TW201410699A - 歐貝提膽酸之製造與用途 - Google Patents

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Abstract

本發明關於歐貝提膽酸：□或其醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物。該歐貝提膽酸有用於治療或預防FXR調介之疾病或病況、心血管疾病或膽汁瘀積性肝病，及用於減低HDL膽固醇、降低哺乳類中的三酸甘油酯、或抑制纖維變性。本發明亦關於該歐貝提膽酸之合成方法。

Description

歐貝提膽酸之製造與用途
本發明關於歐貝提膽酸，FXR之激動劑，歐貝提膽酸之製造方法，包含歐貝提膽酸之醫藥調配物，及其治療用途。
歐貝提膽酸為具有以下化學結構之醫藥活性成分(亦稱為INT-747)：
歐貝提膽酸的製造係揭示在美國公開案號 2009/0062526 A1(在本文稱為“‘526公開案”)、美國專利案號7,138,390(在本文稱為“‘390專利”)及WO 2006/122977(在本文稱為“‘977公開案”)。
本發明關於結晶狀歐貝提膽酸型式C，其係以包括在約4.2、6.4、9.5、12.5和16.7度2-θ之特徵峰的X-射線繞射圖案為特徵。結晶狀歐貝提膽酸型式C係以實質上類似於圖5中所示之X-射線繞射圖案為特徵及進一步以具有在約98±2℃之吸熱值的微差掃描熱量法(DSC)溫度記錄圖為特徵。
本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸；將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸；及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與NaOH反應，以形成E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸；將E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸；將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸(chol-6-en-24-oic acid)甲酯與CH3CHO反應，以形成E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯；將E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與NaOH反應，以形成E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸；將E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸；將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與Li[N(CH(CH3)2)2]及Si(CH3)3Cl反應，以形成3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯；將3α,7-二-三甲基 矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯與CH3CHO反應，以形成E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯；將E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與NaOH反應，以形成E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸；將E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸；將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與CH3OH及H2SO4反應，以形成3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯；將3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與Li[N(CH(CH3)2)2]及Si(CH3)3Cl反應，以形成3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯；將3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯與CH3CHO反應，以形成E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯；將E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與NaOH反應，以形成E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸；將E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸；將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其中結晶狀歐貝提膽酸型式C轉化成歐貝提膽酸型式1包含以下步驟：將結晶狀歐貝提膽酸型式C溶解在NaOH水溶液中及添加HCl。
本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其中形成結晶狀歐貝提膽酸的3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與NaBH4之反應係在約85℃至約110℃之溫度在鹼性水溶液中進行。
本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其中形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸的E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與Pd/C及氫氣之反應係在約100℃至約105℃之溫度及在約4至約5巴之壓力下進行。
本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其中形成E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸的E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與NaOH之反應係在約20℃至約60℃之溫度進行。
本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其中形成E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯的3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯與CH3CHO之反應係在極性非質子性溶劑中，在約-50℃至約-70℃之溫度，在BF3的存在下進行。
本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其中形成3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯的 3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與Li[N(CH(CH3)2)2]及Si(CH3)3Cl之反應係在極性非質子性溶劑中在約-10℃至約-30℃之溫度進行。
本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其中將形成3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯的3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與CH3OH及H2SO4之反應加熱約3小時且將反應混合物的pH以鹼性水溶液調整至約6.5至約8.0之pH值。
本發明關於一種歐貝提膽酸，或其醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物，其具有大於約98%，大於約98.5%，大於約99.0%或大於約99.5%之效力。本發明關於一種醫藥組成物，其包含以本發明方法所製造之歐貝提膽酸型式1及醫藥上可接受之載劑。
本發明關於一種治療或預防受驗者中的FXR調介之疾病或病況的方法，其包含投予有效量的歐貝提膽酸型式1。疾病或病況係選自膽管閉鎖、膽汁瘀積性肝病、慢性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、C型肝炎感染、酒精性肝病、原發性膽汁性肝硬化(PBC)、由於進行性纖維變性、肝纖維變性和心血管疾病(包括動脈粥樣硬化、動脈硬化症、高膽固醇血症和高血脂症)的肝功能損害。本發明關於一種降低受驗者中的三酸甘油酯之方法，其包含投予有效量的歐貝提膽酸型式1。
圖1為實施例1之步驟4的粗製化合物5以1毫克/毫升注入3微升注入體積的HPLC-UV/MS層析圖。層析圖係根據實施例2中所述之方法獲得。
圖2為實施例1之步驟4的化合物5(純化之參考物)以1毫克/毫升注入20微升注入體積的HPLC-UV/MS層析圖。層析圖係根據實施例2中所述之方法獲得。
圖3為實施例1之步驟4的粗製化合物5使用HPLC方法的UV層析圖。層析圖係根據實施例2中所述之方法獲得。
圖4A為純粹以HPLC方法分離的實施例1之步驟4的化合物5之主要波峰沖提份(RT 29.0分鐘)的m/z 850.61914±3ppm之精確的離子軌跡(參閱實施例2)。
圖4B為純粹以HPLC方法分離的實施例1之步驟4的化合物5之次要波峰沖提份(RT 29.9分鐘)的m/z 850.61914±3ppm之精確的離子軌跡(參閱實施例2)。
圖4C為實施例1之步驟4的粗製化合物5的m/z 850.61914±3ppm之精確的離子軌跡(參閱實施例2)。
圖4D為實施例1之步驟4的化合物5(純化之參考物)的m/z 850.61914±3ppm之精確的離子軌跡(參閱實施例2)。
圖5為結晶狀歐貝提膽酸型式C的XRPD繞射圖(參 閱實施例3)。
圖6顯示結晶狀歐貝提膽酸型式C的TGA和DSC溫度記錄圖(參閱實施例3)。
圖7顯示結晶狀歐貝提膽酸在25℃、110℃和120℃的VT-XRPD繞射圖(參閱實施例3)。
圖8A為結晶狀歐貝提膽酸型式C的GVS等溫線圖(參閱實施例3)。
圖8B為結晶狀歐貝提膽酸型式C的GVS動力圖(參閱實施例3)。
圖8C顯示結晶狀歐貝提膽酸型式C在GVS分析前和後的XRPD繞射圖(參閱實施例3)。
圖9顯示結晶狀歐貝提膽酸型式C在40℃/75% RH下貯存前和後的XRPD繞射圖(參閱實施例3)。
圖10為批號1之歐貝提膽酸型式1的XRPD繞射圖(參閱實施例5)。
圖11顯示批號1、2、3、4、5和6之歐貝提膽酸型式1的XRPD繞射圖(參閱實施例5)。
圖12為批號1之歐貝提膽酸型式1在d6-DMSO中的NMR光譜(參閱實施例5)。
圖13顯示批號1、2、3、4、5和6之歐貝提膽酸型式1的1H NMR光譜(參閱實施例5)。
圖14為擴展歐貝提膽酸型式1從10-75ppm區域之13C DEPTQ NMR光譜(參閱實施例5)。
圖15為擴展歐貝提膽酸型式1從10-75ppm區域之 13C DEPT135 NMR光譜，其隱藏四級碳(參閱實施例5)。
圖16為歐貝提膽酸型式1的定量性13C NMR(參閱實施例5)。
圖17為圖16的32.3ppm之波峰的擴展圖(參閱實施例5)。
圖18為批號1之歐貝提膽酸型式1的FT-IR光譜(參閱實施例5)。
圖19顯示批號1之歐貝提膽酸型式1的TGA和DSC溫度記錄圖(參閱實施例5)。
圖20顯示批號1之歐貝提膽酸型式1的可調式DSC溫度記錄圖(參閱實施例5)。
圖21顯示批號1、2、3、4、5和6之歐貝提膽酸型式1的TGA軌跡(參閱實施例5)。
圖22顯示批號1、2、3、4、5和6之歐貝提膽酸型式1的DSC軌跡(參閱實施例5)。
圖23A為批號1之歐貝提膽酸型式1在偏振光顯微鏡下的圖形。圖23B為批號2之歐貝提膽酸型式1在偏振光顯微鏡下的圖形。圖23C為批號3之歐貝提膽酸型式1在偏振光顯微鏡下的圖形。圖23D為批號4之歐貝提膽酸型式1在偏振光顯微鏡下的圖形。圖23E為批號5之歐貝提膽酸型式1在偏振光顯微鏡下的圖形。圖23F為批號6之歐貝提膽酸型式1在偏振光顯微鏡下的圖形。
圖24顯示批號1之歐貝提膽酸型式1的GVS等溫線 圖(參閱實施例5).
圖25顯示批號1之歐貝提膽酸型式1的GVS動力圖(參閱實施例5)。
圖26顯示批號1之歐貝提膽酸型式1在GVS前和後的XRPD繞射圖(參閱實施例5)。
圖27為歐貝提膽酸型式1以三種不同比值之甲醇/水的pKa測量曲線圖(參閱實施例5)。
圖28為歐貝提膽酸型式1的Yasuda-Shedlovsky圖(參閱實施例5)。
圖29為顯示取決於歐貝提膽酸型式1的pH之種類分布的曲線圖(參閱實施例5)。
圖30為顯示以歐貝提膽酸型式1的電位法所獲得之差異曲線的曲線圖(參閱實施例5)。
圖31顯示歐貝提膽酸型式1的親脂性輪廓(參閱實施例5)。
圖32顯示批號1之歐貝提膽酸型式1在40℃/75% RH下貯存後的XRPD繞射圖(參閱實施例5)。
圖33顯示批號1之歐貝提膽酸型式1在25℃/97% RH下貯存後的XRPD繞射圖(參閱實施例5)。
圖34顯示歐貝提膽酸型式G之分子的晶體結構圖示，顯示50%概率水平之非氫原子的各向異性原子位移橢球體(參閱實施例6)。
圖35顯示歐貝提膽酸型式G的晶體結構之分子間氫鍵的圖示，其中氫鍵結係以虛線顯示(參閱實施例6)。
圖36顯示模擬之粉末圖案、所獲得的晶體之實驗圖案與歐貝提膽酸型式G的XRPD重疊圖(參閱實施例6)。
圖37顯示在經口服投予20毫克/公克之歐貝提膽酸型式1和結晶型式F之後的血漿歐貝提膽酸相對於時間之輪廓的曲線圖(參閱實施例7)。
圖38顯示在投予之後不同的時間間隔之歐貝提膽酸型式1和結晶型式F的牛磺共軛物之血漿濃度的曲線圖(參閱實施例7)。
圖39顯示型式1的DSC曲線(參閱實施例7)。
圖40顯示型式F的DSC曲線(參閱實施例7)。
本發明的詳細說明
本發明係指向歐貝提膽酸，其為具有以下化學結構之醫藥活性成分(亦稱為INT-747)： 其包括實質上純的歐貝提膽酸，歐貝提膽酸之製造方法，包含結晶狀歐貝提膽酸作為合成中間物，及確認歐貝提膽酸的存在與純度之分析方法，及在製造歐貝提膽酸之方法中的合成中間物。本發明亦說明歐貝提膽酸之醫藥組成物 和調配物及此等組成物之用途。
製造歐貝提膽酸之方法
本發明係指向一種製造高純度歐貝提膽酸之方法。本發明方法顯示於流程1中。該方法為6-步驟合成法，接著為一個純化步驟，以製造高純度歐貝提膽酸。
本發明方法亦包括一種根據流程1之方法，其中化合物4和5各自由E與Z異構物之混合物所組成，如以下化 合物4A和5A之結構所例證：
在一個具體例中，E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4A)之E/Z異構物比為約50%，大於約60%，大於約70%，大於約80%，大於約83%，大於約85%，大於約90%，大於約93%，大於約95%或大於約99%。在一個具體例中，E/Z比係以HPLC測定。在一個具體例中，該比為大於約80%。在一個具體例中，該比為大於約83%。在一個具體例中，該比為大於約85%。在一個具體例中，該比為大於約90%。在一個具體例中，該比為大於約93%。在一個具體例中，該比為大於約95%。在一個具體例中，該比為大於約99%。
在一個具體例中，E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5A)之E/Z異構物比為約50%，大於約60%，大於約70%，大於約80%，大於約83%，大於約85%，大於約90%，大於約93%，大於約95%或大於約99%。在一個具體例中，E/Z比係以HPLC測定。在一個具體例中，該比為大於約80%。在一個具體例中，該比為大於約83%。在一個具體例中，該比為大於約85%。在一個具體例中，該比為大於約90%。在一個具體例中，該比為大於約93%。在一個具體例中，該比為大於約95%。在一個具體例中，該比為大於約99%。
從未於本技術領域中記述本發明方法。該方法為6-步驟合成法，接著為一個純化步驟。步驟1為7-酮基石膽酸(KLCA)之C-24羧酸使用甲醇在酸性觸媒的存在下酯化及加熱，以製造甲酯化合物1。步驟2為使用強鹼從化合物1形成矽烷基烯醇醚，接著以氯矽烷處理，以製造化合物3。步驟3為矽烷基烯醇醚化合物3與乙醛之醛醇縮合反應，以製造化合物4(或化合物4A)。步驟4為酯水解，亦即化合物4(或化合物4A)之C-24甲酯的皂化作用，以製造羧酸化合物5(或化合物5A)。步驟5為化合物5(或化合物5A)之6-亞乙基部分的氫化作用，接著異構化作用，以製造化合物6。步驟6為化合物6之7-酮基的選擇性還原成7α-羥基，以製造結晶狀歐貝提膽酸。步驟7為結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
本發明方法關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其中該方法係利用歐貝提膽酸之結晶型式作為合成中間物。
在一個具體例中，本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5A)與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)，將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)，將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4A)與NaOH反應，以形成E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5A)，將E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5A)與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)， 將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4)與NaOH反應，以形成E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)，將E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)，將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯(3)與CH3CHO反應，以形成E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4A)，將E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4A)與NaOH反應，以形成E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5A)，將E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5A)與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基- 5β-膽烷-24-酸(6)，將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯(3)與CH3CHO反應，以形成E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4)，將E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4)與NaOH反應，以形成E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)，將E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)，將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(1)與Li[N(CH(CH3)2)2]及Si(CH3)3Cl反應，以形成3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯(3)，將3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯(3 )與CH3CHO反應，以形成E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4A)，將E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4A)與NaOH反應，以形成E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5A)，將E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5A)與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)，將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(1)與Li[N(CH(CH3)2)2]及Si(CH3)3Cl反應，以形成3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯(3)，將3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯(3)與CH3CHO反應，以形成E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4)，將E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4)與NaOH反應，以形成E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)，將E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽 烷-24-酸(6)，將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(KLCA)與CH3OH及H2SO4反應，以形成3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(1)，將3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(1)與Li[N(CH(CH3)2)2]及Si(CH3)3Cl反應，以形成3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯(3)，將3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯(3)與CH3CHO反應，以形成E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4A)，將E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4A)與NaOH反應，以形成E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5A)，將E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5A)與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)，將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，本發明關於一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含以下步驟：將3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(KLCA)與CH3OH及H2SO4反應，以形成3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(1)，將3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(1)與Li[N(CH(CH3)2)2]及Si(CH3)3Cl反應，以形成3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯(3)，將3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯(3)與CH3CHO反應，以形成E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4)，將E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4)與NaOH反應，以形成E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)，將E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)，將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，本發明關於一種使用結晶狀歐貝提膽酸製造歐貝提膽酸型式1之方法。在另一具體例中，結晶狀歐貝提膽酸為型式C。在一個具體例中，結晶狀歐貝提膽酸型式C係以實質上類似於圖5中所示之X-射線繞 射圖案為特徵。在一個具體例中，結晶狀歐貝提膽酸型式C係從乙酸正丁酯結晶及再結晶。
步驟1
步驟1為3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(KLCA)與CH3OH及H2SO4之反應，以形成3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(1)。在步驟1的一個具體例中，將反應混合物加熱約3小時且將反應混合物的pH以鹼性水溶液調整至約6.5至約8.0之pH-值。在一個具體例中，3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(1)的分離進一步包含以活性碳處理。在一個具體例中，3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(1)的分離不進一步包含以活性碳處理。在一個具體例中，不以活性碳處理3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(1)的分離供給較高的產率。在一個具體例中，3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(1)與CH3OH及H2SO4之反應係在甲醇中進行。在一個具體例中，鹼性溶液為NaOH水溶液。在一個具體例中，pH-值為約7.0至約7.5。
在一個具體例中，甲醇充當甲基化試劑以及反應溶劑。在一個具體例中，將含有產物的溶液以活性碳處理約30分鐘且過濾，以移除碳固體。在一個具體例中，將含有產物的溶液不以活性碳處理。為了沉澱產物，添加在約5℃至約20℃之水及接種材料。在另一具體例中，水係在約10℃至約15℃。在一個具體例中，將產物以離心分離 且以甲醇與水之混合物清洗。在一個具體例中，濕材料的水含量係以卡耳費雪法(Karl Fischer)(KF)定量。在一個具體例中，在用於下一步驟前，將材料在滾筒式乾燥機中乾燥。在一個具體例中，在用於下一步驟前，不將材料乾燥。
步驟2
步驟2為3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(1)與Li[N(CH(CH3)2)2]及Si(CH3)3Cl之反應，以形成3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯(3)。在一個具體例中，步驟2係在極性非質子性溶劑中以約-10℃至約-30℃之溫度進行。在一個具體例中，極性非質子性溶劑為四氫呋喃。在一個具體例中，溫度為約-20℃至約-25℃。在一個具體例中，將3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(1)與Li[N(CH(CH3)2)2]及Si(CH3)3Cl之反應攪拌約2小時。
在一個具體例中，將化合物1裝入在惰性條件下的反應器中。在另一具體例中，殘餘水及甲醇係在約65℃及正常壓力下以重複的共沸蒸餾移除。在另一具體例中，在必要時將THF添加至殘餘物中且重複蒸餾約4次。在另一具體例中，重複蒸餾約3次，約2次，或約1次。在一個具體例中，含有產物的剩餘溶液具有≦0.05%之最終水含量(卡耳費雪法滴定)。水可使此步驟中稍後添加的氯三甲基矽烷水解。在一個具體例中，將產物溶液預冷卻至 約-10℃至約-30℃且接著添加氯三甲基矽烷。在另一具體例中，將溶液預冷卻至約-20℃至約-25℃。在一個具體例中，將強鹼及THF裝入單獨的反應器中且冷卻至約-10℃至約-30℃。在一個具體例中，強鹼為二異丙基醯胺鋰。在另一具體例中，反應器在例如氮或氬氛圍下為惰性。在另一具體例中，將鹼及THF之溶液冷卻至約-20℃至約-25℃。在一個具體例中，將3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯、THF及氯三甲基矽烷的乾燥之冷卻溶液裝入在約-10℃至約-30℃的鹼性溶液中。在另一具體例中，溫度為約-20℃至約-25℃。在一個具體例中，將反應混合物攪拌約2小時。在一個具體例中，將反應混合物添加至預冷卻之酸性溶液中，以進行整理。在另一具體例中，酸性溶液為檸檬酸水溶液。在一個具體例中，在添加之後，將水相分離且棄置。在一個具體例中，溶劑係在約50℃以真空蒸餾從有機相移除。在一個具體例中，分離之殘餘物為3α,7α-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯(3)，以其〝原樣子〞用於下一步驟中。另一選擇地，可將化合物3在步驟3前純化。
步驟3
步驟3為3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯(3)與CH3CHO之反應，以形成3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4)。在一個具體例中，步驟3係在極性非質子性溶劑中，在約-50℃至約-70℃之溫度 ，在BF3的存在下進行。在一個具體例中，極性非質子性溶劑為二氯甲烷。在一個具體例中，BF3為在乙腈中的16重量%之溶液。在一個具體例中，溫度為約-60℃至約-65℃。
在一個具體例中，將極性非質子性溶劑中的化合物3裝入惰性反應器中。在另一具體例中，極性非質子性溶劑為來自先前步驟的殘餘溶劑(例如，THF)。在一個具體例中，THF的添加有助於蒸餾出殘餘水和二異丙胺。在約50℃之最大溫度及真空下蒸餾出殘餘的極性非質子性溶劑量。在含有化合物3之殘餘物中的水含量限定至≦0.5%(卡耳費雪法滴定)。接著將含有化合物3之殘餘物溶解在極性非質子性溶劑中且預冷卻至約-50℃至約-70℃。極性非質子性溶劑為二氯甲烷。在另一具體例中，將極性非質子性溶劑中的含有化合物3之殘餘物預冷卻至約-60℃至約-65℃。添加乙醛(CH3CHO)。將極性非質子性溶劑及三氟化硼(BF3)溶劑化複合物裝入單獨的反應器中且接著冷卻至約-50℃至約-70℃。在另一具體例中，極性非質子性溶劑為二氯甲烷。在另一具體例中，三氟化硼溶劑化複合物為三氟化硼乙腈複合物。BF3溶液之溫度為約-60℃至約-65℃。將含有化合物3及乙醛之溶液添加至約-60℃至約-65℃之BF3溶液中。在另一具體例中，含有化合物3及乙醛之溶液為無水的。在一個具體例中，將反應混合物在約-60℃至約-65℃攪拌約2小時，加熱至多約23℃至約28℃，再攪拌約2小時及冷卻至約2℃至約10℃， 以進行水解/整理。在一個具體例中，添加與攪拌的總時間為約4小時。在一個具體例中，將來自反應器的冷卻溶液添加至預冷卻之鹼性水溶液中，以進行整理。在另一具體例中，鹼性水溶液為約50重量%之氫氧化鈉(NaOH；苛性鹼)。在一個具體例中，將相分離且將(下)有機層轉移至單獨的反應器中。在一個具體例中，在不超過(NMT)50℃以蒸餾儘可能移除有機層的溶劑。在一個具體例中，殘餘物包含3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4)及一些剩餘的乙腈和二氯甲烷。應瞭解步驟4可形成E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4A)。以步驟3的產物直接執行步驟4。
步驟4
步驟4為3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4)與NaOH之反應，以形成E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)。在一個具體例中，在步驟4之前，將來自步驟3的殘餘物加熱至約45℃至約60℃，以移除殘餘的溶劑量。在一個具體例中，溫度為約49℃至約55℃。在一個具體例中，使3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4)與NaOH反應的酯水解反應係在約20℃至約25℃於甲醇、水和NaOH溶液中進行。
在一個具體例中，將反應用3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4)裝入反應器中。在另一具體例中，反應器為惰性的，例如氮或氬氛圍下。在NMT 50℃ 之溫度及在真空下蒸餾出殘餘的溶劑量。在一個具體例中，將殘餘物加熱至多約45℃至約60℃。在另一具體例中，將殘餘物加熱至多約49℃至約55℃。在另一具體例中，將來自步驟3的殘餘物(化合物4)溶解在甲醇、水和鹼性水溶液中。在另一具體例中，鹼性水溶液為約50重量%之氫氧化鈉(NaOH；苛性鹼)。步驟4的酯水解反應係在約20℃至約60℃進行且攪拌，直到水解反應完成為止。在一個具體例中，酯水解係在約20℃至約25℃進行。檢查反應混合物的pH，以證實其>12。若pH<12，則添加額外的NaOH。將反應混合物以水稀釋水且將溫度調整至約20℃至約35℃。在另一態樣中，將反應混合物以水稀釋且將溫度調整至約25℃至約35℃。在一個具體例中，將相分離，將下水層轉移至單獨的反應器中且將有機層棄置，以進行整理。化合物5係在水相中。在一個具體例中，將乙酸乙酯及酸添加至含有以劇烈攪拌至水層的化合物5之水相中。在另一具體例中，酸為檸檬酸水溶液。在一個具體例中，將相分離且將下水層棄置。化合物5係在有機層中。在一個具體例中，從有機層蒸餾出乙酸乙酯且以乙酸乙酯替換。在一個具體例中，重複蒸餾，直到蒸餾物的水含量為NMT 1%為止或直到達成固定的沸點為止。在一個具體例中，將懸浮液冷卻至約10℃至約30℃，分離且以乙酸乙酯清洗。在另一具體例中，將含有化合物5的所得懸浮液冷卻至約20℃至約25℃。在一個具體例中，所得產物係在真空下以約60℃進行乾燥(例如， 滾筒式乾燥機)。
在一個具體例中，粗製E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)係使用乙醇結晶。在一個具體例中，將乙醇及粗製化合物5裝入反應器中。在另一具體例中，反應器為惰性的。在一個具體例中，將混合物加熱至回流，以溶解粗製化合物5。在一個具體例中，將混合物以受控之冷卻坡方式冷卻至約15℃至約20℃。在一個具體例中，將結晶狀化合物5使用離心分離且接著以乙酸乙酯清洗。在一個具體例中，結晶狀化合物5係在真空下及約60℃進行乾燥(例如，滾筒式乾燥機)。可取得樣品以測量純化之化合物5的檢定、純度及濕度。在一個具體例中，純化之化合物5含有3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸之E和Z異構物二者。在一個具體例中，E對Z之比為約99：1、約98：2、約95：5、約90：10、約85：15、約80：20、約75：25、約70：30、約65：35、約60：40、約55：45或約50：50。關於純化之化合物5的鑑證及特徵之完整細節，參閱實施例2。
步驟4亦可以為E/Z異構物之混合物的化合物開始進行。例如，步驟4為E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4A)與NaOH之反應，以形成E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5A)。在一個具體例中，在步驟4之前，將來自步驟3的殘餘物加熱至約45℃至約60℃，以移除殘餘的溶劑量。在一個具體例中，溫度為約49℃至約55℃。在一個具體例中，包含E/Z-3α- 羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4A)與NaOH反應的酯水解反應係在約20℃至約25℃，在甲醇、水和NaOH溶液中進行。在一個具體例中，NaOH溶液為50重量%之水溶液。
在一個具體例中，將反應用E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4A)裝入反應器中。在另一具體例中，反應器在例如氮或氬氛圍下為惰性的。在NMT 50℃之溫度及在真空下蒸餾出殘餘的溶劑量。在一個具體例中，將殘餘物加熱至多約45℃至約60℃。在一個具體例中，溫度為約49℃至約55℃。在一個具體例中，將來自步驟3的殘餘物(化合物4A)溶解在甲醇、水和鹼性水溶液中。在另一具體例中，鹼性水溶液為約50重量%之氫氧化鈉(NaOH；苛性鹼)。步驟4的酯水解反應係在約20℃至約60℃進行且攪拌，直到水解反應完成為止。在一個具體例中，酯水解係在約20℃至約25℃進行。檢查反應混合物的pH，以確定>12。若pH<12，則添加額外的NaOH。將反應混合物以水稀釋且將溫度調整至約20℃至約35℃。在一個具體例中，將相分離，將下水層轉移至單獨的反應器中且將有機層棄置，以進行整理。化合物5A係在水相中。在一個具體例中，將乙酸乙酯及酸添加至含有以劇烈攪拌至水層的化合物5A之水相中。在另一具體例中，酸為檸檬酸水溶液。在一個具體例中，將相分離且將下水層棄置。化合物5A係在有機層中。在一個具體例中，從有機層蒸餾出乙酸乙酯且以乙酸乙酯替換 。在一個具體例中，重複蒸餾，直到蒸餾物的水含量為NMT 1%為止或直到達成固定的沸點為止。在一個具體例中，將懸浮液冷卻至約10℃至約30℃，分離且以乙酸乙酯清洗。在另一具體例中，將含有化合物5A的所得懸浮液冷卻至約20℃至約25℃。在一個具體例中，所得產物係在真空下以約60℃進行乾燥(例如，滾筒式乾燥機)。化合物5A可以不純化而前進至步驟5。
在一個具體例中，粗製E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5A)係使用乙醇結晶。在一個具體例中，將乙醇及粗製化合物5A裝入反應器中。在另一具體例中，反應器為惰性的。在一個具體例中，將混合物加熱至回流，以溶解粗製化合物5A。在一個具體例中，將混合物以受控之冷卻坡方式冷卻至約15℃至約20℃。在一個具體例中，將結晶狀化合物5A使用離心分離且接著以乙酸乙酯清洗。在一個具體例中，結晶狀化合物5A係在真空下及在約60℃進行乾燥(例如，滾筒式乾燥機)。在一個具體例中，步驟4的分離之結晶產物為化合物5。
可替代之步驟4
化合物5可根據可替代之方法製造。在一個具體例中，將化合物4裝入惰性反應器中。在約50℃(最高)及真空下可蒸餾出殘餘的溶劑量(例如，乙腈、二氯甲烷)。將殘餘物溶解在甲醇中且冷卻。添加自來水及苛性鹼(50重量%之NaOH)。在一個具體例中，將反應混合物在 約20℃至約25℃攪拌約4小時。將溶液以自來水稀釋且添加甲苯。在攪拌之後，將相分離且將下水層轉移至惰性反應器中。將有機層棄置。將乙酸乙酯及檸檬酸溶液在劇烈攪拌期間添加至水層中。將相分離且將下水層棄置。將有機層轉移至惰性反應器中。從有機層蒸餾出乙酸乙酯且以乙酸乙酯替換。在一個具體例中，重複此操作，直到蒸餾物的水含量不超過約1%為止或直到達成固定的沸點為止。將本發明懸浮液冷卻至約20℃至約25℃，將化合物5分離且以乙酸乙酯以惰性離心清洗。在真空下的滾筒式乾燥機中及約60℃進行乾燥。
此可替代之步驟4亦可以為E/Z異構物之混合物的化合物開始進行。在一個具體例中，將化合物4A裝入惰性反應器中。在約50℃(最高)及真空下蒸餾出殘餘的溶劑量(例如，乙腈、二氯甲烷)。將殘餘物溶解在甲醇中且冷卻。添加自來水及苛性鹼(50重量%之NaOH)。在一個具體例中，將反應混合物在約20℃至約25℃攪拌約4小時。將溶液以自來水稀釋且添加甲苯。在攪拌之後，將相分離且將下水層轉移至惰性反應器中。將有機層棄置。將乙酸乙酯及檸檬酸溶液在劇烈攪拌期間添加至水層中。將相分離且將下水層棄置。將有機層轉移至惰性反應器中。從有機層蒸餾出乙酸乙酯且以乙酸乙酯替換。在一個具體例中，重複此操作，直到蒸餾物的水含量不超過約1%為止或直到達成固定的沸點為止。將本發明懸浮液冷卻至約20℃至約25℃，將化合物5A分離且以乙酸乙酯以惰 性離心清洗。在真空下的滾筒式乾燥機中及約60℃進行乾燥。
步驟5
步驟5為E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)與Pd/C及氫氣之反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)。步驟5可以一個相(氫化與異構化一起)或兩個相(氫化及接著異構物)進行。在一個具體例中，步驟5係在約90℃至約110℃之溫度及在約4至約5巴之壓力進行。在一個具體例中，在整理期間，將反應混合物的有機相以活性碳處理。在一個具體例中，壓力為約4.5至約5.5巴。在另一具體例中，壓力為約5巴。在一個具體例中，允許氫化反應混合物攪拌約1小時。在一個具體例中，將E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)與Pd/C及氫氣之反應加熱至約100℃及攪拌約2小時至約5小時。在一個具體例中，將E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)與Pd/C及氫氣之反應加熱至約100℃及攪拌約3小時。
在一個具體例中，E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)與Pd/C及氫氣之反應係在鹼性溶液的存在下進行。在一個具體例中，鹼性溶液為50重量%之氫氧化鈉(NaOH；苛性鹼)溶液。在氫化反應之後，將反應混合物加熱至多約100℃(以進行C-6位置從β構型至α構型的異構化作用)且接著冷卻至約40℃至約50℃。將 Pd/C濾除，以進行整理。在一個具體例中，將乙酸正丁酯及酸添加至過濾物中。在另一具體例中，酸為氫氯酸(HCl)。在檢查pH-值以確定其為酸性之後，將水相分離且棄置。將含有產物的有機相以活性碳處理。在一個具體例中，將活性碳濾除，將含有產物的所得過濾物以蒸餾冷凝且將所得懸浮液冷卻至約10℃至約30℃。在另一具體例中，將懸浮液冷卻至約15℃至約20℃。將含有化合物6的懸浮液分離且以乙酸正丁酯清洗。將化合物6使用壓濾器過濾。在一個具體例中，在真空下的壓濾器中以約80℃進行乾燥。
在步驟5的一個具體例中，將E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)、水、NaOH溶液(例如，50重量%)與Pd/C在約5巴之H2氣及在約100℃至約105℃之溫度混合，直到H2攝入停止為止。將反應混合物冷卻至約40℃至約50℃且濾除Pd/C。接著將乙酸正丁酯及HCl添加至含有化合物6之溶液中。在一個具體例中，將水相分離且棄置。將含有化合物6的有機相以活性碳處理。將碳濾除且將過濾物移至另一反應器，將其在此以蒸餾縮減，及接著將懸浮液冷卻至約5℃至約20℃。在一個具體例中，將化合物6經由過濾分離且將過濾物在真空下的壓濾器上以約80℃乾燥。
步驟5亦可以為E/Z異構物之混合物的化合物開始進行。例如，步驟5為E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5A)與Pd/C及氫氣之反應且加熱，以形成3α- 羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)。步驟5可以一個相(氫化與異構化一起)或兩個相(氫化，接著異構物)進行。在一個態樣中，步驟5係在約90℃至約110℃之溫度及在約4至約5巴之壓力進行。在一個具體例中，在整理期間，將反應混合物的有機相以活性碳處理。在一個具體例中，壓力為約4.5至約5.5巴。在另一具體例中，壓力為約5巴。在一個具體例中，允許氫化反應混合物攪拌約1小時。在一個具體例中，將E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5A)與Pd/C及氫氣之反應加熱至約100℃且攪拌約2小時至約5小時。在一個具體例中，將E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5A)與Pd/C及氫氣之反應加熱至約100℃且攪拌約3小時。
在一個具體例中，E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5A)與Pd/C及氫氣之反應係在鹼性溶液的存在下進行。在一個具體例中，鹼性溶液為50重量%之氫氧化鈉(NaOH；苛性鹼)溶液。在氫化反應之後，將反應混合物加熱至多約100℃(以進行C-6位置從β構型至α構型的異構化作用)且接著冷卻至至約40℃至約50℃。將Pd/C濾除，以進行整理。在一個具體例中，將乙酸正丁酯及酸添加至過濾物中。在另一具體例中，酸為氫氯酸(HCl)。在檢查pH-值以確定其為酸性之後，將水相分離且棄置。將含有產物的有機相以活性碳處理。在一個具體例中，將活性碳濾除，將含有產物的所得過濾物以蒸餾冷凝且將所得懸浮液冷卻至約10℃至約30℃。在另 一具體例中，將懸浮液冷卻至約15℃至約20℃。將含有化合物6的懸浮液分離且以乙酸正丁酯清洗。將化合物6使用壓濾器過濾。在一個具體例中，在真空下的壓濾器中以約80℃進行乾燥。
在步驟5的一個具體例中，將E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5A)、水、NaOH溶液(例如，50重量%)與Pd/C在約5巴之H2氣及在約100℃至約105℃之溫度混合，直到H2攝入停止為止。將反應混合物冷卻至約40℃至約50℃且濾除Pd/C。接著將乙酸正丁酯及HCl添加至含有化合物6之溶液中。在一個具體例中，將水相分離且棄置。將含有化合物6的有機相以活性碳處理。將碳濾除且將過濾物移至另一反應器，將其在此以蒸餾縮減，及接著將懸浮液冷卻至約5℃至約20℃。在一個具體例中，將化合物6經由過濾分離且將過濾物在真空下的壓濾器上以約80℃乾燥。
在另一具體例中，用於製造化合物6的上述氫化/異構化反應係以兩個相進行(從化合物5或化合物5A開始)。首先在約4至5巴進行氫化及接著將反應混合物加熱至約20℃至約40℃。加熱反應混合物使6-位置上的乙基異構化成所欲α構型。將反應混合物加熱，直到完成異構化作用為止。
步驟6
步驟6為3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6 )與NaBH4之反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸。在一個具體例中，步驟6係在約85℃至約110℃之溫度在鹼性水溶液中進行。在一個具體例中，溫度為約90℃至約95℃。在一個具體例中，鹼性水溶液為NaOH水溶液。在一個具體例中，鹼性水溶液為50重量%之NaOH溶液與水的混合物。在一個具體例中，將化合物6與NaBH4的反應混合物攪拌約3小時至約5小時。在另一具體例中，將反應混合物攪拌約4小時。
在反應完成之後，將混合物冷卻至約80℃且轉移至冷卻之反應器中，以進行整理。在一個具體例中，在約20℃至約60℃添加乙酸正丁酯及酸。在一個具體例中，溫度為約40℃至約45℃。在另一具體例中，酸為檸檬酸。在檢查Ph-值以確定其為酸性之後，將水相分離且棄置。將含有產物的有機相以蒸餾濃縮。在一個具體例中，將乙酸正丁酯添加至殘餘物中且再蒸餾出。在一個具體例中，將乙酸正丁酯再添加至殘餘物中且接著緩慢冷卻。在另一具體例中，在約50℃接種殘餘物。在另一具體例中，在出現結晶之後，將混合物加熱至52℃且接著緩慢冷卻至約15℃至約20℃。在另一具體例中，將殘餘物冷卻至約15℃至約20℃。在一個具體例中，將所得歐貝提膽酸以乙酸正丁酯清洗。在一個具體例中，將歐貝提膽酸分離且以乙酸正丁酯清洗(例如，在壓濾器中)。在另一具體例中，壓濾器為惰性的。將結晶產物在真空下以約60℃乾燥。在一個具體例中，將所得結晶狀歐貝提膽酸從有機 溶劑分離(例如，庚烷)。關於結晶狀歐貝提膽酸型式C的鑑證及特徵之完整細節，參閱實施例3。
步驟7
步驟7為結晶狀歐貝提膽酸型式C轉化成歐貝提膽酸型式1。在一個具體例中，步驟7包含以下步驟：將結晶狀歐貝提膽酸型式C溶解在NaOH水溶液中及添加HCl。
在一個具體例中，將結晶狀歐貝提膽酸在約20℃至約50℃溶解在水及苛性鹼溶液(50重量%)中。在一個具體例中，溫度為約30℃至約40℃。在一個具體例中，結晶狀歐貝提膽酸為型式C。在一個具體例中，將結晶狀歐貝提膽酸型式C的所得溶液在約20℃至約50℃添加至稀釋之酸中。在另一具體例中，溫度為約30℃至約40℃。在另一具體例中，酸為氫氯酸(例如，37%)。在一個具體例中，將37%之氫氯酸溶液以水稀釋至低於約1體積%。在一個具體例中，將37%之氫氯酸溶液以水稀釋至約0.7體積%。在一個具體例中，將稀釋之酸中的產物懸浮液在約20℃至約50℃攪拌約30分鐘。在另一具體例中，溫度為約30℃至約40℃。在一個具體例中，將歐貝提膽酸型式1分離且在NMT約20℃以水清洗(例如，在壓濾器中)。在一個具體例中，將歐貝提膽酸型式1分離且在NMT約20℃以水清洗(例如，在壓濾器中)。在另一具體例中，壓濾器為惰性的。將產物在真空下的壓濾器上以NMT約50℃之溫度乾燥。
本發明方法利用結晶狀中間物製造歐貝提膽酸型式1，該方法意外導致顯著改進的整體製造及最終產物之純度。合成法的步驟6特別製造新穎的歐貝提膽酸結晶型式。此結晶型式的製造導致實質上純的歐貝提膽酸型式1。
本發明方法為超越先前技藝中所揭示之方法的改進方法。歐貝提膽酸的製造係揭示在美國公開案號2009/0062526 A1(在本文稱為“‘526公開案”)、美國專利案號7,138,390(在本文稱為“‘390專利”)及WO 2006/122977(在本文稱為“‘977公開案”)。
在‘390專利中製造歐貝提膽酸之方法(在本文稱為“‘390方法”)描述於流程3中(R為乙基)。
儘管此方法包含很少的步驟，但是其呈現出一系列的缺點。在所有的步驟中，反應產物係在層析管柱上純化，亦即不可能以工業規模使用的非常昂貴之分離方法。而且，在步驟2中的反應產率極低(12-13%)，大幅降低整個產率，使其低於3.5%。此方法亦使用六亞甲基磷醯胺 作為反應物，其為已知的致癌劑。
在’977申請案中製造歐貝提膽酸之方法描述於流程4中。
製造歐貝提膽酸的‘977方法為8-步驟合成法，其包括一個純化步驟(步驟7)，接著2個額外的純化步驟。 在‘977方法與本發明方法之間有相當多的差異。以下表A說明至少一些在兩種方法之間的差異：
本發明方法與‘977方法相比的差異造成本發明方法的顯著改進，包括與擴大規模優化、安全性，以及純度有關的改進和整體方法的改進。以本發明方法所製造之歐貝提膽酸的純度為實質上純的。特別以本發明方法所製造之歐貝提膽酸實質上比以先前技藝的方法(包括‘390方法和‘977方法)所製造之歐貝提膽酸更純。例如，將本發明方法所製造之歐貝提膽酸與以‘977方法所製造之歐貝提膽酸的分析憑證中所呈示之結果的比較顯示於以下表B中。雜質百分比係使用HPLC方法測定。
雜質1為6-乙基熊去氧膽酸。
雜質2為3α-羥基-6α-乙基-7-夏托(cheto)-5β-膽烷-24-酸。
雜質3為6β-乙基鵝去氧膽酸。
雜質4為3α,7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷-24-酸。
雜質5為鵝去氧膽酸。
雜質6為3α(3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽-24-醯氧基)-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸(6ECDCA二聚物)。
NMT係指〝不超過〞。
結晶狀歐貝提膽酸作為合成中間物
歐貝提膽酸目前係以非結晶固體發展為活性醫藥成分。為了促進歐貝提膽酸的發展，故進行初始結晶和同質多晶形性研究，以測定是否可得到結晶型式，若可以，則該等是否適合發展。在對材料於各種溶劑中的行為得到更多了解而設計之初步溶解度篩選之後，看來材料具有形成凝膠的傾向且有可能結晶。接著進行廣泛的多晶形物篩選，將材料暴露於大範圍的溶劑及結晶條件，以便鑑證儘可能多的相關之多晶形物且予以特徵化。在此篩選期間發現5種不同的固體型式。
三種歐貝提膽酸型式(A、C和D)為含有0.25莫耳當量之水及各種範圍之有機溶劑量的混合型水合物/溶劑化物。在加熱時，該等固體同時且均勻地失去結晶度及溶劑，該等溶劑化型式係由於彼等低的熔融溫度及高的溶劑含量而不適合進一步發展為醫藥成分。亦注意到此類型存在有類似的〝不適合〞形式。例如，在稍後的實驗中發現低熔融之溶劑化型式，以及另一型式的單晶體，其以SCXRD(單晶體X-射線繞射)顯示為單水合物/苯甲醚溶劑化物。
兩種剩餘型式具有更高的熔點且可能更有希望，但是該等中之一(型式G)不能以擴大規模再製，儘管許多嘗試亦不能重複製造。製造此型式的難度使其不適合於發展。剩餘的非溶劑化型式F可重複製造，但是其需要擴大的 再結晶程序及使用硝甲烷，其為毒性溶劑且若敏化時可以胺、鹼、強酸或高溫或絕熱壓縮而爆炸。擔憂的硝甲烷殘餘程度認為型式F亦不適合於發展。
初始結晶和同質多晶形性研究的整體結果揭露材料可能形成各種型式的結晶材料，但是沒有一種結晶材料或型式被認為適合於發展。
直到很久以後才發現製造結晶狀歐貝提膽酸作為本發明方法的倒數第二步驟之中間物的重要性。結晶狀歐貝提膽酸可使用本發明方法輕易地大規模分離。此結晶狀歐貝提膽酸經測定與初始結晶和同質多晶形性研究的型式C一致。在本發明方法的步驟7中經製造為合成中間物之結晶狀歐貝提膽酸的形成、易分離性及高純度確實為製造實質上純的歐貝提膽酸之關鍵。
在一個具體例中，本發明關於一種結晶狀歐貝提膽酸型式C，其特徵為包括在約4.2、6.4、9.5、12.5和16.7度2-θ之特徵峰的X-射線繞射圖。在一個具體例中，X-射線繞射圖案包括在約4.2、6.4、9.5、12.5、12.6、15.5、15.8、16.0、16.7和19.0度2-θ之特徵峰。在一個具體例中，X-射線繞射圖案包括在約4.2、6.4、8.3、9.5、11.1、12.2、12.5、12.6、15.5、15.8、16.0、16.3、16.7、18.6和19.0度2-θ之特徵峰。在一個具體例中，X-射線繞射圖案包括在約4.2、6.4、8.3、9.5、11.1、12.2、12.5、12.6、15.5、15.8、16.0、16.3、16.7、17.0、17.8、18.6、18.8、19.0、20.5和20.9度2-θ之特徵峰。在一 個具體例中，本發明關於一種結晶狀歐貝提膽酸型式C，其特徵為具有實質上類似於圖5中所示之X-射線繞射圖案。在一個具體例中，X-射線繞射圖案係由使用Cu Kα輻射(40Kv，40mA)之繞射計獲得。在一個具體例中，X-射線繞射圖案包括在約12.0至約12.8及約15.4至約21.0之特徵峰。
在一個具體例中，本發明關於一種結晶狀歐貝提膽酸型式C，其特徵為具有在約98±2℃之吸熱值的微差掃描熱量法(DSC)溫度記錄圖，如以Mettler DSC 823e儀器所測量。在一個具體例中，微差掃描熱量法(DSC)溫度記錄圖具有在約98±2℃之吸熱值，如以Mettler DSC 823e儀器所測量。
在一個具體例中，本發明關於一種結晶狀歐貝提膽酸，其中該結晶狀歐貝提膽酸為型式C且具有大於約90%之純度。在一個具體例中，該結晶狀歐貝提膽酸型式C的純度係以HPLC測定。在一個具體例中，本發明關於一種結晶狀歐貝提膽酸型式C，或其醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物。在一個具體例中，溶劑化物為水合物。在一個具體例中，純度為大於約92%。在一個具體例中，純度為大於約94%。在一個具體例中，純度為大於約96%。在一個具體例中，純度為大於約98%。在一個具體例中，純度為大於約99%。
在一個具體例中，本發明關於一種結晶狀歐貝提膽酸，其中該結晶狀歐貝提膽酸為型式C且具有大於約90% 之效力。在一個具體例中，該結晶狀歐貝提膽酸型式C的純度係以HPLC及/或本技術領域中已知的其他分析程序測定。在一個具體例中，本發明關於一種結晶狀歐貝提膽酸型式C，或其醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物。在一個具體例中，溶劑化物為水合物。在一個具體例中，效力為大於約92%。在一個具體例中，效力為大於約94%。在一個具體例中，效力為大於約96%。在一個具體例中，效力為大於約98%。在一個具體例中，效力為大於約99%。
在一個具體例中，本發明關於一種結晶狀歐貝提膽酸型式C，其含有總共少於約4%之一或多種選自下列之雜質：6-乙基熊去氧膽酸、3α-羥基-6α-乙基-7-夏托-5β-膽烷-24-酸、6β-乙基鵝去氧膽酸、3α,7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷-24-酸、鵝去氧膽酸和3α(3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽-24-醯氧基)-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸。在一個具體例中，總雜質為少於約3.8%。在一個具體例中，總雜質為少於約3.6%。
本發明的實施例3提供此新穎的歐貝提膽酸結晶型式之完整特徵。
獲得歐貝提膽酸的單晶體X-射線結構且指定絕對立體化學。例如，結晶狀歐貝提膽酸型式G的單晶體X-射線結構係從以0.1℃/分鐘冷卻至5℃之後從乙腈溶液再結晶歐貝提膽酸，接著以RT/50℃之8小時循環經1週成熟所獲得的晶體來測定。
結構為斜方系，空間群P212121，且在不對稱單元中含有一個歐貝提膽酸分子。最後R1[I>2σ(I)]=3.22%。分子的絕對立體化學經測定如下文所示，具有Flack參數=-0.01(13)。該結構為有序的。
進行歐貝提膽酸型式1(非結晶狀)相對於結晶狀歐貝提膽酸型式F的生物利用率研究(實施例7)。研究結果顯示固體歐貝提膽酸的物理狀態在經口服投予受驗者時可在分子的生物利用率中扮演一角色。固體歐貝提膽酸型式1(非結晶狀)和結晶型式F在經口服投予後的血漿動力學及腸吸收效率和藥物動力學係根據本技術領域中已知的方法評估。本發明的實施例8顯示歐貝提膽酸血漿濃度相對於投予歐貝提膽酸形式1或型式F之後的時間、tmax、Cmax和AUC之輪廓(參閱圖37-38)。結晶型式F具有比歐貝提膽酸型式1(非結晶狀)高的生物利用率。血漿輪廓顯示更有效地吸收型式F(較高的AUC)及甚至更規律的動力學，反映藥物在腸內容物中的最優分布。
歐貝提膽酸型式1(非結晶狀)的水溶解度略高於型式F。型式F似乎為穩定的，因為熱重量分析(TGA)在 所研究之溫度範圍內未顯示任何重量損失。
實質上純的歐貝提膽酸
本發明提供實質上純的歐貝提膽酸，及其醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物：
醫藥活性成分歐貝提膽酸的其他名稱為INT-747、3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸、6α-乙基-鵝去氧膽酸、6-乙基-CDCA、6ECDCA和膽烷-24-酸，6-乙基-3,7-二羥基-,(3α,5β,6α,7α)-。
本發明提供包含歐貝提膽酸型式1之組成物及高純度歐貝提膽酸型式1之合成方法，其為安全的且以大規模製造歐貝提膽酸。在一個態樣中，歐貝提膽酸型式1係以商業規模之方法製造。術語〝商業規模之方法〞係指以至少100公克之單一批組操作的方法。在一個態樣中，本發明方法製造高產率(>80%)及雜質有限的歐貝提膽酸型式1。
如本文所使用之術語〝純度〞係指基於HPLC的歐貝提膽酸量。純度係基於化合物的〝有機物〞純度。純度不包括任何水、溶劑、金屬、無機鹽等量的測量值。在一個態樣中，歐貝提膽酸的純度係藉由比較波峰下的面積而與 參考標準物的純度比較。在另一態樣中，已知關於純度的標準物為歐貝提膽酸參考標準物。在一個態樣中，歐貝提膽酸具有大於約96%之純度。在一個態樣中，歐貝提膽酸具有大於約98%之純度。例如，歐貝提膽酸型式1之純度為96.0%、96.1%、96.2%、96.3%、96.4%、96.5%、96.6%、96.7%、96.8%、96.9%、97.0%、97.1%、97.2%、97.3%、97.4%、97.5%、97.6%、97.7%、97.8%、97.9%、98.0%、98.1%、98.2%、98.3%、98.4%、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%。例如，歐貝提膽酸型式1之純度為98.0%、98.1%、98.2%、98.3%、98.4%、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%。例如，歐貝提膽酸之純度為98.0%、98.5%、99.0%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%。例如，歐貝提膽酸之純度為98.5%、99.0%或99.5%。在一個具體例中，歐貝提膽酸為歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，本發明關於具有純度大於約98%之歐貝提膽酸。在一個具體例中，純度係以HPLC測定。在另一具體例中，本發明關於歐貝提膽酸，或其醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物。在一個具體例中，純度為大於約98.5%。在一個具體例中，純度為大於約99.0%。在一個具體例中，純度為大於約99.5%。在一個 具體例中，歐貝提膽酸為歐貝提膽酸型式1。
如本文所使用之術語〝效力〞為基於已知的標準(例如，約95%至約102%之接受準則)之歐貝提膽酸量的測量值。效力考慮所有可能的雜質，包括水、溶劑、有機和無機雜質。在一個態樣中，已知的標準物為歐貝提膽酸。在一個態樣中，歐貝提膽酸具有大於約96%之效力。在一個態樣中，歐貝提膽酸具有大於約98%之效力。在一個態樣中，已知的標準物為歐貝提膽酸。在另一態樣中，效力為100%減去水、硫酸灰份、殘餘溶劑和其他雜質含量的量，雜質為諸如6-乙基熊去氧膽酸、3α-羥基-6α-乙基-7-夏托-5β-膽烷-24-酸、6β-乙基鵝去氧膽酸、3α,7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷-24-酸、鵝去氧膽酸和3α(3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽-24-醯氧基)-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸。在另一具體例中，效力係由於水、溶劑、金屬、無機鹽和其他無機或有機雜質而以雜質佔據。例如，歐貝提膽酸型式1之效力為96.0%、96.1%、96.2%、96.3%、96.4%、96.5%、96.6%、96.7%、96.8%、96.9%、97.0%、97.1%、97.2%、97.3%、97.4%、97.5%、97.6%、97.7%、97.8%、97.9%、98.0%、98.1%、98.2%、98.3%、98.4%、98.5%、98.6%、98.7%、98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%。在一個態樣中，歐貝提膽酸型式1之效力為98.0%、98.1%、98.2%、98.3%、98.4%、98.5%、98.6%、98.7%、 98.8%、98.9%、99.0%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%。例如，歐貝提膽酸之效力為98.0%、98.5%、99.0%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%。例如，歐貝提膽酸之效力為98.5%、99.0%或99.5%。在一個具體例中，歐貝提膽酸為歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，本發明關於含有總共少於約2%之一或多種選自下列之雜質的歐貝提膽酸：6-乙基熊去氧膽酸、3α-羥基-6α-乙基-7-夏托-5β-膽烷-24-酸、6β-乙基鵝去氧膽酸、3α,7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷-24-酸、鵝去氧膽酸和3α(3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽-24-醯氧基)-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸。在一個具體例中，總雜質為少於約1.5%。在一個具體例中，總雜質為少於約1.4%。在一個具體例中，歐貝提膽酸為歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，歐貝提膽酸含有少於約10%之水，少於約9%之水，少於8%之水，少於7%之水，少於6%之水，少於5%之水，少於4%之水，少於3%之水，少於2%之水或少於1%之水。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有少於約1.2%之水。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有少於約1.0%之水。在一個具體例中，歐貝提膽酸為歐貝提膽酸型式1。
在另一具體例中，歐貝提膽酸含有不超過(NMT)0.15%之6-乙基熊去氧膽酸和3α,7α-二羥基-6-亞乙基-5β- 膽烷-24-酸。在另一具體例中，歐貝提膽酸含有總共少於約0.07%之6-乙基熊去氧膽酸和3α,7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷-24-酸。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有總共少於約0.06%之6-乙基熊去氧膽酸和3α,7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷-24-酸。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有總共少於約0.05%之6-乙基熊去氧膽酸和3α,7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷-24-酸。在一個具體例中，歐貝提膽酸為歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，歐貝提膽酸含有不超過(NMT)0.15%之3α-羥基-6α-乙基-7-夏托-5β-膽烷-24-酸。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有少於約0.07%之3α-羥基-6α-乙基-7-夏托-5β-膽烷-24-酸。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有少於約0.06%之3α-羥基-6α-乙基-7-夏托-5β-膽烷-24-酸。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有少於約0.05%之3α-羥基-6α-乙基-7-夏托-5β-膽烷-24-酸。在一個具體例中，歐貝提膽酸為歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，歐貝提膽酸含有不超過(NMT)0.15%之6β-乙基鵝去氧膽酸。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有少於約0.07%之6β-乙基鵝去氧膽酸。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有少於約0.06%之6β-乙基鵝去氧膽酸。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有少於約0.05%之6β-乙基鵝去氧膽酸。在一個具體例中，歐貝提膽酸為歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，歐貝提膽酸含有不超過(NMT)3 %之鵝去氧膽酸(CDCA)。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有少於約1%之CDCA。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有少於約0.5%之CDCA。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有少於約0.3%之CDCA。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有少於約0.2%之CDCA。在一個具體例中，歐貝提膽酸為歐貝提膽酸型式1。
在一個具體例中，歐貝提膽酸含有不超過(NMT)4%之CDCA和6-乙基熊去氧膽酸。
在一個具體例中，歐貝提膽酸含有不超過(NMT)1.5%之3α(3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽-24-醯氧基)-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有少於約1%之3α(3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽-24-醯氧基)-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有少於約0.07%之3α(3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽-24-醯氧基)-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有少於約0.06%之3α(3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽-24-醯氧基)-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸。在一個具體例中，歐貝提膽酸含有少於約0.05%之3α(3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽-24-醯氧基)-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸。在一個具體例中，歐貝提膽酸為歐貝提膽酸型式1。
口服調配物及投予
歐貝提膽酸係經口服投予。在一個具體例中，調配物 係經口服投予以預防或治療FXR調介之疾病或病況。在一個具體例中，調配物包含歐貝提膽酸型式1。在另一具體例中，調配物包含實質上純的歐貝提膽酸。
適合於口服投予之調配物可以下列者提供：分立單元，諸如片劑、膠囊、扁囊劑(由藥劑師用於給予藥物之糯米膠囊)、錠劑，各者含有預定量的歐貝提膽酸；粉末或顆粒；在水性或非水性液體中的溶液或懸浮液；或水包油或油包水乳液。
本發明調配物可以任何適合的方法製造，典型地藉由將歐貝提膽酸與液體或細碎的固體載劑或二者以所需之比例均勻且緊密地摻合，及若必要時接著將所得混合物定型成所欲形狀。
例如，片劑可藉由將包含歐貝提膽酸粉末或顆粒與一或多種隨意成分(諸如結合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑或表面活性分散劑)的緊密混合物壓縮，或藉由將粉末狀活性成分與惰性液體稀釋劑的緊密混合物模塑而製造。
例如，可投予一或多種片劑而得到基於受驗者重量的標的劑量水平，例如介於約30公斤至約70公斤之間的人類。
在一個具體例中，受驗者為孩童，且調配物係用於治療膽管閉鎖。亦稱為〝肝外膽管發育不良〞和〝進行性閉塞性膽管病變〞的膽管閉鎖為肝臟的先天性或後天性疾病且為同種異體肝移植之慢性排斥的主要形式之一。在先天性形式中，在肝臟與小腸之間的總膽管阻塞或不存在。後 天性類型最常發生在自體免疫疾病的境況中且為同種異體肝移植之慢性排斥的主要形式之一。
有膽管閉鎖的嬰兒和孩童患有進行性膽汁滯留，具有以下所有慣見的伴隨特性：黃疸、皮膚搔癢、吸收不良的生長遲緩、脂溶性維生素缺乏、高血脂症和最後具有肝門高壓症的肝硬化。若未經確診，則病況導致肝衰竭-但是沒有核黃疸，因為肝臟仍能夠接合膽紅素，而接合之膽紅素無法穿越血-腦障壁。病況的原因未知。唯一有效的治療為特定的手術，諸如肝門腸吻合術(kasai procedure)或肝臟移植。
在一個具體例中，當人類孩童出生時沒有膽管或在出生時膽管完全阻塞，則使孩童進行肝門腸吻合術，其中肝門腸吻合術有效地給予他們有功能的膽管。
除了上文特別述及的成分以外，本發明的口服調配物可包括那些熟諳關於發佈的調配物類型之配藥學技藝者已知的其他劑。適合的口服調配物可包括調味劑。
在一個具體例中，本發明關於歐貝提膽酸，或其醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物的醫藥調配物，其中歐貝提膽酸係以本發明方法製造(歐貝提膽酸型式1)。在另一具體例中，調配物係經口服投予。
在一個具體例中，調配物係呈片劑形式。在另一具體例中，調配物包含歐貝提膽酸及一或多種選自下列者之組份：微結晶纖維素、澱粉乙醇酸鈉、硬脂酸鎂、包覆材料或膠態二氧化矽。在一個具體例中，包覆材料為Opadry® 包覆材料。
在另一具體例中，調配物以每片劑包含約0.1毫克至約1500毫克歐貝提膽酸。在另一具體例中，調配物包含約1毫克至約100毫克。在另一具體例中，調配物包含約1毫克至約50毫克。在另一具體例中，調配物包含約1毫克至約30毫克。在另一具體例中，調配物包含約4毫克至約26毫克。在另一具體例中，調配物包含約5毫克至約25毫克。在一個具體例中，調配物包含約1毫克至約2毫克。在一個具體例中，調配物包含約1.2毫克至約1.8毫克。在一個具體例中，調配物包含約1.3毫克至約1.7毫克。在一個具體例中，調配物包含約1.5毫克。
在一個具體例中，調配物以每片劑包含約1毫克至約25毫克歐貝提膽酸。在一個具體例中，調配物包含約1毫克歐貝提膽酸，約180至約190毫克微結晶纖維素，約10至約15毫克澱粉乙醇酸鈉，約1至約3毫克硬脂酸鎂，及約5毫克至約10毫克包覆材料。在一個具體例中，包覆材料為Opadry®包覆材料。
在一個具體例中，調配物以每片劑包含約1毫克至約25毫克歐貝提膽酸。在一個具體例中，調配物包含約1毫克歐貝提膽酸，約185.0毫克微結晶纖維素，約12.0毫克澱粉乙醇酸鈉，約2.0毫克硬脂酸鎂，及約8.0毫克包覆材料。在一個具體例中，包覆材料為Opadry®包覆材料。
在一個具體例中，調配物以每片劑包含約1毫克至約 25毫克歐貝提膽酸。在一個具體例中，調配物包含約5毫克歐貝提膽酸，約175至約190毫克微結晶纖維素，約10至約15毫克澱粉乙醇酸鈉，約1至約3毫克硬脂酸鎂，及約5毫克至約10毫克包覆材料。在一個具體例中，包覆材料為Opadry®包覆材料。
在一個具體例中，調配物以每片劑包含約1毫克至約25毫克歐貝提膽酸。在一個具體例中，調配物包含約5毫克歐貝提膽酸，約181.0毫克微結晶纖維素，約12.0毫克澱粉乙醇酸鈉，約2.0毫克硬脂酸鎂，及約8.0毫克包覆材料。在一個具體例中，包覆材料為Opadry®包覆材料。
在一個具體例中，調配物以每片劑包含約1毫克至約25毫克歐貝提膽酸。在一個具體例中，調配物包含約10毫克歐貝提膽酸，約170毫克至約180毫克微結晶纖維素，約10毫克至約15毫克澱粉乙醇酸鈉，約1毫克至約3毫克硬脂酸鎂，及約5毫克至約10毫克包覆材料。在一個具體例中，包覆材料為Opadry®包覆材料。
在一個具體例中，調配物以每片劑包含約1毫克至約25毫克歐貝提膽酸。在一個具體例中，調配物包含約10毫克歐貝提膽酸，約176.0毫克微結晶纖維素，約12.0毫克澱粉乙醇酸鈉，約2.0毫克硬脂酸鎂，及約8.0毫克包覆材料。在一個具體例中，包覆材料為Opadry®包覆材料。
在一個具體例中，調配物以每片劑包含約1毫克至約 25毫克歐貝提膽酸。在一個具體例中，調配物包含約25毫克歐貝提膽酸，約150毫克至約160毫克微結晶纖維素，約10毫克至約15毫克澱粉乙醇酸鈉，約1毫克至約3毫克硬脂酸鎂，約5至約10毫克包覆材料，及約1至約10毫克膠態二氧化矽。在一個具體例中，包覆材料為Opadry®包覆材料。
在一個具體例中，調配物以每片劑包含約1毫克至約25毫克歐貝提膽酸。在一個具體例中，調配物包含約25毫克歐貝提膽酸，約157.0毫克微結晶纖維素，約12.0毫克澱粉乙醇酸鈉，約2.0毫克硬脂酸鎂，約8.0毫克包覆材料，及約4.0毫克膠態二氧化矽。在一個具體例中，包覆材料為Opadry®包覆材料。
在本文所使用之所有百分比及比值皆以重量計，除非另有其他指示。二聚物雜質百分比係以面積百分比為基準，典型地以分析用HPLC定量。
在整個說明書中，將組成物說明為具有、包括或包含特定組份時，其涵蓋組成物亦在本質上由或亦由所引用之組份所組成。同樣地，將方法(methods或processes)說明為具有、包括或包含特定的方法步驟時，該方法亦在本質上由或亦由所引用之處理步驟所組成。應進一步瞭解步驟的次序或執行特定作用的次序無關緊要，只要本發明仍可操作。而且，二或多個步驟或作用可同時進行。
片劑調配物
API：活性醫藥成分
HSE=內部規格
USP-NF=美國藥典國家配方(US Pharmacopeia National Formulary)
Ph Eur=歐洲藥典
JP=日本藥典
*所呈示之歐貝提膽酸量假定API為無水的且具有100%之純度；實際的量係基於所使用之藥物物質批貨的效力來調整，且相應降低微結晶纖維素的量。
在一個具體例中，片劑包含黃色Opadry®。在另一具體例中，片劑包含白色Opadry®。在另一具體例中，片劑包含綠色Opadry®。
醫藥組成物
歐貝提膽酸(包括歐貝提膽酸型式1、實質上純的歐貝提膽酸型式及結晶狀歐貝提膽酸型式)，或其醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物有用於各種藥用目的。歐貝提膽酸可用在預防或治療FXR調介之疾病或病況的方法中。在一個具體例中，疾病或病況係選自膽管閉鎖、膽汁瘀積性肝病、慢性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、C型肝炎感染、酒精性肝病、原發性膽汁性肝硬化(PBC)、由於進行性纖維變性、肝纖維變性和心血管疾病(包括動脈粥樣硬化、動脈硬化症、高膽固醇血症和高血脂症)的肝功能損害。在一個具體例中，歐貝提膽酸型式1可用於降低三酸甘油酯的方法中。在一個具體例中，結晶狀歐貝提膽酸可用於降低三酸甘油酯的方法中。歐貝提膽酸型式1或結晶狀歐貝提膽酸可增加HDL。歐貝提膽酸型式1或結晶狀歐貝提膽酸的其他效應包括降低鹼性磷酸酶(ALP)、膽紅素、ALT、AST和GGT。
在一個具體例中，本發明關於一種包含歐貝提膽酸及醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物，其中歐貝提膽酸係以本發明方法製造，例如歐貝提膽酸型式1。在一個具體例中，醫藥組成物包含實質上純的歐貝提膽酸及醫藥上可接受之載劑。在另一具體例中，醫藥組成物包含結晶狀歐貝 提膽酸及醫藥上可接受之載劑。在另一具體例中，結晶狀歐貝提膽酸為型式C。
在一個具體例中，本發明關於一種治療或預防受驗者中的FXR調介之疾病或病況的方法，其包含投予有效量的以本發明方法所製造之歐貝提膽酸型式1或其醫藥組成物。在一個具體例中，本發明關於一種治療或預防受驗者中的FXR調介之疾病或病況的方法，其包含投予有效量的以本發明方法所製造之實質上純的歐貝提膽酸或其醫藥組成物。在一個具體例中，本發明關於一種治療或預防在受驗者中的FXR調介之疾病或病況的方法，其包含投予有效量的結晶狀歐貝提膽酸或其醫藥組成物。在另一具體例中，結晶狀歐貝提膽酸為型式C。在一個具體例中，結晶狀歐貝提膽酸為型式A。在一個具體例中，結晶狀歐貝提膽酸為型式C。在一個具體例中，結晶狀歐貝提膽酸為型式D。在一個具體例中，結晶狀歐貝提膽酸為型式F。在一個具體例中，結晶狀歐貝提膽酸為型式G。
在另一具體例中，疾病或病況為心血管疾病或膽汁瘀積性肝病及降低三酸甘油酯。在另一具體例中，心血管疾病為動脈粥樣硬化或高膽固醇血症。在另一具體例中，受驗者為哺乳類。在另一具體例中，哺乳類為人類。
在另一具體例中，化合物或醫藥組成物係經口服、非經腸或局部投予。在另一具體例中，化合物或醫藥組成物係經口服投予。
在一個具體例中，本發明關於一種抑制在患有膽汁瘀 積病況之受驗者中的纖維變性之方法，該方法包含將有效量的歐貝提膽酸或其醫藥組成物投予受驗者的步驟，其中歐貝提膽酸係以本發明方法製造。在一個具體例中，本發明關於抑制在未患有膽汁瘀積病況之受驗者中的纖維變性之方法，該方法包含將有效量的歐貝提膽酸或其醫藥組成物投予受驗者的步驟，其中歐貝提膽酸係以本發明方法製造。在具體例中，欲抑制之纖維變性係發生在表現FXR之器官中。
在一個具體例中，膽汁瘀積病況被定義為具有不正常上升之鹼性磷酸酶、7-穀胺醯轉肽酶(GGT)和5’核苷酸酶血漿值。在另一具體例中，膽汁瘀積病況被進一步定義為呈現至少一種臨床徵候。在另一具體例中，徵候為搔癢(皮膚搔癢)。在另一具體例中，纖維變性係選自由下列者所組成之群組：肝纖維變性、腎纖維變性和腸纖維變性。在另一具體例中，膽汁瘀積病況係選自由下列者所組成之群組：原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、藥物誘發之膽汁淤積、遺傳性膽汁淤積和妊娠期肝內膽汁淤積。在另一具體例中，受驗者未患有與選自由下列者所組成之疾病或病況相關聯的膽汁瘀積病況：原發性肝癌和膽道癌、轉移性癌症、敗血症、慢性全腸外營養、囊性纖維變性和肉芽腫性肝病。
在另一具體例中，受驗者患有與選自由下列者所組成之疾病相關聯的肝纖維變性：B型肝炎；C型肝炎；寄生蟲性肝病；移植後的細菌、病毒和真菌感染；酒精性肝病 (ALD)；非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)；非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；由甲氨蝶呤(methotrexate)、異煙肼(isoniazid)，氧芬尼它汀(oxyphenistatin)、甲基多巴(methyldopa)、氯丙嗪(chlorpromazine)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)或胺碘酮(amiodarone)所誘發之肝病；自體免疫性肝炎；類肉瘤病；威爾森氏(Wilson's)症；血色素沉著症，高雪氏(Gaucher’s)病；III、IV、VI、IX和X型肝糖貯積症；α1-抗胰蛋白酶缺乏症；齊薇格(Zellweger)症候群；酪胺酸血症；果糖血症；半乳糖血症；與布加氏(Budd-Chiari)症候群、小靜脈閉塞病或門靜脈血栓形成相關聯的血管損壞；及先天性肝纖維變性。
在另一具體例中，受驗者患有與選自由下列者所組成之疾病相關聯的腸纖維變性：克隆氏(Crohn’s)病、潰瘍性結腸炎，輻射後的結腸炎和微小性結腸炎。
在另一具體例中，受驗患有與選自由下列者所組成之疾病相關聯的腎纖維變性：糖尿病腎病變、高血壓性腎硬化、慢性腎小球腎炎、慢性移植腎小球病、慢性間質性腎炎和多囊性腎病。
定義
為方便起見，在說明書、實施例及所附申請專利範圍中所使用之特定術語收集於此。
如本文所使用之術語〝歐貝提膽酸〞或〝OCA〞係指 具有以下化學結構之化合物： 歐貝提膽酸的其他化學名稱包括：3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸、6α-乙基-鵝去氧膽酸、6-乙基-CDCA、6ECDCA、膽烷-24-酸，6-乙基-3,7-二羥基-,(3α,5β,6α,7α)-和INT-747。歐貝提膽酸之CAS登錄號為459789-99-2。此術語係指歐貝提膽酸的所有型式，例如非結晶狀、結晶狀和實質上純的型式。
如本文所使用之術語〝結晶狀歐貝提膽酸〞係指具有以下化學結構之化合物的任何結晶型式： 結晶狀歐貝提膽酸意指使化合物結晶成三維空間中特定的晶體堆積排列或具有外面平面的化合物。結晶型式之歐貝提膽酸(或其醫藥上可接受之鹽、胺基酸共軛物、溶劑化物)可結晶成不同的晶體堆積排列，全部皆具有相同的元素組成之歐貝提膽酸。不同的晶型通常具有不同的X-射線繞射圖案、紅外光譜、熔點、密度硬度、晶體形狀、光 學和電性質、穩定性及溶解度。再結晶溶劑、結晶速率、貯存溫度和其他因素可使得一種晶型佔優勢。歐貝提膽酸的晶體可藉由在不同的條件下結晶而製得，例如不同的溶劑、溫度等。
如本文所使用之術語〝結晶狀歐貝提膽酸型式C〞係指具有實質上類似於圖5中所示之X-射線繞射圖案的結晶型式之歐貝提膽酸，例如以實施例3中特徵化之結晶型式。
如本文所使用之術語〝實質上純的貝提膽酸〞係指具有效力大於約95%之歐貝提膽酸。歐貝提膽酸的效力考慮歐貝提膽酸樣品中的雜質，包括例如水、溶劑及其他有機和無機雜質。在另一具體例中，已知的效力標準為100%之歐貝提膽酸，且效力係藉由從100%之已知標準減去雜質(諸如溶劑、水及其他有機和無機雜質)的百分比來測定。在一個態樣中，無機雜質包括例如無機鹽和硫酸灰份。在一個態樣中，有機雜質包括6-乙基熊去氧膽酸、3α-羥基-6α-乙基-7-夏托-5β-膽烷-24-酸、6β-乙基鵝去氧膽酸、3α,7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷-24-酸、鵝去氧膽酸和3α(3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽-24-醯氧基)-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸。雜質量可以本技術領域中已知的程序測定，例如HPLC、NMR或來自美國藥典或歐洲藥典之方法或該等方法中之二或多者之組合。
如本文所使用之術語〝純度〞係指從例如HPLC所獲 得的化合物之化學分析。在一個具體例中，化合物的純度係與參考標準物(例如，歐貝提膽酸)的純度比較，其係經由比較用的該等各自波峰下的面積進行比較。在一個具體例中，純度說明在樣品中的有機雜質。
如本文所使用之術語〝反應混合物〞係指一或多種物質組合在一起的混合物。在一個具體例中，物質的混合或組合引起原始物質中之一或多者的化學轉變或改變。
如本文所使用之術語〝歐貝提膽酸型式1〞係指非結晶狀歐貝提膽酸。在一個具體例中，此型式之歐貝提膽酸係經由作為合成中間物的結晶狀歐貝提膽酸而製得。例如，此型式之歐貝提膽酸係以本發明方法經由作為合成中間物的結晶狀歐貝提膽酸型式C而製得。在一個具體例中，歐貝提膽酸型式1為用作為醫藥活性成分的型式。更多的細節參閱實施例5。
〝治療〞包括造成病況、疾病、病症等改進的任何效應，例如減輕、減少、調節或消除。疾病狀態的〝治療(treating或treatment)〞包括抑制疾病狀態，亦即遏止疾病狀態或其臨床徵候的發展；或緩和疾病狀態，亦即引起疾病狀態或其臨床徵候的暫時性或永久性退化。
〝預防〞疾病狀態包括在可能暴露於或易感染疾病狀態，但是尚未經歷或顯現疾病狀態之徵候的受驗者中未引起疾病狀態之臨床徵候的發展。
〝疾病狀態〞意指任何疾病、病症、病況、徵候或徵兆。
如本文所使用之術語〝有效量〞係指在投予適當的劑量時產生急性或慢性療效的歐貝提膽酸量(例如，FXR-活化配位基)。該療效包括預防、矯治、抑制或逆轉疾病/病況(例如，肝、腎或腸的纖維變性)之徵候、前兆和潛在的病變及任何可偵測程度相關併發症。
〝治療有效量〞意指在投予哺乳類以治療疾病時足以實現此疾病治療的歐貝提膽酸量。〝治療有效量〞將取決於歐貝提膽酸，疾病和其嚴重性，及欲治療之哺乳類的年齡、體重等而改變。
治療有效量的歐貝提膽酸可以投予人類或動物的醫藥上可接受之載劑調配。據此，歐貝提膽酸或其調配物可例如經由口、非經腸或及局部途徑投予，以提供有效量的化合物。在可替代的具體例中，依照本發明所製造之歐貝提膽酸可用於包覆或浸漬醫療裝置，例如支架。
如本文所使用之〝藥理效應〞包含在受驗者中所產生以達成意欲之治療目的的效應。在一個具體例中，藥理效應意指預防、減輕或減少在治療之受驗者的主要徵兆。例如，藥理效應可為造成經治療之受驗者中的主要徵兆之預防、減輕或減少的效應。在另一具體例中，藥理效應意指預防、減輕或減少在治療之受驗者的主要徵兆之病症或徵候。例如，藥理效應可為造成經治療之受驗者中的主要徵兆之預防或減少的效應。
本發明亦包含經同位素標記之歐貝提膽酸，或其醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物，其與那些以本 發明及隨後的化學式中所引用者相同，但事實是一或多個原子以具有原子量或質量數與自然中最常發現的原子量或質量數不同的原子取代。可併入歐貝提膽酸，或其醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物之同位素的實例包括氫、碳、氮、氟之同位素，諸如3H、11C、14C和18F。
含有前述同位素及/或其他原子的同位素之歐貝提膽酸，或其醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物係在本發明的範圍內。例如，那些併入放射活性同位素(諸如3H、14C)的經同位素標記之歐貝提膽酸，或其醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物有用於藥物及/或基質組織分布檢定法中。氚化(亦即3H)和碳-14(亦即14C)同位素係由於其容易製造及可偵測性而特別佳。再者，以較重的同位素取代(諸如氘，亦即2H)可由於較大的代謝穩定性而供給特定的治療優勢，例如增加活體內半生期或降低劑量需求，而因此在一些境況中可能較佳，經同位素標記之歐貝提膽酸，或其醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物通常可藉由進行在本發明的流程及/或實施例中所揭示之程序，以可輕易取得的經同位素標記之試劑取代未經同位素標記之試劑而製得。在一個具體例中，歐貝提膽酸，或其醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物未經同位素標記。在一個具體例中，氘化歐貝提膽酸有用於生物分析檢定法。在另一具體例中，歐貝提膽酸，或其醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物係經放射標記。
〝幾何異構物〞意指非鏡像異構物，彼等的存在歸功於雙鍵周圍的旋轉受阻。該等構型係以其名稱的字首順式和反式，或Z和E而予以區別，該等指出基團係根據Cahn-Ingold-Prelog規則在分子中之雙鍵的同一邊或對立邊。
〝溶劑化物〞意指含有化學計量或非化學劑量之溶劑的溶劑加成形式。歐貝提膽酸可具有捕陷固定的莫耳比之溶劑分子於結晶固態中的傾向，因此形成溶劑化物。若溶劑為水，則所形成的溶劑化物為水合物，當溶劑為醇時，則所形成的溶劑化物為醇化物。水合物係藉由組合一或多個水分子與物質中之一而形成，其中水保留其為H2O的分子態，此組合能夠形成一或多種水合物。另外，本發明化合物(例如，化合物之鹽)可以水合或非水合(無水)形式，或以與其他溶劑分子的溶劑化物存在。水合物的非限制性實例包括單水合物、二水合物等。溶劑化物的非限制性實例包括乙醇溶劑化物、丙酮溶劑化物等。
〝互變異構物〞係指其結構有顯著不同的原子排列，但是以容易且快速平衡存在的化合物。應瞭解可將歐貝提膽酸描述為不同的互變異構物。亦應瞭解當歐貝提膽酸及本發明的合成中間物具有互變異構物形式時，則亦意欲使所有的互變異構物形式在本發明的範圍內，且歐貝提膽酸的命名不排除任何互變異構物形式。歐貝提膽酸及本發明的合成中間物可以數種互變異構物形式存在，包括酮-烯醇。例如，在酮-烯醇互變異構現象中，電子與氫原子同 時發生位移。互變異構物係以互變異構物組在溶液中的混合物存在。在固體形式中，通常以一種互變異構物佔優勢。儘管可以一種互變異構物說明，但是本發明包括本發明化合物的所有互變異構物。
應據此瞭解由不對稱碳原子所引起之異構物(例如，所有的鏡像異構物和非鏡像異構物)包括在本發明的範圍內，除非另有其他指示。此等異構物可藉由傳統的分離技術及立體化學控制之合成法而以實質上純的形式獲得。此外，在本申請案中所討論之結構及其他化合物和部分亦包括其所有的互變異構物。烯屬烴在適當時可包括E-或Z-幾何性。歐貝提膽酸及合成中間物可以立體異構物形式存在，而因此可以個別的立體異構物或混合物製得。
〝醫藥組成物〞為適合投予受驗者之形式的含有歐貝提膽酸之調配物。在一個具體例中，醫藥組成物係呈散裝形式或單位劑型。可能有利的是調配成容易投予且劑量均勻的單位劑型之組成物。如本文所使用之單位劑型係指適合於欲治療之受驗者的單一劑量之物理分立單位；各單位含有經計算與必需之醫藥載劑結合以產生所欲療效的預定量之活性試劑。本發明的單位劑型規格係由且直接取決於活性試劑獨有的特徵及欲達成之特別療效，以及在化合此治療個體的活性劑之技藝中固有的限制來指定。
單位劑型為各種形式中之任一者，包括例如膠囊、IV袋、片劑、在氣霧吸入器上的單泵、或小瓶。在單位劑量之組成物中的歐貝提膽酸數量(例如，歐貝提膽酸，或其 醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物之調配物)為有效量且根據所涉入之特殊治療而改變。熟諳所屬技術領域者應認知有時必須取決於病患的年齡和病況而進行劑量的例行變化。劑量亦取決於投予途徑。涵蓋各種途徑，包括經口、肺、直腸、非經腸、透皮、皮下、靜脈內、肌肉內、腹膜內、吸入、頰內、舌下、胸膜內、鞘內、鼻內及類似者。用於局部或透皮投予本發明化合物的劑型包括粉末、噴霧劑、軟膏、糊劑、乳霜、洗劑、凝膠、溶液、貼片和吸入劑。在一個具體例中，歐貝提膽酸係在無菌條件下與醫藥上可接受之載劑及必需的任何保存劑、緩衝劑或推進劑混合。
術語〝閃釋劑量(flash dose)〞係指快速分散劑型的歐貝提膽酸調配物。
術語〝立即釋放〞被定義為在相對短的時間期限內從劑型釋放歐貝提膽酸，通常至多約60分鐘。術語〝修正釋放〞被定義為延遲釋放、延長釋放和脈衝式釋放。術語〝脈衝釋放〞被定義為從劑型一連串性釋放藥物。術語〝持續釋放〞或〝延長釋放〞被定義為經延長期間連續從劑型釋放歐貝提膽酸。
〝受驗者〞包括哺乳類，例如人類、作伴動物(例如，狗、貓、鳥及類似者)、農場動物(例如，牛、羊、豬、馬、禽類及類似者)和實驗室動物(例如，大鼠、小鼠、天竺鼠、鳥及類似者)。在一個具體例中，受驗者為人類。在一個具體例中，受驗者為人類孩童(例如，介於約 30公斤至約70公斤之間)。在一個具體例中，人類孩童曾經肝門腸吻合術，當他們出生時沒有膽管或在出生時膽管完全阻塞，其中肝門腸吻合術有效地給予他們有功能的膽管。
如本文所使用之詞組〝醫藥上可接受〞係指在健全的醫療判斷範圍內適合與人類及動物組織接觸使用而沒有過量毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症且具有相稱合理的利益/風險比的那些化合物、材料、組成物、載劑及/或劑型。
〝醫藥上可接受之賦形劑〞意指有用於製造通常安全、無毒性且既不是生物學上，亦不是其他方面非所欲的醫藥組成物之賦形劑，且包括獸醫用途以及人類醫藥用途可接受之賦形劑。在說明書及申請專利範圍中所使用之〝醫藥上可接受之賦形劑〞同時包括一種及一種以上的此等賦形劑。
雖然有可能直接投予歐貝提膽酸而不以任何調配物，但是歐貝提膽酸通常係以包含醫藥上可接受之賦形劑及歐貝提膽酸的醫藥調配物形式投予。該等調配物可以各種途徑投予，包括經口、頰內、直腸、鼻內、透皮、皮下、靜脈內、肌肉內和鼻內。在本文以〝口服調配物及投予〞為標題之章節中進一步說明歐貝提膽的口服調配物。
在一個具體例中，歐貝提膽酸可透皮投予。為了透皮投予，故需要透皮輸送裝置(〝貼片〞)。此等透皮貼片可用於提供連續或不連續灌注量受到控制的本發明化合物 。用於輸送藥劑的透皮貼片之構造及用途為本技術領域中所熟知。參閱例如美國專利案號5,023,252。此等貼片可建構為連續式、脈衝式或按需要輸送藥劑。
在本發明的一個具體例中，其係提供一種在適合於頰內及/或舌下或經鼻投予之調配物中包含至少如上述之歐貝提膽酸的醫藥調配物。此具體例提供以避免牽連胃(諸如胃系統及/或通過肝的首過代謝)的方式投予歐貝提膽酸。此投予途徑亦可減少吸附時間，提供更快速開始的治療優勢。本發明化合物可提供特別有利的溶解度輪廓，其有助於舌下/頰內用調配物。此等調配物通常需要相對高濃度的活性成分，在調配物與表面積接觸之相對短的期間內輸送足夠的活性成分量至有限的舌下/頰黏膜表面積，允許活性成分吸收。因此，非常高活性的歐貝提膽酸與其高溶解度的組合有助於其於舌下/頰內用調配物的適用性。
歐貝提膽酸較佳地調配成單位劑型，各劑型含有從約0.1毫克至約1500毫克。在另一具體例中，調配物包含約1毫克至約100毫克。在另一具體例中，調配物包含約1毫克至約50毫克。在另一具體例中，調配物包含約1毫克至約30毫克。在另一具體例中，調配物包含約4毫克至約26毫克。在另一具體例中，調配物包含約5毫克至約25毫克。在一個具體例中，調配物包含約1毫克至約2毫克。在一個具體例中，調配物包含約1.2毫克至約1.8毫克。在一個具體例中，調配物包含約1.3毫克至約1.7 毫克。在一個具體例中，調配物包含約1.5毫克。術語〝單位劑型〞係指適合於人類受驗者和其他哺乳類的單一劑量之物理分立單位，各單位含有經計算與如上述之適合的醫藥賦形劑結合以產生所欲療效的預定量之活性材料。
歐貝提膽酸通常有很寬的有效劑量範圍。例如，每天的劑量正常係落在約0.0001至約30毫克/公斤體重之範圍內。在治療成年人時，以約0.1至約15毫克/公斤/天之範圍的單次或分次劑量尤其較佳。在具體例中，調配物包含約0.1毫克至約1500毫克。在另一具體例中，調配物包含約1毫克至約100毫克。在另一具體例中，調配物包含約1毫克至約50毫克。在另一具體例中，調配物包含約1毫克至約30毫克。在另一具體例中，調配物包含約4毫克至約26毫克。在另一具體例中，調配物包含約5毫克至約25毫克。在一個具體例中，調配物包含約1毫克至約2毫克。在一個具體例中，調配物包含約1.2毫克至約1.8毫克。在一個具體例中，調配物包含約1.3毫克至約1.7毫克。在一個具體例中，調配物包含約1.5毫克。然而，應瞭解實際投予之歐貝提膽酸量係由醫師按照相關境況來決定，包括欲治療之病況，所選擇之投予途徑，歐貝提膽酸之投予形式，個體病患的年齡、體重和反應，及病患徵候的嚴重性，因此上述劑量範圍不意欲以任何方式限制本發明的範圍，在一些事例中，比前述範圍之下限低的劑量水平可能更適當，而在其他的情況中，還可能使用更大的劑量而不引起任何有害的副作用，其先決條件為此 等較大的劑量先分成供整天投予的數個較小的劑量。
〝本發明方法〞係指製造如本文所述之歐貝提膽酸的方法，其中該方法包含結晶狀歐貝提膽酸。
〝纖維變性〞係指涉及組織或器官中過度的纖維結締組織(例如，疤痕組織)發展的病況。此疤痕組織的產生可回應於感染、發炎或由於疾病、創傷、化學毒性等等的器官傷害而發生。纖維變性可在各種不同的組織和器官中發展，包括肝、腎、腸、肺、心臟等。
如本文所使用之術語〝抑制(inhibiting或inhibition)〞係指對疾病或病況的發展或進行有任何可偵測的正面效應。此正面效應可包括延遲或預防疾病或病況之至少一種徵候或前兆的開始，徵候或前兆的減輕或逆轉，及減慢或預防徵候或前兆的進一步惡化。
如本文所使用之〝膽汁瘀積病況〞係指其中從肝排泄膽汁受損或阻塞的任何疾病或病況，其可以發生在肝中或膽管中。肝內膽汁淤積和肝外膽汁淤積為膽汁瘀積病況的兩種類型。肝內膽汁淤積(其發生在肝的內部)最常見於原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、敗血症(全身性感染)、急性酒精性肝炎，藥物毒性，全腸外營養(經靜脈內餵食)、惡性腫瘤，囊性纖維變性和懷孕中。肝外膽汁淤積(其發生在肝的外部)可由膽管腫瘤、狹窄(stricture)、囊腫、憩室、在總膽管中形成結石、胰腺炎、胰腺腫瘤或假囊腫，及由於附近器官中的質量或腫瘤壓迫所引起。
膽汁瘀積病況的臨床徵候和前兆包括：搔癢(皮膚搔癢)、疲勞、患黃疸的皮膚或眼睛、無法消化某些食物、噁心、嘔吐、大便灰白、尿色深和右上腹部疼痛。患有膽汁瘀積病況的病患可基於一套標準的臨床實驗室試驗在臨床上進行診斷和追蹤，包括測量在病患血清中的鹼性磷酸酶、γ-穀胺醯轉肽酶(GGT)、5’核苷酸酶、膽紅素、膽酸和膽固醇水平。若診斷的全部三種標記物：鹼性磷酸酶、GGT和5'核苷酸酶之血清水平被認為異常升高時，則通常病患被診斷為膽汁瘀積病況。該等標記物的正常血清水平可取決於測試方案而從實驗室至實驗室及從程序至程序有一定程度的變化。因此，醫師能夠基於特定的實驗室及試驗程序來決定什麼是每個標記物異常升高的血液水平。例如，患有膽汁瘀積病況的病患通常在血液中具有大於約125 IU/L之鹼性磷酸酶，大於約65 IU/L之GGT，及大於約17 NIL之5’核苷酸酶。因為血清標記物水平的變異性，所以除了上述徵候中之至少一者(諸如搔癢(皮膚搔癢))以外，膽汁瘀積病況尚可基於該三種標記物的異常水平來診斷。
術語〝器官〞係指由細胞和組織所組成及在有機體中執行一些特定功能的分化性結構(如在心臟、肺、腎、肝等中)。此術語亦包含執行功能或在動作中合作(例如，眼睛及構成視覺器官的相關結構)的身體部位。術語〝器官〞進一步包含可能有發展成完整結構的能力之分化性細胞和組織的任何部分結構(例如，肝葉或肝切片)。
將本文所引用之所有公開案及專利文件併入本文以供參考，如同每個該等公開案或文件係經特別且單獨指出以併入本文以供參考。公開案及專利文件的引用不意欲承認任何有關的先前技藝，亦不構成任何對其內容或日期的承認。現以書面說明方式說明本發明，那些熟諳所屬技術領域者應認知本發明可以各種具體例實行，而且前述的說明及以下的實施例係以說明為目的，並非限制隨後的申請專利範圍。
在說明書中，單數形式亦包括複數，除非上下文另有其他明確的指定。在本文所使用之所有技術和科學術語具有與一般熟諳屬於本發明之技術領域者共同理解的相同意義，除非另有其他定義。在衝突的情況下，由本發明支配。
本文所使用之所有百分比及比值係以重量計，除非另有其他指示。
實施例 實施例1：歐貝提膽酸的合成
在此合成程序中所論及的化合物編號係指那些流程1及對應於每個步驟的反應中所見到的。
步驟1-3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(1)的製造：
反應1：7-酮基石膽酸(KLCA)之C-24羧酸的酯化作用
將3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(KLCA；500.0公克，1.28莫耳)使用甲醇(2500毫升)在酸性觸媒的存在下(硫酸，1.0毫升)酯化且加熱至多62℃至64℃經約3小時，得到3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(1)。在此反應中，甲醇充當甲基化試劑以及反應溶劑。將pH-值以氫氧化鈉溶液(2N)調整至pH 7.0至7.5，以進行整理。將溶液以活性碳(25公克)處理約30分鐘且過濾，以移除碳固體。另一選擇地，不將溶液以活性碳處理。為了使產物沉澱，在10℃至15℃經15分鐘添加水(625毫升)及添加接種材料。將反應混合物在10℃至15℃攪拌1小時。經約20至25分鐘添加另一部分的水(1875毫升)。將產物懸浮液在10℃至15℃攪拌30分鐘。將產物以離心分離且以甲醇與水的混合物(1：1，350毫升)清洗。將濕材料的水含量以卡耳費雪法(KF)定量。將材料在真空下的滾筒式乾燥機中以NMT 70℃乾燥。亦可以未乾燥的材料用於下一步驟中。產量(以乾燥之產物計算)為501.4公克(1.24莫耳，96.8%)。
步驟2-3α,7α-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯(3)的製造：
反應2：從7-酮基石膽酸甲酯形成矽烷基烯醇醚
將含有殘餘水及甲醇的化合物1(60.69公克，150毫莫耳，以無水物質計算)裝入在惰性條件下的反應器中且溶解在四氫呋喃(THF，363毫升)中。在約65℃及正常壓力下以重複的共沸蒸餾移除水及甲醇。在必要時添加THF至殘餘物中且重複蒸餾約4次。剩餘溶液必須具有≦0.05%(卡耳費雪法滴定)之最終水含量。將此溶液預冷卻至-20℃至-25℃且接著以約30至45分鐘添加氯三甲基矽烷(73.33公克，675毫莫耳，4.5當量)。在氮氛圍下，將二異丙基醯胺鋰(28%之LDA溶液，900毫莫耳)及THF(504毫升)裝入單獨的惰性反應器中且冷卻至-20℃至-25℃。將化合物1、THF(84毫升)及氯三甲基矽烷的無水冷卻溶液裝入在-20℃至-25℃之LDA溶液中。接著將 反應混合物攪拌約2小時。將反應混合物添加至2℃至8℃的預冷卻之檸檬酸水溶液(在300毫升中的34.6公克)中，以進行整理。在添加之後，將水相分離且棄置。在最高50℃以真空蒸餾移除有機相的液體。分離之殘餘物含有化合物3和一些殘餘溶劑且以〝原樣子〞用於下一步驟中。
步驟3-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯(4)的製造：
反應3：矽烷基烯醇醚與乙醛的醛醇縮合反應
將THF中的化合物3(164.68公克，300毫莫耳，以乾燥物質計算)之溶液裝入惰性反應器中。將殘餘的THF量在真空下以50℃之最高溫度蒸餾。將殘餘物中的水含量限制至≦0.5%(卡耳費雪法滴定)，以便繼續進行。接著將殘餘物溶解在二氯甲烷(200毫升)中且預冷卻至-60℃至-65℃。接著添加乙醛(33.8毫升，600毫莫耳)。在氮氛圍下，將二氯甲烷(700毫升)及三氟化硼(在乙腈中的16重量%之溶液，318公克，750毫莫耳)乙腈 複合物裝入單獨的反應器中且接著冷卻至-60℃至-65℃。在-60℃至-65℃添加無水化合物3溶液。將反應混合物在-60℃至-65℃攪拌約2小時，加熱至多23℃至28℃，再攪拌約3小時且冷卻至約2℃至10℃，以進行水解/整理。將來自反應器的冷卻溶液添加至50重量%之苛性鹼(40毫升)與660毫升水之預冷卻水溶液中，以進行整理。在劇烈攪拌約10分鐘之後，將相分離且將(下)有機層轉移至單獨的反應器中。在NMT 50℃以蒸餾儘可能移除有機層的溶劑。將由化合物4及一些剩餘的乙腈和二氯甲烷所組成的殘餘物排放至鼓輪中。化合物4A(E/Z-異構物之混合物)亦可以上述步驟3之程序製造。
步驟4-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)的製造：
反應4：C-24酯的皂化作用
將化合物4(258.37公克，600毫莫耳，以乾燥物質計算)裝入惰性反應器中。在真空下以NMT 50℃之溫度蒸餾出殘餘的溶劑量。將殘餘物溶解在甲醇(360毫升)中且添加水(54毫升)及苛性鹼50重量%(54毫升)。 將反應混合物加熱至多49℃至53℃且在此溫度攪拌至少2小時。檢查反應混合物的pH且證實為>12。若pH<12，則添加額外的NaOH且重複2小時的反應時間。將溶液以水(1000毫升)稀釋且將溫度調整至25℃至35℃。允許反應混合物靜置至少30分鐘，以進行整理。將相分離且將下水層轉移至單獨的反應器中且將有機層棄置。將乙酸乙酯(1400毫升)及水性檸檬酸(在480毫升中的244公克)以劇烈攪拌添加至水層中。將反應混合物在25℃至35℃攪拌10分鐘。將相分離且將下水層棄置。從有機層蒸餾出乙酸乙酯且以乙酸乙酯(800毫升)替換。重複此操作，直到蒸餾物的水含量為NMT 1%為止或直到達成固定的沸點為止。將懸浮液冷卻至20℃至25℃，攪拌30分鐘，接著將產物分離且以乙酸乙酯(100毫升，3至4次)清洗。在真空下的滾筒式乾燥機中以約60℃進行乾燥。產量為118.71公克(從KLCA為47.5%)粗製化合物5。化合物4A(E/Z異構物之混合物)亦可用作為製造化合物5A(E/Z異構物之混合物)的起始材料。
粗製化合物5接著使用乙醇結晶。用於結晶之粗製化合物亦可為E/Z異構物之混合物(化合物5A)。將乙醇(390至520毫升)及粗製化合物5(130公克)裝入惰性反應器中。將反應混合物加熱至回流，以溶解粗製化合物5。接著將反應混合物以線性輪廓的受控之冷卻坡方式在3至5小時之內冷卻至15℃至20℃。將結晶狀化合物5A使用離心分離且接著以乙酸乙酯(50-100毫升，2次 )清洗。在真空下的滾筒式乾燥機中以約60℃進行乾燥。此導致85.8公克(66%)之產量。取得樣品以測量純化之化合物5的檢定、純度及濕度。純化之化合物5為3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸之E異構物。關於純化之化合物5的鑑證及特徵之完整細節，參閱實施例2。可隨意地分離純化之化合物5(E異構物)。E異構物與Z異構物具有不同的溶解度。E異構物具有低的可溶性且結晶，所以可洗出Z異構物。
製造化合物5的替代方法係如下。將化合物4(111.96公克)裝入惰性反應器中。在真空下以最高50℃蒸餾出殘餘的溶劑量(例如，乙腈、二氯甲烷)。將殘餘物溶解在甲醇(156毫升)中且冷卻至約10℃。添加自來水(23.4毫升)及苛性鹼50%(23.4毫升)。將反應混合物在約20℃至約25℃攪拌約4小時。將溶液以自來水(433毫升)稀釋且添加甲苯(144毫升)。在攪拌之後，將相分離且將下水層轉移至惰性反應器中。將有機層棄置。將乙酸乙酯(607毫升)及檸檬酸溶液(在208毫升水中的105.7公克)在劇烈攪拌期間添加至水層中。將相分離且將下水層棄置。將有機層轉移至惰性反應器中。從有機層蒸餾出乙酸乙酯且以乙酸乙酯(347毫升)替換。在一個具體例中，以乙酸乙酯(173毫升)重複此操作，直到蒸餾物的水含量不超過約1%為止或直到達成固定的沸點為止。將本發明懸浮液冷卻至約20℃至約25℃。將化合物5分離且以乙酸乙酯(3至4次，各43毫升)以 惰性離心清洗。在真空下的滾筒式乾燥機中及約60℃進行乾燥(以化合物1為基準計64.8%之產率)。化合物4A(E/Z異構物之混合物)亦可用作為製造化合物5A(E/Z異構物之混合物)之步驟4的起始材料。
步驟5-3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(6)的製造：
反應5：6-亞乙基部分的氫化作用
將純化之化合物5(110公克，264毫莫耳)、水(1100毫升)、50%之苛性鹼溶液(35.8毫升，682毫莫耳)與鈀觸媒(Pd/C，11公克)之混合物裝入氫化反應器中。將溫度調整至25℃至35℃且將反應器以氮(2巴)吹洗3次及以氫(1巴)吹洗3次。該等壓力閥係相對於周圍溫度(=0巴)而給定。施加5巴之氫壓力，將反應混合物經1.5小時期間加熱至多100℃(異構化至α位置)且接著攪拌3小時，同時維持氫壓力在4.5至5巴。接著將反應混合物冷卻至40℃至50℃。將Pd/C濾除，以進行整理。將乙酸正丁酯(1320毫升)及氫氯酸 (67.8毫升，815毫莫耳，37%)添加至過濾物中。將水相分離且棄置。將有機相在40至50℃以活性碳(5.5公克)處理約10分鐘。將活性碳濾除，將過濾物以蒸餾冷凝且將所得懸浮液在2至3小時之內冷卻至15℃至20℃。將沉澱之化合物6分離且以乙酸正丁酯(160毫升)清洗。將產物使用壓濾器過濾。在真空下的壓濾器中以約60℃進行乾燥。此導致89.8公克(81.2%)化合物6。化合物5A(E/Z異構物之混合物)可用在製造化合物6的步驟5中。
步驟6-3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸(歐貝提膽酸)的製造：
反應6：7-酮基成為7α-羥基的選擇性還原作用
將化合物6(86公克，205.4毫莫耳)、水(688毫升)與50%之氫氧化鈉溶液(56.4毫升)的混合物與硼氫化鈉(7.77公克，205.4毫莫耳)在50重量%之氫氧化鈉溶液(1.5毫升)與水(20毫升)的混合物中以90℃至105℃反應。將反應混合物加熱至回流且攪拌至少3小時。在反應完成之後，將反應混合物冷卻至約80℃且轉移 至冷卻之反應器中，以進行整理。在30℃至50℃添加在水(491毫升)中的乙酸正丁酯(860毫升)及檸檬酸(320.2公克，無水)。在檢查pH-值以確定其為酸性之後，將水相分離且棄置。將有機相轉移且蒸餾。將殘餘物以乙酸正丁酯稀釋，緩慢冷卻至15℃至20℃且將粗製歐貝提膽酸使用離心過濾。將濕產物從乙酸正丁酯結晶。將歐貝提膽酸產物分離且在惰性壓濾器中以乙酸正丁酯(43毫升，4次)清洗。在真空下的壓濾器中以約80℃進行乾燥。此導致67.34公克(77.9%)結晶狀歐貝提膽酸。關於結晶狀歐貝提膽酸的鑑證及特徵之完整細節，參閱實施例3。
步驟7-歐貝提膽酸型式1的製造：
反應7：從結晶狀歐貝提膽酸型式C製造歐貝提膽酸型式1
結晶狀歐貝提膽酸型式C(58公克)溶解在30℃至40℃之水(870毫升)及苛性鹼溶液(50%，8.7毫升，166毫莫耳)中。將混合物攪拌，直到所有的固體溶解為止。固體係使用以下的整理而沉澱。將歐貝提膽酸溶液在30℃至40℃經由過濾器緩慢地添加至水(870毫升)中的 稀釋之氫氯酸(37%，16.05毫升，193毫莫耳)。將懸浮液在30℃至40℃攪拌約30分鐘且接著冷卻至不超過(NMT)20℃。將產物分離且在惰性壓濾器中以水(465毫升，6次)清洗。在真空下的壓濾器中以NMT 50℃之溫度進行乾燥。此導致53.2公克(91.7%)歐貝提膽酸型式1。
實施例2：E-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸(5)之特徵
化合物5為本發明方法的重要中間物。將化合物與乙酸乙酯分離且接著從乙醇結晶。非常純的化合物5能以高效及高產能製造化合物6且接著製造結晶狀歐貝提膽酸型式C和歐貝提膽酸型式1，包括實質上純的歐貝提膽酸。
來自實施例1中的步驟4之化合物5的結構係使用1H NMR、13C NMR和質譜法認定。來自步驟4之粗製產物在利用LC/MS-連結的品質控制方法1所產生之UV層析圖中結果是在27.457分鐘之滯留時間(RT)的主要產物及在28.078分鐘之RT的次要產物。兩種產物為化合物5之E/Z異構物：
該兩種異構物在MS/MS光譜中顯示相同的精確質量及相同的片段。該等不可能以質譜數據區別。
利用半製備性方法分離E/Z異構物波峰，E/Z異構物之結構係使用兩階段法認定。HPLC品質控制方法1係使用非揮發性磷酸緩衝液，而因此與非揮發性緩衝液的直接LC/MS連結是不可行的。調整方法的初步試驗顯示僅UPLC方法能以非常多的管柱板數用於E/Z異構物的適當分離。兩階段法係如下：步驟A係以新發展之UPLC/MS方法鑑證在兩個樣品中的E/Z異構物，及步驟B係以HPLC方法2分離E/Z異構物波峰之沖提份及接著以UPLC/MS方法1鑑證。方法的實驗細節係如下：
結果顯示於圖1和2中。圖1和2為〝粗製化合物5〞(圖1)和以高性能UPLC管柱所獲得的化合物5〝純化之參考物〞(圖2)的UPLC UV/MS層析圖。關於圖1，將樣品以1毫克/毫升溶解在1：1之ACN/H2O中；200×2毫米Hypersil GOLD R122；LMA：H2O+10mM AF+0.1%之HFo；LMB：ACN；45%-20-60%(10)；0.4毫升/分鐘；40℃；UVA=200奈米；3微升注入體積。關於圖2，將樣品以1毫克/毫升溶解在ACN/H2O中；200×2 毫米Hypersil GOLD R122；A：10mM AF+0.1%之HFo；B：ACN；45%-20-60% B(10)；0.4毫升/分鐘；20微升注入體積。在兩種樣品中，主要組份(RT 9.92分鐘)及次要組份(RT 10.77分鐘)的分子量如所預期為相同的且兩種化合物的精確質量與顯示於下的正和負離子測量數據之表D和E中所示而提供之結構一致：
為了確保品質控制HPLC方法2的可攜性，在規定的條件下確切地重複原始操作。主要波峰和次要波峰係以半製備法分離。具有顯著位置之捕陷沖提份的所得UV層析 圖顯示於圖3中。圖3為使用HPLC方法2之粗製化合物5的UV層析圖；125×4毫米Purospher STAR C18 5微米AG；LMA：H2O pH 2.6mit H3PO4；LMB：CAN；30%之B-10-35%-30-60%-1-90%(9)；1毫升/分鐘；35℃；UVA=200奈米；ohne MS；25毫升。接著將分離之沖提份以新發展之UPLC/MS方法單獨分析。使用該方法評估在850.61914±3ppm之準分子離子[2M+NH4]精確的離子軌跡。將主要波峰沖提份、次要波峰沖提份及兩種樣品之所得層析圖顯示於圖4(A-D)中。MS研究顯示以品質控制方法2所產生在RT 27.457分鐘和在RT 28.078分鐘的兩個波峰為具有式C26H40O4的兩個異構物。此式與以E/Z異構物所提議之結構一致。因此，UPLC-MS方法的發展顯示3α-羥基-亞乙基-7-酮基-5β-膽-24酸之E/Z異構物可以高解析度的色譜分離。來自FR-ICR質譜法精確的MS數據與以E/Z異構物所提議之結構一致。兩種異構物得到相同的式C26H40O4。
由於以HPLC方法2的半製備性分離E/Z-異構物波峰及接著以UPLC-MS方法鑑證，吾等可顯示以品質控制方法2所產生的兩個波峰(RT 27.457分鐘和RT 28.078分鐘，參閱圖1)為具有式C26H40O4的兩種異構物。此式與以E/Z-異構物所提議之結構一致。與下述之NMR結果結合獲得以下的指定(assignment)：RT 27.457分鐘屬於E-異構物和RT 28.078分鐘屬於Z-異構物。
3α-羥基-亞乙基-7-酮基-5β-膽-24酸之E異構物的1H 和13C位移之指定顯示於下。位移係根據“L.Bettarello等入之II Farmaco 55(2000),51-55(3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸物質)”而評估。
S=單峰
D=二重峰
T=三重峰
Q=四重峰
M=多重峰
DD=兩個二重峰
DT=兩個三重峰
實施例3：結晶狀歐貝提膽酸型式C之特徵
來自流程1和實施例1之步驟6的產物之全固態特徵顯示歐貝提膽酸為結晶狀。此結晶型式標識為型式C。以下為總結結晶狀歐貝提膽酸型式C之特徵的表：
熱分析
DSC(微差掃描熱量法)數據係以配備有34個位置自動取樣器之Mettler DSC 823e獲得。儀器係使用經認證之銦進行能量和溫度校準。通常將0.5-1毫克各樣品在針孔鋁鍋內以10℃．分鐘-1從25℃加熱至350℃。維持50毫升．分鐘-1之氮氣吹洗過樣品。儀器控制和數據分析軟體為STARe v9.20。
TGA(熱重量分析)數據係以配備有34個位置自動取樣器之Mettler TGA/SDTA 851e獲得。儀器係使用經認 證之銦進行溫度校準。通常將5-10毫克各樣品裝載於預稱重之鋁坩堝上且以10℃．分鐘-1從周圍溫度加熱至300℃。維持50毫升．分鐘-1之氮氣吹洗過樣品。儀器控制和數據分析軟體為STARe v9.20。
以結晶狀歐貝提膽酸型式C之TGA觀察兩個重量損失階段。第一階段發生在室溫(r.t.)與85℃之間(0.41%)及第二階段發生在85℃-115℃之間(4.10%)。第一重量損失階段可歸因於水的損失，而第二階段可歸因於剩餘水的損失(水承擔約1.2%之重量損失)與結合之庚烷的損失(約3.4%之重量損失)。結晶狀歐貝提膽酸型式C含有介於0.15與0.2莫耳之間的溶劑(庚烷)及約1.5% w/w(0.3莫耳)。結晶狀歐貝提膽酸型式C之DSC溫度記錄圖含有一個吸熱線。此吸熱線相當陡峭且以約98℃開始。參閱圖6。不同的溶劑會有不同的沸點，而因此在DSC和TGA實驗內會以不同的溫度蒸發。
X-射線粉末繞射(XRPD)分析 Bruker AXS C2 GADDS
X-射線粉末繞射圖案係以Bruker AXS C2 GADDS繞射計獲得，其係使用Cu Kα輻射(40Kv，40mA)，自動化XYZ級，用於自動樣品定位之雷射視訊顯微鏡及HiStar 2-維區域檢測器。X-射線光學係由與0.3毫米針孔瞄準儀連結的單Göbel多層鏡所組成。使用經認證之標準NIST 1976 Corundum(平板)進行每週的性能檢查。
光束發散度(亦即在樣品上有效的X-射線光束尺寸)為約4毫米。使用具有20公分之樣品-檢測器距離的θ-θ連續掃描模式，得到3.2°-29.7°之有效的2θ範圍。通常將樣品暴露於X-射線光束120秒。用於數據收集的軟體為WNT 4.1.16之GADDS且使用Diffrac Plus EVA v 9.0.0.2或v 13.0.0.2分析及呈示數據。
周圍條件：將在周圍條件下操作之樣品使用如接收而未研磨之粉末製成平板樣本。將約1-2毫克樣品輕輕壓在載玻片上，獲得扁平表面。
非周圍條件：將在非周圍條件下操作之樣品架設在具有導熱化合物的矽晶圓上。接著將樣品以約10℃．分鐘-1加熱至適當的溫度且在開始數據收集前以恆溫保持約1分鐘。
Bruker AXS/Siemens D5000
X-射線粉末繞射圖案係以Siemens D5000繞射計獲得，其係使用Cu Kα輻射(40Kv，40mA)，θ-θ測角器，V20之發散度和接收細縫，石墨二級單色器和閃爍計數器。使用經認證之Corundum標準(NIST 1976)檢查儀器性能。用於數據收集的軟體為Diffrac Plus XRPD Commander v2.3.1，且使用Diffrac Plus EVA v 11,0.0.2或v 13.0.0.2分析及呈示數據。
在周圍條件下操作使用如接收之粉末製成平板樣本的樣品。將約20毫克樣品小心地擠進切成拋光之零背景( 510)矽晶圓的凹穴內。樣品在分析期間以其自身平面旋轉。數據收集的詳述為：．角度範圍：2至42°2θ
．步長：0.05°2θ
．收集時間：4秒．步階-1
Bruker AXS D8 Advance
X-射線粉末繞射圖案係以Bruker D8繞射計獲得，其係使用Cu Kα輻射(40Kv，40mA)，θ-2θ測角器，及V4之發散度和接收細縫，Ge單色器和Lynxeye檢測器。使用經認證之Corundum標準(NIST 1976)檢查儀器性能。用於數據收集的軟體為Diffrac Plus XRPD Commander v2.5.0，且使用Diffrac Plus EVA v 11.0.0.2或v 13.0.0.2分析及呈示數據。
在周圍條件下操作使用如接收之粉末製成平板樣本的樣品。將約5毫克樣品小心地擠進切成拋光之零背景(510)矽晶圓的凹穴內。樣品在分析期間以其自身平面旋轉。數據收集的詳述為：．角度範圍：2至42°2θ
．步長：0.05°2θ
．收集時間：0.5秒．步階-1
XRPD顯示從本發明方法的步驟6所分離之粉末係以Bruker AXS D8 Advance獲得。參閱圖5。X-射線繞射圖之對應數據呈示於以下表中。用於數據收集的軟體為 Diffrac Plus XRD Commander v2.6.1且使用Diffrac Plus EVA v13.0.0.2或v15.0.0.0分析及呈示數據。在周圍條件下操作使用如接收之粉末製成平板樣本的樣品。將樣品小心地擠進切成拋光之零背景(510)矽晶圓的凹穴內。樣品在分析期間以其自身平面旋轉。數據收集的詳述為：．角度範圍：2至42°2θ
．步長：0.05°2θ
．收集時間：0.5秒．步階-1
VT-XRPD(可變溫度-X-射線繞射)揭露在DSC溫度記錄圖中所見的吸熱線對應於樣品的去溶劑化，因為在加熱時沒有觀察到型式變化。在DSC與VT-XRPD數據之間 有溫度差異的存在，因為VT-XRPD實驗係以暴露於大空間的樣品進行，而DSC實驗係在侷限的密閉空間中進行。此差異為約20℃，且解釋為什麼樣品在DSC實驗中以更低的溫度熔融及樣品在VT-XRPD實驗中以110℃仍出現結晶狀。VT-XRPD顯示使材料的溶劑乾燥造成結晶度損失，其與呈溶劑化形式之材料一致。參閱圖7。
重量蒸氣吸附法(Gravimetric Vapour Sorption)(GVS)
吸附等溫線係使用以DVS內在控制軟體v 1.0.0.30控制的SMS DVS內在水分吸附分析儀獲得。樣品溫度係以儀器控制而維持在25℃。濕度係藉由混合乾與濕氮氣流以200毫升．分鐘-1之總流速控制。相對濕度係以設置在樣品附近的經校準之Rotronic探針(1.0-100% RH之動態範圍)測量。以% RH(相對濕度)為函數之樣品重量變化(質量鬆弛(mass relaxation))係以微量天平持續監控(±0.005毫克之精確度)。
將5至20毫克樣品放入在周圍條件下秤量之絲網不銹鋼籃中。樣品係在40% RH和25℃(典型為室內條件)裝載和卸載。水分吸附等溫線係如以下概述方式執行(2次掃描產生1次完全循環)。標準等溫線係在25℃以10% RH間隔在0.5-90% RH之範圍內執行。以使用DVS分析Suite v6.0.0.7的Microsoft Excel進行數據分析。SMS DVS內在實驗的方法參數係如下：
在完成等溫線之後回收樣品且以XRPD再分析。
結晶狀歐貝提膽酸型式C的分析顯示樣品略微的吸濕性，因為注意到在介於0-90% RH之間增加1.18%之質量。此水的攝入在整個分析期間為穩定的且所有步驟皆達到平衡。曲線具有小的滯後現象，其表明樣品穩定地損失經吸取的水。在GVS分析之後的XRPD分析顯示樣品未改變。參閱圖8A、8B和8C。
以卡耳費雪法滴定(KF)來測定水
各樣品的水含量係在使用Hydranal Coulomat AG試劑和氬氣吹洗的Mettler Toledo DL39電量計上測量。將秤重之固體樣品引入在鉑TGA盤上的容器中，該盤係與subaseal連接以避免水進入。每次滴定使用約10毫克樣品且進行重複測定。
卡耳費雪法分析顯示結晶狀歐貝提膽酸型式C含有1.5%之水，其相當於約0.3莫耳水。
在40℃和75% RH的一週穩定性
歐貝提膽酸在40℃和75% RH(相對濕度)的穩定性係測定如下。將歐貝提膽酸樣品貯存在40℃/75% RH之濕度室內一週。將樣品以XRPD再分析且發現其未曾改變。
固態研究顯示使歐貝提膽酸型式C結晶需要相對大量的有機溶劑存在。非常不可能使歐貝提膽酸型式1之樣品在貯存時自發性結晶以形成結晶狀歐貝提膽酸型式C。
實施例4：歐貝提膽酸片劑調配物
下表顯示歐貝提膽酸片劑之定量組成物。使用5毫克、10毫克和25毫克調配物作為第三期臨床試驗材料。
API：活性醫藥成分
HSE=內部規格
USP-NF=美國藥典國家配方集
Ph Eur=歐洲藥典
JP=日本藥典
*所呈示之歐貝提膽酸量假定API為無水的且具有100%之純度；實際的量係基於所使用之藥物物質批貨的效力來調整，且相應降低微結晶纖維素的量。
實施例5：歐貝提膽酸型式1之特徵
歐貝提膽酸型式1係指歐貝提膽酸之非結晶型式。此歐貝提膽酸型式可經由結晶狀歐貝提膽酸作為合成中間物而製造。歐貝提膽酸型式1可用作為醫藥活性成分。歐貝提膽酸型式1之特徵及分析如下。
將批號1之歐貝提膽酸型式1使用以下的技術特徵化：以X-射線粉末繞射(XPRD)評定結晶度、1H和13C核磁共振(NMR)、傅立葉(Fourier)轉換紅外光譜學(FT-IR)、光學評定(例如，粒子形狀/大小)、熱性質(例如，微差掃描熱量法(DSC)和熱重量分析(TGA))、以卡耳費雪法(KF)測定水、貯存在40℃和75% RH及2週後以XRPD再分析、以電位法之pKa、以電位法之Log P/D(辛醇/水)及使用重量蒸氣吸附法測定對水分的穩定性(GVS；例如以XRPD獲得的固體分析完全吸附-脫附循環)。亦將5種其他批號(例如，批號2、3、4、5和6)之歐貝提膽酸型式1使用以下的技術特徵化及比較：以XPRD評定且與主要批號1之圖案比較、1H和13C NMR、FT-IR、光學評定(例如，粒子形狀/大小)、熱性質(例如，DSC、TGA和熱載臺顯微鏡)及以KF測定水。
X-射線粉末繞射(XRPD)分析
X-射線粉末繞射圖案係以Bruker AXS C2 GADDS繞射計獲得，其係使用Cu Kα輻射(40Kv，40mA)，自動化XYZ級，用於自動樣品定位之雷射視訊顯微鏡及 HiStar 2-維區域檢測器。X-射線光學係由與0.3毫米針孔瞄準儀連結的單Göbel多層鏡所組成。光束發散度(亦即在樣品上有效的X-射線光束尺寸)為約4毫米。使用具有20公分之樣品-檢測器距離的θ-θ連續掃描模式，得到3.2°-29.7°之有效的2θ範圍。通常將樣品暴露於X-射線光束120秒。用於數據收集的軟體為WNT 4.1.16之GADDS且使用Diffrac Plus EVA v 9.0.0.2或v 13.0.0.2分析及呈示數據。
將在周圍條件下操作之樣品使用如接收而未研磨之粉末製成平板樣本。將約1-2毫克樣品輕輕壓在矽晶圓上，獲得扁平表面。繞射圖顯示歐貝提膽酸型式1為非晶晶狀(參閱圖10和圖11)。
NMR特徵
NMR光譜係以Bruker 400MHz儀器獲得，其配備有自動取樣器且由DRX400主控臺控制。自動化實驗係使用ICONNMR v4.0.4(版本1)而取得，其係使用標準的Bruker裝載實驗之Topspin v 1.3(修補級別8)操作。關於非常規光譜法，數據僅經由使用Topspin而取得。樣品係在d6-DMSO中製造，除非另有其他說明。使用ACD SpecManager v 9.09(版本7703)進行離線分析。
圖12顯示批號1之1H NMR光譜。亦記錄批號2-6之1H NMR光譜且與批號1之光譜比較。參閱圖13。光譜全部皆相似，但是有不同的水量。注意到在介於0.75ppm 與2ppm之間大的質子群組之整合有一些差異，在此波峰重疊且不可以單獨整合。表J顯示在批號1-6之光譜中整合的總質子數量，考慮到在0.75-2ppm區域內的變異。
已排除羧酸質子，所以質子數應該為43，但在6個光譜之間實際的變化從40至43。然而，在來自(0.75-2ppm)之變異的區域非常寬，且由於基線的特性，所以不可依賴此整合。
因為不可能完全指定光譜且整合各不相同，所以記錄批號2之13C NMR光譜。圖14顯示DEPTQ光譜，其中CH2和四級碳波峰指向上，而CH3和CH基團指向下。有13個波峰指向下，其對應於9個CH和4個CH3基團。此與結構一致。在175ppm觀察到羧酸之碳波峰。為了使關注的區域清晰起見，已從此擴展視圖排除碳波峰。然而，僅有11個波峰指向上，而其應該為12個，因為在分子中有10個CH2基團及2個四級碳(排除羰基)。1個碳似乎與另一信號重疊。因此，收集隱藏四級碳信號之 DEPT135光譜，其能顯示重疊之信號是否為四級碳。參閱圖15。DEPT135光譜與DEPTQ光譜的比較顯示一個波峰(在42.5ppm)消失。在分子中有2個四級碳，其應該對應於兩個消失的波峰。因此，重疊的碳信號為四級碳。
進一步進行測定碳之鬆弛時間的實驗，以測定其中未看到的四級碳信號係與另一碳信號重疊。參閱圖16。此13C光譜含有整合之波峰。此顯示在32.3ppm之波峰說明2個碳。參閱圖17在32.3ppm之波峰的擴展視圖。因此，現以整合說明26個碳(包括羧酸)，其與結構一致。
以ATR之FT-IR
數據係以裝備有Universal ATR取樣附件之Perkin-Elmer Spectrum One獲得。使用Spectrum v5.0.1軟體收集及分析數據。參閱圖18。
以微差掃描熱量法(DSC)之熱分析及熱重量分析(TGA)
DSC數據係以配備有50個位置自動取樣器之TA Instruments Q2000獲得。儀器係使用經認證之銦進行能量和溫度校準。通常將0.5-3毫克各樣品在針孔鋁鍋內以10℃．分鐘-1從25℃加熱至300℃。維持50毫升．分鐘-1之氮氣吹洗過樣品。儀器控制軟體為Advantage for Q Series v2.8.0.392和Thermal Advantage v4.8.3，且使用Universal Analysis v4.3A分析數據。用於可調式DSC的樣品係如前述方式製造，且將鍋以2℃．分鐘-1從25℃加熱至200℃。 調制器條件為0.20℃之振幅及40秒之週期性。取樣間隔為1秒/pt。
TGA數據係以配備有16個位置自動取樣器之TA Instruments Q2000獲得。儀器係使用經認證之阿鋁美(Alumel)進行溫度校準。通常將5-10毫克各樣品裝載於預稱重之鉑坩堝上且以10℃．分鐘-1從周圍溫度加熱至350℃。維持60毫升．分鐘-1之氮氣吹洗過樣品。儀器控制軟體為用於Q Series v2.8.0.392之Advantage和Thermal Advantage v4.8.3。
批號1之熱分析係以DSC和TGA執行。TGA軌跡(參閱圖19)顯示在介於周圍溫度與121℃之間的1.7%之重量損失，其很可能為水的損失。DSC軌跡(參閱圖19)顯示寬的低溫吸熱線，可能對應於水的損失，接著在94℃開始的小吸熱線。
此第二吸熱線可能表示玻璃轉變且進一步以可調式DSC研究(參閱圖20)。此技術能使可逆事件(諸如玻璃轉變)與不可逆事件(諸如溶劑損失或結晶型式熔融)分離。在可調式DSC中的可逆熱流軌跡顯示玻璃轉變作為在95℃之曲折點(inflexion point)(Tg)的步驟。此對於玻璃轉變為高溫且示意型式1為穩定的。在不可逆熱流軌跡上以89℃開始的小吸熱線對應於塊材在玻璃轉變溫度的分子鬆弛。
DSC軌跡(參閱圖19)顯示約220℃開始分解，其亦對應於曲線下降的TGA軌跡。
批號1、2、3、4、5和6之TGA軌跡具有相似的形狀(圖21)。在周圍溫度與120℃之間所測量的重量損失顯示於表K中。該等與以NMR所觀察的不同水量一致。該等量係以卡耳費雪法(KF)水滴定進一步定量。參閱以FK之水測定。
圖22顯示6種批號之DSC軌跡的比較。軌跡都差不多，具有不同大小的寬低溫吸熱線，與不同的水量一致，接著在玻璃轉變溫度附近的小吸熱線，如在章節DSC和TGA中所見。將結果總結於表L中。
偏振光顯微鏡法(PLM)
以具有捕獲影像之數位視訊相機的Leica LM/DM偏振光顯微鏡研究樣品。將少量各試樣放置在載玻片上，架設在矽油中且以玻璃片覆蓋，將個別粒子儘可能徹底分開。以適當放大觀察樣品且使光部分偏振，連結至λ假濾色器。
圖23A-23F顯示批號1、2、3、4、5和6係由小的不規則粒子之大型硬黏聚物所組成的材料。批號1、2、3、4、5和6看起來都差不多。在平面偏振光下未觀察到雙折射，其與非結晶狀材料一致。粒子大小範圍從小於1微米至3微米。該等小尺寸粒子示意該等非常快速沉澱。
重量蒸氣吸附法(GVS)
吸附等溫線係使用以SMS Analysis Suite軟體控制的SMS DVS內在水分吸附分析儀獲得。樣品溫度係以儀器控制而維持在25℃。濕度係藉由混合乾與濕氮氣流以200毫升．分鐘-1之總流速控制。相對濕度係以設置在樣品附近 的經校準之Rotronic探針(1.0-100% RH之動態範圍)測量。以% RH為函數之樣品重量變化(質量鬆弛)係以微量天平持續監控(±0.005毫克之精確度)。
通常將5-20毫克樣品放入在周圍條件下秤量之絲網不銹鋼籃中。樣品係在40% RH和25℃(典型為室內條件)裝載和卸載。水分吸附等溫線係如以下概述方式執行(2次掃描產生1次完全循環)。標準等溫線係在25℃以10% RH間隔在0.5-90% RH之範圍內執行。
重量蒸氣吸附法(GVS)等溫線係在25℃以批號1獲得且顯示在圖24中。樣品似乎具有適度的吸濕性，從0至90%相對濕度(RH)具有3.8%之總重量變化。具有小的滯後現象(在吸附與脫附曲線之間的區域)，其表明固體非常輕易地釋出所吸收的水。未觀察到水合物的形成。在整個實驗之後沒有顯著的重量變化(0.3%)。
GVS之動力圖(圖25)顯示水的吸附大部分發生在 非常高的濕度下及脫附係發生在非常低的濕度下。在吸附期時，樣品在至多80% RH非常快速到達平衡及在90% RH需較長的時間平衡。在脫附時，在所有階段的質量皆穩定。
在完成GVS之後，回收樣品且以XRPD再分析，其顯示材料仍為非結晶狀(圖26)。
以卡耳費雪法(KF)測定水
各樣品的水含量係以使用Hydranal Coulomat AG試劑和氬氣吹洗的Mettler Toledo DL39電量計測量。將秤重的固體樣品引入在鉑TGA盤上的容器中，該盤係與subaseal連接以避免水進入。每次滴定使用約10毫克樣品且進行重複測定。
以電量卡耳費雪法的水滴定得到2.4重量%之水的結果。此比以TGA所觀察之重量損失略高。此可能意指一些水在加熱時未從材料釋出，但很可能由於該兩種技術不同的實驗程序。
各批號的水含量係以電量卡耳費雪法測定。表N顯示該等結果，且將該等結果與早先所獲得的卡耳費雪法結果及以TGA所觀察之重量損失比較。數據一致，因為在全部三種分析中的趨勢都一樣。早先所獲得的卡耳費雪法數據顯示水量比在此所獲得的結果低。此與吸濕的材料一致，雖然一些樣品比其他樣品吸取更多的水。TGA重量損失始終比以卡耳費雪法滴定所獲得的結果低，其可能意指一 些水經補陷而留在材料中且在加熱時未釋出，但是亦可能由於實驗程序。
pKa測定和預測
pKa測定數據係以附接有D-PAS的Sirius GlpKa儀器獲得。在25℃以UV在水溶液中及以電位法在甲醇水混合物中進行測量。滴定介質具有經0.15M KCl(水性)調整之離子強度(ISA)。將甲醇水混合物中實測之值經由Yasuda-Shedlovsky外推法校正至0%之共溶劑。使用Refinement Pro軟體v1.0細化數據。使用ACD pKa預測軟體v9預測pKa值。
歐貝提膽酸之pKa係以使用甲醇作為共溶劑的電位法 測量(圖27)且使用Yasuda-Shedlovsky外推法外推至0%之共溶劑(圖28)。pKa能夠測定化合物在給定之pH呈中性及離子化型式的比例。圖29顯示取決於pH之種類分布。
Log P測定
數據係以Sirius GlpKa儀器的電位滴定法獲得，該滴定法係使用辛醇：經調整離子強度(ISA)之水的三個比值來產生Log P、Log P離子和Log D值。使用Refinement Pro軟體v1.0細化數據。使用ACD v9和Syracuse KOWWIN v1.67軟體預測Log P值。
LogP係使用ACD軟體預測及接著以電位法測量。三種滴定係以三個不同比值之辛醇/ISA水執行，得到在圖30中所繪製之差異曲線。黑色曲線為純水性pKa滴定及3個有色曲線對應於三個比值之辛醇/ISA水。PKa之位移能夠測定LogP。
親脂性曲線(以pH為函數之logD)顯示於圖31中。Log D為分布係數，代表在特定的pH下存在的所有 種類之組合的親脂性。LogP為化合物常數，其對應於純中性種類之指令係數，而LogPion為純離子化種類之指令係數。LogP和LogPion可從親脂性曲線測定為Y軸分別與pH標度開始時之切線(當分子純粹呈其中性型式時)及pH標度結束時之切線(當分子完全離子化時)的交叉點。
在40℃ & 75% RH和25℃ & 97% RH的兩週穩定性
將批號1之樣品在固體形式之加速穩定性測試中貯存在40℃和75%相對濕度(RH)。將另一樣品貯存在25℃和97%相對濕度，以檢查非常高濕度的效應。將兩種樣品在5天後及兩週後以XRPD再分析。兩種樣品在兩個貯存條件下經至多兩週仍為非結晶狀，顯示型式1對該等條件為穩定的。參閱圖32和圖33。
所分析的6個批號全部皆為非結晶狀。以可調式DSC實驗測量在95℃之玻璃轉變溫度。6個批號以所使用的所有分析技術似乎非常相似，該等之間唯一的差異為該等的水含量，以卡耳費雪法滴定的水含量變化從1.9%至2.8%。熱分析顯示不同的水量且表明約175-220℃開始分解。所測量之pKa為4.82及LogP為5.54。顯微鏡評估顯示非常小的不規則粒子之大型硬黏聚物。
穩定性測試顯示材料在加速條件下(40℃/75% RH)或在高濕度下(25℃/97% RH)兩週後仍為非結晶狀。重量蒸氣吸附法(GVS)分析顯示材料僅具有適度的吸濕性，從0至90%相對濕度(RH)具有3.8%之總重量增加。 以GVS未觀察到水合物的形成。在GVS之後以XRPD再分析之樣品仍為非結晶狀。高玻璃轉變溫度和穩定性測試結果示意非結晶型式為穩定的。
實施例6：單晶X-射線結構和絕對立體化學
歐貝提膽酸之單晶X-射線結構係從以0.1℃/分鐘冷卻至5℃之後從乙腈溶液再結晶歐貝提膽酸，接著以RT/50℃之8小時循環經1週成熟所獲得的晶體來測定(參閱圖34)。結構與型式G一致且產生模擬之XRPD圖案作為此材料的參考圖案。型式G可藉由冷卻在例如乙腈中的歐貝提膽酸溶液而製造。
結構為斜方系，空間群P212121，且在不對稱單元中含有一個歐貝提膽酸分子。最後R1[I>2σ(I)]=3.22%。晶體顯出約0.4×0.4×0.3毫米尺寸之棱柱形態。測定分子的絕對立體化學，在掌性中心C5、C9、C10和C14為S及在掌性中心C3、C6、C7、C8、C13、C17和C22為R，具有Flack參數=-0.01(13)。關於具有呈R構型的掌性中心C5、C9、C10和C14及呈S構型的掌性中心C3、C6、C7、C8、C13、C17和C22之反轉結構，Flack參數=1.01(13)，確認上文述及之指定。
整體來看，結構具有強大的數據集且為有序的。
用於指定立體化學的軟體(PLATON)測定掌性中心(C8)為R立體中心，而ACD軟體(及Cahn-Ingold-Prelog)指定(C8)為S。然而，B/C環系統的反式環接合點之指定絕對係從晶體結構來定義。
使用基於Bijvoet差異的Bayesian統計學之絕對結構的測定(Hooft等人之J.Appl.Cryst.,(2008),41,96-103)揭露呈示為正確的絕對結構之概率為1.000，而雙或假外消旋物的絕對結構之概率分別為0.000和0.000。Flack等效和其不確定性係經由此程式計算為-0.019(17)。
歐貝提膽酸之結構含有稠合在一起的1個5員環和3個6員環。5員環(C13、C14、C15、C16和C17))的構型分析揭露此環的最接近之折環描述物為半椅(half-chair)型。3個6員環(C1、C2、C3、C4、C5和C10)；(C5、C6、C7、C8、C9和C10)及(C8、C9、C11、C12 C13和C14)的構型分析揭露該等環的最接近之折環描述物為椅型。
在晶體結構中觀察到兩個獨特的分子間氫鍵。歐貝提膽酸的各分子使氫鍵與氧O1和O4形成歐貝提膽酸的兩個不同對稱性之相關分子，氧O1和O4分別充當氧O3和 O1的施體，充當受體O1-H1C---O3[D…A=2.7419(12)Å]和O4-H4C---O1[D…A=2.6053(13)Å(參閱圖35)。該等交互作用導致複雜的3維氫鍵結網絡。最終的傅立葉差異圖顯示分別為0.402和-0.176 eÅ-3的最大和最小電子密度。
以實驗批號的結構計算之XRPD圖案的重疊顯示晶體與整批一致且為歐貝提膽酸型式G(參閱圖36)。
實施例7：在歐貝提膽酸型式1(非結晶狀)與結晶型式(型式F)之間的生物利用率差異
固體歐貝提膽酸的物理狀態可在經口服投予受驗者(例如，大鼠)時在分子的生物利用率中扮演一角色。進行下文所述之研究以評估在單次口服投予之後的血漿動力學及固體非結晶與結晶型式之歐貝提膽酸的腸吸收效率和藥物動力學。比較在投予歐貝提膽酸型式1(非結晶狀)或型式F之後的歐貝提膽酸血漿濃度相對於時間、tmax、Cmax和AUC之輪廓(參閱圖37-38)。
將歐貝提膽酸型式1(非結晶狀)和型式F投予大鼠且在不同的時期收集各動物的血液經至少3小時。以6隻動物研究各型式的歐貝提膽酸。
實驗方案：
所使用的試驗物質為歐貝提膽酸型式1(非結晶狀)和結晶型式F。型式F可藉由從乙腈或硝甲烷成熟而製造。可將調配物製造成pH 4之水中的懸浮液。研究模型為約225至約250公克成年雄性Sprague Dawley大鼠(Harlan Laboratories)。每一劑量途徑使用6隻動物。劑量為PO 20毫克/公斤/5毫升。將動物在以歐貝提膽酸調配物治療前經隔夜禁食。以胃管灌食法執行口服投予。
某天在一隻動物的左頸靜脈裝上植入之插管(SOP VIVO/SAF6)，以異氟烷獲得麻醉。實驗係在手術恢復日之後開始。將約500微升血液(250微升血漿)經由插管取至肝素化注射器(Na肝素)中且立刻收集在冰/水浴中的微管中。在1小時之內，將樣品在4℃以10000xg離心5分鐘。將血漿立即轉移至微管中且貯存在-20℃。在給藥後30分鐘、1小時、1.3小時、2小時和3小時收集血液樣品。使用HPLC-ES/MS/MS定量方法分析血漿樣品。使用非隔室方法(non-compartmental method)執行藥物動力學研究。
結果：
在口服投予20毫克/公斤b.w之單一劑量的兩種固體型式之後，將歐貝提膽酸的平均血漿濃度記述在圖37中。值為各調配物的6組實驗之平均。將標準偏差記述在曲線圖中。在投予結晶型式之後，在1.5小時後達到Cmax 且血漿歐貝提膽酸濃度遵循具有一個最大值之規律的動力學，並在3小時之後，劑量為幾乎一半的Cmax。
在投予歐貝提膽酸型式1(非結晶型式1)之後的動力學輪廓與結晶型式F不同。在30分鐘之後獲得很快的血漿濃度波峰及在2小時之後獲得第二波峰。6隻大鼠中的數據變異性非常低且此表現在統計學上與結晶型式不同。經3小時研究之AUC以結晶形式較高。動力學示意歐貝提膽酸在3小時之後仍存在於血漿中。先前已論證歐貝提膽酸通過肝產生肝代謝物牛磺共軛物，其分泌至膽汁中且聚積在肝腸循環中。因此，牛磺共軛物的測量可用於測定通過肝的歐貝提膽酸量。牛磺共軛物形成速率記述在圖38中，其顯示在投予結晶型式之後更快形成牛磺共軛物及達成更高的濃度。
熔點和玻璃轉變
歐貝提膽酸型式1(非結晶型式1)和結晶型式F之熔點係使用習知的方法測量。測量作為參考化合物的鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸之熔點。重複執行測量3次。關於結晶型式，從固體轉變成液態被定義為熔融溫度(Tm)，而關於非結晶型式，該轉變被定義為玻璃轉變溫度(Tg)，在表中記述以攝氏℃和凱氏°K二者表示的測量值。
結果：
以CDCA和UDCA所獲得的值與先前所記述之值相符，其中UDCA之熔點比CDCA高。型式1之玻璃轉變溫度Tg(102-112℃)比型式F之熔點溫度(120-124℃)低。此所觀察之圖案與先前在比較兩種固態時所記述之數據相符。型式F具有在較高溫度的額外轉變(235-237℃)。
在以凱氏度表示之最高熔點溫度與玻璃轉變溫度之間 的比值與其他藥物和其他膽酸非常相似(J.Kerc等人之Thermochim.Acta,1995(248)81-95)。
微差掃描熱量法分析
進行微差掃描熱量法(DSC)分析，以更好地定義歐貝提膽酸結晶型式和非結晶型式之熔點及物理狀態。所使用之儀器為Mettler Toledo DSC821e。將約4-5毫克各型式1和型式F昇華以進行分析。將化合物以10℃/分鐘之加熱速率暴露在30-300℃之溫度範圍內。
圖39顯示以歐貝提膽酸結晶型式F所獲得的DSC曲線。偵測出一個在120.04℃之吸熱轉變，其對應於化合物之熔點。此結果亦以熱載臺顯微鏡(HSM)確認；在30°-240℃之範圍內觀察到在122-124℃之固體-液體轉變。在DSC軌跡中，以型式F所獲得的波峰形狀和強度與以結晶型式所示之典型表現相符。然而，波峰寬度相當寬；這可能由於不均勻的晶體。熱重量分析(TGA)在30-300℃之溫度範圍內未顯示任何重量損失。
圖40顯示以歐貝提膽酸非結晶型式1所獲得的DSC曲線。在79.95℃觀察到吸熱轉變。波峰形狀和強度與非結晶狀化合物所預期之表現相符。用於該等物質的固體-液體轉變所需之能量(玻璃轉變)比結晶狀化合物少。溫度記錄圖在30-300℃之溫度範圍內未顯示任何重量損失。
水溶解度
歐貝提膽酸型式1(非結晶型式1)和結晶型式F之水溶解度係依照本技術領域中已知的程序測量。簡言之，將固體懸浮在低的pH(HCl 0.1莫耳/公升)之水中且處於略微混合下以25℃經1週平衡。將飽和溶液過濾且以HPLC-ES-MS/MS測量在溶液中的化合物濃度。
結果：
型式1呈示較高的溶解度，其以17.9微莫耳/公升相對於型式F之9.1微莫耳/公升。
根據歐貝提膽酸之生物利用率數據，結晶型式F比歐貝提膽酸型式1(非結晶狀)高。儘管在投予型式1之後很快的血漿濃度波峰，但是血漿輪廓顯示更有效地吸收型式F(較高的AUC)且甚至更規律的動力學，反映藥物在腸內容物中的最優分布。型式1顯示此很快的波峰，接著後來第二波峰具有比型式F低的Cmax。
型式1之水溶解度比型式F高。型式F似乎是穩定的，因為熱重量分析(TGA)在所研究之溫度範圍內未顯示任何重量損失。
根據該等結果，型式F在經口服投予時似乎更有效地經腸吸收且由肝吸取。主要的肝代謝物牛磺共軛物之形成速率就與型式1相比之型式F為幾乎兩倍，示意在3小時 之後更有效運輸及聚積在肝腸循環及血漿濃度中。
實施例8：經雷射標記之歐貝提膽酸的製造
經雷射標記之歐貝提膽酸係根據以下流程製造。
NMR光譜係在5-毫米外徑試管中(Norell,Inc.507-HP)以CDCl3和MeOD-d4溶液及30℃記錄且在Varian VNMRS-400上以用於1H之400MHz獲得。化學位移(δ)係相對於四甲基矽烷(TMS=0.00ppm)且以ppm表示。LC-MS/MS係在以Accela-Thermo Finnigan LCQ Fleet 操作EST(-)離子化模式之Ion-trap Mass光譜計上取得。HPLC係在連線β-Ram之Agilent 1200系列(管柱：Xterra MS C8,250×4.6毫米，5微米，40℃)取得。比活性係在LSA(液體閃爍分析儀，Perkin Elmer，Tri-Carb 2900TR)上取得。
化合物2X的製造
將n-BuLi(6.30毫升，2.5M，15.8毫莫耳)在-20℃添加至無水THF(6.0毫升)中的二異丙胺(1.59公克，15.8毫莫耳)之溶液中。在將反應混合物在-20℃攪拌1小時之後，冷卻至-78℃且添加TMSCl(1.72公克，15.8毫莫耳)，接著添加在無水THF(6.0毫升)中的化合物1X(3.00公克，6.29毫莫耳)。將反應混合物在-78℃攪拌1小時，藉由添加NaHCO3而中止且在室溫下攪拌30分鐘。將有機層分離且在真空中濃縮，得到化合物2X(3.29公克，95%)且不進一步純化而用於下一步驟。
化合物3X的製造
將甲苯(1.0毫升)中的[1-14C]乙醛(330 mCi，5.63毫莫耳)(從[14C]BaCO3製造，SA=58.6 mCi/毫莫耳)與在DCM(2.0毫升)中的乙醛(130毫克，2.95毫莫耳)在-78℃混合且接著轉移至DCM(13.0毫升)中的化合物2X(3.29公克，6.00毫莫耳)之溶液中，接著在-78℃添加BF3．OEt2(1.05公克，7.40毫莫耳)。在-78℃攪拌1小時之後，允許反應混合物溫熱至35℃且在上述溫度攪拌1小時。反應係藉由添加水(10毫升)而中止，將水層以DCM萃取，將合併的有機層經無水Na2SO4乾燥，過濾且在真空濃縮。將殘餘物以管柱層析術在SiO2上純化(己烷：EtOAc=5：1至3：1)，得到成為白色固體的化合物3X(102 mCi，31%，SAW 37.0 mCi/毫莫耳)。
1H-NMR(CDCl3，Varian，400MHz)：8 0.65(3H,s)；0.93(3H,d,J=6.0Hz),1.01(3H,s),1.06-1.49(12H,m),1.62-2.04(7H,m),1.69(3H,d,J=6.8Hz),2.18-2.28(2H,m),2.32-2.43(2H,m),2.58(1H,dd,J=12.8,4.0Hz),3.62-3.70(1H,m),3.67(3H,s),6.18(1H,q,J=6.8Hz)。
化合物4X的製造
將H2O(3.0毫升)中的NaOH(220毫克，5.50毫莫耳)在室溫添加至MeOH(6.0毫升)中的化合物3X(102 mCi，2.75毫莫耳)之溶液中。在將反應混合物在45℃攪拌1小時之後，冷卻至室溫，在減壓下移除MeOH且以H2O(12毫升)稀釋。將水層以H3PO4酸化，以DCM萃取且將有機層在真空中濃縮。將殘餘物懸浮在Et2O中且以過濾收集沉澱物，得到成為白色固體的化合物4X(86.3 mCi，85%)。
1H-NMR(CDCI3，Varian，400MHz)：8 0.63(3H,s),0.92(3H,d,J=6.0Hz),0.99(3H,s),1.04-1.50(13H,m),1.61-2.01(7H,m),1.67(3H,d,J=7.2Hz),2.21-2.28(2H,m),2.35-2.41(2H,m),2.56(1H,dd,J=12.8,4.0Hz),3.58-3.69(1H,m),6.16(1H,q,J=7.2Hz)。
化合物5X的製造
將0.5M水性NaOH(10毫升，5.0毫莫耳)中的化合物4X(86.3 mCi，2.35毫莫耳)與5%-Pd/C(100毫克)之混合物在室溫及H2氛圍(汽球)下攪拌10小時，且接著在100℃攪拌14小時。以過濾移除觸媒，以水清洗，且將過濾物以H3PO4酸化。以過濾收集沉澱物，將固體溶解在EtOAc中，以食鹽水清洗，經由短的SiO2墊過濾且在真空中濃縮。將殘餘固體以EtOAc再結晶，得到成為白色固體的化合物5X(67.7 mCi，78%)。
1H-NMR(MeOD-d4，Varian，400MHz)：8 0.71(311,s),0.75-0.84(1H,m),0.81(3H,t,J=7.4Hz),0.921.01(1H,m),0.96(3H,d,J=6.4Hz),1.06-1.38(7H,m),1.25(3H,s),1.41-1.96(1211,m),2.01-2.05(1H,m),2.11-2.24(2H,m),2.30-2.37(1H,m),2.50(1H,t,J=11.4Hz),2.80-2.85(1H,m),3.42-3.49(1H,m)。
[乙基-1-14C]歐貝提膽酸的製造
將H2O(2.0毫升)中的NaBH4(416毫克，11.0毫莫耳)之溶液在80℃添加至2M水性NaOH(4.50毫升，9.00毫莫耳)中的化合物5X(67.7 mCi，1.83毫莫耳)之溶液中。在將反應混合物在100℃攪拌2小時之後，在室溫添加水(6.0毫升)且以H3PO4酸化。將水層以DCM萃取，經無水Na2SO4乾燥，經由短的SiO2墊過濾且在真空中濃縮。將殘餘物以管柱層析術在SiO2上純化(己烷：EtOAc=1：1至1：3)，得到成為白色固體的產物(44.0 mCi，65%)。將產物(44.0 mCi，1.19毫莫耳)及歐貝提膽酸(120毫克，0.285毫莫耳)溶解在EtOAc(4毫升)中，將溶液在50℃攪拌2小時且接著在真空中濃縮。將殘餘油懸浮在Et2O中，以過濾收集沉澱物，得到成為白色固體的[乙基-1-14C]歐貝提膽酸(560毫克，38.5 mCi，SA=29 mCi/毫莫耳)。
1H-NMR(CDCl3，Varian，400MHz)：8 0.66(3H,s),0.88(311,s),0.93(3H,t,J=7.2Hz),0.93(3H,d,I=6.4Hz),0.96-1.04(1H,m),1.08-1.52(14H,m),1.51-1.60(1011,m),2.22-2.30(111,m),2.36-2.44(1H,m),3.38-3.45(111,m),3.71(IH,s)。
LC-MS/MS(MS：LCQ Fleet)：MS計算值：421.56；MS實測值：421.07[M-H]-。
Radio TLC：二氧化矽60 F254之TLC板及移動相為EtOAc。放射化學純度為98.90%，Rf=0.675。
HPLC(Agilent 1200系列)：移動相：乙腈：5mM磷酸鹽緩衝液(pH=3)：MeOH=450：450：100。放射化學純度為98.19%(β-ram)，Rt=20.00分鐘。
[乙基-1-14C]歐貝提膽酸具有14C1C25H44O4之分子式及以LSC在29 mCi/毫莫耳之比活性下具有421.46之分子量。

Claims (107)

  1. 一種結晶狀歐貝提膽酸型式C，其特徵為包括在約4.2、6.4、9.5、12.5和16.7度2-θ之特徵峰的X-射線繞射圖案。
  2. 一種結晶狀歐貝提膽酸型式C，其特徵為具有實質上類似於圖5中所示之X-射線繞射圖案。
  3. 根據申請專利範圍第1項之結晶狀歐貝提膽酸型式C，其係以包括在約4.2、6.4、9.5、12.5、12.6、15.5、15.8、16.0、16.7和19.0度2-θ之特徵峰的X-射線繞射圖案為特徵。
  4. 根據申請專利範圍第3項之結晶狀歐貝提膽酸型式C，其係以包括在約4.2、6.4、8.3、9.5、11.1、12.2、12.5、12.6、15.5、15.8、16.0、16.3、16.7、18.6和19.0度2-θ之特徵峰的X-射線繞射圖案為特徵。
  5. 根據申請專利範圍第4項之結晶狀歐貝提膽酸型式C，其係以包括在約4.2、6.4、8.3、9.5、11.1、12.2、12.5、12.6、15.5、15.8、16.0、16.3、16.7、17.0、17.8、18.6、18.8、19.0、20.5和20.9度2-θ之特徵峰的X-射線繞射圖案為特徵。
  6. 根據申請專利範圍第1-5項中任一項之結晶狀歐貝提膽酸型式C，其中該X-射線繞射圖案係由使用Cu Kα輻射之繞射計獲得。
  7. 根據申請專利範圍第1-5項中任一項之結晶狀歐貝提膽酸型式C，其係以包括在約12.0至約12.8及約 15.4至約21.0之特徵峰的X-射線繞射圖案為特徵。
  8. 一種結晶狀歐貝提膽酸型式C，其特徵為具有在約98±2℃之吸熱值的微差掃描熱量法(DSC)溫度記錄圖。
  9. 根據申請專利範圍第1-5項中任一項之結晶狀歐貝提膽酸型式C，其進一步以具有在約98±2℃之吸熱值的微差掃描熱量法(DSC)溫度記錄圖為特徵。
  10. 一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含歐貝提膽酸之結晶型式作為合成中間物。
  11. 一種製造歐貝提膽酸型式1之方法，其包含將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
  12. 根據申請專利範圍第11項之方法，其包含以下步驟：將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
  13. 根據申請專利範圍第12項之方法，其包含以下步驟：將E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸，將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
  14. 根據申請專利範圍第13項之方法，其包含以下步驟：將3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與NaOH反應，以形成E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸，將E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸，將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
  15. 根據申請專利範圍第14項之方法，其包含以下步驟：將3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸(chol-6-en-24-oic acid)甲酯與CH3CHO反應，以形成3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯，將E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與NaOH反應，以形成E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸，將E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸，將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及 將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
  16. 根據申請專利範圍第15項之方法，其包含以下步驟：將3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與Li[N(CH(CH3)2)2]及Si(CH3)3Cl反應，以形成3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯，將3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯與CH3CHO反應，以形成E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯，將E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與NaOH反應，以形成E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸，將E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸，將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
  17. 根據申請專利範圍第16項之方法，其包含以下步驟：將3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與CH3OH及H2SO4反應，以形成3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯，將3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與Li[N(CH(CH3)2)2]及Si(CH3)3Cl反應，以形成3α,7-二-三 甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯，將3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯與CH3CHO反應，以形成E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯，將E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與NaOH反應，以形成E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸，將E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與Pd/C及氫氣反應，以形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸，將3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與NaBH4反應，以形成結晶狀歐貝提膽酸，及將結晶狀歐貝提膽酸轉化成歐貝提膽酸型式1。
  18. 根據申請專利範圍第17項之方法，其中該結晶狀歐貝提膽酸為型式C。
  19. 根據申請專利範圍第18項之方法，其中該結晶狀歐貝提膽酸型式C係以類似於圖5中所提出之X-射線繞射圖案為特徵。
  20. 根據申請專利範圍第18或19項中任一項之方法，其中該結晶狀歐貝提膽酸型式C係從乙酸正丁酯結晶。
  21. 根據申請專利範圍第11-17項中任一項之方法，其中該結晶狀歐貝提膽酸型式C轉化成歐貝提膽酸型式1包含以下步驟：將結晶狀歐貝提膽酸型式C溶解在水性 NaOH溶液中及添加HCl。
  22. 根據申請專利範圍第21項之方法，其中該分離之結晶狀歐貝提膽酸型式C係在真空下以約80℃乾燥。
  23. 根據申請專利範圍第12-17項中任一項之方法，其中該形成結晶狀歐貝提膽酸的3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與NaBH4之反應係在約85℃至約110℃之溫度在鹼性水溶液中進行。
  24. 根據申請專利範圍第23項之方法，其中該溫度為約90℃至約105℃。
  25. 根據申請專利範圍第24項之方法，其中該鹼性水溶液為NaOH水溶液。
  26. 根據申請專利範圍第25項之方法，其中該鹼性水溶液為50重量%之NaOH溶液與水的混合物。
  27. 根據申請專利範圍第13-17項中任一項之方法，其中該形成3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸的E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與Pd/C及氫氣之反應係在約20℃至約40℃之溫度及在約4至約5巴之壓力下進行。
  28. 根據申請專利範圍第27項之方法，其中將該反應混合的有機相以活性碳處理。
  29. 根據申請專利範圍第28項之方法，其中該溫度為約25℃至約35℃。
  30. 根據申請專利範圍第29項之方法，其中該壓力為約4.5至約5.5巴。
  31. 根據申請專利範圍第30項之方法，其中容許該氫化反應混合物攪拌約1小時。
  32. 根據申請專利範圍第31項之方法，其中將該E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與Pd/C及氫氣之反應加熱至約100℃且攪拌約2小時至約5小時。
  33. 根據申請專利範圍第32項之方法，其中將該E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與Pd/C及氫氣之反應加熱至約100℃且攪拌約3小時。
  34. 根據申請專利範圍第14-17項中任一項之方法，其中該形成E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸的E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與NaOH之反應係在約20℃至約60℃之溫度進行。
  35. 根據申請專利範圍第34項之方法，其中該溫度為約20℃至約25℃。
  36. 根據申請專利範圍第35項之方法，其中該E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與NaOH之反應係在甲醇、水及NaOH溶液中進行。
  37. 根據申請專利範圍第36項之方法，其中該NaOH溶液為50重量%之水溶液。
  38. 根據申請專利範圍第15-17項中任一項之方法，其中該形成E-或E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯的3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯與CH3CHO之反應係在極性非質子性溶劑中，在約-50℃至約-70℃之溫度，在BF3的存在下進行。
  39. 根據申請專利範圍第38項之方法，其中該極性非質子性溶劑為二氯甲烷。
  40. 根據申請專利範圍第39項之方法，其中該BF3為乙腈中的16重量%之溶液。
  41. 根據申請專利範圍第40項之方法，其中該溫度為約-60℃至約-65℃。
  42. 根據申請專利範圍第16-17項中任一項之方法，其中該形成3α,7-二-三甲基矽烷氧基-5β-膽-6-烯-24-酸甲酯的3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與Li[N(CH(CH3)2)2]及Si(CH3)3Cl之反應係在極性非質子性溶劑中在約-10℃至約-30℃之溫度進行。
  43. 根據申請專利範圍第42項之方法，其中該極性非質子性溶劑為四氫呋喃。
  44. 根據申請專利範圍第43項之方法，其中該溫度為約-20℃至約-25℃。
  45. 根據申請專利範圍第44項之方法，其中將該3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯與Li[N(CH(CH3)2)2]及Si(CH3)3Cl之反應攪拌約2小時。
  46. 根據申請專利範圍第17項之方法，其中將該形成3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯的3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與CH3OH及H2SO4之反應加熱約3小時且將反應混合物的pH以鹼性水溶液調整至約6.5至約8.0之pH值。
  47. 根據申請專利範圍第46項之方法，其中該3α-羥 基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸甲酯的分離另外包含添加活性碳。
  48. 根據申請專利範圍第47項之方法，其中該3α-羥基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸與CH3OH及H2SO4之反應係在甲醇中進行。
  49. 根據申請專利範圍第48項之方法，其中該鹼性溶液為NaOH水溶液。
  50. 根據申請專利範圍第49項之方法，其中該pH為約7.0至約7.5。
  51. 一種藉由根據申請專利範圍第10-17項中任一項之方法所製造的E/Z-3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷-24-酸化合物，其中E/Z異構物比大於約50%，大於約60%，大於約70%，大於約80%，大於約83%，大於約85%，大於約90%，大於約93%，大於約95%或大於約99%。
  52. 根據申請專利範圍第51項之化合物，其中該E/Z比係以HPLC測定。
  53. 根據申請專利範圍第52項之化合物，其中該比大於約80%。
  54. 根據申請專利範圍第53項之化合物，其中該比大於約83%。
  55. 根據申請專利範圍第54項之化合物，其中該比大於約85%。
  56. 根據申請專利範圍第55項之化合物，其中該比 大於約90%。
  57. 根據申請專利範圍第56項之化合物，其中該比大於約93%。
  58. 根據申請專利範圍第57項之化合物，其中該比大於約95%。
  59. 根據申請專利範圍第58項之化合物，其中該比大於約99%。
  60. 一種歐貝提膽酸或其醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物，其具有大於約98%之效力(potency)。
  61. 根據申請專利範圍第60項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸具有大於約98%之效力。
  62. 根據申請專利範圍第60項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸之效力係藉由去除水、硫酸灰份(sulphated ash)、殘餘溶劑和其他有機雜質的量來測定。
  63. 根據申請專利範圍第62項之歐貝提膽酸，其具有大於約98.5%之效力。
  64. 根據申請專利範圍第63項之歐貝提膽酸，其具有大於約99.0%之效力。
  65. 根據申請專利範圍第64項之歐貝提膽酸，其具有大於約99.5%之效力。
  66. 根據申請專利範圍第61項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有總共少於約2%之一或多種選自下列之雜質：6-乙基熊去氧膽酸(ethylursodeoxycholic acid)、 3α-羥基-6α-乙基-7-夏托(cheto)-5β-膽烷-24-酸、6β-乙基鵝去氧膽酸(ethylchenodeoxycholic acid)、3α,7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷-24-酸、鵝去氧膽酸和3α(3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽-24-醯氧基)-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸。
  67. 根據申請專利範圍第66項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有總共少於約1.5%之雜質。
  68. 根據申請專利範圍第67項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸型式1含有總共少於約1.4%之雜質。
  69. 根據申請專利範圍第68項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有少於約1.2%之水。
  70. 根據申請專利範圍第69項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有少於約1.0%之水。
  71. 根據申請專利範圍第66項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有總共少於約0.15%之6-乙基熊去氧膽酸與3α,7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷-24-酸。
  72. 根據申請專利範圍第71項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有總共少於約0.06%之6-乙基熊去氧膽酸與3α,7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷-24-酸。
  73. 根據申請專利範圍第72項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有總共少於約0.05%之6-乙基熊去氧膽酸與3α,7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷-24-酸。
  74. 根據申請專利範圍第66項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有少於約0.15%之3α-羥基-6α-乙基-7-夏 托-5β-膽烷-24-酸。
  75. 根據申請專利範圍第74項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有少於約0.06%之3α-羥基-6α-乙基-7-夏托-5β-膽烷-24-酸。
  76. 根據申請專利範圍第75項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有少於約0.05%之3α-羥基-6α-乙基-7-夏托-5β-膽烷-24-酸。
  77. 根據申請專利範圍第66項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有少於約0.15%之6β-乙基鵝去氧膽酸。
  78. 根據申請專利範圍第77項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有少於約0.06%之6β-乙基鵝去氧膽酸。
  79. 根據申請專利範圍第78項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有少於約0.05%之6β-乙基鵝去氧膽酸。
  80. 根據申請專利範圍第66項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有少於約3%之鵝去氧膽酸。
  81. 根據申請專利範圍第80項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有少於約1%之鵝去氧膽酸。
  82. 根據申請專利範圍第81項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有少於約0.2%之鵝去氧膽酸。
  83. 根據申請專利範圍第66項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有少於約0.15%之3α(3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽-24-醯氧基)-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸。
  84. 根據申請專利範圍第83項之歐貝提膽酸，其中 該歐貝提膽酸含有少於約0.06%之3α(3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽-24-醯氧基)-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸。
  85. 根據申請專利範圍第84項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸含有少於約0.05%之3α(3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽-24-醯氧基)-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸。
  86. 根據申請專利範圍第85項之歐貝提膽酸，其中該歐貝提膽酸為歐貝提膽酸型式1。
  87. 一種結晶狀歐貝提膽酸，或其醫藥上可接受之鹽、溶劑化物或胺基酸共軛物，其中該結晶狀歐貝提膽酸為型式C。
  88. 根據申請專利範圍第87項之結晶狀歐貝提膽酸，其中該結晶狀歐貝提膽酸具有大於約90%之效力。
  89. 根據申請專利範圍第88項之結晶狀歐貝提膽酸型式C，其中該歐貝提膽酸型式C之效力係藉由去除水、硫酸灰份、殘餘溶劑和其他有機雜質的量來測定。
  90. 根據申請專利範圍第87項之結晶狀歐貝提膽酸型式C，其中該溶劑為水合物。
  91. 根據申請專利範圍第88項之結晶狀歐貝提膽酸型式C，其具有大於約92%之效力。
  92. 根據申請專利範圍第91項之結晶狀歐貝提膽酸型式C，其具有大於約94%之效力。
  93. 根據申請專利範圍第92項之結晶狀歐貝提膽酸 型式C，其具有大於約96%之效力。
  94. 根據申請專利範圍第93項之結晶狀歐貝提膽酸型式C，其具有大於約98%之效力。
  95. 根據申請專利範圍第94項之結晶狀歐貝提膽酸型式C，其具有大於約99%之效力。
  96. 根據申請專利範圍第87項之結晶狀歐貝提膽酸型式C，其中該結晶狀歐貝提膽酸型式C含有總共少於約4%之一或多種選自下列之雜質：6-乙基熊去氧膽酸、3α-羥基-6α-乙基-7-夏托-5β-膽烷-24-酸、6β-乙基鵝去氧膽酸、3α,7α-二羥基-6-亞乙基-5β-膽烷-24-酸、鵝去氧膽酸和3α(3α,7α-二羥基-6α-乙基-5β-膽-24-醯氧基)-7α-羥基-6α-乙基-5β-膽烷-24-酸。
  97. 根據申請專利範圍第96項之結晶狀歐貝提膽酸型式C，其中該總雜質少於約3.8%。
  98. 根據申請專利範圍第97項之結晶狀歐貝提膽酸型式C，其中該總雜質少於約3.6%。
  99. 一種醫藥組成物，其包含以申請專利範圍第10-17項中任一項之方法所製造的歐貝提膽酸型式1及醫藥上可接受之載劑。
  100. 一種醫藥組成物，其包含結晶狀歐貝提膽酸及醫藥上可接受之載劑。
  101. 根據申請專利範圍第100項之醫藥組成物，其中該結晶狀歐貝提膽酸為型式C。
  102. 一種根據申請專利範圍第60-86項中任一項的 歐貝提膽酸型式1或根據申請專利範圍第10-17項中任一項之方法所製造的歐貝提膽酸型式1之用途，其係用於製造供治療或預防FXR調介之疾病或病況的藥劑。
  103. 一種根據申請專利範圍第1-5或87-98項中任一項之結晶狀歐貝提膽酸之用途，其係用於製造供治療或預防FXR調介之疾病或病況的藥劑。
  104. 根據申請專利範圍第102項之用途，其中該疾病或病況係選自膽管閉鎖、膽汁瘀積性肝病、慢性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、C型肝炎感染、酒精性肝病、原發性膽汁性肝硬化(PBC)、由於進行性纖維變性、肝纖維變性和心血管疾病(包括動脈粥樣硬化、動脈硬化症、高膽固醇血症和高血脂症)的肝功能損害。
  105. 根據申請專利範圍第103項之用途，其中該疾病或病況係選自膽管閉鎖、膽汁瘀積性肝病、慢性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、C型肝炎感染、酒精性肝病、原發性膽汁性肝硬化(PBC)、由於進行性纖維變性、肝纖維變性和心血管疾病(包括動脈粥樣硬化、動脈硬化症、高膽固醇血症和高血脂症)的肝功能損害。
  106. 一種根據申請專利範圍第60-86項中任一項的歐貝提膽酸型式1或根據申請專利範圍第10-17項中任一項之方法所製造的歐貝提膽酸型式1之用途，其係用於降低三酸甘油酯。
  107. 一種根據申請專利範圍第1-5或87-98項中任一項之結晶狀歐貝提膽酸之用途，其係用於降低三酸甘油酯。
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