KR20100134695A

KR20100134695A - 펩티드 ｙｙ (ｐｙｙ) 분비촉진제 및 ｐｙｙ에 의해 조절되는 병태의 치료에 유용한 화합물을 확인하기 위해 ｇ 단백질-결합 수용체를 사용하는 방법

Info

Publication number: KR20100134695A
Application number: KR1020107023786A
Authority: KR
Inventors: 지-리앙 추; 제임스 엔. 레오나르드; 로버트 엠. 존스
Original assignee: 아레나 파마슈티칼스, 인크.
Priority date: 2008-04-07
Filing date: 2009-04-06
Publication date: 2010-12-23
Also published as: WO2009126245A1; EA201070996A1; AU2009234418A1; US20100203556A1; US20090253153A1; IL208244A0; JP2009250977A; CL2009000829A1; US20130131086A1; TW200946911A; CA2633354A1; CA2633354C; BRPI0911070A2; US8883714B2; US20100210666A1; US8486646B2; EP2108960A1; AR071127A1; CN102016593A; EP2146210A1

Abstract

본 발명은 펩티드 YY (PYY) 분비촉진제, 및 PYY에 의해 조절되는 병태, 예를 들어 NPY Y2 수용체 (Y2R)에 자극에 의해 조절되는 병태의 치료에 유용한 화합물을 확인하기 위해 GPR119 수용체를 사용하는 방법에 관한 것이다. GPR119 수용체의 작용제는 PYY에 의해 조절되는 병태, 예를 들어 Y2R의 자극에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방을 위한 치료제로서 유용하다. PYY에 의해 조절되는 병태, 예를 들어 Y2R의 자극에 의해 조절되는 병태는 뼈 관련 병태, 대사 장애, 혈관신생-관련 병태, 허혈-관련 병태, 경련성 질환, 흡수장애 질환, 암, 및 염증성 질환을 포함한다.

Description

펩티드 ＹＹ (ＰＹＹ) 분비촉진제 및 ＰＹＹ에 의해 조절되는 병태의 치료에 유용한 화합물을 확인하기 위해 Ｇ 단백질-결합 수용체를 사용하는 방법{METHODS OF USING A G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR TO IDENTIFY PEPTIDE YY (PYY) SECRETAGOGUES AND COMPOUNDS USEFUL IN THE TREATMENT OF CONDITIONS MODULATED BY PYY}

관련 출원에 대한 교차 참조

본원은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 가출원 61/123,273 (2008년 4월 7일 출원)을 기초로 한 우선권을 주장한다.

본 발명은 펩티드 YY (PYY) 분비촉진제 (secretagogue) 및 PYY에 의해 조절되는 병태, 예를 들어 NPY Y2 수용체 (Y2R)의 자극에 의해 조절되는 병태의 치료에 유용한 화합물을 확인하기 위해 GPR119 수용체를 사용하는 방법에 관한 것이다. GPR119 수용체의 작용제는 PYY에 의해 조절되는 병태, 예를 들어 Y2R의 자극에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방을 위한 치료제로서 유용하다. PYY에 의해 조절되는 병태, 예를 들어 Y2R의 자극에 의해 조절되는 병태는 뼈 관련 병태, 대사 장애, 혈관신생-관련 병태, 허혈-관련 병태, 경련성 질환, 흡수장애 질환, 암, 및 염증성 질환을 포함한다.

다음 논의는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로서, 본 발명의 선행 기술로서 의도되거나 인정되는 것이 아니다.

A. 골다공증

골다공증은 골 강도를 손상시켜 환자의 취약 골절의 위험을 증가시키는 경향이 있는, 골 질량 손실 및 골격 구조의 미세구조 악화를 특징으로 하는 무능화 질병이다. 골다공증은 유럽, 일본 및 미국에서 7천5백만 명이 넘는 사람에게 침범하고, 유럽과 미국에서만 2천3백만 명을 초과하는 사람에서 골절을 일으킨다. 미국에서, 골다공증은 모든 폐경후 백인 여성의 적어도 25％에 침범하고, 그 비율은 80세 초과의 여성에서 70％로 상승한다. 50세 초과의 여성 3명 중 1명이 사회에서 상당한 사회적 및 재정적 부담을 일으키는 골다공증성 골절이 있을 것이다. 이 질병은 여성에게 제한되지 않고; 고령의 남성도 또한 걸릴 수 있다. 2050년에는, 남성에서 고관절 (hip) 골절의 전세계 발병률은 310％, 여성에서는 240％ 증가할 것으로 추정된다. 임상적으로 나타나는 고관절, 전완 및 척추 골절에 대한 전체적인 평생 위험도는 약 40％로, 심혈관 질병에 대한 위험과 동등하다. 따라서, 골다공증성 골절은 실질적인 사망률, 이환률, 및 경제적인 비용을 일으킨다. 효과적인 예방 전략이 개발되지 않으면, 고령화하는 인구집단에서, 골다공증성 골절의 수와 그 비용은 다음 50년 내에 적어도 2배가 될 것이다 (예를 들어, 문헌 ([Atik et al., Clin Orthop Relat Res (2006) 443:19-24]; [Raisz, J Clin Invest (2005) 115:3318-3325]; 및 [World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis]) 참조).

B. 비만 및 당뇨병

비만은 증가하는 유병률 및 연관된 건강 위험 때문에 주요 공중 보건 문제이다. 또한, 비만은 제한된 운동성 및 감소된 신체 지구력을 통해 및 사회적, 학업적 및 직업적 차별을 통해 개인의 생활의 질을 해칠 수 있다.

비만 및 과체중은 일반적으로 체질량 지수 (BMI)에 의해 정의되고, 이는 총 체지방과 상호관련되고 특정 질병의 위험의 척도로서 역할을 한다. BMI는 킬로그램 단위의 체중을 제곱미터 단위의 키로 나누어 계산한다 (kg/m²). 과체중은 대개 25-29.9 kg/m²의 BMI로서 규정되고, 비만은 대개 30 kg/m² 이상의 BMI로서 규정된다 (예를 들어, 문헌 [National Heart, Lung, and Blood Institute, Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Overweight and Obesity in Adults, The Evidence Report, Washington, DC: U.S. Department of Health and Human Services, NIH publication no. 98-4083 (1998)] 참조).

최근 연구에서는 비만 및 연관된 건강 위험이 성인에 제한되지 않고, 소아 및 청소년에서도 놀라운 정도로 발생하는 것으로 밝혀졌다. 미국 질병 통제 센터 (Center for Disease Control)에 따르면, 과체중으로 규정된 소아 및 청소년의 비율은 1970대 초반 이래로 2배 초과가 되었고, 소아 및 청소년의 약 15％가 현재 과체중이다. 심장병에 대한 위험 인자, 예를 들어 고콜레스테롤 및 고혈압은 유사한 연령의 정상 체중 대상에 비해 과체중 소아 및 청소년에서 증가된 빈도로 발생한다. 또한, 이전에 성인 질병으로 간주된 2형 당뇨병이 소아 및 청소년에서 급격히 증가하였다. 과체중 상태 및 비만은 2형 당뇨병에 밀접하게 관련된다. 최근에, 과체중 청소년이 과체중 또는 비만 성인으로 되는 가능성이 70％인 것으로 추정되었다. 부모 중 적어도 1명이 과체중이거나 비만이면 그 가능성은 약 80％로 증가한다. 소아 자신이 지각하는 과체중의 가장 즉각적인 결과는 사회적 차별이다.

과체중 또는 비만 개체는 고혈압, 이상지질혈증, 2형 (인슐린 비의존성) 당뇨병, 인슐린 저항성, 포도당 불내성, 고인슐린혈증, 관상동맥성 심장병, 협심증, 울혈성 심부전, 뇌졸중, 담석, 담낭염, 담석증, 통풍, 골관절염, 폐쇄성 수면 무호흡 및 호흡 문제, 담낭 질병, 특정 형태의 암 (예를 들어, 자궁내막, 유방, 전립선, 및 대장) 및 심리학적 장애 (예를 들어 우울증, 섭식 장애, 신체상 왜곡 및 낮은 자존감)와 같은 병에 대한 위험이 증가된다. 비만의 부정적인 건강상 결과로 인해 비만은 미국에서 예방가능한 사망의 2번째 주요 원인이고, 사회에 유의한 경제적 및 정신사회적 효과를 부여한다 (예를 들어, 문헌 [McGinnis et al, JAMA (1993) 270:2207-2212] 참조).

비만은 현재, 그의 연관된 건강 위험을 감소시키기 위해 치료를 필요로 하는 만성 질병으로 인정된다. 체중 감소가 중요한 치료 성과이지만, 비만 관리의 주요 목표 중 하나는 비만-관련 이환률 및 사망률을 감소시키기 위해 심혈관 및 대사 수치를 개선하는 것이다. 5-10％ 체중 감소가 대사 수치, 예를 들어 혈당, 혈압, 및 지질 농도를 실질적으로 개선할 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, 체중의 5-10％ 감소는 이환률 및 사망률을 감소시킬 수 있는 것으로 생각된다.

비만 관리를 위해 현재 이용가능한 처방약은 일반적으로 오를리스타트와 같이 식이 지방 흡수를 감소시킴으로써, 또는 시부트라민에서 보이는 바와 같이 음식 섭취 감소 및/또는 에너지 소모 증가의 에너지 결손을 일으킴으로써 체중을 감소시킨다. 현재 이용가능한 항비만제의 대체물에 대한 탐색에서는 몇몇 경로를 취하였고, 이 중 하나는 포만감을 조절하는데 관련된 특정 내장 펩티드, 예를 들어 펩티드 YY (PYY)에 집중하였다 (Chaudhri et al, Annu Rev Physiol (2008) 70:239-255).

C. 죽상경화증

죽상경화증은 염증, 지질 축적, 세포 사멸 및 섬유증을 특징으로 하는 복합 질병이다. 죽상경화증은 거품 (foam) 세포 형성을 일으키는, 내피하 공간 내로 단핵구 침윤 및 콜레스테롤 퇴적을 특징으로 한다. 죽상경화증에 후속적인 혈전증은 심근경색 및 뇌졸중을 일으킨다. 죽상경화증은 미국을 포함한 많은 국가에서 선도적인 사망 원인이다 (예를 들어, 문헌 ([Ruggeri, Nat Med (2002) 8: 1227-1234]; [Arehart et al, Circ Res, 2008, Mar 6 Epub ahead of print]) 참조).

D. 염증성 장 질병 ( IBD )

염증성 장 질병 (IBD)은 창자에서 염증을 일으키는 질병에 대한 일반 명칭이고, 예를 들어 크론 (Crohn) 병, 궤양 대장염, 궤양성 직장염을 포함한다. 1990년에 염증성 장 질병에 대한 미국의 의료 비용은 14억 내지 18억 달러인 것으로 추산되었다. 생산성 손실이 추가로 4억 내지 8억 달러를 추가하는 것으로 추산되었고, 따라서 염증성 장 질병의 추산된 비용은 18억 내지 26억 달러이다 (예를 들어, 문헌 ([Pearson, Nursing Times (2004) 100:86-90]; [Hay et al, J Clin Gastroenterol (1992) 14:309-317]; [Keighley et al, Ailment Pharmacol Ther (2003) 18:66-70]) 참조)

창자염은 창자, 특히 소장의 염증을 나타내고, 임의의 많은 상이한 원인이 있을 수 있는 일반적인 상태이다. 창자염은 소장 및 대장의 염증을 나타낸다.

크론병 (CD)은 소화관의 임의의 부분에 침범할 수 있는 염증성 과정이지만, 달리 (말단) 회장 및 맹장으로 불리는 소장의 마지막 부위에서 가장 일반적으로 보인다. 상기 영역들은 함께 회맹장 구역으로도 알려져 있다. 다른 사례에서는 대장만, 소장만 (십이지장, 공장 및/또는 회장), 항문, 위 또는 식도 중 하나 이상에 침범할 수 있다. 궤양 대장염과 대조적으로, CD는 대체로 직장에 침범하지 않지만, 대신에 종종 항문에 침범한다. 염증은 이환된 장기의 내층으로 깊이 확장한다. 염증은 통증을 일으킬 수 있고, 창자를 빈번하게 비워서, 설사를 일으킬 수 있다. 크론병은 또한 창자염으로 불릴 수 있다. 육아종성 (granulomatous) 대장염은 대장에 침범하는 크론병에 대한 다른 명칭이다. 회장염은 소장의 제3 부위인 회장의 CD이다. 크론 대장염은 대장의 일부 또는 모두에 침범하는 CD이다.

궤양 대장염 (UC)은 흔히 대장으로 불리는 큰 창자의 염증성 질병이다. UC는 대장 및 직장의 내부 내층의 염증 및 궤양형성을 일으킨다. UC의 염증은 직장 영역에서 대체로 가장 중증이고, 대장 및 소장이 연결되는 맹장을 향해 중증도가 감소한다 (환자마다 다른 비율로). 직장의 염증은 직장염으로 불린다. S상 결장 (직장 바로 위에 위치함)의 염증은 S상 결장염으로 불린다. 전체 대장에 관여되는 염증은 전대장염 (pancolitis)으로 불린다. 염증은 대장을 빈번하게 비워서 설사를 일으킨다. 대장의 내층이 파괴되므로, 궤양은 방출하는 점액, 농 및 혈액을 형성한다. 궤양성 직장염은 직장만을 침범하는 UC의 일종이다.

E. 펩티드 YY ( PYY )

펩티드 YY (PYY)는 1980년에 돼지 창자로부터 처음 단리된 36개 아미노산의 펩티드이다 (Tatemoto et al, Nature (1980) 285:417-418). PYY는 대장과 소장 둘 모두에서 장내분비 L-세포로부터 분비된다. 면역반응성 PYY의 래트 및 인간 내장 농도는 십이지장과 공장에서 낮고, 회장과 대장에서 높고, 직장에서 가장 높은 것으로 밝혀졌다 ([Lundberg et al, PNAS USA (1982) 79:4471-4475]; [Adrian et al, Gastroenterol (1985) 89:1070-1077]; [Ekblad et al, Peptides (2002) 23:251-261]; [Ueno et al, Regul Pept (2008) 145:12-16]). 래트에서 PYY 발현은 랑게르한스섬의 알파 세포 및 연수 내의 세포까지 확장되는 것으로 보고되었다 (Ekblad et al, Peptides (2002) 23:251-261). PYY는 PYY₁ _-36 및 PYY₃ _-36으로서 순환계 내로 방출된다 (Eberlein et al, Peptides (1989) 10:797-803). PYY₃ _-36은 디펩티딜 펩티다제 IV에 의한 N-말단 Tyr 및 Pro 잔기의 절단에 의해 PYY₁ _-36으로부터 생성된다. PYY₃ _-36은 인간 식후 혈장 내의 PYY의 우세한 형태이다 (Grandt et al, Regul Pept (1994) 51:151-159). PYY_1-36 및 PYY₃ _-36은 G 단백질-결합 수용체인 NPY Y2 수용체 (Y2R)에서 동등한 작용제 활성을 갖는 것으로 보고되었지만 (Parker et al, Br J Pharmacol (2008) 153:420-431), PYY₃ _-36은 고-친화도 Y2R 선택적 작용제인 것으로 보고되었다 (Keire et al, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol (2000) 279:G126-G131). 이후에 PYY는 말초 투여 후에 래트에서 고지방 음식 섭취를 감소시키고 (Okada et al, Endocrinology Supplement (1993) 180), 말초 투여 후에 마우스에서 체중 감소를 야기하는 (Morley et al, Life Sciences (1987) 41:2157-2165) 것으로 보고되었다.

PYY₃ _-36의 말초 투여는 래트에서 음식 섭취 및 체중 증가를 현저하게 감소시키고, 인간에서 식욕 및 음식 섭취를 감소시키지만, Y2R-미함유 마우스에서는 그렇지 않기 때문에, 음식 섭취 효과는 Y2R을 필요로 함을 제시한다고 언급되었다. 인간 연구에서, PYY₃ _-36의 주입은 유의하게 식욕을 감소시키고 24시간에 걸쳐 음식 섭취를 33％ 감소시킨다고 밝혀졌다. 펩티드의 정상적인 식후 순환 농도에 도달하기 위해 PYY₃ _-36을 주입하면 15분 내에 PYY₃ _-36의 피크 혈청 수준에 도달한 후, 30분 내에 기저 수준까지 신속하게 감소하였다. PYY₃ _-36 주입 후 12시간 내에 음식 섭취의 유의한 억제가 발생하지만, 12시간 내지 24시간에서는 음식 섭취에 대한 효과가 본질적으로 존재하지 않았음이 보고되었다. 래트 연구에서, PYY₃ _-36의 반복적인 복강내 투여 (7일 동안 1일 2회 주사)는 누적적인 음식 섭취를 감소시켰다 ([Batterham et al, Nature (2002) 418:650-654], [Renshaw et al, Current Drug Targets (2005) 6:171-179]).

PYY₃ _-36의 말초 투여는 암수 모두의 대사 질병의 다양한 설치류 모델에서 음식 섭취, 체중 증가 및 혈당 지수를 감소시키는 것으로 보고되었다 (Pittner et al, Int J Obes Relat Metab Disord (2004) 28:963-971). 특이적인 길항제 BIIE-246을 사용한 Y2R의 차단은 음식 섭취 감소에 대한 말초 투여된 내인성 및 외인성 PYY_3-36의 효과를 약화시킨다고 보고되었다 (Abbott et al, Brain Res (2005) 1043:139-144). 신규한 장기 작용성의 선택적인 Y2R 폴리에틸렌 글리콜-접합된 펩티드 작용제의 말초 투여는 설치류에서 음식 섭취를 감소시키고, 포도당 대사 (포도당 처리, 혈장 인슐린 및 혈장 포도당)를 개선하는 것으로 보고되었다 ([Ortiz et al, JPET (2007) 323:692-700]; [Lamb et al, J Med Chem (2007) 50:2264-2268]). 마우스에서 PYY를 제거하면 고인슐린혈증 및 비만이 발생한다고 보고되었다 (Boey et al, Diabetologia (2006) 49:1360-1370). 장기 작용성의 효능있는 고선택적 Y2R 작용제를 말초 투여하면, 마우스에서 음식 섭취가 억제되고 지방 대사가 촉진된다고 보고되었다 (Balasubramaniam et al, Peptides (2007) 28:235-240).

생체 내에서 PYY 합성을 자극하는 물질이 다이어트-유발 및 유전적 비만에 대한 보호를 제공할 수 있고, 포도당 내성을 개선시킬 수 있다는 증거가 존재한다 (Boey et al, Neuropeptides (2008) 42:19-30).

Y2R 작용제, 예를 들어 PYY₁ _-36 및 PYY₃ _-36은 간질 발작, 예를 들어 카이네이트 발작에 대한 보호를 제공할 수 있는 것으로 보고되었다 ([El Bahh et al, Eur J Neurosci (2005) 22:1417-1430]; [Woldbye et al, Neurobiology of Disease (2005) 20:760-772]).

Y2R 작용제, 예를 들어 PYY₁ _-36 및 PYY₃ _-36은 정맥내 투여시에 장의 다양한 부위에서 물과 나트륨 모두의 흡수를 증가시키는, 친흡수성 (proabsorbtive) (또는 항-분비) 호르몬으로서 작용한다고 보고되었다 ([Bilchik et al, Gastroenterol (1993) 105:1441-1448], [Liu et al, J Surg Res (1995) 58:6-11]; [Nightingale et al, Gut (1996) 39:267-272]; [Liu et al, Am Surg (1996) 62:232-236]; [Balasubramaniam et al, J Med Chem (2000) 43:3420-3427]). Y2R 작용제, 예를 들어 PYY 유사체는 장 상피에서 분비를 억제하고 흡수 및 성장을 촉진한다고 보고되었다 (Balasubramaniam et al, J Med Chem (2000) 43:3420-3427). PYY는 정상 래트에서 장 성장을 촉진한다고 보고되었다 (Gomez et al, Am J Physiol (1995) 268:G71-G81). Y2R 작용제, 예를 들어 PYY₁ _-36 및 PYY₃ _-36은 장 운동을 억제하고 설사를 억제하는 작용을 한다고 보고되었다 (EP1902730; 또한, 문헌 [Cox, Peptides (2007) 28:345-351] 참조).

Y2R 작용제, PYY₁ _-36 및 PYY₃ _-36은 염증성 장 질병, 예를 들어 궤양 대장염 및 크론병에 대한 보호를 제공할 수 있는 것으로 보고되었다 (WO 03/105763). PYY-결핍 마우스는 골감소 표현형을 보인다고, 즉, PYY가 골 질량을 증가시킬 수 있고/있거나 골 질량 손실에 대한 보호를 제공할 수 있다 (예를 들어, 골 질량 손실을 감소시킨다)고 보고되었다 (Wortley et al, Gastroenterol (2007) 133:1534-1543). PYY₃ _-36은 설치류 췌장염 모델에서 보호를 제공할 수 있는 것으로 보고되었다 (Vona-Davis et al, Peptides (2007) 28:334-338).

혈관신생은 Y2R-결핍 마우스에서 손상되는 것으로 (Lee et al, Peptides (2003) 24:99-106), 즉, Y2R의 작용제, 예를 들어 PYY₁ _-36 및 PYY₃ _-36이 혈관신생을 촉진하는 것으로 보고되었다. 상처 치료는 Y2R-결핍 마우스에서 손상된다고 (Ekstrand et al, PNAS USA (2003) 100:6033-6038), 즉, Y2R의 작용제, 예를 들어 PYY_1-36 및 PYY₃ _-36이 상처 치료를 촉진한다고 보고되었다. 허혈성 혈관신생은 Y2R-결핍 마우스에서 손상된다고 (Lee et al, J Clin Invest (2003) 111:1853-1862), 즉, Y2R의 작용제, 예를 들어 PYY₁ _-36 및 PYY₃ _-36이 혈관재형성 허혈성 조직의 기능 회복을 촉진한다고 보고되었다. Y2R의 작용제, 예를 들어 PYY₁ _-36 및 PYY_3-36은 래트 말초 동맥 질환 모델에서 측부 (collateral) 의존성 혈류의 증가를 매개한다고 보고되었다 (Cruze et al, Peptides (2007) 28:269-280).

PYY 및 Y2R 작용제, 예를 들어 PYY₃ _-36은 예를 들어 췌장암, 예를 들어 췌관 선암종, 유방암, 예를 들어 침윤성 유관 선암종, 대장암, 예를 들어 대장 선암종 및 바렛 (Barrett) 선암종의 경우에 종양 성장을 억제할 수 있는 것으로 보고되었다 ([Liu et al, Surgery (1995) 118:229-236]; [Liu et al, J Surg Res (1995) 58:707-712]; [Grise et al, J Surg Res (1999) 82:151-155]; [Tseng et al, Peptides (2002) 23:389-395]; [McFadden et al, Am J Surg (2004) 188:516-519]).

예를 들어 PYY₃ _-36에 의한 Y2R의 자극은 혈장 아디포넥틴의 증가를 유도하는 것으로 보고되었다 (Ortiz et al, JPET (2007) 323:692-700). 아디포넥틴은 효능있는 소염 특성을 갖는 아디포킨이다 ([Ouchi et al, Clin Chim Acta (2007) 380:24-30]; [Tilg et al, Nat Rev Immunol (2006) 6:772-783]). 아디포넥틴은 주로 근육 및 간에서 혈관 내피 세포 및 대식세포의 표적화에 의한 항-죽종 형성 (atherogenic) 효과 및 인슐린-민감성 효과를 발휘한다 ([Kubota et al, J Biol Chem (2002) 277:25863-25866]; [Maeda et al, Nat Med (2002) 8:731-737]). 낮은 아디포넥틴 수준은 이상지질혈증 (상승된 트리글리세리드, 저밀도 LDL 콜레스테롤, 낮은 HDL 콜레스테롤)에서 죽종 형성 지단백질과 연관되는 것으로 보고되었다 (Marso et al, Diabetes Care (2008) Feb 5 Epub ahead of print). 아디포넥틴은 고밀도 지단백질 (HDL) 조립에 관련된다 (Oku et al, FEBS Letters (2007) 581:5029-5033). 아디포넥틴은 감소된 아디포넥틴 수준과 연관된 비만-연관 대사증후군의 마우스 모델에서 인슐린 저항성, 고혈당, 및 이상지질혈증을 포함하는 대사증후군의 이상을 개선하는 것으로 밝혀졌다 (Hara et al, Diabetes Care (2006) 29:1357-1362). 아디포넥틴은 조직 허혈에 반응하여 혈관신생을 자극하는 것으로 보고되었다 (Shibata et al, J Biol Chem (2004) 279:28670-28674). 아디포넥틴은 내피 산화질소 합성효소-의존성 메카니즘을 통해 뇌 허혈성 손상을 억제하는 것으로 보고되었다 (Nishimura et al, Circulation (2008) 117:216-223). 아디포넥틴은 심근 허혈-재관류 손상에 대한 보호를 제공하는 것으로 보고되었다 ([Shibata et al, Nat Med (2005) 11:1096-1103]; [Tao et al, Circulation (2007) 115:1408-1416]). 아디포넥틴은 AMP-활성화된 단백질 키나제, Akt, 및 산화질소를 통해 심근 허혈-재관류 손상에 대한 보호를 제공하는 것으로 보고되었다 (Gonon et al, Cardiovasc Res (2008) 78:116-122). 아디포넥틴은 심비대 및 간질 섬유증을 억제하고 근세포 및 모세혈관 손실에 대해 보호하는 그의 능력을 통해 심근경색 후의 수축 기능장애의 발생에 대한 보호를 제공하는 것으로 보고되었다 (Shibata et al, J Mol Cell Cardiol (2007) 42:1065-1074). 아디포넥틴은 염증성 폐 질병에 대한 보호를 제공하는 것으로 보고되었고; 아디포넥틴-결핍 마우스는 폐기종-유사 표현형을 보인다 (Summer et al, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (March 7, 2008)). 아디포넥틴은 천식과 연관될 수 있는 것과 같은 알러지성 기도 염증 및 기도 과민반응에 대한 보호를 제공하는 것으로 보고되었다 (Shore et al, J Allergy Clin Immunol (2006) 118:389-395). 아디포넥틴은 그의 인슐린-민감성 효과에 의해 폐 동맥 고혈압에 대한 보호를 제공하는 것으로 제안되었다 (Hansmann et al, Circulation (2007) 115:1275-1284). 아디포넥틴은 비만-관련 고혈압을 개선하는 것으로 보고되었고, 상기 고혈압의 개선은 부분적으로는 상향조절된 프로스타사이클린 발현과 연관된다 (Ohashi et al, Hypertension (2006) 47:1108-1116). 아디포넥틴은 인간 대동맥 내피 세포 (HAEC)에서 부착 분자 VCAM-1, E-셀렉틴 및 ICAM-1의 종양 괴사 인자 (TNF)-α-유도 발현을 감소시키고 (Ouchi et al, Circulation (1999) 100:2473-2476), 대식세포에서 TNF-α의 생산을 억제하는 것으로 보고되었다 (Yokota et al, Blood (2000) 96:1723-1732). 아디포넥틴은 혈관내 치료 후에 재협착에 대한 보호를 제공하는 것으로 보고되었다 (Matsuda et al, J Biol Chem (2002) 277:37487-37491). 염증에서 TNF-α의 중추적인 역할은 염증성 병태를 치료하기 위해 TNF-α의 작용을 차단하는 물질의 능력에 의해 입증되었다. TNF-α-매개 염증성 병태는 류마티스 관절염, 염증성 장 질병, 예를 들어 크론병, 강직성 척추염, 건선, 허혈성 뇌 손상, 심장 동종이식 거부, 천식 등을 포함한다 (Bradley, J Pathol (2008) 214:149-160). 예를 들어, 문헌 [Yamamoto et al, Clinical Science (2002) 103:137-142]; [Behre, Scand J Clin Lab Invest (2007) 67:449-458]; [Guerre-Millo, Diabetes & Metabolism (2008) 34:12-18]; [Parker et al, Br J Pharmacol (2008) 153:420-431]을 참조한다.

F. PYY 에 의해 조절되는 병태의 치료

PYY에 의해 조절되는 병태의 치료를 위한 매력적인 다른 방법은 예를 들어 내장 장내분비 세포에서 PYY 분비의 자극에 의해 개체에서 PYY의 내인성 수준, 예를 들어 혈장 PYY의 내인성 수준을 증가시키기 위한 경구 활성 조성물을 개발하는 것이다.

G. GPR119

GPR119는 G 단백질-결합 수용체 (GPR119; 예를 들어, 인간 GPR119, GenBank^® 기탁 번호 AAP72125 및 그의 대립유전자; 예를 들어, 마우스 GPR119, GenBank^® 기탁 번호 AY288423 및 그의 대립유전자)이다. 작용제에 의한 GPR119 자극은 세포내 cAMP 수준의 상승을 야기하였고, 이것은 GPR119가 Gs에 결합한다는 사실에 일치하였다. 특허 문헌에서, GPR119는 RUP3으로 언급되었고 (예를 들어, WO 00/31258); GPR119는 포도당-의존성 인슐린 분비 자극성 (insulinotropic) 수용체 (GDIR)로서도 언급되었다.

H. G 단백질-결합 수용체

많은 수용체 종류가 인간에 존재하지만, 현재까지 가장 풍부하고 치료상 관련되는 것은 G 단백질-결합 수용체 (GPCR) 종류에 의해 제시된다. 인간 게놈 내에 일부 30,000-40,000개의 유전자가 존재하는 것으로 추정되고, 이 중에서 약 2％가 GPCR을 코딩하는 것으로 추정된다.

GPCR은 의약품의 개발을 위한 중요한 영역을 제시한다. GPCR에서 활성인 약물은 통증, 인지 장애, 고혈압, 소화성 궤양, 비염, 및 천식처럼 다양한 광범위한 인간 질병에 걸쳐 치료 효과를 갖는다. 약 500개의 임상적으로 시판되는 약물 중에서, 30％ 초과는 GPCR 기능의 조절제이다. 이들 약물은 약 30개의 잘 특성화된 GPCR에서 그의 활성을 발휘한다 (예를 들어, 문헌 [Wise et al, Annu Rev Pharmacol Toxicol (2004) 44:43-66] 참조).

GPCR은 각각 막에 걸치는 7개의 알파 나선을 형성하는, 22 내지 24개의 소수성 아미노산의 7개의 서열을 갖는 공통적인 구조적 모티프를 공유한다 (각각의 스팬 (span)은 숫자, 즉, 트랜스멤브레인 (transmembrane)-1 (TM-1), 트랜스멤브레인-2 (TM-2) 등에 의해 확인된다). 트랜스멤브레인 나선은 세포막의 외부 또는 "세포외" 측면 (이들은 각각 "세포외" 구역 1, 2 및 3 (EC-1, EC-2 및 EC-3)으로 언급됨) 상의 트랜스멤브레인-2와 트랜스멤브레인-3 사이, 트랜스멤브레인-4와 트랜스멤브레인-5 사이, 및 트랜스멤브레인-6과 트랜스멤브레인-7 사이의 아미노산 가닥에 의해 연결된다. 트랜스멤브레인 나선은 또한 세포막의 내부 또는 "세포내" 측면 (이들은 각각 "세포내" 구역 1, 2 및 3 (IC-1, IC-2 및 IC-3)으로 언급됨) 상의 트랜스멤브레인-1과 트랜스멤브레인-2 사이, 트랜스멤브레인-3과 트랜스멤브레인-4 사이, 및 트랜스멤브레인-5와 트랜스멤브레인-6 사이의 아미노산 가닥에 의해 연결된다. 수용체의 "카르복시" ("C") 말단은 세포 내의 세포내 공간에 존재하고, 수용체의 "아미노" ("N") 말단은 세포 외부의 세포외 공간에 존재한다.

일반적으로, 리간드가 수용체에 결합할 때 (종종 수용체의 "활성화"로 언급됨), 세포내 구역과 세포내 "G-단백질" 사이의 결합을 용이하게 하는 수용체의 입체형태의 변화가 발생한다. GPCR은 G 단백질에 대해 "무차별성 (promiscuous)"이다, 즉 GPCR은 1 초과의 G 단백질과 상호작용할 수 있는 것으로 보고되었다 (예를 들어, 문헌 [Kenakin, Life Sciences (1988) 43: 1095-1101] 참조). 다른 G 단백질이 존재하지만, 현재 Gq, Gs, Gi, Gz 및 Go가 확인된 G 단백질이다. G-단백질과 리간드-활성화된 GPCR의 결합은 신호전달 캐스케이드 과정 ("신호 전달"로 언급됨)을 개시시킨다. 정상적인 조건 하에서, 신호 전달은 최종적으로 세포성 활성화 또는 세포성 억제를 야기한다. 이론에 매이기를 원하지 않지만, IC-3 루프 (loop) 및 수용체의 카르복시 말단이 G 단백질과 상호작용하는 것으로 생각된다.

또한, 여러 종류의 GPCR을 포스포리파제 C 경로에 결부시키는 것으로 보이는 무차별성 G 단백질, 예를 들어 G15 또는 G16 (Offermanns & Simon, J Biol Chem (1995) 270:15175-80), 또는 매우 많은 상이한 GPCR을 동일한 경로에 결부시키기 위해 설계된 키메라 (chimeric) G 단백질, 예를 들어 포스포리파제 C (Milligan & Rees, Trends in Pharmaceutical Sciences (1999) 20:118-24)가 존재한다.

생리학적 조건 하에서, GPCR은 2개의 상이한 입체형태, 즉 "불활성" 상태 및 "활성" 상태 사이의 평형 상태로 세포막에 존재한다. 불활성 상태의 수용체는, 신호 전달을 개시시켜 생물학적 반응을 유도하기 위해 세포내 신호전달 경로에 연결될 수 없다. 수용체 입체형태를 활성 상태로 변경하면, 신호전달 경로에 연결되고 (G-단백질을 통해), 생물학적 반응을 생성시킬 수 있다.

수용체는 리간드 또는 화합물, 예를 들어 약물에 의해 활성 상태로 안정화될 수 있다. 수용체의 아미노산 서열 변형을 포함하고 이로 제한되지 않는 최근의 발견은 수용체를 활성 상태 입체형태로 촉진하고 안정화시키기 위한, 리간드 또는 약물 이외의 다른 수단을 제공한다. 이들 수단은 수용체에 대한 리간드 결합 효과를 모방함으로써 수용체를 활성 상태로 효과적으로 안정화시킨다. 상기 리간드-독립적인 수단에 의한 안정화는 "구성적 수용체 활성화"로 불린다.

<발명의 개요>

본 발명은 GPR119 작용제를 개체에게, 예를 들어 경구 투여에 의해 투여하면 개체에서 혈장 총 PYY를 증가시키는 작용을 할 수 있다는 본 발명자들의 예기치 않은 발견에 관한 것이다. 본 발명은 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 및 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 확인하기 위한 GPR119에 관련된 방법을 특징으로 한다. GPR119 작용제는 개체에서 혈장 총 PYY의 증가에 유용하다. 특정 실시태양에서, 개체는 인간이다.

인간 GPR119 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 1에 제시된다. 상기 코딩되는 인간 GPR119 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 2에 제시된다.

제1 측면에서, 본 발명은

(a) 시험 화합물을 숙주 세포와 또는 G 단백질-결합 수용체를 포함하는 숙주 세포의 막과 접촉시키고, 여기서 G 단백질-결합 수용체는

(i) 서열 2의 아미노산 1-335;

(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;

(iii) (i)에 규정된 아미노산 서열의 하나 또는 몇 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 (i)로부터 유래된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열;

(iv) 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열;

(v) (a') 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열; 및 (b') 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열

로 이루어지는 군 중에서 선택될 때의 서열 2의 변이체;

(vi) 서열 2를 갖는 구성적 활성 버전의 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열; 및

(vii) (i) 내지 (vi) 중의 임의의 하나의 생물학적 활성 단편

으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 단계;

(b) 시험 화합물이 G 단백질-결합 수용체의 기능성을 자극하는 능력을 결정하는 단계

를 포함하고, 여기서 시험 화합물이 G 단백질-결합 수용체의 기능성을 자극하는 능력은 시험 화합물이 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물임을 나타내는 것인, PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다.

특정 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체는 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열을 포함한다.

특정 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함한다.

특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 서열 2의 대립유전자이다.

특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 서열 2의 오르토로그 (ortholog)이다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 서열 2의 포유동물 오르토로그이다.

특정 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체는 재조합체이다.

특정 실시태양에서, 방법은 PYY 분비촉진제를 확인하는 방법이다.

특정 실시태양에서, 방법은 수용체의 작용제를 확인하는 것을 포함한다.

특정 실시태양에서, 방법은 수용체의 부분 작용제를 확인하는 것을 포함한다.

특정 실시태양에서, 방법은 PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 확인하는 방법이다.

특정 실시태양에서, 방법은 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 확인하는 방법이다.

본 발명은 추가로 상기 제1 측면의 단계 (a) 및 (b)를 포함하고, 추가로

(c) 임의로 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 합성하는 단계;

(d) 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 시험관 내에서 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키는 단계;

(e) 화합물이 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포로부터 PYY 분비를 자극하는지를 결정하는 단계

를 포함하고; 여기서 시험 화합물이 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포로부터 PYY 분비를 자극하는 능력은 시험 화합물이 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물임을 더 나타내는 것인, PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다.

특정 실시태양에서, 척추동물 장내분비 세포는 포유동물 장내분비 세포이다. 특정 실시태양에서, 장내분비 세포는 L 세포이다. 특정 실시태양에서, 장내분비 세포는 소장 또는 대장으로부터 얻은 조직에 포함되거나 이로부터 유래된다. 특정 실시태양에서, 장내분비 세포는 소장 또는 대장의 L 세포 함유 구역으로부터 얻은 조직에 포함되거나 이로부터 유래된다. 특정 실시태양에서, 장내분비 세포는 십이지장, 공장, 회장, 결장 또는 직장 조직에 포함되거나 이로부터 유래된다 (예를 들어, 문헌 [Lundberg et al, PNAS USA (1982) 79:4471-4475]; [Adrian et al, Gastroenterol (1985) 89:1070-1077]; [Ekblad et al, Peptides (2002) 23:251-261]; [Ueno et al, Regul Pept (2008) 145:12-16] 참조). 특정 실시태양에서, 장내분비 세포는 장내분비 세포주이다. 특정 실시태양에서, PYY를 분비할 수 있는 세포는 랑게르한스섬에 포함되거나 이로부터 유래되는 세포이다. 특정 실시태양에서, PYY를 분비할 수 있는 세포는 뉴런 세포이다. 특정 실시태양에서, PYY를 분비할 수 있는 세포는 PYY를 분비할 수 있도록 조작된 재조합 세포이다.

(d) 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 척추동물에게 투여하는 단계;

(e) 화합물이 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계

를 포함하고; 여기서 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물임을 더 나타내는 것인, PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다.

특정 실시태양에서, PYY 수준은 총 PYY의 혈액 또는 혈장 농도이다. 특정 실시태양에서, PYY 수준은 PYY₃ _-36의 혈액 또는 혈장 농도이다.

특정 실시태양에서, 척추동물은 포유동물이다. 특정 실시태양에서, 척추동물은 비-인간 척추동물이다. 특정 실시태양에서, 척추동물은 비-인간 포유동물이다. 특정 실시태양에서, 포유동물은 비-인간 포유동물이다.

특정 실시태양에서, 척추동물 또는 포유동물은 인간이다. 특정 실시태양에서, 인간은 약물의 시판 승인을 담당하는 정부 기관에서 검토된 연구의 참가자이다. 특정 실시태양에서, 연구는 임상 시험이다. 특정 실시태양에서, 정부 기관은 미국 식품 의약국 (Food and Drug Administration)이다.

특정 실시태양에서, 인간은 임상 시험에 등록되거나 치료를 받고 있는 개체 또는 환자이다.

(d) 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 사전에 투여한 척추동물로부터 얻은 샘플 내의 PYY 수준을 화합물이 증가시키는지를 결정하는 단계

특정 실시태양에서, 척추동물 또는 포유동물은 인간이다. 특정 실시태양에서, 인간은 약물의 시판 승인을 담당하는 정부 기관에서 검토된 연구의 참가자이다. 특정 실시태양에서, 연구는 임상 시험이다. 특정 실시태양에서, 정부 기관은 미국 식품 의약국이다.

(d) 임의로 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 제공하는 단계;

(e) 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 시험관 내에서 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키는 단계;

(f) 화합물이 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포로부터 PYY 분비를 자극하는지를 결정하는 단계

특정 실시태양에서, 척추동물 장내분비 세포는 포유동물 장내분비 세포이다. 특정 실시태양에서, 장내분비 세포는 L 세포이다. 특정 실시태양에서, 장내분비 세포는 소장 또는 대장으로부터 얻은 조직에 포함되거나 이로부터 유래된다. 특정 실시태양에서, 장내분비 세포는 소장 또는 대장의 L 세포 함유 구역으로부터 얻은 조직에 포함되거나 이로부터 유래된다. 특정 실시태양에서, 장내분비 세포는 십이지장, 공장, 회장, 결장 또는 직장 조직에 포함되거나 이로부터 유래된다 (예를 들어, 문헌 [Lundberg et al, PNAS USA (1982) 79:4471-4475]; [Adrian et al, Gastroenterol (1985) 89:1070-1077]; [Ekblad et al, Peptides (2002) 23:251-261]; [Ueno et al, Regul Pept (2008) 145: 12-16] 참조). 특정 실시태양에서, 장내분비 세포는 장내분비 세포주이다. 특정 실시태양에서, PYY를 분비할 수 있는 세포는 랑게르한스섬에 포함되거나 이로부터 유래되는 세포이다. 특정 실시태양에서, PYY를 분비할 수 있는 세포는 뉴런 세포이다. 특정 실시태양에서, PYY를 분비할 수 있는 세포는 PYY를 분비할 수 있도록 조작된 재조합 세포이다.

(e) 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 척추동물에게 투여하는 단계;

(f) 화합물이 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계

를 포함하고; 여기서 시험 화합물의 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는 능력은 시험 화합물이 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물임을 더 나타내는 것인, PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다.

(e) 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 사전에 투여한 척추동물로부터 얻은 샘플 내의 PYY 수준을 화합물이 증가시키는지를 결정하는 단계

를 포함하고; 여기서 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물임을 더 나타내는 것인, PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다.

특정 실시태양에서, 확인된 PYY 분비촉진제, 또는 PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 확인된 화합물, 또는 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 확인된 화합물은 수용체의 작용제이다. 일부 실시태양에서, 확인된 PYY 분비촉진제, 또는 PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 확인된 화합물, 또는 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 확인된 화합물은 수용체의 부분 작용제이다.

특정 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체는 G 단백질에 결합된다. 특정 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체의 자극은 세포내 cAMP 축적 수준을 증가시킨다. 특정 실시태양에서, G 단백질은 Gs이다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 G 단백질-결합 수용체는 서열 2 또는 그의 대립유전자이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 G 단백질-결합 수용체는 서열 2의 대립유전자이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 G 단백질-결합 수용체는 서열 2의 오르토로그이다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합하는 G 단백질-결합 수용체이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 그에 대한 리간드인 G 단백질-결합 수용체이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 G 단백질-결합 수용체이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 G 단백질-결합 수용체는 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 축적 수준을 증가시키기 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포 (melanophore)에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다.

특정 실시태양에서, 엄격한 혼성화 조건은 50％ 포름아미드, 5xSSC (1xSSC = 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르트 (Denhardt) 용액, 10％ 덱스트란 술페이트, 및 20 ㎍/ml의 변성, 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 내에서 42℃에서의 혼성화, 이어서 0.1xSSC를 포함하는 용액 내에서 65℃에서의 세척을 포함한다. 혼성화 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다.

특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 서열 2 또는 그의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 서열 2의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 서열 2의 오르토로그이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 수용체이다. 일부 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 축적 수준을 증가시키기 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다.

특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체이다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체이다. 특정 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체인 서열 2의 변이체는 내인성 G 단백질-결합 수용체이다. 특정 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체인 서열 2의 변이체는 비-내인성 G 단백질-결합 수용체이다.

특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2 또는 그의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2의 오르토로그이다. 특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 수용체이다. 일부 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다.

특정 실시태양에서, 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2 또는 서열 2의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2의 오르토로그이다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 수용체이다. 일부 실시태양에서, 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP의 수준을 증가시키기 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다.

일부 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체는 G 단백질을 포함하는 융합 단백질의 일부이다. GPCR:G 융합 구성체의 제조 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, 국제 특허 출원 WO 02/42461 참조).

특정 실시태양에서, 숙주 세포는 발현 벡터를 포함하고, 상기 발현 벡터는 G 단백질-결합 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예시적인 적합한 발현 벡터는 pCMV이다. 다른 적합한 발현 벡터는 당업자에게 쉽게 명백해질 것이고, 매우 다양한 발현 벡터가 상업적으로 이용가능하다 (예를 들어, 클론테크 (Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로 알토); 스트라타젠 (Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 홀라); 및 인비트로겐 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드)으로부터).

일부 실시태양에서, 숙주 세포는 척추동물 세포이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시태양에서, 포유동물 숙주 세포는 293 세포, 293T 세포, CHO 세포, MCB3901 세포, 및 COS-7 세포로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 효모 세포이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 멜라닌 보유 세포이다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 쉽게 명백해질 것이고, 매우 다양한 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 20110-2209 버지니아주 매나서스 유니버시티 불리바드 10801)으로부터 이용가능하다.

특정 실시태양에서, 상기 결정은 G 단백질-결합 수용체가 Gs-결합 수용체라는 사실과 일치한다.

일부 실시태양에서, 상기 결정은 G 단백질-결합 수용체가 무차별성 G 단백질, 예를 들어 Gα15 또는 Gα16을 통해 포스포리파제 C 경로에 연결된다는 사실과 일치한다. 무차별성 G 단백질은 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Offermanns et al., J Biol Chem (1995) 270: 15175-15180] 참조). 일부 실시태양에서, 상기 결정은 G 단백질-결합 수용체가 예를 들어 키메라 G 단백질을 통해 포스포리파제 C 경로에 연결된다는 사실과 일치한다. 키메라 G 단백질은 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Milligan et al., Trends in Pharmaceutical Sciences (1999) 20: 118-124]; 및 WO 02/42461 참조).

일부 실시태양에서, 상기 결정은 제2 메신저 수준의 측정을 통해 수행한다.

일부 실시태양에서, 상기 결정은 시클릭 AMP (cAMP), 시클릭 GMP (cGMP), 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트 (IP₃), 디아실글리세롤 (DAG), MAP 키나제 활성, MAPK/ERK 키나제 키나제-1 (MEKK1) 활성, 및 Ca² ⁺으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 제2 메신저 수준의 측정을 통해 이루어진다. 몇몇 바람직한 실시태양에서, 제2 메신저는 cAMP이다. 특정 실시태양에서, 세포내 cAMP의 수준이 증가한다.

특정 실시태양에서, 상기 결정은 G 단백질-결합 수용체를 포함하는 단리된 막을 사용하여 수행된다.

특정 실시태양에서, 상기 결정은 멜라닌 보유 세포 분석의 사용을 통해 수행한다. 특정 실시태양에서, 색소 분산의 수준이 증가한다.

일부 실시태양에서, 상기 결정은 리포터 분석을 통해 수행한다. 일부 실시태양에서, 상기 리포터 분석은 CRE-Luc 리포터 분석이다.

일부 실시태양에서, 상기 결정은 세포내 cAMP의 수준을 증가시킴으로써 매개된 활성의 측정을 통해 수행한다.

일부 실시태양에서, 상기 결정은 CRE-Luc 리포터 분석을 통해 수행한다. 특정 실시태양에서, 루시퍼라제 활성의 수준이 증가한다.

일부 실시태양에서, 상기 결정은 G 단백질-결합 수용체를 포함하는 막에 대한 GTPγS 결합의 측정을 통해 수행한다. 특정 실시태양에서, 상기 GTPγS는 [³⁵S]로 표지된다. 특정 실시태양에서, 상기 GPCR을 포함하는 막에 대한 GTPγS 결합이 증가한다.

일부 실시태양에서, 시험 화합물은 소분자이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 폴리펩티드가 아닌 소분자이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아닌 소분자이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 지질이 아닌 소분자이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 폴리펩티드 또는 지질이 아닌 소분자이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 폴리펩티드이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아닌 폴리펩티드이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 지질이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아니다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.

일부 실시태양에서, 방법은 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물의 구조를 임의로 결정하는 단계를 더 포함한다.

일부 실시태양에서, 방법은 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물의 명칭 또는 구조를 임의로 제공하는 단계를 더 포함한다.

일부 실시태양에서, 상기 방법은 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 임의로 생산 또는 합성하는 단계를 더 포함한다.

일부 실시태양에서, 상기 방법은 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 임의로 제약으로서 제형화하는 단계를 더 포함한다.

일부 실시태양에서, 상기 방법은 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물의 생체이용률의 평가를 더 포함한다.

일부 실시태양에서, 상기 방법은 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 제약 조성물로 제형화하는 단계를 더 포함한다.

특정 실시태양에서, PYY에 의해 조절되는 병태는 뼈 관련 병태이다.

특정 실시태양에서, 뼈 관련 병태는 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태이다. 특정 실시태양에서, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태는 골감소증, 골다공증, 류마티스 관절염, 골관절염, 치주병, 치조골 (alveolar bone) 손실, 절골 (osteotomy) 뼈 손실, 소아 특발성 뼈 손실, 파제트 (Paget) 병, 전이성 암에 의한 뼈 손실, 골용해성 병변, 척추 만곡, 및 키 (height) 감소로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

특정 실시태양에서, 뼈 관련 병태는 뼈 골절이다. 특정 실시태양에서, 뼈 골절은 외상성 뼈 골절, 장기 뼈 골절, 및 골다공증성 뼈 골절로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

특정 실시태양에서, 뼈 관련 병태는 뼈 질병이다. 특정 실시태양에서, 뼈 질병은 골감소증, 골다공증, 류마티스 관절염, 골관절염, 치주병, 치조뼈 손실, 절골 뼈 손실, 소아 특발성 뼈 손실, 파제트 병, 전이성 암에 의한 뼈 손실, 골용해성 병변, 척추 만곡, 및 키 감소로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

특정 실시태양에서, 뼈 관련 병태는 향상된 뼈 치유 또는 뼈 성장이고, 상기 향상된 뼈 치유 또는 뼈 성장은 안면 재건, 상악 재건, 하악 재건, 치주병 또는 발치 후의 향상된 뼈 치유, 향상된 장골 신장, 향상된 인공보형물 내성장 (prosthetic ingrowth), 및 증가된 뼈 유합 (synostosis)으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

특정 실시태양에서, PYY에 의해 조절되는 병태는 대사 장애이다.

특정 실시태양에서, 대사 장애는 과체중, 비만, 과식증, 당뇨병 (1형 당뇨병 및 2형 당뇨병 포함), 2형 당뇨병, 손상된 포도당 내성, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 이상지질혈증, 고혈압 및 대사증후군으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

특정 실시태양에서, PYY에 의해 조절되는 병태는 혈관신생-관련 병태이다.

특정 실시태양에서, 혈관신생-관련 병태는 말초 동맥 질환, 상처 치유 및 허혈로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

특정 실시태양에서, PYY에 의해 조절되는 병태는 허혈-관련 병태이다.

특정 실시태양에서, 허혈-관련 병태는 허혈성 뇌졸중, 허혈성 심장병, 심근경색, 허혈-재관류 손상, 심근 경색후 재형성, 심부전 및 울혈성 심부전으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

특정 실시태양에서, PYY에 의해 조절되는 병태는 흡수장애 질환이다.

특정 실시태양에서, 흡수장애 질환은 단장 증후군, 장염, 크론병, 궤양 대장염, 과민성 장 증후군, 콜레라 및 설사를 수반하는 질환으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

특정 실시태양에서, PYY에 의해 조절되는 병태는 경련성 질환이다.

특정 실시태양에서, 경련성 질환은 간질이다.

특정 실시태양에서, PYY에 의해 조절되는 병태는 암이다.

특정 실시태양에서, 암은 췌장암, 유방암, 대장암 및 바렛 선암종으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

특정 실시태양에서, PYY에 의해 조절되는 병태는 염증성 질환이다.

특정 실시태양에서, 염증성 질환은 죽상경화증, 죽상혈전증, 인슐린 저항성, 당뇨병 (1형 당뇨병 및 2형 당뇨병 포함), 1형 당뇨병, 허혈성 뇌졸중, 췌장염, 재협착, 염증성 폐 질병, 및 염증성 장 질병으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 특정 실시태양에서, 염증성 폐 질병은 천식, 폐기종, 및 폐 동맥 고혈압이다. 특정 실시태양에서, 염증성 장 질병은 장염, 전장염, 크론병, 육아종성 대장염, 회장염, 크론 대장염, 궤양 대장염, S상 결장염, 전대장염 및 궤양성 직장염으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

특정 실시태양에서, PYY-관련 활성의 조절은 다음으로 이루어지는 군 중에서 선택된다:

(a) 혈장 PYY의 증가;

(b) 골 질량의 증가;

(c) 골 질량 손실의 감소;

(d) 뼈 형성의 증가;

(e) 음식 섭취의 감소;

(f) 체중 감소;

(g) 포만감의 증가;

(h) 포도당 처리의 증가;

(i) 혈장 포도당 감소;

(j) 혈관신생의 증가;

(k) 장 상피 내 분비의 감소;

(l) 장 상피 내 흡수의 증가; 및

(m) 혈장 아디포넥틴의 증가.

본 발명은 추가로 상기 제1 측면에 따른 방법을 수행하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다.

제2 측면에서, 본 발명은

(a) 제1 측면에 따른 방법에 의해 확인된 화합물을 시험관 내에서 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키는 단계;

(b) 화합물이 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포로부터 PYY 분비를 자극하는지를 결정하는 단계

를 포함하고; 여기서 시험 화합물이 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포로부터 PYY 분비를 자극하는 능력은 시험 화합물이 PYY 분비촉진제, PYY-관련 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물임을 더 나타내는 것인, PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다.

본 발명은 추가로

(a) 제1 측면에 따른 방법에 의해 확인된 화합물을 척추동물에게 투여하는 단계;

(b) 화합물이 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계

를 포함하고; 여기서 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 PYY 분비촉진제, PYY-관련 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물임을 더 나타내는 것인, PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다.

본 발명은 추가로

(a) 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 사전에 투여한 척추동물로부터 얻은 샘플 내의 PYY 수준을 화합물이 증가시키는지를 결정하는 단계

특정 실시태양에서, 척추동물은 포유동물이다. 특정 실시태양에서, 척추동물은 비-인간 척추동물이다. 특정 실시태양에서, 척추동물은 비-인간 포유동물이다.

일부 실시태양에서, 상기 방법은 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 제약으로서 제형화하는 단계를 더 포함한다.

본 발명은 추가로 상기 제2 측면에 따른 방법을 수행하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다.

제3 측면에서, 본 발명은

(a) GPR119 작용제를 시험관 내에서 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키는 단계;

(b) GPR119 작용제가 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포로부터 PYY 분비를 자극하는지를 결정하는 단계

를 포함하고; 여기서 GPR119 작용제가 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포로부터 PYY 분비를 자극하는 능력은 GPR119 작용제가 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물임을 나타내는 것인, PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다.

본 발명은 추가로

(a) GPR119 작용제를 척추동물에게 투여하는 단계;

(b) GPR119 작용제가 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계

를 포함하고; 여기서 GPR119 작용제가 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는 능력은 GPR119 작용제가 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물임을 나타내는 것인, PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다.

본 발명은 추가로

(a) 화합물이 GPR119 작용제를 사전에 투여한 척추동물로부터 얻은 샘플 내의 PYY 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계; GPR119 작용제를 투여하는 단계

특정 실시태양에서, GPR119 작용제는 내인성 GPR119의 작용제이다.

특정 실시태양에서, GPR119 작용제는 인간 GPR119의 작용제이다.

특정 실시태양에서, GPR119 작용제는 GPR119 부분 작용제이다.

특정 실시태양에서, GPR119 작용제는 선택적인 GPR119 작용제이다.

특정 실시태양에서, GPR119 작용제는 소분자이다. 일부 실시태양에서, 소분자는 폴리펩티드가 아니다. 일부 실시태양에서, 소분자는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아니다. 일부 실시태양에서, 소분자는 지질이 아니다. 일부 실시태양에서, 소분자는 폴리펩티드 또는 지질이 아니다.

특정 실시태양에서, GPR119 작용제는 경구로 이용가능하다.

특정 실시태양에서, GPR119 작용제의 EC₅₀ 값은 약 10 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 75 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 15 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 4 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만이다. 특정 실시태양에서, GPR119 작용제의 EC₅₀ 값은 서열 2를 갖는 인간 GPR119에서 약 10 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 75 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 15 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 4 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만이다. 특정 실시태양에서, GPR119 작용제의 EC₅₀ 값은 아데닐일 시클라제 분석 (예시적인 아데닐일 시클라제 분석은 하기 실시예 9, 실시예 10 및 실시예 11에 제공된다)에서 서열 2를 갖는 인간 GPR119에서 약 10 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 75 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 15 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 4 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만이다. 특정 실시태양에서, GPR119 작용제의 EC₅₀ 값은 멜라닌 보유 세포 분석 (예시적인 멜라닌 보유 세포 분석은 하기 실시예 12에 제공된다)에서 서열 2를 갖는 인간 GPR119에서 약 10 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 75 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 15 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 4 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만이다.

예시적인 GPR119 작용제는 예를 들어 국제 특허 출원 PCT/US2004/001267 (WO 04/065380로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2004/005555 (WO 04/076413으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2004/022327 (WO 05/007647로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2004/022417 (WO 05/007658로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2005/019318 (WO 2005/121121로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2004/050046 (WO 2005/061489로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US06/00567 (WO 2006/083491로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2005/050264 (WO 2006/067531로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2005/050265 (WO 2006/067532로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2005/050266 (WO 2006/070208로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/JP02/09350 (WO 03/026661로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/JP2005/018412 (WO 06/040966으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/JP2005/019000 (WO 2006/043490으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2006/050176 (WO 2007/003960으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2006/050177 (WO 2007/003961로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2006/050178 (WO 2007/003962로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2006/050182 (WO 2007/003964로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/JP02/09350 (WO 03/026661로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2007/050183 (WO 2007/116229로 공개됨), 국제 특허 출원 PCT/GB2007/050190 (WO 2007/116230로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2007/073364 (WO 2008/008895로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/EP2007/058991 (WO 2008/025798로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/EP2007/058993 (WO 2008/025799로 공개됨); 및 국제 특허 출원 PCT/EP2007/058995 (WO 2008/025800으로 공개됨)에 개시되어 있다.

특정 실시태양에서, 방법은 GPR119 작용제의 제공을 포함한다.

특정 실시태양에서, GPR119 작용제는 제1 측면에 따른 방법에 의해 확인할 수 있다.

특정 실시태양에서, 방법은 GPR119 작용제를 확인하기 위해 제1 측면에 따른 방법을 수행하는 것을 포함한다.

특정 실시태양에서, 방법은 제1 측면에 따른 방법에 의한 GPR119 작용제의 확인을 포함한다.

본 발명은 추가로 상기 제3 측면에 따른 방법을 수행하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다.

제4 측면에서, 본 발명은

(a) G 단백질-결합 수용체를 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에 수용체에 대한 임의로 표지된 공지의 리간드와 접촉시키고, 여기서 수용체에 대한 리간드는 GPR119에 대한 리간드이고, G 단백질-결합 수용체는

(i) 서열 2의 아미노산 1-335;

(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;

로 이루어지는 군 중에서 선택될 때의 서열 2의 변이체;

(vii) (i) 내지 (vi) 중의 임의의 하나의 생물학적 활성 단편

(b) 상기 공지의 리간드 및 상기 수용체 사이의 복합체를 검출하는 단계;

(c) 상기 복합체가 시험 화합물의 부재 하에서보다 시험 화합물의 존재 하에서 더 적게 형성되는지를 결정하는 단계

를 포함하고; 여기서 상기 결정은 시험 화합물이 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물임을 나타내는 것인, PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다.

특정 실시태양에서, 수용체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함한다.

특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 서열 2의 오르토로그이다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 서열 2의 포유동물 오르토로그이다.

특정 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체는 재조합체이다.

특정 실시태양에서, 방법은 PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물의 확인 방법이다.

특정 실시태양에서, 방법은 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물의 확인 방법이다.

특정 실시태양에서, GPR119에 대한 리간드는 GPR119 작용제이다. 특정 실시태양에서, GPR119에 대한 리간드 또는 GPR119 작용제는 내인성 척추동물, 포유동물 또는 인간 GPR119 수용체의 리간드 또는 작용제이다. 특정 실시태양에서, GPR119에 대한 리간드 또는 GPR119 작용제는 내인성 인간 GPR119 수용체의 리간드 또는 작용제이다. 특정 실시태양에서, GPR119에 대한 리간드 또는 GPR119 작용제는 예를 들어 국제 특허 출원 PCT/US2004/001267 (WO 04/065380으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2004/005555 (WO 04/076413으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2004/022327 (WO 05/007647로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2004/022417 (WO 05/007658로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2005/019318 (WO 2005/121121로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2004/050046 (WO 2005/061489로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US06/00567 (WO 2006/083491로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2005/050264 (WO 2006/067531로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2005/050265 (WO 2006/067532로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2005/050266 (WO 2006/070208로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/JP02/09350 (WO 03/026661로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/JP2005/018412 (WO 06/040966으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/JP2005/019000 (WO 2006/043490으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2006/050176 (WO 2007/003960으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2006/050177 (WO 2007/003961로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2006/050178 (WO 2007/003962로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2006/050182 (WO 2007/003964로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/JP02/09350 (WO 03/026661로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2007/050183 (WO 2007/116229로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2007/050190 (WO 2007/116230으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2007/073364 (WO 2008/008895로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/EP2007/058991 (WO 2008/025798로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/EP2007/058993 (WO 2008/025799로 공개됨); 또는 국제 특허 출원 PCT/EP2007/058995 (WO 2008/025800으로 공개됨)에 개시된 화합물과 동일하다. 특정 실시태양에서, GPR119에 대한 리간드 또는 GPR119 작용제는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이다. 특정 실시태양에서, GPR119에 대한 리간드는 내인성 척추동물, 포유동물, 또는 인간 GPR119 수용체의 내인성 리간드이다.

특정 실시태양에서, 임의로 표지된 공지의 리간드는 표지된 공지의 리간드이다. 특정 실시태양에서, 표지된 공지의 리간드는 방사성 표지된 공지의 리간드이다. 화합물을 방사성 표지하기 위한, 예를 들어 본 발명의 G 단백질-결합 수용체의 공지의 리간드를 표지하기 위한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 WO 04/065380을 참조한다. 또한 예를 들어, 하기 실시예 14를 참조한다.

G 단백질-결합 수용체 및 G 단백질-결합 수용체에 대한 리간드인 것으로 공지된 화합물 사이의 복합체를 검출하는 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, 국제 특허 출원 WO 04/065380 참조). 또한, 예를 들어, 하기 실시예 15를 참조한다.

본 발명은 추가로 상기 제4 측면의 단계 (a) 내지 (c)를 포함하고, 추가로

(d) 임의로 그의 존재 하에 상기 복합체가 단계 (c)에서 덜 형성되는 화합물을 합성하는 단계;

(e) 그의 존재 하에 상기 복합체가 단계 (c)에서 덜 형성되는 화합물을 시험관 내에서 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키는 단계;

(e) 그의 존재 하에 상기 복합체가 단계 (c)에서 덜 형성되는 화합물을 척추동물에게 투여하는 단계;

(e) 그의 존재 하에 상기 복합체가 단계 (c)에서 덜 형성되는 화합물을 투여한 척추동물로부터 얻은 샘플 내의 PYY 수준을 화합물이 증가시키는지를 결정하는 단계

를 포함하고; 여기서 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물임을 나타내는 것인, PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다.

(d) 임의로 그의 존재 하에 상기 복합체가 단계 (c)에 따라 덜 형성되는 화합물을 합성하는 단계;

(e) 임의로 그의 존재 하에 상기 복합체가 단계 (c)에 따라 덜 형성되는 화합물을 제공하는 단계;

(f) 그의 존재 하에 상기 복합체가 단계 (c)에 따라 덜 형성되는 화합물을 시험관 내에서 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키는 단계;

(g) 화합물이 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포로부터 PYY 분비를 자극하는지를 결정하는 단계

(f) 그의 존재 하에 상기 복합체가 단계 (c)에서 덜 형성되는 화합물을 척추동물에게 투여하는 단계;

(g) 화합물이 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계

(f) 그의 존재 하에 상기 복합체가 단계 (c)에서 덜 형성되는 화합물을 투여한 척추동물로부터 얻은 샘플 내의 PYY 수준을 화합물이 증가시키는지를 결정하는 단계

일부 실시태양에서, 본 발명의 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합하는 G 단백질-결합 수용체이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 그에 대한 리간드인 G 단백질-결합 수용체이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 G 단백질-결합 수용체이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 G 단백질-결합 수용체는 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 축적 수준의 증가를 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다.

특정 실시태양에서, 엄격한 혼성화 조건은 50％ 포름아미드, 5xSSC (1xSSC = 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10％ 덱스트란 술페이트, 및 20 ㎍/ml의 변성, 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 내에서 42℃에서의 혼성화, 이어서 0.1xSSC를 포함하는 용액 내에서 65℃에서의 세척을 포함한다. 혼성화 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다.

특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 서열 2 또는 그의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 서열 2의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 서열 2의 오르토로그이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민이 그에 대한 리간드인 수용체이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 수용체이다. 일부 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 수준의 증가를 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다.

특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2 또는 그의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2의 오르토로그이다. 특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 수용체이다. 일부 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 수준의 증가를 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다.

특정 실시태양에서, 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2 또는 서열 2의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2의 오르토로그이다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 수용체이다. 일부 실시태양에서, 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체는 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 수준의 증가를 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다.

특정 실시태양에서, 상기 결정은 G 단백질-결합 수용체를 포함하는 숙주 세포를 사용하여 수행한다. 특정 실시태양에서, 숙주 세포는 발현 벡터를 포함하고, 상기 발현 벡터는 GPCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예시적인 적합한 발현 벡터는 pCMV이다. 다른 적합한 발현 벡터는 당업자에게 쉽게 명백해질 것이고, 매우 다양한 발현 벡터는 상업적으로 이용가능하다 (예를 들어, 클론테크; 스트라타젠; 및 인비트로겐으로부터).

일부 실시태양에서, 숙주 세포는 척추동물 세포이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시태양에서, 포유동물 숙주 세포는 293 세포, 293T 세포, CHO 세포, MCB3901 세포, 및 COS-7 세포로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 효모 세포이다. 일부 실시태양에서, 숙주 세포는 멜라닌 보유 세포이다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 쉽게 명백해질 것이고, 매우 다양한 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 이용가능하다.

특정 실시태양에서, 상기 결정은 G 단백질-결합 수용체를 포함하는 막을 사용하여 수행한다.

일부 실시태양에서, 시험 화합물은 소분자이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 폴리펩티드가 아닌 소분자이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아닌 소분자이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 지질이 아닌 소분자이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 소분자는 폴리펩티드 또는 지질이 아닌 소분자이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 폴리펩티드이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아닌 폴리펩티드이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 지질이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아니다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.

본 발명은 추가로 상기 제4 측면에 따른 방법을 수행하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다.

제5 측면에서, 본 발명은

(a) 서열 2의 아미노산 1-335;

(b) 서열 2의 아미노산 2-335;

(c) (a)에 규정된 아미노산 서열의 하나 또는 몇 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 (a)로부터 유래된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열;

(d) 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열;

(e) (i) 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열; 및 (ii) 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열

로 이루어지는 군 중에서 선택될 때의 서열 2의 변이체;

(f) 서열 2를 갖는 구성적 활성 버전의 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열; 및

(g) (a) 내지 (f) 중의 임의의 하나의 생물학적 활성 단편

으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 G 단백질-결합 수용체의 사용을 특징으로 하는, PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방을 위한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절을 위한 화합물을 확인하기 위해 시험 화합물을 스크리닝하는 방법을 특징으로 한다.

특정 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체는 재조합체이다.

특정 실시태양에서, 방법은 수용체의 작용제의 확인을 포함한다.

특정 실시태양에서, 방법은 수용체의 부분 작용제의 확인을 포함한다.

본 발명은 추가로 상기 제5 측면에 따른 방법을 수행하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다.

제6 측면에서, 본 발명은 제1 측면, 제2 측면, 제3 측면, 제4 측면 또는 제5 측면에 따라 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방을 위한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절을 위한 화합물을 확인하고, 상기 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방을 위한 상기 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절을 위한 상기 화합물을 제약 조성물로 제형화하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다.

제7 측면에서, 본 발명은 시험 화합물을 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방을 위한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절을 위한 화합물로서 스크리닝하기 위한 G 단백질-결합 수용체의 용도를 특징으로 하고, 여기서 G 단백질-결합 수용체는

(a) 서열 2의 아미노산 1-335;

(b) 서열 2의 아미노산 2-335;

로 이루어지는 군 중에서 선택될 때의 서열 2의 변이체;

(g) (a) 내지 (f) 중의 임의의 하나의 생물학적 활성 단편

으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

특정 실시태양에서, 수용체는 재조합체이다.

특정 실시태양에서, 시험 화합물은 소분자이다.

특정 실시태양에서, 시험 화합물은 GPR119 작용제이다.

특정 실시태양에서, GPR119 작용제는 GPR119 부분 작용제이다.

특정 실시태양에서, GPR119 작용제는 소분자이다.

특정 실시태양에서, GPR119 작용제는 경구로 이용가능하다.

예시적인 GPR119 작용제는 예를 들어 국제 특허 출원 PCT/US2004/001267 (WO 04/065380으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2004/005555 (WO 04/076413로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2004/022327 (WO 05/007647로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2004/022417 (WO 05/007658로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2005/019318 (WO 2005/121121로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2004/050046 (WO 2005/061489로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US06/00567 (WO 2006/083491로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2005/050264 (WO 2006/067531로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2005/050265 (WO 2006/067532로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2005/050266 (WO 2006/070208로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/JP02/09350 (WO 03/026661로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/JP2005/018412 (WO 06/040966로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/JP2005/019000 (WO 2006/043490으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2006/050176 (WO 2007/003960으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2006/050177 (WO 2007/003961로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2006/050178 (WO 2007/003962로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2006/050182 (WO 2007/003964로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/JP02/09350 (WO 03/026661로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2007/050183 (WO 2007/116229로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2007/050190 (WO 2007/116230으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2007/073364 (WO 2008/008895로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/EP2007/058991 (WO 2008/025798로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/EP2007/058993 (WO 2008/025799로 공개됨); 및 국제 특허 출원 PCT/EP2007/058995 (WO 2008/025800으로 공개됨)에 개시되어 있다.

제8 측면에서, 본 발명은

(a) 제1 측면에 따른 방법에 의해 결정되거나 확인된, G 단백질-결합 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 시험관 내에서 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키고, 여기서 상기 G 단백질-결합 수용체는

(i) 서열 2의 아미노산 1-335;

(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;

로 이루어지는 군 중에서 선택될 때의 서열 2의 변이체;

(vii) (i) 내지 (vi) 중의 임의의 하나의 생물학적 활성 단편

특정 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체는 재조합체이다.

본 발명은 추가로

(a) 척추동물에게 제1 측면에 따른 방법에 의해 결정되거나 확인된, G 단백질-결합 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 투여하고, 여기서 상기 G 단백질-결합 수용체는

(i) 서열 2의 아미노산 1-335;

(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;

로 이루어지는 군 중에서 선택될 때의 서열 2의 변이체;

(vii) (i) 내지 (vi) 중의 임의의 하나의 생물학적 활성 단편

으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;

특정 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체는 재조합체이다.

본 발명은 추가로

(a) 제1 측면에 따른 방법에 의해 결정되거나 확인된, G 단백질-결합 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 사전에 투여한 척추동물로부터 얻은 샘플 내의 PYY 수준을 화합물이 증가시키는지를 결정하는 단계

를 포함하고; 여기서 상기 G 단백질-결합 수용체는

(i) 서열 2의 아미노산 1-335;

(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;

로 이루어지는 군 중에서 선택될 때의 서열 2의 변이체;

(vii) (i) 내지 (vi) 중의 임의의 하나의 생물학적 활성 단편

으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 단계; 여기서 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물임을 더 나타내는 것인, PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 특징으로 한다.

특정 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체는 재조합체이다.

특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 서열 2 또는 그의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 서열 2의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 서열 2의 오르토로그이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민이 그에 대한 리간드인 수용체이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 수용체이다. 일부 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 수준의 증가를 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다.

특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2 또는 그의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2의 오르토로그이다. 특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 수용체이다. 일부 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 수준의 증가를 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다.

일부 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 소분자이다. 일부 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 폴리펩티드가 아닌 소분자이다. 일부 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아닌 소분자이다. 일부 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 지질이 아닌 소분자이다. 일부 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 폴리펩티드 또는 지질이 아닌 소분자이다. 일부 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 폴리펩티드이다. 일부 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아닌 폴리펩티드이다. 일부 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 지질이다. 일부 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아니다. 일부 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체의 기능성을 자극하는 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.

본 발명은 추가로 상기 제8 측면에 따른 방법을 수행하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다.

제9 측면에서, 본 발명은

(a) 그의 존재 하에 G 단백질-결합 수용체 및 수용체에 대한 임의로 표지된 공지의 리간드 사이의 복합체가 그의 부재 하에서보다 덜 형성되는, 제4 측면에 따른 방법에 의해 결정되거나 확인된 화합물을 시험관 내에서 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키고, 여기서 G 단백질-결합 수용체는

(i) 서열 2의 아미노산 1-335;

(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;

로 이루어지는 군 중에서 선택될 때의 서열 2의 변이체;

(vii) (i) 내지 (vi) 중의 임의의 하나의 생물학적 활성 단편

특정 실시태양에서, G 단백질-결합 수용체는 재조합체이다.

특정 실시태양에서, 척추동물 장내분비 세포는 포유동물 장내분비 세포이다. 특정 실시태양에서, 장내분비 세포는 L 세포이다. 특정 실시태양에서, 장내분비 세포는 소장 또는 대장으로부터 얻은 조직에 포함되거나 이로부터 유래된다. 특정 실시태양에서, 장내분비 세포는 소장 또는 대장의 L 세포 함유 구역에 포함되거나 이로부터 유래된다. 특정 실시태양에서, 장내분비 세포는 십이지장, 공장, 회장, 결장 또는 직장 조직에 포함되거나 이로부터 유래된다 (예를 들어, 문헌 [Lundberg et al, PNAS USA (1982) 79:4471-4475]; [Adrian et al, Gastroenterol (1985) 89:1070-1077]; [Ekblad et al, Peptides (2002) 23:251-261]; [Ueno et al, Regul Pept (2008) 145:12-16] 참조). 특정 실시태양에서, 장내분비 세포는 장내분비 세포주이다. 특정 실시태양에서, PYY를 분비할 수 있는 세포는 랑게르한스섬에 포함되거나 이로부터 유래되는 세포이다. 특정 실시태양에서, PYY를 분비할 수 있는 세포는 뉴런 세포이다. 특정 실시태양에서, PYY를 분비할 수 있는 세포는 PYY를 분비할 수 있도록 조작된 재조합 세포이다.

본 발명은 추가로

(a) 제4 측면에 따른 방법에 의해 결정되거나 확인된 화합물을 척추동물에게 투여하고, 여기서 상기 화합물의 존재 하에 G 단백질-결합 수용체 및 수용체에 대한 임의로 표지된 공지의 리간드 사이의 복합체는 화합물의 부재 하에서보다 덜 형성되고, G 단백질-결합 수용체는

(i) 서열 2의 아미노산 1-335;

(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;

로 이루어지는 군 중에서 선택될 때의 서열 2의 변이체;

(vii) (i) 내지 (vi) 중의 임의의 하나의 생물학적 활성 단편

본 발명은 추가로

(a) 그의 존재 하에 G 단백질-결합 수용체 및 수용체에 대한 임의로 표지된 공지의 리간드 사이의 복합체가 그의 부재 하에서보다 덜 형성되는, 제4 측면에 따른 방법에 의해 결정되거나 확인된 화합물을 사전에 투여한 척추동물로부터 얻은 샘플 내의 PYY 수준을 화합물이 증가시키는지를 결정하고, 여기서 G 단백질-결합 수용체는

(i) 서열 2의 아미노산 1-335;

(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;

로 이루어지는 군 중에서 선택될 때의 서열 2의 변이체;

(vii) (i) 내지 (vi) 중의 임의의 하나의 생물학적 활성 단편

으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단계

특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 서열 2 또는 그의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 서열 2의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 서열 2의 오르토로그이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민이 그에 대한 리간드인 수용체이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 수용체이다. 일부 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 수준의 증가를 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다.

특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2 또는 그의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 서열 2의 오르토로그이다. 특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 수용체이다. 일부 실시태양에서, 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체는 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 수준의 증가를 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다.

일부 실시태양에서, 그의 존재 하에 G 단백질-결합 수용체 및 수용체에 대한 임의로 표지된 공지의 리간드 사이의 복합체가 그의 부재 하에서보다 덜 형성되는 화합물은 소분자이다. 일부 실시태양에서, 그의 존재 하에 G 단백질-결합 수용체 및 수용체에 대한 임의로 표지된 공지의 리간드 사이의 복합체가 그의 부재 하에서보다 덜 형성되는 화합물은 폴리펩티드가 아닌 소분자이다. 일부 실시태양에서, 그의 존재 하에 G 단백질-결합 수용체 및 수용체에 대한 임의로 표지된 공지의 리간드 사이의 복합체가 그의 부재 하에서보다 덜 형성되는 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아닌 소분자이다. 일부 실시태양에서, 그의 존재 하에 G 단백질-결합 수용체 및 수용체에 대한 임의로 표지된 공지의 리간드 사이의 복합체가 그의 부재 하에서보다 덜 형성되는 화합물은 지질이 아닌 소분자이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 폴리펩티드 또는 지질이 아닌 소분자이다. 일부 실시태양에서, 시험 화합물은 폴리펩티드이다. 일부 실시태양에서, 그의 존재 하에 G 단백질-결합 수용체 및 수용체에 대한 임의로 표지된 공지의 리간드 사이의 복합체가 그의 부재 하에서보다 덜 형성되는 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아닌 폴리펩티드이다. 일부 실시태양에서, 그의 존재 하에 G 단백질-결합 수용체 및 수용체에 대한 임의로 표지된 공지의 리간드 사이의 복합체가 그의 부재 하에서보다 덜 형성되는 화합물은 지질이다. 일부 실시태양에서, 그의 존재 하에 G 단백질-결합 수용체 및 수용체에 대한 임의로 표지된 공지의 리간드 사이의 복합체가 그의 부재 하에서보다 덜 형성되는 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아니다. 일부 실시태양에서, 그의 존재 하에 G 단백질-결합 수용체 및 수용체에 대한 임의로 표지된 공지의 리간드 사이의 복합체가 그의 부재 하에서보다 덜 형성되는 화합물은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.

특정 실시태양에서, GPR119에 대한 리간드는 GPR119 작용제이다. 특정 실시태양에서, GPR119에 대한 리간드 또는 GPR119 작용제는 내인성 척추동물, 포유동물 또는 인간 GPR119 수용체의 리간드 또는 작용제이다. 특정 실시태양에서, GPR119에 대한 리간드 또는 GPR119 작용제는 내인성 인간 GPR119 수용체의 리간드 또는 작용제이다. 특정 실시태양에서, GPR119에 대한 리간드 또는 GPR119 작용제는 예를 들어 국제 특허 출원 PCT/US2004/001267 (WO 04/065380으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2004/005555 (WO 04/076413로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2004/022327 (WO 05/007647로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2004/022417 (WO 05/007658로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2005/019318 (WO 2005/121121로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2004/050046 (WO 2005/061489로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US06/00567 (WO 2006/083491로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2005/050264 (WO 2006/067531로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2005/050265 (WO 2006/067532로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2005/050266 (WO 2006/070208로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/JP02/09350 (WO 03/026661로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/JP2005/018412 (WO 06/040966으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/JP2005/019000 (WO 2006/043490으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2006/050176 (WO 2007/003960으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2006/050177 (WO 2007/003961로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2006/050178 (WO 2007/003962로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2006/050182 (WO 2007/003964로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/JP02/09350 (WO 03/026661로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2007/050183 (WO 2007/116229로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/GB2007/050190 (WO 2007/116230으로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/US2007/073364 (WO 2008/008895로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/EP2007/058991 (WO 2008/025798로 공개됨); 국제 특허 출원 PCT/EP2007/058993 (WO 2008/025799로 공개됨); 또는 국제 특허 출원 PCT/EP2007/058995 (WO 2008/025800으로 공개됨)에 개시된 화합물과 동일하다. 특정 실시태양에서, GPR119에 대한 리간드 또는 GPR119 작용제는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이다. 특정 실시태양에서, GPR119에 대한 리간드는 내인성 척추동물, 포유동물, 또는 인간 GPR119 수용체의 내인성 리간드이다.

G 단백질-결합 수용체 및 G 단백질-결합 수용체의 리간드인 것으로 공지된 화합물 사이의 복합체를 검출하는 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 WO 04/065380을 참조한다. 또한 예를 들어, 하기 실시예 15를 참조한다.

본 발명은 추가로 상기 제9 측면에 따른 방법을 수행하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다.

본 발명자들은 본 발명의 임의의 실시태양으로부터 임의의 하나 이상의 후보 화합물을 배제할 권리를 보유한다. 본 발명자들은 본 발명의 임의의 실시태양으로부터 임의의 하나 이상의 조절제를 배제할 권리를 보유한다. 비제한적인 예로서, 본 발명자들은 본 발명의 임의의 실시태양으로부터 임의의 하나 이상의 작용제를 배제할 권리를 보유한다. 본 발명자들은 본 발명의 임의의 실시태양으로부터 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 배제할 권리를 보유한다. 본 발명자들은 추가로 본 발명의 임의의 실시태양으로부터 임의의 PYY에 의해 조절되는 병태, 임의의 뼈 관련 병태, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 임의의 뼈 관련 병태, 뼈 골절인 임의의 뼈 관련 병태, 뼈 질병인 임의의 뼈 관련 병태, 향상된 뼈 치유 또는 뼈 성장인 임의의 뼈 관련 병태, 임의의 대사 장애, 임의의 혈관신생-관련 병태, 임의의 허혈-관련 병태, 임의의 흡수장애 질환, 임의의 경련성 질환, 임의의 암, 임의의 염증성 질환, 임의의 염증성 폐 질병, 임의의 염증성 장 질병, 및 개체에서 PYY-관련 활성의 임의의 조절을 배제할 권리를 보유한다. 또한, PYY에 의해 조절되는 병태, 뼈 관련 병태, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 뼈 관련 병태, 뼈 골절인 뼈 관련 병태, 뼈 질병인 뼈 관련 병태, 향상된 뼈 치유 또는 뼈 성장인 뼈 관련 병태, 대사 장애, 혈관신생-관련 병태, 허혈-관련 병태, 흡수장애 질환, 경련성 질환, 암, 염증성 질환, 염증성 폐 질병, 염증성 장 질병, 및 본 발명의 개체에서 PYY-관련 활성의 조절이 개별적으로 또는 임의의 조합으로 실시태양에 포함될 수 있음이 분명히 고려된다.

본 발명은 여기에 첨부된 도면과 관련하여 설명된다.
도 1은 GPR119 수용체가 형질감염된 HEK293 세포에서 cAMP 축적을 증가시키기 위한 구성적 활성을 보임을 보여준다.
도 2는 화합물 1이 GPR119 수용체의 작용제임을 보여준다.
도 3은 야생형 마우스에서 혈장 총 PYY에 대한 GPR119 작용제 투여의 효과를 보여준다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 적어도 부분적으로는 GPR119 작용제를 개체에게, 예를 들어 경구 투여에 의해 투여하면 개체에서 혈장 총 PYY를 증가시킬 수 있다는 본 발명자들의 놀라운 발견을 기초로 한다. 본 발명은 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 및 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물을 확인하기 위한 GPR119에 관련된 방법을 특징으로 한다. GPR119 작용제는 개체에서 혈장 총 PYY의 증가에 유용하다. 특정 실시태양에서, 개체는 인간이다. GPR119 작용제는 PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방 및 개체에서 PYY-관련 활성의 조절을 위한 제약 물질로서 유용하다.

용어 "리간드"는 본원에서 사용될 때, 폴리펩티드, 예를 들어 GPR119에 특이적으로 결합하는 분자 (예를 들어, 시험 화합물)를 의미한다. 리간드는 예를 들어 폴리펩티드, 지질, 소분자, 항체일 수 있다. 화합물 1은 GPR119 수용체 폴리펩티드의 예시적인 리간드이다 (화합물 1의 화학 구조 및 화학명을 제시하는 표 A 참조). 화합물 1은 국제 특허 출원 PCT/US2004/001267 (WO 2004/065380으로 공개됨)에 개시된 화합물과 동일하다. (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민 (표 A 참조)은 GPR119 수용체 폴리펩티드의 예시적인 리간드이다. 내인성 리간드는 천연 폴리펩티드, 예를 들어 GPR119에 대한 내인성 천연 리간드인 리간드이다. 리간드는 "길항제", "작용제", "부분 작용제", 또는 "역 (inverse) 작용제" 등일 수 있다.

<표 A>

용어 "작용제"는 본원에서 사용될 때, GPCR에 대한 결합에 의해 GPCR을 활성화 (예를 들어, 자극)하여 GPCR에 의해 매개되는 세포내 반응을 유발하는 물질 (예를 들어, 리간드, 시험 화합물)을 의미한다.

용어 "부분 작용제"는 본원에서 사용될 때, 완전 작용제보다는 낮은 정도 또는 수준이지만, GPCR에 대한 결합에 의해 GPCR을 활성화 (예를 들어, 자극)하여 GPCR에 의해 매개되는 세포내 반응을 유발하는 물질 (예를 들어, 리간드, 시험 화합물)을 의미한다.

용어 "길항제"는 작용제 또는 부분 작용제와 대략 동일한 부위에서 GPCR에 결합하지만, 바람직하게는 경쟁적으로 결합하지만 활성 형태의 GPCR에 의해 개시되는 세포내 반응을 활성화시키지 않고, 따라서 작용제 또는 부분 작용제에 의한 세포내 반응을 억제할 수 있는 물질 (예를 들어, 리간드, 시험 화합물)을 의미한다. 길항제는 일반적으로 작용제 또는 부분 작용제의 부재 하의 기준선 세포내 반응을 감소시키지 않는다.

용어 "역작용제"는 GPCR에 결합하고, 작용제 또는 부분 작용제의 부재 하에 관찰되는 정상적인 기준 수준 활성 미만의 활성 형태의 수용체에 의해 개시되는 기준선 세포내 반응을 억제하는 물질 (예를 들어, 리간드, 시험 화합물)을 의미한다.

용어 "GPR119 작용제"는 본원에서 사용될 때, GPR119 수용체에 결합하여 작용제로서 기능하는 화합물을 의미한다. 화합물 1은 예시적인 GPR119 작용제이다 (화합물 1의 화학 구조 및 화학명을 제시하는 표 A 참조). 화합물 1은 국제 특허 출원 PCT/US2004/001267 (WO 2004/065380으로 공개됨)에 개시된 화합물과 동일하다. (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민은 예시적인 GPR119 작용제이다.

용어 "선택적인 GPR119 작용제"는 본원에서 사용될 때, 하나 이상의 관련 수용체, 예를 들어 부신피질자극호르몬-방출 인자-1 (CRF-1) 수용체에 걸쳐서 GPR119 수용체에 대한 선택성을 갖는 GPR119 작용제에 관한 것이다. 화합물 1은 예시적인 선택적 GPR119 작용제이다 (화합물 1의 화학 구조 및 화학명을 제시하는 표 A 참조). 화합물 1은 국제 특허 출원 PCT/US2004/001267 (WO 2004/065380으로 공개됨)에 개시된 화합물과 동일하다. (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민은 예시적인 선택적인 GPR119 작용제이다.

용어 "PYY 분비촉진제"는 개체, 예를 들어 척추동물 또는 포유동물에게 투여시에 세포, 예를 들어 장내분비 세포에서 PYY의 분비를 촉진 (예를 들어, 자극)하거나 또는 총 PYY의 수준, 예를 들어 혈액 또는 혈장 총 PYY의 수준을 증가시키는 물질 (예를 들어, 리간드, 시험 화합물)을 의미한다. 특정 실시태양에서, PYY 분비촉진제는 개체 내의 총 PYY의 수준, 예를 들어 혈액 또는 혈장 총 PYY의 수준을 증가시키기 위해 적합한 화합물이다.

본원에서 사용될 때, 용어 "PYY에 의해 조절되는 병태"는 G 단백질-결합 수용체를 조절할 수 있는 PYY₁ _-36 또는 그의 단편에 의해 조절되는 병태를 의미한다. 특정 실시태양에서, 용어 "PYY에 의해 조절되는 병태"는 PYY₃ _-36에 의해 조절되는 병태를 의미한다. 특정 실시태양에서, 용어 "PYY에 의해 조절되는 병태"는 NPY Y2 수용체 (Y2R) 작용제에 의해 조절되는 병태를 의미한다. 특정 실시태양에서, 용어 "PYY에 의해 조절되는 병태"는 Y2R의 자극에 의해 조절되는 병태를 의미한다. 특정 실시태양에서, 용어 "PYY₃ _-36에 의해 조절되는 병태"는 Y2R 작용제에 의해 조절되는 병태를 의미한다. 특정 실시태양에서, 용어 "PYY₃ _-36에 의해 조절되는 병태"는 Y2R의 자극에 의해 조절되는 병태를 의미한다.

본원에서 사용될 때, 용어 "PYY-관련 활성"은 PYY의 수준을 조절하는 활성 또는 PYY와 연관된 활성을 의미한다. 특정 실시태양에서, 용어 "PYY-관련 활성"은 PYY의 수준을 증가시키는 활성 또는 PYY와 연관된 활성을 의미한다.

용어 "개체"는 본원에서 사용될 때, 어류 (예를 들어 상업적으로 사육된 어류, 애완 어류 등), 양서류 (예를 들어 개구리, 두꺼비, 애완 양서류 등), 파충류 (예를 들어 뱀, 도마뱀, 거북이, 애완 파충류 등), 조류 (예를 들어 닭, 칠면조, 애완 조류 등) 및 포유동물 (예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 돼지, 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 비-인간 영장류, 비-인간 포유동물, 애완 비-인간 포유동물, 인간 등)을 포함하고 이로 제한되지 않는 척추동물이다. 특정 실시태양에서, 개체는 어류이다. 특정 실시태양에서, 개체는 양서류이다. 특정 실시태양에서, 개체는 파충류이다. 특정 실시태양에서, 개체는 조류이다. 특정 실시태양에서, 개체는 칠면조이다. 지난 25년에 걸쳐서, 보다 큰 가슴근육량을 갖는 칠면조에 대한 상업적인 선택 압력 때문에 골격 강도에 대한 요구가 증가하였다. 그러나, 증가된 가슴근육량에는 골격의 보상적인 (compensatory) 변화가 수반되지 않았고, 이에 따라 칠면조 산업은 다리 문제의 증가를 경험하게 되었다. 젊은 성체 수컷 칠면조의 긴 뼈 골절이 보고되었다 (예를 들어, 문헌 [Crespo et al, Poult Sci (2000) 79:602-608] 참조). 특정 실시태양에서, 개체는 포유동물이다. 특정 실시태양에서, 개체는 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 돼지, 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 비-인간 영장류 또는 인간이다 (본 발명의 실시태양에 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함될 수 있다). 특정 실시태양에서, 개체는 말이다. 경주, 걷기 (pacing) 및 다른 경쟁 사건과 같은 활동에 관련되는 말인 퍼포먼스 (performance) 말은 뼈 골절에 취약하다. 특정 실시태양에서, 개체는 개 또는 고양이이다. 특정 실시태양에서, 개체는 인간 반려 동물 (예를 들어 개, 고양이 등), 농장 동물 (예를 들어 소, 양, 염소, 돼지, 닭 등), 스포츠 동물 (예를 들어 말, 개 등), 짐 운반 동물 (예를 들어 노새, 낙타 등) 또는 이색 동물 (예를 들어, 동물원에서 볼 수 있는 동물 등)이고, 이들은 본 발명의 실시태양에 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함될 수 있다. 특정 실시태양에서, 개체는 비-인간 척추동물이다. 특정 실시태양에서, 개체는 비-인간 포유동물이다. 특정 실시태양에서, 개체는 비-인간 영장류 (예를 들어 붉은털 원숭이, 침팬지 등)이다. 특정 실시태양에서, 개체는 인간이다.

용어 "예방 또는 치료를 필요로 하는"은 본원에서 사용될 때, 개체가 치료를 필요로 하거나 치료에 의해 도움을 받게 될 것이라는 의료인 (예를 들어, 인간의 경우에 의사, 간호사, 전담간호사; 비-인간 척추동물, 특정 실시태양에서 비-인간 포유동물의 경우에 수의사)의 판단을 나타낸다.

용어 "치료 유효량" 또는 "치료 유효 용량"는 본원에서 사용될 때, 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 목표로 하는 조직, 시스템, 동물, 개체 또는 인간에서 다음 중의 하나 이상을 포함하는 생물학적 또는 약물 반응을 유도하는 활성 화합물 또는 제약 물질의 양을 의미한다:

(1) 질병의 예방; 예를 들어, 질병, 병태 또는 질환에 걸리기 쉽지만 아직 질병의 병상 또는 증상을 경험하거나 보이지 않는 개체에서 질병, 병태 또는 질환의 예방,

(2) 질병의 억제; 예를 들어, 질병, 병태 또는 질환의 병상 또는 증상을 경험하거나 보이고 있는 개체에서 질병, 병태 또는 질환의 억제 (즉, 병상 및/또는 증상의 추가 발생의 중지), 및

(3) 질병의 개선; 예를 들어, 질병, 병태 또는 질환의 병상 또는 증상을 경험하거나 보이고 있는 개체에서 질병, 병태 또는 질환의 개선 (즉, 병상 및/또는 증상의 역전).

용어 "치료 효능"은 본원에서 사용될 때, 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 목표로 하는 조직, 시스템, 동물, 개체 또는 인간에서 다음 중의 하나 이상을 포함하는 생물학적 또는 약물 반응의 유도를 의미한다:

용어 "예방에 효과적인 양"은 예방을 목적으로 하는 생물학적 또는 의학적 사건의 발생을 예방하거나 발생 위험을 감소시키는 약물의 양을 의미한다. 많은 경우에, 예방에 효과적인 양은 치료 유효량과 동일하다.

용어 "말초 투여"는 중추신경계 외부에서의 투여를 의미한다. 말초 투여는뇌로의 직접 투여를 포함하지 않는다. 말초 투여는 혈관내, 근육내, 피하, 흡입, 경구, 설하, 장내, 직장, 경피, 또는 비내 투여를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

용어 "조성물"은 하나 이상의 성분을 포함하는 물질을 의미할 것이다.

용어 "활성 성분"은 질병의 진단, 치유, 완화, 치료, 또는 예방시에 약리학적 활성 또는 다른 직접적인 효과를 제공하는 임의의 성분을 의미한다.

용어 "제약 조성물"은 적어도 하나의 활성 성분을 포함하여, 포유동물의 조사 및 치료에 사용될 수 있는 조성물을 의미한다.

"제약상 허용되는"은 담체, 비히클 (vehicle), 희석제, 부형제, 및/또는 염이 제형의 다른 성분과 상용성이어야 하고, 그의 수여자에게 유해하지 않아야 함을 의미한다.

용어 "투여 형태"는 약물이 생산되고 분배되는 물리적인 형태, 예를 들어 정제, 캡슐, 또는 주사제를 의미한다.

뼈"는 치밀한 유기 기질 및 무기질 성분을 포함하는, 대부분의 척추동물의 골격의 주요 부분을 형성하는 치밀한 반경질의 다공성 석회성 결합 조직을 의미한다. 뼈는 척추동물의 골격을 구성하는 임의의 많은 해부학상 구별되는 구조이다.

용어 "골 질량" 및 "뼈 무기질 밀도 (BMD)"는 본원에서 서로 교환가능하게 사용된다. 인간에서 BMD는 대체로 표준 방사선사진 기술인 이중 에너지 X-선 흡수계측법 (DXA)에 의해 측정된다. BMD를 평가하기 위해 개발된 많은 기술 중에서, DXA는 기술적으로 가장 고도로 개발되고, 생물학적으로 가장 철저하게 입증되었다. 적합하게 채용된 소프트웨어를 사용하여 DXA 기술은 또한 동물 연구에서 BMD를 신뢰할 수 있게 평가하기 위해 사용될 수 있다. DXA는 골다공증 진단, 예후 (골절 예측), 질환의 자연 경과의 모니터링 및 치료에 대한 반응의 평가에 사용된다.

용어 "낮은 골 질량"은 본원에서 사용될 때, 개체에서 뼈 무기질 밀도 (BMD)의 임의의 저하 또는 감소를 나타내고, 세계보건기구 (WHO)의 제안에서 규정된 골다공증 및 골감소증을 모두 포함한다. WHO는 정상을 젊은 성인 참조 평균의 1 표준 편차 내의 BMD 값 (T-스코어≥-1)으로서 규정하였다. WHO는 골감소증을 젊은 성인 평균보다 1 표준 편차 초과로부터 2.5 표준 편차 미만까지의 값으로 더 작은 BMD 값 (T-스코어<-1 및 >-2.5)으로서 규정하였다. WHO는 골다공증을 골감소증의 보다 심각한 형태로 특성화하였고, 골다공증을 젊은 성인 평균보다 2.5 표준 편차 이상의 값으로 더 작은 BMD 값 (T-스코어≤-2.5)으로 규정하였다 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis] 참조). 보다 통상적으로는, 골감소증은 -1 미만 및 -2 초과의 T-스코어로서 규정되고, 골다공증은 -2 이하의 T-스코어로서 규정된다. 본 발명의 특정 실시태양에서, T-스코어는 DXA를 사용하여 고관절에서 측정된다.

용어 "골다공증"은 본원에서 사용될 때 젊은 성인 참조 평균보다 2 표준 편차 이상의 값으로 더 작은 BMD 값 (T-스코어≤-2)으로 규정되거나 또는 의료인 (예를 들어 인간의 경우에 의사, 간호사, 전담간호사; 비-인간 척추동물의 경우에 수의사)에 의한 진단을 의미한다.

골다공증은 1차 또는 2차로 분류될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis] 참조). 본원에서 사용될 때, 용어 "골다공증"은 원발성 골다공증 및 2차성 골다공증을 포함한다. 특정 실시태양에서, 골다공증은 원발성 골다공증이다. 특정 실시태양에서, 골다공증은 2차성 골다공증이다.

"원발성 골다공증"는 본원에서 사용될 때 폐경 (자연, 조기 또는 수술), 노화 또는 둘 모두와 연관된다. 본 발명에서 폐경 (자연, 조기 또는 수술)과 연관된 원발성 골다공증, 노화와 연관된 원발성 골다공증, 및 폐경 및 노화와 연관된 원발성 골다공증이 실시태양에 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함될 수 있음을 이해해야 한다.

"2차성 골다공증"는 본원에서 사용될 때 폐경 또는 노화와 연관되지 않고 오히려 의학적 병태 또는 약제 또는 약물의 사용과 연관되는 골다공증을 의미한다. 골다공증의 위험 증가는 그의 예는 당업자에게 잘 알려져 있는 내분비 및 대사 장애, 및 악성 질병을 포함하고 이로 제한되지 않는 다수의 의학적 병태 및 특정 약제 및 약물의 사용과 연관된다 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis]; [Williams Textbook of Endocrinology, 10^th Edition)] 참조). 2차성 골다공증은 부동화 (immobilization)와 연관될 수 있다. 의학적 병태, 약제 또는 약물의 사용, 또는 부동화에 2차적인 골다공증의 진단은 의료인 (예를 들어 인간의 경우에 의사, 간호사, 전담간호사; 비-인간 척추동물의 경우에 수의사)에 의해 수행될 수 있다.

"뼈 골절"은 뼈의 완전한 또는 불완전한 부러짐, 파열 또는 균열을 의미한다. 골절의 진단은 일반적으로 임상 검사 및 방사선 판독에 의해 이루어진다. 본 발명에서, 뼈 골절은 외상성 골절, 장기 골절, 및 병리학적 골절을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

"외상성 골절"은 본원에서 사용될 때 뼈의 천연 탄성을 초과하는 국소 충격 수준에 따른 역치상 외상을 수반하는 즉각적인 골절을 의미한다. 이 골절에는 연조직 및 매우 종종 피부에 대한 동시 손상이 수반될 수 있다. 외상성 골절은 닫힐 수 있다 (인접 연조직은 손상될 수 있지만, 그를 덮고 있는 연부는 대부분 보존된다). 외상성 골절은 개방된 상태일 수 있다 (뼈의 골절 단부는 광범한 연조직 손상에 의해 개방된 상태로 외부로부터의 병원체가 상처에 직접 들어올 수 있다).

"장기 골절"은 본원에서 사용될 때 만성 골절, 피로 골절, 스트레스 골절 또는 자연 골절 타입 I을 의미한다.

"병리학적 골절"는 본원에서 사용될 때 자연 골절 타입 II를 의미한다. 병리학적 골절은 그를 설명하는 적절한 외상 없이도 자연적으로 발생한다. 뼈는 전신 질병 (예를 들어, 골다공증, 골형성장애, 또는 파제트 변형성 골염)에 의해 또는 국소 뼈 병변 (예를 들어, 전이, 방사선 골괴사, 또는 뼈 종양)에 의해 이전에 손상될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Adler, Claus-Peter, BONE DISEASES, p. 114 (Springer-Verlag, Germany 2000)] 참조).

또한, 골절은 경사 염전 (oblique torsion) 골절, 횡골절, 분쇄 골절, 압박 골절, 늑골 골절, 잠행 (creeping) 골절, 및 대퇴경부 골절을 포함하고 이로 제한되지 않는다 (Adler, Claus-Peter, BONE DISEASES, Springer-Verlag, Germany (2000)).

본원에서 사용될 때, "뼈 관련 병태"는 골 질량 또는 뼈 성장을 증가시킴으로써 또는 골 질량 손실을 감소시킴으로써 본 발명에 따른 치료를 통해 도움을 받는 병태를 의미하고, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태, 뼈 골절, 뼈 질병, 및 향상된 뼈 치유 또는 뼈 성장을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서 본 발명에 따라 치료될 수 있는 뼈 관련 병태는 실시태양에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함될 수 있음을 이해해야 한다.

본원에서 사용될 때, 용어 "낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태"는 골감소증, 골다공증, 류마티스 관절염, 골관절염, 치주병, 치조뼈 손실, 절골 뼈 손실, 소아 특발성 뼈 손실, 척추 만곡 및 키 감소를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 골다공증은 원발성 골다공증이다. 특정 실시태양에서, 골다공증은 2차성 골다공증이다. 특정 실시태양에서, 2차성 골다공증은 의학적 병태와 연관된다. 특정 실시태양에서, 2차성 골다공증은 약제 또는 약물의 사용과 연관된다. 특정 실시태양에서, 2차성 골다공증은 부동화와 연관된다. 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태는 또한 파제트 병, 전이성 암에 의한 뼈 손실, 및 골용해성 병변, 예를 들어 신생물성 질병, 방사선요법, 또는 화학요법에 의해 야기되는 병변을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태는 또한 골다공증의 장기 합병증, 예를 들어 척추 만곡, 키 감소 및 인공보형물 수술을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태는 실시태양에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함될 수 있음을 이해해야 한다 (예를 들어, 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis]; [Williams Textbook of Endocrinology, 10^th Edition, Larsen et al, Eds. (2002), W.B. Saunders Company]; 및 [Endocrinology and Metabolism, 4^th Edition, Felig et al, Eds. (2001), McGraw-Hill Book Company] 참조).

본원에서 사용될 때, "뼈 질병"은 뼈의 이상에 관련된 질환 또는 병태를 의미한다. 골 질량 또는 뼈 성장을 증가시키거나 또는 골 질량 손실을 감소시킴으로써 본 발명에 따라 치료될 수 있는 뼈 질병은 골감소증, 골다공증, 류마티스 관절염, 골관절염, 치주병, 치조뼈 손실, 절골 뼈 손실, 소아 특발성 뼈 손실, 척추 만곡, 및 키 감소를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 골다공증은 원발성 골다공증이다. 특정 실시태양에서, 골다공증은 2차성 골다공증이다. 특정 실시태양에서, 2차성 골다공증은 의학적 병태와 연관된다. 특정 실시태양에서, 2차성 골다공증은 약제 또는 약물의 사용과 연관된다. 특정 실시태양에서, 2차성 골다공증은 부동화와 연관된다. 골 질량 또는 뼈 성장을 증가시킴으로써 본 발명에 따라 치료될 수 있는 뼈 질병은 또한 파제트 병 및 전이성 암에 의한 뼈 손실을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 골 질량 또는 성장을 증가시킴으로써 본 발명에 따라 치료될 수 있는 파괴성 뼈 질환은 골다공증, 골관절염, 및 골용해성 병변, 예를 들어 신생물성 질병, 방사선요법, 또는 화학요법에 의해 야기되는 병변을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 골 질량 또는 성장을 증가시킴으로써 본 발명에 따라 치료될 수 있는 뼈 질병은 실시태양에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함될 수 있음을 이해해야 한다 (예를 들어, 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis]; [Williams Textbook of Endocrinology, 10^th Edition, Larsen et al, Eds. (2002), W.B. Saunders Company]; 및 [Endocrinology and Metabolism, 4^th Edition, Felig et al, Eds. (2001), McGraw-Hill Book Company] 참조).

또한, 본 발명은 안면 재건, 상악 재건, 하악 재건, 치주병 또는 발치 후의 향상된 뼈 치유, 향상된 장골 신장, 향상된 인공보형물 내성장 및 증가된 뼈 유합을 포함하고 이로 제한되지 않는, 골 질량 또는 뼈 성장을 증가시킴으로써 또는 골 질량 손실을 감소시킴으로써 본 발명에 따른 치료를 통해 도움을 받는 다른 병태에 관한 것이다.

본원에서 사용될 때, "대사 장애"는 대사 이상에 관련된 장애를 의미한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 대사 장애는 과체중, 비만, 과식증, 당뇨병 (1형 당뇨병 및 2형 당뇨병 포함), 2형 당뇨병, 손상된 포도당 내성, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 이상지질혈증, 고혈압 및 대사증후군을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서 본 발명에 따라 치료될 수 있는 대사 장애는 실시태양에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함될 수 있음을 이해해야 한다.

본원에서 정의되고, [Adult Treatment Panel III (ATP III; National Institutes of Health: Third Report of the National Cholesterol Education Program Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel HT), Executive Summary; Bethesda, Md., National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute, 2001 (NIH pub. No 01-3670))]에 따른 용어 "대사증후군"은 개체가 비만, 고트리글리세리드혈증, 낮은 HDL 콜레스테롤, 고혈압, 및 높은 공복 포도당에 관한 5개의 기준 중 3개 이상을 충족시킬 때 발생한다.

용어 "비만"은 본원에서 사용될 때, WHO 체중 분류에 따라 30.0 이상의 체질량 지수 (BMI)로서 규정된다 (그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Kopelman, Nature (2000) 404:635-643]).

"손상된 포도당 내성" (IGT)은 본원에서 사용될 때 명백한 2형 당뇨병과 정상 포도당 내성 (NGT) 사이의 중간인 인슐린-저항성과 연관된 병태를 나타내기 위한 것이다. IGT는 이환된 사람의 식후 포도당 반응이 식후 2시간 혈장 포도당 수준에 의해 평가될 때 비정상으로 결정되는 절차에 의해 진단된다. 상기 시험에서, 포도당의 측정된 양이 환자에게 제시되고, 혈액 포도당 수준은 규칙적인 간격으로, 대체로 처음 2시간 동안 30분마다, 그후 매시간마다 측정된다. "정상" 또는 비-IGT 개체에서, 포도당 수준은 처음 2시간 동안 수준 140 mg/dl 미만의 수준으로 상승한 후, 신속하게 저하된다. IGT 개체에서, 혈액 포도당 수준은 더 높고, 저하 수준은 더 느린 속도에서 이루어진다.

"인슐린 저항성"은 본원에서 사용될 때, 정맥내 포도당 내성 시험 또는 공복 인슐린 수준의 측정을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 많은 방법에 의해 수행되는 인슐린 저항성의 통상적인 진단을 포함하고자 의도된다. 공복 인슐린 수준과 인슐린 저항성 정도 사이에는 밀접한 상관관계가 존재한다고 잘 알려져 있다. 따라서, 어느 정상 포도당 내성 (NGT) 개체가 인슐린 저항성을 갖는지를 확인하기 위해 인슐린 저항성에 대한 대리 마커로서 상승된 공복 인슐린 수준을 사용할 수 있다. 또한, 인슐린 저항성의 진단은 정상혈당 포도당 클램프 (clamp) 시험을 사용하여 수행할 수도 있다.

"이상지질혈증"은 본원에서 혈장 유리 지방산의 상승된 수준, 혈장 콜레스테롤의 상승된 수준, LDL-콜레스테롤의 상승된 수준, HDL-콜레스테롤의 감소된 수준, 총 콜레스테롤 대 HDL 콜레스테롤의 상승된 비율, 및 혈장 트리글리세리드의 상승된 수준 중의 어느 하나를 포함하는 질환을 포함하고자 의도된다.

본원에서 사용될 때, "혈관신생-관련 병태"는 증가된 혈관신생으로부터 도움을 받는 병태를 의미한다. 혈관신생을 증가시킴으로써 본 발명에 따라 치료될 수 있는 혈관신생-관련 병태는 말초 동맥 질환, 상처 치유, 및 허혈을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서 본 발명에 따라 치료될 수 있는 혈관신생-관련 병태는 실시태양에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함될 수 있음을 이해해야 한다.

본원에서 사용될 때, "허혈"은 조직 산소 부족 또는 부전 상태를 의미한다.

본원에서 사용될 때, "허혈-관련 병태"는 허혈에 관련된 병태를 의미한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 허혈-관련 병태는 뇌 허혈, 뇌졸중, 허혈성 심장병, 심근경색, 허혈-재관류 손상, 심근경색 후 재형성, 심부전 및 울혈성 심부전을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서 본 발명에 따라 치료될 수 있는 허혈-관련 병태는 실시태양에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함될 수 있음을 이해해야 한다.

"뇌졸중"은 뇌에 혈액을 공급하는 혈관이 이환되는 심혈관 질병이고, 본원에서 가장 흔한 종류의 뇌졸중인 뇌 혈전증을 포함하고자 의도된다. 뇌 혈전증은 혈액 혈병 (혈전)이 형성되고 뇌 부분에 혈액을 공급하는 동맥 내의 혈류를 차단할 때 발생한다. 혈전은 대체로 죽상경화증에 의해 손상된 동맥 내에서 형성된다.

본원에서 사용될 때, "허혈성 심장병"은 심장 조직의 산소 결핍에 의해 야기되는, 심장의 근육이 이환되고 심장이 적절하게 펌핑할 수 없는 질환을 의미한다. 허혈성 심장병은 미국에서 가장 흔한 심근병증이다.

본원에서 사용될 때, "심근경색"은 부적절한 산소 공급에 의한 심근 영역의 손상 또는 사멸을 의미한다. 심근경색 종종 관상 동맥 (심장 근육에 산소를 보내는 혈관)의 하나를 차단하는 혈병에 의해 야기된다. 혈병은 혈액 및 산소가 심장 영역에 도달하지 못하도록 만들어 그 영역 내의 심장 세포의 사멸을 야기한다.

심근경색에 의한 심근 조직의 손실은 심실에 대한 지속적인 과도한 혈류역학적 부담을 야기한다. 심실 비대는 그에 의해 심장이 증가된 부하 (load)를 보상하는 원리 메카니즘의 하나를 구성한다. 그러나, 혈류역학적 과부하에도 불구하고 심장 기능을 유지하기 위한 상기 적응 능력은 한계가 있고, 만성적으로 유지될 경우 비적응성이 된다. 점차적으로, 적응성 비대 표현형은 확대된 심실이 점진적으로 팽창하고 수축 기능이 약화되면서 명백한 심부전으로 전이된다. 심장에서 심근경색에 대한 적응성 및 비적응성 반응의 자연 경과는 "심근 경색 후 재형성"으로 언급된다.

"울혈성 심부전"은 심장이 혈액을 효율적으로 펌핑하는 그의 능력을 상실하는 질환을 의미한다. 울혈성 심부전은 고령화되면서 보다 일반적으로 발생한다. 허혈성 심장병은 울혈성 심부전의 가장 통상적인 원인으로서, 모든 환자의 60-70％가 여기에 해당한다. 12 mmHg 초과의 증가된 정맥압은 25초 초과의 순환 시간과 동등한 심박출량의 감소인, 울혈성 심부전에 대한 주요 프레이밍햄 (Framingham) 기준의 하나이다.

본원에서 사용될 때, "흡수장애 질환"은 장 상피 내의 분비 및/또는 흡수 이상에 관련된 질환을 의미한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 흡수장애 질환은 단장 증후군, 장염, 크론병, 궤양 대장염, 과민성 장 증후군, 콜레라 및 설사를 수반하는 질환을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본원에서 사용될 때, "설사를 수반하는 질환"은 설사를 수반하는 질병 또는 증상인 경우라면 특별히 제한되지 않으며, 질환이 급성 질병인지 만성 질병인지의 여부는 중요하지 않다. 그러한 질병 또는 증상의 예는 설사 (기생충, 세균, 바이러스, 물리적 자극, 소화불량, 정신 장애, 위장 염증 또는 알러지 등에 의해 야기되는), 과민성 장 증후군, 궤양 대장염 등을 포함한다. 각각의 설사를 수반하는 질환이 본 발명의 범위 내에서 별개의 실시태양임이 명백하게 고려된다. 본 발명에서 본 발명에 따라 치료될 수 있는 흡수장애 질환은 실시태양에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함될 수 있음을 이해해야 한다.

본원에서 사용될 때, "경련성 질환"은 대상이 경련, 예를 들어, 간질 발작에 의한 경련으로 고통받는 개체의 질환을 의미한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 경련성 질환은 간질 및 비-간질 발작, 예를 들어 개체에게 경련유발제를 투여함으로써 발생하는 경련을 포함한다. 본 발명에서 본 발명에 따라 치료될 수 있는 경련성 질환은 실시태양에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함될 수 있음을 이해해야 한다.

본원에서 사용될 때, "암"은 악성 신생물을 의미한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 암은 췌장암, 유방암, 대장암 및 바렛 선암종을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서 본 발명에 따라 치료될 수 있는 암은 실시태양에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함될 수 있음을 이해해야 한다.

본원에서 사용될 때, "염증성 질환"은 염증 이상에 관련된 질환을 의미한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 염증성 질환은 죽상경화증, 죽상혈전증, 인슐린 저항성, 췌장염, 재협착, 염증성 폐 질병, 및 염증성 장 질병을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서 본 발명에 따라 치료될 수 있는 염증성 질환은 실시태양에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함될 수 있음을 이해해야 한다.

본원에서 사용될 때, "죽상혈전증"은 죽상경화성 혈관 내의 혈전 형성을 의미한다.

본원에서 사용될 때, "염증성 폐 질병"은 폐 내의 염증 이상에 관련된 병태를 의미한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 염증성 폐 질병은 천식, 폐기종 및 폐 동맥 고혈압 (PAH)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. PAH는 우심실 비대를 야기하는 진행성 폐 혈관병증을 특징으로 하는 치명적인 질병이고; 치료하지 않고 방치할 경우 우측 심부전이 발생한다. PAH는 폐 동맥 고혈압에 대한 2003 World Health Organization (WHO) 임상 분류에서 설명된 다음 형태의 폐 동맥 고혈압을 포함하는 것으로 이해된다: 특발성 PAH, 가족성 PAH, 다른 병태와 연관된 PAH, 및 유의한 정맥 또는 모세관 침범과 연관된 PAH. 본 발명에서 본 발명에 따라 치료될 수 있는 염증성 폐 질병은 실시태양에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함될 수 있음을 이해해야 한다.

본원에서 사용될 때, "염증성 장 질병"은 장 내의 염증 이상에 관련된 병태를 의미한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 염증성 장 질병은 장염, 전장염, 크론병, 육아종성 대장염, 회장염 또는 크론 대장염일 수 있는 크론병 및 궤양 대장염, S상 결장염, 전대장염 및 궤양성 직장염일 수 있는 궤양 대장염을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서, 본 발명에 따라 치료될 수 있는 염증성 장 질병은 실시태양에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함될 수 있음을 이해해야 한다.

용어 "죽상경화증"은 본원에서 사용될 때 큰 및 중간 크기의 동맥의 벽의 최내층 상에 콜레스테롤 및 지질을 함유하는 죽상판 (atheromatous plaque)의 퇴적을 특징으로 하는 혈관 질병의 한 형태를 의미한다.

"알츠하이머 (Alzheimer) 질병"은 하나 초과의 인지 도메인의 유의한 기능 상실을 특징으로 하고 종종 행동 또는 성격의 변화를 수반하는 진행성 신경변성 질병이다. 알츠하이머 질병은 치매의 가장 통상적인 원인이다. 베타-아밀로이드 펩티드 (Aβ)는 알츠하이머 질병의 병상에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 생각된다.

"경증 인지 장애" (MCI)는 직업 또는 사회적 기능에 유의한 영향을 줄 정도로 심각하지는 않은, 가장 통상적으로는 단지 기억에 대한 인지 장애 상태이다. 그러나, MCI가 존재하는 많은 사람이 10-15％/년의 속도로 5년 내에 60％ 이하까지 알츠하이머 질병으로 진행된다. 점차 증가하는 증거는 알츠하이머 질병의 병상이 알츠하이머 기준의 진단을 허용할 정도의 심각한 증상의 발생보다 훨씬 더 일찍 시작됨을 보여준다. 2001년에, 미국 신경학회 (American Academy of Neurology (AAN))는 MCI 및 경증의 알츠하이머 질병 모두의 인식, 진단 및 치료를 증가시킬 MCI 검출을 위한 임상 시험 파라미터를 발표하였다.

본원에서 사용될 때, "프리온-연관 질병"은 소 해면상 뇌병증, 크로이츠펠트-야콥 (Creutzfeldt-Jakob) 병, 쿠루 (kuru), 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커 (Gerstmann-Straussler-Scheinker) 증후군, 및 치명적 가족성 불면증을 포함하고 이로 제한되지 않는 의도이다 (Collins et al, Lancet (2004) 363:51-61).

본원에서 사용될 때, "흥분독성 손상"은 물질-유발 발작 과다활성, 예를 들어 글루타메이트-유발 발작 활성에 의해 발생하는 뉴런 세포 손상 또는 뉴런 세포 사멸을 의미한다.

"파킨슨 (Parkinson) 병"은 운동 증상, 예를 들어 진전, 운동완만증, 근강직, 보행 장애, 및 자세불안정을 특징으로 하는 만성, 진행성 신경변성 질환이다. 연구자들은 파킨슨병의 1차적 병태생리 메카니즘으로서 흑색질 내의 도파민성 뉴런의 생성을 확인하였다.

"아디포넥틴"은 지방세포에 의해 분비된 혈장 단백질이고, N-말단에 배치된 콜라겐-유사 구역 및 C-말단 구상 구역으로 이루어진다. 아디포넥틴의 수준 감소는 죽상경화증, 관상동맥성 심장병, 뇌졸중, 인슐린 저항성 및 2형 당뇨병을 포함하는 많은 대사-관련 질환과 연관되었다. 여성에 대한 혈청 아디포넥틴 수준은 한 연구에서 남성에 대한 수준보다 더 높은 것으로, 예를 들어 13.5 ㎍/ml 대 7.2 ㎍/ml로 보고되었다 (Yamamoto et al, Clin Sci (London) (2002) 103:137-142).

용어 "내인성"은 개체 (예를 들어, 비제한적으로 인간)가 자연적으로 생산하는 물질을 의미할 것이다. 이와 대조적으로, "비-내인성"은 개체 (예를 들어, 비제한적으로 인간)에 의해 자연적으로 생산되지 않는 물질을 의미할 것이다.

용어 G 단백질-결합 수용체의 "생물학적 활성 단편"은 천연 생성 GPCR의 구조적 및 생화학적 기능을 갖는 GPCR의 단편을 의미한다. 특정 실시태양에서, 생물학적 활성 단편은 G 단백질에 결합한다. 특정 실시태양에서, 생물학적 활성 단편은 GPCR의 공지의 리간드에 결합한다.

용어 "프라이머"는 본원에서 표적 뉴클레오티드 서열에 상보성이고 표적 뉴클레오티드 서열의 혼성화를 위해 사용되는 특이적인 뉴클레오티드 서열을 나타내기 위해 사용된다. 프라이머는 DNA 중합효소, RNA 중합효소, 또는 역전사효소에 의해 촉매되는 뉴클레오티드 중합을 위한 개시점으로서 기능한다.

용어 "발현 벡터"는 클로닝된 DNA의 전사 및 발현 벡터에 대한 적절한 숙주 세포 재조합에서의 전사된 mRNA의 번역을 위해 필요한 DNA 서열을 의미한다. 적절하게 제조된 발현 벡터는 숙주 세포 내에서의 자동 복제를 위한 복제 기점, 선택가능한 마커, 제한된 수의 유용한 제한 효소 부위, 고 카피 수를 위한 능력, 및 활성 프로모터를 함유하여야 한다. 전사되는 클로닝된 DNA는 발현 벡터 내에 구성적으로 또는 조건적으로 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

용어 "숙주 세포"는 그 내부에 벡터를 포함할 수 있는 세포를 의미한다. 본 문맥에서, 벡터는 일반적으로 GPCR 또는 GPCR 융합 단백질이 발현되도록 적합한 프로모터 서열과 작동가능하게 연결된 GPCR 또는 GPCR 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 함유할 것이다. 특정 실시태양에서, 숙주 세포는 진핵 숙주 세포이다. 특정 실시태양에서, 진핵 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다. 특정 실시태양에서, 진핵 숙주 세포는 효모 숙주 세포이다. 특정 실시태양에서, 진핵 숙주 세포는 멜라닌 보유 세포 숙주 세포이다.

용어 "접촉하다" 또는 "접촉"은 적어도 2개의 모이어티 (moiety)를 함께 접하게 됨을 의미한다.

용어 "조절하다" 또는 "변형하다"는 특정 활성, 기능 또는 분자의 양, 질 또는 효과의 증가 또는 감소를 나타내거나, 또는 병태와 관련하여 사용될 때 상기 병태의 상태 변화를 나타내기 위해 사용된다. 비제한적인 예시로서, G 단백질-결합 수용체의 작용제, 부분 작용제, 역작용제, 및 길항제는 수용체의 조절제이다.

용어 "소분자"는 분자량이 약 10,000 g/몰 미만인 화합물, 예를 들어 펩티드, 펩티드 모방체 (peptidomimetic), 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 유기 화합물 또는 무기 화합물 (즉, 이종유기 화합물 또는 유기금속 화합물), 및 그의 염, 에스테르 및 다른 제약상 허용되는 형태를 의미하기 위해 사용된다. 특정 실시태양에서, 소분자는 분자량이 약 5,000 g/몰 미만인 유기 또는 무기 화합물이다. 특정 실시태양에서, 소분자는 분자량이 약 1,000 g/몰 미만인 유기 또는 무기 화합물이다. 특정 실시태양에서, 소분자는 분자량이 약 800 g/몰 미만인 유기 또는 무기 화합물이다. 특정 실시태양에서, 소분자는 분자량이 약 600 g/몰 미만인 유기 또는 무기 화합물이다. 특정 실시태양에서, 소분자는 분자량이 약 500 g/몰 미만인 유기 또는 무기 화합물이다.

본원에서 사용되는 아미노산 약어는 하기 표 B에 제시된다:

<표 B>

용어 "폴리펩티드"는 중합체의 길이와 무관하게 아미노산의 중합체를 의미한다. 따라서, 펩티드, 올리고펩티드, 및 단백질이 폴리펩티드의 정의 내에 포함된다. 또한, 상기 용어는 폴리펩티드의 발현후 변형을 명시하거나 배제하지 않는다. 예를 들어, 글리코실기, 아세틸기, 포스페이트기, 지질기 등의 공유 부착을 포함하는 폴리펩티드가 용어 폴리펩티드에 분명하게 포함된다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 단일쇄 또는 이중체 형태의 RNA, DNA, 또는 하나 초과의 뉴클레오티드의 RNA/DNA 하이브리드 서열을 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 합성, 재조합, 생체외 생성, 또는 그의 조합을 포함하는 임의의 공지의 방법에 의해, 및 당업계에 공지된 임의의 정제 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

용어 "항체"는 본원에서 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 포함하는 것으로 의도된다.

용어 "제2 메신저"는 수용체 활성화의 결과로서 생성된 세포내 반응물을 의미한다. 제2 메신저는 예를 들어 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트 (IP₃), 디아실글리세롤 (DAG), 시클릭 AMP (cAMP), 시클릭 GMP (cGMP), MAP 키나제 활성, MAPK/ERK 키나제 키나제-1 (MEKK1) 활성, 및 Ca² ⁺를 포함할 수 있다. 제2 메신저 반응물은 수용체 활성화의 결정을 위해 측정될 수 있다.

용어 "수용체 기능성"은 유전자 전사의 조절, 이온의 유입 또는 유출의 조절, 촉매 반응의 유도, 및/또는 G-단백질을 통한 활성의 조절, 예를 들어 제2 메신저 반응의 유도를 포함하고 이로 제한되지 않는, 세포에서 자극을 수용하고 효과를 조정하는 수용체의 정상 작용을 의미한다.

용어 "반응" 또는 "수용체의 기능성"과 관련한 용어 "자극하다" 또는 "자극하는"은 반응 또는 수용체의 기능성이 화합물의 부재 하에서와 달리 화합물의 존재 하에 증가함을 의미한다.

용어 "반응" 또는 "수용체의 기능성"과 관련한 용어 "억제하다" 또는 "억제하는"은 반응 또는 수용체의 기능성이 화합물의 부재 하에서와 달리 화합물의 존재 하에 감소하거나 억제됨을 의미한다.

용어 "화합물 효능"은 수용체 결합 친화도와 달리 수용체 기능성을 억제하거나 자극하는 화합물의 능력의 척도를 의미한다.

본원에서 "후보 화합물"과 서로 교환가능하게 사용되는 용어 "시험 화합물"은 스크리닝 기술에 적용될 수 있는 분자 (예를 들어, 비제한적으로 화학적 화합물)를 의미한다.

G 단백질-결합 수용체와 관련하여 용어 "구성적 활성"은 G 단백질-결합 수용체가 작용제-독립적인 활성을 보임을 의미한다.

문구 "시험 화합물"과 관련한 용어 "직접 확인하는" 또는 "직접 확인된"은 G 단백질-결합 수용체에 대한 공지의 리간드 (예를 들어, 공지의 작용제)의 부재 하에 G 단백질-결합 수용체에 대한 화합물의 스크리닝을 의미한다.

일정 범위의 값이 제공될 경우, 문맥상 명백하게 다르게 표시되지 않으면 하한의 1/10까지 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재하는 값 및 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급되거나 또는 개재하는 값이 본 발명의 범위 내에 포함됨이 이해된다. 상기 더 작은 범위의 상한 및 하한은 더 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있고, 이 역시 본 발명의 범위 내에 포함되고, 이는 언급된 범위 내의 임의의 구체적으로 배제된 한계치에도 적용된다. 언급된 범위가 한계치의 하나 또는 둘 모두를 포함할 경우, 그 포함된 한계치의 하나 또는 둘 모두가 배제된 범위도 본 발명에 포함된다.

A. 도입

다음 섹션의 순서는 효율적으로 제시하기 위한 것으로서, 발명의 개시내용 또는 첨부되는 청구의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않으며 제한하는 것으로 생각하지 않아야 한다.

B. 수용체 발현

1. 관심있는 GPCR 폴리펩티드

본 발명의 GPCR은

(a) 서열 2의 아미노산 1-335;

(b) 서열 2의 아미노산 2-335;

로 이루어지는 군 중에서 선택될 때의 서열 2의 변이체;

(g) (a) 내지 (f) 중의 임의의 하나의 생물학적 활성 단편

으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

특정 실시태양에서, 본 발명의 GPCR은 서열 2의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 GPCR은 서열 2의 대립유전자이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 GPCR은 서열 2의 오르토로그이다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 GPCR은 재조합체이다. 일부 실시태양에서, 재조합 GPCR은 재조합 인간 GPR119이다.

특정 실시태양에서, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 GPCR은 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 GPCR은 내인성이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 GPCR은 포유동물 GPR119이다. 일부 실시태양에서, 내인성인 본 발명의 GPCR은 포유동물 GPR119이다.

비제한적인 예로서, N-말단 메티오닌 잔기의 결실은 본 발명에서 사용될 수 있는 생물학적 활성 단편을 제공할 것으로 생각된다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 생물학적 활성 단편은 N-말단 메티오닌 잔기 및 화합물 1에 특이적으로 결합하는 HA 에피토프 태그 (헤마글루티닌 인플루엔자 바이러스로부터의)를 포함하는 펩티드에 그의 N-말단에서 임의로 융합된 단편이다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 생물학적 활성 단편은 N-말단 메티오닌 잔기 및 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합하는 HA 에피토프 태그 (헤마글루티닌 인플루엔자 바이러스로부터의)를 포함하는 펩티드에 그의 N-말단에서 임의로 융합된 단편이다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 생물학적 활성 단편은 하기 실시예 15에 따른 수용체 결합 분석에서의 IC₅₀ 값이 약 50 μM 미만, 약 25 μM 미만, 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만인, N-말단 메티오닌 잔기 및 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합하는 HA 에피토프 태그를 포함하는 펩티드에 그의 N-말단에서 임의로 융합된 단편이다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 생물학적 활성 단편은 하기 실시예 15에 따른 수용체 결합 분석에서의 IC₅₀ 값이 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만인, N-말단 메티오닌 잔기 및 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합하는 HA 에피토프 태그를 포함하는 펩티드에 그의 N-말단에서 임의로 융합된 단편이다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 생물학적 활성 단편은 N-말단 메티오닌 잔기 및 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 HA 에피토프 태그를 포함하는 펩티드에 그의 N-말단에서 임의로 융합된 단편이고, 상기 펩티드에 그의 N-말단에서 임의로 융합된 상기 단편에서 상기 작용제의 EC₅₀ 값은 실시예 10에 따른 전체 세포 아데닐일 시클라제 분석 또는 하기 실시예 11에 따른 HTRF^® 분석에서 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만이다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 생물학적 활성 단편은 N-말단 메티오닌 잔기 및 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 HA 에피토프 태그를 포함하는 펩티드에 그의 N-말단에서 임의로 융합된 단편이고, 상기 펩티드에 그의 N-말단에서 임의로 융합된 상기 단편에서 상기 작용제의 EC₅₀ 값은 실시예 10에 따른 전체 세포 아데닐일 시클라제 분석 또는 하기 실시예 11에 따른 HTRF^® 분석에서 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만이다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 생물학적 활성 단편은 N-말단 메티오닌 잔기 및 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보이는 HA 에피토프 태그를 포함하는 펩티드에 그의 N-말단에서 임의로 융합된 단편이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 수준의 증가를 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다. 특정 실시태양에서, 단편은 본질적으로 N-말단 메티오닌 잔기 및 HA 에피토프 태그로 구성된 펩티드에 그의 N-말단에서 융합된다. N-말단 메티오닌 잔기 및 HA 에피토프 태그를 포함하거나 본질적으로 이로 구성된 펩티드를 폴리펩티드 단편의 N-말단에 융합시키는 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 상업적으로 입수할 수 있다 (예를 들어, 클론테크).

서열 2의 인간 GPR119의 대립유전자 변이체는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 생각된다. 인간 GPR119는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 생각된다.

서열 2의 인간 GPR119의 척추동물 오르토로그인 변이체는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 생각된다. 서열 2의 인간 GPR119의 포유동물 오르토로그인 변이체는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 생각된다. 비제한적인 예로서, 마우스 GPR119 (예를 들어, GenBank® 기탁 번호 AY288423), 래트 GPR119 (GenBank® 기탁 번호 AAN95195), 햄스터 GPR119, 개 GPR119, 및 비-인간 영장류 GPR119가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 생각된다.

특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 GPCR이다.

서열 2에 대해 적어도 약 80％, 적어도 약 85％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％, 적어도 약 96％, 적어도 약 97％, 적어도 약 98％, 또는 적어도 약 99％ 동일성을 갖는 서열 2의 변이체는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 생각된다. 특정 실시태양에서, 서열 2에 대해 적어도 약 80％, 적어도 약 85％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％, 적어도 약 96％, 적어도 약 97％, 적어도 약 98％, 또는 적어도 약 99％ 동일성을 갖는 서열 2의 변이체는 GPCR이다. 일부 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 내인성 GPCR이다. 일부 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 비-내인성 GPCR이다. 일부 실시태양에서, 내인성 GPCR인 서열 2의 변이체는 포유동물 GPCR이다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 화합물 1에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합하고, 여기서 하기 실시예 15에 따른 수용체 결합 분석에서의 IC₅₀ 값은 약 50 μM 미만, 약 25 μM 미만, 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만 또는 약 50 nM 미만이다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합하고, 여기서 하기 실시예 15에 따른 수용체 결합 분석에서의 IC₅₀ 값은 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만 또는 약 50 nM 미만이다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 수용체이고, 상기 작용제의 EC₅₀ 값은 실시예 10에 따른 전체 세포 아데닐일 시클라제 분석 또는 하기 실시예 11에 따른 HTRF^® 분석에서 상기 수용체에서 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만 또는 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만이다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 수용체이고, 상기 작용제의 EC₅₀ 값은 실시예 10에 따른 전체 세포 아데닐일 시클라제 분석 또는 하기 실시예 11에 따른 HTRF^® 분석에서 상기 수용체에서 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만이다. 일부 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 수준의 증가를 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다. 동일성 ％는 공지의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다.

특정 실시태양에서, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 변이체 GPCR은 서열 2에 대해 적어도 약 80％, 적어도 약 85％, 적어도 약 90％, 적어도 약 95％, 적어도 약 96％, 적어도 약 97％, 적어도 약 98％, 또는 적어도 약 99％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어 서열 2에 대해 95％ "동일성"을 갖는 변이체 GPCR은 변이체의 아미노산 서열이 서열 2의 각각의 100개의 아미노산마다 5개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 점을 제외하고는 서열 2의 아미노산 1-335와 동일함을 의미한다. 따라서, 예를 들어 서열 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 95％ 동일성을 갖는 아미노산 서열을 얻기 위해, 서열 2의 아미노산 1-335에 비해 서열 내의 아미노산 잔기 중의 5％ (100개 중의 5개) 이하의 잔기가 삽입되거나, 결실되거나 또는 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 이러한 변경은 아미노 또는 카르복시 말단에서 발생하거나 또는 서열 내의 잔기 중에 종속되거나 또는 서열 내의 하나 이상의 인접한 기에 산재한, 상기 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 발생할 수 있다.

특정 실시태양에서, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 변이체 G 단백질-결합 수용체는 하나 또는 몇 개의 아미노산의 결실, 치환, 및/또는 부가에 의해 서열 2로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 G 단백질-결합 수용체이다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 변이체 G 단백질-결합 수용체는 서열 2의 아미노산 서열 내의 10개 이하의 보존적 아미노산 치환 및/또는 3개 이하의 비-보존적 아미노산 치환에 의해 서열 2로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 G 단백질-결합 수용체이다. 특정 실시태양에서, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘은 서로 보존적으로 치환될 수 있고; 글루탐산 및 아스파르트산은 서로 보존적으로 치환될 수 있고; 글루타민 및 아스파라긴은 서로 보존적으로 치환될 수 있고; 류신, 이소류신 및 발린은 서로 보존적으로 치환될 수 있고; 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 서로 보존적으로 치환될 수 있고; 및 글라이신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메티오닌은 서로 보존적으로 치환될 수 있다. 아미노산 치환, 아미노산 결실, 및 아미노산 부가는 임의의 위치에서 (예를 들어, C- 또는 N-말단, 또는 내부 위치에서) 발생할 수 있다. 일부 실시태양에서, 변이체는 내인성 G 단백질-결합 수용체이다. 일부 실시태양에서, 변이체는 내인성 척추동물 G 단백질-결합 수용체이다. 일부 실시태양에서, 변이체는 내인성 포유동물 G 단백질-결합 수용체이다. 일부 실시태양에서, 변이체는 내인성 인간 G 단백질-결합 수용체이다. 일부 실시태양에서, 변이체는 비-내인성 G 단백질-결합 수용체이다. 일부 실시태양에서, 변이체는 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 수준의 증가를 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다. 특정 실시태양에서, 서열 2로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 상기 G 단백질-결합 수용체는 화합물 1이 그에 대해 리간드인 G 단백질-결합 수용체이다. 특정 실시태양에서, 서열 2로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 상기 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민이 그에 대한 리간드인 상기 G 단백질-결합 수용체이고, 상기 리간드의 하기 실시예 15에 따른 수용체 결합 분석에서의 IC₅₀ 값은 약 50 μM 미만, 약 25 μM 미만, 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만이다. 특정 실시태양에서, 서열 2로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 상기 G 단백질-결합 수용체는 화합물 1이 그에 대해 작용제인 G 단백질-결합 수용체이다. 특정 실시태양에서, 서열 2로부터 유래되는 아미노산 서열을 갖는 상기 G 단백질-결합 수용체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 상기 G 단백질-결합 수용체이고, 실시예 10에 따른 전체 세포 아데닐일 시클라제 분석 또는 하기 실시예 11에 따른 HTRF^® 분석에서 상기 작용제의 EC₅₀ 값은 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만이다.

서열 2의 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 75, 또는 적어도 100개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체인 서열 2의 변이체는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 생각된다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 75, 또는 적어도 100개의 인접한 아미노산을 포함하는 서열 2의 변이체는 GPCR이다. 일부 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 내인성 GPCR이다. 일부 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 비-내인성 GPCR이다. 일부 실시태양에서, 내인성 GPCR인 서열 2의 변이체는 포유동물 GPCR이다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체 화합물 1에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민에 특이적으로 결합하고, 여기서 하기 실시예 15에 따른 수용체 결합 분석에서의 IC₅₀ 값은 약 50 μM 미만, 약 25 μM 미만, 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만 또는 약 50 nM 미만이다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민에 특이적으로 결합하고, 여기서 하기 실시예 15에 따른 수용체 결합 분석에서의 IC₅₀ 값은 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만 또는 약 50 nM 미만이다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 수용체이고, 상기 작용제의 EC₅₀ 값은 실시예 10에 따른 전체 세포 아데닐일 시클라제 분석 또는 하기 실시예 11에 따른 HTRF^® 분석에서 상기 수용체에서 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만 또는 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만이다. 특정 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 수용체이고, 상기 작용제의 EC₅₀ 값은 실시예 10에 따른 전체 세포 아데닐일 시클라제 분석 또는 하기 실시예 11에 따른 HTRF^® 분석에서 상기 수용체에서 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만이다. 일부 실시태양에서, 서열 2의 변이체는 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 수준의 증가를 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 서열 2의 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 75, 또는 적어도 100개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체는 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 수준의 증가를 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 변이체 GPCR은 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR이다. 일부 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 내인성 GPCR이다. 일부 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 비-내인성 GPCR이다. 일부 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고 내인성 GPCR인 GPCR은 포유동물 내인성 GPCR이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 서열 2 또는 그의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 서열 2의 대립유전자이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 서열 2의 오르토로그이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR 화합물 1에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합한다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합하고, 여기서 하기 실시예 15에 따른 수용체 결합 분석에서의 IC₅₀ 값은 약 50 μM 미만, 약 25 μM 미만, 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민에 특이적으로 결합하고, 여기서 하기 실시예 15에 따른 수용체 결합 분석에서의 IC₅₀ 값은 약 10 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 수용체이고, 상기 작용제의 EC₅₀ 값은 실시예 10에 따른 전체 세포 아데닐일 시클라제 분석 또는 하기 실시예 11에 따른 HTRF^® 분석에서 상기 수용체에서 약 5 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만이다. 특정 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리디민-4-일}-아민이 그에 대한 작용제인 수용체이고, 상기 작용제의 EC₅₀ 값은 실시예 10에 따른 전체 세포 아데닐일 시클라제 분석 또는 하기 실시예 11에 따른 HTRF^® 분석에서 상기 수용체에서 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만이다. 일부 실시태양에서, 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 GPCR은 검출가능한 수준의 구성적 활성을 보인다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 수준의 증가를 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다.

혼성화 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 일부 실시태양에서, 엄격한 혼성화 조건은 50％ 포름아미드, 5xSSC (1xSSC = 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10％ 덱스트란 술페이트, 및 20 ㎍/ml의 변성, 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 내에서 42℃에서의 철야 인큐베이션, 이어서 0.1xSSC를 포함하는 용액 내에서 약 65℃에서의 세척을 포함한다. 일부 실시태양에서, 엄격한 혼성화 조건은 50％ 포름아미드, 5xSSC (1xSSC = 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10％ 덱스트란 술페이트, 및 20 ㎍/ml의 변성, 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 내에서 42℃에서의 철야 인큐베이션, 이어서 0.1xSSC/0.1％ SDS (나트륨 도데실 술페이트) 또는 0.2xSSC/0.1％ SDS 내에서 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃ 또는 약 65℃에서의 세척을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 엄격한 조건은 65℃에서 0.1xSSC를 사용한 세척을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 엄격한 조건은 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 또는 약 65℃에서 0.1xSSC/0.1％ SDS 또는 0.2xSSC/0.1％ SDS를 사용한 세척을 포함한다.

일부 실시태양에서, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 GPCR은 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 비-내인성의 구성적으로 활성화된 수용체이고, 여기서 서열 2의 아미노산 위치 224의 류신은 류신 이외의 다른 아미노산으로 치환된다. 일부 실시태양에서, 류신 이외의 다른 아미노산은 라이신이다. 일부 실시태양에서, 류신 이외의 다른 아미노산은 알라닌이다. 일부 실시태양에서, 류신 이외의 다른 아미노산은 아르기닌이다. 일부 실시태양에서, 류신 이외의 다른 아미노산은 히스티딘이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 수준의 증가를 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다.

특정 실시태양에서, 본 발명의 GPCR은 서열 2를 갖는 구성적 활성 버전의 G 단백질-결합 수용체를 포함한다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성 버전의 수용체는 서열 2를 갖는 내인성 구성적 활성 버전이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성 버전의 수용체는 서열 2의 아미노산 위치 224에 돌연변이가 존재하는 비-내인성 구성적 활성 버전이다. 일부 실시태양에서, 돌연변이된 잔기는 류신 이외의 다른 잔기로 돌연변이된다. 일부 실시태양에서, 돌연변이된 잔기는 라이신 잔기로 돌연변이된다. 일부 실시태양에서, 돌연변이된 잔기는 알라닌 잔기로 돌연변이된다. 일부 실시태양에서, 돌연변이된 잔기는 아르기닌 잔기로 돌연변이된다. 일부 실시태양에서, 돌연변이된 잔기는 히스티딘 잔기로 돌연변이된다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 세포내 cAMP 수준의 증가를 위한 것이다. 일부 실시태양에서, 구성적 활성은 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산이 발생하도록 하기 위한 것이다.

특정 실시태양에서, 본 발명의 GPCR은 G 단백질과의 융합 단백질의 일부를 형성한다.

a. 서열 동일성

특정 실시태양에서, 동일성 ％는 당업계에 잘 알려져 있는 [Basic Local Alignment Search Tool] ("BLAST")을 사용하여 평가된다 (예를 들어, 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Karlin and Altschul, Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:2264-2268]; [Altschul et al., J Mol Biol (1990) 215:403-410]; [Altschul et al., Nature Genetics (1993) 3:266-272]; 및 [Altschul et al., Nucleic Acids Res (1997) 25:3389-3402] 참조). BLAST 프로그램은 디폴트 파라미터 또는 사용자에 의해 제공된 변형된 파라미터와 함께 사용될 수 있다. 바람직하게는, 파라미터는 디폴트 파라미터이다.

특정 실시태양에서, 조회 서열 (예를 들어, 서열 2의 아미노산 서열)과 조사되는 서열 사이의 최적의 총 매치를 결정하기 위한 바람직한 방법 (전체적인 서열 정렬로도 언급됨)은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Brutlag et al. (Comp App Biosci (1990) 6:237-245)]의 알고리즘을 기초로 하여 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 서열 정렬에서, 조회 및 조사되는 서열은 모두 아미노산 서열이다. 상기 전체적인 서열 정렬의 결과는 동일성 ％로 제시된다. FASTDB 아미노산 정렬에서 사용되는 바람직한 파라미터는 다음과 같다: 매트릭스=PAM 0, k-tuple=2, 미스매치 페널티 (Mismatch Penalty)=1, 연결 페널티 (Joining Penalty)=20, 무작위 그룹=25, 길이=0, 컷오프 스코어 (Cutoff score)=1, 윈도우 (Window) 크기=서열 길이, 갭 페널티=5, 갭 크기 페널티=0.05, 윈도우 크기=247 또는 조사되는 아미노산 서열의 길이 (이 중에서 더 짧은 것). 조사되는 서열이 내부 결실이 아니라 N- 또는 C-말단 결실에 의해 조회 서열보다 더 짧은 경우, 동일성 ％로 제시되는 결과는 전체적인 동일성 비율을 계산할 때 FASTDB 프로그램이 조사되는 서열의 N- 및 C-말단 절단을 설명하지 못하기 때문에 수동으로 교정하여야 한다. 조회 서열에 비해 N- 및 C-말단에서 절단된 조사되는 서열의 경우, 동일성 비율은 상응하는 조사되는 서열 잔기와 매치/정렬되지 않는, 조사되는 서열의 N- 및 C-말단에 위치하는 조회 서열의 잔기의 수를 조회 서열의 총 염기의 비율로서 계산함으로써 교정된다. 잔기가 매치/정렬되는지의 여부는 FASTDB 서열 정렬의 결과에 의해 결정된다. 이어서, 상기 비율은 최종 동일성 비율 스코어를 얻기 위해 특정 파라미터를 사용하는 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 동일성 비율로부터 차감된다. 상기 최종 동일성 비율 스코어는 본 발명의 목적을 위해 사용되는 것이다. 조회 서열과 매치/정렬되지 않는, 조사되는 서열의 N- 및 C-말단에 위치하는 잔기는 단지 동일성 비율 스코어를 수동으로 조정하기 위한 목적에서 고려된다. 즉, 조사되는 서열의 가장 먼 N- 및 C-말단 잔기 외부에 위치하는 조회 아미노산 잔기는 단지 상기 목적에서 고려된다.

예를 들어, 90개 아미노산 잔기의 조사되는 서열은 동일성 비율을 결정하기 위해서 100개 잔기의 조회 서열과 정렬된다. 결실은 조사되는 서열의 N-말단에서 발생하고, 따라서, FASTDB 정렬은 N-말단에서 제1 잔기와 매치/정렬되지 않는다. 10개의 짝을 이루지 않은 잔기는 서열의 10％ (매치되지 않는 N- 및 C- 말단의 잔기의 수/조회 서열 내의 잔기의 총수)이고, 따라서 10％를 FASTDB 프로그램으로 계산된 동일성 비율 스코어로부터 차감한다. 나머지 90개의 잔기가 정확하게 매칭된다면, 최종 동일성 비율은 90％일 것이다.

다른 예에서, 90개 잔기의 조사되는 서열이 100개 잔기의 조회 서열과 비교된다. 이때 결실이 내부에서 발생하고, 따라서 조회 서열과 매치/일치되지 않는, 조사되는 서열의 N- 또는 C-말단에 잔기가 존재하지 않는다. 이 경우에, FASTDB로 계산된 동일성 비율은 수동으로 교정되지 않는다. 다시, 조회 서열과 매치/일치되지 않는, FASTDB 정렬에서 제시되는 대상 서열의 N- 및 C-말단부 외부의 잔기 위치만이 수동으로 교정된다. 다른 교정은 본 발명의 목적을 위해 실시되지 않는다.

b. 융합 단백질

특정 실시태양에서, 관심있는 폴리펩티드는 융합 단백질이고, 예를 들어 친화도 태그 도메인 또는 리포터 도메인을 함유할 수 있다. 적합한 친화도 태그는 다른 모이어티, 대체로 다른 폴리펩티드, 가장 대체로 항체에 특이적으로 결합된 임의의 아미노산 서열을 포함한다. 적합한 친화도 태그는 당업계에 공지된 바와 같은 에피토프 태그, 예를 들어, V5 태그, FLAG 태그, HA 태그 (헤마글루티닌 인플루엔자 바이러스로부터), myc 태그 등을 포함한다. 또한, 적합한 친화도 태그는 그에 대한 결합 기질이 알려져 있는 도메인, 예를 들어, 당업계에 공지된 바와 같은 HIS, GST 및 MBP 태그, 및 그에 대한 특이적 결합 파트너, 예를 들어, 항체, 특히 모노클로날 항체가 이용가능한 다른 단백질로부터의 도메인을 포함한다. 또한, 적합한 친화도 태그는 임의의 단백질-단백질 상호작용 도메인, 예를 들어 적합한 결합 파트너, 예를 들어 IgG Fc 수용체에 특이적으로 결합되고 이를 사용하여 검출될 수 있는 IgG Fc 구역을 포함한다. 그러한 융합 단백질이, 그의 N-말단 메티오닌 잔기가 결실되거나 다른 아미노산으로 치환된 GPCR에 인-프레임 (in-frame)으로 융합된 이종성 N-말단 도메인 (예를 들어, 에피토프 태그)을 함유할 수 있음이 명백하게 고려된다.

적합한 리포터 도메인은 폴리펩티드의 존재를 보고할 수 있는 임의의 도메인을 포함한다. 친화도 태그가, 예를 들어 태그에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 폴리펩티드의 존재를 보고하기 위해 사용될 수 있음이 이해되지만, 발광 리포터 도메인이 보다 일반적으로 사용된다. 적합한 발광 리포터 도메인은 루시퍼라제 (예를 들어 반딧불이, 바르굴라 (Vargula), 레닐라 레니포르미스 (Renilla reniformis) 또는 레닐라 무엘레리 (Renilla muelleri)로부터의), 또는 그의 발광 변이체를 포함한다. 다른 적합한 리포터 도메인은 형광 단백질 (예를 들어, 해파리, 산호 및 다른 강장동물, 예를 들어 아에쿠오리아 (Aequoria), 레닐라, 프틸로사르쿠스 (Ptilosarcus), 스틸라툴라 (Stylatula) 종으로부터의), 또는 그의 발광 변이체를 포함한다. 상기 리포터 단백질의 발광 변이체는 당업계에 매우 잘 알려져 있고, 천연 리포터 단백질에 비해 더 밝거나, 더 희미하거나, 또는 상이한 여기 및/또는 방출 스펙트럼을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 변이체는 더 이상 녹색이 아니고 청색, 청록색, 황색, 향상된 주황색 (각각 BFP, CFP, YFP, eYFP 및 RFP로 칭함)으로 보이거나 또는 당업계에 공지된 바와 같은 다른 방출 스펙트럼을 갖도록 변경된다. 다른 적합한 리포터 도메인은 생화학적 또는 색깔 변화를 통해 폴리펩티드의 존재를 보고할 수 있는 도메인, 예를 들어 β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 및 분비된 배아 알칼리성 포스파타제를 포함한다.

당업계에 공지된 바와 같이, 친화도 태그 또는 리포터 도메인은 관심있는 폴리펩티드 내의 임의의 위치에 존재할 수 있다. 그러나, 대부분의 실시태양에서, 이들은 관심있는 폴리펩티드의 C- 또는 N-말단부에 존재한다.

2. 관심있는 GPCR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산

핵산을 조작하기 위한 유전자 코드 및 재조합 기술, 및 위에서와 같이 설명된 관심있는 GPCR 폴리펩티드의 아미노산 서열이 공지되어 있으므로, 관심있는 GPCR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 설계 및 생산은 당업자의 기술 내에 있다. 특정 실시태양에서, 표준 재조합 DNA 기술 ([Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995]; [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.]) 방법이 사용된다. 예를 들어, GPCR 코딩 서열은 본원에서 설명될 필요가 없는 다양한 재조합 방법 중 임의의 하나 또는 방법의 조합을 이용하여 GPCR 코딩 서열의 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 단백질을 코딩하는 핵산 서열에서 뉴클레오티드의 후속적인 치환, 결실 및/또는 부가를 또한 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수행할 수 있다.

예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발 및 서브클로닝이 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내에 핵산 잔기를 도입/결실/치환하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시태양에서, PCR을 사용할 수 있다. 또한, 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 전적으로 올리고뉴클레오티드로부터 화학 합성에 의해 제조할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Cello et al., Science (2002) 297:1016-8] 참조).

일부 실시태양에서, 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 코돈은 특정 종, 특히 포유동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 비-인간 영장류, 또는 인간 종의 세포 내에서 발현을 위해 최적화된다. 일부 실시태양에서, 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 코돈은 특정 종, 특히 양서류 종의 세포 내에서 발현을 위해 최적화된다.

a. 벡터

본 발명에서 대상 핵산을 포함하는 벡터 ("구성체"로도 칭함)를 추가로 제공한다. 본 발명의 많은 실시태양에서, 대상 핵산 서열은 서열이 예를 들어, 프로모터를 포함하는 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 후 숙주 내에서 발현될 것이다. 대상 핵산은 또한 대개 에피좀으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합 부분으로서 숙주 세포 내에서 복제할 수 있는 발현 벡터 내에 놓인다. 통상적으로, 발현 벡터는 목적하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출을 허용하기 위해 선택 마커, 예를 들어, 테트라사이클린 또는 네오마이신을 함유할 것이다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 4,704,362 참조). 단일 및 이중 발현 카세트 벡터를 포함하는 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다 ([Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995]; [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.]). 적합한 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체 (인간 인공 염색체, 세균 인공 염색체, 효모 인공 염색체 등), 미니-염색체 등을 포함한다. 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 벡터가 사용될 수 있다.

다양한 발현 벡터가 세포 내에서 관심있는 폴리펩티드를 생산하기 위한 목적에서 당업자에게 이용가능하고, 상업적으로 이용가능한 발현 벡터 (예를 들어, 인비트로겐; 클론테크; 스트라타젠)를 포함한다. 상업적으로 이용가능한 발현 벡터는 비제한적인 예로서 CMV 프로모터-기반 벡터를 포함한다. 하나의 적합한 발현 벡터는 pCMV이다. 발현 벡터는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 예시적인 아데노바이러스 벡터는 큐바이오진 (Qbiogene, 미국 캘리포니아주 칼스바드)로부터 AdEasy™으로서 구입할 수 있다 (각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [He TC et al, Proc Natl Acad Sci USA (1998) 95:2509-2514]; 및 미국 특허 5,922,576). 다른 적합한 발현 벡터는 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다.

대상 핵산은 대체로 관심있는 대상 폴리펩티드를 코딩하는 단일 개방 판독 프레임을 포함하지만, 특정 실시태양에서, 관심있는 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주 세포가 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포일 수 있으므로, 개방 판독 프레임에는 인트론이 개재할 수 있다. 대상 핵산은 대개 대상 핵산에 추가로 RNA 안정성, 번역 효율 등을 유도할 수 있는 3' 및 5' 비번역 구역 (UTR)을 함유할 수 있는 전사 단위의 일부이다. 대상 핵산은 또한 대상 핵산에 추가로 폴리펩티드의 전사 및 발현을 유도하는 프로모터, 및 전사 종결인자를 함유하는 발현 카세트의 일부일 수 있다.

바이러스 프로모터 및 진핵 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함한 진핵 프로모터는 진핵 숙주 세포 내에서 기능성인 임의의 프로모터일 수 있다. 예시적인 진핵 프로모터는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 마우스 메탈로티오네인 I 유전자 서열의 프로모터 (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288, 1982); 헤르페스 (Herpes) 바이러스의 TK 프로모터 (McKnight, Cell 31:355-365, 1982); SV40 조기 프로모터 (Benoist et al., Nature (London) 290:304-310, 1981); 효모 gal1 유전자 서열 프로모터 ([Johnston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:6971-6975, 1982]; [Silver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:5951-59SS, 1984]), CMV 프로모터, EF-1 프로모터, 엑디손-반응성 프로모터(들), 테트라사이클린-반응성 프로모터 등. 바이러스 프로모터가 일반적으로 특히 강한 프로모터이므로 특히 중요할 수 있다. 특정 실시태양에서, 표적 병원체의 프로모터인 프로모터가 사용된다. 본 발명에서 사용하기 위한 프로모터는 그들이 도입되는 세포 종류 (및/또는 동물) 내에서 기능성이도록 선택된다. 특정 실시태양에서, 프로모터는 CMV 프로모터이다.

특정 실시태양에서, 대상 벡터는 또한 선택가능한 마커의 발현을 제공할 수 있다. 적합한 벡터 및 선택가능한 마커는 문헌 ([Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995] 및 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제3 Edition, (2001) Cold Spring Harbor, N.Y.])에 논의된 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다. 다양한 상이한 유전자가 선택가능한 마커로서 사용되었고, 편의상 선택가능한 마커로서 대상 벡터에서 사용된 특정 유전자가 주로 선택된다. 공지의 선택가능한 마커 유전자는 티미딘 키나제 유전자, 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자, CAD, 아데노신 데아미나제 유전자, 아스파라긴 신테타제 유전자, 항생제 내성 유전자, 예를 들어 tetr, ampr, Cmr 또는 cat, kanr 또는 neor (아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자), 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자 등을 포함한다.

상기 언급한 바와 같이, 관심있는 폴리펩티드는 친화도 도메인 및/또는 리포터 도메인을 함유하는 융합 단백질일 수 있다. 리포터 또는 태그와 예를 들어, GPCR의 C- 또는 N-말단에서 GPCR 사이에 융합체를 제조하기 위한 방법은 당업자의 기술 내에 있고 (예를 들어 문헌 [McLean et al, Mol. Pharma. Mol Pharmacol. 1999 56:1182-91]; [Ramsay et al., Br. J. Pharmacology, 2001, 315-323]), 임의로 추가로 설명하지 않을 것이다. 그러한 융합 단백질이, 그의 N-말단 메티오닌 잔기가 결실되거나 다른 아미노산으로 치환된 GPCR과 인-프레임으로 융합된 이종성 N-말단 도메인 (예를 들어, 에피토프 태그)을 함유할 수 있음이 명백하게 고려된다. 관심있는 폴리펩티드는 먼저 천연 폴리펩티드로부터 제조된 후 상기 설명된 바와 같이 적합한 리포터/태그에 작동가능하게 연결될 수 있음이 이해된다.

대상 핵산은 대체로 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 제조를 용이하게 하기 위해, 제한 부위, 다중 클로닝 부위, 프라이머 결합 부위, 라이게이션가능한 단부, 재조합 부위 등을 또한 함유할 수 있다.

b. 숙주 세포

본 발명은 대상 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 적합한 숙주 세포는 원핵, 예를 들어 세균 세포 (예를 들어 이. 콜라이 (E. coli)), 및 진핵 세포, 예를 들어 동물 세포 (예를 들어 곤충, 포유동물, 어류, 양서류, 조류 또는 파충류 세포), 식물 세포 (예를 들어 옥수수 또는 아라비돕시스 (Arabidopsis) 세포), 또는 진균 세포 (예를 들어 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae) 세포)를 포함한다. 특정 실시태양에서, 관심있는 폴리펩티드-코딩 핵산의 발현에 적합한 임의의 세포가 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 대체로, 동물 숙주 세포주가 사용되고, 그 예는 다음과 같다: 원숭이 신장 세포 (COS 세포), SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CVI 세포 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포 (HEK-293 ["293"], [Graham et al. J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); HEK-293T ["293T"] 세포; 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO, [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216, (1980)]); 시리아 (Syrian) 골든 햄스터 세포 MCB3901 (ATCC CRL-9595); 마우스 세르톨리 (sertoli) 세포 (TM4, [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CVI ATCC CCL 70); 아프리카 초록 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci 383:44-68 (1982)); NIH/3T3 세포 (ATCC CRL-1658); 및 마우스 L 세포 (ATCC CCL-1). 특정 실시태양에서, 멜라닌 보유 세포가 사용된다. 멜라닌 보유 세포는 하등 척추동물에서 발견되는 피부 세포이다. 관련 물질 및 방법은 미국 특허 5,462,856 및 미국 특허 6,051,386의 개시내용에 따를 것이다. 이들 특허 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

추가의 세포주는 당업자에게 쉽게 명백해질 것이고, 매우 다양한 세포주가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 이용가능하다.

C. 후보 화합물의 스크리닝

1. 포괄적 GPCR 스크리닝 분석 기술

G 단백질 수용체가 활성 상태로 될 때, 이는 G 단백질 (예를 들어, Gq, Gs, Gi, Gz, Go)에 결합하고, G 단백질에 대한 GTP의 결합을 자극한다. 이어서, G 단백질은 GTPase로서 작용하고, GTP를 GDP로 서서히 가수분해하고, 그에 의해 수용체는 정상 조건 하에 탈활성화된다. 그러나, 활성화된 수용체는 계속하여 GDP를 GTP로 교환한다. GTP의 비-가수분해가능한 유사체인 [³⁵S]GTPγS를 사용하여 활성화된 수용체를 발현하는 막에 대한 향상된 결합을 모니터링할 수 있다. [³⁵S]GTPγS는 리간드의 부재 및 존재 하에 막에 대한 G 단백질 결합을 모니터링하기 위해 사용될 수 있음이 보고되었다. 당업계에서 잘 공지되고 이용가능한 다른 예 중에서 상기 모니터링의 예는 문헌 [Traynor and Nahorski in 1995]에서 보고되었다. 상기 분석 시스템의 바람직한 용도는 시스템이 수용체의 세포내 도메인과 상호작용하는 특정 G 단백질에 무관하게 모든 G 단백질-결합 수용체에 포괄적으로 적용가능하기 때문에 후보 화합물의 초기 스크리닝을 위한 것이다.

2. 특이적 GPCR 스크리닝 분석 기술

일단 후보 화합물이 "포괄적" G 단백질-결합 수용체 분석 (즉, 작용제 또는 역작용제인 화합물을 선택하기 위한 분석)을 이용하여 확인되면, 일부 실시태양에서 화합물이 수용체 부위에서 상호작용하는지 확인하기 위한 추가의 스크리닝이 바람직하다. 예를 들어, "포괄적" 분석에 의해 확인된 화합물은 수용체에 결합하지 않을 수 있지만, 대신에 단지 세포내 도메인으로부터 G 단백질을 "분리 (uncouple)"시킬 수 있다.

a. Gs , Gz 및 Gi .

Gs는 효소 아데닐일 시클라제를 자극한다. 그 반면에, Gi (및 Gz 및 Go)는 아데닐일 시클라제를 억제한다. 아데닐일 시클라제는 ATP의 cAMP로의 전환을 촉매하여; Gs 단백질에 결합하는 활성화된 GPCR은 cAMP의 증가된 세포내 수준과 연관된다. 그 반면에, Gi (또는 Gz, Go) 단백질에 결합하는 활성화된 GPCR은 cAMP의 감소된 세포내 수준과 연관된다 (일반적으로, 문헌 ["Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission," Chpt. 8, From Neuron To Brain (3^rd Ed.) Nichols, J.G. et al eds. Sinauer Associates, Inc. (1992)] 참조). 따라서, cAMP를 검출하는 분석을 후보 화합물이 예를 들어 수용체에 대한 역작용제인지 (즉, 그러한 화합물이 cAMP의 수준을 감소시킬 것인지) 결정하기 위해 이용할 수 있다. cAMP를 측정하기 위해 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있고; 일부 실시태양에서 바람직한 방안은 ELISA-기반 형식에서 항-cAMP 항체의 사용에 의존한다. 이용할 수 있는 다른 종류의 분석은 전체 세포 제2 메신저 리포터 시스템 분석이다. 유전자 상의 프로모터는 특정 유전자가 코딩하는 단백질의 발현을 추진시킨다. 시클릭 AMP는 cAMP-반응성 DNA 결합 단백질 또는 전사 인자 (CREB)의 결합을 촉진하여, cAMP 반응 요소로 불리는 특이적 부위에서 프로모터에 결합하고 유전자의 발현을 추진시킴으로써 유전자 발현을 추진시킨다. 리포터 유전자, 예를 들어, β-갈락토시다제 또는 루시퍼라제 전에 다수의 cAMP 반응 요소를 함유하는 프로모터를 갖는 리포터 시스템이 제작될 수 있다. 따라서, 활성화된 Gs-연결 수용체는 cAMP의 축적 (이는 이후 유전자를 활성화시킨다) 및 리포터 단백질의 발현을 일으킨다. 이어서, β-갈락토시다제 또는 루시퍼라제와 같은 리포터 단백질은 표준 생화학 분석을 이용하여 검출할 수 있다 (Chen et al. 1995).

b. Go 및 Gq .

Gq 및 Go는 인지질 PIP₂를 가수분해하여 2개의 세포내 메신저, 즉 디아실글리세롤 (DAG) 및 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트 (IP₃)를 방출하는 효소 포스포리파제 C의 활성화와 연관된다. IP₃ 축적의 증가는 Gq- 및 Go-회합 수용체의 활성화와 연관된다 (일반적으로 문헌 ["Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission," Chpt. 8, From Neuron To Brain (3^rd Ed.) Nichols, J.G. et al eds. Sinauer Associates, Inc. (1992)] 참조). IP₃ 축적을 검출하는 분석은 후보 화합물이 예를 들어 Gq- 또는 Go-회합 수용체에 대한 역작용제인지 (즉, 그러한 화합물이 IP₃의 수준을 감소시킬 것인지) 결정하기 위해 이용될 수 있다. Gq-회합 수용체는 또한 AP1 리포터 분석을 이용하여 검사할 수 있고, 여기서 Gq-의존 포스포리파제 C는 AP1 요소를 함유하는 유전자의 활성화를 일으키고; 따라서, 활성화된 Gq-회합 수용체는 상기 유전자의 발현의 증가를 입증할 것이고, 그에 의해 그에 대한 역작용제는 그러한 발현의 감소를 입증할 것이고, 작용제는 그러한 발현의 증가를 입증할 것이다. 상기 검출을 위한 상업적으로 이용가능한 분석이 이용가능하다.

3. GPCR 융합 단백질

역작용제 또는 작용제의 직접 확인을 위한 후보 화합물의 스크리닝에서 사용하기 위한 내인성의 구성적 활성 GPCR 또는 비-내인성의 구성적으로 활성화된 GPCR의 용도는 흥미로운 스크리닝 대상을 제공하고, 여기서 정의 상, 수용체는 그에 결합된 내인성 리간드의 부재 하에서도 활성이다. 따라서, 후보 화합물이 역작용제 또는 작용제인지 그러한 수용체에 대해 효과를 갖지 않는지 여부에 대한 이해를 허용하기 위한 목적에서, 예를 들어 후보 화합물의 존재 하에 비-내인성 수용체 및 그 화합물의 부재 하에 비-내인성 수용체 사이를 구분하기 위해, 일부 실시태양에서, 상기 구분을 향상시킬 수 있는 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 일부 실시태양에서, 바람직한 방법은 GPCR 융합 단백질의 사용이다.

일반적으로, 일단 비-내인성 GPCR이 상기 기재된 분석 기술 (및 당업자에게 공지된 다른 것)을 이용하여 구성적으로 활성화되는 것으로 결정되면, 내인성 GPCR과 결합하는 우세한 G 단백질을 결정하는 것이 가능하다. GPCR에 대한 G 단백질의 결합은 평가될 수 있는 신호전달 경로를 제공한다. 일부 실시태양에서, 스크리닝은 포유동물 또는 멜라닌 보유 세포 발현 시스템을 사용하여 일어나는 것이 바람직하고, 이는 그러한 시스템이 내부에 내인성 G 단백질을 갖는 것으로 예상될 것이기 때문이다. 따라서, 정의 상, 그러한 시스템에서, 비-내인성의 구성적으로 활성화된 GPCR은 연속적으로 신호를 발생시킬 것이다. 일부 실시태양에서, 예를 들어, 수용체에 대한 역작용제의 존재 하에, 특히 스크리닝의 배경에서, 역작용제와 접촉될 때 수용체 사이를 보다 쉽게 구분할 수 있도록 상기 신호가 향상되는 것이 바람직하다.

GPCR 융합 단백질은 GPCR과 G 단백질 결합의 효능을 향상시키도록 의도된다. GPCR 융합 단백질은 내인성의 구성적 활성 GPCR 또는 비-내인성의 구성적으로 활성화된 GPCR을 사용한 스크리닝을 위해 바람직할 수 있고, 이는 그러한 방안이 상기 스크리닝 기술에서 생성되는 신호를 증가시키기 때문이다. 이는 유의한 "신호 대 소음" 비를 촉진하는데 중요하고; 그러한 유의한 비는 본원에 개시되는 후보 화합물의 스크리닝을 위해 바람직하다.

GPCR 융합 단백질의 발현을 위해 유용한 구성체의 제작은 당업자의 능력 범위 내에 있다. 상업적으로 이용가능한 발현 벡터 및 시스템은 조사자의 특정 필요에 맞출 수 있는 다양한 방법을 제공한다. 상기 GPCR 융합 단백질 구성체의 제작에서 중요한 기준은 GPCR 서열 및 G 단백질 서열 모두가 인-프레임으로 존재하고 (바람직하게는, 내인성 GPCR에 대한 서열이 G 단백질 서열의 상류에 있다), GPCR의 발현시에 G 단백질이 또한 발현될 수 있도록 GPCR의 "중지" 코돈이 결실 또는 교체되는 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다. GPCR은 G 단백질에 직접 연결될 수 있거나, 둘 사이에 스페이서 (spacer) 잔기 (수는 당업자가 쉽게 확인할 수 있지만 바람직하게는 약 12개 이하)가 존재할 수 있다. 편의성에 기초하여, 스페이서를 사용하는 것이 바람직하다. 일부 실시태양에서, 비-내인성 GPCR에 결합하는 G 단백질은 GPCR 융합 단백질 구성체의 생성 전에 확인되는 것이 바람직하다.

상기한 바와 같이, Gi, Gz 및 Go에 결합하는 활성화된 GPCR은 cAMP의 형성을 억제하는 것으로 예상되고, 이는 이들 종류의 GPCR에 기반한 분석을 도전받도록 한다 (즉, cAMP 신호는 활성화 시에 감소하여, 예를 들어, 작용제 (상기 신호를 더욱 감소시킬)의 직접 확인을 도전받도록 한다). 본원에 개시되는 바와 같이, 이들 종류의 수용체에 대해, 실행가능한 시클라제-기반 분석을 확립하기 위한 노력에서 GPCR의 내인성 G 단백질에 기반하지 않은 GPCR 융합 단백질을 생성하는 것이 가능한 것으로 확인되었다. 따라서, 예를 들어, 내인성 Gi 결합 수용체는 Gs 단백질에 융합될 수 있고, 상기한 융합 구성체는 발현 시에 내인성 GPCR을 "천연" Gi 단백질보다는, 예를 들어 Gs와 결합하도록 "추진하거나" "강제하고", 따라서 시클라제-기반 분석이 확립될 수 있다. 따라서, Gi, Gz 및 Go 결합 수용체에 대해, 일부 실시태양에서 GPCR 융합 단백질이 사용되고, 분석이 아데닐일 시클라제 활성의 검출에 기반할 때, 융합 구성체가 Gs (또는 효소 아데닐일 시클라제의 형성을 자극하는 동등한 G 단백질)를 사용하여 확립되는 것이 바람직하다.

<표 C>

Gs, Gi, Gz 또는 Go 단백질과 융합된 Gq 단백질을 이용하는 G 단백질 융합 구성체가 동일하게 효과적이다. 일부 실시태양에서, 바람직한 융합 구성체는 Gq 단백질을 사용하여 달성할 수 있고, 여기서 G-단백질 α-하위단위 ("Gαq")의 처음 6개의 아미노산이 결실되고 Gαq의 C-말단 단부에서 마지막 5개의 아미노산이 관심있는 G 단백질의 Gα의 상응하는 아미노산으로 교체된다. 예를 들어, 융합 구성체는 Gi 단백질과 융합된 Gq (6개 아미노산 결실)를 가질 수 있어서, "Gq/Gi 융합 구성체"를 생성할 수 있다. 상기 융합 구성체는 내인성 Gi 결합 수용체를 그의 비-내인성 G 단백질, Gq에 결합시킬 것이고, 따라서 제2 메신저, 예를 들어, 이노시톨 트리포스페이트 또는 디아실글리세롤이 cAMP 생산 대신에 측정될 수 있다.

4. 신호- 향상제 ( enhancer ) Gs 결합 GPCR 을 사용한 표적 Gi 결합 GPCR 의 동시-형질감염 ( cAMP 기반 분석)

Gi 결합 수용체는 아데닐일 시클라제를 억제하고, 따라서, cAMP 생산 수준을 감소시키는 것으로 알려져 있고, 이는 cAMP 수준의 평가를 도전받도록 만들 수 있다. 특정 실시태양에서, 활성화 시에 Gi에 우세하게 결합하는 수용체의 활성화의 표시로서 cAMP의 생산 감소를 측정하는데 효과적인 기술은 신호 향상제, 예를 들어, 활성화 시에 Gs에 우세하게 결합하는 비-내인성의 구성적으로 활성화된 수용체 (예를 들어, TSHR-A623I; 아래 참조)를 Gi 연결 GPCR로 동시-형질감염시킴으로써 달성할 수 있다. 명백한 바와 같이, Gs 결합 수용체의 활성화는 cAMP의 생산 증가에 기초하여 결정할 수 있다. Gi 결합 수용체의 활성화는 cAMP 생산의 감소를 일으킨다. 따라서, 동시-형질감염 방안은 이들 "반대" 효과를 유리하게 활용하기 위해 의도된다. 예를 들어, 비-내인성의 구성적으로 활성화된 Gs 결합 수용체 ("신호 향상제")를 발현 벡터만으로 동시-형질감염시키면 기준선 cAMP 신호를 제공한다 (즉, Gi 결합 수용체는 cAMP 수준을 감소시킬 것이지만, 상기 "감소"는 구성적으로 활성화된 Gs 결합 신호 향상제에 의해 확립된 cAMP 수준의 실질적인 증가에 대해 상대적일 것이다). 이어서, 신호 향상제를 "표적 수용체"로 동시-형질감염시킴으로써, Gi 결합 표적 수용체의 역작용제는 측정된 cAMP 신호를 증가시킬 반면, Gi 결합 표적 수용체의 작용제는 상기 신호를 감소시킬 것이다.

상기 방법을 이용하여 직접 확인되는 후보 화합물은 이들이 신호 향상 수용체를 표적화하지 않도록 보장하기 위해 독립적으로 평가될 수 있다 (이는 동시-형질감염된 수용체에 대해 스크리닝하기 전에 또는 스크리닝한 후에 시행될 수 있다).

조성물/제형 및 치료 방법

본 발명의 화합물, 예를 들어 GPR119 작용제, PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물은 당업계에 잘 알려진 기술을 이용하여 본 발명에 따라 사용하기 위한 제약 조성물 및 의약으로 제형화될 수 있다. 적합한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 결정된다. 특정 실시태양에서, 상기 투여는 비-인간 척추동물 또는 비-인간 포유동물에게 시행된다.

본 발명의 요법, 즉, GPR119 작용제에 관한 요법에 관련하여, 본 발명에 따른 화합물은 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 적합한 투여 경로는 경구, 코, 직장, 경점막, 경피, 또는 장 투여, 비경구 전달, 예를 들어 근육내, 피하, 골수내 주사뿐만 아니라 당업계에 공지된 방법을 이용하는 경막내, 직접 뇌실내, 정맥내, 복강내, 코 내, 폐내 (흡입된) 또는 눈 내 주사를 포함한다. 다른 적합한 투여 경로는 에어로졸 및 데포 (depot) 제형이다. 본 발명의 의약의 지속 방출 제형, 특히 데포가 명백하게 고려된다. 특정한 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 화합물은 경구 투여된다. 본 발명에 따른 화합물은 고체 또는 액체 형태, 예를 들어 정제, 캡슐, 분말, 시럽, 엘릭시르 등, 에어로졸, 멸균 용액, 현탁액 또는 에멀젼 등으로 제조될 수 있다. 특정 실시태양에서, GPR119 작용제는 경구 투여된다.

특정한 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 화합물, 예를 들어 GPR119 작용제는 경구 투여된다. 특정한 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 화합물, 예를 들어 GPR119 작용제는 내장 장내분비 세포에서 PYY 분비의 자극을 허용하는 방식으로 투여된다. 특정한 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 화합물, 예를 들어 GPR119 작용제는 내장 장내분비 세포에서 PYY 분비의 자극을 허용하는 방식으로 경구 투여된다.

특정한 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 화합물, 예를 들어 PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물은 경구 투여된다. 특정한 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 화합물, 예를 들어 GPR119 작용제는 내장 장내분비 세포에서 PYY 분비의 자극을 허용하는 방식으로 투여된다. 특정한 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 화합물, 예를 들어 GPR119 작용제는 내장 장내분비 세포에서 PYY 분비의 자극을 허용하는 방식으로 경구 투여된다.

경구 투여용 제형은 고체 정제 및 캡슐 제형에 추가로 수성 용액 및 현탁액 형태일 수 있다. 수성 용액 및 현탁액은 멸균 분말 또는 과립으로부터 제조할 수 있다. 화합물을 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 옥수수 기름, 면실유, 땅콩 기름, 참기름, 벤질 알콜, 염화나트륨 및/또는 다양한 버퍼에 용해할 수 있다. 다른 보조제는 당업계에 널리 공지되어 있다.

GPR119 작용제의 제약 조성물은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해, 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 (dragee)-제조, 연화 (levigating), 유화, 캡슐화, 포집 (entrapping), 동결 공정 또는 분무 건조에 의해 제조할 수 있다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 제약 조성물은 제약상 사용될 수 있는 제제로 활성 화합물의 가공을 용이하게 하는, 부형제 및 보조제를 포함한 하나 이상의 생리학상 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 수단으로 제형화될 수 있다. 적합한 제약상 허용되는 담체는 당업계에서 이용가능하다 (예를 들어, 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 ([Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (Gennaro et al., eds.), 20^th Edition, 2000, Lippincott Williams & Wilkins]; 및 [Handbook of Pharmaceutical Excipients (Rowe et al., eds), 4^th Edition, 2003, Pharmaceutical Press]) 참조). 적합한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 결정된다. 용어 "담체" 물질 또는 "부형제" 물질은 본원에서 대상에 치료제 전달을 위해 담체 및/또는 희석제 및/또는 보조제, 또는 비히클로서 사용되거나, 그의 취급 또는 저장 특성을 개선하도록 또는 경구 투여에 적합한 캡슐 또는 정제와 같은 개별 품목으로 조성물의 용량 단위의 형성을 허용 또는 촉진하도록 제약 조성물에 첨가된, 치료제 자체가 아닌 임의의 물질을 의미한다. 부형제는 비제한적인 예로서 희석제, 붕해제, 결합제, 접착제, 습윤제, 중합체, 윤활제, 활택제, 유쾌하지 않은 맛 또는 냄새를 차단하거나 대응하기 위해 첨가되는 물질, 향미제, 염료, 방향제, 및 조성물의 외관 개선을 위해 첨가되는 물질을 포함할 수 있다. 허용되는 부형제는 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 산화마그네슘, 인산 및 황산의 나트륨 및 칼슘염, 탄산마그네슘, 탈크, 젤라틴, 아카시아검, 알긴산나트륨, 펙틴, 덱스트린, 만니톨, 소르비톨, 락토스, 수크로스, 전분, 젤라틴, 셀룰로직 물질, 예를 들어 알칸산의 셀룰로스 에스테르, 및 셀룰로스 알킬 에스테르, 저융점 왁스 코코아 버터 또는 분말, 중합체, 예를 들어 폴리비닐-피롤리돈, 폴리비닐 알콜 및 폴리에틸렌 글리콜, 및 다른 제약상 허용되는 물질을 포함한다. 제약 조성물의 성분들은 편리한 투여를 위해 캡슐화 또는 정제화될 수 있다.

"제약상 허용되는"은 약리학적/독성학적 관점에서 환자에게, 및 조성물, 제형화, 안정성, 환자 허용성 및 생체이용률에 관한 물리적/화학적 관점에서 제조 제약 화학자에게 허용되는 특성 및/또는 물질을 나타낸다.

당의정 코어에 적합한 코팅을 제공한다. 상기 목적을 위해, 임의로 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화티탄, 래커 (lacquer) 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 농축 당 용액을 사용할 수 있다. 염료 또는 색소가 확인을 위해 또는 활성 화합물 용량의 상이한 조합을 특성화하기 위해 정제 또는 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.

경구로 사용될 수 있는 제약 조성물은 젤라틴으로 제조된 푸시-핏 (push-fit) 캡슐, 및 젤라틴 및 가소제, 예를 들어 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸시-핏 캡슐은 활성 성분을 충전제, 예를 들어 락토스, 결합제, 예를 들어 전분, 및/또는 윤활제, 예를 들어 탈크 또는 스테아르산마그네슘 및 임의로 안정화제와의 혼합물로 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 적합한 액체, 예를 들어 지방 오일, 액체 파라핀, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 크레모포르 (cremophor), 캅뮬 (capmul), 중쇄 또는 장쇄 모노-, 디- 또는 트리글리세리드 내에 용해되거나 현탁될 수 있다. 안정화제가 또한 이들 제형에 첨가될 수 있다.

추가로, GPR119 작용제는 지속 방출 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 다양한 지속 방출 물질이 확립되었고 당업자에게 잘 알려져 있다. 지속 방출 정제 또는 캡슐이 특히 바람직하다. 예를 들어, 시간 지연 물질, 예를 들어 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 사용할 수 있다. 투여 형태는 또한 제어 방출을 위한 삼투성 치료 정제를 형성하도록 미국 특허 4,256,108, 4,166,452, 및 4,265,874에 기재된 기술에 의해 코팅될 수 있다.

본 발명의 요법, 즉, GPR119 작용제에 관련한 요법은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 제약상 또는 생리학상 허용되는 화합물과 조합으로 투여되거나 제공될 수 있음이 명백하게 고려된다. 본 발명의 한 측면에서, 다른 제약상 또는 생리학상 허용되는 화합물은 GPR119 작용제가 아니다. 본 발명의 한 측면에서, 다른 제약상 또는 생리학상 허용되는 화합물은 칼슘, 비타민 D, 에스트로겐, 티볼론, 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM; 예를 들어, 랄록시펜, 타목시펜), 비포스포네이트 (예를 들어, 에티드로네이트, 알렌드로네이트, 리세드로네이트), 칼시토닌, 비타민 D의 1α-히드록실화 대사물질, 플루오라이드, 티아지드, 동화 스테로이드, 이프리플라본, 비타민 K, 부갑상선 호르몬 (PTH), 스트론튬, 스타틴, 오스테오프로테레린, EP4 수용체 선택적 작용제, 대마초제제 수용체 타입 2 (CB2) 선택적 작용제, 및 p38 MAP 키나제 억제제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 제약 물질이다 (예를 들어, 문헌 [World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis] 참조).

한 측면에서, 본 발명은 일정량의 본 발명에 따른 GPR119 작용제를 포함하거나 본질적으로 그로 이루어지는 조성물에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 일정량의 본 발명에 따른 GPR119 작용제 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체를 포함하거나 본질적으로 그로 이루어지는 제약 조성물에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 일정량의 본 발명에 따른 GPR119 작용제를 포함하거나 본질적으로 그로 이루어지는 조성물에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 일정량의 본 발명에 따른 GPR119 작용제 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체를 포함하거나 본질적으로 그로 이루어지는 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 GPR119 작용제, PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물이 개체에서 PYY 수준, 예를 들어 혈장 총 PYY 수준 또는 혈장 PYY₃ _-36 수준을 증가시키기 위해 충분한 양으로 존재하는 조성물 또는 제약 조성물의 투여 형태에 관한 것이다. 본 발명은 또한 GPR119 작용제가 개체에서 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태, 예를 들어 골다공증을 치료 또는 예방하는데, 및/또는 골 질량을 증가시키는데 효과를 제공하기 위해 충분한 양으로 존재하는 조성물 또는 제약 조성물의 투여 형태에 관한 것이다.

한 측면에서, 본 발명은 일정량의 본 발명에 따른 GPR119 작용제를 포함하거나 본질적으로 그로 이루어지는 조성물에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 일정량의 본 발명에 따른 GPR119 작용제 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체를 포함하거나 본질적으로 그로 이루어지는 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 GPR119 작용제가 개체에서 PYY 수준을 증가시키는데 효과를 제공하기에 충분한 양으로 존재하는 조성물 또는 제약 조성물의 투여 형태에 관한 것이다. 본 발명은 또한 GPR119 작용제가 개체에서 총 PYY (PYY₁ _-36 및 PYY₃ _-36 포함) 수준을 증가시키는데 효과를 제공하기에 충분한 양으로 존재하는 조성물 또는 제약 조성물의 투여 형태에 관한 것이다. 본 발명은 또한 GPR119 작용제가 개체에서 PYY₃ _-36 수준을 증가시키는데 효과를 제공하기에 충분한 양으로 존재하는 조성물 또는 제약 조성물의 투여 형태에 관한 것이다.

본 발명에서 사용하기 위해 적합한 제약 조성물은 활성 성분이 그들의 의도된 목적을 달성하기 위한 양으로 함유되는 조성물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 제약 조성물은 PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방을 위해 유용한 것으로 이해된다. PYY에 의해 조절되는 병태는 본 발명에 따른다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 제약 조성물은 개체에서 PYY 수준을 증가시키기 위해 유용한 것으로 이해된다. 본 발명에 관련하여, 본 발명에 따른 의도된 목적을 달성하기 위해 충분한 GPR119 작용제의 양의 결정은 특히 본원에 제공되는 상세한 개시문에 비추어 당업자의 능력 내에 있다.

마우스, 래트, 토끼, 돼지, 및 비-인간 영장류를 사용하는 연구를 포함하고 이로 제한되지 않는 동물 연구로부터 얻은 데이타는 인간에 사용하기 위해 투여량 범위를 만드는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 당업자는 동물 모델 시스템에서 얻은 생체내 데이타를 다른 것, 예를 들어 인간에 대해 외삽하는 방법을 이해한다. 일부 상황에서, 이들 외삽은 다른 것, 예를 들어 인간에 비교하여 단지 동물 모델의 체중에 기초할 수 있고; 다른 상황에서, 이들 외삽은 단순히 체중에 기초하는 것이 아니라, 다양한 인자를 포함한다. 대표적인 인자는 환자의 종류, 연령, 체중, 성별, 식이 및 의학 상태, 질병의 중증도, 투여 경로, 약물학적 고려사항, 예를 들어 사용된 특정 화합물의 활성, 효능, 약동학 및 독성학 프로파일, 약물 전달 시스템이 이용되는지 여부, 급성 또는 만성 질병 상태가 치료되는지 또는 예방이 수행되는지 여부, 또는 본 발명의 화합물에 추가로 및 약물 조합의 일부로서 추가의 활성 화합물이 투여되는지 여부를 포함한다. 본 발명의 화합물 및/또는 조성물을 사용하여 질병 상태를 치료하기 위한 투여량 요법은 상기 나열한 다양한 인자에 따라 선택된다. 따라서, 사용된 실제 투여량 요법은 넓게 변할 수 있고, 따라서 바람직한 투여 요법으로부터 벗어날 수 있고, 당업자는 이들 전형적인 범위를 벗어난 투여량 및 투여량 요법이 시험될 수 있고, 적절한 경우에 본 발명의 방법에서 사용될 수 있음을 알 것이다.

예시적인 동물 모델 시스템은 래트 난소절제 (OVX) 뼈 손실 모델이다. 난소절제한 래트는 에스트로겐 결핍된 인간 골격의 중요한 임상 특징 및 치료제의 반응을 정확하게 모방하는 뛰어난 전임상 동물 모델이다. 상기 모델에서, 치료 효능은 난소절제와 연관된 뼈 손실이 부분적으로 또는 완전히 방지될 때 달성된다 (예를 들어, 문헌 ([Bollag et al, Mol Cell Endocrinol (2001) 177:35-41]; 및 [Jee et al, J Musculoskel Neuron Interact (2001) 1:193-207]) 참조). 특정 실시태양에서, 치료 효능은 난소절제와 연관된 뼈 손실이 적어도 약 10％ 방지, 적어도 약 20％ 방지, 적어도 약 30％ 방지, 적어도 약 40％ 방지, 적어도 약 50％ 방지, 적어도 약 60％ 방지, 적어도 약 70％ 방지, 적어도 약 75％ 방지, 적어도 약 80％ 방지, 적어도 약 85％ 방지, 적어도 약 90％ 방지, 적어도 약 95％ 방지, 또는 100％ 방지될 때 달성된다.

추가의 예시적인 동물 모델 시스템은 마우스에서 포도당 부하 후 혈액 PYY 수준의 증가이다. 특정 실시태양에서, 혈액 PYY 수준은 혈장 PYY 수준이다. 특정 실시태양에서, PYY 수준은 포도당-독립적 PYY 수준이다. 특정 실시태양에서, PYY 수준은 포도당-의존성 PYY 수준이다. 특정 실시태양에서, PYY는 PYY₁ _-36 및 PYY_3-36을 포함한 총 PYY이다. 특정 실시태양에서, PYY는 PYY₃ _-36이다. 설치류 또는 인간에서 총 PYY 또는 PYY₃ _-36를 측정하기 위한 키트는 예를 들어 피닉스 파마슈티칼스, 인크. (Phoenix Pharmaceuticals, Inc., 미국 캘리포니아주 버링에임))로부터 상업적으로 이용가능하다. 또한, PYY₁ _-36 및 PYY₃ _-36은 생화학적 수단에 의해 독립적으로 측정할 수 있다 ([Eberlein et al, Peptides (1989) 10:797-803]; [Grandt et al, Regul Pept (1994) 51:151-159]; [Cruze et al, Peptides (2007) 28:269-280]). 특정 실시태양에서, 본 발명의 PYY-관련 활성은 PYY₃ _-36-관련 활성이다. 특정 실시태양에서, 치료 효능은 혈액 또는 혈장 PYY 수준이 적어도 약 10％, 적어도 약 25％, 적어도 약 50％, 적어도 약 100％, 적어도 약 150％, 적어도 약 200％, 적어도 약 300％, 적어도 약 400％, 적어도 약 500％, 적어도 약 600％, 적어도 약 700％, 적어도 약 800％, 적어도 약 900％, 또는 적어도 약 1000％ 증가될 때 달성된다.

GPR119 작용제가 개체에서 증가된 수준의 PYY를 달성하기 위해 매일 또는 규칙적으로 투여될 수 있음이 명백하게 고려된다. 특정 실시태양에서, GPR119 작용제는 개체에서 PYY의 증가된 혈액 (예를 들어, 혈장) 수준을 달성하기 위해 매일 또는 규칙적으로 투여된다. 특정 실시태양에서, GPR119 작용제는 개체에서 PYY의 정상 혈액 (예를 들어, 혈장) 수준 (예를 들어, 정상 식전 혈장 PYY 수준 (예를 들어, 혈장 총 PYY 수준) 또는 정상 식전 및 식후 혈장 PYY 수준 사이의 혈장 PYY 수준 (예를 들어, 혈장 총 PYY 수준)), 또는 치료 이전의 개체 내의 PYY (예를 들어, 혈장 총 PYY)의 혈액 (예를 들어, 혈장) 수준의 적어도 약 10％, 적어도 약 25％, 적어도 약 50％, 적어도 약 100％, 적어도 약 150％, 적어도 약 200％, 적어도 약 300％, 적어도 약 400％, 적어도 약 500％, 적어도 약 600％, 적어도 약 700％, 적어도 약 800％, 적어도 약 900％, 또는 적어도 약 1000％인 개체 내의 PYY의 증가된 혈액 (예를 들어, 혈장) 수준을 달성하기 위해 매일 또는 규칙적으로 투여된다. PYY (예를 들어, 혈장 총 PYY)의 증가된 혈액 (예를 들어, 혈장) 수준의 이들 범위는 예시적인 범위이고 본 발명을 제한하려는 의미가 없음을 주지한다.

GPR119 작용제가 개체에서 증가된 수준의 PYY를 달성하기 위해 매일 또는 규칙적으로 투여될 수 있음이 명백하게 고려된다. 특정 실시태양에서, GPR119 작용제는 개체에서 PYY의 증가된 혈액 (예를 들어, 혈장) 수준을 달성하기 위해 매일 또는 규칙적으로 투여된다. 특정 실시태양에서, GPR119 작용제는 0.1 ng/ml 내지 10 ng/ml 또는 100 ng/ml, 0.2 ng/ml 내지 10 ng/ml 또는 100 ng/ml, 0.3 ng/ml 내지 10 ng/ml 또는 100 ng/ml, 0.4 ng/ml 내지 10 ng/ml 또는 100 ng/ml, 0.5 ng/ml 내지 10 ng/ml 또는 100 ng/ml, 0.6 ng/ml 내지 10 ng/ml 또는 100 ng/ml, 0.7 ng/ml 내지 10 ng/ml 또는 100 ng/ml, 0.8 ng/ml 내지 10 ng/ml 또는 100 ng/ml, 0.9 ng/ml 내지 10 ng/ml 또는 100 ng/ml, 1 ng/ml 내지 10 ng/ml 또는 100 ng/ml, 2 ng/ml 내지 10 ng/ml 또는 100 ng/ml, 3 ng/ml 내지 10 ng/ml 또는 100 ng/ml, 또는 5 ng/ml 내지 10 ng/ml 또는 100 ng/ml의 농도 범위 내에서 개체에서 PYY의 증가된 혈액 (예를 들어, 혈장) 수준을 달성하기 위해 매일 또는 규칙적으로 투여된다. 혈액 (예를 들어, 혈장) PYY 농도 (예를 들어, 혈장 총 PYY 농도)의 이들 범위는 예시적인 범위이고 본 발명을 제한하려는 의미가 없음을 주지한다.

투여량 및 간격은 의도된 치료 효과를 제공하도록 조정될 수 있다. 본 발명에 따른 GPR119 작용제의 정확한 투여량은 GPR119 작용제, 그의 효력, 투여 방식, 환자의 연령 및 체중 및 치료할 병태의 중증도에 따라 변할 것임이 이해될 것이다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태에 비추어 개별 의사가 선택할 수 있다. 비제한적인 예시로서, 본 발명에 따른 GPR119 작용제의 양은 약 0.001 mg/kg 체중 미만, 약 0.005 mg/kg 체중 미만, 약 0.01 mg/kg 체중 미만, 약 0.05 mg/kg 체중 미만, 약 0.1 mg/kg 체중 미만, 약 0.5 mg/kg 체중 미만, 약 1 mg/kg 체중 미만, 약 5 mg/kg 체중 미만, 약 10 mg/kg 체중 미만, 약 50 mg/kg 체중 미만, 또는 약 100 mg/kg 체중 미만의 양이다.

목적하는 결과를 달성하기 위해 매일 또는 규칙적으로 투여될 수 있는 본 발명의 화합물 (예를 들어 GPR119 작용제, PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물)의 양에 대한 바람직한 투여량 범위는 0.1-100 mg/kg 체질량이다. 다른 바람직한 투여량 범위는 0.1-30 mg/kg 체질량이다. 다른 바람직한 투여량 범위는 0.1-10 mg/kg 체질량이다. 다른 바람직한 투여량 범위는 0.1-3.0 mg/kg 체질량이다. 예시적인 바람직한 투여량은 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1.0 mg/kg, 3.0 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg 및 100 mg/kg로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 물론, 이들 일일 투여량은 하루 동안 주기적으로 소량으로 전달 또는 투여될 수 있다. 이들 투여량 범위는 단지 바람직한 범위이고 본 발명을 제한하려는 의미가 없음을 주지한다. 이들 투여량 범위는 단지 바람직한 범위이고 본 발명을 제한하려는 의미가 없음을 주지한다.

투여량 및 간격은 의도된 치료 효과를 달성하는 본 발명에 따른 GPR119 작용제의 혈장 수준을 제공하도록 개별적으로 조정될 수 있다. 투여 간격은 또한 의도된 치료 효과를 달성하도록 선택된 범위의 GPR119 작용제 농도에 대한 값을 사용하여 결정될 수 있다. GPR119 작용제는 혈장 수준을 시간의 10-90％ 동안, 바람직하게는 시간의 30-99％, 가장 바람직하게는 시간의 50-90％ 동안 선택된 범위의 GPR119 작용제 농도 내에 유지하는 요법을 이용하여 투여되어야 한다. 국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우에, 의도된 치료 효과를 제공하는 GPR119 작용제 농도의 범위는 혈장 농도에 관련되지 않을 수 있다.

투여되는 조성물의 양은 물론, 치료되는 개체, 개체의 체중, 병의 중증도, 투여 방식, 및 처방 의사의 판단에 따라 결정될 것이다

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 개체에게 일정량의 본 발명에 따른 GPR119 작용제를 포함하거나 본질적으로 그로 이루어지는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태, 예를 들어 골다공증을 치료 또는 예방하는, 또는 골 질량을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 조성물은 제약 조성물이다.

한 측면에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 개체에게 일정량의 본 발명에 따른 GPR119 작용제를 포함하거나 본질적으로 그로 이루어지는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태, 예를 들어 골다공증을 치료 또는 예방하는, 또는 골 질량을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 관련 측면에서, 본 발명은 GPR119 작용제가 개체에서 PYY 수준을 증가시키느데 효과를 제공하기에 충분한 양으로 투여되는 상기 방법에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 조성물은 제약 조성물이다.

본 발명의 요법, 예를 들어 GPR119 작용제에 관련한 요법은 PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에서 유용하다.

특정 실시태양에서, 뼈 관련 병태는 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태이다. 특정 실시태양에서, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태는 골감소증, 골다공증, 류마티스 관절염, 골관절염, 치주병, 치조뼈 손실, 절골 뼈 손실, 소아 특발성 뼈 손실, 파제트 병, 전이성 암에 의한 뼈 손실, 골용해성 병변, 척추 만곡, 및 키 감소로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

특정 실시태양에서, 뼈 관련 병태는 향상된 뼈 치유 또는 뼈 성장이고, 여기서 상기 향상된 뼈 치유 또는 뼈 성장은 안면 재건, 상악 재건, 하악 재건, 치주병 또는 발치 후의 향상된 뼈 치유, 향상된 장골 신장, 향상된 인공보형물 내성장, 및 증가된 뼈 유합으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

특정 실시태양에서, 대사 장애는 과체중, 비만, 과식증, 당뇨병 (1형 당뇨병 및 2형 당뇨병 포함), 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 손상된 포도당 내성, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 이상지질혈증, 고혈압 및 대사증후군으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

특정 실시태양에서, 허혈-관련 병태는 뇌 허혈, 뇌졸중, 허혈성 심장병, 심근경색, 허혈-재관류 손상, 심근경색 후 재형성, 심부전 및 울혈성 심부전으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

특정 실시태양에서, 흡수장애 질환은 단장 증후군, 장염, 크론병, 궤양 대장염, 과민성 장 증후군, 콜레라, 및 설사를 수반하는 질환으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

특정 실시태양에서, 경련성 질환은 간질이다.

특정 실시태양에서, PYY에 의해 조절되는 병태는 암이다.

특정 실시태양에서, 염증성 질환은 죽상경화증, 죽상혈전증, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 골관절염, 인슐린 저항성, 당뇨병 (1형 당뇨병 및 2형 당뇨병 포함), 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 대사증후군, 비만, 정상보다 낮은 HDL-콜레스테롤, 고혈압, 고지혈증, 허혈성 심장병, 심근경색, 울혈성 심부전, 골다공증, 정상보다 높은 파골세포분화, 췌장염, 간질성 신염, 급성 이식 거부, 만성 간염, 간 지방증, 다발 경화증, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 재협착, 허혈-재관류 손상, 알러지성 염증, 파킨슨병, 프리온-연관 질병, 흥분독성 손상, 알츠하이머 질병, 경증 인지 장애 (MCI), 파종성 혈관내 응고, 패혈성 쇼크, 염증성 폐 질병 및 염증성 장 질병으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 특정 실시태양에서, 염증성 폐 질병은 천식, 폐기종, 간질성 폐병, 특발성 폐 섬유증, 폐쇄성 세기관지염 증후군, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 및 폐 동맥 고혈압으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 특정 실시태양에서, 염증성 장 질병은 장염, 전장염, 크론병, 육아종성 대장염, 회장염, 크론 대장염, 궤양 대장염, S상 결장염, 전대장염 및 궤양성 직장염으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

특정 실시태양에서, 염증성 질환은 죽상경화증, 죽상혈전증, 인슐린 저항성, 췌장염, 재협착, 염증성 폐 질병 및 염증성 장 질병으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 특정 실시태양에서, 염증성 폐 질병은 천식, 폐기종, 및 폐 동맥 고혈압으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 특정 실시태양에서, 염증성 장 질병은 장염, 전장염, 크론병, 육아종성 대장염, 회장염, 크론 대장염, 궤양 대장염, S상 결장염, 전대장염 및 궤양성 직장염으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태는 골감소증, 골다공증, 류마티스 관절염, 골관절염, 치주병, 치조뼈 손실, 절골 뼈 손실, 소아 특발성 뼈 손실, 파제트 병, 전이성 암에 의한 뼈 손실, 골용해성 병변, 척추 만곡, 및 키 감소를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태는 골다공증이다. 특정 실시태양에서, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태는 골다공증이다. 특정 실시태양에서, 골다공증은 원발성 골다공증이다. 특정 실시태양에서, 골다공증은 2차성 골다공증이다. 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태는 또한 골다공증의 장기 합병증, 예를 들어 척추 만곡, 키 감소 및 인공보형물 수술을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태는 실시태양에서 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함될 수 있음이 이해된다. 특정 실시태양에서, 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태는 원발성 골다공증이다.

특정 실시태양에서, 골 질량의 증가를 필요로 하는 개체는 뼈 무기질 밀도 (BMD)가 젊은 성인 참조 평균의 1 초과 (T-스코어<-1), 1.5 이상 (T-스코어≤-1.5), 2 이상 (T-스코어≤-2), 또는 2.5 이상 (T-스코어≤-2.5) 표준 편차 미만이다. 특정 실시태양에서, 골 질량의 증가를 필요로 하는 개체는 뼈 골절의 치료를 필요로 하는 개체이다. 특정 실시태양에서, 뼈 골절의 치료를 필요로 하는 개체는 외상성 뼈 골절, 장기 뼈 골절, 또는 골다공증성 뼈 골절이 있는 개체이다. 특정 실시태양에서, 개체는 뼈 질병의 치료를 필요로 한다. 특정 실시태양에서, 뼈 질병의 치료를 필요로 하는 개체는 골감소증, 골다공증, 류마티스 관절염, 골관절염, 치주병, 치조뼈 손실, 절골 뼈 손실, 소아 특발성 뼈 손실, 파제트 병, 전이성 암에 의한 뼈 손실, 골용해성 병변, 척추 만곡, 또는 키 감소가 있는 개체이다. 특정 실시태양에서, 뼈 질병의 치료를 필요로 하는 개체는 골다공증이 있는 개체이다. 특정 실시태양에서, 골다공증은 원발성 골다공증이다. 특정 실시태양에서, 골다공증은 2차성 골다공증이다. 본 발명에 따라 치료할 수 있는 파괴성 뼈 질환은 골다공증, 골관절염, 및 골용해성 병변, 예를 들어 신생물성 질병, 방사선요법, 또는 화학요법에 의해 야기되는 병변을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 골다공증은 원발성 골다공증이다. 특정 실시태양에서, 골다공증은 2차성 골다공증이다.

본 발명의 요법, 예를 들어 GPR119 작용제에 관련한 요법은 개체에서 안면 재건, 상악 재건, 하악 재건, 치주병 또는 발치 후의 뼈 치유의 향상, 장골 신장의 향상, 인공보형물 내성장의 향상 또는 뼈 유합의 증가에서 추가로 유용하다.

본 발명의 요법, 예를 들어 GPR119 작용제에 관련한 요법은 개체에서 PYY-관련 활성의 조절에서 유용하다. 특정 실시태양에서, PYY-관련 활성의 조절은 다음으로 이루어지는 군 중에서 선택된다:

(a) 혈장 PYY의 증가;

(b) 골 질량의 증가;

(c) 골 질량 손실의 감소;

(d) 뼈 형성의 증가;

(e) 음식 섭취의 감소;

(f) 체중 감소;

(g) 포만감의 증가;

(h) 포도당 처리의 증가;

(i) 혈장 포도당 감소;

(j) 혈관신생의 증가;

(k) 장 상피 내 분비의 감소;

(l) 장 상피 내 흡수의 증가; 및

(m) 혈장 아디포넥틴의 증가.

특정 실시태양에서, 개체는 척추동물이다. 특정 실시태양에서, 척추동물인 개체는 어류, 양서류, 파충류, 조류 또는 포유동물이다. 특정 실시태양에서, 개체 또는 척추동물은 포유동물이다. 특정 실시태양에서, 포유동물인 개체 또는 척추동물은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 돼지, 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 비-인간 포유동물, 비-인간 영장류 또는 인간이다. 특정 실시태양에서, 개체는 인간이다. 특정 실시태양에서, 인간은 폐경후 여성 또는 50세 초과의 남성이다.

추가로 상술하지 않으면서, 당업자는 상기한 설명을 이용하여 본 발명을 그의 최대 정도로 실시할 수 있는 것으로 생각된다. 상기 상세한 설명은 단지 이해의 명확성을 위해 제공되고, 본 발명의 범위 내에서 변형이 당업자에게 명백해질 수 있으므로 그로부터 불필요한 제한은 없는 것으로 이해되어야 한다.

본원 전체에서, 다양한 공개문, 특허 및 특허 출원이 인용된다. 본원에서 인용되는 이들 공개문, 특허 및 특허 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본 발명자들이 공개문, 특허 및 특허 출원을 본원에서 인용하였지만, 본 발명자들이 상기 공개문, 특허 및 특허 출원을 선행 기술로서 인정한 것은 아니다.

실시예

추가로 상술하지 않으면서, 당업자는 상기한 설명을 이용하여 본 발명을 그의 최대 정도로 실시할 수 있는 것으로 생각된다. 다음 상세한 실시예는 단지 예시적인 것으로서 해석되어야 하고, 어떠한 식으로도 상기한 개시문을 제한하지 않는다. 당업자는 절차로부터 적절한 변동을 즉시 알 것이다.

실시예 1

GPR119 수용체는 형질감염된 수용체 HEK293 세포에서 cAMP 축적을 증가시키기 위한 구성적 활성을 보인다

GPR119 수용체는 cAMP 분석에서 구성적 활성을 보이는 것으로 나타났다. cAMP 측정은 공급자의 프로토콜에 따라 Flash Plate 아데닐일 시클라제 키트 (엔이엔 라이프 사이언스 프러덕츠 (NEN Life Science Products, 미국 매사추세츠주 보스턴))를 사용하여 이루어졌다. 간단히 설명하면, HEK293 세포를 리포펙타민 (Lipofectamine) (인비트로겐)을 사용하여 빈 벡터 DNA ("벡터") 또는 인간 GPR119 수용체 발현 플라스미드 DNA ("GPR119")로 형질감염시켰다. 24 h 후에, 형질감염된 세포를 깁코 (GIBCO, 미국 메릴랜드주 게이터스버그) 세포 분리 버퍼 (카탈로그 no. 13151-014) 내에 수거하고, 분석 버퍼 (50％ 1X PBS/50％ 자극 버퍼) 내에 재현탁하였다. 인큐베이션은 10⁵ 세포/웰을 사용하여 60 min 동안 실온에서 수행하였다. 검출 버퍼 내에 추적자 (tracer)와 함께 추가 2-h 인큐베이션 후에, 플레이트를 월락 (Wallac, 미국 메릴랜드주 게이터스버그) MicroBeta 섬광 계수기에서 계수하였다. 웰당 cAMP의 값을 각각의 분석 플레이트 상에 포함된 표준 cAMP 곡선으로부터 외삽하였다. 결과를 도 1에 제시한다. 도 1에 제시된 결과로부터, GPR119 수용체가 형질감염된 HEK293 세포에서 cAMP 축적을 증가시키기 위한 구성적 활성을 보임이 명백하다.

실시예 2

화합물 1은 예를 들어, GPR119 -형질감염된 HEK293 세포에서 cAMP 축적의 자극에 의해 입증된 바와 같이 GPR119 수용체의 작용제이다

화합물 1 (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민)은 cAMP 분석에서 GPR119 수용체의 작용제인 것으로 나타났다. cAMP 측정은 공급자의 프로토콜에 따라 Flash Plate 아데닐일 시클라제 키트 (엔이엔 라이프 사이언스 프러덕츠)를 사용하여 이루어졌다. 간단히 설명하면, HEK293 세포를 리포펙타민 (인비트로겐)을 사용하여 빈 벡터 DNA ("벡터") 또는 인간 GPR119 수용체 발현 플라스미드 DNA ("GPR119")로 형질감염시켰다. 24 h 후에, 형질감염된 세포를 깁코 세포 분리 버퍼 (카탈로그 no. 13151-014) 내에 수거하고, 분석 버퍼 (50％ 1X PBS/50％ 자극 버퍼) 내에 재현탁하였다. 화합물 1을 10⁵ 세포/웰과 함께 60 min 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 검출 버퍼 내에 추적자와 함께 추가 2-h 인큐베이션 후에, 플레이트를 월락 MicroBeta 섬광 계수기에서 계수하였다. 웰당 cAMP의 값을 각각의 분석 플레이트 상에 포함된 표준 cAMP 곡선으로부터 외삽하였다. 결과를 도 2에 제시한다. 도 2에 제시된 결과로부터, 화합물 1이 GPR119 수용체의 작용제임이 명백하다.

실시예 3

야생형 마우스에서 혈장 PYY 에 대한 GPR119 작용제 투여의 효과

C57BL/6 수컷 마우스 (약 8주령; 할란 (Harlan, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)으로부터 입수함)를 18시간 동안 굶기고, 각각의 군에 대해 n=6인 8개 군으로 무작위로 배정하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 마우스에게 비히클 (80％ 폴리에틸렌 글리콜 400/10％ Tween 80/10％ 에탄올) 또는 GPR119 작용제 (화합물 1; (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민)를 10 mg/kg로 경구로 투여하였다. 처리 30분 후에, 포도당 볼러스 (bolus)를 3 g/kg로 경구로 전달하고, 혈액을 포도당 볼러스 후 0분 (포도당 볼러스 없음), 2분, 5분 및 10분에 수집하였다. 혈장 총 PYY (PYY₁ _-36 및 PYY₃ _-36 포함) 수준은 피닉스 파마슈티칼스, 인크.로부터 구입한 PYY EIA 키트 (펩티드 YY (PYY) (래트, 마우스, 돼지, 개) EIA 키트, 카탈로그 No. EK-059-03)를 키트 내에 제공된 지시서에 따라 사용함으로써 결정하였다. 도 3에 제시된 결과로부터, GPR119 작용제 (화합물 1)의 투여가 마우스에서 혈장 총 PYY를 증가시켰음이 명백하다. 도 3에 제시된 결과로부터, GPR119 작용제 (화합물 1)가 마우스에서 혈장 총 PYY를 자극하였음이 명백하다. 화합물 1은 국제 특허 출원 PCT/US2004/001267 (WO 2004/065380으로 공개됨)에 개시된 화합물과 동일하다.

실시예 4

야생형 마우스에 비해 GPR119 -결핍 (녹아웃 ( KNOCKOUT )) 마우스에서 혈장 PYY에 대한 GPR119 작용제 투여의 효과

GPR119-결핍 수컷 마우스 (Chu et al, Endocrinology (2007) 148:2601-2609) 및 야생형 한배 새끼를 18시간 동안 굶겼다. 마우스에게 비히클 (80％ 폴리에틸렌 글리콜 400/10％ 에탄올/10％ Tween 80) 또는 본 발명에 따른 GPR119 작용제 (화합물 1; (2-플루오로-4-메탄술포닐-페닐)-{6-[4-(3-이소프로필-[1,2,4]옥사디아졸-5-일)-피페리딘-1-일]-5-니트로-피리미딘-4-일}-아민)를 20 mg/kg로 경구로 투여하였다. 처리 30분 후에, 혈액 (100 ㎕)을 눈의 후안와 정맥을 통해 수집한 후 (시간 0분), 포도당 볼러스를 3 g/kg로 (경구로) 제공하였다. 포도당을 전달한 5분 후에, 추가의 혈액 샘플 (100 ㎕)을 수집하였다 (시간 5분). 원심분리 후에 혈장을 수집하고, 혈장 총 PYY 수준을 피닉스 파마슈티칼스, 인크.로부터 구입한 PYY EIA 키트 (펩티드 YY (PYY) (래트, 마우스, 돼지, 개) EIA 키트, 카탈로그 No. EK-059-03)를 키트 내에 제공된 지시서에 따라 사용함으로써 결정하였다. 마우스에서 혈장 총 PYY를 증가시키기 위해 투여된 GPR119 작용제에 대해 기능적 GPR119 수용체가 필요함이 더욱 나타날 수 있다. 화합물 1은 야생형 마우스에서 혈장 총 PYY를 자극하지만 GPR119-결핍 마우스에서는 그렇지 않은 것으로 나타날 수 있다. 화합물 1은 국제 특허 출원 PCT/US2004/001267 (WO 2004/065380으로 공개됨)에 개시된 화합물과 동일하다.

실시예 5

난소절제한 래트에서 골 질량에 대한 GPR119 작용제 투여의 효과

본 발명에 따른 GPR119 작용제는 아래 설명된 생체내 난소절제된 (OVX) 래트 모델을 사용하여 개체에서 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태, 예를 들어 골다공증을 치료 또는 예방하는데, 및/또는 골 질량을 증가시키는데 효과적인 것으로 나타날 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bollag et al, Mol Cell Endocrinol (2001) 177:35-41] 참조).

20마리의 처녀 암컷 OVX 및 20마리의 처녀 비-OVX 스프라그-돌리 (Sprague-Dawley) 래트 (150-175 g) (8주령)를 할란 스프라그-돌리, 인크. (Harlan Sprague-Dawley, Inc., 미국 인디애나주 인디애나폴리스))로부터 구입하였다. 동물에게 자유롭게 (ad libitum) 규정 시판 펠렛 식이인 Teklab Rodent 식이 (1.46％ 칼슘)을 먹이고, 물에 자유롭게 접근시켰다. 래트를 4개의 체중-매칭된 실험군으로 무작위로 나누고, 비히클 또는 본 발명에 따른 GPR119 작용제를 경구로 제공받도록 선택하였다. 6주 동안 매일 기준으로 계속 처리한다.

1. 대조군. 10 마리의 비-OVX 래트에게 비히클을 경구로 투여한다.

2. 대조군 + 처리. 10마리의 비-OVX 래트에게 GPR119 작용제를 경구로 투여한다.

3. OVX. 10마리의 OVX 래트에게 비히클을 경구로 투여한다.

4. OVX + 처리. 10마리의 OVX 래트에게 GPR119 작용제를 경구로 투여한다.

래트를 매일 계량하고, 길이를 기준선에서 및 6주에서 다시 측정하였다. Hologic QDR 1000/W (미국 매사추세츠주 월섬)을 사용한 이중 에너지 X-선 흡수계측법 (DXA)을 모든 동물에 대해 처리의 개시 전에 및 6주에 수행하고, 소프트웨어 Rat Whole Body 버전 5.53을 이용하여 데이타를 분석하였다. 뼈 무기질 밀도 (BMD)를 척추에서 결정하였다.

처리 6주 후에 척추 뼈 밀도의 변화 ％를 결정하였다. GPR119 작용제의 투여가 척추 뼈 밀도에 대한 난소절제의 부정적인 효과를 약화시키는 것으로 나타났다. 척추 뼈 밀도에 대한 난소절제의 부정적인 효과의 약화는 개체에서 낮은 골 질량을 특징으로 하는 병태, 예를 들어 골다공증을 치료 또는 예방하는데, 및/또는 골 질량을 증가시키는데 효능을 갖는 처리의 표시이다.

실시예 6

뼈 골절 치유에 대한 GPR119 작용제 투여의 효과

본 발명에 따른 GPR119 작용제는 아래 기재된 생체내 분석을 사용하여 뼈 골절의 치료에서 효과적인 것으로 나타날 수 있다.

골절 기술

3월령의 스프라그-돌리 래트를 케타민으로 마취시켰다. 우측 경골 또는 대퇴골의 근위 부위의 앞내측면에서 1 cm 절개를 수행하였다. 다음은 경골 수술 기술을 설명한다. 절개는 뼈를 통해 수행되고, 전방 융기 (ridge)로 2 mm 중앙의 경골 조면 (tuberosity)의 원위면에 대해 4 mm 근위에 1 mm 구멍을 팠다. 0.8 mm 스테인레스 스틸 튜브 (최대 부하 36.3 N, 최대 강성 (stiffness) 61.8 N/mm, 뼈와 동일한 조건 하에 시험함)를 사용하여 골수내 금속정 고정 (nailing)을 수행하였다. 골수 공간의 확장은 수행하지 않았다. 블런트 죠 (blunt jaws)를 가진 특수 설계된 조정가능한 겸자 (forceps)를 사용하여 3-지점 굽힘 (bending)에 의해 경비 연결부 위로 2 mm에서 표준화된 닫힌 골절을 생성시켰다. 연조직 손상을 최소화하기 위해, 골절을 옮기지 않도록 주의하였다. 피부를 단일필라멘트 나일론 봉합사로 봉합하였다. 수술은 멸균 조건 하에 수행하였다. 모든 골절의 방사선사진을 금속정 고정 직후에 취하고, 명시된 골간 (diaphyseal) 영역 밖에 골절이 있는 래트 또는 금속정이 옮겨진 래트는 배제하였다. 나머지 동물들을 골절 치유를 시험하기 위한 시점 당 각각의 하위군 당 10-12 동물을 포함하는 다음 군으로 무작위로 나누었다. 래트에게 비히클 또는 GPR119 작용제를 매일 경구로 투여하였다. GPR119 작용제를 0.001 mg/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중의 양으로 사용하였다. 처리를 10, 20, 40 및 80일 동안 계속하였다.

10, 20, 40 및 80일에, 각각의 군으로부터 10-12마리의 래트를 케타민으로 마취시키고, 출혈에 의해 희생시켰다. 양쪽 경비골을 절개에 의해 제거하고, 모든 연조직을 긁어냈다. 각각의 군에 대해 5-6마리의 래트로부터의 뼈를 조직학 분석을 위해 70％ 에탄올 내에 저장하고, 각각의 군에 대해 다른 5-6마리의 래트로부터의 뼈를 방사선사진 및 수행되는 생물기계적 (biomechanical) 시험을 위해 완충 링거 (Ringer's) 용액 (+4℃, pH 7.4) 내에 저장하였다.

조직학 분석

골절된 뼈의 조직학 분석을 위한 방법은 문헌 [Mosekilde and Bak (Bone (1993) 14: 19-27)]에서 이전에 공개되었다. 간단히 설명하면, 골절 부위를 골절선의 각각의 측면에 대해 8 mm에서 톱으로 자르고, 메틸메타크릴레이트 내에 미탈회 (undecalcified) 상태로 포매하고, 전두골 (frontal) 절편을 Reichert-Jung Polycut 절편기 (microtome) 상에서 8 μM 두께로 잘랐다. 마손-트리크롬 (Masson-Trichome) 염색된 중앙-전두골 절편 (경골 및 비골 모두 포함)을 처리를 한 및 처리를 하지 않은 골절 치유에 대한 세포 및 조직 반응의 시각화를 위해 사용하였다. 시리우스 레드 (Sirius red) 염색된 절편을 사용하여, 가골 (callus) 구조의 특징을 입증하고 골절 부위에서 교직골 (woven bone) 및 층판골 (lamellar bone) 사이를 구분하였다. 다음 측정을 수행하였다: (1) 골절 간극 - 골절 내의 피질골 (cortical bone) 단부들 사이의 최단 거리로서 측정됨, (2) 가골 길이 및 가골 직경, (3) 가골의 총 뼈 부피 면적, (4) 가골 영역 내의 조직 영역당 뼈 조직, (5) 가골 내의 섬유상 조직, 및 (6) 가골 내의 연골 영역.

생물기계적 분석

생물기계적 분석을 위한 방법은 문헌 [Bak and Andreassen (Calcif 조직 Int (1989) 45:292-297)]에서 이전에 공개되었다. 간단히 설명하면, 모든 골절의 방사선사진을 생물기계적 시험에 앞서 취하였다. 치유 골절의 기계적 특성을 파괴적 3-지점 또는 4-지점 굽힘 절차에 의해 분석하였다. 최대 부하, 강성, 최대 부하 시의 에너지, 최대 부하 시의 편향, 및 최대 스트레스를 결정하였다.

실시예 7

내인성 인간 GPR119 의 전장 클로닝

내인성 인간 GPR119를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 GPR119 특이적 프라이머 5'-GTCCTGCCACTTCGAGACATGG-3' (서열 3; 센스, 개시 코돈으로서 ATG), 5'-GAAACTTCTCTGCCCTTACCGTC-3' (서열 4; 안티센스, 중지 코돈의 3') 및 주형 (template)으로서 인간 게놈 DNA를 사용하여 PCR에 의해 클로닝하였다. 다음 사이클에 의한 증폭을 위해 TaqPlus Precision™ DNA 중합효소 (스트라타젠)를 사용하였고, 여기서 단계 2 내지 단계 4를 35회 반복하였다: 94℃, 3분; 94℃, 1분; 58℃, 1분; 72℃, 2분; 72℃, 10분. 예측된 크기의 1.0 Kb PCR 단편을 단리하고, pCRII-TOPO™ 벡터 (인비트로겐) 내로 클로닝하고, T7 DNA 시쿼나제 (sequenase) 키트 (아머샴)를 이용하여 완전히 서열 결정하였다. 핵산 서열에 대해 서열 1 및 추정 아미노산 서열에 대해 서열 2를 참조한다.

실시예 8

수용체 발현

다양한 세포가 G 단백질-결합 수용체의 발현을 위해 당업계에서 이용가능하지만, 진핵 세포가 이용되는 것이 가장 바람직하다. 특정 실시태양에서, 포유동물 세포 또는 멜라닌 보유 세포가 이용된다. 다음은 예시적이고; 당업자는 당업자의 필요에 우선적으로 유익한 기술을 결정하는 능력이 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 이는 멜라닌 보유 세포에 관련되므로 아래 실시예 12를 참조한다.

a. 일시적인 형질감염

제1 일에, 6x10⁶/10 cm 접시의 293 세포를 플레이팅하였다. 제2 일에, 2개의 반응 튜브를 제조하였다 (각각의 튜브에 대한 다음의 비율은 플레이트에 대한 것이다): 튜브 A는 4 ㎍ DNA (예를 들어, pCMV 벡터; 수용체 cDNA를 갖는 pCMV 벡터 등)를 0.5 ml 무혈청 DMEM (깁코 비알엘 (Gibco BRL)) 내에서 혼합함으로써 제조하고; 튜브 B는 24 ㎕ 리포펙타민 (깁코 비알엘)을 0.5 ml 무혈청 DMEM 내에서 혼합함으로써 제조하였다. 튜브 A 및 B를 뒤집어서 (수회) 혼합한 후, 실온에서 30-45 min 동안 인큐베이팅하였다. 혼합물은 "형질감염 혼합물"로서 칭한다. 플레이팅된 293 세포를 1XPBS로 세척한 후, 5 ml 무혈청 DMEM을 첨가하였다. 1 ml의 형질감염 혼합물을 세포에 첨가한 후, 4hr 동안 37℃/5％ CO₂에서 인큐베이팅하였다. 형질감염 혼합물을 흡인 여과에 의해 제거한 후, 10 ml의 DMEM/10％ 태소 혈청을 첨가하였다. 세포를 37℃/5％ CO₂에서 인큐베이팅하였다. 48 hr 인큐베이션 후에, 세포를 수거하고, 분석에 이용하였다.

b. 안정한 세포주

약 12x10⁶개의 293 세포를 15 cm 조직 배양 플레이트 상에 플레이팅하였다. 10％ 태소 혈청 및 1％ 피루브산나트륨, L-글루타민, 및 항생제를 함유하는 DME 고포도당 배지에서 성장시켰다. 293 세포의 플레이팅 후 24시간에 (또는 ~80％ 융합도로), 세포를 12 ㎍의 DNA (예를 들어, 수용체 cDNA를 갖는 pCMV-neo^r 벡터)를 사용하여 형질감염시킨다. 12 ㎍의 DNA를 60 ㎕의 리포펙타민 및 혈청이 없는 2 ml의 DME 고포도당 배지와 혼합하였다. 배지를 플레이트로부터 흡인시키고, 세포를 혈청이 없는 배지로 1회 세척하였다. DNA, 리포펙타민, 및 배지 혼합물을 10 ml의 혈청이 없는 배지와 함께 플레이트에 첨가하였다. 37℃에서 4 내지 5시간 동안 인큐베이팅한 후, 배지를 흡인하고, 25 ml의 혈청을 함유하는 배지를 첨가하였다. 형질감염 24시간 후에, 배지를 다시 흡인하고, 혈청이 있는 신선한 배지를 첨가하였다. 형질감염 48시간 후에, 배지를 흡인하고, 최종농도로 게네티신 (G418 약물)을 함유하는 혈청이 있는 배지를 첨가하였다. 약 12x10⁶개의 293 세포를 15 cm 조직 배양 플레이트 상에 플레이팅하였다. 10％ 태소 혈청 및 1％ 피루브산나트륨, L-글루타민, 및 항생제를 함유하는 DME 고포도당 배지에서 성장시켰다. 293 세포의 플레이팅 후 24시간에 (또는 ~80％ 융합도로), 세포를 12 ㎍의 DNA (예를 들어, 수용체 cDNA를 갖는 pCMV 벡터)를 사용하여 형질감염시킨다. 12 ㎍의 DNA를 60 ㎕의 리포펙타민 및 혈청이 없는 2 ml의 DME 고포도당 배지와 혼합하였다. 배지를 플레이트로부터 흡인시키고, 세포를 혈청이 없는 배지로 1회 세척하였다. DNA, 리포펙타민, 및 배지 혼합물을 10 ml의 혈청이 없는 배지와 함께 플레이트에 첨가하였다. 37℃에서 4 내지 5시간 동안 인큐베이팅한 후, 배지를 흡인하고, 25 ml의 혈청을 함유하는 배지를 첨가하였다. 형질감염 24시간 후에, 배지를 다시 흡인하고, 혈청이 있는 신선한 배지를 첨가하였다. 형질감염 48시간 후에, 배지를 흡인시키고, 500 ㎍/ml의 최종 농도로 게네티신 (G418 약물)을 함유하는 혈청이 있는 배지를 첨가하였다. 형질감염된 세포를 이제 G418 내성 유전자를 함유하는 양성으로 형질감염된 세포에 대해 선택한다. 선택이 일어날 때 배지를 4 내지 5일마다 교체한다. 선택 동안, 세포를 성장시켜 안정한 풀 (pool)을 생성하거나, 안정한 클로날 선택을 위해 나누었다.

실시예 9

후보 화합물을, 예를 들어 GPR119 작용제로서 스크리닝하기 위한 분석

후보 화합물을, 예를 들어 GPR119 작용제로서 스크리닝하기 위해 다양한 방법이 이용가능하다. 다음은 예시적이고; 당업자는 당업자의 필요에 우선적으로 유익한 기술을 결정하는 능력이 있는 것으로 여겨진다. 화합물을 G 단백질-결합 수용체의 작용제로서 스크리닝하기 위한 분석은 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, 국제 특허 출원 WO 02/42461 참조)

1. 막 결합 분석: [ ³⁵ S] GTP γS 분석

G 단백질-결합 수용체가 리간드 결합 또는 구성적 활성화의 결과로서 그의 활성 상태로 있을 때, 수용체는 G 단백질에 결합하여, GDP의 방출 및 G 단백질에 대한 GTP의 후속적인 결합을 자극한다. G 단백질-수용체 복합체의 알파 하위단위는 GTPase로서 작용하고, GTP를 GDP로 서서히 가수분해하고, 이 시점에서 수용체는 보통 탈활성화된다. 활성화된 수용체는 계속하여 GDP를 GTP로 교환한다. 비-가수분해가능한 GTP 유사체인 [³⁵S]GTPγS는 활성화된 수용체를 발현하는 막에 대한 [³⁵S]GTPγS의 향상된 결합을 입증하기 위해 사용될 수 있다. 활성화를 측정하기 위해 [³⁵S]GTPγS 결합을 사용하는 잇점은 (a) 모든 G 단백질-결합 수용체에 포괄적으로 적용가능하고; (b) 막 표면에서 근위이어서, 세포내 케스케이드에 영향을 미치는 분자를 덜 집어내는 점이다.

분석에서는 관련 수용체를 발현하는 막에 대한 [³⁵S]GTPγS 결합을 자극하는 G 단백질 결합된 수용체의 능력을 이용한다. 분석은 포괄적이고, 모든 G 단백질-결합 수용체에서 약물 발견에 적용된다.

막 제제

일부 실시태양에서, 예를 들어. 수용체의 작용제로서 후보 화합물의 확인에서 사용하기 위한, 본 발명의 G 단백질-결합 수용체를 포함하는 막은 바람직하게는 다음과 같이 제조된다:

a. 물질

"막 스크레이프 (Scrape) 버퍼"는 20 mM HEPES 및 10 mM EDTA (pH 7.4)로 이루어지고; "막 세척 버퍼"는 20 mM HEPES 및 0.1 mM EDTA (pH 7.4)로 이루어지고; "결합 버퍼"는 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 및 10 mM MgCl₂ (pH 7.4)로 이루어진다.

b. 절차

모든 물질은 절차 내내 얼음 상에 유지될 것이다. 먼저, 세포의 융합 단층으로부터 배지를 흡인시킨 후, 10 ml 냉 PBS로 세정한 후, 흡인 여과한다. 그 후에, 세포를 긁기 위해 5 ml의 막 스크레이프 버퍼를 첨가할 것이고; 이 후 세포 추출물을 50 ml 원심분리관 (20,000 rpm에서 17분 동안 4℃에서 원심분리함)에 전달할 것이다. 그 후에, 상등액을 흡인시킬 것이고, 펠렛을 30 ml 막 세척 버퍼 내에 재현탁시킨 후, 20,000 rpm에서 17분 동안 4℃에서 원심분리할 것이다. 이어서, 상등액을 흡인시키고, 펠렛을 결합 버퍼 내에 재현탁할 것이다. 이어서, 이를 Brinkman Polytron™ 균질기 (homogenizer) (모든 물질이 현탁액 상태가 될 때까지 15-20초 버스트 (burst))를 사용하여 균질화시킬 것이다. 이를 본원에서 "막 단백질"로서 칭한다.

브래드포드 (Bradford) 단백질 분석

균질화 후에, 막의 단백질 농도를 브래드포드 단백질 분석을 이용하여 결정할 것이다 (단백질은 약 1.5 mg/ml로 희석되고, 분취되고, 나중에 사용을 위해 동결될 수 있고 (-80℃); 동결될 때, 사용하기 위한 프로토콜은 다음과 같을 것이다: 분석 일에, 동결된 막 단백질을 실온에서 해동시킨 후, 볼텍싱한 (vortex) 후, Polytron을 사용하여 약 12 x 1,000 rpm에서 약 5-10초 동안 균질화시키고; 다수의 제제를 위해, 균질기는 상이한 제제의 균질화 사이에 철저하게 깨끗해야 함에 주목한다).

a. 물질

결합 버퍼 (위에서와 같음); 브래드포드 염료 시약; 브래드포드 단백질 표준물을 제조자의 지시에 따라 사용할 것이다 (바이오라드 (Biorad), cat. no. 500-0006).

b. 절차

하나는 막을 포함하고 하나는 대조군 "블랭크 (blank)"인 이중 튜브를 제조할 것이다. 각각은 800 ㎕ 결합 버퍼를 함유한다. 그 후에, 10 ㎕의 브래드포드 단백질 표준물 (1 mg/ml)을 각각의 튜브에 첨가할 것이고, 이어서, 10 ㎕의 막 단백질을 하나의 튜브에만 (블랭크에는 첨가하지 않음) 첨가할 것이다. 그 후에, 200 ㎕의 브래드포드 염료 시약을 각각의 튜브에 첨가한 후, 각각 볼텍싱할 것이다. 5분 후에, 튜브를 재-볼텍싱할 것이고, 그 내부의 물질을 큐벳에 옮길 것이다. 이어서, 큐벳을 파장 595에서 CECIL 3041 분광광도계를 사용하여 판독할 것이다.

확인 분석

a. 물질

GDP 버퍼는 37.5 ml 결합 버퍼 및 2 mg GDP (시그마 (Sigma), cat. no. G-7127)로 이루어지고, 이 후 결합 버퍼 내에 연속 희석하여 0.2 μM GDP를 얻고 (각각의 웰 내의 GDP의 최종 농도는 0.1 μM GDP이었다); 후보 화합물을 포함하는 각각의 웰은 최종 부피가 200 ㎕으로, 100 ㎕ GDP 버퍼 (최종 농도, 0.1 μM GDP), 결합 버퍼 내의 50 ㎕ 막 단백질, 및 결합 버퍼 내의 50 ㎕ [³⁵S]GTPγS (0.6 nM) (2.5 ㎕ [³⁵S]GTPγS/10 ml 결합 버퍼)로 이루어진다.

b. 절차

후보 화합물을 바람직하게는 96-웰 플레이트 형식을 이용하여 스크리닝할 것이다 (이들은 -80℃에서 동결될 수 있다). 막 단백질 (또는 대조군으로서 표적 GPCR이 없는 발현 벡터를 갖는 막)은 현탁액 상태까지 잠깐 동안 균질화할 것이다. 이어서, 단백질 농도는 상기 기재된 브래드포드 단백질 분석을 이용하여 결정될 것이다. 이어서, 막 단백질 (및 대조군)을 결합 버퍼 내에 0.25 mg/ml로 희석할 것이다 (최종 분석 농도, 12.5 ㎍/웰). 그 후에, 100 ㎕ GDP 버퍼를 월락 Scintistrip™ (월락)의 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, 5 ㎕ 핀 툴 (pin-tool)을 사용하여 5 ㎕의 후보 화합물을 그러한 웰 내에 전달하였다 (즉, 200 ㎕의 총 분석 부피 내에 5 ㎕은 1:40 비여서, 후보 화합물의 최종 스크리닝 농도는 10 μM이다). 다시, 오염을 피하기 위해, 각각의 전달 단계 후에, 핀 툴을 물 (1X), 에탄올 (1X) 및 물 (2X)을 포함하는 3개의 저장기 내에 세정해야 하고 - 과잉의 액체는 각각의 세정 후에 툴로부터 털어내고 종이와 킴와이프 (kimwipe)로 건조시켜야 한다. 그 후에, 50 ㎕의 막 단백질을 각각의 웰에 첨가하고 (표적 GPCR 없이 막을 포함하는 대조 웰을 또한 사용하였다), 5-10분 동안 실온에서 예비-인큐베이팅시킬 것이다. 그 후에, 결합 버퍼 내의 50 ㎕의 [³⁵S]GTPγS (0.6 nM)를 각각의 웰에 첨가한 후, 진탕기 상에서 60분 동안 실온에서 인큐베이팅할 것이다 (다시, 본 실시예에서, 플레이트를 호일로 덮었다). 이어서, 플레이트를 4000 RPM에서 15분 동안 22℃에서 원심분리함으로써 분석을 중지시킬 것이다. 이어서, 플레이트를 8 채널 매니폴드 (manifold)로 흡인시키고, 플레이트 커버로 밀봉할 것이다. 이어서, 플레이트를 농도 (setting) "Prot. #37"를 이용하여 (제조자의 지시에 따라) 월락 1450 상에서 판독할 것이다.

2. 아데닐일 시클라제 분석

세포-기반 분석을 위해 설계된 Flash Plate™ 아데닐일 시클라제 키트 (뉴 잉글랜드 뉴클리어 (New England Nuclear); Cat. No. SMP004A)를 조질 혈장 막과 함께 사용하기 위해 변형시킬 수 있다. Flash Plate 웰은 섬광제 코팅을 함유할 수 있고, 또한 cAMP를 인식하는 특이적 항체를 함유한다. 웰 내에 생성된 cAMP는 cAMP 항체에 대한 방사성 cAMP 추적자의 결합에 대한 직접적인 경쟁에 의해 정량할 수 있다. 다음은 수용체를 발현하는 세포 내에서 cAMP 수준의 변화 측정을 위한 짧은 프로토콜이다.

특정 실시태양에서, 다음 프로토콜에 따라 예를 들어, GPR119 작용제로서 후보 화합물의 확인을 위해 변형된 Flash Plate™ 아데닐일 시클라제 키트 (뉴 잉글랜드 뉴클리어; Cat. No. SMP004A)를 사용한다.

본 발명의 G 단백질-결합 수용체로 형질감염된 세포를 형질감염의 약 3일 후에 수거하였다. 20 mM HEPES (pH 7.4) 및 10 mM MgCl₂를 함유하는 버퍼 내에서 현탁된 세포의 균질화에 의해 막을 제조한다. 균질화는 얼음 상에서 Brinkman Polytron™을 사용하여 약 10초 동안 수행한다. 생성되는 균질액을 49,000 X g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 이어서, 생성되는 펠렛을 20 mM HEPES (pH 7.4) 및 0.1 mM EDTA를 함유하는 버퍼 내에 재현탁시키고, 10초 동안 균질화시킨 후, 49,000 x g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리시킨다. 이어서, 생성되는 펠렛을 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 직접적인 확인 스크리닝 일에, 막 펠렛을 실온에서 서서히 해동시키고, 20 mM HEPES (pH 7.4) 및 10 mM MgCl₂를 함유하는 버퍼 내에 재현탁시켜, 0.60 mg/ml의 최종 단백질 농도를 얻는다 (재현탁된 막은 사용시까지 얼음 상에 놓는다).

cAMP 표준물 및 검출 버퍼 (2 μCi의 추적자 (11 ml 검출 버퍼에 [¹²⁵I]cAMP (100 ㎕))를 포함함)를 제조자의 지시에 따라 제조하고 유지한다. 분석 버퍼는 스크리닝을 위해 새로 제조되었고, 20 mM HEPES (pH 7.4), 10 mM MgCl₂, 20 mM 포스포크레아틴 (시그마), 0.1 단위/ml 크레아틴 포스포키나제 (시그마), 50 μM GTP (시그마), 및 0.2 mM ATP (시그마)를 함유하였고; 이어서, 분석 버퍼를 사용할 때까지 얼음 상에 보관하였다.

후보 화합물을 바람직하게는 예를 들어 96-웰 플레이트 웰 (3 ㎕/웰; 12μM 최종 분석 농도)에 40 ㎕ 막 단백질 (30 ㎍/웰) 및 50 ㎕의 분석 버퍼와 함께 첨가하였다. 이어서, 상기 혼합물을 부드럽게 진탕하면서 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다.

인큐베이션 후에, 100 ㎕의 검출 버퍼를 각각의 웰에 첨가한 후, 2-24시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 "Prot. #31" (제조자의 지시에 따라)을 사용하여 월락 MicroBeta™ 플레이트 판독기에서 계수하였다.

3. CRE - Luc 리포터 분석

293 및 293T 세포를 96 웰 플레이트 상에 2 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 다음날 리포펙타민 시약 (BRL)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 형질감염시켰다. DNA/지질 혼합물을 각각의 6-웰 형질감염을 위해 다음과 같이 제조하였다: 100 ㎕의 DMEM 중 260 ng의 플라스미드 DNA를 100 ㎕의 DMEM 내의 2 ㎕의 지질과 부드럽게 혼합하였다 (260 ng의 플라스미드 DNA는 200 ng의 8xCRE-Luc 리포터 플라스미드, 50 ng의 본 발명의 G 단백질-결합 수용체를 포함하는 pCMV 또는 pCMV 단독, 및 10 ng의 GPRS 발현 플라스미드 (pcDNA3 내의 GPRS (인비트로겐))로 이루어진다). 8xCRE-Luc 리포터 플라스미드는 다음과 같이 제조하였다: 벡터 SRIF-β-gal은 pβgal-Basic 벡터 (클론테크) 내에서 BglV-HindIII 부위에서 래트 소마토스타틴 프로모터 (-71/+51)를 클로닝함으로써 수득하였다. 8개 카피의 cAMP 반응 요소는 아데노바이러스 주형 AdpCF126CCRE8로부터 PCR에 의해 수득하고 (그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Suzuki et al., Hum Gene Ther (1996) 7:1883-1893] 참조), SRIF-β-gal 벡터 내로 Kpn-BglV 부위에서 클로닝하여, 8xCRE-β-gal 리포터 벡터를 생성하였다. 8xCRE-Luc 리포터 플라스미드는 8xCRE-β-gal 리포터 벡터 내의 베타-갈락토시다제 유전자를 HindlIII-BamHI 부위에서 pGL3-basic 벡터 (프로메가 (Promega))로부터 얻은 루시퍼라제 유전자를 교체함으로써 생성하였다. 실온에서 30 min 인큐베이션 후에, DNA/지질 혼합물을 400 ㎕의 DMEM로 희석하고, 100 ㎕의 희석시킨 혼합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 10％ FCS를 함유하는 100 ㎕의 DMEM을 세포 배양 인큐베이터 (incubator) 내에서 4hr 인큐베이션 후에 각각의 웰에 첨가하였다. 다음날, 형질감염된 세포를 10％ FCS를 함유하는 200 ㎕/웰의 DMEM으로 교환하였다. 8시간 후에, 웰을 PBS로 1회 세척한 후 페놀 레드가 없는 100 ㎕/웰의 DMEM로 교환하였다. 루시퍼라제 활성을 다음날 LucLite™ 리포터 유전자 분석 키트 (패카드 (Packard))를 사용하여 제조자의 지시에 따라 측정하고, 1450 MicroBeta™ 섬광 및 발광 계수기 (월락) 상에서 판독하였다.

실시예 10

예를 들어, GPR119 작용제 활성에 대한 전체 세포 아데닐일 시클라제 분석

시클릭 AMP 측정은 Flash Plate™ 아데닐일 시클라제 키트 (뉴 잉글랜드 뉴클리어)를 사용하여 공급자의 프로토콜에 따라 이루어진다. HEK293 세포를 15-cm 조직 배양 접시에 12x10⁶ 세포/접시로 통상의 성장 배지 (DMEM/10％ FBS) 내에 플레이팅하였다. 다음날, 10 ㎍의 빈 벡터 DNA 또는 발현 플라스미드 DNA를 리포펙타민 (인비트로겐)을 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 세포 내로 형질감염시켰다. 배양액 내에서 24시간 후에, 형질감염된 세포를 깁코 세포 분리 버퍼 (Cat #13151-014) 내에 수거하고, 5분 동안 1,100 rpm에서 원심분리에 의해 펠렛화하고, 적절한 부피의 분석 버퍼 (50％ 1xPBS 및 50％ 자극 버퍼) 내로 조심스럽게 재현탁시켜 2x10⁶ 세포/ml의 최종 세포 계수를 제공하였다. 시험 화합물을 50 ㎕ 분석 버퍼 내에 지시되는 목적하는 분석 농도에서 제조하고, 96-웰 Flash Plate의 웰 내로 피펫팅하였다. 이어서, 상기 제조된 세포 현탁액을 첨가하였다 (50 ㎕/웰). 실온에서 60분의 인큐베이션 시간 후에, 추적자 [¹²⁵I]-cAMP를 함유하는 100 ㎕의 검출 믹스를 웰에 첨가하였다. 플레이트를 추가의 2시간 동안 인큐베이팅한 후, 월락 MicroBeta 섬광 계수기 내에 계수하였다. cAMP/웰의 값을 각각의 분석 플레이트 상에 포함된 표준 cAMP 곡선으로부터 외삽하였다.

빈 벡터로 형질감염된 HEK293 세포에 비해 GPR119-형질감염된 HEK293 세포 내의 cAMP 수준의 증가는 시험 화합물이 GPR119 수용체 기능성을 자극하는 화합물임을 표시한다.

실시예 11

직접적 cAMP 측정을 위한 균질한 시간-분해 ( TIME - RESOLVED ) 형광 ( HTRF ^® ) 분석

화합물을 직접적 cAMP 측정을 위한 HTRF^® 분석 (Gabriel et al, ASSAY and Drug Development Technologies, 1:291-303, 2003) 및 GPR119 수용체로 안정하게 형질감염된 재조합 CHO-K1 세포를 이용하여 GPR119 수용체를 자극하는 화합물에 대해, 예를 들어 GPR119 수용체의 작용제에 대해 스크리닝하였다. 화합물을 직접적 cAMP 측정을 위한 HTRF^® 분석 (Gabriel et al, ASSAY and Drug Development Technologies, 1:291-303, 2003) 및 GPR119 수용체로 안정하게 형질감염된 재조합 CHO-K1 세포를 이용하여 GPR119 수용체의 작용제에 대해 스크리닝하였다. CHO-K1 세포는 ATCC® (미국 버지니아주 매나사스; 카탈로그 # CCL-61)로부터 입수하였다. GPR119 수용체의 작용제는 직접적 cAMP 측정을 위한 HTRF^® 분석에서 cAMP 농도를 증가시키는 화합물로서 검출되었다. HTRF^® 분석은 또한 GPR119 수용체 작용제에 대한 EC₅₀ 값을 결정하기 위해 사용된다.

분석의 원리: HTRF^® 분석 키트는 시스비오-유에스, 인크. (Cisbio-US, Inc.; 미국 매사추세츠주 베드포드; 카탈로그 # 62AM4PEC)로부터 구입하였다. 키트에 의해 지지되는 HTRF^® 분석은 CHO-K1 세포에 의해 생산된 내인성 cAMP 및 염료 d2로 표지된 추적자 cAMP 사이의 경쟁적 면역분석이다. 추적자 결합을 크립테이트 (Cryptate)로 표지된 모노클로날 항-cAMP 항체에 의해 시각화하였다. 특이적 신호 (즉, 형광 공명 에너지 전이, FRET)는 표준물 또는 샘플 내의 비표지된 cAMP의 농도에 역비례한다.

표준 곡선: 분석에 포함된 표준물 (0.17 내지 712 nM cAMP)의 형광비 (665 nm/620 nm)를 계산하고, 키트 제조자의 지시에 따라 cAMP 표준 곡선을 생성하기 위해 사용하였다. 샘플 (시험 화합물 또는 화합물 버퍼)의 형광비를 계산하고, cAMP 표준 곡선을 참조함으로써 각각의 cAMP 농도를 추정하기 위해 사용하였다.

분석의 구성: HTRF^® 분석은 384-웰 플레이트 형식 (ProxiPlates; 퍼킨엘머 (PerkinElmer, 미국 캘리포니아주 프레몬트); 카탈로그 # 6008280)에서 20 ㎕ 총 부피/웰에서, 본질적으로 키트 제조자의 지시에 따라 2-단계 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 각각의 실험 웰에 IBMX (100 μM) 및 롤리프람 (10 μM) (포스포디에스테라제 억제제; 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스); 각각 카탈로그 # I5879 및 카탈로그 # R6520) 및 0.1％ 소 혈청 알부민 (BSA) 분획 V (시그마-알드리치; 카탈로그 # A3059))를 보충한 5 ㎕ 분석 버퍼 (염화칼슘 및 염화마그네슘을 함유하는 포스페이트 완충 염수 (인비트로겐; 카탈로그 # 14040) 내의 3000 재조합 CHO-K1 세포를 전달한 후, 5 ㎕ 분석 버퍼 내의 시험 화합물 또는 5 ㎕ 분석 버퍼를 전달하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 각각의 웰에 키트 제조자의 지시에 따라 용해 버퍼 내의 5 ㎕ cAMP-d2 접합체 및 용해 버퍼 내의 5 ㎕ 크립테이트 접합체를 첨가하였다. 이어서, 플레이트 실온에서 1시간 동안 추가로 인큐베이팅한 후, 분석 플레이트를 판독하였다.

분석 판독: HTRF^® 판독을 PHERAstar (비엠지 랩테크 인크. (BMG LABTECH Inc., 미국 노쓰캐롤라이나주 더햄)) 또는 EnVision™ (퍼킨엘머) 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 달성하였다.

실시예 12

예를 들어, GPR119 작용제 활성에 대한 멜라닌 보유 세포 분석

멜라닌 보유 세포를 문헌 [Potenza et al [Pigment Cell Research (1992) 5:372-378]]에 보호된 바와 같이 배양액 내에 유지하고, 전기천공을 이용하여 GPR119 수용체를 코딩하는 발현 벡터 (GPR119; 예를 들어, 인간 GPR119, GenBank® 기탁 번호 AAP72125 및 그의 대립유전자)로 형질감염시켰다. 전기천공 후에, 형질감염된 세포를 분석을 위해 96 웰 플레이트 내로 플레이팅하였다. 이어서, 전기천공 절차로부터 회수하고 최대 수용체 발현 수준을 얻기 위해, 세포를 48시간 동안 성장시켰다.

분석일에, 세포 상의 성장 배지를 10 nM 멜라토닌을 함유하는 무혈청 버퍼로 교체하였다. 멜라토닌은 세포내 cAMP 수준을 저하시키기 위해 멜라닌 보유 세포 내에서 내인성 Gi-결합 GPCR을 통해 작용한다. 저하된 cAMP 수준에 반응하여, 멜라닌 보유 세포는 그들의 색소를 세포의 중심으로 전위시킨다. 그의 순수 효과는 600-650 nm에서 측정한 웰 내의 세포 단층의 흡광도 판독치의 유의한 감소이다.

멜라토닌 내에서 1시간 인큐베이션 후에, 세포는 완전히 색소-응집되었다. 이 시점에, 기준선 흡광도 판독치를 수집하였다. 이어서, 시험 화합물의 연속 희석액을 플레이트에 첨가하였고, GPR119 작용제 활성을 갖는 화합물은 세포내 cAMP 수준을 증가시켰다. 이들 증가된 cAMP 수준에 반응하여, 멜라닌 보유 세포는 그들의 색소를 다시 세포 주변으로 전위시킨다. 1시간 후에, 자극된 세포는 완전히 색소-분산되었다. 분산 상태에서 세포 단층은 600-650 nm 범위에서 훨씬 더 많은 빛을 흡수한다. 기준선 판독치에 비해 측정된 흡광도 증가로 인해 수용체 자극의 정도를 정량하고, 용량-반응 곡선을 플로팅할 수 있다.

멜라닌 보유 세포 분석에 관한 물질 및 방법은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,462,856 및 6,051,386에서 발견된다.

빈 벡터로 형질감염된 멜라닌 보유 세포에 비해 GPR119-형질감염된 멜라닌 보유 세포에서 색소 분산의 증가는 시험 화합물이 GPR119 수용체 기능성을 자극하는 화합물임을 표시한다.

화합물을 GPR119 작용제로서 확인하기 위한 다른 분석은 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다 (예를 들어, 상기 실시예 9 참조).

실시예 13

예를 들어, GPR119 작용제 활성에 대한 효모 리포터 분석

효모 세포-기반 리포터 분석은 문헌에서 이전에 설명되었다 (예를 들어, 문헌 ([Miret et al, J Biol Chem (2002) 277:6881-6887]; [Campbell et al, Bioorg Med Chem Lett (1999) 9:2413-2418]; [King et al, Science (1990) 250:121-123]); WO 99/14344; WO 00/12704; 및 US 6,100,042 참조). 간단히 설명하면, 내인성 효모 G-알파 (GPA1)가 결실되고 다수의 기술을 이용하여 구성된 G-단백질 키메라로 교체되도록 효모 세포를 조작하였다. 추가로, 선택된 포유동물 GPCR의 상동성 발현을 허용하도록 내인성 효모 알파-세포 GPCR, Ste3이 결실되었다. 효모 내에서, 진핵 세포에서 보존된 페로몬 신호전달 경로 (예를 들어, 미토겐-활성화된 단백질 키나제 경로)의 요소는 Fus1의 발현을 추진시킨다. β-갈락토시다제 (LacZ)를 Fus1 프로모터 (Fus1p)의 제어 하에 놓음으로써, 그에 의해 수용체 활성화가 효소적 판독 (readout)을 이끄는 시스템이 개발되었다.

효모 세포를 아가텝 (Agatep) 등 (Agatep et al, 1998, Transformation of Saccharomyces cerevisiae by the lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol (LiAc/ss-DNA/PEG) protocol. Technical Tips Online, Trends Journals, Elsevier)에 의해 설명된 아세트산리튬 방법의 개조에 의해 형질전환시켰다. 간단히 설명하면, 효모 세포를 효모 트립톤 플레이트 (YT) 상에서 밤새 성장시켰다. 아세트산리튬/폴리에틸렌 글리콜/TE 버퍼 및 효모 발현 벡터 (2 ㎍ 복제 기점) 내의 담체 단일 가닥 DNA (10 ㎍), 2 ㎍의 각각의 2개의 Fus1p-LacZ 리포터 플라스미드 (하나는 URA 선택 마커를 갖고 하나는 TRP를 가짐), 2 ㎍의 GPR119 (예를 들어, 인간 수용체)를 에펜도르프 튜브 내로 피펫팅하였다. 효모 수용체를 함유하는 발현 플라스미드/수용체가 없는 대조군은 LEU 마커를 가졌다. 효모 세포를 상기 혼합물 내로 접종하고, 반응을 30℃에서 60 min 동안 진행시켰다. 이어서, 효모 세포를 42℃에서 15 min 동안 열-쇼크 (heat-shock)시켰다. 이어서, 세포를 세척하고 선택 플레이트 상에 도말하였다. 선택 플레이트는 합성 규정된 효모 배지 - LEU, URA 및 TRP (SD-LUT)이었다. 30℃에서 2-3일 동안 인큐베이팅한 후, 선택 플레이트 상에서 성장하는 콜로니를 LacZ 분석으로 시험하였다.

β-갈락토시다제에 대한 형광측정 효소 분석을 수행하기 위해, 대상 GPR119 수용체를 보유하는 효모 세포를 액체 SD-LUT 배지 내에서 불포화 농도로 밤새 성장시킨다 (즉, 세포는 여전히 분할하고, 정지상에 아직 도달하지 않았다). 이들을 신선한 배지 내에 최적의 분석 농도로 희석하고, 90 ㎕의 효모 세포를 96-웰 흑색 폴리스티렌 플레이트 (코스타르 (Costar))에 첨가하였다. DMSO에 용해시키고 10％ DMSO 용액 내에 10X 농도로 희석한 시험 화합물을 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 30℃에서 4h 동안 놓았다. 4h 후에, β-갈락토시다제에 대한 기질을 각각의 웰에 첨가하였다. 이들 실험에서, 플루오레세인 디(β-D-갈락토피라노시드) (FDG, 플루오레세인을 방출하는 효소에 대한 기질)를 사용하여, 형광측정 판독을 허용하였다. 20 ㎕/웰의 500 μM FDG/2.5％ TritonX100을 첨가하였다 (세포를 투과성으로 하기 위해 세제가 필요하다). 세포를 기질과 함께 60 min 동안 인큐베이팅한 후에, 20 ㎕/웰의 1 M 탄산나트륨을 첨가하여 반응을 종결시키고 형광 신호를 가화시켰다. 이어서, 플레이트를 형광계에서 485/535 nm에서 판독하였다.

빈 벡터로 형질전환된 효모 세포에 비해 GPR119-형질전환된 효모 세포에서 형광 신호의 증가는 시험 화합물이 GPR119 수용체 기능성을 자극하는 화합물 (예를 들어, GPR119의 작용제 또는 부분 작용제인 화합물)임을 표시한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 형광 신호를 배경 신호 (비히클 단독의 존재 하에 얻어진 신호)를 초과하여 증가시킨다.

실시예 14

방사성 표지된 화합물

특정 실시태양에서, 본 발명의 G 단백질-결합 수용체의 리간드인 것으로 공지된 화합물은 방사성 표지된다. 방사성 표지된 화합물은 본원에서 설명될 때 화합물을 확인/평가하기 위해 스크리닝 분석에서 사용될 수 있다. 일반적인 용어에서, 새로 합성된 또는 확인된 화합물 (즉, 시험 화합물)을 방사성 표지된 공지의 리간드 및 수용체 사이에서 복합체 형성을 감소시키는 그의 능력에 의해 수용체에 대한 방사성 표지된 공지의 리간드의 결합을 감소시키는 그의 능력에 대해 평가할 수 있다. 본 발명의 화합물에 포함될 수 있는 적합한 방사성 핵종은 ³H (또한 T로도 표기함), ¹¹C, ¹⁴C, ¹⁸F, ¹²⁵I, ⁸²Br, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ¹⁵O, ¹³N, ³⁵S 및 ⁷⁷Br을 포함하고 이로 제한되지 않는다. ³H, ¹⁴C, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ⁸²Br을 포함하는 화합물이 일반적으로 가장 유용할 것이다.

"방사성 표지된" 화합물은 적어도 하나의 방사성 핵종을 포함한 화합물인 것으로 이해된다. 일부 실시태양에서, 방사성 핵종은 ³H, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³⁵S 및 ⁸²Br로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 방사성 핵종은 ³H 또는 ¹⁴C이다. 또한, 본 발명의 G 단백질-결합 수용체의 리간드인 것으로 공지된 화합물에 표시된 모든 원자는 그러한 원자의 가장 일반적으로 발생하는 동위원소 또는 보다 드문 방사성 동위원소 또는 비-방사성 동위원소일 수 있음을 이해해야 한다.

본 발명의 G 단백질-결합 수용체의 리간드인 것으로 공지된 화합물에 적용가능한 것을 포함하는 방사성 동위원소를 유기 화합물 내로 포함시키기 위한 합성 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 활성 수준의 트리튬을 표적 분자 내로 포함시키는 것을 포함한다: A. 트리튬 기체를 사용하는 촉매적 환원 - 상기 절차는 보통 높은 특이적 활성의 생성물을 생성시키고, 할로겐화 또는 불포화 전구체를 필요로 한다. B. 수소화붕소나트륨[³H]을 사용한 환원 - 상기 절차는 다소 저렴하고, 알데히드, 케톤, 락톤, 에스테르 등과 같은 환원성 관능기를 함유하는 전구체를 필요로 한다. C. 수소화알루미늄리튬 [³H]을 사용한 환원 - 상기 절차는 거의 이론적 비활성도 (specific activity)에서 생성물을 제공한다. 이는 또한 알데히드, 케톤, 락톤, 에스테르 등과 같은 환원성 관능기를 함유하는 전구체를 필요로 한다. D. 트리튬 기체 노출 표지 - 상기 절차는 교환가능한 양성자를 함유하는 전구체를 적합한 촉매의 존재 하에 트리튬 기체에 노출시키는 것을 포함한다. E. 메틸 요오다이드 [³H]를 사용한 N-메틸화 - 상기 절차는 대체로 적절한 전구체를 높은 비활성의 메틸 요오다이드 (³H)로 처리함으로써 O-메틸 또는 N-메틸 (³H) 생성물을 제조하기 위해 사용된다. 상기 방법은 일반적으로 약 80-87 Ci/mmol과 같은 높은 비활성을 허용한다.

활성 수준의 ¹²⁵I를 표적 분자 내로 포함시키는 합성 방법은 다음을 포함한다: A. 샌드마이어 (Sandmeyer) 및 유사 반응 - 상기 절차는 아릴 또는 헤테로아릴 아민을 디아조늄 염, 예를 들어 테트라플루오로보레이트 염으로, 및 후속적으로 Na¹²⁵I를 사용하여 ¹²⁵I 표지된 화합물로 전환시킨다. 표시된 절차는 문헌 [Zhu, D.-G. and co-workers in J. Org. Chem. 2002, 67, 943-948]에서 보고되었다. B. 페놀의 오르소 ¹²⁵요오드화 - 상기 절차는 문헌 [Collier, T. L. and co-workers in J. Labelled Compd Radiopharm. 1999, 42, S264-S266]에 보고된 바와 같이 페놀의 오르소 위치에서 ¹²⁵I의 혼입을 허용한다. C. ¹²⁵I를 사용한 아릴 및 헤테로아릴 브로마이드 교환 - 상기 방법은 일반적으로 2 단계 과정이다. 제1 단계는 예를 들어, Pd 촉매된 반응 (즉, Pd(Ph₃P)₄)를 이용하는 또는 트리-알킬주석할라이드 또는 헥사알킬이주석 (예를 들어, (CH₃)₃SnSn(CH₃)₃)의 존재 하에 아릴 또는 헤테로아릴 리튬을 통한 아릴 또는 헤테로아릴 브로마이드의 상응하는 트리-알킬주석 중간체로의 전환이다. 제시된 절차는 문헌 [Bas, M.-D. and co-workers in J Labelled Compd Radiopharm 2001, 44, S280-S282]에서 보고되었다.

상기한 기술은 예시적이고 비제한적인 것으로 의도된다. 본 발명의 G 단백질-결합 수용체의 리간드인 것으로 공지된 화합물을 방사성 표지하는 다른 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다.

실시예 15

수용체 결합 분석

시험 화합물을 본 발명의 G 단백질-결합 수용체의 리간드인 것으로 공지된 화합물 및 수용체 사이의 복합체 형성을 감소시키는 그의 능력에 대해 평가할 수 있다. 특정 실시태양에서, 공지의 리간드는 방사성 표지된다. 방사성 표지된 공지의 리간드는 화합물을 확인/평가하기 위해 스크리닝 분석에서 사용될 수 있다. 일반적인 용어에서, 새로 합성된 또는 확인된 화합물 (즉, 시험 화합물)을 방사성 표지된 공지의 리간드 및 수용체 사이에서 복합체 형성을 감소시키는 그의 능력에 의해 수용체에 대한 방사성 표지된 공지의 리간드의 결합을 감소시키는 그의 능력에 대해 평가할 수 있다.

시험 화합물의 부재 하에 방사성 표지된 공지의 리간드의 특이적 결합의 수준보다 낮은 시험 화합물의 존재 하에 방사성 표지된 공지의 리간드의 특이적 결합의 수준은 상기 방사성 표지된 공지된 리간드 및 상기 수용체 사이의 복합체가 시험 화합물의 부재 하보다 시험 화합물의 존재 하에 더 적음을 표시한다.

본 발명의 G 단백질-결합 수용체의 리간드인 것으로 공지된 화합물 및 수용체 사이의 복합체를 검출하기 위한 분석 프로토콜

A. 수용체의 제조

293 세포를 60 ㎕ 리포펙타민 (15-cm 접시당)을 사용하여 본 발명의 G 단백질-결합 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 10 ㎍ 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. 일시적으로 형질감염된 세포를 접시 내에서 24시간 동안 (75％ 융합도) 배지 교환하면서 성장시키고, 10 ml/접시의 Hepes-EDTA 버퍼 (20 mM Hepes + 10 mM EDTA (pH 7.4))로 제거하였다. 이어서, 세포를 Beckman Coulter 원심분리기에서 20분 동안 17,000 rpm (JA-25.50 rotor)에서 원심분리하였다. 후속적으로, 펠렛을 20 mM Hepes + 1 mM EDTA (pH 7.4) 내에 재현탁시키고, 50-ml Dounce 균질기로 균질화시키고, 다시 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후에, 펠렛을 결합 분석에서 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 분석에서 사용될 때, 막을 20분 동안 얼음 상에서 해동시킨 후, 10 mL의 인큐베이션 버퍼 (20 mM Hepes, 1 mM MgCl₂, 100 mM NaCl (pH 7.4))를 첨가하였다. 이어서, 막을 볼텍싱하여 조질 막 펠렛을 재현탁시키고, 세팅 6에서 Brinkmann PT-3100 Polytron 균질기를 사용하여 15초 동안 균질화시켰다. 막 단백질의 농도는 BRL 브래드포드 단백질 분석을 이용하여 결정하였다.

B. 결합 분석

총 결합을 위해, 총 부피 50 ㎕의 적절하게 희석된 막 (50 mM Tris HCl (pH 7.4), 10 mM MgCl₂, 및 1 mM EDTA을 함유하는 분석 버퍼 내에 희석시킴; 5-50 ㎍ 단백질)을 96-웰 폴리프로필렌 미세적정 플레이트에 첨가한 후, 100 ㎕의 분석 버퍼 및 50 ㎕의 방사성 표지된 공지의 리간드를 첨가하였다. 비특이적 결합에 대해, 50 ㎕의 분석 버퍼를 100 ㎕ 대신 첨가하고, 방사성 표지되지 않은 추가의 50 ㎕의 10 uM의 상기 공지의 리간드를 첨가한 후 50 ㎕의 상기 방사성 표지된 공지의 리간드를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 60-120분 동안 인큐베이팅하였다. 분석 플레이트를 Brandell 96-웰 플레이트 수거기가 있는 마이크로플레이트 디바이시즈 (Microplate Devices) GF/C Unifilter 여과 플레이트를 통해 여과함으로써 결합 반응을 종결시킨 후, 0.9％ NaCl을 함유하는 냉 50 mM Tris HCl (pH 7.4)로 세척하였다. 이어서, 여과 플레이트의 저변을 밀봉하고, 50 ㎕의 Optiphase Supermix를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트의 상단을 밀봉하고, 플레이트를 Trilux MicroBeta 섬광 계수기에서 계수하였다. 시험 화합물의 존재 하에 상기 방사성 표지된 공지의 리간드 및 상기 수용체 사이에 복합체가 더 적게 형성되는지 결정하기 위해, 100 ㎕의 분석 버퍼를 첨가하는 대신에 100 ㎕의 적절하게 희석시킨 상기 시험 화합물을 적절한 웰에 첨가한 후, 50 ㎕의 상기 방사성 표지된 공지의 리간드를 첨가하였다.

C. 계산

시험 화합물을 초기에 10, 1 및 0.1 μM에서 분석한 후, 중간 용량이 방사성 표지된 공지의 리간드 결합의 약 50％ 억제를 일으키도록 (즉, IC₅₀) 일정 범위의 농도를 선택하였다. 시험 화합물의 부재 하에 특이적 결합 (B_O)은 총 결합 (Bτ) - 비-특이적 결합 (NSB)의 차이이고, 유사하게 특이적 결합 (시험 화합물의 존재 하에) (B)은 치환 결합 (BD) - 비-특이적 결합 (NSB)의 차이이다. IC₅₀은 억제 반응 곡선 (％ B/B_O 대 시험 화합물의 농도의 로짓-로그 (logit-log) 플롯)으로부터 결정된다.

K_i는 쳉 및 프루스토프 (Cheng and Prustoff) 전환에 의해 계산된다:

식에서, [L]은 분석에 사용된 방사성 표지된 공지의 리간드의 농도이고, K_D는 동일한 결합 조건 하에 독립적으로 결정된 방사성 표지된 공지의 리간드의 해리 상수이다.

실시예 16

장내분비 세포에서 또는 창자의 L 세포 함유 구역으로부터 유래된 조직 내의 세포에서 또는 PYY 를 분비할 수 있는 세포에서 PYY 분비에 대한 GPR119 작용제의 효과

본 발명에 따른 GPR119 작용제는 본원에 설명되는 시험관내 분석을 이용하여 장내분비 세포, 예를 들어 장내분비 세포주에서, 또는 창자의 L 세포 함유 구역으로부터 유래된 조직 내의 장내분비 세포와 같은 세포에서 (예를 들어, 십이지장, 공장, 회장, 결장 또는 직장 조직; 예를 들어, 문헌 ([Lundberg et al, PNAS USA (1982) 79:4471-4475]; [Adrian et al, Gastroenterol (1985) 89:1070-1077]; [Ekblad et al, Peptides (2002) 23:251-261]; [Ueno et al, Regul Pept (2008) 145:12-16]) 참조) 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포에서 PYY 분비를 자극하는 것으로 나타날 수 있다. 장내분비 세포, 또는 창자의 L 세포 함유 구역으로부터 유래된 조직 내의 장내분비 세포와 같은 세포를 24-웰 플레이트 내에 제1 일에 완전 배양 배지 (DMEM/10％ FBS) 내에 플레이팅하였다. 제2 일에, 배양 배지를 저포도당 배지 (DMEM/3mM 포도당/10％ FBS)로 교체하였다. 제3 일에, 세포를 1xPBS로 2회 세척하였다. 세척한 세포를 비히클로 또는 GPR119 작용제로 다양한 농도 (예를 들어, 1 nM 내지 20 uM의 범위)에서 또는 양성 대조군으로서 포르스콜린 (1 uM)으로 15 mM 포도당을 함유하는 무혈청 DMEM 내에서 1시간 동안 37℃ 및 5％ CO₂에서 조직 배양 인큐베이터 내에서 자극하였다. 이어서, 상등액을 수집하고, 500 g 및 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 청정화하였다. 상등액 내로 방출된 총 PYY는 피닉스 파마슈티칼스, 인크.로부터 구입한 PYY EIA 키트 (펩티드 YY (PYY) (래트, 마우스, 돼지, 개) EIA 키트, 카탈로그 No. EK-059-03)를 사용하여 키트 내에 제공된 지시서에 따라 결정하였다.

PYY를 분비할 수 있는 세포는 장내분비 세포주일 수 있는 장내분비 세포, 창자의 L 세포 함유 구역으로부터 유래된 조직 내의 장내분비 세포일 수 있는 세포, 랑게르한스섬의 알파 세포, RINm5F일 수 있는 랑게르한스섬으로부터 유래된 세포주 (Bargsten, Arch Histol Cytol (2004) 67:79-94), 연수로부터의 조직 내에 있을 수 있는 뉴런 세포와 같은 세포, 뉴런 세포주, 및 재조합 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는 것으로 명백하게 고려된다.

실시예 17

마우스에서 죽종 형성에 대한 GPR119 작용제의 생체내 효과

수컷 apoE^-/- 마우스 (잭슨 래보래토리 (Jackson Laboratory, 미국 메인주 바 하버)에게 보통 사료 (normal chow)를 먹였다. 아포지단백질 E-결핍 (apoE^-/-) 마우스는 사료 식이 시에 광범한 죽상경화성 병변을 발병하는 죽상경화증의 확립된 동물 모델이다 [Zhang et al, Science (1992) 258:468-471]. 12주령에서, GPR119 작용제 또는 비히클 단독을 매일 경구 투여로 투여하였다. GPR119 작용제의 바람직한 용량은 0.1-100 mg/kg이다. 다른 바람직한 용량은 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1.0 mg/kg, 3.0 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg 및 100 mg/kg로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

마우스를 펜토바비탈 (50 mg/kg)의 복강내 주사로 마취시키고, 대동맥동 및 대동맥궁을 포함하는 심장을 GPR119 작용제의 투여 14일 후에 수거하였다. 심장을 또한 실험 개시 시에 조작되지 않은 마우스로부터 수거하였다. 각각의 3개의 실험군에 대해 10마리의 마우스를 사용하였다.

10％ 포르말린 내에 밤새 고정시킨 후 최적 절단 온도 화합물 (OCT; 사쿠라 파인테크니컬 코., 엘티디 (Sakura Finetechnical Co., Ltd)) 내에 포매된 대동맥동의 동결된 절편 (10 μM 두께)을 슬라이드 상에 탑재하였다. 판 크기의 분석을 위해, 각각의 마우스로부터 3개의 절편 (100 μM 떨어진)을 Oil Red O로 염색하였다. 병변 크기 및 병변 내의 지질 액적 직경을 영상 분석 컴퓨터 소프트웨어로 정량하고, 평균값을 결정하였다. GPR119 작용제를 투여한 군에 대한 평균값을 비히클을 단독 투여한 군에 대한 평균값과 비교하였다.

데이타를 평균±SEM으로 제시하고, 그들의 분포 패턴에 따라 스튜던츠 (Student) t 검정 또는 만-휘트니 (Mann-Whitney) U 검정에 의해 분석하였다. P<0.05의 값은 통계상 유의한 것으로 여겨진다 (예를 들어, 문헌 [Okamoto et al, Circulation (2002) 106:2767-2770] 참조).

이들 결과는 GPR119 작용제는 죽종 형성의 억제제임을 입증할 수 있다.

다른 실시태양에서 GPR119 작용제는 비-침습적 생체내 기술을 이용하여 아포E^-/- 마우스에서 죽종 형성의 억제제인 것으로 나타날 수 있음이 명백하게 고려된다 (예를 들어, 문헌 [Fayad et al, Circulation (1998) 98: 1541-1547] 참조). 다른 실시태양에서, 작용제의 투여가 경구 이외로, 예를 들어 작용제의 투여가 복강내 또는 정맥내인 것이 명백하게 고려된다. 다른 실시태양에서, 치료를 12주령 이외에서, 12주령보다 더 빨리 또는 더 늦게 시작하는 것이 명백하게 고려된다. 다른 실시태양에서 치료를 14일 이내 또는 초과 동안 계속하는 것이 명백하게 고려된다. 투여가 매일 이외일 수 있음이 명백하게 고려된다.

실시예 18

마우스에서 만성 염증성 관절염에 대한 GPR119 작용제의 생체내 효과

수컷 및 암컷 MRL-lpr 마우스 (잭슨 래보래토리)를 13-14주령에서 사용하였다. MRL-lpr 마우스는 세포 침윤, 판누스 (pannus) 형성, 뼈 및 연골 파괴, 및 혈청 류마티스 인자의 존재를 포함한, 인간 류마티스 관절염과 유사한 특징이 있는 만성 염증성 관절염을 자연적으로 발병한다. 질병은 정상적으로 동물 수명의 끝을 향해 발병하지만; 완전 프로인트 (Freund) 어쥬번트 (CFA)를 주사하면 조기 발병을 개시시키고, 관절염의 중증도를 증가시킨다 [Rakay et al, J Immunol (1993) 151:5081-5087].

각각의 실험의 제0일에, 모든 군의 마우스에게 열 불활성화시킨 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) H37 Ra (디프코 (Difco, 미국 미시건주 디트로이트))로 10 mg/ml로 보충한 0.05 ml CFA를 사용하여 CFA를 흉부 및 서혜부 부위 내로 피부내 주사하였다. 즉시, GPR119 작용제 또는 비히클 단독을 매일 경구 투여로 투여하였다. GPR119 작용제의 바람직한 용량은 0.1-100 mg/kg이다. 다른 바람직한 용량은 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1.0 mg/kg, 3.0 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg 및 100 mg/kg로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

처리를 30일 동안 계속하였다. 붓기 (swelling)를 정량하기 위해, 발목 폭을 마이크로미터 (micrometer)로 측정하였다. 발목 폭 측정의 짝을 이룬 세트의 통계적 비교는 스튜던츠 t 검정을 이용하여 얻었다.

조직병리학 분석

CFA 주입 30일 후에, 뒷발을 완충 포르말린 내에 고정시켰다. 10％ 포름산 내에서 48시간 동안 탈회시킨 후, 조직을 파라핀 포매를 위해 처리하였다. 족근-중족 관절의 연속 절편을 5 mm의 두께로 절단하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 절편을 실험 프로토콜을 모르는 개인이 검사하였다. 최소 10개의 절편/관절을 평가하고 스코어링하여 윤활막하 염증 (0, 정상; 1 국소 염증성 침윤물; 2, 세포 조직학을 특징짓는 염증성 침윤물), 윤활막 비대 (0, 정상; 1, 하나의 관절에서 보이는 연속적인 최소 3층 두께의 윤활막 내막 (lining); 2, 몇몇 관절에서 검출되는 최소 3층 두께의 윤활막 내막), 판누스 형성 및 연골 침식 (0, 정상; 1, 명백한 연뼈 손실 없이 연골 표면을 부분적으로 덮은 판누스; 2, 명백한 연뼈 손실에 연결된 판누스), 뼈 파괴 (0, 정상; 1, 판누스 또는 파골세포 활성에 의한 검출가능한 뼈 파괴; 2, 판누스 또는 파골세포 활성이 뼈의 유의한 부위를 파괴시킨다)의 반정량적 측정치를 제공하였고, 마지막으로, 전체 병리학은 이들 기준에 대한 값의 합에 의해 유래된 총 평가이다 (예를 들어, 문헌 [Gong et al, J Exp Med (1997) 186:131-137] 참조). 조직병리학 지표의 통계적 분석은 스튜던츠 t 검정을 이용하여 이루어졌다.

이들 결과는 GPR119 작용제가 만성 염증성 관절염의 억제제임을, 예를 들어 GPR119 작용제가 류마티스 관절염의 억제제임을 입증할 수 있다.

다른 실시태양에서, 작용제의 투여가 경구 이외로, 예를 들어 작용제의 투여가 복강내 또는 정맥내인 것이 명백하게 고려된다. 다른 실시태양에서, 치료를 13-14주령 이외에, 13-14주령보다 더 빨리 또는 더 늦게 시작하는 것이 명백하게 고려된다. 다른 실시태양에서 치료를 30일 이내 또는 초과 동안 계속하는 것이 명백하게 고려된다. 투여가 매일 이외일 수 있음이 명백하게 고려된다.

실시예 19

염증성 장 질병에 대한 동물 모델의 대장 손상의 감소

GPR119 작용제는 본질적으로 WO 03/105763에 설명된 바와 같이 동물 모델을 사용하여 염증성 장 질병으로부터 보호를 부여하는 것으로 나타날 수 있다.

방법

동물 준비 :

250-300 g의 10-11주령 수컷 HSD 래트를 12:12 명암 사이클로 수용시키고, 표준 설치류 식이 (Taklad L M 485 (미국 위스콘신주 매디슨)) 및 물에 자유롭게 접근하도록 하였다. 동물을 실험 전에 24시간 동안 굶겼다.

절차 :

만성 대장 염증의 단순하고 재현가능한 래트 모델은 문헌 [Morris et al (Gastroenterology (1989) 96:795-803)]에서 이전에 설명되었다. 이는 염증 및 궤양형성의 비교적 긴 지속시간을 보여서, 특이적으로 제어된 방식으로 대장 염증성 질병의 병태생리학을 연구하기 위해 및 잠재적으로 인간에서 염증성 장 질병에 적용가능한 새로운 치료를 평가하기 위해 기회를 제공한다.

래트를 3％ 이소플루오란으로 마취시키고, 37℃로 설정된 조절된 가열 패드에 놓았다. 위관영양 (gavage) 바늘을 직장으로 대장 7 cm 내로 삽입하였다. 50％ 에탄올 (v/v)에 용해시킨 합텐 트리니트로벤젠술폰산 (TNBS)을 위관영양 바늘을 통해 30 mg/kg의 용량으로 0.4-0.6 mL의 총 부피 내에 대장 내강으로 전달하였다. 대조군에는 염수 용액 (NaCl 0.9％)을 대장내 투여하였다.

대장염 유도 4일 후에, 대장을 마취시킨 래트로부터 절제한 후, 래트를 경추탈골로 안락사시켰다. 절제된 대장 및 비장의 중량을 측정하고, 대장을 평가 척도 (rating scale) (0 = 손상 없음, 1 = 국소화 충혈 (hyperemia)이 있지만 궤양 없음, 2 = 유의한 염증이 없는 선형 궤양, 3 = 하나의 부위에 염증이 있는 선형 궤양, 4 = 2 이상의 부위의 궤양형성 및/또는 염증, 5 = 2 이상의 주요 부위의 염증 및 궤양형성, 또는 대장의 길이를 따라 >1 cm 연장하는 하나의 주요 부위의 염증 및 궤양형성)에 따른 거시 형태학적 손상의 스코어링을 위해 사진을 찍은 후, 3 부위로 나누었다. 맹장으로부터 1 cm의 대장 조각을 10％ 포르말린 내에 고정시켰다. 다른 조각들을 드라이 아이스 상에서 즉시 동결시켰다.

염증은 충혈 및 장벽 비후화의 구역으로서 정의한다. 결장을 실험 치료에 대해 모르는 몇몇 관찰자가 독립적으로 관찰하였다.

상기 분석을 위해, 5개의 처리군을 다음과 같이 구성하였다:

A군 (n=3). 염수로 경구 처리한 대장내 염수;

B군 (n=8). 염수의 경구 처리 후, 30 mg/kg TNBS에 의한 대장염의 유도;

C군 (n=10). 실험군 - 30 mg/kg TNBS에 의한 대장염의 유도 전 2일, 유도 후 2일, 및 유도 전 30 min 동안 GPR119 작용제 (예를 들어, 30 mg/kg의 용량)로 매일 2회 경구 처리.

D군 (n=9). 양성 대조군 - 30 mg/kg TNBS에 의한 대장염의 유도 전 60 min에 Depo-Medrol 600 ㎍/kg의 근육내 주사;

E군 (n=10). 양성 대조군, 대장염 유도전 60 min 및 그 후 매일 0.5 mL 염수 내의 200 mg/kg 대장내 투여로 5-아미노 살리실산 (시그마) 현탁액.

GPR119 작용제의 바람직한 용량은 0.1-100 mg/kg이다. 다른 바람직한 용량은 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1.0 mg/kg, 3.0 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg 및 100 mg/kg로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

다른 실시태양에서, 작용제의 투여가 경구 이외로, 예를 들어 작용제의 투여가 피하 또는 정맥내인 것이 명백하게 고려된다.

실시예 20

마우스에서 카이네이트 발작에 대한 GPR119 작용제의 효과

GPR119 작용제는 본질적으로 문헌 [Woldbye et al (Neurobiology of Disease (2005) 20:760-772)]에 설명된 바와 같이 동물 모델을 사용하여 마우스에서 카이네이트 발작으로부터 보호를 부여하는 것으로 나타날 수 있다.

수컷 NMRI 마우스 (타코닉 엠앤비 (Taconic M&B, DK); 23-30 g)에게 10 mM 포스페이트-완충 염수 (PBS, 0.13 M NaCl, 7 mM Na₂HPO₄, 3 mM NaH₂PO₄) 내의 0.05％ 소 혈청 알부민을 함유하는 비히클 내에 GPR119 작용제를 예를 들어, 0.2, 1, 10, 20 또는 30 mg/kg의 용량으로 경구로 투여하였다 (n = 7-8). 대조군에게 비히클만을 경구 투여로 투여하였다 (n = 28). 5분 후에, 모든 동물에게 등장 염수 내에 용해시키고 pH 7.4로 조정한 카이네이트 (30 mg/kg; #2020, 오션 프로듀스 인터내셔널 (Ocean Produce International, 캐나다))를 피하 주사하고; 발작 중증도를 문헌 [Marsh et al (PNAS USA (1999) 96:13518-13523)]의 변형된 평가 척도에 따라 스코어링하였다: 0 = 발작 활동 없음, 1 = 노려보기 또는 안면 운동, 2 = 머리 끄덕임 또는 단절된 연축 (twitch), 3 = 앞다리 간대성 경련 (clonus)이 있는 운동 발작, 4 = 뒷발로 서기가 있는 운동 발작, 5 = 자세 상실 또는 간질 지속 상태 (적어도 10 min의 연속적 운동 발작 활동)이 있는 운동 발작, 6 = 사멸. 제1 운동 발작 (적어도 3으로서 스코어링될 때) 및 자세 상실이 있는 운동 발작에 대한 발작 스코어 및 지연은 마우스 정체를 모르는 관찰자가 각각의 처리군에 대해 결정하였다.

다른 실시태양에서, 작용제의 투여가 경구 이외로, 예를 들어 작용제의 투여가 복강내 또는 정맥내인 것이 명백하게 고려된다. 카이네이트의 피하 주사가 별법으로 5분을 초과하는 GPR119 작용제의 투여 후 일정 시간에 수행될 수 있음이 명백하게 고려된다.

실시예 21

마른 마우스에서 음식 섭취에 대한 GPR119 작용제의 효과

GPR119 작용제는 본질적으로 문헌 [Ortiz et al (JPET (2007) 323:692-700)]에 설명된 바와 같이 굶기고 다시 먹이를 준 마른 마우스를 사용하여 음식 섭취를 감소시키는 것으로 나타날 수 있다.

마른 C57BL/6 마우스 타코닉 팜스 ((Taconic Farms, 미국 뉴욕주 저먼타운))을 12-h 명암 사이클에서 제어된 온도 및 습도로 최소 1주 적응시켰다. 마우스를 격자 바닥이 있는 케이지 내에 쌍으로 수용하고, 음식과 물 (표준 사료 펠렛 식이)이 연속적으로 이용가능하도록 하였다. 연구는 처리군 당 20마리 마우스를 포함하였다. 마우스를 암 주기 동안 물을 이용가능하도록 하면서 밤새 굶기고 (18 h), USP 염수 내의 GPR119 작용제 (예를 들어, 30 mg/kg의 용량) 또는 비히클만을 경구 투약하였다. 투약 30 min 후에 미리 계량한 음식을 제공하고, 누적 음식 섭취를 72 h에 걸쳐 측정하였다 (예를 들어, 1 h, 2h, 4 h, 24 h, 48 h, 및 72 h에서).

다른 실시태양에서, 작용제의 투여가 경구 이외로, 예를 들어 작용제의 투여가 복강내 또는 정맥내인 것이 명백하게 고려된다.

실시예 22

식이-유도 비만 ( DIO ) 마우스에서 체중 및 혈장 아디포넥틴에 대한 GPR119 작용제의 효과

GPR119 작용제는 본질적으로 문헌 [Ortiz et al (JPET (2007) 323:692-700)]에 설명된 바와 같이 식이 유도 비만 (DIO) 마우스를 사용하여 체중 감소 및 혈장 아디포넥틴 증가를 제공하는 것으로 나타날 수 있다.

수컷 C57BL/6 마우스 (타코닉 팜스)에게 지방으로부터 45％ 칼로리를 함유하는 고지방 식이 (설치류 식이 D12451; 리써치 다이어츠, 인크. (Research Diets, Inc, 미국 뉴저지주 뉴 브런스위크)를 20 내지 22주 동안 먹였고, 이들은 표준 사료 펠렛 식이 (지방으로부터 5％ 칼로리)를 먹인 마우스보다 평균 체중이 약 5 SD를 초과하였다. 연구는 처리군 당 10마리 마우스를 포함하였다. 마우스를 표준 동물실 내에 제어된 온도 및 습도 하에 12/12-h 명암 사이클로 유지하였다. 물 및 음식은 연속적으로 이용가능하였다. 동물을 격자 바닥에 4일 동안 적응시키고, 비히클 (USP 염수)를 추가로 4일 동안 투약한 후, 2일의 기준선 체중 및 24-h 음식 및 물 소비를 기록하였다. 마우스를 체중의 초기 평균 및 평균의 표준 오차가 유사하도록 그들의 체중에 기초하여 처리군에 배정하였다. 동물에게 USP 염수 내의 GPR119 작용제 (예를 들어, 30 mg/kg의 용량에서) 또는 비히클만을 매일 암 주기 전에 경구로 투여하고, 및 체중과 음식 및 물 소비를 측정하였다. 동물에게 40일 동안 매일 투약하였다.

아디포넥틴 분석을 위해 혈액을 제40일에 후안와 출혈에 의해 수집하고; 혈장 아디포넥틴을 마우스 아디포넥틴 ELISA 키트 (카탈로그 No. EZMADP-60K; 밀리포어 코프. (Millipore Corp., 미국 매사추세츠주 빌레리카))를 사용하여 제조자의 지시에 따라 측정하였다.

실시예 23

식이 유도 비만 ( DIO ) 마우스에서 혈장 포도당, 혈장 인슐린, 및 포도당 처리에 대한 GPR119 작용제의 효과

GPR119 작용제는 본질적으로 문헌 [Ortiz et al (JPET (2007) 323:692-700)]에 설명된 바와 같이, 2형 당뇨병에 대한 위험과 연관된 식이 유도 비만 (DIO) 마우스의 대사 파라미터, 예를 들어 포도당 처리 (굶긴 마우스에서 포도당 처리, 예를 들어 OGTT 후의 포도당 처리를 증가시키도록), 혈장 포도당 수준 (먹이를 먹인 마우스에서 혈액 포도당을 감소시키도록), 및 혈장 인슐린 수준 (굶긴 마우스에서 혈장 인슐린을 증가시키도록)에서 양호한 개선을 제공하는 것으로 나타날 수 있다.

수컷 C57BL/6 마우스 (타코닉 팜스)에게 지방으로부터 45％ 칼로리를 함유하는 고지방 식이 (설치류 식이 D12451; 리써치 다이어츠, 인크.)를 20 내지 22주 동안 먹였고, 이들은 표준 사료 펠렛 식이 (지방으로부터 5％ 칼로리)를 먹인 마우스보다 평균 체중이 5 SD를 초과하였다. 연구는 처리군 당 10마리 마우스를 포함하였다. 마우스를 표준 동물실 내에 제어된 온도 및 습도 하에 12/12-h 명암 사이클로 유지하였다. 물 및 음식은 연속적으로 이용가능하였다. 동물을 격자 바닥에 4일 동안 적응시키고, 비히클 (USP 염수)를 추가로 4일 동안 투약한 후, 2일의 기준선 체중 및 24-h 음식 및 물 소비를 기록하였다. 마우스를 체중의 초기 평균 및 평균의 표준 오차가 유사하도록 그들의 체중에 기초하여 처리군에 배정하였다.

동물에게 USP 염수 내의 GPR119 작용제 (예를 들어, 30 mg/kg의 용량에서) 또는 비히클만을 매일 암 주기 전에 경구 투여하였다. 동물에게 11일 동안 매일 투약하였다. 혈액 샘플을 먹이를 먹인 마우스의 꼬리로부터 수집하고, 처리 제 10일에 Ascensia 포도당 측정기 (바이엘 헬쓰케어 (Bayer Healthcare, 미국 뉴욕주 태리타운))로 분석하였다. 음식을 급식기 전에 5 h 제거하고, 동물을 14 h 동안 굶긴 후, 인슐린 분석을 위해 후안와 출혈을 이용하여 혈액을 수집하였다. 경구 포도당 내성 시험 (OGTT)을 2 g/kg 포도당의 경구 투여 이후 후안와 출혈 2 h 후에 수행하고, 꼬리 혈액 포도당을 30-min 간격으로 3 h 동안 측정하였다. 인슐린을 효소-연결 면역흡착 분석 (EIA) (알프코 다이아그노스틱스 (Alpco Diagnostics, 미국 뉴햄프셔주 윈드햄))에 의해 측정하였다.

다른 실시태양에서, 작용제의 투여가 경구 이외로, 예를 들어 작용제의 투여가 피하 또는 정맥내인 것이 명백하게 고려된다. 다른 실시태양에서, 복강내 포도당 내성 시험 (IPGTT)을 2 g/kg 포도당의 복강내 투여 이후 후안와 출혈 2 h 후에 수행하는 것이 명백하게 고려된다.

실시예 24

말초 동맥 부전의 래트 모델에서 측부 의존성 혈류에 대한 GPR119 작용제의 효과

GPR119 작용제는 본질적으로 문헌 [Cruze et al (Peptides (2007) 28:269-280)]에 설명된 바와 같이, 종종 간헐성 파행 (intermittent claudication)의 증상을 보이는 큰 혈관 폐쇄 질병의 특징인 급성 발현 말초 동맥 부전의 래트 모델을 이용하여 측부 의존성 혈류를 증가시키는 것으로 나타날 수 있다.

말초 동맥 부전을 성체 수컷 스프라그-돌리 래트 (325-350 g; 타코닉 팜스, 인크.)에서 서혜 인대에 원위인 대퇴 동맥의 양측 폐쇄로 확립시켰다. 동일한 외과 절차에서, 14일 삼투 펌프 (Alzet®)에 연결된 카테터를 혈관 성장 인자-A (잔기 1-165) (VEGF₁₆₅)를 15 ㎍/kg/일 용량으로 전신 전달하기 위해 측부 팽창의 부위 가까이 주입을 위해 엉덩 동맥 내로 삽입하고; GPR119 작용제 (예를 들어, 30 mg/kg의 용량으로) 및 비히클 단독 (포스페이트 완충 염수, 10％ 시트르산나트륨, 1.6％ 글리세롤, 0.008％ Tween 20)을 매일 경구 투여로 투여하였다. 모든 물질은 조사자에게 맹검 방식으로 공급하고 투여하였다. 혈류에 대한 GPR119 작용제 또는 VEGF₁₆₅의 임의의 급성 효과를 제거하기 위해 혈류를 제 16일에 측정하였다. 문헌 [Yang et al (Am J Physiol Heart Circ Phys (2000) 278:H1966-H1973)]에 설명된 바와 같이, 근육 혈류를 트레드밀 (treadmill) 달리기 동안 방사성 표지된 미세구를 사용하여 맹검 방식으로 결정하였다. 사용된 VEGF₁₆₅의 용량 (15 ㎍/kg/일)에서는 상기 모델에서 측부 의존성 혈류의 최대-근사 증가를 일으켰다 (Cruze et al, Peptides (2007) 28:269-280).

다른 실시태양에서, 작용제의 투여가 경구 이외로, 예를 들어 작용제의 투여가 예를 들어, 30 mg/kg/일의 용량에서 정맥내 주입에 의한 것이 명백하게 고려된다. GPR119 작용제의 바람직한 주입 용량은 0.1-100 mg/kg/일이다. 다른 바람직한 주입 용량은 0.1 mg/kg/일, 0.3 mg/kg/일, 1.0 mg/kg/일, 3.0 mg/kg/일, 10 mg/kg/일, 30 mg/kg/일 및 100 mg/kg/일로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

실시예 25

생체내 래트 모델에서 혈관활성 장 펩티드 ( VIP )-유도된 공장 분비에 대한 GPR119 작용제의 효과

GPR119 작용제는 본질적으로 문헌 ([Balasubramaniam et al (J Med Chem (2000) 43:3420-3427)] 및 [Souli et al (Peptides (1997) 18:551-557)])에 설명된 바와 같이, 혈관활성 장 펩티드 (VIP)-유도된 공장 분비의 생체내 래트 모델을 사용하여 장 상피에서 분비를 감소시키는 것으로 나타날 수 있다. 문헌 [Balasubramaniam et al (J Med Chem (2000) 43:3420-3427)]에서는 또한 상기 분석에서 활성을 갖는 PYY의 유사체를 설명하고 있다.

수컷 Wistar 래트 (챨스 리버 래보래토리스, 인크. (Charles River Laboratories, Inc., 미국 매사추세츠주 윌밍턴))를 마취시키고, 약물을 주입하기 위해 복재 (saphenous) 정맥을 캐눌라 연결하였다. 복부를 개방하고, 공장 루프 (~20 cm long)를 2개의 결찰 (ligature)에 의해 한계를 결정하였다. 시간 0에서, 37℃로 예열시킨 2 mL의 0.9％ 염수를 공장 루프 내에 넣었다. 이어서, 루프를 복부에 되돌려 넣고 닫았다. VIP (30 ㎍/kg/시)를 복재 정맥을 통해 2.5 mL/시의 속도로 시간 0에서 시작하여 30분 동안 주입하였다. GPR119 작용제 (예를 들어, 30 mg/kg의 용량에서) 또는 염수 (대조군)을 VIP 주입의 시작 15 min 전에 볼러스 용량으로 경구 투여하였다. 실험의 끝에, 래트를 희생시키고, 공장 루프를 절제하였다. 이어서, 루프를 넣어진 유체를 제거하기 전후에 측정하고 계량하였다. 순수 물 유입 (flux) (㎕/cm/30 min으로서 표현함)을 다음 식을 이용하여 계산하였다: (F-E - 2000)/L (식에서, F 및 E는 남아있는 유체를 비우기 전후의 루프의 중량 (mg)이고, L은 루프의 길이 (cm)이고, 2000은 처음에 넣어진 유체의 부피 (㎕)이다). 순수 흡수는 음의 값으로 표시되고, 순수 분비는 양의 값으로 표시된다. 각각의 용량을 6-8마리의 동물에서 조사하였다.

실시예 26

생체내 개 모델에서 장 흡수에 대한 GPR119 작용제의 효과

GPR119 작용제는 본질적으로 문헌 [Balasubramaniam et al (J Med Chem (2000) 43:3420-3427)]에 설명된 바와 같이, 생체내 개 모델에서 장 상피에서 흡수를 증가시키는 것으로 나타날 수 있다. 문헌 [Balasubramaniam et al (J Med Chem (2000) 43:3420-3427)]에서는 또한 상기 분석에서 활성을 갖는 PYY의 유사체를 설명하고 있다.

기초 조건 하에 공장, 회장 및 결장에 의한 물 및 전해질 흡수에 대한 GPR119 작용제의 생체내 효과를 본질적으로 문헌 ([Bilchik et al (Gastroenterology (1993) 105:1441-1448)] 및 [Bilchik et al (Am J Surg (1994) 167:570-574)])에 보다 상세히 설명된 바와 같이, 공장, 회장 및/또는 결장 Thiry-Vella 루프를 장치한 의식이 있는 개에서 조사하였다. 각각의 실험은 90-mm 기초 기간, 이어서 150-min 실험 기간으로 이루어졌다. 소장 조각을 근위 캐눌라를 통해 롤러 (roller) 펌프를 사용하여 2 mL/min로 관류시켰다. 관류액 (pH 7.4)은 37℃로 유지시키고, (단위 nmol/L) 140 Na⁺, 5.2 K⁺, 119.8Cl^-, 25 HCO₃, 1.2 Ca² ⁺, 1.2 Mg² ⁺, 2.4 HPO₂ ⁴ ^-, 0.4 H₂PO₄ ^-, 10 포도당 및 10 μC [¹⁴C]폴리(에틸렌 글리콜)를 5 g/L 폴리(에틸렌 글리콜)로 함유하였다. 20-min 세척기 후에, 관류액을 Na⁺, Cl^- 및 물 함량의 결정을 위해 15 min마다 모았다.

GPR119 작용제는 시간 0에서, 예를 들어 30 mg/kg의 용량으로 경구로 투여하였다.

다른 실시태양에서, 작용제의 투여가 경구 이외로, 예를 들어 작용제의 투여가 시간 0에서 시작하여, 예를 들어 30 mg/kg/일의 용량으로 관강내 (intraluminal) 주입에 의한 것이 명백하게 고려된다. GPR119 작용제의 바람직한 주입 용량은 0.1-100 mg/kg/시이다. 다른 바람직한 주입 용량은 0.1 mg/kg/시, 0.3 mg/kg/시, 1.0 mg/kg/시, 3.0 mg/kg/시, 10 mg/kg/시, 30 mg/kg/시 및 100 mg/kg/시로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

실시예 27

마우스에서 피마자유-유도된 배변 및 설사 증상에 대한 설사의 억제

GPR119 작용제는 본질적으로 EP 1902730에 설명된 바와 같이, 피마자유-유도된 배변 및 설사 증상 마우스 모델을 사용하여 설사 증상을 억제하는 것으로 나타날 수 있다.

C57BL/6 마우스를 사용하였다. 마우스를 설치류 사료 (CE-2, 니뽄 씨엘이에이 (Nippon CLEA)) 및 음용수에 자유롭게 접근하도록 하면서 제어된 환경 (온도: 23℃, 상대 습도: 55％, 명 시간: 7:00에서 19:00까지)의 동물실 내에서 바닥 매트가 깔린 케이지 내에 개별적으로 수용하였다.

GPR119 작용제 (예를 들어, 30 mg/kg의 용량에서), 통상적인 지사제 로페라미드 (1 mg/kg), 통상적인 지사제 아트로핀 (10 mg/kg), 또는 비히클만을 마우스에 각각 경구 투여, 복강내 투여, 복강내 투여 및 경구 투여로 투여하고, 투여 15분 후에, 피마자유 (0.3 ml/동물)를 마우스에 경구 투여하였다. 대변 중량 및 설사 스코어 (정상: 0, 연한 대변: 1, 설사: 2)를 시간-의존 방식 (투여 1, 2, 및 4시간 후)으로 측정하였다. 동시에, 비히클만을 투여하고 피마자유를 투여하지 않은 마우스에 대해 동일한 측정을 수행하였다.

실시예 28

경구 생체이용률

본 발명의 화합물, 예를 들어 GPR119 작용제, PYY 분비촉진제, PYY에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 유용한 화합물, 또는 PYY-관련 활성의 조절에 유용한 화합물의 경구 생체이용률을 직접 평가하기 위한 물리화학적 분석 방안은 당업자에게 잘 알려져 있고 사용될 수 있다 (예를 들어, 비제한적으로 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 ([Wong PC et al., Cardiovasc Drug Rev (2002) 20: 137-52]; 및 [Buchan P et al., Headache (2002) Suppl 2:S54-62]) 참조). 추가의 비제한적인 예로서, 상기 대안적인 분석 방안은 액체 크로마토그래피-직렬 (tandem) 질량 분석법을 포함할 수 있다 (각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 ([Chavez-Eng CM et al., J ChromatogrB Analyt Technol Biomed Life Sci (2002) 767:117-29]; [Jetter A et al., Clin Pharmacol Ther (2002) 71:21-9]; [Zimmerman JJ et al., J Clin Pharmacol (1999) 39:1155-61]; 및 [Barrish A et al., Rapid Commun Mass Spectrom (1996) 10:1033-7]) 참조). 최근에, 양전자 방출 단층촬영 (PET)가 약물의 경구 투여 후에 포유동물 신체에서 경구 생체이용률을 포함한 약물 분포의 직접 측정치를 얻기 위해 성공적으로 사용되었다 (그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Gulyas et al., Eur J Nucl Med Mol Imaging (2002) 29: 1031-8] 참조).

상기한 명세서는 본 발명의 원리를 교시하고 실시예는 예시의 목적으로 제공되지만, 본 발명의 실시는 다음 특허청구범위 및 그의 동등물의 범위 내에 있는 모든 보통의 변이, 개조 또는 변형을 포함함이 이해될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Arena Pharmaceuticals Inc. Chu, Zhi-Liang Leonard, James Jones, Robert M. <120> METHODS OF USING A G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR TO IDENTIFY PEPTIDE YY (PYY) SECRETAGOGUES AND COMPOUNDS USEFUL IN THE TREATMENT OF CONDITIONS MODULATED BY PYY <130> 157.US2 22578-0018001 <140> US 12/391,097 <141> 2009-02-23 <150> US 61/123,273 <151> 2008-04-07 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1008 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 1 atggaatcat ctttctcatt tggagtgatc cttgctgtcc tggcctccct catcattgct 60 actaacacac tagtggctgt ggctgtgctg ctgttgatcc acaagaatga tggtgtcagt 120 ctctgcttca ccttgaatct ggctgtggct gacaccttga ttggtgtggc catctctggc 180 ctactcacag accagctctc cagcccttct cggcccacac agaagaccct gtgcagcctg 240 cggatggcat ttgtcacttc ctccgcagct gcctctgtcc tcacggtcat gctgatcacc 300 tttgacaggt accttgccat caagcagccc ttccgctact tgaagatcat gagtgggttc 360 gtggccgggg cctgcattgc cgggctgtgg ttagtgtctt acctcattgg cttcctccca 420 ctcggaatcc ccatgttcca gcagactgcc tacaaagggc agtgcagctt ctttgctgta 480 tttcaccctc acttcgtgct gaccctctcc tgcgttggct tcttcccagc catgctcctc 540 tttgtcttct tctactgcga catgctcaag attgcctcca tgcacagcca gcagattcga 600 aagatggaac atgcaggagc catggctgga ggttatcgat ccccacggac tcccagcgac 660 ttcaaagctc tccgtactgt gtctgttctc attgggagct ttgctctatc ctggaccccc 720 ttccttatca ctggcattgt gcaggtggcc tgccaggagt gtcacctcta cctagtgctg 780 gaacggtacc tgtggctgct cggcgtgggc aactccctgc tcaacccact catctatgcc 840 tattggcaga aggaggtgcg actgcagctc taccacatgg ccctaggagt gaagaaggtg 900 ctcacctcat tcctcctctt tctctcggcc aggaattgtg gcccagagag gcccagggaa 960 agttcctgtc acatcgtcac tatctccagc tcagagtttg atggctaa 1008 <210> 2 <211> 335 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 2 Met Glu Ser Ser Phe Ser Phe Gly Val Ile Leu Ala Val Leu Ala Ser 1 5 10 15 Leu Ile Ile Ala Thr Asn Thr Leu Val Ala Val Ala Val Leu Leu Leu 20 25 30 Ile His Lys Asn Asp Gly Val Ser Leu Cys Phe Thr Leu Asn Leu Ala 35 40 45 Val Ala Asp Thr Leu Ile Gly Val Ala Ile Ser Gly Leu Leu Thr Asp 50 55 60 Gln Leu Ser Ser Pro Ser Arg Pro Thr Gln Lys Thr Leu Cys Ser Leu 65 70 75 80 Arg Met Ala Phe Val Thr Ser Ser Ala Ala Ala Ser Val Leu Thr Val 85 90 95 Met Leu Ile Thr Phe Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Lys Gln Pro Phe Arg 100 105 110 Tyr Leu Lys Ile Met Ser Gly Phe Val Ala Gly Ala Cys Ile Ala Gly 115 120 125 Leu Trp Leu Val Ser Tyr Leu Ile Gly Phe Leu Pro Leu Gly Ile Pro 130 135 140 Met Phe Gln Gln Thr Ala Tyr Lys Gly Gln Cys Ser Phe Phe Ala Val 145 150 155 160 Phe His Pro His Phe Val Leu Thr Leu Ser Cys Val Gly Phe Phe Pro 165 170 175 Ala Met Leu Leu Phe Val Phe Phe Tyr Cys Asp Met Leu Lys Ile Ala 180 185 190 Ser Met His Ser Gln Gln Ile Arg Lys Met Glu His Ala Gly Ala Met 195 200 205 Ala Gly Gly Tyr Arg Ser Pro Arg Thr Pro Ser Asp Phe Lys Ala Leu 210 215 220 Arg Thr Val Ser Val Leu Ile Gly Ser Phe Ala Leu Ser Trp Thr Pro 225 230 235 240 Phe Leu Ile Thr Gly Ile Val Gln Val Ala Cys Gln Glu Cys His Leu 245 250 255 Tyr Leu Val Leu Glu Arg Tyr Leu Trp Leu Leu Gly Val Gly Asn Ser 260 265 270 Leu Leu Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Tyr Trp Gln Lys Glu Val Arg Leu 275 280 285 Gln Leu Tyr His Met Ala Leu Gly Val Lys Lys Val Leu Thr Ser Phe 290 295 300 Leu Leu Phe Leu Ser Ala Arg Asn Cys Gly Pro Glu Arg Pro Arg Glu 305 310 315 320 Ser Ser Cys His Ile Val Thr Ile Ser Ser Ser Glu Phe Asp Gly 325 330 335 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gtcctgccac ttcgagacat gg 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gaaacttctc tgcccttacc gtc 23

Claims

(a) 시험 화합물을 숙주 세포와 또는 G 단백질-결합 수용체를 포함하는 숙주 세포의 막과 접촉시키고, 여기서 G 단백질-결합 수용체는
(i) 서열 2의 아미노산 1-335;
(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;
(iii) (i)에 규정된 아미노산 서열의 하나 또는 몇 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 (i)로부터 유래된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열;
(iv) 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열;
(v) (a') 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열; 및 (b') 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열
로 이루어지는 군 중에서 선택될 때의 서열 2의 변이체의 아미노산 서열;
(vi) 서열 2를 갖는 구성적 활성 버전의 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열; 및
(vii) (i) 내지 (vi) 중의 임의의 하나의 생물학적 활성 단편
으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 단계;
(b) 시험 화합물이 수용체의 기능성을 자극하는 능력을 결정하는 단계
를 포함하고, 여기서 시험 화합물이 수용체의 기능성을 자극하는 능력은 시험 화합물이 펩티드 YY (PYY) 분비촉진제임을 나타내는 것인 방법에서, PYY를 확인하기 위한 G 단백질-결합 수용체의 용도.
제1항에 있어서,
(c) 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 시험관 내에서 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키는 단계; 및
(d) 화합물이 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포로부터 PYY 분비를 자극하는지를 결정하는 단계
를 더 포함하고; 여기서 시험 화합물이 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포로부터 PYY 분비를 자극하는 능력은 시험 화합물이 PYY 분비촉진제임을 더 나타내는 것인 용도.
제1항에 있어서,
(c) 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 사전에 투여한 척추동물로부터 얻은 샘플 내의 PYY 수준을 화합물이 증가시키는지를 결정하는 단계
를 더 포함하고; 여기서 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 PYY 분비촉진제임을 더 나타내는 것인 용도.
제1항에 있어서,
(c) 단계 (b)에서 수용체의 기능성을 자극하는 화합물을 척추동물에게 투여하는 단계; 및
(d) 화합물이 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계
를 더 포함하고; 여기서 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 PYY 분비촉진제임을 더 나타내는 것인 용도.
제3항 또는 제4항에 있어서, 척추동물이 비-인간 척추동물인 용도.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체가 재조합체인 용도.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 발현 벡터를 포함하고, 상기 발현 벡터가 G 단백질-결합 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 용도.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정이 제2 메신저 수준의 측정을 통해 수행되는 것인 용도.
제8항에 있어서, 제2 메신저가 시클릭 AMP (cAMP), 시클릭 GMP (cGMP), 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트 (IP₃), 디아실글리세롤 (DAG), MAP 키나제 활성, MAPK/ERK 키나제 키나제-1 (MEKK1) 활성 및 Ca² ⁺로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 용도.
제9항에 있어서, cAMP의 수준이 증가되는 것인 용도.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정이 멜라닌 보유 세포 (melanophore) 분석의 사용, 상기 GPCR을 포함하는 막에 대한 GTPγS 결합의 측정, 또는 리포터 분석을 통해 수행되는 것인 용도.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 숙주 세포이거나, 숙주 세포가 효모 숙주 세포이거나, 숙주 세포가 멜라닌 보유 세포 숙주 세포인 용도.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 화합물이 소분자인 용도.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체가 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열을 포함하는 것인 용도.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체가 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 용도.
(a) 시험 화합물을 시험관 내에서 숙주 세포와 또는 G 단백질-결합 수용체를 포함하는 숙주 세포의 막과 접촉시키고, 여기서 G 단백질-결합 수용체는
(i) 서열 2의 아미노산 1-335;
(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;
(iii) (i)에 규정된 아미노산 서열의 하나 또는 몇 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 (i)로부터 유래된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열;
(iv) 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열;
(v) (a') 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열; 및 (b') 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열
로 이루어지는 군 중에서 선택될 때의 서열 2의 변이체의 아미노산 서열;
(vi) 서열 2를 갖는 구성적 활성 버전의 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열; 및
(vii) (i) 내지 (vi) 중의 임의의 하나의 생물학적 활성 단편
으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 단계;
(b) 시험 화합물이 수용체의 기능성을 자극하는 능력을 결정하는 단계
를 포함하고, 여기서 시험 화합물이 수용체의 기능성을 자극하는 능력은 시험 화합물이 펩티드 YY (PYY) 분비촉진제임을 나타내는 것인, PYY 분비촉진제를 확인하는 방법.
(a) GPR119 작용제가 사전에 투여되지 않은 척추동물 참조 샘플에 비해 GPR119 작용제가 사전에 투여된 척추동물로부터 얻은 샘플 내의 PYY 수준이 증가되는지를 결정하는 단계
를 포함하고; 여기서 샘플 내의 PYY 수준을 증가시키는 GPR119 작용제의 능력은 GPR119 작용제가 PYY 분비촉진제임을 더 나타내는 것인, PYY 분비촉진제를 확인하는 방법.
(a) GPR119 작용제를 척추동물에게 투여하는 단계; 및
(b) GPR119 작용제가 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계
를 포함하고; 여기서 GPR119 작용제가 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는 능력은 GPR119 작용제가 PYY 분비촉진제임을 나타내는 것인, PYY 분비촉진제를 확인하는 방법.
(a) GPR119 작용제를 시험관 내에서 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키는 단계; 및
(b) GPR119 작용제가 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포로부터 PYY 분비를 자극하는지를 결정하는 단계
를 포함하고; 여기서 GPR119 작용제가 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포로부터 PYY 분비를 자극하는 능력은 GPR119 작용제가 PYY 분비촉진제임을 나타내는 것인, PYY 분비촉진제를 확인하는 방법.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 척추동물이 비-인간 척추동물인 방법.
(a) G 단백질-결합 수용체를 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에 수용체에 대한 임의로 표지된 공지의 리간드와 접촉시키고, 여기서 수용체에 대한 리간드는 GPR119에 대한 리간드이고, G 단백질-결합 수용체는
(i) 서열 2의 아미노산 1-335;
(ii) 서열 2의 아미노산 2-335;
(iii) (i)에 규정된 아미노산 서열의 하나 또는 몇 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 (i)로부터 유래된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열;
(iv) 엄격한 조건 하에 서열 1의 보체에 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열;
(v) (a') 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열; 및 (b') 서열 2의 적어도 20개의 인접한 아미노산을 포함하는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열
로 이루어지는 군 중에서 선택될 때의 서열 2의 변이체의 아미노산 서열;
(vi) 서열 2를 갖는 구성적 활성 버전의 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열; 및
(vii) (i) 내지 (vi) 중의 임의의 하나의 생물학적 활성 단편
으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고 것인 단계;
(b) 상기 공지의 리간드 및 상기 수용체 사이의 복합체를 검출하는 단계; 및
(c) 상기 복합체가 시험 화합물의 부재 하에서보다 시험 화합물의 존재 하에서 더 적게 형성되는지를 결정하는 단계
를 포함하고; 여기서 상기 결정은 시험 화합물이 PYY 분비촉진제임을 나타내는 것인 방법에서, PYY 분비촉진제를 확인하기 위한 G 단백질-결합 수용체의 용도.
제21항에 있어서,
(d) 그의 존재 하에 상기 복합체가 단계 (c)에서 덜 형성되는 화합물을 시험관 내에서 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포와 접촉시키는 단계; 및
(e) 화합물이 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포로부터 PYY 분비를 자극하는지를 결정하는 단계
를 더 포함하고; 여기서 시험 화합물이 척추동물 장내분비 세포 또는 PYY를 분비할 수 있는 세포로부터 PYY 분비를 자극하는 능력은 시험 화합물이 PYY 분비촉진제임을 더 나타내는 것인 용도.
제21항에 있어서, 상기 방법이
(d) 그의 존재 하에 상기 복합체가 단계 (c)에서 덜 형성되는 화합물을 투여한 척추동물로부터 얻은 샘플 내의 PYY 수준을 화합물이 증가시키는지를 결정하는 단계
를 더 포함하고; 여기서 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 PYY 분비촉진제임을 더 나타내는 것인 용도.
제21항에 있어서, 상기 방법이
(d) 그의 존재 하에 상기 복합체가 단계 (c)에서 덜 형성되는 화합물을 척추동물에게 투여하는 단계;
(e) 화합물이 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는지를 결정하는 단계
를 더 포함하고; 여기서 척추동물에서 PYY 수준을 증가시키는 시험 화합물의 능력은 시험 화합물이 PYY 분비촉진제임을 더 나타내는 것인 용도.
제21항 또는 제22항에 있어서, 척추동물이 비-인간 척추동물인 용도.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체가 재조합체인 용도.
제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 발현 벡터를 포함하고, 상기 발현 벡터가 G 단백질-결합 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 용도.
제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, GPR119에 대한 리간드가 GPR119 작용제인 용도.
제16항 내지 제20항 및 제28항 중 어느 한 항에 있어서, GPR119 작용제가 인간 GPR119의 작용제인 방법 또는 용도.
제16항 내지 제20항, 제28항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GPR119 작용제가 선택적인 GPR119 작용제인 방법 또는 용도.
제16항 내지 제20항 및 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, GPR119 작용제가 10 μM, 1 μM 및 100 nM 미만으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 EC₅₀ 값을 갖는 것인 방법 또는 용도.
제17항 내지 제20항 및 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, GPR119 작용제가 소분자인 방법 또는 용도.
제17항 내지 제20항 및 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, GPR119 작용제가 경구로 생체이용가능한 것인 방법 또는 용도.
제16항 및 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 화합물이 소분자인 용도 또는 방법.
제21항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체가 서열 2에 적어도 약 80％ 동일성을 갖는 G 단백질-결합 수용체의 아미노산 서열을 포함하는 것인 용도 또는 방법.
제21항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체가 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 용도 또는 방법.
펩티드 YY (PYY)에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 있어서 GPR119 작용제의 용도.
NPY Y2 수용체 (Y2R)의 자극에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방에 있어서 GPR119 작용제의 용도.
GPR119 작용제를 포함하는 제약 조성물을 그를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 펩티드 YY (PYY)에 의해 조절되는 병태의 치료 또는 예방 방법.
GPR119 작용제를 포함하는 제약 조성물을 그를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, NPY Y2 수용체 (Y2R)의 자극에 의해 개선되는 병태의 치료 방법.
제39항 또는 제40항에 있어서, GPR119 작용제가 개체의 장내분비 세포에서 PYY 발현을 자극할 수 있는 방식 또는 양으로 투여되는 것인 방법.
제16항 내지 제20항 및 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 확인된 PYY 분비촉진제를 생산 또는 합성하는 것을 더 포함하는 방법.
제16항 내지 제20항, 제29항 내지 제33항 및 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 확인된 PYY 분비촉진제를 조성물로서 생산 또는 합성하는 것을 더 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 시험 화합물이 소분자인 방법.
제13항, 제16항, 제32항, 제34항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 소분자의 분자량이 10,000 g/몰 미만인 방법.
제13항, 제16항, 제32항, 제34항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 소분자의 분자량이 5,000 g/몰 미만인 방법.
대상에서 PYY 수준을 증가시키기 위한 충분한 양으로 존재하는 GPR119 작용제를 포함하는 투여 형태.
제47항에 있어서, 상기 양이 대상에서 장내분비 세포 내의 PYY 수준을 증가시키기 위해 충분한 것인 투여 형태.
제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 또는 예방이
(a) 혈장 PYY의 증가;
(b) 골 질량의 증가;
(c) 골 질량 손실의 감소;
(d) 뼈 형성의 증가;
(e) 음식 섭취의 감소;
(f) 체중 감소;
(g) 포만감의 증가;
(h) 포도당 처리의 증가;
(i) 혈장 포도당 감소;
(j) 혈관신생의 증가;
(k) 장 상피 내 분비의 감소;
(l) 장 상피 내 흡수의 증가; 및
(m) 혈장 아디포넥틴의 증가
를 포함하는 군 중에서 선택되는 영향을 포함하는 것인 용도 또는 방법.
개체에서 PYY 수준을 증가시킴으로써 치료될 수 있는 병태의 치료 방법에서 사용하기 위한 GPR119 작용제.