KR102312555B1

KR102312555B1 - 광 공동 pcr

Info

Publication number: KR102312555B1
Application number: KR1020187005611A
Authority: KR
Inventors: 루크 피. 이; 준 호 손
Original assignee: 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2015-07-30
Filing date: 2016-07-27
Publication date: 2021-10-14
Also published as: EP3328535A4; CN107921399B; WO2017019768A1; JP2018521665A; KR20180034579A; JP6964579B2; EP3328535A1; US20210008562A1; US20180236451A1; US10766034B2; US11406983B2; CN107921399A

Abstract

LED 구동 광 공동 PCR 시스템 및 방법은 신속하고, 정확하며, 신뢰성 있는 PCR 기반의 진단에 대하여 개시한다. 두 개의 광 흡수 금속(Au) 박막을 포함하는 광 공동은 광을 균일하게 흡수하기 위해 사용되며, 이후 광열 광-열(plasmonic photo thermal light-to-heat) 전환이 PCR 열 사이클링을 위해 사용된다.

Description

광 공동 PCR

본 발명은 핵산 증폭 시스템에 관한 것이며, 구체적으로는 의료 진단 및 생명 과학용 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 열 사이클 시스템에 관한 것이다.

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 각각 참고에 의해 여기에 완전히 통합되는, 2015년 5월 28일에 출원한, 미국 출원 번호 14/724,356의 우선권을 요구한다.

연방 정부로 후원 받은 연구 또는 개발에 관한 선언서

해당 사항 없음

컴퓨터 프로그램 부록의 통합 참조

해당 사항 없음

저작권 보호 대상 자료의 고지

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에볼라 바이러스 질병 (Ebola virus disease; EVD), 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 (Middle East Respiratory Syndrome corona virus; MERS-CoV) 및 조류 독감 A (H7N9) 바이러스로 인한 인체 감염과 같은 치명적인 질병의 세계적 발생으로 인해 신속하고 정확한 진단이 절실히 필요하게 되었다. 많은 의학 진단 테스트를 위한 "금 표준(Gold standard)"인 중합 효소 연쇄 반응(PCR)은 임상 검사실, 환경 과학, 과학 수사 및 농업 과학의 중요한 기술이 되었다. 일반적으로 2 또는 3개의 불연속 온도 사이에서 다중 사이클이 필요한 PCR은 펠티에 기반 가열 블록의 높은 열 질량 및 가열 블록과 플라스틱 PCR 튜브 사이의 느린 열 때문에 증폭 당 한 시간 이상이 걸린다. 그러나, 고속/초고속 PCR은 빠른 치료 소요 시간 (fast therapeutic turnaroundtime, TAT)이 사망률 뿐만 아니라 다른 사람들이 알지 못하는 질병을 전염시키는 심각한 위험성을 감소시키기 때문에, 감염성 질환(infectious diseases), 메티실린 내성 황색 포도 구균 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 및 현장 진단 (point of care; POC) 수준에서 패혈증과 같이 시간에 민감한 진단과 같은 응용 분야에서 매우 바람직하다.

공기 가열/냉각 및 모세관 또는 직접 저항 가열을 사용하는 상업용 PCR 시스템은 10분 이내에 30회의 열 사이클을 수행할 수 있다. 그러나 이러한 상업용 PCR 시스템은 일반적으로 높은 전력 소비(최대 800-1000W) 및 높은 중량(20kg 이상)으로 인해 POC 테스트에 적합하지 않다. 개발도상국이나 현장 실험실과 같은 자원이 제한된 환경에서의 POC 테스트의 경우, 고속/초고속 PCR 시스템은 민감하고, 선택적이고, 휴대 가능하고, 견고하며, 사용하기 쉬워야 하며 소형화 및 통합을 통한 저전력 소비를 특징으로 해야 한다.

이러한 요구 조건을 달성하기 위해, 고속/초고속 PCR 시스템을 위한 마이크로 유체 접근법은 샘플 용량(즉, 열 질량)을 감소시킴으로써 증폭 시간을 줄이기 위해 광범위하게 연구되어 빠른 열 전달을 가능하게 하여 전력 소비를 줄이면서 열 사이클을 빠르게 한다.

정적 마이크로 유체 PCR 열 사이클링에 가장 일반적으로 사용되는 방법은 미세 가공된 박막 히터 및 저항 온도 검출기 (resistance temperature detector, RTD)를 통한 저항 가열이다. 전력 소비가 상대적으로 낮지만 이 방법은 박막 히터와 RTD를 칩에 통합하기 위해 복잡한 제조 공정을 필요로 한다.

펠티에 가열 블록은 빠른 가열 및 냉각 속도 때문에 정적 및 연속 흐름 PCR에도 널리 사용되지만 더 높은 전력 소비가 요구된다. 이 방법은 정적 PCR보다 빠른 열 사이클링을 생성할 수 있지만 일반적으로 흐름 제어를 위해 외부 주사기 펌프를 필요로 하며, 사이클 횟수를 변경할 수 있는 기능이 부족하다. 다른 접근법은 1000 nm 이상의 파장에서 물에 의한 강한 IR 흡광도를 이용하는 IR 레이저 또는 필라멘트 램프를 사용하는 PCR 열 사이클링용 PCR 혼합물의 적외선 (IR) 간접 비접촉 선택적 가열을 포함한다. 그러나 PCR 혼합물의 부피가 나노 리터에서 마이크로 리터로 증가함에 따라, PCR 용액의 빠른 가열과 냉각의 제한 때문에 총 열 사이클링 시간도 ~5 분에서 ~40 분으로 증가한다.

따라서, 본 발명의 목적은 민감하고, 선택적이고, 휴대 가능하고, 강건하며, 간단하고, 사용하기 쉬우며, 소형화 및 집적화를 통해 저전력 소모를 특징으로 하는 POC 테스트를 위한 고속/초고속 PCR 시스템에 있다.

본 발명의 일 양태는 빠르고 정확하며 신뢰성 있는 PCR 기반의 진단을 위한 발광 다이오드(LED)에 의해 구동되는 광 공동 PCR 및 방법에 있다. 균일한 광 흡수 후 광열 전환을 위해 구성된 두 개의 금속(예를 들어, Au(금)) 박막을 포함하는 광 공동은 PCR 열 사이클링을 위해 사용된다. 시뮬레이션 결과는 750 pm 두께의 공동에서 온도 차이가 94 ℃(변성) 및 68 ℃(어닐링/연장)에서 각각 2 ℃ 및 0.2 ℃ 미만임을 나타낸다. 본 발명에 따른 광 공동 PCR은 사이클 사이에서 1 ℃ 미만의 온도 변화에 따른 우수한 온도 정밀성을 나타내며, Au 박막의 낮은 열 질량 및 높은 열 전도도 때문에 4 분 이내에 94~68℃에서 30번의 PCR 열 사이클을 달성할 수 있다. 본 발명의 LED 구동 광 공동 PCR 공정을 사용하여, 핵산(c-MET cDNA) 증폭은 15분 내에 10-88 ng μL-1의 매우 낮은 템플릿 DNA 농도로 증명되었다.

기술의 추가 양태는 본 명세서의 다음 부분에서 제시될 것이며, 상세한 설명은 제한을 두지 않고 기술의 바람직한 실시예를 완전히 개시하는 것을 목적으로 한다.

여기에 설명된 기술은 단지 설명을 목적으로 하는 다음의 도면을 참조하여 더욱 완전하게 이해될 것이다:
도 1a는 명확성을 위해 부분적으로 제거된 상부 공동층 및 중간 공동층을 가지는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 통한 핵산 증폭용 광 공동의 사시도이다.
도 1b는 도 1a의 광 공동에서 광 흡수의 개략 측면도이다.
도 1c는 도 1a의 공동에 대한 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 통하여 대응하는 핵산 증폭의 개략도이다.
도 2a는 LED 광원을 가지는 도 1의 광 공동 PCR 장치의 개략 사시도이다.
도 2b는 도 2a의 LED 구동 광 공동 PCR 장치의 개략 측면도이다.
도 3은 도 1a의 광 공동 레이어링의 확대 측면도이다.
도 4a~4d는 바닥에서만 만 및 공동 (상부 및 바닥) 가열을 위해 750 pm 두께의 광학 PCR 챔버 내부에서 계산된 온도 분포의 이미지를 도시한다.
도 5는 도 4a~4d에서 하얀 화살표를 따라 PCR 챔버의 온도 프로파일의 플롯을 도시한다.
도 6은 PCR 챔버 높이의 함수로서 본 발명의 광학 PCR 챔버의 z-축(x-축 상의 0 pm)을 따르는 온도 차이의 그래프를 도시한다.
도 7은 챔버 높이가 상이한 LED 구동 광 공동을 사용하여 94~68℃에서의 30회의 PCR 열 사이클에 대한 대표적인 온도 프로파일을 도시한다.
도 8a는 다양한 챔버 높이를 가지는 본 발명의 광 공동 PCR 장치에 대한 30회의 열 사이클의 전체 반응 시간을 도시한다.
도 8b는 30회의 PCR 사이클 동안의 평균 속도 및 상이한 챔버 높이에 대한 샘플 표준 편차를 도시한다.
도 8c는 상이한 챔버 높이에 대한 30회의 열 사이클 동안의 94(변성)~68(어닐링/연장)℃에서 측정된 온도 분포를 도시한다.
도 8d는 두 위치 사이의 열 순환 동안의 온도 프로파일의 비교를 도시한다.
도 9a는 95~68℃에서 상이한 사이클 회수를 가지는 (750 pm 두께의 PCR 챔버를 가지는) 본 발명의 광 공동 PCR 장치와 비교된 벤치 탑 열 순환기(bench-top thermal cycler)로부터의 2 %의 아가로스 겔 이미지를 도시한다.
도 9b는 템플릿 DNA의 상이한 초기 농도를 가지는 본 발명의 PCR 장치로부터의 2%의 아가로스 겔 이미지를 도시한다.
도 10은 본 발명의 광 공동 PCR 장치와 비교된 벤치 탑 열 순환기에 대한 전체 반응 시간을 요약한 그래프를 도시한다.

이하에 자세히 설명된 실시예는 PCR 혼합물 또는 유사 물질 (광 공동 PCR)을 가열하기 위한 광 공동에 관한 것이다. 일반적인 PCR 감지 방법에 있어서, PCR 혼합물은 일반적으로 PCR 반응에 영향을 주는 복수의 가열 및 냉각 사이클을 거친다. 따라서, 타겟 샘플(예를 들어 PCR 혼합물)의 빠르고 균일한 가열은 POC 테스트에 매우 유익하다. 이하에서 설명되는 실시예는 PCR 기반 감지에 관한 것이지만, 샘플의 빠르고 균일한 가열이 필요한 임의의 프로세스와 함께 사용하기 위해 본 명세서의 광 공동을 통합할 수 있다.

1. 광 공동 PCR의 구성

도 1a은 명확성을 위해 부분적으로 제거된 상부 공동층 및 중간 공동층을 가지는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 통한 핵산 증폭을 위하여 광 공동(20)을 포함하는 PCR 감지 장치(10)의 실시예의 사시도를 도시한다. 도 1b는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 통한 광 흡수 및 대응하는 핵산 증폭을 도시하는, 광 공동(20)의 개략 사시도이다.

일 실시예에서, 광 공동(20)은 PCR 기반 테스트를 위한 PCR 혼합물을 보유하는 특정 예시에 사용될 때 이하에서 "PCR 챔버"라 칭하는, 마이크로 유체 열 사이클 챔버(24)의 벽을 정의하기 위해 간격을 두고 떨어져 있는 두 개의 대향 박막 시트 또는 레이어(하부 박막(22a) 및 상부 박막(22b))를 포함한다. 박막(22a, 22b)은 바람직하게 광 흡수 물질을 포함하거나 또는 박막의 신속하고 균일한 가열을 제공하는 방식으로 광을 흡수하도록 구성된다. 하부 박막(22a) 및 상부 박막(22b)은 각각 하부 기판층(18) 및 상부 기판층(14) 상에 증착된다. 광 공동(20)은 예를 들어 단일 열 사이클 챔버(24) 또는 다중 증폭용 챔버의 어레이를 포함할 수 있다.

바람직한 실시예에 있어서, 하나 이상의 박막(22a, 22b)은 금(Au)을 포함한다. 하지만, 다른 물질 또는 다른 조성물은 대안으로 사용될 수 있으며, 예를 들어 은(Ag), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 크롬(Cr), 게르마늄(Ge), 팔라듐(Pd), 루테늄(Ru), 텅스텐(W), 이리듐(Ir), 백금(Pt)과 같은 금속 및 상기 금속들로 이루어진 합금 또는 상기 금속들로 이루어진 다층 금속 구조 또는 이들의 조합물일 수 있다.

또한, 박막 시트(22a, 22b)는 그래핀(graphene), 그래파이트(graphite), 탄소나노튜브(carbon nanotubes; CNTs), 페인트 등을 포함하는 비금속의 광 흡수 물질을 포함할 수 있다.

다른 실시예에 있어서, 하나 이상의 하부 박막(22a) 및 상부 박막(22b)은 공명에 의한 광 흡수를 증가시키기 위해 패턴화될(patterned) 수 있다. 패턴화된 박막은 편평한 폴리머 기판(14, 18) 상에 형성될 수 있으며, 하나 이상의 필러 어레이, 1 D 또는 2 D 격자, 광 결정(photonic crystal), 반구체(hemisphere) 등의 형상으로 2-D 또는 3-D 마이크로 구조 또는 나노 구조를 포함한다.

중간 공동층(16)은 광 공동(20)의 두께를 결정하기 위해 하부 기판층(18) 및 상부 기판층(14) 사이에 배치된다. 바람직한 실시예에서, 하부 기판층(18) 및 하부 기판층(14)은 아크릴 유리, 예를 들어 폴리 메틸 메타크릴레이트(PMMA) 또는 광의 투과를 허용하는 유사 물질과 같은 투명한 폴리머를 각각 포함한다.

바람직한 실시예에 따르면, 하부 기판층(18) 및 상부 기판층(14)은 광이 광 공동(20)을 통과할 수 있도록 투명 또는 반투명 조성물을 포함하는 것이 바람직하다. 하부 기판층(18) 및 상부 기판층(14)은 일반적으로 PMMA를 포함하는 것으로 명세서 전반에 걸쳐 상세히 설명되어 있지만, 이러한 재료의 선택은 단지 예시적인 것이며, 임의의 개수의 폴리머 또는 반투명/투명 물질이 박막용 플랫폼으로서 사용을 위해 선택될 수 있다. 하부 기판층(18) 및 상부 기판층(14)은 또한 필러 어레이, 1 D 또는 2 D 격자, 광 결정, 반구체 또는 다른 패턴화된 또는 랜덤 구조(미도시) 중 하나 이상을 포함할 수 있는, 2 D 또는 3 D 마이크로 구조 또는 나노 구조를 포함할 수 있다. 일 실시예에 다르면, 하부 기판층(18) 및 상부 기판층(14)은 나노 플라즈몬 구조 또는 나노 플라즈몬 구조의 공명 파장 및 플라즈몬 광열 광-열(plasmonic photo thermal light-to-heat) 가열을 야기하는 지속 기간에서 조사되도록 구성된 벽 표면 상의 나노 플라즈몬 피드백 레이저 공동을 포함한다.

도 1a에 도시한 바와 같이, 한 쌍의 포트 25a, 25b는 상부 기판층(14) 및 중간 공동층을 통하여 광학 챔버(20)와 연통하고 있다. 포트(25a, 25b)는 시료 또는 샘플(예를 들어, PCR 혼합물)을 분배시킨다. 일 실시예에 따르면, PCR 혼합물은 제1 포트(25)에 주입되어서, PCR 혼합물은 PCR 챔버(24)를 가득 채운다. 제2 포트(25b)는 PCR 혼합물이 전체 챔버를 밀봉하고 제2 포트(25) 밖으로 배출될 때까지 공기를 챔버 밖으로 밀어 내도록 한다. 하나 이상의 유체 밸브(미도시) 및/또는 유체 제어 장치(미도시)는 PCR 챔버(24)를 채우는 것을 수월하게 하기 위해 사용될 수 있다.

도 1b는 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 통한 핵산 증폭을 위하여 광 공동(20)에서의 개략적인 광 흡수를 도시한다. 초기 강도 I₀로 하부 기판층(18)(예를 들어, PMMA)를 통해 광이 조사될 때, 광은 하부 박막(22a)을 통해 반사되고(R₁), 흡수되며(A₁) 투과된다(T₁). 그 후, 투과된 광(T₁)은 챔버(24)를 통과하며, 상부 박막(22b)을 통해 반사되고(R₂), 흡수되며(A₂) 투과된다(T₂). 박막(22a, 22b)은 PCT 열 사이클을 위한 플라즈몬 광열 광-열 컨버터(plasmonic photo thermal light-to-heat converter)로 작용한다. 흡수된 광(A₁, A₂)는 PCR의 열 사이클을 위한 박막(예를 들어, 금(Au)) 원자의 광열 가열에 기여한다.

도 1c는 박막을 가열할 시 발생하는 변성, 어닐링/연장, 및 복제(증폭) 단계의 PCR 공정의 일 실시예를 도시한다.

제1 단계(1)에서, 공정은 박막(22a, 22b)으로 균일한 광 흡수량에 영향을 주며 박막(22a, 22b)의 가열을 수반하는 특정 기간 동안, 박막(22a, 22b)을 광으로 조사하는 단계를 포함하여, PCR 혼합물 내에서 변성에 영향을 주는 제1 기간 동안 선택된 온도로 챔버(24) 내에 유체 샘플(예를 들어, PCR 혼합물)의 온도를 상승시킨다.

제2 단계(2)에서, 박막(22a, 22b)은 특정 기간 동안 입사광(input light)으로 다시 조사되어서, PCR 혼합물 내에서 어닐링/연장에 영향을 주는 제2 기간 동안 선택된 온도로 챔버(24) 내 유체 샘플(예를 들어, PCR 혼합물)의 온도를 상승시킨다.

제3 단계(3)에서, 박막(22a, 22b)은 특정 기간 동안 입사광으로 다시 조사되어서, PCR 혼합물 내에서 복제/증폭에 영향을 주는 제3 기간 동안 선택된 온도로 챔버(24) 내 유체 샘플(예를 들어, PCR 혼합물)의 온도를 상승시킨다.

일 실시예에서, 3개의 단계는 약 30~40 사이클 동안 반복된다.

이러한 모델에 기반하여, Au 박막 1 및 2의 전체 흡수율은 방정식 1 및 2에 주어진다:

상기 방정식 2에서 I₀는 LED로부터 광의 초기 강도이며, A₁(및 A₂), T₁(및 T₂) 및 R₁(및 R₂)는 각각 박막(22a)(및 22b)의 흡수율, 투과율 및 반사율이다.

Au 박막의 두께는 최대 균일 온도 분포뿐만 아니라 우수한 전체 광 흡수율(∑A_fiimi +∑A_fii_m2)을 위하여 두 개의 박막(∑A_filml =∑A_film2)에서 균일한 광 흡수율을 갖도록 최적화된다. 첫째로, LED의 방출 파장을 통한 Au 박막(22a, 22v)의 평균 투과율, 반사율 및 흡수율은 상이한 두께를 가지는 Au 박막의 측정된 흡수 스펙트럼 및 LED의 방출 스펙트럼으로부터 측정된다(표 2 참조). 그 후, 흡수율(∑A_filml/∑A_film2) 및 전체 흡수율(∑A_filml + ∑A_fli_m2)을 표 1에 도시된 바와 같이 상부 및 하부 금(Au) 두께의 상이한 조합에 대하여 측정된다. Au 박막(22a)에 대한 두께 10 nm 및 Au 박막(22b)에 대한 120 nm 두께의 조합은 흡수율(1.06) 및 광의 전체 흡수율(70 %) 모두에 대해 최적인 것으로 밝혀졌으며, 이는 바람직한 형상으로 광 공동(20)을 위한 Au 박막의 두께로 사용될 수 있다.

박막 (22a, 22b)의 흡수율를 조정하기 위해 대체재가 사용될 수도 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 하부 박막(22a)은 상부 박막(22b)보다 흡수성이 적은(투과 특성이 더 큰) 물질로 구성 될 수 있다. 따라서, 지오메트리(geometry) 및/또는 재료 조성물을 이용하여 박막(22a, 22b)의 흡수 특성을 조정할 수 있다.

도 2a는 조명(illumination) 또는 광원을 가지는 광 공동 PCR 장치(10)의 개략적인 사시도를 도시한다. 광원은 입사광 I₀을 광 공동(20) 쪽으로 향하게 하기 위한 렌즈(30)와 함께, 플랫폼(32)(예를 들어, 40 mm 원형 냉각 베이스) 상에 배치된 일련의 LED(34)(예를 들어, 7 Luxeon Rebel Royal Blue, 447.5 nm의 피크 파장을 가지는 LED, 700 mA 주입 전류에서 6230 mW)로서 도시되었다. 대안적 광원은 레이저 다이오드(LD), 텅스텐 램프, 형광 램프, 할로겐 램프, 수은 램프, 크세논 램프, 금속 할로겐화물 램프, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 광원의 유형, 및/또는 입사광 I₀의 파장 또는 강도의 선택은 박막(22a, 22b)의 공명 주파수에 영향을 줄 수 있으며, 따라서 박막(22a 및 22b)은 입사광 I₀의 성질에 따라 변할 수 있다.

타입 K 열전대(type-K thermocouple, 28)을 갖는 기준 챔버(26)가 광 공동(20)의 옆에 배치된다. 기준 챔버 (26) 및 광 공동(20)은 광 공동(20)과 기준 챔버(26)가 동일한 강도를 수용하도록 렌즈(30)의 초점 길이에서 입사광 빔(10)의 중앙부(예를 들어, ø = 12mm)에 의해 보호되도록 구성되어서, 광 열 가열이 동일한 비율로 발생할 것이다. 광 공동(20) 및 기준 챔버(26) 모두는 가장 높은 광 흡수를 위해 렌즈(30)의 초점 길이(예를 들어,이 구성에서 렌즈의 상부 표면으로부터 25mm 떨어진 위치)에 배치된다. 일 실시예에서, 렌즈(30)는 폴리머 옵틱스(Polymer Optics, 7) 셀 클러스터 컨센트레이터 광학 어레이(Cell Cluster Concentrator Optic array)를 포함한다.

기준 챔버(26)는 챔버 내 온도에 대한 기준을 제공하기 위하여 도 2a의 구성에서 사용되는 것을 이해해야 한다. 그러나, POC 테스트에 대한 바람직한 구성에 있어서, 본 발명의 장치는 기준 챔버(26)를 제외한, 광 공동(20), 또는 복수의 다중 광 공동 또는 다중 광 공동의 어레이를 포함 할 수 있다. 이러한 경우에, 챔버 (24) 온도에 관한 피드백은 온도 센서(미도시) 또는 다른 감지 수단을 통해 얻어 질 수 있다.

도 3은 광 공동 및 기판층의 레이어링의 상세도이다. 일 실시예에서, 각각의 박막(22a 및 22b)은 금속층 또는 광 흡수 물질에 의한 PCR 반응 저하를 방지하기 위하여 보호막(passivation layer, 23)으로 보호된다. 보호층(23)은 산화물 박막(oxide thin film), 폴리머 박막(thin polymer layer), 단백질 박막(thin protein layer) 등을 포함할 수 있다. 중간 공동층(16)은 높이 h를 가지며, 상부 및 하부 PMMA층(14, 18)은 높이 h_s를 가진다. 본 발명의 장치를 테스트 하기 위해 사용된 일 실시예에서, (4 mm의 전체 공동 길이에 대하여) h_s = 1.4mm, L₁ = 6mm, L₂=4mm 이며, 공동 두께 h는 100 pm, 200 pm, 400 pm, 및 750pm로 다양하다. 상기 치수가 하나의 가능성있는 실시예를 설명하고 있지만, 다른 구성도 고려될 수 있다.

이하에서 더 자세히 설명되어있는 테스트에서는 고속 모드, 자동 제로 및 냉 접점 보상(cold junctioncompensation)(미도시)을 갖춘 국가 기구 (National Instruments; Nl) 9213 16-채널 열전대 모듈을 사용하여 타입-K 열전대(28)의 정확한 온도를 획득하였다. 온도 사이클링은 LabVIEW 프로그램을 통하여 모두 제어된LED(34), 80mm의 냉각 팬(미도시), 소스 미터(source meter)(미도시) 및 열전대(28)를 사용하여 수행되었다.

하나의 예시적인 구성에서, 1mm 두께의 폴리(메틸 메타 크릴 레이트)(poly(methyl methacrylate); PMMA) 시트는 광 공동(20)의 상부 및 하부 기판층(14, 18)에 사용되었을뿐만 아니라 중간 공동층(16)을 위한 100, 200, 400 및 750㎛ 두께의 PMMA 시트는 VersaLASER VL-200 레이저 절단 시스템(Universal Laser System, Inc., Scottsdale, AZ, USA)으로 절단되었다. 상부 기판층(14)은 레이저 절단에 의해 손상된 영역의 어닐링을 허용하기 위해 56℃의 오븐에서 6시간 동안 배양된다. 하부 기판층(18) 및 중간 공동층(16)은 10분 동안 PMMA 시트의 UV/오존 처리 후 0.2 미터 톤(metric ton)의 압력으로 140 ℉에서 열 접착을 사용하여 처음 서로 접합되었다. 그 다음, (공동 챔버층과 결합된)하부 및 상부층은 10분 동안 70 % 에탄올로 두 번 세척되고, 탈 이온(D1)수로 헹궈지고 N₂를 사용하여 건조된다.

상이한 두께(10, 20, 40, 80 및 120 nm)를 갖는 Au 박막(22a, 22b)은 2 x 10^-7 토르의 기압 하에서 전자 빔(E- 빔) 증착에 의해 하부 및 상부 PMMA 시트 상에 증착된다. 50nm 두께의 SiO₂ 보호층은 Au 박막에 의하여 PCR 반응이 억제되는 것을 방지하기 위해 RF 스퍼터링(RF sputtering)에 의해 Au 박막 (22a, 22b) 위에 증착되었다.

마지막으로, (공동 챔버 층과 결합된)하부 및 상부층은 10분 동안 PMMA 시트의 UV/오존 처리 후에 0.2 미터 톤의 압력으로 140 ℉에서 수행 된 열 결합을 사용하여 PCR 챔버(24)에 광 공동(20)을 형성하기 위해 함께 결합되었다.

일 실시예에서, 광 공동(20)은 실시간 광 공동 PCR을 위한 PCR 반응 동안 형광 방출의 레이징(lasing)을 위해 구성될 수 있다. 이러한 구성은 종래의 실시간 PCR과 비교하여 실시간 공동 PCR의 감도를 더욱 증가시킬 수 있다.

2. 실험 결과

a. 광 공동 PCR의 온도 균일성을 위한 시뮬레이션

COMSOL을 이용한 열전달 시뮬레이션 세트가 PCR 열 사이클 동안 광 공동(20) 내부의 온도 균일성을 특성화하기 위해 수행되었다. 도 4a~도 4d는 하부만 가열 및 공동(상부 및 바닥) 가열을 위하여 750 pm 두께의 PCR 챔버 내부에서 측정된 온도 분포를 도시한다.

도 4a 및도 4c는 바닥만 가열할 때 측정된 온도 분포를 도시하고, 도 4b 및 도 4d는 챔버 중심(x 축에서 0 pm 및 z 축에서 375pm)의 온도가 각각 변성을 위해 94℃에 도달하고 어닐링/연장을 위해 68℃에 도달할 때, PCR 챔버(24)에서 상부 및 하부(공동)을 가열하여 측정된 온도 분포를 도시한다.

도 4a~도 4d는 본 명세서의 장치의 광 공동(상부 및 하부) 가열이 특히 94 ℃에서 하부 만을 가열할 때 보다 균일한 온도 분포를 제공한다는 명확한 설명을 제시하였다. 챔버의 높이에 따른(백색 화살표에 따른) 온도 구배가 도 5에 표시되었다. 각각 94℃ 및 68℃에서 하부만을 가열할 경우 14.4℃ 및 0.4℃의 온도 차이가 나타난 것과 비교하여, 본 발명에 따른 공동 가열은 오직 1.9℃ 및 0.2℃의 온도 차이로 더 우수한 온도 균일성을 나타낸다.

도 6을 참조하면, 온도 균일성에 대한 PCR 챔버 높이의 영향 또한 조사되었다. PCR 챔버의 높이가 낮아짐에 따라, 챔버의 높이를 가로 지르는 온도 차이(ΔT = T_max - T_min)는 열 전달이 더 얇은 PCR 챔버에서 부피가 더 적어야 더 효과적일 수 있기 때문에 바닥만 가열하는 구성 및 공동을 가열하는 구성 모두에서 감소한다.

또한, 본 발명의 장치의 공동 가열은 변성 및 어닐링/연장 온도 모두에서 모든 챔버 높이에 대해 훨씬 더 작은 온도 차이를 나타낸다는 것에 대해 주목할 만하다. 따라서, 본 발명에 따라 공동 가열을 사용하면 효율적이고 신뢰성있는 핵산 증폭을 위한 PCR 혼합물의 균일한 가열이 가능해진다.

b. LED-구동 광 공동 PCR 열 사이클러

도 7은 상이한 챔버 높이에 대하여 LED-구동 광 공동을 사용하여 94~68℃에서 30번의 PCR 열 사이클의 대표적인 온도 프로파일을 도시한다. 캐비티 높이 h가 감소함에 따라, 30번의 PCR 사이클의 총 시간은 공동 높이 h가 감소함에 따라 감소되어서, 100 pm 두께의 광 공동(20), PCR 챔버(24)에서 최소 시간(평균 235.5초)을 달성하고, 도8a에 도시된 바와 같이 0.9899의 조정된 R2 값을 갖는 양호한 선형성을 나타낸다.

열 순환 결과를 사용하여, 가열 및 냉각 속도를 측정하였다. 30번의 PCR 사이클 동안의 평균 속도 및 표본 표준 편차가 도 1에 도시된 바와 같이 얻어졌다. 7.50 ± 0.46 ℃ sec^-1 및 6.35 ± 0.49 ℃ sec^-1의 가장 빠른 가열 및 냉각 속도가 100 pm 두께의 PCR 챔버(24)로부터 얻어졌다.

도 8c는 상이한 챔버 높이에 대하여 30번의 열 사이클 동안 94℃(변성) 및 68℃(어닐링/연장)에서 측정된 온도 분포를 도시한다. 각각의 PCR 사이클 동안 달성된 최대 온도 및 최소 온도는 94℃에서 1℃ 미만 및 68℃에서 0.5℃ 미만으로, 상적으로 이용가능한 벤치 탑 열 사이클러와 비교가능한 온도 정확성을 나타낸다. 특히, 50 nm 두께의 SiO₂ 층을 통한 Au 박막과 PCR 혼합물 간의 빠른 열 전달 뿐만 아니라 더 적은 열 질량 때문에, 공동 PCR의 오버 슈트(overshoot) 및 언더 슈트(undershoot)(94℃에서 0.85℃, 68℃에서 0.25℃)는 벤치-탑 열 사이클러가 빠른 열 사이클링을 위해 설계되지 않았기 때문에 고속 사이클링이 수행될 때 벤치 탑 열 사이클러(94℃에서 ~2℃, 68℃에서 ~4℃)와 비교하여 매우 낮다.

위치 1(기준 챔버(26)) 및 위치 2(광 공동 PCR 챔버(24))의 두 챔버가 동일한 속도로 가열되도록 하기 위해, 타입-K 열전대(28)를 갖는 기준 챔버(26)가 두 위치에 배치되며, 열 사이클링이 수행된다. 도 8d는 위치 1과 위치 2 사이의 열 순환 동안의 온도 프로파일의 비교를 도시하여, 두 위치 모두가 Au 박막의 광열 가열을 위하여 LED로부터 동일한 강도의 광을 수신하는 것을 분명히 알 수 있다.

c. 광 공동 PCR을 사용한 핵산 증폭

본 발명의 LED 구동 광 공동 PCR 시스템 및 방법을 검증하기 위해, 핵산(c-MET cDNA, 폐암 바이오 마커)의 증폭이 입증되었다.

사람의 HGFR 또는 c-MET cDNA는 PCR의 템플릿으로 사용되었다. 권장 농도를 가지는 일반적인 벤치 탑 PCR의 경우, PCR 반응은 0.08μL KAPA2G DNA 중합 효소, 4μL 5x KAPA2G 완충액 A, 0.4μL dNTP 혼합물, 각각 1μL의 순방향 및 역방향 c-MET 프라이머(원액 10μM), 6.7μL BSA(10μg μL^-1 BSA의 최종 농도에 대하여 3 % w/v 원액) 및 2μL 템플릿 cDNA로 이루어진다. 물은 최종 부피를 20 μL로 만들기 위해 첨가된다. 고속 사이클링 공동 PCR에서 증폭 효율을 증가시키기 위하여, 고농도의 중합 효소 및 프라이머가 사용되었다. 공동 PCR에 대한 PCR 반응은 0.4μL KAPA2G DNA 중합 효소, 2μL 5x KAPA2G 완충액 A, 0.2 μL dNTP 혼합물, 각각 1μL의 순방향 및 역방향 c-MET 프라이머(원액 100μM), 3.3 μL의 BSA(10μg μL^-1 BSA의 최종 농도에 대하여 3 % w/v 원액) 및 1 μL 템플릿 DNA로 이루어진다. 다시, 반응이 최종 부피 10 μL에 도달할 때까지 물을 첨가 하였다. c-MET cDNA의 농도는 다양하였고, 10-8 ng μL^-1(2 μL 당 2 복제(copies))로 낮추어졌다.

PCR혼합물은 피펫과 제1 포트(25)를 사용하여 챔버(24)의 반대편에 있는 제2 포트(25)가 열 사이클링 동안에 공기 방울이 형성되지 않도록 하기 위해 유체로 채워질 때까지 공동(20) PCR 챔버(24)에 로드된다. 2 개의 포트(25)는 기포 형성 또는 유체 손실을 막기 위해 PCR 밀봉 테이프로 밀봉되었다. 광 공동(20)은 광을 균일하게 흡수하고 및 Au 박막의 최대 총 흡수를 위한 최적의 구성이기 때문에, 상부에 120nm 두께의 Au 박막을 갖는 기준 챔버(26)와 일렬로 배치된다. 증폭 후, 10 μL의 (피펫을 사용하여 공동 PCR 챔버에서 수집된)PCR 생성물과 10 μL의 E-겔 샘플 로딩 버퍼(Invitrogen)의 혼합물은 SYBR 세이프 DNA 겔 얼룩(Invitrogen)을 가지는 E-겔 2 % 아가로스 겔에 로드되고, E-Gel 아이페이스 세이프 시스템(Invitrogen)에서 실행되며, E-Gel 세이프 이미저 투과 조명기로 겔 이미지를 촬영한다. 50 bp DNA 사다리(ladder)는 생성물의 크기를 확인하기 위해 사용되었다. CFX96 실시간 PCR 검출 시스템이 있는 Bio-Rad C1000TM 열 순환 장치가 참조 PCR 시스템을 위해 사용되었다. PCR은 벤치 탑의 경우 20μL 부피로 수행되며, 챔버 두께가 상이한 공동 PCR의 경우 5 μL 및 10 μL 부피로 수행되었다. c-MET cDNA 외에도, λ-DNA 또한 초기 공동 PCR 최적화를 위하여 PCR의 템플릿으로 사용되었다. Z-TaqTM DNA 중합 효소를 사용하여 104 염기쌍(bp) λ-DNA 표적을 증폭시키는 PCR 반응은 0.5 μL의 Z-Taq DNA 중합 효소, 5 μL의 10x Z-Taq 완충액, 4 μL의 dNTP 혼합물, 4.5 μL의 10μM 프라이머(각각) 및 10 μL의 소 혈청 알부민(BSA)(50 μg)을 포함하며, PCR 급수를 사용하여 50μL로 만들어졌다. 템플렛 λ-DNA의 최종 농도는 0.01 ng μL^-1내지 10 ng uL^-1로 다양하다.

도 9a는 95~68℃에서 상이한 사이클 회수에 따른, 벤치 탑 열 사이클러(CFX96 실시간 PCR 검출 시스템이 있는 Bio-Rad C1000TM 열 순환기) 및 (750 ㎛ 두께의 PCR 챔버(24)가 구비된) 공동 PCR의 2% 아가로스 겔 이미지를 도시한다(포인트 1: 벤치 상단 10^-4 ng μL^-1 및 30 사이클, 포인트 2: 벤치 탑 NTC, 포인트 3 : 20 사이클에서의 공동, 포인트 4: 30 사이클에서의 공동, 포인트 5 : 40 사이클에서의 공동, 포인트 5 : NTC에서의 공동).

벤치-탑 PCR에 대하여, 3 단계 열 사이클링 프로토콜이 사용되었다.

도 9a는 사이클 횟수가 증가함에 따라 광 공동(20)에 대한 대역의 강도가 증가한다는 명확한 추세를 보여준다.

도 9b는 템플릿 DNA의 상이한 초기 농도에 따른 공동 PCR 생성물에서의 2% 아가로스 겔 이미지를 도시한다(10^-5 ng μL^-1 에서 포인트 1, 10^-7 ng μL^-1 에서 포인트 2, 10^-7 ng μL^-1 에서 포인트 3, 10^-8 ng μL^-1 에서 포인트 4, NTC에서 포인트 5). 농도가 변화함에 따라 대역 강도에 명확한 추세가 있다. 또한, 40번의 사이클의 공동 PCR은 15분 이내에 10^-8 ng μL^-1(μL-1 당 2 복제)만큼 낮게 증폭될 수 있다.

벤치-탑 및 공동 PCR에 대한 총 반응 시간은 도 10a에 요약되었다. KAPA2G Fast PCR 키트의 총 반응 시간이 종래의 PCR 분석보다 20-70% 더 짧지만, 본 발명에 따른 공동 PCR을 사용하여 전체 반응 시간을 70% ~ 80% 감소시킬 수 있다.

신속하고 민감한 핵산 증폭 이외에도, 광 공동(20)은 매우 반복 가능하고, 재현 가능하다. 강건한 LED 구동 광 공동 PCR의 입증에 의해, 본 발명의 시스템 및 방법이 신속하고 정확하며 신뢰할 수 있는 핵산 증폭이 필요한 POC 플랫폼으로의 구현을위한 이상적인 후보가 되게 한다.

3. 요약

본 발명의 광 공동 PCR 장치(10)는 고속 PCR 열 사이클링 뿐만 아니라 종래 벤치 탑 PCR 시스템과 비교하여 신뢰할만한 핵산 증폭에도 효과적이었다. 단 한번의 방문으로 시험 결과를 30분 이내에 제공하는 것이 바람직하다. 본 발명의 광 공동 PCR 장치(10)는 4 내지 10분 내에 30사이클의 PCR 열 사이클을 달성 할 수 있고, 15분 이내에 10^-8 ng μL^-1(μL 당 2 복제) 이하의 핵산 농도를 증폭시킬 수 있기 때문에 이러한 요건을 충족시킬 수 있다.

광 공동(20)의 Au 박막의 두께를 최적화함으로써, 광 공동(20)의 상부 및 하부 Au 박막(22a, 22b)에서 광이 균일하게 흡수될 수있어서, 각각 94 ℃에서 1.9 ℃ 및 68 ℃에서 0.2 ℃의 차이로 우수한 온도 균일성을 나타낸다. 결과적으로, 본 발명의 광 공동 PCR 장치(10)는 우수한 온도 균일성뿐만 아니라 정확한 온도 정확성으로 인해 우수한 반복성 및 재현성을 나타낸다. 일반적으로, 열 사이클이 빨라질수록 열적 관성(thermal inertia)으로 인해 PCR 샘플의 온도 변화가 커진다. 그러나 광 공동 PCR에서는 1.3 μL에서 10 μL까지의 다양한 샘플 용량에 따른 온도 정확성에 큰 차이를 나타내지 않는다. 이것은 열 질량이 적을뿐 아니라 두께가 50 nm 인 SiO₂ 초박 보호층을 통과하는 Au 박막과 PCR 혼합물 사이의 빠른 열전달에도 기인할 수 있다.

7개의 LED가 동일한 속도로 기준 챔버 및 공동 PCR 챔버를 가열하기 위해 넓은 빔 중앙부를 가지도록 단일 PCB에서 사용되었기 때문에, 테스트 장치의 소비 전력은 상대적으로 높다(~ 20W). 그러나, 기준 챔버(26) 및 광 공동(20)(또는 다중 구성에서 개별 광 공동(20)) 각각에 대해 2 개의 3W LED를 사용함으로써, 전력 소비는 더욱 감소될 수 있다(약 6W). 본 발명의 실시예는 형광 검출을 이용하는 양적 실시간 PCR뿐만 아니라 처리량이 높은 다중 증폭이 가능하도록 다중 PCR 벽 및 다수의 LED를 통합하는 것에 초점을 둔다.

결론적으로, LED 구동 광 공동 PCR 열 사이클러에 의한 신규 초고속 PCR이 증명되었다. 공동의 상부 및 하부 상의 두께가 상이한 Au 박막은 하부만을 가열하는 광자 PCR 보다 광-열 전환 효율이 증가하고, 온도 균일성이 향상된다. 전체 증폭 시간이 제어될 때, 상업용 벤치 탑 열 사이클러와 C-MET 유전자의 비교가능한 핵산 증폭이 입증되었다. c-MET 유전자의 초고속 증폭, 94℃(변성) 및 64℃(어닐링/연장) 사이에서의 열 사이클링은 초고속 가열에 따라 30 사이클에서 4~10분 내에 달성된다. 또한, 우리는 우리의 공동 PCR 플랫폼의 반복성과 재현성을 입증하였다. 우리는 간단하고 견고한 초고속 공동 PCR 열 사이클러가 POC 진단에 적합하다고 제안한다.

본 명세서의 설명으로부터, 본 발명은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 실시예를 포함한다는 것을 이해해야할 것이다:

1. 유체 샘플의 열 사이클링 장치로서,

상기 유체 샘플을 보유하도록 구성된 복수의 챔버 벽에 의해 정의되는, 적어도 하나의 마이크로-유체 열 사이클링 챔버;

상기 열 사이클링 챔버의 제1 챔버 벽을 정의하기 위해 제1 기판 상에 배치된 제1 박막;

상기 제1 챔버 벽의 반대편에 제2 챔버벽을 형성하기 위해 제2 기판 상에 배치된 제2 금속 박막; 및

상기 제1 박막을 조사하기 위해 구성된 광원을 포함하며,

상기 제1 박막 상에 조사되는 광의 제1 부분은 상기 제1 박막 내에 흡수되며, 상기 제1 박막 상에 조사되는 광의 제2 부분은 상기 제1 박막을 투과하고,

상기 제1 박막을 투과한 광은 상기 제2 박막을 조사하며,

상기 제2 박막 상에 조사된 상기 투과 광의 적어도 일부가 상기 제2 박막 내에 흡수되고,

상기 제1 박막 및 상기 제2 박막 내에 흡수된 광은 상기 열 사이클링 챔버 내 상기 유체 샘플을 가열하기 위해 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막의 온도를 높이도록 구성되는, 열 사이클링 장치.

2. 하나 이상의 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막은 금속층을 포함하는, 선행 실시예의 장치.

3. 상기 금속층은 금(Au), 은(Ag), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 크롬(Cr), 게르마늄(Ge), 팔라듐(Pd), 루테늄(Ru), 텅스텐(W), 이리듐(Ir), 또는 백금(Pt)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 금속을 포함하는, 선행 실시예의 장치.

4. 하나 이상의 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막은 다층 금속 구조를 포함하며,

상기 다층 금속 구조는 금(Au), 은(Ag), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 크롬(Cr), 게르마늄(Ge), 팔라듐(Pd), 루테늄(Ru), 텅스텐(W), 이리듐(Ir), 또는 백금(Pt)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 금속을 포함하는, 선행 실시예의 장치.

5. 하나 이상의 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막은 그래핀(graphene), 그래파이트(graphite), 탄소나노튜브(carbon nanotubes; CNTs), 또는 페인트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 비금속 광 흡수 물질을 포함하는, 선행 실시예의 장치.

6. 하나 이상의 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막은 공명에 의한 광 흡수를 증가시키기 위해 패턴화된 표면을 포함하는, 선행 실시예의 장치.

7. 하나 이상의 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판은 조사된 광이 상기 제1 기판을 통해 상기 제1 박막을 투과하도록 구성된 반투명 물질을 포함하는, 선행 실시예의 장치.

8. 하나 이상의 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판은 하나 이상의 필러 어레이, 1 D 또는 2 D 격자, 광 결정(photonic crystal), 반구체(hemisphere) 등의 형상으로 2-D 또는 3D 마이크로구조 또는 2-D 또는 3D 나노구조를 포함하는, 선행 실시예의 장치.

9. 상기 제1 박막은 제1 두께를 가지며,

상기 제2 박막은 상기 제1 두께와 상이한 제2 두께를 갖는, 선행 실시예의 장치.

10. 상기 제1 박막의 두께 및 상기 제2 박막의 두께는 상기 제1 박막 내 광 흡수율과 상기 제2 박막 내 광 흡수율이 일치하도록 선택되어서, 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막이 대체로 균일한 온도 상승률를 가지는, 선행 실시예의 장치.

11. 상기 열 사이클링 챔버 내부의 온도를 감지하도록 구성된 적어도 하나의 온도 센서를 더 포함하는, 선행 실시예의 장치.

12. 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막은 상기 열 사이클림 챔버 내부에서 PCR 반응이 억제되는 것을 방지하기 위하여 보호층(passivation layer)으로 보호된 표면을 갖는, 선행 실시예의 장치.

13. 상기 광원은 발광 다이오드(LED) 레이저 다이오드(LD), 텅스텐 램프, 형광 램프, 할로겐 램프, 수은 램프, 크세논 램프, 금속 할로겐화물 램프, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 선행 실시예의 장치.

14. 상기 열 사이클링 챔버에 결합된 제1 포트 및 제2 포트를 더 포함하며,

상기 제1 포트 및 상기 제2 포트는 상기 열 사이클링 챔버에 상기 유체 샘플을 유입시키도록 구성되는, 선행 실시예의 장치.

15. 유체 샘플의 초고속 열 사이클링을 수행하는 방법으로서,

대향하는 제1 박막 및 제2 박막에 의해 정의된 마이크로 유체 열 사이클링 챔버를 제공하는 단계;

상기 열 사이클링 챔버를 상기 유체 샘플로 충전시키는 단계;

상기 제1 박막 상에 조사된 광의 제1 부분이 상기 제1 박막 내에 흡수되며, 상기 제1 박막 상에 조사된 광의 제2 부분이 상기 제1 박막에 투과되는, 상기 제1 박막을 광원으로 조사하는 단계;

상기 제2 박막을 조사하는 상기 투과 광의 적어도 일부가 상기 제2 필름 내에 흡수되는, 상기 제1 박막을 투과한 광으로 상기 제2 박막을 조사하는 단계;

상기 제1 박막 및 상기 제2 박막 내로 흡수된 광의 함수로서 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막의 온도를 균일하게 상승시키는 단계; 및

상기 제1 박막 및 상기 제2 박막의 온도 상승의 결과로 상기 열 사이클링 챔버 내의 상기 유체 샘플을 가열하는 단계를 포함하는, 방법.

16. 상기 제1 박막의 조사는 상기 유체 샘플의 초고속 마이크로 유체 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하도록 간헐적으로 적용되는, 선행 실시예의 방법.

17. 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막의 온도를 균일하게 상승시키는 단계는:

제1 간격 동안 선택된 온도로 상기 열 사이클링 챔버 내 상기 유체 샘플의 온도를 상승시키기 위하여 제1 기간 동안 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막을 조사하는 단계;

제2 간격 동안 선택된 온도로 상기 열 사이클링 챔버 내 상기 유체 샘플의 온도를 상승시키기 위하여 제2 기간 동안 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막을 조사하는 단계;

제3 간격 동안 선택된 온도로 상기 열 사이클링 챔버 내 상기 유체 샘플의 온도를 상승시키기 위하여 제3 기간 동안 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막을 조사하는 단계; 및

상기 유체 샘플을 증폭시키기 위하여 다중 사이클 동안 조사 간격의 사이클을 반복하는 단계를 포함하는, 선행 실시예의 방법.

18. 상기 제1 박막은 제1 두께를 가지며,

상기 제2 박막은 상기 제1 박막과 상이한 제2 두께를 갖는, 선행 실시예의 방법.

19. 상기 제1 박막의 두께 및 상기 제2 박막의 두께는 상기 제1 박막 내로 광이 흡수되는 속도와 상기 제2 박막 내로 광이 흡수되는 속도가 일치하도록 선택되어서, 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막은 대체로 균일한 온도 상승률을 가지는, 선행 실시예의 방법.

20. 상기 열 사이클링 챔버 내의 온도를 측정하는 단계를 더 포함하는, 선행 실시예의 방법.

21. 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막은 상기 열 사이클링 챔버 내부에서 PCR 반응이 억제되는 것을 방지하기 위하여 보호층으로 보호된 표면을 가지는, 선행 실시예의 방법.

22. 상기 열 사이클링 챔버를 상기 유체 샘플로 충전시키는 단계는:

상기 열 사이클링 챔버에 결합된 제1 포트를 통해 상기 사이클링 챔버 내로 상기 유체 샘플을 주입시키는 단계를 포함하며,

주입된 상기 유체 샘플은 상기 열 사이클링 챔버에 결합된 제2 포트 밖으로 공기를 밀어내는, 선행 실시예의 방법.

23. 광 공동은 상기 PCR 반응 중에 형광 방출의 레이징(lasing)을 위해 구성되는, 선행 실시예의 방법.

여기서의 기재는 많은 세부 사항을 포함하고 있지만, 이러한 기재는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아닌, 단지 현재의 바람직한 실시예들의 일부의 예시를 제공하는 것으로 유추해야 한다. 그러므로, 본 발명의 범위는 통상의 기술자에게 자명하게 될 수 있는 다른 실시예들을 충분히 포함한다는 것이 이해될 것이다.

청구범위에서, 단수의 한 요소에 대한 언급은 명백하게 그렇게 설명된 것이 아니라면 "하나 및 오직 하나"를 의미하는 것이 아닌, "하나 또는 그 이상"을 의미하는 것으로 의도된 것이다. 통상의 기술자에게 알려진 상기 개시된 실시예들의 요소들에 대한 모든 구조적, 화학적 및 기능적 등가물은 여기에 참조로 명백히 포함되며, 제시된 청구범위에 의해 포함되도록 의도된다. 더욱, 본 개시에서 요소, 구성 또는 방법 단계는 그 요소, 성분 또는 방법 단계가 청구항들에서 명시적으로 인용되어 있는지에 관계없이 공중에 전용되도록 의도된 것이 아니다. 여기서 청구항 요소는 그 요소가 분명하게 "위한 수단(means for)"이라는 문구를 사용하여 인용되지 않는다면 "수단 플러스 기능(means plus function)"의요소로서 유추되어야 한다. 여기서 청구항 요소는 그 요소가 분명하게 "위한 단계(step for)"라는 문구를 사용하여 인용되지 않는다면 "단계 플러스 기능(step plus function)"의요소로서 유추되어야 한다.

광 공동 PCR 챔버에서 Au 박막의 최적화

LED의 방출 파장을 통하여 측정된 상이한 두께를 가지는 Au 박막의 평균 투과율, 반사율 및 흡수율

Claims

유체 샘플의 열 사이클링 장치로서,
상기 유체 샘플을 보유하도록 구성된 복수의 챔버 벽에 의해 정의되는, 적어도 하나의 마이크로-유체 열 사이클링 챔버;
상기 열 사이클링 챔버의 제1 챔버 벽을 정의하기 위해 제1 기판 상에 배치되며 광 흡수 물질을 포함하는 제1 박막;
상기 제1 챔버 벽의 반대편에 제2 챔버벽을 형성하기 위해 제2 기판 상에 배치되며 광 흡수 물질을 포함하는 제2 금속 박막; 및
상기 제1 박막을 조명하기 위해 구성된 광원을 포함하며,
상기 제1 박막 상에 조명되는 광의 제1 부분은 상기 제1 박막 내에 흡수되며, 상기 제1 박막 상에 조명되는 광의 제2 부분은 상기 제1 박막을 투과하고,
상기 제1 박막을 투과한 광은 상기 제2 박막을 조명하며,
상기 제2 박막 상에 조명된 상기 투과 광의 적어도 일부가 상기 제2 박막 내에 흡수되고,
상기 제1 박막 및 상기 제2 박막 내에 흡수된 광은 상기 열 사이클링 챔버 내 상기 유체 샘플을 가열하기 위해 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막의 온도를 높이도록 구성되는, 열 사이클링 장치.
제1항에 있어서,
하나 이상의 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막은 금속층을 포함하는, 열 사이클링 장치.
제2항에 있어서,
상기 금속층은 금(Au), 은(Ag), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 크롬(Cr), 게르마늄(Ge), 팔라듐(Pd), 루테늄(Ru), 텅스텐(W), 이리듐(Ir), 또는 백금(Pt)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 금속을 포함하는, 열 사이클링 장치.
제1항에 있어서,
하나 이상의 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막은 다층 금속 구조를 포함하며,
상기 다층 금속 구조는 금(Au), 은(Ag), 니켈(Ni), 티타늄(Ti), 크롬(Cr), 게르마늄(Ge), 팔라듐(Pd), 루테늄(Ru), 텅스텐(W), 이리듐(Ir), 또는 백금(Pt)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 금속을 포함하는, 열 사이클링 장치.
제1항에 있어서,
하나 이상의 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막은 그래핀(graphene), 그래파이트(graphite), 탄소나노튜브(carbon nanotubes; CNTs), 또는 페인트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 비금속 광 흡수 물질을 포함하는, 열 사이클링 장치.
제1항에 있어서,
하나 이상의 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막은 공명에 의한 광 흡수를 증가시키기 위해 패턴화된 표면을 포함하는, 열 사이클링 장치.
제1항에 있어서,
하나 이상의 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판은 조명된 광이 상기 제1 기판을 통해 상기 제1 박막을 투과하도록 구성된 반투명 물질을 포함하는, 열 사이클링 장치.
제1항에 있어서,
하나 이상의 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판은 하나 이상의 필러 어레이, 1 D 또는 2 D 격자, 광 결정(photonic crystal), 반구체(hemisphere)의 형상으로 2-D 또는 3D 마이크로구조 또는 2-D 또는 3D 나노구조를 포함하는, 열 사이클링 장치.
제1항에 있어서,
상기 제1 박막은 제1 두께를 가지며,
상기 제2 박막은 상기 제1 두께와 상이한 제2 두께를 갖는, 열 사이클링 장치.
제9항에 있어서,
상기 제1 박막의 두께 및 상기 제2 박막의 두께는 상기 제1 박막 내 광 흡수율과 상기 제2 박막 내 광 흡수율이 일치하도록 선택되어서, 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막이 균일한 온도 상승률를 가지는, 열 사이클링 장치.
제1항에 있어서,
상기 열 사이클링 챔버 내부의 온도를 감지하도록 구성된 적어도 하나의 온도 센서를 더 포함하는, 열 사이클링 장치.
제1항에 있어서,
상기 제1 박막 및 상기 제2 박막은 상기 열 사이클림 챔버 내부에서 PCR 반응이 억제되는 것을 방지하기 위하여 보호층(passivation layer)으로 보호된 표면을 갖는, 열 사이클링 장치.
제1항에 있어서,
상기 광원은 발광 다이오드(LED) 레이저 다이오드(LD), 텅스텐 램프, 형광 램프, 할로겐 램프, 수은 램프, 크세논 램프, 금속 할로겐화물 램프, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 열 사이클링 장치.
제1항에 있어서,
상기 열 사이클링 챔버에 결합된 제1 포트 및 제2 포트를 더 포함하며,
상기 제1 포트 및 상기 제2 포트는 상기 열 사이클링 챔버에 상기 유체 샘플을 유입시키도록 구성되는, 열 사이클링 장치.
유체 샘플의 초고속 열 사이클링을 수행하는 방법으로서,
대향하는 제1 박막 및 제2 박막에 의해 정의된 마이크로 유체 열 사이클링 챔버를 제공하는 단계;
상기 열 사이클링 챔버를 상기 유체 샘플로 충전시키는 단계;
상기 제1 박막 상에 조명된 광의 제1 부분이 상기 제1 박막 내에 흡수되며, 상기 제1 박막 상에 조명된 광의 제2 부분이 상기 제1 박막에 투과되도록, 상기 제1 박막을 광원으로 조명하는 단계;
상기 제2 박막을 조명하는 상기 투과 광의 적어도 일부가 상기 제2 박막 내에 흡수되도록, 상기 제1 박막을 투과한 광으로 상기 제2 박막을 조명하는 단계;
상기 제1 박막 및 상기 제2 박막 내로 흡수된 광에 따라 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막의 온도를 균일하게 상승시키는 단계; 및
상기 제1 박막 및 상기 제2 박막의 온도 상승의 결과로 상기 열 사이클링 챔버 내의 상기 유체 샘플을 가열하는 단계를 포함하는, 방법.
제15항에 있어서,
상기 제1 박막의 조명는 상기 유체 샘플의 초고속 마이크로 유체 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하도록 간헐적으로 적용되는, 방법.
제16항에 있어서,
상기 제1 박막 및 상기 제2 박막의 온도를 균일하게 상승시키는 단계는:
제1 간격 동안 선택된 온도로 상기 열 사이클링 챔버 내 상기 유체 샘플의 온도를 상승시키기 위하여 제1 기간 동안 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막을 조명하는 단계;
제2 간격 동안 선택된 온도로 상기 열 사이클링 챔버 내 상기 유체 샘플의 온도를 상승시키기 위하여 제2 기간 동안 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막을 조명하는 단계;
제3 간격 동안 선택된 온도로 상기 열 사이클링 챔버 내 상기 유체 샘플의 온도를 상승시키기 위하여 제3 기간 동안 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막을 조명하는 단계; 및
상기 유체 샘플을 증폭시키기 위하여 다중 사이클 동안 조명 간격의 사이클을 반복하는 단계를 포함하는, 방법.
제16항에 있어서,
상기 제1 박막은 제1 두께를 가지며,
상기 제2 박막은 상기 제1 박막과 상이한 제2 두께를 갖는, 방법.
제18항에 있어서,
상기 제1 박막의 두께 및 상기 제2 박막의 두께는 상기 제1 박막 내로 광이 흡수되는 속도와 상기 제2 박막 내로 광이 흡수되는 속도가 일치하도록 선택되어서, 상기 제1 박막 및 상기 제2 박막은 균일한 온도 상승률을 가지는, 방법.
제16항에 있어서,
상기 열 사이클링 챔버 내의 온도를 측정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제16항에 있어서,
상기 제1 박막 및 상기 제2 박막은 상기 열 사이클링 챔버 내부에서 PCR 반응이 억제되는 것을 방지하기 위하여 보호층으로 보호된 표면을 가지는, 방법.
제16항에 있어서,
상기 열 사이클링 챔버를 상기 유체 샘플로 충전시키는 단계는:
상기 열 사이클링 챔버에 결합된 제1 포트를 통해 상기 사이클링 챔버 내로 상기 유체 샘플을 주입시키는 단계를 포함하며,
주입된 상기 유체 샘플은 상기 열 사이클링 챔버에 결합된 제2 포트 밖으로 공기를 밀어내는, 방법.
제16항에 있어서,
광 공동이 상기 PCR 반응 중에 형광 방출의 레이징(lasing)을 위해 구성되는, 방법.