CZ300347B6

CZ300347B6 - Zpusob zvýšení úcinnosti subtilizinu a zpusob výroby pracího prostredku

Info

Publication number: CZ300347B6
Application number: CZ20001493A
Authority: CZ
Inventors: J. Poulose@Ayrookaran; Schellenberger@Volker; T. Kellis@James; Paech@Christian; Nadherny@Joanne; P. Naki@Donald; M. Caldwell@Robert; D. Collier@Katherine
Original assignee: Genencor International, Inc.
Priority date: 1997-10-23
Filing date: 1998-10-23
Publication date: 2009-04-29
Also published as: WO1999020723A9; WO1999020770A3; BRPI9813115B1; CA2306794A1; AU758371B2; CN100506963C; EP1398367B1; JP2001520308A; EP1612271B1; HUP0104539A3; TR200101861T2; EP1025194A1; CA2306894C; DE69840346D1; BRPI9813266B1; BR9813115A; AU742694B2; ATE417099T1; ES2319470T3; AU1197199A

Abstract

Zpusob zvýšení úcinnosti subtilizinu v systému s nízkým obsahem detergentu, obsahujícím méne než 800 ppm složek detergentu v prací vode, spocívající v nahrazení zbytku aminokyseliny v jedné nebo vetším poctu poloh v prekurzoru subtilizinu za vzniku varianty subtilizinu, kde substituce mení náboj v této poloze, pricemž náboj se stává více negativním nebo méne pozitivním ve srovnání s prekurzorem, a testování úcinnosti takto vzniklé varianty. Zpusob zvýšení úcinnosti subtilizinu v systému s vysokou koncentrací detergentu, obsahujícím více než 2000 ppm složek detergentu v prací vode, spocívající v nahrazení zbytku aminokyseliny v jedné nebo vetším poctu poloh v prekurzoru subtilizinu za vzniku varianty subtilizinu, kde substituce mení náboj v této poloze, pricemž náboj se stává méne negativním nebo více pozitivním ve srovnání s prekurzorem, a testování úcinnosti takto vzniklé varianty. Zpusob výroby pracího prostredku zvýšením úcinnosti subtilizinu popsaným zpusobem a jeho zpracování na prací prostredek.

Description

Způsob zvýšení účinnosti subtilizinu a způsob výroby pracího prostředku

Oblast technikv

Serinové proteázy jsou podskupiny karbonylových hydroláz. Obsahují diverzní skupinu enzymů, které vykazují široké rozmezí specifit a biologických funkci (popisuje se v publikaci Stroud, R. Sci. Amer., 131: 74-88). Navzdory jejích funkční diverzitě katalytického mechanizmu serinových proteáz se dosáhlo alespoň u dvou geneticky odlišných rodin enzymů; 1) subtiliziny a 2) io serinové proteázy příbuzné savčímu chymotrypsinu a homologní bakteriální serinové proteázy (například trypsin a trypsin 5. gresius). Tyto dvě rodiny serinových proteáz vykazují značně stejné mechanizmy katalýzy (popisuje se v publikaci Kraut, J. (1977), Annu. Rev. Biochem., 46: 331-358. Dále, ačkoli proteázy nemají příbuznou primární strukturu, terciární struktura těchto dvou enzymatických rodin tvoří konzervativní katalytickou triádu aminokyselin, které obsahují serin, histidin a aspartát.

Subtiliziny jsou serinové proteázy (s přibližnou molekulovou hmotností 27 500), které se vylučují ve velkém množství z širokého rozmezí druhů Bacillus a jiných mikroorganizmů. Proteinová sekvence subtilizinu se stanovila alespoň z devíti různých druhů Bacillus (Markand, F. S., et al., (1983), Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 364: 1537-1540). V literatuře se zmiňuje trojrozměrná krystalografická struktura subtilizinu z mikroorganizmu Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus Ucheniformis a několik přirozených variant mikroorganizmu B. lentus. Tyto studie ukazují, že ačkoli subtilizin není geneticky příbuzný se savčími serinovými proteázami, vykazuje podobnou, aktivní místní strukturu. Analýza krystalických struktur subtilizinu pomocí rentgenového záření, přičemž subtilizin obsahuje kovalentně vázané peptidové inhibitory (popisuje se v publikaci Robertus, J. D., et al., (1972), Blochemistry, 11: 2439-2449) nebo komplexy produktů (popisuje se v publikaci Robertus, J. D. et aL, (1976), J. Biol. Chem, 251: 1097-1103), poskytuje také informace o aktivním místě a předpokládaném vazebném štěpení substrátu subtilizinu. Publikuje se velké množství studií kinetických a chemických úprav molekul (popisuje se v publikaci Sved30 sen, B., (1976) Carlsberg Res. Commun., 41: 237-291, Markland, F. S. Id.) a existuje alespoň jedna zpráva, kde vedlejší řetězec methioninu subtilizinu s 222 zbytky se přeměnil peroxidem vodíku na methioninsulfoxid (popisuje se v publikaci Stauffer, D. C., et al., (1965), J. Biol. Chem., 244: 5333-5338) a provedla se rozsáhlá místně specifická mutageneze (Wells and Estell (1988) TIBS 13:291-297).

Běžným problémem vývoje proteázové varianty vhodné pro použití v detergentové formulaci jsou různé podmínky promytí zahrnující různé detergentové formulace, kde se mohou použít proteázová varianty. Detergentové formulace užívané v různých oblastech mají různé koncentrace různých relevantních komponent přítomných v promývací vodě. Například Evropský detergento40 vý systém v typickém případě obsahuje přibližně 4500 až 5000 ppm detergentových komponentů v prací vodě, zatímco Japonský detergentový systém v typickém případě obsahuje v prací vodě přibližně 667 ppm detergentových komponentů. V Severní Americe, zvláště pak ve Spojených státech, vykazuje detergentový systém v práci vodě přibližně 975 ppm detergentových komponentů, Překvapivě, se vyvinul způsob detailního projektu varianty proteáz vhodné pro použití v systému s nízkou koncentrací detergentu, systému s vysokou koncentrací detergentu a/nebo systému se střední koncentrací detergentu, stejně jako ve všech třech typech systému koncentrací detergentu.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje proteázové varianty obsahující substituce aminokyselin v jedné nebo ve více pozicích zbytků tak, že substituce mění náboj v této poloze na více negativní nebo méně pozitivní ve srovnání s prekurzorovou proteázou a tak proteázová varianta je více účinná v systému s níz55 kou koncentrací detergentu ve srovnáni s prekurzorovou proteázou. Systém s nízkou koncentrací

-1 CZ 300347 B6 detergentu je promývací systém, který obsahuje méně než přibližně 800 ppm komponentů detergentu přítomných v prací vodě.

Dále vynález popisuje proteázové varianty obsahující substituce aminokyselin v poloháchjedno5 ho nebo více zbytků tak, že substituce mění náboj v této poloze tak, že náboj je více pozitivní nebo méně negativní ve srovnání s prekurzorovou proteázou a tak proteázová varianta je více účinná v systému s vysokou koncentrací, detergentu ve srovnání s prekurzorovou proteázou.

Systém s vysokou koncentrací detergentu je promývací systém, který má obsah detergentových komponentů vyšší než přibližně 2000 ppm detergentových komponent přítomných v prací vodě.

Dále vynález popisuje proteázové varianty obsahující substituce aminokyselin v jedné nebo více polohách zbytků, které mění náboj v této poloze tak, že je více pozitivní nebo méně negativní ve srovnání s prekurzorovou proteázou, což znamená, že proteázová varianta je více účinná v systému se střední koncentrací detergentu ve srovnání s prekurzorovou proteázou. Systém se střední koncentrací detergentu je systém, který obsahuje v prací vodě přibližně 800 až 2000 ppm detergentových komponentů.

Vynález dále popisuje proteázové varianty obsahující substituce aminokyselin v polohách jednoho nebo více zbytků tak, že substituce mění náboj v této poloze tak, že náboj je více negativní nebo méně pozitivní ve srovnání s prekurzorovou proteázou a tak proteázová varianta je více účinná v systému se střední koncentrací detergentu ve srovnání prekurzorovou proteázou. Systém se střední koncentrací detergentu je promývací systém, který obsahuje v prací vodě přibližně 800 až přibližně 2000 ppm detergentových komponentů.

Dále vynález popisuje sekvence DNA kódující takové proteázové varianty, stejně jako expresívní vektory obsahující takové varianty sekvencí DNA.

Vynález dále popisuje hostitelské buňky transformované takovými vektory, stejně jako hostitelské buňky, které jsou schopny exprimovat takovou DNA, aby se produkovaly proteázové varian30 ty buď uvnitř buňky nebo vně buňky.

Dále vynález popisuje čisticí kompozici obsahující proteázovou variantu podle vynálezu.

Navíc se popisuje krmení pro zvířata obsahující proteázovou variantu podle vynálezu.

Dále se popisuje kompozice vhodná pro ošetření textilií obsahující proteázovou variantu podle vynálezu.

Dále se popisuje způsob produkce proteázové varianty, která je více účinná v systému nízké, střední a vysoké koncentrace detergentu ve srovnání s prekurzorovou proteázou, která zahrnuje;

a) substituci aminokyseliny v jedné nebo více polohách zbytků, kde substituce mění náboj v této poloze tak, že činí náboj více pozitivní nebo méně negativní ve srovnání s prekurzorovou proteázou,

b) substituce aminokyseliny v jedné nebo více poloh zbytků, kde substituce mění náboj v této poloze tak, že činí náboj více negativní nebo méně pozitivní ve srovnání s prekurzorovou proteázou,

c) testovaní varianty pro stanovení jej í účinnosti v systému vysoké, střední a nízké koncentrace detergentu ve srovnání s prekurzorovou proteázou a «

d) opakování kroků popsaných v odstavci a) až c), které jsou nezbytné k produkci proteázové varianty, která je více účinná v systému s nízkou, střední a vysokou koncentrací detergentu

-2CZ 3UW347 B6 ve srovnání s prekurzorovou proteázou, přičemž kroky a) až b) se mohou provést v libovol- . ném pořadí.

Jak se uvádí shora v textu, jistá zeměpisná místa vykazují jisté podmínky praní a různé typy , detergentů. Například v Japonsku používají systém s nízkou koncentrací detergentů, zatímco , v Evropě používají systém s vysokou koncentrací detergentů. Jak se diskutuje shora v textu ve Spojených státech se používá systém se střední koncentrací detergentů. Zjistilo se, že různé proteázové varianty působí v těchto různých detergentových formulacích optimálně. Avšak na základě tohoto pozorování se předpokládá, že bude obtížné nalézt proteázu, která bude dobře fungovat to ve všech třech typech detergentů. Překvapivě, není tomu tak. Vyvinul se způsob rozumně navržené proteázové varianty, která se použije bud’ v systému s nízkou koncentrací detergentů, nebo v systému s vysokou koncentrací detergentů nebo dokonce v systému se střední koncentrací detergentů nebo dále pracuje ve všech systémech uvedených třech koncentrací.

Zjistilo se, že za účelem produkovat proteázovou Variantu, kteráje účinnější v systému s nízkou koncentrací, je nezbytné nahradit pozitivně nabitý zbytek nebo zbytky buď negativně nabitým zbytkem, nebo zbytky nebo neutrálním zbytkem nebo zbytky s negativně nabitým zbytkem nebo zbytky. Naopak se uvádí, že za účelem produkce proteázové Varianty, kteráje účinnější v systému s vysokou koncentrací detergentů, je nezbytné nahradit negativně nabitý zbytek(zbytky) buď pozitivně nabitým zbytkem (zbytky), nebo neutrálním zbytkem(zbytky) a/nebo neutrálním zbytkem(zbytky) s pozitivně nabitým zbytkem(zbytky). Dále se zjistilo, že řada proteázových variant použitelná v systému s nízkou koncentrací detergentů a/nebo v systému s vysokou koncentrací detergentů je také účinná v systému se střední koncentrací detergentů. Vyvážením těchto změn je . možné produkovat proteázovou variantu, která funguje dobře v systémech s nízkou koncentrací detergentů, v systémech s nízkou nebo střední koncentrací detergentů, v systémech se střední a vysokou koncentrací detergentů nebo v systémech všech tří koncentrací detergentů.

Elektrostatický náboj libovolného ionizovatelného vedlejšího řetězce aminokyseliny s kyselou nebo bazickou funkcí ve vodném roztoku je funkce pH. Kyselé zbytky Glu a Asp v rovnovážném postupu ztrácí disociací při hodnotě pH 3 až 6 proton, přičemž získávají negativní náboj. Stejným způsobem His, Lys a Arg se pří hodnotách pH 5 až 8, 8,5 až 11,5 a pH 11 až 14 postupně deprotonizují, čímž ztrácejí pozitivní náboj. Proton zbytku Tyr OH zvyšuje svou disociací mezi hodnotami pH 8,5 a 11,5, přičemž Tyr získává negativní náboj. Disociační rozmezí karboxylového konce se pohybuje mezi hodnotami pH 1 až 4, což vede ke vzniku negativního náboje.

V případě N-konce je tato hodnota pH 8 až 11, což je doprovázeno ztrátou pozitivního náboje. Disociační rozmezí vedlejšího řetězce aminokyseliny jsou průměrné hodnoty pro řadu proteinů, aleje známo, zeje ovlivňují neobvyklé strukturální konfigurace v některých proteinech.

ς ' ··—

Kumulativní účinek všech nábojů stanoví, zda protein má při dané hodnotě pH čistě pozitivní nebo negativní náboj. Hodnota pH, při kterém účinnost pozitivního a negativního náboje je účinná a uvádí protein do elektrostaticky neutrálního stádia se nazývá izoelektrický bod (ρί). V případě, že se posune hodnota pH nebo že se přidá nebo odstraní aminokyselina s ionizovatelným zbytkem vedlejšího řetězce, protein ztratí nebo získá náboj. Zvýšení čistě pozitivního náboje se dosáhne buď nahrazením zbytku, který je při daném pH negativně nabitý, pozitivně nabitým zbytkem, nebo zbytkem bez náboje, což vede k formální změně náboje +1 a +2. Nahrazením nenabitého zbytku vedlejšího řetězce zbytkem, který je protonizován při daném pH, formální změna náboje je +1. Podobně čistě negativní náboj se může zvýšit nahrazením pozitivně nabitých a nenabitých vedlejších řetězců negativně nabitými vedlejšími řetězci při pH pozorování, čímž se zvýší negativní náboj o-l a-2.

Systém s nízkou koncentrací detergentů zahrnuje detergenty, kde v prací vodě je přítomno méně než přibližně 800 ppm detergentových komponentů. Japonské detergenty se v obecném případě považují za systém s nízkou koncentraci detergentů, který obsahuje v prací vodě přibližně 667 ppm detergentových komponentů.

-3CZ 3U0347 B6

Střední koncentrace detergentu zahrnuje detergenty, kde v prací vodě je obsaženo přibližně 800 a 2000 ppm detergentových komponentů. Detergenty v Severní Americe se v obecném případě považují za systémy se střední koncentrací detergentu, které v prací vodě obsahují přibližně 975 ppm detergentových komponentů. V Brazílii obsahují detergenty v typickém přípa5 dě v prací vodě přibližně 1500 ppm detergentových komponentů.

Systém s vysokou koncentrací detergentu zahrnuje detergenty, kde v promývací vodě je obsaženo více jak 2000 ppm detergentových komponentů. Evropské detergenty se v obecném případě považují za systémy s vysokou koncentrací detergentu, což znamená, že v prací vodě obsahují io přibližně 4500 až 5000 ppm detergentových komponentů.

Detergenty Latinské Ameriky v obecném případě obsahují vysoké množství fosfátů a rozmezí detergentu používaných v Latinské Americe spadá do systému se střední nebo vysokou koncentrací detergentu, což je rozmezí mezi 1500 až 6000 ppm detergentových komponentů v prací vodě. Jak se uvádí shora v textu brazilské detergenty v typickém případě obsahují v prací vodě 1500 ppm detergentových komponentů. Avšak výskyt detergentu s vysokým obsahem fosfátů není omezen na další státy Latinské Ameriky, kde se mohou používat systémy s vysokou koncentrací detergentu, které obsahují v promývací vodě až přibližně 6000 ppm detergentových komponentů,

Z uvedených skutečností je zřejmé, že koncentrace detergentových sloučenin v typických pracích roztocích v celém světě kolísá od hodnoty nižší než přibližně 800 ppm (což je nízká koncentrace detergentu), například přibližně 667 ppm v Japonsku, přes hodnotu 800 ppm k hodnotě 2000 ppm (což je střední koncentrace detergentu), například přibližné 975 ppm v US a přibližně 1500 v Brazílii až k hodnotě 2000 ppm (což je vysoká koncentrace detergentu). Příkladem je koncentrace 4500 ppm až přibližně 5000 ppm v Evropě a 6000 ppm v místech, kde se používají detergenty s vysokým obsahem fosfátů.

Koncentrace v typických pracích roztocích se stanoví empiricky. V USA v typickém případě v pračce udržuje objem 64,4 1 pracího roztoku. Aby se získala přibližná hodnota koncentrace detergentu v pracím roztoku 975 ppm, pak se musí do pracího roztoku přidat přibližně 62,72 g detergentové kompozice. Toto množství je typické množství odměřované uživatelem do prací vody odměrkou, která je při balena u detergentu.

Proteázy jsou karbonylové hydrolázy, které v obecném případě štěpí peptidové vazby proteinů nebo peptidů. Termín „proteáza“ znamená přirozeně se vyskytující proteázu nebo rekombinantní proteázu. Přirozeně se vyskytující proteázy zahrnují α-aminoacylpeptidovou hydrolázu, peptidylam i nokyselinovou hydrolázu, acylaminohydrolázu, serinovou karboxypeptidázu, metalokarboxypeptidázu, thiolproteinázu, karboxylproteinázu a metaloproteinázu. Zahrnují také serinové proteázy, metaloproteázy a kyselé proteázy, stejně jako endo- a exoproteázy.

Vynález dáte popisuje proteázové enzymy, které jsou varianty karbonylových hydroláz, které se přirozeně nevyskytují (proteázové varianty), které vykazují odlišnou proteolytickou aktivitu, stabilitu, substrátovou specifitu, profil pH a nebo charakteristiky použití ve srovnání s prekurzo45 rovou karbonylovou hydrolázou, ze které se získala aminokyselinová sekvence varianty. Ve specifickém případě takové proteázové varianty vykazují aminokyselinovou sekvenci, která se v přírodě nevyskytuje a která se získala substitucí řady aminokyselinových zbytků prekurzorové proteázy různými aminokyselinami, Prekurzorová proteáza může být přirozeně se vyskytující proteázou nebo rekombinantní proteázou.

Proteázové varianty podle vynálezu zdůrazňují substituci libovolné z devatenácti přirozeně se vyskytujících L-aminokyselin v určených polohách aminokyselinových zbytků. Takové substituce se mohou provést v libovolném prekurzorovém subtilizinu (prokaryontní, eukaryontní, savčí atd). V tomto dokumentu se různé aminokyseliny značí běžným třípísmenným kódem. Takový

-4CZ 300347 Bó kód je stanoven v publikaci Dále, M.W. (1989), Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley and Sons, Ltd., Appendix B.

Zde používané proteázové varianty se přednostně získaly ze subtilizinu mikroorganizmu Bacil5 lus. Více se upřednostňují varianty proteáz získané ze subtilizinu mikroorganizmu Bacillus lentus a subtilizinu 309.

Subtiliziny jsou bakteriální a houbové proteázy, které v obecném případě štěpí peptidové vazby proteinů nebo peptidů. Termín „subtilizin“ znamená přirozeně se vyskytující subtilizin nebo io rekombinantní subtilizin. Je známo, že série přirozeně se vyskytujících subtilizinu produkují a Často vylučují různé druhy mikroorganizmů. Aminokyselinové sekvence zástupců této série nejsou zcela homologní. Avšak subtiliziny v této sérii vykazují stejný nebo podobný typ proteolytické aktivity. Tato třída serinových proteáz sdílí běžnou aminokyselinovou sekvenci definující katalytickou triádu, která se odlišuje ód třídy serinových proteáz příbuzných chymotripsinu.

Subtiliziny a serinové proteázy příbuzné chymotrypsinu vykazují katalytickou triádu obsahující aspartát, histidin a serín, U proteáz příbuzných subtilizinu relativní pořadí těchto aminokyselin (čtou se od N-konce k C-konci) je aspartát-histidin-serin. U proteáz příbuzných chymotrypsinu je relativní pořadí histidin-aspartát-serin. Subtilizin zde vystupuje jako serinová proteáza vykazující katalytickou triádu proteáz příbuzných subtilizinu. Příklady zahrnují, ale nejsou omezeny na subtiliziny uvedené na obrázku č. 3. Číslování aminokyselin v proteázách odpovídá číslům přiřazených sekvencím subtilizinu mikroorganizmu Bacillus amyloliquefaciens přítomných na obrázku č, 1.

Termín „rekombinantní subtilizin“ nebo „rekombinantní proteáza“ znamená subtilizin, ve kterém sekvence DNA kódující subtilizin nebo proteázu je upravena tak, aby se produkovala varianta (nebo mutant) sekvence DNA, která kóduje substituci, deleci nebo inzerci jedné nebo více aminokyselin v přirozeně se vyskytující aminokyselinové sekvenci. Vhodné metody produkce takové úpravy jsou popsány v dokumentu patent US RE 34 606, patent US 5 204 01.5 a patent US 5 185 258, patent US 5 700 676, patent US 5 801 038 a patent US 5 763 257.

Termín „subtiliziny, které nepocházejí z člověka“ a DNA je kódující se mohou získat z mnoha prokaryontních a eukaryontních organizmů. Vhodné příklady prokaryontních organizmů zahrnují gram-negativní organizmy, jako je E. coli nebo Pseudomonas a gram pozitivní bakterie jako je Micrococcus nebo Bacillus. Příklady eukaryontních organizmů, ze kterých je možné získat subtilizin a jejich geny, mohou zahrnovat kvasinky, jako jsou Saccharomyces cerevisiae, houby jako je Aspergillus sp..

Termín „varianta proteázy“ má aminokyselinovou sekvenci, která se získala z aminokyselinové sekvence „prekurzorové proteázy“. Prekurzorové proteázy zahrnují přirozeně se vyskytující pro40 teázy a rekombinantní proteázy. Aminokyselinová sekvence varianty proteázy se „získala“ z aminokyselinové sekvence prekurzorové proteázy substitucí, deleci nebo inzercí jedné nebo více aminokyselin prekurzorové aminokyselinové sekvence. Taková modifikace je spíše modifikace „sekvence prekurzorové DNA“, která kóduje aminokyselinovou sekvenci prekurzorové proteázy, než úprava enzymy prekurzorové proteázy per se. Vhodné metody takových úprav prekurzorové sekvence DNA zahrnují zde popsané metody, stejně jako metody známé v oboru (popisuje se například v dokumentu EP 0 328 299, WO 39/06279 a v už uvedených US patentech a přihláškách).

Tyto čísla poloh aminokyselin odpovídají číslům označujícím sekvenci subtilizinu mikroorganiz50 mu Bacillus amyloliquefaciens, která je uvedena na obrázku č. 1, Vynález se neomezuje pouze na mutaci tohoto určitého subtilizinu, ale také zahrnuje prekurzorové proteázy, které obsahují aminokyselinové zbytky v polohách, které jsou „ekvivalentní“ s určitými identifikovanými zbytky v subtilizinu organizmu Bacillus amyloliquefaciens. V preferovaném provedení vynálezu prekurzorová proteáza je subtilizin organizmu Bacillus lentus a substituce se provádí v ekviva-5CZ 300347 B6 lentních polohách aminokyselinových zbytků v organizmu B. lentus, které odpovídají těm uvedeným shora v textu.

Poloha zbytku (aminokyseliny) prekurzorové proteázy je ekvivalentní zbytku subtilizinu mikro5 organizmu Bacillus amyloliquefaciens v případě, že je buď homologní (to znamená, že odpovídá poloze buď v primární nebo terciární struktuře), nebo analogická se specifickým zbytkem nebo částí uvedeného zbytku v subtilizinu organizmu Bacillus amyloliquefaciens (to znamená, že vykazuje stejnou nebo podobnou funkční kapacitu kombinovat, reagovat nebo chemicky interagovat).

Za účelem dosáhnout homoíogie s primární strukturou aminokyselinová sekvence prekurzorové proteázy se přímo porovnává s primární sekvencí subtilizinu a zvláště se sadou zbytků, kteréjsou známy, že jsou v subtilizinech se známou sekvencí neměnné. Například obrázek č. 2 znázorňuje konzervativní zbytky subtilizinu organizmu B. amyloliquefaciens a B. lentus. Po uspořádání konzervativních zbytků, což umožňuje nezbytné začlenění a delece za účelem udržet uspořádání (to znamená zabránit eliminaci konzervativních zbytků pomocí doplňkové delece a inzerce), se definují zbytky ekvivalentní pro určité aminokyseliny v primární sekvenci subtilizinu organizmu Bacillus amyloliquefaciens. Uspořádání konzervativních zbytků by mělo přednostně konzervovat 100 % takových zbytků. Avšak uspořádání vyšší než 75 nebo 50 % konzervativních zbytků je také adekvátní pro definování ekvivalentních zbytků. Měla by se udržovat konzervativnost katalytické triády Asp32/His64/Ser221. V publikaci Síezen et al., (1991) Protein Eng. 4(7): 719-737 se popisuje uspořádání velkého množství serinových proteáz. V této publikaci se také popisuje rozděleni subtiláz nebo serinových proteáz podobných subtilizinu do jednotlivých skupin.

Například na obrázku č. 3 jsou uspořádány aminokyselinové sekvence subtilizinu z mikroorganizmů Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus lichenoformis (carlsbergensis) a Becillus lentus, přičemž se stanoví maximální množství homoíogie mezi aminokyselinovými sekvencemi. Porovnání těchto sekvencí naznačuje, že v každé sekvenci existuje řada konzervativních zbytků. Tyto konzervativní zbytky (mezi BPN' a B. lentus) jsou uvedeny na obrázku č. 2.

Tyto konzervativní zbytky se tak mohou použít k definici odpovídajících ekvivalentních aminokyselinových zbytků subtilizinu mikroorganizmu Bacillus amyloliquefaciens v jiných subtilizinech, jako je subtilizin mikroorganizmu Bacillus lentus (popisuje se v přihlášce PCT WO 89/06279, zveřejněné 13. července 1989), který je preferovaným proteázovým prekurzoro35 vým enzymem nebo subtilizin popsaný jako PB92 (popsaný v dokumentu EP 0 328 299), který vykazuje vysokou homologii s preferovaným subtilizinem mikroorganizmu Bacillus lentus. Aminokyselinové sekvence jistého z těchto subtilizinu jsou uspořádány na obrázku č. 3 A a3B se sekvencí subtilizinu Bacillus amyloliquefaciens tak, aby se dosáhlo maximální homoíogie konzervativních zbytků. Jak je možné vidět, v sekvenci mikroorganizmu Bacillus lentus ve srovnání se subtilizinem Bacillus amyloliquefaciens existuje řada delecí. Tak například ekvivalentní aminokyselinou v případě Val 165 v subtilizinu Bacillus amyloliquefaciens u jiných subtilizinu mikroorganizmů je izoleucinB. lentus aB. licheniformis.

Termín „ekvivalentní zbytky“ se mohou také definovat stanovenou homologii prekurzorové pro45 teázy na úrovni terciární struktury, přičemž terciární struktura se stanovila krystalografií pomocí rentgenového záření. Ekvivalentní zbytky se definují jako ty, pro které atomové koordináty dvou nebo více hlavních řetězcových atomů určitého aminokyselinového zbytku prekurzorové proteázy a subtilizin mikroorganizmu Bacillus amyloliquefaciens (N na N, CA na CA, C na C a O na O) jsou 0,13 nm, přičemž se upřednostňuje, aby tyto atomové koordináty po uspořádání byly

0,1 nm. Uspořádání se dosáhne poté, co se zorientuje a umístí nejlepší model, přičemž dojde k maximálnímu přesahu atomových koordinát atomů vodíku proteinu proteázy vůči subtilizinu Bacillus amyloliquefaciens. Nejlepším modelem je krystalografický model vykazující nejnižší faktor R v případě experimentálních difrakčních dat při nejvyšším možném rozlišení.

-6CZ 300347 B6

Rfactor _llt\F₀(h)\

Ekvivalentní zbytky, které jsou funkčními analogy ke specifickému zbytku subtilizinu Bacillus amyloliquefaciens jsou definovány jako aminokyseliny prekurzorové proteázy, které mohou přizpůsobit konformací tak, že buď změní, nebo se podílejí definovaným způsobem na struktuře proteinu, navázání substrátu nebo katalýze a přiřazují se ke specifickému zbytku subtilizinu mikroorganizmu Bacillus amyloliquefaciens. Jsou to ty zbytky prekurzorové proteázy (jejichž terciární struktura se získala rentgenovou krystalografií), které obsazují analogickou polohu, ačkoli atomy hlavního řetězce daného zbytku nemohou uspokojit kriterium ekvivalence na zákla10 dě obsazení homologické polohy, přičemž atomové koordináty alespoň dvou atomů vedlejšího řetězce zbytku leží 0,13 nm od odpovídajících atomů vedlejšího řetězce subtilizinu mikroorganizmu Bacillus amyloliquefaciens. Koordináty trojrozměrné struktury subtilizinu mikroorganizmu Bacillus amyloliquefaciens jsou uvedeny v dokumentu přihláška EP 0 251 446 (ekvivalent patentu US 5 182 204) a může se použit ke stanovení ekvivalentních zbytků na úrovni terciární struk15 tury.

Některé z těchto zbytků určených pro substituci jsou konzervativní zbytky, zatímco ostatní nejsou konzervativní. V případě zbytků, které nejsou konzervativní, substituce jedné nebo více aminokyselin je limitována na substituci, která produkuje variantu, která vykazuje aminokyseli20 novou sekvencí, která neodpovídá sekvenci zjištěné v přírodě. V případě konzervativních zbytků výsledkem takových substitucí nebude přirozeně se vyskytující sekvence. Varianty proteáz podle vynálezu zahrnují zralé formy variant proteáz, stejně jako pro-formy a prepro-formy takových variant proteáz. Prepro-formy jsou preferované konstrukce, protože umožňují expresi, sekreci variant proteáz. Termín „pro-sekvence“ znamená sekvence aminokyselin vázaných na N-termi25 nální část zralé formy proteázy, která když se odstraní vede k objevení „zralé“ formy proteázy. Rada proteolytických enzymů se nachází v přírodě jako translační proenzymové produkty a v nepřítomnosti post-translačního zpracování se exprimují tímto způsobem. Preferované prosekvence produkující varianty proteáz jsou předpokládané pro-sekvence subtilizinu mikroorganizmu Bacillus amyloliquefaciens, ačkoli se mohou použít jiné proteázové pro-sekvence.

Termín „signální sekvence“ nebo „presekvence“ znamenají libovolnou sekvenci aminokyselin vázaných na N-terminální části proteázy nebo N-terminální části pro-proteázy, která se může podílet na sekreci zralé formy nebo pro-formy proteázy. Tato definice signální sekvence je funkční, jestliže zahrnuje všechny uvedené aminokyselinové sekvence kódované N-terminální částí genu proteázy, která se podílí na uskutečnění sekrece proteázy za nativních podmínek. Vynález popisuje takové sekvence, které se používají pro ovlivnění sekrece zde definovaných variant proteáz. Jedna možná signální sekvence obsahuje prvních sedm aminokyselinových zbytků signální sekvence, které pochází ze subtilizinu Bacillus subtillis fúzovaného se zbytkem signální sekvence subtilizinu z mikroorganizmu Bacillus lenlus (ATCC 21536).

Termín „prepro-,, forma varianty proteázy zahrnuje zralou formu proteázy obsahující prosekvenci operativně spojenou s aminokoncem proteáz a s pre-sekvencí nebo se signální sekvenci operativně spojenou s amino-koncem prosekvence.

Termín „expresivní vektor“ znamená konstrukci DNA obsahující sekvenci DNA, která je operativně spojená s vhodnou kontrolní sekvencí schopnou ovlivnit expresi uvedené DNA ve vhodném hostiteli. Takové kontrolní sekvence zahrnují promotor, který ovlivňuje transkripci, operátorovou sekvenci, která řídí takovou transkripci, sekvence kódující vhodná ribosom vazebná místa na mRNA a sekvence, které řídí ukončení transkripce a translace. Vektorem může být plazmid, fágové částice nebo jednoduše potencionální inzert v genomu. Poté, co je vhodný hostitel transformován, vektor se může replikovat a funguje nezávisle na genomu hostitele nebo se může v některých případech sám začlenit do genomu hostitele. Ό některých specifikací termín „plaz-7CZ 300347 B6 mid“ a „vektor“ jsou vnitřně zaměnitelné, přičemž plazmid je nejběžněji užívanou formou vektoru, Vynález dále popisuje také jiné formy expresívních vektorů, které vykazují ekvivalentní funkce a stávají se dobře známy v oboru,

Termín „hostitelská buňka“ podle vynálezu je v obecném případě prokaryontní nebo eukaryontní hostitel, který se přednostně upravuje metodami popsanými v patentu US RE 34 606 tak, aby nebyl schopen vylučovat enzymaticky aktivní endoproteázy. Preferovaná hostitelská buňka pro expresi proteázy je mikroorganizmus Bacillus kmen BG2036, který je nedostatečný v případě enzymaticky aktivní neutrální proteázy a alkalické proteázy (subtilizinu). Konstrukce kmene io BG2036 se popisuje v patentu US 5 264 366, Jiné hostitelské buňky vhodné pro expresi proteázy zahrnují Bacillus subtilis 168 (popisuje se v publikaci patent US 34 606 a patent US 5 264 366) stejně jako vhodný kmen mikroorganizmu Bacillus, jako je B. licheniformis, B. lentus atd.

Hostitelské buňky se transformovaly nebo transfekovaly vektory konstruovanými za použití metod rekombinace DNA. Takové transformované hostitelské buňky jsou schopny replikovat vektory kódující varianty proteáz nebo exprimovat požadovanou variantu proteáz. V případě vektorů, které kódují pre- nebo prepro-formu varianty proteázy, se pak tyto varianty v typickém případě vylučují z hostitelské buňky do média hostitelské buňky.

Termín „operativně spojený“ znamená vztah mezi dvěma oblastmi DNA. Jednoduše znamená, že jsou vzájemně funkčně příbuzné. Například pre-sekvence je operativně spojená s peptidem, jestliže funguje jako signální sekvence, která se podílí na vylučováni zralé formy proteinu, přičemž nej pravděpodobněji zahrnuje štěpení signální sekvence. Promotor je operativně spojen s kódující sekvencí, jestliže řídí transkripci sekvence. Vazebné místo ribozómu je operativně spojeno s kódující sekvencí, jestliže je umístěno tak, že umožňuje translaci.

Geny kódující přirozeně se vyskytující prekurzorovou proteázu se mohou získat pomocí obecných metod, které jsou známy v oboru. Metody v obecném případě, obsahují syntézu značených sond, které vykazují předpokládané sekvence kódující oblasti proteázy, přípravu genomových knihoven genu hybridizací se sondami. Pozitivně hybridizující klony se pak mapují a sekvenují.

+

Klonované proteázy se pak používají pro transformaci hostitelské buňky za účelem exprese proteázy. Gen proteázy se pak liguje do plazmidu s vysokým počtem kopií. Tento plazmid se replikuje v hostitelech ve smyslu, že obsahuje dobře známé elementy nezbytné pro plazmidovou repli35 kácí¹, promotor je operativně spojený s genem (který se může začlenit jako vlastní homologní promotor genu, jestliže je rozeznán, to znamená transkribován hostitelem), ukončení transkripce a polyadenylační oblast (nezbytnou pro stabilitu mRNA transkribovanou hostitelem z genu proteázy v jistých buňkách eukaryontního hostitele); která je exogenní nebo se dodává endogenní terminační oblastí genu proteázy a je—Ii to nutné, zahrnuje selekční gen, jako je gen nesoucí rezistenci na antibiotika, který umožňuje kontinuální kultivaci buněk hostitele infikovaných plazmidem růstem v médiu, které obsahuje antibiotika. Plazmidy s vysokým počtem kopií také obsahují počátek replikace, který je pro hostitele vhodný. Plazmidy s vysokým počtem kopií také obsahují počátek replikace, což umožňuje vytvořit velké množství plazmidu v cytoplazmě bez omezení chromozomu. Avšak vynález také popisuje začlenění více kopií genu proteázy do hostí45 telského genomu. To umožňují prokaryontní a eukaryontní organizmy, které jsou zvláště náchylné k homologní rekombinaci.

Gen může být přirozený gen organizmu B. lentus. V jiném případě je možné produkovat syntetický gen kódující přirozeně se vyskytující nebo mutantní prekurzorovou proteázu. V takovém případě je možné stanovit sekvenci DNA a/nebo aminokyselinovou sekvenci prekurzorové proteázy. Syntetizovalo se několik přesahujících syntetických jednořetezcových fragmentů DNA, které po hybridizací a ligaci produkují syntetickou DNA kódující prekurzorovou proteázu. Příklad syntetické genové konstrukce se uvádí v příkladu 3 patentu US 5 204 015.

-8CZ 3UU347 Bó

Klonoval se přirozeně se vyskytující nebo syntetický gen prekurzorové proteázy. Provedla se řada modifikací, aby se zvýšila možnost použití genu při syntéze přirozeně se vyskytující prekurzorové proteázy. Takové modifikace zahrnují produkci rekombinantních proteáz, jak se popisuje v publikaci patentu US RE 34 606 a přihlášce EP 0 251 446, a produkci zde popsaných variant proteáz.

Následující způsob kazetové mutageneze se může použít pro konstrukci variant proteáz podle vynálezu, ačkoli se mohou použít i jiné metody. Nejdříve se získá přirozeně se vyskytující gen kódující proteázu a celý nebo jeho část se sekvenuje. Pak se v sekvenci hledá bod, ve kterém je nutné provést mutaci (deleci, inzerci nebo substituci) jedné nebo více aminokyselin v kódovaném enzymu. V sekvenci, která sousedí s tímto bodem se hodnotila přítomnost restrikčních míst vhodných pro nahrazení krátkého segmentu genu s oligonukleotidy, které v případě, že se exprimují budou kódovat různé mutanty. Upřednostňuje se, aby taková restrikční místa byla jediná restrikční místa v proteázovém genu, což umožňuje nahrazení segmentu genu. Může se však použít libo15 volné restrikční místo, které se v genu proteázy neopakuje, přičemž štěpením restrikčními enzymy mohou vznikat genové fragmenty, které se sestaví do správné sekvence. Jestliže restrikční místa nejsou v polohách s vhodnou vzdáleností od vybraného bodu (10 až 15 nukleotidů), pak se taková místa vytvoří substitucí nukleotidů v genu takovým způsobem, že se v konečné konstrukci změní čtecí rámec nebo kódované aminokyseliny. Extenzí primeru M13 podle obecně známých metod se provedla mutace genu za účelem změny sekvence.

Jestliže jednou dojde ke klonováni přirozeně se vyskytující DNA nebo syntetické DNA, pak restrikční místa lemující místa, kde se provede mutace, se štěpí restrikčními enzymy a do genu se liguje pluralita oíigonukleotidových kazet s komplementárním koncem. Tímto způsobem se zjed25 noduší mutageneze, protože všechny oligonukleotidy se syntetizovaly tak, aby měly stejná restrikční místa a pro vznik restrikčních míst jsou nezbytné syntetické linkeiy.

Proteolytická aktivita se definuje jako rychlost hydrolýzy peptidových vazeb na miligram aktivního enzymu. Za účelem měření proteolytieké aktivity existuje řada známých postupů (popisuje se v publikaci K. M. Kalisz, „Microbial Proteinases,“ Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, A. Fiechter ed., 1988). Vedle upravené proteolytieké aktivity řada enzymů podle vynálezu může mít jiné upravené vlastnosti, jako je poměr k_m, k^,, k-jK™ a/nebo upravenou specifítu substrátu a/nebo upravený profil aktivity v závislosti na pH. Tyto enzymy se mohou upravit pro určitý substrát, který předchází přípravě peptidu neboje přítomen při hydrolytickém zpracování, jako je použití při praní prádla.

Podstatu vynálezu tvoří způsob zvýšení účinnosti subtilizinu v systému s nízkým obsahem detergentu, obsahujícím méně než 800 ppm složek detergentu v prací vodě, postup spočívá v tom, že se

a) nahradí zbytek aminokyseliny v jedné nebo větším počtu poloh v prekurzorů subtilizinu za vzniku varianty subtilizinu, kde substituce mění náboj v této poloze, přičemž náboj se stává více negativním nebo méně pozitivním ve srovnání s prekurzorem a

b) varianta se testuje na účinnost v systému s nízkým obsahem detergentu, který obsahuje méně než 800 ppm složek detergentu v prací vodě a účinnost se srovnává s účinností prekurzorů, pokud jde o odstranění skvrn.

Zjistilo se, že varianty proteáz obsahující substituce aminokyselin v jedné nebo více poloh zbytků tak, že substituce mění náboj v poloze tak, že se stává více negativní nebo méně pozitivní ve srovnání s prekurzorovou proteázou, jsou účinnější pří nižší koncentraci detergentu než prekurzorová proteáza, . Zjistilo se, že varianty proteáz obsahující substituce aminokyselin v jedné nebo ve více polohách zbytku tak, že substituce mění náboj v této poloze, přičemž náboj se stává více pozitivní nebo

-9CZ 30U347 Bó méně negativní ve srovnání s prekurzorovou proteázou, jsou účinnější při vysokých koncentracích detergentu ve srovnání s prekurzorovou proteázou.

Zjistilo se, že řada variant proteáz jsou použitelné v systému nízkých koncentracích detergentu a/nebo v systémech s vysokými koncentracemi detergentu; také jsou účinné v systému střední koncentrace detergentu.

Tyto substituce se přednostně provádí u subtilizinu organizmu Bacillus lentus (rekombinantní nebo přirozený typ), ačkoli se substituce mohou provést v libovolné proteáze organizmu Bacillus, io upřednostňuje se subtilizin organizmu Bacillus.

Na základě výsledků získaných s rozdílnými proteázami, uvedené mutace v subtilizinu organizmu Bacillus amyloliquefaciens jsou důležité při proteolytické aktivitě a/nebo stabilitě těchto enzymů a při čištění nebo promývání takových enzymů.

Řada proteázových variant podle vynálezu je použitelná při vytváření různých kompozic detergentu nebo formulaci osobní potřeby, jakó jsou šampony nebo pleťová voda. Řada známých látek jsou vhodná povrchově aktivní činidla, která se používají v kompozicích obsahujících mutanty proteáz podle vynálezu. Tyto látky zahrnují neiontové, aniontové, kationtové nebo obojetné detergenty, jak se popisuje v dokumentu US 4 404 128 (Barry a Anderson) a US 4 261 868 (Jiri Flora, et al.,). Vhodná detergentová formulace se popisuje v příkladu 7 patentu US 5 204 015. V oboru jsou známy různé formulace, které se používají jako čisticí kompozice. Vedle typických čisticích kompozic se pro libovolný účel, kde se používá přirozená proteáza nebo proteáza divokého typu, je možné použít varianty proteáz podle vynálezu. Tyto varianty se mohou použít například při aplikacích kusového nebo kapalného mýdla, při aplikaci prostředků na nádobí, čisticích roztoků pro kontaktní čočky, produktů hydrolýzy peptidu, při zpracování odpadů, aplikací na textilie, jako enzymy štěpící fúzi při produkci proteinů. Varianty podle vynálezu mohou vykazovat zvýšenou účinnost detergentové kompozice (ve srovnání s prekurzorem). Zvýšená účinnost detergentu se definuje jako zesílení schopnosti čistit skvrny citlivé vůči jistému enzymu, jako jsou skvrny od trávy a krve, jak se definuje obvyklým hodnocením po standardním cyklu praní.

Proteázy podle vynálezu se mohou vnést do práškových nebo kapalných detergentu, jejichž pH je mezi 6,5 a 12,0 s procentovým zastoupením přibližně 0,01 až 5% hmot. (upřednostňuje se 0,1 až 0,5 %). Tyto detergentové čisticí kompozice mohou také zahrnovat jiné enzymy, jako jsou proteázy, amylázy, celulázy, lipázy nebo endoglykolázy stejně jako plnidla nebo stabilizéry.

Vedle proteáz podle vynálezu neexistuje žádné specifické využití běžných čisticích prostředků. Jinými slovy libovolná teplota a pH vhodné pro detergent je také vhodný pro uvedenou kompozici, pokud pH je ve shora uvedeném rozmezí a teplota je nižší než teplota denaturující proteázy.

Proteázy podle vynálezu se mohou použít jako čisticí kompozice bez. detergentu buď samotné, nebo v kombinaci s plnidly a stabilizéry.

Vynález také popisuje čisticí kompozice obsahující proteázové varianty podle vynálezu. Čisticí kompozice mohou dále obsahovat aditiva, která se v těchto čisticích kompozicích běžně používa45 jí. Tyto aditiva se mohou vybrat, ale nejsou omezena, na bělidla, povrchově aktivní činidla, plnidla, enzymy a bělici katalytická činidla. V oboru je známo, že aditiva jsou vhodná pro inkluzi do kompozic. Zde uvedený seznam není vyčerpávající a je nutné ho brát jako příklady vhodných aditiv, V oboru je také známo, že je možné používat pouze ty aditiva, která jsou kompatibilní s enzymy a jinými komponenty v kompozici, jako je například povrchově aktivní činidlo.

Množství aditiva, které je přítomno v čisticí kompozici je přibližně 0,01 až 99,9 %, upřednostňuje se přibližně 1 až 95 %, více se upřednostňuje 1 až 80 %.

Proteázové varianty podle vynálezu se mohou přidat do zvířecího krmení, jak se popisuje v doku55 mentu US 5 612 055, US 5 314 692 a US 5 147 642.

-10CZ 30U347 B6

Dále vynález popisuje kompozici pro ošetření textilu, které zahrnují proteázové varianty podle vynálezu. Kompozice se může použít při ošetření například hedvábí nebo vlny, jak se popisuje v dokumentech RD 216 034, EP 134 267, US 4 533 359 a EP 344 259.

Přehled obrázků na výkresech

Na obrázku č. 1 A až C je znázorněna sekvence DNA a aminokyselinová sekvence subtilizínu io , mikroorganizmu Bacillus amyloliquefaciens a částečná restrikční mapa tohoto genu.

Na obrázku, č. 2 jsou znázorněny konzervativní aminokyselinové zbytky subtilizinů mikroorganizmů Bacillus amyloliquefaciens (BPN)' & Bacillus lentus (divoký typ).

Na obrázcích 3Aaž3B je znázorněna aminokyselinová sekvence čtyř subtilizinů. Horní řádek reprezentuje aminokyselinovou sekvenci subtilizinů z mikroorganizmu Bacillus amyloliquefaciens (také se někdy nazývá jako subtilizin BPN'). Druhý řádek znázorňuje aminokyselinovou sekvenci subtilizinů z mikroorganizmu Bacillus subtilis. Třetí řádek znázorňuje aminokyselinovou sekvenci subtilizinů z mikroorganizmu B. licheniformis. Čtvrtý řádek znázorňuje aminokyse20 línovou sekvenci subtilizinů z mikroorganizmu Bacillus lentus (který se v dokumentu PCT WO 89/06276 nazývá subtilizin 309). Symbol *.znázorňuje nepřítomnost specifických aminokyselinových zbytků ve srovnání se subtilízinem BPN'.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 * Produkovalo se a čistilo se velké množství variant proteáz za použití metod dobře známých v oboru. Všechny mutace se provedly v subtilizinů organizmu Bacillus lentus GG36.

Produkované proteázové varianty se testovaly u dvou typů detergentu a při dvou typech promývání za použití testu popsaných v publikaci „An improved method of assaying for a preferred enzyme and/or preffered detergent composition,“ US Seriál No. 60/068 796.

V tabulce 1 až 13 se uvádějí testované proteázy a výsledky testů ve dvou různých detergentech. Všechny hodnoty jsou dány jako porovnání s- první proteázou uvedenou v tabulce (to znamená, že hodnota 1,32 ukazuje schopnost uvolnit 132 % barviva v porovnání se 100 % první varianty uvedené v tabulce).

Sloupec A ukazuje rozdíly v náboji variant. V případě sloupce B detergentem byl 0,67 g/l filtrovaného Ariel Ultra (Procter and Gamble, Cincinnati, OH, USA) v roztoku, který obsahuje 3 zrna na 3,785 I míchaného Ca2+/Mg2+. V každé prohlubni se použilo 0,3 ppm enzymu při teplotě

25 °C (systém s nízkou koncentrací detergentu). V odstavci C detergentem byl 3,38 g/l filtrovaného Ariel Futur (Procter and Gamble, Cincinnati, OH, USA) v roztoku obsahujícím 15 zrn v 3,785 I směsi Ca2+/Mg2+ a v každé prohlubni se použilo 0,3 ppm enzymu při teplotě 40 °C (systém s vysokou koncentraci detergentu).

- 11 CZ 300347 B6

Tabulka č. 1

i 1				A \| B	c
N76D \| S1O3A	V1O4I:	Q1O9.R		i 1.00	1.00
].N76D \| S103A	V104Í.	Q1O9R	Q245R	r +1 0.48	1.41

s

Tabulka č. 2

					.i...		A	B	c
V68A	N75D	S103A	< O £	G159D	Q236H.JG248R			1,00	1.00
V68A	N76D-	S103A	< o -h.	G159O	N204D \|C235H 1'	Q2-45R	-1	1.11	0.03

io

Tabulka č. 3

					' ! A I 1	B	C
V68A	N76D	S103A	V104I		!	1.C0	1.00
T22K	V68A	N76D	S103A	V104I	ί ⁺i	0.74	1.85

Tabulka č. 4

						A	B	C
N76D	S103A	V1041	M222S				1.00	1.00
N76D	S103A	V104I	N173R	M222S		0	0.66	1.84
Q12R	N76D	Š103A	V104I	M222S	Q245R	+ 1	0.41	5.84

Tabulka č. 5

A

B

C

Q12R

N76D

S103A

I104T

S130T

M222S

Q245R

1.00

Q12R

N76D

S103A

I104T

S130T

M222S

Q245R

N261O

-1

1.79

0.81

Q12R

N76D

S103A

I104T

S130T

R170S

N185D

M222S

N243D

Q245R

-3

2,87

0.02

- 12CZ 3UU347 B6

Tabulka č. 6

A

B

C

V68A

W76D

S1O3A

V1O4I

G159O

Q236H

1.00

V68A

N76D

S103A

V1O4I

G159D

Q236H

Q245R

+1

0.94

6.80

V68A

S103A

V104I

GÍ59D

A232V

Q236H

Q245R

N252K

+3

0.44

20.60

Tabulka č. 7

-

A

B

' C

V68A

N76D

S103A

V104I

G159D

A232V

Q236H

Q245R

T00

1.00

V68A

N76D

S103A

V1041

G159D

P210R

A232V

Q236H

Q245FL

+ 1

0.44

2.66

Tabulka Č. 8

A

B

C

V68Á

S103A

V104I

G159D

A232V

Q236H

Q245R

N252K

1.00

V68A

S103A

V104I

G159D

A232V

Q236H

Q245R

N248D

N252K

-1

1.96

0;65

Tabulka č. 9

					I		A	5	C
V68A	S103A	V104I	G159D	A232V	Q236H G245R			1,00	1.00
V68A	S103A	V1Ó4I	. G159D	A232V	Q236H K237E	Q245R	2	1.27.	0.12

Tabulka č. 10

A

B

C i

V68A

S103A

V104)

G159D

A232V

Q236H

Q24SR

L257V

1.00

1.00 j

V68A

N76D

S103A

V104Í

G159D

A232V

Q236H

Q245R

L257V

-1

1.56

0.48

Tabulka č. 11

A

B

C

S103A

V104I

G159D

A232V

Q236H

G245R

Ň248D

N252K

1.00

S103A

V104I

G159D:

L217E

A232V

Q236H

Q245R

N248D

N252K

-1

1,90

0.15

- 13CZ 3U0347 B6

Tabulka č. 12

A

B

C

S103A

V1041

S1Q1G

G159D

A232V

G236H

G24SR

N248D

N252K

1.00

i.oo

N76D

S103A

V1Ó4I

S101G

G159D

A232V

Q236H

Q245R

N248D

N252K

-1

1=28

0,39

Tabulka č. 13

A

B

C

N62O

S103A

V1041

G159D

T213R

A232V

Q236H

G245R

N248D

N252K

1,00

N62D

S103A

V104I

Q109R

G159D

T213R

A232V

Q236H

Q245R

N248D

N252K

+ 1

0.40

1.74

Příklad 2

Následující varianty proteáz se připravily a testovaly, jak se popisuje v příkladu 1.

Varianty v tabulce ě. 14 jsou varianty proteáz, které vykazují oba typy substitucí; ty, které mění náboj v uvedené poloze, přičemž se zde mění náboj tak, že je více negativní nebo méně negativní ve srovnání s organizmem B. lentus GG36 stejně jako neutrální substituce, které neovlivňují náboj v dané poloze zbytku. Tak se produkují proteázové varianty, jejíž účinnost je lepší než standardní účinnost v obou systémech detergentových koncentrací, jak v systému s nízkou koncentrací detergentu (sloupec A, 0,67 g/1 filtrovaného Ariel Ultra (Procter and Gamble, Cincinnati, OH, USA), což je roztok, který obsahuje 3 zrna na 3,785 I míchaného Ca2+/Mg2+ a v každé prohlubni se použilo 0,3 ppm enzymu při teplotě 25 °C, tak v systému s vysokou koncentraci detergentu (sloupec B, 3,38 g/1 filtrovaného Ariel/Futur (Procter and Gamble, Cincinnati, OH,

USA) v roztoku, který obsahuje 15 zrn na 3,785 I míchaného Ca2+/Mg2+ a v každé prohlubni se použilo 0,3 ppm enzymu při teplotě 40 °C),

-14CZ 5U0347 B6

Tabulka č. 14

A

B

N76D

S103A

V1041

1.00

V68A

S103A

V1041

G159D

A232V

Q236H

Q245R

N252K

1.41

1.85

V68A

N76D

S103A

V104I

G159D

T213R

A232V

Q236H

Q245R

T260A

1.30

1.73

V68A

S103A

V104I

G159D

A232V

G236H

Q245R

N248D

N252K

2.77

1,20

V68A

S103A

Λ/104Ι

N140D

G159D

A232V

Q236H

Q245R

N252K

2.96

1.42

N43K

V68A.

S103A

V104I.

G159D

A232V

Q23BH

Q245R

2.05

1.78

N43D

V68A

S103A

V1O4I

G159D

A232V

Q236H

Q245R

N252K

2.00

1.34

V68A

N76D

S103A

V1041

G1S9D

A215R

A232V

Q236H

Q245R

1.67

1.45

Q12R

V68A

N76D

S103A

V1041

G159D

A232V

Q236H^:

Q245R

2.16

1,72

N76D

S103A

V104I

V147I

G159D

A232V

Q236H

Q245R

N248S

K251R

1.35

1.29

V68A

N76D

S103A

V104I

G159D

'A232V

Q236H

Q245R

S256R

2.01

1.72

V68A

N76D

S103A

V1Ό4Ι

G159D

Q206R

A232V

Q236H

Q245R

2.09

1.62

S103A

V104I

G159D

A232V

Q236H

Q245R

N248D

N252K

1.44

1.41

G20R

V68A

S103A

V104I

G159D

A232V

Q236H

Q245R.

N248D

N252K

1.81

1.72

V68A

S103A

V104Í

G159D

A232V

Q236H

Q245R

N248D

N252K

L257R

1.51

1.41

V68A

S103A

V1041

A232V

Q236H

Q245R

N248D

N252K

1.04

1.50

N76D

S103A

V104I

G159D

A232V

Q236H

Q245R

L257V

1.92

1,09

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob zvýšení účinnosti subtilizinu v systému s nízkým obsahem detergentu, obsahujícím méně než 800 ppm složek detergentu v prací vodě, vyznačující se tím, že se

15 a) nahradí zbytek aminokyseliny v jedné nebo větším-počtu polok v prekurzoru subtilizinu za vzniku varianty subtilizinu, kde substituce mění náboj v této poloze, přičemž náboj se stává více negativním nebo méně pozitivním ve srovnání s prekurzorem a

b) varianta se testuje na účinnost v systému s nízkým obsahem detergentu, který obsahuje méně

20 než 800 ppm složek detergentu v prací vodě a účinnost se srovnává s účinností prekurzoru, pokud jde o odstranění skvrn.

2. Způsob zvýšení účinnosti subtilizinu v systému s vysokou koncentrací detergentu, obsahujícím více než 2000 ppm složek detergentu v prací vodě, vyznačující se t í m, že se

a) nahradí zbytek aminokyseliny v jedné nebo větším počtu poloh v prekurzoru subtilizinu za vzniku varianty subtilizinu, kde substituce mění náboj v této poloze, přičemž náboj se stává méně negativním nebo více pozitivním ve srovnání s prekurzorem a

30 b) varianta se testuje na účinnost v systému s vysokým obsahem detergentu, který obsahuje více než 2000 ppm složek detergentu v prací vodě a účinnost se srovnává s účinností prekurzoru, pokud jde o odstranění skvrn.

-15CZ 300347 B6

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že prekurzorem je subtilizin organismu Bacillus.

5

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že prekurzorem je subtilizin z Bacillus lentus.

5. Způsob výroby pracího prostředku, vyznačující se tím, že se zvýší účinnost subtilizinu způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 a získaná varianta subtilizinu se zpracuje na io prací prostředek ve formě prášku nebo kapalíny o pH v rozmezí 6,5 až 12,0 při koncentraci

0,1 až 5 % hmotnostních.