ES2225466T3

ES2225466T3 - Dispositivo de sujecion para un molde, la mitad de un molde o un porta-moldes en una maquina de moldeo por inyeccion.

Info

Publication number: ES2225466T3
Application number: ES01901108T
Authority: ES
Inventors: Walter Schmidt; Joel S. Rossier; Frederic Reymond
Original assignee: DiagnoSwiss SA
Current assignee: DiagnoSwiss SA
Priority date: 2000-01-31
Filing date: 2001-01-30
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2021-01-30
Also published as: EP1255690A2; CA2399027A1; AU776266C; US20030102284A1; EP1255690B1; DE60105979T2; DE60105979D1; ATE277865T1; WO2001056771A2; AU2661701A; CA2399027C; PT1255690E; US7087181B2; AU776266B2; WO2001056771A3

Abstract

Un método para fabricar dispositivos microfluídicos mediante el mordentado de un cuerpo de varias capas hecho de una pluralidad de materiales, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una capa de polímero revestida con al menos una capa protectora; (b) estructurar dicha al menos una capa protectora de manera que se cree al menos una oquedad en dicha al menos una capa protectora; (c) estructurar dicha capa de polímero del cuerpo de varias capas resultante mediante mordentado plasmático, fotoablación o una combinación de los mismos, sirviendo dicha al menos una capa protectora como pantalla en este procedimiento de estructuración, en donde la capa de polímero se estructura de tal manera que se forma una microestructura que comprende al menos un microcanal, un depósito, un depósito de fluido o un pocillo en dicha capa de polímero, formándose dicho microcanal, depósito, depósito de fluido o pocillo en el lugar de dicha oquedad de dicha al menos una capa protectora y teniendo esencialmenteparedes de material polímero, en donde la estructuración se lleva a cabo de tal manera que una primera proporción de las paredes de dicho microcanal, depósito, depósito de fluido o pocillo se forma a fin de proporcionar una superficie hidrófoba y una segunda proporción de las paredes de dicho microcanal, depósito, depósito de fluido o pocillo se forma a fin de proporcionar una superficie hidrófila, (d) por lo que dicha microestructura forma un microsistema para realizar análisis químicos y/o biológicos usando propiedades electroquímicas de los fluidos.

Description

Dispositivo de sujección para un molde, la mitad de un molde o un porta-moldes en una máquina de moldeo por inyección.

Método para fabricar microestructuras con diversas propiedades superficiales en un cuerpo de varias capas mediante mordentado plasmático.

Campo de la invención

La presente invención proporciona un método de fabricación para la estructuración y el diseño tridimensionales de al menos dos propiedades superficiales diferentes para microsistemas o microsustratos.

Antecedentes de la invención

Durante los diez últimos años, se ha observado un esfuerzo general hacia la miniaturización de las herramientas analíticas. Dos razones principales están impulsando el desarrollo de aparatos químicos miniaturizados, que se han denominado MicroSistemas de Análisis Totales (\mu-TAS): una disminución en el consumo de analitos y una disminución de la duración del análisis simple. Ambas necesidades son particularmente evidentes en el nuevo desarrollo de la ciencia de la vida, donde el análisis genético y el rastreo de alto rendimiento en el descubrimiento de fármacos adquieren cada vez más importancia. En estas aplicaciones, la razón para limitar el consumo de analitos se evidencia por el número creciente de análisis realizados. En este caso, el uso de reaccionantes para el análisis debe ser tan pequeño como sea posible no sólo para reducir el coste sino también para limitar la producción de residuos. En otros casos, se requiere el análisis de volúmenes extremadamente pequeños. Tal volumen puede ser sólo unos pocos nl, por ejemplo en el caso del análisis de fluidos neurológicos o en diagnóstico prenatal. En muchos casos, la disminución en el tiempo de análisis también es una cuestión importante, por ejemplo, en el diagnóstico médico, donde el factor temporal puede significar una cuestión letal para el paciente. Dos estrategias diferentes y complementarias se han desarrollado en paralelo para alcanzar estos objetivos. Por una parte, la fabricación de dispositivos microfluídicos ha permitido el manejo de fluidos en volúmenes de pl y, por otra parte, la inmovilización de reactivos de afinidad en dispositivos bidimensionales de alta densidad para el análisis de afinidad de alto rendimiento.

En los últimos años, los métodos electroforéticos capilares han disfrutado de una popularidad creciente, principalmente debido a las altas eficacias de separación observadas, la resolución de los picos y los amplios intervalos dinámicos de pesos moleculares que pueden analizarse. Por otra parte, el diseño de capilares tubulares abiertos simples ha conducido él mismo a una variedad de estrategias de automatización, inyección y detección desarrolladas previamente para tecnologías analíticas más convencionales.

El entorno instrumental general implica un capilar relleno con una solución de electrolito y un suministro de energía de alto voltaje conectado a electrodos en contacto con pequeños depósitos rellenos de fluido en cualquier extremo del capilar. El suministro de energía se hace funcionar para aplicar un campo de potencial eléctrico tangencial a la superficie del capilar, en el intervalo de 100-1000 V/cm. Cuando se aplica el potencial, se producen procesos de migración. El campo eléctrico impone una fuerza sobre especies cargadas que conduce a la migración electroforética de moléculas de muestra dentro del capilar. Por otra parte, cuando la superficie del capilar relleno se carga, un flujo de toda la solución es inducido por electroósmosis. Por lo tanto, la electroforesis está en la mayoría de los casos superpuesta a un llamado flujo electroosmótico (EOF). Las especies que se mueven en el capilar como resultado de estas fuerzas se transportarán a continuación a un detector adecuado, siendo la absorbancia y la fluorescencia los más comunes. La electroforesis capilar se ha aplicado a numerosos analitos que abarcan interés farmacéutico, ambiental y agrícola. Un foco común entre estas actividades es el bioanálisis. Se desarrollan métodos de separación para la secuenciación de péptidos, aminoácidos, la determinación del punto isoeléctrico para proteínas, la actividad enzimática, la hibridación de ácidos nucleicos, fármacos y metabolitos en matrices biológicas y técnicas de afinidad tales como inmunoensayos. Por otra parte, aditivos tamponadores tales como ciclodextrinas y fases micelares han añadido la capacidad de realizar separaciones quirales de enantiómeros biológicamente activos de derivados de triptófano, alcaloides del cornezuelo del centeno, epinefrinas y otros, lo que es de gran interés para la industria farmacéutica.

Los capilares descritos anteriormente tienen generalmente diámetros internos entre 50-200 \mum y se forman en sílice fundida. La microfabricación de capilares también se ha efectuado maquinando directamente sobre sustratos planos basados en silicio. Los sustratos de silicio tienen una abundancia de grupos silanol cargados y así generan un EOF considerable. En el caso del micromaquinado, el EOF puede ser una ventaja ya que el flujo de la solución en masa puede usarse para muchas operaciones de manejo de líquidos. Ha habido recientemente una intensidad actividad en el área de la miniaturización de la instrumentación química. Se han hecho esfuerzos para reducir sistemas de laboratorio enteros sobre sustratos de microchips y estos sistemas se han denominado micro-Sistemas Analíticos Totales (\mu-TAS). Como ya se ha mencionado, la mayoría de tales dispositivos de \mu-TAS hasta la fecha ha sido producida fotolitográficamente sobre sustratos basados en silicio. Este procedimiento implica la generación del diseño deseado sobre una pantalla, a través de la cual una pastilla de dióxido de silicio revestida con fotorresistor se expone a la luz. El fotorresistor solubilizado se retira a continuación y el diseño resultante se mordenta anisótropamente con ácido fluorhídrico. Los capilares mordentados se sellan a continuación generalmente mediante unión térmica con una cobertura de vidrio. La técnica de unión es particularmente laboriosa y tecnológica y la unión térmica requiere temperaturas entre 600-1000ºC. Esta técnica de unión tiene una tolerancia muy baja de defectos o presencia de polvo y requiere condiciones ambientales limpias para la fabricación, lo que significa que la producción es muy costosa. También se han desarrollado técnicas de fabricación alternativas basadas en polímeros orgánicos. La fabricación de dispositivos microfluídicos polímeros se ha mostrado moldeando por inyección o polimerizando polidimetilsiloxano (PDMS) sobre un molde. Estas dos técnicas tienen la ventaja de replicar un gran número de microestructuras con el mismo diseño dado por el molde. También se ha mostrado recientemente que son factibles otras técnicas basadas en la radiación electromagnética para la polimerización bajo rayos X (LIGA) o para la ablación. Esta última técnica de fabricación permite la prototipificación rápida dibujando un diseño sobre un sustrato que puede moverse en las direcciones X e Y. A continuación pueden fabricarse diferentes estructuras solamente moviendo el sustrato frente al haz lasérico.

Como ya se ha mencionado, el bombeo electroosmótico se usa aquí no solo para separar muestras sino también para aportar cantidades discretas de reactivo o para poner en contacto soluciones para la reacción en sistemas de flujo continuo. Se ha presentado una gran diversidad de estructuras y conexiones eléctricas que permiten suministrar y analizar muestras en menos de un milisegundo mediante electroforesis, por ejemplo.

Esta propiedad espectacular también evidencia que, en estos microcanales, el principal mecanismo de transporte entre dos soluciones que fluyen es la difusión. Como las diferentes especies exhiben diferentes coeficientes de difusión, la mezcladura eficaz se hace problemática y a menudo se presenta como una limitación importante para el uso más amplio de la microfluídica en sistemas de análisis totales. Para solucionar este problema, se han presentado mezcladores en los que los flujos se dividen por ejemplo en canales más pequeños (20 \mum) antes de ponerse en contacto. De esta manera, el tiempo de difusión se reduce y de ahí que se mejore la eficacia de mezcladura.

Muchos avances recientes en el análisis químico han implicado la incorporación de biomoléculas capaces de la unión selectiva y con alta afinidad a analitos de interés. Tales dispositivos se denominan a menudo biosensores, que implican la transducción en tiempo real del suceso de unión en una señal electrónica, pero también incluyen tecnología analítica que consiste en inmunoensayos, una reacción enzimática, así como hibridación de ácidos nucleicos. Los dispositivos bioanalíticos que utilizan esta tecnología se han aplicado a una amplia gama de aplicaciones en medicina, agricultura, higiene industrial y protección medioambiental. Los electrodos enzimáticos representan el grupo más antiguo de biosensores y se están usando recientemente para pruebas clínicas de metabolitos tales como glucosa, lactato, urea, creatinina o bilirrubina. Varios grupos han desarrollado electrodos de tipo aguja, para medidas de glucosa subcutáneas. Se ha desarrollado un transistor enzimático microelectroquímico para medir bajas concentraciones de glucosa. Los esfuerzos continúan hacia otros metabolitos clínicamente relevantes, particularmente para la determinación de analitos múltiples. La estrategia de incorporar etapas de afinidad también es un área activa de los biosensores. El área emergente de biosensores de hibridación de DNA ha sido un asunto muy popular para diagnóstico clínico de enfermedades hereditarias y para la detección rápida de microorganismos infecciosos.

El interés reciente en el desarrollo de métodos de ensayo de unión de múltiples analitos, basados en series, miniaturizados, sugiere que el campo del ensayo de los ligandos está en la antesala de una revolución tecnológica. Los estudios en este área se han centrado principalmente en series de manchas de anticuerpos o DNA localizadas sobre microchips que son potencialmente capaces de determinar las cantidades de cientos de analitos diferentes en una pequeña muestra (tal como una sola gota de sangre). Los métodos de inmunoensayo basados en series muestran la importancia particular en áreas tales como el control medioambiental donde se requiere que las concentraciones de muchos analitos diferentes en muestras de prueba sean determinadas simultáneamente. Affymetrix desarrolló un modo de sintetizar y ensayar moléculas biológicas en un formato paralelo altamente denso. La integración de dos tecnologías clave forma la piedra angular del método. La primera tecnología, química combinatoria dirigida por luz, permite la síntesis de cientos de miles de compuestos discretos con alta resolución y en posiciones precisas sobre un sustrato. La segunda exploración de fluorescencia confocal lasérica permite la medida de interacciones moleculares sobre la serie.

Recientemente, el Laboratoire d'Electrochimie del EPFL Lausanne ha presentado una técnica de diseño basada en el procedimiento de fotoablación. Para fabricar microseries de proteínas, el sustrato de polímero se bloquea en primer lugar con una capa de albúmina de suero bovino (BSA) que evita la adsorción no específica de proteína sobre la capa de sustrato. Se crean a continuación micromanchas sobre la superficie mediante fotoablación de la capa de BSA, sobre la que todavía puede absorberse avidina. Esta técnica de microdiseño permite a continuación adsorber específicamente anticuerpos ligados a biotina sobre las manchas de avidina que se visualizan mediante el complejo biotina-fluoresceína.

Aparte de las separaciones electroforéticas de hibridación, se ha mostrado en los últimos pocos años un número creciente de aplicaciones sobre \mu-TAS. Los analizadores de DNA completo se han puesto en práctica en un solo dispositivo con una cámara de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) seguido por una separación electroforética. La PCR de flujo continuo también ha mostrado dónde se conduce la solución de analito a través de un capilar que cruza zonas de diferente temperatura. También se ha mostrado otro análisis genético que comprende la secuenciación de DNA a alta velocidad, la separación paralela de alta densidad o la detección de moléculas simples de DNA. Otra aplicación de los \mu-TAS se ha mostrado en la electrocromatografía. Una electrocromatografía de canal abierto en combinación con programación de disolvente se ha demostrado usando un dispositivo de microchip. Otros han usado satisfactoriamente \mu-TAS para efectuar inmunoensayos que implican marcadores competitivos, apreciando varias ventajas sobre formatos más tradicionales incluyendo (a) separaciones de alta eficacia entre marcadores competitivos y complejos anticuerpo-marcador, (b) excelentes límites de detección (0,3-0,4 amol inyectados) a alta velocidad y (c) buen potencial para la automatización. Esto ha sido demostrado en primer lugar en un dispositivo de electroforesis capilar micromaquinado por Koutny y otros. Se determinó cortisol en suero usando un inmunoensayo competitivo que subsiguientemente se cuantificó usando \mu-TAS. Un sistema microfluídico se fabricó sobre un chip de vidrio para estudiar la movilización de células biológicas sobre el chip. Se usaron bombeo electroosmótico y/o electroforético para conducir el transporte celular dentro de una red de canales de capilares. Se realizó un ensayo enzimático automatizado dentro de una red de canales microfabricada. Las concentraciones precisas de sustrato, enzima e inhibidor se mezclaron en volúmenes de nanolitros usando flujo electrocinético. Finalmente, la nueva percepción en el uso de sistemas microfabricados ha sido combinar la ventaja de reacciones paralelas y manejo de líquidos en volúmenes extremadamente pequeños con una interfase de electropulverización o nanopulverización para análisis de espectrometría de masas. Esta última aplicación abre un modo de usar eficazmente el formato de microchips no solo para análisis genético donde ya se ha reconocido sino también en la secuenciación de proteínas.

Se han mostrado varios procedimientos de microfabricación que modifican las propiedades superficiales del polímero.

Se sabe que las reacciones de plasmas gaseosos con polímeros pueden clasificarse como sigue:

1. Reacciones superficiales

: Reacciones entre la especie en fase gaseosa y la especie superficial producen grupos funcionales y/o sitios de reticulación en la superficie.

2. Polimerización plasmática

: La formación de una película delgada sobre la superficie de un polímero a través de la polimerización de un monómero orgánico tal como CH_{4}, C_{2}H_{6}, C_{2}F_{4} y C_{3}F_{6} en un plasma.

3. Limpieza y mordentado

: Los materiales se retiran de una superficie de polímero mediante reacciones químicas y mordentado físico en la superficie para formar un producto volátil.

: Patentes de particular relevancia en el procedimiento de mordentado:

US 5698299 (Dyconex). Esta patente describe el uso de mordentado para elaborar estructuras de polímero de varias capas, pero no analiza aplicaciones de las propiedades superficiales modificadas para el campo de la microfluídica.

Patente con particular relevancia en la selladura por estratificación de una microestructura de polímero:

WO 991197 17 UAclara Biosciences)

Patente de particular relevancia en el diseño de propiedades:

WO 9823957 A(EPFL)

Otras patentes sobre la microfabricación y el control fluídico por las propiedades superficiales:

WO 9823957 A(EPFL)

WO 9846439 (Caliper technology)

WO 9807019 (Gamera Bioscience)

Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método de mordentado para fabricar microestructuras o aberturas en un cuerpo de varias capas hecho de materiales seleccionados, en el que las propiedades superficiales de las capas se controlan individualmente y preferiblemente se controlan simultáneamente, de modo que se forman conductos, ranuras, depósitos, agujeros, etc. y exhiben diversas propiedades superficiales que permiten una funcionalización adicional de superficies seleccionadas así como el manejo de fluidos.

Además, se proporciona un método de mordentado del tipo anterior en el que los conductos y los depósitos se fabrican en etapas de mordentado secuenciales entre las que pueden retirarse o añadirse capas seleccionadas del o al cuerpo de varias capas o entre las que pueden modificarse las propiedades de superficies mordentadas seleccionadas.

Aún más, se proporciona un método de mordentado tal para fabricar microestructuras o aberturas en un cuerpo de varias capas que puede contener una secuencia seleccionada de capas aislantes y ópticamente o eléctricamente conductoras, por lo que se proporcionan la medida y/o la detección de uno o más analitos y/o medios para el manejo de fluidos.

Además, se proporciona un método de mordentado tal en el que se fabrica una pluralidad de capas simultáneamente o en el que se usan procedimientos de mordentado.

Así, la presente invención proporciona un método de fabricación para la estructuración y el diseño tridimensionales de al menos dos propiedades superficiales diferentes para microsistemas.

La invención comprende además productos fabricados usando este método según se define en las reivindicaciones.

La tecnología se basa en el mordentado plasmático anisótropo de láminas de polímero orgánico parcialmente protegidas por una pantalla metálica. La originalidad del procedimiento es diseñar las propiedades superficiales mediante los mismos medios físicos que los usados para la fabricación tridimensional y simultáneamente a esta fabricación. Propiedades superficiales significa, pero no se limita a, hidrofobia, hidrofilia, conductividad, reflectancia, rugosidad y más precisamente el estado químico y/o físico de la superficie. También es posible generar las funcionalidades deseadas, por ejemplo ácido carboxílico, éster, éter, amida o imida, durante el procedimiento de mordentado. El diseño de las diferentes propiedades puede alcanzarse mediante dos técnicas diferentes que pueden usarse separadamente o simultáneamente.

1.: La fabricación de una multicapa de polímero de diferentes propiedades, por ejemplo, un sándwich compuesto de dos capas delgadas de aislante eléctrico (poliestireno) revestido giratoriamente sobre ambas caras y una lámina de polímero conductor (poliestireno cargado con carbono). El mordentado plasmático corta verticalmente las tres capas, haciendo evidente una banda de banda conductora aislada por otras dos.

2.: El sustrato parcialmente protegido por una pantalla sobre ambas caras se pone en medio de dos cámaras (A y B), separadas herméticamente, dentro de las cuales se genera un plasma de forma diferente en la cámara A que en la cámara B. Para esto, la superficie expuesta a la cámara A se trata con un plasma oxidativo (O_{2}) mientras que la otra con un plasma no oxidativo (N_{2}). La superficie de tal agujero sería mitad hidrófila y mitad hidrófoba con respecto al grado de mordentado de ambos plasmas.

En una modalidad preferida, la tecnología puede aplicarse para fabricar sistemas microanalíticos que se dedican a muchas aplicaciones, como por ejemplo análisis, síntesis y/o separación químicos y biológicos. Por otra parte, en otra modalidad, la tecnología puede servir para fabricar dispositivos dedicados a reacciones que se producen en la interfase entre un líquido y una superficie sólida o en la interfase entre dos soluciones.

Por ejemplo, microelectrodos o microagujas pueden fabricarse y usarse para la detección electroquímica o en muestreo de espectrometría de masas. El sistema puede usarse para la extracción de líquido entre dos fases, como los experimentos de reparto. Por otra parte, la tecnología puede aplicarse a cualquier tipo de flujo inducido como difusión, convección (por ejemplo, mediante electroosmosis) o migración (por ejemplo, mediante electroforesis). La tecnología también puede usarse para aplicaciones en las que la superficie creada por plasma se deriva químicamente o bioquímicamente para realizar ensayos químicos o bioquímicos. Como otro ejemplo, la tecnología puede aplicarse a tipos de reacción en los que la temperatura puede ajustarse y/o controlarse, por ejemplo, mediante el uso de medios eléctricos como termistores o termopares integrados, como por ejemplo para reacciones de PCR.

Breve descripción de los dibujos

Las Figs. 1A-1E muestran vistas en sección esquemática a través de una porción de una modalidad del cuerpo de varias capas, que muestran métodos para fabricar microestructuras o aberturas en este cuerpo de varias capas que está revestido sobre ambas caras y que está hecho de una pluralidad de materiales,

las Figs 2A-2E muestran vistas en sección esquemáticas, a través de una porción de una modalidad del cuerpo de varias capas, que muestran métodos para fabricar microestructuras o aberturas en este cuerpo de varias capas que está revestido sobre ambas caras y que está hecho de una pluralidad de materiales, conteniendo ya una de las capas microestructuras o aberturas,

las Figs. 3A-3C muestran vistas en sección esquemáticas a través de una porción de una modalidad del cuerpo de varias capas, que muestran métodos para fabricar microestructuras o aberturas en este cuerpo de varias capas hecho de una pluralidad de materiales usando una pluralidad de procedimientos de mordentado que permiten procesar una capa y retirar otra simultáneamente,

las Figs 4A-4C muestran vistas en sección esquemática a través de una porción de una modalidad del cuerpo de múltiples capas, que muestran métodos para fabricar microestructuras o aberturas en un cuerpo de varias capas hecho de una pluralidad de materiales, usando una pluralidad de procedimientos de mordentado que permiten discriminar la estructuración de dos porciones diferentes de una capa,

la Fig. 5 es un diagrama esquemático que muestra un método para procesar una película de plástico de longitud indeterminada de acuerdo con la presente invención,

las Figs 6A-6E muestran esquemáticamente una secuencia de microfabricación con mordentado plasmático,

las Figs. 7A-7C muestran una vista amplia de microestructuras fabricadas mediante mordentado plasmático con los electrodos y la estratificación,

la Fig. 8 es una vista en planta de la microestructura no sellada, junto con vistas más cercanas del microdisco de electrodo insertado en el microcanal,

la Fig. 9A muestra la detección voltamétrica de ácido ferrocenocarboxílico en el microcanal en el modo de tres electrodos frente a Ag/AgCl (concentración de ácido ferrocenocarboxílico de 0 a 500 \muM en 125 mM de PBS, pH 7,4, + KCl 100 mM),

la Fig. 9B representa la concentración de ácido ferrocenocarboxílico frente a la corriente a 400 mV frente a Ag/AgCl,

la Fig. 10 muestra la detección voltamétrica de glucosa a 15 mM en el microcanal en el modo de tres electrodos frente a Ag/AgCl (concentración de ácido ferrocenocarboxílico 100 \muM en PBS 125 mM, pH 7,4, + KCl 100 mM),

la Fig. 11A muestra la detección voltamétrica de diferentes concentraciones de glucosa en el microcanal en el modo de tres electrodos frente a Ag/AgCl (concentración de ácido ferrocenocarboxílico 100 \muM en PBS 125 mM, pH 7,4, + KCl 100 mM),

la Fig. 11B representa la concentración de glucosa frente a la corriente a 400 mV frente a Ag/AgCl dentro del microcanal,

la Fig. 12A muestra la detección voltamétrica de diferentes concentraciones de glucosa sobre los bloques en el modo de tres electrodos frente a Ag/AgCl (concentración de ácido ferrocenocarboxílico 100 \muM en PBS 125 mM, pH 7,4, + KCl 100 mM),

la Fig. 12B representa la concentración de glucosa frente a la corriente a 400 mV frente a Ag/AgCl sobre los bloques de los electrodos,

la Fig. 13 muestra la configuración usada aquí para el bombeo electrocinético a 1100 voltios y la detección electroquímica simultánea. Esta estructura es una vista en planta de la estructura presentada como una sección transversal en la Figura 7c, y

la Fig. 14 muestra la detección electroquímica de ácido ferrocenocarboxílico bombeado mediante flujo electroosmótico en el dispositivo de la Figura 13 (1 mM de ácido ferrocenocarboxílico en tampón de fosfato 10 mM a pH 7,4).

Descripción de las modalidades preferidas

El término "microestructura", según se usa aquí, significa y se refiere a un solo microcanal, una serie de microcanales o una red de microcanales interconectados no limitados en conformación pero que tienen una sección transversal que permite manipulaciones microfluídicas. De acuerdo con la presente invención, estas "microestructuras" se forman habitualmente en, por ejemplo, una placa, un sustrato plano o similares, y habitualmente se elaboran en al menos dos capas, conteniendo una el diseño de la microestructura deseado y sirviendo una segunda como componente de selladura.

El término "aberturas", según se usa aquí, significa y se refiere a pasajes o espacios huecos. Estas aberturas incluyen, por ejemplo, cámaras de reacción, depósitos, pocillos y similares. Pueden estar solas o pueden situarse en cualquier extremo de un canal. Cuando tales aberturas están solas, pueden usarse por ejemplo para la introducción de reactivos, la mezcladura, la incubación, el lavado, la reacción, la detección y similares, según se requiera, en, por ejemplo, ensayos homogéneos. Cuando están conectadas a un canal, se usan por ejemplo como medios para introducir un fluido en un canal principal o una red de canales. Cuando atraviesan una pluralidad de capas, estas aberturas también pueden usarse para formar una microestructura que tiene porciones seleccionadas de diversas propiedades superficiales.

En la presente invención, "canales" y "microcanales" son conductos o medios de comunicación (por ejemplo, comunicación hidráulica) entre aberturas y similares. Incluyen, por ejemplo, fosos, ranuras, zanjas, capilares, etc., sin limitación en la conformación. Los "microcanales" están sin embargo limitados a 0,1-1000 \mum en al menos una de sus dimensiones.

Las "propiedades superficiales", según se usa aquí este término, significan y se refieren al estado químico y/o físico de la superficie. Incluyen, por ejemplo, hidrofobia, hidrofilia, conductividad, reflectancia, rugosidad, tamizado, afinidad, etc. El término "conductividad" se refiere aquí a la capacidad de una superficie para transferir electrones desde otro material o solución a su masa o, opuestamente, transferir electrones desde su masa a otro material o solución en contacto. Esas propiedades superficiales están intrínsecamente relacionadas con la naturaleza de los materiales usados para formar cada capa, y, de acuerdo con la presente invención, pueden modificarse en algunas partes de un cuerpo de varias capas durante el procedimiento de estructuración. En algunas modalidades, las propiedades superficiales de partes seleccionadas de un cuerpo de varias capas pueden modificarse adicionalmente después del procedimiento de estructuración. Las propiedades superficiales sirven, por ejemplo, para controlar el desplazamiento o no de un medio dentro de las microestructuras o aberturas formadas. De acuerdo con la presente invención, las propiedades superficiales pueden seleccionarse en diversas partes de un cuerpo de varias capas para, por ejemplo, prevenir o favorecer el flujo capilar, el electroflujo (es decir, el flujo electrocinético, el flujo electroosmótico, el flujo electroforético, el flujo dielectroforético, etc), la retención cromatográfica, la unión de moléculas (por ejemplo, adsorción o fisisorción), la conductividad óptica o eléctrica, etc.

Las Figs. 1 a 4 muestran diferentes maneras de fabricar microestructuras en un cuerpo de varias capas con el control simultáneo de las propiedades de las superficies mordentadas. En algunas modalidades, el cuerpo de varias capas es una película de plástico que tiene un material resistente al mordentado revestido sobre una o ambas caras. El término "material resistente al mordentado" se refiere aquí a una sustancia que es resistente al medio de mordentado o, al menos, es mucho más resistente que el material que ha de mordentarse.

En una modalidad preferida, se usa mordentado plasmático, es decir una técnica en la que el medio de mordentado es gaseoso, preferiblemente a otras técnicas tales como mordentado químico en húmedo o fotoablación, debido a la dificultad del primero para proporcionar la precisión necesaria requerida para fabricar microestructuras y debido a la velocidad de procesamiento relativamente baja de la última. Sin embargo, es posible usar combinaciones de estos métodos para modificar adicionalmente superficies seleccionadas de capas mordentadas para modificar su funcionalidad.

La precisión del método de mordentado plasmático depende directamente de la precisión del diseño estructurado en los revestimientos de material resistente al mordentado y del grosor de la capa que ha de mordentarse. Cualesquiera métodos disponibles, como, por ejemplo, los procedimientos fotoquímicos usados en la industria de la electrónica, pueden usarse para estructurar el material resistente al mordentado, como, por ejemplo, un material fotorresistente con precisión micrométrica. El mordentado plasmático tiene la ventaja adicional de permitir un mordentado adicional (mordentado plasmático anisotrópico), que evita el mordentado lateral de material por debajo del material resistente al mordentado, un fenómeno denominado "submordentado". Por otra parte, el material resistente al mordentado puede retirarse después de la fabricación de la microestructura o las aberturas cuando el material del protector frente al mordentado no se desea. Este es por ejemplo el caso de películas plásticas que se han metalizado, por ejemplo, mediante deposición de metal a vacío antes del procedimiento de mordentado, pero que no pueden estar constituidas de metal para sus aplicaciones. Finalmente, la principal ventaja del mordentado plasmático con respecto a la presente invención es que el medio de mordentado puede variarse para diseñar la propiedad superficial deseada de materiales seleccionados.

Las Figs. 1 a 4 muestran diferentes maneras de microestructurar capas de polímero proporcionando diversas propiedades superficiales a la superficie mordentada de cada material que compone el cuerpo de varias capas. Las figuras no son a escala y representan solo una porción de los cuerpos enteros. También presentan diferentes fases de un procedimiento de mordentado que tiene lugar desde ambas caras del cuerpo de varias capas, aunque cada cara del cuerpo de varias capas pueda procesarse secuencialmente.

La Fig. 1A muestra una porción de un cuerpo de varias capas, por ejemplo hecho de una película 3 de plástico sellada en ambas caras con un estratificado 2, 2' hecho de un segundo material que está revestido por un material 1, 1' resistente al mordentado. La película de plástico central es, por ejemplo, poli(tereftalato de etileno) (PET) de 100 \mum de grosor, mientras que la película de estratificado es polietileno (PE) de 25 \mum de grosor sellado a la primera capa mediante cualquier técnica disponible. El material resistente al mordentado puede ser un metal tal como cobre con un grosor de 12 \mum que se ha aplicado mediante un procedimiento electrolítico conocido, estratificando, bombardeando o cualquier otra técnica disponible. Este material resistente al mordentado ya contiene oquedades tales como 4 y 4' que tienen la conformación necesaria para fabricar el diseño deseado, y que están situadas en las posiciones deseadas donde han de formarse las aberturas. Las etapas preliminares de aplicación de fotoprotector sobre ambas caras del cuerpo y desarrollo adicional de este revestimiento fotoprotector para obtener las oquedades 4 y 4' del diseño deseado no se presentan en ninguna de las figuras posteriores, no siendo su fabricación un objeto de la presente invención.

En las Figs. 1B y 1C, las aberturas 5, 5' y 7, 7' se mordentan sucesivamente a través de las capas 2, 2' y, respectivamente, 3, dando como resultado de ese modo pasajes que exhiben diferentes propiedades superficiales 6, 6' y 8. En la Fig. 1D, el material 1 resistente al mordentado se retira mediante cualquier método disponible, ya que puede requerirse para diversas aplicaciones. De forma similar, el material resistente al mordentado puede revestirse con otra capa (no mostrada), por ejemplo para conexiones interfaciales de los revestimientos metálicos. Cualquiera de estas etapas de mordentado puede estar precedida por un tratamiento en una solución, no mostrado, para reducir el tiempo de mordentado. Por otra parte, cualquiera de estas etapas de mordentado puede estar seguida por un tratamiento para modificar las propiedades superficiales de las aberturas estructuradas. En el ejemplo en el que el cuerpo es una película de PET sellada a una película de PE de estratificado revestido con cobre, la superficie de la película de PET se hace altamente hidrófila durante un procedimiento de mordentado oxidativo (como con mordentado plasmático con oxígeno), mientras que la superficie del PE permanece mucho menos hidrófila. En este caso, una gota de solución acuosa depositada sobre el revestimiento 1 de cobre no podrá entrar en la abertura 7 mediante llenado capilar. Una fuerza externa debe aplicarse a esta gota para dejarla alcanzar la superficie 8 hidrófila. Una vez que la superficie 8 está en contacto con la gota, se induce el llenado capilar en esta porción de la microestructura, pero se detiene tan pronto como el frente de la solución alcanza la segunda superficie 6' hidrófoba. Aquí, de nuevo, es necesaria una fuerza externa para dejar que el frente de fluido penetre en la abertura 7'. Este ejemplo ilustra una manera de manejar fluidos en microestructuras formadas de acuerdo con la presente invención. También puede usarse mordentado que proporciona superficies de hidrofobia media para frenar el flujo de fluido en una porción dada de una microestructura, lo que puede ser ventajoso para completar una reacción, una adsorción, etc. en el caso en el que sean necesarios tiempos más prolongados.

En la Fig. 1E, el cuerpo de varias capas estructuradas está revestido mediante una capa nueva suplementaria que usa cualquier método convencional, tal como, por ejemplo, estratificación, para sellar un extremo de la estructura formada, proporcionando de ese modo una estructura con una abertura solo en el extremo opuesto.

La Fig. 2 muestra diferentes fases de un procedimiento de fabricación totalmente similar al aclarado para la Fig. 1. La única diferencia consiste en el hecho de que la capa 3 central contiene una o más microestructuras o aberturas 10 situadas en la posición o posiciones deseadas para prevenir (no mostrado) o para permitir la conexión con la abertura que ha de mordentarse. En este último caso, la conformación de la microestructura completa formada por el procedimiento de mordentado se modifica, así como la extensión de las propiedades 8 superficiales diseñadas durante este procedimiento de mordentado. En otra variación, la microestructura o microestructuras o la abertura o aberturas 10 está o están hechas de un tercer material, tal como, por ejemplo, un polímero, un gel, una pasta, etc., o está o están rellenas con un conjunto de materiales tales como fibras, guías de onda, cuentas, etc.

Las Figs. 3 y 4 muestran dos modos diferentes de fabricar microestructuras en diferentes capas usando una pluralidad de procedimientos de mordentado. En la Fig. 3, la capa 11 es resistente a un primer procedimiento de mordentado y contiene la oquedad 15 para producir el diseño deseado en la capa 12. Un segundo procedimiento de mordentado se usa a continuación para fabricar las microestructuras o aberturas deseadas para retirar simultáneamente la capa en la capa 13, sin afectar a las propiedades 16 superficiales de la capa previamente mordentada y crear diferentes propiedades 17 superficiales en la capa 13. En el presente caso, la capa 11 solo sirve como un material resistente al mordentado para la primera etapa de fabricación, debido a que no se desea para el uso del cuerpo estructurado. Si esta capa es perjudicial para el segundo procedimiento de mordentado, puede retirarse antes que la capa 13 de estructuración. En otra modalidad la capa 11 puede seleccionarse de tal manera que es resistente al primer procedimiento de mordentado, pero no al segundo, de modo que ambas capas 11 y el diseño deseado en la capa 13 se mordentan simultáneamente. En la Fig. 3, las microestructuras o aberturas mordentadas no se extienden a través de la capa 14 que es resistente a ambos procedimientos de mordentado. Sin embargo, esta no es una necesidad del procedimiento, y el cuerpo de varias capas puede seleccionarse de tal manera que ambas caras puedan mordentarse simultáneamente siguiendo el procedimiento anterior. Por otra parte, las operaciones anteriores también pueden repetirse varias veces para fabricar microestructuras y aberturas en un cuerpo que contiene un mayor número de capas.

La Fig. 4 muestra un método similar al presentado en la Fig. 3 para la estructuración de un cuerpo de varias capas y el diseño de propiedades superficiales de diversas naturalezas en capas diferentes. El material 15 resistente al mordentado contiene una pluralidad de oquedades 20 y 21 y la segunda capa está hecha de una pluralidad de materiales (dos materiales 16 y 17 en el caso mostrado). Ninguno de los procedimientos de mordentado puede atacar el material 15 resistente al mordentado y esta capa no se retira entre dos etapas de fabricación. Los materiales 16 y 17 se seleccionan de tal manera que sólo el material 16 sea resistente al primer procedimiento de mordentado, de modo que se cree una oquedad solamente en la capa 17. En una segunda etapa, se usa un segundo procedimiento de mordentado para producir las microestructuras deseadas de las aberturas en la capa 16 solamente, en la capa 18 solamente (casos no mostrados) o en ambas capas 16 y 18 simultáneamente. Esto conduce a una estructura tridimensional en la que los agujeros 20 y 21 tienen diferentes propiedades superficiales dependiendo de la naturaleza de las capas y de la etapa durante la que se mordentan. En el presente ejemplo, las superficies 22, 23 y 24 pueden tener diferentes propiedades o, si las capas 16 y 18 están elaboradas de materiales similares, las superficies 23 y 24 tienen las mismas propiedades mientras que 22 es diferente.

También debe ponerse de relieve que las superficies de las microestructuras mordentadas descritas en cualquiera de las Figs. 1 a 4 puede tratarse adicionalmente para unirse a, inmovilizar o revestir una molécula en materiales seleccionados y/o capas seleccionadas. Esto puede aplicarse, por ejemplo, para inmovilizar moléculas biológicas sobre una porción de una capa para realizar una separación o un ensayo. La cromatografía de afinidad, los ensayos de inmunoabsorción con enzimas ligadas, los ensayos de unión a receptores son algunos ejemplos de las aplicaciones de las microestructuras fabricadas de acuerdo con la invención. De forma similar, un material orgánico, como por ejemplo lisina, poliacrilamida o dodecilsulfato sódico, puede enlazarse a capas mordentadas seleccionadas para realizar electroforesis.

La Fig. 5 muestra un procedimiento continuo para producir microestructuras y aberturas en películas de plástico. Un rodillo 31 de suministro soporta el cuerpo 32 de varias capas que puede estar revestido con un material resistente al mordentado sobre una o ambas caras que contienen oquedades preformadas o no. Rodillos 33 pequeños dirigen el cuerpo de varias capas a través de diversas fases de procesamiento y las etapas 40 a 43, y el extremo final del cuerpo de varias capas se arrolla sobre un rodillo 39 de recogida para recoger el producto final. Esta instalación puede usarse, por ejemplo, para procesar la estructura mostrada en la Fig. 4. Una primera fase 40 comprende todas las etapas requeridas para revestir el cuerpo 32 de varias capas con un material 15 resistente al mordentado que contiene las oquedades 20 y 21. En una fase 41 de mordentado de metales y transporte de fotoprotector, el mordentado de los revestimientos 15 metálicos tiene lugar en la posición de la oquedad 20 donde las microestructuras y/o aberturas han de formarse. En la siguiente fase 42 de procesamiento, se usa otro segundo procedimiento para mordentar las capas 16 y 18 simultáneamente, creando de ese modo las propiedades 22, 23 y 24 superficiales deseadas en cada material. Durante la última fase 43 de procesamiento, el material 15 resistente al mordentado se retira y el cuerpo de varias capas estructurado se sella finalmente estratificando una película 38 de plástico suplementaria, dando el producto 39 final.

También pueden añadirse fases de procesamiento adicionales a la instalación de separación, y las diversas fases de procesamiento pueden dedicarse a otras funciones como lavado, curado, revestimiento, modificación superficial, inmovilización, etc. De forma similar, pueden añadirse capas al cuerpo entre dos o varias fases de procesamiento. Esto se ilustra en la Fig. 5 mediante el rodillo 34 suplementario que permite estratificar una película 35 de plástico que se usa, por ejemplo, como una selladura de las microestructuras y las aberturas mordentadas formadas en fases de procesamiento previas y/o como un material resistente al mordentado suplementario para las siguientes fases de procesamiento.

En lo siguiente, se describe un ejemplo de un experimento llevado a cabo usando el método de acuerdo con la invención y sus resultados para ejemplificar el concepto de la invención.

Para el experimento, hojas de poliimida revestidas sobre ambas caras con cobre de 5 \mum de grosor se usan como material de sustrato.

En una primera etapa, se fabrican microestructuras mordentadas con plasma. El plasma es un estado altamente excitado de la materia, típicamente el de un gas diluido, en el que un cierto porcentaje de los átomos y las moléculas de gas está ionizado y a continuación se divide para formar radicales gaseosos altamente reactivos. Estas partículas químicamente agresivas reaccionan preferentemente con materiales orgánicos y generan subproductos de reacción que subsiguientemente se desorben de la superficie. Si la superficie de un dieléctrico orgánico está parcialmente cubierta con una pantalla metálica, solo pueden atacarse las áreas abiertas.

Hojas de poliimida de 40 x 40 cm^{2} de 50 \mum de grosor y revestidas sobre ambas caras con 5 \mum de cobre se fijan en un armazón. El cobre se mordenta químicamente después del diseño del fotoprotector con la ayuda de una impresora de ordenador, por ejemplo una impresora de alta resolución de 25.000 dpi.

En las Figuras 6A-6E, la secuencia de fabricación para una hoja de doble cara con microestructuras perforadas con plasma se muestra esquemáticamente. La Figura 6A muestra una hoja 50 revestida sobre ambas caras por una capa 51 de cobre. En la Fig. 6B, estas capas de cobre se cubren a continuación mediante un fotoprotector 52 que se expone adicionalmente a luz de tal manera que se crean dos agujeros 53 y 53' y una oquedad 54, según se muestra en la Fig. 6C. Este cuerpo de varias capas se mordenta a continuación químicamente para estructurar las capas de cobre y crear agujeros 55 y 55' y la oquedad 56 de los mismos diseños que los realizados dentro de las capas fotoprotectoras (Fig. 6D). La hoja de polímero se estructura a continuación mediante exposición a plasma para crear una entrada 57 y un depósito de salida 57' sobre una cara y una ranura 58 sobre la otra cara (Fig. 6E).

Debido al hecho de que el plasma ha accedido al sustrato desde ambas caras, los agujeros 57 y 57' y la ranura 58 se forman simultáneamente cuando el cobre 51 se ha diseñado sobre ambas caras de la hoja 50. Después de este procedimiento, el estado superficial del polímero puede ser muy hidrófobo o hidrófilo dependiendo de la composición del plasma que es O_{2}, CF_{4} o N_{2}. En los ejemplos posteriores, se ha usado plasma de oxígeno para obtener una superficie oxidada que puede generar flujo capilar dentro de los microcanales. Sin embargo, la superficie exterior del capilar, protegida por la capa de cobre, permanecerá hidrófoba.

El procedimiento anterior puede repetirse para crear porciones estructuradas de diferente nivel (diversas profundidades), produciendo de ese modo oquedades, cavidades, formas salientes y similares. Esto puede usarse por ejemplo para crear contacto entre las diversas capas que constituyen el cuerpo de varias capas.

En otro ejemplo, este procedimiento se usa para integrar electrodos dentro del dispositivo. Para alcanzar esto, porciones bien definidas del dispositivo estructurado (como, por ejemplo, porciones de la ranura 58 mostrada en la Fig. 6E) se exponen de nuevo al plasma a través de una nueva pantalla de cobre que contiene los diseños deseados. De esta manera, la hoja 50 de polímero puede mordentarse adicionalmente hasta que se alcanza la capa 51 de cobre. Después de estas etapas, un metal, tal como por ejemplo oro, se electrodeposita sobre la capa de cobre para obtener una superficie que es adecuada para propósitos electroquímicos.

Un ejemplo de tal dispositivo mordentado con plasma se muestra en la Figura 7A. En el presente caso, el dispositivo se produce en una hoja de poliimida de 50 \mum de grosor, y contiene: un microcanal 58 con una entrada 57 y una salida 57', así como dos microelectrodos 60 que son bloques de cobre revestido con oro. La estructura final se sella a continuación mediante la estratificación de una capa 60 de poli(tereftalato de etileno)-polietileno (PET-PE) de 35 \mum de grosor (Morane LTD, Reino Unido) con el mismo procedimiento que el ya presentado en otras partes.

Es muy importante observar las propiedades superficiales del canal después del procedimiento de fabricación, que se describe esquemáticamente en la Figura 7B. En efecto, dentro del microcanal, la superficie 61 está cargada y de ahí es hidrófila, lo que es necesario para permitir el flujo capilar y/o electrostático. La pared del microcanal sellado hecho de la capa 61 estratificada es sin embargo menos hidrófila debido a la naturaleza del PE. Fuera del capilar, la superficie 63 debe ser hidrófoba, a fin de evitar la dispersión de la gota de solución alrededor de las aberturas que sirven como entrada y salida. En los ejemplos posteriores, se elige la poliimida, que es un material hidrófobo, para ese propósito, puesto que se hace hidrófila durante la exposición al plasma de oxígeno. Otra propiedad superficial es la conductividad de la superficie 64 donde la capa metálica está en contacto con la solución. Estas estructuras demuestran por lo tanto el concepto de la invención: diseñar diferentes propiedades superficiales que son necesarias para el control de los flujos de fluidos, realizar reacciones químicas, detectar analitos, etc.

La Figura 7C muestra otro ejemplo de distribución de las propiedades superficiales anteriores, donde se ponen electrodos directamente por encima de la entrada y la salida de un microcanal sellado.

A continuación, se realiza la detección electroquímica mediante voltametría cíclica con un potenciostato portátil AEW2 (Sycopel Scientific, Reino Unido) conectando uno de los electrodos como electrodo de trabajo (WE) y otro como contraelectrodo (CE). Se usa un alambre de Ag/AgCl recientemente oxidado como electrodo de referencia y se pone en la parte superior de una entrada del canal en contacto con la solución que ha de analizarse. La caracterización por voltametría cíclica de ácido ferrocenocarboxílico se presenta en primer lugar para entender el comportamiento de los microelectrodos revestidos con oro de forma similar a lo que se presentaba anteriormente en un documento previo.

Ahora, las microestructuras fabricadas de acuerdo con la presente invención se usan a continuación para demostrar algunos ejemplos de aplicaciones analíticas, a saber ensayos inmunológicos y reacciones enzimáticas.

Para el ejemplo de un inmunoensayo, la immovilización de los anticuerpos de ratón se realizó mediante fisisorción a pH 7 durante una hora a temperatura ambiente. Dependiendo de los experimentos, se usa entre 1 y 100 \mug/ml de concentración de anticuerpo. La superficie se bloquea a continuación con albúmina de suero bovino (BSA) al 5%. La inmunorreacción se realiza llenando canales secados con anticuerpo de ratón inmovilizado con un conjugado anti-ratón de cabra-HRP e incubándolo 5 minutos a diluciones entre 1/225.000 y 1/25.000 de concentración. Después de la incubación con el conjugado, la solución de sustrato que contiene hidroquinona 100 mM y peróxido 100 mM se añade al canal para permitir la detección electroquímica de peroxidasa de rábano picante (HRP) con un procedimiento similar al propuesto por Wang y otros. Entre cada etapa, se realiza un procedimiento de lavado con una solución de tampón de lavado a pH 7,4 y que contiene tampón de fosfato 0,1 M y BSA al 0,1%.

En un segundo ejemplo, el uso del microchip se demuestra para un ensayo enzimático. Se han usado microestructuras mordentadas con plasma aquí para la detección de glucosa. Una solución de glucosa oxidasa (enzima) y ácido ferrocenocarboxílico (mediador) se mezcla con una solución de glucosa y se rellena en el microcanal en el que se realiza una detección voltamétrica cíclica.

En otro esquema, la solución de glucosa oxidasa y ferroceno se rellena en el microcanal y la solución de glucosa se pone en uno de los depósitos.

En un ejemplo adicional, 2 \mul de glucosa oxidasa y ácido ferrocenocarboxílico se depositan y se dejan secar sobre los bloques de electrodo fuera del canal. A continuación, se deposita una solución de glucosa sobre la solución secada y se realiza una voltametría cíclica.

En lo siguiente, los resultados obtenidos se describen brevemente.

En primer lugar, se trata el aspecto de las estructuras usadas. El examen microscópico de las hojas 70 de plástico mordentadas con plasma antes de sellar mediante estratificación de una capa de PET-PE muestra los diferentes diseños que componen la microestructura. Cuatro vistas en alzado del dispositivo se presentan en la Figura 8, que contiene un color amarillo-marrón debido a la absorción de la capa 70 de poliimida. En una vista superior a la izquierda, se muestra la presencia del microcanal 71 como un diseño en el medio de la imagen, que significa que el grosor de la poliimida en este lugar es menor. En ambos extremos del canal, hay un agujero 72 que sirve como depósito o como entrada y salida, permitiendo de ese modo que el líquido acceda dentro del canal después del procedimiento de estratificación. Las otras líneas diseñadas sobre la superficie 73 son los bloques revestidos con oro para conectar los electrodos con el potenciostato. En las vistas más cercanas del dispositivo presentado en la Figura 8, puede observarse que la geometría del electrodo es un disco que está ligeramente rebajado desde el nivel del canal.

Merece la pena apreciar que la vista superior a la izquierda de la Figura 8 también muestra una serie de cuatro agujeros 74 que se usan para el alineamiento preciso del dispositivo durante su procedimiento de fabricación.

Caracterización electroquímica: Los análisis voltamétricos cíclicos de ácido ferrocenocarboxílico presentados en la Figura 9 exhiben una conformación esperada para microelectrodos de tres dimensiones en un microcanal.

Puede obtenerse una calibración de ácido ferrocenocarboxílico entre 0 y 0,5 mM con una pendiente de 34 pA/\muM, que es aproximadamente 6 veces mayor que la que se obtenía en una geometría similar con un electrodo de banda de carbono 5 veces menor. El comportamiento de estos electrodos está muy de acuerdo con tal trabajo previo y puede usarse para ensayos de diagnóstico.

Detección de glucosa con microchips mordentados con plasma: en un primer experimento, la reacción se realiza mezclando la enzima y la solución de mediador con una solución de glucosa 15 mM en el tubo de ensayo fuera del microchip. Esta solución se inyecta a continuación en el microcanal y se realiza un experimento de voltametría cíclica. La detección de la glucosa en tal microchip puede observarse en la Figura 10. Sin la presencia de glucosa en la solución, el voltamograma muestra la oxidación de ácido ferrocenocarboxílico como en la Figura 9. La presencia de glucosa se revela por la conformación catalítica del voltamograma, que significa que el mediador se reduce y se oxida mediante la enzima y el electrodo, respectivamente. Esto muestra que la detección de glucosa es posible dentro de este microcanal. Merece la pena añadir que el volumen del microcanal es aproximadamente 50 nl en este ejemplo.

En un segundo experimento, la solución de glucosa oxidasa y ácido ferrocenocarboxílico se rellena en el microcanal. Se depositan a continuación soluciones de diferentes concentraciones de glucosa sobre el depósito a la salida del microcanal. La glucosa se detecta finalmente mediante voltametría cíclica según se presenta en la Figura 11A. La corriente detectada a 400 mV también se representa en la Figura 11B frente a la concentración de glucosa. Una buena correlación de la concentración de glucosa y la corriente detectada se evidencia entre 0 y 20 mM. Para concentraciones de glucosa mayores, la detección alcanza una saturación.

En un tercer experimento, 2 \mul de glucosa oxidasa y ácido ferrocenocarboxílico se secan sobre los bloques de electrodo fuera del microcanal. En este experimento, 2 \mul de solución de glucosa se añaden sobre los bloques de electrodo y los voltamogramas registrados se presentan en la Figura 12A. La correlación de la corriente frente a la concentración (Figura 12B) es lineal de 0 a 20 mM. Es interesante comparar las intensidades de corriente entre la detección dentro del microcanal (Figuras 10 y 11) y sobre los bloques de electrodo fuera del microcanal. La corriente es mayor en este último experimento debido a la diferencia en la dimensión del electrodo. El volumen de detección en este último caso es 2 \mul frente a 50 nl dentro del microcanal.

Otro ejemplo de aplicación se muestra ahora para demostrar que la presente invención puede usarse para fabricar microestructuras en las que las paredes son suficientemente hidrófilas para generar un flujo capilar y para controlar el movimiento de los fluidos por medios eléctricos. A este fin, el dispositivo presentado esquemáticamente en la Figura 13 se ha producido en una hoja 75 de poliimida de 50 \mum de grosor después de un procedimiento de mordentado similar al descrito en la Figura 6. El dispositivo de la Figura 13 contiene un microcanal 76 de 10 cm de largo con una entrada 77 y una salida 78 en cada extremo. Estas entrada y salida también sirven como depósitos, y están rodeadas por dos bloques 79 y 80 de cobre revestidos con oro que se usan como electrodos. En el depósito de salida, un electrodo 81 de platino y un electrodo 82 de referencia de plata/cloruro de plata (Ag/AgCl) se ponen en contacto con la solución. Se aplica a continuación un campo eléctrico alto (1100 voltios) entre los electrodos 79 y 81, a fin de bombear electrocinéticamente la solución a través del microcanal 76 hacia la salida 78. La flecha en la Figura 13 muestra la dirección del flujo generado por la aplicación de este alto voltaje. Un potencial bajo (por ejemplo 400 mV frente a Ag/AgCl) también puede aplicarse entre los electrodos 80 y 82 para detectar las moléculas que alcanzan el depósito de salida.

Experimentos preliminares mostraban que es posible aspirar una solución a través de tales microcanales para rellenarlos y vaciarlos fácilmente. Experimentos adicionales se han efectuado para la caracterización del flujo electroosmótico generado en microcanales sellados de la conformación mostrada en la Figura 13.

A este fin, una solución de ácido ferrocenocarboxílico (1 mM de ácido ferrocenocarboxílico en tampón de fosfato 10 mM a pH 7,4) se pone a la entrada del microcanal y se bombea en la dirección de la instalación de detección de bajo voltaje situada a la salida. Tan pronto como las especies electroactivas bombeadas alcanzan la salida del microcanal, se detecta una corriente mediante el sistema electroquímico definido por los electrodos 80 y 82. Según se muestra en la Figura 14, cuando la solución solo contiene el tampón de fosfato, la corriente permanece cercana a cero. Solo se detecta una corriente al principio del experimento, lo que es un artefacto debido al cambio del potencial. Cuando la solución de ácido ferrocenocarboxílico se añade a la entrada del microcanal, la corriente permanece igual que la registrada para el tampón de fosfato durante 150 segundos. Después de estos 150 segundos, la corriente se incrementa rápidamente hasta que alcanza una meseta después de aproximadamente 200 segundos. Esto muestra claramente que el ácido ferrocenocarboxílico se ha bombeado electrocinéticamente a través del microcanal y que necesitaba aproximadamente 150 segundos para alcanzar el depósito de salida.

Este experimento demuestra que es posible usar flujo electroosmótico en microsistemas producidos por la presente invención y de ahí usarlos para realizar separaciones electroforéticas como una técnica cromatográfica.

Los tres experimentos mostrados aquí evidencian el gran interés de usar la estructura o los tipos de estructuras presentes fabricados mediante mordentado con plasma para aplicaciones en análisis químico o biológico.

Ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) con detección electroquímica: Para desarrollar un ensayo de inmunodiagnóstico, pueden inmovilizarse anticuerpos sobre la superficie de las paredes del canal. El procedimiento se realiza sobre la base de fisisorción o mediante ligazón covalente. A continuación, puede realizarse un inmunoensayo estándar en modo sándwich o competitivo. La detección puede alcanzarse, por ejemplo, habiendo marcado el anticuerpo secundario o el antígeno con una enzima tal como, pero no limitada a, HRP, ALP, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, etc. Las estructuras y las series o redes de estructuras similares a las mostradas en las Figuras 6 a 8 pueden usarse a continuación para tales inmunoensayos, ya que pueden diseñarse propiedades superficiales apropiadas usando la presente invención.

Fabricación por nanopulverización: La estructura fabricada y presentada en la Figura 7 puede usarse para análisis de espectrometría de masas. En efecto, si la estructura se corta con una cuchilla, un láser o mediante plasma, la sección transversal del canal puede ponerse frente a una entrada de espectrómetro de masas y el alto voltaje requerido para pulverizar la solución fuera del capilar puede aplicarse gracias al electrodo fabricado dentro del capilar. El interior del canal (que es hidrófilo) sirve para dejar que el canal se rellene y la salida del canal (que es hidrófoba) sirve para favorecer la fabricación del cono de Taylor. En efecto, el exterior debe ser hidrófobo para evitar que la solución acuosa se extienda fuera del canal, favoreciendo de ese modo la generación del aerosol 10.

Además, el dispositivo microfluídico puede formarse comprendiendo dicha capa de polímero y al menos una capa añadida, estando dicha capa estructurada, y teniendo dicha capa añadida propiedades superficiales químicas y/o físicas diferentes de las propiedades superficiales de dicha capa de polímero, de modo que dichas microestructuras tienen secciones con diferentes propiedades superficiales, por lo que se permite el transporte, el análisis o el tratamiento de fluidos en dichas microestructuras. El dispositivo microfluídico puede formarse con al menos un microcanal que tiene al menos una dimensión en el intervalo de 0,1 a 1000 \mum, o de un modo tal que cada capa tenga un grosor máximo de 1 cm pero no esté limitada en altura, anchura y conformación, o con una abertura que sirve como una cámara de reacción, un depósito, un pocillo o un agujero de acceso, o con al menos una de las microestructuras que comprende una sección superficial que es hidrófoba y una sección superficial que es hidrófila, o en una manera tal que pueda conectarse a medios ópticos y/o eléctricos para detectar un compuesto de interés usando estos medios conectados. Puede entenderse bien que esas características pueden combinarse de cualquier modo adecuado.

Se ha mostrado que el dispositivo microfluídico puede usarse realizando análisis químicos y/o biológicos. Puede usarse para prácticas de fluido eléctricas y/o mecánicas y para aportar un líquido. Puede usarse con al menos una porción de dichas microestructuras rellenas con un medio, en donde dicho medio puede ser un fluido, un sólido o un gel. En el caso de tener un medio tal que es parte del dispositivo microfluídico, el medio puede contener partículas cargadas tales como iones, moléculas, células o virus o el medio puede contener cuentas. Como se ha mostrado, pueden utilizarse mordentado plasmático, fotoablación o técnicas de mordentado adecuadas para proporcionar capas de sustrato de polímero con estructuras en el intervalo de 0,1 a 1000 \mum para fabricar dispositivos microfluídicos para realizar análisis químicos y/o biológicos.

Estos ejemplos demuestran el uso de la presente invención aunque no se limita a estas aplicaciones.

Claims

1. Un método para fabricar dispositivos microfluídicos mediante el mordentado de un cuerpo de varias capas hecho de una pluralidad de materiales, que comprende las etapas de:

(a): proporcionar una capa de polímero revestida con al menos una capa protectora;

(b): estructurar dicha al menos una capa protectora de manera que se cree al menos una oquedad en dicha al menos una capa protectora;

(c): estructurar dicha capa de polímero del cuerpo de varias capas resultante mediante mordentado plasmático, fotoablación o una combinación de los mismos, sirviendo dicha al menos una capa protectora como pantalla en este procedimiento de estructuración, en donde la capa de polímero se estructura de tal manera que se forma una microestructura que comprende al menos un microcanal, un depósito, un depósito de fluido o un pocillo en dicha capa de polímero, formándose dicho microcanal, depósito, depósito de fluido o pocillo en el lugar de dicha oquedad de dicha al menos una capa protectora y teniendo esencialmente paredes de material polímero,

: en donde la estructuración se lleva a cabo de tal manera que una primera proporción de las paredes de dicho microcanal, depósito, depósito de fluido o pocillo se forma a fin de proporcionar una superficie hidrófoba y una segunda proporción de las paredes de dicho microcanal, depósito, depósito de fluido o pocillo se forma a fin de proporcionar una superficie hidrófila,

(d): por lo que dicha microestructura forma un microsistema para realizar análisis químicos y/o biológicos usando propiedades electroquímicas de los fluidos.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se forma al menos un microcanal esencialmente paralelo a una superficie de la capa y/o se forma al menos un microcanal esencialmente perpendicular a una superficie de la capa.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque al menos una de dichas al menos una capa protectora está hecha de un material eléctricamente conductor.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque dicha capa protectora eléctricamente conductora está provista además de cables para la conexión a una fuente de energía eléctrica y dicha microestructura se diseña de tal manera que dicho material eléctricamente conductor pueda usarse como un electrodo.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una de dichas capas protectoras primera y segunda se retira además parcialmente o totalmente después de estructurar dicha capa de polímero.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se forma simultáneamente una pluralidad de microestructuras.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho cuerpo de varias capas se fabrica con una pluralidad de capas de polímero.

8. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque dicho microcanal está formado con un grosor correspondiente al grosor total de al menos una de dichas capas de polímero.

9. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque dicha microestructura en dicho cuerpo de varias capas se mordenta usando una pluralidad de etapas de mordentado y/o bajo una pluralidad de atmósferas incluyendo, pero no limitadas a, aire, oxígeno, nitrógeno, hidrógeno, argón o flúor.

10. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque dicho cuerpo de varias capas está provisto de medios para ensamblar dichas capas en posiciones relativas precisas para el alineamiento deseado de dicha microestructura.

11. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque se añade al menos una capa suplementaria a dicho cuerpo de varias capas después del mordentado de dicha capa de polímero, por ejemplo mediante estratificación, adición de adhesivo, aplicación de presión y/o unión después del tratamiento mediante exposición a un plasma.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque dicha capa suplementaria antes de añadirse a dicho cuerpo de varias capas ya contiene una o varias de dichas microestructuras.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, caracterizado porque dicha capa suplementaria se diseña de tal manera que puede usarse para cubrir dicha microestructura a fin de formar uno o una pluralidad de microcanales sellados con al menos un agujero de acceso conectado a dichos microcanales.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque una pluralidad de dichos microcanales sellados se conecta entre sí para formar microcanales interconectados.

15. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque dichas capas están provistas de una capa con propiedades superficiales hidrófilas y una capa con propiedades superficiales hidrófobas.

16. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque al menos dos capas diferentes se mordentan simultáneamente.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha estructuración de dicha capa protectora primera y/o segunda se realiza parcialmente con la ayuda de una impresora de ordenador.

18. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque las propiedades superficiales de al menos una capa de dicho cuerpo de varias capas se modifican adicionalmente mediante al menos un tratamiento físico o químico.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque dicha modificación adicional de dichas propiedades superficiales resulta de la deposición de un metal o resulta de una reacción de polimerización.

20. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque se usan etapas de mordentado secuenciales para fabricar formas tridimensionales en dicho cuerpo de varias capas, en donde las formas tridimensionales comprenden preferiblemente una microestructura que acaba en una conformación de punta.

21. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque una etapa de mordentado está seguida por la derivación y/o la inmovilización de material sobre la microestructura o las microestructuras mordentadas sumergiendo el cuerpo de varias capas en una solución que contiene el reactivo deseado para tal derivación y/o inmovilización.

22. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, para fabricar microestructuras huecas y/o sólidas interconectadas y/o interconectables en un cuerpo de varias capas elaborado mediante un procedimiento de mordentado; en el que dichas capas de polímero se eligen individualmente para algunas o para todas las capas o en el que el procedimiento de mordentado se elige de modo que se produzcan o se mantengan propiedades en masa o superficiales deseadas durante el procedimiento de mordentado y/o en el que algunas propiedades superficiales se consiguen mediante una etapa siguiente de activación de la superficie de algunas o todas las microestructuras; de modo que el cuerpo de varias capas incorpora microestructuras interconectadas y/o interconectables de propiedades superficiales físicas o químicas o actividades parcialmente diferentes, respectivamente.

23. Un dispositivo microfluídico, que ha de fabricarse mediante un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende un cuerpo de varias capas que incluye una capa de polímero, estando estructurada dicha capa de polímero de tal manera que comprende un microsistema para realizar análisis químico y/o biológico usando propiedades electroquímicas de fluidos, comprendiendo dicho microsistema al menos un microcanal, un depósito, un depósito de fluido o un pocillo en dicha capa de polímero, teniendo dicho microcanal, depósito, depósito de fluido o pocillo paredes esencialmente de material polímero, en donde una primera proporción de las paredes de dicho microcanal, depósito, depósito de fluido o pocillo comprende una superficie hidrófoba y una segunda proporción de las paredes de dicho microcanal, depósito, depósito de fluido o pocillo comprende una superficie hidrófila.

24. Un dispositivo microfluídico de acuerdo la reivindicación 23, que comprende además al menos una capa suplementaria, que cubre dicha microestructura a fin de formar uno o una pluralidad de microcanales sellados con al menos un agujero de acceso conectado a dichos microcanales.

25. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con las reivindicaciones 23 ó 24, que comprende al menos dos capas de polímero, caracterizado porque al menos una de dichas dos capas de polímero comprende una superficie adyacente a la otra de dichas dos capas de sustrato con microestructuras formadas sobre la misma de modo que se forma al menos uno de dichos microcanales entre dichas dos capas de sustrato, comprendiendo dicho microcanal una superficie con secciones que tienen diferentes propiedades superficiales químicas o físicas, con lo que se permite el transporte, el análisis o el tratamiento de fluidos en dicho microcanal.

26. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, que comprende una red de microestructuras huecas y/o sólidas interconectadas y/o interconectables de propiedades superficiales físicas o químicas parcialmente diferentes.

27. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, caracterizado porque se forma una estructura eléctrica de tal manera que un fluido es desplazable por medio de un campo eléctrico que puede generarse por medio de dicha estructura eléctrica.

28. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizado porque una estructura eléctrica está formada de tal manera que partículas cargadas, tales como iones, moléculas, células o virus, pueden separarse o mezclarse desplazándolas en un campo eléctrico generado por medio de dicha estructura eléctrica.

29. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28, caracterizado porque el dispositivo proporciona una estructura eléctrica, dada por las capas que comprenden una hoja eléctricamente aislante que forma una primera capa de polímero y una estratificación que forma una segunda capa de polímero y que comprende además un microcanal dispuesto entre dicha hoja aislante y dicha estratificación, la superficie entre dicho microcanal y dicha hoja aislante puede estar cargada eléctricamente y puede evitarse que otras secciones superficiales de dicha hoja aislante se carguen eléctricamente.

30. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, caracterizado porque secciones superficiales de al menos una de dichas microestructuras tienen diferentes conductividades, reflectancias, rugosidades, velocidades de tamizado, una corrugación diferente y/o velocidades de fisisorción diferentes y/o quimisorción diferentes de un material particular.

31. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, caracterizado porque la superficie de al menos una proporción de dicha capa de polímero está formada de tal manera que una molécula tal como un antígeno, un anticuerpo, una enzima u otro reactivo de afinidad se inmoviliza sobre dicha superficie, preferiblemente mediante fisisorción, quimisorción, unión covalente o unión iónica.

32. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 31, que comprende medios para acoplarse a un sistema analítico tal como un cromatógrafo de líquidos, un aparato de electroforesis capilar, un sistema de enfoque isoeléctrico, un dispositivo de discriminación por tamaños, un espectrómetro de masas o similares.

33. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, caracterizado porque el dispositivo está formado como una punta de electropulverización o nanopulverización o como una punta sensora o como un distribuidor de fluidos.

34. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 33, caracterizado porque el dispositivo está formado de tal manera que al menos una porción de dichas microestructuras pueda recibir un medio, siendo dicho medio un fluido, un sólido o un gel.

35. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 34, caracterizado porque el dispositivo está formado de tal manera que pueden realizarse ensayos químicos y/o biológicos, tales como, por ejemplo, ensayos inmunológicos, ensayos enzimáticos o ensayos celulares.

36. Uso de un dispositivo microfluídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 35, fabricado de acuerdo con un método de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, para realizar reacciones químicas y/o biológicas preferiblemente en solución y particularmente en relación con la síntesis, y/o para realizar análisis químicos y/o biológicos particularmente en relación con ensayos químicos y/o biológicos y/o técnicas de separación, tales como electroforesis, cromatografía, espectrometría de masas, etc.