbitrariamente especificadas em cada protocolo, a cabeça do detector necessitaria percorrer entre as posições de uma maneira ineficiente e poderia até achar impossível realizar as detecções nos tempos requeridos. Isto é, cada de uma pluralidade de protocolos a ser iniciado simultaneamente e executado em paralelo simultaneamente através de cada das câmaras de reação no cartucho, seria muito ineficiente para o detector atender a cada das solicitações de detecção do protocolo. Particularmente, uma vez que a calibração foi concluída o detector necessitaria primeiro viajar para posições adequadas para realizar detecções para cada par de fontes de luz- detectores em sua primeira disposição para o primeiro perfil. No momento em que o detector terminou, entretanto, cada dos protocolos restantes estaria entrando em um período quando a detecção não deve ser realizada. Portanto, há um período de “tempo morto” quando o detector não pode realizar qualquer detecção e deve em vez disso simplesmente permanecer ocioso esperando a oportunidade de realizar a próxima detecção. Este “tempo morto” é ineficiente e desnecessariamente prolonga o processo de diagnóstico. Além disso, onde detecções sucessivas devem ser realizadas, o “tempo morto” pode gerar detecções irregulares e aperiódicas da mesma câmara, possivelmente introduzindo leituras inconsistentes.
[0117] Certas das presentes modalidades contemplam os ajustes automáticos para partes do perfil 2000 para facilitar detecção eficiente através de múltiplos protocolos. Isto pode ser realizado permitindo-se o usuário para editar ou o sistema pode editar automaticamente, o comprimento de segmento 2000B ou 2000D.
[0118] Deve ser entendido contanto que pelo menos um tempo de patamar mínimo ocorra, alguma extensão menor de tempos de patamar pode ser acomodada na maioria dos protocolos de amplificação. Esta flexibilidade é utilizada para toda acomodação eficiente de diferentes
53/68 ensaios sendo realizados simultaneamente, ao mesmo tempo em que realizando o monitoramento em tempo real de amplificação por leitura dos vários ensaios usando uma varredura da cabeça do detector.
[0119] Se a detecção deveria ser realizada durante o segmento 2000B, por exemplo, o sistema ou o usuário pode prolongar a duração do segmento 2000B quando necessário para acomodar o movimento da cabeça do detector e coordenar a leitura de uma pluralidade de ensaios sendo realizados simultaneamente. A duração dos segmentos 2000A e 2000C pode ser calculada usando uma taxa de resfriamento padrão predeterminada das temperaturas precedentes e incorporadas na análise. Algumas modalidades não permitem que o usuário edite esses segmentos e eles são em vez disso, responsabilizados pelo sistema internamente.
[0120] Em certas modalidades, os ajustes do protocolo determinados pelo sistema podem compreender pelo menos três formas separadas. O primeiro ajuste pode compreender um “ajuste intra-ciclo” sendo que o patamar tal como 2000B e 2000D do protocolo é prolongado tal que o ciclo da etapa total 2000A-D atinja uma duração desejada, em alguns casos um múltiplo de número inteiro de um tempo de ciclo de detecção. Este ajuste é descrito com respeito a Figura 13. Uma vez que o ajuste inter-ciclo é completo, o sistema pode então realizar um “ajuste interciclo”. Um ajuste inter-ciclo pode garantir que os eventos de detecção em cada ciclo ocorram em múltiplos de número inteiro de uma duração desejada a parte um do outro (tal como um múltiplo de número inteiro do tempo de ciclo de detecção) entre os ciclos. Esses ajustes são descritos com respeito à Figura 14. O terceiro ajuste pode compreender um “ajuste de compensação inicial” que pode depender somente da faixa usada para a execução do protocolo. Esses ajustes são descritos com respeito às Figuras 15A-C.
Visão Geral de Ajuste de Protocolo
54/68 [0121] A Figura 12 descreve um fluxograma de um processo 4000 usado em certas das modalidades descritas para determinar uma solução apropriada durante os tempos de detecção do detector e perfis de protocolo. O processo 4000 pode ser executado em software, hardware ou uma combinação de firmware dos dois. Por exemplo, o processo pode ser executado em qualquer de um FPGA, um microcontrolador ou software executando em um processador de computador. As partes do processo podem ser realizadas por um processado de propósito geral, tal como um microcontrolador, ao mesmo tempo em que outras partes podem ser realizadas por sistemas dedicados de hardware, software ou firmware. O processo começa 4001 determinando-se um tempo de ciclo de detecção (ou usando um tempo de ciclo de detecção predeterminado, por exemplo, já na memória) para o sistema 4002. O tempo de ciclo de detecção pode compreender o tempo que é requerido para o detector se mover para cada das posições de detecção (detecção com cada dos pares de emissores/detectores em uma cabeça de detecção em cada das seis colunas da Figura 6), realizar todas as detecções necessárias, e retornar para uma posição inicial. Opcionalmente, o usuário ou sistema pode ser permitido fazer ajuste para o procedimento de detecção para modificar o tempo de ciclo de detecção. Por exemplo, o usuário pode desejar somente realizar a detecção usando um subgrupo dos detectores. Em algumas modalidades o tempo de ciclo de detecção é aproximadamente 10 segundos, quando a modalidade compreende seis colunas de pares de detectores e todas as seis colunas são usadas.
[0122] Em algumas modalidades, o processo pode primeiro determinar uma pluralidade de “ajustes intra-ciclo” para um ou mais dos protocolos 4003. Como descrito abaixo com respeito a Figura 13, as durações para uma etapa ou sub-etapa podem compreender o tempo para realizar uma sub-etapa ou etapa particular no protocolo. Os tempos do ciclo podem ser determinados por uma combinação de especificações do usuário e restrições identificadas no sistema. Em certas modalidades, o
55/68 sistema exigirá que a pluralidade de tempos de ciclo seja múltiplos de número inteiro do tempo de ciclo de detecção. Os “ajustes intra-ciclo” podem ser introduzidos para satisfazer esta restrição. Por exemplo, se os tempos de ciclo de detecção foram 12,2 segundos, os tempos de ciclo para uma etapa de protocolo podem ser 22,4, 33,6, 44,8 ou qualquer outra duração N * 12,2, onde N é um número inteiro maior do que 0. Em algumas modalidades, é somente necessário impor esta restrição quando uma detecção deve ser realizada no ciclo.
[0123] Desse modo, os ajustes intra-ciclo garantem que o ciclo do protocolo é um múltiplo de número inteiro do tempo de ciclo de detecção. Entretanto, uma detecção pode ser solicitada em qualquer ponto em um ciclo. Se o tempo de ciclo de detecção for 10 segundos, então o mais rápido que uma detecção poderá ser realizada será em 10 segundos após o protocolo iniciar. As detecções podem em seguida ser realizadas em múltiplos de número inteiro após tal tempo (20, 30, 40 segundos etc.).
[0124] Desse modo, um outro ajuste, um ajuste “inter-ciclo” 4004, pode em seguida ser determinado para garantir que a detecção solicitada ocorre no tempo apropriado. Esses “ajustes interciclo” podem ser incorporados no protocolo como atrasos adicionais entre as etapas e sub-etapas de protocolo. Dito de forma diferente, um protocolo de PCR uma vez submetido aos ajustes “intra-ciclo” pode compreender etapas de ciclo “válidas”. O protocolo de PCR pode então ser gerado encadeando junto cada das etapas e adicionando transições de etapa para etapa. O “ajuste inter-ciclos” 4004 garante que os tempos de detecção ocorram nos múltiplos de número inteiro desejados do tempo de ciclo de detecção após os ciclos terem sido encadeados juntos.
[0125] Por exemplo, para um sistema tendo um tempo de ciclo de detecção de 10 segundos um protocolo pode compreender uma etapa tendo sua primeira detecção em 18 segundos em um ciclo. A duração
56/68 do ciclo (a duração da etapa total) pode durar 30 segundos (talvez após um ajuste de “intra-ciclo”). Desse modo, ao mesmo tempo em que o tempo de ciclo como um todo é apropriadamente alinhado com o tempo de ciclo de detecção de 10 segundos (3 x 10 = 30 segundos) a primeira detecção é sozinha não apropriadamente alinhada com a detecção (18 segundo não é um múltiplo de 10 segundos). O sistema adicionará 2 segundos do ajuste “inter-ciclo” a primeira execução de detecção de modo que a primeira detecção ocorra 20 segundos após o início do protocolo. Isto pode ser feito prologando-se a temperatura de conservação final da etapa prévia durante um adicional de 2 segundos através de um ajuste de absorção”. Se não há nenhuma etapa prévia, o sistema introduziría uma conservação de 2 segundos em temperatura ambiente ao início da primeira execução do ciclo. Desse modo, se o sistema começa a operação em TO, a primeira detecção ocorrerá em T0 + 20 segundos, a segunda detecção em T0 + 50 segundos, e assim por diante.
[0126] Por causa dos ajustes inter e intra-ciclo, o protocolo está agora em uma forma tal que as detecções somente sejam solicitadas em tempos convenientes para a cabeça do detector se mover para a câmara de reação realizando o protocolo. Todos os protocolos foram realizados em câmaras de reação localizadas na primeira coluna do cartucho (e número suficiente de detectores presentes na cabeça do detector) ajustes intra e inter-ciclos sozinhos seriam o sufucuente para apropriadamente modificar o protocolo para a detecção eficiente (uma primeira coluna aqui se referindo a uma coluna de faixas tais como faixas 1706a e 1706b com câmaras associadas 1703a e 1703b na Figura 3A). Entretanto, porque os protocolos operam em diferentes colunas do cartucho é também necessário para compensação que o início do protocolo compense quanto ao atraso da cabeça do detector em alcançar o local da câmara.
57/68 [0127] Desse modo as “compensações de ajuste iniciais” são adicionadas ao protocolo com base no local da câmara na qual o protocolo é realizado. Essas “compensações de ajuste iniciais” 4005 são descritas em maiores detalhes com respeito às Figuras 15A-C. Em algumas modalidades, esses ajustes são feitos no tempo de execução e dependem unicamente do local da faixa de execução. Por exemplo, nenhum ajuste pode ser necessário para a execução de um protocolo nas faixas localizadas em uma primeira coluna da câmara, de modo que uma execução do protocolo nessas câmaras da faixa terão um tempo inicial retardado de +0 segundos. Cada coluna subsequente de faixas ganha um atraso de 400 milissegundos para sua distância da primeira coluna, devido ao tempo requerido para as detecções (duas detecções em 100 millisegundos cada, realizado de forma assíncrona nesta modalidade) e o movimento do motor do detector (200 milissegundos). Neste exemplo, com um tempo de ciclo de detecção de 10 segundos, a primeira possível detecção para cada coluna de faixas é como segue: coluna 1 tem sua primeira detecção em 10 segundos, coluna 2 tem sua primeira detecção em 10,4 segundos, coluna 3 tem sua primeira detecção em 10,8 segundos etc. Retardando-se o início de um protocolo apropriadamente alinhado pelo tempo necessário para uma faixa particular, o alinhamento esperado pode ser mantido. Ao mesmo tempo em que este exemplo particular assume que o protocolo já está alinhado (de ajustes 4003 e 4004), o técnico versado facilmente apreciará que outras modalidades podem determinar as compensações antecipando os futuros ajustes.
[0128] Embora descrito na ordem das etapas 4003, 4005, e 4004, alguém facilmente reconhecerá que essas etapas podem estar dispostas em qualquer outra ordem adequada e nem a necessidade do sistema realizar cada etapa sucessivamente. Em algumas modalidades, entretanto, tal como aquelas descritas acima, pode ser necessário realizar o ajuste inter-ciclos após realizar os ajustes íntra-ciclo, uma vez que o ajuste inter-ciclo depende da modificação do íntra-ciclo. Em contraste,
58/68 o ajuste de compensação inicial 4005 pode não depender de qualquer determinação prévia. Isto é, em algumas modalidades a compensação inicial 4005 necessita ser determinada somente uma vez no momento da execução, ao passo que os ajustes intra-ciclo 4003 e ajustes interciclo 4004 podem ser realizados para cada etapa do ciclo nos protocolos.
[0129] Em algumas modalidades, uma vez que os tempos do protocolo foram apropriadamente ajustados, o processo pode em seguida iniciar os protocolos 4006. Em algumas modalidades um processador pode simplesmente colocar as compensações em um local da memória para recuperação por um componente dedicado separado do sistema que sozinho inicia cada protocolo.
Ajuste Intra-Ciclo [0130] Os “ajustes intra-ciclo” compreendem ajustes para os intervalos de etapa ou sub-etapa, como pode ter sido especificado por um usuário ou recebido de um banco de dados, de modo que a etapa como um todo seja um múltiplo de número inteiro de uma duração predeterminada. Com referência à Figura 13 em certas modalidades o usuário pode especificar certos aspectos do perfil do protocolo, tal como os tempos desejados para uma sub-etapa do protocolo, usando uma interface do usuário ou interface do usuário gráfica (GUI). Em algumas modalidades, o sistema pode então validar a seleção do usuário. Após calcular os comprimentos do segmento para cada das sub-etapas, o software do sistema validará o tempo do ciclo da etapa e indicará se algum ajuste é necessário. Em algumas modalidades um tempo de ciclo de etapa “válido” é um tempo de ciclo de etapa que é um múltiplo de número inteiro do tempo de ciclo de detecção. Se um tempo de ciclo da etapa não for válido, o usuário poderá ser propenso a fazer os ajustes para tal etapa 5003b. Se nenhum ajuste for necessário, o usuário poderá ser notificado que a etapa está alinhada apropriadamente 5003a.
59/68 [0131] No exemplo da Figura 13, o usuário requereu uma etapa de incubação 5001 compreendendo uma única sub-etapa de 900 segundos. O usuário solicitou que a etapa 5001 ocorra somente uma vez 5010 e, portanto, compreenda um ciclo de etapa única. Neste exemplo, o ciclo de detecção compreende 10 segundos. O usuário não especificou que qualquer detecção deve ser realizada e consequentemente a etapa é válida, uma vez que a etapa não exigirá que a posição da cabeça do detector seja ajustada. Quando nenhuma detecção é solicitada o sistema registra os intervalos de tempo solicitados, para futuras considerações de compensação, porém não pode impor qualquer restrição que o intervalo de tempo seja um múltiplo do tempo de detecção (embora a duração possa ser considerada na determinação de um ajuste inter-ciclo subsequente). Se, entretanto, neste exemplo o usuário solicitou detecção durante esta etapa, a etapa ainda seria válida se nenhum outro atraso incorresse, uma vez que 900 segundos é um múltiplo do 10 segundos do ciclo de detecção. Em qualquer evento, na modalidade ilustrada, o sistema determinou que esta entrada da etapa é válida.
[0132] No exemplo ilustrado na Figura 13, a etapa PCR 5002 compreende duas sub-etapas, uma primeira sub-etapa onde a câmara deve ser mantida a 95°C e a outra sub-etapa onde a câmara deve ser mantida a 61 °C. O usuário solicitou que 45 ciclos desta etapa sejam realizados 5011. O usuário solicitou que a primeira sub-etapa durasse 2 segundos e que a segunda sub-etapa durasse 10,2 segundos durante um total de 12,2 segundos. Como descrito acima com respeito a Figura 7, o sistema também calculou o tempo de transição de 95°C a 61 °C e adicionou esta duração às solicitações do usuário. Neste exemplo, o aquecimento de 61 °C a 95°C requer 4,25 segundos e o resfriamento de 95°C a 61 °C em 7,05 segundos. Esses valores podem ser armazenados internamente na memória do sistema ou determinados dinamicamente com base nas entradas do usuário. Finalmente, em algumas modalida
60/68 des, quando uma detecção é solicitada para uma sub-etapa 5004, como o usuário solicitou aqui, o sistema adiciona um atraso adicional ao tempo de conservação para esta sub-etapa. Neste exemplo, este atraso é de 2,2 segundos, que representa o tempo mínimo requerido para permitir que o detector se mova e detecte com cada das seis colunas de pares de emissores de luz -fotodetectores na cabeça do detector. Isto é, neste exemplo, cada detecção de cor requer 200 milissegundos de tempo de exposição e 200 milissegundos para mover o motor entre as colunas (5 transições * 200ms + 6 detecções * 200ms = 2,2 segundos).
[0133] Desse modo, a duração total para a etapa como um todo é:
[0134] 4,25 (calor) + 2,0 (desnaturado) + 7,05 (resfriamento) + 10,2 (recozimento) + 2,2 (detecção)= 25,7 segundos.
[0135] Como 25,7 segundos não é um múltiplo dos 10 segundos do tempo de detecção, o ajuste será necessário. Como indicado 5003b, o sistema informa o usuário que ele pode ou remover 5,7 segundos da duração da etapa ou adicionar um adicional de 4,3 segundos para obter um múltiplo do tempo de ciclo de detecção (isto é, um múltiplo de 10 segundos). Esses “ajustes de etapa intra-ciclo” serão incorporados no protocolo após a seleção do usuário.
[0136] Alguém reconhecerá que o sistema pode considerar uma pluralidade de outros fatores não indicados neste exemplo ao fornecer o usuário com uma faixa de ajuste. Por exemplo, os atrasos adicionais para movimento do motor ou preparação da incubação pode ser levado em consideração na análise do sistema.
Ajuste de Interciclos [0137] Como mencionado acima, os “ajustes inter-ciclos” compreendem os ajustes para o primeiro ciclo de uma sub-etapa para criar um atraso entre as etapas do ciclo. Os “ajustes inter-ciclos” podem depender do
61/68 tempo das etapas precedentes e da temperatura final da etapa imediatamente precedente (se algum existe). Com referência a Figura 14 o “ajuste inter-ciclo” 6005 determinado para obter uma ocorrência de tempo de detecção apropriada, será descrito.
[0138] Em algumas modalidades o ajuste 6005 é determinado primeiro determinando-se o tempo requerido para aquecer ou resfriar a temperatura do final da etapa anterior para a primeira temperatura da subetapa da etapa seguinte. Se qualquer tempo adicional for necessário para o alinhamento, a temperatura do final da etapa prévia pode ser mantida durante este tempo. Um exemplo de alinhamento entre a temperatura final de uma etapa de conservação a 75°C até a primeira temperatura da sub-etapa de 95°C é mostrada na Figura 14. A temperatura é elevada a 8°C/s de 75°C a 95°C de pontos 6001b a 6001c, com o tempo restante requerido com o tempo restante requerido para o alinhamento gasto mantido a 75°C após o final da etapa prévia, dos pontos 6001a a 6001b. Este período pode ser referido como um “ajuste inter-ciclo”. Para obter continuação do alinhamento de detecção entre as etapas, pode ser necessário mudar (ou atrasar) o início de um ciclo da etapa após o final da etapa prévia por este “ajuste inter-ciclo”. O tempo requerido para aquecer ou resfriar a temperature do final da etapa prévia até a primeira temperatura da sub-etapa da etapa seguinte pode então ser calculado. Se algum tempo adicional for necessário para o alinhamento, a temperatura do final da etapa prévia é mantida durante o tempo do “ajuste inter-ciclo”. Em algumas modalidades, o sistema pode levar em consideração estas considerações ao receber a entrada do usuário através de GUI 5000 e incorporá-las na variação proposta 5003b.
Ajustes iniciais de compensação [0139] A Figura 15A ilustra o início dos ciclos de dois perfis de protocolo separados 3001 e 3005. Em cada desses protocolos os ajustes inter e
62/68 intra-ciclo podem ter sido realizados, porém, a compensação inicial já foi aplicada. Neste exemplo, o perfil 3001 inclui uma etapa com um tempo de ciclo de 30 segundos (o intervalo de tempo 0 a tempo 30). Um tempo para a detecção 3020a ou uma solicitação de detecção ocorre em 30 segundos. Notar que nos termos dos ajustes inter-ciclos descritos acima, um pequeno atraso pode ter sido incluído no protocolo 3001 apena antes da primeira rampa de calor para o alinhamento da primeira detecção 3020a. Como descrito acima, os ajustes inter-ciclo e intraciclo facilitam as solicitações de detecção sendo feitas em múltiplos de número inteiro do tempo de ciclo de detecção. Aqui, para um tempo de ciclo de detecção de 10 segundos, as solicitações 3020a e 3020b ocorrem nos múltiplos de número inteiro 30 e 60 segundos.
[0140] O segundo protocolo 3005 inclui um perfil diferente de 3001. O perfil 3005 compreende uma etapa de inicialização durando de 0 a 30 segundos. O perfil 3005 é em seguida seguido por uma pluralidade de ciclos de 50 segundos, com a primeira detecção em 40 segundos. Esses ciclos representam um PCR de 3 Temperaturas, que inclui um desnaturado a uma temperatura elevada, o recozimento e a detecção na baixa temperatura, e em seguida uma extensão em uma temperatura média. Como antes, o primeiro ciclo de inicialização pode incluir um pequeno atraso inter-ciclo no início do alinhamento. Alguém reconhecerá que seu atraso inter-ciclo pode ser inserido em uma variedade de posições sobre a etapa de inicialização para garantir o alinhamento de detecção.
[0141] A Figura 15B ilustra múltiplos casos dos dois protocolos da Figura 15A. As detecções foram possíveis realizar através de todas as faixas em todas as colunas de câmara simultaneamente, os perfis ilustrados na Figura 15B seriam adequados. Entretanto, devido ao atraso do tempo requerido para a cabeça do detector para varredura através de uma coluna da câmara com cada de suas colunas de pares de detectores, é necessário compensar cada dos protocolos 3001-3007
63/68 com base no local da câmara na qual eles são executados. Para simplicidade, cada dos protocolos 3001 -3007 é presumido ser executado em uma coluna vizinha. Se o protocolo 3001 é executado na primeira coluna da câmara, o protocolo 3002 é executado no segundo, 3003 no terceiro, 3004 no quarto etc.
[0142] A Figura 15C ilustra a execução dos protocolos 3001 -3007 com os “ajustes de compensação iniciais” 3010-3015 introduzidos para garantir o alinhamento da detecção. As compensações iniciais demonstram o movimento do detector através das faixas do cartucho e a sincronização de tal movimento com as detecções requeridas por cada dos protocolos de execução. Desse modo, o protocolo 3001 solicitará a detecção, usando a primeira coluna da cabeça do detector na solicitação 3020a. Quando a cabeça do detector se move para alinhar a segunda coluna da cabeça do detector com a câmara de protocolo 3001, a primeira coluna de cabeça do detector será disposta sobre a câmara de 3002 que, vantajosamente, esteja agora também solicitando uma detecção 3021a. Subsequentemente, o processo continua com a primeira coluna da cabeça do detector agora lendo o protocolo 3003 na solicitação 3022a, a segunda leitura da coluna 3002, e a terceira leitura 3001. Alguém reconhecerá que a distorção ilustrada na Figura 15C não é para escala (em algumas modalidades a distorção pode estar na ordem de -400 milissegundos), e foi ilustrada como mostrado para somente propósitos de explicação.
[0143] Desse modo, com os “ajustes iniciais” apropriadamente selecionados o sistema pode garantir os tempos de detecção consistentes através de cada dos reatores. Como ilustrado na Figura 15C, as detecções ordenadas e eficientes são feitas ao longo das linhas 3007a-d quando a solução determinada é executada pelo sistema detector. Desse modo, a detecção para um reator particular ocorrerá ao mesmo tempo de ciclo para ciclo. Os detalhes para uma modalidade para
64/68 determinar essas soluções serão descritos em maiores detalhes com respeito a Figura 16.
Resfriamento Ativo [0144] Em certas modalidades ao mesmo tempo em que o aquecimento da câmara do reator é ativo, isto é, aquecedores são ativamente aplicados à câmara, o resfriamento da câmara do reator pode ser passiva, onde a convecção sozinha é usada para resfriar os teores do reator. Para também fornecer desempenho de diagnóstico consistente, certas modalidades contemplam participação ativa no processo de resfriamento do reator para garantir comportamento consistente. Figura 16 ilustra um perfil térmico 7001 compreendendo um componente de resfriamento. O perfil 7001 compreende um tempo elevação 7006, um patamar 7005, e um período de resfriamento 7002/7003.
[0145] A temperatura ambiente no local onde a unidade de aquecimento/detecção está localizada pode não ser a mesma. Isto é, um sistema operacional no sul do Arizona não pode ser submetido a mesma temperatura ambiente como um sistema operacional no norte do Alasca. Desse modo, na temperatura ambiente mais quente na qual o sistema é esperado ser operado, o perfil 7001 pode ter uma curva de resfriamento 7003. Em um ambiente mais frio, o perfil de resfriamento 7002 pode resultar em vez disso. Para compensar quanto à diferença, certas modalidades contemplam o monitoramento do perfil de resfriamento do reator através dos sensores de temperatura, possivelmente aqueles descritos com respeito a Figura 3b. Quando os desvios do perfil máximo 7003 são detectados, o aquecimento suficiente pode ser aplicado de modo que o perfil 7002 em vez disso, siga o perfil 7003. Em algumas modalidades o calor pode ser aplicado periodicamente nos tempos 7004a-c, ao passo que o calor pode ser aplicado continuamente em outras modalidades. Dessa maneira, os perfis consistentes podem ser obtidos independente do local geográfico do termociclizador ou tempera65/68 tura ambiente operacional.
[0146] Certas destas modalidades aplicam a lei de Newton de resfriamento para determinar quando aplicar os aquecedores:
T(t) = Ta + (T(0) - Ta)e-rt [0147] Onde: T(t) é a temperatura no tempo t, T(0) é a temperatura inicial, Ta é o parâmetro de temperatura ambiente, r é o parâmetro constante de decaimento, e t é o tempo. Em algumas modalidades 50,2 graus Celsius e 0,098 podem ser usados como o parâmetro de temperatura ambiente e parâmetro constante de decaimento, respectivamente. Nesta modalidade, o parâmetro de temperatura ambiente é selecionado para ser mais elevado do que qualquer temperatura operacional ambiente esperada, desse modo permitindo o controle total sobre o ciclo de resfriamento aplicando-se pelo menos uma pequena quantidade de calor durante cada ciclo de resfriamento, independente da temperatura ambiente, para combinar o resfriamento atual com a curva de resfriamento do perfil máximo 7003 em cada caso.
[0148] Como usado aqui, uma “entrada” pode ser, por exemplo, os dados recebidos de um teclado, esfera de rolagem, mouse, sistema de reconhecimento de voz ou outro dispositivo capaz de transmitir informação de um usuário para um computador. O dispositivo de entrada também pode ser uma tela de toque associada com o monitor, em cujo caso o usuário responde às solicitações no visor tocando a tela. O usuário pode entrar com informação de texto através do dispositivo de entrada tal como o teclado ou a tela de toque.
[0149] A invenção é operacional com numerosas outras configurações ou ambientes de sistema de computação de propósitos gerais ou propósitos especiais. Os exemplos d sistemas, ambientes, e/ou configurações de computação bem conhecidos que podem ser adequados para uso
66/68 com a invenção incluem, porém, sem limitação, microcontroladores, computadores pessoais, computadores servidores, dispositivos portáteis ou laptop, sistemas de multiprocessador, sistemas com base em microprocessador, eletrônicos de consumo programáveis, PCs de rede, minicomputadores, computadores de grande porte, ambientes de computação distribuídos que incluem quaisquer dos dispositivos ou sistemas acima.
[0150] Como usado aqui, “instruções” se refere às etapas executadas pelo computador para processar informação no sistema. As instruções podem ser executadas em software, firmware ou hardware e incluem qualquer tipo de etapa programa aceita pelos componentes do sistema.
[0151] Um “microprocessador” ou “processador” pode ser qualquer microprocessador de núcleo único ou múltiplo de propósito geral convencional tal como um processador Pentium®, Intel® Core™, um processador 8051, um processador MIPS® ou um processador ALPHA®. Além disso, o microprocessador pode ser qualquer microprocessador de propósito especial convencional tal como um processador de sinal digital ou um processador de gráficos. Um “processador” pode também se referir a, porém, não está limitado a, microcontroladores, conjuntos de entradas programáveis de campo (FPGAs), circuitos integrados específicos de aplicação (ASICs), dispositivos lógicos programáveis complexos (CPLDs), conjuntos lógicos programáveis (PLAs), microprocessadores ou outros dispositivos de processamento similares.
[0152] O sistema é compreendido de vários módulos como descrito em detalhes abaixo. Como pode ser apreciado por alguém de experiência ordinária na técnica, cada dos módulos compreende várias sub-rotinas, procedimentos, declarações de definições e macros. Cada dos módulos são tipicamente separadamente compilado e ligado em um único programa executável. Portanto, a seguinte descrição de cada dos módulos é usada por conveniência para descrever a funcionalidade do sistema
67/68 preferido. Desse modo, os processos que estão passando por cada dos módulos podem ser arbitrariamente redistribuídos para um dos outros módulos, combinados juntos em um único módulo ou disponibilizados em, por exemplo, uma biblioteca de ligação dinâmica compartilhável.
[0153] Certas modalidades do sistema podem ser usadas em conjunto com vários sistemas operacionais tais como SNOW LEOPARD®, iOS®, LINUX, UNIX ou MICROSOFT WINDOWS® ou qualquer outro sistema operacional adequado.
[0154] Certas modalidades do sistema podem ser escritas em qualquer linguagem de programação convencional, tal como montagem, C, C++, BASIC, Pascal ou Java, e executadas sob um sistema operacional convencional ou similar ou qualquer outra linguagem de programação adequada.
[0155] Além disso, os módulos ou instruções podem ser armazenados em um ou mais dispositivos de armazenamento programáveis, tais como unidades FLASH, CD-ROMs, discos rígidos, e DVDs. Uma modalidade inclui um dispositivo de armazenamento programável tendo instruções armazenadas nele.
[0156] Ao mesmo tempo em que os processos e métodos acima são descritos acima como incluindo certas etapas e são descritos em uma ordem particular, deve ser reconhecido que esses processos e métodos podem incluir as etapas adicionais ou podem omitir algumas destas etapas descritas. Além disso, cada das etapas dos processos não necessariamente necessita ser realizada na ordem que está descrita.
[0157] Ao mesmo tempo em que a descrição acima mostrou, descreveu e apontou novos aspectos da invenção como aplicado para várias modalidades, será entendido que várias omissões, substituições, e mudanças na forma e detalhes do sistema ou processo ilustrado podem
68/68 ser feitas por aqueles versados na técnica sem afastar-se do espírito da invenção. Como será reconhecida, a presente invenção pode ser incorporada de uma forma que não forneça todos os aspectos e benefícios apresentados aqui, uma vez que alguns aspectos podem ser usados ou praticados separadamente de outros.
[0158] As etapas de um método ou algoritmo descrito em conjunto com as modalidades descritas aqui podem ser incorporadas diretamente em hardware, em um módulo de software executado por um processador ou em uma combinação dos dois. Um módulo de software pode residir na memória RAM, memória flash, memória ROM, memória EPROM, memória EEPROM, registros, disco rígido, um disco removível, um CDROM ou qualquer outra forma de meio de armazenamento conhecido na técnica. Um meio de armazenamento exemplar pode ser acoplado ao processador tal que o processador possa ler a informação de, e escrever a informação para, o meio de armazenamento. Na alternativa, o meio de armazenamento pode ser integral para o processador. O processador e o meio de armazenamento podem residir em um ASIC. O ASIC pode residir em um terminal do usuário. Na alternativa, o processador e o meio de armazenamento podem residir como componentes discretos em um terminal de usuário.

Claims (30)

1 - Método Implementado em Um ou Mais Processadores de Computador Para Ajustar Protocolos Para Realizar Simultaneamente Pluralidade de Reações de Ciclos Térmicos, em que cada uma das reações de cicies térmicos tem uma ou mais etapas de detecção e em que as referidas reações de ciclos térmicos são realizadas numa pluralidade de reatores, caracterizado por que o método compreende:
determinar ou proporcionar ou acessar um tempo do ciclo de detecção para, cada um. da referida pluralidade de reatores;
receber ou acessar uma etapa de protocolo de um protocolo, sendo a etapa associada a uma duração de etapa, compreendendo a etapa um tempo cm que a detecção deve ocorrer durante a etapa; e determinar um primeiro ajustamento para a. etapa de tal modo que a duração da etapa seja um múltiplo do tempo do ciclo de detecção,
2 - Método Implementado em Um ou Mais Processadores de Computador Para Ajustar Protocolos Para Realizar Simultaneamente Pluralidade de Reações de Ciclos Térmicos, de acordo com a Reivindicação
1, caracterizado por que compreende ainda determinar um segundo ajustamento para a etapa, em que o tempo de detecção é um múltiplo do tempo do cicio de detecção, quando a etapa é ajustada pelo primeiro ajus tamento e pelo segundo ajustamento.
3 - Método Implementado em Um ou Mais Processadores de Computador Para Ajustar Protocolos Para Realizar Simultaneamente Pluralidade de Reações de Ciclos Térmicos, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que compreende ainda determinar um ajustamento de desvio de partida com base numa, posição de uma câmara de reação associada ao protocolo.
2/10
4 - Método Implementado em Um ou Mais Processadores de Computador Para Ajustar Protocolos Para Realizar Simultaneamente Pluralidade de Reações de Ciclos Térmicos, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o tempo do ciclo de detecção compreende a. quantidade de tempo necessária para que um cabeçote de detecção execute uma. pluralidade predeterminada de detecções para um reator,
5 - Método Implementado em Um ou Mais Processadores de Computador Para Ajustar Protocolos Para Realizar Simultaneamente Pluralidade de Reações de Ciclos Térmicos, de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por que o tempo do ciclo de detecção compreende ainda um tempo necessário para o movimente do cabeçote de detector para cada um de uma pluralidade de reatores e o movimento do cabeçote do detector par<i a posição de início.
6 « Método Implementado em Um ou Mais Processadores de Computador Para Ajustar Protocolos Para Realizar Simultaneamente Pluralidade de Reações de Ciclos Térmicos, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o protocolo compreende um protocolo de reação em cadeia da polimerase (PCR).
7 - Método Implementado em Um ou Mais Processadores de Computador Para Ajustar Protocolos Para Realizar Simultaneamente Pluralidade de Reações de Ciclos Térmicos, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que compreende ainda iniciar o protocolo.
8 «Meio Não Transitório Legível por Computador, compreendendo instruções, caracterizado por que as instruções são configuradas para fazer que um ou mais processadores executem o método seguinte;
determinar ou fornecer ou acessar um tempo do ciclo de detecção;
receber ou acessar uma etapa de protocolo de urn protocolo, sendo a etapa associada a uma duração da etapa, compreendendo a etapa um tempo em que a detecção deve ocorrer durante a etapa; e determinar um primeiro ajustamento para a etapa de tal modo que a duração da. etapa seja um múltiplo do tempo do ciclo de detecção.
9 - Meio Não Transitório Legível por Computador, de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que a etapa de protocolo è associada a um protocolo a partir de uma pluralidade de protocolos, cada, um da pluralidade de protocolos associado com, pelo menos, uma de uma pluralidade de reações de cielização térmica, em que cada reação de cielização térmica compreende uma ou mais etapas de detecção e em que determinar um primeiro ajustamento se baseia, pelo menos em parte, numa medição de tempo de uma ou mais etapas de detecção associado com as reações de ciclização térmica, de, pelo menos, dois ou mais de entre a pluralidade de protocolos, quando os dois ou mais da pluralidade de protocolos são executados simultaneamente.
10 - Meio Não Transitório Legível por Computador, de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que o método compreende ainda a determinação de um segundo ajustamento para a etapa, em que o tempo de detecção è um múltiplo do tempo do ciclo de detecção, quando a etapa ê ajustada pelo primeiro ajustamento e pelo segundo ajustamento.
11- Meio Não Transitório Legível por Computador, de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que o método compreende ainda a determinação de um ajustamento de desvio de partida com base numa posição de uma eàmara de reação associada ao protocolo.
12 ~ Meio Não Transitório Legível por Computador, de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que o tempo do ciclo de detecção compreende a quantidade de tempo necessária para que um cabeçote de detecção execute uma pluralidade predeterminada de detecções para uma câmara de reação.
13 - Meio Não Transitório Legível por Computador, de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado por que o tempo do ciclo de detecção compreende ainda um tempo necessário para o movimento do cabeçote de detector para cada uma de uma pluralidade de posições de detecção da câmara de reação e o movimento da cabeçote de detector para uma posição de partida.
14 ♦ Meio Não Transitório Legível por Computador, de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que o protocolo compreende um protocolo de reação em cadeia da polimerase (PCR).
15 » Meio Não Transitório Legível por Computador, de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que o método compreende ainda iniciar o protocolo,
16 - Sistema Para Ajustar Protocolos Para Pluralidade de Câmaras de Reação, para otimizar a eficiência de detecção, caracterizado por que o sistema compreende:
um processador configurada para executar o seguinte:
a determinação ou o fornecimento ou acessamcnto a um tempo do ciclo de detecção;
o recebimento ou o acessa.me.nto de uma etapa de protocolo de um protocolo, sendo a etapa associada a uma duração de etapa, compreendendo a etapa um tempo em que a detecção deve ocorrer durante a etapa; e a determinação de um primeiro ajustamento para a etapa, de tal modo que a duração da etapa seja um múltiplo do tempo do ciclo de
5/10 detecção.
17 - Sistema Para Ajustar Protocolos Para Pluralidade de Câmaras de Reação, de acordo com a Reivindicação 1.6, caracterizado por que a etapa de protocolo é associada a um protocolo a partir de uma pluralidade de protocolos, sendo cada um da pluralidade de protocolos associado, pelo menos, a um de uma pluralidade de reações de eicHzação térmica, em que cada reação de cíclizaçâo térmica compreende uma ou mais etapas de detecção e em que a determinação de ura primeiro ajustamento se baseia, pelo menos em parte, numa medição de temp de uma ou mais etapas de detecção associadas às reações de oiclízaçào térmica de, pelo menos, dois ou mais da pluralidade de protocolos quando os dois ou mais da pluralidade de protocolos são executados simultaneamente.
18 ~ Sistema Para Ajustar Protocolos Para Pluralidade de Câmaras de Reação, de acordo com a Reivindicação 1.6, caracterizado por que o processador é ainda configurado para determinar um segundo ajustamento da etapa, em que o tempo de detecção é um múltiplo do tempo do ciclo de detecção, quando a etapa é ajustada pelo primeiro ajustamento e pelo segundo ajustamento.
19 - Sistema Para Ajustar Protocolos Para de Pluralidade de Câmaras de Reação, de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por que o processador é ainda configurado para determinar um ajustamento de desvio de partida com base numa, posição de uma câmara de reação associada ao protocolo.
20 - Sistema Para Ajustar Protocolos Para Pluralidade de Câmaras de Reação, de acordo com a Reivindicação 16. caracterizado por que o tempo do ciclo de detecção compreende a quantidade de tempo necessária para que um cabeçote de detecção execute uma pluralidade predeterminada de detecções para uma câmara de reação.
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21 - Sistema Para Ajustar Protocolos Para Pluralidade de Câmaras de Reação, de acordo com a Reivindicação 20, caracterizado por que o tempo do ciclo de detecção compreende ainda um tempo necessário para o movimento do cabeçote de detector para cada uma de uma. pluralidade de posições de detecção da câmara de reação e o movimento do cabeçote de detector para a. posição de partida.
22 - Sistema Para Ajustar Protocolos Para Pluralidade de Câmaras de Reação, de acordo com a. Reivindicação 16, caracterizado por que o protocolo oompreen.de um protocolo de reação em cadeia da polimerase (PCR).
23 - Sistema Para Ajustar Protocolos Para Pluralidade de Câmaras de Reação, de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por que o processador é ainda configurado para iniciar o protocolo.
24 - Método Para Realizar Simultaneamente PCR em Tempo Real em Pluralidade de Câmaras de Reação de PCR, caracterizado por que compreende:
(a) proporcionar um tempo de varredura suficiente para que um conjunto detector realize um ciclo de varredura, durante o qual pode varrer cada uma da pluralidade de câmaras de reação de PCR, quanto a, pelo menos, um sinal detectàvel e tornar-se pronto para repetir a varredura;
(b) proporcionar um protocolo de reação para cada uma das câmaras de reação de PCR, que inclui múltiplos ciclos, compreendendo cada ciclo um tempo de ciclo que inclui, pelo menos, uma etapa de aquecimento, pelo menos, uma etapa de arrefecimento c, pelo menos, um patamar de temperatura que incluí um período de ciclo de leitura durante o qual o conjunto detector deve varrer a câmara de reação quanto a, pelo menos, um sinal detectàvel;
7/10 (o) determinar, utilizando um processador, se o tempo de ciclo para essa câmara de reação é o mesmo ou um múltiplo inteiro do tempo de varredura e. se não, ajustar o tempo do ciclo de modo que o tempo do ciclo seja o mesmo ou um múltiplo inteiro do tempo de varredura;
(d) executar pelo menos os passos (b) e (c) para o protocolo de reação para cada uma da pluralidade de câmaras de reação de PCR de modo a que o tempo de ciclo para nada protocolo de reação seja o mesmo ou um múltiplo intei.ro do tempo de varredura; e (e) sob a direção de um processador, realizar PCR em tempo real em cada uma das câmaras de reação, utilizando o protocolo de reação para cada uma das câmaras de reação, incluindo realizar múltiplos ciclos de varredura com o conjunto detectar, em que cada câmara, de reação de PCR ê varrida pelo conjunto detector durante cada período de ciclo de leitura para, essa câmara de reação.
25 «Método Para Realizar Simultaneamente PCR em Tempo Real em Pluralidade de Câmaras de Reação de PCR, de. acordo com a Reivindicação 24, caracterizado por que compreende ainda ajustar o tempo de ciclo do protocolo de reação para pelo menos uma das câmaras de reação.
26 - Método Para Realizar Simultaneamente PCR em Tempo Real em Pluralidade de Câmaras de Reação de PCR, de acordo com a Reivindicação 24, caracterizado por que pelo menus um dito protocolo de reação ê diferente de outro referido protocolo de reação.
27 - Método Para Realizar Simultaneamente PCR em Tempo Real em Pluralidade de Câmaras de Reação de PCR, de acordo com. a. Reivindicação 26, caracterizado por que, pelo menos, um tempo de ciclo num protocolo de reação ê diferente do tempo de ciclo noutro protocolo de reação.
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28 - Sistema Para Ajustar Protocolos Para Pluralidade de Câmaras de Reação, para otimizar a eficiência de detecção, de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por que compreendei ainda a. determinação de um ajuste de interciclo para alongar ou encurtar o tempo entre as etapas de protocolo do protocolo.
29 - Equipamento Para a Realização de Amplificação e Detecção de Ácido Nucleico em Tempo Real, caracterizado por que compreende;
um cabeçote de detector que compreende uma pluralidade de pares de detector de foto e fonte de luz. sendo o referido cabeçote de detector montado num trilho, em que os pares de detector c fontes de luz estão alinhados em uma primeira linha e uma segunda linha;
um receptáculo para um cartucho de microfluidos que compreende uma. pluralidade de câmaras de reação independentes alinhadas em colunas adjacentes de uma primeira fila e uma. segunda fila; e uma placa de abertura, sendo a placa de abertura configurada para, ser posicionada sobre o cartucho de mícrofluidos, quando o cartucho está presente no receptáculo, sendo o cabeçote de detecção localizado por cima. d.a placa de abertura, em que a placa de abertura compreende uma. pluralidade de aberturas que estão alinhadas, cada uma, ao longo de cada uma da pluralidade de câmaras de reação, quando o receptáculo está, prendendo o cartucho de mícrofluidos, em que o cabeçote de detector é móvel ao longo do trilho, de tal moda que cada um da pluralidade de pares de detectores de foto e fonte de luz na primeira fila pode ser colocado sobre cada uma das aberturas na primeira fila da placa de abertura e cada um da pluralidade de pares de detectores de foto e fonte de luz na segunda linha, pode ser po
9/10 sickmado por cima de cada abertura na segunda íila da placa de abertura.
30 - Equipamento Para a Realização de Amplificação e Detecção de
Ácido Nucleico em Tempo Real, de acordo com a Reivindicação 43, caracterizado por que compreende ainda:
um segundo cabeçote de detector compreendendo uma pluralidade de pares de fotodetectores e fonte de luz, sendo dito segundo cabeçote do detector montado no trilho, em que os segundos pares de detectores e fontes de luz estão alinhados numa linha primeira e numa segunda linha:
um segundo receptáculo para um cartucho de mícrofluidos compreendendo uma pluralidade de câmaras de reação independentes alinhadas em colunas adjacentes de uma primeira fda e uma segunda fíla; e uma segunda placa de abertura, sendo a segunda abertura da placa configurada para ser posicionada sobre o segundo cartucho de microíluidos, quando o segundo cartucho estiver presente na segundo receptáculo, sendo o segundo cabeçote de detecção localizado por cima da placa de abertura, em que a. segunda placa de abertura compreende urna pluralidade de aberturas que estão alinhadas, cada uma, ao longo de cada uma da pluralidade de câmaras de reação do segundo cartucho de microfluidos, quando o segundo receptáculo está prendendo o segundo cartucho de mícrofluidos, em que o segundo cabeçote de detector ê móvel ao longo do trilho, de tal modo que nada um da pluralidade de pares de fotodetectores e fonte de luz na primeira linha do segundo cabeçote de detector pode ser posicionado por cima de nada abertura na primeira linha da segunda ιο/ιο placa de abertura e cada um da pluralidade de pares de fotodeteetores e fonte de luz na segunda üla da. segundo cabeçote de detector pode ser posicionado por cima de cada abertura na segunda fila da segunda placa de abertura.
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 13/04/2012, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.