JP3709123B2 - 電気泳動分析方法 - Google Patents
電気泳動分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3709123B2 JP3709123B2 JP2000185276A JP2000185276A JP3709123B2 JP 3709123 B2 JP3709123 B2 JP 3709123B2 JP 2000185276 A JP2000185276 A JP 2000185276A JP 2000185276 A JP2000185276 A JP 2000185276A JP 3709123 B2 JP3709123 B2 JP 3709123B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mobility
- migration time
- sample
- eof
- unknown sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
- G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
- G01N27/44726—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means using specific dyes, markers or binding molecules
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44704—Details; Accessories
- G01N27/44743—Introducing samples
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気泳動分析方法に係り、特に、キャピラリー電気泳動法を用いて、未知試料に標準物質を添加してそれぞれの泳動時間を変換して、未知試料の実効移動度を求めることにより、未知試料を高い精度で迅速に同定する電気泳動分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、各種溶液中に含まれる高分子、コロイド粒子等を同定する場合、溶液中で高分子やコロイド粒子が電位差に応じて移動（泳動）する現象、いわゆる電気泳動を利用した分析方法が普及している。高分子、コロイド粒子の溶液中での泳動速度は、溶液中の電解質の種類や濃度だけでなく、高分子、コロイド粒子自身の粒子の形及び大きさに影響される。このため、この電気泳動を利用した分析方法のひとつである、キャピラリー電気泳動（ＣＺＥ、capillary zone electrophoresis）は、例えば、タンパク質等に含まれるＤＮＡ断片の長さを分析するための重要な分析方法として注目されている。
【０００３】
このキャピラリー電気泳動分析方法には、溶液中の未知物質（未知試料）の定性指標として直接用いられるピークポジションの高い再現性が求められる。このキャピラリー電気泳動による分析結果を、横軸に溶液中の未知試料による泳動時間、縦軸にピークポジションをとる座標軸に基づいたフェログラムで表現する場合、再現性の良いピークポジションを得るためには、泳動電圧（電流）、分離チャンバーの温度及び電気浸透流のコントロールがそれぞれ重要なファクターとなる。
【０００４】
この泳動電圧（電流）及び分離チャンバーの温度は、分析する際の条件（例えば、キャピラリーの内径、支持電解液等）を同じにすることで、コントロールすることが十分可能である。一方、電気浸透流のコントロールは、ジュール熱によるセパレーションチューブの温度上昇が避けられないため、困難となる。このため、時間軸を持つ通常のキャピラリー電気泳動フェログラムの分析再現性は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ほど高くはない。
【０００５】
溶液中の未知試料の泳動時間の再現性を妨げる要因としては、例えば、電気浸透流の変化、電位勾配の緩和効果（ＲＰＧ）、高電圧の印加に伴って発生するジュール熱による温度上昇等が挙げられる。これらは複合的な要因で起こるためコントロールが難しく、異なる装置を用いて測定した場合、試料や支持電解液が同じであっても同じ泳動時間を得ることが困難となることが想定される。したがって、異なる装置を使用した場合での測定結果を正しく比較するためには、電気泳動データの標準化が必要とる。
【０００６】
一方、Ｌｅｅらは、電気量、すなわち、電流の積分値をキャピラリーの断面積とキャピラリー全長で割った値を用いる泳動指標（ＭＩ、Migration Index）と、さらに浸透流のＭＩを補正した調節泳動指標（ＡＭＩ、Adjusted Migration Index）を提案した（ＭＩ、ＡＭＩの単位は、明細書中、μＣ／ｍ３とした）。ＡＭＩは、支持電解液が同じであれば、かなり良い定性指標になると考えられたが、ＡＭＩのパラメータのひとつに支持電解液の伝導度が含まれているため、わずかな組成の違い（例えば、ｐＨはほぼ同じでもカウンターイオンが異なる場合等）で測定結果が異なってしまう。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述の事項を防止するためには、定性指標として、試料イオンと支持電解液の条件だけに依存する実効移動度を用いる電気泳動分析方法を提案すればよい。しかしながら、従来の泳動時間から実効移動度への変換法では、ジュール熱による移動度の変化や電位勾配の緩和効果が考慮されていない場合が多かった。
【０００８】
ここで、本発明に関連する技術について説明する。
本発明者らは、ジュール熱による移動度の変化や電位勾配の緩和効果を補正する方法として、未知試料に標準物質を添加して、キャピラリー電気泳動を実行し、標準物質の泳動時間を求め、浸透流の速度が時間に対し直線的に変化すると仮定して、この標準物質の泳動時間から実効移動度に変換する方法を既に出願している（特願平１１−２５１６０４）。
【０００９】
この方法は、試料の実効移動度の温度依存性（サンプルイオン自身の温度依存性と支持電解液への温度依存性）などを、厳密な物理現象と関連させて補正するものでなく、浸透流の速度が時間に対し直線的に変化すると仮定した仮想的な浸透流速度を用いるので、この直線的変化を表す実験式中の係数にすべての現象が含まれてしまい物理的な意味合いがあいまいになってしまうことが想定される。
【００１０】
そこで、本発明者らは、再現性を低下させる三つの要因（泳動速度に影響するサンプルイオン自身の温度依存性、支持電解液への温度依存性、電位勾配の緩和効果に基づく泳動時間の遅れ）を、本来の物理的な現象として捉えると共に、これらの要因を理論的に取り除く方法を模索した。
【００１１】
本発明は、以上の点に鑑み、キャピラリー電気泳動法を用いて、未知試料を同定するために重要な役割を果たす実効移動度を、高い精度で迅速に求めることを目的とする。
また、本発明は、分析装置の動作条件による実効移動度のばらつきをなくし、未知試料毎の標準指標としてのデータの信頼性を高めることを目的とする。また、本発明は、異なる分析装置で同じ指標を使用することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１の解決手段によると、
未知試料を含む試料に標準物質を添加すると共に、電気泳動による標準物質及び未知試料の泳動時間と、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間を測定するステップと、
前記測定するステップにより測定された、標準物質及び未知試料の泳動時間、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間と、標準物質の基準温度における既知の実効移動度に基づいて、未知試料の実効移動度を求めるステップと
を含む電気泳動分析方法を提供する。
【００１３】
本発明の第２の解決手段によると、
未知試料を含む試料に標準物質を添加すると共に、電気泳動による標準物質及び未知試料の泳動時間を測定するステップと、
前記測定するステップにより測定された、標準物質及び未知試料の泳動時間と、標準物質の基準温度における既知の実効移動度に基づいて、未知試料の実効移動度を求めるステップと
を含む電気泳動分析方法を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
１．概要
１−１．キャピラリー電気泳動
電気泳動を用いた分析方法としては、Ｕ字管電気泳動法、アガロース電気泳動法、キャピラリー電気泳動法等が知られている。本発明では、キャピラリー電気泳動法を用いて、未知試料を同定するために重要な役割を果たす実効移動度を求めるため、まず、キャピラリー電気泳動法についての概要を説明する。
【００１５】
キャピラリー電気泳動は、水、有機溶媒を問わず、イオンの移動度の差により分離・分析する手法であり、液体クロマトグラフィー法と比べて数段分離能が高く、近年非常に注目されている分析方法である。このキャピラリー電気泳動は、何かの溶媒に溶け、電気を導通する事ができれば利用することができるので、分離する条件（溶媒、ｐＨ、添加剤等）さえ整えば、ほぼ「何でも」分析することができる。但し、このキャピラリー電気泳動は、そのままでは移動度の差がない中性物質や巨大分子などには適用されにくいため、これらの分離・分析には、他の電気泳動モードが用いられことが多い。
【００１６】
他の電気泳動法としては、例えば、中性分子の場合、ミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）と呼ばれる方法が用いられ、巨大分子の場合には、電解液にゲルを添加するキャピラリーゲル電気泳動法（ＣＧＥ）が用いられる。キャピラリーゲル電気泳動法は、特に、ヒトゲノム計画のキーテクノロジーの一つで、塩基配列はこの手法を用いて決定されている。なお、本発明は、これらの電気泳動法にも適用可能な場合がある。
【００１７】
また、キャピラリー電気泳動は、ゲノムプロジェクトの次の生化学研究の段階と考えられているプロテオーム（タンパクの機能・構造の特定）分析に対して有用と注目されており、特に、精密な移動度の決定ができれば、質量分析装置と組み合わせることで、タンパク質の研究に非常に有効な分析方法となることが報告されている。さらに、廃液が大変少ないため（どんなに多くても数ｍｌ）、環境への影響も考慮した分析方法といえる。
【００１８】
図１は、一般的なキャピラリー電気泳動装置の概略構成図である。但し、分析対象は、試料内の陽イオンとし、この陽イオンの分析には、後述する間接吸収法を適用した。
このキャピラリー電気泳動装置１は、例えば、高圧電源部２、バイアル３、４、キャピラリー５、スリット６、光源（例えば、ＵＶランプ）７、回折格子８及びマルチチャンネルフォトダイオード９を備える。高圧電源部２は、例えば、出力０〜３０ｋＶの高電圧電源であって、配線を介してバイアル３、４にそれぞれ接続されている。バイアル３、４は、図示しないターンテーブルや並進台上に載置されている。バイアル３、４には、ＵＶ吸収のある適宜の支持電解液が注入される。また、バイアル３には、分析するためのＵＶ吸収のない試料が導入される。キャピラリー５は、適宜の内径及び長さを有する管であり、キャピラリー５の一端はバイアル３に挿入され、他端はバイアル４に挿入されている。
【００１９】
キャピラリー５には、光源７から照射される紫外線の幅を制限するための隙間を有するスリット６が取り付けられている。このスリット６を通過した光は、回折格子８によって、適宜のスペクトルに分解される。この得られたスペクトルは、マルチチャンネルフォトダイオード９によって、ＵＶの吸光度として数値化される。なお、高圧電源部２、バイアル３、４及びマルチチャンネルフォトダイオード９は、図示しないコンピュータにより制御されている。
【００２０】
キャピラリー電気泳動装置１の動作概要を説明する。
まず、支持電解液が注入されたバイアル３と空のバイアル４とをセットする。バイアル４を密封しバイアル３に注入された支持電解液を吸引する。この吸引された支持電解液は、キャピラリー５内に満たされる。次に、例えば、落差法により、試料をキャピラリー５の一端付近に注入する。具体的には、バイアル４に支持電解液（水でもよい）、バイアル３に試料を導入する。この際、バイアル３の液面がバイアル４の液面より高くなるように設定する。このバイアル３、４の液面差によるサイフォンの原理で、試料がバイアル３からキャピラリー５の一端付近に注入される。次に、支持電解液が注入され、液面が同じ高さであるバイアル３、４をセットする。ここで、高圧電源部２からの高電圧をキャピラリー５の両端に印加する。
【００２１】
試料は、キャピラリー５内を有効長（試料が導入されたキャピラリー５の一端付近からキャピラリー５に沿ったスリット６までの距離）だけ泳動する。この試料内の陽イオンの泳動方向は、図中矢印で示すように、バイアル３からバイアル４に向かっている。この間に、試料内の各陽イオンは、各陽イオンの泳動速度（実効移動度）の差により分離される。この泳動速度（実効移動度）の差により分離された試料は、上述した回折格子８によって、一定時間ごとのスペクトルデータとして検出される。このスペクトルデータは、上述したマルチチャンネルフォトダイオード９によって、ＵＶの吸光度として数値化される。なお、ここでは、試料内の陽イオンを分析したが、陰イオンを分析する場合は、高圧電源部２の符号を逆にすればよい。
【００２２】
また、試料をキャピラリー５の一端付近に注入する際、落差法を採用したが、これ以外の方法としては、例えば、吸引法、加圧法及び電気的加圧法が挙げられる。吸引法では、バイアル３に試料を詰め、バイアル４を空にする。つぎに、空のバイアル４を密封し吸引することにより、試料をキャピラリー５内に注入する。加圧法では、バイアル３に試料を詰め、バイアル４を空にする。つぎに、バイアル３を密封し加圧することにより、試料をキャピラリー５内に注入する。電気的注入法では、バイアル３に試料を詰め、バイアル４に電解液（水でも可）を詰める。つぎに、高電圧を印加することにより、試料をキャピラリー５内に注入する。
【００２３】
１−２．泳動時間−実効移動度変換法による実効移動度の算出
キャピラリー電気泳動法における電気泳動現象と実効移動度の算出の概要を説明する。
従来の泳動時間−実効移動度変換法では、実効移動度ｍは以下のようにして求められる。
ｍ＝νｉｏｎ／Ｅ ＝（ｌ／ｔ−νｅｏｆ）／（Ｖ／Ｌ） （１）
ここで、Ｖは印加電圧、Ｅは電位勾配、ｌは有効長、Ｌはキャピラリー全長、νｉｏｎは未知試料の泳動速度、ｔは未知試料が検出器によって検出されるまでの時間（泳動時間）である。
【００２４】
また、νｅｏｆ（電気浸透流速度、electroosmotic flow velocity）は、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間ｔｅｏｆを用いて以下の式から得られる。
νｅｏｆ＝ｌ／ｔｅｏｆ （２）
すなわち、式（１）は次のようになる。
ｍ＝（ｌ／ｔ−ｌ／ｔｅｏｆ）／（Ｖ／Ｌ） （１）’
【００２５】
システムピークとは、間接吸収法を用いたとき、電気浸透流によってキャピラリー内の液体が流され、試料を導入した部分が検出器に到達した場合に出現する、あたかも何か物質があるかのようなピークをいう。したがって、システムピークの泳動時間ｔｅｏｆは、システムピークが出現するまでの時間をいう。また、間接吸収法とは、例えば、試料にＵＶ（紫外線）の吸収がない場合、電解液にUV吸収のある物質を用いると、試料の部分だけ電解液の物質が減少し、ＵＶの吸光度が低下することを利用した検出方法である。
【００２６】
また、電気浸透流とは、例えば、シリカキャピラリーを用いたとき、キャピラリー内壁にあるシラノール基が解離することにより内壁が負に帯電し、キャピラリー内部にある溶液が見かけ上正に帯電することにより、電場を印加すると液体全体が負電極側に流れる現象をいう。この電気浸透流は、キャピラリーに他の物質を用いても、ほとんどの場合、発生する（但し、物質や電解液の組成により流れる向きが変わることもある）。また、移動度０の泳動時間ｔｅｏｆは、電場の印加により、上述のように、電気浸透流のためにキャピラリー内の液体全体が押し流されるため、移動度を持たないような（即ち、移動度０）物質（例えば、中性物質）でも検出器によって検出されるので、このような電場を印加してから検出されるまでの時間である。
【００２７】
ここで、温度による移動度の変化を詳しく検討すると、サンプルの実効移動度ｍの温度依存性は、次式のように、サンプルイオン自身の項ｆ（Ｔ）と支持電解液への温度依存性の項ｇ（Ｔ）＝ε／η（ε：誘電率，η：粘性係数）とに分けて考えられる。
ｍ＝ｆ（Ｔ）・ｇ（Ｔ） （３）
【００２８】
この式を基準温度Ｔ０の周りでテイラー展開すると、次のようになる。
但し、ΔＴ＝Ｔ−Ｔ０，ｆ０＝ｆ（Ｔ０），ｇ０＝ｇ（Ｔ０）
ここで、温度変化によるイオンサイズの変化は、溶媒の粘度や誘電率の温度依存性と比較して非常に小さいため、イオン自身への影響の温度依存性を無視すると、実効移動度ｍは次式で表される。
ｍ＝ｆ０（ｇ０＋ｇ１ΔＴ＋ｇ２ΔＴ２＋…）
【００２９】
＝ｆ０ｇ０（１＋ｇ１／ｇ０・ΔＴ＋ｇ２／ｇ０・ΔＴ２＋…） （５）
ここで、ΔＴが小さいところでは２次以降の項を無視することができ、さらに、
ｆ０ｇ０＝ｍ０，ｇ１／ｇ０＝αと置き換えると、物質に依らず移動度は
ｍ＝（１＋αΔＴ）・ｍ０ （６）
と表される。ここで、ｍ０は基準温度におけるサンプルの実効移動度を表し、αはサンプルイオンに依存しない温度係数を表す。一般に、２５℃における温度係数αの値は約０．０２（例：Ｋ ０．０１９１、Ｌｉ ０．０２２８）である。
【００３０】
１−３．温度係数のみを考慮した変換法
次に温度係数のみを考慮した変換法について説明する。
既知標準物質（実効移動度ｍｓ）の基準温度Ｔ０における実効移動度ｍ０，ｓは、式（１）’を用いて次のように求められる。
ｍ０，ｓ＝（ｌ／ｔｓ−ｌ／ｔｅｏｆ）／｛（１＋αΔＴ）Ｅ｝
【００３１】
さらに、式（６）よりｍｓとｍ０，ｓの関係は次のようになっている。
１＋αΔＴ＝ｍｓ／ｍ０，ｓ （７）
また、試料物質（実効移動度ｍ）の基準温度Ｔ０における実効移動度ｍ０は式（１）’を用いて次のように求められる。
ｍ０＝（ｌ／ｔ−ｌ／ｔｅｏｆ）／｛（１＋αΔＴ）Ｅ｝
【００３２】
さらに、ｍとｍ０の関係は、式（６）から次のようになる。
１＋αΔＴ＝ｍ／ｍ０
これらの式から、温度Ｔ０における試料物質（イオン）の実効移動度ｍ０は次式のように得られる。
この式（８）によれば、Ｅ，Ｖ，ｌ，Ｌといった装置に依存するパラメータが消去されることになり、装置の条件に依存しない電気泳動データの標準化が可能となる。
【００３３】
したがって、本実施の形態では、以上の理論を用いて、未知試料に標準物質を添加してそれぞれの泳動時間から移動度を測定し、その移動度の値から物質を同定するキャピラリー電気泳動法において、まず、実効移動度が温度のみに影響される場合の補正方法として、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間ｔｅｏｆ、標準物質の泳動時間ｔｓおよび標準物質の基準温度Ｔ０における実効移動度ｍｏ，ｓから未知物質の実効移動度ｍ０を式（８）を用いて求める。なお、式（８）に含まれるパラメータであるｍｏ，ｓは、論文・既存データから決定される。また、ｔｅｏｆは、例えば、キャピラリー内の電解液の濃度のむら等により測定される。さらに、ｔｅｏｆ、ｔ及びｔｓは、既存データ・実験値、又はだいたいの見積もり等から、どの検出ピークがどの物質に対応するのか当たりを付けることができるので、後述する実験より得られたフェログラムからそれぞれの泳動時間を決定できる。
【００３４】
１−４．温度及び時間補正を考慮した変換法
次に、温度だけでなく、時間補正も考慮した変換法について説明する。
一般に、電位勾配の緩和効果によりイオンの泳動時間はすべて一定時間だけ遅れるものと考えられる。この電位勾配の緩和効果は、本発明者らがシミュレーションにより見出した現象である(J. Chromatogr.A, 898(1999)19-29)。具体的には、定電圧電源を用いてキャピラリーの両端に高電圧をかけた場合、試料を導入した部分の電位勾配の時間変化のために、キャピラリーを流れる電流がすぐには一定にならず、しばらく時間がたってから一定になる。そのため、従来電気泳動を用いて移動度を決定するときに用いられる平均電位勾配（電圧/キャピラリー全長）は、すぐには得られないため、従来の計算方法で予測される泳動時間よりも、ある一定時間遅れて検出される現象をいう（この遅延時間を、本明細書中、τと表す）。
【００３５】
ここで、電気浸透流が測定中一定であるとして、この電位勾配の緩和効果を考慮に入れると、サンプルイオンの実効移動度ｍは次のように表される。
ｍ＝ｌ／｛（ｔ−τ）Ｅ｝−ｍｅｏｆ （９）
【００３６】
ここで、ｍｅｏｆは浸透流の移動度、νｅｏｆ／Ｅである。すなわち、この移動度は、ジュール熱により上昇したキャピラリー内温度におけるものを表している。この式を上記式（６）に代入すると、基準温度Ｔ０における実効移動度ｍ０を求めることのできる次式を得る。
ｍ０＝｛ｌ／（ｔ−τ）Ｅ−ｍｅｏｆ｝／（１＋αΔＴ） （１０）
【００３７】
しかしながら、パラメーターτ、ｍｅｏｆおよび１＋αΔＴは未知数である。そこで、移動度が既知である標準試料（標準物質）Ａ，Ｂおよび移動度０の物質又はシステムピークの泳動時間ｔｅｏｆから、これらのパラメーターを決定する。標準試料Ａ，Ｂおよびシステムピークの移動度は以下の式で表される。
ｍ０，Ａ＝［ｌ／｛（ｔＡ−τ）Ｅ｝−ｍｅｏｆ］／（１＋αΔＴ） （１１）
ｍ０，Ｂ＝［ｌ／｛（ｔＢ−τ）Ｅ｝−ｍｅｏｆ］／（１＋αΔＴ） （１２）
ｍｅｏｆ＝ｌ／｛（ｔｅｏｆ−τ）Ｅ｝ （１３）
【００３８】
ここで、ｔＡ、ｔＢは、標準物質Ａ、Ｂの泳動時間、ｍ０，Ａ、ｍ０，Ｂは、標準物質Ａ、Ｂの基準温度Ｔ０における実効移動度である。
式（１１）〜（１３）から、次式が得られる。
τ＝｛ｍ０，ＡｔＡ（ｔｅｏｆ−ｔＢ）−ｍ０，ＢｔＢ（ｔｅｏｆ−ｔＡ）｝／｛ｍ０，Ａ（ｔｅｏｆ−ｔＢ）−ｍ０，Ｂ（ｔｅｏｆ−ｔＡ）｝ （１４）
【００３９】
また、式（１１）を変形して、次式が得られる。
１＋αΔＴ＝［ｌ／｛（ｔＡ−τ）Ｅ｝−ｍｅｏｆ］／ｍ０，Ａ （１５）
さらに、式（１３）（１５）を式（１０）に代入すると
ｍ０＝｛（ｔＡ−τ）（ｔｅｏｆ−ｔ）／（ｔ−τ）（ｔｅｏｆ−ｔＡ）｝・ｍ０，Ａ （１６）
となる。この式（１６）によれば、Ｅ、Ｖ、ｌ、Ｌといった装置に依存するパラメーターが消去されることになり、装置の条件に依存しない電気泳動データの標準化が可能となる。
【００４０】
したがって、本実施の形態では、実効移動度ｍ０が温度に影響されるのみならず電位勾配の緩和効果による泳動時間遅れの影響も受ける場合の補正方法として、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間ｔｅｏｆ、二つ以上の標準物質の泳動時間ｔＡ、ｔＢおよび該標準物質の基準温度Ｔ０における実効移動度ｍ０，Ａ、ｍ０，Ｂから、未知物質の実効移動度ｍ０を式（１４）及び（１６）を用いて求める。なお、式（１４）及び（１６）に含まれるパラメータであるｍ０，Ａ、ｍ０，Ｂは、論文・既存データから決定される。また、ｔｅｏｆ、ｔ及びｔＡ、ｔＢは、上述のように、例えば、既存データ・実験値又はだいたいの見積もり等から当たりを付け、物質との関係を把握することができるので、後述する実験より得られたフェログラムからそれぞれの泳動時間を決定できる。
【００４１】
さらに、移動度０の物質が添加できない、又は、システムピークを検出することができない（すなわち、ｔｅｏｆを特定できない）場合を考慮した変換法について説明する。まず、移動度が既知の標準物質Ａ、Ｂ、Ｃを試料に添加し、これらの泳動時間ｔＡ、ｔＢ、ｔＣを測定することにより、必要なパラメータを決定する。
【００４２】
標準物質Ａ、Ｂ、Ｃの移動度は、上述したように次のように表される。
ｍ０，Ａ＝［ｌ／｛（ｔＡ−τ）Ｅ｝−ｍｅｏｆ］／（１＋αΔＴ） （１１）
ｍ０，Ｂ＝［ｌ／｛（ｔＢ−τ）Ｅ｝−ｍｅｏｆ］／（１＋αΔＴ） （１２）
ｍ０，Ｃ＝［ｌ／｛（ｔＣ−τ）Ｅ｝−ｍｅｏｆ］／（１＋αΔＴ） （１７）
式（１１）（１２）（１７）から、次式が得られる。
ただし、ｉ、ｊはＡ、Ｂ、Ｃのいずれかであり、かつ、ｉ≠ｊ
ｍｅｏｆ＝ｌ／｛（ｔｉ−τ）Ｅ｝−ｍ０，ｉ（１＋αΔＴ） （２０）
ただし、ｉはＡ、Ｂ、Ｃのいずれかである。
【００４３】
このようにして得られたτ、１＋αΔＴ、ｍｅｏｆを式（１０）に代入すると次式が得られる。
ｍ０＝｛（ｔｉ−ｔ）（ｔｊ−τ）（ｍ０，ｊ−ｍ０，ｉ）｝／｛（ｔ−τ）（ｔｉ−ｔｊ）｝＋ｍ０，ｉ （２１）
ただし、ｉ、ｊは、Ａ、Ｂ、Ｃのいずれかであって、かつ、ｉ≠ｊ
ここで、ｍ０，Ｃ＝０、ｔＣ＝ｔｅｏｆ、ｉ＝Ｃ、ｊ＝Ａとすると、式（１４）〜（１６）が得られる。
導出過程を以下に示す。
式（１１）（１２）（１７）から、次式が得られる。
ｍｅｏｆ＝ｌ／｛（ｔＡ−τ）｝−ｍ０，Ａ（１＋αΔＴ） （１１）’
ｍｅｏｆ＝ｌ／｛（ｔＢ−τ）｝−ｍ０，Ｂ（１＋αΔＴ） （１２）’
ｍｅｏｆ＝ｌ／｛（ｔＣ−τ）｝−ｍ０，Ｃ（１＋αΔＴ） （１７）’
【００４４】
また、式（１１）’から式（１２）’および式（１７）’を引いて整理すると、次式が得られる。
（ｔＡ−τ）（ｔＢ−τ）＝｛ｌ（ｔＢ−ｔＡ）｝／｛Ｅ（１＋αΔＴ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｂ）｝ （ａ）
（ｔＡ−τ）（ｔＣ−τ）＝｛ｌ（ｔＣ−ｔＡ）｝／｛Ｅ（１＋αΔＴ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｃ）｝ （ｂ）
さらに、（ａ）／（ｂ）から
（ｔＢ−τ）／（ｔｃ−τ）＝｛（ｔＢ−ｔＡ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｃ）｝／｛（ｔＣ−ｔＡ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｂ）｝＝Ｋ （ｃ）
とすると、次式が得られる。
τ＝（ｔＢ−ＫｔＣ）／（１−Ｋ） （ｃ）’
【００４５】
ここで、τの分子及び分母をそれぞれ整理すると、
τの分子＝ｔＢ−｛（ｔＢ−ｔＡ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｃ）ｔＣ｝／｛（ｔＣ−ｔＡ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｂ）｝
＝｛ｍ０，ＡｔＡ（ｔＣ−ｔＢ）＋ｍ０，ＢｔＢ（ｔＡ−ｔＣ）＋ｍ０，ＣｔＣ（ｔＢ−ｔＡ）｝／｛（ｔＣ−ｔＡ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｂ）｝
τの分母＝１−｛（ｔＢ−ｔＡ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｃ）｝／｛（ｔＣ−ｔＡ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｂ）｝
＝｛ｍ０，Ａ（ｔＣ−ｔＢ）＋ｍ０，Ｂ（ｔＡ−ｔＣ）＋ｍ０，Ｃ（ｔＢ−ｔＡ）｝／｛（ｔＣ−ｔＡ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｂ）｝
となり、さらに、次式が得られる。
【００４６】
また、式（ａ）もしくは（ｂ）から、次式が得られる。
１＋αΔＴ＝｛ｌ（ｔｉ−ｔｊ）｝／｛Ｅ（ｔｉ−τ）（ｔｊ−τ）（ｍ０，ｉ−ｍ０，ｊ）｝ （１９）
また、式（１１）’（１２）’（１７）’のいずれかを使うことで、次式が得られる。
ｍｅｏｆ＝ｌ／｛（ｔｉ−τ）｝−ｍ０，ｉ（１＋αΔＴ） （２０）
【００４７】
これにより、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間ｔｅｏｆを特定できない場合であっても、三つ以上の標準物質の泳動時間ｔＡ、ｔＢ、ｔＣおよび該標準物質の基準温度Ｔ０における実効移動度ｍ０，Ａ、ｍ０，Ｂ、ｍ０，Ｃから、未知物質の実効移動度ｍ０を式（１８）及び（２１）を用いて求めることができる。但し、ｍ０，Ｃ＝０、ｔＣ＝ｔｅｏｆ、ｉ＝Ｃ、ｊ＝Ａとすると、式（１４）と（１８）、式（１６）と（２１）は、それぞれ同等の式となるので、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間ｔｅｏｆを特定できない場合での実験は、省略する。なお、式（１８）及び（２１）に含まれるパラメータであるｍ０，Ａ、ｍ０，Ｂ、ｍ０，Ｃは、論文・既存データから決定される。また、ｔＡ、ｔＢ、ｔＣ及びｔは、上述のように、例えば、既存データ・実験値又はだいたいの見積もり等から当たりを付け、物質との関係を把握することができるので、実験より得られたフェログラムからそれぞれの泳動時間を決定できる。
【００４８】
１−５．本発明による電気泳動分析方法の処理手順
図２は、本発明による電気泳動分析方法のフローチャートである。なお、説明の便宜上、ここでのフローチャートの説明は、概略的なものとし、具体的な実験結果は後述する。
【００４９】
まず、未知物質（未知試料）を含む試料に標準物質を添加する（Ｓ１０１）。この標準物質を添加された未知試料を、キャピラリー内に導入すると共に、上述したキャピラリー電気泳動を実行する（Ｓ１０３）。つぎに、このキャピラリー電気泳動を実行することにより、上述１−３で説明したように、実効移動度を求める際、温度による影響のみを考慮した場合、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間ｔｅｏｆ、標準物質の泳動時間ｔｓ及び未知試料の泳動時間ｔが得られ、さらに、標準物質の基準温度Ｔ０における既知の実効移動度ｍｏ，ｓを得る（Ｓ１０５）。これらのパラメータ値と式（８）に基づいて、未知試料の実効移動度ｍ０を算出する（Ｓ１０７）。なお、この算出された未知試料の実効移動度ｍ０に基づいて、未知試料の物質の同定を行ってもよい（Ｓ１０９）。
【００５０】
また、上述１−４で説明したように、実効移動度を求める際、温度だけでなく電位勾配の緩和効果による泳動時間遅れの影響も考慮した場合、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間ｔｅｏｆ、二つ以上の標準物質の泳動時間ｔＡ、ｔＢ及び未知試料の泳動時間ｔが得られ、さらに、該標準物質の基準温度Ｔ０における既知の実効移動度ｍ０，Ａ、ｍ０，Ｂを得る（Ｓ１０５）。これらのパラメータ値と式（１４）及び（１６）に基づいて、未知試料の実効移動度ｍ０を算出する（Ｓ１０７）。なお、この算出された未知試料の実効移動度ｍ０に基づいて、未知試料の物質の同定を行ってもよい（Ｓ１０９）。
【００５１】
２．実験および比較
２−１．実験方法
ここで、発明した方法の有効性を検証するために利用したキャピラリー電気泳動装置には、内径（Ｉ．Ｄ．）７５μｍおよび５０μｍ、全長４０ｃｍ（有効長２７．５ｃｍ）とする、キャピラリーが備えられている。このキャピラリーは、設定温度２５℃であり、１５ｋＶおよび３０ｋＶの電圧が印加される。さらに、波長を検出するために（座標軸上に測定結果を載せるために）、２６５ｎｍの３，５‐ルチジンの吸収を測定する間接吸収法を採用した。
【００５２】
試料は、ＫＣｌ，ＬｉＣｌ，ＴＲＩＳ（トリヒドロキシメチルアミノメタン、Hydroxymethyl Aminomethan），ε−アミノカプロン酸とオクチルスルホン酸ナトリウム３０ｍＭおよび０．３ｍＭの等モル混合試料を用いた。この３０ｍＭ，０．３ｍＭの等モル試料は、それぞれ上述した落差法（２ｃｍ １５ｓ），（２ｃｍ ７５ｓ）を用いて注入した。支持電解液は、２０ｍＭ３，５ルチジンにＨＣｌを加えてｐＨ６．０に調節した溶液（支持電解液Ａ：ＳＥ２０ｍＭ）と、４０ｍＭ３，５‐ルチジンに酢酸を用いてｐＨ６．０に調節した溶液（支持電解液Ｂ：ＳＥ４０ｍＭ）を用いた。
【００５３】
２−２．本発明による泳動時間−実効移動度変換を適用しない状態での実験
図３は、本発明による泳動時間−実効移動度変換を適用しない実験により得られたフェログラムを示す。フェログラムは、上から順に
（Ａ）sample ３０ｍＭ，ＳＥ２０ｍＭ（支持電解液Ａ），Ｉ．Ｄ．７５μｍ，Ｖ＝３０ｋＶ
（Ｂ）sample ３０ｍＭ，ＳＥ４０ｍＭ（支持電解液Ｂ），Ｉ．Ｄ．７５μｍ，Ｖ＝３０ｋＶ
（Ｃ）sample ３０ｍＭ，ＳＥ４０ｍＭ（支持電解液Ｂ），Ｉ．Ｄ．５０μｍ，Ｖ＝３０ｋＶ
（Ｄ）sample ３０ｍＭ，ＳＥ４０ｍＭ（支持電解液Ｂ），Ｉ．Ｄ．５０μｍ，Ｖ＝１５ｋＶ
（Ｅ）sample ３０ｍＭ，ＳＥ４０ｍＭ（支持電解液Ｂ），Ｉ．Ｄ．７５μｍ，Ｖ＝１５ｋＶ
（Ｆ）sample ０.３ｍＭ，ＳＥ４０ｍＭ（支持電解液Ｂ），Ｉ．Ｄ．７５μｍ，Ｖ＝１５ｋＶ
の条件で測定して得られた。また、（Ｃ）では新しいキャピラリーを内壁の処理なしで用い、それ以外の実験では、何度か測定に用いたキャピラリーを用いた。
表１に泳動時間の測定結果（単位：秒）を示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
したがって、ピークは、左から順にＫ＋，Ｎａ＋，Ｌｉ＋，ＴＲＩＳ，ε−アミノカプロン酸，システムピーク，オクチルスルホン酸である。同じ試料・電解液でも、このように実験条件を変化させることにより様々なフェログラムが得られることがわかる。したがって、上述したように、異なる装置を使えば、このように泳動時間の異なるフェログラムしか得られないことになる。このため、多数の未知試料を同時に測定するには、上述したような同じ物質が同じ定性指標を示すような標準化法が有効となる。
【００５６】
２−３．本発明による式（８）を用いた泳動時間−実効移動度変換の実験
図４は、式（８）を用いて移動度を算出（Ｓ１０１〜Ｓ１０７を実行）した際のフェログラムである。
ピークは、左から順にＫ＋，Ｎａ＋，Ｌｉ＋，ＴＲＩＳである。また、図中の実線は標準試料として用いたＬｉの２５℃での既報値３４．９（式（８）のｍｏ，ｓ）である。点線は左からＫ、Ｎａ、ＴＲＩＳの２５℃での既報値であり、それぞれ６９．９、４６．３、２４．４である。この実験により、データのばらつきが大きく改善され、Ｎａ、Ｌｉ、Ｔｒｉｓの移動度のそれぞれの平均（相対標準偏差）は、６６．６（３．６０％）、４５．７（１．１６％）、２２．６（８．０７％）であった。また、これの平均（相対標準偏差）は、既報値の値から４．７４％、１．３７％、７．４９％のずれであった。特に、最も電力が小さく、内径が細く印加電圧の低いサンプル（Ｄ）では、Ｋ，Ｎａの移動度は、既報値と０．９３％、０．０８％のずれしか生じなかった。しかしながら、他のデータは、Ｋの移動度が既報値より小さく見積もられた。
【００５７】
すなわち、これは電位勾配の緩和効果による遅延時間τを考慮に入れていないため、泳動時間の小さなＫの誤差が相対的にやや大きくなったと考えられる。例えば、移動度の小さなＮａでは、その影響が小さくなった。
【００５８】
２−４．本発明による式（１６）を用いた泳動時間−実効移動度変換の実験
図５は、式（１４）及び（１６）を用いて移動度を算出（Ｓ１０１〜Ｓ１０７を実行）した際のフェログラムである。
ピークは、左から順にＫ＋，Ｎａ＋，Ｌｉ＋，ＴＲＩＳである。また、図中の実線は、標準試料として用いたＫ、Ｌｉの２５℃での既報値であり、それぞれ６９．９（式（１４）および（１６）中のｍ０，Ａ）、３４．９（式（１４）および（１６）中のｍ０，Ｂ）である。図中の点線は、左からＮａ、Ｔｒｉｓの２５℃での既報値であり、それぞれ４６．３、２４．４である。この実験によりデータのばらつきが顕著に改善された。Ｎａ、ＴＲＩＳの移動度の平均（相対標準偏差）は４６．４（０．３０％）、２２．２（７．６８％）であった。また、これらは既報値の値から０．２９％、９．１７％のずれであった。なお、ＴＲＩＳの大きなずれは、テーリングを起こしているためである。一方、Ｎａについては、移動度のばらつきを０．３％以下にすることが可能であることが示された。
【００５９】
また、参照温度での実効移動度に変換することが可能なため、例えば、伝導度法のような他の方法で求められた実効移動度と比較することが可能になり、データの汎用性を向上させることができる。
【００６０】
３．従来との比較
３−１．泳動指標（ＭＩ、Migration Index）を用いた実験
図６は、ＭＩを横軸としたフェログラムである。
上述のように、Ｌｅｅらが提案した電気量、すなわち電流の積分値をキャピラリーの断面積とキャピラリー全長で割った値を用いる、ＭＩを用いた場合、図３で示したフェログラムで、全く異なった泳動時間でピークが出ていた（Ｂ）（Ｄ）（Ｅ）（Ｆ）がＭＩで整理することにより、比較的良い一致を示した（ピークは、図３と同様に、左から順にＫ＋，Ｎａ＋，Ｌｉ＋，ＴＲＩＳである）。しかしながら、支持電解液が異なる（Ａ）や浸透流の速度が大きく異なる（Ｃ）では、大きく異なるＭＩにピークが現れた。
【００６１】
すなわち、このＭＩを用いたフェログラムは、ＭＩでは温度の影響を除去することができるが、電解液の性質や浸透流の影響までは十分に除去できないことを示している。
【００６２】
３−２．調節泳動指標（ＡＭＩ、Adjusted Migration Index）を用いた実験
図７は、ＡＭＩを横軸としたフェログラムである。
ＭＩに対して、さらに浸透流の影響を考慮したＡＭＩを用いた場合では、同じ支持電解液を用いた（Ｂ）〜（Ｆ）では、比較的良い一致を示している。図中の点線は、（Ｂ）〜（Ｆ）のそれぞれの物質のピーク位置の平均値を示している。この点線を指標にＡＭＩの値を詳しく調べてみると、相対標準偏差（ＲＳＤ）は４．８３％（Ｋ），３．７７％（Ｎａ），４．７０％（Ｌｉ），７．０８％（Ｔｒｉｓ）とばらついている。さらに、移動度がほぼ同じであるにもかかわらず、（Ａ）では全く異なるフェログラムであった。この差は、支持電解液の伝導度が異なるために生じたものである。
【００６３】
すなわち、このＡＭＩを用いたフェログラムは、温度と浸透流の影響を除去することができるが、電解液の性質やまでは十分に除去できないことを示している。
【００６４】
３−３．実効移動度を横軸とした従来の分析方法による実験
図８は、実効移動度を横軸とした従来の分析方法によるフェログラムを示す。この従来の分析方法では、泳動時間から速度を求め、その速度から浸透流の速度との差を求め、その差を印加した電圧で割り、さらに、キャピラリーの全長をかけることで、実効移動度を算出する。この実効移動度を横軸としたフェログラムでは、ピークは、左から順にＫ＋，Ｎａ＋，Ｌｉ＋，ＴＲＩＳである。また、図中の点線は左からＫ、Ｎａ、Ｌｉ、Ｔｒｉｓ、の２５℃での既報値であり、それぞれ６９．９、４６．３、３４．９、２４．４である。それぞれのピークの移動度は大きくばらついており、Ｋ、Ｎａ、Ｌｉ、Ｔｒｉｓ、の移動度の平均（相対標準偏差）は、９０．７（１７．５％）、６２．５（１９．９％）、４７．８（２１．０％）、３１．１（２６．０％）であった。
【００６５】
さらに詳しく考察すると、印加電圧３０ｋＶの（Ａ）〜（Ｃ）は、１５ｋＶの（Ｄ）〜（Ｆ）と比較して実効移動度が大きく見積もられている。これは系内で発生する電力が大きく、内部の温度が上昇しているため、実効移動度が大きくなったことによる。特に、内径が太く濃い支持電解液を用いた（Ｂ）では、その傾向が顕著であった。さらに、既報値と比較してもすべての物質の移動度が大きく見積もられた。
【００６６】
このように、高電圧を印加するキャピラリー電気泳動を用いて、再現性のあるデータを得るためには、上述の本実施の形態ような、内部温度の上昇を補正するためのデータ処理方法が有効となる。
【００６７】
３−４．実効移動度を横軸とした本発明者らが既に出願した分析方法による実験図９は、実効移動度を横軸とした本発明者らが既に出願した分析方法（特願平１１−２５１６０４）によるフェログラムを示す。
【００６８】
この分析方法によって算出した実効移動度を横軸としたフェログラムでは、ピークは、左から順にＫ＋，Ｎａ＋，Ｌｉ＋，ＴＲＩＳである。また、図中の実線は標準試料として用いたＫ、Ｌｉ、の２５℃での既報値であり、それぞれ６９．９、３４．９である。図中の点線は左からＮａ、Ｔｒｉｓの２５℃での既報値であり、それぞれ４６．３、２４．４である。この実験によれば、データのばらつきが大きく改善され、Ｎａ，Ｔｒｉｓの移動度の平均（相対標準偏差）は、４６．９（１．０５％）、２１．８（８．１１％）であった。また、これらは既報値の値から０．６４％、１０．７％のずれであった。なお、ＴＲＩＳの泳動時間の評価は、テールを引いているために困難であるとＭｉｋｋｅｒｓらが報告しているとおり、Ｔｒｉｓの移動度は既報値と大きくずれたが、Ｎａは、既報値とほぼ一致した。
【００６９】
これにより、この方法は、非常に有用な方法であるが、上述のように物理的な意味合いがあいまいなとなってしまう場合が想定される。
以上、本実施の形態による式（８）、（１４）及び（１６）を用いた泳動時間−実効移動度変換の実験と、従来の方法である、ＭＩ及びＡＭＩを用いた実験、実効移動度を横軸とした従来の分析方法による実験及び本発明者らが既に出願した分析方法による実験とを、比較することにより、キャピラリー電気泳動により測定したデータを、本実施の形態による処理を施せば、混合物中の未知試料のある参照温度での実効移動度が迅速かつ正確に求めることができる。
【００７０】
また、本実施の形態では、一つの装置でもその動作条件によって異なっていた実効移動度のばらつきをなくし、物質毎に標準指標としてのデータの蓄積ができる。また、異なる装置で同じ指標が使用できるため、これらのデータベースの蓄積が進めば、将来未知物質を同定する際、非常に迅速かつ正確な分析が期待される。
【００７１】
【発明の効果】
本発明によると、以上説明した通り、キャピラリー電気泳動法を用いて、未知試料を同定するために重要な役割を果たす実効移動度を、高い精度で迅速に求めることができる。また、本発明によれば、分析装置の動作条件による実効移動度のばらつきをなくし、未知試料毎の標準指標としてのデータの信頼性を高めることができる。また、本発明によれば、異なる分析装置で同じ指標を使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】一般的なキャピラリー電気泳動装置の概略構成図。
【図２】本発明による電気泳動分析方法のフローチャート。
【図３】本発明による泳動時間−実効移動度変換を適用しない実験により得られたフェログラム。
【図４】式（８）を用いて移動度を算出した際のフェログラム。
【図５】式（１４）及び（１６）を用いて移動度を算出した際のフェログラム。
【図６】ＭＩを横軸としたフェログラム。
【図７】ＡＭＩを横軸としたフェログラム。
【図８】実効移動度を横軸とした従来の分析方法によるフェログラム。
【図９】実効移動度を横軸とした本発明者らが既に出願した分析方法によるフェログラム。
【符号の説明】
１ キャピラリー電気泳動装置
２ 高圧電源部
３、４ バイアル
５ キャピラリー
６ スリット
７ 光源
８ 回折格子
９ マルチチャンネルフォトダイオード
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気泳動分析方法に係り、特に、キャピラリー電気泳動法を用いて、未知試料に標準物質を添加してそれぞれの泳動時間を変換して、未知試料の実効移動度を求めることにより、未知試料を高い精度で迅速に同定する電気泳動分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、各種溶液中に含まれる高分子、コロイド粒子等を同定する場合、溶液中で高分子やコロイド粒子が電位差に応じて移動（泳動）する現象、いわゆる電気泳動を利用した分析方法が普及している。高分子、コロイド粒子の溶液中での泳動速度は、溶液中の電解質の種類や濃度だけでなく、高分子、コロイド粒子自身の粒子の形及び大きさに影響される。このため、この電気泳動を利用した分析方法のひとつである、キャピラリー電気泳動（ＣＺＥ、capillary zone electrophoresis）は、例えば、タンパク質等に含まれるＤＮＡ断片の長さを分析するための重要な分析方法として注目されている。
【０００３】
このキャピラリー電気泳動分析方法には、溶液中の未知物質（未知試料）の定性指標として直接用いられるピークポジションの高い再現性が求められる。このキャピラリー電気泳動による分析結果を、横軸に溶液中の未知試料による泳動時間、縦軸にピークポジションをとる座標軸に基づいたフェログラムで表現する場合、再現性の良いピークポジションを得るためには、泳動電圧（電流）、分離チャンバーの温度及び電気浸透流のコントロールがそれぞれ重要なファクターとなる。
【０００４】
この泳動電圧（電流）及び分離チャンバーの温度は、分析する際の条件（例えば、キャピラリーの内径、支持電解液等）を同じにすることで、コントロールすることが十分可能である。一方、電気浸透流のコントロールは、ジュール熱によるセパレーションチューブの温度上昇が避けられないため、困難となる。このため、時間軸を持つ通常のキャピラリー電気泳動フェログラムの分析再現性は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ほど高くはない。
【０００５】
溶液中の未知試料の泳動時間の再現性を妨げる要因としては、例えば、電気浸透流の変化、電位勾配の緩和効果（ＲＰＧ）、高電圧の印加に伴って発生するジュール熱による温度上昇等が挙げられる。これらは複合的な要因で起こるためコントロールが難しく、異なる装置を用いて測定した場合、試料や支持電解液が同じであっても同じ泳動時間を得ることが困難となることが想定される。したがって、異なる装置を使用した場合での測定結果を正しく比較するためには、電気泳動データの標準化が必要とる。
【０００６】
一方、Ｌｅｅらは、電気量、すなわち、電流の積分値をキャピラリーの断面積とキャピラリー全長で割った値を用いる泳動指標（ＭＩ、Migration Index）と、さらに浸透流のＭＩを補正した調節泳動指標（ＡＭＩ、Adjusted Migration Index）を提案した（ＭＩ、ＡＭＩの単位は、明細書中、μＣ／ｍ３とした）。ＡＭＩは、支持電解液が同じであれば、かなり良い定性指標になると考えられたが、ＡＭＩのパラメータのひとつに支持電解液の伝導度が含まれているため、わずかな組成の違い（例えば、ｐＨはほぼ同じでもカウンターイオンが異なる場合等）で測定結果が異なってしまう。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述の事項を防止するためには、定性指標として、試料イオンと支持電解液の条件だけに依存する実効移動度を用いる電気泳動分析方法を提案すればよい。しかしながら、従来の泳動時間から実効移動度への変換法では、ジュール熱による移動度の変化や電位勾配の緩和効果が考慮されていない場合が多かった。
【０００８】
ここで、本発明に関連する技術について説明する。
本発明者らは、ジュール熱による移動度の変化や電位勾配の緩和効果を補正する方法として、未知試料に標準物質を添加して、キャピラリー電気泳動を実行し、標準物質の泳動時間を求め、浸透流の速度が時間に対し直線的に変化すると仮定して、この標準物質の泳動時間から実効移動度に変換する方法を既に出願している（特願平１１−２５１６０４）。
【０００９】
この方法は、試料の実効移動度の温度依存性（サンプルイオン自身の温度依存性と支持電解液への温度依存性）などを、厳密な物理現象と関連させて補正するものでなく、浸透流の速度が時間に対し直線的に変化すると仮定した仮想的な浸透流速度を用いるので、この直線的変化を表す実験式中の係数にすべての現象が含まれてしまい物理的な意味合いがあいまいになってしまうことが想定される。
【００１０】
そこで、本発明者らは、再現性を低下させる三つの要因（泳動速度に影響するサンプルイオン自身の温度依存性、支持電解液への温度依存性、電位勾配の緩和効果に基づく泳動時間の遅れ）を、本来の物理的な現象として捉えると共に、これらの要因を理論的に取り除く方法を模索した。
【００１１】
本発明は、以上の点に鑑み、キャピラリー電気泳動法を用いて、未知試料を同定するために重要な役割を果たす実効移動度を、高い精度で迅速に求めることを目的とする。
また、本発明は、分析装置の動作条件による実効移動度のばらつきをなくし、未知試料毎の標準指標としてのデータの信頼性を高めることを目的とする。また、本発明は、異なる分析装置で同じ指標を使用することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１の解決手段によると、
未知試料を含む試料に標準物質を添加すると共に、電気泳動による標準物質及び未知試料の泳動時間と、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間を測定するステップと、
前記測定するステップにより測定された、標準物質及び未知試料の泳動時間、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間と、標準物質の基準温度における既知の実効移動度に基づいて、未知試料の実効移動度を求めるステップと
を含む電気泳動分析方法を提供する。
【００１３】
本発明の第２の解決手段によると、
未知試料を含む試料に標準物質を添加すると共に、電気泳動による標準物質及び未知試料の泳動時間を測定するステップと、
前記測定するステップにより測定された、標準物質及び未知試料の泳動時間と、標準物質の基準温度における既知の実効移動度に基づいて、未知試料の実効移動度を求めるステップと
を含む電気泳動分析方法を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
１．概要
１−１．キャピラリー電気泳動
電気泳動を用いた分析方法としては、Ｕ字管電気泳動法、アガロース電気泳動法、キャピラリー電気泳動法等が知られている。本発明では、キャピラリー電気泳動法を用いて、未知試料を同定するために重要な役割を果たす実効移動度を求めるため、まず、キャピラリー電気泳動法についての概要を説明する。
【００１５】
キャピラリー電気泳動は、水、有機溶媒を問わず、イオンの移動度の差により分離・分析する手法であり、液体クロマトグラフィー法と比べて数段分離能が高く、近年非常に注目されている分析方法である。このキャピラリー電気泳動は、何かの溶媒に溶け、電気を導通する事ができれば利用することができるので、分離する条件（溶媒、ｐＨ、添加剤等）さえ整えば、ほぼ「何でも」分析することができる。但し、このキャピラリー電気泳動は、そのままでは移動度の差がない中性物質や巨大分子などには適用されにくいため、これらの分離・分析には、他の電気泳動モードが用いられことが多い。
【００１６】
他の電気泳動法としては、例えば、中性分子の場合、ミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）と呼ばれる方法が用いられ、巨大分子の場合には、電解液にゲルを添加するキャピラリーゲル電気泳動法（ＣＧＥ）が用いられる。キャピラリーゲル電気泳動法は、特に、ヒトゲノム計画のキーテクノロジーの一つで、塩基配列はこの手法を用いて決定されている。なお、本発明は、これらの電気泳動法にも適用可能な場合がある。
【００１７】
また、キャピラリー電気泳動は、ゲノムプロジェクトの次の生化学研究の段階と考えられているプロテオーム（タンパクの機能・構造の特定）分析に対して有用と注目されており、特に、精密な移動度の決定ができれば、質量分析装置と組み合わせることで、タンパク質の研究に非常に有効な分析方法となることが報告されている。さらに、廃液が大変少ないため（どんなに多くても数ｍｌ）、環境への影響も考慮した分析方法といえる。
【００１８】
図１は、一般的なキャピラリー電気泳動装置の概略構成図である。但し、分析対象は、試料内の陽イオンとし、この陽イオンの分析には、後述する間接吸収法を適用した。
このキャピラリー電気泳動装置１は、例えば、高圧電源部２、バイアル３、４、キャピラリー５、スリット６、光源（例えば、ＵＶランプ）７、回折格子８及びマルチチャンネルフォトダイオード９を備える。高圧電源部２は、例えば、出力０〜３０ｋＶの高電圧電源であって、配線を介してバイアル３、４にそれぞれ接続されている。バイアル３、４は、図示しないターンテーブルや並進台上に載置されている。バイアル３、４には、ＵＶ吸収のある適宜の支持電解液が注入される。また、バイアル３には、分析するためのＵＶ吸収のない試料が導入される。キャピラリー５は、適宜の内径及び長さを有する管であり、キャピラリー５の一端はバイアル３に挿入され、他端はバイアル４に挿入されている。
【００１９】
キャピラリー５には、光源７から照射される紫外線の幅を制限するための隙間を有するスリット６が取り付けられている。このスリット６を通過した光は、回折格子８によって、適宜のスペクトルに分解される。この得られたスペクトルは、マルチチャンネルフォトダイオード９によって、ＵＶの吸光度として数値化される。なお、高圧電源部２、バイアル３、４及びマルチチャンネルフォトダイオード９は、図示しないコンピュータにより制御されている。
【００２０】
キャピラリー電気泳動装置１の動作概要を説明する。
まず、支持電解液が注入されたバイアル３と空のバイアル４とをセットする。バイアル４を密封しバイアル３に注入された支持電解液を吸引する。この吸引された支持電解液は、キャピラリー５内に満たされる。次に、例えば、落差法により、試料をキャピラリー５の一端付近に注入する。具体的には、バイアル４に支持電解液（水でもよい）、バイアル３に試料を導入する。この際、バイアル３の液面がバイアル４の液面より高くなるように設定する。このバイアル３、４の液面差によるサイフォンの原理で、試料がバイアル３からキャピラリー５の一端付近に注入される。次に、支持電解液が注入され、液面が同じ高さであるバイアル３、４をセットする。ここで、高圧電源部２からの高電圧をキャピラリー５の両端に印加する。
【００２１】
試料は、キャピラリー５内を有効長（試料が導入されたキャピラリー５の一端付近からキャピラリー５に沿ったスリット６までの距離）だけ泳動する。この試料内の陽イオンの泳動方向は、図中矢印で示すように、バイアル３からバイアル４に向かっている。この間に、試料内の各陽イオンは、各陽イオンの泳動速度（実効移動度）の差により分離される。この泳動速度（実効移動度）の差により分離された試料は、上述した回折格子８によって、一定時間ごとのスペクトルデータとして検出される。このスペクトルデータは、上述したマルチチャンネルフォトダイオード９によって、ＵＶの吸光度として数値化される。なお、ここでは、試料内の陽イオンを分析したが、陰イオンを分析する場合は、高圧電源部２の符号を逆にすればよい。
【００２２】
また、試料をキャピラリー５の一端付近に注入する際、落差法を採用したが、これ以外の方法としては、例えば、吸引法、加圧法及び電気的加圧法が挙げられる。吸引法では、バイアル３に試料を詰め、バイアル４を空にする。つぎに、空のバイアル４を密封し吸引することにより、試料をキャピラリー５内に注入する。加圧法では、バイアル３に試料を詰め、バイアル４を空にする。つぎに、バイアル３を密封し加圧することにより、試料をキャピラリー５内に注入する。電気的注入法では、バイアル３に試料を詰め、バイアル４に電解液（水でも可）を詰める。つぎに、高電圧を印加することにより、試料をキャピラリー５内に注入する。
【００２３】
１−２．泳動時間−実効移動度変換法による実効移動度の算出
キャピラリー電気泳動法における電気泳動現象と実効移動度の算出の概要を説明する。
従来の泳動時間−実効移動度変換法では、実効移動度ｍは以下のようにして求められる。
ｍ＝νｉｏｎ／Ｅ ＝（ｌ／ｔ−νｅｏｆ）／（Ｖ／Ｌ） （１）
ここで、Ｖは印加電圧、Ｅは電位勾配、ｌは有効長、Ｌはキャピラリー全長、νｉｏｎは未知試料の泳動速度、ｔは未知試料が検出器によって検出されるまでの時間（泳動時間）である。
【００２４】
また、νｅｏｆ（電気浸透流速度、electroosmotic flow velocity）は、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間ｔｅｏｆを用いて以下の式から得られる。
νｅｏｆ＝ｌ／ｔｅｏｆ （２）
すなわち、式（１）は次のようになる。
ｍ＝（ｌ／ｔ−ｌ／ｔｅｏｆ）／（Ｖ／Ｌ） （１）’
【００２５】
システムピークとは、間接吸収法を用いたとき、電気浸透流によってキャピラリー内の液体が流され、試料を導入した部分が検出器に到達した場合に出現する、あたかも何か物質があるかのようなピークをいう。したがって、システムピークの泳動時間ｔｅｏｆは、システムピークが出現するまでの時間をいう。また、間接吸収法とは、例えば、試料にＵＶ（紫外線）の吸収がない場合、電解液にUV吸収のある物質を用いると、試料の部分だけ電解液の物質が減少し、ＵＶの吸光度が低下することを利用した検出方法である。
【００２６】
また、電気浸透流とは、例えば、シリカキャピラリーを用いたとき、キャピラリー内壁にあるシラノール基が解離することにより内壁が負に帯電し、キャピラリー内部にある溶液が見かけ上正に帯電することにより、電場を印加すると液体全体が負電極側に流れる現象をいう。この電気浸透流は、キャピラリーに他の物質を用いても、ほとんどの場合、発生する（但し、物質や電解液の組成により流れる向きが変わることもある）。また、移動度０の泳動時間ｔｅｏｆは、電場の印加により、上述のように、電気浸透流のためにキャピラリー内の液体全体が押し流されるため、移動度を持たないような（即ち、移動度０）物質（例えば、中性物質）でも検出器によって検出されるので、このような電場を印加してから検出されるまでの時間である。
【００２７】
ここで、温度による移動度の変化を詳しく検討すると、サンプルの実効移動度ｍの温度依存性は、次式のように、サンプルイオン自身の項ｆ（Ｔ）と支持電解液への温度依存性の項ｇ（Ｔ）＝ε／η（ε：誘電率，η：粘性係数）とに分けて考えられる。
ｍ＝ｆ（Ｔ）・ｇ（Ｔ） （３）
【００２８】
この式を基準温度Ｔ０の周りでテイラー展開すると、次のようになる。
ここで、温度変化によるイオンサイズの変化は、溶媒の粘度や誘電率の温度依存性と比較して非常に小さいため、イオン自身への影響の温度依存性を無視すると、実効移動度ｍは次式で表される。
ｍ＝ｆ０（ｇ０＋ｇ１ΔＴ＋ｇ２ΔＴ２＋…）
【００２９】
＝ｆ０ｇ０（１＋ｇ１／ｇ０・ΔＴ＋ｇ２／ｇ０・ΔＴ２＋…） （５）
ここで、ΔＴが小さいところでは２次以降の項を無視することができ、さらに、
ｆ０ｇ０＝ｍ０，ｇ１／ｇ０＝αと置き換えると、物質に依らず移動度は
ｍ＝（１＋αΔＴ）・ｍ０ （６）
と表される。ここで、ｍ０は基準温度におけるサンプルの実効移動度を表し、αはサンプルイオンに依存しない温度係数を表す。一般に、２５℃における温度係数αの値は約０．０２（例：Ｋ ０．０１９１、Ｌｉ ０．０２２８）である。
【００３０】
１−３．温度係数のみを考慮した変換法
次に温度係数のみを考慮した変換法について説明する。
既知標準物質（実効移動度ｍｓ）の基準温度Ｔ０における実効移動度ｍ０，ｓは、式（１）’を用いて次のように求められる。
ｍ０，ｓ＝（ｌ／ｔｓ−ｌ／ｔｅｏｆ）／｛（１＋αΔＴ）Ｅ｝
【００３１】
さらに、式（６）よりｍｓとｍ０，ｓの関係は次のようになっている。
１＋αΔＴ＝ｍｓ／ｍ０，ｓ （７）
また、試料物質（実効移動度ｍ）の基準温度Ｔ０における実効移動度ｍ０は式（１）’を用いて次のように求められる。
ｍ０＝（ｌ／ｔ−ｌ／ｔｅｏｆ）／｛（１＋αΔＴ）Ｅ｝
【００３２】
さらに、ｍとｍ０の関係は、式（６）から次のようになる。
１＋αΔＴ＝ｍ／ｍ０
これらの式から、温度Ｔ０における試料物質（イオン）の実効移動度ｍ０は次式のように得られる。
【００３３】
したがって、本実施の形態では、以上の理論を用いて、未知試料に標準物質を添加してそれぞれの泳動時間から移動度を測定し、その移動度の値から物質を同定するキャピラリー電気泳動法において、まず、実効移動度が温度のみに影響される場合の補正方法として、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間ｔｅｏｆ、標準物質の泳動時間ｔｓおよび標準物質の基準温度Ｔ０における実効移動度ｍｏ，ｓから未知物質の実効移動度ｍ０を式（８）を用いて求める。なお、式（８）に含まれるパラメータであるｍｏ，ｓは、論文・既存データから決定される。また、ｔｅｏｆは、例えば、キャピラリー内の電解液の濃度のむら等により測定される。さらに、ｔｅｏｆ、ｔ及びｔｓは、既存データ・実験値、又はだいたいの見積もり等から、どの検出ピークがどの物質に対応するのか当たりを付けることができるので、後述する実験より得られたフェログラムからそれぞれの泳動時間を決定できる。
【００３４】
１−４．温度及び時間補正を考慮した変換法
次に、温度だけでなく、時間補正も考慮した変換法について説明する。
一般に、電位勾配の緩和効果によりイオンの泳動時間はすべて一定時間だけ遅れるものと考えられる。この電位勾配の緩和効果は、本発明者らがシミュレーションにより見出した現象である(J. Chromatogr.A, 898(1999)19-29)。具体的には、定電圧電源を用いてキャピラリーの両端に高電圧をかけた場合、試料を導入した部分の電位勾配の時間変化のために、キャピラリーを流れる電流がすぐには一定にならず、しばらく時間がたってから一定になる。そのため、従来電気泳動を用いて移動度を決定するときに用いられる平均電位勾配（電圧/キャピラリー全長）は、すぐには得られないため、従来の計算方法で予測される泳動時間よりも、ある一定時間遅れて検出される現象をいう（この遅延時間を、本明細書中、τと表す）。
【００３５】
ここで、電気浸透流が測定中一定であるとして、この電位勾配の緩和効果を考慮に入れると、サンプルイオンの実効移動度ｍは次のように表される。
ｍ＝ｌ／｛（ｔ−τ）Ｅ｝−ｍｅｏｆ （９）
【００３６】
ここで、ｍｅｏｆは浸透流の移動度、νｅｏｆ／Ｅである。すなわち、この移動度は、ジュール熱により上昇したキャピラリー内温度におけるものを表している。この式を上記式（６）に代入すると、基準温度Ｔ０における実効移動度ｍ０を求めることのできる次式を得る。
ｍ０＝｛ｌ／（ｔ−τ）Ｅ−ｍｅｏｆ｝／（１＋αΔＴ） （１０）
【００３７】
しかしながら、パラメーターτ、ｍｅｏｆおよび１＋αΔＴは未知数である。そこで、移動度が既知である標準試料（標準物質）Ａ，Ｂおよび移動度０の物質又はシステムピークの泳動時間ｔｅｏｆから、これらのパラメーターを決定する。標準試料Ａ，Ｂおよびシステムピークの移動度は以下の式で表される。
ｍ０，Ａ＝［ｌ／｛（ｔＡ−τ）Ｅ｝−ｍｅｏｆ］／（１＋αΔＴ） （１１）
ｍ０，Ｂ＝［ｌ／｛（ｔＢ−τ）Ｅ｝−ｍｅｏｆ］／（１＋αΔＴ） （１２）
ｍｅｏｆ＝ｌ／｛（ｔｅｏｆ−τ）Ｅ｝ （１３）
【００３８】
ここで、ｔＡ、ｔＢは、標準物質Ａ、Ｂの泳動時間、ｍ０，Ａ、ｍ０，Ｂは、標準物質Ａ、Ｂの基準温度Ｔ０における実効移動度である。
式（１１）〜（１３）から、次式が得られる。
τ＝｛ｍ０，ＡｔＡ（ｔｅｏｆ−ｔＢ）−ｍ０，ＢｔＢ（ｔｅｏｆ−ｔＡ）｝／｛ｍ０，Ａ（ｔｅｏｆ−ｔＢ）−ｍ０，Ｂ（ｔｅｏｆ−ｔＡ）｝ （１４）
【００３９】
また、式（１１）を変形して、次式が得られる。
１＋αΔＴ＝［ｌ／｛（ｔＡ−τ）Ｅ｝−ｍｅｏｆ］／ｍ０，Ａ （１５）
さらに、式（１３）（１５）を式（１０）に代入すると
ｍ０＝｛（ｔＡ−τ）（ｔｅｏｆ−ｔ）／（ｔ−τ）（ｔｅｏｆ−ｔＡ）｝・ｍ０，Ａ （１６）
となる。この式（１６）によれば、Ｅ、Ｖ、ｌ、Ｌといった装置に依存するパラメーターが消去されることになり、装置の条件に依存しない電気泳動データの標準化が可能となる。
【００４０】
したがって、本実施の形態では、実効移動度ｍ０が温度に影響されるのみならず電位勾配の緩和効果による泳動時間遅れの影響も受ける場合の補正方法として、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間ｔｅｏｆ、二つ以上の標準物質の泳動時間ｔＡ、ｔＢおよび該標準物質の基準温度Ｔ０における実効移動度ｍ０，Ａ、ｍ０，Ｂから、未知物質の実効移動度ｍ０を式（１４）及び（１６）を用いて求める。なお、式（１４）及び（１６）に含まれるパラメータであるｍ０，Ａ、ｍ０，Ｂは、論文・既存データから決定される。また、ｔｅｏｆ、ｔ及びｔＡ、ｔＢは、上述のように、例えば、既存データ・実験値又はだいたいの見積もり等から当たりを付け、物質との関係を把握することができるので、後述する実験より得られたフェログラムからそれぞれの泳動時間を決定できる。
【００４１】
さらに、移動度０の物質が添加できない、又は、システムピークを検出することができない（すなわち、ｔｅｏｆを特定できない）場合を考慮した変換法について説明する。まず、移動度が既知の標準物質Ａ、Ｂ、Ｃを試料に添加し、これらの泳動時間ｔＡ、ｔＢ、ｔＣを測定することにより、必要なパラメータを決定する。
【００４２】
標準物質Ａ、Ｂ、Ｃの移動度は、上述したように次のように表される。
ｍ０，Ａ＝［ｌ／｛（ｔＡ−τ）Ｅ｝−ｍｅｏｆ］／（１＋αΔＴ） （１１）
ｍ０，Ｂ＝［ｌ／｛（ｔＢ−τ）Ｅ｝−ｍｅｏｆ］／（１＋αΔＴ） （１２）
ｍ０，Ｃ＝［ｌ／｛（ｔＣ−τ）Ｅ｝−ｍｅｏｆ］／（１＋αΔＴ） （１７）
式（１１）（１２）（１７）から、次式が得られる。
ｍｅｏｆ＝ｌ／｛（ｔｉ−τ）Ｅ｝−ｍ０，ｉ（１＋αΔＴ） （２０）
ただし、ｉはＡ、Ｂ、Ｃのいずれかである。
【００４３】
このようにして得られたτ、１＋αΔＴ、ｍｅｏｆを式（１０）に代入すると次式が得られる。
ｍ０＝｛（ｔｉ−ｔ）（ｔｊ−τ）（ｍ０，ｊ−ｍ０，ｉ）｝／｛（ｔ−τ）（ｔｉ−ｔｊ）｝＋ｍ０，ｉ （２１）
ただし、ｉ、ｊは、Ａ、Ｂ、Ｃのいずれかであって、かつ、ｉ≠ｊ
ここで、ｍ０，Ｃ＝０、ｔＣ＝ｔｅｏｆ、ｉ＝Ｃ、ｊ＝Ａとすると、式（１４）〜（１６）が得られる。
導出過程を以下に示す。
式（１１）（１２）（１７）から、次式が得られる。
ｍｅｏｆ＝ｌ／｛（ｔＡ−τ）｝−ｍ０，Ａ（１＋αΔＴ） （１１）’
ｍｅｏｆ＝ｌ／｛（ｔＢ−τ）｝−ｍ０，Ｂ（１＋αΔＴ） （１２）’
ｍｅｏｆ＝ｌ／｛（ｔＣ−τ）｝−ｍ０，Ｃ（１＋αΔＴ） （１７）’
【００４４】
また、式（１１）’から式（１２）’および式（１７）’を引いて整理すると、次式が得られる。
（ｔＡ−τ）（ｔＢ−τ）＝｛ｌ（ｔＢ−ｔＡ）｝／｛Ｅ（１＋αΔＴ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｂ）｝ （ａ）
（ｔＡ−τ）（ｔＣ−τ）＝｛ｌ（ｔＣ−ｔＡ）｝／｛Ｅ（１＋αΔＴ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｃ）｝ （ｂ）
さらに、（ａ）／（ｂ）から
（ｔＢ−τ）／（ｔｃ−τ）＝｛（ｔＢ−ｔＡ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｃ）｝／｛（ｔＣ−ｔＡ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｂ）｝＝Ｋ （ｃ）
とすると、次式が得られる。
τ＝（ｔＢ−ＫｔＣ）／（１−Ｋ） （ｃ）’
【００４５】
ここで、τの分子及び分母をそれぞれ整理すると、
τの分子＝ｔＢ−｛（ｔＢ−ｔＡ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｃ）ｔＣ｝／｛（ｔＣ−ｔＡ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｂ）｝
＝｛ｍ０，ＡｔＡ（ｔＣ−ｔＢ）＋ｍ０，ＢｔＢ（ｔＡ−ｔＣ）＋ｍ０，ＣｔＣ（ｔＢ−ｔＡ）｝／｛（ｔＣ−ｔＡ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｂ）｝
τの分母＝１−｛（ｔＢ−ｔＡ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｃ）｝／｛（ｔＣ−ｔＡ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｂ）｝
＝｛ｍ０，Ａ（ｔＣ−ｔＢ）＋ｍ０，Ｂ（ｔＡ−ｔＣ）＋ｍ０，Ｃ（ｔＢ−ｔＡ）｝／｛（ｔＣ−ｔＡ）（ｍ０，Ａ−ｍ０，Ｂ）｝
となり、さらに、次式が得られる。
また、式（ａ）もしくは（ｂ）から、次式が得られる。
１＋αΔＴ＝｛ｌ（ｔｉ−ｔｊ）｝／｛Ｅ（ｔｉ−τ）（ｔｊ−τ）（ｍ０，ｉ−ｍ０，ｊ）｝ （１９）
また、式（１１）’（１２）’（１７）’のいずれかを使うことで、次式が得られる。
ｍｅｏｆ＝ｌ／｛（ｔｉ−τ）｝−ｍ０，ｉ（１＋αΔＴ） （２０）
【００４７】
これにより、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間ｔｅｏｆを特定できない場合であっても、三つ以上の標準物質の泳動時間ｔＡ、ｔＢ、ｔＣおよび該標準物質の基準温度Ｔ０における実効移動度ｍ０，Ａ、ｍ０，Ｂ、ｍ０，Ｃから、未知物質の実効移動度ｍ０を式（１８）及び（２１）を用いて求めることができる。但し、ｍ０，Ｃ＝０、ｔＣ＝ｔｅｏｆ、ｉ＝Ｃ、ｊ＝Ａとすると、式（１４）と（１８）、式（１６）と（２１）は、それぞれ同等の式となるので、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間ｔｅｏｆを特定できない場合での実験は、省略する。なお、式（１８）及び（２１）に含まれるパラメータであるｍ０，Ａ、ｍ０，Ｂ、ｍ０，Ｃは、論文・既存データから決定される。また、ｔＡ、ｔＢ、ｔＣ及びｔは、上述のように、例えば、既存データ・実験値又はだいたいの見積もり等から当たりを付け、物質との関係を把握することができるので、実験より得られたフェログラムからそれぞれの泳動時間を決定できる。
【００４８】
１−５．本発明による電気泳動分析方法の処理手順
図２は、本発明による電気泳動分析方法のフローチャートである。なお、説明の便宜上、ここでのフローチャートの説明は、概略的なものとし、具体的な実験結果は後述する。
【００４９】
まず、未知物質（未知試料）を含む試料に標準物質を添加する（Ｓ１０１）。この標準物質を添加された未知試料を、キャピラリー内に導入すると共に、上述したキャピラリー電気泳動を実行する（Ｓ１０３）。つぎに、このキャピラリー電気泳動を実行することにより、上述１−３で説明したように、実効移動度を求める際、温度による影響のみを考慮した場合、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間ｔｅｏｆ、標準物質の泳動時間ｔｓ及び未知試料の泳動時間ｔが得られ、さらに、標準物質の基準温度Ｔ０における既知の実効移動度ｍｏ，ｓを得る（Ｓ１０５）。これらのパラメータ値と式（８）に基づいて、未知試料の実効移動度ｍ０を算出する（Ｓ１０７）。なお、この算出された未知試料の実効移動度ｍ０に基づいて、未知試料の物質の同定を行ってもよい（Ｓ１０９）。
【００５０】
また、上述１−４で説明したように、実効移動度を求める際、温度だけでなく電位勾配の緩和効果による泳動時間遅れの影響も考慮した場合、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間ｔｅｏｆ、二つ以上の標準物質の泳動時間ｔＡ、ｔＢ及び未知試料の泳動時間ｔが得られ、さらに、該標準物質の基準温度Ｔ０における既知の実効移動度ｍ０，Ａ、ｍ０，Ｂを得る（Ｓ１０５）。これらのパラメータ値と式（１４）及び（１６）に基づいて、未知試料の実効移動度ｍ０を算出する（Ｓ１０７）。なお、この算出された未知試料の実効移動度ｍ０に基づいて、未知試料の物質の同定を行ってもよい（Ｓ１０９）。
【００５１】
２．実験および比較
２−１．実験方法
ここで、発明した方法の有効性を検証するために利用したキャピラリー電気泳動装置には、内径（Ｉ．Ｄ．）７５μｍおよび５０μｍ、全長４０ｃｍ（有効長２７．５ｃｍ）とする、キャピラリーが備えられている。このキャピラリーは、設定温度２５℃であり、１５ｋＶおよび３０ｋＶの電圧が印加される。さらに、波長を検出するために（座標軸上に測定結果を載せるために）、２６５ｎｍの３，５‐ルチジンの吸収を測定する間接吸収法を採用した。
【００５２】
試料は、ＫＣｌ，ＬｉＣｌ，ＴＲＩＳ（トリヒドロキシメチルアミノメタン、Hydroxymethyl Aminomethan），ε−アミノカプロン酸とオクチルスルホン酸ナトリウム３０ｍＭおよび０．３ｍＭの等モル混合試料を用いた。この３０ｍＭ，０．３ｍＭの等モル試料は、それぞれ上述した落差法（２ｃｍ １５ｓ），（２ｃｍ ７５ｓ）を用いて注入した。支持電解液は、２０ｍＭ３，５ルチジンにＨＣｌを加えてｐＨ６．０に調節した溶液（支持電解液Ａ：ＳＥ２０ｍＭ）と、４０ｍＭ３，５‐ルチジンに酢酸を用いてｐＨ６．０に調節した溶液（支持電解液Ｂ：ＳＥ４０ｍＭ）を用いた。
【００５３】
２−２．本発明による泳動時間−実効移動度変換を適用しない状態での実験
図３は、本発明による泳動時間−実効移動度変換を適用しない実験により得られたフェログラムを示す。フェログラムは、上から順に
（Ａ）sample ３０ｍＭ，ＳＥ２０ｍＭ（支持電解液Ａ），Ｉ．Ｄ．７５μｍ，Ｖ＝３０ｋＶ
（Ｂ）sample ３０ｍＭ，ＳＥ４０ｍＭ（支持電解液Ｂ），Ｉ．Ｄ．７５μｍ，Ｖ＝３０ｋＶ
（Ｃ）sample ３０ｍＭ，ＳＥ４０ｍＭ（支持電解液Ｂ），Ｉ．Ｄ．５０μｍ，Ｖ＝３０ｋＶ
（Ｄ）sample ３０ｍＭ，ＳＥ４０ｍＭ（支持電解液Ｂ），Ｉ．Ｄ．５０μｍ，Ｖ＝１５ｋＶ
（Ｅ）sample ３０ｍＭ，ＳＥ４０ｍＭ（支持電解液Ｂ），Ｉ．Ｄ．７５μｍ，Ｖ＝１５ｋＶ
（Ｆ）sample ０.３ｍＭ，ＳＥ４０ｍＭ（支持電解液Ｂ），Ｉ．Ｄ．７５μｍ，Ｖ＝１５ｋＶ
の条件で測定して得られた。また、（Ｃ）では新しいキャピラリーを内壁の処理なしで用い、それ以外の実験では、何度か測定に用いたキャピラリーを用いた。
表１に泳動時間の測定結果（単位：秒）を示す。
【００５４】
【表１】
したがって、ピークは、左から順にＫ＋，Ｎａ＋，Ｌｉ＋，ＴＲＩＳ，ε−アミノカプロン酸，システムピーク，オクチルスルホン酸である。同じ試料・電解液でも、このように実験条件を変化させることにより様々なフェログラムが得られることがわかる。したがって、上述したように、異なる装置を使えば、このように泳動時間の異なるフェログラムしか得られないことになる。このため、多数の未知試料を同時に測定するには、上述したような同じ物質が同じ定性指標を示すような標準化法が有効となる。
【００５６】
２−３．本発明による式（８）を用いた泳動時間−実効移動度変換の実験
図４は、式（８）を用いて移動度を算出（Ｓ１０１〜Ｓ１０７を実行）した際のフェログラムである。
ピークは、左から順にＫ＋，Ｎａ＋，Ｌｉ＋，ＴＲＩＳである。また、図中の実線は標準試料として用いたＬｉの２５℃での既報値３４．９（式（８）のｍｏ，ｓ）である。点線は左からＫ、Ｎａ、ＴＲＩＳの２５℃での既報値であり、それぞれ６９．９、４６．３、２４．４である。この実験により、データのばらつきが大きく改善され、Ｎａ、Ｌｉ、Ｔｒｉｓの移動度のそれぞれの平均（相対標準偏差）は、６６．６（３．６０％）、４５．７（１．１６％）、２２．６（８．０７％）であった。また、これの平均（相対標準偏差）は、既報値の値から４．７４％、１．３７％、７．４９％のずれであった。特に、最も電力が小さく、内径が細く印加電圧の低いサンプル（Ｄ）では、Ｋ，Ｎａの移動度は、既報値と０．９３％、０．０８％のずれしか生じなかった。しかしながら、他のデータは、Ｋの移動度が既報値より小さく見積もられた。
【００５７】
すなわち、これは電位勾配の緩和効果による遅延時間τを考慮に入れていないため、泳動時間の小さなＫの誤差が相対的にやや大きくなったと考えられる。例えば、移動度の小さなＮａでは、その影響が小さくなった。
【００５８】
２−４．本発明による式（１６）を用いた泳動時間−実効移動度変換の実験
図５は、式（１４）及び（１６）を用いて移動度を算出（Ｓ１０１〜Ｓ１０７を実行）した際のフェログラムである。
ピークは、左から順にＫ＋，Ｎａ＋，Ｌｉ＋，ＴＲＩＳである。また、図中の実線は、標準試料として用いたＫ、Ｌｉの２５℃での既報値であり、それぞれ６９．９（式（１４）および（１６）中のｍ０，Ａ）、３４．９（式（１４）および（１６）中のｍ０，Ｂ）である。図中の点線は、左からＮａ、Ｔｒｉｓの２５℃での既報値であり、それぞれ４６．３、２４．４である。この実験によりデータのばらつきが顕著に改善された。Ｎａ、ＴＲＩＳの移動度の平均（相対標準偏差）は４６．４（０．３０％）、２２．２（７．６８％）であった。また、これらは既報値の値から０．２９％、９．１７％のずれであった。なお、ＴＲＩＳの大きなずれは、テーリングを起こしているためである。一方、Ｎａについては、移動度のばらつきを０．３％以下にすることが可能であることが示された。
【００５９】
また、参照温度での実効移動度に変換することが可能なため、例えば、伝導度法のような他の方法で求められた実効移動度と比較することが可能になり、データの汎用性を向上させることができる。
【００６０】
３．従来との比較
３−１．泳動指標（ＭＩ、Migration Index）を用いた実験
図６は、ＭＩを横軸としたフェログラムである。
上述のように、Ｌｅｅらが提案した電気量、すなわち電流の積分値をキャピラリーの断面積とキャピラリー全長で割った値を用いる、ＭＩを用いた場合、図３で示したフェログラムで、全く異なった泳動時間でピークが出ていた（Ｂ）（Ｄ）（Ｅ）（Ｆ）がＭＩで整理することにより、比較的良い一致を示した（ピークは、図３と同様に、左から順にＫ＋，Ｎａ＋，Ｌｉ＋，ＴＲＩＳである）。しかしながら、支持電解液が異なる（Ａ）や浸透流の速度が大きく異なる（Ｃ）では、大きく異なるＭＩにピークが現れた。
【００６１】
すなわち、このＭＩを用いたフェログラムは、ＭＩでは温度の影響を除去することができるが、電解液の性質や浸透流の影響までは十分に除去できないことを示している。
【００６２】
３−２．調節泳動指標（ＡＭＩ、Adjusted Migration Index）を用いた実験
図７は、ＡＭＩを横軸としたフェログラムである。
ＭＩに対して、さらに浸透流の影響を考慮したＡＭＩを用いた場合では、同じ支持電解液を用いた（Ｂ）〜（Ｆ）では、比較的良い一致を示している。図中の点線は、（Ｂ）〜（Ｆ）のそれぞれの物質のピーク位置の平均値を示している。この点線を指標にＡＭＩの値を詳しく調べてみると、相対標準偏差（ＲＳＤ）は４．８３％（Ｋ），３．７７％（Ｎａ），４．７０％（Ｌｉ），７．０８％（Ｔｒｉｓ）とばらついている。さらに、移動度がほぼ同じであるにもかかわらず、（Ａ）では全く異なるフェログラムであった。この差は、支持電解液の伝導度が異なるために生じたものである。
【００６３】
すなわち、このＡＭＩを用いたフェログラムは、温度と浸透流の影響を除去することができるが、電解液の性質やまでは十分に除去できないことを示している。
【００６４】
３−３．実効移動度を横軸とした従来の分析方法による実験
図８は、実効移動度を横軸とした従来の分析方法によるフェログラムを示す。この従来の分析方法では、泳動時間から速度を求め、その速度から浸透流の速度との差を求め、その差を印加した電圧で割り、さらに、キャピラリーの全長をかけることで、実効移動度を算出する。この実効移動度を横軸としたフェログラムでは、ピークは、左から順にＫ＋，Ｎａ＋，Ｌｉ＋，ＴＲＩＳである。また、図中の点線は左からＫ、Ｎａ、Ｌｉ、Ｔｒｉｓ、の２５℃での既報値であり、それぞれ６９．９、４６．３、３４．９、２４．４である。それぞれのピークの移動度は大きくばらついており、Ｋ、Ｎａ、Ｌｉ、Ｔｒｉｓ、の移動度の平均（相対標準偏差）は、９０．７（１７．５％）、６２．５（１９．９％）、４７．８（２１．０％）、３１．１（２６．０％）であった。
【００６５】
さらに詳しく考察すると、印加電圧３０ｋＶの（Ａ）〜（Ｃ）は、１５ｋＶの（Ｄ）〜（Ｆ）と比較して実効移動度が大きく見積もられている。これは系内で発生する電力が大きく、内部の温度が上昇しているため、実効移動度が大きくなったことによる。特に、内径が太く濃い支持電解液を用いた（Ｂ）では、その傾向が顕著であった。さらに、既報値と比較してもすべての物質の移動度が大きく見積もられた。
【００６６】
このように、高電圧を印加するキャピラリー電気泳動を用いて、再現性のあるデータを得るためには、上述の本実施の形態ような、内部温度の上昇を補正するためのデータ処理方法が有効となる。
【００６７】
３−４．実効移動度を横軸とした本発明者らが既に出願した分析方法による実験図９は、実効移動度を横軸とした本発明者らが既に出願した分析方法（特願平１１−２５１６０４）によるフェログラムを示す。
【００６８】
この分析方法によって算出した実効移動度を横軸としたフェログラムでは、ピークは、左から順にＫ＋，Ｎａ＋，Ｌｉ＋，ＴＲＩＳである。また、図中の実線は標準試料として用いたＫ、Ｌｉ、の２５℃での既報値であり、それぞれ６９．９、３４．９である。図中の点線は左からＮａ、Ｔｒｉｓの２５℃での既報値であり、それぞれ４６．３、２４．４である。この実験によれば、データのばらつきが大きく改善され、Ｎａ，Ｔｒｉｓの移動度の平均（相対標準偏差）は、４６．９（１．０５％）、２１．８（８．１１％）であった。また、これらは既報値の値から０．６４％、１０．７％のずれであった。なお、ＴＲＩＳの泳動時間の評価は、テールを引いているために困難であるとＭｉｋｋｅｒｓらが報告しているとおり、Ｔｒｉｓの移動度は既報値と大きくずれたが、Ｎａは、既報値とほぼ一致した。
【００６９】
これにより、この方法は、非常に有用な方法であるが、上述のように物理的な意味合いがあいまいなとなってしまう場合が想定される。
以上、本実施の形態による式（８）、（１４）及び（１６）を用いた泳動時間−実効移動度変換の実験と、従来の方法である、ＭＩ及びＡＭＩを用いた実験、実効移動度を横軸とした従来の分析方法による実験及び本発明者らが既に出願した分析方法による実験とを、比較することにより、キャピラリー電気泳動により測定したデータを、本実施の形態による処理を施せば、混合物中の未知試料のある参照温度での実効移動度が迅速かつ正確に求めることができる。
【００７０】
また、本実施の形態では、一つの装置でもその動作条件によって異なっていた実効移動度のばらつきをなくし、物質毎に標準指標としてのデータの蓄積ができる。また、異なる装置で同じ指標が使用できるため、これらのデータベースの蓄積が進めば、将来未知物質を同定する際、非常に迅速かつ正確な分析が期待される。
【００７１】
【発明の効果】
本発明によると、以上説明した通り、キャピラリー電気泳動法を用いて、未知試料を同定するために重要な役割を果たす実効移動度を、高い精度で迅速に求めることができる。また、本発明によれば、分析装置の動作条件による実効移動度のばらつきをなくし、未知試料毎の標準指標としてのデータの信頼性を高めることができる。また、本発明によれば、異なる分析装置で同じ指標を使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】一般的なキャピラリー電気泳動装置の概略構成図。
【図２】本発明による電気泳動分析方法のフローチャート。
【図３】本発明による泳動時間−実効移動度変換を適用しない実験により得られたフェログラム。
【図４】式（８）を用いて移動度を算出した際のフェログラム。
【図５】式（１４）及び（１６）を用いて移動度を算出した際のフェログラム。
【図６】ＭＩを横軸としたフェログラム。
【図７】ＡＭＩを横軸としたフェログラム。
【図８】実効移動度を横軸とした従来の分析方法によるフェログラム。
【図９】実効移動度を横軸とした本発明者らが既に出願した分析方法によるフェログラム。
【符号の説明】
１ キャピラリー電気泳動装置
２ 高圧電源部
３、４ バイアル
５ キャピラリー
６ スリット
７ 光源
８ 回折格子
９ マルチチャンネルフォトダイオード
Claims (4)
- 未知試料を含む試料に標準物質を添加すると共に、電気泳動による標準物質及び未知試料の泳動時間と、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間を測定するステップと、
前記測定するステップにより測定された、標準物質及び未知試料の泳動時間、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間と、標準物質の基準温度における既知の実効移動度に基づいて、未知試料の実効移動度を求めるステップと
を含み、
前記未知試料の実効移動度を求めるステップは、
未知試料の実効移動度ｍ ０ を、標準物質の泳動時間ｔ ｓ 、未知試料の泳動時間ｔ、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間ｔ ｅｏｆ 、及び、標準物質の基準温度における実効移動度ｍ ｏ，ｓ に基づいて、次式、
ｍ ０ ＝｛（ｔ ｅｏｆ ／ｔ−１）／（ｔ ｅｏｆ ／ｔ ｓ −１）｝・ｍ ｏ，ｓ
を用いて求めるようにした電気泳動分析方法。 - 未知試料を含む試料に標準物質を添加すると共に、電気泳動による標準物質及び未知試料の泳動時間と、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間を測定するステップと、
前記測定するステップにより測定された、２つ以上の標準物質の泳動時間、未知試料の泳動時間、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間、及び、該標準物質の基準温度における既知の実効移動度に基づいて、未知試料の実効移動度を求めるステップと
を含み、
前記未知試料の実効移動度を求めるステップは、
未知試料の実効移動度ｍ ０ を、２つ以上の標準物質のうち任意の２つの物質の泳動時間ｔ Ａ ，ｔ Ｂ 、未知試料の泳動時間ｔ、移動度０の物質の泳動時間又はシステムピークの泳動時間ｔ ｅｏｆ 、及び、該標準物質の基準温度における実効移動度ｍ ０，Ａ ，ｍ ０，Ｂ に基づいて、次式、
ｍ ０ ＝｛（ｔ Ａ −τ）（ｔ ｅｏｆ −ｔ）／（ｔ−τ）（ｔ ｅｏｆ −ｔ Ａ ）｝・ｍ ０，Ａ τ＝｛ｍ ０，Ａ ｔ Ａ （ｔ ｅｏｆ −ｔ Ｂ ）−ｍ ０，Ｂ ｔ Ｂ （ｔ ｅｏｆ −ｔ Ａ ）｝／｛ｍ ０，Ａ （ｔ ｅｏｆ −ｔ Ｂ ）−ｍ ０，Ｂ （ｔ ｅｏｆ −ｔ Ａ ）｝
を用いて求めるようにした電気泳動分析方法。 - 未知試料の実効移動度から未知試料の物質を同定するステップをさらに含む請求項１又は２に記載の電気泳動分析方法。
- 未知試料を含む試料に標準物質を添加すると共に、電気泳動による標準物質及び未知試料の泳動時間を測定するステップと、
前記測定するステップにより測定された、標準物質及び未知試料の泳動時間と、標準物質の基準温度における既知の実効移動度に基づいて、未知試料の実効移動度を求めるステップと
を含み、
前記未知試料の実効移動度を求めるステップは、
未知試料の実効移動度ｍ ０ を、３つ以上の標準物質のうち任意の３つの物質の泳動時間ｔ Ａ 、ｔ Ｂ 、ｔ Ｃ 、未知試料の泳動時間ｔ、及び、該標準物質の基準温度における実効移動度ｍ ０，Ａ 、ｍ ０，Ｂ 、ｍ ０，Ｃ に基づいて、次式、
ｍ ０ ＝｛（ｔ ｉ −ｔ）（ｔ ｊ −τ）（ｍ ０，ｊ −ｍ ０，ｉ ）｝／｛（ｔ−τ）（ｔ ｉ −ｔ ｊ ）｝＋ｍ ０，ｉ
ただし、ｉ、ｊは、標準物質Ａ、Ｂ、Ｃのいずれかであって、かつ、ｉ≠ｊ
τ＝｛ｍ ０，Ａ ｔ Ａ （ｔ Ｃ −ｔ Ｂ ）＋ｍ ０，Ｂ ｔ Ｂ （ｔ Ａ −ｔ Ｃ ）＋ｍ ０，Ｃ ｔ Ｃ （ｔ Ｂ −ｔ Ａ ）｝／｛ｍ ０，Ａ （ｔ Ｃ −ｔ Ｂ ）＋ｍ ０，Ｂ （ｔ Ａ −ｔ Ｃ ）＋ｍ ０，Ｃ （ｔ Ｂ −ｔ Ａ ）｝
を用いて求めるようにした電気泳動分析方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000185276A JP3709123B2 (ja) | 2000-06-20 | 2000-06-20 | 電気泳動分析方法 |
| US10/311,300 US20070044541A1 (en) | 2000-06-20 | 2001-06-19 | Electrophoretic analysis method |
| PCT/JP2001/005213 WO2001098768A1 (fr) | 2000-06-20 | 2001-06-19 | Procede d'analyse electrophoretique |
| EP01938745A EP1312915A4 (en) | 2000-06-20 | 2001-06-19 | ELECTROPHORESIS ANALYSIS PROCEDURE |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000185276A JP3709123B2 (ja) | 2000-06-20 | 2000-06-20 | 電気泳動分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002005886A JP2002005886A (ja) | 2002-01-09 |
| JP3709123B2 true JP3709123B2 (ja) | 2005-10-19 |
Family
ID=18685613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000185276A Expired - Fee Related JP3709123B2 (ja) | 2000-06-20 | 2000-06-20 | 電気泳動分析方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20070044541A1 (ja) |
| EP (1) | EP1312915A4 (ja) |
| JP (1) | JP3709123B2 (ja) |
| WO (1) | WO2001098768A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3871689B2 (ja) * | 2004-08-25 | 2007-01-24 | ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 | 電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法 |
| JPWO2015152135A1 (ja) * | 2014-03-31 | 2017-04-13 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 糖ペプチドの合成と分析方法 |
| JP7224207B2 (ja) * | 2019-03-05 | 2023-02-17 | 株式会社日立ハイテク | 遺伝子型解析装置及び方法 |
| KR102651017B1 (ko) * | 2019-11-07 | 2024-03-22 | 주식회사 엘지화학 | 용출 제어형 비료의 용출 특성을 분석하는 방법 및 시스템 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2940211B2 (ja) * | 1991-03-29 | 1999-08-25 | 株式会社島津製作所 | キャピラリ電気泳動装置 |
| WO1994007132A1 (en) * | 1992-09-14 | 1994-03-31 | Purdue Research Foundation | Electrophoretically mediated chemical analysis |
| US5932080A (en) * | 1997-05-30 | 1999-08-03 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Mobility-based and normalized capillary electrophoresis |
| JPH11248679A (ja) * | 1998-02-26 | 1999-09-17 | Jasco Corp | キャピラリーゾーン電気泳動装置 |
| JP3259032B2 (ja) * | 1999-09-06 | 2002-02-18 | 広島大学長 | キャピラリーゾーン電気泳動法における仮想的浸透流を用いた電気泳動時間−実効移動度変換法 |
| EP1305615B1 (en) * | 2000-07-21 | 2004-09-29 | Aclara BioSciences, Inc. | Method and devices for capillary electrophoresis with a norbornene based surface coating |
| US7052589B1 (en) * | 2001-03-19 | 2006-05-30 | The Texas A&M University System | Method for electrophoretic separations using dynamically generated opposite mobilities |
-
2000
- 2000-06-20 JP JP2000185276A patent/JP3709123B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-06-19 WO PCT/JP2001/005213 patent/WO2001098768A1/ja active Application Filing
- 2001-06-19 US US10/311,300 patent/US20070044541A1/en not_active Abandoned
- 2001-06-19 EP EP01938745A patent/EP1312915A4/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20070044541A1 (en) | 2007-03-01 |
| JP2002005886A (ja) | 2002-01-09 |
| WO2001098768A1 (fr) | 2001-12-27 |
| EP1312915A1 (en) | 2003-05-21 |
| EP1312915A4 (en) | 2008-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Monnig et al. | Capillary electrophoresis | |
| Camilleri | Capillary electrophoresis: theory and practice | |
| Jorgenson et al. | Free-zone electrophoresis in glass capillaries. | |
| Kuhr et al. | Capillary electrophoresis | |
| Jansson et al. | N-Methylformamide as a separation medium in capillary electrophoresis | |
| Foret et al. | Capillary zone electrophoresis: quantitative study of the effects of some dispersive processes on the separation efficiency | |
| US7118660B2 (en) | Method and apparatus for analyzing a mixture of sample substances | |
| Deml et al. | Electric sample splitter for capillary zone electrophoresis | |
| Kim et al. | Quantitative analysis of serum proteins separated by capillary electrophoresis | |
| Jorgenson | Zone electrophoresis in open-tubular capillaries | |
| Wätzig et al. | Capillary electrophoresis–A high performance analytical separation technique | |
| AU669308B2 (en) | Use of capillary electrophoresis for quantitating the concentration of protein components and of the total proteinin fluids | |
| Pospı́chal et al. | Analytical aspects of carrier ampholyte-free isoelectric focusing | |
| JP3190678B2 (ja) | クロマトグラフィー分析法 | |
| Engelhardt et al. | Capillary electrophoresis: methods and scope | |
| JP3709123B2 (ja) | 電気泳動分析方法 | |
| Copper | Capillary electrophoresis: Part I. Theoretical and experimental background | |
| JP4067441B2 (ja) | キャピラリー電気泳動方法、キャピラリー電気泳動プログラム、そのプログラムを記憶した記録媒体及びキャピラリー電気泳動装置 | |
| Pyell et al. | Optimization strategies in micellar electrokinetic capillary chromatography. Optimization of the temperature of the separation capillary | |
| Jenkins | Clinical applications of capillary electrophoresis: Status at the new millennium | |
| Václav et al. | Capillary electrophoresis device with double UV detection and its application to the determination of effective mobilities of peptides | |
| JP3747017B2 (ja) | 酸解離定数測定方法及び測定装置 | |
| Natishan | Capillary Electrophoresis | |
| Štěpánová et al. | Determination of physicochemical parameters of (bio) molecules and (bio) particles by capillary electromigration methods | |
| Jorgenson | Capillary electrophoresis: An introduction |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050510 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050628 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050726 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050805 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090812 Year of fee payment: 4 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |