KR20130092391A

KR20130092391A - 비접촉 실시간 마이크로 폴리머라제 연쇄 반응 시스템 및 그 방법

Info

Publication number: KR20130092391A
Application number: KR1020127029020A
Authority: KR
Inventors: 스웨타 찬드라; 수딥 몬달; 벤카타라만 벤카타크리쉬난; 사티아딥 비스와나단; 렌지쓰 마힐라데비 라다크리쉬난; 라비프라카쉬 자야라만; 나이르 찬드라세카르 바스카란; 필라리세티 벤카타 수바라오
Original assignee: 빅텍 프라이빗 리미티드
Priority date: 2010-04-30
Filing date: 2011-04-28
Publication date: 2013-08-20
Also published as: BR112012027876A2; JP6026996B2; SG185045A1; US9404151B2; EP2563513A4; WO2011135535A1; CN102939161B; TWI591174B; TW201144432A; AR081288A1; EA201291008A1; JP2013524832A; EP2563513A1; CN102939161A; US20130101983A1

Abstract

본 개시는 시료를 유지시키기 위한 반응 챔버 및 상기 반응 챔버 아래에 상기 시료를 가열시키기 위한 내장된 금속 히터를 포함하는 칩; 형광을 검출하기 위한 상기 칩 위에 위치한 결합된 LED 드라이버와 광 검출기 증폭기를 포함하는 광 검출기 증폭기; 상기 칩 주위에 장착되고 상기 금속 히터에 의해 유도적으로 결합된 유도 히터; 금속 히터의 온도를 측정하기 위한 상기 칩 아래에 장착된 적외선 온도 센서이고 상기 적외선 온도 센서는 신호 조절부와 접속되고; 및 상기 신호 조절부를 통하여 상기 적외선 온도 센서로부터 받은 피드백에 기초하여 상기 유도의 파워를 조절하기 위한 상기 신호 조절부 및 상기 유도 히터와 접속된 제어기를 제공한다.

Description

비접촉 실시간 마이크로 폴리머라제 연쇄 반응 시스템 및 그 방법{A non contact real time micro polymerase chain reaction system and method thereof}

본 개시의 구체예는 비접촉 실시간 마이크로-폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 시스템, 더 특히 구체예는 실링된 반응 챔버 및 적외선 온도 감지를 갖는 유도적으로 가열된 칩을 갖는 PCR 시스템에 관한 것이다.

분자 생물학에서, PCR은 데옥시리보핵산(DNA)의 조각의 단일 또는 몇몇 카피를 10의 수 자승 정도 증폭시키기 위한 기법으로, 특정한 DNA 서열의 수 백만개의 카피를 발생시킨다. 이 방법은 열의 순환, 예, 시료의 연속적인 가열 및 쿨링에 기초한다. PCR을 진행할수록, 생성된 DNA는 자체가 증폭을 위한 주형으로 사용된다. PCR은 25-30 회 동안 반복되는 가열 및 쿨링의 세 주된 단계를 포함한다. 각 사이클은 (i) 약 94 oC에서 모든 이중 가닥이 단일 가닥 DNA로 용해되는 변성, (ii) 양 프라이머가 단일 가닥 주형과 짝을 이루는 더 낮은 온도 약 54 도에서의 어닐링 및 (iii) 폴리머라제가 주형에 상보적인 염기를 붙임으로써 상기 프라이머를 연장하여, 각 주형에 대하여 이중 가닥 DNA의 두 카피를 만드는 약 72 도에서의 연장을 포함한다.

통상적인 벤치-탑 PCR 시스템은 폴리프로필렌 튜브 내에 로딩된 시료의 온도를 순환시키는 큰 금속 가열 및 쿨링 블록을 사용하고, 반응 챔버의 소형화는 통합, 속도 및 효율의 면에서 장점을 제공한다. 이러한 장점과 함께 PCR을 위한 소형화된 시스템의 개발이 활발한 관심의 분야가 되었다. 장치는 생물학적 반응을 위하여 적절한 다양한 재료를 사용하여 많은 연구군에 의하여 제조되었다. 연구군의 대부분은 높은 열 전도도 및 특성이 잘 규명된 공정 조건을 위하여 이들의 기질로 실리콘을 사용하였다. 맨 실리콘은 시각적으로 투명하지 않고 PCR 반응을 억제하는 것으로 보고되었다. 산화된 실리콘 또는 유리가 바람직하나, 이러한 칩 내 반응 챔버, 히터, 및 온도 센서의 복잡한 다단계 제조는 이들을 일회용으로 사용 가능한 장치를 위해 너무 비싸게한다. 게다가, 반응 챔버 실링 단계는 용융 접합, 양극 접합, 접착 접합, 가역 접합 및 초음파 접합과 같은 다른 유형의 접합의 하나에 의하여 전형적으로 수반되는, 열 증착을 피하는 것을 필요로 한다. 반면에 폴리머는 투명한 생체에 적합한 저비용 재료이고 더 낮은 온도에서 용이하게 주조될 수 있다. 그러나 이들의 온도 전도도는 실리콘에 비하여 더 작다. 따라서 히터 및 온도 센서의 설계는 중요하다.

가열 방법의 선택은 신속한 마이크로칩 PCR 프로토콜을 위한 재료의 선택과 함께 중요한 역할을 한다. 일반적으로 다양한 그룹에 의하여 보통 사용되는 가열 방법의 두 가지 유형이 있다: 접촉 및 비접촉 가열. 접촉 가열 방법은 저항성의 히터를 활용하여 PCR 용액을 가열시킨다. 상기 히터는 저항에 재현할 수 있는 온도 의존성, 높은 온도를 견딜 수 있는 능력, 좋은 화학적 안정성 및 높은 순도 때문에 전형적으로 얇은 막 금속, 주로 백금(Pt)이다. 게다가 티타늄의 얇은 층은 Pt를 위한 접착층으로 종종 사용되고, 후자가 높은 온도에서 높은 발산(diffusion) 비율이기 때문이고, 이는 성과를 악화시킬 것이다. 그러나 Pt는 매우 비싸고 광학적으로 불투명하다. 또한 다른 금속 및 합금은 히터로서 사용되었다. 또한 일부 상업적으로 이용가능한 펠티에 블록 열전기의 유닛은 이의 큰 열식 질량, 더 늦은 온도 램핑(ramping) 속도 및 투명하지 않은 것에도 불구하고 PCR 칩의 온도 제어에 널리 사용되어 왔다. PCR을 위한 대부분 보통으로 사용되는 비접촉 가열 계획은 원하는 온도에서 공기의 줄기를 신속하게 전환함으로써 수행되는 높은 공기 사이클링에 기초한다. 그러나 단일 칩을 위한 뜨거운 공기의 제어 및 적용은 용이하지 않을 수 있다. 일부 보고에서, 텅스텐 램프를 사용하는 적외선 방사가 35 사이클 동안 15분 이상 요구된 가열의 비접촉 소스로서 활용되었다. 그러나 상기 텅스텐 램프는 비간섭성 및 비집중된 광원이고, 따라서 필요로하는 온도에 이르기 위하여 칩을 위한 높은 파워(50 내지 100 W)을 필요로 한다. 또 다른 보고에서, 실리콘 마이크로 반응 챔버에서 신속한 온도 램핑을 위한 낮은 파워 방사 근원으로서 비싸지 않은 할로겐 램프가 기술되었다.

앞선 논의를 고려하여, 상술한 문제를 극복하기 위하여 실링된 반응 챔버 및 적외선 온도 감지를 갖고, 폴리-디메틸-실록신 [PDMS], 아크릴(acrylic), 폴리프로필렌 및 폴리카보네이트로 이루어지나 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택되는 재료로 만들어지는 인용된(cite) 칩 및 유도적으로 가열된 폴리머를 갖는 비접촉 실시간 마이크로-폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 시스템을 개발하는 것이 필요하다.

본 개시의 목적

본 개시의 일 목적은 유도 히터 및 적외선 방사 온도 센서를 갖는 비접촉 실시간 마이크로-폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 시스템을 제공하는 것이다.

본 개시의 일 목적은 반응 챔버 및 내장된(embedded) 금속 히터를 갖는 칩을 갖는 비접촉 실시간 마이크로 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 시스템을 제공하는 것이다.

본 개시의 요약

본 개시에 청구된 시스템 및 방법의 제공을 통하여 이전 기술의 단점이 극복되고 추가적 장점이 제공된다.

추가적 특성 및 장점은 본 개시의 기법을 통하여 실현된다. 본 개시의 다른 구체예 및 양태는 본 명세서에 구체적으로 기재되고 청구된 개시의 일 부분으로 고려된다.

본 개시의 주된 구체예는 비접촉 실시간 마이크로 폴리머라제 연쇄 반응 [PCR] 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 시료를 유지시키기 위한 반응 챔버 및 상기 반응 챔버 아래에 상기 시료를 가열하기 위한 내장된(embedded) 금속 히터를 갖는 칩을 포함한다. 결합된 LED 드라이버와 광 검출기 증폭기를 포함하는 광학 유닛은 상기 칩 위에 위치하여 형광을 검출한다. 유도 히터는 칩 주위에 장착되고 상기 금속 히터에 유도적으로 결합된다(inductively couple). 적외선 온도 센서는 금속 히터의 온도를 측정하기 위한 상기 칩 아래에 장착되고, 상기 적외선 온도 센서는 신호 조절부와 접속된다(interface). 그리고 상기 신호 조절부를 통하여 상기 적외선 온도 센서로부터 받은 피드백에 기초하여 상기 유도 히터의 파워를 조절하기 위한, 상기 신호 조절부 및 상기 유도 히터와 접속된 제어기.

본 개시의 일 구체예에서, 상기 칩은 폴리--디메틸-실록산 [PDMS], 아크릴, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌으로 제한되지 않는 군으로부터 선택되는 물질로부터 제조된다.

본 개시의 일 구체예에서 상기 LED 드라이버와 광 검출기 증폭기 및 상기 펄스 폭 모듈 제어기는 PCR의 다른 파라미터를 모니터하기 위한 데이터 취득 및 제어 시스템과 접속된다.

본 개시의 일 구체예에서 유도 히터는 코일이고, 상기 코일은 상기 금속 히터를 유도적으로 가열하기 위하여 상기 칩에 인접하여 위치한다. 그리고 상기 칩과 상기 코일 간의 거리는 0-10mm 사이에서 변한다.

본 개시의 일 구체예에서, 제어기(5)는 펄스 폭 변조기, 비례 적분 미분(PDI) 제어기 및 ON/OFF 스위치 중 하나 이상으로부터 선택된다.

본 개시의 일 구체예에서, 상기 반응 챔버는 시료를 채우는(filling) 동안 포획된 공기(trapped air)를 한 측면상에 한정하기 위한 노즐을 갖는다.

본 개시의 다른 구체예는 비접촉 실시간 마이크로 폴리머라제 연쇄 반응 [PCR] 시스템을 작동시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 칩의 반응 챔버에 시료를 채우는 행위를 포함한다. 상기 시료를 내장된 금속 히터를 사용하여 가열시키고, 상기 내장된 금속 히터는 유도 히터로부터 열 에너지를 받기 위하여 상기 유도 히터에 유도적으로 연결된다. 그 이후 상기 금속 히터의 온도를 적외선 온도 센서를 사용하여 측정한다. 그리고 적외선 온도 센서로부터 받은 피드백에 기초하여 제어기를 사용하여 상기 유도 히터에 대한 파워가 조절된다.　

본 개시의 일 구체예에서, 포획된 공기는 상기 시료를 채우기 전에 상기 칩의 한 말단에 제공된 노즐을 통하여 상기 반응 챔버로부터 나온다(flush out).

본 개시의 일 구체예에서, 형광은 결합된 LED 드라이버와 광 검출기 증폭기를 포함하는 광학 유닛을 사용하여 검출된다.

본 개시의 일 구체예에서, 폴리머라제 연쇄 반응의 다른 파라미터 모니터링은 데이터 취득 및 제어시스템을 이용한다.

본 개시의 일 구체예에서, 열 공급은 유도 히터로부터 상기 금속 히터로 전자기 유도 공정에 의한다.

앞선 요약은 예시일 뿐이고 어떤 제한하는 식으로 의도되지 않는다. 상기 기술된 구체적인(illustrative) 양태, 구체예, 및 특성, 추가적 양태, 구체예, 및 특성은 도 및 다음 상세한 설명에 대한 참고에 의해 명확해질 것이다.

본 개시의 새로운 성질 및 특성 규명은 첨부된 청구항에 설명된다. 그러나, 개시 자체와 사용의 바람직한 방식, 이의 더 목적 및 장점은 수반하는 도와 함께 결합하여 읽는 경우 다음의 예시적인 구체예의 상세한 설명에 대한 참조에 의하여 가장 잘 이해될 것이다. 하나 이상의 구체예는 오직 예시의 방식에 의하여, 수반하는 도에 대한 참조로서 참조 번호는 요소를 대표하고 하기에서 기술된다:　
도 1은 비접촉 마이크로-PCR 시스템의 블록선도를 도시한다.
도 2a-2c는 내장된 히터 및 반응 챔버를 가진 PDMS 칩을 위한 세 단계 제조 공정을 도시한다.
도 2d 및 2e는 PDMS 칩의 평면도 및 투시도를 도시한다.
도 3a-3c는 칩, 대물 렌즈 및 IR 센서에 대하여 코일의 위치를 도시한다.
도 4는 주파수 50 kHz에서 10A의 전류를 지니는 1mm 직경 와이어의 구리 코일의 2 회전 10 mm 직경을 이용하여 유도에 의하여 가열된 0.4mm 두께의 8mm 직경 니켈 고리 주위에 자기장의 2D 수치 시물레이션을 도시한다.
도 5는 주파수의 함수로서 다른 히터 재료: 스테인리스 강(SS), 알루미늄(Al) 및 구리(Cu)에서 소산된(dissipated) 파워의 수치 시물레이션을 도시한다. 구리 코일 자체(코일)에서 소산된 파워도 보여준다.
도 6은 온도의 함수로서 실시간 형광 신호의 도함수를 보여주는 용해 곡선을 도시한다(칩을 위한 교정되지 않은 IR 센서 측정값 및 MJR 열순환기 내에 튜브를 위한 교정된 열전대).
도 7은 사이클링 동안 온도 프로파일을 도시한다. 검은 선은 컴퓨터에 의한 즉각적으로 전환된 설정값을 보여주는 반면 붉은 곡선은 IR 센서로부터 (정정된) 온도를 보여준다. 왼쪽의 그림은 모든 사이클을 위한 완전한 프로파일을 보여주는 반면 오른쪽 사진은 처음의 약간의 사이클을 보여준다.
도 8은 상업적 열순환기를 사용하여 폴리프로필렌 튜브에서 수행된 비슷한 실험을 가진 PDMS 칩 내에300 bp 람다 DNA의 증폭으로부터 실시간 형광 신호를 도시한다.
도 9는 튜브 및 PDMS 칩에서 증폭된 300 bp DNA의 용해 곡선 분석을 도시한다. 두 시료는 칩 내에 로딩되어서 IR 센서를 가지고 용해 곡선을 기록하였다.
그림은 예시의 목적을 위해서만 본 개시의 구체예에 도시된다. 당해 기술에서 능숙한 자는 구조의 대안적인 구체예인 다음의 기술로부터 쉽게 알아볼 것이고 본 명세서에서 예시된 방법은 본 명세서에서 기술된 개시의 원칙으로부터 벗어나지 않고 채용될 수 있다.

다음의 본 개시의 상세한 설명이 더 잘 이해될 수 있도록 하기 위하여 선행은 넓게 본 개시의 특성 및 기술적 장점의 개요를 서술하였다. 본 개시의 추가적 특성 및 장점이 본 개시의 청구항의 주제를 형성하는 본 명세서에서 기술될 것이다. 당해 분야에서 능숙한 자에 의하여 개시된 구상 및 특정 구체예는 쉽게 본 개시의 동일한 목적을 수행하기 위한 다른 구조를 변형 또는 설계하기 위한 기본으로서 활용될 수 있다. 당해 분야에서 능숙한 자에 의하여 이러한 등가물 구성은 첨부된 청구항에서 설명하는 바와 같이 본 개시의 정신 및 범위를 벗어나지 않는다는 점이 실현되어야 한다. 본 개시의 특성이라고 믿어지는 신규한 특성, 이의 조직 및 작동의 방법에 관하여 모두, 추가적 목적 및 장점과 함께 첨부된 도와 연결하여 고려되는 경우 하기 기재로부터 더 잘 이해될 수 있다. 그러나, 이는 명확히 이해되고, 도의 각각은 예시의 목적으로만 제공되고 기재는 오직 본 개시의 제한의 정의로서 의도되지 않는다.

본 명세서 상기에 논의된 문제를 극복하기 위하여, 본 개시는 비접촉 실시간 마이크로 폴리머라제 연쇄 반응 시스템(A)을 제공한다. 상기 시스템은 간단하고 어떠한 광 방사(radiation)와 추가적 렌즈 및 필터를 필요로 하지 않는다. 유도 가열(induction heating)은 개선된 신뢰도를 가진 더욱 더 간단한 칩(1) 제조 단계에 이른다. 게다가 적외선 온도 센서(3)는 상기 시스템에서 칩 온도를 감시하고 제어하기 위하여 사용된다. 이는 복잡한 제조 단계를 사용하여 칩 내에 내장되어야 하는 열전대(thermocouple) 또는 저항기와 같은 유형 온도계(type thermometer)와 접촉할 필요를 제거한다. 온도계는 칩(1) 자체의 부분이 아니고, 상기 칩의 비용 및 처분 가능성은 대단히 증진된다. 게다가, 온도계 교정(calibration)은 모든 칩을 위하여 아니라 칩 리더 유닛의 부분으로서 한번만 되어야 한다. 상기 가열(heating)에다가 비접촉 온도 감지의 사용은 완전한 비접촉 PCR 칩 시스템의 장점을 완전히 실현하기에 충분하다.

본 개시는 PDMS 칩(1)을 사용한 완전한 비접촉 PCR 시스템(A)의 설계를 제공한다. 비접촉 가열은 전자기 유도를 사용하여 실현되는 반면 비접촉 온도 감지는 적외선 열전대(4)로 달성된다. 본 개시는 더 구체적으로 내장된 히터(1b)를 갖는 칩의 설계, 히터 금속의 선택의 최적화 및 이의 기하하적 구조(geometry), 모니터 온도에 대한 적외선 온도 감지(3)의 사용, 최선의 적외선 방출 및 형광을 위한 히터 표면 코팅의 최적화, 적외선 온도계를 교정하기 위한 DNA의 용해 곡선(melting curve)의 사용, 증발 장벽으로 미네랄 오일 또는 다른 첨가물을 위한 필요를 제거하는 마이크로-주사기를 이용하여 시료가 주입될 수 있는, PDMS 칩(1) 내에 실링된 반응 챔버(1a), 히터(1b) 및 반응 챔버(1a) 부분 및 공기 중에서 플라즈마 결합을 사용하여 이들을 같이 결합하기 위한 제조 공정, 주파수는 최적의 파워가 내장된 히터(1b)까지 전달되도록 맞추어진 공명하여 여기된 유도 코일, 및 최종적으로 적외선 온도 센서(3)로부터 피드백에 기초하여 유도 히터(2)로의 파워를 조절하기 위한 낮은 파워 펄스 폭 조절(PWM) 제어기(5)에 관한 것이다.

형광 검출 유닛을 포함하는 비접촉 PCR 시스템(A)의 원형을 만들고 람다 DNA의 증폭 및 용해로 시험하였다. 본 개시의 PCR 장치는 PCR 동안 매 0.5 초에 형광을 측정한다. 본 개시는 크기 600, 800 및 1000 bp를 포함하지만 이에 제한되지 않는 람다 DNA의 증폭을 보여주고, 산물 특이성을 상업적 PCR 기계와 비교하여 용해 곡선으로 확인하였다. 실시간 마이크로칩 PCR 적용을 위하여 어떠한 전기적 접촉 없이, 일회용의 투명하고 생체에 적합한 폴리머 칩의 사용은 이러한 저비용 시스템의 급속한 배치를 위한 길을 조성할 수 있다.

방법 및 재료:

도 1은 비접촉 마이크로-PCR 시스템(A)을 도시하는 예시적인 구체예이다. 상기 시스템은 유도 히터(2)에 유도적으로 결합된(inductively coupled) 내장된 금속 히터(1b)를 가진 PDMS 칩(1)을 포함한다. 적외선 방사 온도 센서(3)는 칩(1)의 바닥으로부터 상기 히터(1a) 온도를 측정한다. 온도 신호는 설정값과 비교되고 상기 유도 히터(2)에 대한 파워는 PWM 온-오프식의 제어 회로(5)에 의하여 조절된다. 결합된 LED 드라이버와 광 검출기 증폭기(7)를 가진 광학 픽업(pick-up) 유닛은 상기 칩(1a) 위에 형광을 검출하기 위하여 배치된다. 상기 광 검출기 증폭기(7) 및 PMW 온-오프식의 제어 회로(5)는 데이터 취득 및 제어 시스템(8)과 접속된다. 상기 데이터 취득 및 제어 시스템(8)은 폴리머라제 연쇄 반응의 파라미터를 모니터하는 프로그램에 만들어져 있다. 각각의 서브-시스템의 추가적 세부항은 하기 주어진다.

PDMS 칩의 제조

도 2a-2c는 PDMS 칩(1)의 제조가 포함된 단계를 도시하는 예시적인 구체예이다.　상기 칩(1)의 상반부는 복제 몰딩 기법을 이용하여 제조된 반응 챔버(1a)로 구성된다. 마스터(master)가 SU-8 및 포토리소그래피를 이용하여 처음으로 설계되고 제조된다. 음성 포토 레지스트(negative photo resist) [SU8 2150]가 2 인치 실리콘 웨이퍼에서 100 rpm에 30초 동안 스핀 코트(spin coat)된다. 소프트 베이크(soft bake) 후, 포토 마스크의 패턴이 2분 동안 UV 노광에 의하여 SU8 코팅된 실리콘 웨이퍼에 전달된다. 노광된 패턴을 포스트 베이크하고, 30분 동안 현상한 후 열처리(hard bake)시켰다. 상기 칩(1)의 상반부를 얻기 위하여, 10:1 PDMS를 마스터에 붓고, 베이크 및 박리(peel off)시켰다. 반응 챔버의 부피는 약 5 μL [약 3 mm 직경 및 600 μm 높이]이다. 원형 챔버는 포획된 공기를 가두어 넣기(confine) 위하여 한 측면상에 노즐을 갖는다. 상기 칩(1)의 하반부는 PDMS 내에 얇은 원형 금속 시트로 구성된다. 이는 금속 디스크를 소수성 유리 슬라이드 상에 부은 PDMS의 얇은 층내에 간단히 담금으로써 제조된다. 2시간 동안 90 도 섭씨(oC)에서 열처리 후, 조각을 슬라이드로부터 자르고 박리시켰다. 결국, 위쪽 및 아래쪽의 PDMS을 2분 동안 공기 플라즈마에 노출시키고, 온화한 압력 하에 접촉하여 놓고, 오븐에서 30분 동안 90도 섭씨에서 가열시켜 내장된 반응 챔버(1a) 및 히터(1b)를 가진 비가역적으로 결합된 PCR 칩(1)을 얻었다.

칩(1)을 사용하기 위하여, 상기 반응 챔버(1a)는 우선 마이크로-주사기를 이용하여 노즐(1c)에 구멍을 내었다. 다음에 상기 챔버(1a)를 반대면으로부터 상기 마이크로-주사기를 사용하여 용액으로 채웠다. 대부분의 공기를 상기 노즐(1c)를 통하여 내보내고 구멍난 환기구로부터 빠져나왔다. 잔여의 포획된 공기 거품은 노즐(1c)에 넣고 PCR 또는 형광 신호를 간섭하지 않는다.

도 2d 및 2e는 각각 PDMS 칩(1)의 평면도 및 투시도를 도시한다. 상기 칩(1)은 시료를 유지시키기 위한 반응 챔버(1a) 및 상기 시료를 가열시키기 위하여 상기 반응 챔버(1a) 아래에 내장된 금속 히터(1b)를 포함한다. 상기 칩(1)은 상기 반응 챔버(1a)의 측면상에 노즐을 더 포함하여 상기 반응 챔버(1a)로부터 포획된 공기가 나온다(flush out).

내장된 히터 설계

주어진 1차(primary) 코일을 위하여, 파워는 주파수, 금속의 저항률 및 기하학적 면적(직경 및 두께)에 의존하여 2차와 결합된다. 더 큰 면적은 결합된 파워를 향상시킬 것이나, 증가된 열식 질량으로 인해 수동적 쿨링 속도를 저하시킨다. 더 높은 주파수는 더 좋은 가열 효율을 이끌 것이나, 이는 파워 트랜지스터에서 스위치 손실로 상쇄되어진다. 다른 상업적으로 이용가능한 다양한 두께의 철, 구리 및 알루미늄 금속 시트가 시도되고, 시물레이션이 최고의 스위치 주파수를 결정하기 위하여 수행되었다. 시트의 상단면은 매우 다듬어(polished) 수집된 형광 신호를 향상시키는 반면 바닥 면은 적외선 방사 온도 센서(3)에 의한 최고의 열의 검출을 위하여 검정으로 코팅되었다.

유도 가열 코일 및 IR 검출기

적외선 검출기(3)는 직경 약 7 mm의 방출 표면의 온도를 정확하게 감지하기 위하여 약 2 mm 내에 위치되어야 한다. 따라서 상기 칩(1)의 바로 아래 위치된다.

센서의 몸체는 금속이기 때문에, 유도 히터(2) 1차 코일의 위치는 중요하다. 도 3a에 도시된 바와 같이 10 회전의 코일이 칩(1) 아래에 사용되면, 적외선 온도 센서(3) 몸체 또한 가열되고 온도 신호가 방해된다. 반면에, 도 3b에 도시된 바와 같이 상기 코일이 칩(1) 위에 놓이면, 금속 몸체를 갖는 대물 렌즈(6)가 가열되어 과도한 파워 소실에 이른다. 게다가, 칩(1)의 조작이 불편해지고 가열 효율의 손실이 있다. 따라서 도 3c에 도시된 최종적으로 최적화된 설계는 칩(1)의 바로 주위와 광학 유닛(6) 및 IR 센서(3)로부터 떨어져 위치한 3 회전의 코일로 구성되어 있다. 유도 가열 코일은 칩에 인접하여 배치되고 상기 유도 코일 및 칩(1)간의 거리는 0-10mm으로 다양하다.

형광 검출 유닛

끼워넣어지는 염료(intercalating dye) Sybr 그린을 위하여 최적화된 형광 검출 시스템은 이색성 거울을 사용하여 투사되고 20X 마이크로 범위 대물렌즈(objective)를 사용하여 PDMS 칩(1)에 초점을 둔(focused), 470 nm 파랑 LED 여기 소스로 구성된다. 520 nm에서 방출을 동일한 렌즈를 통하여 수집하였고, 대역통과 필터를 사용하여 필터시켰고, 실리콘 광 다이오드에 초점을 두었다. LED 세기는 190 Hz에 조절시켰고 광 전류를 증폭기 내에 록(lock)을 사용하여 동시적으로 검출시켰다. 시간에 기대어 표시된 매 초마다 얻은 신호는 PCR 동안 연속적인 형광 방출을 주었다.

온도 교정(calibration)

상업적 IR 센서는 검게 칠해진 내장된 히터의 방사율을 위하여 교정되어야 한다. 게다가 내장된 히터로부터 약 0.5mm 떨어져 배치된 반응 챔버(1a)는 더 낮은 온도에 있을 것이다. 따라서 DNA 자체는 교정을 위한 주형 기준으로서 상기 반응 챔버(1a) 내에서 사용하였다. 이는 형광을 사용하여 상기 칩(1) 내에 DNA의 용해점을 확인하고, 용해가 일어나는 곳의 IR 센서(3) 신호를 기록하고, 상업적 PCR 열순환기(thermocycler) 내에서 얻은 실제 용해점과 비교하여 한다. 다른 용해점을 갖은 DNA를 사용하여, 센서 측정값은 실제의 챔버 온도에 교정될 수 있다. 센서에 대하여 동일한 위치에 놓인 유사한 칩(1) 내에서 다음의 반응이 일어난 이후로, 주어진 시스템(A)를 위하여 이는 한번만 행해져야 한다.

신호 공정 및 파워 제어 전자기술

상기 적외선 방사 온도 센서(3)로부터 DC 신호는 정밀 증폭기을 이용하여 완화시키고 아나로그 장치(Analog Devices)로부터 냉접점을 가진 열순환기 증폭기 IC를 이용하여 증폭시켰다. 신호는 PWM 파형을 또한 발생시키는 마이크로제어기의 내장 콤퍼레이터(comparator) 내로 주었다. 또한 PC로부터 설정온도는 USB DAC/ADC 시스템을 사용하여 콤퍼레이터에 주었다. 상기 콤퍼레이터 출력(output)은 MOSFET 드라이버에 의하여 제어되고 상기 출력은 PWM 신호의 형태로 파워 MOSFET으로 보내졌다. 그 이후 트랜지스터를 켜고, 5 볼트 DC로부터 파워를 유도 히터 1차 코일 및 10μF 저손실 콘덴서에 의하여 형성된 공진 회로 내에 공급하였다. USB-DAQ 시스템은 PC에 IR 온도 신호 및 광학 유닛으로부터 형광 신호를 기록한다.

시료 제조

PCR 시료 제조를 2X DyNAmo Sybr 그린 마스터(Master) 혼합물(mix), Taq 폴리머라제, 람다 DNA, PCR 물 및 프라이머들을 이용하여 하였다. 1 마이크로리터의 람다 DNA 주형, 2.5 마이크로리터의 P1 [5-AGT GTCGAA TTC TGA TCG TGG TGA TAT CCG-3], 2.5 마이크로리터의 P2 [5-AGT GTC AAG CCT CAG CTT CAG TTC TCT-3], 1 마이크로리터의 Taq 폴리머라제, 25 마이크로리터의 마스터 혼합물, 및 18 마이크로리터 PCR 물을 가진 50 마이크로리터 혼합물을 제조하여 311 bp의 증폭된 DNA를 생산하였다. 다른 프라이머를 약 600 bp 및 약 1000 bp의 증폭된 람다 DNA를 생산하기 위하여 사용하였다.

비접촉 PCR의 단계적인 실행

비접촉 실시간 PCR 시스템(A)는 내장된 금속 히터(1b)를 가진 실링하여 사용가능한 PDMS 칩(1)을 사용하여 PCR 반응을 작동하고, 다음 단계를 실행하여야 한다:

a.　　　　　PCR 시료는 보통의 벤치-탑(bench-top) 상업적 열순환기 프로토콜에 따라 제조된다. 시료는 주형 DNA, 프라이머, dNTPs, Taq 폴리머라제 또는 등가물, 적절한 염 및 PCR 물 중에 버퍼를 포함한다. 또한 시료는 Sybr 그린 또는 Taqman 형광 프로브를 포함한다. DyNAmo 키트 및 이의 등가물과 같은 상업적 마스터 혼합물이 사용될 수 있다.

b.　　　　　포획된 공기를 배출하기 위한 가는 바늘을 가진 깨끗하고 살균된 주사기를 사용하여 반응챔버(1a)를 노즐(1c)로 구멍을 내었다(puncture). 몇몇 경우에 공기 거품이 이 반응을 간섭하지 않기 때문에 이 단계는 선택적이다.

c.　　　　　약 5 내지 10 마이크로리터의 시료가 상단 실링(top sealing)을 통하여 구멍이 나서 PDMS 칩(1)의 반응챔버에 주입시켰다. 이 과정 동안 포획된 공기는 단계 2로부터 구멍난 홀(hole)을 통하여 나오는 노즐(1c)를 향하여 밀었다. 어떠한 잔여 포획된 공기도 노치(notch)에서 작은 거품을 형성하고 그 이후 PCR 반응에 간섭하지 않는다.

d.　　　　　PCR 시료를 가진 PDMS 칩(1)을 유도 히터(2)의 코일 내에 작은 홀더에 놓는다. 상기 홀더 위치를 최적의 가열과 형광 및 어느 반응도 방해하지 않을 필요를 위하여 미리 조절한다.

e.　　　　　광학 헤드를 형광을 수집하기 위한 위치 내로 낮춘다. 상기 헤드의 위치는 최고의 형광 및 어느 반응도 방해하지 않을 필요를 위하여 미리 조절한다.

f.　　　　　일부 설계에서, 상기 광학 헤드는 고정된 반면 상기 시료 홀더는 칩(1)을 배치하고 제거하기 위하여 이동될 수 있다. 최종 위치에서, 광학 렌즈는 PDMS 표면으로부터 어느 정도 밀리미터 떨어져 있다.

g.　　　　　상기 적외선 방사 온도 센서(3)는 상기 시료 홀더 아래 미리 조절된 위치 및 어느 반응도 방해하지 않을 필요를 위하여 둔다. 상기 시료 홀더는 센서에 의하여 수집되는 적외선 방사가 통하는 중앙 홀을 갖는다.

h.　　　　　상기 PDMS 칩(1) 및 광학 헤드(6)가 위치에 놓이고, 명령이 마이크로 컴퓨터를 통하여 소프트웨어 제어기를 실행하기 위하여 주어진다. 또한 반응의 파라미터, 예를 들면 초기 배양 온도와 시간, 변성을 위한 각각의 온도 및 시간을 가진 사이클의 수, 어닐링 및 연장 단계, 및 최종의 연장 온도 및 시간을 상기 소프트웨어 내에 입력시킨다. 그 후 상기 소프트웨어는 각 단계의 온도 및 시간을 제어하는 하드웨어에 명령을 낸다. 각 사이클 동안 형광이 연속적으로 또는 사용자가 정한 시간에 기록된다.

i.　　　　　반응 이후, 시료를 상온까지 식힌다. 상기 PDMS 칩(1)은 상기 홀더로부터 이제 제거될 수 있다.

j.　　　　　시간의 함수로서 형광 및 온도의 데이터를 상기 소프트웨어로부터 회수하고 분석할 수 있다.

결과

QuickField 2-D 전자기의 시뮬레이터에 의하여 결정된 얇은 금속 판 주위에 작은 코일에 의하여 발생된 자기의 유속 밀도는 도 4에서 보여준다.

시뮬레이션을 위하여, 상기 코일은 전도도 5.88 x 10⁷ S/m 의 1 mm 직경 구리 와이어를 가진 두개의 와이어 10 mm 직경 루프로 이루어져있다. 히터는 전도도 1 x 10⁷ S/m의 8mm 직경 0.4mm 굵은 니켈 디스크이고 주파수는 50 KHz이었다. 도 5에 도시된 바와 같이 자기장으로부터 떨어져, 구리 코일(1차) 및 히터 디스크(2차) 내에서 소산된 파워는 또한 다른 히터 재료, 예를 들면 스테인리스 강(SS), 알루미늄(Al) 및 구리(Cu)를 위하여 주파수의 함수로 계산되었다.

1차(코일) 내에서 소산된 파워는 상대적으로 재료에 독립적이고 주파수에 따라 증가함이 관찰된다. 반면에, 히터 내에서 소산된 파워는 낮은 주파수에서 Al 및 높은 주파수에서 스테인리스 강(SS)이 가장 컸다. 그러나 전환 트랜지스터에서 소산된 파워는 높은 주파수에서 증가해서 알루미늄 히터를 가진 약 130 KHz의 최적의 주파수가 PCR 실험으로 선택되었다. 최적의 히터 기하학적 구조는 두께 0.38 mm, 직경 7.14 mm 및 가장 높은 적외선 방사율을 위하여 바닥 면에 검정으로 칠해진 Al 시트로 구성되었다.

온도 교정은 칩(1) 및 상업적 열순환기(MJ 리서치, 미국) 내에 로딩된 폴리프로필렌 튜브 내의 세가지 다른 DNA 즉 람다 300bp, 600bp 및 1000bp의 용해 곡선을 비교함으로써 수행되었다. 약 5 마이크로리터가 로딩되었고 온도는 어닐링(54 oC)으로부터 변성(90 oC)까지 늘렸다.

도 6은 얻은 용해 곡선을 보여주고 표 1은 PDMS 칩(1) 내에 DNA 의 용해점에서 IR 센서(3) 측정값(reading)과 상업적 열순환기로부터 읽는 실제 용해점을 비교한다.

표 1: 다른 람다 DNA 시료를 위한 튜브(교정된 열전대) 및 칩(교정되지 않은 IR 센서)로부터 용해점.

두가지 밝혀진 교정 곡선 사이의 리니어핏(linear fit) 및 IR 센서(3) 측정값을 다음 PCR 실험을 위한 반응 챔버(1a) 내의 시료의 진정한 온도를 표시하도록 교정시켰다. 칩 내 로딩된 5 μL를 위한 프로토콜은 96 도에서 60 초 동안 초기의 변성 단계 다음, 18 사이클 동안 변성(15초 동안 96 도), 어닐링(15초 동안 48 도), 및 연장(100초 동안 72 도) 단계 및 300 초동안 72도에서 최종의 연장으로 이루어졌다. 도 7은 비접촉 IR 센서(3)로부터 피드백을 가진 온-오프식의 히터 제어에 의하여 유지된 온도 프로파일을 보여준다. 변성 및 어닐링 단계 사이를 전환할 때 작은 약 5 W 팬이 쿨링 속도를 향상시키기 위하여 사용되었다는 점을 주목하라.

도 8은 상업적 열순환기를 사용하여 폴리프로필렌 튜브에서 수행된 비슷한 실험을 가진 PDMS 칩 내에300 bp 람다 DNA의 증폭으로부터 실시간 형광 신호를 보여준다.

증폭은 재현 가능하게 모든 DNA 시료(300 bp, 600 bp and 1000 bp)로부터 얻을 수 있었다. 증폭 후, 용해 곡선 분석을 도 9에 도시된 바와 같이 동일한 칩에서 수행시켰다. 또한 상업적 열순환기를 사용하여 튜브에서 증폭되었으나, 또 다른 PDMS 칩에서 로딩된 유사한 DNA 시료로부터 얻은 용해 곡선이 보인다. PDMS 장치에서 작동된 두 용해는 다른 사이클 수로 인하여 작은 차이점과 함께 거의 동일하였다.

산업상 이용가능성:

본 개시는 Bio-MEMS 분야, 다시 말하면, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용한 DNA 증폭에 넓은 적용을 갖는다. DNA 증폭은 병원체 검출, 법의학적 조사, 바이오-방어(bio-defense), 음식 및 물 제어, 환경 모니터, DNA 시퀀싱 등을 위한 다양한 형태로 사용된다.

균등물

본 명세서에서 실질적으로 어떠한 복수의 및/또는 단일의 용어의 사용에 관하여, 당해 분야에서 기술을 가진 자는 문맥 및/또는 적용에 적절하게 되는 바와 같이 복수를 단수로 및/또는 단수로부터 복수로 전환할 수 있다. 다양한 단수/복수의 순열은 본 명세서에서 명확성의 목적으로 설명된다.

일반적으로, 당업자에 의하여 본 명세서, 및 특히 첨부된 청구항(예, 첨부된 청구항의 몸체)에서 사용되는 용어는 일반적으로 "개방(open)" 용어로 이해될 것이다(예, 용어 "포함하는(including)"은 "포함하나 이에 제한되지 않는(including but not limited to)으로 해석되어야 하고," 용어 "갖는(having)"은 "적어도 갖는(having at least,)"으로 해석되어야 하고 용어 "포함한다(includes)"는 "포함하나 이에 제한되지 않는다(includes but is not limited to,)"로 해석되어야 한다 등). 도입된 청구항 인용의 특정 수가 의도된다면, 이러한 의도는 명쾌하게 청구항에서 인용되고, 이러한 인용의 부재에서 어떠한 의도도 존재하지 않는다고 당업자에 의하여 더 이해될 수 있다. 예를 들면, 이해에 대한 도움으로서, 다음 첨부된 청구항은 서두의 구 "적어도 일(at least one)" 및 "하나 이상(one or more)"의 사용을 청구항 인용을 도입하기 위하여 포함할 수 있다. 그러나, 이러한 구의 사용은 심지어 동일한 청구항이 도입구 "하나 이상의" 또는 "적어도 하나" 및 "a" 또는 "an"과 같은 부정관사(예, "a" 및/또는 "an"은 전형적으로 "적어도 하나 " 또는 "하나 이상의 "를 의미하는 것으로 해석되어야 한다)를 포함하는 경우, 부정 관사 "a" 또는 "an"에 의한 청구항 인용의 도입은 이러한 도입된 청구항 인용을 포함하는 어떠한 특정 청구항을 오직 하나의 이러한 인용을 포함하는 발명으로 제한하는 것을 시사하는 것으로 해석되지 않아야 한다; 도입된 청구항 인용에 사용되는 부정 관사의 사용을 위하여 동일한 것이 진실을 유지한다.　게다가, 심지어 도입된 청구항 인용의 특정 수가 명쾌하게 인용되면, 당업자는 이러한 인용을 전형적으로 적어도 인용된 수를 의미하는것으로 해석되는 것으로 인식될 것이다(예, 다른 변형 없는 "두 인용,"의 맨 인용은 전형적으로 적어도 두 인용, 또는 두 이상의 인용을 의미한다). 게다가, "적어도 하나의 A, B, 및 C, 등."에 유사한 관습이 사용되는 이러한 예에서, 일반적으로 이러한 해석은 당업자가 관습을 이해하는 뜻에서 의도된다(예, "하나 이상의 A, B, 및 C를 갖는 시스템 "은 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B 함께, A와 C 함께, B와 C 함께, 및/또는 A, B,와 C 함께, 등을 갖는 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는다). "적어도 하나의 A, B, 또는 C, 등"에 유사한 관습이 사용되는 이러한 예에서 "하나 이상의 A, B, 또는 C, 등."이 사용되고, 일반적으로 이러한 해석은 당업자가 관습을 이해하는 뜻에서 의도된다(예, "하나 이상의 A, B, 또는 C를 포함하는 시스템 "은 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B 함께, A와 C 함께, B와 C 단독, 및/또는 A, B, 및 C 함께, 등을 갖는 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는다).　설명서, 청구항, 또는 도에서든지 둘 이상의 대안적 용어를 제시하는 사실상 어느 분리성의 단어 및/또는 구는 용어의 하나, 용어 중 하나, 또는 용어 모두 포함의 가능성이 고려되는 것이 이해되어야 한다는 것은 당업자들에 의하여 더 이해될 것이다. 예를 들면, 구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B."의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 　

다양한 양태 및 구체예는 본 명세서에 개시된 반면, 다른 양태 및 구체예는 당업자에게 명백할 것이다. 본 명세서에 개시된 다양한 양태 및 구체예는 다음의 청구항에 의하여 가리키는 진정한 범위 및 정신과 함께 제한하는 의도가 아닌 예시의 목적이다.

참조 번호:

Claims

시료를 유지시키기 위한 반응 챔버(1a) 및 상기 반응 챔버(1a) 아래에 상기 시료를 가열시키기 위한 내장된(embedded) 금속 히터(1b)를 포함하는 칩(1);
형광을 검출하기 위한 상기 칩(1) 위에 위치한 결합된 LED 드라이버와 광 검출기 증폭기(7)를 포함하는 광학 유닛(6);
상기 칩(1) 주위에 장착되고 상기 금속 히터(1b)에 유도적으로 결합된(inductively coupled) 유도 히터(2);
금속 히터(1a)의 온도를 측정하기 위한 상기 칩(1) 아래에 장착된 적외선 온도 센서(3)로서, 상기 적외선 온도 센서(3)는 신호 조절부(4)와 접속된(interfaced) 적외선 온도 센서(3);
상기 신호 조절부(4)를 통하여 상기 적외선 온도 센서(3)로부터 받은 피드백에 기초하여 상기 유도 히터(2)에로의 파워를 조절하기 위한, 상기 신호 조절부(4) 및 상기 유도 히터(2)와 접속된 제어기(5)를 포함하는 비접촉 실시간 마이크로 폴리머라제 연쇄 반응 [PCR] 시스템(A).
청구항 1에 있어서, 상기 칩은 폴리-디메틸-실록산 [PDMS], 아크릴(acrylic), 프로필렌 및 폴리카보네이트 중의 하나 이상으로부터 선택되는 물질로부터 제조된 것인 시스템.
청구항 1에 있어서, 상기 LED 드라이버와 광 검출기 증폭기(7) 및 상기 펄스 폭 모듈 제어기(5)는 PCR의 다른 파라미터를 모니터하기 위한 데이터 취득 및 제어 시스템(8)과 접속된 것인 시스템.
청구항 1에 있어서, 상기 유도 히터(2)는 코일이고, 상기 코일은 상기 금속 히터(1a)를 유도적으로 가열하기 위하여 상기 칩(1)에 인접하여 위치한 것인 시스템.
청구항 1에 있어서, 상기 제어기(5)는 펄스 폭 변조기, 비례 적분 미분(PID) 제어기 및 ON/OFF 스위치 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 시스템.　
청구항 1에 있어서, 상기 반응 챔버(1)는 시료를 채우는 동안 포획된 공기(trapped air)를 한 측면상에 한정하기 위한 노즐을 갖는 것인 시스템.
칩(1)의 반응 챔버(1a)에 시료를 채우는 단계;
내장된 금속 히터(b)를 사용하여 상기 시료를 가열시키는 단계로서, 상기 내장된 금속 히터(1b)는 유도 히터로부터 열 에너지를 받기 위하여 상기 유도 히터(2)에 유도적으로 연결된 것인 단계;
적외선 온도 센서(3)를 사용하여 상기 금속 히터(1b)의 온도를 측정하는 단계; 및
상기 적외선 온도 센서(3)로부터 받은 피드백에 기초하여 제어기(5)를 사용하여 상기 유도 히터(20)에 대한 파워를 조절하는 단계의 행위를 포함하는 비접촉 실시간 마이크로 폴리머라제 연쇄 반응 [PCR] 시스템을 작동시키는 방법,
청구항 7에 있어서, 상기 포획된 공기는 상기 시료를 채우기 전에 상기 칩(1)의 일 말단에 제공된 노즐을 통하여 상기 반응 챔버(1a)로부터 나오는(flush out) 것인 방법. 　　
청구항 7에 있어서, 상기 형광은 결합된 LED 드라이버와 광 검출기 증폭기(7)를 포함하는 광학 유닛(6)을 사용하여 검출되는 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 폴리머라제 연쇄 반응의 다른 파라미터 모니터링은 데이터 취득 및 제어 시스템(8)을 사용하는 것인 방법.　　
청구항 7에 있어서, 상기 열 공급은 유도 히터(2)로부터 상기 금속 히터(1a)로 전자기 유도 공정에 의한 것인 방법.
DNA 증폭, DNA 추출, 세포 분석 및 화학적 분석/합성의 하나 이상으로부터 선택되는 바이오-멤스(BIO-MEMS) 응용(applications)에 사용되는 것인 청구항 1에 따른 시스템.