JP5633133B2

JP5633133B2 - 遺伝子解析装置

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Publication number: JP5633133B2
Application number: JP2009227907A
Authority: JP
Inventors: 星野　昭裕; 昭裕星野; 雅人中山
Original assignee: Toppan Inc
Current assignee: Toppan Inc
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2029-09-30
Also published as: JP2011072263A

Description

本発明は、遺伝子解析装置に関する。より詳細には、本発明は、核酸の増幅反応、光連結反応および蛍光測定を利用した遺伝子解析装置に関する。

最近、ＤＮＡマイクロアレイをはじめとするハイブリダイゼーション検出技術の実用化が進んでいる。ＤＮＡマイクロアレイは、多種・多様のＤＮＡプローブを基板表面に集積して固定したものである。このＤＮＡマイクロアレイを用いて、ＤＮＡマイクロアレイ基板表面のハイブリダイゼーションを検出することにより、細胞・組織等における遺伝子を網羅的に解析することができる。

このマイクロアレイにより得られたデータを、ＰＣＲ法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ；ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて検証することが微量核酸の定性分析および定量分析の標準的手法となっている。

リアルタイムＰＣＲ法では、「熱変性→プライマーとのアニーリング→ポリメラーゼ伸長反応」という増幅サイクルを連続的に行い、ＤＮＡ等を数十万倍にも増幅させ、このように得られたＰＣＲ増幅産物をリアルタイムでモニタリングすることで、前記微量核酸の定性分析および定量分析を行う。試料にて増幅反応が進行する際に励起光を照射することで、増幅の程度が蛍光信号としてリアルタイムで検出される。

遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲで定量する原理を以下に述べる。まず、段階希釈した濃度既知の標準サンプルを鋳型として使用してＰＣＲを行なう。そして、一定の増幅産物量に達するサイクル数（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｃｙｃｌｅ；Ｃｔ値）を求める。このＣｔ値を横軸に、初発のＤＮＡ量を縦軸にプロットして、検量線を作成する。未知濃度のサンプルについても、同じ条件下でＰＣＲ反応を行ってＣｔ値を求める。この値と前述した検量線とから、サンプル中の目的のＤＮＡ量を測定できる。

リアルタイムＰＣＲでは、ＰＣＲ増幅産物を蛍光により検出する。検出方法は、大きく分けてインターカレーターを用いる方法と蛍光標識プローブを用いる方法の２種類がある。

インターカレーター法は、二本鎖ＤＮＡをすべて検出するため、検出の対象となる遺伝子ごとにプローブを用意する必要がない。そのため、実験コストを低く抑えることができ、反応系の構築も容易である。しかしながら、検出特異性はあまり高くない。当該方法では、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩといった、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する試薬（インターカレーター）が使用される。インターカレーターは、ＰＣＲ反応によって合成された二本鎖ＤＮＡと結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターできる。

一方、蛍光標識プローブを用いる方法は、コストは高くなるが、検出特異性が高いため相同性の高い配列同士であっても区別して検出できる。当該方法では、例えばＴａｑＭａｎプローブが使用される。このプローブは、５’末端を蛍光色素で、３’末端をクエンチャーで修飾したオリゴヌクレオチドである。ＴａｑＭａｎプローブは、アニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。伸長反応ステップにおいて、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのもつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光が発せられる。この原理を用いて、ＳＮＰ等の検出が可能となる。

光連結反応を利用した遺伝子の解析方法は、３６５ｎｍ前後のＵＶ光を照射することで連結反応を誘導することができる光応答性化合物を用いた解析方法である。当該方法では、光応答性化合物で修飾したプローブを、複製されたＤＮＡ等に配列特異的にハイブリダイゼーションさせ、プローブの光連結反応の有無を通じて、ＤＮＡの塩基配列を判別する。このとき、３６５ｎｍ前後のＵＶ光を必要なエネルギー量だけ照射することで、反応量を任意に制御でき、さらに、反応に適した温度、タイミングなどの条件選択も可能となる。特にＳＮＰ検出等において、その選択性と障害性を用いて蛍光収量に差異を生じさせることができるため、ＳＮＰ等の検出に有効な方法と考えられている。

光連結反応を利用した技術および装置に関する先行文献として、特許文献１が知られている。特許文献１の第１図は、特許文献１に係る検定を行うための方法および装置の模式図である。この模式図には、ターゲットポリヌクレオチドおよび第一プローブと第二プローブにハイブリダイゼーション条件を付与する手段、封入容器内に放射エネルギーを発生させる手段、および検出手段等が含まれていると記載されている（特許文献１の１２頁左カラム３９行目〜４６行目参照）。しかし、各構成要素は具体的に示されておらず、当該方法を実施するための装置も開示されていない。

特許第２８５８７７１号公報

従来の方法によれば、遺伝子解析に用いる光連結反応は単独で行われることは少なく、ＰＣＲによる増幅を経た後に光連結反応のための操作が行われる。すなわち、ＰＣＲによる増幅、光連結のための光照射および光連結の検出が、それぞれ専用の独立した装置で行われている。そのため、ＰＣＲ装置、光連結用ＵＶ照射装置および光連結用検出装置間のチューブ等の移動操作が煩雑となり、一連の解析のために手間および時間を要している。このような煩雑な操作は、解析結果の精度を下げる一因ともなっている。

また、従来の方法では、ＰＣＲ用装置の温度調節手段のみを使ってチューブを一定の温度に加熱し、その後、紫外線照射により光連結を行うが、紫外線照射ユニットとチューブの位置決めの自由度が高い装置が用いられるため、使用する人によって位置決め位置が異なるといった場合もあり、再現性に問題が生じている。

本発明の目的は、煩雑な操作が要らず、再現性の高い解析が可能な遺伝子解析装置を提供することにある。

本発明の第１の実施形態によれば、核酸の増幅および光連結反応が行われるサンプルが収容される反応容器と、前記反応容器内のサンプルの温度を調節する温度調節手段と、前記反応容器内のサンプルに光連結反応を促進する光を照射する光連結用光源を備えた光連結誘導手段と、前記反応容器内のサンプルにおける光連結反応の有無を測定するための蛍光測定用励起光源および蛍光取得ユニットを備えた蛍光測定手段とを備え、前記光連結誘導手段と前記蛍光測定手段とが、前記反応容器を挟んで対向して位置し、前記光連結誘導手段と前記反応容器との間に、前記光連結誘導手段側に紫外光に対する反射防止コーティングが施され、前記反応容器側に赤外光を反射する赤外反射コーティングが施されたガラス基板を有する遺伝子解析装置が提供される。

本発明の第２の実施態様によれば、前記蛍光測定手段が、前記蛍光測定用励起光源からの光の波長帯域を制限するフィルターと、前記反応容器内のサンプルから放出される蛍光の波長帯域を制限するフィルターとを備え、前記反応容器が蓋を有したチューブであり、前記蓋は平らな形状であり且つ紫外光から可視光の間の光を透過し、前記光連結誘導手段と前記反応容器との間に、前記チューブの蓋に押し付けて固定されるヒータープレートを備え、前記ヒータープレートは前記光連結誘導手段からの光を前記反応容器まで通過させる孔を有し、前記温度調節手段は、複数の前記反応容器をそれぞれ収容できる複数の孔を有した温度調節ブロックと、前記温度調節ブロックの側面に備えられた温度調節用ヒートシンクとを備え、前記光連結誘導手段は、前記光連結用光源を固定し且つ冷却する冷却固定ブロックと、前記冷却固定ブロックに取り付けられた光連結用ヒートシンクとをさらに備えた請求項１に記載の装置が提供される。

本発明の第３の実施態様によれば、前記光連結用光源が、３６５ｎｍを中心波長とする光を照射し、３６５ｎｍ±１０ｎｍのバンド幅の透過用フィルターを備える請求項１に記載の装置が提供される。

本発明の第４の実施態様によれば、前記温度調節手段が、前記反応容器内のサンプルの温度を、核酸の増幅および光連結反応の進行に適した温度に調節する請求項１に記載の装置が提供される。

本発明の第５の実施態様によれば、前記蛍光測定用励起光源が発光ダイオードであり、前記蛍光取得ユニットがアバランシェ・フォトダイオード、光電子増倍管またはフォトダイオードである請求項１に記載の装置が提供される。

本発明の第６の実施態様によれば、前記光連結用光源と前記反応容器との間に挿入可能な、表面に凹凸が形成された無反射板を備える請求項１に記載の装置が提供される。

本発明の第７の実施態様によれば、前記ガラス基板における前記赤外反射コーティングは、１００ｎｍ以下の厚さの酸化インジウムスズ膜から成る請求項１に記載の装置が提供される。

本発明の第８の実施態様によれば、前記光連結誘導手段は、前記光連結用ヒートシンクに対して送風する空冷ファンをさらに備えた請求項２に記載の装置が提供される。

本発明によれば、核酸を増幅する手段、光連結を誘導する手段および蛍光を測定する手段とが備わった装置が提供されるため、煩雑な操作を必要とせず、且つ、再現性の高い光連結を行うことが可能となり、精度の高い遺伝子解析を行うことができる。

本発明の遺伝子解析装置を示す断面図。本発明の装置の一部を構成する反応容器の平面図および正面図。本発明の遺伝子解析装置を示す斜視図。ガラス基板の反射防止コーティングの特性を示すグラフ。ガラス基板の赤外反射コーティングの特性を示すグラフ。従来方法による測定結果を示すグラフ。本発明方法による測定結果を示すグラフ。混合方法による測定結果を示すグラフ。図６〜図８における９０℃の蛍光強度比を示すグラフ。

以下、図面を参照しながら本発明の実施形態を説明する。
図１は、本発明の遺伝子解析装置の概要を示す断面図である。本発明の遺伝子解析装置は、反応容器１、温度調節手段２、光連結誘導手段３および蛍光測定手段４を備える。当該装置には、任意に、ガラス基板５およびヒータープレート６を設けることができる。光連結誘導手段３は、光連結用光源３１を備え、任意に光連結用フィルター３２を備える。蛍光測定手段４は、蛍光測定用励起光源４１および蛍光取得ユニット４２を備え、任意に、励起用フィルター４３、蛍光測定用フィルター４４、ダイクロイックミラー４５、迷光吸収ユニット４６および集光レンズ４７を備える。

本発明の遺伝子解析装置において、反応容器１は、その内部に研究対象のサンプルや反応の進行のために必要な試薬等を保持し、当該装置によって誘導される反応の場を提供する。温度調節手段２は、反応容器１内部の温度条件を調節するために設置され、核酸の増幅等の反応を誘導する。光連結誘導手段３は、反応容器１内部における光連結反応を誘導するために設置される。蛍光測定手段４は、反応容器１内部にて生じた反応を随時モニタリングするために設置される。本発明の遺伝子解析装置は、以上の反応容器１、温度調節手段２、光連結誘導手段３および蛍光測定手段４を具備することによって、医学または生物学の分野で要求される種々の遺伝子解析を行うことができる。

そのような使用例の１つは、特定の塩基配列におけるＳＮＰの検出である。この使用例では、当該装置によって、（ａ）標的核酸の増幅、（ｂ）標的核酸と２種のプローブとのハイブリダイゼーション、（ｃ）プローブ間の光連結および（ｄ）連結したプローブから照射される蛍光の測定が、この順に行われる。例えば、標的核酸が正常な配列である場合、正常な配列に対して相補的に設計された２種のプローブと、標的核酸とがハイブリダイズし、その結果、２種のプローブは標的核酸上で隣接する。その状態で特定の光を照射して２種のプローブ間で光連結反応を誘導すると、プローブ同士が連結する。その後、連結したプローブ双方に予め修飾された蛍光色素が蛍光共鳴エンルギー転移（FRET）により発光した特定波長の蛍光を測定することで、標的核酸が正常配列であったことを確認できる。これに対し、標的核酸中にＳＮＰが生じている場合、標的核酸とプローブとが完全にハイブリダイズしないため、特定の光を照射してもプローブ間での光連結反応が起こらず、結果的にFRET光を発光することができない。このようにして、ＳＮＰの存在を確認できる。なお、このような使用方法については、後に詳述する。

このような解析方法を行う場合、従来、上記（ａ）〜（ｄ）のそれぞれの工程を独立した装置によって行っていたが、本発明の装置を使用することで、最初に必要な試薬等を反応容器１に投入し、適切な条件を設定して解析を開始するだけで、途中で試薬の投入等なんら処理を行う必要なく、自動で解析が終了する。これによって、操作者は煩雑な作業から解放され、さらに、そのような作業に起因して生じる実験の誤差やエラーを防止することができる。なお、本発明の遺伝子解析装置は、上記のようなＳＮＰ解析に限定されず、挿入・欠損、繰り返し配列変異、コピー数変異（ＣＮＶ）等、当業者に既知のあらゆる対象の解析方法に利用することができる。

次に、本発明の遺伝子解析装置の、各要素について詳述する。

反応容器１は、その内部に研究対象のサンプルや反応の進行のために必要な試薬等を保持し、当該装置によって誘導される反応の場を提供する。反応容器１としては、そのような反応に影響を与えず、且つ、温度調節手段２によって加熱された場合でも変形しない容器が使用される。例えば、反応容器１として、チューブまたはプレートを使用することができる。また、内部に収容する反応液が蒸発して消失することを防止するために、蓋が付いており密封することが可能なものが好ましい。チューブとしては、ＰＣＲ用途に使用される一般的なチューブを使用することができ、例えば、ポリプロピレン製チューブを使用できる。

チューブを使用する場合、図２に示される形状のものが好適である。すなわち、チューブ本体１ｂに、取り外し可能な蓋１ａを有するものである。蓋１ａは、側面からみた図（図２B）に示されるとおり、上部が平らな形状を有していることが好ましい。また、蓋１ａは、上からみた図（図２A）に示されるとおり、透過窓１ｃを有しており、チューブ内部に対して特定の光を透過できることが好ましい。透過窓１ｃは、紫外から可視にかけての光、特に３６５ｎｍ付近に波長ピークを有する光に対して透過性が高いことが好ましい。チューブの上部に光連結誘導手段３を配置し、透過窓１ｃに対して光を照射する構成とする場合、透過窓１ｃが平らで、且つ透過性が高いことにより、光の強度を維持したままチューブ内部に光を到達させることが可能となる。

温度調節手段２は、反応容器１内部の温度条件を調節するために設置され、核酸の増幅等の反応を誘導する。温度調節手段２としては、従来のＰＣＲ用サーマルサイクラーに一般的に使用される温度調節手段を使用することができる。例えば、アルミニウムまたは銅といった熱伝導性の高い金属のブロックとペルチェ素子とを組み合わせたものを使用できる。さらに温度センサとして熱電対を具備させることもできる。図１の断面図のように、反応容器１と温度調節手段２との接触面積がより大きいほうが、熱伝導の観点から有利である。したがって、図１に示されるように、温度調節手段２のブロックに、反応容器１の形状に合わせた溝または孔を作り、そこに反応容器１を隙間なく収容することで、高い熱伝導性を達成出来る。

より具体的には、図３に示されるように、温度調節手段２は、温度調節ブロック２１に温度調節用ヒートシンク２２を設けたものである。図３に示される温度調節手段２では、温度調節ブロック２１は、複数の孔を有し、複数の反応容器１を同時に収容できるようになっている。温度調節ブロック２１の側面に、温度調節用ヒートシンク２２が備えられており、温度調節用ヒートシンク２２から熱を放出させることで、過度の温度上昇を避けることができる。温度調節用ヒートシンク２２は、例えば、アルミニウムや銅といった熱伝導性の高い金属を素材とするものを使用でき、また、大きさや形状は放出熱容量に合わせたものを選ぶ。例えば、温度調節ブロック２１の大きさに合わせた金属プレートを、温度調節ブロック２１の側面に接着することで、温度調節用ヒートシンク２２を形成できる。さらに放熱性を上げるために、温度調節用ヒートシンク２２に対して送風するファンを設置することもできる。

温度調節手段２によって、反応容器１内部の温度を適切に調節することが可能となる。温度調節手段２は、一定の温度まで上昇させる機能のみ、または一定の温度を維持する機能のみを有するものであってもよいが、好ましくは、ＰＣＲ法等の実行のために要求される温度条件を達成できる機能を有する。すなわち、予め設定したプログラムに従って、一定の温度を一定時間維持し、さらに、そのようなサイクルを複数回繰り返すことが可能であることが好ましい。なお、本発明の遺伝子解析装置において、主に温度調節手段２によって達成される核酸の増幅反応は、ＰＣＲ法のみに限定されず、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＳＭＡＰ法、ＬＣＲ法等、当該分野において既知の方法で行うことができる。また、温度調節手段２は、核酸の増幅反応においてのみ機能するわけではなく、光連結反応、蛍光測定時において、それらの反応に適した温度条件を提供することもできる。例えば、光連結反応を行う際には、反応容器１内部の温度を約５０℃程度にすることが好ましく、このような温度条件を温度調節手段２によって達成することができる。

光連結誘導手段３は、反応容器１内部における核酸等の連結反応を誘導するために設置される。光連結誘導手段３は、図１に示されるように、光連結用光源３１および光連結用フィルター３２を含む。光連結用光源３１としては、波長３６５ｎｍを中心波長とする光源、例えば高出力発光ダイオード（ＵＶ−ＬＥＤ）を使用することができる。光連結用フィルター３２としては、３６５ｎｍ付近の光を透過するフィルター、例えば３６５ｎｍ±１０ｎｍのバンド幅の透過用フィルターを使用することができる。更に、光連結用フィルター３２として凸レンズを使用し、光連結用光源３１からの光を、反応容器１内の適切な距離で焦点を結ぶよう設定することができる。光連結誘導手段３は、図３に示されるように、反応容器１と同数設けることができる。これによって、複数の反応容器１に対して同時に光を照射することができ、全体の処理時間の短縮が達成できる。なお光連結用光源及び各フィルターの波長は、用いる光応答性化合物に応じて適宜選択することが可能である。以下の説明では、光応答性化合物の応答波長が３６５ｎｍ付近であるとして説明するが、これを応答波長に応じて差し替えることができる。

本発明の遺伝子解析装置において、光連結誘導手段３と蛍光測定手段４を、反応容器１を挟んで対向して位置するよう設置することができる。このように、光連結誘導手段３を反応容器１の真上に配置することで、光連結用光源３１と反応容器１内部の照射領域との間の距離をより小さくすることができ、その間を進む紫外光の強度を維持することができる。すなわち、このような配置は、強度の低い光連結用光源３１を本発明に使用できる点で有利である。

図１のように光連結用光源３１を装置の上部に設置する場合、温度調節手段２や、後に詳述するヒータープレート６から発生した熱によって、光連結用光源３１が加熱される場合がある。この場合、光連結用光源３１の紫外線放射効率が下がることによって必要な照射が得にくくなる問題、温度の上昇のため照射される光の中心波長が長波長側に多少シフトする問題、光連結用光源３１の寿命が短くなる問題等が発生し得る。

加熱の問題を回避するために、図３に示すように冷却固定ブロック３３および光連結用ヒートシンク３４を用いる。冷却固定ブロック３３内部に、複数の光連結用光源３１が等間隔に並べて固定されている。光連結用光源３１は、冷却固定ブロック３３の低部まで貫通しており、光連結用光源３１から照射される光は、遮断されることなく反応容器１に到達できる。冷却固定ブロック３３は、温度調節ブロック２と同様に、アルミニウムまたは銅といった熱伝導性の高い金属にペルチェ素子を組み合わせたものを使用できる。冷却固定ブロック３３と光連結用光源３１との間の熱伝導性を上げるために、冷却固定ブロック３３と光連結用光源３１との間にアルミの粉末が練りこまれた熱伝熱性の高いシリコーン樹脂を挟むことができる。冷却固定ブロック３３に光連結用ヒートシンク３４を取り付けて、放熱効率を上げる。さらに、光連結用ヒートシンク３４に対して送風する空冷ファン３５を設置することで、光連結用ヒートシンク３４に伝わった熱を効率良く放出させることができる。

上記の加熱の問題の他の回避策として、光連結用光源３１と反応容器１との位置関係を変更してもよい。すなわち、光連結用光源３１を反応容器１の真上に配置せず、光連結用光源３１からの光を、例えばダイクロイックミラーを介して反応容器１に照射する構成とすることができる。このような構成では、光連結用光源３１は、反応容器１の真上に位置しないため、反応容器１とそれを囲む温度調節手段２等からの熱を直接受けることがなく、当該熱に起因する加熱を抑制できる。

その他の加熱の問題の回避策として、ガラス基板５または無反射板の利用が挙げられるが、これらに関しては後に詳述する。

蛍光測定手段４は、反応容器１内部にて生じた反応を随時モニタリングするために設置される。図１に示されるように、蛍光測定用励起光源４１および蛍光取得ユニット４２を備え、任意に、励起用フィルター４３、蛍光測定用フィルター４４、ダイクロイックミラー４５、迷光吸収ユニット４６および集光用レンズ４７を備える。

蛍光測定用励起光源４１としては、反応容器１に添加される試薬に応じて、適切な波長を照射する光源が選択される。例えば、波長４７０ｎｍ付近の光によって励起される蛍光分子を使用する場合には、蛍光測定用励起光源４１として、４７０ｎｍ付近のピーク波長を有する光源が使用される。一般に、励起光の波長と、蛍光分子から照射される蛍光の波長とが重複しないことが好ましい。従って、蛍光測定用励起光源４１が、必要な波長以外の光を照射する場合には、励起用フィルター４３を使用して、そのような光を遮断することができる。例えば、波長４７０ｎｍ付近の光によって励起したい場合、励起用フィルター４３として、スペクトル幅を４７０ｎｍ±２０ｎｍまたは４７０ｎｍ±１０ｎｍに限定するバンドパスフィルターを使用できる。また、励起用フィルター４３をレンズとすることもでき、この場合、蛍光測定用励起光源４１から照射された励起光を、反応容器１内の光照射位置１１に集光させることができる。

蛍光取得ユニット４２としては、アバランシェ・フォトダイオード、光電子増倍管（ＰＭＴ：フォトマルチプライヤー）またはフォトダイオードといった、特定の光を電流に変換できる素子が使用される。このような素子によって、反応容器１内の蛍光分子から生じた光を検出することができる。蛍光の検出の際は、検出の精度向上の観点から、バックグラウンドの光を抑え、蛍光分子から発生した蛍光のみを検出することが好ましい。したがって、蛍光測定用フィルター４４を取り付けて、蛍光測定用励起光源４１からの直接の光や外部からの光を遮断し、測定しようとする波長の光のみが蛍光取得ユニット４２に到達するようにできる。

図１に示すように、蛍光測定用励起光源４１から水平方向に出た光は、ダイクロックミラー４５で波長選択反射され、鉛直下方から反応容器１内のサンプルに照射される。励起された蛍光分子から放出された蛍光は、集光用レンズ４７励起用を透過した後、ダイクロイックミラー４５を反射せずに透過し、蛍光測定用フィルター４４を透過して蛍光取得ユニットに取り込まれる。なお、蛍光測定用励起光源４１を出てダイクロイックミラー４５を反射せずに透過する迷光は、迷光吸入ユニット４６に吸収させ、測定への影響を抑えることができる。

本発明の遺伝子解析装置では、図３に示されるように、反応容器１に合わせて複数設置される光連結誘導手段３とは異なり、蛍光測定手段４の設置数は１つとすることが好ましい。この場合、蛍光測定手段４は、移動手段を備え、複数の反応容器１を順に測定できる。複数の蛍光測定手段４を設置する場合、蛍光測定手段４ごとの測定誤差が生じる可能性があるが、蛍光測定手段４を１つとすることで、この問題を回避できる。

本発明の遺伝子解析装置は、図１および図３のように、光連結誘導手段３と反応容器１との間に、ガラス基板５を有する。このガラス基板５は、温度調節手段２等に起因した光連結誘導手段３の加熱の防止を主な目的とする。また、ヒータープレート６を使用する場合には、ガラス基板５は、光連結誘導手段３とヒータープレート６との間に設置される。

ガラス基板５の反応容器１側の面は、温度調節手段２等からの熱伝達を防止するために、赤外線を反射するための赤外反射コーティング５２が施される。特に、赤外反射コーティング５２は、図５の分光特性に示されるように、７００ｎｍ以上の光を反射する。赤外反射コーティング５２は、ＩＴＯ（酸化インジウムスズ）膜とすることができる。ガラス基板５に対するＩＴＯ膜のコーティングは、例えば高周波スパッタ装置によって行うことができる。ＩＴＯ膜は、作製条件によっては波長３６５ｎｍの光の一部を吸収するため、１００ｎｍ以下の薄い膜とすることが好ましい。例えば、高周波スパッタ装置を用いて、屈折率１．５２のガラス基板上に、ガラス基板温度を２００℃として、ＩＴＯ膜を５０ｎｍ程度の厚さでコーティングすることができる。

一方、ガラス基板５の光連結用光源３１側の面は、光連結用光源３１から照射される光を良好に透過するために、反射防止コーティング５１が施される。特に、反射防止コーティング５１は、図４の透過率特性に示されるように、紫外域の光、具体的には３６５ｎｍをピークとし半値幅が２０ｎｍである光を良好に透過するものが選択される。反射防止コーティング５１は、例えば誘電体多層膜で構成することができ、具体的には、ＳｉＯ_２（低屈折率１．４７）とＴｉＯ_２（高屈折率２．３８）をλ／４の膜厚で１０〜３０層積層することで得られる。通常の光学ガラスでは片面４％、両面８％程度の反射が起こるところ、反射防止コーティング５１を施したガラス基板５では、反射が１〜２％程度に抑えられ、好ましくは０．５％以下、さらに好ましくは０．２％以下に抑えられる。結果として、波長３６５ｎｍに光について９９％以上の透過率が得られる。

本発明の遺伝子解析装置は、光連結誘導手段３と反応容器１との間に、ヒータープレート６を有する。ヒータープレート６は、反応容器１（特にチューブ）の蓋に押し付けて固定され、且つ、光連結用光源３１から照射される光を反応容器１に到達させるための孔を有する。

ＰＣＲ法による核酸の増幅の工程において、反応容器１内の温度は１００℃前後まで加熱される。これにより、反応容器１中の溶液が気化した状態となる。この結果、反応容器１内部の、温度調節手段２に覆われていない部分に結露が生じる。この結露が、光連結誘導手段３からの光を取り込む部分に部分（例えば、図２における透過窓１ｃ）に生じた場合、光の透過率を減少させる。また溶媒が気化することによって、反応溶液中の試薬濃度に変化が生じ、反応の進行の障害となり得る。さらに、気化することで反応容器１の内部圧力が上昇し、反応容器１の蓋が開くおそれがある。

このような問題は、ヒータープレート６を設置することで解決できる。ヒータープレート６は、反応容器１に接触して固定される。ここにおいて、反応容器１は、図１に示されるように、ヒータープレート６と温度調節手段２との間に挟まれて固定され、これによって、反応容器１内の内部圧力が上昇した場合でも、蓋の開封が防止される。また、ヒータープレート６は、１００℃以上まで加熱することができ、反応容器１が接触する部分の結露を防ぐことができる。このように結露が予防されるため、反応溶液の溶媒の量も一定に保たれる。ヒータープレート６に設けられる光を通過させるための孔の大きさは、使用する反応容器１に合わせて適宜選択でき、例えば図２のようなチューブを使用する場合、孔の大きさは、透過窓１ｃの大きさとほぼ同一にすることができる。当該孔は、反応容器１の数に応じて設けられる。ヒータープレートは、アルミニウムまたは銅といった熱伝導性の高い金属のプレートにシリコンヒーターを設置したものを使用できる。

本発明の遺伝子解析装置は、光連結誘導手段３と反応容器１との間に挿入可能な、表面が凹凸形状である無反射板を具備することができる。無反射板の素材としては、表面を光の反射を低く抑えるように凹凸加工できるもの、最も好ましくはサブミクロンの凹凸に加工できるもの、あるいは、素材自体が光の反射性が低いものであれば任意のものを使用でき、例えば金属またはプラスチック等を使用できる。蛍光測定手段４によって測定を行う際に、無反射板を光連結誘導手段３と反応容器１との間に挿入することで、測定に影響を与える光の反射を防止できる。本発明の遺伝子解析装置にガラス基板５を使用している場合、無反射板は光連結誘導手段３とガラス基板５との間に挿入することが好ましい。

本発明の遺伝子解析装置は、医学または生物学の分野で要求される種々の遺伝子解析のために使用することができる。その一例は、塩基配列中のＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism：一塩基多型）の検出である。この例では、本発明の遺伝子解析装置によって、（ａ）標的核酸の増幅、（ｂ）標的核酸と２種のプローブとのハイブリダイゼーション、（ｃ）プローブ間の光連結および（ｄ）連結したプローブから照射される蛍光の測定が、この順に行われる。以下に詳細を説明する。

（ａ）核酸の増幅
この工程では、ＰＣＲ法によって標的核酸が増幅される。予め反応容器１内に、解析の対象となる配列を含むゲノムＤＮＡ、プライマー、ポリメラーゼおよびＰＣＲに必要な試薬が添加されており、温度調節手段２により反応容器１内の温度条件を調節することによってＰＣＲが進行し、ゲノムＤＮＡから特定の配列を有した標的核酸が増幅される。なお、標的核酸の増幅はＰＣＲ法によらず、当該分野で既知のその他の増幅方法によって行うこともできる。

（ｂ）核酸とプローブのハイブリダイゼーション
この工程では、増幅した標的核酸と、予め反応容器１内に添加されていた２種のプローブとのハイブリダイゼーションが行われる。このハイブリダイゼーションは、主に温度調節手段２による温度条件の設定によって達成される。例えば、解離温度まで加熱して増幅した二本鎖の標的核酸を一本鎖にした後、一定の温度まで冷却して、当該一本鎖にプローブをアニーリングさせる。この２種のプローブの配列は、標的核酸の配列に相補的であり、且つ、標的核酸にハイブリダイズした場合には互いに隣接して位置するように設計されている。また、プローブの２つの末端のうち、標的核酸上で隣接してハイブリダイズしたときに他方のプローブ側に位置する末端は、それぞれ光応答物質によって修飾されている。光応答物質とは、例えば、光照射によって開裂する共役二重結合を有した化合物であり、光の照射によって２種のプローブの共有結合による連結をもたらす。さらに、一方のプローブにはアクセプター分子が結合されており、他方のプローブにはドナー分子が結合されており、これらの分子が接近した場合にはＦＲＥＴ（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＲｅｓｏｎａｎｃｅＥｎｅｒｇｙＴｒａｎｓｆｅｒ、蛍光共鳴エネルギー移動）が生じるように設計されている。ここにおいて、ＦＲＥＴとは、互いに近接したドナー分子とアクセプター分子との間で、励起エネルギーが、電磁波となることなく、電子の共鳴により直接移動する現象のことである。標的核酸の配列が、予め設計したプローブの配列と一致する場合には、標的核酸と２種のプローブとのハイブリダイゼーションが良好に生じ、標的核酸上で２種のプローブが隣接した状態となる。一方、標的核酸の配列にＳＮＰが生じており、予め設計したプローブの配列とは完全に一致しない場合、少なくとも一方のプローブは標的核酸とハイブリダイズできずまたは不完全な状態でハイブリダイズし、その結果、標的核酸上で、２種のプローブが十分隣接した状態とならない。

（ｃ）プローブ間の光連結
この工程では、標的核酸上で隣接して位置する２種のプローブに、光連結誘導手段３から光を照射し、プローブ間の光連結を誘導する。それぞれのプローブを光応答物質で修飾しているため、標的核酸上で隣接した場合には、波長３６５ｎｍの光を受けることで、光応答物質の有する共役二重結合が開裂し、光応答物質間で共有結合が生じる。一方、標的核酸中にＳＮＰが生じており、標的核酸とプローブとの間で良好なハイブリダイゼーションが生じなかった場合、光を照射しても、光応答物質同士が十分接近していないため共有結合が生じない。すなわち、正常な配列とＳＮＰを有する配列との違いが、光連結の有無となる。

（ｄ）連結したプローブから放出される蛍光の測定
この工程では、光連結の有無を蛍光の発生の有無として検出する。上記の通り、２種のプローブには、ＦＲＥＴの反応におけるドナー分子およびアクセプター分子がそれぞれ結合されており、２種のプローブ同士が光連結できた場合、ドナー分子とアクセプター分子との間でＦＲＥＴが生じ得る状態となる。ここで、ドナー分子として、波長４３６ｎｍの光によって励起され、波長４８０ｎｍの光を放出する分子を使用し、アクセプター分子として波長４８０ｎｍの光によって励起され、波長５３５ｎｍの光を放出する分子を使用した場合、蛍光測定用励起光源４１から４３６ｎｍの光を照射すると、その光は一旦ドナー分子に吸収された後、ＦＲＥＴによってアクセプター分子が励起され、続いて波長５３５ｎｍの光が放出される。一方、光連結が出来なかった場合は、蛍光測定用励起光源４１からの波長４３６ｎｍの光は、ドナー分子によって吸収された後、そのままドナー分子から波長４８０ｎｍの光として放出される。蛍光測定用フィルター４４および蛍光取得ユニット４２で測定することで、波長５３５ｎｍの光が放出されたか、波長４８０ｎｍの光が放出されたかを判断することによって、光連結反応が生じたか否か、すなわち標的核酸にＳＮＰがあったか否かが判断できる。また、ドナー分子およびアクセプター分子の代わりに、蛍光分子およびクエンチャー分子を使用することもでき、この場合、光連結が生じた場合では、励起された蛍光分子から生じるエネルギーは、クエンチャー分子によって消光され、光連結が生じなかった場合には、励起された蛍光分子から生じるエネルギーは、そのまま蛍光として放出される。

上述のようなＳＮＰ検出方法は、本発明の遺伝子解析装置の使用の一例であり、その他の用途にも使用できる。例えば、ＳＮＰに限らず特定の配列を有する核酸のスクリーニング等にも使用できる。また、本発明の遺伝子解析装置は、温度調節手段２、光連結誘導手段３および蛍光測定手段４の全ての機能を使用する用途に限定されず、ＰＣＲの増幅のみ、光連結誘導のみまたは蛍光測定のみに使用することもできる。

本発明の遺伝子解析装置を作製し、遺伝子解析を実行し、評価した。遺伝子解析としては、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のＳＮＰ解析を行った。

［装置の製造］
＜反応容器＞
反応容器としてＰＣＲ用チューブを使用した。２００μｌ容量で、キャップ上面が平らなマイクロチューブ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。

以下の表１に示される各物質を、表記した量となるように添加し、全量４５μｌのサンプルを作製した。

ここにおいて、ゲノムＤＮＡの条件を代えて、ＷＴ、ＭＴおよびＮＣで示される、以下の３種類のサンプルを作製した。
ＷＴ：正常なＣＹＰ２Ｃ９遺伝子を含むゲノムＤＮＡを使用
ＭＴ：ＳＮＰを含むＣＹＰ２Ｃ９遺伝子を含むゲノムＤＮＡを使用
ＮＣ：ゲノムＤＮＡを添加しない。

＜温度調節手段＞
温度調節手段としては、一般にＰＣＲ用サーマルサイクラーにおいて使用されるものを使用した。すなわち、複数枚のペルチェ素子と熱電対とで構成された温度調節ブロックを使用した。当該ブロックは、チューブを１２連で設置可能なものとした。それを制御系に接続し、通常のＰＣＲ法を実行できるよう設定した。また、光連結反応および蛍光測定において、特定の温度条件を達成できるように設定した。

＜光連結誘導手段＞
光連結誘導手段として、波長３６５ｎｍの光を照射する光連結用光源と、光連結用フィルターとしてのレンズとを組み合わせて作製した。光連結用光源は、日亜化学の高出力ＵＶ−ＬＥＤチップ（型番ＮＣＳＵ０３３Ａ：駆動電流５００ｍＡ）を備えた浜松ホトニクス製のＵＶ−ＬＥＤモジュール（型番ＬＣ−Ｌ２）を用いた。レンズは、チューブ内の光照射位置での照度および希望照射距離を考慮して、φ６ｍｍの照射エリアを持つもの（浜松ホトニクス社製、型番Ｌ１０５６１−２１５）を選択した。

チューブとＵＶ−ＬＥＤとが一対一となるように、１２個のＵＶ−ＬＥＤを用意した。１２個のＵＶ−ＬＥＤを等間隔に並べ、冷却固定ブロック（アルミ製ブロック）で固定した。そのように固定されたブロックを、温度調節手段に設置されたチューブの上に設置することで、１つのＵＶ−ＬＥＤが、１つのチューブの蓋部分を真上から照射できる。このアルミ製ブロックは、２つのブロックから構成され、それぞれに円筒状のＵＶ−ＬＥＤを挟持固定できるよう溝が形成されている。ＵＶ−ＬＥＤとアルミ製ブロックとの間には、アルミの粉末が練り込まれた熱伝導性の高いシリコーン樹脂を挟んだ。さらに、ＵＶ−ＬＥＤを挟んで固定した後、アルミ製ブロックの外側に、ヒートシンク（１０ｃｍ角、厚さ３０ｍｍ）を４枚取り付けた。さらに、ヒートシンクに対して送風する空冷ファンを設置した。

ＵＶ−ＬＥＤを固定したアルミ製ブロックは、チューブが設置される温度調節手段の上部に、上下移動可能な状態で吊るして設置した。また、当該アルミ製ブロックの両端に位置決め用のピンを付けた。このピンは、アルミ製ブロックを温度調節手段に向けて降ろしたときに、温度調節手段に設けられた穴に収まるようになっており、これによって、各ＵＶ−ＬＥＤが、対応するチューブに対して適切に位置することができ、さらに、衝撃等に起因してそれらの位置関係がずれるのを予防することができる。

ＵＶ−ＬＥＤは、ＵＶ−ＬＥＤヘッド部とＬＥＤドライバー部からなり、ＬＥＤドライバー部はＡＣアダプターによって電源供給される。ＬＥＤドライバーは、ＲＳ２３２Ｃ通信でパソコンと接続した。ＵＶ−ＬＥＤの制御は、米国ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＬａｂｖｉｅｗを用いて作製した。また、ＰＣＲ装置とＵＶ−ＬＥＤを連動させて、ＵＶ照射、ＰＣＲチューブの温度制御、蛍光測定を行った。ＵＶ−ＬＥＤの冷却固定ブロックの温度をモニターし、たとえば、３０℃を超えた場合には、空冷ファンが回り冷却するように設計した。

＜蛍光検出手段＞
蛍光検出手段は、蛍光測定用励起光源として日亜化学の４７０ｎｍの青発光の駆動電流２０ｍＡのＬＥＤを使用した。また、蛍光取得ユニットとして、浜松ホトニクス製の光電子増倍管（型番Ｈ６７８０）を使用した。上記青色ＬＥＤは、４７０ｎｍ以外の可視光も若干放出するため、蛍光波長に被らないように励起光源のスペクトル幅を４７０ｎｍ±２０ｎｍや４７０ｎｍ±１０ｎｍに限定するバンドパスフィルターを必要に応じ設置した。蛍光については、３波長用に３組のフィルターを交換して使用した。

また、図１に示すように、ダイクロイックミラーおよび迷光吸収ユニットを使用した。これにより、励起光源から照射された波長４７０ｎｍの光が、ダイクロイックミラーで９０度曲げられて、チューブの底から照射される。それによって励起された蛍光分子から放射される蛍光は、フィルターを通して光電子増倍管で検出される。

＜ガラス基板＞
反射防止コーティングと、赤外反射コーティングとを施したガラス基板を使用した。屈折率１．５２のガラス基板の片面に、高周波スパッタ装置により、基板温度を２００℃として、ＩＴＯを５０ｎｍ程度形成した。これが、赤外反射コーティングとなる。また、ガラス基板の他方の面に、スパッタで屈折率１．４７のＳｉＯ_２の膜を６２ｎｍ程度形成した。これによって、通常４％以上の反射率が、１〜２％程度の反射率に抑えられる。これが、反射防止コーティングとなる。

＜ヒータープレート＞
チューブを固定および加熱するためのヒータープレートを作製し、設置した。アルミ製プレートのチューブを固定する面とは反対側に、坂口電熱製シリコンラバーヒーターを貼り付けた。またヒーター内に、ヒーターの温度制御用の熱電対を設置した。ヒーター温度調節は、熱電対の温度モニターでヒーターをＰＩＤ制御した。ヒータープレートは、温度調節手段にチューブをセットした後に、チューブの蓋を押し付けて固定した。

［解析の実行および評価］
上記の通り作製した遺伝子解析装置を使用して、ＰＣＲ法による核酸増幅、ＵＶ照射による光連結およびＦＲＥＴを利用した蛍光検出を行った。上述のとおり、３種のサンプル（ＷＴ、ＭＴおよびＮＣ）について、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のＳＮＰ解析を行った。ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のＳＮＰ解析は、既に正常遺伝子と変異遺伝子との識別検出系が確立されている。

上記の遺伝子解析装置を使用した方法（本発明方法）のほかに、核酸増幅、光連結および蛍光検出を個々の装置によって行う従来の解析方法（従来方法）を行い、さらに、核酸増幅および光連結を本発明の装置によって行い、蛍光検出のみ従来の測定装置で行う方法（混合方法）を行った。

＜従来方法＞
図６は、従来方法による測定結果である。蛍光測定の際に、ドナー分子が発する波長４８８ｎｍ近辺の光およびアクセプター分子が発する波長５９４ｎｍ近辺の光を、チューブの温度を上昇しながら随時測定した。縦軸を、アクセプター分子由来の５９４ｎｍ付近の蛍光強度をドナー分子由来の４８８ｎｍ付近の蛍光強度で割った比とし、横軸を温度として表した。したがって、アクセプター分子とドナー分子との間でＦＲＥＴが良好に生じる場合には、縦軸の蛍光強度比は高く検出される。

ＮＣのサンプルは、鋳型となるゲノムＤＮＡを添加していないため、ＰＣＲを行っても標的核酸が増幅されず、２種のプローブが標的核酸上で隣接した状態が生じない。そのため、アクセプター分子とドナー分子との間でＦＲＥＴが生じることはなく、それぞれ独立に蛍光を発する。結果として、図６のように、温度変化にかかわらず、一定の蛍光強度比を示す。

一方、ＷＴのサンプルは、正常なＣＹＰ２Ｃ９遺伝子を含むゲノムＤＮＡを添加したものであり、ＰＣＲによって正常配列を有した標的核酸が増幅される。増幅された標的核酸に対し、２種のプローブが隣接してハイブリダイズする。その後、ＵＶを照射し光連結を誘導するが、ここで、全ての隣接したプローブ間で光連結が生じるわけではなく、一部のみが光連結する。図６の結果の通り、低温域では、光連結の有無に関係なく、２種のプローブは標的核酸上で隣接した状態に維持されているため、ＦＲＥＴが良好に生じて蛍光強度比が高く検出される。しかし、高温域では、プローブと核酸とのハイブリダイゼーションが解かれ、光連結を生じなかったプローブ同士が分離する分、蛍光強度比は低下する。高温域で検出される蛍光強度比は、光連結が生じてアクセプター分子とドナー分子とが近接した状態が維持されたプローブに起因するものである。この実験で使用されるプローブのＴｍ値（ハイブリダイゼーションが解かれる温度）は、６５度付近であるが、その温度付近を境に蛍光強度比が低下していることから、本実験の信頼性が高いことがわかる。

ＭＴのサンプルは、ＳＮＰを含むＣＹＰ２Ｃ９遺伝子を含むゲノムＤＮＡを添加したものであり、ＰＣＲによって標的核酸は増幅されるものの、２種のプローブとのハイブリダイゼーションは、ＷＴほど効率良く生じない。その結果、ＵＶ照射を行っても光連結はほとんど生じない。図６の結果から、低温域では標的核酸とのハイブリダイゼーションに起因して蛍光強度比が高くなっているものの、高温域では、ハイブリダイゼーションが解かれると、プローブがばらばらとなり、蛍光強度比が低下することが理解できる。ＭＴは、最終的に、ＮＣの蛍光強度比と近い値となっている。

実際に未知の標的核酸についてＳＮＰ検出する場合、値の安定した高温域での蛍光強度比によって判定できるが、全温域における蛍光強度比のプロファイルからは、測定結果の信頼性を知ることが出来る。したがって、本発明による測定が信頼できるものかどうかを判断する場合、最終的な蛍光強度比の比較に加えて、プロファイルの比較が重要となる。

＜本発明方法＞
図７は、本発明方法による測定結果である。本発明による遺伝子測定装置を使用した場合、ＮＣのサンプルでは、温度にかわらずほぼ一定の蛍光強度比が得られるのに対し、ＷＴのサンプルおよびＭＴのサンプルでは、低温域では高いものの、６５度付近を境に高温域で低い蛍光強度比が得られた。さらに、ＷＴのサンプルに比べて、ＭＴのサンプルは、全温度域で低く、高温域ではＭＴはＮＣに近い蛍光強度比となった。すなわち、本発明の遺伝子解析装置を使用した方法によって、個々の装置を組み合わせて使用する従来方法と同様の結果が得られることがわかった。

＜混合方法＞
図８は、混合方法による測定結果である。すなわち、核酸の増幅および光連結誘導までは本発明の遺伝子解析装置によって行い、その後、サンプルを従来の蛍光検出装置に移して測定した結果である。測定結果から、この方法によっても、従来方法と同様の結果が得られることがわかった。このことから、核酸の増幅および光連結誘導について、本発明の装置によれば、個別の装置を使用する場合と、同程度の反応効率を達成できることがわかった。

さらに、図９は、図６〜図８に示されるプロファイルから９０℃における蛍光強度比を抽出し、棒グラフとして示したものである。この結果から、各方法の間で、蛍光強度比の値に多少の違いはあるものの、ＮＣ：ＷＴ：ＭＴの蛍光強度比の値の比は同等であることがわかる。

以上より、本発明の遺伝子解析装置を使用すれば、従来の個別の装置を使用して行う遺伝子解析と同様に、信頼性の高い結果が得られることがわかった。また、本発明の装置を使用することで、サンプルチューブの装置間の移動といった煩雑な作業を行う必要がなく、最終的に解析結果が得られるまでの時間も短縮された。

１…反応容器、１ａ…蓋、１ｂ…チューブ本体、１ｃ…透過窓、１１…光照射位置、２…温度調節手段、２１…温度調節ブロック、２２…温度調節用ヒートシンク、３…光連結誘導手段、３１…光連結用光源、３２…光連結用フィルター、３３…冷却固定ブロック、３４…光連結用ヒートシンク、３５…空冷ファン、４…蛍光測定手段、４１…蛍光測定用励起光源、４２…蛍光取得ユニット、４３…励起用フィルター、４４…蛍光測定用フィルター、４５…ダイクロイックミラー、４６…迷光吸収ユニット、４７…集光用レンズ、５…ガラス基板、５１…反射防止コーティング、５２…赤外反射コーティング、６…ヒータープレート

Claims

核酸の増幅および光連結反応が行われるサンプルが収容される反応容器と、
前記反応容器内のサンプルの温度を調節する温度調節手段と、
前記反応容器内のサンプルに光連結反応を促進する光を照射する光連結用光源を備えた光連結誘導手段と、
前記反応容器内のサンプルにおける光連結反応の有無を測定するための蛍光測定用励起光源および蛍光取得ユニットを備えた蛍光測定手段と
を備え、
前記光連結誘導手段と前記蛍光測定手段とが、前記反応容器を挟んで対向して位置し、
前記光連結誘導手段と前記反応容器との間に、前記光連結誘導手段側に紫外光に対する反射防止コーティングが施され、前記反応容器側に赤外光を反射する赤外反射コーティングが施されたガラス基板を有する
遺伝子解析装置。
前記蛍光測定手段が、前記蛍光測定用励起光源からの光の波長帯域を制限するフィルターと、前記反応容器内のサンプルから放出される蛍光の波長帯域を制限するフィルターとを備え、
前記反応容器が蓋を有したチューブであり、前記蓋は平らな形状であり且つ紫外光から可視光の間の光を透過し、
前記光連結誘導手段と前記反応容器との間に、前記チューブの蓋に押し付けて固定されるヒータープレートを備え、前記ヒータープレートは前記光連結誘導手段からの光を前記反応容器まで通過させる孔を有し、
前記温度調節手段は、複数の前記反応容器をそれぞれ収容できる複数の孔を有した温度調節ブロックと、前記温度調節ブロックの側面に備えられた温度調節用ヒートシンクとを備え、
前記光連結誘導手段は、前記光連結用光源を固定し且つ冷却する冷却固定ブロックと、前記冷却固定ブロックに取り付けられた光連結用ヒートシンクとをさらに備えた
請求項１に記載の装置。
前記光連結用光源が、３６５ｎｍを中心波長とする光を照射し、３６５ｎｍ±１０ｎｍのバンド幅の透過用フィルターを備える請求項１に記載の装置。
前記温度調節手段が、前記反応容器内のサンプルの温度を、核酸の増幅および光連結反応の進行に適した温度に調節する請求項１に記載の装置。
前記蛍光測定用励起光源が発光ダイオードであり、前記蛍光取得ユニットがアバランシェ・フォトダイオード、光電子増倍管またはフォトダイオードである請求項１に記載の装置。
前記光連結用光源と前記反応容器との間に挿入可能な、表面に凹凸が形成された無反射板を備える請求項１に記載の装置。
前記ガラス基板における前記赤外反射コーティングは、１００ｎｍ以下の厚さの酸化インジウムスズ膜から成る請求項１に記載の装置。
前記光連結誘導手段は、前記光連結用ヒートシンクに対して送風する空冷ファンをさらに備えた請求項２に記載の装置。