JP2013524832A - 非接触リアルタイムマイクロポリメラーゼ連鎖反応システムおよびその方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示の態様は、非接触リアルタイムマイクロポリメラーゼ連鎖反応(PCR)システムに関し、より詳細には、態様は、密封された反応チャンバーおよび赤外温度感知を有する誘導的に加熱されたチップを有するPCRシステムに関する。
分子生物学において、PCRは、単一または数コピーのデオキシリボ核酸(DNA)の断片を数オーダーの規模で増幅する技術であり、数百万コピーの特定のDNA配列を生成する。この方法は、温度サイクリング、すなわち試料の連続的な加熱および冷却に基づく。PCRが進行するに従い、生成されたDNA自体が、複製のための鋳型として用いられる。PCRは、25〜30回繰り返される加熱および冷却の3つの主要な段階を含む。各サイクルは、(i)すべての二本鎖が一本鎖DNAに融解する、〜94度での変性、(ii)両プライマーが一本鎖の鋳型と対になる、より低い温度である〜54度でのアニーリング、および(iii)鋳型に相補的な塩基を付加することによりポリメラーゼがプライマーを伸長する、〜72度での伸長が含まれ、このようにして、各鋳型につき二本鎖DNAが2コピー生成される。
本開示の1つの目的は、誘導加熱器および赤外放射温度感知器を有する非接触リアルタイムマイクロポリメラーゼ連鎖反応(PCR)システムを提供することである。
本開示の1つの目的は、反応チャンバーおよび埋め込み金属加熱器を有するチップを有する非接触リアルタイムマイクロポリメラーゼ連鎖反応(PCR)システムを提供することである。
本開示において請求されるシステムを提供することにより、先行技術の欠点が克服され、そしてさらなる利点が提供される。
本開示の技術を介して、さらなる特徴および利点が理解される。本開示に係る他の態様および側面は本明細書に詳細に記載されており、これらは請求される開示の一部であると考えられる。
本開示の一態様において、LED駆動および光検出増幅器およびパルス幅変調制御器は、PCRの種々のパラメータを観測するためのデータ獲得および制御システムと連動する。
本開示の一態様において、制御器(5)は、パルス幅変調器、線形積分微分型(PID)制御器およびオン/オフ切替器の少なくとも1つから選択される。
本開示の一態様において、反応チャンバーは、一側にノズルを有し、試料を充填する間に閉じ込められた空気を漏らさない。
本開示の一態様において、LED駆動と光検出とが関連した増幅器を含む光ユニットを使用して、蛍光を検出する。
本開示の一態様において、データ獲得および制御システムを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応の異なるパラメータをモニターする。
前述の概要は単に説明するためのものであって、いかなる限定をも意図しない。前記の説明的な側面、態様、および特徴に加えて、さらなる側面、態様、および特徴は、以下の図面および詳細な説明を参照することにより明らかとなるであろう。
本開示の新規な特徴および特性は、添付の請求の範囲に記載されている。しかし、本開示自体、ならびに使用の好ましい様式、そのさらなる目的および利点は、添付の図と併せて読むと、説明的な態様に係る以下の詳細な記載を参照することにより最も良く理解されるだろう。同じ参照番号は同じ構成要素を示す添付の図を参照して、例示のみの目的で、1または2以上の態様が今、記載され、そしてそこにおいて:
以下の本開示の詳細な記載がより良く理解されることを目的として、前述のものにより、本開示の特徴および技術的利点の要点を広く概説した。本開示の請求の範囲の主旨を形成する本開示のさらなる特徴および利点が、本明細書において記載されるであろう。本開示と同じ目的を実行するために、他の構造を修飾または設計するための基礎として、開示される概念および具体的な態様を容易に利用してもよいことが、当業者に理解されるべきである。このような均等の構造が、添付の請求の範囲に記載された本開示の精神および範囲から逸脱していないこともまた、当業者に理解されるべきである。さらなる目的および利点とともに、その機構および操作方法の両者に関して、本開示の特性であると考えられる新規な特徴は、添付の図面と関連して考慮すると、以下の記載から、より良く理解されるだろう。しかし、各図が単に説明および記載のみの目的で提供されていること、および本開示の限定の定義として意図させることがないことが、明確に理解されるべきである。
図1は、非接触マイクロPCRシステム(A)を説明する例示的な態様である。このシステムは、誘導加熱器(2)と誘導的に連結された埋め込み金属加熱器(1b)を有するPDMSチップ(1)を含む。赤外放射温度感知器(3)は、チップ(1)の底部から、加熱器(1a)温度を測定する。温度信号を設定値と比較して、PWMオン−オフ制御回路(5)により誘導加熱器(2)への電力を調節する。関連するLED駆動および光検出が増幅器(7)を有する光ピックアップユニット(6)は、チップ(1a)の上方に配置され、蛍光を検出する。光検出の増幅器(7)およびPWMオン−オフ制御回路(5)は、データ獲得および制御システム(8)と連動している。データ獲得および制御システム(8)は、ポリメラーゼ連鎖反応のパラメータをモニターする内臓プログラムを有する。個々のサブシステムのさらなる詳細については以下のとおりである。
図2a〜2cは、PDMSチップ(1)の製造に含まれる段階を説明する例示的な態様である。チップ(1)の上半分は、レプリカ成形技術を使用して製造された反応チャンバー(1a)からなる。まず原版を設計し、SU−8とフォトリソグラフィとを使用して製造した。2インチのシリコンウェハ上にネガ型のフォトレジスト[SU8 2150]を、1000rpmで30秒間スピンコートした。ソフトベーク後、2分間のUV露光によって、フォトマスク上のパターンを、SU8で被覆したシリコンウェハに転写した。露光したパターンをポストベークし、30分間現像した後、ハードベークした。チップ(1)の上半分を得るために、10:1のPDMSを原版に注ぎ、ベークし、剥がした。反応チャンバー(1a)の容積は約5μL[直径3mmおよび高さ600μm]である。、円形チャンバーは、一側にノズル(1c)を有し、充填の間に、捕捉した空気を閉じ込める。薄い円形金属シートからなるチップ(1)の下半分は、PDMSに埋め込まれた。金属ディスクを疎水性のスライドガラス上に注がれたPDMSの薄層へと浸すだけで、これを製造した。セ氏90度での2時間のハードベークののち、断片を切断し、スライドから剥がした。最後に、PDMSの上半分および下半分を空気プラズマに2分間曝露し、軽く圧迫しながら接触させて、セ氏90度で30分間オーブンで加熱することにより、不可逆的に接合した、埋め込み反応チャンバー(1a)および加熱器(1b)を有するPCRチップ(1)が得られた。
所定の一次コイルに関し、二次のものへと結合される電力は、周波数、金属の抵抗率および幾何学的寸法(直径および厚さ)に依存する。寸法が大きいほど、結合する電力は向上するであろうが、増大した熱質量のため受動的冷却速度が低下する。周波数が高くなるほど、良好な加熱効率がもたらされるが、これにより電力トランジスタにおけるスイッチング損失が代償とならなければならない。様々な厚さの異なる商業的に入手可能な鋼鉄、銅およびアルミニウムの金属シートを試し、シミュレーションを行い最も良好なスイッチング周波数を決定した。蛍光信号の集光を改善するためにシートの上面を研磨する一方で、赤外放射温度感知器(3)による最も良好な温度検出のために底面を黒く被覆することが重要である。
赤外検出器(3)は、直径〜7mmの放出表面の温度を正確に感知するために、〜2mm以内に配置しなければならない。よって、チップ(1)の直下にそれを配置する。
インターカレート染料Sybr Greenに対して最適化された蛍光検出システムは、470nm青色LED励起源からなり、ダイクロックミラーを使用して投影され、20×顕微鏡対物を使用してPDMSチップ(1)に焦点を合わせた。同じレンズを介して520nmの発光を集光し、バンドパスフィルターを使用してフィルターを掛け、シリコンフォトダイオードに焦点を合わせた。LED強度を190Hzに変調し、増幅器のロックを使用して光電流を同調的に検出した。時間に対してプロットする場合において毎秒ごとに獲得される信号により、PCRの間の連続的な蛍光がもたらされた。
市販のIR感知器は、黒く塗られた埋め込み加熱器の放射率に対し較正する必要がある。加えて、反応チャンバー(1a)は、加熱器(1b)から〜0.5mm離して配置され、より低い温度であるだろう。したがって、DNA自体を、較正用の温度標準として反応チャンバー(1a)内で使用した。蛍光を使用してチップ(1)内のDNAの融点を同定し、この融解が発生した時点のIR感知器(3)の信号を記録し、それを市販のPCRサーモサイクラーで得られた実際の融点と比較することにより、これを行う。異なる融点を有するDNAを使用することにより、感知器の示数を実際のチャンバー温度に対して較正することができる。所定のシステム(A)では、これを一度しか行う必要がない。なぜなら、後続反応も、前記感知器に対して同じ場所に配置された同様のチップ(1)内で起こるからである。
赤外放射温度感知器(3)のDC信号を、精密オペアンプ(op-amp)を使用して緩和し、Analog Devicesからの冷接点補償を有する熱電対増幅ICを使用して増幅した。PWM波形もまた生成するマイクロ制御器の内蔵比較器にその信号を送った。PCからの設定温度もまた、USB DAC/ADCシステムを使用して比較器に送った。比較器の出力をMOSFETドライバーにより制御し、該出力をPWM信号の形式で、パワーMOSFETに送る。その後、該トランジスタをオンに切り替え、5ボルトDCからの電力を、誘導加熱器一次コイルと10μF低損失コンデンサとにより形成された共振回路に供給した。USB−DAQシステムは、PC上にIR温度ならびに光ユニットからの蛍光信号を記録する。
2×DyNAmo Sybr green Masterミックス、Taqポリメラーゼ、ラムダDNA、PCR水およびプライマーを使用して、PCR試料の調製を行った。1マイクロリットルのラムダDNA鋳型、2.5マイクロリットルのP1[5−AGT GTCGAA TTC TGA TCG TGG TGA TAT CCG−3]、2.5マイクロリットルのP2[5−AGT GTC AAG CCT CAG CTT CAG TTC TCT-3]、1マイクロリットルのTaqポリメラーゼ、25マイクロリットルのMasterミックス、および18マイクロリットルのPCR水を用いて、50マイクロリットルのミックスを調製し、311bpの増幅DNAを産生した。異なるプライマーを使用し、〜600bpおよび〜1000bpの増幅ラムダDNAを産生した。
非接触リアルタイムPCRシステム(A)においては、埋め込み金属加熱器(1b)を有する、密封の使い捨てのPDMSチップ(1)を使用してPCR反応を実行するところ、以下の工程を実行する必要がある:
a.標準的な卓上の市販サーモサイクラープロトコルに従い、PCR試料を調製する。試料には、PCR水に鋳型DNA、プライマー、dNTP、Taqポリメラーゼまたは均等物、適切な塩および緩衝剤が含まれる。また、試料には、Sybr GreenまたはTaqman蛍光プローブも含まれる。DyNAmoキットなどの市販のマスターミックスおよびその均等物を使用することができる。
b.細針付きのクリーンでありかつ滅菌されたシリンジを使用して、ノズル(1c)の位置で反応チャンバー(1a)に穴を開け、閉じ込められた空気を放出する。場合によっては、気泡は反応に干渉しないため、この段階は任意である。
d.PCR試料を有するPDMSチップ(1)を、誘導加熱器(2)のコイル内の小さな保持器に配置する。保持器の位置は最適な加熱および蛍光のために予め調整され、そしていかなる反応に対しても妨げられる必要がない。
f.いくつかの設計において、光ヘッドは固定されるが、チップ(1)を配置および取り外すために、試料保持器を移動することができる。最終位置において、光学レンズはPDMS表面から数ミリメートル離れている。
h.PDMSチップ(1)および光ヘッド(6)を適切な位置に置いた後、マイクロコンピュータにソフトウェア制御器を実行するための指令を与える。また、反応のパラメータ、すなわち最初のインキュベーション温度および時間、変性、アニーリングおよび伸長の段階のためのそれぞれの温度でのサイクル数および時間ならびに最後の伸長温度および時間も、ソフトウェアに入力する。その後、ソフトウェアから、各段階の温度および時間を制御するハードウェアへと指令が送られる。蛍光は、連続的に、または各サイクル間におけるユーザーが決定した時間においてのいずれかで記録する。
j.時間の関数としての蛍光および温度のデータをソフトウェアから回収し、分析することができる。
QuickField 2-D電磁シミュレータにより決定される、金属薄板周囲の小さいコイルにより生成された磁束密度を図4に示す。
このシミュレーションに関し、このコイルは、伝導率5.88×107S/mの直径1mmの銅針金での2線の直径10mmのループからなる。加熱器は、伝導率1×107S/mの8mm直径、0.4mm厚さのニッケルディスクであり、周波数は50KHzであった。磁場とは別に、銅コイル(一次)では電力が消散し、そして加熱ディスク(二次)についても、図5に示されるように、周波数の関数として異なる加熱材料、すなわち、ステンレス鋼(SS)、アルミニウム(Al)および銅(Cu)に対し算出された。
図6は得られた融解曲線を示し、そして表1はPDMSチップ(1)内のDNAの融点でのIR感知器(3)の示数を、市販のサーモサイクラーからの読み取りとしての実際の融点と比較するものである。
すべてのDNA試料(300bp、600bpおよび1000bp)に関して、増幅を再現的に獲得できた。増幅後に、融解曲線分析を、図9で示すように同じチップ内で実施した。もう1つのPDMSチップにロードしたが、市販のサーモサイクラーを使用してチューブで増幅した同様のDNA試料から得られた融解曲線もまた示す。PDMS装置での2つの融解実行は、サイクル回数の違いによる小さな差異を有するものの、ほとんど同一であった。
本開示はBio−MEMS分野において、すなわちポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用するDNA増幅において、広範な適用を有する。DNA増幅は、病原体検出、法医学捜査、生体防御、食糧および水の管理、環境モニタリング、DNA配列決定などの様々な形態で使用される。
本明細書中の複数形および/または単数形の用語の実質的にいずれの使用に関して、当業者は、文脈および/または用途に適切であるように、複数形から単数形へとおよび/または単数形から複数形へと置き換えることができる。さまざまな単数形/複数形の置換が、明確さのために、本明細書中に明示的に記載されてもよい。
Claims (12)
- 試料を保持するための反応チャンバー(1a)および該反応チャンバー(1a)の下方に前記試料を加熱するための埋め込まれた金属加熱器(1b)を有するチップ(1);
前記チップ(1)の上方に配置される、関連するLED駆動および光検出増幅器(7)を含む、蛍光を検出するための光ユニット(6);
前記チップ(1)の周囲にマウントされ、および金属加熱器(1b)と誘導的に結合した誘導加熱器(2);
前記チップ(1)の下方にマウントされる、前記金属加熱器(1a)の温度を測定するための赤外温度感知器(3)、ここで該赤外温度感知器(3)は信号調整器(4)と連動する;ならびに
前記信号調整器(4)を介して前記赤外温度感知器(3)から受信されるフィードバックに基づき、前記誘導加熱器(2)への電力を調節するための、該信号調整器(4)および該誘導加熱器(2)と連動した制御器(5)
を含む、非接触リアルタイムマイクロポリメラーゼ連鎖反応[PCR]システム(A)。 - チップが、ポリ−ジメチル−シロキサン[PDMS]、アクリル、プロピレンおよびポリカーボネートの少なくとも1つから選択される材料から製造される、請求項1に記載のシステム。
- LED駆動および光検出増幅器(7)ならびにパルス幅変調制御器(5)が、PCRの種々のパラメータをモニターするためのデータ収集および制御システム(8)と連動する、請求項1に記載のシステム。
- 誘導加熱器(2)がコイルであり、金属加熱器(1a)を誘導的に加熱するために該コイルがチップ(1)の近傍に位置する、請求項1に記載のシステム。
- 制御器(5)が、パルス幅変調器、線形積分微分型(PID)制御器およびオン/オフ切替器の少なくとも1つから選択される、請求項1に記載のシステム。
- 反応チャンバー(1)が、一側にノズル(1c)を有し、試料の充填の間に閉じ込められた空気を漏らさない、請求項1に記載のシステム。
- 非接触リアルタイムマイクロポリメラーゼ連鎖反応[PCR]システムの操作方法であって、
チップ(1)の反応チャンバー(1a)へと試料を充填すること;
埋め込み金属加熱器(1b)を使用して前記試料を加熱すること、ここで該埋め込み金属加熱器(1b)は、誘導加熱器(2)からの熱エネルギーを受け取るために、該誘導加熱器(2)と誘導的に連結している;
赤外温度感知器(3)を使用して前記金属加熱器(1b)の温度を測定すること;および
前記赤外温度感知器(3)から受信したフィードバックに基づき、制御器(5)を使用して前記誘導加熱器(2)への電力を調節すること
の行為を含む、前記方法。 - 試料を充填する前に、チップ(1)の一端に提供されたノズルを介して、反応チャンバー(1a)から、閉じ込められた空気を追い出す、請求項7に記載の方法。
- 関連するLED駆動および光検出増幅器(7)を含む光ユニット(6)を使用して蛍光を検出する、請求項7に記載の方法。
- データ獲得および制御システム(8)を使用してポリメラーゼ連鎖反応の異なるパラメータをモニターする、請求項7に記載の方法。
- 電磁誘導工程により誘導加熱器(2)から金属加熱器(1a)へ熱を供給する、請求項7に記載の方法。
- DNA増幅、DNA抽出、細胞分析および化学分析/合成の少なくとも1つから選択されるBIO−MEMSアプリケーションで使用される、請求項1に記載のシステム(A)。
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