CN107674106B - 一种奥贝胆酸二聚体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种奥贝胆酸二聚体的制备方法，将奥贝胆酸的羧基和羟基进行保护，得到3α,7α‑二羟基‑6α‑乙基‑5β‑胆烷酸苄基酯（Ⅵ）和3α,7α‑二‑(4‑甲氧基三苯基甲基)‑6α‑乙基‑5β‑胆烷酸（Ⅳ），再将化合物Ⅳ和Ⅵ在碱性条件下进行酯化，最后依次脱去羟基和羧基的保护基团，即可得到奥贝胆酸二聚体（Ⅰ）。本发明中制备的奥贝胆酸二聚体纯度高，不需进一步纯化，即能够很好的用于奥贝胆酸的杂质研究。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种奥贝胆酸二聚体的制备方法。
背景技术
奥贝胆酸由美国Intercept 制药研发，其主要适应症为原发性胆汁性肝硬化（PBC）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是一种慢性肝病，患病率为10%～20%，病因目前尚未明确，引起慢性炎症导致肝硬化。目前尚无 FDA批准的药物治疗该症。熊去氧胆酸（UDCA）13-15mg/kg/d 是目前唯一批准用于PBC患者治疗的药物，但是高达50%的患者对它没有充分反应。现在亟需一种新的治疗药物填补国内治疗 NASH 疾病方面的空白，为 PBC 患者提供新的有效的治疗药物。
目前，奥贝胆酸用于治疗 PBC 已在美国与欧洲获得孤儿药资格。Intercept 公司在2015年6 月29日宣布，其用于原发性胆汁性肝硬化（PBC）的奥贝胆酸（OCA）达到两个重要的监管里程碑，即向美国 FDA 提交了该药加速批准的新药申请（NDA），另外其上市许可申请（MAA）也被欧洲药品管理局（EMA）接受。
奥贝胆酸的化学名称为 3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸，其结构如式（Ⅶ）所示：
（Ⅶ），
在奥贝胆酸的合成过程中，会产生二聚体杂质，其结构如式（I）所示
（I），
WO2013/192097 申请公开有该杂质的报道，但并未披露该杂质的制备方法。为了更好的控制奥贝胆酸的质量，必须对其中的杂质进行研究，因此制备该杂质作为对照品，用于杂质研究，很有必要。
两分子奥贝胆酸直接在酸性环境下进行反应，得到的副产物较多，产品纯度低，分离困难，不能用于杂质研究。
本发明在充分分析杂质结构的基础上，制定了合理的合成路线，并成功合成出纯度较高的奥贝胆酸二聚体，能够用于奥贝胆酸的质量研究，该产品纯度高，不需进一步纯化，即能够很好的用于奥贝胆酸的杂质研究。
发明内容
本发明提供了一种奥贝胆酸二聚体的制备方法，该二聚体结构如式（Ⅰ）所示
（I），
其包括以下步骤：
步骤a：在碱及有机溶剂存在下，用苄基溴保护3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅶ）的羧基
（Ⅶ），
以得到 3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯(Ⅵ)
(Ⅵ)。
步骤 b：在-5℃~10℃，将 3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯(Ⅵ)在咪唑存在下溶解于非质子性溶剂中，用 4-甲氧基三苯基氯甲烷对其羟基进行保护，得到3α,7α-二- (4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ）
（Ⅴ）。
步骤c：在 1~3 个大气压下，于非质子性溶剂中使用 Pd/C 氢化脱去苄基，得到3α,7 α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅳ）
（Ⅳ）。
步骤d：在有机碱、催化剂以及脱水剂存在下，将3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅳ）和3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ）于非质子性溶剂中，酯化得到3α[3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基]-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅲ）
（Ⅲ）。
步骤e：在酸性环境下，于溶剂中脱去4-甲氧基三苯基甲基保护基，得到3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅱ）
（Ⅱ）。
步骤f：在1~3个大气压下，于非质子性溶剂中使用Pd/C氢化脱去苄基，得到式（Ⅰ）所示奥贝胆酸二聚体。
其中步骤a中所述碱为碳酸钾、碳酸铯或1,8-二氮杂环十一碳-7-烯（简称DBU）中任意一种。
其中步骤a中所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、乙腈中任意一种。
其中步骤b反应温度优选-5至5℃。
其中步骤c或f中所述Pd/C为10%的Pd/C，使用量在10至30%之间，优选10至20%，即在反应中每克主料加入0.1—0.3克10%的Pd/C，优选每克主料加入0.1—0.2克10%的Pd/C。
其中步骤b、c、d或f中所述非质子性溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、四氢呋喃中任意一种。
其中步骤d所述脱水剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐(简称EDCI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺(简称EDC)、二环己基碳二亚胺(简称DCC)中任意一种，优选1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐(简称EDCI)。
其中步骤d中所述有机碱为二异丙胺、三乙胺、二异丙基乙基胺（简称DIPEA）中任意一种。
其中步骤d中所述催化剂为4-二甲氨基吡啶（简称DMAP），用量在0.2~0.5eq.，优选0.3~0.5eq.；即每摩尔主料加入4-二甲氨基吡啶0.2~0.5eq.，优选加入0.3~0.5eq.。
其中步骤e所述酸性环境为在反应中加入酸，所用酸为盐酸、醋酸或三氟化硼乙醚中任意一种，其用量为3eq.，即每摩尔主料加入盐酸、醋酸或三氟化硼乙醚3eq.。
其中步骤e中所述溶剂为四氢呋喃。
其中步骤a中获得的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ）反应液倾入饱和氯化钠溶液中，加入乙酸乙酯萃取，经过简单的萃取处理，干燥，有机相浓缩后，用于下步反应。
其中步骤b中制备的3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ）的反应液中加入水分液，收集有机相，干燥，有机相浓缩后，用于下步反应。
其中步骤c中制备的3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅳ）的反应液，过滤后浓缩，得到产物直接用于下步反应；过滤过程中可以加入硅藻土提高过滤速度。
其中步骤d中制备的3α[3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基]-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅲ）的反应液，加水洗后分液，收集有机相，有机相干燥，过滤，滤液浓缩后，经过柱层析纯化，得到固体，用于下步反应。
其中步骤e中制备的3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅱ）的反应液，倒入饱和食盐水中，乙酸乙酯萃取，水洗，收集有机相，干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化，得到白色固体，用于下步反应。
其中步骤f中制备的3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅰ）的反应液，经过滤，滤液减压浓缩，得白色固体，加入乙酸乙酯搅拌1h，过滤，得到最终产品，含量达到95%以上，可直接用于产品杂质分析。
由于采用上述技术方案，本发明中制备的奥贝胆酸二聚体纯度高，含量可达到95%以上，不需进一步纯化，即能够很好的用于奥贝胆酸的杂质研究。
具体实施方式
下述实施例仅用于阐述实现本发明的方法，不应理解为对本发明的限制。
本发明所用奥贝胆酸为华北制药集团新药研究开发有限责任公司生产，特殊试剂如下表 所列，其它常规试剂均为市售分析试剂，不定型硅胶购自青岛海洋化工有限公司。层析柱购自上海申越实验器材有限公司；检测仪器包括Waters e2695高效液相色谱仪，2489型紫外检测器（Waters公司生产），ELSD 2000ES型检测器（Alltech公司生产）、；INVOA500型核磁共振波谱仪购自Varian公司；Acquity uplc system，PDA检测器，Xevo TQ MS/MS检测器均购自Waters公司。
实施例1
步骤a：3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ）的制备
室温下，将10.0g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅶ），5.0g的碳酸钾和100ml N,N-二甲基甲酰胺加入到反应瓶中，搅拌下加入6.1g的苄基溴(1.5eq)，反应搅拌10h。将反应液倒入100ml饱和氯化钠溶液中，加入100ml乙酸乙酯萃取，收集有机相。有机相用10%氯化钠水溶液50ml洗两遍，50ml水洗一遍，加20g无水硫酸镁干燥2h，过滤，浓缩有机相，得到11.24g的 3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ），含量96.7%，收率92.4%。
步骤b：3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ）的制备
控制温度在0~5℃，将7g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯和4.7g的咪唑加入100ml二氯甲烷溶液中，搅拌均匀后加入10.6g的4-甲氧基三苯基氯甲烷。混合物搅拌10h，反应完全后，用50ml水洗两遍，加20g无水硫酸镁干燥2h，过滤，减压浓缩有机相，得到7.38g的3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ），含量91.3%，收率64.9%。
步骤c：3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅳ）的制备
室温下，将7g的3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ）、1.5g 10%的Pd/C、100ml 四氢呋喃加入高压反应釜中，反应混合物在1至3个大气压下氢化，直到指示氢不再吸收为止。在硅藻土助滤下过滤反应液，浓缩后得到3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸5.1g，含量87.9%，收率80.2%，直接用于下一步反应。
步骤d：3α[3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基] -7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅲ）的制备
将3.2g 的3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅳ）溶于60ml的二氯甲烷中，依次加入1g 的EDCI、0.3g的DMAP、1.3g的DIPEA，搅拌30min后，将5g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ）溶于20ml二氯甲烷中，缓慢滴加入反应瓶中，滴加完毕后，室温搅拌8h，反应结束后，加100ml水洗两遍，有机相加10g无水硫酸镁干燥2小时，过滤，滤液减压浓缩后，加入二氯甲烷溶解，拌入5克200-300目的不定型硅胶，干燥得到物料干样，注入260mm*490mm型硅胶柱（200-300目的不定型硅胶，装量为200g）进行层析分离，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱，根据液相检测结果，收集含量大于95%的洗脱液，35℃减压浓缩洗脱液至干，得到白色固体2.8g，含量95.36%，收率35.0%。
步骤e：3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅱ）的制备（脱羟基保护基）
将2.8g的3α[3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基]-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅲ），溶于30ml的四氢呋喃中，加入12%的盐酸2ml，室温搅拌4h，将反应液倒入50ml的饱和食盐水中，30ml的乙酸乙酯萃取，有机相用20ml水洗两遍，有机相加5g无水硫酸镁干燥2小时，过滤，减压浓缩，加入乙酸乙酯溶解，拌入5克200-300目的不定型硅胶，干燥得到物料干样，注入260mm*490mm型硅胶柱（200-300目的不定型硅胶，装量为200g）进行层析分离，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱，根据液相检测结果，收集含量大于98%的洗脱液，35℃减压浓缩洗脱液至干，得到白色固体0.94g，含量98.7%，收率57.0%。
步骤f：3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅰ）的制备
将0.9g的3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅱ）溶于10ml的四氢呋喃中，加入0.15g10%的Pd/C，在1至3个大气压下氢化，直到指示氢不再吸收为止。反应液加硅藻土2g，过滤，滤饼用5ml四氢呋喃洗，滤液减压浓缩，得白色固体，加入3ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤，得到3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅰ）0.5g，含量97.31%，收率61.3%。
实施例2
步骤a：3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ）的制备
将10.0g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅶ），11.2g的碳酸铯和100ml乙腈加入到反应瓶中，搅拌下加入6.1g的苄基溴(1.5eq)，反应搅拌10h。将反应液减压浓缩后，加入100ml饱和氯化钠溶液，用100ml乙酸乙酯萃取。有机相用10%氯化钠水溶液50ml洗两遍，50ml水洗一遍，加20g无水硫酸镁干燥3h，过滤，浓缩有机相，得到11.36g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ），含量97.6%，收率93.4%。
步骤b：3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ）的制备
控制温度在-5~0℃，将7g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯和4.7g的咪唑加入100ml三氯甲烷溶液中，搅拌均匀后加入10.6g的4-甲氧基三苯基氯甲烷。混合物搅拌11h，反应完全后，用50ml水洗两遍，加20g无水硫酸镁干燥2h，过滤，减压浓缩有机相，得到7.24g的3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ），含量92.4%，收率63.7%。
步骤c：3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅳ）的制备
将7g的3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ）、0.7 g10%的Pd/C、100ml 四氢呋喃加入高压反应釜中，反应混合物在1至3个大气压下氢化，直到指示氢不再吸收为止。在硅藻土助滤下过滤反应液，浓缩后得到3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸5.35g，含量88.2%，收率84.1%，直接用于下一步反应。
步骤d：3α[3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基]-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅲ）的制备
将3.2g的3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅳ）溶于60ml的三氯甲烷中，依次加入1.1g的EDC、0.15g的DMAP、1.3g的DIPEA，搅拌30min后，将5g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ）溶于20ml三氯甲烷中，缓慢滴加入反应瓶中，滴加完毕后，室温搅拌8h，反应结束后，加100ml水洗两遍，有机相加10g无水硫酸镁干燥2小时，过滤，滤液减压浓缩，加入三氯甲烷溶解，拌入5克200-300目的不定型硅胶，干燥得到物料干样，注入260mm*490mm型硅胶柱（200-300目的不定型硅胶，装量为200g）进行层析分离，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱，根据液相检测结果，收集含量大于95%的洗脱液，35℃减压浓缩洗脱液至干，得到白色固体2.72g，含量95.3%，收率34.0%。
步骤e：3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅱ）的制备（脱羟基保护基）
将2.7g的3α[3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基]-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅲ），溶于30ml的四氢呋喃中，加入0.8ml三氟化硼乙醚，室温搅拌4h，将反应液倒入50ml的饱和食盐水中，30ml的乙酸乙酯萃取，有机相用20ml水洗两遍，有机相加5g无水硫酸镁干燥2小时，过滤，减压浓缩，加入乙酸乙酯溶解，拌入5克200-300目的不定型硅胶，干燥得到物料干样，注入260mm*490mm型硅胶柱（200-300目的不定型硅胶，装量为200g）进行层析分离，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱，根据液相检测结果，收集含量大于98%的洗脱液，35℃减压浓缩洗脱液至干，得到白色固体0.98g，含量98.1%，收率61.6%。
步骤f：3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅰ）的制备
将0.9g的3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅱ）溶于10ml的二氯甲烷中，加入0.1g10%的Pd/C，在1至3个大气压下氢化，直到指示氢不再吸收为止。反应液加硅藻土2g，过滤，滤饼用5ml二氯甲烷洗，滤液减压浓缩，得白色固体，加入3ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤，得到3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅰ）0.48g，含量97.19%，收率58.8%。
实施例3
步骤a：3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ）的制备
将10.0g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅶ），5.4g的DBU和100ml N,N-二甲基甲酰胺加入到反应瓶中，搅拌下加入6.1g的苄基溴(1.5eq)，反应搅拌10h。将反应液减压浓缩后，加入100ml饱和氯化钠溶液，用100ml乙酸乙酯萃取。有机相用10%氯化钠水溶液50ml洗两遍，50ml水洗一遍，加20g无水硫酸镁干燥2.5h，过滤，浓缩有机相，得到11.31g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ），含量96.9%，收率93%。
步骤b：3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ）的制备
控制温度在-5~0℃，将7g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯和4.7g的咪唑加入100ml四氢呋喃溶液中，搅拌均匀后加入10.6g的4-甲氧基三苯基氯甲烷。混合物搅拌11h，反应完全后，用50ml水洗两遍，加20g无水硫酸镁干燥2h，过滤，减压浓缩有机相，得到7.3g的3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ），含量90.7%，收率64.2%。
步骤c：3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅳ）的制备
将7g的3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ）、2.1 g10%的Pd/C、100ml 二氯甲烷加入高压反应釜中，反应混合物在1至3个大气压下氢化，直到指示氢不再吸收为止。在硅藻土助滤下过滤反应液，浓缩后得到3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸5.26g，含量86.4%，收率82.7%，直接用于下一步反应。
步骤d：3α[3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基] -7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅲ）的制备
将3.2g 的3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅳ）溶于60ml的四氢呋喃中，依次加入1.1g的DCC、0.17g的DMAP、1.0g的三乙胺，搅拌30min后，将5g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ）溶于20ml四氢呋喃中，缓慢滴加入反应瓶中，滴加完毕后，室温搅拌8h，反应结束后，加100ml水洗两遍，有机相加10g无水硫酸镁干燥2小时，过滤，滤液减压浓缩，加入四氢呋喃溶解，拌入5克200-300目的不定型硅胶，干燥得到物料干样，注入260mm*490mm型硅胶柱（200-300目的不定型硅胶，装量为200g）进行层析分离，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱，根据液相检测结果，收集含量大于95%的洗脱液，35℃减压浓缩洗脱液至干，得到白色固体2.88g，含量95.13%，收率36.0%。
步骤e：3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅱ）的制备（脱羟基保护基）
将2.8g的3α[3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基]-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅲ），溶于30ml的四氢呋喃中，加入0.5ml醋酸，室温搅拌4h，将反应液倒入50ml的饱和食盐水中，30ml的乙酸乙酯萃取，有机相用20ml水洗两遍，有机相加5g无水硫酸镁干燥2小时，过滤，减压浓缩，加入乙酸乙酯溶解，拌入5克200-300目的不定型硅胶，干燥得到物料干样，注入260mm*490mm型硅胶柱（200-300目的不定型硅胶，装量为200g）进行层析分离，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱，根据液相检测结果，收集含量大于98%的洗脱液，35℃减压浓缩洗脱液至干，得到白色固体0.97g，含量98.1%，收率58.8%。
步骤f：3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅰ）的制备
将0.9g的3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅱ）溶于10ml的三氯甲烷中，加入0.27g 10%的 Pd/C，在1至3个大气压下氢化，直到指示氢不再吸收为止。反应液加硅藻土2g，过滤，滤饼用5ml三氯甲烷洗，滤液减压浓缩，得白色固体，加入3ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤，得到3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅰ）0.52g，含量97.88%,收率63.7%。
实施例4
步骤a：3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ）的制备
将10.0g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅶ），4.95g的碳酸钾和100ml N,N-二甲基乙酰胺加入到反应瓶中，搅拌下加入6.1g的苄基溴(1.5eq)，反应搅拌11h。将反应液减压浓缩后，加入100ml饱和氯化钠溶液，用100ml乙酸乙酯萃取。有机相用10%氯化钠水溶液50ml洗两遍，50ml水洗一遍，加20g无水硫酸镁干燥2.5h，过滤，浓缩有机相，得到11.32g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ），含量95.8%，收率93.05%。
步骤b：3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ）的制备
控制温度在-5~0℃，将7g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯和4.7g咪唑加入100ml的1,2-二氯乙烷溶液中，搅拌均匀后加入10.6g的4-甲氧基三苯基氯甲烷。混合物搅拌11h，反应完全后，用50ml水洗两遍，加20g无水硫酸镁干燥2h，过滤，减压浓缩有机相，得到7.43g的3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ），含量90.32%，收率65.3%。
步骤c：3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅳ）的制备
将7g的3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ）、1.5g10%的Pd/C、100ml 1,2-二氯乙烷加入高压反应釜中，反应混合物在1至3个大气压下氢化，直到指示氢不再吸收为止。在硅藻土助滤下过滤反应液，浓缩后得到3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸5.14g，含量85.79%，收率80.8%，直接用于下一步反应。
步骤d：3α[3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基] -7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅲ）的制备
将3.2g 的3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅳ）溶于60ml的1,2-二氯乙烷中，依次加入1.0g 的EDCI、0.12g 的DMAP、1.0g的二异丙胺，搅拌30min后，将5g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ）溶于20ml1,2-二氯乙烷中，缓慢滴加入反应瓶中，滴加完毕后，室温搅拌9.5h，反应结束后，加100ml水洗两遍，有机相加10g无水硫酸镁干燥2小时，过滤，滤液减压浓缩，加入1,2-二氯乙烷溶解，拌入5克200-300目的不定型硅胶，干燥得到物料干样，注入260mm*490mm型硅胶柱（200-300目的不定型硅胶，装量为200g）进行层析分离，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱，根据液相检测结果，收集含量大于95%的洗脱液，35℃减压浓缩洗脱液至干，得到白色固体2.83g，含量95.07%，收率35.4%。
步骤e：3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅱ）的制备（脱羟基保护基）
将2.8g的3α[3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基]-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅲ），溶于30ml的四氢呋喃中，加入0.8ml三氟化硼乙醚，室温搅拌4h，将反应液倒入50ml的饱和食盐水中，30ml的乙酸乙酯萃取，有机相用20ml水洗两遍，有机相加5g无水硫酸镁干燥2小时，过滤，减压浓缩，加入乙酸乙酯溶解，拌入5克200-300目的不定型硅胶，干燥得到物料干样，注入260mm*490mm型硅胶柱（200-300目的不定型硅胶，装量为200g）进行层析分离，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱，根据液相检测结果，收集含量大于98%的洗脱液，35℃减压浓缩洗脱液至干，得到白色固体1.03g，含量98.13%，收率62.4%。
步骤f：3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅰ）的制备
将1g的3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅱ）溶于10ml的1,2-二氯乙烷中，加入0.2g 10%的Pd/C，在1至3个大气压下氢化，直到指示氢不再吸收为止。反应液加硅藻土2g，过滤，滤饼用5ml1,2-二氯乙烷洗，滤液减压浓缩，得白色固体，加入3ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤，得到3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基) -7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅰ）0.55g，含量97.63%,收率60.6%。
实施例5
步骤a：3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ）的制备
将10.0g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅶ），5.4g的DBU和100ml乙腈加入到反应瓶中，搅拌下加入6.1g的苄基溴(1.5eq)，反应搅拌11h。将反应液减压浓缩后，加入100ml饱和氯化钠溶液，用100ml乙酸乙酯萃取。有机相用10%氯化钠水溶液50ml洗两遍，50ml水洗一遍，加20g无水硫酸镁干燥2.5h，过滤，浓缩有机相，得到11.18g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ），含量96.35%，收率91.9%。
步骤b：3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ）的制备
控制温度在0~5℃，将7g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯和4.7g咪唑加入100ml的二氯甲烷溶液中，搅拌均匀后加入10.6g的4-甲氧基三苯基氯甲烷。混合物搅拌11h，反应完全后，用50ml水洗两遍，加20g无水硫酸镁干燥2h，过滤，减压浓缩有机相，得到7.43g的3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ），含量91.76%，收率65.4%。
步骤c：3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅳ）的制备
将7g的3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ）、2.0g10%的Pd/C、100ml四氢呋喃加入高压反应釜中，反应混合物在1至3个大气压下氢化，直到指示氢不再吸收为止。在硅藻土助滤下过滤反应液，浓缩后得到3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸5.23g，含量86.53%，收率82.2%，直接用于下一步反应。
步骤d：3α[3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基] -7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅲ）的制备
将3.2g的3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅳ）溶于60ml的二氯甲烷中，依次加入1.1g 的DCC、0.25g的DMAP、1.0g的二异丙胺，搅拌30min后，将5g的3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ）溶于20ml二氯甲烷中，缓慢滴加入反应瓶中，滴加完毕后，室温搅拌10h，反应结束后，加100ml水洗两遍，有机相加10g无水硫酸镁干燥2小时，过滤，滤液减压浓缩，加入二氯甲烷溶解，拌入5克200-300目的不定型硅胶，干燥得到物料干样，注入260mm*490mm型硅胶柱（200-300目的不定型硅胶，装量为200g）进行层析分离，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱，根据液相检测结果，收集含量大于95%的洗脱液，35℃减压浓缩洗脱液至干，得到白色固体2.85g，含量95.16%，收率35.65%。
步骤e：3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基) -7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅱ）的制备（脱羟基保护基）
将2.8g的3α[3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基]-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅲ），溶于30ml的四氢呋喃中，加入0.8ml三氟化硼乙醚，室温搅拌4h，将反应液倒入50ml的饱和食盐水中，30ml的乙酸乙酯萃取，有机相用20ml水洗两遍，有机相加5g无水硫酸镁干燥2小时，过滤，减压浓缩，加入乙酸乙酯溶解，拌入5克200-300目的不定型硅胶，干燥得到物料干样，注入260mm*490mm型硅胶柱（200-300目的不定型硅胶，装量为200g）进行层析分离，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱，根据液相检测结果，收集含量大于98%的洗脱液，35℃减压浓缩洗脱液至干，得到白色固体0.96g，含量98.09%，收率58.16%。
步骤f：3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅰ）的制备
将0.95g的3α(3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅱ）溶于10ml的二氯甲烷中，加入0.15g 10%的Pd/C，在1至3个大气压下氢化，直到指示氢不再吸收为止。反应液加硅藻土2g，过滤，滤饼用5ml二氯甲烷洗，滤液减压浓缩，得白色固体，加入3ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤，得到3α(3α, 7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基)-7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅰ）0.51g，含量96.84%，收率59.15%。
分析
MS：[M+Na]+ m/z 845.65，[M-H]- m/z 821.60，其分子式为C52H86O7，分子量822.64。
1H NMR0.6(s, C18, C18'的6H), 0.8-1.0(C19, C19', C21, C21', C26, C26'的18H),1.9-2.2(C22, C22', C23, C23'的8H), 4.0-4.4(C3, C3', C7, C7'的4H)
13C NMR(500MHz,DMSO) δ(ppm):11.5(C26, C26')，18.0(C19, C19', C18, C18'),20.3(C21, C21')，30(C23, C23')，55(C20, C20')，68-73(C3, C3', C7, C7') 。
Claims (9)
1.一种奥贝胆酸二聚体的制备方法，该二聚体结构如式（Ⅰ）所示
（Ⅰ），
其包括以下步骤：
步骤a：在碱及有机溶剂存在下，用苄基溴保护3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅶ）的羧基
（Ⅶ），
以得到3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯(Ⅵ)
(Ⅵ)；
步骤b：在-5℃~10℃，将3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯(Ⅵ)在咪唑存在下溶解于非质子性溶剂中，用4-甲氧基三苯基氯甲烷对其羟基进行保护，得到3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅴ）
（Ⅴ）；
步骤c：在1~3个大气压下，于非质子性溶剂中使用Pd/C氢化脱去苄基，得到3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅳ）
（Ⅳ）；
步骤d：在有机碱、催化剂以及脱水剂存在下，将3α,7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆烷酸（Ⅳ）和 3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅵ）于非质子性溶剂中，酯化得到3α[3α, 7α-二-(4-甲氧基三苯基甲基)-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基] -7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅲ）
（Ⅲ）；
步骤 e：在酸性环境下，于溶剂中脱去 4-甲氧基三苯基甲基保护基，得到 3α(3α, 7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆-24-羰氧基) -7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（Ⅱ）
（Ⅱ）；
步骤 f：在 1~3 个大气压下，于非质子性溶剂中使用 Pd/C 氢化脱去苄基，得到式（Ⅰ）所示奥贝胆酸二聚体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤a所述碱为碳酸钾、碳酸铯或1,8-二氮杂环十一碳-7-烯中任意一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤a所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、乙腈中任意一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤b、c、d或f所述非质子性溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、四氢呋喃中任意一种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤d中所述脱水剂为1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐、1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基-碳二亚胺、二环己基碳二亚胺盐酸盐中任意一种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤d中所述有机碱为二异丙胺、三乙胺、二异丙基乙基胺中任意一种。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤d中所述催化剂为4-二甲氨基吡啶。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤e所述酸性环境所用酸为盐酸、醋酸或三氟化硼乙醚中任意一种。
9.根据权利要求1的制备方法，其中步骤e中所述溶剂为四氢呋喃。
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Address after: 052165 North China Pharmaceutical Group new drug research and Development Co., Ltd., No. 98, Hainan Road, Shijiazhuang Economic and Technological Development Zone, Hebei Province Applicant after: ZEPHAN BIOPHARMACEUTICALS, Inc. Address before: 050015 No. 388 Heping East Road, Shijiazhuang, Hebei, Changan District Applicant before: ZEPHAN BIOPHARMACEUTICALS, Inc. |
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| GR01 | Patent grant | ||
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