WO2006022283A1

WO2006022283A1 - 電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法

Info

Publication number: WO2006022283A1
Application number: PCT/JP2005/015325
Authority: WO
Inventors: Masahiro Sugimoto; Tomoyoshi Soga; Masaru Tomita
Original assignee: Human Metabolome Technologies, Inc.
Priority date: 2004-08-25
Filing date: 2005-08-24
Publication date: 2006-03-02
Also published as: JP3871689B2; US20070256935A1; JP2006064472A; EP1783485A1; CA2578436A1

Abstract

　マイクロチップ型電気泳動、キャピラリ電気泳動（ＣＥ）又はキャピラリ電気泳動／質量分析計（ＣＥ／ＭＳ）内の移動時間が不明な低分子化合物の移動時間を予測する際に、まず、電気泳動の移動時間が既知の物質について、その構造から数値的に表現可能な特徴量を計算して、該特徴量と移動時間の関係を予測し、幾つかの物質の移動時間を電気泳動又は電気泳動／質量分析計で計測して、前記関係を学習させ、該学習させた結果を用いて、電気泳動又は電気泳動／質量分析計内の移動時間が不明の物質の構造から、その移動時間を予測する。

Description

明細書

電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法

技術分野

[0001] 本発明は、マイクロチップ型電気泳動、キヤビラリ電気泳動（CE)又はキヤビラリ電気泳動 (CE)と質量分析 (MS)を組み合わせたキヤビラリ電気泳動 Z質量分析計 (C EZMS)等で計測されるイオン性化合物の検出時間を予測するための電気泳動測定によるイオン性ィ匕合物の移動時間予測方法に関する。

背景技術

[0002] 従来、マイクロチップ型電気泳動、キヤビラリ電気泳動（CE)や高速液体クロマトダラフィ (HPLC)等の分離分析装置で測定されたピークは、化合物名が既知である標準物質のピークの出現時間と比較することにより、物質の同定が行なわれてきた (特許第 3341765号公報参照)。し力しながら、全ての化合物のうち、入手可能な標準物質は限られており、全ピークに関する物質の同定は、従来法では不可能であった。

[0003] この問題を解決するため、コンピュータを使った方法を用いて、 CEや液体クロマトグラフィ (LC)の移動や保持の原理に基づき、各物質の検出時間を予測する手法が開発されている（Anal. Chem. , 1998, 70, 173-181. 、 Analyst, 1998, 123, 1487-14 92. 、 Anal. Chem. , 1999, 71, 687-699. 、 Anal. Chem. , 2001, 73, 1324-1329. 、 Electrophoresis, 2003, 24, 1596- 1602、 Anal. Biochem. 1989, 179, 28-33.参照）。

[0004] 又、人工知能技術である-ユーラル'ネットワーク（Artificial Neural Networks : A NN)を用いて移動時間や溶出時間を予測する方法も開発されて、る (J. Pharmaceu tical and Biomedical Analysis 1999, 21, 95— 103、 J. Pnarmaceutical and Biome dical Analysis 2002, 28, 581— 590、 Anal. Chem. 2003, 75, 1039-1048. 、J. Chro matogrA, 2001, 927, 21ト 218、 ChromatogrA, 2002, 971, 207 - 215、 Electrophor esis, 2002, 23, 1815- 1821参照）。

[0005] し力しながら、いずれの場合も、物理的、化学的性質が似た少数の物質群の予測に適応したものであり、何百とある様々な種類の化合物の検出時間を同時に予測する方法は未だ存在しない。 [0006] 電気泳動分析における各物質の移動時間を予測する方法は、以下の 2種類がある

[0007] (1)電気移動度の原理を利用した予測法

この予測法は、電気泳動の各物質の移動度は、「物質の電荷に比例し、試料粘度と水和イオン半径に反比例する」という原理に基づいている。しかし、この予測法は、「イオンを球状と仮定する」「電気泳動緩衝液と物質間にスリップが起きなヽ」など様々な仮定を基に考案された方法であり、実際の物質の移動時間の実測値と予想値が合わない例が多数報告されている。又、同族体などのごく少数の特定の物質群を予測する研究例しかなぐ予測する式に関する数値パラメータは物資群毎に個別にチューニングしているものもあり、予めどのような種類の物質が存在するか分からない場合には使用できな、と、う問題点がある。

[0008] (2)-ユーラル ·ネットワークによる予測法

これまで、 CE分析における化合物の特徴を数値的に表わす判別子の内、重回帰分析を用いて、移動度に影響の大きいと考えられるものを 3個程度に絞込み、これらと物質の移動度間の関係を ANNで学習する方法が使用されてきた。しかし、絞り込まれる判別子は対象とする物質群毎に異なり、この方法でも、特定の少数の物質群に関する移動度の予測し力適用することができない。

[0009] 一方近年、キヤビラリ電気泳動と質量分析を組み合わせた、高感度で高選択性を有する CEZMSも開発されている（特開 2001— 83119号公報参照)。しかしながら、この CEZMSでは、物質がキヤビラリ内で移動中にキヤビラリの出口に接続している MSから引圧あるいは背圧を受けるため、 CEと CEZMSで同じ予測モデルをそのまま使用することはできな、と、う問題点を有して、た。

発明の開示

[0010] 本発明は、前記従来の問題点を解決するべくなされたもので、 CEだけでなぐこれまで誰も成功してヽな、マイクロチップ型電気泳動や、 CEZMS内のあらゆる種類が混在した低分子化合物群の移動度を予測することを課題とする。

[0011] 本発明は、マイクロチップ型電気泳動、キヤビラリ電気泳動又はキヤビラリ電気泳動

Z質量分析計内の移動時間が不明の物質の移動時間を予測する際に、まず、電気泳動の移動時間が既知の物質について、その構造力数値的に表現可能な特徴量 (例えば、半径、質量、イオン価数等)を計算して、該特徴量と移動時間の関係を予測し、幾つかの物質の移動時間を電気泳動又は電気泳動 Z質量分析計で計測して、前記関係を学習させ、該学習させた結果を用いて、電気泳動又は電気泳動 Z質量分析計内の移動時間が不明の物質の構造から、その移動時間を予測するようにして、前記課題を解決したものである。

[0012] 又、前記特徴量が、物質の 2次元構造から予測した 3次元構造から計算した、分子の特徴を示す判別子、分子の 2次元構造力計算した電離指数、及び、化合物のィオン価数を含むようにしたものである。

[0013] 又、前記 3次元構造が、真空内に単独で存在し他から影響の無い状態を仮定し、化合物単体でエネルギ的に最も安定な構造を取るような形状をとるようにしたものである。

[0014] 又、前記化合物のイオン価数を、次式を用いて計算するようにしたものである。

[0015] [数 1]

Q

jQ

）

q =∑^a「+∑^a … （3 )

(ここで、 iと jは酸解離指数 pKaの添え字で、 nは負の値に電荷を生じる物質の pKa の数、 mは正の値に電荷を生じる物質の pKaの数であり、 pHにはマイクロチップ型電気泳動、 CE又は CEZMSで使用する泳動緩衝液の pHの値を用いる。 )

[0016] 又、前記移動時間を、電気泳動又は電気泳動 Z質量分析計内で計測した化合物の移動時間を、内標準物質の移動時間で正規ィ匕した相対移動時間としたものである

[0017] 又、前記関係を、入力層と隠れ層と出力層を有する 3層構造のニューラル 'ネットヮークを用いて、例えばバック'プロパゲーション法により学習するようにしたものである

[0018] 又、前記入力層に、化合物の判別子の値全てとイオン価数を加え、前記出力層に、化合物の相対移動時間をカ卩えるようにしたものである。

[0019] 又、前記入力層と出力層に加える各値の最大値と最小値の差が大きく離れている場合は、対数正規化を行ない、差が小さい場合は、線形正規ィ匕を行なうようにしたものである。

[0020] 又、同じデータを多数の-ユーラル ·ネットワークで学習させて、出力は平均値をとるようにしたものである。

[0021] 本発明によれば、どのような種類のイオン性ィ匕合物に関しても、構造式を与えることにより、その 2次元構造から、マイクロチップ型電気泳動、 CE及び CEZMSの移動時間を高い精度で予測することができる。従って、構造式が分かれば、標準物質が無くても、マイクロチップ型電気泳動、 CE又は CEZMSで検出された物質を特定することがでさる。

[0022] 更に、既存の方法ではできなかった、マイクロチップ型電気泳動、 CE又は CEZM S分析における様々な種類の分子の移動度を一度に予測することが可能になる。よつて、候補化合物の移動時間を全て予想し、マイクロチップ型電気泳動、 CE又は C EZMSで検出された未知成分の移動時間で比較することにより、何の種類の物質が入っているか分からないサンプルの未知ピークの同定を行なうことが可能になる。図面の簡単な説明

[0023] [図 1]本発明が適用されるキヤビラリ電気泳動 Z質量分析計の構成例を示す模式図 [図 2]本発明により予測される 2次元分子構造と 3次元分子構造の関係の例を示す図 [図 3]本発明で用いる-ユーラル'ネットワークの構造と入出力層に割り当てられる値の例を示す図

[図 4]同じく ANNアンサンブノレの構成図

[図 5]本発明の実施例における相対移動時間の実測値と予測値の関係の例を示す図

発明を実施するための最良の形態

[0024] 以下図面を参照して、本発明の実施形態を詳細に説明する。

[0025] 本発明の適用対象の一つである CEZMSは、例えば図 1に示す如ぐ試料の分離を行なうキヤビラリ電気泳動装置 (CE) 30と、分離された試料を霧化する霧化装置としてのエレクトロスプレー-一ドル 40と、霧化した試料力イオン性ィ匕合物を分析する質量分析計 (MS) 50から構成される。

[0026] 前記 CE30は、キヤビラリ 32と、該キヤビラリ 32の中に導入され、試料を分離するための泳動緩衝液 (バッファとも称する） 22を貯留する緩衝液槽 20と、該泳動緩衝液 2

2に先端が浸漬された白金電極 12と、該白金電極 12に高電圧 (例えば— 30kV〜 +

30kV)を印加するための高電圧電源 16とを含んで!/、る。

[0027] 前記キヤビラリ 32の一端は前記泳動緩衝液 22に浸漬され、他端は前記エレクト口スプレー-一ドル 40に接続されて!、る。

[0028] 前記エレクトロスプレー-一ドル 40には、シース液槽 42内に貯留されたシース液 4

4力ポンプ 46により、エレクトロスプレーに適した液量で供給されると共に、細かい液滴を生成してイオンィ匕を促進するネブライザガス (例えば窒素ガス) 48が供給されている。

[0029] 前記 MS50は、コーン 52を備え、該コーン 52には、イオンを加速して窒素ガスに衝突させ、フラグメントイオンを生成するためのフラグメンタ電圧が印加されると共に、 C E30から入ってきた溶媒を揮発させるためのドライイングガス (例えば窒素ガス） 54が供給されている。

[0030] このような装置において、緩衝液槽 20に試料を入れ、白金電極 12に所定の高電圧を印加すると、試料と泳動緩衝液 22とは、キヤビラリ 32を通って、エレクトロスプレ一-一ドル 40へ移動する。このとき、イオン性化合物は、イオン半径やイオン性の違いにより移動速度が異なるので分離され、バンド状になってエレクトロスプレーニードル 40へ泳動する。そして、エレクトロスプレー-一ドル 40で霧化され、 MS50で分析される。

[0031] 本発明による移動時間の予測は次のようにして行なう。

[0032] 本実施形態では、あらゆる種類のイオン性ィ匕合物の CEZMS内での移動度を予測するために、まず、図 2に例示する如ぐ物質の 2次元構造から 3次元構造を予測する。このとき、 3次元構造は真空内に単独で存在し、他から影響の無い状況を仮定し、化合物単体でエネルギ的に最も安定な構造を取るような形状をとるようにする。

[0033] 次に、予測した 3次元構造から、分子の特徴を示す判別子を計算する。判別子として fま、 f列え ί Chemical Computing Group Inc.の Molecular Operating Environe nt (MOE)の標準判別子を用いることができる。

[0034] 又、分子の 2次元構造から酸解離指数 pKaを計算し、次の（1)〜（3)式を用いて、化合物のイオン価数を計算する。

[0035] [数 2]

10

α 10 十】

10

α 二 ( 2 )

[0036] 次に、化合物の判別子、酸解離指数 pKa、イオン価数と、 CEZMSで計測した化合物の移動時間を内標準物質の移動時間で割って正規化した相対移動時間の間の関係を、図 3に例示するような 3層構造（1入力層、 1隠れ層、 1出力層）の-ユーラル.ネットワーク ANNを用いて、例えばバック'プロパゲーション法により学習する。図 3に、ニューラル ·ネットワーク ANNの構造と入出力層に割り当てられる値を示す。

[0037] 該-ユーラル'ネットワーク ANNの出力層のノード数は 1で固定であり、内標準物質の移動時間によって正規ィ匕された化合物の相対移動時間を加える。

[0038] 前記入力層には、次のものを加える。

[0039] (1)化合物の判別子で、学習の対象とする全ての物質において、 1つでも値が異なるもの全てを用いる。

[0040] (2)酸解離指数 pKaの値のうち、測定時の泳動緩衝液の pHに最も近、値 1つを用いる。

[0041] (3) (1)〜（3)式で計算したイオン価数を用いる。

[0042] 従って、入力層のノード数は、入力される判別子の数と酸解離指数 pKaとイオン価数の和となる。

[0043] 前記入力層及び出力層に与えられる値は、 0. 1〜0. 9の間の値に正規化する。即ち、最大値と最小値の差が大きく離れている場合は、（4)式を用いて対数正規ィ匕を行ない、差が小さい場合は、（5)式を用いて線形正規化を行なう。

[0044] V* =0. 8 * (log V— log V ) / (log V —log V ) +0. 1

10 10 min 10 max 10 min

…(

V* =0. 8 * (V— V ) / (V -V ) +0. 1 - -- (5)

min max min

[0045] ここで、 Vは正規化される値で、 V と V は対象とする化合物において最大値と最

max min

小値、 V*は正規ィ匕された値である。

[0046] 更に、図 4に示す如ぐ同じ学習データを多数の-ユーラル.ネットワーク ANN 〜A NNで学習させて、各 ANNの出力の平均値を取る ANNアンサンブル法を用いるこ

N

とで、学習の精度を高めることができる。なお、アンサンブル法は省略することもできる。

[0047] 本発明の処理は、全てパーソナル 'コンピュータで行なうことができる。

[0048] 本発明により陽イオン性低分子の移動時間を予測した。

[0049] (l) CEZMS分析条件

キヤビラリ 32には、内径 50 μ m、外径 360 μ m、全長 100cmのフューズドシリカキャビラリを用いた。泳動緩衝液 22には、 1M蟻酸 (pH= l. 8)を用いた。印加電圧は、 + 30kV、キヤビラリ 32の温度は 20°Cで測定した。試料は、加圧法を用いて、 50mb arで 3秒間注入した。質量分析装置（MS) 50は、エレクトロスプレーイオン化法の正イオンモードを用い、キヤビラリ電圧は 4000V、フラグメンタは 100Vに設定した。窒素をドライイングガス 54に用い、ガスの温度は 300°C、 101Z分の流速で測定した。

[0050] シース液 44には 10mM酢酸アンモ-ゥム、 50%メタノール水溶液を用い、流速 10 μ 1Z分で送液した。測定試料には内標準物質としてメチォニンスルフォンを添加し、各測定物質の移動時間をメチォニンスルフォンの移動時間を用いて補正し、相対移動時間を求めた。

[0051] (2) ANNに使用するデータの計算

2次元分子構造は、 http:〃ligand.genome.ad.jp:8080/compound/からダウンロード可能な、 KEGG Ligand Databaseに登録されている物質のうち、 MDL社の MDL ZMol形式のものを用いた。 [0052] 2次元分子構造から 3次元分子構造の予測、及び、物質の特徴の判別子には、 Ch emical Computing Group Inc.の Molecular Operating Environent (MOE) 用いた。即ち、 MOEの Energy Minize機能を用いて 3次元構造を予測し、標準判別子 192個を計算した。

[0053] 物質の電離指数 pKaの計算には、 Advanced Chemistry Developmenet社のソフトウェア pKaDBを用い、得られた pKaから、（1)〜（3)式によりイオン価数を計算した。

[0054] 相対移動時間は、対象とする物質の移動時間を、メチォニンスルフォンの移動時間で割った値を用いた。

[0055] (3) ANNの計算

i.学習方法

以下のクロスノくリディーション法を用、て ANNを学習した。 271の実測データを無作為にグループ (約 90%の学習データと、残り 10%のテストデータ）に分割する。学習データを用いて ANNを学習させ、学習済み ANNでテストデータを予測する。次の試行では、同じデータがテストデータとして選ばれないようにして、全てのデータが一度はテストデータとして選ばれるように、この手順を 10回繰り返した。

[0056] ii.データの正規ィ匕

ANNの入出力層に割り当てられる値で 10³より離れて、るものは、（4)式で対数正規ィ匕し、 10³以下のものは、（5)式で線形正規化を行なった。

[0057] iii. ANNの学習パラメータは、以下のように設定した。

[0058] 学習の速さを決定する学習率は 0. 03、 0. 04、 · · ·、 0. 07の 4通りを用いた。

[0059] 学習の遅さを決定するモーメンタムには 0. 9を用いた。

[0060] 隠れ層のユニット数は 10、 20、 · · ·、 100の 10通りを用いた。

[0061] 学習の回数（エポック数）は 8000を用いた。

[0062] 又、ユニット間の初期重みは乱数を用いて発生させた。異なる乱数の種を用い、上記の設定の全ての組合せに対し、 10種類の初期重みのパターンを発生させた。即ち、 4 (学習率） X 10 (隠れ層） X 10ほ L数）で 400パターンの学習パラメータの ANN を学習した。

[0063] (4) ANNアンサンブルの計算 (3)で計算した ANNのうち、学習データに関して実測値と予想値の相関係数が高いものから 30個分の出力の平均値を計算し、これを化合物の予測相対移動時間とした。

[0064] 上記の条件を用いて、 271個の陽イオンを予測した相対移動時間の実測値と予測値の関係を図 5に示す。この方法で予測した相対移動時間と、 CEZMSで実測した相対移動時間の相関係数は 0. 931という高い値であった。

[0065] なお、前記実施形態にお!、ては、質量分析計 (MS)でエレクトロスプレー法 (ESI) によるイオンィ匕を用いていたが、イオン化法は、これに限定されず、大気圧化学ィォン化法 (APCI)、高速原子衝突法 (FAB)等であってもよ、。

[0066] 又、質量分析計も、図示したシングルステージの四重極型の質量分析計に限らず、磁場型、飛行時間、イオントラップ等の他の形式の質量分析計や、タンデム型の質量分析計（MS/MS、 MSⁿ)であってもよい。更に、 CE/MSに限らず、 CE単独であつてもよい。又、 CEでなくマイクロチップ型電気泳動であってもよい。

[0067] 又、予測をする際に、 2次元構造力 3次元構造を予測しなくても、多少精度は落ちるが 2次元構造だけ力化合物の移動時間を予測することもできる。

[0068] 又、 ANNアンサンブルでなくても、多少精度は落ちるが単独の ANNでも予測することができる。

[0069] 又、 ANNでなくても、重回帰分析や、サポート 'ベクタ一'マシーンのような複数の数値パラメータ間の関係を学習する方法でも予測することが出来る。

[0070] 又、 MDL社の MOL形式以外でも、分子の 2次元構造が分るファイルの形式であれば、どのようなフォーマットであってもそのデータを用いて予測することが出来る。

[0071] 又、 KEGG Ligand Database以外のデータベース（例えば、 Merck Indexなど）でも、分子の 2次元構造が分るデータが登録されていれば、そのデータを用いて予柳』することができる。

[0072] 又、 ANNの入出力層に使用する数値を正規化する方法に関して、前記実施形態では、その最大値と最小値に大きな差があるデータに関しては対数正規化、その他の値は線形正規ィ匕を行っているが、多少精度は落ちるが、どのような正規化の方法でも構わない。産業上の利用の可能性

本発明は、マイクロチップ型電気泳動、キヤビラリ電気泳動（CE)又はキヤビラリ電気泳動 (CE)と質量分析 (MS)を組み合わせたキヤビラリ電気泳動 Z質量分析計 (C EZMS)等で計測されるイオン性ィ匕合物の検出時間を予測するために用いることができる。

Claims

請求の範囲

[1] マイクロチップ型電気泳動、キヤビラリ電気泳動又はキヤビラリ電気泳動 Z質量分析計内の移動時間が不明の物質の移動時間を予測する際に、

まず、電気泳動の移動時間が既知の物質について、その構造力数値的に表現可能な特徴量を計算して、該特徴量と移動時間の関係を予測し、

幾つ力の物質の移動時間を電気泳動又は電気泳動 Z質量分析計で計測して、前記関係を学習させ、

該学習させた結果を用いて、電気泳動又は電気泳動 Z質量分析計内の移動時間が不明の物質の構造から、その移動時間を予測することを特徴とする電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法。

[2] 前記特徴量が、物質の 2次元構造から予測した 3次元構造から計算した、分子の特徴を示す判別子、分子の 2次元構造から計算した電離指数、及び、化合物のイオン価数を含むことを特徴とする請求項 1に記載の電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法。

[3] 前記 3次元構造が、真空内に単独で存在し他から影響の無い状態を仮定し、化合物単体でエネルギ的に最も安定な構造を取るような形状をとるようにすることを特徴とする請求項 2に記載の電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法。

[4] 前記化合物のイオン価数を、次式を用いて計算することを特徴とする請求項 2に記載の電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法。

[数 3]

Q

α— = ιο ) +i 一^{1 ( 1 )}

Q q =2 )

i-t ⁺ … （3

=l

(ここで、 iと jは酸解離指数 pKaの添え字で、 nは負の値に電荷を生じる物質の pKa の数、 mは正の値に電荷を生じる物質の pKaの数であり、 pHにはマイクロチップ型電気泳動、キヤビラリ電気泳動又はキヤビラリ電気泳動 Z質量分析計で使用する泳動緩衝液の pHの値を用いる。 )

[5] 前記移動時間が、電気泳動又は電気泳動 Z質量分析計内で計測した化合物の移動時間を、内標準物質の移動時間で正規化した相対移動時間である請求項 1に記載の電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法。

[6] 前記関係を、入力層と隠れ層と出力層を有する多層構造のニューラル 'ネットワークを用いて学習することを特徴とする請求項 1に記載の電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法。

[7] 前記入力層に、化合物の判別子の値全てとイオン価数を加え、前記出力層に、化合物の相対移動時間を加えることを特徴とする請求項 6に記載の電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法。

[8] 前記入力層と出力層に加える各値の最大値と最小値の差が大きく離れている場合は、対数正規化を行ない、差が小さい場合は、線形正規化を行なうことを特徴とする請求項 7に記載の電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法。

[9] 同じデータを多数の-ユーラル ·ネットワークで学習させて、出力は平均値をとることを特徴とする請求項 6に記載の電気泳動測定によるイオン性化合物の移動時間予測方法。