CN107921399A - 光腔pcr - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于基于PCR快速、准确、可靠诊断的LED驱动光腔PCR系统和方法。PCR热循环使用包括两个光吸收金属(AU)薄膜的光腔，以实现均匀的光吸收及后续光热的光到热转化。

Description

光腔PCR
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背景技术
1.技术领域
本发明主要涉及核酸扩增系统，更具体地，涉及用于医疗诊断和生命科学的聚合酶链反应(PCR)热循环系统。
2.背景讨论
由于埃博拉病毒病(EVD)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)及人感染禽流感A型(H7N9)病毒等致命疾病的全球爆发，亟需快速准确的诊断。聚合酶链反应(PCR)是许多医疗诊断测试的“黄金标准”，已经成为临床实验室、环境科学、法医学和农业科学领域的重要技术。由于基于Peltier的加热块热质量较大，且加热块与塑料PCR管之间的热传递较慢，PCR通常需要2或3个独立温度之间的多次循环，因而每次扩增耗时至少1个小时。然而，在例如传染性疾病的时间敏感诊断、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)及在护理点(point-of-care，POC)水平的败血症等应用中，非常需要快速/超快PCR，因为快速治疗周转时间(TAT)不仅可以降低死亡率，还可以减少疾病在不知不觉间传染给他人的严重风险。
使用空气加热/冷却及毛细管或直接电阻加热的商业PCR系统可以在10分钟内执行30次热循环。但是，由于这种系统功耗较大(最高可达800-1000W)且较重(超过20kg)，通常不适用于POC测试。对于有限资源环境下的POC测试，如在发展中国家或野外实验室，快速/超快PCR系统应当敏感、可选择、便携、稳健、简单、便于使用且具有通过微型化和集成化实现低功耗的特点。
为了满足这些要求，已经对用于快速/超快PCR系统的微流体方法进行了广泛研究，以通过减少样本体积(即热质量)来缩短扩增时间，允许快速热传递，进而在低功耗的情况下加快热循环。静态微流体PCR热循环最常用的方法就是用微构造薄膜加热器和电阻温度检测器(RTD)进行电阻加热。虽然功耗相对较低，但该方法需要复杂的制造工艺将薄膜加热器和RTD集成在芯片上。
由于加热和冷却速率快，Peltier加热块也广泛用于静态及连续流PCR，但需要更大的功耗。对于连续流PCR，在反应样本通过分立的温度区域时发生PCR扩增。这种方法可以产生比静态PCR更快的热循环，但通常需要外部注射泵进行流量控制，并且缺乏改变循次数的能力。另一种方法包括使用红外激光器或白炽灯对用于PCR热循环的PCR混合物进行红外光(IR)介导非接触选择性加热，这利用了水在1000nm以上波长范围内的强红外吸收。但是，随着PCR混合物的体积从纳升增加至微升，由于PCR溶液的快速加热和冷却的限制，总热循环时间也从约5分钟增加至约40分钟。
因此，本发明的一个目标是一种用于POC测试的快速/超快PCR系统，所述PCR系统敏感、可选择、便携、稳健、简单、便于使用且具有通过微型化和集成化实现低功耗的特点。
发明内容
一方面，本发明提供一种由发光二极管(LED)驱动的光腔PCR系统及方法，用于快速、准确、可靠的基于PCR的诊断。包括构造为实现均匀的光吸收及后续光热的光到热转化的两个金属(如Au)薄膜的光腔以用于PCR热循环。模拟结果显示，整个750μm厚的腔的温度差在94℃(变性)和68℃(退火/延展)时分别小于2℃和0.2℃。根据本发明的光腔PCR展现出优异的温度精确性，在循环之间的温度变化小于1℃，并且由于Au薄膜热质量小、热导率高，能够在4分钟内完成从94℃到68℃的30次PCR热循环。使用本发明的LED驱动光腔PCR方法，显示核酸(c-MET cDNA)的扩增在15分钟内达到最低模板DNA浓度10-8ng μL-1(2个副本/μL)。
本发明接下来的部分将介绍本技术的其它方面，其中，详细描述的目的在于充分披露本技术的优选实施例，而非对其进行限制。
附图说明
结合以下仅旨在说明的附图，可以更充分地理解本文所描述的技术：
图1A示出用于通过聚合酶链反应(PCR)进行核酸扩增的光腔透视图，为了更清楚，光腔的腔顶层和腔中层部分移除。
图1B是图1A所示光腔中的光吸收的示意性侧视图。
图1C示出图1A所示光腔通过聚合酶链反应(PCR)进行核酸扩增的示意图。
图2A示出具有LED光源的图1所示光腔PCR设备的示意性透视图。
图2B示出图2A所示LED驱动光腔PCR设备的示意性侧视图。
图3示出图1A所示光腔的分层放大侧视图。
图4A-4D示出用于仅底部加热和腔(顶部和底部)加热的750μm厚的光学PCR室内计算的温度分布图像。
图5示出PCR室沿图4A-4D中白色箭头的温度曲线图。
图6示出沿本发明光学PCR室的z轴(x轴上的0μm)的温度差异图，其作为PCR室高度的函数。
图7示出使用LED驱动光腔在不同室高度从94℃到68℃的30次PCR热循环的示意温度曲线。
图8A示出本发明的光腔PCR设备在不同室高度的30次热循环的总反应时间。
图8B示出30次PCR循环的平均速率及不同室高度的样本标准偏差。
图8C示出在不同室高度的30次热循环过程中，94℃(变性)和68℃(退火/延展)时的测量温度分布。
图8D示出热循环过程中两个位置之间的温度曲线对比。
图9A示出来自台式热循环仪的2％琼脂糖胶图像与在95℃至68℃时具有不同循环次数的本发明光腔PCR设备(具有750μm厚的PCR腔)的对比图。
图9B示出具有不同初始模板DNA浓度的本发明PCR设备的2％琼脂糖胶图像。
图10示出台式热循环仪与本发明光腔PCR设备总反应时间的对比归纳图。
具体实施方式
以下详细说明的实施例涉及一种用于加热PCR混合物或类似物质的光腔(光腔PCR)。在典型的PCR感测过程中，PCR混合物通常经多次加热冷却循环以影响PCR反应。因此，快速均匀地加热目标样本(如PCR混合物)对于POC测试来说大有益处。虽然以下详细说明的实施例是针对基于PCR的感测，应当理解的是，本发明的光腔可以并入需要快速均匀加热样本的任意工艺一起使用。
1.光腔PCR构造
图1A示出PCR感测设备10一个实施例的透视图，其包括光腔20，用于通过聚合酶链反应(PCR)进行核酸扩增，为了更清楚，光腔20的腔顶层和腔中层部分移除。图1B是光腔20的示意性侧视图，其示出光吸收及通过聚合酶链反应(PCR)进行的相应核酸扩增。
在一个实施例中，光腔20包括两个相对的薄膜片或层(下薄膜22a和上薄膜22b)，其间隔分开以限定微流体热循环室24的壁，在下文中，当用于保持PCR混合物以进行基于PCR的测试的特定实例时，热循环室24被称为“PCR室”。薄膜22a和22b优选包括光吸收材料或以其它方式构造为以某种方式吸收光，从而提供薄膜的快速均匀加热。下薄膜22a和上薄膜22b分别沉积在相应的下基底层18和上基底层14上。例如，光腔20可以包括单个热循环室24，或用于多重扩增的室阵列。
在优选实施例中，薄膜22a和22b中的一个或多个包括Au。但是，可以替代性地使用其它材料或组合物，如银(Ag)、镍(Ni)、钛(Ti)、铬(Cr)、锗(Ge)、钯(Pd)、钌(Ru)、钨(W)、铱(Ir)、铂(Pt)等金属及由上述金属组成的任意合金，或由上述金属或其组合构成的多层金属结构。
此外，薄膜片22a和22b可以包括非金属吸光材料，包括石墨、石墨烯、碳纳米管(CNTs)、涂料等。
在另一实施例中，下薄膜22a和上薄膜22b中的一个或多个可以图案化，以通过共振增加光吸收。图案化薄膜可以形成在平坦聚合基底14、18上，并且包括以一个或多个柱阵列、1D或2D栅格、光子晶体、半球等形式存在的2D或3D微结构或纳米结构。
腔中层16设置在下基底层18和上基底层14之间，以限定光腔20的厚度。在优选实施例中，下基底层18和上基底层14分别包括丙烯酸玻璃等透明聚合物，如允许光透射的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或类似物质。
根据优选实施例，下基底层18和上基底层14优选包括透明或半透明组合物，以允许光穿过并到达光腔20。虽然整个说明书中详细描述了下基底层18和上基底层14一般包括PMMA，应当理解的是，这种材料选择仅为示例目的，并且可以选择任意数量的聚合材料或半透明/透明材料作为薄膜的平台。下基底层18和上基底层14也可以包括2D或3D微结构或纳米结构，微结构或纳米结构可以包括一个或多个柱阵列、1D或2D栅格、光子晶体、半球或其它图案化或随机的结构(未示出)。在一个实施例中，下基底层18和上基底层14包括位于阱表面的纳米等离子结构或纳米等离子反馈激光腔，阱构造为在出现纳米等离子结构的共振波长且持续时间导致对纳米等离子结构的等离子光热加热时被照亮。
如图1A所示，一对端口25a、25b通过上基底层14和腔中层与光腔20连通。端口25a、25b允许分配标本或样本(如PCR混合物)。在一个实施例中，PCR混合物注入第一端口25a内，从而使PCR混合物填充PCR室24。第二端口25b允许将空气推出室，直到PCR混合物密封整个室并且也从第二端口25排出。可以使用一个或多个流体阀和/或流体控制设备(均未示出)促进填充PCR室24。
图1B示出用于通过聚合酶链反应(PCR)进行核酸扩增的光腔20内的光吸收示意图。当光以初始强度I0照射穿过下基底层18(如PMMA)时，光被下薄膜22a反射(R1)、吸收(A1)和透射(T1)。之后，透射光(T1)穿过室24，同样被上薄膜22b反射(R2)、吸收(A2)和透射(T2)。薄膜22a和22b作为用于PCR热循环的等离子光热光到热转化器。吸收光A1、A2促进用于PCR热循环的薄膜(如Au)原子的光热加热。
图1C示出在加热薄膜时发生的变性、退火/延展，以及复制(扩增)阶段的PCR过程的实施例。
在第一步骤(1)中，该过程包括持续用光照射薄膜22a和22b特定时间，这影响薄膜22a和22b的均匀光吸收量并伴随着薄膜22a和22b的加热，从而在第一时期内将室24内的流体样本(如PCR混合物)提升至选定温度，影响PCR混合物的变性。
在第二步骤(2)中，再次用输入光持续照射薄膜22a和22b特定时间，从而在第二时期内将室24内的流体样本(如PCR混合物)提升至选定温度，影响PCR混合物的退火/延展。
在第三步骤(3)中，再次用输入光持续照射薄膜22a和22b特定时间，从而在第三时期内将室24内的流体样本(如PCR混合物)提升至选定温度，影响PCR混合物的复制/扩增。
在一个实施例中，上述三个步骤重复大约30-40次循环。
基于该模型，用方程式1和2给出Au膜1和2的总吸收：
其中，I0是来自LED的初始光强度，A1(和A2)、T1(和T2)及R1(和R2)分别是薄膜22a(和22b)的吸收率、透射率和反射率。
为了实现最均匀温度分布及最大的总光吸收(∑A膜1+∑A膜2)，Au膜的厚度优化为在两个薄膜上均具有均匀光吸收(∑A膜1＝∑A膜2)。首先，Au薄膜22a、22b在LED发射波长内的平均透射率、反射率和吸收率用不同厚度的Au薄膜的测量吸收光谱和LED发射光谱计算。(参见表2)。之后，为表1所示的不同上下Au厚度组合计算吸收比(∑A膜1/∑A膜2)和总吸收(∑A膜1+∑A膜2)。发现Au薄膜22a厚度为10nm、Au薄膜22b厚度为120nm的组合在吸收比(1.06)和总光吸收(70％)方面都是优选的，在优选构造中，该组合可以作为光腔20的Au薄膜的厚度。
同样应当理解的是，替代材料可以用于对薄膜22a、22b的吸收进行调整。例如，下薄膜22a可以包括比上薄膜22b吸收性更差(透射特征更多)的材料。因此，几何和/或材料组成可以用于对薄膜22a、22b的吸收特性进行调整。
图2A示出具有照明源或光源的光腔PCR设备10的示意性透视图。图2B示出光腔PCR设备10的示意性侧视图。光源被示为设置在平台32(如40mm的圆形冷基底)上的一系列LED34(如在700mA的注入电流时峰值波长为447.5nm，6230mW的7个Luxeon Rebel品蓝LED)，以及用于朝光腔20引导输入光I0的透镜30。替代光源可以包括：激光二极管(LD)、钨灯、荧光灯、卤素灯、汞灯、氙灯、金属卤化物灯或前述的任意组合。还应当理解的是，光源类型的选择和/或输入光I0的波长或强度可以影响薄膜22a和22b的共振频率，从而使薄膜22a和22b的厚度和材料选择可以根据输入光I0的性质变化。
具有K型热电偶28的参考室26放置在光腔20的旁边。参考室26和光腔20构造为在透镜30的焦距处由输入光束I0的束腰(例如，)覆盖，以确保光腔20和参考室26接收相同强度的光，从而使光热加热以相同速率发生。光腔20和参考室26均设置在透镜30的焦距处(例如，在本构造中为距离透镜顶表面25mm处)以获得最高的光吸收。在一个实施例中，透镜30包括聚合光学器件7单元群聚光学集中器件(Polymer Optics 7Cell ClusterConcentrator Optic)阵列。
应当理解的是，图2A的构造中采用参考室26的目的在于提供室内温度的参考。但是，在用于POC测试的优选构造中，本发明的设备可以仅包括光腔20，或多个多路复用光腔或其阵列，而没有参考室26。这种情况下，可以经由温度传感器(未示出)或其它感测装置获取室24的温度反馈。
图3示出光腔分层和基底层的近视图。在一个实施例中，薄膜22a和22b中的每一个均由钝化层23覆盖，以防止金属层或光吸收材料抑制PCR反应。钝化层23可以包括氧化物薄膜、薄聚合物层、薄蛋白质层等。腔中层16具有高度h，并且上PMMA层14和下PMMA层18具有高度hs。在用于测试本发明装置的一个示例性实施例中，hs＝1.4mm，L1＝6mm，L2＝4mm(针对4mm的腔总长)，并且腔厚度h从100μm、200μm、400μm和750μm变化。虽然上述尺寸是一个可能实施例的说明，但应当理解的是，其它构造也是可以预期的。
对于下文中进一步详细描述的测试，美国国家仪器公司(NI)9213 16——具有高速模式、自动归零和冷端补偿的通道热电偶模块(未示出)用于从K型热电偶28准确获取温度。用LED34，80mm的冷却扇(未示出)、源表(未示出)和热电偶28执行温度循环，上述这些均通过LabVIEW程序控制。
在一个实施例中，1mm厚的聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)片用于光腔20的上下基底层14、18，并且用于腔中层16的100、200、400和750μm厚的PMMA片用VersaLASER VL-200激光切割系统(Universal Laser System,Inc.,Scottsdale,AZ,USA)切割。上基底层14在56℃的炉中培养6小时，以允许用激光切割对破坏区域进行退火。PMMA片经UV/臭氧处理10分钟后，下基底层18和腔中层16首先通过140°F、0.2公吨压力下的热粘合结合在一起。之后，底层(与腔室层粘合)和顶层用70％的乙醇清洗两次，共10分钟，然后用去离子(DI)水冲洗并用N2烘干。具有不同厚度(10、20、40、80和120nm)的Au薄膜22a、22b通过2×10-7Torr基准压力下的电子束(E-beam)蒸发沉积在上下PMMA片上。50nm厚的SiO2钝化层通过RF溅射沉积在Au薄膜22a、22b上方，以防止Au薄膜抑制PCR反应。最后，在PMMA片经UV/臭氧处理10分钟后，底层(与腔室层粘合)和顶层粘合在一起，利用140°F、0.2公吨压力下的热粘合形成光腔20的PCR室24。
在一个实施例中，光腔20可以构造为用于实时光腔PCR的PCR反应过程中的激光荧光发射。与传统实时PCR相比，这种构造可以进一步增强实时腔PCR的敏感性。
2.试验结果
a.光腔PCR的温度均匀性模拟。
用COMSOL进行一组热传递模拟以体现PCR热循环过程中光腔20内的温度均匀性。图4A-4D示出用于仅底部加热和腔(顶部和底部)加热的750μm厚的PCR室内计算的温度分布。图4A和4C分别示出当室中央(x轴上的0μm、z轴上的375μm)的温度达到变性温度94℃及退火/延展温度68℃时，在PCR室24内仅底部加热时计算得出的温度分布，图4B和4D示出顶部和底部(腔)加热时计算得出的温度分布。
图4A-4D清楚地说明，与仅加热底部相比，本发明设备的光腔(顶部和底部)加热提供更均匀的温度分布，尤其是在94℃时。图5示出腔整个高度(沿白色箭头)的温度梯度图。仅底部加热在94℃和68℃的温差分别为14.4℃和0.4℃，与之相比，根据本发明的腔加热体现出更好的温度均匀性，温差仅为1.9℃和0.2℃。
参见图6，同样对PCR室高度对温度均匀性的影响进行了研究。随着PCR室的高度降低，由于更窄PCR腔的更小体积可以更有效地进行热传递，在仅底部加热和腔加热的构造中，整个室高度的温差(ΔΤ＝Tmax-Tmin)均有下降。此外，值得注意的是，本发明设备的腔加热在变性温度和退火/延展温度下在所有腔高度均体现出更小的温度差异。因此，采用根据本发明的腔加热允许均匀加热PCR混合物，以高效且可靠地进行核酸扩增。
b.LED驱动光腔PCR热循环仪。
图7示出使用LED驱动光腔在不同室高度从94℃到68℃的30次PCR热循环的示意温度曲线。如图8A所示，30次PCR循环的总时间随着腔高度h的下降而减少，在100μm厚的光腔20的PCR室24中获得最短时间(平均235.5秒)，并且在R2值调整为0.9899时表现出良好线性。
使用热循环结果计算加热速率和冷却速率。如图8B所示，获得30次PCR循环的平均速率和样本标准偏差。最快加热速率和冷却速率，7.50±0.46℃ sec-1和6.35±0.49℃sec-1，来自100μm厚的PCR室24。
图8C示出不同腔高度的30次热循环过程中，在94℃(变性)和68℃(退火/延展)时的测量温度分布。每次PCR循环期间获得的最高和最低温度在94℃时的变化小于1℃，并且在68℃时的变化小于0.5℃，表现出可以匹敌市场上的台式热循环仪的温度准确性。特别地，由于热质量更小且通过50nm厚的SiO2层在Au薄膜与PCR混合物之间快速的热传递，当执行快速循环时，由于台式热循环仪并非设计为用于快速热循环，与台式热循环仪的过冲和下冲(94℃时约为2℃，68℃时约为4℃)相比，腔PCR的过冲和下冲非常小(94℃时为0.85℃，68℃时为0.25℃)。
为了确保位于位置1(参考室26)和2(光腔PCR室24)的两个室以相同速率加热，在两个位置分别设置具有K型热电偶28的参考室26并进行热循环。图8D示出位置1和2之间热循环期间的温度曲线对比，可以清楚地看到，两个位置均接收来自LED的相同光强度，用于Au薄膜的光热加热。
c.用光腔PCR进行核酸扩增。
为了验证本发明的LED驱动光腔PCR系统和方法，展示核酸扩增(c-MET cDNA，肺癌生物指标)。
使用人体HGFR，或c-MET cDNA作为PCR模板。对于具有推荐浓度的传统台式PCR来说，PCR反应包括0.08μL的KAPA2G DNA聚合酶、4μL的5x KAPA2G缓冲液A、0.4μL的dNTP混合物、1μL每个均为正向和反向的c-MET引物(储备溶液10μΜ)、6.7μL的BSA(3％w/v储备溶液，用于10μgμL-1BSA的最终浓度)以及2μL的模板cDNA。加入水以使最终体积为20μL。为了提高快速循环腔PCR内的扩增效率，使用高浓度聚合酶和引物。用于腔PCR的PCR反应包括0.4μL的KAPA2G DNA聚合酶、2μL的5x KAPA2G缓冲液A、0.2μL的dNTP混合物、1μL每个均为正向和反向的c-MET引物(储备溶液100μΜ)、3.3μL的BSA(3％w/v储备溶液，用于10μg μL-1BSA的最终浓度)以及1μL的模板DNA。同样加入水，直到反应达到10μL的最终体积。同样改变c-METcDNA的浓度，使其低至10-8ng μL-1(2个副本/μL)。
利用移液器和第一端口25将PCR混合物上样至光腔20的PCR室24，直到室24另一侧的第二端口25充满流体，从而确保热循环过程中不会形成气泡。两个端口25用PCR密封带密封，以确保不会形成气泡或损失流体。光腔20设置为在顶部与具有120nm厚的Au膜的参考室26对齐，这是实现Au薄膜均匀光吸收和最大总吸收的最优构造。扩增后，将10μL PCR产物(用移液器从腔PCR室收集)和10μL E-Gel上样缓冲液(Invitrogen)的混合物上样至具有SYBR Safe DNA凝胶染色剂(Invitrogen)的E-Gel 2％琼脂糖胶上，并在E-Gel iBasePower System(Invitrogen)中运行，并使用E-Gel Safe Imager Transilluminator拍摄凝胶图像。使用50bp的DNA梯来确定产物的大小。将具有CFX96实时PCR检测系统的Bio-RadC1000TM热循环仪用于参考PCR系统。对于台式，在20μL体积中进行PCR，对于不同室厚度的腔PCR，在5μL和10μL体积中进行。除c-MET cDNA之外，λ-DNA同样用作PCR的模板，用于初始腔PCR优化。用Z-TaqTM DNA聚合酶扩增104个碱基对(bp)λ-DNA靶的PCR反应包括0.5μL的Z-Taq DNA聚合酶、5μL的10x Z-Taq缓冲液、4μL的dNTP混合物、4.5μL的10μM引物(每个)和10μL的牛血清白蛋白(BSA)(50μg)，并用PCR级水使其达到50μL。模板λ-DNA的最终浓度的变化范围为0.01ng μL-1至10ng μL-1。
图9A示出来自台式热循环仪(具有CFX96实时PCR检测系统的Bio-Rad C1000TM热循环仪)及来自具有不同循环次数的腔PCR(具有750μm厚的PCR腔24)从95℃至68℃的2％琼脂糖胶图像(点1：台式10-4ng μL-1、30次循环，点2：台式NTC，点3：20次循环的腔，点4：30次循环的腔，点5：40次循环的腔，点5：NTC处的腔)。
对于台式PCR来说，使用三步热循环方案。图9A示出随着循环次数增加，光腔20的谱带强度增加的明显趋势。
图9B示出来自不同模板DNA初始浓度的腔PCR产物的2％琼脂糖胶图像(10-5ng μL-1处的点1、10-7ng μL-1处的点2、10-7ng μL-1处的点3、10-7ng μL-1处的点4、NTC处的点5)。随着浓度变化，谱带强度出现明显的趋势。此外，40次循环的腔PCR能够在15分钟内扩增至低至10-8ng μL-1(2个副本/μL)。
在图10中总结台式和腔PCR的总反应时间。虽然与传统PCR测定相比，KAPA2G FastPCR工具箱的总反应时间已经缩短了20-70％，但通过使用根据本发明的腔PCR，可以缩短70％至80％的总反应时间。
除快速敏感的核酸扩增外，光腔20具有高度可重复性和可再生性。所展示的稳健LED驱动光腔PCR使得本发明的系统和方法成为在要求快速、准确、可靠的核酸扩增的POC平台中实施的理想候选。
3.概述
本发明的光腔PCR设备10不仅在快速PCR热循环中有效，同时在与传统台式PCR系统相当的可靠的核酸扩增中也是有效的。为了使单次访问可行，在30分钟内提供测试结果是非常必要的。本发明的光腔PCR设备10可以满足这种需求，因为该设备可以在4至10分钟内完成30次PCR热循环并在15分钟内将核酸浓度扩增至低至10-8ng μL-1(2个副本/μL)。
通过优化光腔20的Au薄膜的厚度，光吸收可以在光腔20的Au薄层22a、22b的顶部和底部均匀吸收，从而实现在94℃和68℃分别仅为1.9℃和0.2℃的优异的温度均匀性。因此，本发明的光腔PCR设备10因其优异的温度均匀性和精确的温度准确性而表现出优异的可重复性和可再生性。一般地，热循环驱动地越快，整个PCR样本中因热惯性导致的温度差异就越大。但是，在光腔PCR中，从1.3μL到10μL的不同样本体积在温度准确性上并没有出现明显的大差异。这可能不仅是因为热质量小，同时也要归功于Au薄膜与PCR混合物之间通过50nm厚的超薄SiO2钝化层所进行的快速热传递。
由于在单个PCB上使用7个LED以获得宽束腰，从而以相同速率加热参考室和腔PCR室，被测设备的功耗相对较高(约20W)。但是，通过为参考室26和光腔20(或多路复用构造中的单个光腔20)分别提供两个3W的LED，功耗可以进一步降低(约6W)。本发明的实施例关注的是利用荧光检测并集成多个PCR阱和多个LED以允许高吞吐量多路复用扩增的定量实时PCR。
总之，本文展示了一种通过LED驱动光腔PCR热循环仪实现的新型超快PCR。与仅底部加热的光子PCR相比，腔顶部和底部不同厚度的Au薄膜均出现光到热转换效率提升，温度均匀性改善的情况。在控制总扩增时间的情况下，显示出可以与商业台式热循环仪匹敌的c-MET基因的核酸扩增。利用超快加热，c-MET基因的超快扩增、94℃(变性)至68℃(退火/延展)之间的热循环在4-10分钟的30次循环内实现。此外，我们还展示了本发明腔PCR平台的可重复性和可再生性。我们建议这种简单稳健的超快腔PCR热循环仪适用于POC诊断。
从本文的描述应当理解的是，本发明包括多个实施例，这些实施例包括但不限于：
1.一种用于流体样本热循环的装置，所述装置包括：至少一个微流体热循环室，所述室由多个室壁限定，所述室壁构造为保持所述流体样本；第一薄膜，其设置在第一基底上，以限定所述热循环室的第一室壁；第二金属薄膜，其设置在第二基底上，以形成与所述第一室壁相对的第二室壁；以及光源，其构造为照射所述第一薄膜；其中，照射在所述第一薄膜上的第一部分光吸收至所述第一薄膜内，并且照射在所述第一薄膜上的第二部分光透射穿过所述第一薄膜；其中，透射穿过所述第一薄膜的所述光照射所述第二薄膜；其中，照射在所述第二薄膜上的至少部分透射光吸收至所述第二薄膜内；并且其中，吸收至所述第一薄膜和所述第二薄膜内的光构造为提升所述第一薄膜和所述第二薄膜的温度以加热所述热循环室内的流体样本。
2.根据前述任意一项实施例所述的装置，其中，所述第一薄膜和所述第二薄膜中的一个或多个包括金属层。
3.根据前述任意一项实施例所述的装置，其中，所述金属层包括从金(Au)、银(Ag)、镍(Ni)、钛(Ti)、铬(Cr)、锗(Ge)、钯(Pd)、钌(Ru)、钨(W)、铱(Ir)或铂(Pt)组成的组中选择的金属。
4.根据前述任意一项实施例所述的装置：其中，所述第一薄膜和所述第二薄膜中的一个或多个包括多层金属结构；并且其中，所述金属结构包括从金(Au)、银(Ag)、镍(Ni)、钛(Ti)、铬(Cr)、锗(Ge)、钯(Pd)、钌(Ru)、钨(W)、铱(Ir)或铂(Pt)组成的组中选择的一种或多种金属。
5.根据前述任意一项实施例所述的装置，其中，所述第一薄膜和所述第二薄膜中的一个或多个包括从包含石墨、石墨烯、碳纳米管(CNTs)或涂料组成的组中选择的非金属光吸收材料。
6.根据前述任意一项实施例所述的装置，其中，所述第一薄膜和所述第二薄膜中的一个或多个包括图案化表面以通过共振增加光吸收。
7.根据前述任意一项实施例所述的装置，其中，所述第一基底和所述第二基底中的一个或多个包括半透明材料，所述半透明材料构造为允许所述照射光至少穿过所述第一基底透射至所述第一薄膜。
8.根据前述任意一项实施例所述的装置，其中，所述第一基底和所述第二基底中的一个或多个包括以一个或多个柱阵列、1D或2D栅格、光子晶体或半球形式的2D或3D微结构或纳米结构。
9.根据前述任意一项实施例所述的装置，其中，所述第一薄膜具有第一厚度，并且所述第二薄膜具有不同于所述第一厚度的第二厚度。
10.根据前述任意一项实施例所述的装置，其中，所述第一薄膜厚度和所述第二薄膜厚度选择为匹配进入所述第一薄膜和所述第二薄膜的光吸收率，从而使所述第一薄膜和所述第二薄膜具有大体均匀的温度提升速率。
11.根据前述任意一项实施例所述的装置，进一步包括至少一个温度传感器，其构造为感测所述热循环室内的温度。
12.根据前述任意一项实施例所述的装置，其中，所述第一薄膜和所述第二薄膜具有由钝化层覆盖的表面，以防止在所述热循环室内抑制PCR反应。
13.根据前述任意一项实施例所述的装置，其中，所述光源从发光二极管(LED)、激光二极管(LD)、钨灯、荧光灯、卤素灯、汞灯、氙灯、金属卤化物灯或其任意组合组成的组中选择。
14.根据前述任意一项实施例所述的装置，进一步包括：第一端口和第二端口，其耦合至所述热循环室；其中，所述第一端口和所述第二端口构造为允许所述流体样本输入至所述热循环室内。
15.一种执行流体样本超快热循环的方法，所述方法包括：提供由相对的第一薄膜和第二薄膜限定的微流体热循环室；用所述流体样本填充所述热循环室；用光源照射所述第一薄膜；其中，照射在所述第一薄膜上的第一部分光吸收至所述第一薄膜内，并且照射在所述第一薄膜上的第二部分光透射穿过所述第一薄膜；用透射穿过所述第一薄膜的光照射所述第二薄膜；其中，照射所述第二薄膜的至少部分透射光吸收至所述第二薄膜内；均匀提升所述第一薄膜和所述第二薄膜的所述温度，作为进入所述第一薄膜和所述第二薄膜的吸收光的函数；以及通过所述第一薄膜和所述第二薄膜的温度提升，加热所述热循环室内的所述流体样本。
16.根据前述任意一项实施例所述的方法，其中，间歇性地照射所述第一薄膜，以执行所述流体样本的超快微流体聚合酶链反应(PCR)。
17.根据前述任意一项实施例所述的方法，其中，均匀提升所述第一薄膜和所述第二薄膜的所述温度包括：在第一持续时间照射所述第一膜和所述第二膜，以在第一时期将所述热循环室内所述流体样本的所述温度提升至选定温度；在第二持续时间照射所述第一膜和所述第二膜，以第二时期将所述热循环室内所述流体样本的所述温度提升至选定温度；在第三持续时间照射所述第一膜和所述第二膜，以在第三时期将所述热循环室内所述流体样本的所述温度提升至选定温度；以及为多次循环重复照射时期的循环以扩增所述流体样本。
18.根据前述任意一项实施例所述的方法，其中，所述第一薄膜具有第一厚度，并且所述第二薄膜具有不同于所述第一厚度的第二厚度。
19.根据前述任意一项实施例所述的方法，其中，所述第一薄膜厚度和所述第二薄膜厚度选择为匹配进入所述第一薄膜和所述第二薄膜的光吸收率，从而使所述第一薄膜和所述第二薄膜具有大体均匀的温度提升速率。
20.根据前述任意一项实施例所述的方法，进一步包括：测量所述热循环室内的温度。
21.根据前述任意一项实施例所述的方法，其中，所述第一薄膜和所述第二薄膜具有由钝化层覆盖的表面，以防止在所述热循环室内抑制PCR反应。
22.根据前述任意一项实施例所述的方法，其中，用所述流体样本填充所述热循环室包括：通过耦合至所述热循环室的第一端口将流体样本注射至所述循环室内；其中，所述注射的流体样本将空气推出耦合至所述热循环室的第二端口。
23.根据前述任意一项实施例所述的方法，其中，所述光腔构造为用于所述PCR反应过程中的激光荧光发射。
虽然本文的描述包含许多细节，但这些细节不应理解为限制本公开的范围，而是仅提供一些目前优选实施例的说明。因此，应当理解的是，本公开的范围充分包括对于本领域技术人员来说显而易见的其它实施例。
除非有明确说明，否则在权利要求书中，涉及元件单数的并非旨在表示“一个且仅有一个”，而是表示“一个或多个”。本领域普通技术人员已知的所公开实施例中的元件的所有结构、化学和功能等同物明确以引用形式并入本文，并且旨包含在本发明的权利要求中。此外，不管元件、组件或方法步骤是否在权利要求中明确地叙述，本公开中的任何元件、组件或方法步骤均非旨在专用于公众。除非使用短语“用于...的装置”来明确地叙述元件，否则本文中任何权利要求元件均不应理解为“装置加功能”元件。除非使用短语“用于...的步骤”来明确地叙述元件，否则本文中任何权利要求元件均不应理解为“步骤加功能”元件。
表1
光腔PCR室内的Au膜优化
表2
Au薄膜在不同厚度的LED发射波长范围内的平均透射率、反射率和吸收率

Claims (23)

1.一种用于流体样本热循环的装置，所述装置包括：
至少一个微流体热循环室，所述室由多个室壁限定，所述室壁构造为保持所述流体样本；
第一薄膜，其设置在第一基底上，以限定所述热循环室的第一室壁；
第二金属薄膜，其设置在第二基底上，以形成与所述第一室壁相对的第二室壁；以及
光源，其构造为照射所述第一薄膜；
其中，照射在所述第一薄膜上的第一部分光吸收至所述第一薄膜内，并且照射在所述第一薄膜上的第二部分光透射穿过所述第一薄膜；
其中，透射穿过所述第一薄膜的所述光照射所述第二薄膜；
其中，照射在所述第二薄膜上的至少部分透射光吸收至所述第二薄膜内；并且
其中，吸收至所述第一薄膜和所述第二薄膜内的光构造为提升所述第一薄膜和所述第二薄膜的温度以加热所述热循环室内的流体样本。
2.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一薄膜和所述第二薄膜中的一个或多个包括金属层。
3.根据权利要求2所述的装置，其中，所述金属层包括从金(Au)、银(Ag)、镍(Ni)、钛(Ti)、铬(Cr)、锗(Ge)、钯(Pd)、钌(Ru)、钨(W)、铱(Ir)或铂(Pt)组成的组中选择的金属。
4.根据权利要求1所述的装置：
其中，所述第一薄膜和所述第二薄膜中的一个或多个包括多层金属结构；并且
其中，所述金属结构包括从金(Au)、银(Ag)、镍(Ni)、钛(Ti)、铬(Cr)、锗(Ge)、钯(Pd)、钌(Ru)、钨(W)、铱(Ir)或铂(Pt)组成的组中选择的一种或多种金属。
5.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一薄膜和所述第二薄膜中的一个或多个包括从包含石墨、石墨烯、碳纳米管(CNTs)或涂料组成的组中选择的非金属光吸收材料。
6.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一薄膜和所述第二薄膜中的一个或多个包括图案化表面以通过共振增加光吸收。
7.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一基底和所述第二基底中的一个或多个包括半透明材料，所述半透明材料构造为允许所述照射光至少穿过所述第一基底透射至所述第一薄膜。
8.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一基底和所述第二基底中的一个或多个包括以一个或多个柱阵列、1D或2D栅格、光子晶体或半球形式的2D或3D微结构或纳米结构。
9.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一薄膜具有第一厚度，并且所述第二薄膜具有不同于所述第一厚度的第二厚度。
10.根据权利要求9所述装置，其中，所述第一薄膜厚度和所述第二薄膜厚度选择为匹配进入所述第一薄膜和所述第二薄膜的光吸收率，从而使所述第一薄膜和所述第二薄膜具有大体均匀的温度提升速率。
11.根据权利要求1所述的装置，进一步包括至少一个温度传感器，其构造为感测所述热循环室内的温度。
12.根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一薄膜和所述第二薄膜具有由钝化层覆盖的表面，以防止在所述热循环室内抑制PCR反应。
13.根据权利要求1所述的装置，其中，所述光源从发光二极管(LED)、激光二极管(LD)、钨灯、荧光灯、卤素灯、汞灯、氙灯、金属卤化物灯或其任意组合组成的组中选择。
14.根据权利要求1所述的装置，进一步包括：
第一端口和第二端口，其耦合至所述热循环室；
其中，所述第一端口和所述第二端口构造为允许所述流体样本输入至所述热循环室内。
15.一种执行流体样本超快热循环的方法，所述方法包括：
提供由相对的第一薄膜和第二薄膜限定的微流体热循环室；
用所述流体样本填充所述热循环室；
用光源照射所述第一薄膜；
其中，照射在所述第一薄膜上的第一部分光吸收至所述第一薄膜内，并且照射在所述第一薄膜上的第二部分光透射穿过所述第一薄膜；
用透射穿过所述第一薄膜的光照射所述第二薄膜；
其中，照射所述第二薄膜的至少部分透射光吸收至所述第二薄膜内；
均匀提升所述第一薄膜和所述第二薄膜的所述温度，作为进入所述第一薄膜和所述第二薄膜的吸收光的函数；以及
通过所述第一薄膜和所述第二薄膜的温度提升，加热所述热循环室内的所述流体样本。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，间歇性地照射所述第一薄膜，以执行所述流体样本的超快微流体聚合酶链反应(PCR)。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，均匀提升所述第一薄膜和所述第二薄膜的所述温度包括：
在第一持续时间照射所述第一膜和所述第二膜，以在第一时期将所述热循环室内所述流体样本的温度提升至选定温度；
在第二持续时间照射所述第一膜和所述第二膜，以在第二时期将所述热循环室内所述流体样本的温度提升至选定温度；
在第三持续时间照射所述第一膜和所述第二膜，以在第三时期将所述热循环室内所述流体样本的温度提升至选定温度；以及
为多次循环重复照射时期的循环以扩增所述流体样本。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述第一薄膜具有第一厚度，并且所述第二薄膜具有不同于所述第一厚度的第二厚度。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第一薄膜厚度和所述第二薄膜厚度选择为匹配进入所述第一薄膜和所述第二薄膜的光吸收率，从而使所述第一薄膜和所述第二薄膜具有大体均匀的温度提升速率。
20.根据权利要求16所述的方法，进一步包括：
测量所述热循环室内的温度。
21.根据权利要求16所述的方法，其中，所述第一薄膜和所述第二薄膜具有由钝化层覆盖的表面，以防止在所述热循环室内抑制PCR反应。
22.根据权利要求16所述的方法，其中，用所述流体样本填充所述热循环室包括：
通过耦合至所述热循环室的第一端口将流体样本注射至所述循环室内；
其中，所述注射的流体样本将空气推出耦合至所述热循环室的第二端口。
23.根据权利要求16所述的方法，其中，所述光腔构造为用于所述PCR反应过程中的激光荧光发射。
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