TW585912B

TW585912B - Multiply-substituted protease variants with altered net charge for use in detergents

Info

Publication number: TW585912B
Application number: TW087117614A
Authority: TW
Inventors: Ayrookaran J Poulose; Volker Schellenberger; James T Kellis Jr; Christian Paech; Joanne Nadherny
Original assignee: Genencor Int
Priority date: 1997-10-23
Filing date: 1999-01-14
Publication date: 2004-05-01
Also published as: DK1027418T3; CA2618389C; KR20010031372A; ATE314478T1; DE69829577T3; CZ20001479A3; EP1082404A2; AU8733701A; JP2001520044A; ID26501A; CN1295313C; AR015977A1; ATE513479T1; CN100558871C; ES2310014T3; NZ520771A; BRPI9813266B1; DE69839677D1; CA2307638A1; ATE417099T1

Description

585912 五、發明說明（1) 相關申請案本案為美國專利案08/956，3 23，公告於1998年10月93 日’美國專利案08/956, 564，公告於1998年1〇月23日，及美國專利案08/956，324 ’公告於1998年1〇月23日之部份續篇，以上均以全文列為本案參考用。、發明背景由於蛋白酶是綠基水解酶之亞群。其含有各類具有大範圍特異性及生物功能之酵素。Stroud，R. Sci. Amer\， 1 3 1 : 74-88。除了其功能的多樣性，絲胺酸蛋白酶之催化機制經由至少二個遺傳上不同酵素族所研討：丨）栝草桿菌蛋白酶及2)與哺乳動物胰凝乳蛋白酶有關及同源的細菌絲胺酸蛋白酶（如胰蛋白酶及S· gresius胰蛋白酶）。此二族絲胺酸蛋白酶有顯著相似之催化機制。Kraut，j. 一矢 ( 1 977 )，Annu· Rev· Biochem·，4 6:3 3 1 -3 58。再者，雖然此二酵族之一級結構是不相關的，而其三級結構則一起形成由絲胺酸、組胺酸及天冬胺酸所組成之胺基酸固催化組。又枯草桿菌蛋白酶為絲胺酸蛋白酶（約MW 27, 5〇〇)，其自各種芽孢桿菌屬及其他有機體中被大量分泌。枯草桿義白酶之蛋白質序列已自至少9種不同的芽孢桿菌中蛋〇seizen et al· ( 1 9 8 3 )，H〇ppe —Seyler，s ζ·

Ckm·， 3 64:1 5 37- 1 540。由解澱粉芽孢桿菌，地衣芽曰菌及許多遲緩芽孢桿菌之天然變異體所得之枯草桿: 酶三度空間結晶結已有所報告。$些研究顯示，雖然y

585912 五、發明說明（2) '^*--- 桿菌蛋白酶和哺乳動物絲胺酸蛋白酶在遺傳上無關，仍有相似的活性位置結構。含有枯草桿菌蛋白酶1 二晶結構之共價鍵結的肽抑制劑（R〇bertus，J D.，^ ( 1 972 )，Wochenustry，1 1:243 9_2449 )或產物抑制 (Robertus, J.D·， et al· (1976)， j·βι〇1· Chem二 2 5 1 : 1 0 97- 1 1 0 3 )在關於枯草桿菌蛋白酶活性位置及推想受質結合裂口方面’也有提供資訊。此外，也有關於=草桿菌蛋白酶的許多動力學及化學修飾研究（Svendsen，β. (1976), Carlsberg Res. Commun., 41:237-291； Markland，F.S· Id.)以及至少一種報告是其中在枯草桿菌蛋白酶第2 2 2殘基上之甲硫胺酸，側鏈被過氧化氫轉化成曱硫胺酸-亞楓（Stauffer，D.C·，et al. (1965)，J. Biol· Chem·， 244:5333-5338)且已進行充份的位置特異的突變作用（界6115311(|£5七€11 (1988) 1'183 13:291- 297)。 * 在發展蛋白酶變異體以應用於清潔劑調和物上的共同課越疋各樣的洗務條件，包括變化可使蛋白酶變異體 < 於其中使用之清潔劑調和物。例如，清潔劑調和物應用於不同領域時其在洗液中相關組份之濃度是不同的。例如，欧洲的清潔劑在洗液中通常清潔劑組份約4 5 0 〇 - 5 0 0 0 ppm，而曰本的清潔劑在洗液中只有約6 6 7 ppm組份。在北美，特別是在美國，洗液中清潔劑組份通常為約975 ppm。令人驚訝地，一種合理的設計蛋白酶變異體，使其可應用於低清潔劑濃度系統，高清潔濃度系統，及/或中清潔劑濃度

E: \aaa\55503. ptd 第10頁 585912 五、發明說明（3) 系統，以及以上各型式清潔劑濃度系統，此方法已被發展出來了。發明要點本發明在此的一個主題是提出一種蛋白酶變異體，其中在一個以上殘基位置上含有胺基酸之置換，如此改變該位置之電荷，使電荷較前4區體蛋白酶較具陰性或少陽性，且因此蛋白酶變異體在低清潔劑濃度系統中較前軀體蛋白酶更為有效。低清潔劑濃度系統是指洗液系統其中清潔劑組份少於約8 0 0 p p m。在此的另一主題是提出蛋白酶變異體，其在一個以上殘基位置上含有胺基酸之置換作用，如此可改變該位置上之電荷，使其較前軀體蛋白酶更具陽性或少陰性，且因此蛋白酶變異體高清潔劑濃度系統中較前軀體蛋白酶更為有效。高清潔劑濃度系統是指洗液系統其中清潔劑組份大於約 2 0 0 0 ppm 〇本發明在此的另一主題是提出蛋白酶變異體，其在一個以上殘基位置上含有胺基酸之置換作用，如此可改變該位置上之電荷，使其較前軀體蛋白酶更具陽性或少陰性，且因此蛋白酶變異體在中清潔劑濃度系統中較前軀體蛋白酶更為有效。中清潔劑濃度系統是指洗液中清潔劑組份介於約8 0 0 p p m及約2 0 0 0 p p m之間。此中另一主題是提出蛋白酶變異體，其在一個以上殘基位置上含有胺基酸之置換，如此可改變該位置處之電荷，使其較前軀體蛋白酶更陰性或少陽性，且因此蛋白酶變異

E:\aaa\55503. ptd 第11頁 585912 五、發明說明（4) 體在中清潔劑濃度系統中較前軀體蛋白酶更為有效。中清潔劑濃度系統是洗液中清潔劑組份在約8 0 0 ppm及約2 0 0 0 ppm之間。進一步的目的是提出編碼此蛋白酶變異體之DNA序列，以及含有此變異體DNA序列之表現載體。又進一步，本發明另一主題是提出以此載體所轉形之宿主細胞，以及可表現此DNA，於細胞内或細胞外產製蛋白酶變異體之宿主細胞。在此進一步提出含有本發明蛋白酶變異體之清潔劑組成物。另外，在此提出含有本發明蛋白酶變異體之動物飼料。在此也提出處理織品之組成物，其中含有本發明之蛋白酶變異體。在此進一步提出產製蛋白酶變異體之方法，其在低、中及高清潔劑濃度系統中較前軀體蛋白酶更為有效，包括： a) 在一個以上殘基位置上置換胺基酸，其中置換作用可改變該位置上之電荷使電荷較前4區體蛋白酶更具陽性或少陰性； b) 在一個以上殘基位置上置換胺基酸，其中置換作用可改變該位置上之電荷使電荷較前軀體蛋白酶更具陰性或少陽性； c) 測試變異體以決定其在高、中及低清潔劑濃度系統中較前軀體蛋白酶之效力；及 d) 依必要重覆步驟a)-c)以產生在低，中及高清潔劑濃度

E:\aaa\55503. ptd 第12頁

系統中較前軀體蛋白酶及b)步驟可以任何次序=為有效之蛋白酶變異體，其中a) 附圖說明订° 圖ΙΑ-B示出解澱粉芽基酸序列，及此芙因知囷枯草桿菌蛋白酶之MA及胺圖？千Φ * a A 土之部份限制輿與圖。固2不出來自解殿粉芽生型）之枯箪尸H 梓囷（βΡΝ)，及遲緩芽孢桿菌（野

La上：酶間之固之绫获矣站= 種枯草桿菌蛋白酶的胺基酸序列。上方 (右0士 ^、解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶之胺基酸序列 ^也稱為括草桿g蛋白騎『）。第三線代表枯草桿菌之祜卓蛋白酶胺基酸序列。第三線示出地衣芽孢桿菌之枯f +干菌蛋白酶胺基酸序列。第四線示出遲緩芽孢桿菌之括草桿菌蛋白酶胺基酸序列(在PCT w〇 89/0 6276中也稱為括草桿菌蛋白酶3〇9)。符號*表示和枯草桿菌蛋白酶 BPN’ ’比較下無特異的胺基酸殘基。發明詳細明如上述，某些區域有特定的洗滌條件，且因此使用不同型式之清潔劑。例如日本使用低清潔劑濃度系統，而歐洲使用南清潔劑濃度系統。如先前所述，美洲使用中清潔劑濃度系統。吾等發現不同的蛋白酶變異體在這些不同的清潔劑調和物中有最適宜之操作。然而，由於這些觀察結果 ’吾等可預期將無法找到可在所有三型式清潔劑中均操作功能良好之清潔劑。令人驚訝地，事實上並非如此。合理地設計一種蛋白酶變異體，使其可應用於低清潔劑濃度系

E:\aaa\55503. ptd 第13頁 585912 五、發明說明（6) ，或高清潔裔1濃度系統或甚至中清潔劑濃度系統’以及設计種可在二型清潔劑濃度系統中均操作良好的方法已發展出來了。吾2發現，為了產製在低清潔劑濃度系統中較為有效之蛋白酶變異體，必須以負t荷殘基或中性殘基取代正電荷殘基，，/，或以負電荷殘基取代中性殘基。相反的，為了產生在局清潔劑濃度系統中較為有效之蛋白酶變異體，必 t Ϊ正電何或中性電荷取代負電荷殘基，及/或以正電荷 I ”…生殘基」再者，吾等發現，許多可用於低二 θ展又糸統及/或兩清潔劑濃度系統之蛋白酶變異體，在 :/月潔剤/辰度系統也是有效的。為了平衡這些變化，將可 :I ΐ ί在低清潔劑濃度系、统，低及中清潔劑濃度系統，劑濃度系統，高清潔劑濃度系、统，或所有ί種 Ζ月，糸劑/農度糸統中均操作良好之蛋白酶變異體。且任何胺基酸側鏈所有之電荷為pH之函數關係。酸性殘一個#雷广H•一/吳子化可分別在PH 4及δ以上時獲得一乂、電:Η 1 s在去質子化作用時於ρΗ 7以上時會命，正=何。賴胺酸及精胺酸側鏈一旦高至Μ丨〇會呈正二，而-旦Lys側鏈被去質子化會失去其電荷。上’ Τ7Γ會去質子化而獲得一個負電荷。戈祥：t TPH值改變時或當荷電殘基移去或加入時合喪失或獲侍電荷。將在特定pH值下呈才曰丧失或正電荷殘基取代，可使正電荷增加，以電：電加Η或+ 2’或將未荷電殘基以正電荷者取=

E:\aaa\55503. ptd 第14頁 585912 五、發明說明（7) 可增加+1。同樣的，未荷電殘基以i電荷者取代可增加負電荷，造成-1之淨變化’或以未何電或負電荷者取代正電荷殘基，造成-1或-2分別之淨變化° 低清潔劑濃度系統包括其中在洗液中清潔劑組份少於約 8 Ο Ο ρ ρ ιώ之清潔劑。曰本清潔劑通常為相當低清潔劑濃度系統，因其在洗液中之清潔劑約6 6 7 ppm。中清潔劑濃度包括其中洗液内之清潔劑組份介於約8 0 0 p p in及約2 Ο Ο Ο ρ ρ οι之間。北美的清潔劑通常被視為_清潔劑濃度系統，因其在洗液中之清潔劑組份為約9 7 5 ppm。巴西在洗液中之清潔劑組份約1 5 Ο Ο ppm。高清潔劑濃度系統包括其中洗液内清潔劑組份大於約 2 0 0 0 p p m者。歐洲清潔劑通常被視為高清潔劑濃度系統，因其在洗液中之清潔劍組份為約4 5 0 0 - 5 0 0 0 p p m。拉丁美洲之清潔劑通常是高肥皂泡之磷酸鹽組份清潔劑，且在拉丁美洲使用的清潔劑範圍屬於中及高清潔劑濃度内，因其清潔劑組份在洗液中由約1 5 0 0 p p m至6 0 0 0 p p m 。如上述，巴西之清潔劑組份在洗液中通常有約1 5 0 0 p p in 。然而，其他高肥皂泡磷酸鹽組份清潔劑區域，並不限於其他拉丁美洲國家，也有高清潔劑濃度系統，其中清潔劑組份在洗液中可高達約6 0 0 0 ppm。基於上述，可明顯知道全世界典型洗液中清潔劑組成中之濃度可由少於約8 0 〇 ppm清潔劑組成物（”低清潔劑濃度區域）’如在曰本之約6 6 7 p p in，至約8 0 0 P P m至約2 0 0 0 ppm之間（"中清潔劑濃度區域，，），如在美國的約975 ppm及

E:\aaa\55503. ptd 第15頁 585912

五、發明說明（8) 在巴西的約1 5 0 0 p p m，至大於約2 0 0 0 p p m (高清潔劑濃度區域），如在歐洲的約4 5 0 0 p p in至約5 0 0 0 p p m，及在高肥皂水磷酸鹽組份區域的約6 0 0 0 ppm。典型洗液之）辰度由實驗來決定。例如在美國，典型的洗衣機可保有約64· 4升洗液之體積。因此，為了在洗液内得到約975 ppm之清潔劑濃度，在64· 4升洗液中必須加入約 6 2 · 7 9克清潔劑組成物。此劑量是消費者利用清潔劑所提供之計量杯蓋量入洗液内之典型劑量。

蛋白酶為羰基水解酶，其通常作用以解離蛋白質或肽之肽鍵。如此中所用，”蛋白酶”表示自然之蛋白酶或重組體蛋白酶。自然生成的蛋白酶包括α -胺基醯基肽水解酶，肽基胺基酸水解酶，醯基胺基水解酶，絲胺酸羧基肽酶，金屬羧基肽酶，硫醇蛋白酶，羧基蛋白酶及金屬蛋白酶。絲胺酸，金屬，硫醇及酸性蛋白酶包括在内，以及内及外 -蛋白酶。 ▲本發明包括蛋白酶酵素，其為非天然生成之羰基水解酶 ’交異體（蛋白質變異體），當和變異體胺基酸序列衍生出處之則軀體羰基水解酶比較，其具有不同的蛋白水解活性，穩疋性’叉質特異性，pH概況及/或操作特性。特言之，此種蛋白酶交異體有自然界未見之胺基酸序列，其由不同胺基酸置換前軀體蛋白酶許多胺基酸殘基而衍生。前軀體蛋白酶可為自然生成之蛋白酶或重組體蛋白酶。此中有用之蛋白酶變異體包括在所設計之胺基酸殘基位置上置換1 9個自然生成之l—胺基酸上任_者。此種置換作

585912 五、發明說明（9) 用可在任何前軀體枯草桿菌蛋白酶上進行（原核細胞，真核細胞，哺乳動物等）。在本申請案中，對各種胺基酸之參考乃經由一般的一字及三字碼來說明。此種密碼在 Dale, M.W. (1989), Molecular Genetics of Bacteria,

John Wiley & Sons，Ltd·，Appendix B 中鑑知。此中可用的蛋白酶變異體較好是衍生自枯草桿菌。較好，蛋白酶變異體是衍生自遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶及 /或枯草桿菌蛋白酶3〇9。枯草桿菌蛋白酶為細菌性或真菌蛋白酶，其通常作用以解離蛋白質或肽之肽鍵。如此中所用之”枯草桿菌蛋白酶" 表示自然生成之枯草桿菌蛋白酶或重組體枯草桿菌蛋白酶。已知可產生一系列自然生成之沽草桿菌蛋白酶，且通常由各種U生物種類分泌。此序列成員之胺基酸序列並非完全均夤。然而，此系列之栝草桿菌蛋白酶呈現相同或相似之蛋白水解活性型式。此類絲胺酸蛋白酶共有可界定催化組之共同胺基酸序列，其與絲胺酸蛋白酶之胰凝乳蛋白酶相關種類有所區別。枯草桿菌蛋白酶及胰凝乳蛋白酶相關之絲胺酸蛋白酶二者均有含有天冬胺酸，組胺酸及絲胺酸之催化組。在枯草桿菌蛋白酶相關之蛋白酶中，這些胺基酸之相對-人序由胺基漬至竣基末端為天冬胺酸-組胺酸—絲胺酸。在胰凝乳蛋白酶相關之蛋白酶中，相關次序卻是組胺酸二天冬胺酸-絲胺酸。因此此中之枯草桿菌蛋白酶指具有枯草桿菌相關蛋白酶之催化組之絲胺酸蛋白酶。實例包括圖3所鑑知之枯草桿菌蛋白酶，但不限於此。一般而言

585912

且基於本發明紋，私# Α 目的’蛋白酶中胺基酸之編號相當於在成熟 ^ t 困枯早才干囷蛋白酶序列中所命名之編號，示 I白重|^^體^枯草桿菌蛋白酶〃或〃重組體蛋白酶〃指枯草桿菌資白讎或蛋白_甘

^ 母具中編碼括草桿菌蛋白酶或蛋白酶之DNA 白秋士 5 ^舞以產生變異體（或突變體）DNA序列，其編碼 ^ 、私基酸序列中一個以上胺基酸之置換，刪除或嵌入έ入生此修飾作用之適合的方法，且其可與此中所揭示的組合’包括揭示於Μ專利RE 34,60 6，US專利5,204,0 1 5 及US 專利5，1 8 5,258，US 專利 5,70 0,6 76，US 專利 5, 801，0 38 及US 專利 5, 763, 2 5 7。非人類枯草桿菌蛋白酶"及編碼後之DNA可得自許多原核及真核有機體。原核有機體之適合的實例包括革蘭氏陰性f機，，如E· col i或假單胞菌，及革蘭氏陽性菌如黴球菌或芽孢桿菌。可由此中獲得枯草桿菌蛋白酶及其基因之真核細胞有機體包括真菌，如釀酒酵母菌，真菌如曲霉蛋白酶變異體”具有衍自”前軀體蛋白酶”胺基酸序列之胺基酸序列。前軀體蛋白酶包括自然生成之蛋白酶及重組蛋白酶。蛋白酶變異體之胺基酸序列是”衍生自前軀體胺基酸序列一個以上胺基酸經由置換，刪除或嵌入而來之前軀體胺基酸序列。此種處理修飾屬於”前軀體DNA序列，，，其編碼前軀體蛋白酶之胺基酸序列’而非前軀體蛋白酶酵素本身之操作。操作前軀體DNA序列之適合的方法包括此

E:\aaa\55503.ptd 第丨8頁 585912 五、發明說明（11) 中揭不之方法，以及精藝者已知之方法（如〇，Wj8 9/06279及此令已引為參考之us專利案及申請^ 299 這些胺基酸位置編號參見圖，為成熟的解澱粉芽：:二 :古早桿菌蛋白酶序列所設定的。然而本：： :枯草桿菌蛋白酶之突，，而是延伸至前軀體蛋白：此：令在相當於解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白之 ^ 殘基上含有胺基酸殘基K發明之較佳具體實例身區體蛋白酶是遲緩芽孢枯草桿菌蛋白_，且在遲二菌相當於上列之相當胺基酸殘基位置上有置換作用。L干前軀體蛋白酶之殘基（胺基酸）位置，若其均質於（即相當於在一.級或三級結才冓中之位置）或類似於解殿粉桿菌巧草”蛋白酶令特異的殘基或部份，則其相當於解焱粉牙孢桿囷枯草桿菌蛋白酶之殘基（即，具有相同或似的功能性能力以組合，反應或化學地交互作用）。為了發展此-級結構之同質性’前軀體蛋白酶之胺基酸序列直接與解澱粉芽孢桿菌栝草桿菌蛋白酶一級序列比較’且特別是與序列已知之括草桿菌蛋白酶中不變之已知殘基組做比較。例如’圖2示出在解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌素及遲缓芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶間之固有殘基。一旦排列好固有殘基後，並可有必要的漱人及刪除以維持排列 (即，經由任意的刪除及嵌人避免固有殘基被消除），再界定相當於解澱粉芽孢桿菌括草桿菌蛋白酶一級序列中特定胺基酸之殘基。固有殘基之排列，較好應保有此殘基達 urn。然而’大於75%或少至50%固有殘基之排列也足以定

E:\aaa\55503.ptd 第19頁 585912 五、發明說明（12) 義相當的殘基。催化組，Asp32/Hi s64/Ser221之保留應予、、准持 ^ezen et ai· (1991) Peotein Eng· 4(7): 9 了 3 7 ”’、員示許多絲胺酸蛋白酶之排列。s i e z e n e t a 1 ·指稱此組為枯草菌酶或類—枯草桿菌蛋白酶絲胺酸蛋白酶。在圖3中，將解澱粉芽孢桿菌、枯草桿菌、地衣芽抱杯$及遲緩芽孢桿菌之枯草桿菌蛋白酶胺基酸序列排列，使胺基酸序列間有最大之同質性。這些序列之比較顯示在各序列中含有大量固有的殘基。這些固有的殘基（在 BPN’及遲緩芽孢桿菌之間）示於圖2。因此泛些固有殘基可用來在其他枯草桿菌蛋白酶中定義 i目當於解ί粉芽抱桿菌枯$桿菌}白酶之胺|酸殘基，如自遲緩牙抱桿菌之枯草桿菌蛋白酶（PCT案丨^0· W〇89/ Α、σ於1989年7月13日），此中較佳之蛋白酶前軀，一 ’、^或％之為Ρβ92之栝草桿菌蛋白酶（ΕΡ ◦ 3 28 2 9 9 ) 。二=幸父佳，，緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶有高度類似性 j：曰-二ΐ ΐ ίτ菌蛋白酶的某些胺基酸序列，與解殿粉芽孢干囷+卓桿菌蛋白酶之序列於圖3Α及3Β中共列，以使固有 ^殘基有最大之同質性。如所見的，和解澱粉芽孢桿菌括早桿菌蛋白酶比較下，遲續年的士曰#々广以+ ‘ 固枯 f又下遲緩牙孢柃囷之序列中有許多的刪广 ^ 例如在解殿粉芽抱桿菌枯草桿菌蛋白_中當胺基酸，峨芽抱桿菌及地衣芽=菌中兩共臼胺酸。 "相當的殘基”也可在前躯體蛋白酶之三級結構層決定同質性而界定，盆中的二纺纟士搂，、T的一、、及、，Ό構係以X 一射線結晶法予

585912 五、發明說明（13) 以決定。相當殘基之定義是當前軀體蛋白酶及解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶之特殊胺基酸殘基主鏈原子上二個以上之原子配位（N於N，CA於CA，C於C及0於0)在〇·〗3毫微米之内，且較好是排列後在0 · 1毫微米之内。在最佳模式已 =向及定位後可達成排列，使討論中之蛋白質可與^澱粉牙孢桿菌枯草桿菌蛋白酶之非氫蛋白質原子之原子配位有最大之重疊。最佳模式是在可運用之最高解析下，實驗之繞射數據可生成最低R值之結晶模型。、’ R因子

Zh\Fo(h)\-\Fc(h) ~^\F〇(h)\~~ 將功能上與解澱粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白類似之相當殘基定羞為玎、登埋γ m I符殊殘基之胺芙酸:擇採用一構型之前躺體蛋白酶之胺基酸，如此其可以所定義之方式或改冑，於蛋白質結構，並構入解澱粉 _白_ 特異殘基。再纟，其也可以…「：；枯草杯囷蛋白酶之已由X射峻处曰風禮1 疋刚躺體蛋白酶殘基中（其中匕® X射線結晶學獲得三級社特定殘基之主鏈原子在占摅魅彳）〃據頬似位置者，其雖然等之準則，# @ Μ康類似位置之基礎上無法滿足同寻I早則，然殘基側鏈原子中粉芽孢桿菌栝草桿菌蛋白酶：=:者之原子共價與解殿米。解澱粉芽孢桿菌枯草桿:酶側鏈原子距0. 1 3耄微 ΕΡ0案Ν。· G 25 1 446 (相當於USH三級結構之配位示於已列為此中參考），且可充作文J木5’182,2〇4，其揭不平下決定相當的殘基。文之概況以在三級結構水

585912

五、發明說明U4) 針對置換作用所鑑……马固有的殘基，… 否。在殘基非固有的例子中’ _個以上胺基酸之置換限於可產生變異體之置換1具有未相當於自然中所見之胺基酸：列。纟固有殘f之例子中’此置換作用不應生成自然生成之序β。本發明之蛋白酶變異體包括蛋白酶變異體之成熟型式，以及此蛋白酶變異體之原一及前型式。以前原一型式為較佳之構體，因為此有助於蛋白酶變異體之表現，分泌及成熟。 "原序列”指結合至蛋白酶成熟型式〜—末端部份之胺基酸序列，其若移去會造成蛋白酶"成熟”型式之出現。許多蛋白水解酶在自然界是以轉譯上之酶原產物型式出現，且在無轉譯後處理修飾下’即以此方式表現。用於產製蛋白酶變異體之較佳原序列為解澱粉芽孢桿菌括草桿菌蛋白酶推想之原序列’然而其他的蛋白酶原序列也可使用。 ”訊號序列"或’’前序列”是指結合至蛋白酶之Ν-末端部份或原蛋白酶Ν-末端部份之任何胺基酸序列，其參與於蛋白酶成熟或原型式之分泌作用。訊號序列的此定義屬於功能上之定義，表示包括所有由蛋白酶基因Ν -末端部份，可在天然條件下達成蛋白酶之分泌，所編碼之所有胺基酸序列。本發明利用此序列以達成如此中所定義之蛋白酶變異體之分泌。一個可能的訊號序列包括枯草桿菌蛋白酶訊號序列中前7個胺基酸殘基，稠合至來自遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶其餘的訊號序列上（ATCC 2 1 536 )。蛋白酶變異體之”前原"型式由具有原序列並操作鏈結至

E:\aaa\55503. ptd 第22頁 585912 、發明說明（15) _^ 蛋白酶之胺基末端之蛋白酶成熟型式’及操序列胺基末端之”前'1或，'訊號"序列所組成。鏈、至原 "表現載體π指一種DNA構體，复么有择控制序狀D㈣列，可達㈣= 適適合的此控制序列包括可達成轉錄作用之啟動作用之視所需之操作子序列，編工制此轉錄 J '、兩碼適合的丨τι R Ν Α核糠駟纟士人位置之序列及可控制轉錄及轉嗶 # μ Ό合 #銨妒抑羋^ #之序列。載體可為質體，噬”拉或早純的具潛力之基因體嵌入子。一用，或者在某些例子中是整= = 關下複製及作中’"質體”及1體”有時可互換作用用之載體型式。然而，本發明咅 f目月〗最书體，其用於相當之功能其他型式之表現載 ^ ^ ^ ^ 可以或將是技藝中已知的。用於本毛明之’’宿主細胞”通常好已用US專利案RE 3“二：疋原核或真核宿主’其較 „ , ^ e ^ 円蛋白S母。用於表現蛋白酶之較佳的烷主細胞疋牙孢桿菌株肫2〇36，复 ^的侣白酶及鹼性蛋白酶（枯y疋、缺乏具酵素^舌性之中性蛋述於US專利5, 2 64 6H :蛋白酶）。Β_6株之構築詳 ., 3 6 6。可表現蛋白酶之其他宿主細胞有枯早柃囷1168C也述於us專利宰/有 3 66 ,其揭示已列為此中夂、34, 6 0 6及US專利5, 264, 株，如地衣芽& γ: / )，以及任何適合的芽孢桿菌 — 包桿菌，遲緩芽孢桿菌等。佰主細胞以利用重組體DMA技術m^Μ ^ 感。此種經轉形> —所構染之載體轉形或轉之但主細胞或可複製編碼蛋白酶變里體之

第23胃 585912 五、發明說明（16) 載體，或可表現欲求之蛋白酶變異體。在編碼蛋白酶變異 2之前—或前原_型式之載體例子中，此變異體當表現時通常可自宿主細胞分泌至宿主細胞介質中。 ⑽’’操作性鏈結”，當描述二個ΜΑ區域間之相互關係時，早純地表示其在功能上互相有關。例口，一段前序列若作用如訊號序列時可操作性鏈結至肽上，涉及於蛋白質成熟型式之分泌者最可能涉及於訊號序列之解離。一個啟動^ 若可控制序列之轉錄作用，即係操作性鏈結至編碼序列；

一個核糖體若其定位使可令轉譯作用，則係操作性鏈結至編碼序列。編碼自然生成之前軀體蛋白酶之基因，可依精藝者已知，一般方法獲得。方法通常包括合成具有推想序列之經標記探針，其編碼令人感興趣之蛋白酶區域，且可表現蛋白酶之有機體中製備基因庫，並由探針之雜交篩選基因庫中之重點基因。再定出陽性雜交之純系並予以定序。所選殖之蛋白酶再用來轉形宿主細胞以表現蛋白酶。蛋白酶基因再連接至高套數之質體。此質體在宿主中複製，伤主中含有質體複製所必要之熟知之要件：操作鏈結至重點基因之啟動子（其若被宿主所確認，即轉錄，可呈基因本身之同質啟動子般供應），轉錄終結子及聚腺苷化^域 (為某些真核宿主細胞中自蛋白酶基因轉錄―^穩定性所必要的），其係外源的或為蛋白酶基因之内源終結子區域所供應，且欲求地，選擇用基因如抗生素抗性基°因，其經由在含有抗生素之培養基中生長可使感染有質體之宿主細

585912 五、發明說明（17) — 胞連續f持。高套數之質體也含有用於宿主之複製源，因此使大量的質體可在胞質中產生而無染色體之限制。然而將多重套數之蛋白酶基因整合至宿主基因體中也在此中之 ί巳圍内。對於特易感受同質重組作用之原核及真核有機體此點尤其有益。基因可為天然的遲緩芽孢桿菌基因。另外，也可產生編碼自然生成的或變異體前軀體蛋白酶之合成基因。在此途徑下，可決定出前軀體蛋白酶之⑽Α及/或胺基酸序列。之後合成多重，重疊的合成單股DNA片段，一旦雜交及連接可產生編碼前軀體蛋白酶之合成的DNA。合成基因構築之實例示於U S專利5，2 0 4，0 1 5中之實例3，其揭示已列為本案參考。一旦選殖出自然生成的或合成的前軀體蛋白酶基因，應了解許多的處理修飾可用來加強基因之用法，超越自然生成之前軀體蛋白酶之合成。此處理修部包括重組體蛋白酶之產製，如揭示於us專利案RE 34, 60 6及EPO案No· 0 2 5 1 446及此中所述之蛋白酶變異體之產製。可使手以下的匡式突變方法，以助本發明蛋白酶變異體之構築，然而其他的方法也可使用。首先，先獲得編碼蛋白酶之自然生成之基因’並整個或部份地定序。之後掃描序列，所針對之點係希望可在所編码之酵素一個以上胺基酸上製作突變（刪除，嵌入或置換）。評估在此點鄰近之序列是否存在有限制位置，以供寡核苷酸匯集取代短基因片段之用，其中募核苷酸匯集當表現時可編碼各種突變體。

第25頁 E:\aaa\55503· ptd 585912

此種限制位置較好是蛋白酶基因内之獨特位、片段之取代。然而，也可使用蛋白酶基因二助基因之任何合宜的限制位置’只要由限制水解量豐富段可以適合之序列組合即可。若限制位置斑基因片離不是在合宜的距離内（距10至15個苔 =二，之距因中置換μ酸而產生，此—方式下讀繹;由基胺基酸在最終之構築中均未改變。為了證實=斤：碼之行基因突變以改變其序列可由M13引子伸展作用、’進已知方法完成。定位適合的鄰接區域並評估所需u之以=二個合宜的限制位置序列，可由遺傳密碼之“性，基因之限制與圖及大量不同的限制酶來完成。若合宜的鄰接限制位置可運用時，只有在配合不含有ϋ 之鄰接區域下才需採用上述方法。置 -旦自然生成之DNA或合成的DNA被選殖，鄰接欲立置之限制位置可以關聯的限制位置水解，並將許多末端互補之募核苷酸匣連接至基因内。以此方法可簡化突變 ’因為所有的募核苷酸均可被合成以具有相同的限制位置 ’且在生成限制位置上勿需合成的連接子。如此中所用的，蛋白水解活性可定義為每毫克活性酵素肽鍵水解之速率。在偵測蛋白水解活性方面有許多已知方法可運用（Κ·Μ· Kalisz，"Microbial Proteinases ’，

Advances in Biochemical Engineering/Biotechnol〇gy A· Fiechter ed.， 1 98 8 )。除此之外或另一修飾蛋白水解活性之方法，本發明的變異體酵素也可有其他的修飾特性

E:\aaa\55503. ptd 第26頁五、發明說明（19) __ ，如 Km , Kcat，κ / τζ , 經修飾之pH活性概^。例^及/或經修飾之受質特異性及/或其預期存在於如狀萝=些酵素可針對特殊受質修飾之，在本發明一方面太中或水解過程，如於洗衣用途上。具有不同蛋白水解活々主題是確保和前軀體蛋白酶比較下 (數字上較大）可使酵去之變異體蛋白酶，因為增加此活性。另外令人感興趣的尚二用途作用在標的受質上更有效率的受質特異性之變1髀f有不同之熱安定性及/或不同某些例子中，或者需二係和前4區體比較而言）。在瞬夕厶士、、以要車乂低蛋白水解活性，如若欲求蛋白 !ίi) ^^^: 相反的’在某些例子中希望可增加變显 :酵，對於其前躺體之蛋白水解活性。mu異沪^穩疋性或減低之（改變），不論是鹼或熱穩定性，均是 _ 的Keat ’ &或Kcat/Km之增加或降低對於決定這些動力學變數時所使用之受質是特異的。在本發明另一方面，頃發現在一個以上殘基位置之胺基酸置換使置換改變該位置處之電荷，進而使電荷和前軀體，白酶比較下較具陰性而少陽性，則含此等置換之蛋白酶 ’交異體在低清潔剞濃度中較前軀體蛋白酶更為有效。充本發明進一步方面是頃發現在一個以上殘基位置之胺基馱置換作用可改變該位置之電荷，使其與前軀體蛋白酶比幸父下更具陽性而少陰性，此等含置換作用之蛋白酶變異體在高清潔劑濃度下較前軀體蛋白酶更為有效。

585912 五、發明說明（20) ---^ 再者，吾等發現許多在低清潔劑濃度系統及/或言主知劑濃度系統中有用之蛋白酶變異體，在中清潔劑产M 中也是有效的。 ♦又乐統這些置換作用較好是在遲緩芽孢桿菌（重組體或秋I 式）枯草桿菌蛋白酶上進行，然而也可在任何芽跑禪'菌、$ 白酶中進行，較好是芽孢桿菌之枯草桿菌蛋白酶。干囷蛋依據以變異體蛋白酶所得之篩選結果，在解澱粉芽抱桿菌枯草桿菌蛋白酶中所見之突變，對於這些酵素之蛋解活性，性能及/或穩定性，及此變異體酵素之清潔或洗滌性能而言是十分重要的。 / 本發明的許多蛋白酶變異體可用於調和和種清潔劑組成物。已知的許多化合物均是含有本發明蛋白酶變異體之組成物所適用之界面活性劑。這些包括非離子性，陰離子性 ’陽離子或兩性離子清潔劑，如US 4, 404, 1 28 Barry J. Anderson 及 US 4,261，868 Jiri Flora, et al.所述。適合的清潔劑調和物述於US專利5，2 0 4，0 1 5中之實例7 (先前已列為本案參考）。技藝中已熟知可充作清潔組成物的不同調和物。除了典蜇之清潔組成物，可容易明白的是本發明之蛋白酶變異體玎應用於可使用天然或野生型蛋白酶之任何目的中。因此，這些變異體可用於如塊狀或液狀皂，洗碟調和物，隱形眼鏡清潔溶液或產物，肽水解，廢水處理’織品應用，充作蛋白質產製之融合-解離酵素等。本發明之變異體在清潔劑組成物中有加強之性能（和前軀體比較而言）。如此中所用的，清潔劑加強之性能可定義為

E:\aaa\55503.ptd 第 28 頁 585912

對某些酵素敏感性污點加強清潔4，如草或血液，由標準洗務循壞後以寻常以評估法來決定。本發明之蛋白酶可調和成已知之粉末狀及液狀清潔劑，具有6. 5及12.0間之pH值，且在約0〇ι至約5%(較好是 0· l%-0. 5V)按重計水平下。這些清潔劑清潔組成物也可包含有其他的酵素，如已知之蛋白酶，澱粉酶，纖維素酶，脂酶或内糖苷酶，以及組份及穩定剖。在傳統的清潔組成物中加入蛋白酶並無任何特殊之使用限制。換言之’適於清潔劑之任何溫度及pHfi，只要^值在上述範圍之内’且溫度低於所述之蛋白酶變性溫度，均適於本組成物。此夕卜’本發明之蛋白酶可用於無清潔劑之清潔組成物中，再次地其或可單獨地或與組份及穩定劑組合使用。本發明也是有。清潔組成物可些可選自如漂白劑。一般精藝者成物中。此中提實例而已。般關含有另外含劑，界應可容出之表精藝也他組份在於清，較好面活性易地明列絕非可容易，如界潔組；^ 是約1 % 及組成物中之其當存在時，存 0 · 0 1 % 至約 9 9 · 9 %至約80%。本發明之變異體蛋白酶可納於清潔組劑，組份白，何種全部，且地明白，面活性劑物中之添至約95% 異體之清潔組成物成物之添加物。這，酵素及漂白催化添加物適於納入組僅為適合添加物之只可以使用與酵素 ’相容之添加物。加物含量由約 1又更好是由約Γ/〇入動物飼料中，如部份的

585912 五、發明說明（22) 物飼料添加物，如述於US 5, 612, 055 ; US 5, 3 1 4, 692 ;及 US 5, 147, 642 °

本發明的一方面是處理織品之組成物，其中包括有本發明之變異體蛋白酶。組成物可用來處理如絲或羊毛，如RD 216,034 ;EP 134,267 ;US 4,533,359 ;及EP 344,259 上所述。示出下列係經由實例，且不欲因此限制本申請專利範圍之範疇。

此中參考的所有申請案及專利，係以全文供為本案參考〇實例1 利用技藝中热知之方法產製及純化大量蛋白酶變異體。試驗所產生之蛋白酶變異體，以在二種清潔劑及洗滌條件型式下進行’其中利用u· S.系列案No· 60/068, 796π分析較佳酵素及/或較佳清潔劑組成物之改進方法，，中所述之微量洗滌分析法。

表1 — 13列出所分析之變異體蛋白酶，及於二種不同清潔劑中測試之結果。在各表中，基於此實例目的，第一種變異體是前軀體蛋白酶，且在表中接著的變異體有額外的突變生成。如此，此表中之前軀體蛋白酶比較以出示所有數值（即1 · 3 2之數值表示和標準品之1 〇〇 %相對下，可釋出 132%污點之能力）。 Α欄示出變異體與其表上之前軀體之電荷差值。β攔中清潔劑為0· 67克/升經過濾之Ariel Ultra (procter & ^

585912 五、發明說明（23) Gamble，Cincinnati，OH，USA)，於含有 3 克/ 加命混合的 Ca~/Mg2+硬度之溶液中，且各孔洞在25°C下使用〇.3 ppm酵素。於C欄，清潔劑為3·38克/升經過濾之Ariei Futur (Procter & Gamble，Cincinnati，〇H，USA)，於含有 15 克/加命混合的Ca2+ /Mg2+硬度之溶液中，且各孔洞在4〇。〇下使用0.3 ppm酵素。

E:\aaa\55503. ptd

第31頁 585912 五、發明說明（24) 表1 A 巳 C N76D S103A V104I Q109R 1.00 1.00 N76D S103A V104I Q109R Q245R +1 0.48 1.41 表2 A B C V68A N76D S103A V104I G159D Q236H Q245R 1.00 1.00 V68A N76D S103A V104I G159D N204D Q236H Q245R -1 1.11 0.03 表3 A B C V68A N76D S103A V104I 1.00 1.00 T22K V68A N76D S103A V104I +1 0.74 1.85 表4 A 巳 C N76D S103A V104I N173R M222S 0 0.66 1.84 Q12R N76D S103A V104I M222S Q245R + 1 0.41 5.84 画圓圓1 E:\aaa\55503. ptd 第32頁 585912 五、發明說明（25) < G) < O) CO > 00 > z G) U z ⑦ o ω _x (f) —i. 〇 o CO > < < o o 〇 o cn CD 〇 ii CD o > N) 00 〇刀 M < 00 ro < D ro c〇 cn 工 δ 〇〇 G) 工 D M cn 刀 D ro cn Zl + > o •么〇〇 OD N) b CD —k •o 〇〇 < G) > < 〇 CO > cn s > z: o 2： S) ◦ < o ω —i. O w (!) _3k o Q _x cn CD 〇 < 〇 < _x o > 03 ro < CD _k cn CD 〇 o —X cn CD 〇 D ro 00 o 工 D N) 00 ③ 工 D ro CO 工 D ro cn 刀 D N) cn 刀 Z N) (jy hj 7； + > o 〇 (Ό —i. o 0□ 〇 g <J) •g _k o o 〇 _k o _Ik. D ro 刀 M Zl M 刀 Z Ο) 〇 z o Z o cn cn ω -JL W to > w CO > GJ > —X. 〇 Η H O H cn _L CO 〇 H cn —X OJ 〇 H cn _ H 刀 N、 2： fv N ⑺ l\J ΓΟ ro ω ΓΌ ro ro ω Z Γτ\ O M fv 〇 ro fv KJJ ΟΊ u cn 刀 cn 刀 ro M M ω z ro (J) o z M f VJJ Ό 〇 M cn 刀 CO 1 > M bo _k '-Vl CO —w b o CD 〇 s o 00 o o 画画_ E:\aaa\55503. ptd 第33頁 585912 五、發明說明（26) ω —k ο 00 > < ο Q _k cn CD Ο > Μ GO ΓΟ < Ο ro ω CD 工 Ο Μ cn 73 2 Μ 会 Ο ζ: NJ cn Ν3 7s > Ο CD _k ο Ο < CD rvN 〇〇 > UJ > ζ ⑺ —λ. ο (κ\ ο > ω _χ < S «.λ ο |ν > < ο Q —Ik. cn CD Ο ο > fO (SI CD <\J 00 M Ο < > D K \ l\J 00 Μ IXJ 00 σ> < 工 Ο ίο Ο ΝΛ InJ 00 σ) 1、《^ αι 工 73 Ο μ cn cn 70 < [3 cn < ι > _Ik. cn ω k σ CD ο 00 Ο Ο < Ο) 00 > 00 > ω »λ, ο ω —X Ο ω < Ο < _k Ο ο cn CD Ο ο _χ cn CD Ο > Μ Ο) Μ < > Μ 03 ro < Ο Μ 03 0) 工 Ο ro Ο) ο 工 CO m D ro cn ΖΙ Ο Μ cn 73 ro > —k Kj _λ. σ CD ο Μ Ο Ο < σ> 00 > UJ > (I) S > CD Ο 00 > < < 〇 ο 〇 —3L ο _X 疒η U 1 CD Ο U1 CD Ο > κ > > ΓΟ IXJ 00 ΓΟ < 00 Μ < Ο Κ Λ Ο Ν ^ INJ 00 σ) X CO σ> 工 D Μ cn 刀 D Μ cn 刀 z κ > 公 00 ο l\J cn Μ 7； Ζ ΓΟ αι ΓΟ 1 > _1L CD Ο) 〇 Ο 03 Ο σ) cn 〇〇 Ο E:\aaa\55503. ptd 第34頁 585912

z z CD M CD N) 〇〇 ω (f) O ω s > < < ο 〇 D Q g cn CO 刀〇 Ο —i> id cn CD σ id > M —x. 00 CO K) 刀 < > N) D κ \ 00 ΓΟ IvJ 03 O) < 工 D D N) 03 σ> N3 Ol 工 73 δ 2 rr% CTl 刀 uu o z M 払 00 z M cn ro σ 7； z Νί cn M 7； + > 〇〇 _k o 03 _L 2 _k o o 2 ω —X σ> Ο S > ω < Ο ο < cn ο ο Ο ω —L Ο —λ «Λ Ο cn CD ο ο > ΓΟ ΰΐ CD C0 Κ3 Ο < > Κ Λ Ο κ y INJ (λ) Μ l\J (λ) CD < 工 Ο Κ Λ Ο hO l>J 03 Ο 工私 cn 73 Ο Z Μ / τ% ro 厶 00 vji 刀 ο 2： Μ 厶 00 z Κ3 cn NJ α ζ Μ cn Ν) 7； 1 > _λ Ν) 00 __jk b o CD Ο *00 CD b 〇 o ω _x. 〇 < _k O Q ·_l cn CD 〇 [3 _3l m > ro CO ro < 〇 ro 03 CD 工 D N) a；刀 z ro 00 〇 z ro cn ro 7； 1 _i>. CD 〇〇 k cn

E:\aaa\55503. ptd 第35頁

Claims

585912 案號金1念本 ί Λν#* ^ _日避翻 .正 X 1 六、申請專利範圍 1. 一種枯草桿菌蛋白酶變異體，其在選自由包括A1E， V4E, Q12H, Q12R, A16T, R19C, R19L, T38S, L42I, L42V, A48T, N62H, V68A, I 72V, N76D, N77D, A98E, S101G, S103A, V104I, L111M, N123S, S130T, A133T, G146S，A158E，G159D，R1 70S, A174V, N183D, N184D, N185D, S188E， N204D, Q206E, L217E, M222S, T224A, A232V, Q236H, K237E, K237Q, N238S, N243D, V244A, Q245L, Q245R, N248D, H249Q, H249Y, K251T, N252K, N252D， L257V， N261D, T274A 及 R275H 所組成之群組中之 =個以上殘基位置上含有胺基酸置換作用，其中置換會改變該位置之電荷，使電荷較前軀體蛋白酶更具陰性或少陽性’ ί其中蛋白酶變異體在低清潔劑濃度系統中較前軀體蛋白酶更為有效。 τ权〜t肢其係衍生自芽ΐίί圍第1項之枯草t菌蛋白酶變異體，其係衍生自遲ϊ s t圍第2項之枯草桿菌蛋白酶變異體， 4. 一從说-牙跑桿菌之枯草桿菌蛋白酶0 體之DNA 種編瑪申請專利範圍第1項之枯草桿菌蛋白酶變異種編石馬φ丄主击種以申I =專利範圍第4項之DNA之表現載體。明寻利範圍第5項之表現載體所轉形之宿主 5.6. 細胞。 7· —種含有申含主體之清潔組成物了利範圍第1項之枯草桿菌蛋白酶變異

585912 _ 案號87117614 年^ 3 日修正_ 六、申請專利範圍 8 · —種含有申請專利範圍第1項之枯草桿菌蛋白酶變異體之動物飼料。 9 · 一種處理織品之組成物，其中含有根據申請專利範圍第1項之枯草桿菌蛋白酶變異體。 10. —種枯草桿菌蛋白酶變異體，其在選自由包括Q12R， A13T， H17L， G20R， T22K， T38G, N43S， A48V， T58S， N62D, V68A, N76D, S87R, E89D, A98V, S99G, S101G, G1 02A, SI 03A, VI 041 , Q1 09R, N116K, SI28G, P131V, Q1 37R, N140D, G1 59D, D181N, N183K, N183I, N184G, N1 85D, A1 94P, V205I, Q206R, Y209W, Y209F, P210F, P21 0R, P210L, P210I, G21 1R, S212C, S212G, S212P, T213Q, T21 3R, T213S, Y214L, A215R, A215V, S216T, S21 6V, L217E, N218S, M222S, T224A, A228T, A228V, A230V, A232V, Q236H, K237E, S242P, S242T, V244A, V244T, Q245R, N248D, N248S, N248G, N252K, N252S, N252L, T255V, S256R, S256N, L257V, L257R, G258R, S259G, T260A, T260R, T260V, N261Y, N261R, V268F, E271 V, E271Q, E271G及A272S所組成之群組之一個以上殘基位置上含有胺基酸置換作用，其中置換可改變該位置之電荷使電荷較前軀體蛋白酶更具陽性或少陰性，且其中蛋白酶變異體在高清潔劑濃度系統中較前軀體蛋白酶更為有效。 1 1 ·根據申請專利範圍第1 〇項之枯草桿菌蛋白酶變異體，其係衍生自芽孢桿菌之枯草桿菌蛋白酶。

O:\55\55503-930308.ptc 第37頁 2004. 03. 30. 038 585912 _案號87117614 年、月日修正_ 六、申請專利範圍 1 2 .根據申請專利範圍第1 1項之枯草桿菌蛋白酶變異體，其係衍生自遲緩芽孢桿菌之枯草桿菌蛋白酶。 1 3 . —種編碼申請專利範圍第1 0項之枯草桿菌蛋白酶變異體之DNA。 14. 一種編碼申請專利範圍第13項之DNA之表現載體。 1 5 . —種以申請專利範圍第1 4項之表現載體所轉形之宿主細胞。 1 6. —種含有申請專利範圍第1 0項之枯草桿菌蛋白酶變異體之清潔組成物。 1 7. —種含有申請專利範圍第1 0項之枯草桿菌蛋白酶變異體之動物飼料。 1 8. —種處理織品之組成物，其中含有根據申請專利範圍第1 0項之枯草桿菌蛋白酶變異體。 1 9.根據申請專利範圍第1項之枯草桿菌蛋白酶變異體，其中的高清潔劑濃度是洗液中之濃度大於2 0 0 0 ppm。 2 0 .根據申請專利範圍第1 0項之枯草桿菌蛋白酶變異體，其係為具有S103A， V104I， G159D， A232V， Q245R, N 2 48D 及 N 2 5 2 K 之變異體 S 0 0 5 5 C09。 2 1 . —種產製枯草桿菌蛋白酶變異體之方法，其在低，中及高清潔劑濃度系統中較前軀體蛋白酶更為有效，其方法包括： a)在一個以上殘基位置上置換胺基酸，其中之置換可改變該位置之電荷，使電荷較前軀體蛋白酶更具陽性或少陰性；

O:\55\55503-930308.ptc 第38頁 2004. 03. 30. 039 585912 _m 87117614 q、年、月曰修±__ 六、申請專利範圍 b)在一個以上殘基位置置換胺基酸，其中置換可改變該位置之電荷，使電荷較前軀體蛋白酶更具陰性或少陽性； c )測試變異體以決定其與前軀體蛋白酶比較下，在高、中及低清潔劑濃度系統中之效力；及 d )依必要重覆步驟a ) - c )，以產生在低、中及高清潔劑》辰度糸統中較前4區體蛋白酶更為有效之蛋白酶變異體。 22· —種枯草桿菌蛋白酶變異體，其在選自包括53[， Q12R， G203， K27N, T38G， N62D， V68A, N76D， E89D， G97E, A98D, A98L, S99E, S99G, S10AG, G102A, S103A, V104I, SI 06E, Q1 09E, Q1 09R, S128L, S 1 2 8 G， S130A, SI30G, P131V, A133V, G159D, S160V, SI66D, Y1 67F, N173D, N184D, N184G, N185D, A194P, V205I, Q206E, Q206R, Y209F, Y209W, P210I, P210L, P210R, S212C, S212E, S212G, T213Q, T213E, T21 3R, T213S, A215R, A215V, S21 6C, S21 6T, S216V, L217E, N218S, A228V, A230V, A232V, Q236H, V244A, V244T, Q245R, Q245V, N248D, N248G, N252F, N 2 5 2 K , N252L, T255V, N256E, S256R, L257R, G258D, S260R, T260A, N261R 及E271Q 所組成之群組中之一個以上殘基位置上含有胺基酸置換，其中置換會改變該位置處之電荷，使電荷較前軀體蛋白酶更為陽性或少陰性，且其中蛋白酶變異體在中清潔劑濃度系統中較前軀體蛋白酶更為有效。

O:\55\55503-930308.ptc 第39頁 2004. 03. 30. 040 585912

圖式画 1A

C/a IlDv/crII mco Ri Sam Hi § V E:\aaa\55503.ptd 第1頁