JP3871689B2

JP3871689B2 - 電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法

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Publication number: JP3871689B2
Application number: JP2004245728A
Authority: JP
Inventors: 昌弘杉本; 朋義曽我; 勝冨田
Original assignee: HUMAN METABOLOME TECHNOLOGIES, INC.
Current assignee: HUMAN METABOLOME TECHNOLOGIES, INC.
Priority date: 2004-08-25
Filing date: 2004-08-25
Publication date: 2007-01-24
Anticipated expiration: 2024-08-25
Also published as: CA2578436A1; US20070256935A1; WO2006022283A1; JP2006064472A; EP1783485A1

Description

本発明は、マイクロチップ型電気泳動、キャピラリ電気泳動（ＣＥ）又はキャピラリ電気泳動（ＣＥ）と質量分析（ＭＳ）を組み合わせたキャピラリ電気泳動／質量分析計（ＣＥ／ＭＳ）等で計測されるイオン性化合物の検出時間を予測するための電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法に関する。

従来、マイクロチップ型電気泳動、キャピラリ電気泳動（ＣＥ）や高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）等の分離分析装置で測定されたピークは、化合物名が既知である標準物質のピークの出現時間と比較することにより、物質の同定が行なわれてきた（特許文献２参照）。しかしながら、全ての化合物のうち、入手可能な標準物質は限られており、全ピークに関する物質の同定は、従来法では不可能であった。

この問題を解決するため、コンピュータを使った方法を用いて、ＣＥや液体クロマトグラフィ（ＬＣ）の移動や保持の原理に基づき、各物質の検出時間を予測する手法が開発されている（非特許文献１乃至６参照）。

又、人工知能技術であるニューラル・ネットワーク（Ａrtificial Ｎeural Ｎetworks：ＡＮＮ）を用いて移動時間や溶出時間を予測する方法も開発されている（非特許文献７乃至１２参照）。

しかしながら、いずれの場合も、物理的、化学的性質が似た少数の物質群の予測に適応したものであり、何百とある様々な種類の化合物の検出時間を同時に予測する方法は未だ存在しない。

特開２００１−８３１１９号公報特許第３３４１７６５号公報Ａnal．Ｃhem．，1998，70，173-181．Ａnalyst，1998，123，1487-1492．Ａnal．Ｃhem．，1999，71，687-699．Ａnal．Ｃhem．，2001，73，1324-1329．Ｅlectrophoresis，2003，24，1596-1602 Ａnal．Ｂiochem．1989，179，28-33．Ｊ．Ｐharmaceutical and Ｂiomedical Ａnalysis 1999，21，95-103 Ｊ．Ｐharmaceutical and Ｂiomedical Ａnalysis 2002，28，581-590 Ａnal．Ｃhem．2003，75，1039-1048．Ｊ．ＣhromatogrＡ，2001，927，211-218 Ｊ．ＣhromatogrＡ，2002，971，207-215 Ｅlectrophoresis，2002，23，1815-1821

電気泳動分析における各物質の移動時間を予測する方法は、以下の２種類がある。

（１）電気移動度の原理を利用した予測法
この予測法は、電気泳動の各物質の移動度は、「物質の電荷に比例し、試料粘度と水和イオン半径に反比例する」という原理に基づいている。しかし、この予測法は、「イオンを球状と仮定する」「電気泳動緩衝液と物質間にスリップが起きない」など様々な仮定を基に考案された方法であり、実際の物質の移動時間の実測値と予想値が合わない例が多数報告されている。又、同族体などのごく少数の特定の物質群を予測する研究例しかなく、予測する式に関する数値パラメータは物資群毎に個別にチューニングしているものもあり、予めどのような種類の物質が存在するか分からない場合には使用できないという問題点がある。

（２）ニューラル・ネットワークによる予測法
これまで、ＣＥ分析における化合物の特徴を数値的に表わす判別子の内、重回帰分析を用いて、移動度に影響の大きいと考えられるものを３個程度に絞込み、これらと物質の移動度間の関係をＡＮＮで学習する方法が使用されてきた。しかし、絞り込まれる判別子は対象とする物質群毎に異なり、この方法でも、特定の少数の物質群に関する移動度の予測しか適用することができない。

一方近年、キャピラリ電気泳動と質量分析を組み合わせた、高感度で高選択性を有するＣＥ／ＭＳも開発されている（特許文献１参照）。しかしながら、このＣＥ／ＭＳでは、物質がキャピラリ内で移動中にキャピラリの出口に接続しているＭＳから引圧あるいは背圧を受けるため、ＣＥとＣＥ／ＭＳで同じ予測モデルをそのまま使用することはできないという問題点を有していた。

本発明は、前記従来の問題点を解決するべくなされたもので、ＣＥだけでなく、これまで誰も成功していないマイクロチップ型電気泳動や、ＣＥ／ＭＳ内のあらゆる種類が混在した低分子化合物群の移動度を予測することを課題とする。

本発明は、マイクロチップ型電気泳動、キャピラリ電気泳動又はキャピラリ電気泳動／質量分析計内の移動時間が不明の物質の移動時間を予測する際に、まず、電気泳動の移動時間が既知の物質について、その２次元構造から予測した３次元構造から計算した、分子の特徴を示す記述子、分子の２次元構造から計算した電離指数、及び、化合物のイオン価数を含む、数値的に表現可能な特徴量（例えば、半径、質量、イオン価数等）を計算して、該特徴量と移動時間の関係を予測し、幾つかの物質の移動時間を電気泳動又は電気泳動／質量分析計で計測して、前記関係を学習させ、該学習させた結果を用いて、電気泳動又は電気泳動／質量分析計内の移動時間が不明の物質の構造から、その移動時間を予測するようにして、前記課題を解決したものである。

又、前記３次元構造が、真空内に単独で存在し他から影響の無い状態を仮定し、化合物単体でエネルギ的に最も安定な構造を取るような形状をとるようにしたものである。

又、前記化合物のイオン価数を、次式を用いて計算するようにしたものである。

（ここで、ｉとｊは酸解離指数ｐＫａの添え字で、ｎは負の値に電荷を生じる物質のｐＫａの数、ｍは正の値に電荷を生じる物質のｐＫａの数であり、ｐＨにはマイクロチップ型電気泳動、ＣＥ又はＣＥ／ＭＳで使用する泳動緩衝液のｐＨの値を用いる。）

又、前記移動時間を、電気泳動又は電気泳動／質量分析計内で計測した化合物の移動時間を、内標準物質の移動時間で正規化した相対移動時間としたものである。

又、前記関係を、入力層と隠れ層と出力層を有する３層構造のニューラル・ネットワークを用いて、例えばバック・プロパゲーション法により学習するようにしたものである。

又、前記入力層に、化合物の記述子の値全てとイオン価数を加え、前記出力層に、化合物の相対移動時間を加えるようにしたものである。

又、前記入力層と出力層に加える各値の最大値と最小値の差が大きく離れている場合は、対数正規化を行ない、差が小さい場合は、線形正規化を行なうようにしたものである。

又、同じデータを多数のニューラル・ネットワークで学習させて、出力は平均値をとるようにしたものである。

本発明によれば、どのような種類のイオン性化合物に関しても、構造式を与えることにより、その２次元構造から、マイクロチップ型電気泳動、ＣＥ及びＣＥ／ＭＳの移動時間を高い精度で予測することができる。従って、構造式が分かれば、標準物質が無くても、マイクロチップ型電気泳動、ＣＥ又はＣＥ／ＭＳで検出された物質を特定することができる。

更に、既存の方法ではできなかった、マイクロチップ型電気泳動、ＣＥ又はＣＥ／ＭＳ分析における様々な種類の分子の移動度を一度に予測することが可能になる。よって、候補化合物の移動時間を全て予想し、マイクロチップ型電気泳動、ＣＥ又はＣＥ／ＭＳで検出された未知成分の移動時間で比較することにより、何の種類の物質が入っているか分からないサンプルの未知ピークの同定を行なうことが可能になる。

以下図面を参照して、本発明の実施形態を詳細に説明する。

本発明の適用対象の一つであるＣＥ／ＭＳは、例えば図１に示す如く、試料の分離を行なうキャピラリ電気泳動装置（ＣＥ）３０と、分離された試料を霧化する霧化装置としてのエレクトロスプレーニードル４０と、霧化した試料からイオン性化合物を分析する質量分析計（ＭＳ）５０から構成される。

前記ＣＥ３０は、キャピラリ３２と、該キャピラリ３２の中に導入され、試料を分離するための泳動緩衝液（バッファとも称する）２２を貯留する緩衝液槽２０と、該泳動緩衝液２２に先端が浸漬された白金電極１２と、該白金電極１２に高電圧（例えば−３０ｋＶ〜＋３０ｋＶ）を印加するための高電圧電源１６とを含んでいる。

前記キャピラリ３２の一端は前記泳動緩衝液２２に浸漬され、他端は前記エレクトロスプレーニードル４０に接続されている。

前記エレクトロスプレーニードル４０には、シース液槽４２内に貯留されたシース液４４が、ポンプ４６により、エレクトロスプレーに適した液量で供給されると共に、細かい液滴を生成してイオン化を促進するネブライザガス（例えば窒素ガス）４８が供給されている。

前記ＭＳ５０は、コーン５２を備え、該コーン５２には、イオンを加速して窒素ガスに衝突させ、フラグメントイオンを生成するためのフラグメンタ電圧が印加されると共に、ＣＥ３０から入ってきた溶媒を揮発させるためのドライイングガス（例えば窒素ガス）５４が供給されている。

このような装置において、緩衝液槽２０に試料を入れ、白金電極１２に所定の高電圧を印加すると、試料と泳動緩衝液２２とは、キャピラリ３２を通って、エレクトロスプレーニードル４０へ移動する。このとき、イオン性化合物は、イオン半径やイオン性の違いにより移動速度が異なるので分離され、バンド状になってエレクトロスプレーニードル４０へ泳動する。そして、エレクトロスプレーニードル４０で霧化され、ＭＳ５０で分析される。

本発明による移動時間の予測は次のようにして行なう。

本実施形態では、あらゆる種類のイオン性化合物のＣＥ／ＭＳ内での移動度を予測するために、まず、図２に例示する如く、物質の２次元構造から３次元構造を予測する。このとき、３次元構造は真空内に単独で存在し、他から影響の無い状況を仮定し、化合物単体でエネルギ的に最も安定な構造を取るような形状をとるようにする。

次に、予測した３次元構造から、分子の特徴を示す記述子を計算する。記述子としては、例えばＣhemical Ｃomputing Ｇroup Ｉnc．のＭolecular Ｏperating Ｅnvironment（ＭＯＥ）の標準記述子を用いることができる。

又、分子の２次元構造から酸解離指数ｐＫａを計算し、次の（１）〜（３）式を用いて、化合物のイオン価数を計算する。

次に、化合物の記述子、酸解離指数ｐＫａ、イオン価数と、ＣＥ／ＭＳで計測した化合物の移動時間を内標準物質の移動時間で割って正規化した相対移動時間の間の関係を、図３に例示するような３層構造（１入力層、１隠れ層、１出力層）のニューラル・ネットワークＡＮＮを用いて、例えばバック・プロパゲーション法により学習する。図３に、ニューラル・ネットワークＡＮＮの構造と入出力層に割り当てられる値を示す。

該ニューラル・ネットワークＡＮＮの出力層のノード数は１で固定であり、内標準物質の移動時間によって正規化された化合物の相対移動時間を加える。

前記入力層には、次のものを加える。

（１）化合物の記述子で、学習の対象とする全ての物質において、１つでも値が異なるもの全てを用いる。

（２）酸解離指数ｐＫａの値のうち、測定時の泳動緩衝液のｐＨに最も近い値１つを用いる。

（３）（１）〜（３）式で計算したイオン価数を用いる。

従って、入力層のノード数は、入力される記述子の数と酸解離指数ｐＫａとイオン価数の和となる。

前記入力層及び出力層に与えられる値は、０．１〜０．９の間の値に正規化する。即ち、最大値と最小値の差が大きく離れている場合は、（４）式を用いて対数正規化を行ない、差が小さい場合は、（５）式を用いて線形正規化を行なう。

Ｖ^＊＝０．８＊（log₁₀Ｖ−log₁₀Ｖ_min）／（log₁₀Ｖ_max−log₁₀Ｖ_min）＋０．１
…（４）
Ｖ^＊＝０．８＊（Ｖ−Ｖ_min）／（Ｖ_max−Ｖ_min）＋０．１ …（５）
ここで、Ｖは正規化される値で、Ｖ_maxとＶ_minは対象とする化合物において最大値と最小値、Ｖ^＊は正規化された値である。

更に、図４に示す如く、同じ学習データを多数のニューラル・ネットワークＡＮＮ_１〜ＡＮＮ_Ｎで学習させて、各ＡＮＮの出力の平均値を取るＡＮＮアンサンブル法を用いることで、学習の精度を高めることができる。なお、アンサンブル法は省略することもできる。

本発明の処理は、全てパーソナル・コンピュータで行なうことができる。

本発明により陽イオン性低分子の移動時間を予測した。

（１）ＣＥ／ＭＳ分析条件
キャピラリ３２には、内径５０μｍ、外径３６０μｍ、全長１００ｃｍのフューズドシリカキャピラリを用いた。泳動緩衝液２２には、１Ｍ蟻酸（ｐＨ＝１．８）を用いた。印加電圧は、＋３０ｋＶ、キャピラリ３２の温度は２０℃で測定した。試料は、加圧法を用いて、５０mbarで３秒間注入した。質量分析装置（ＭＳ）５０は、エレクトロスプレーイオン化法の正イオンモードを用い、キャピラリ電圧は４０００Ｖ、フラグメンタは１００Ｖに設定した。窒素をドライイングガス５４に用い、ガスの温度は３００℃、１０ｌ／分の流速で測定した。

シース液４４には１０ｍＭ酢酸アンモニウム、５０％メタノール水溶液を用い、流速１０μｌ／分で送液した。測定試料には内標準物質としてメチオニンスルフォンを添加し、各測定物質の移動時間をメチオニンスルフォンの移動時間を用いて補正し、相対移動時間を求めた。

（２）ＡＮＮに使用するデータの計算
２次元分子構造は、http://ligand.genome.ad.jp:8080/compound/からダウンロード可能な、ＫＥＧＧＬigand Ｄatabaseに登録されている物質のうち、ＭＤＬ社のＭＤＬ／Ｍol形式のものを用いた。

２次元分子構造から３次元分子構造の予測、及び、物質の特徴の記述子には、Ｃhemical Ｃomputing Ｇroup Ｉnc．のＭolecular Ｏperating Ｅnvironment（ＭＯＥ）を用いた。即ち、ＭＯＥのＥnergy Ｍinimize機能を用いて３次元構造を予測し、標準記述子１９２個を計算した。

物質の電離指数ｐＫａの計算には、Ａdvanced Ｃhemistry Ｄevelopment社のソフトウェアｐＫａＤＢを用い、得られたｐＫａから、（１）〜（３）式によりイオン価数を計算した。

相対移動時間は、対象とする物質の移動時間を、メチオニンスルフォンの移動時間で割った値を用いた。

（３）ＡＮＮの計算
イ．学習方法
以下のクロスバリディーション法を用いてＡＮＮを学習した。２７１の実測データを無作為にグループ（約９０％の学習データと、残り１０％のテストデータ）に分割する。学習データを用いてＡＮＮを学習させ、学習済みＡＮＮでテストデータを予測する。次の試行では、同じデータがテストデータとして選ばれないようにして、全てのデータが一度はテストデータとして選ばれるように、この手順を１０回繰り返した。

ロ．データの正規化
ＡＮＮの入出力層に割り当てられる値で１０³より離れているものは、（４）式で対数正規化し、１０³以下のものは、（５）式で線形正規化を行なった。

ハ．ＡＮＮの学習パラメータは、以下のように設定した。

学習の速さを決定する学習率は０．０３、０．０４、・・・、０．０７の４通りを用いた。

学習の遅さを決定するモーメンタムには０．９を用いた。

隠れ層のユニット数は１０、２０、・・・、１００の１０通りを用いた。

学習の回数（エポック数）は８０００を用いた。

又、ユニット間の初期重みは乱数を用いて発生させた。異なる乱数の種を用い、上記の設定の全ての組合せに対し、１０種類の初期重みのパターンを発生させた。即ち、４（学習率）×１０（隠れ層）×１０（乱数）で４００パターンの学習パラメータのＡNNを学習した。

（４）ＡＮＮアンサンブルの計算
（３）で計算したＡＮＮのうち、学習データに関して実測値と予想値の相関係数が高いものから３０個分の出力の平均値を計算し、これを化合物の予測相対移動時間とした。

上記の条件を用いて、２７１個の陽イオンを予測した相対移動時間の実測値と予測値の関係を図５に示す。この方法で予測した相対移動時間と、ＣＥ／ＭＳで実測した相対移動時間の相関係数は０．９３１という高い値であった。

なお、前記実施形態においては、質量分析計（ＭＳ）でエレクトロスプレー法（ＥＳＩ）によるイオン化を用いていたが、イオン化法は、これに限定されず、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）、高速原子衝突法（ＦＡＢ）等であってもよい。

又、質量分析計も、図示したシングルステージの四重極型の質量分析計に限らず、磁場型、飛行時間、イオントラップ等の他の形式の質量分析計や、タンデム型の質量分析計（ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ^ｎ）であってもよい。更に、ＣＥ／ＭＳに限らず、ＣＥ単独であってもよい。又、ＣＥでなくマイクロチップ型電気泳動であってもよい。

又、予測をする際に、２次元構造から３次元構造を予測しなくても、多少精度は落ちるが２次元構造だけから化合物の移動時間を予測することもできる。

又、ＡＮＮアンサンブルでなくても、多少精度は落ちるが単独のＡＮＮでも予測することができる。

又、ＡＮＮでなくても、重回帰分析や、サポート・ベクター・マシーンのような複数の数値パラメータ間の関係を学習する方法でも予測することが出来る。

又、ＭＤＬ社のＭＯＬ形式以外でも、分子の２次元構造が分るファイルの形式であれば、どのようなフォーマットであってもそのデータを用いて予測することが出来る。

又、ＫＥＧＧＬigand Ｄatabase以外のデータベース（例えば、Ｍerck Ｉndexなど）でも、分子の２次元構造が分るデータが登録されていれば、そのデータを用いて予測することができる。

又、ＡＮＮの入出力層に使用する数値を正規化する方法に関して、前記実施形態では、その最大値と最小値に大きな差があるデータに関しては対数正規化、その他の値は線形正規化を行っているが、多少精度は落ちるが、どのような正規化の方法でも構わない。

本発明が適用されるキャピラリ電気泳動／質量分析計の構成例を示す模式図本発明により予測される２次元分子構造と３次元分子構造の関係の例を示す図本発明で用いるニューラル・ネットワークの構造と入出力層に割り当てられる値の例を示す図同じくＡＮＮアンサンブルの構成図本発明の実施例における相対移動時間の実測値と予測値の関係の例を示す図

符号の説明

１６…高電圧電源
２０…緩衝液槽
２２…泳動緩衝液（バッファ）
３０…キャピラリ電気泳動装置（ＣＥ）
３２…キャピラリ
４０…エレクトロスプレーニードル
４２…シース液槽
４４…シース液
４８…ネプライザガス
５０…質量分析計（ＭＳ）
５４…ドライイングガス
ＡＮＮ…ニューラル・ネットワーク

Claims

マイクロチップ型電気泳動、キャピラリ電気泳動又はキャピラリ電気泳動／質量分析計内の移動時間が不明の物質の移動時間を予測する際に、
まず、電気泳動の移動時間が既知の物質について、その２次元構造から予測した３次元構造から計算した、分子の特徴を示す記述子、分子の２次元構造から計算した電離指数、及び、化合物のイオン価数を含む、数値的に表現可能な特徴量を計算して、該特徴量と移動時間の関係を予測し、
幾つかの物質の移動時間を電気泳動又は電気泳動／質量分析計で計測して、前記関係を学習させ、
該学習させた結果を用いて、電気泳動又は電気泳動／質量分析計内の移動時間が不明の物質の構造から、その移動時間を予測することを特徴とする電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法。
前記３次元構造が、真空内に単独で存在し他から影響の無い状態を仮定し、化合物単体でエネルギ的に最も安定な構造を取るような形状をとるようにすることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法。
前記化合物のイオン価数を、次式を用いて計算することを特徴とする請求項１に記載の電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法。

（ここで、ｉとｊは酸解離指数ｐＫａの添え字で、ｎは負の値に電荷を生じる物質のｐＫａの数、ｍは正の値に電荷を生じる物質のｐＫａの数であり、ｐＨにはマイクロチップ型電気泳動、キャピラリ電気泳動又はキャピラリ電気泳動／質量分析計で使用する泳動緩衝液のｐＨの値を用いる。）
前記移動時間が、電気泳動又は電気泳動／質量分析計内で計測した化合物の移動時間を、内標準物質の移動時間で正規化した相対移動時間である請求項１に記載の電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法。
前記関係を、入力層と隠れ層と出力層を有する多層構造のニューラル・ネットワークを用いて学習することを特徴とする請求項１に記載の電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法。
前記入力層に、化合物の記述子の値全てとイオン価数を加え、前記出力層に、化合物の相対移動時間を加えることを特徴とする請求項５に記載の電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法。
前記入力層と出力層に加える各値の最大値と最小値の差が大きく離れている場合は、対数正規化を行ない、差が小さい場合は、線形正規化を行なうことを特徴とする請求項６に記載の電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法。
同じデータを多数のニューラル・ネットワークで学習させて、出力は平均値をとることを特徴とする請求項５に記載の電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法。