JP4896349B2 - ノルボルネンベースの表面コーティングを用いるキャピラリー電気泳動のための方法およびデバイス。 - Google Patents
ノルボルネンベースの表面コーティングを用いるキャピラリー電気泳動のための方法およびデバイス。 Download PDFInfo
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Description
(発明の分野)
本発明の技術分野は、キャピラリー電気泳動である。
【0002】
(発明の背景)
キャピラリー電気泳動(CE)は、化学操作および生化学操作を行うための有用性を増加している。分析時間の実質的節約、分析費用、分析を行うために必要とされる実験室の空間、自動化およびハイスループットを含む多くの利点を提供し得る。これらの利点は、関連するヒト因子(例えば、労働費用、操作誤りに関連する費用、ならびにヒトの間および全体的なヒトの操作間での一般的な不一致)の最小化および軽減に大きく起因する。
【0003】
便利さ、費用および効率のような因子に起因して、プラスチック材料は、CEの分野における使用について非常に魅力的になっている。例えば、従来の成形技術を使用して、多数の使い捨てのプラスチックデバイス(それぞれが、マイクロチャネルネットワークおよびリザーバのような正確かつ複雑な機構を有する)を作製し得る。プラスチックフィルムはまた、電気泳動チャネルを含む積層物(laminate)に効率的に押出され得る。種々のプラスチックまたはポリマーが、上記の型およびフィルムとともに使用され得、そして使用されている。これらには、とりわけ、ポリメタクリレートおよび他のアクリル、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、およびポリアルケンが挙げられる。しかし、それぞれについての問題は、壁表面電荷物理的および化学的構成および微小構造における変化に関連する複雑な表面化学である。これらの化学および表面電荷は、キャピラリー壁へのサンプル吸着を悪化させる傾向があり、そして不均一な電気浸透流れを生成する。不均一な電気浸透流れは、減少した分離分解能を引き起こしながら、吸着は、曲がったピークを生じ、そして/または分析物移動を生じないので、信頼のおける一致した結果を得ることは困難であった。
【0004】
EOFは、固体マイクロチャネル壁の近位におけるゼータ電位および粘度の両方に高く依存する。ゼータ電位は、表面電荷密度、緩衝液または媒体の組成およびpHに依存する、荷電された表面またはイオン化された表面と電解質溶液または緩衝液との間の出荷平面(shipping plane)(剪断の表面)における電位である。この効果は、種々の基板に存在する。例えば、従来のシリカキャピラリーが、CEのために使用される場合、EOFは、キャピラリーの負に電荷された内壁に起因して増加する。これらの壁は、電解質緩衝液から、過剰の陽イオンを拡散層に引き付けるシラノール基によって支配される。拡散層における可動性の過剰の陽性イオンが電気電位の影響下でカソードに向かって流れるので、バルク溶液はまた、同じ方向に引かれる。
【0005】
現在、EOFおよび吸着を部分的にまたは完全に制御するためのいくつかの方法(緩衝液変化および添加剤、有機溶媒の使用、壁への中性および/または荷電高分子(界面活性剤を含む)の吸着、化学的に結合された層などを含む)がある。例えば、米国特許第4,628,201号、同第4,690,749号、同第4,865,707号、同第4,931,328号、同第5,112,460号(これらは、本明細書中において参考として援用される)を参照のこと。その基礎となる考えは、荷電した実体を実質的に減少させるために壁の電荷の性質を穏やかにすることである。これらの方法のそれぞれが、困難性を有し、そしてCEの性能について他の所望の表面性質を依然として提供しながら、EOFの所望の減少を提供し得ない。
【0006】
(発明の要旨)
キャピラリー電気泳動を実行するためのノルボルネン(norbornene)に基づくポリマー表面を使用する方法およびデバイスが提供される。実質的に飽和の中性ポリ(ノルボルネン)ホモポリマーおよび実質的に飽和の中性ポリ(ノルボルネン)コポリマーは、イオンが電場の影響下で移動するマイクロチャネルの表面として使用される。混合物(特に、核酸混合物)の改善された分離および分解能(resolution)は、EOFを避けるために表面を処理する必要なしに、他のマイクロチャネル表面を使用して、匹敵する条件下で達成される。
【0007】
(特定の実施形態の説明)
中性水素化ポリ(ノルボルネン)ホモポリマーまたは中性水素化ポリ(ノルボルネン)コポリマーを有するマイクロチャネルを使用する、電気泳動分離を行うための方法およびデバイスが提供される。好都合には、マイクロチャネルおよび他の機構が形成されるポリマーを含む基板が使用される。これらの方法およびデバイスによって、EOFのレベルを減少するための表面の改変または薬剤の添加の必要性なしに、分析物(特に、核酸混合物)の増加した分解能での分離が可能である。ポリマーは、ノルボルネンベースのモノマー分子を使用して開環メタセシス重合(ROMP)によって重合し、続いて水素化することによって作製され得る。ポリマーは、実質的に完全に水素化され(約5%未満の不飽和を一般的に有する(水素化の前に存在する二重結合の数に基づく))、そして熱耐性を有する(約60℃より高いTg、通常、約90℃より大きいTgを有する)。コモノマーとしては、置換ノルボルネン改変モノマー(特に、アルキル置換ノルボルネン)および多環式化合物、1−オレフィン(約2〜10個の炭素原子)などが挙げられる。
【0008】
ノルボルネンベースのポリマーによって、このポリマーが、少なくとも約10モル%のノルボルネンモノマー(特に、このポリマーが開環メタセシス重合(ROMP)を使用する重合、続く利用可能な不飽和を減少させるための水素化によって形成される)を含むことを意図する。望ましくは、ノルボルネンベースのポリマーは、ノルボルネンおよび置換ノルボルネンを含むモノマーからなる。
【0009】
ノルボルネンモノマーは、通常、コポリマーの少なくとも約20モル%、より通常は少なくとも約50モル%、しばしば少なくとも約75モル%である。ポリマーの固有粘度は、少なくとも約0.5dl/gである(25℃で、トルエン中で決定される)。ポリマーは、従来の方法で調製され得、多数のホモポリマーおよびコポリマーが市販されている)。例えば、米国特許第5,191,026号を参照のこと。好都合には、マイクロチャネル表面またはマイクロチャネルの基板に使用されるポリマーは、ノルボルネンまたはノルボルネン誘導体の開環メタセシス(ROMP)によって作製される。メタセシス反応は、当該分野において公知であり、この例は、米国特許第4,945,135号;同第5,198,511号;同第5,312,940号;および同第5,342,909号に提供される。重合の後に、主要ポリマー鎖および置換基の二重結合は、水素化によって実質的に飽和される。Hashimoto,M.、Synthesis and Properties of Hydrogenated Ring Opening Metathesis Polymer,Polymeric Materials:Science and Engineering,American Chemical Society、第76巻、61頁を参照のこと。目的のチャネル表面材料は、無定形、水不溶性、非多孔質、非極性(電気的中性)および電気非伝導性(すなわち、高い電気抵抗を有する)である。この材料は、安定で、化学操作に必要な条件(例えば、キャピラリー電気泳動に必要な条件、すなわち、pHが2〜12の範囲であり得る塩含有水性媒体)下で、その形状を保持するのに十分な機械的強度および剛性を有する。このポリマーは、熱可塑性であり、従来の成形プロセスおよび押出しプロセスを使用して、正確に形成または成形するのに適切である。ウェブベースのフィルムプロセシングはまた、目的のポリマーが、目的のマイクロチャネルを含む積層体に押出される場合、可能である。例えば、PCT/US98/21869号を参照のこと。調製されるフィルムは、一般的に、約25μ〜1000μの範囲、より通常では、約25μ〜約750μの範囲である厚みを有する。
【0010】
大部分について、目的の材料は、1つ以上の異なるモノマーを含み、ここで、その鎖に沿った個々のモノマー単位は、このポリマーがホモポリマーであるかまたはコポリマーであるかに依存して変化し得、ここで、このポリマーは、少なくとも約50モル%の以下の式
【0011】
【化1】
のモノマーを含み、
ここで、R1およびR2は、水素、1〜12個の炭素原子、通常1〜6個の炭素原子のアルキルであるか、または一緒になってそれらが結合する炭素原子と環を形成し、ここで、この環構造は、単環式または多環式であり得、そしてそれらが結合する炭素原子を含んで、約5〜12個の炭素原子、通常約5個〜10個の炭素原子を有し、そして置換されていても(特に、約1〜6個の炭素原子の1〜2個のアルキル置換基)、置換されていなくてもよい。
【0012】
ノルボルネン、ならびにジシクロペンタジエン(DCP)、テトラシクロドデセン(TCD)、4,7−メタノ−2,3,3a,4,7,7a−ヘキサヒドロインデン(HDCP)またはジヒドロジシクロペンタジエン、1,4−メタノ−1,4,4a,9a−テトラヒドロフルオレン(MTF)、およびそのアルキル置換誘導体(特に、1〜6個、通常1〜3個の炭素原子の0〜2個のアルキル基を有する)のうちの少なくとも1つに基づくコポリマーである。
【0013】
マイクロチャネルに使用されるポリマーの所望の性質および全体の質は、モノマー単位の選択および比における変更によって操作され得る。Hashimoto,M.、Synthesis and Properties of Hydrogenated Ring Opening Metathesis Polymer,Polymeric Materials:Science and Engineering,American Chemical Society、第76巻、61頁を参照のこと。例えば、多くの微小流体適用において、熱に対する耐性を有する、ラボチップ(lab chip)または基板にチャネルを有することが望ましい。従って、ポリマーは、有機溶媒に対する良好な溶媒耐性、3mmの厚み(ASTM D1003)において、350nm以上で約90%より大きい光透過性、0.01未満の低い吸水性(ASTM D570);低い自己蛍光(通常、30%未満、より通常は、約20%未満の低い検出信号);媒体の低い吸収を伴う、従来の分離媒体との適合性;キャピラリー電気泳動の条件下で水性塩溶液によるぬれ性;および導入される機構の保持を伴う成形および押出しの可能性を有する。市販の型の目的の(コ)ポリマーとしては、Nippon ZeonのZeonor(登録商標)およびZeonex(登録商標)ポリマーシリーズ;BF GoodrichのAccord(登録商標)ポリマー;TiconaのTopas(登録商標)ポリマー;およびJSRのArton(登録商標)ポリマーが挙げられる。これらのポリマーのうちのいくつかについての記載について、例えば、Schut.J.H.、New Cyclic Olefins are Clearly Worth a Look,Plastic Technology、第46巻、No.3、2000年3月、44頁を参照のこと。
【0014】
電気泳動デバイスの目的のマイクロチャネルは、一般に、マイクロスケールの断面内部寸法を有し、その結果、この非依存的な寸法は、約1μmよりも大きく、そして約1000μmよりも小さい。このチャネルの特定の性質に依存するこれらの非依存的な断面寸法(すなわち、幅、深さ、または直径)は、一般に、約1〜200μm、通常、約10〜150μm、より通常、約20〜100μmの範囲であり、この全内部断面積は、約100〜40,000μm2、通常、約200〜25,000μm2の範囲である。このチャネルの内部断面の形状は、多くの異なる形状(矩形、四角形、菱形、三角形、またはV字形、円形、半円形、楕円形などを含む)の間で変化し得る。
【0015】
目的の微小流体デバイスは、一般に、少なくとも2つの層を有し、この層は、2枚のフィルム(1枚のより厚い基板と1枚のフィルム)、複数の層または積層板であり得、このマイクロチャネルおよび他の機構(例えば、リザーバ)は、ポートを提供するため、この機構の一部を囲むためなどのに使用される一方の層および他方の層において、切断、エンボス、成形などされ得る。個々の層は、加熱、接着、熱結合または他の従来の手段によって連結され得る。通常、このデバイスは、基板に存在する個々の機構を用いて基板を成形し、次いで、このマイクロチャネルを囲むためにカバー層を適用することによって調製され、このリザーバへのアクセスは、成形プロセスにおいてまたはカバー層によって提供され得る。
【0016】
ラボチップは、約0.5〜5cmの範囲の短い寸法、および約1〜50cmの範囲の長い寸法を有し得、1つまたは複数の個々の電気泳動ユニットを有する(各ユニットは、少なくとも3個のリザーバおよび2個の接続チャネルを有する)。この目的のチャネルは、ヘビ状ネットワーク、線状ネットワーク、分枝ネットワークまたはいくつかの他の従来のネットワークであり得る。分枝ネットワークに関して、1つ以上の注入チャネルによって交差される1つ以上の主分析チャネルまたは分離チャネルを有することが可能である。主分析チャネルまたは分離チャネルに関して、検出ゾーンが通常存在し、一般に、放射に対してアクセス可能である。関連するチャネルの長さに沿った、この検出ゾーンの配置は、このチャネルが使用される適用に依存する。例えば、DNA配列決定において、長い電気泳動分離チャネルが、長いDNAフラグメント中の末端ヌクレオチドの適切な分解能を達成するのに必要とされる。このような適用において、検出ゾーンは、18cm長までであり得る分離チャネルの末端またはその末端付近に存在する。酵素アッセイのような別の型の適用において、長い分析チャネルの末端付近の検出ゾーンは、一般に必要とされない。マイクロチャネル、チャネルネットワーク、微小流体チップおよびそれらの操作の一般的な例について、米国特許第5,750,015号、同第5,858,188号、同第5,599,432号および同第5,942,433号ならびにWO96/04547号(これらは、本明細書中で参考として援用されている)を参照のこと。
【0017】
目的のデバイスは、従来の方法に従って調製され得、このマイクロチャネルは、ノルボルネン(norbornene)ベースのポリマーでコーティングされ得るが、通常、このノルボルネンベースのポリマーは、少なくとも基板を提供し、この基板にマイクロチャネルおよびリザーバのような機構が形成される。次いで、このマイクロチャネルは、囲まれ得、そしてこのリザーバの床は、従来の手段によって囲まれた層と接着する基板と同じ組成または異なる組成を有する、ノルボルネンベースのポリマーによって提供される。これらの基板は成形され得るか、そうでなければ、複数の個々のマイクロユニットを有するように形成され、このユニットの各々は、他のユニットから別個にされ得るか、または接続され得る。
【0018】
この目的のポリマー組成物は、微小流体デバイスを調製するためにサンドイッチ形態において使用され得る。基板が成形され得、ここで、所望の機構(例えば、リザーバおよびマイクロチャネル)が導入される。このリザーバの開口部は、基板を通って延び、一方で、このマイクロチャネルは、基板の厚さの一部でのみ延びる。低いガラス転移温度を有する目的のポリマー組成物の薄層が、この基板から適用され、続いて、第3の層が適用され、これは、マイクロカプセルおよびリザーバの一方の側面を囲むのに役立ち、その結果、囲まれた層は、任意の構造機構を有する必要がない。ガラス転移温度またはほぼガラス転移温度での中間層のサンドイッチ圧縮により、強力な接着結合が、この層間で得られる一方で、マイクロチャネル表面の性質をなお保存する。一般に、中間層と他の2つの層との間のガラス転移温度の違いは、少なくとも約10℃、より一般に、少なくとも約25℃、そして約50℃未満である。以前に示したように、他の技術がまた、微小流体デバイスを構築するために使用され得る。
【0019】
この目的の微小流体デバイスは、分離のために従来使用された添加剤以外の添加物を必要としない。すなわち、多くの場合において、篩い分け媒体が使用され、特に、分離されるべきイオンは、核酸が観測される場合、実質的に同一の質量/電荷比を有する。さらに、異なる質量/電荷比が分析に関与する場合、分離を増強するために、このチャネル中の媒体中にポリマー添加剤を含むことが、頻繁に所望される。ほとんどの部分において、このポリマーは、極性であり、そして水性媒体において安定的に分散可能であり、通常、水性媒体中で安定であり、このポリマーは、酸素、窒素などを含むモノマー(ここで、この官能基は、オキシ(エーテルおよびヒドロキシル)、非−オキソ−カルボニル(エステルおよびアミド)などである)を含む。
【0020】
特定の目的は、多くの数の異なるサイズの核酸の複合体混合物(例えば、多くのゲノム塩基配列決定適用または一核酸多型分析から生じたDNAフラグメント)の電気泳動分離である。特定の目的は、約10〜10,000,000塩基サイズ、通常、約10〜10,000塩基サイズ、より通常、約10〜5,000個の塩基サイズの範囲の鎖を有するssDNAフラグメントまたはdsDNAフラグメントの分離である。マイクロチャネルを使用する、DNA検出方法およびDNA配列決定方法は、Barron & Blach、およびLipshutz & Fodor、Curr.Opinion(Struct.Biol.)(1994)4:3 76−380に包括的に記載されている。
【0021】
DNAを配列決定するために、通常、Sanger法またはGilbert法が使用される。これらの方法は、テンプレートとしてhe標的DNAを使用する工程、および末端で標識されたヌクレオチド(例えば、蛍光標識されたジデオキシヌクレオチド)の存在下でプライマーを伸長する工程を包含する。異なる末端ヌクレオチドを区別し得るように、別々に標識された異なるヌクレオチドの各々を有することにより、配列の決定を可能にする配列ラダー(ladder)を提供する。目的のデバイスを使用して、400個のヌクレオチド、またはより具体的に少なくとも約500個のヌクレオチドの配列が、単一の決定において分析され得る場合に、個々のフラグメントの効率的かつ有効な分離が、得られる。これは、図3および4において、ノルボルネンベースのポリマーおよびPMMAの両方で行われる類似のCE分離から生じるデータを用いて実証され、PMMAは、電気泳動に首尾良く使用されることが示された。例えば、米国特許第6,054,034号を参照のこと。この比較から、改良された分解能および効率がノルボルネンベースのポリマーマイクロチャネルの使用を介して達成され得ることが、容易に明らかである。
【0022】
チャネル分離を実施することにおいて、目的のマイクロチャネルは、通常、圧力下で、分離媒体を用いて予め充填される。従来の分離媒体の例としては、ポリアクリルアミド、ヒドロキシエチルセルロース(MW 50kDa〜1000kDa)、アガロース、デキストラン、ポリエチレングリコール(20kDa〜200kDa)、ポリ−N−アクリロイル−tris(ポリNAT)、ポリAAEE(ポリN−アクリロイルアミノエトキシエタノール)、PEO(ポリエチレンオキシド)などが挙げられる。適切な緩衝液がまた、使用され得る。例えば、米国特許第5,120,413号を参照のこと。電気泳動におけるサンプル注入およびマイクロチャネルの使用は、一般に、米国特許第6,054,034号(これは、本明細書中で参考として援用されている)に記載されている。標準的な条件は、各々の所望される適用に従って変えられ得る。核酸の電気泳動について、異なる長さを有するDNAフラグメントは、全て、同一の質量/電荷比を有し、そして分子の篩い分けは、この違いを解決するためのメカニズムであるので、これらの条件は、一般に、そのもつれ(entanglement)閾値よりも高い親水性分離媒体濃度を用いて実施される。場の強度は、50〜1000V/cmの範囲、ほとんど、100〜200V/cmの範囲である。DNA分離を実施するための温度は、20〜80℃の範囲、ほとんど、50〜60℃の間である。通常の緩衝液系は、pH約8.3の、Tris−TAPS−EDTA緩衝液、Tris−ホウ酸−EDTA緩衝液、およびナトリウム−TAPS緩衝液である。小イオンの電気泳動のために、親水性分離媒体が、この緩衝液系の粘度を増加させるためおよびこのチャネル内での水力学的フローを防止するために、それらのもつれ閾値よりもかなり低い濃度、通常、それより低い濃度で緩衝液中に添加される。小さな分析物の質量/電荷比は、さらに、分離のための基礎である。分離場の強度は、50〜2000V/cmの間、通常、100と300V/cmとの間である。ハイスループットスクリーニングアッセイのために、低分子量のPEOポリマーが、25mMのHEPES緩衝液のような分離媒体に添加される。非イオン特性および親水特性を有するポリマーは、通常、この場合において好ましいが、常に必要であるとは限らない。
【0023】
ノルボルネンベースのポリマーを使用する目的のデバイスは、優れた分離性能を提供する。目的のデバイスは、サンプル成分の増強した分離を提供し、従来の媒体を使用して、DNA配列決定における特定の適用を見出し、広い範囲のフラグメントサイズにわたる改良された分離を可能にする。
【0024】
以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定の目的では提供されるのではない。
【0025】
(実施例)
(核酸配列決定)
(チップのレイアウト)
本実験で使用されるプラスチックマイクロチップを、所望の電気泳動パターンを含むニッケル電鋳マスターを用いてホットエンボス(hot emboss)することによって製造した。電気泳動デバイスは、図5に例示されるように、二重T字型インジェクターおよび主分離マイクロチャネルを備える。このデバイス100を、チャネルを表す線およびリザーバを表す円によって線図により示す。サンプルリザーバを、側部チャネル106によって分析用チャネル104に連結する一方で、このサンプル廃棄リザーバを、第2の側部チャネル110によって分析用チャネル104に連結する。それらの関連した側部チャネル106および110を備える、このサンプルリザーバ102および廃棄リザーバ108は、サンプルを分析用チャネル104に注入するのに役立つ。この二重T字型インジェクターは、分析用チャネル104で交差された250μmの間隙を有した。緩衝液リザーバ112および廃棄リザーバは、分析用チャネル104の反対の末端にある。分析用チャネル104の断面を、図5bに示す。インジェクターの中心から検出点までの距離は、約18cmであった。緩衝液112、サンプル廃棄緩衝液108、廃棄緩衝液114およびサンプル102を含む4つのアクセスリザーバは、約1.5mmの直径であった。この廃棄リザーバ114以外で、他のリザーバは、二重T字型注入交差点から4mmであった。電極(示さず)を、場の強度の自動制御のためにリザーバの各々に配置した。このプラスチックのマイクロチップを、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)またはZeonor1420R(Nippon Zeon Co.,Ltd.,Kawasaki,Japan)から製造した。このポリ(メチルメタクリレート)マイクロチップを、工場内で使用される材料から調製し、そして適切な表面改変または添加が使用される場合、良好な分離を提供することが見出された(McCormickら、Anal.Chem.1997、69、2626〜2630(本発明の譲渡人の実験室);およびSoperら、Jornal of Chromatography A,833(1999)107−120を参照のこと)。
【0026】
(LPA分離媒体の調製)
重合を、わずかに改変したEur.Polym.J.1984,20,505−512に記載されるプロトコルに従って実施した。Pyrex反応フラスコ中で、アクリルアミドの40%w/w溶液を、1:1の容量比に対して特定の石油中2.4%のSPAN 80の溶液に分散させた。この反応を触媒するために、APDSおよびTEMEDを、両方とも0.0055w/vの最終濃度で使用した。酸素を除去するために、分散液全体を窒素で連続的にパージし、次いで、重合反応を、350℃で一晩行った。アセトンを使用して、ポリアクリルアミドを沈殿させた。この沈殿物を、ブフナー漏斗上でアセトンで数回洗浄し、そして残りの溶媒をロータリーエバポレーターを用いて、オイルポンプ真空下で除去した。DNAの配列決定のための2%LPAマトリクス溶液を分離するために、この乾燥ポリマー、尿素、緩衝液濃縮物および水を、ガラスジャーに所望の濃度まで添加し、次いでマグネチックバーでゆっくりと撹拌した。
【0027】
(LDD30疎水性コポリマーの調製)
LDD30ポリマーは、フリーラジカル溶液重合によって合成される非架橋ポリマーである。この重合は、モノマーのジエチルアクリルアミドおよびジメチルアクリルアミド(70:30)の水溶液中で行う。モノマーの総濃度は、約10%未満(w/v)である。この溶液を、アルゴン、ヘリウムまたは窒素をバブリングすることによって、合成前に脱気した。過硫酸アンモニウムおよびTEMED(テトラメチルエチレンジアミン)を添加することによって、重合を開始する。この溶液を純水に対する透析に供し、そして凍結乾燥して未反応のモノマーを除去し、そして固体形態のポリマーを得る。
【0028】
LDD30は、30重量% ジエチルアクリルアミド、70重量% ジメチルアクリルアミドとして規定される組成物であり、ここでこの割合は、重合前の溶液中のモノマーの全質量の割合として表される。この組成物は、望ましい分離特性およびコーティング特性を有することが見出された。他の比の2つのモノマーを含むポリマーは、性能要件に依存して有用であり得る。得られるポリマーへの各モノマーの組込みの程度は、アッセイしなかった。
【0029】
(GeneScan 700 DNAラダー)
GeneScan 700 DNAラダーは、蛍光色素(TET、6−カルボキシ−4,7,2’,7’−テトラクロロフルオレセイン、発光波長:540nm;励起波長:520nm)で標識された、一連の特別に設計されたDNAフラグメントである。GeneScan 700は、35bp、50bp、75bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、340bp、350bp、400bp、450bp、490bp、500bp、550bp、600bp、650bp、および700bpを含む20のフラグメントを含む。用いた実験条件下で、この範囲の小さな蛍光フラグメントの同時移動の干渉に起因して、35bpおよび50bpを除く18のフラグメントのみが観察された。充填サンプルを、5μのGeneScan 700、5μlの脱イオン水、および10μLの脱イオンホルムアミドを用いて調製した。次いで、この充填サンプルを95℃で2分間変性し、その後、氷浴中で冷却した。
【0030】
(分離条件)
LPA(上で言及された親水性分離媒体)を、2〜5分間150〜200psiを付与することによって、緩衝液廃液レザバ(114)から充填した。残りのレザバ中のサンプルおよび緩衝液で充填した後、必要に応じて、全マイクロチップをサーマルステーション上に置き、そして35℃まで加熱した。Peltierデバイスは、このサーマルステーションを熱的に制御した。従来の蛍光検出を用いた。そのデータ収集速度は、約10Hzであり、一方、488nmのARUイオンレーザーを、約7mWのレーザー出力で使用した。分離フィールド強度は、約150V/cmであった。電圧セットアップは、以下の表に列挙する:
【0031】
【表1】
(データ分析のための交差プロット)
ピーク間隔およびピーク幅の交差プロットを、DNAフラグメントサイズに対してプロットした。これらのプロットを、図1および2に示す。このピーク間隔は、1ヌクレオチド長だけ異なる2つのDNAフラグメント間の空間距離である。このピーク幅とは、半ピーク高全幅値(FWHM)をいう。2本の線が交差する点は、1つの塩基の分離の分解能限界を示し、そして0.59の分解度値に相当する。このピーク幅を、515〜530の波長で、Blueチャネルを使用して測定した。このピーク幅を、二次多項式にフィッティングした。このデータをベースラインとし、そしてPE Biosystemsの交差ツールソフトウエアを用いて分析した。
【0032】
ガラスチップを用いて、比較も行い、ここでコーティングポリマーのLDD30を用いた。ガラスは、コーティングポリマーの非存在下で、有用な分離を提供しない。分離を、40℃、150V/cmの有効分離電界強度で行った。
【0033】
(代表的なデータ)
(PMMAチップを用いるDNA分離)
DNA分離を、工場内で調製されるサンドイッチチップを用いて(例えば、非イオン性界面活性剤コーティングを使用する微小流体デバイスの材料としてのPMMAの使用の記載について、Songら、Electrophoresis 1999,20:2847−2855を参照のこと)、150V/cmおよび35℃で行い、1×TTE(1×TTE=50mM Tris;50mM TAPS;および2mM EDTA、pH8.2)および7Mの尿素溶液中2%の高分子量LPAを、GeneScan 700 DNAラダーの分離に使用した。多くの連続実行を行った。チャネル表面がどのように処理されそしてどのように清浄されるかにかかわらず、交差点は、決して300塩基より大きくなかった。図1は、サンドイッチチップ上のGeneScan 700ラダーの分離および関連の交差プロットを示す。この場合、交差点は250bpである。このことは、ふるいマトリクスの粘度は高いにもかかわらず、PMMA表面由来の残りのEOFが比較的高く、そしてDNA分離の分離能の低下を生じ得ることを示唆する。これは、様々な実験において、適切な分解能(500bp付近)は、非慣用的な分離ポリマーまたは表面前処理を使用することなく達成され得ないという事実に従う。
【0034】
(Zeonorチップを用いるDNA分離)
同じサンプル(TETで標識したGeneScan 700ラダー)の分離を、Z1420R/Z1020R/Z1420Rの組み合わせからなるZeonorサンドイッチチップを使用して実施し、ここで、これらの層は、熱圧縮され、このZ1020R組成物は、低いガラス転移温度を有し、その結果、接着層として働く。2つの外層は、1mm厚であり、中間層は、50〜100μmの範囲の厚さを有する。この外層のうちの1つを、層にパターンを刻むために、マスターを使用して、チャネルパターンでエンボス加工した。1×TTEおよび7Mの尿素中の同じ2%のLPA溶液を、ふるいマトリクスとして使用し、そしてこの実験を35℃および150V/cmで行った。この結果を、図2に示す。同じふるいマトリクスのフラッシュを数回行った後、GeneScan 700の分離は、交差点に関して、525bpまでの分解能に達した。図4は、Zeonorサンドイッチチップを用いるGeneScan 700のDNA分離のいくつかの電気泳動グラフを示す。これらのグラフから、露出したZeonor表面は、いずれの改変も行うことなく、500bpまでのDNA分離を提供し得ることが明らかである。
【0035】
以下の表は、PMMAおよびZeonorの2つの異なる表面上のDNA分離の連続実行の比較である。これは、Zeonor表面が、2% LPA溶液との相互作用を提供し得、その結果、このZeonor表面はEOFを減少させるが、PMMAは減少させないことを示唆する。
【0036】
【表2】
図6〜7は、それぞれ、ガラスチップおよびノルボルネンベースのポリマーチップを用いた場合の結果の交差プロットを示し、それにより同じ表面コーティング材料の存在下において、ノルボルネンベースのポリマーチップは、分離においてガラスチップより実質的に良好であること、およびこの表面コーティングは、コーティング組成物の非存在と比較して、ノルボルネンベースのポリマーチップを用いた場合に、小さな分離の増大を提供することを示す。
【0037】
上記の結果および考察から明らかであることは、本発明に従うポリマーマイクロチャネルは、イオンの電気泳動分離において良好な性能を提供するということである。この表面は、予め処理する必要がなく、このシステムは、従来のふるい媒体の存在下で操作的である。特別な添加物または表面の処理は、必要ではない。
【0038】
本明細書中で記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、各々の個々の刊行物、特許または特許出願が参考として援用されるように詳細かつ個々に示されるのと同じ程度まで、本明細書中で参考として援用される。
【0039】
本発明は、ここで、詳細に記載され、多くの変更および改変は、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくなされ得ることが、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、裸のPMMAチップ上のDNAラダーのDNA分離のエレクトロフェログラムおよび分離間隔のグラフ(交差プロット)である。
【図2】 図2は、裸のノルボルネンに基づくポリマーチップ上のDNAラダーのDNA分離のエレクトロフェログラムおよび分離間隔のグラフ(交差プロット)である。
【図3】 図3は、2.4%LPA、1×TTEおよび7M尿素を使用する、PMMAチップ上で行われるDNAラダーの最初の連続的なDNA分離からの結果を示す。
【図4】 図4は、2.4%LPA、1×TTEおよび7M尿素を使用する、ノルボルネンに基づくポリマーチップ上で行われるDNAラダーの最初の連続的なDNA分離からの結果を示す。
【図5】 図5は、微小流体パターンの概略図であり、図5Bは、チャネルの断面である。図5Bは、チャネルの断面である。
【図6】 図6は、コーティング組成物を使用する、ガラスマイクロチップ上のDNAラダーの分離についての交差プロットである。
【図7】 図7は、ガラスマイクロチップについて使用されるのと同じコーティング組成物を使用する、ノルボルネンに基づくポリマーマイクロチップ上のDNAラダーの分離についての交差プロットである。
Claims (19)
- 微小流体デバイスを使用する、サンプル中のイオンの混合物を分離するための方法であって、該微小流体デバイスは、中性のノルボルネンベースのポリマー基板、該基板に形成されたマイクロチャネル、および、該マイクロチャネル内で電場を生成するための2つの電極を備え、該方法は、以下:
該電場の電気的影響下で篩い分けポリマーの水性分散を含む該マイクロチャネル中に該サンプルを導入し、これによって該サンプル中のイオンが該水性分散において移動して画分に分離される、工程、
を包含する、方法。 - 前記イオンが核酸である、請求項1に記載の方法。
- 前記篩い分けポリマーがアクリルアミドである、請求項1に記載の方法。
- 前記ノルボルネンベースのポリマーが、炭化水素コポリマーである、請求項1に記載の方法。
- 前記炭化水素コポリマーが、ノルボルネン誘導体のコポリマーである、請求項4に記載の方法。
- 核酸を配列決定する方法であって、
該方法は、
標的DNAをコピーして、該核酸のサンプルの配列に相補的な複数の異なるサイズの標識されたフラグメントのサンプル混合物を生成する工程、
中性のノルボルネンベースのポリマー基板、該基板に形成されたマイクロチャネル、および、該マイクロチャネル内で電場を生成するための2つの電極を備える微小流体デバイスを使用する工程、
を包含し、そして、該方法は、さらに、以下:
該電場の影響下で篩い分けポリマーを含む該マイクロチャネル中に該サンプル混合物を導入し、これによって該異なるサイズの標識されたフラグメントがサイズごとに分離される工程;および
該異なるサイズの標識されたフラグメントを検出して該標的DNAの配列を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記篩い分けポリマーが線状ポリアクリルアミドである、請求項6に記載の方法。
- 前記フラグメントが、少なくとも1つの標識された終止ヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって生成される、請求項6に記載の方法。
- 中性ノルボルネンベースのポリマー基板、該基板において形成されたマイクロチャネル、および、該マイクロチャネル内で電場を生成するための2つの電極を備え、該マイクロチャネルが100〜40,000μm2の範囲の断面を有する、微小流体デバイス。
- 前記ノルボルネンベースのポリマーがコポリマーである、請求項9に記載の微小流体デバイス。
- 前記マイクロチャネルが、篩い分けポリマーの水性分散を含む、請求項9に記載の微小流体デバイス。
- 前記篩い分けポリマーが線状ポリアクリルアミドである、請求項11に記載の微小流体デバイス。
- 前記中性ノルボルネンベースのポリマー基板が、3層のノルボルネンベースのポリマーを含み、第一の外側層は、マイクロチャネルおよびリザーバ機構を備え、第二の中間層、および第三の外側層は、該機構の片側を囲み、ここで該第二の中間層は、該第一の外側層および第三の外側層よりも低いガラス転移温度を有する、請求項9に記載の微小流体デバイス。
- 前記ノルボルネンベースのポリマーが、コポリマーである、請求項13に記載の微小流体デバイス。
- 前記マイクロチャネルが、篩い分けポリマーの水性分散を含む、請求項13に記載の微小流体デバイス。
- 前記篩い分けポリマーが、線状ポリアクリルアミドである、請求項15に記載の微小流体デバイス。
- 少なくとも1cm2かつ200cm2以下の表面積を有する中性ノルボルネンポリマーベースの固体基板を備える微小流体デバイスであって、少なくとも2つの接続されたマイクロチャネルおよび少なくとも3つのリザーバを備える少なくとも1つの微小流体ユニットを有し、該マイクロチャネルは100〜40,000μm2の範囲の断面積を有し、そして、該基板に形成され、ノルボルネンポリマーベースのカバー層が、該中性ノルボルネンポリマーベースの固体基板に接着されて少なくとも該マイクロチャネルを囲んでおり、そして、該マイクロチャネル内で電場を生成するための2つの電極を備える、微小流体デバイス。
- 請求項17に記載の微小流体デバイスであって、ここで前記カバー層は、前記基板のガラス転移温度よりも少なくとも20℃低いガラス転移温度を有するノルボルネンポリマーベースの層によって該基板に結合されている、微小流体デバイス。
- 前記チャネルの少なくとも1つにおいて篩い分けポリマーを含む、請求項17に記載の微小流体デバイス。
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