MX2010010952A - Metodos de uso de un receptor acoplado a proteina g para identificar secretagogos del peptido yy (pyy) y compuestos utiles en el tratamiento de afecciones moduladas por pyy. - Google Patents

Metodos de uso de un receptor acoplado a proteina g para identificar secretagogos del peptido yy (pyy) y compuestos utiles en el tratamiento de afecciones moduladas por pyy.

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Abstract

La presente invención se refiere a métodos de uso del receptor GPR119 para identificar secretagogos del péptido YY (PYY) y compuestos útiles en el tratamiento de afecciones moduladas por PYY, como las afecciones moduladas por estimulación del receptor del NPY Y2 (Y2R). Los agonistas del receptor GPR119 son útiles como agentes terapéuticos para tratar o prevenir una afección modulada por PYY, como una afección modulada por estimulación de Y2R. Las afecciones moduladas por PYY como puede "ser una afección modulada por estimulación de Y2R incluyen afecciones óseas, trastornos metabólicos, afecciones relacionadas con angiogénesis, afecciones isquémicas, trastornos convulsivos, trastornos por mala absorción, diferentes tipos de cáncer y trastornos inflamatorios.

Description

MÉTODOS DE USO DE UN RECEPTOR ACOPLADO A PROTEÍNA G PARA IDENTIFICAR SECRETAGOGOS DEL PÉPTIDO YY (PYY) Y COM PUESTOS ÚTILES EN EL TRATAMIENTO DE AFECCIONES MODULADAS POR PYY Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica prioridad frente a la Solicitud Provisional de los Estados Unidos N° 61 /1 23,273, presentada el 7 de abril de 2008, cuya divulgación se incorpora por referencia, en su totalidad , en esta solicitud .
Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos de uso del receptor GPR1 1 9 para identificar secretagogos del péptido YY (PYY) y compuestos útiles en el tratamiento de afecciones moduladas por PYY, como las afecciones moduladas por estimulación del receptor del NPY Y2 (Y2R). Los agonistas del receptor GPR1 1 9 son útiles como agentes terapéuticos para tratar o prevenir una afección modulada por PYY, como una afección modulada por estimulación de Y2R. Las afecciones moduladas por PYY como puede ser una afección modulada por estimulación de Y2R incluyen afecciones óseas, trastornos metabólicos, afecciones relacionadas con angiogénesis, afecciones isquémicas, trastornos convulsivos, trastornos por mala absorción, diferentes tipos de cáncer y trastornos inflamatorios.
Antecedentes de la invención La discusión siguiente pretende facilitar la comprensión de la invención , pero no se pretende ni se admite que constituya estado anterior de la técnica de la invención .
A. Osteoporosis La osteoporosis es una enfermedad discapacitante que se caracteriza por pérdida de masa ósea y deterioro de la microarquitectura ósea, que produce una disminución de la resistencia de los huesos predisponiendo al paciente a un mayor riesgo de fracturas por fragilidad . La osteoporosis afecta a más de 75 millones de personas en Europa, Japón y los Estados Unidos, y causa más de 2 ,3 millones de fracturas sólo en Europa y Estados Unidos. En Estados Unidos, la osteoporosis afecta al menos a 25% de todas las mujeres posmenopáusicas de raza blanca, y la proporción aumenta a 70% en las mujeres de más de 80 años de edad . Una de tres mujeres mayores de 50 años tendrá una fractura osteoporósica que cause una carga social y económica importante en la sociedad. La enfermedad no está restringida a las mujeres, los hombres ancianos también pueden verse afectados. Se proyecta que para el año 2050 , la incidencia mundial de fractura de cadera en los hombres aumentará en un 31 0% y en un 240% en las mujeres. El riesgo combinado durante toda la vida de sufrir fracturas de cadera, antebrazo y vertebrales que se presentan clínicamente es de alrededor de 40% , equivalente al riesgo de enfermedad cardiovascular. Las fracturas osteoporósicas causan por lo tanto una mortalidad , una morbilidad y un costo económico considerables.
En una población que está envejeciendo, el número de fracturas osteoporosicas y su costo, al menos se duplicarán en los próximos 50 años, a menos que se elaboren estrategias preventivas eficaces. (Consulte, por ejemplo, Atik et al . , Clin Orthop Relat Res (2006) 443: 1 9-24; Raisz, J Clin I nvest (2005) 1 15:331 8-3325; y World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis).
B. Obesidad y diabetes La obesidad es una preocupación principal de salud pública debido al aumento de su prevalencia y riesgos asociados para la salud. Además, la obesidad puede afectar la calidad de vida de una persona al limitar su movilidad y disminui r su resistencia física así como mediante la discriminación social, académica y laboral.
La obesidad y el sobrepeso se definen en general mediante el índice de masa corporal (IMC), que está relacionado con la grasa corporal total y sirve como una medida del riesgo de contraer ciertas enfermedades. El IMC se calcula como el peso en kilogramos dividido entre la altura en metros al cuadrado (kg/m2). El sobrepeso se define en general como un I MC de 25-29,9 kg/m2 y la obesidad como un IMC de 30 kg/m2 o superior. Consulte, por ejemplo, National Heart, Lung, and Blood Institute, Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Overweight and Obesity in Adults, The Evidence Report, Washington, DC: EE.UU . Department of Health and Human Services, N I H puiblicación N° 98-4083 ( 1998).
Estudios recientes descubrieron que la obesidad y los riesgos asociados para la salud no están limitados a los ad ultos, sino que también afectan a los niños y los adolescentes en un grado sorprendente. De acuerdo con el Center for Disease Control , el porcentaje de niños y adolescentes con sobrepeso se ha duplicado desde el comienzo de la década de 1 970 y aproximadamente 1 5 por ciento de los niños y adolescentes tienen actualmente sobrepeso. Los factores de riesgo de enfermedad cardíaca, como altos niveles de colesterol e hipertensión ocurren con mayor frecuencia en niños y adolescentes con sobrepeso en comparación con los sujetos de edad similar con un peso normal . Asimismo, la diabetes tipo 2, que antes se consideraba una enfermedad de adultos, ha aumentado dramáticamente en los niños y los adolescentes. Las afecciones por sobrepeso y obesidad están estrechamente relacionadas con la diabetes tipo 2. Recientemente, se estimó que los adolescentes con sobrepeso tienen un 70% más de probabilidad de convertirse en adultos con sobrepeso u obesos. La probabilidad aumenta hasta aproximadamente el 80% si al menos uno de los padres tiene sobrepeso o es obeso. La consecuencia más inmediata de tener sobrepeso según la perciben los mismos niños es la discriminación social .
Los individuos con sobrepeso u obesos tienen mayor riesgo de sufrir dolencias como hipertensión , dislipidemia , diabetes tipo 2 (no dependiente de la insulina), resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa, hiperinsulinemia, arteriopatía coronaria , angina pectoris, insuficiencia cardíaca congestiva, accidente cerebrovascular, cálculos biliares, colescistitis, colelitiasis, gota, osteoartritis, apnea obstructiva del sueño y problemas respiratorios, colecistopatía, ciertas formas de cáncer (por ejemplo, de endometrio , mama, próstata y colon) y trastornos psicológicos (como depresión , trastornos en los hábitos alimenticios, imagen del cuerpo distorsionada y baja autoestima). Las consecuencias negativas de la obesidad sobre la salud , la convierten en la segunda causa de muerte por enfermedades evitables en los Estados Unidos, y provocan efectos económicos y sicológicos significativos en la sociedad . Consulte, por ejemplo, McGinnis et al , JAMA ( 1 993) 270:2.207-2.21 2.
En la actualidad la obesidad se reconoce como una enfermedad crónica que requiere tratamiento para reducir los riesgos asociados para la salud . Aunque la pérdida de peso es un resultado importante del tratamiento, uno de los principales objetivos del manejo de la obesidad es mejorar los valores cardiovasculares y metabólicos para reducir la morbilidad y la mortalidad debidas a la obesidad. Se ha demostrado que 5-10% de pérdida de peso corporal puede mejorar mucho los valores metabólicos, como la glucemia, la presión arterial y las concentraciones de lípidos. En consecuencia, se cree que una disminución de 5-1 0% del peso corporal puede reducir la morbilidad y la mortalidad .
Los fármacos de los que se dispone en la actualidad para el manejo de la obesidad , generalmente disminuyen el peso reduciendo la absorción de las grasas de la dieta, como sucede con orlistat, o creando un déficit energético por reducción del consumo de alimentos y/o el aumento del gasto energético, como se ve con sibutramina. La búsqueda de alternativas a los agentes antiobesidad de que se dispone en la actualidad ha tomado varios caminos, uno de los cuales se ha enfocado en ciertos péptidos intestinales que han sido relacionados con la modulación de la saciedad como el péptido YY (PYY) (Chaudhri et al. Annu Rev Physiol (2008) 70:239-255).
C. Aterosclerosis La aterosclerosis es una enfermedad compleja caracterizada por inflamación, acumulación de lípidos, muerte celular y fibrosis. La aterosclerosis se caracteriza por depósitos de colesterol e infiltración de monocitos en el espacio subendotelial , que produce la formación de células espumosas. La trombosis subsiguiente a la aterosclerosis produce infarto miocárdico y accidente cerebrovascular. La aterosclerosis es la principal causa de mortalidad en muchos países, incluido los Estados Unidos. (Consulte, por ejemplo, Ruggeri, Nat ed (2002) 8: 1 .227-1 .234; Arehart et al , Circ Res, 2008, Mar 6 Publicación electrónica antes de la impresión ).
D. Enfermedad Inflamatoria intestinal (Ell) La enfermedad inflamatoria intestinal (El l) es el nombre general para las enfermedades que causan inflamación en los intestinos e incluye, por ejemplo, la enfermedad de Crohn , la colitis ulcerosa y la proctitis ulcerosa. Los costos médicos en los Estados Unidos, en 1 990, debidos a enfermedad inflamatoria intestinal fueron estimados en $ 1 ,4 a $ 1 ,8 mil millones de dólares. Se estimó que la pérdida de productividad agregó otros $ 0,4 a $ 0 ,8 mil millones de dólares, llevando el costo estimado por enfermedad inflamatoria intestinal a un valor entre $ 1 ,8 y $2,6 mil millones de dólares. (Consulte, por ejemplo, Pearson, Nursing Times (2004) 100:86-90; Hay et al, J Clin Gastroenterol (1 992) 14:309-31 7; Keighley et al , Ailment Pharmacol Ther (2003) 18:66-70).
La enteritis se refiere a la inflamación del intestino, especialmente del intestino delgado, una afección general que puede tener varias causas diferentes La enterocolitis se refiere a la inflamación del intestino delgado y el colon.
La enfermedad de Crohn (EC) es un proceso inflamatorio que puede afectar a cualquier porción del tubo digestivo, pero se ve con mayor frecuencia en la última parte del intestino delgado denominado íleo (terminal) y ciego. En conjunto esta área también se conoce como la región ileocecal. Otros casos pueden afectar a uno o más de: únicamente el colon, únicamente el intestino delgado (duodeno, yeyuno y/o íleo), el ano, el estómago o el esófago. En contraposición con la colitis ulcerosa, la EC generalmente no afecta al recto, pero frecuentemente en su lugar afecta al ano. La inflamación se extiende profundamente en el recubrimiento del órgano afectado. La inflamación puede causar dolor y puede hacer que los intestinos se vacíen con frecuencia provocando diarrea. La enfermedad de Crohn también se denomina enteritis. La colitis granulomatosa es otro nombre para la enfermedad de Crohn que afecta al colon . La ileítis es la enfermedad de Crohn en el íleo que es la tercera porción del intestino delgado . La colitis de Crohn es la EC que afecta a una parte o todo el colon .
La colitis ulcerosa (CU ) es una enfermedad inflamatoria del i ntestino grueso, común mente denomi nado colon . La CU causa inflamación y ulceración del recubrimiento interno del colon y el recto . La inflamación de la EC es habitualmente más severa en el área rectal , disminuyendo su severidad (a u na velocidad q ue va ría de paciente a paciente) hacia el ciego, donde se unen el intestino delgado y el intestino grueso. La inflamación del recto se denomina proctitis . La inflamación del colon sigmoideo (ubicado justo por encima del recto) se denomina sigmoiditis. La inflamación que i nvolucra a todo el colon se denomina pancolitis. La inflamación hace que el colon se vacíe frecuentemente provocando diarrea. A med ida que el recubrimiento del colon es destruido las úlceras forman mucus, pus y sangre que se liberan . La proctitis ulcerosa es una forma de EC que afecta solamente al recto .
E . Péptido YY (PYY) El péptido YY (PYY) es un péptido de 36 ami noácidos aislado origi nalmente en 1 980 del intestino de porcinos (Tatemoto et al , Nature ( 1980) 285:41 7-4 8). El PYY es segregado por las células L enteroendocrinas dentro tanto del intestino grueso como del delgado . Se ha demostrado que las concentraciones de PYY inmunoreactivo en el intestino de ratas y seres humanos son bajas en el duodeno y el yeyuno , altas en el íleo y el colon , y más altas en el recto (Lundberg et al, PNAS USA (1982) 79:4471-4475; Adrián et al, Gastroenterol (1985) 89:1070-1077; Ekblad et al, Peptides (2002) 23:251-261; Ueno et al, Regul Pept (2008) 145:12-16). (Se ha informado que la expresión de PYY en las ratas también se extiende a las células alfa de los islotes de Langerhans y a las células de la médula oblongada (Ekblad et al, Peptides (2002) 23:251-261; PYY es liberado en la circulación como PYY1-36 y PYY3-36 (Eberlein et al, Peptides (1989) 10:797-803). PYY3.36 se genera a partir de PYYi-36 por escisión de los residuos de Tyr y Pro N-terminales mediante la dipeptidil peptidasa IV. PYY3-36 es la forma predominante de PYY en el plasma postprandial humano (Grandt et al, Regul Pept (1994) 51:151-159). Se ha informado que PYYi-36 y PYY3-36 tienen una actividad agonista semejante en el receptor de NPY Y2 (Y2R), un receptor acoplado a la proteína G (Parker et al, Br J Pharmacol (2008) 153:420-431); sin embargo, se ha informado que PYY3-36 es un agonista selectivo de gran afinidad de Y2R (Keire et al, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol (2000) 279.G126-G131). Posteriormente se informó que PYY reduce el consumo de alimentos ricos en grasas en ratas, luego de la administración periférica (Okada et al, Endocrinology Supplement (1993) 180) y causa pérdida de peso en ratones, luego de la administración periférica (Morley et al, Life Sciences (1987) 41:2.157-2.165).
Se ha informado que la administración periférica de PYY3.36 reduce en gran medida el consumo de alimentos y el aumento de peso en las ratas, disminuye el apetito y el consumo de alimentos en los humanos, y disminuye el consumo de alimentos en los ratones, pero no en los ratones que carecen de Y2R, lo que sugiere que el efecto sobre el consumo de alimentos requiere de Y2R. En estudios en humanos, se encontró que la infusión de PYY3-36 disminuía significativamente el apetito y reducía el consumo de alimentos en un 33% en el transcurso de 24 horas. La infusión de PYY3-36 para lograr las concentraciones circulatorias postprandiales normales del péptido producen niveles séricos máximos de PYY3-36 en el transcurso de 15 minutos, seguido de una rápida declinación a los niveles básales en el transcurso de 30 minutos. Se ha informado que no hubo una inhibición significativa del consumo de alimentos en el período de 12 horas siguiente a la infusión de PYY3-36, pero prácticamente no hubo efecto sobre el consumo de alimentos en el período de 12 horas a 24 horas. En un estudio en ratas, la administración intraperitoneal repetida de PYY3-36 (inyecciones 2 veces al día durante 7 días) redujo el consumo acumulativo de alimentos (Batterham et ai, Nature (2002) 418:650-654; Renshaw et al, Current Drug Targets (2005) 6:171-179).
Se ha informado que la administración periférica de PYY3-36 reduce el consumo de alimentos, el aumento del peso corporal y los índices de glucemia en diversos modelos de enfermedades metabólicas de ambos sexos en roedores (Pittner et al, Int J Obes Relat Metab Disord (2004) 28:963-971). Se ha informado que el bloqueo de Y2R con el antagonista específico BIIE-246 atenúa el efecto de PYY3-36 endógeno y exógeno administrado periféricamente de reducción del consumo de alimentos (Abbott et al, Brain Res (2005) 1.043:139-144). Se ha informado que la administración periférica de un nuevo péptido conjugado a polietilenglicol agonista selectivo de Y2R de acción prolongada, reduce el consumo de alimentos y mejora el metabolismo de la glucosa (eliminación de la glucosa, insulina plasmática y glucosa plasmática) en roedores (Ortiz et al, JPET (2007) 323:692-700; Lamb et al, J Med Chem (2007) 50:2.264-2.268). Se ha informado que la ablación de PYY en ratones produce la aparición de hiperinsulinemia y obesidad (Boey et al, Diabetologia (2006) 49:1.360-1.370). Se ha informado que la administración periférica de un agonista potente y altamente selectivo de Y2R de acción prolongada inhibe el consumo de alimentos y promueve el metabolismo de las grasas en ratones (Balasubramaniam et al, Peptides (2007) 28:235-240).
Hay evidencia de que agentes que estimulan la síntesis de PYY ¡n vivo pueden conferir protección contra la obesidad inducida por la dieta y genética y pueden mejorar la tolerancia a la glucosa (Boey et al, Neuropeptides (2008) 42:19-30).
Se ha informado que los agonistas de Y2R como PYYi-36 y PYY3-36 pueden conferir protección contra ataques epilépticos, así como contra convulsiones inducidas por kainate (El Bahh et al, Eur J Neurosci (2005) 22:1.417-1.430; Woldbye et al, Neurobiology of Disease (2005) 20:760-772).
Se ha informado que los agonistas de Y2R como PYY1-36 y PYY3.36 actúan como hormonas proabsortivas (o antisecretorias), incrementando, luego de la administración intravenosa, la absorción tanto de agua como de sodio en diversas partes del intestino grueso (Bilchik et al, Gastroenterol (1993) 105:1.441-1.448; Liu et al. J Surg Res (1995) 58:6-11; Nightingale et al, Gut (1996) 39:267-272; Liu et al, Am Surg (1996) 62:232-236; Balasubramaniam et al, J Med Chem (2000) 43:3.420-3.427). Se ha informado que los agonistas de Y2R como los análogos de PYY inhiben la secreción y promueven la absorción y el crecimiento en el epitelio intestinal (Balasubramaniam et al, J Med Chem (2000) 43:3420-3427). Se ha informado que el PYY promueve el crecimiento intestinal en ratas normales (Gómez et al, Am J Physiol (1995) 268:G71 -G81 ). Se ha informado que los agonistas de Y2R como PYYi-36 y PYY3-36 inhiben la motilidad del intestino grueso y previenen la diarrea (EP1902730; consulte también Cox, Peptides (2007) 28:345-351).
Se ha informado que los agonistas de Y2R como PYYi-36 y PYY3-36 pueden conferir protección contra la enfermedad inflamatoria intestinal como la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn (WO 03/105763). Se ha informado que ratones que carecen de PYY presentan un fenotipo osteopénico, es decir que PYY puede aumentar la masa ósea y/o puede conferir protección contra la pérdida de masa ósea (por ejemplo, disminuir la pérdida de masa ósea) (Wortley et al, Gastroenterol (2007) 133:1.534-1.543). Se ha informado que PYY3-36 puede conferir protección en modelos de pancreatitis en roedores (Vona-Davis et al, Peptides (2007) 28:334- 338).
Se ha informado que la angiogénesis está disminuida en ratones que carecen de Y2R (Lee et al, Peptides (2003) 24:99-106), es decir que los agonistas de Y2R como PYY1-36 y PYY3-36 promueven la angiogénesis. Se ha informado que la cicatrización está disminuida en ratones que carecen de Y2R (Ekstrand et al, PNAS USA (2003) 100:6.033-6.038), es decir que los agonistas de Y2R como PYYi-36 y PYY3-36 promueven la cicatrización. Se ha informado que la angiogénesis isquémica está disminuida en ratones que carecen de Y2R (Lee et al, J Clin Invest (2003) 111:1853-1862), es decir que los agonistas de Y2R como PYYi-36 y ???3-36 promueven la revascularización y la restauración de la función del tejido isquémico. Se ha informado que los agonistas de Y2R como PYY1-36 y PYY3-36 median aumentos en la circulación sanguínea dependiente de la colateral en un modelo de arteriopatía periférica en ratas (Cruze et al, Peptides (2007) 28:269-280).
Se ha informado que el PYY y los agonistas de Y2R como PYY3-36 pueden suprimir el crecimiento de un tumor en los casos, por ejemplo, de cáncer pancreático como adenocarcinoma ductal pancreático, cáncer de mama como adenocarcinoma ductal infiltrativo de mama, cáncer de colon como adenocarcinoma de colon y adenocarcinoma de Barrett (Liu et al, Surgery (1995) 118:229-236; Liu et al, J Surg Res (1995) 58:707-712; Grise et al, J Surg Res (1999) 82:151-155; Tseng et al, Peptides (2002) 23:389-395; McFadden et al, Am J Surg (2004) 188:516-519).
Se ha informado que la estimulación de Y2R por ejemplo mediante PYY3.36 produce un aumento de la adiponectina plasmática (Ortiz et al , JPET (2007) 323:692-700). La adiponectina es una adipoquina con potentes propiedades antiinflamatorias (Ouchi et al , Clin Chim Acta (2007) 380:24-30; Tilg et al , Nat Rev Immunol (2006) 6:772-783). La adiponectina ejerce efectos antiaterógenos dirigiendo células endoteliales vasculares y macrófagos y efectos sensibilizantes a la insulina, predominantemente en el músculo y el hígado (Kubota et al , J Biol Chem (2002) 277:25863-25866; Maeda et al, Nat Med (2002) 8:731 -737). Se ha informado que niveles bajos de adiponectina se asocian con lipoproteínas aterógenas en la dislipidemia (triglicéridos elevados, colesterol LDL poco denso , colesterol HDL bajo) (Marso et al, Diabetes Care (2008) Feb 5 Publicación electrónica antes de la impresión). La adiponectina ha sido implicada en la unión de las lipoproteínas de alta densidad (H DL) (Oku et al, FEBS Letters (2007) 581 :5029-5033). Se encontró que la adiponectina mejora las anomalías del síndrome metabólico, incluidas la resistencia a la insulina, la hiperglucemia y la dislipidemia, en un modelo de síndrome metabólico vinculado a la obesidad asociado con una disminución de los niveles de adiponectina en ratones (Hará et al , Diabetes Care (2006) 29:1 .357- 1 .362). Se ha informado que la adiponectina estimula la angiogenesis en respuesta a la isquemia tisular (Shibata et al, J Biol Chem (2004) 279:28.670-28.674). Se ha informado que la adiponectina evita la lesión cerebral isquémica a través de mecanismos dependientes de la óxido nítrico sintasa endotelial (Nishimura et al, Circulation (2008) 117:216-223). Se ha informado que la adiponectina confiere protección contra la lesión miocárdica por isquemia-reperfusión (Shibata et al, Nat Med (2005) 11:1.096-1.103; Tao et al, Circulation (2007) 115:1.408-1.416). Se ha informado que la adiponectina confiere protección contra la lesión miocárdica por isquemia-reperfusión a través de una proteína quinasa activada por AMP, Akt y óxido nítrico (Gonon et al, Cardiovasc Res (2008) 78:116-122). Se ha informado que la adiponectina confiere protección contra la aparición de disfunción sistólica luego de un infarto de miocardio, a través de su capacidad para suprimir la hipertrofia cardiaca y la fibrosis intersticial, y protege contra la pérdida de miocitos y capilares (Shibata et al, J Mol Cell Cardiol (2007) 42:1.065-1.074). Se ha informado que la adiponectina confiere protección contra la enfermedad pulmonar inflamatoria; los ratones que carecen de adiponectina presentan un fenotipo semejante a enfisema (Summer et al, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (Marzo 7, 2008)). Se ha informado que la adiponectina confiere protección contra la inflamación alérgica de las vías respiratorias y la hiperreactividad de las vías respiratorias como la que puede estar asociada al asma (Shore et al, J Allergy Clin Immunol (2006) 18:389-395). Se ha sugerido que la adiponectina confiere protección contra la hipertensión arterial pulmonar en virtud de sus efectos sensibilizantes a la insulina (Hansmann et al, Circulation (2007) 115:1275-1284). Se ha informado que la adiponectina mejora la hipertensión relacionada con obesidad, donde dicha mejoría está asociada en parte con la expression aumentada de prostaciclina (Ohashi et al, Hypertension (2006) 47:1.108-1.116). Se ha informado que la adiponectina disminuye la expresión inducida por el factor de necrosis tumoral alfa (TNF)-a de las moléculas de adhesión VCAM-1, E-selectina e ICAM-1 en las células endoteliales aórticas humanas (CEAH) (Ouchi et al, Circulation (1999) 100:2.473-2.476) y que inhibe la producción de TNF-a en los macrófagos (Yokota et al, Blood (2000) 96:1.723-1.732). Se ha informado que la adiponectina confiere protección contra la reestenosis posterior a una intervención vascular (Matsuda et al, J Biol Chem (2002) 277:37.487-37.491). El papel fundamental del TNF-a en la inflamación ha sido demostrado por la capacidad de los agentes que bloquean la acción del TNF-a para tratar una serie de afecciones ( inflamatorias. Las afecciones inflamatorias mediados por TNF-a abarcan la artritis reumatoide, la enfermedad intestinal inflamatoria, la enfermedad de Crohn, la espondilitis anquilosante, la psoriasis, la lesión cerebral isquémica, el rechazo al aloinjerto cardiaco, el asma y similares (Bradley, J Pathol (2008) 214:149-160). Consulte, por ejemplo, Yamamoto et al, Clinical Science (2002) 103:137-142; Behre, Scand J^Clin Lab Invest (2007) 67:449-458; Guerre-Millo, Diabetes & Metabolism (2008) 34:12-18; Parker et al, Br J Pharmacol (2008) 53:420-431.
F. Tratamiento de las afecciones moduladas por PYY Un atractivo enfoque alternativo para el tratamiento de las afecciones moduladas por PYY es desarrollar una composición por vía oral activa para aumentar el nivel de PYY endógeno en un individuo, tales como el nivel endógeno de PYY plasmático, por ejemplo por estimulación de la secreción de PYY en las células enteroendocrinas del intestino.
G. GPR1 19 GPR1 1 9 es un receptor acoplado a la proteína G (GPR1 19; por ejemplo, GPR1 19 humano, N° de registro GenBank® AAP721 25 y sus alelos; por ejemplo, GPR1 9 de ratón, N° de registro GenBank® AY288423 y sus alelos). La estimulación de GPR1 1 9 por ejemplo con un agonista produce la elevación del nivel de AMPc intracelular, compatible con el acoplamiento de GPR1 1 9 a Gs. En la bibliografía de patentes, se hace referencia a GPR1 19 como RUP3 (por ejemplo, WO 00/31 258); también se hace referencia a GPR1 1 9 como el receptor insulinotrópico dependiente de glucosa (GDI R).
H . Receptores acoplados a proteínas G Aunque existen varias clases de receptores en humanos, por lejos la más abundante e importante desde el punto de vista terapéutico está representada por la clase de receptores acoplados a proteínas G (GPCR). Se calcula que hay unos 30.000-40.000 genes en el genoma humano, y de éstos, se calcula que aproximadamente 2% codifican los GPCR.
Los GPCR representan un área importante para el desarrollo de productos farmacéuticos. Los fármacos que son activos en los GPCR producen beneficios terapéuticos en un amplio espectro de enfermedades humanas tan diversas como dolor, disfunción cognitiva , hipertensión , úlceras pépticas , rinitis y asma . De los aproximadamente 500 fármacos que se comercializan clínicamente , más del 30% son moduladores de la función de los GPCR. Estos fármacos ejercen su actividad en aproximadamente 30 GCPR bien caracterizados . (Consulte, por ejemplo, Wise et al , Annu Rev Pharmacol Toxicol (2004) 44:43-66).
Los GPCR comparten un motivo estructural común , tienen siete secuencias entre 22 y 24 aminoácidos hidrófobos que forman siete hélices alfa , cada una de las cuales se extiende por encima de la membrana (cada tramo se identifica por número, es decir, transmembrana-1 (TM-1 ), transmembrana-2 (T -2), etc).. Las hélices transmembranares son unidas por hebras de aminoácidos entre transmembrana-2 y transmembrana-3 , transmembrana-4 y transmembrana-5 , y transmembrana-6 y transmembrana-7 en el exterior, o lado "extracelular", de la membrana cel ular (éstas se denominan regiones "extracelulares" 1 , 2 y 3 (EC-1 , EC-2 y EC-3), respectivamente). Las hélices transmembranares también son unidas por hebras de aminoácidos entre transmembrana- 1 y transmembrana-2 , transmembrana-3 y transmembrana-4, transmembrana-5 y transmembrana-6 en el interior, o lado "intracelular" , de la membrana celular (éstas se denomi nan regiones "intracelulares" 1 , 2 y 3 (I C-1 , I C-2 y IC-3), respectivamente). El "carboxi" ("C") terminal del receptor se encuentra en el espacio intracelular dentro de la célula , y el "amino" ("N" ) Termi nal del receptor se encuentra en el espacio extracelular fuera de la célula .
Generalmente, cuando un ligando se une con el receptor (a menudo denominado "activación" del receptor), se produce un cambio en la conformación del receptor que facilita el acoplamiento entre la región intracelular y una "proteína G" intracelular. Se ha informado que los GPCR son "promiscuos" con respecto a las proteínas G, es decir, que un GPCR puede interactuar con más de una proteína G. Consulte, Kenakin, Life Sciences (1988) 43:1.095-1.101. Aunque existen otras proteínas G, actualmente, Gq, Gs, Gi, Gz y Go son proteínas G que han sido identificadas. El acoplamiento, activado por ligando, de GPCR con la proteína G inicia un proceso de señalización en cascada (denominado "transducción de la señal"). En condiciones normales, la transducción de la señal resulta en último lugar en la activación celular o la inhibición celular. Sin desear adherir a ninguna teoría, se cree que el bucle IC-3 así como el extremo carboxi terminal del receptor interactúan con la proteína G.
También hay proteínas G promiscuas, que parecen acoplar varias clases de GPCR a la ruta de la fosfolipasa C, como G15 o G16 (Offermanns & Simón, J Biol Chem (1995) 270:15.175-80), o proteínas G quiméricas designadas para acoplar un gran número de diferentes GPCR a la misma ruta, por ejemplo fosfolipasa C ( illigan & Rees, Trends in Pharmaceutical Sciences (1999) 20:118-24).
En condiciones fisiológicas, los GPCR existen en la membrana celular en equilibrio entre dos conformaciones diferentes: un estado "inactivo" y un estado "activo". Un receptor en un estado inactivo es incapaz de unirse a la ruta de transducción de la señalización intracelular para iniciar la transducción de la señal que produce la respuesta biológica . Cambiar la conformación del receptor al estado activo permite la unión a la ruta de transducción (a través de la proteína G ) y produce una respuesta biológica.
Un receptor puede ser estabilizado en un estado activo por un ligando o un compuesto como un fármaco. Descubrimientos recientes, incluidos, pero no exclusivamente, las modificaciones de la secuencia de aminoácidos del receptor, proporcionan medios diferentes de los ligandos o los fármacos para promover y estabilizar el receptor en la conformación del estado activo. Estos medios estabilizan eficazmente el receptor en un estado activo simulando el efecto de la unión de un ligando al receptor. La estabilización por medios independientes del ligando se denomina "activación constitutiva del receptor.
Breve descripción de la invención La presente invención se refiere al descubrimiento inesperado por el solicitante de que la administración de un agonista de GPR1 19 a un individuo, como la administración oral , puede actuar de manera de aumentar el PYY plasmático total en el individuo. La presente invención describe métodos relacionados con GPR1 1 9 para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY y compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo. Un agonista de G PR1 19 es útil para aumentar el PYY plasmático total en un individuo. En ciertas modalidades, el individuo es un ser humano.
La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido GPR1 1 9 humano se indica en SEQ . ID N°: 1 . La secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido GPR1 1 9 humano codificado se indica en SEQ. I D N°: 2.
En un primer aspecto, la invención describe un método para identificar secretagogos de PYY , compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, que comprende los pasos de: (a ) poner en contacto un com puesto de prueba con una célula huésped o con la membrana de una célula huésped que contiene un receptor acoplado a proteína G , donde dicho receptor acoplado a proteína G comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) aminoácidos 1 -335 de SEQ. I D N°: 2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ. ID N°: 2; (iii) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de (i) por sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos definida en (i); (iv) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. I D N°: 1 ; (v) una variante de SEQ . I D N°: 2 cuando se selecciona del grupo que consiste en : (a' ) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ . I D N°: 2; y (b' ) una secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. I D N°: 2 ; (vi) la secuencia de aminoácidos de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado a proteína G que tiene SEQ . I D N°: 2 ; y (vii ) un fragmento biológicamente activo - de cualquiera de (i ) a (vi); y (b) determinar la capacidad de un compuesto de prueba para estimular la funcionalidad de un receptor acoplado a prote ína G ; donde la capacidad del compuesto de prueba para esti mular la funcionalidad del receptor acoplado a proteína G indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY , o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G comprende la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. I D N°: 2.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. I D N°: 2.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un alelo de SEQ . I D N°: 2.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un ortólogo de SEQ. I D N°: 2. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un ortólogo mam ífero de SEQ . I D N°: 2.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G es recombinante.
En ciertas modalidades, el método es un método para identificar secretagogos de PYY.
En ciertas modalidades, el método comprende identificar un agonista del receptor.
En ciertas modalidades, el método comprende identificar un agonista parcial del receptor.
En ciertas modalidades, el método es un método para identificar compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY.
En ciertas modalidades, el método es un método para identificar compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, que comprende los pasos (a) y (b) de este primer aspecto, y comprende además: (c) sintetizar opcionalmente un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor del paso (b); (d) poner en contacto un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor del paso (b) in vitro con una célula enteroendocrina de un vertebrado o con una célula capaz de secretar PYY; y (e) determinar si el compuesto estimula la secreción de PYY de la célula enteroendocrina del vertebrado o de la célula capaz de secretar PYY; donde la capacidad del compuesto de prueba para estimular la secreción de PYY de la célula enteroendocrina del vertebrado o de la célula capaz de secretar PYY además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina del vertebrado es una célula enteroendocrina de un mamífero. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina es una célula L. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido obtenido del intestino delgado o el intestino grueso. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido obtenido de una región del intestino delgado o el intestino grueso que contiene células L. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido de duodeno, yeyuno, íleo, colon o recto (consulte, por ejemplo, Lundberg et al, PNAS USA (1982) 79:4471 -4475; Adrián et al , Gastroenterol (1985) 89: 1070-1077; Ekblad et al, Peptides (2002) 23:251 -261 ; lleno et al, Regul Pept (2008) 145: 1 2-1 6). En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina es una línea celular enteroendocrina. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula compuesta o derivada de islotes de Langerhans. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula neuronal . En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula recombinante modificada genéticamente para ser capaz de secretar PYY.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, que comprende los pasos (a) y (b) de este primer aspecto, y comprende además: (c) sintetizar opcionalmente un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor del paso (b); (d) administrar un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor del paso (b) a un vertebrado; y (e) determinar si el compuesto aumenta el nivel de PYY en el vertebrado; donde la capacidad del compuesto de prueba para aumentar el nivel de PYY en el vertebrado además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el nivel de PYY es la concentración sanguínea o plasmática de PYY total . En ciertas modalidades, el nivel de PYY es la concentración sanguínea o plasmática de PYY3-36.
En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero. En ciertas modalidades, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero no humano. En ciertas modalidades, el mamífero es un mamífero no humano. , En ciertas modalidades, el vertebrado o el mamífero es un ser humano. En ciertas modalidades, el ser humano es un participante en un estudio revisado por un organismo gubernamental encargado de la aprobación comercial de un fármaco. En ciertas modalidades, el estudio es un ensayo clínico. En ciertas modalidades, el organismo gubernamental es la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos.
En ciertas modalidades, el ser humano es un individuo o un paciente inscrito o sometido a un tratamiento en un ensayo clínico.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de u na actividad relacionada con PYY en un i nd ividuo , que com prende los pasos (a ) y (b ) de este primer aspecto, y comprende además: (c) si ntetizar opcionalmente un compuesto que estimula la funcional idad del receptor del paso (b); y (d ) determinar si el compuesto aumenta el nivel de PYY en una m uestra , habiendo sido obtenida dicha muestra de un vertebrado al que se administró previamente un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor del paso (b); donde la capacidad del compuesto de prueba para aumentar el nivel de PYY en el vertebrado además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad rel acionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el vertebrado es un mam ífero. En ciertas modalidades, el vertebrado es un vertebrado no humano . En ciertas modalidades, el vertebrado es un mam ífero no humano . En ciertas modalidades, el mam ífero es un mam ífero no humano.
En ciertas modalidades, el vertebrado o el mam ífero es un ser humano . En ciertas modalidades, el ser humano es un participante en un estudio revisado por un organismo gubernamental encargado de la aprobación comercial de un fármaco. En ciertas modalidades, el estudio es un ensayo cl ínico. En ciertas modalidades, el organismo gubernamental es la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, que comprende los pasos (a) y (b) de este primer aspecto, y comprende además: (c) sintetizar opcionalmente un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor del paso (b); (d) proporcionar opcionalmente un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor del paso (b); (e) poner en contacto un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor del paso (b) in vitro con una célula enteroendocrina de un vertebrado o con una célula capaz de secretar PYY; y (f) determinar si el compuesto estimula la secreción de PYY de la célula enteroendocrina del vertebrado o de la célula capaz de secretar PYY; ' donde la capacidad del compuesto de prueba para estimular la secreción de PYY de la célula enteroendocrina de un vertebrado o de la célula capaz de secretar PYY además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina del vertebrado es una célula enteroendocrina de un mamífero. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina es una célula L. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido obtenido del intestino delgado o el intestino grueso. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido obtenido de una región del intestino delgado o el intestino grueso que contiene células L. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido de duodeno, yeyuno, íleo, colon o recto (consulte, por ejemplo, Lundberg et al , PNAS USA (1982) 79:4471 -4475; Adrián et al , Gastroenterol ( 1 985) 89: 1070-1077; Ekblad et al, Peptides (2002) 23:251 -261 ; Ueno et al , Regul Pept (2008) 145: 1 2-1 6). En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina es una linea celular enteroendocrina. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula compuesta o derivada de islotes de Langerhans. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula neuronal . En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula recombinante modificada genéticamente para ser capaz de secretar PYY.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY, que comprende los pasos (a) y (b) de este primer aspecto, y comprende además : (c) sintetizar opcionalmente un compuesto que esti mula la funcionalidad del receptor del paso (b); (d ) proporcionar opcionalmente un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor del paso (b); (e) administrar un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor del paso ( b) a un vertebrado ; y (f) determinar si el compuesto aumenta el nivel de PYY en el vertebrado; donde la capacidad del compuesto de prueba para aumentar el nivel de PYY en el vertebrado además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY , o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el nivel de PYY es la concentración sangu ínea o plasmática de PYY total . En ciertas modalidades, el nivel de PYY es la concentración sanguínea o plasmática de ???3- 6 · En ciertas modalidades, el vertebrado es un mam ífero. En ciertas modalidades, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero no humano. En ciertas modalidades, el mamífero es un mamífero no humano .
En ciertas modalidades, el vertebrado o el mamífero es un ser humano. En ciertas modalidades, el ser humano es un participante en un estudio revisado por un organismo gubernamental encargado de la aprobación comercial de un fármaco. En ciertas modalidades, el estudio es un ensayo clínico. En ciertas modalidades, el organismo gubernamental es la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY, que comprende los pasos (a) y (b) de este primer aspecto, y comprende además: (c) sintetizar opcionalmente un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor del paso (b); (d) proporcionar opcionalmente un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor del paso (b); y (e) determinar si el compuesto aumenta el nivel de PYY en una muestra, habiendo sido obtenida dicha muestra de un vertebrado al que se administró previamente un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor del paso (b); donde la capacidad del compuesto de prueba para aumentar el nivel de PYY en el vertebrado además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el vertebrado es un mam ífero. En ciertas modalidades, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero no humano. En ciertas modalidades, el mamífero es un mamífero no humano.
En ciertas modalidades, el vertebrado o el mamífero es un ser humano . En ciertas modalidades, el ser humano es un participante en un estudio revisado por un organismo gubernamental encargado de la aprobación comercial de un fármaco. En ciertas modalidades, el estudio es un ensayo clínico. En ciertas modalidades, el organismo gubernamental es la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos.
En ciertas modalidades, el secretagogo de PYY identificado, o el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY identificado o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY identificado, es un agonista del receptor. En algunas modalidades, el secretagogo de PYY identificado, o el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY identificado o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY identificado, es un agonista parcial del receptor.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G está acoplado a una proteína G. En ciertas modalidades, la estimulación del receptor acoplado a proteína G aumenta el nivel de acumulación de AM Pc intracelular. En ciertas modalidades, la proteína G es Gs.
En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es SEQ. ID N°: 2 o uno de sus alelos. En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es un alelo de SEQ. ID N°: 2. En algunas modalidades, el receptor acoplado a proteína G de la invención es un ortólogo de SEQ. ID N°: 2.
En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es un receptor acoplado a proteína G que se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es un receptor acoplado a proteína G para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonll-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un ligando. En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es un receptor acoplado a proteína G para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)- piperídin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un agonista. En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de acumulación de AMPc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento.
En ciertas modalidades, las condiciones de hibridación rigurosas comprenden la hibridación a 42°C en una solución que contiene formamída al 50%, 5 x SSC (1 x SSC = NaCI 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 20 g/ml, seguido de lavado a 65°C en una solución que contiene 0,1 x SSC. Las técnicas de hibridación son bien conocidas por los técnicos con experiencia.
En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 es SEQ. ID N°: 2 o uno de sus alelos. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 es un alelo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 es un ortólogo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)- piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}- amina es un agonista. En algunas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de acumulación de AMPc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 es un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. I D N°: 2. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 es un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. I D N°: 2. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 que es un receptor acoplado a proteína G es un receptor acoplado a proteína G endógeno. En ciertas modalidades, la variante de SEQ . I D N°: 2 que es un receptor acoplado a proteína G es un receptor acoplado a proteína G no endógeno.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ . I D N°: 2 es SEQ. ID N°: 2 o uno de sus alelos. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2 es un alelo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. I D N°: 2 es un ortólogo de SEQ. I D N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. I D N°: 2 se une específicamente a (2-Fluoro-4- metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un agonista. En algunas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2 presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 es SEQ. ID N°: 2 o un alelo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 es un alelo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 es un ortólogo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}- amina. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ . I D N°: 2 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2 ,4]oxadiazol-5-il )-piperidi n-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-ami na es un agonista . En algunas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. I D N°: 2 presenta un nivel detectable de actividad constitutiva . En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AM Pc intracelular. En algu nas modal idades , la actividad constitutiva es para hacer que las cél ulas melanóforas sufran di spersión del pigmento.
En algunas modalidades, el receptor acoplado a proteína G es parte de una proteína de fusión que comprende una proteína G . Las técnicas para preparar un constructo de fusión G PCR: G son bien conocidas por los técnicos con experiencia (consulte, por ejemplo , la Solicitud Internacional WO 02/42461 ).
En ciertas modalidades, la célula huésped comprende un vector de expresión , y dicho vector de expresión comprende un polinucleótido que codifica el receptor acoplado a proteína G. Un ejemplo de vector de expresión adecuado es pCMV. Otros vectores de expresión adecuados serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia y una amplia variedad de vectores de expresión se puede adquirir en el comercio (por ejemplo, a Clontech, Palo Alto, CA; Stratagene , La Jolla , CA; e Invitrogen , Carlsbad , CA).
En algunas modalidades, la célula huésped es una célula de un vertebrado . En algunas modalidades, la célula huésped es una célula de un mam ífero. En algunas modalidades, la célula huésped de un mamífero se selecciona del grupo que consiste en una célula 293, una célula 293T, una célula CHO, una célula MCB3901 y una célula COS-7. En algunas modalidades, la célula huésped es una célula de una levadura . En algunas modalidades, la célula huésped es una célula melanófora. Otras células huéspedes adecuadas serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia, y una amplia variedad de líneas celulares se puede obtener de American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard , Manassas, VA 201 10-2209.
En ciertas modalidades, dicha determinación es compatible con que el receptor acoplado a proteína G sea un receptor acoplado a proteína Gs.
En algunas modalidades, dicha determinación es compatible con que el receptor acoplado a proteína G se acople a través de una proteína G promiscua, como Ga1 5 o Ga16, a la ruta de la fosfolipasa C. Las proteínas G promiscuas son bien conocidas por los técnicos con experiencia (consulte, por ejemplo, Offermanns et al . , J Biol Chem (1995) 270: 1 5175-1 5180). En algunas modalidades, dicha determinación es compatible con que el receptor acoplado a proteína G se acople a través de una proteína G quimérica, por ejemplo a la ruta de la fosfolipasa C. Las proteínas G quiméricas son bien conocidas por los técnicos con experiencia (consulte, por ejemplo, Milligan et al ., Trends in Pharmaceutical Sciences ( 1999) 20: 1 18- 1 24; y WO 02/42461 ).
En algunas modalidades, dicha determinación se realiza a través de la medición del nivel de un segundo mensajero.
En algunas modalidades, dicha determinación se realiza a través de la medición del nivel de un segundo mensajero seleccionado del grupo que consiste en: AMP cíclico (AMPc), GMP cíclico (GMPc), 1 ,4,5-trifosfato de inositol (IP3), diacilglicerol (DAG), actividad de MAP quinasa, actividad de MAPK/ERK quinasa-quinasa-1 (MEKK1) y Ca2+. En algunas modalidades preferidas, el segundo mensajero es AMPc. En ciertas modalidades, el nivel de AMPc intracelular está aumentado.
En ciertas modalidades, dicha determinación se lleva a cabo usando membrana aislada que contiene el receptor acoplado a proteína G.
En ciertas modalidades, dicha determinación se realiza a través del uso de un ensayo melanóforos. En ciertas modalidades, el nivel de dispersión de pigmento está aumentado.
En algunas modalidades, dicha determinación se realiza a través de un ensayo de un reportero. En algunas modalidades, dicho ensayo del reportero es el ensayo del reportero CRE-Luc.
En algunas modalidades, dicha determinación se realiza a través de la medición de una actividad mediada por un aumento del nivel de AMPc intracelular.
En algunas modalidades, dicha determinación se realiza a través del ensayo del reportero CRE-Luc. En ciertas modalidades, el nivel de actividad de luciferasa está aumentado.
En algu nas modal idades, dicha determinación se realiza a través de la medición de la unión de GTPvS a la membrana q ue contiene el receptor acoplado a proteína G . En ciertas modalidades , d icho G T PYS está marcado con [35S]. En ciertas modalid ades, dicha unión de GTPyS a la membrana q ue contiene el G PC R está aumentada .
En algunas modalidades, el compuesto de prueba es una molécula pequeña . En algunas modalidades, el com puesto de prueba es una molécula pequeña , con la cond ición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido. En algunas modalidades , el compuesto de prueba es una molécula pequeña , con la condición de que la molécula pequeña no sea un anticuerpo ni uno de sus fragmentos de unión al antígeno. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es una molécula pequeña , con la condición de que la molécula pequeña no sea un l ípido. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es una molécula pequeña , con la condición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido ni un lípido. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un polipéptido . En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un polipéptido , con la condición de que el polipéptido no sea un anticuerpo ni uno de sus fragmentos de unión al antígeno. En algunas modal idades, el compuesto de prueba es un l ípido. En algunas modalidades, el compuesto de prueba no es un anticuerpo ni uno de sus fragmentos de unión al antígeno. En algunas modalidades , el compuesto de prueba es un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno.
En algunas modalidades, el método comprende además el paso de determinar opcionalmente la estructura del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En algunas modalidades, el método comprende además el paso de proporcionar opcionalmente el nombre o la estructura del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un i ndividuo.
En algunas modalidades, dicho método comprende además el paso de producir o sintetizar opcionalmente el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En algunas modalidades, dicho método comprende además el paso de formular el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, como un producto farmacéutico.
En algunas modalidades, dicho método comprende además evaluar la biodisponibilidad del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY.
En algunas modalidades , dicho método comprende además el paso de formular el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en u n i ndividuo, como una composición farmacéutica .
En ciertas modalidades, la afección modulada por PYY es una afección ósea .
En ciertas modalidades, l a afección ósea es una afección que se caracteriza por una baja masa ósea . En ciertas mod alidades, la afección ósea caracterizada por una baja masa ósea se selecciona del grupo que consiste en osteopenia, osteoporosis , artritis reumatoide , osteoartritis , enfermedad periodontal , pérdida ósea alveolar, osteotom ía por pérdida ósea , pérdida ósea ididopática infantil , enfermedad de Paget, pérdida ósea debida a cáncer metastásico, lesiones osteol íticas, curvatura de la columna vertebral y pérdida de altura.
En ciertas modalidades, la afección ósea es una fractura ósea . En ciertas modalidades, la fractura ósea se selecciona del grupo que consiste en una fractura ósea traumática , una fractura ósea de largo plazo y una fractura ósea osteoporósica.
En ciertas modalidades, la afección ósea es una enfermedad ósea . En ciertas modalidades, la enfermedad ósea se selecciona del grupo que consiste en osteopenia, osteoporosis, artritis reumatoide, osteoartritis , enfermedad periodontal , pérdida ósea alveolar, osteotom ía por pérdida ósea , pérdida ósea ididopática infanti l , enfermedad de Paget, pérdida ósea debida a cáncer metastásico , lesiones osteol íticas, curvatura de la columna vertebral y pérdida de altura.
En ciertas modalidades, la afección ósea es un aumento de la cicatrización ósea o el crecimiento óseo, donde dicho aumento de la cicatrización ósea o el crecimiento óseo se selecciona del grupo que consiste en aumento de la cicatrización ósea luego de una reconstrucción facial , reconstrucción maxilar, reconstrucción mandibular, enfermedad periodontal o extracción dental , aumento de la extensión de huesos largos, aumento de la osteointegración protésica , aumento de la sinostosis ósea.
En ciertas modalidades, la afección modulada por PYY es un trastorno metabólico.
En ciertas modalidades, el trastorno metaból ico se selecciona del grupo que consiste en sobrepeso , obesidad , hiperfagia, diabetes (i nclusive diabetes de tipo 1 y diabetes de tipo 2), diabetes tipo 2, intolerancia a la glucosa , resistencia a la insulina, hiperinsul inemia, disl ipidemia, hipertensión y síndrome metabólico.
En ciertas modalidades, la afección modulada por PYY es una afección relacionada con angiogenesis.
En ciertas modalidades, la afección relacionada con angiogenesis se selecciona del grupo que consiste en arteriopatía periférica , cicatrización de heridas e isquemia.
En ciertas modalidades, la afección modulada por PYY es una afección isquémica.
En ciertas modalidades, la afección isquémica se selecciona del grupo que consiste en accidente cerebrovascular isquémico, cardiopatía isquémica, infarto de miocardio, lesión por isquemia-reperfusión, remodelación post infarto de miocardio, insuficiencia card íaca e isquemia cardíaca congestiva.
En ciertas modalidades, la afección modulada por PYY es un trastorno por mala absorción .
En ciertas modalidades, el trastorno por mala absorción se selecciona del grupo que consiste en síndrome del intestino corto, enterocolitis, enfermedad de Crohn , colitis ulcerosa , síndrome de intestino irritable, cólera y un trastorno acompañado de diarrea.
En ciertas modalidades, la afección modulada por PYY es un trastorno convulsivo.
En ciertas modalidades, el trastorno convulsivo es epilepsia.
En ciertas modalidades, la afección modulada por PYY es un cáncer.
En ciertas modalidades, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de páncreas, mama, colon y adenocarcinoma de Barrett.
En ciertas modalidades, la afección modulada por PYY es un trastorno inflamatorio.
En ciertas modalidades, el trastorno inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en aterosclerosis, aterotrombosis, resistencia a la insulina, diabetes (inclusive diabetes tipo 1 y diabetes tipo 2) diabetes tipo 1 , accidente cerebrovascular isquémico, pancreatitis, reestenosis, una enfermedad pulmonar inflamatoria y una enfermedad intestinal inflamatoria. En ciertas modalidades, la enfermedad pulmonar inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en asma, enfisema e hipertensión arterial pulmonar. En ciertas modalidades, la enfermedad intestinal inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en enteritis, enterocolitis, enfermedad de Crohn, colitis granulomatosa, ileítis, colitis de Crohn , colitis ulcerosa, sigmoiditis, pancolitis y proctitis ulcerosa.
En ciertas modalidades, la modulación de una actividad relacionada con PYY se selecciona del grupo que consiste en (a) aumentar el PYY plasmático; (b) aumentar la masa ósea; (c) disminuir la pérdida de masa ósea; (d) aumentar la formación de hueso; (e) disminuir el consumo de alimentos; (f) disminuir el peso corporal ; (g ) aumentar la saciedad (h) aumentar la eliminación de glucosa; (i) disminuir la glucosa plasmática; (j) aumentar la angiogenesis; (k) disminuir la secreción en el epitelio intestinal; (I) aumentar la absorción en el epitelio intestinal ; y (m) aumentar la adiponectina plasmática.
La invención describe además un proceso que comprende l levar a cabo un método de acuerdo con este primer aspecto.
En un segundo aspecto la invención describe un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un compuesto in vitro con una célula enteroendocrina de un vertebrado o con una célula capaz de secretar PYY, donde dicho compuesto ha sido identificado por un método de acuerdo con el primer aspecto; y (b) determinar si el compuesto estimula la secreción de PYY de la célula enteroendocri na del vertebrado o de la célula capaz de secretar PYY; donde la capacidad del compuesto de prueba para esti mular la secreción de PYY de la célula enteroendocri na de u n vertebrado o de la célula capaz de secretar PYY también indica si el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección relacionada con PYY o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY.
En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina del vertebrado es una cél ula enteroendocrina de un mam ífero . En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina es una célula L . En ciertas modalidades, la célula enteroendocri na está compuesta o deriva de tejido obtenido del intestino delgado o el intestino grueso. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido obtenido de una región del intestino delgado o el intestino grueso que contiene células L. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido de duodeno, yeyuno, íleo, colon o recto (consulte, por ejemplo, Lundberg et al , PNAS USA ( 1982) 79:4471 -4475; Adrián et al, Gastroenterol ( 1985) 89: 1070-1077; Ekblad et al, Peptides (2002) 23:251 -261 ; lleno et al, Regul Pept (2008) 1 45: 12-1 6). En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina es una l ínea celular enteroendocrina. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula compuesta o derivada de islotes de Langerhans. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula neuronal . En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula recombinante modificada genéticamente para ser capaz de secretar PYY.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, que comprende los pasos de: (a) administrar un compuesto a un vertebrado, donde dicho compuesto ha sido identificado mediante un método de acuerdo con el primer aspecto; y (b) determinar si el compuesto aumenta el nivel de PYY en el vertebrado; donde la capacidad del compuesto de prueba para aumentar el nivel de PYY en el vertebrado también indica si el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección relacionada con PYY o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el nivel de PYY es la concentración sangu ínea o plasmática de PYY total . En ciertas modalidades, el nivel de PYY es la concentración sanguínea o plasmática de PYY3-36.
En ciertas modalidades, el vertebrado es un mam ífero. En ciertas modalidades, el vertebrado es un vertebrado no humano . En ciertas modalidades, el vertebrado es un mam ífero no humano . En ciertas modalidades, el mamífero es un mamífero no humano.
En ciertas modalidades, el vertebrado o el mamífero es un ser humano. En ciertas modalidades, el ser humano es un participante en un estudio revisado por un organismo gubernamental encargado de la aprobación comercial de un fármaco. En ciertas modalidades, el estudio es un ensayo clínico. En ciertas modalidades, el organismo gubernamental es la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, que comprende los pasos de: (a) determinar si el compuesto aumenta el nivel de PYY en una muestra , habiendo sido obtenida dicha muestra de un vertebrado al que se administró previamente un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor del paso (b); donde la capacidad del compuesto de prueba para aumentar el nivel de PYY en el vertebrado además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el nivel de PYY es la concentración sangu ínea o plasmática de PYY total. En ciertas modalidades, el nivel de PYY es la concentración sanguínea o plasmática de ??3-36 · En ciertas modalidades, el vertebrado es un mam ífero. En ciertas modalidades, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero no humano. En ciertas modalidades, el mam ífero es un mamífero no humano.
En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero. En ciertas modalidades, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero no humano.
En ciertas modalidades, el vertebrado o el mamífero es un ser humano. En ciertas modalidades, el ser humano es un participante en un estudio revisado por un organismo gubernamental encargado de la aprobación comercial de un fármaco. En ciertas modalidades, el estudio es un ensayo clínico. En ciertas modalidades, el organismo gubernamental es la Administración de Fármacos y Al i mentos de los Estados Unidos.
En algunas modal idades , el compuesto de prueba es una molécula pequeña. En algunas modalidades , el compuesto de prueba es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un poli péptido. En algunas modal idades, el compuesto de prueba es una molécula pequeña , con la condición de que la molécula peq ueña no sea un anticuerpo ni uno de sus fragmentos de unión al antígeno. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es una molécula pequeña , con la condición de que la molécula pequeña no sea un l ípido. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es una molécula pequeña , con la cond ición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido ni un lípido. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un polipéptido. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un poli péptido , con la cond ición de que el polipéptido no sea un anticuerpo ni uno de sus fragmentos de unión al antígeno. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un l ípido . En algunas modalidades , el compuesto de prueba no es un anticuerpo ni uno de sus fragmentos de unión al antígeno . En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno.
En algunas modalidades, el método comprende además el paso de determinar opcionalmente la estructura del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En algunas modalidades, el método comprende además el paso de proporcionar opcionalmente el nombre o la estructura del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En algunas modalidades, dicho método comprende además el paso de producir o sintetizar opcionalmente el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En algunas modalidades, dicho método comprende además el paso de formular el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, como un producto farmacéutico.
En algunas modalidades, dicho método comprende además evaluar la biodisponibilidad del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY.
En algunas modalidades, dicho método comprende además el paso de formular el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, como una composición farmacéutica .
La invención describe además un proceso que comprende llevar a cabo un método de acuerdo con este segundo aspecto.
En un tercer aspecto, la invención describe un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un agonista de GPR1 1 9 in vitro con una célula enteroendocrina de un vertebrado o con una célula capaz de secretar PYY; y (b) determinar si el compuesto agonista de GPR1 1 9 estimula la secreción de PYY de la célula enteroendocrina del vertebrado o de la célula capaz de secretar PYY; donde la capacidad del agonista de GPR1 19 para estimular la secreción de PYY de la célula enteroendocrina de un vertebrado o de la célula capaz de secretar PYY indica que el agonista de GPR1 1 9 es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo .
En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina del vertebrado es una célula enteroendocrina de un mamífero. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina es una célula L. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido obtenido del intestino delgado o el intestino grueso. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido obtenido de una región del intestino delgado o el intestino grueso que contiene células L. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido de duodeno, yeyuno, íleo, colon o recto (consulte, por ejemplo, Lundberg et al , PNAS USA (1982) 79:4471 -4475; Adrián et al , Gastroenterol ( 1985) 89: 1 070-1077; Ekblad et al , Peptides (2002) 23:251 -261 ; lleno et al , Regul Pept (2008) 145: 1 2-1 6). En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina es una l ínea celular enteroendocrina. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula compuesta o derivada de islotes de Langerhans. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula neuronal. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula recombinante modificada genéticamente para ser capaz de secretar PYY.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, que comprende los pasos de: (a) administrar un agonista de GPR1 19 a un vertebrado; y (b) determinar si el agonista de GPR1 1 9 aumenta el nivel de PYY en el vertebrado; donde la capacidad del agonista de GPR1 1 9 para aumentar un nivel de PYY en el vertebrado indica que el agonista de GPR1 1 9 es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el nivel de PYY es la concentración sanguínea o plasmática de PYY total. En ciertas modalidades, el nivel de PYY es la concentración sanguínea o plasmática de PYY3- 36 - En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero. En ciertas modalidades, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero no humano. En ciertas modalidades, el mamífero es un mamífero no humano.
En ciertas modalidades, el vertebrado o el mamífero es un ser humano. En ciertas modalidades, el ser humano es un participante en un estudio revisado por un organismo gubernamental encargado de la aprobación comercial de un fármaco. En ciertas modalidades, el estudio es un ensayo clínico. En ciertas modalidades, el organismo gubernamental es la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, que comprende los pasos de: (a) determinar si el compuesto aumenta un nivel de PYY en una muestra, habiendo sido obtenida dicha muestra de un vertebrado al que se administró previamente un agonista del GPR1 1 9, administrar un agonista de GPR1 1 9 a un vertebrado; donde la capacidad del agonista de GPR1 1 9 para aumentar un nivel de PYY en el vertebrado indica que el agonista de GPR1 1 9 es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el nivel de PYY es la concentración sanguínea o plasmática de PYY total. En ciertas modalidades, el nivel de PYY es la concentración sanguínea o plasmática de PYY3-36 En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero. En ciertas modalidades, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero no humano. En ciertas modalidades, el mamífero es un mamífero no humano .
En ciertas modalidades, el vertebrado o el mamífero es un ser humano. En ciertas modalidades, el ser humano es un participante en un estudio revisado por un organismo gubernamental encargado de la aprobación comercial de un fármaco. En ciertas modalidades, el estudio es un ensayo clínico. En ciertas modalidades, el organismo gubernamental es la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos.
En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 es un agonista de un GPR119 endógeno.
En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 es un agonista del GPR119 humano.
En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 es un agonista parcial de GPR119.
En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 es un agonista selectivo de GPR119.
En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 es una molécula pequeña. En algunas modalidades, la molécula pequeña no es un polipéptido. En algunas modalidades, la molécula pequeña no es un anticuerpo ni uno de sus fragmentos de unión al antígeno. En algunas modalidades, la molécula pequeña no es un lípido. En algunas modalidades, la molécula pequeña no es un polipéptido ni un lípido.
En ciertas modalidades, el agonista de GPR 19 está disponible por vía oral.
En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 tiene un valor de CE50 menor de aproximadamente 10 µ?, menor de aproximadamente 1 µ?, menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, menor de aproximadamente 15 nM, menor de aproximadamente 10 nM, menor de aproximadamente 5 nM, menor de aproximadamente 4 nM, menor de aproximadamente 3 nM, menor de aproximadamente 2 nM o menor de aproximadamente 1 nM. En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 tiene un valor de CE50 menor de aproximadamente 10 µ?, menor de aproximadamente 1 µ?, menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, menor de aproximadamente 15 nM, menor de aproximadamente 10 nM, menor de aproximadamente 5 nM, menor de aproximadamente 4 nM, menor de aproximadamente 3 nM, menor de aproximadamente 2 nM o menor de aproximadamente 1 nM en el GPR119 humano que tiene SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 tiene un valor de CE50 menor de aproximadamente 10 µ?, menor de aproximadamente 1 µ?, menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, menor de aproximadamente 15 nM, menor de aproximadamente 10 nM, menor de aproximadamente 5 nM, menor de aproximadamente 4 nM, menor de aproximadamente 3 nM, menor de aproximadamente 2 nM o menor de aproximadamente 1 nM en el GPR119 humano que tiene SEQ. ID N°: 2. En el ensayo de adenililciclasa (el ejemplo de ensayo de adenililciclasa se proporciona en el Ejemplo 9, el Ejemplo 10 y el ejemplo Ejemplo 11, infra). En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 tiene un valor de CE5o menor de aproximadamente 10 µ?, menor de aproximadamente 1 µ?, menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, menor de aproximadamente 15 nM, menor de aproximadamente 10 nM, menor de aproximadamente 5 nM, menor de aproximadamente 4 nM, menor de aproximadamente 3 nM, menor de aproximadamente 2 nM o menor de aproximadamente 1 nM en el GPR119 humano que tiene SEQ. ID N°: 2 en el ensayo de melanóforos (el ejemplo de ensayo de melanóforos se proporciona en el Ejemplo 12, infra).
Los ejemplos de agonistas de GPR119 se divulgan, por ejemplo, en la Solicitud Internacional N° PCT/US2004/001267 (publicada como WO 04/065380); Solicitud Internacional N° PCT/US2004/005555 (publicada como WO 04/076413); Solicitud Internacional N° PCT/US2004/022327 (publicada como WO 05/007647); Solicitud Internacional N° PCT/US2004/022417 (publicada como WO 05/007658); Solicitud Internacional N° PCT/US2005/019318 (publicada como WO 2005/121121); Solicitud Internacional N° PCT/GB2004/050046 (publicada como WO 2005/061489); Solicitud Internacional N° PCT/US06/00567 (publicada como WO 2006/083491); Solicitud Internacional N. PCT/GB2005/050264 (publicada como WO 2006/067531); Solicitud Internacional N° PCT/GB2005/050265 (publicada como WO 2006/067532); Solicitud Internacional N° PCT/GB2005/050266 (publicada como WO 2006/070208); Solicitud Internacional N° PCT/JP02/09350 (publicada como WO 03/026661); Solicitud Internacional N° PCT/JP2005/018412 (publicada como WO 06/040966); Solicitud Internacional N° PCT/JP2005/019000 (publicada como WO 2006/043490); Solicitud Internacional N° PCT/GB2006/050176 (publicada como WO 2007/003960); Solicitud Internacional N° PCT/GB2006/050177 (publicada como WO 2007/003961 ); Solicitud Internacional N° PCT/GB2006/0501 78 (publicada como WO 2007/003962); Solicitud Internacional N° PCT/GB2006/050182 (publicada como WO 2007/003964); Solicitud Internacional N° PCT/J P02/09350 (publicada como WO 03/026661 ); Solicitud Internacional N° PCT/GB2007/050 83 (publicada como WO 2007/1 1 6229); Solicitud Internacional N° PCT/GB2007/0501 90 (publicada como WO 2007/ 16230); Solicitud Internacional N° PCT/US2007/073364 (publicada como WO 2008/008895); Solicitud Internacional N° PCT/EP2007/058991 (publicada como WO 2008/025798); Solicitud I nternacional N° PCT/EP2007/058993 (publicada como WO 2008/025799); y la Solicitud Internacional N° PCT/EP2007/058995 (publicada como WO 2008/025800).
En ciertas modalidades, el método comprende proporcionar el agonista de GPR1 1 9.
En ciertas modalidades, el agonista de GPR1 1 9 es identificable por un método de acuerdo con el primer aspecto.
En ciertas modalidades, el método comprende llevar a cabo un método de acuerdo con el primer aspecto para identificar el agonista de GPR1 19.
En ciertas modalidades, el método comprende haber identificado el agonista de GPR1 19 por un método de acuerdo con el primer aspecto.
En algunas modalidades, el método comprende además el paso de determinar opcionalmente la estructura del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección mod ulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de u na actividad relacionada con PYY en un individuo.
En algunas modalid ades, el método comprende además el paso de proporcionar opcionalmente el nombre o la estructura del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección mod ulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En algunas modalidades , dicho método comprende además el paso de producir o si ntetizar opcional mente el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la mod ulación de una actividad relacionada con PYY en un i ndividuo.
En algunas modalidades, dicho método comprende además el paso de formular el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la mod ulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo , como un producto farmacéutico.
En algunas modalidades, dicho método comprende además evaluar la biodisponibilidad del secretagogo de PYY , del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de u na actividad relacionada con PYY.
En algunas modalidades, dicho método comprende además el paso de formular el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, como una composición farmacéutica.
La invención describe además un proceso que comprende llevar a cabo un método de acuerdo con este tercer aspecto.
En un cuarto aspecto, la invención describe un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo , que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un receptor acoplado a proteína G con un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor, en presencia o ausencia de un compuesto de prueba, donde un ligando del receptor es un ligando de GPR1 1 9 y donde el receptor acoplado a proteína G comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) aminoácidos 1 -335 de SEQ. I D N°: 2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ. I D N°: 2; (iii) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de (i) por sustitución , deleción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos definida en (i); (iv) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°:1; (v) una variante de SEQ. ID N°: 2 cuando se selecciona del grupo que consiste en: (a') la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2; y (b') la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2; (vi) la secuencia de aminoácidos de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado a proteína G que tiene SEQ. ID N°: 2; y (vii) un fragmento biológicamente activo de cualquiera de (i) a (vi); y (b) detectar el complejo entre dicho ligando conocido y dicho receptor; y (c) determinar si se forma menos de dicho complejo en presencia del compuesto de prueba que en ausencia del compuesto de prueba; donde dicha determinación indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G comprende la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, el receptor comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un alelo de SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un ortólogo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un ortólogo mamífero de SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G es recombinante.
En ciertas modalidades, el método es un método para identificar secretagogos de PYY.
En ciertas modalidades, el método es un método para identificar compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY.
En ciertas modalidades, el método es un método para identificar compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el ligando de GPR119 es un agonista de GPR119. En ciertas modalidades, el ligando de GPR119 o el agonista de GPR119 es un ligando o un agonista de un receptor GPR119 endógeno de un vertebrado, un mamífero o un ser humano.
En ciertas modalidades, el ligando de GPR1 19 o el agonista de GPR1 1 9 es un ligando o un agonista de un receptor GPR1 1 9 endógeno humano. En ciertas modalidades, el ligando de GPR1 19 o el agonista de GPR1 1 9 es idéntico a un compuesto divulgado, por ejemplo, en la Solicitud Internacional N° PCT/US2004/001267 (publicada como WO 04/065380); Solicitud I nternacional N° PCT/US2004/005555 (publicada como WO 04/07641 3); Solicitud Internacional N° PCT/US2004/022327 (publicada como WO 05/007647); Solicitud Internacional N° PCT/US2004/022417 (publicada como WO 05/007658); Solicitud Internacional N° PCT/US2005/01931 8 (publicada como WO 2005/1 21 1 21 ); Solicitud I nternacional N° PCT/GB2004/050046 (publicada como WO 2005/061489); Solicitud Internacional N° PCT/US06/00567 (publicada como WO 2006/083491 ); Solicitud I nternacional N . PCT/GB2005/050264 (publicada como WO 2006/067531 ); Solicitud Internacional N° PCT/GB2005/050265 (publicada como WO 2006/067532); Solicitud Internacional N° PCT/GB2005/050266 (publicada como WO 2006/070208); Solicitud Internacional N° PCT/JP02/09350 (publicada como WO 03/026661 ); Solicitud Internacional N° PCT/JP2005/01 8412 (publicada como WO 06/040966); Solicitud Internacional N° PCT/JP2005/019000 (publicada como WO 2006/043490); Solicitud Internacional N° PCT/GB2006/050176 (publicada como WO 2007/003960); Solicitud Internacional N° PCT/GB2006/050177 (publicada como WO 2007/003961 ); Solicitud Internacional N° PCT/GB2006/050178 (publicada como WO 2007/003962); Solicitud I nternacional N° PCT/GB2006/050182 (publicada como WO 2007/003964); Solicitud Internacional N° PCT/JP02/09350 (publicada como WO 03/026661 ); Solicitud Internacional N° PCT/GB2007/0501 83 (publicada como WO 2007/1 16229); Solicitud Internacional N° PCT/GB2007/050190 (publicada como WO 2007/1 1 6230); Solicitud I nternacional N° PCT/US2007/073364 (publicada como WO 2008/008895); Solicitud Internacional N° PCT/EP2007/058991 (publicada como WO 2008/025798); Solicitud Internacional N° PCT/EP2007/058993 (publicada como WO 2008/025799); o la Solicitud I nternacional N° PCT/EP2007/058995 (publicada como WO 2008/025800). En ciertas modalidades, el ligando de G PR 1 1 9 o el agonista de G P R1 1 9 es (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il )-piperidin- -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina; En ciertas modalidades, el ligando de GPR1 1 9 es un ligando endógeno de un receptor GPR1 1 9 endógeno de un vertebrado, un mamífero, o un ser humano.
En ciertas modalidades, el ligando conocido opcionalmente marcado es un ligando conocido marcado. En ciertas modalidades, el ligando conocido marcado es un ligando conocido radiomarcado. Las técnicas para radiomarcar un compuesto, como para marcar un ligando conocido de un receptor acoplado a proteína G de la invención , son bien conocidas por los técnicos con experiencia. Consulte, por ejemplo, la Solicitud Internacional WO 04/065380. Consulte también, por ejemplo, el Ejemplo 1 4, infra.
Las técnicas para detectar el complejo entre un receptor acoplado a proteína G y un compuesto que se sabe que es un ligando del receptor acoplado a proteína G son bien conocidas por los técnicos con experiencia. Consulte, por ejem plo , l a Solicitud Internacional WO 04/065380. Consulte también , por ejemplo, el Ejemplo 1 5 , infra.
La invención descri be además un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o com puestos útiles para la mod ulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo , que comprende los pasos (a) a (c) de este cuarto aspecto, y comprende además: (d ) sintetizar opcionalmente un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo en el paso (c); (e) poner en contacto un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo en el paso (c) in vitro con una célula enteroendocrina de un vertebrado o con una célula capaz de secretar PYY; y (f) determinar si el compuesto estimula la secreción de PYY de la célula enteroendocrina del vertebrado o de la célula capaz de secretar PYY; donde la capacidad del compuesto de prueba para estimular la secreción de PYY de la célula enteroendocri na del vertebrado o de la célula capaz de secretar PYY además indica que el com puesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY , o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina del vertebrado es una célula enteroendocrina de un mamífero. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina es una célula L. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido obtenido del intestino delgado o el intestino grueso. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido obtenido de una región del intestino delgado o el intestino grueso que contiene células L. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido de duodeno, yeyuno, íleo, colon o recto (consulte, por ejemplo, Lundberg et al, PNAS USA (1982) 79:4471-4475; Adrían et al, Gastroenterol (1985) 89:1070-1077; Ekblad et al, Peptides (2002) 23:251-261; Ueno et al, Regul Pept (2008) 145:12-16). En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina es una línea celular enteroendocrina. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula compuesta o derivada de islotes de Langerhans. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula neuronal. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula recombinante modificada genéticamente para ser capaz de secretar PYY.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo , que comprende los pasos (a) a (c) de este cuarto aspecto, y comprende además: (d ) sintetizar opcionalmente un compuesto en presencia del cual se forma menos de d icho complejo en el paso (c); (e) administrar un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo en el paso (c) a un vertebrado; y (f) determinar si el compuesto aumenta el nivel de PYY en el vertebrado; donde la capacidad del compuesto de prueba para aumentar el nivel de PYY en el vertebrado además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY , un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades , el vertebrado es un mam ífero. En ciertas modalidades, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mam ífero no humano. En ciertas modalidades , el mamífero es un mamífero no humano.
En ciertas modalidades, el vertebrado o el mam ífero es un ser humano . En ciertas modalidades, el ser humano es un participante en un estudio revisado por un organismo gubernamental encargado de la aprobación comercial de un fármaco. En ciertas modalidades, el estudio es un ensayo clínico. En ciertas modalidades, el organismo gubernamental es la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, que comprende los pasos (a) a (c) de este cuarto aspecto, y comprende además: (d) sintetizar opcionalmente un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo en el paso (c); y (e) determinar si el compuesto aumenta el nivel de PYY en una muestra obtenida de un vertebrado, al cual se le había administrado un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo en el paso (c); donde la capacidad del compuesto de prueba para aumentar el nivel de PYY en el vertebrado indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el vertebrado es un mam ífero. En ciertas modalidades, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero no humano. En ciertas modalidades, el mamífero es un mamífero no humano.
En ciertas modalidades, el vertebrado o el mamífero es un ser humano. En ciertas modalidades, el ser humano es un participante en un estudio revisado por un organismo gubernamental encargado de la aprobación comercial de un fármaco . En ciertas modalidades, el estudio es un ensayo cl ínico. En ciertas mod alidades, el organi smo gubernamental es la Ad mi nistración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos.
La invención descri be además un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo , que comprende los pasos (a) a (c) de este cuarto aspecto, y comprende además: (d ) sintetizar opcionalmente un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo de acuerdo con el paso (c); (e) proporcionar opcionalmente un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo de acuerdo con el paso (c); (f) poner en contacto un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo de acuerdo con el paso (c) in vitro con una célula enteroendocrina de un vertebrado o con una célula capaz de secretar PYY; y (g) determinar si el compuesto estimula la secreción de PYY de la célula enteroendocrina del vertebrado o de la célula capaz de secretar PYY; donde la capacidad del compuesto de prueba para esti mular la secreción de PYY de la célula enteroendocrina del vertebrado o de la célula capaz de secretar PYY además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina del vertebrado es una célula enteroendocrina de un mamífero. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina es una célula L. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido obtenido del intestino delgado o el intestino grueso. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido obtenido de una región del intestino delgado o el intestino grueso que contiene células L. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido de duodeno, yeyuno, íleo, colon o recto (consulte, por ejemplo, Lundberg et al, PNAS USA (1982) 79:4471-4475; Adrián et al, Gastroenterol (1985) 89:1070-1077; Ekblad et al, Peptides (2002) 23:251-261; lleno et al, Regul Pept (2008) 145:12-16). En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina es una línea celular enteroendocrina. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula compuesta o derivada de islotes de Langerhans. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula neuronal. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula recombinante modificada genéticamente para ser capaz de secretar PYY.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY , compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individ uo, que comprende los pasos (a) a (c) de este cuarto aspecto, y comprende además: (d ) sintetizar opcionalmente un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo de acuerdo con el paso (c); (e ) proporcionar opcionalmente un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo de acuerdo con el paso (c); (f) admi nistrar un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo en el paso (c) a un vertebrado; y (g ) determinar si el compuesto aumenta el nivel de PYY en el vertebrado ; donde la capacidad del compuesto de prueba para aumentar el nivel de PYY en el vertebrado además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto úti l para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el vertebrado es un mam ífero . En ciertas modalidades, el vertebrado es un vertebrado no humano . En ciertas modalidades, el vertebrado es un mam ífero no humano. En ciertas modalidades, el mam ífero es un mam ífero no humano.
En ciertas modalidades, el vertebrado o el mam ífero es un ser humano. En ciertas modalidades, el ser humano es un participante en un estudio revisado por un organismo gubernamental encargado de la aprobación comercial de un fármaco. En ciertas modalidades, el estudio es un ensayo cl ínico. En ciertas modalidades, el organismo gubernamental es la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY , compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo , que comprende los pasos (a) a (c) de este cuarto aspecto, y comprende además: (d ) sintetizar opcionalmente un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo de acuerdo con el paso (c); (e) proporcionar opcionalmente un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo de acuerdo con el paso (c); y (f) determinar si el compuesto aumenta el nivel de PYY en una muestra obtenida de un vertebrado, al cual se le hab ía administrado un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo en el paso (c); donde la capacidad del compuesto de prueba para aumentar el nivel de PYY en el vertebrado además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el vertebrado es un mam ífero . En ciertas modalidades, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero no humano . En ciertas modalidades, el mamífero es un mamífero no humano .
En ciertas modalidades, el vertebrado o el mam ífero es un ser humano. En ciertas modalidades, el ser humano es un participante en un estudio revisado por un organismo gubernamental encargado de la aprobación comercial de un fármaco . En ciertas modalidades, el estudio es un ensayo clínico. En ciertas modalidades, el organismo gubernamental es la Ad ministración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos.
En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es SEQ. I D N°: 2 o uno de sus alelos. En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es un alelo de SEQ. I D N°: 2. En algunas modalidades, el receptor acoplado a proteína G de la i nvención es un ortólogo de SEQ . I D N°: 2.
En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es un receptor acoplado a proteína G que se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il )-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}- amina . En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es un receptor acoplado a proteína G para el cual (2- Fluoro-4-metanosulfonil-fenil )-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2 ,4]oxadiazol-5-il )- piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un ligando. En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es un receptor acoplado a proteína G para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil )-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2 ,4]oxadiazol-5-il )-piperid in-1 -i l]-5-nitro-pi rimidi n-4-il}-amina es un agonista. En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención presenta un nivel detectable de actividad constitutiva . En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de acumulación de AM Pc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento.
En ciertas modalidades, las condiciones de hibridación rigurosas comprenden la hibridación a 42°C en una solución que contiene formamida al 50% , 5 x SSC ( 1 x SSC = NaCI 1 50 mM , citrato trisódico 1 5 mM ), fosfato de sodio 50 mM (pH 7 ,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 1 0% , y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 20 g/ml , seguido de lavado a 65°C en una solución que contiene 0, 1 x SSC. Las técnicas de hibridación son bien conocidas por los técnicos con experiencia .
En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ . I D N°: 1 es SEQ . ID N°: 2 o uno de sus alelos. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 es un alelo de SEQ . I D N°: 2. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido q ue se hí brida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ . I D N°: 1 es un ortólogo de SEQ . I D N°: 2. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se h íbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. I D N°: 1 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il )-piperidin- 1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. En ciertas modalidades , el GPCR codificado por u n polinucleótido que se híbrida en condiciones rigu rosas al complemento de S EQ. I D N°: 1 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-feni l )-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2 ,4]oxadiazol-5-il )-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un ligando. En ciertas modalidades, el G PCR codificado por un polinucleótido que se h íbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidi n-4-il}-ami na es un agonista. En algunas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de S EQ. ID N°: 1 presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AM Pc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran di spersión del pigmento .
En ciertas modalidades, la variante de SEQ . I D N°: 2 es un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ . I D N°: 2. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, la variante de SEQ, ID N°: 2 que es un receptor acoplado a proteína G es un receptor acoplado a proteína G endógeno. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 que es un receptor acoplado a proteína G es un receptor acoplado a proteína G no endógeno.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2 es SEQ. ID N°: 2 o uno de sus alelos. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2 es un alelo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2 es un ortólogo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-píperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un agonista. En algunas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ.
ID N°: 2 presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 es SEQ. ID N°: 2 o un alelo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 es un alelo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 es un ortólogo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}- amina es un agonista. En algunas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento .
En algunas modalidades , el receptor acoplado a proteína G es parte de una proteína de fusión que comprende una proteína G . Las técnicas para preparar un constructo de fusión G PCR: G son bien conocidas por los técnicos con experiencia (consulte, por ejemplo , la Solicitud I nternacional WO 02/42461 ).
En ciertas modalidades , dicha determinación se lleva a cabo usando u na cél ula huésped que contiene el receptor acoplado a proteína G . En ciertas modalidades, la célula huésped comprende un vector de expresión y dicho vector de expresión comprende un polinucleótido q ue codifica al G PCR. Un ejemplo de vector de expresión adecuado es pCMV. Otros vectores de expresión adecuados serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia y una amplia variedad de vectores de expresión se puede adquiri r en el comercio (por ejemplo , a Clontech , Palo Alto, CA; Stratagene, La Jolla , CA; e Invitrogen , Carlsbad , CA).
En algunas modalidades, la célula huésped es una célula de un vertebrado. En algunas modalidades, la célula huésped es una célula de un mam ífero . En algunas modalidades, la célula huésped de un mam ífero se selecciona del grupo que consiste en una célula 293, una célula 293T, una célula CHO, una célula MCB3901 y una cél ula COS-7. En algunas modalidades, la célula huésped es una célula de una levad ura . En algunas modalidades , la célula huésped es una célula melanófora. Otras cél ulas huéspedes adecuadas serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia, y una amplia variedad de líneas celulares se puede obtener de American Type Culture Collection, 1 0801 University Boulevard , Manassas, VA 201 1 0-2209.
En ciertas modalidades, dicha determinación se lleva a cabo usando membrana que contiene el receptor acoplado a proteína G.
En algunas modalidades, el compuesto de prueba es una molécula pequeña. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es una molécula pequeña , con la condición de que la molécula pequeña no sea un anticuerpo ni uno de sus fragmentos de unión al antígeno. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un lípido. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido ni un lípido. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un polipéptido. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un polipéptido, con la condición de que el polipéptido no sea un anticuerpo ni uno de sus fragmentos de unión al antígeno. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un lípido. En algunas modalidades, el compuesto de prueba no es un anticuerpo ni uno de sus fragmentos de unión al antígeno. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno.
En algunas modalidades, el método comprende además el paso de determinar opcionalmente la estructura del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En algunas modalidades, el método comprende además el paso de proporcionar opcionalmente el nombre o la estructura del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En algunas modalidades, dicho método comprende además el paso de producir o sintetizar opcionalmente el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En algunas modalidades, el método comprende además el paso de determinar opcionalmente la estructura del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En algunas modalidades, el método comprende además el paso de proporcionar opcionalmente el nombre o la estructura del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un i nd ividuo .
En algunas modalidades , dicho método comprende ad emás el paso de producir o si ntetizar opcionalmente el secretagogo de PYY , el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY , o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En algunas modalidades , dicho método comprende además el paso de formular el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, como un producto farmacéutico.
En algunas modalidades, dicho método comprende además eval uar la biodisponibilidad del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección mod ulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY.
En algunas modalidades, dicho método comprende además el paso de formular el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, como una composición farmacéutica .
La invención describe además un proceso que comprende llevar a cabo un método de acuerdo con este cuarto aspecto.
En un quinto aspecto, la invención describe un método para detector compuestos de prueba para identificar un secretagogo de PYY, un compuesto para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, que se caracteriza por usar un receptor acoplado a proteína G que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) aminoácidos 1-335 de SEQ. ID N°: 2; (b) aminoácidos 2-335 de SEQ. ID N°: 2; (c) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de (a) por sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos definida en (a); (d) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°:1; (e) una variante de SEQ. ID N°: 2 cuando se selecciona del grupo que consiste en: (i) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2; y (ii) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2; (f) la secuencia de aminoácidos de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado a proteína G que tiene S EQ. I D N°: 2 ; y (g) un fragmento biológicamente activo de cualquiera de (a) a (f).
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G comprende la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. I D N°: 2.
En ciertas modalidades, el receptor comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ . I D N°: 2 es un alelo de SEQ . I D N° : 2.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ . I D N°: 2 es un ortólogo de SEQ . I D N°: 2. En ciertas modalidades, la variante de SEQ . I D N°: 2 es un ortólogo mam ífero de SEQ . I D N°: 2.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G es recombinante.
En ciertas modalidades, el método comprende identificar un agonista del receptor.
En ciertas modalidades, el método comprende identificar un agonista parcial del receptor.
En algunas modalidades , dicho método comprende además el paso de formular el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, como un producto farmacéutico.
En algunas modalidades, dicho método comprende además evaluar la biodisponibilidad del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY.
En algunas modalidades, dicho método comprende además el paso de formular el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, como una composición farmacéutica.
La invención describe además un proceso que comprende llevar a cabo un método de acuerdo con este quinto aspecto.
En un sexfo aspecto, la invención describe un método que comprende, haber identificado un secretagogo de PYY, un compuesto para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo de acuerdo con el primer aspecto, el segundo aspecto, el tercer aspecto, el cuarto aspecto o el quinto aspecto, formular dicho secretagogo de PYY, dicho compuesto para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY o dicho compuesto para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, como una forma farmacéutica.
En un séptimo aspecto, la invención describe el uso de un receptor acoplado a proteína G para detectar compuestos de prueba como secretagogos de PYY, compuestos para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, donde el receptor acoplado a proteína G comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) aminoácidos 1-335 de SEQ. ID N°: 2; (b) aminoácidos 2-335 de SEQ. ID N°: 2; (c) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de (a) por sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos definida en (a); (d) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°:1; (e) una variante de SEQ. ID N°: 2 cuando se selecciona del grupo que consiste en: (i) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2; y (ii) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2; (f) la secuencia de aminoácidos de una * versión constitutivamente activa de un receptor acoplado a proteína G que tiene SEQ. ID N°: 2; y (g) un fragmento biológicamente activo de cualquiera de (a) a (f).
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G comprende la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, el receptor comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un alelo de SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un ortólogo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un ortólogo mamífero de SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, el receptor es recombinante.
En ciertas modalidades, el compuesto de prueba es una molécula pequeña.
En ciertas modalidades, el compuesto de prueba es un agonista de GPR119.
En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 es un agonista de un GPR119 endógeno.
En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 es un agonista del GPR119 humano.
En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 es un agonista parcial de GPR119.
En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 es un agonista selectivo de GPR119.
En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 es una molécula pequeña.
En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 está disponible por vía oral.
En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 tiene un valor de CE50 menor de aproximadamente 10 µ?, menor de aproximadamente 1 µ?, menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, menor de aproximadamente 15 nM, menor de aproximadamente 10 nM, menor de aproximadamente 5 nM, menor de aproximadamente 4 nM, menor de aproximadamente 3 nM, menor de aproximadamente 2 nM o menor de aproximadamente 1 nM. En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 tiene un valor de CE50 menor de aproximadamente 10 µ?, menor de aproximadamente 1 µ?, menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, menor de aproximadamente 15 nM, menor de aproximadamente 10 nM, menor de aproximadamente 5 nM, menor de aproximadamente 4 nM, menor de aproximadamente 3 nM, menor de aproximadamente 2 nM o menor de aproximadamente 1 nM en el GPR119 humano que tiene SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 tiene un valor de CE50 menor de aproximadamente 10 µ?, menor de aproximadamente 1 µ?, menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, menor de aproximadamente 15 nM, menor de aproximadamente 10 nM, menor de aproximadamente 5 nM, menor de aproximadamente 4 nM, menor de aproximadamente 3 nM, menor de aproximadamente 2 nM o menor de aproximadamente 1 nM en el GPR119 humano que tiene SEQ. ID N°: 2. En el ensayo de adenililciclasa (el ejemplo de ensayo de adenililciclasa se proporciona en el Ejemplo 9, el Ejemplo 10 y el ejemplo Ejemplo 11, infra). En ciertas modalidades, el agonista de GPR119 tiene un valor de CE50 menor de aproximadamente 10 µ?, menor de aproximadamente 1 µ?, menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, menor de aproximadamente 15 nM, menor de aproximadamente 10 nM, menor de aproximadamente 5 nM, menor de aproximadamente 4 nM, menor de aproximadamente 3 nM, menor de aproximadamente 2 nM o menor de aproximadamente 1 nM en el GPR119 humano que tiene SEQ. ID N°: 2 en el ensayo de melanóforos (el ejemplo de ensayo de melanóforos se proporciona en el Ejemplo 12, infra).
Los ejemplos de agonistas de GPR119 se divulgan, por ejemplo, en la Solicitud Internacional N° PCT/US2004/001267 (publicada como WO 04/065380); Solicitud Internacional N° PCT/US2004/005555 (publicada como WO 04/076413); Solicitud I nternacional N° PCT/US2004/022327 (publicada como WO 05/007647); Solicitud Internacional N° PCT/US2004/02241 7 (publicada como WO 05/007658); Solicitud Internacional N° PCT/US2005/01931 8 (publicada como WO 2005/121 1 21 ); Solicitud Internacional N° PCT/GB2004/050046 (publicada como WO 2005/061489); Solicitud Internacional N° PCT/US06/00567 (publicada como WO 2006/083491 ); Solicitud Internacional N . PCT/GB2005/050264 (publicada como WO 2006/067531 ); Solicitud Internacional N° PCT/GB2005/050265 (publicada como WO 2006/067532); Solicitud Internacional N° PCT/GB2005/050266 (publicada como WO 2006/070208); Solicitud Internacional N° PCT/JP02/09350 (publicada como WO 03/026661 ); Solicitud Internacional N° PCT/JP2005/018412 (publicada como WO 06/040966); Solicitud Internacional N° PCT/JP2005/019000 (publicada como WO 2006/043490); Solicitud I nternacional N° PCT/GB2006/0501 76 (publicada como WO 2007/003960); Solicitud Internacional N° PCT/GB2006/050177 (publicada como WO 2007/003961 ); Solicitud Internacional N° PCT/GB2006/050178 (publicada como WO 2007/003962); Solicitud I nternacional N° PCT/GB2006/050182 (publicada como WO 2007/003964); Solicitud Internacional N° PCT/JP02/09350 (publicada como WO 03/026661 ); Solicitud Internacional N° PCT/GB2007/0501 83 (publicada como WO 2007/1 1 6229); Solicitud Internacional N° PCT/GB2007/050190 (publicada como WO 2007/1 16230); Solicitud I nternacional N° PCT/US2007/073364 (publicada como WO 2008/008895); Solicitud Internacional N° PCT/EP2007/058991 (publicada como WO 2008/025798); Solicitud Internacional N° PCT/EP2007/058993 (publicada como WO 2008/025799); y la Solicitud Internacional N° PCT/EP2007/058995 (publicada como WO 2008/025800).
En un octavo aspecto la invención describe un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor acoplado a proteína G donde dicho receptor acoplado a proteína G comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) aminoácidos 1 -335 de SEQ. I D N°: 2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ. I D N°: 2; (iii)una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de (i) por sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos definida en (i ); (iv)la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. I D N°: 1 ; (v)una variante de SEQ. I D N°: 2 cuando se selecciona del grupo que consiste en: (a') la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ . I D N°: 2; y (b' ) una secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. I D N° : 2 ; (vi ) la secuencia de aminoácidos de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado a proteína G que tiene S EQ . I D N°: 2 ; y (vii) un fragmento biológicamente activo de cualquiera de (i ) a (vi); in vitro con una célula enteroendocrina de un vertebrado o con una célula capaz de secretar PYY, donde dicho compuesto ha sido determi nado o identificado por un método de acuerdo con el primer aspecto; y (b) determinar si el compuesto estimula la secreción de PYY de la célula enteroendocrina del vertebrado o de la cél ula capaz de secretar PYY ; donde la capacidad del compuesto de prueba para estimular la secreción de PYY de la célula enteroendocrina del vertebrado o de la cél ula capaz de secretar PYY además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY , o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades , el receptor acoplado a proteína G comprende la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, el receptor comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un alelo de SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un ortólogo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un ortólogo mamífero de SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G es recombinante.
En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina del vertebrado es una célula enteroendocrina de un mamífero. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina es una célula L. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido obtenido del intestino delgado o el intestino grueso. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido obtenido de una región del intestino delgado o el intestino grueso que contiene células L. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido de duodeno, yeyuno, íleo, colon o recto (consulte, por ejemplo, Lundberg et al, PNAS USA (1982) 79:4471-4475; Adrián et al, Gastroenterol (1985) 89:1070-1077; Ekblad et al, Peptides (2002) 23:251-261; Ueno et al, Regul Pept (2008) 145:12-16). En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina es una l ínea celular enteroendocri na . En ciertas modalidades, la cél ula capaz de secretar PYY es una célula compuesta o derivada de islotes de Langerhans. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula neu ronal . En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula recombinante modificada genéticamente para ser capaz de secretar PYY.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY , compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, que comprende los pasos de: (a ) administrar a u n vertebrado un compuesto que estim ula la funcionalidad de un receptor acoplado a proteína G , donde dicho receptor acoplado a proteína G comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en : (i ) ami noácidos 1 -335 d e SEQ. I D NT: 2 ; (ii ) aminoácidos 2-335 de SEQ. I D N°: 2; (iii ) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado, de (i ) por sustitución , deleción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos definida en (i ); (iv) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ . I D N°: 1 ; (v) una variante de SEQ . I D N°: 2 cuando se selecciona del gru po que consiste en: (a' ) la secuencia de ami noácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. I D N°: 2 ; y (b' ) una secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ . I D N°: 2 ; (vi ) la secuencia de aminoácidos de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado a proteína G que tiene S EQ. I D N°: 2; y (vii) un fragmento biológicamente activo de cualquiera de (i ) a (vi ); habiendo sido determinado o identificado dicho compuesto por un método de acuerdo con el primer aspecto; y (b) determinar si el compuesto aumenta el nivel de PYY en el vertebrado; donde la capacidad del compuesto de prueba para aumentar el nivel de PYY en el vertebrado además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY , un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G comprende la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, el receptor comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un alelo de SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un ortólogo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un ortólogo mamífero de SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G es recombinante.
En ciertas modalidades, el nivel de PYY es la concentración sanguínea o plasmática de PYY total. En ciertas modalidades, el nivel de PYY es la concentración sanguínea o plasmática de PYY3-36- En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero. En ciertas modalidades, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero no humano. En ciertas modalidades, el mamífero es un mamífero no humano.
En ciertas modalidades, el vertebrado o el mamífero es un ser humano. En ciertas modalidades, el ser humano es un participante en un estudio revisado por un organismo gubernamental encargado de la aprobación comercial de un fármaco. En ciertas modalidades, el estudio es un ensayo clínico. En ciertas modalidades, el organismo gubernamental es la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, que comprende los pasos de: (a) determinar si el compuesto aumenta el nivel de PYY en una muestra, habiendo sido obtenida dicha muestra de un vertebrado al que se administró previamente un compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado a proteína G, donde dicho receptor acoplado a proteína G comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) aminoácidos 1-335 de SEQ. ID N°: 2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ. ID N°: 2; (iii) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de (i) por sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos definida en (i); (iv) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°:1; (v) una variante de SEQ. ID N°: 2 cuando se selecciona del grupo que consiste en: (a') la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2; y (b' ) una secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2; (vi) la secuencia de aminoácidos de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado a proteína G que tiene SEQ. I D N°: 2; y (vii) un fragmento biológicamente activo de cualquiera de (i ) a (vi); habiendo sido determinado o identificado dicho compuesto por un método de acuerdo con el primer aspecto; y donde la capacidad del compuesto de prueba para aumentar el nivel de PYY en el vertebrado además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G comprende la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. I D N°: 2.
En ciertas modalidades, el receptor comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. I D N°: 2.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 es un alelo de SEQ. I D N°: 2.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 es un ortólogo de SEQ . I D N°: 2. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. I D N° : 2 es un ortólogo mamífero de SEQ . I D N°: 2.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G es recombinante.
En ciertas modalidades , el vertebrado es un mamífero . En ciertas modalidades, el vertebrado es un vertebrado no h umano. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mam ífero no h umano. En ciertas modalidades , el mam ífero es un mam ífero no humano .
En ciertas modalidades, el vertebrado o el mam ífero es un ser humano. En ciertas modalidades, el ser humano es un participante en un estudio revisado por un organismo gubernamental encargado de la aprobación comercial de un fármaco. En ciertas modalidades, el estudio es un ensayo cl ínico. En ciertas mod alidades, el organismo gubernamental es la Administración de Fármacos y Al i mentos de los Estados Unidos.
En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es SEQ. I D N°: 2 o uno de sus alelos. En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es un alelo de SEQ. I D N°: 2. En algunas modalidades , el receptor acoplado a proteína G de la invención es un ortólogo de S EQ . I D N°: 2.
En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es un receptor acoplado a proteína G que se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfoni l-fenil )-{6-[4-(3- isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidi n-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}- amina . En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es un receptor acoplado a proteína G para el cual (2-Fl uoro-4-metanosulfonil-fenil )-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2 ,4]oxadiazol-5-il )-pi peridin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un ligando . En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es un receptor acoplado a proteína G para el cual (2-Fl uoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il )-pi peridin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-ami na es un agonista . En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención presenta un nivel detectable de actividad constitutiva . En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de acumulación de AM Pc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento.
En ciertas modalidades , las condiciones de hibridación rigu rosas comprenden la hibridación a 42°C en una sol ución que contiene formamida al 50% , 5 x SSC ( 1 x SSC = NaCI 1 50 iriM , citrato trisódico 1 5 mM ), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% , y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 20 pg/ml , seguido de lavado a 65°C en una solución que contiene 0, 1 x SSC. Las técnicas de hibridación son bien conocidas por los técnicos con experiencia.
En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un poli nucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ . I D N°: 1 es SEQ . I D N°: 2 o uno de sus alelos.
En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 es un alelo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 es un ortólogo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[ ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un ligando. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 es un receptor para el cual (2-Fluoro- 4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-ísopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)- piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un agonista. En algunas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 es un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. I D N°: 2. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 es un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. I D N°: 2. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 que es un receptor acoplado a proteína G es un receptor acoplado a proteína G endógeno. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 que es un receptor acoplado a proteína G es un receptor acoplado a proteína G no endógeno.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ . I D N°: 2 es SEQ. ID N°: 2 o uno de sus alelos. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2 es un alelo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. I D N°: 2 es un ortólogo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. I D N°: 2 se une específicamente a (2-Fluoro-4- metanosulfonil-fenil )-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)- piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. I D N°: 2 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-p¡peridin-1-il]-5-nitro-pirirnidin-4-il}-arnina es un agonista. En algunas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2 presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 es SEQ. ID N°: 2 o un alelo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 es un alelo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 es un ortólogo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}- amina. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}- amina es un agonista. En algunas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. I D N°: 2 presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AM Pc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento.
En algunas modalidades, el receptor acoplado a proteína G es parte de una proteína de fusión que comprende una proteína G. Las técnicas para preparar un constructo de fusión GPCR:G son bien conocidas por los técnicos con experiencia (consulte, por ejemplo, la Solicitud Internacional WO 02/42461 ).
En algunas modalidades, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado a proteína G es una molécula pequeña. En algunas modalidades, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado a proteína G es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido. En algunas modalidades, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado a proteína G es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un anticuerpo ni uno de sus fragmentos de unión al antígeno. En algunas modalidades, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado a proteína G es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un lípido. En algunas modalidades, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado a proteína G es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido ni un lípido. En algunas modalidades, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado a proteína G es un polpéptido. En algunas modalidades, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado a proteína G es un polipéptido, con la condición de que el polipéptido no sea un anticuerpo ni uno de sus fragmentos de unión al antígeno. En algunas modalidades, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado a proteína G es un lípido. En algunas modalidades, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado a proteína G no es un anticuerpo ni uno de sus fragmentos de unión al antígeno. En algunas modalidades, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado a proteína G es un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno.
En algunas modalidades, el método comprende además el paso de determinar opcionalmente la estructura del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En algunas modalidades, el método comprende además el paso de proporcionar opcionalmente el nombre o la estructura del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En algunas modalidades, dicho método comprende además el paso d e producir o si ntetizar opcional mente el secretagogo de PYY , el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección mod ulada por PYY, o el compuesto úti l para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un i nd ividuo.
En algunas modalidades , dicho método comprende además el paso de formular el secretagogo de PYY , el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en u n individuo, como un producto farmacéutico.
En algunas modalidades , dicho método comprende además eval uar la biodisponibilidad del secretagogo de PYY , del compuesto úti l para el tratamiento o la prevención de una afección mod ulada por PYY, o del compuesto úti l para la modulación de una actividad relacionada con PYY.
En algunas modalidades , dicho método comprende además el paso de form ular el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, como una composición farmacéutica .
La invención describe además un proceso que comprende llevar a cabo un método de acuerdo con este octavo aspecto.
En un noveno aspecto la invención describe un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratami ento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un compuesto en presencia del cual se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado a proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto, donde el receptor acoplado a proteína G comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) aminoácidos 1 -335 de SEQ. I D N°: 2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ. ID N°: 2; (iii) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de (i) por sustitución , deleción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos definida en (i ); (iv) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ . I D N°: 1 ; (v) una variante de SEQ. I D N°: 2 cuando se selecciona del grupo que consiste en: (a') la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. I D N°: 2; y (b') la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 ; (vi) la secuencia de aminoácidos de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado a proteína G que tiene SEQ. I D N°: 2; y (vii ) un fragmento biológicamente activo de cualquiera de (i) a (vi); in vitro con una célula enteroendocrina de un vertebrado o con una célula capaces de secretar PYY, donde dicho compuesto ha sido determinado o identificado por un método de acuerdo con el cuarto aspecto; y (b) determinar si el compuesto estimula la secreción de PYY de la célula enteroendocrina del vertebrado o de la célula capaz de secretar PYY; donde la capacidad del compuesto de prueba para estimular la secreción de PYY de la célula enteroendocrina del vertebrado o de la célula capaz de secretar PYY además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G comprende la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. I D N°: 2.
En ciertas modalidades, el receptor comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un alelo de SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un ortólogo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un ortólogo mamífero de SEQ. ID N°: 2.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G es recombinante.
En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina , del vertebrado es una célula enteroendocrina de un mamífero. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina es una célula L. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido obtenido del intestino delgado o el intestino grueso. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido obtenido de una región del intestino delgado o el intestino grueso que contiene células L. En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina está compuesta o deriva de tejido de duodeno, yeyuno, íleo, colon o recto (consulte, por ejemplo, Lundberg et al, PNAS USA (1982) 79:4471-4475; Adrián et al, Gastroenterol (1985) 89:1070-1077; Ekblad et al, Peptides (2002) 23:251-261; Ueno et al, Regul Pept (2008) 145:12-16). En ciertas modalidades, la célula enteroendocrina es una línea celular enteroendocrina. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula compuesta o derivada de islotes de Langerhans. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula neuronal. En ciertas modalidades, la célula capaz de secretar PYY es una célula recombinante modificada genéticamente para ser capaz de secretar PYY.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, que comprende los pasos de: (a) administrar un compuesto a un vertebrado, donde en presencia de dicho compuesto se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado a proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto, donde el receptor acoplado a proteína G comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en : (i) aminoácidos 1 -335 de SEQ. I D N°: 2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ . I D N°: 2; (iii) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de (i) por sustitución , deleción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de (i); (iv) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ . I D N°: 1 ; (v) una variante de SEQ. ID N°: 2 cuando se selecciona del grupo que consiste en: (a' ) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2; y (b') la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2; (vi) la secuencia de aminoácidos de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado a proteína G que tiene SEQ. ID N°: 2; y (vii) un fragmento biológicamente activo de cualquiera de (i) a (vi); habiendo sido determinado o identificado dicho compuesto por un método de acuerdo con el cuarto aspecto; y (b) determinar si el compuesto aumenta el nivel de PYY en el vertebrado; donde la capacidad del compuesto de prueba para aumentar el nivel de PYY en el vertebrado además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero. En ciertas modalidades, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mamífero no humano. En ciertas modalidades, el mamífero es un mamífero no humano.
En ciertas modalidades, el vertebrado o el mamífero es un ser humano. En ciertas modalidades, el ser humano es un participante en un estudio revisado por un organismo gubernamental encargado de la aprobación comercial de un fármaco. En ciertas modalidades, el estudio es un ensayo clínico. En ciertas modalidades, el organismo gubernamental es la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos.
La invención describe además un método para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, que comprende los pasos de: (a) determinar si el compuesto aumenta el nivel de PYY en una muestra, habiendo sido obtenida dicha muestra de un vertebrado al que se había administrado previamente un compuesto en presencia del cual se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado a proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto, donde el receptor acoplado a proteína G comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) aminoácidos 1 -335 de SEQ. I D N°: 2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ. I D N°: 2; (iii) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de (i) por sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos definida en (i ); < (¡v) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ . I D N°: 1 ; (v) una variante de SEQ. I D N°: 2 cuando se selecciona del grupo que consiste en: (a') la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ . I D N°: 2; y (b') la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2; (vi ) la secuencia de aminoácidos de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado a proteína G que tiene SEQ . I D N°: 2; y (vií) un fragmento biológicamente activo de cualquiera de (i ) a (vi); habiendo sido determinado o identificado dicho compuesto por un método de acuerdo con el cuarto aspecto; y donde la capacidad del compuesto de prueba para aumentar el nivel de PYY en el vertebrado además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el vertebrado es un mam ífero. En ciertas modalidades, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas modalidades, el vertebrado es un mam ífero no humano. En ciertas modalidades, el mam ífero es un mamífero no humano.
En ciertas modalidades, el vertebrado o el mamífero es un ser humano. En ciertas modalidades, el ser humano es un participante en un estudio revisado por un organismo gubernamental encargado de la aprobación comercial de un fármaco. En ciertas modalidades, el estudio es un ensayo clínico. En ciertas modalidades, el organismo gubernamental es la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos.
En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es SEQ. I D N°: 2 o uno de sus alelos. En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es un alelo de SEQ. ID N°: 2. En algunas modalidades, el receptor acoplado a proteína G de la invención es un ortólogo de SEQ. ID N°: 2.
En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es un receptor acoplado a proteína G que se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil )-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina . En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es un receptor acoplado a proteína G para el cual (2- Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il )- piperidin- -il]-5-nítro-pirimidin-4-il}-amina es un ligando. En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención es un receptor acoplado a proteína G para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il )-piperidin-1 -il]-5-nitro-pir¡midin-4-il}-am¡na es un agonista. En algunas modalidades, un receptor acoplado a proteína G de la invención presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de acumulación de AMPc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento.
En ciertas modalidades, las condiciones de hibridación rigurosas comprenden la hibridación a 42°C en una solución que contiene formamid a al 50% , 5 x SSC ( 1 x SSC = NaCI 1 50 m , citrato trisódico 1 5 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% , y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 20 pg/ml, seguido de lavado a 65°C en una solución que contiene 0, 1 x SSC. Las técnicas de hibridación son bien conocidas por los técnicos con experiencia.
En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 es SEQ. I D N°: 2 o uno de sus alelos. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. I D N°: 1 es un alelo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. I D N°: 1 es un ortólogo de SEQ.
I D N°: 2. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. I D N°: 1 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidi n-4-il}-amina. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. I D N°: 1 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2 ,4]oxadiazol-5-il )-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un ligando. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[ ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un agonista. En algunas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. I D N°: 1 presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AM Pc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 es un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 que es un receptor acoplado a proteína G es un receptor acoplado a proteína G endógeno. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 que es un receptor acoplado a proteína G es un receptor acoplado a proteína G no endógeno.
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2 es SEQ. ID N°: 2 o uno de sus alelos. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2 es un alelo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2 es un ortólogo de SEQ. ID N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2 se une específicamente a (2-Fluoro-4- metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)- piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un agonista. En algunas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2 presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento .
En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. I D N°: 2 es SEQ. I D N°: 2 o un alelo de SEQ . I D N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ . I D N°: 2 es un alelo de SEQ. I D N°: 2. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. I D N°: 2 es un ortólogo de SEQ. I D N°: 2. En ciertas modalidades , el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. I D N°: 2 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. En ciertas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. I D N°: 2 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il )-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}- amina es un agonista. En algunas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. I D N°: 2 presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento.
En algunas modalidades, el receptor acoplado a proteína G es parte de una proteína de fusión que comprende una proteína G. Las técnicas para preparar un constructo de fusión GPCR:G son bien conocidas por los técnicos con experiencia (consulté, por ejemplo, la Solicitud Internacional WO 02/42461 ).
En algunas modalidades, el compuesto en presencia del cual se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado a proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto, es una molécula pequeña. En algunas modalidades, el compuesto en presencia del cual se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado a proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto, es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido. En algunas modalidades, el compuesto en presencia del cual se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado a proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto, es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un anticuerpo ni uno de sus fragmentos de unión al antígeno. En algunas modalidades, el compuesto en presencia del cual se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado a proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto, es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un l ípido. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido ni un l ípido. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es un polipéptido. En algunas modalidades, el compuesto en presencia del cual se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado a proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto, es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un anticuerpo ni uno de sus fragmentos de unión al antígeno. En algunas modalidades, el compuesto en presencia del cual se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado a proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto, es un lípido. En algunas modalidades, el compuesto en presencia del cual se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado a proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto , no es un anticuerpo ni uno de sus fragmentos de unión al antígeno. En algunas modalidades, el compuesto en presencia del cual se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado a proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto, es un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno.
En ciertas modalidades, el método es un método para identificar secretagogos de PYY.
En ciertas modalidades, el método es un método para identificar compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY.
En ciertas modalidades, el método es un método para identificar compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En ciertas modalidades, el ligando de GPR119 es un agonista de GPR119. En ciertas modalidades, el ligando de GPR119 o el agonista de GPR119 es un ligando o un agonista de un receptor GPR119 endógeno de un vertebrado, un mamífero o un ser humano. En ciertas modalidades, el ligando de GPR119 o el agonista de GPR119 es un ligando o un agonista de un receptor GPR119 endógeno humano. En ciertas modalidades, el ligando de GPR119 o el agonista de GPR119 es idéntico a un compuesto divulgado, por ejemplo, en la Solicitud Internacional N° PCT/US2004/001267 (publicada como WO 04/065380); Solicitud Internacional N° PCT/US2004/005555 (publicada como WO 04/076413); Solicitud Internacional N° PCT/US2004/022327 (publicada como WO 05/007647); Solicitud Internacional N° PCT/US2004/022417 (publicada como WO 05/007658); Solicitud Internacional N° PCT/US2005/019318 (publicada como WO 2005/121121); Solicitud Internacional N° PCT7GB2004/050046 (publicada como WO 2005/061489); Solicitud Internacional N° PCT/US06/00567 (publicada como WO 2006/083491); Solicitud Internacional N. PCT/GB2005/050264 (publicada como WO 2006/067531); Solicitud Internacional N° PCT/GB2005/050265 (publicada como WO 2006/067532); Solicitud Internacional N° PCT/GB2005/050266 (publicada como WO 2006/070208); Solicitud Internacional N° PCT/JP02/09350 (publicada como WO 03/026661); Solicitud Internacional N° PCT/JP2005/018412 (publicada como WO 06/040966); Solicitud Internacional N° PCT/JP2005/019000 (publicada como WO 2006/043490); Solicitud Internacional N° PCT/GB2006/050176 (publicada como WO 2007/003960); Solicitud Internacional N° PCT/GB2006/050177 (publicada como WO 2007/003961); Solicitud Internacional N° PCT/GB2006/050178 (publicada como WO 2007/003962); Solicitud Internacional N° PCT/GB2006/050182 (publicada como WO 2007/003964); Solicitud Internacional N° PCT/JP02/09350 (publicada como WO 03/026661); Solicitud Internacional N° PCT/GB2007/050183 (publicada como WO 2007/116229); Solicitud Internacional N° PCT/GB2007/050190 (publicada como WO 2007/116230); Solicitud Internacional N° PCT/US2007/073364 (publicada como WO 2008/008895); Solicitud Internacional N° PCT/EP2007/058991 (publicada como WO 2008/025798); Solicitud Internacional N° PCT/EP2007/058993 (publicada como WO 2008/025799); o la Solicitud Internacional N° PCT/EP2007/058995 (publicada como WO 2008/025800). En ciertas modalidades, el ligando de GPR119 o el agonista de GPR119 es (2- Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)- piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina; En ciertas modalidades, el ligando de GPR119 es un ligando endógeno de un receptor GPR119 endógeno de un vertebrado, un mamífero, o un ser humano.
En ciertas modalidades , el l igando conocido opcional mente marcado es un ligando conocido marcado. En ciertas modalidades , el l igando conocido marcado es un ligando conocido radiomarcado . Las técnicas para radiomarcar un compuesto, como para marcar un l igando conocido de un receptor acoplado a proteína G de la invención , son bien conocidas por los técnicos con experiencia . Consulte, por ejemplo , la Solicitud I nternacional WO 04/065380. Consulte también , por ejemplo , el Ejemplo 1 4, infra.
Las técnicas para detectar el complejo entre un receptor acoplado a proteína G y un compuesto que se sabe que es un l igando del receptor acoplado a proteína G son bien conocidas por los técnicos con experiencia. Consulte, por ejemplo , la Solicitud I nternacion al WO 04/065380. Consulte también , por ejemplo, el Ejemplo 5 , infra .
En algunas modalidades, el método comprende además el paso de determinar opcionalmente la estructura del secretagogo de PYY , del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en u n individuo.
En alg unas modalidades, el método comprende además el paso de proporcionar opcionalmente el nombre o la estructura del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un i nd ividuo .
En. algunas modalidades, dicho método comprende además el paso de producir o sintetizar opcionalmente el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
En algunas modalidades, dicho método comprende además el paso de formular el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, como un producto farmacéutico.
En algunas modalidades, dicho método comprende además evaluar la biodisponibilidad del secretagogo de PYY, del compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o del compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY.
En algunas modalidades, dicho método comprende además el paso de formular el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, como una composición farmacéutica.
La invención describe además un proceso que comprende llevar a cabo un método de acuerdo con este noveno aspecto.
El solicitante se reserva el derecho de excluir uno cualquiera o más compuestos candidatos de cualquiera de las modalidades de la invención . El solicitante se reserva el derecho de excluir uno cualquiera o más moduladores de cualquiera de las modalidades de la invención . A modo de ejemplo y no con carácter li mitante, el solicitante se reserva el derecho de exclui r uno cualquiera o más agonistas de cualquiera de las modalidades de la i nvención . El solicitante se reserva el derecho de excluir cualquier poli n ucleótido o polipéptido de cualquiera de las modalidades de la invención . El sol icitante se reserva además el derecho de excluir cualquier afección modulada por PYY, cualquier afección ósea , cualquier afección ósea en que la afección ósea es una afección caracterizada por baja masa ósea , cualquier afección ósea en que la afección ósea es una fractura ósea, cualquier afección ósea en q ue la afección ósea es una enfermedad ósea , cualquier afección ósea en que la afección ósea es un aumento de la cicatrización ósea o del crecimiento óseo , cualquier trastorno metabólico, cualquier afección relacionada con angiogenesis, cualquier afección isquémica , cualquier trastorno por mala absorción , cualquier trastorno convulsivo , cualq uier ti po de cáncer, cualquier trastorno i nflamatorio , cualquier enfermedad pul monar inflamatoria , cualquier enfermedad i ntestinal inflamatoria y cualquier modulación de una actividad relacionada con PYY en un i ndividuo de cualquiera de las modalidades de la invención . También se contempla expresamente que las afecciones modulada por PYY, las afecciones óseas, las afecciones óseas en que la afección ósea es una afección caracterizada por baja masa ósea, las afecciones óseas en que la afección ósea es una fractura ósea, las afecciones óseas en que la afección ósea es una enfermedad ósea, las afecciones óseas en que la afección ósea es un aumento de la cicatrización ósea o del crecimiento óseo, los trastornos metabólicos, las afecciones relacionadas con angiogenesis, las afecciones isquémicas, los trastornos por mala absorción, los trastornos convulsivos, los cánceres, los trastornos inflamatorios, las enfermedades pulmonares inflamatorias, las enfermedades intestinales inflamatorias y las modulaciones de una actividad relacionada con PYY en un individuo, de la invención , se pueden incluir en una modalidad ya sea individualmente o en cualquiera de sus combinaciones.
Breve descri pción de las figuras La invención se ilustra en relación con las fig uras adjuntas en las cuales : La FIG. 1 muestra que el receptor GPR1 1 9 presenta actividad constitutiva para aumentar la acumulación de AM Pc en células HEK293 transfectadas.
La FIG. 2 muestra que el Compuesto 1 es un agonista del receptor GPR 1 9.
La FIG. 3 muestra un efecto de la administración del agonista de GPR1 1 9 sobre el PYY total plasmático en ratones silvestres.
Descripción detallada de la invención La presente invención se basa, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento del solicitante de que la administración de un agonista de GPR1 19 a un individuo, como la administración oral , puede actuar de manera de aumentar el PYY total plasmático en el individuo. La presente invención describe métodos relacionados con GPR1 1 9 para identificar secretagogos de PYY, compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY y compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo. Un agonista de GPR1 1 9 es útil para aumentar el PYY total plasmático en un individuo. En ciertas modalidades, el individuo es un ser humano. Los agonistas de GPR1 9 son útiles como agentes farmacéuticos para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY y para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo.
El término "l igando", como se usa aq uí, significará una molécula (por ejemplo, compuesto de prueba) que se une específicamente a un polipéptido, como GPR1 1 9. Un ligando puede ser, por ejemplo, un polipéptido, un lípido, una molécula pequeña o un anticuerpo. El Compuesto 1 es un ejemplo de ligando del polipéptido receptor GPR1 1 9 (consulte la Tabla A, que expone la estructura química y el nombre químico del Compuesto 1 ). El Compuesto 1 es idéntico al compuesto divulgado en la Solicitud de Patente Internacional N° PCT/US2004/001267 (publicada como WO 2004/065380). (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil- [1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina (consulte la Tabla A) es un ejemplo de ligando del polipéptido receptor GPR1 1 9. Un ligando endógeno es un ligando que es un ligando natural y endógeno para un polipéptido nativo, como GPR1 19. Un ligando puede ser un "antagonista" , "agonista" , "agonista parcial", "agonista i nverso" o similares.
Tabla A El término "agonista", como se usa aquí , significará un agente (por ejemplo, ligando o compuesto de prueba ) que en virtud de su unión a GPCR activa (por ejemplo estimula) al GPCR de modo de provocar una respuesta intraceluiar mediada por el GPCR.
El término "agonista parcial", como se usa aquí, significará un agente (por ejemplo, ligando o compuesto de prueba ) que en virtud de su unión a GPCR activa (por ejemplo estimula) al GPCR de modo de provocar una respuesta intraceluiar mediada por el GPCR, aunque en menor medida o grado que lo que lo hace un agonista total.
El término "antagonista" significará un agente (por ejemplo, ligando o compuesto de prueba) que se une, y preferentemente se une competitivamente, a un GPCR aproximadamente en el mismo sitio que un agonista o agonista parcial pero que no activa una respuesta intracelular iniciada por la forma activa del GPCR, y puede por lo tanto inhibir la respuesta intracelular provocada por el agonista o agonista parcial . Un antagonista no disminuye en general la respuesta intracelular basal en ausencia de un agonista o agonista parcial .
El término "agonista inverso" significará un agente (por ejemplo, ligando o compuesto de prueba) que se une a un GPCR y que inhibe la respuesta intracelular basal iniciada por la forma activa del receptor por debajo del nivel de actividad basal normal que se observa en ausencia de un agonista o agonista parcial .
El término "agonista de GPR1 19", como se usa aqu í , se refiere a un compuesto que se une al receptor GPR1 1 9 y actúa como un agonista. El Compuesto 1 es un ejemplo de agonista de GPR1 19 (consulte la Tabla A, que expone la estructura qu ímica y el nombre qu ímico del Compuesto 1 ). El Compuesto 1 es idéntico al compuesto divulgado en la Solicitud de Patente Internacional N° PCT/US2004/001267 (publicada como WO 2004/065380). (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)- piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un ejemplo de agonista de GPR1 19.
El término "agonista selectivo de GPR1 1 9", como se usa aquí , se refiere a un agonista de GPR1 1 9 que tiene selectividad por el receptor GPR1 1 9 en comparación con uno o más receptores relacionados, como el receptor del factor de liberación de corticotrop¡na-1 (CRF-1 ). El Compuesto 1 es un ejemplo de agonista selectivo de GPR1 19 (consulte la Tabla A, que expone la estructura química y el nombre qu ímico del Compuesto 1 ). El Compuesto 1 es idéntico al compuesto divulgado en la Solicitud de Patente I nternacional N° PCT/US2004/001267 (publicada como WO 2004/065380). (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2 ,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un ejemplo de agonista selectivo de GPR1 1 9.
La expresión "secretagogo de PYY" significará un agente (por ejemplo, ligando o compuesto de prueba) que promueve (por ejemplo, estimula) la secreción de PYY en una célula, por ejemplo, una célula enteroendocrina o que aumenta un n i ve l de PYY total , por ejemplo un nivel sanguíneo o plasmático de PYY total , cuando se administra a un individuo como un vertebrado o un mamífero. En ciertas modalidades, un secretagogo de PYY es un compuesto adecuado para aumentar un nivel de PYY total en un individuo, por ejemplo un nivel sanguíneo o plasmático de PYY total.
Como se usa aquí, la expresión "afección modulada por PYY" se refiere a una afección modulada por PYYi-36 o por uno de sus fragmentos que es capaz de modular un receptor acoplado a proteína G. En ciertas modalidades, la expresión "afección modulada por PYY" se refiere a una afección modulada por ???3-36 · En ciertas modalidades, la expresión "afección modulada por PYY" se refiere a una afección modulada por un agonista del receptor N PY Y2 (Y2R). En ciertas modalidades, la expresión "afección modulada por PYY" se refiere a una afección modulada por estimulación de Y2R. En ciertas modalidades, la expresión "afección modulada por PYY3-36" se refiere a una afección modulada por un agonista de Y2R. En ciertas modalidades, la expresión "afección modulada por PYY3 -36 " se refiere a una afección modulada por estimulación de Y2R.
Como se usa aquí, la expresión "actividad relacionada con PYY" se refiere a una actividad para modular un nivel de PYY o una actividad asociada con PYY . En ciertas modalidades, la expresión "actividad relacionada con PYY" se refiere a una actividad para aumentar el nivel de PYY o de una actividad asociada con PYY.
El término "individuo," como se usa aquí, se refiere a un vertebrado, incluidos, pero no exclusivamente, peces (como los peces cultivados comercialmente, los peces mascota, etc). , anfibios (como ranas, sapos, anfibios mascota, etc). , reptiles (como serpientes, lagartos, tortugas, reptiles mascota, etc)., aves (como pollos, pavos, pájaros mascota, etc). y mamíferos (como ratones, ratas, hámsters, conejos, cerdos, perros, gatos, caballos, vacas, ovejas, cabras, primates no humanos, mamíferos no humanos, mamíferos no humanos mascota, humanos, etc).. En ciertas modalidades, el individuo es un pez. En ciertas modalidades, el individuo es un anfibio. En ciertas modalidades, el individuo es un reptil. En ciertas modalidades, el individuo es un ave. En ciertas modalidades, el individuo es un pavo. En los últimos 25 años, la presión por la selección comercial de pavos con mayor masa muscular en la pechuga aumentó la exigencia respecto a la integridad del esqueleto. No obstante, la mayor masa muscular en la pechuga, no estuvo acompañada por cambios compensatorios en el esqueleto, lo que resultó en que la industria de los pavos sufrió un aumento en los problemas en las patas. Se informó de fracturas en los huesos largos en pavos machos adultos jóvenes. (Consulte, por ejemplo, Crespo et al , Poult Sci (2000) 79:602-608). En ciertas modalidades, el individuo es un mamífero. En ciertas modalidades, el individuo es un ratón , una rata, un hámster, un conejo, un cerdo, un gato, un caballo, una vaca, una oveja, una cabra, un primate no humano o un ser humano (que pueden ser incluidos en las modalidades de la invención individualmente o en cualquiera de sus combinaciones). En ciertas modalidades, el individuo es un caballo. Los caballos de exhibición , que son caballos que participan en actividades como carreras, pruebas de resistencia y otros eventos competitivos, son propensos a las fracturas óseas. En ciertas modalidades, el individuo es un perro o un gato. En ciertas modalidades, el individuo es un animal compañero del ser humano (como un perro, un gato, etc). , un animal de granja (como una vaca , una oveja, una cabra , un cerdo, un pollo, etc). un animal para deportes (como un caballo, un perro, etc)., una bestia de carga (como una muía , un camello, etc). o un animal exótico (como un animal que se encuentra en un zoológico, etc). , que se pueden incluir en modalidades de la invención individualmente o en cualquiera de sus combinaciones. En ciertas modalidades, el individuo es un vertebrado no humano. En ciertas modalidades, el individuo es un mamífero no humano. En ciertas modalidades, el individuo es un primate no humano (como un macaco de la India, un chimpancé, etc).. En ciertas modalidades, el individuo es un ser humano.
La expresión "que necesita la prevención o el tratamiento" como se usa aquí se refiere a la opinión que se formó un proveedor de asistencia (por ejemplo, un médico, una enfermera, una enfermera de atención primaria, etc. en el caso de los seres humanos; un veterinario en el caso de los vertebrados no humanos, y en una modalidad particular mamíferos no humanos) de que un individuo requiere o se beneficiará del tratamiento.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" o "dosis terapéuticamente eficaz" como se usa aquí, se refiere a la cantidad de principio activo o agente farmacéutico que produce la respuesta biológica o medicinal en un tejido, sistema, animal, individuo o ser humano que busca un investigador, veterinario, médico u otro clínico, que incluye una o más de las siguientes: (1) Prevenir la enfermedad; por ejemplo, prevenir una enfermedad, afección o trastorno en un individuo que puede estar predispuesto a la enfermedad, la afección o el trastorno pero que todavía no experimenta o presenta la patología o sintomatología de la enfermedad, (2) Inhibir la enfermedad; por ejemplo, inhibir una enfermedad, afección o trastorno en un individuo que está experimentando o presentando la patología o sintomatología de la enfermedad, afección o trastorno (es decir, detener el empeoramiento de la patología y/o sintomatología), y (3) Mejorar la enfermedad; por ejemplo, mejorar una enfermedad , afección o trastorno en un individuo que está experimentando o presentando la patología o sintomatología de la enfermedad , afección o trastorno (es decir, revertir la patología y/o sintomatología).
El término "eficacia terapéutica" como se usa aquí, se refiere a la provocación de la respuesta biológica o medicinal en un tejido, sistema, animal , individuo o ser humano que busca el investigador, el veterinario, el médico u otro clínico, que incluye una o más de las siguientes: (1 ) Prevenir la enfermedad; por ejemplo, prevenir una enfermedad, afección o trastorno en un individuo que puede estar predispuesto a la enfermedad , la afección o el trastorno pero que todavía no experimenta o presenta la patología o sintomatolog ía de la enfermedad , (2) Inhibir la enfermedad ; por ejemplo, inhibir una enfermedad, afección o trastorno en un individuo que está experimentando o presentando la patología o sintomatología de la enfermedad*, afección o trastorno (es decir, detener el empeoramiento de la patología y/o sintomatología), y (3) Mejorar la enfermedad ; por ejemplo, mejorar una enfermedad, afección o trastorno en un individuo que está experimentando o presentando la patología o sintomatología de la enfermedad , afección o trastorno (es decir, revertir la patología y/o sintomatología).
La expresión "cantidad que es eficaz para prevenir" se refiere a la cantidad de fármaco que prevendrá o reducirá el riesgo de aparición del suceso biológico o médico que busca ser prevenido. En muchos casos, la cantidad que es eficaz para prevenir es la misma que la cantidad terapéuticamente eficaz La expresión "administración periférica" significará administración fuera del sistema nervioso central. La administración periférica no incluye la administración directa en el cerebro. La administración periférica incluye, pero no exclusivamente, la ad ministración i ntravascular, intramuscular, subcutánea , por i nhalación , oral, sublingual, enteral , rectal , transdérmica o intranasal.
El término "composición" significará un material que comprende al menos un componente.
La expresión "principio activo" significará cualquier componente que proporciona una actividad farmacológica u otro efecto directo en el diagnóstico, la cura, la mitigación , el tratamiento o la prevención de una enfermedad .
La expresión "composición farmacéutica" significará una composición que comprende al menos un principio activo, mediante el cual la composición es adecuada para la investigación y el tratamiento en un mamífero.
"Farmacéuticamente aceptable" significa que el portador, vehículo, diluyente, excipientes y/o sal deben ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no deben ser perjudiciales para quien los recibe.
La expresión "forma farmacéutica" significará la forma física en la cual un fármaco es producido y administrado, como un comprimido, una cápsula o un inyectable.
"Hueso" significa el tejido conectivo calcificado, poroso, semi rígido y denso que forma la porción principal del esqueleto de la mayoría de los vertebrados, que comprende una matriz orgánica densa y un componente inorgánico mineral . Hueso es cualquiera de las numerosas estructuras anatómicamente diferentes del esqueleto de un vertebrado.
Las expresiones "masa ósea" y "densidad mineral ósea (DMO)" se usan aquí, indistintamente. La DMO en los humanos se mide generalmente mediante una técnica radiográfica estándar, absorciometría de rayos X de energía dual (AXD). De las muchas técnicas desarrolladas para evaluar la DMO, la AXD es la más desarrollada técnicamente y la de más amplia validación biológica. La tecnología AXD, con un software adaptado adecuado , puede incluso usarse para evaluar de manera confiable la DMO en estudios en animales. La AXD se usa en el diagnóstico de osteoporosis, prognosis (predicción de fractura), control de la evolución natural del trastorno y evaluación de la respuesta al tratamiento.
La expresión "baja masa ósea" como se usa aqu í, se refiere a cualquier disminución o reducción en la densidad mineral ósea (DMO) en un individuo, e incluye tanto la osteoporosi s como la osteopenia según se definen en las propuestas de la Organización M undi al de la Salud (OM S). La OM S ha definido como normal un valor de DMO dentro de una desviación estándar de la-\media de referencia del adulto joven (puntuación T > - 1 ). La OM S ha definido la osteopenia como un valor de DMO de más de 1 desviación estándar por debajo de la media del adulto joven , pero menor de 2, 5 desviaciones estándar por debajo de este valor (puntuación T < -1 y > -2 , 5). La OM S ha caracterizado la osteoporosis como una forma más grave de osteopenia, y la definió mediante el valor de DMO de 2 , 5 desviaciones estándar o más por debajo del valor medio del ad ulto joven (puntuación T = -2 ,5). (Consulte, por ejemplo , World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis, cuya divulgación se i ncorpora aquí por referencia en su totalidad ). Más comúnmente, la osteopenia se define como un puntuación T menor de - 1 y mayor de -2 , y la osteoporosis se define como un puntuación T menor o igual a -2. En ciertas modalidades de la presente invención , el puntuación T se mide en la cadera con AXD .
El término "osteoporosis" como se usa aqu í, se define med iante un valor de DMO de 2 o más desviaciones estánda r por debajo de la media de referencia del ad ulto joven (puntuación T = -2) o se refiere a un diagnóstico hecho por un proveedor de asistencia (por ejemplo, un médico, una enfermera o una enfermera de atención primaria en el caso de los seres humanos, o un veterinario en el caso de los vertebrados no humanos).
La osteoporosis se puede clasificar como primaria o secundaria. (Consulte, por ejemplo, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis). Como se usa aquí el término "osteoporosis" abarca la osteoporosis primaria y la osteoporosis secundaria. En ciertas modalidades, la osteoporosis es osteoporosis primaria . En ciertas modalidades, la osteoporosis es osteoporosis secundaria.
"Osteoporosis primaria" como se usa aquí, está asociada con la menopausia (natural , prematura o quirúrgica), el envejecimiento o ambos. Se debe comprender que en la presente invención, la osteoporosis primaria asociada con menopausia (natural, prematura o quirúrgica), la osteoporosis primaria asociada con envejecimiento y la osteoporosis primaria asociada con menopausia y envejecimiento pueden estar incluidas en las modalidades, individualmente o en cualquiera de sus combinaciones.
"Osteoporosis secundaria" como se usa aquí, se refiere a la osteoporosis que está asociada no con la menopausia ni el envejecimiento sino más bien con enfermedades o con el uso de medicamentos o fármacos. Un mayor riesgo de osteoporosis se asocia con un huésped de enfermedades, incluidas, pero no exclusivamente los trastornos endocrinos y metabólicos, y las neoplasias, y con el uso de ciertos medicamentos y fármacos, los ejemplos de los cuales son bien conocidos por los expertos en la materia (consulte, por ejemplo, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003). Prevention and Management of Osteoporosis; Williams Textbok of Endocrinology, 1 0" Edición ; cuya divulgación se incorpora aquí por referencia en su totalidad). La osteoporosis secundaria también puede estar asociada con inmovilización. Un diagnóstico de osteoporosis secundaria a una enfermedad , al uso de un medicamento o fármaco, o a inmovilización puede ser realizado por un proveedor de asistencia (por ejemplo, un médico, una enfermera o una enfermera de atención primaria en el caso de los seres humanos, un veterinario en el caso de los vertebrados no humanos).
Por "fractura ósea" se entiende una quebradura, ruptura o rajadura completa o incompleta de un hueso. El diagnóstico de las fracturas depende normalmente del examen cl ínico y los resultados radiológicos. En la invención , las fracturas óseas incluyen , pero no exclusivamente, fracturas traumáticas, fracturas de largo plazo y fracturas patológicas.
"Fractura traumática" como se usa aquí , se referirá a una fractura inmediata que implica un trauma supraliminal con un grado de violencia local que excede la elasticidad natural del hueso. Puede estar acompañada por una lesión simultánea en los tejidos blandos y muy a menudo en la piel . Una fractura traumática puede ser cerrada (el tejido blando adyacente puede estar lesionado pero las partes blandas que la cubren estar bien conservadas). Una fractura traumática puede ser abierta (los extremos quebrados del hueso quedan expuestos mediante una lesión extensa del tejido blando de modo que los patógenos del exterior pueden ingresar directamente en la herida) "Fractura de largo plazo" como se usa aqu í, se referirá a una fractura crónica, fractura por fatiga, fractura por estrés o fractura espontánea tipo I .
"Fractura patológica" como se usa aquí, se referirá a una fractura espontánea tipo I I . Una fractura patológica se produce espontáneamente, sin un trauma adecuado que la justifique. El hueso puede haber sido dañado previamente por una enfermedad sistémica (por ejemplo osteoporosis, osteodistrofia u osteítis deformante de Paget) o por una lesión ósea local (por ejemplo, metástasis, radioosteonecrosis o tumor óseo). Consulte, Adler, Claus-Peter, BON E DISEASES, p. 1 1 4 (Springer-Verlag , Alemania 2000).
Las fracturas también incluyen, pero no exclusivamente, fractura por torsión oblicua, fractura transversa, fractura conminuta, fractura por compresión , fracturas costales, fractura deformante y cuello femoral fracturado (Adler, Claus-Peter, BON E DISEASES , Springer, Verlag , Alemania (2000)).
Como se usa aquí, "afección ósea" se refiere a una afección que se beneficia del tratamiento de acuerdo con la invención , por aumento de la masa ósea o el crecimiento óseo o disminución de la pérdida de masa ósea, e incluye, pero no exclusivamente, una afección caracterizada por baja masa ósea, una fractura ósea , una enfermedad ósea, un aumento de la cicatrización ósea o el crecimiento óseo. Se debe comprender que en la presente invención , las afecciones óseas que pueden ser tratadas de acuerdo con la invención se pueden incluir en las modalidades, individualmente o en cualquiera de sus combinaciones.
Como se usa aqu í , la expresión "afección caracterizada por baja masa ósea" incluye, pero no exclusivamente, osteopenia, osteoporosis, artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad periodontal , pérdida ósea alveolar, osteotomía por pérdida ósea , pérdida ósea idiopática infantil , curvatura de la columna vertebral y pérdida de altura. En ciertas modalidades, la osteoporosis es osteoporosis primaria. En ciertas modalidades, la osteoporosis es osteoporosis secundaria. En ciertas modalidades, la osteoporosis secundaria se asocia con una enfermedad . En ciertas modalidades, la osteoporosis secundaria se asocia con el uso de un medicamento o fármaco. En ciertas modalidades, la osteoporosis secundaria se asocia con inmovilización. Las afecciones caracterizadas por baja masa ósea también incluyen , pero no exclusivamente, la enfermedad de Paget, la pérdida de masa ósea debida a cáncer metastático y las lesiones osteol íticas como las causadas por enfermedad neoplásica, radioterapia o quimioterapia. Las afecciones caracterizadas por baja masa ósea también incluyen, pero no exclusivamente, las complicaciones a largo plazo de la osteoporosis, como la curvatura de la columna vertebral, la pérdida de altura y la cirug ía protésica. Se debe comprender que en la presente invención , las afecciones caracterizadas por baja masa ósea se pueden incluir en las modalidades, individualmente o en cualquiera de sus combinaciones. (Consulte, por ejemplo, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis; Williams Textbook of Endocrinology, 10° Edición, Larsen et al , Eds. (2002), W.B . Saunders Company; and Endocrinology and Metabolism, 4° Edición, Felig et al , Eds. (2001 ), McGraw-Hill Book Company; cuyas divulgaciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad ).
Como se usa aquí, "enfermedad ósea" se refiere a un trastorno o afección relacionados con anomalías óseas. Las enfermedades óseas que pueden ser tratadas de acuerdo con la invención , mediante aumento de la masa ósea o del crecimiento óseo o disminución de la pérdida de masa ósea, incluyen , pero no exclusivamente, osteopenia, osteoporosis, artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad periodontal , pérdida ósea alveolar, osteotom ía por pérdida ósea, pérdida ósea idiopática infantil , curvatura de la columna vertebral y pérdida de altura, En ciertas modalidades, la osteoporosis es osteoporosis primaria . En ciertas modalidades, la osteoporosis es osteoporosis secundaria. En ciertas modalidades, la osteoporosis secundaria se asocia con enfermedades. En ciertas modalidades, la osteoporosis secundaria se asocia con el uso de un medicamento o fármaco. En ciertas modalidades, la osteoporosis secundaria se asocia con inmovilización. Las enfermedades óseas que pueden ser tratadas de acuerdo con la invención, por aumento de la masa ósea o el crecimiento óseo , incluyen , pero no exclusivamente, la enfermedad de Paget y la pérd ida ósea debida a cáncer metastásico. Los trastornos óseos destructivos q ue pueden ser tratados de acuerdo con la invención , por aumento de la masa ósea o el crecimiento óseo , incluyen , pero no exclusivamente, osteoporosis, osteoartritis y lesiones osteol íticas como las causadas por enfermedad neoplásica , radioterapia o quimioterapia . Se debe comprender que en la presente invención , las enfermedades óseas que pueden ser tratadas de acuerdo con la i nvención , por aumento de la masa ósea o el crecimiento óseo, se pueden incluir en las modalidades , individual mente o en cualquiera de sus combinaciones . (Consulte, por ejemplo , World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis; Williams Textbook of Endocrinology , 1 0° Edición, Larsen et al , Eds. (2002), W. B. Saunders Company; and Endocrinology and Metabolism , 4° Ed ición , Felig et al , Eds. (2001 ), McGraw-Hill Book Company; cuyas divulgaciones se incorporan aqu í por referencia en su totalidad ).
La presente invención también se refiere a las otras afecciones que se benefician del tratamiento de acuerdo con la invención , por aumento de la masa ósea o el crecimiento óseo o por disminución de la pérdida de masa ósea, que incluyen, pero no exclusivamente , el aumento de la cicatrización ósea luego de una reconstrucción facial , reconstrucción maxilar, reconstrucción mandibular, enfermedad periodontal o extracción dental , aumento de la extensión de huesos largos, aumento de la osteointegración protésica y aumento de la sinostosis ósea.
Como se usa aquí, "trastorno metabólico" se refiere a un trastorno relacionado con anomalías del metabolismo. Los trastornos metabolicos que pueden ser tratados de acuerdo con la invención incluyen, pero no exclusivamente, sobrepeso, obesidad, hiperfagia, diabetes (inclusive diabetes de tipo 1 y diabetes de tipo 2), diabetes tipo 2, intolerancia a la glucosa, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, dislipidemia, hipertensión y síndrome metabólico. Se debe comprender que en la presente invención, los trastornos metabolicos que pueden ser tratadas de acuerdo con la invención se pueden incluir en las modalidades, individualmente o en cualquiera de sus combinaciones.
El término "síndrome metabólico" según se define aquí, y de acuerdo con el Adult Treatment Panel III (ATP III; National Institutes of Health: Third Report of the National Cholesterol Education Program Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III), Executive Summary; Bethesda, Md., National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute, 2001 (NIH pub. No 01-3670), se produce cuando una persona cumple tres o más de los cinco criterios relacionados con obesidad, hipertrigliceridemia, bajo colesterol HDL, hipertensión arterial y glucosa elevada en ayunas.
El término "obesidad" como se usa aquí, se define como un índice de masa corporal (IMC) de 30,0 o superior, de acuerdo con las especificaciones de peso de la OMS [Kopelman, Nature (2000) 404:635-643; cuya divulgación se incorpora aquí por referencia en su totalidad].
"Intolerancia a la glucosa" (IG) como se usa aquí, tiene la intención de indicar esa afección asociada con resistencia a la insulina que es intermedia entre la diabetes tipo 2 franca y la tolerancia normal a la glucosa (TNG). La IG se diagnostica mediante un procedimiento en el que la respuesta a la glucosa postprandial de la persona afectada se determina que es anormal al evaluar los niveles de glucosa plasmática postprandial de 2 horas. En esa prueba, se administra una cantidad medida de glucosa al paciente y se miden los niveles de glucosa en sangre a intervalos regulares, generalmente cada media hora durante las primeras 2 horas y posteriormente cada 1 hora. En un individuo "normal" o que no es IG, los niveles de glucosa suben en las primeras dos horas hasta un nivel menor de 140 mg/dl y después caen rápidamente. En un individuo IG, los niveles sanguíneos de glucosa son superiores y el efecto de caída se produce a menor velocidad.
"Resistencia a la insulina" como se usa aquí, pretende abarcar el diagnóstico usual de resistencia a la insulina hecho por cualquiera de una serie de métodos, que incluyen pero no se restringen a: la prueba intravenosa de tolerancia a la glucosa o las mediciones del nivel de insulina en ayunas. Es bien sabido que existe una correlación excelente entre la altura del nivel de insulina en ayunas y el grado de resistencia a la insulina. Por consiguiente, se podrían usar los niveles elevados de insulina en ayunas como un marcador sustituto de la resistencia a la insulina, con el propósito de identificar individuos con tolerancia normal a la glucosa (TNG) que tienen resistencia a la insulina . Un diagnóstico de resistencia a la insulina también se puede hacer usando la prueba de glucosa de la pinza euglucémica .
"Dislipidemia" pretende abarcar trastornos que comprenden cualquiera de los siguientes: nivel elevado de ácidos grasos libres plasmáticos, nivel elevado de colesterol plasmático, nivel elevado de colesterol LDL, nivel reducido de colesterol HDL, relación elevada entre colesterol total y colesterol HDL, y nivel elevado de triglicéridos plasmáticos Como se usa aquí, "afección relacionada con angiogenesis" se refiere a una afección que se beneficia de una mayor angiogenesis. Las afecciones relacionadas con angiogenesis que pueden ser tratadas de acuerdo con la invención , por aumento de la angiogenesis, incluyen , pero no exclusivamente, arteriopatía periférica, cicatrización e isquemia. Se debe comprender que en la presente invención , las afecciones relacionadas con angiogenesis que pueden ser tratadas de acuerdo con la invención se pueden incluir en las modalidades, individualmente o en cualquiera de sus combinaciones.
Como se usa aqu í, "isquemia" se refiere a un estado de privación o insuficiencia de oxígeno en los tejidos.
Como se usa aquí, "afección isquémica" se refiere a una afección que se relaciona con isquemia. Las afecciones isquémicas que pueden ser tratadas de acuerdo con la invención , incluyen, pero no exclusivamente, isquemia cerebral , accidente cerebrovascular, cardiopatía isquémica, infarto de miocardio, lesión por isquemia-reperfusión , remodelación post infarto de miocardio, insuficiencia card íaca e insuficiencia card íaca congestiva. Se debe comprender que en la presente invención , las afecciones isquémicas que pueden ser tratadas de acuerdo con la invención se pueden incluir en las modalidades, individualmente o en cualquiera de sus combinaciones.
"Accidente cerebrovascular" es una enfermedad cardiovascular que afecta a los vasos sanguíneos que suministran sangre al cerebro y tiene la intención de incluir la trombosis cerebral , el tipo más común de accidente cerebrovascular La trombosis cerebral se produce cuando se forma un coágulo sanguíneo (trombo) y bloquea la circulación sanguínea en una arteria que lleva sangre a una parte del cerebro. Los coágulos sanguíneos generalmente se forman en las arterias dañadas por aterosclerosis.
Como se usa aquí, "cardiopatía isquémica" se refiere a un trastorno causado por falta de oxígeno en los tejidos del corazón, en el cual son afectados los músculos del corazón y el corazón no puede bombear adecuadamente. La cardiopatía isquémica es la cardiomiopatía más común en los Estados Unidos.
Como se usa aquí, "infarto de miocardio" se refiere al daño o la muerte de un área del músculo cardíaco debido a un suministro inadecuado de oxígeno en esa área. Los infartos de miocardio son causados a menudo por un coágulo sanguíneo que bloquea una de las arterias coronarias (los vasos sangu íneos que suministran oxígeno al músculo card íaco). El coágulo evita que la sangre y el oxígeno lleguen a esa área del corazón, produciendo la muerte de las células card íacas en esa área.
La pérdida de tejido miocárdico debida a un infarto de miocardio da como resultado una carga hemodinámica sostenida excesiva sobre el ventrículo. La hipertrofia ventricular constituye uno de los mecanismos principales mediante el cual el corazón compensa un aumento de la carga. Sin embargo , la capacidad de esta adaptación de mantener el rendimiento card íaco en la cara de la sobrecarga hemodinámica es finita, y cuando es mantenida de manera crónica, se torna inadaptada Gradualmente, el fenotipo de adaptación hipertrófica cambia a insuficiencia card íaca declarada a medida que los ventrículos agrandados se dilatan progresivamente y la función contráctil se debilita. La evolución natural de la respuesta adaptada e inadaptada al infarto de miocardio en el corazón se conoce como "remodelación post infarto de miocardio".
"Insuficiencia card íaca congestiva" se refiere a un trastorno en el cual el corazón pierde su capacidad para bombear sangre de manera eficaz. La insuficiencia cardíaca congestiva se torna más frecuente con el envejecimiento. La cardiopatía isquémica es la causa más común de insuficiencia card íaca congestiva representando 60-70% de todos los casos. Un aumento de la presión venosa superior a 1 2 mm de Hg es uno de los criterios principales de Framingham para insuficiencia cardíaca congestiva, puesto que es una reducción en el rendimiento card íaco equivalente a un tiempo de circulación superior a 25 segundos.
Como se usa aquí , "trastorno por mala absorción" se refiere a un trastorno relacionado con una anomal ía en la secreción y/o absorción en el epitelio intestinal . Los trastornos por mala absorción que pueden ser tratados de acuerdo con la invención incluyen , pero no exclusivamente, síndrome del intestino corto, enterocolitis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome del intestino irritable, cólera y un trastorno acompañado de diarrea. Como se usa aquí , el "trastorno acompañado de diarrea" no está particularmente limitado mientras que se trate de una enfermedad o un síntoma acompañado de diarrea, y no importa si es una enfermedad aguda o crónica. Los ejemplos de tal enfermedad o síntoma incluyen diarrea (causada por un parásito, una bacteria, un virus, estimulación física, dispepsia , trastorno mental , inflamación gastrointestinal o alergia, etc). , síndrome del intestino irritable, colitis ulcerosa y similares. Está expresamente contemplado que cada trastorno acompañado de diarrea es una modalidad separada comprendida por el campo de aplicación de la presente invención. Se debe comprender que en la presente invención, los trastornos por mala absorción que pueden ser tratados de acuerdo con la invención se pueden incluir en las modalidades, individualmente o en cualquiera de sus combinaciones.
Como se usa aquí, "trastorno convulsivo" se refiere a un trastorno de un individuo en el cual el sujeto sufre de convulsiones, por ejemplo, convulsiones debidas a una crisis epiléptica. Los trastornos convulsivos que pueden ser tratados de acuerdo con la invención incl uyen epilepsia y crisis convulsivas no epilépticas , por ejemplo convulsiones debidas a la ad ministración al ind ividuo de un agente convulsivante. Se debe comprender que en la presente invención , los trastornos convulsivos que pueden ser tratados de acuerdo con la invención se pueden incluir en las modalidades, i ndividual mente o en cualquiera de sus combinaciones .
Como se usa aqu í , "cáncer" se refiere a un neoplasma mal igno. Los tipos de cáncer que pueden ser tratados de acuerdo con la invención incluyen, pero no exclusivamente, cáncer pancreático , cáncer de mama , cáncer de colon y adenocarcinoma de Barrett. Se debe comprender que en la presente i nvención , los tipos de cáncer que pueden ser tratados de acuerdo con la invención se pueden incluir en las modalidades, individualmente o en cualquiera de sus combi naciones .
Como se usa aquí, "trastorno inflamatorio" se refiere a un trastorno relacionado con anomalías de inflamación . Los trastornos inflamatorios que pueden ser tratados de acuerdo con la invención i ncluyen , pero no exclusivamente , aterosclerosis, aterotrombosis, resistencia a la insulina, pancreatitis, reestenosis, una enfermedad pulmonar inflamatoria y una enfermedad intestinal inflamatoria . Se debe comprender que en la presente invención , los trastornos inflamatorios que pueden ser tratados de acuerdo con la invención se pueden incluir en las modalidades, individualmente o en cualquiera de sus combinaciones.
Como se usa aquí, "aterotrombosis" se refiere a la formación de trombos en un vaso ateroesclerótico.
Como se usa aquí, "trastorno pulmonar inflamatorio" se refiere a un trastorno relacionado con anomalías de inflamación en el pulmón . Las enfermedades pulmonares inflamatorias que se pueden tratar de acuerdo con la invención incluyen, pero no exclusivamente, asma, enfisema e hipertensión arterial pulmonar (HAP). La HAP es una enfermedad potencialmente mortal caracterizada por una vasculopatía pulmonar progresiva que produce hipertrofia ventricular derecha; y si no se trata, insuficiencia cardíaca derecha . Se debe comprender que HAP abarca las formas siguientes de hipertensión arterial pulmonar descritas en la clasificación clínica 2003 de la Organización M undial de la Salud (OMS) de hipertensión arterial pulmonar. HAP idiopática, HAP familiar, HAP asociada con otra afección y HAP asociada con afectación venosa o capilar significativa . Se debe comprender que en la presente invención, los trastornos pulmonares inflamatorios que pueden ser tratados de acuerdo con la invención se pueden incluir en las modalidades, individualmente o en cualquiera de sus combinaciones.
Como se usa aqu í, "trastorno intestinal inflamatorio" se refiere a una afección relacionada con anomalías de inflamación en el intestino. Las enfermedades intestinales inflamatorias que pueden ser tratadas de acuerdo con la invención incluyen, pero no exclusivamente, la enfermedad de Crohn como puede ser enteritis, enterocolitis, enfermedad de Crohn, colitis granulomatosa, ileítis o colitis de Crohn y colitis ulcerosa como puede ser la colitis ulcerosa , la sigmoiditis, la pancolitis y la proctitis ulcerosa . Se debe comprender que en la presente i nvención , los trastornos i ntestinales i nflamatorios que pueden ser tratados de acuerdo con la invención se pueden incluir en las modalidades, individualmente o en cualquiera de sus combi naciones.
El término "aterosclerosis" como se usa aqu í , se refiere a la forma de enfermedad vascular caracterizada por depósitos de placas ateromatosas que contienen colesterol y lípidos, en la capa más íntima de las paredes de las arterias de gran tamaño y tamaño mediano.
La "enfermedad de Alzheimer" es una enfermedad neurodegenerativa progresiva caracterizada por una pérdida importante de la función en más de un dominio cognitivo y a menudo acompañada por cambios en el comportamiento o la personalidad . La enfermedad de Alzheimer es la causa más común de demencia . Se cree que el péptido beta amiloide (?ß) tiene un papel fundamental en la patología de la enfermedad de Alzheimer.
La "deficiencia cognitiva leve" ( DCL) es un estado de deficiencia cognitiva, más a menudo sólo de memoria , q ue no es lo suficientemente grave para impactar significativamente en el funcionamiento ocupacional o social . Sin embargo, muchas personas con DCL evolucionan a la enfermedad de Alzheimer, a una tasa de 1 0- 1 5% por año y hasta 60% en 5 años. La evidencia creciente demuestra que la patolog ía de la enfermedad de Alzhei mer comienza mucho antes que el desarrollo de los síntomas suficientemente graves como para permitir un diagnóstico de los criterios de Alzheimer. En 2001 , la American Academy of Neurology (AAN) publicó parámetros de práctica cl ínica para la detección de la DCL que aumentarán la conciencia, el diagnóstico y el tratamiento tanto de la DCL como de las formas leves de la enfermedad de Alzheimer.
Como se usa aquí , "enfermedad priónica" tiene la intención de incluir, pero no exclusivamente, la encefalopatía espongiforme bovina, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, el kuru, el síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker y el insomnio familiar fatal (Collins et al . Lancet (2004) 363:51 -61 ).
Como se usa aqu í, "lesión excitóxica" se refiere al daño celular neuronal o muerte celular neuronal resultante de la hiperactividad paroxística inducida por una sustancia, por ejemplo, actividad paroxística inducida por glutamato.
La "enfermedad de Parkinson" es un trastorno neurodegenerativo, progresivo, crónico caracterizado por síntomas motores como temblor, bradicinesia, rigidez muscular, dificultad para la marcha e inestabilidad postural . Los investigadores han identificado la degeneración de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra como el principal mecanismo fisiopatologico de la enfermedad de Parkinson.
La "adiponectina" es una proteína plasmática segregada por adipocitos y compuesta de una región semejante al colágeno dispuesta N-terminalmente y una región globular C-terminal . Los niveles reducidos de adiponectina han sido asociados con una serie de trastornos metabólicos, incluidas aterosclerosis, coronariopatía , accidente cerebrovascular, resistencia a la insulina y diabetes tipo 2. Se ha informado que el nivel sérico de adiponectina para las mujeres es superior que para los hombres, por ejemplo 1 3,5 Mg/ml frente a 7 ,2 pg/ml en un estudio (Yamamoto et al, Clin Sci (London) (2002) 103: 137-142).
El término "endógeno" significará un material que un individuo (por ejemplo, y no exclusivamente, un ser humano) produce naturalmente. Por contraposición, "no endógeno" significará que no es naturalmente producido por un individuo (por ejemplo, y no exclusivamente, un ser humano).
La expresión "fragmento biológicamente activo" de un receptor acoplado a proteína G significará un fragmento del GPCR que tiene las funciones estructurales y bioquímicas de un GPCR de origen natural . En ciertas modalidades, el fragmento biológicamente activo se acopla a una proteína G . En ciertas modalidades, el fragmento biológicamente activo se une a un ligando conocido del G PCR.
El término "cebador" se usa para indicar una secuencia de nucleótidos específica que es complementaria de una secuencia de nucleótidos destinataria y que se usa para hibridarla a la secuencia de nucleótidos destinataria. Un cebador sirve como punto de iniciación para la polimerización de nucleótidos catalizada por la ADN polimerasa, la RNA polimerasa o la transcriptasa inversa.
La expresión "vector de expresión" significará una secuencia de ADN que es necesaria para la transcripción de ADN clonado y la traducción de ARNm transcrito en una célula huésped recombinante, apropiada para el vector de expresión . Un vector de expresión construido apropiadamente debe contener un origen de replicación para la replicación autónoma en células huésped, marcadores seleccionables, un número limitado de sitios para enzimas de restricción útiles, potencial para un gran número de copias y promotores activos. El ADN clonado que se va a transcribir está unido operativamente a un promotor, constitutiva o condicionalmente activo, dentro del vector de expresión.
La expresión "célula huésped" significará una célula capaz de tener un vector incorporado en ella. En el presente contexto, el vector contendrá típicamente ácido nucleico que codifica un GPCR o una proteína de fusión de GPCR en conexión operativa con una secuencia promotora adecuada para permitir la expresión del GPCR o que se produzca la proteína de fusión de GPCR. En una modalidad particular, la célula huésped es una célula huésped eucariota. En ciertas modalidades, la célula huésped eucariota es una célula huésped de un mamífero. En ciertas modalidades, la célula huésped eucariota es una célula huésped de una levadura. En ciertas modalidades, la célula huésped eucariota es una célula huésped melanófora.
La expresión "poner en contacto" o "poniendo en contacto" significará juntar al menos dos porciones.
Los términos "modular" o "modificar" deberá considerarse que se refieren a un aumento o disminución en la cantidad , la calidad o el efecto de una actividad , función o molécula particular, o, cuando se refieren a una afección, deberá considerarse que se refieren a un cambio en el estado de dicha afección. A título ilustrativo y no limitante, los agonistas, agonistas parciales, agonistas inversos y antagonistas de un receptor acoplado a proteína G son moduladores del receptor.
El término "molécula pequeña" se debe considerar que significa un compuesto que tiene un peso molecular menor de aproximadamente 1 0.000 g por mol, que incluye un péptido, un péptido mimético, un aminoácido, un análogo de un aminoácido, un polinucleótido, un análogo de un polinucleótido , un nucleótido, un análogo de un nucleótido, un compuesto orgánico o un compuesto inorgánico (es decir, que incluye un compuesto heterorgánico u organometálico), y sus sales, ésteres y otras formas farmacéuticamente aceptables. En ciertas modalidades, las moléculas pequeñas son compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 5.000 gramos por mol . En ciertas modalidades, las moléculas pequeñas son compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 1 .000 gramos por mol. En ciertas modalidades, las moléculas pequeñas son compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 800 gramos por mol . En ciertas modalidades, las moléculas pequeñas son compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 600 g ramos por mol . En ciertas modalidades, las moléculas pequeñas son compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 500 gramos por mol .
Las abreviaturas de los aminoácidos utilizados aqu í se exponen en la Tabla B : Tabla B FENILALANINA PHE F PROLINA PRO P SERINA SER S TREONINA THR T TRIPTOFANO TRP w TIROSINA TYR Y VALINA VAL V El término "polipéptido" se referirá a un polímero de aminoácidos, sin importar la longitud del polímero. Por lo tanto, péptidos, oligopéptidos y proteínas están incluidos en la definición de polipéptido. Este término tampoco especifica ni excluye las modificaciones de los polipéptidos post expresión. Por ejemplo, los polipéptido que incluyen la unión covalente de grupos grupo glucosilo, grupos acetilo, grupos fosfato, grupos lipidíeos y similares están expresamente comprendidos por el término polipéptido.
El término "polinucleótido" se referirá a una secuencia de ARN, ADN o un híbrido ARN/ADN de más de un nucleótido ya sea en la forma de cadena simple como de cadena doble. Los polinucleótidos de la invención se pueden preparar por cualquier método conocido, que incluye un método sintético, recombinante, generación ex vivo o una de sus combinaciones, así como utilizando cualquier método de purificación conocido en la técnica.
El término "anticuerpo" tiene la intención de abarcar los anticuerpos monoclonales y los anticuerpos policlonales.
La expresión "segundo mensajero" significará una respuesta intracelular producida como resultado de la activación de un receptor. Un segundo mensajero puede incluir, por ejemplo, 1 ,4, 5-trifosfato de inositol ( I P3), diacilglicerol (DAG ), AM P cíclico (AM Pc), GM P cíclico (G Pc), actividad MAP quinasa, actividad MAPK/ERK quinasa-quinasa-1 (M EKK1 ) y Ca2+. Se puede medir la respuesta de un segundo mensajero para determinar la activación del receptor.
La expresión "funcionalidad del receptor" se referirá a la operación normal de un receptor para recibir un estímulo y moderar un efecto en la célula, incluidos, pero no exclusivamente , regular la transcripción de los genes, regular el influjo o eflujo de iones , efectuar una reacción catalítica y/o modular la actividad a través de las proteínas G , por ejemplo provocar la respuesta de un segundo mensajero.
El término "estimular" o "estimulando" en relación con el término "respuesta" o la expresión "funcionalidad del receptor" significará que una respuesta o una funcionalidad del receptor aumenta o se evita en presencia de un compuesto , por oposición a la ausencia del compuesto.
El término "inhibir" o "inhibiendo" en relación con el término "respuesta" o la expresión "funcionalidad del receptor" significará que una respuesta o una funcionalidad del receptor aumenta o se evita en presencia de un compuesto, por oposición a la ausencia del compuesto .
La expresión "eficacia del compuesto" significará una medida de la capacidad de un compuesto para inhibir o estimular la fu ncionalidad del receptor, por oposición a la afinidad de unión al receptor.
La expresión "compuesto de prueba" util izada indisti ntamente con "compuesto candidato" significará una mol écula (por ejemplo, y no exclusivamente, un compuesto químico) que puede ser sometido a una técnica de detección .
La expresión "constitutivamente activo" en relación con un receptor acoplado a proteína G , significará q ue el receptor acoplado a proteína G presenta actividad independiente del agonista .
La expresión "identificar di rectamente" o "identificado di rectamente", en relación con la frase "compuesto de prueba" , significará la detección selectiva de un compuesto frente a un receptor acoplado a proteína G en ausencia de un ligando conocido (por ejemplo un agonista conocido) del receptor acoplado a proteína G .
Donde se provee un rango de valores , se sobreentiende que cada valor intercalado , hasta la décima del valor l ímite i nferior a menos que el contexto indique claramente algo diferente, entre el l ímite superior e inferior de ese rango y cualquier otro valor indicado o intercalado en el rango establecido, está comprendido por la invención . Los l ímites superior e i nferior de esos rangos más pequeños pueden estar incluidos independientemente en los rangos más pequeños, y también están comprendidos por la invención , sujetos a cualquier l ímite excluido específicamente en el rango establecido . Cuando el rango establecido incl uye uno o ambos de los l ímites, los rangos que excluyen uno o ambos de esos l ímites incluidos también están incluidos en la invención .
A. Introd ucción El orden de las secciones siguientes se establece para una mayor eficacia en la presentación y no pretende ni debe ser interpretado como una limitación de la divulgación o de las reivindicaciones siguientes.
B. Expresión del receptor 1. Polipéptidos GPCR de interés Un GPCR de la invención puede .comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) aminoácidos 1 -335 de SEQ. I D N°: 2; (b) aminoácidos 2-335 de SEQ . I D N°: 2; (c) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de (a) por sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos definida en (a); (d) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. I D N°: 1 ; (e) una variante de SEQ. I D N°: 2 cuando se selecciona del grupo que consiste en: (i) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. I D N°: 2; y (¡i ) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. I D N°: 2 ; (f) la secuencia de aminoácidos de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado a proteína G que tiene SEQ. ID N°: 2; y (g) un fragmento biológicamente activo de cualquiera de (a) a (f).
En ciertas modalidades, un GPCR de la invención comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. I D N°: 2 En algunas modalidades, un GPCR de la invención es un alelo de SEQ. I D N°: 2. En algunas modalidades, un GPCR de la invención es un ortólogo de SEQ. ID N°: 2.
En algunas modalidades, un GPCR de la invención es recombinante. En algunas modalidades, el GPCR recombinante es un GPR1 19 humano recombinante.
En ciertas modalidades, un GPCR que se puede usar en los métodos de la presente presenta un nivel detectable de actividad constitutiva.
En algunas modalidades, un GPCR de la invención es endógeno. En algunas modalidades, un GPCR de la invención es un GPR1 19 de un mamífero. En algunas modalidades, un G PCR de la invención que es endógeno es un GPR1 19 de un mam ífero.
A título ilustrativo y no limitante, se prevé que la deleción de un residuo de metionina N-terminal proporcione un fragmento biológicamente activo que se puede usar en la invención de la presente. En ciertas modalidades, un fragmento biológicamente activo de la invención es un fragmento opcionalmente fusionado en su extremo N-terminal a un péptido que comprende un residuo de metionina N-terminal y una etiqueta del epítopo HA (hemaglutinina del virus de la gripe) que se une específicamente al Compuesto 1 . En ciertas modalidades, un fragmento biológicamente activo de la invención es un fragmento opcionalmente fusionado en su extremo N-terminal a un péptido que comprende un residuo de metionina N-terminal y una etiqueta del epítopo HA (hemaglutinina del virus de la gripe) que se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-feníl)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4] oxadiazol-5-il)-piperidinin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. En ciertas modalidades, un fragmento biológicamente activo de la invención es un fragmento opcionalmente fusionado en su extremo N-terminal a un péptido que comprende un residuo de metionina N-terminal y una etiqueta del epítopo HA que se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}- amina con un valor de Cl50 en el ensayo de unión al receptor de acuerdo con el Ejemplo 1 5, infra, menor de aproximadamente 50 µ? , menor de aproximadamente 25 µ? , menor de aproximadamente 10 µ? , menor de aproximadamente 5 µ? , menor de aproximadamente 1 µ? , menor de aproximadamente 500 nM , menor de aproximadamente 1 00 nM o menor de aproximadamente 50 nM . En ciertas modalidades, un fragmento biológicamente activo de la invención es un fragmento opcionalmente fusionado en su extremo N-terminal a un péptido que comprende un residuo de metionina N-terminal y una etiqueta del epítopo HA que se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina con un valor de Cl50 en el ensayo de unión al receptor de acuerdo con el Ejemplo 15, infra, menor de aproximadamente 10 µ?, menor de aproximadamente 5 µ?, menor de aproximadamente 1 µ?, menor de aproximadamente 500 nM, menor de aproximadamente 100 nM o menor de aproximadamente 50 nM. En ciertas modalidades, un fragmento biológicamente activo de la invención es un fragmento opcionalmente fusionado en su extremo N-terminai a un péptido que comprende un residuo de metionina N-terminal y una etiqueta del epítopo HA para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un agonista que tiene un valor de CE50 en dicho fragmento opcionalmente fusionado en su extremo N-terminal a dicho péptido en el ensayo de adenililciclasa en célula entera de acuerdo con el Ejemplo 10 o en el ensayo de HTRF® de acuerdo con el Ejemplo 11, infra, menor de aproximadamente 5 µ?, menor de aproximadamente 1 µ?, menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, menor de aproximadamente 10 nM, menor de aproximadamente 5 nM o menor de aproximadamente 1 nM. En ciertas modalidades, un fragmento biológicamente activo de la invención es un fragmento opcionalmente fusionado en su extremo N-terminal a un péptido que comprende un residuo de metionina N-terminal y una etiqueta del epítopo HA para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un agonista que tiene un valor de CE50 en dicho fragmento opcionalmente fusionado en su extremo N-terminal a dicho péptido en el ensayo de adenililciclasa en célula entera de acuerdo con el Ejemplo 10 o en el ensayo de HTRF® de acuerdo con el Ejemplo 1 1 , infra, menor de aproximadamente menor de aproximadamente 100 nM , menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM , menor de aproximadamente 1 0 nM , menor de aproximadamente 5 nM o menor de aproximadamente 1 nM. En algunas modalidades, un fragmento biológicamente activo de la invención es un fragmento opcionalmente fusionado en su extremo N-terminal a un péptido que comprende un residuo de metionina N-terminal y una etiqueta del epítopo HA que presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AM Pc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento. En ciertas modalidades, el fragmento se fusiona en su extremo N-terminal a un péptido que consiste esencialmente en un residuo de metionina N- terminal y una etiqueta del epítopo HA. Las técnicas para fusionar un péptido que comprende o consiste esencialmente en un residuo de metionina N-terminal y una etiqueta del epítopo HA al extremo N- terminal de un fragmento de un polipéptido son bien conocidas en el área y se pueden obtener en el comercio (por ejemplo, de Clontech, ountain View, CA).
Se prevé que una variante alélica del GPR119 humano de SEQ. ID N°: 2 esté comprendida por el campo de aplicación de la invención. Se prevé que el GPR119 humano esté comprendido por el campo de aplicación de la invención.
Se prevé que una variante que es un ortólogo de un vertebrado del GPR119 humano de SEQ. ID N°: 2 esté comprendida por el campo de aplicación de la invención. Se prevé que una variante que es un ortólogo de un mamífero del GPR119 humano de SEQ. ID N°: 2 esté comprendida por el campo de aplicación de la invención. A modo ilustrativo y no limitante, se prevé que el GPR119 de ratón (por ejemplo, N° de registro GenBank® AY288423), GPR119 de rata (N° de registro GenBank® AAN95195), GPR119 de hámster, GPR119 de perro y GPR119 de primate no humano estén comprendidos por el campo de aplicación de la invención.
En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un GPCR.
Se prevé que una variante de SEQ. ID N°: 2 que tenga al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98% o al menos aproximadamente 99% de identidad con SEQ. ID N°: 2 esté comprendida por el campo de aplicación de la invención . En ciertas modalidades, la variante de SEQ . I D N°: 2 que tiene al menos aproximadamente 80% , al menos aproximadamente 85% , al menos aproximadamente 90% , al menos aproximadamente 95% , al menos aproximadamente 96% , al menos aproximadamente 97% , al menos aproximadamente 98% o al menos aproximadamente 99% de identidad con SEQ. I D N°: 2 es un GPCR. En algunas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 es un G PCR endógeno. En algunas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 es un GPCR no endógeno. En algunas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 que es un GPCR endógeno es un GPCR de un mamífero. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 se une específicamente al Compuesto 1 . En ciertas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6T[4-(3-isopropil-[ ,2,4]oxadiazol-5-il )-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil )-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il )-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina con un valor de CI 50 en el ensayo de unión al receptor de acuerdo con el Ejemplo 1 5, infra, menor de aproximadamente 50 µ?, menor de aproximadamente 25 µ? , menor de aproximadamente 10 µ? , menor de aproximadamente 5 µ? , menor de aproximadamente 1 µ , menor de aproximadamente 500 nM , menor de aproximadamente 100 nM o menor de aproximadamente 50 nM . En ciertas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil- fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina con un valor de Cl50 en el ensayo de unión al receptor de acuerdo con el Ejemplo 1 5, infra, menor de aproximadamente 1 0 µ? , menor de aproximadamente 5 µ?, menor de aproximadamente 1 µ? , menor de aproximadamente 500 nM , menor de aproximadamente 100 nM o menor de aproximadamente 50 nM . En ciertas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un agonista que tiene un valor de CE50 en dicho receptor en el ensayo de adenililciclasa en célula entera de acuerdo con el Ejemplo 10 o en el ensayo de HTRF® de acuerdo con el Ejemplo 1 1 , infra, menor de aproximadamente 5 µ?, menor de aproximadamente 1 µ? , menor de aproximadamente 100 nM , menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM , menor de aproximadamente 1 0 nM , menor de aproximadamente 5 nM o menor de aproximadamente 1 nM . En ciertas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4- metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)- piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un agonista que tiene un valor de CE50 en dicho receptor en el ensayo de adenililciclasa en célula entera de acuerdo con el Ejemplo 10 o en el ensayo de HTRF® de acuerdo con el Ejemplo 1 1 , infra, menor de aproximadamente 1 00 nM , menor de aproximadamente 50 nM , menor de aproximadamente 25 nM , menor de aproximadamente 10 nM , menor de aproximadamente 5 nM o menor de aproximadamente 1 nM. En algunas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento. El porcentaje de identidad se puede terminar convencionalmente usando programas informáticos conocidos.
En ciertas modalidades, una variante de GPCR que se puede utilizar en los métodos de la presente tiene una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, de al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98% o al menos aproximadamente 99% de identidad con SEQ. ID N°: 2. Con una variante de GPCR que tiene, por ejemplo, 95% "de identidad" con SEQ. ID N°: 2 se quiere dar a entender que la secuencia de aminoácidos de la variante es idéntica a los aminoácidos 1-335 de SEQ. ID N°: 2 excepto que puede incluir hasta 5 alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de SEQ. ID N°: 2. Por lo tanto, para tener por ejemplo una secuencia de aminoácidos con al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID N°: 2, hasta 5% (5 de 100) de los residuos de aminoácidos de la secuencia pueden ser insertados, suprimidos o sustituidos con otros aminoácidos, en comparación con los aminoácidos 1-335 de SEQ. ID N°: 2. Estas alternancias se pueden producir en los extremos amino o carboxi terminales o en cualquier otra parte entre esas posiciones termi nales, intercaladas entre los resid uos en la secuencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia .
En ciertas modalidades, una variante del receptor acopl ado a proteína G que puede ser utilizada en los métodos de la presente es un receptor acoplado a proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de S EQ . I D N°: 2 por deleción, sustitución y/o ad ición de uno o varios aminoácidos . En ciertas modalidades, una variante del receptor acoplado a proteina G que puede ser utilizada en los métodos de la presente es un receptor acoplado a proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de SEQ . I D N°: 2 en no más de 1 0 sustituciones de ami noácidos conservadoras y/o no más de 3 sustituciones de aminoácidos no conservadoras en la secuencia de aminoácidos de S EQ . I D N°: 2. En ciertas modalidades, arginina, Usina e histidina pueden sustituirse conservadoramente entre sí ; ácido glutámico y ácido aspártico pueden sustituirse conservadoramente entre sí; glutamina y asparragi na pueden sustituirse conservadoramente entre sí ; leucina, isoleucina y valina pueden sustituirse conservadoramente entre sí ; fenilalanina, triptofano y tirosina pueden sustituirse conservadoramente entre sí ; y glycina , alanina , serina , treonina y metionina pueden sustituirse conservadoramente entre sí . Las sustituciones de aminoácidos, las deleciones de aminoácidos y las ad iciones de aminoácidos pueden ser en cualquier posición (por ejenfplo, en el extremo C- o N-terminal , o en posiciones internas). En algunas modalidades, la variante es un receptor acoplado a proteína G endógeno. En algunas modalidades, la variante es un receptor acoplado a proteína G endógeno de un vertebrado. En algunas modalidades, la variante es un receptor acoplado a proteína G endógeno de un mamífero. En algunas modalidades, la variante es un receptor acoplado a proteína G endógeno humano. En algunas modalidades, la variante es un receptor acoplado a proteína G no endógeno. En algunas modalidades, la variante presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AM Pc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento. En ciertas modalidades, dicho receptor acoplado a proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de SEQ. ID N°: 2 es un receptor acoplado a proteína G para el cual el Compuesto 1 es un ligando. En ciertas modalidades, dicho receptor acoplado a proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de SEQ . I D N°: 2 es un receptor acoplado a proteína G para el cual (2-Fluoro-4- metanosulfonil-fenil )-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il )- piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un ligando que tiene un valor de Cl50 en el ensayo de unión al receptor de acuerdo con el Ejemplo 1 5, infra, menor de aproximadamente 50 µ? , menor de aproximadamente 25 µ? , menor de aproximadamente 10 µ? , menor de aproximadamente 5 µ? , menor de aproximadamente 1 µ?, menor de aproximadamente 500 nM, menor de aproximadamente 100 nM o menor de aproximadamente 50 nM. En ciertas modalidades, dicho receptor acoplado a proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de SEQ. ID N°: 2 es un receptor acoplado a proteína G para el cual el Compuesto 1 es un agonista. En ciertas modalidades, dicho receptor acoplado a proteína G que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de SEQ. ID N°: 2 es un receptor acoplado a proteína G para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un agonista que tiene un valor de CE50 en el ensayo de adenililciclasa en célula entera de acuerdo con el Ejemplo 10 o en el ensayo de HTRF® de acuerdo con el Ejemplo 11, infra, menor de aproximadamente 5 µ?, menor de aproximadamente 1 µ?, menor de aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, menor de aproximadamente 10 nM, menor de aproximadamente 5 nM o menor de aproximadamente 1 nM.
Se prevé que una variante de SEQ. ID N°: 2 que es un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 75 o al menos 100 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 esté comprendida por el campo de aplicación de la invención. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 que tiene al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 75 o al menos 100 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2 es un GPCR. En algunas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un GPCR endógeno. En algunas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un GPCR no endógeno. En algunas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 que es un GPCR endógeno es un GPCR de un mamífero. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 se une específicamente al Compuesto 1. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il>-amina con un valor de Cl50 en el ensayo de unión al receptor de acuerdo con el Ejemplo 15, infra, menor de aproximadamente 50 µ?, menor de aproximadamente 25 µ?, menor de aproximadamente 10 µ?, menor de aproximadamente 5 µ?, menor de aproximadamente 1 µ?, menor de aproximadamente 500 nM, menor de aproximadamente 100 nM o menor de aproximadamente 50 nM. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro- pirimidin-4-il}-amina con un valor de Cl50 en el ensayo de unión al receptor de acuerdo con el Ejemplo 15, infra, menor de aproximadamente 10 µ?, menor de aproximadamente 5 µ?, menor de aproximadamente 1 µ?, menor de aproximadamente 500 nM, menor de aproximadamente 100 nM o menor de aproximadamente 50 nM. En ciertas modalidades, la variante de SEQ. ID N°: 2 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un agonista que tiene un valor de CE50 en dicho receptor en el ensayo de adenililciclasa en célula entera de acuerdo con el Ejemplo 1 0 o en el ensayo de HTRF® de acuerdo con el Ejemplo 1 1 , infra, menor de aproximadamente 5 µ? , menor de aproximadamente 1 µ? , menor de aproximadamente 100 nM , menor de aproximadamente 50 nM , menor de aproximadamente 25 nM , menor de aproximadamente 10 nM , menor de aproximadamente 5 nM o menor de aproximadamente 1 nM . En ciertas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un agonista que tiene un valor de CE50 en dicho receptor en el ensayo de adenililciclasa en célula entera de acuerdo con el Ejemplo 10 o en el ensayo de HTRF® de acuerdo con el Ejemplo 1 1 , infra, menor de aproximadamente 100 nM , menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM , menor de aproximadamente 1 0 nM , menor de aproximadamente 5 nM o menor de aproximadamente 1 nM . En algunas modalidades, la variante de SEQ. I D N°: 2 presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento. En algunas modalidades, el receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 75 o al menos 100 aminoácidos contiguos de SEQ. I D N°: 2 presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AM Pc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento.
En algunas modalidades, una variante de GPCR que puede ser utilizada en los métodos de la presente es un GPCR codificado por un polinucleotido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 . En algunas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleotido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. I D N°: 1 es un GPCR endógeno. En algunas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleotido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 es un GPCR no endógeno. En algunas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleotido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. I D N°: 1 y que es un GPCR endógeno es un GPCR endógeno de un mamífero. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ . ID N°: 1 es SEQ. I D N°: 2 o uno de sus alelos. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 es un alelo de SEQ. I D N°: 2. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. I D N°: 1 es un ortólogo de SEQ. I D N°: 2. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. I D N°: se une específicamente al Compuesto 1 . En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina. En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ . I D N°: 1 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[ ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pir'imidin-4-il}-amina con un valor de Cl50 en el ensayo de unión al receptor de acuerdo con el Ejemplo 1 5, infra, menor de aproximadamente 50 µ? , menor de aproximadamente 25 µ? , menor de aproximadamente 10 µ? , menor de aproximadamente 5 µ? , menor de aproximadamente 1 µ?, menor de aproximadamente 500 nM , menor de aproximadamente 100 nM o menor de aproximadamente 50 nM . En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ . ID N°: 1 se une específicamente a (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -¡l]-5-nitro-pirimidin-4-il}- amina con un valor de Cl50 en el ensayo de unión al receptor de acuerdo con el Ejemplo 1 5, infra, menor de aproximadamente 10 µ? , menor de aproximadamente 5 µ? , menor de aproximadamente 1 µ?, menor de aproximadamente 500 nM , menor de aproximadamente 1 00 nM o menor de aproximadamente 50 nM . En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. I D N°: 1 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un agonista que tiene un valor de CE50 en dicho receptor en el ensayo de adenililciclasa en célula entera de acuerdo con el Ejemplo 10 o en el ensayo de HTRF® de acuerdo con el Ejemplo 1 1 , infra, menor de aproximadamente 5 µ?, menor de aproximadamente 1 µ? , menor de aproximadamente 100 nM , menor de aproximadamente 50 nM , menor de aproximadamente 25 nM , menor de aproximadamente 10 nM , menor de aproximadamente 5 nM o menor de aproximadamente 1 nM . En ciertas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 es un receptor para el cual (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)- piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un agonista que tiene un valor de CE50 en dicho receptor en el ensayo de adenililciclasa en célula entera de acuerdo con el Ejemplo 10 o en el ensayo de HTRF® de acuerdo con el Ejemplo 1 1 , infra, menor de aproximadamente 100 nM , menor de aproximadamente 50 nM , menor de aproximadamente 25 nM, menor de aproximadamente 10 nM , menor de aproximadamente 5 nM o menor de aproximadamente 1 nM. En algunas modalidades, el GPCR codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. ID N°: 1 presenta un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento.
Las técnicas de hibridación son bien conocidas por los técnicos con experiencia. En algunas modalidades, las condiciones de hibridación rigurosas incluyen la incubación durante toda la noche a 42°C en una solución que contiene formamida al 50%, 5 x SSC (1 x SSC = NaCI 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 20 pg/ml, seguido de lavado del filtro en 0,1 x SSC aproximadamente a 65 °C. En algunas modalidades, las condiciones de hibridación rigurosas incluyen la incubación durante toda la noche a 42°C en una solución que contiene formamida al 50%, 5 x SSC (1 x SSC = NaCI 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esperma de salmón desnaturalizado 20 pg/ml, seguido de lavado en 0,1 x SSC/SDS al 0,1% (dodecilsulfato de sodio) o en 2 x SSC/DSS al 0,1% a aproximadamente 50 °C, a aproximadamente 55 °C, a aproximadamente 60 °C o a aproximadamente 65 °C. En algunas modalidades, dichas condiciones rigurosas comprenden el lavado a 65 °C con 0 , 1 x SSC. En algunas modalidades , dichas condiciones rigurosas comprenden el lavado a aproximadamente 50 °C, a aproximadamente 55 °C , a aproximadamente 60 °C o a aproximadamente 65 °C con 0 , 1 x SSC/DSS al 0, 1 % o con 0, 2 x SSC/DSS al 0 , 1 % .
En algunas modalidades, un GPCR que puede ser utilizado en los métodos de la presente es un receptor no-endógeno , activado constitutivamente que com prende la secuencia de am i noácidos SEQ. I D N°: 2 , donde la leucina en la posición del ami noácido 224 d e SEQ . I D N°: 2 es sustituido por un aminoácido diferente de leucina. En algunas modalidades, el aminoácido diferente de leucina es lisina. En algunas modalidades , el aminoácido diferente de leucina es alanina. En algunas modalidades, el aminoácido diferente de leucina es arginina. En algunas modalidades, el aminoácido diferente de leucina es histidina. En algunas modalidades , la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AM Pc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento.
En ciertas modalidades, un G PCR de la invención comprende una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado a proteína G que tiene SEQ. I D N°: 2. En algunas modalidades, la versión constitutivamente activa del receptor es una versión constitutivamente activa endógena que tiene SEQ . I D N°: 2. En algunas modalidades, la versión constitutivamente activa del receptor es una versión constitutivamente activa no endógena que tiene una mutación ubicada en la posición del aminoácido 224 de SEQ . I D N°: 2. En algunas modalidades, el residuo mutado fue mutado a un residuo diferente de leucina. En algunas modalidades, el residuo mutado fue mutado a un residuo de lisina. En algunas modalidades, el residuo mutado fue mutado a un residuo de alanina. En algunas modalidades, el residuo mutado fue mutado a un residuo de arginina. En algunas modalidades, el residuo mutado fue mutado a un residuo de histidina. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas modalidades, la actividad constitutiva es para hacer que las células melanóforas sufran dispersión del pigmento.
En ciertas modalidades, un GPCR de la invención forma parte de una proteína de fusión con una proteína G . a. Identidad de la secuencia En ciertas modalidades, el porcentaje de identidad se evalúa usando la herramienta Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST"), que es bien conocida en el área [Consulte, por ejemplo, Karlin y Altschul , Proc Nati Acad Sci USA ( 1990) 87:2.264-2.268; Altschul et al ., J Mol Biol (1990) 21 5:403-41 0; Altschul et all , Nature Genetics ( 1 993) 3:266-272; y Altschul et al. , Nucleic Acids Res (1997) 25:3.389-3.402; cuyas divulgaciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad]. Los programas BLAST se pueden usar con los parámetros por defecto o con parámetros modificados provistos por el usuario. Preferentemente, los parámetros son los parámetros por defecto.
En ciertas modalidades , un método preferido para determinar la correspondencia total entre una secuencia preg unta (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de S EQ . I D N°: 2) y una secuencia que va a ser interrogada , también denomi nada alineación global de secuencias , puede ser determinada usando el programa i nformático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al . (Comp App Biosci ( 1 990) 6:237-245 ; cuya divulgación se incorporan aquí por referencia en su total idad ). En una alineación de secuencias la secuencia pregunta y la secuencia interrogada ambas son secuencia de aminoácidos. Los resultados de dicha alineación global de secuencias se expresan en porcentaje de identidad . Los parámetros preferidos utilizados en una alineación de aminoácidos FASTDB son : Matriz = PAM 0, k-tuplo =2 , Pena por no emparejamiento = 1 , Pena coincidencia =20 , Grupo de aleatorización =25 , Longitud =0 , Puntaje de corte = 1 , Tamaño de la ventana = longitud de la secuencia, Pena por espaciado =5, Pena por tamaño del espaciado =0 ,05 , Tamaño de la ventana =247 o la longitud de la secuencia de aminoácidos interrogada , cualquiera sea la más corta .
Si la secuencia interrogada es más corta que la secuencia pregunta debido a deleciones en los extremos N- o C-terminales, no debido a deleciones internas , los resultados, en porcentaje de identidad , deben ser corregidos manualmente porque el programa FASTDB no tiene en cuenta los truncamientos N- y C-terminales de la secuencia interrogada cuando calcula el porcentaje de identidad global . Para las secuencias interrogadas truncadas en los extremos N- y C-terminales , con relación a la secuencia pregunta , el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de residuos de la secuencia pregunta que son N- y C-terminales de la secuencia i nterrogada , que no son coi ncidentes/no se alinean con un residuo de la secuencia interrogada correspond iente, como un porcentaje de los bases totales de la secuencia pregunta. Si un resid uo coincide/se ali nea es determinado por los resultados de la al i neación de secuencias FASTDB . Este porcentaje se resta después del porcentaje de identidad , calculado por el programa FASTDB mencionado antes , usando los parámetros especificados, para llegar a un puntaje final de porcentaje de identidad . Este puntaje final de porcentaje de identidad es el que se usa a los efectos de la presente i nvención . Sólo los residuos N- y C-terminales de la secuencia i nterrogada, que no coinciden/se alineen con la secuencia pregunta , son tomados en cuenta a los efectos de ajustar manualmente el puntaje de porcentaje de identidad . Esto es, sólo los residuos de aminoácidos pregunta que están fuera de los residuos N y C-terminales más alejados de la secuencia interrogada .
Por ejemplo, una secuencia interrogada de 90 residuos de ami noácidos se alinea con una secuencia pregunta de 1 00 residuos para determinar el porcentaje de identidad . La deleción se produce en el extremo N-terminal de la secuencia interrogada y por lo tanto, la alineación con FASTDB no coincide/se alinea con los pri meros residuos en el extremo N-terminal . Los 10 residuos no emparejados representan 1 0% de la secuencia (número de resid uos en los extremos N- y C- terminales no coincidentes/número total de residuos en la secuencia pregunta) por lo tanto se resta 1 0% del puntaje de porcentaje de identidad calculado por el programa FASTDB . Si los restantes 90 residuos fueran perfectamente coincidentes , el porcentaje de identidad final sería de 90% .
En otro ejemplo, u na secuencia i nterrogada de 90 residuos se compara con una secuencia pregunta de 1 00 resid uos. E sta vez las deleciones son internas de modo que no hay resid uos en los extremos N y C-terminales de la secuencia interrogada , que no coincidan/se alineen con la pregunta . En este caso, el porcentaje de identidad calculado con FASTDB no se corrige manualmente. N uevamente, sólo las posiciones de residuos fuera de los extremos N y C-terminales de la secuencia objeto , según se exhiben en la al ineación por FASTDB , que no son coincidentes/se alinean con la secuencia pregunta se corrigen manualmente. No se hace ninguna otra corrección a los efectos de la presente invención. b. Proteínas de fusión En ciertas modalidades , un polipéptido de interés es una proteína de fusión , y puede contener, por ejemplo , un dominio de etiqueta de afinidad o un dominio reportero. Las etiquetas de afinidad adecuadas incluyen cualquier secuencia de aminoácidos que pueda uni rse específicamente a otra porción , general mente otro polipéptido, más generalmente un anticuerpo. Las etiquetas de afinidad adecuadas incluyen etiquetas de ep ítopos, por ejemplo , la etiqueta V5 , la etiqueta FLAG , la etiqueta HA (hemaglutinina del virus de la gripe), la etiqueta myc y similares, como se conoce en el área. Las etiquetas de afinidad adecuadas también incluyen dominios para los cuales, los sustratos de unión son conocidos, por ejemplo, las etiquetas H I S, GST y MB P , como se conoce en el área, y dominios de otras proteínas para las que se dispone de compañeros de unión específicos, por ejemplo, anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales. Las etiquetas de afinidad adecuadas también incluyen cualquier dominio de interacción proteína-proteína, como una región IgG Fe, que puede unirse específicamente y detectarse usando un compañero de unión adecuado, por ejemplo, el receptor de IgG Fe. Se contempla expresamente que una proteína de fusión como esa tenga un dominio heterólogo N-termi nal (un ejemplo, un etiqueta de epítopo) fusionado en fase con un GPCR cuyo residuo de metionina N-terminal haya sido suprimido o sustituido con un aminoácido alternativo.
Los dominios reporteros adecuados incluyen cualquier dominio que puede indicar la presencia de un polipéptido. Si bien se reconoce que se puede utilizar una etiqueta de afinidad para indicar la presencia de un polipéptido usando, por ejemplo, un anticuerpo marcado que se una específicamente a la etiqueta , con mayor frecuencia se usan los dominios reporteros que emiten luz. Los dominios reporteros que emiten luz adecuados incluyen lucíferasa (por ejemplo, de luciérnaga, Vargulla, Renilla reniformes o Renilla muelleri), o sus variantes que emiten luz. Otros dominios reporteros adecuados incluyen proteínas fluorescentes, (por ejemplo , de aguavivas, corales y otros celenterados como de las especies Aequoria, Renilla, Ptilosarcus y Stylatula) o sus variantes que emiten luz. Las variantes que emiten luz de esas proteínas reporteras son bien conocidas en el área y pueden ser más brillantes, más atenuadas o tener diferente espectro de excitación y/o emisión, en comparación con una proteína reportera nativa. Por ejemplo, algunas variantes son alteradas de modo que no aparezcan más de color verde, y pueden aparecer de color azul, azul verdoso, amarillo , amarillo rojizo potenciado (denominadas BFP, CFP, YFP e YFP y RFP, respectivamente) o tener otro espectro de emisión , como se sabe en el área. Otros dominios reporteros adecuados incluyen dominios que pueden indicar la presencia de un polipéptido a través de un cambio bioquímico o de color, como ß-galactosidasa, ß-glucuronidasa, cloranfenicol acetiltransferasa y fosfatasa alcalina embrionaria segregada.
Como también se sabe en la técnica, también pueden estar presentes etiquetas de afinidad o un dominio reportero en cualquier posición en un polipéptido de interés. Sin embargo, en la mayoría de las modalidades, están presentes en el extremo C- o N-terminal de un polipéptido de interés. 2. Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos GPCR de interés Puesto que el código genético y las técnicas de recombinación para manipular ácidos nucleicos son conocidos por los expertos y la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos GPCR de interés son como las descritas precedentemente, el diseño y la producción de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido GPCR de interés forman parte de los conocimientos prácticos de un técnico con experiencia. En ciertas modalidades, se usan métodos estándar de tecnología de recombinación de ADN (Ausubel , et al , Short Protocoís in Molecular Biology, 3a ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook, et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, ( 1989) Cold Spring Harbor, N .Y).. Por ejemplo, las secuencias de codificación de GPCR se pueden aislar de una genoteca de secuencias de codificación de GPCR usando cualquier combinación de una diversidad de métodos de recombinación que no necesitan ser descritos aquí. Las sustituciones, deleciones y/o adiciones subsiguientes de nucleótidos en la secuencia de ácidos nucleicos que codifican una proteína, también se pueden llevar a cabo mediante técnicas estándar de recombinación de ADN .
Por ejemplo, se pueden usar mutagénesis dirigida al sitio y subclonación para introducir/suprimir/sustituir residuos de ácidos nucleicos en un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés. En otras modalidades, se puede usar PCR. Los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de interés también se pueden preparar por síntesis química exclusivamente a partir de oligonucleotidos (por ejemplo, Cello et al . , Science (2002) 297: 1016-8).
En algunas modalidades, los codones de los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de interés son optimizados para la expresión en células de una especie en particular, particularmente especies de mam íferos, por ejemplo ratones, ratas, hámsters, primates no humanos o seres humanos. En algunas modalidades, los codones de los ácidos nucleico que codifican polipéptidos de interés son optimizados para la expresión en células de una especie en particular, particularmente una especie de anfibios. a. Vectores La invención estipula además vectores (también denominados "constructos") que comprenden un ácido nucleico de la presente. En muchas modalidades de la invención, las secuencias de ácidos nucleicos de la presente se expresarán en un huésped después de que las secuencias se hayan unido operablemente a una secuencia de expresión de control, incluido, por ejemplo, un promotor. Los ácidos nucleicos de la presente también están típicamente ubicados en un vector de expresión que se puede replicar en una célula huésped como un plásmido o como una parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección , por ejemplo , tetraciclina o neomicina, para permitir la detección de esas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (consulte, por ejemplo, U.S. Pat. N° 4,704,362 , que se incorpora aquí por referencia). Los vectores, incluidos los vectores casetes simples y duales de expresión son bien conocidos en la técnica (Ausubel , et al , Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed. , Wiley & Sons, 1995; Sambrook, et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, ( 1 989) Cold Spring Harbor, N .Y).. Los vectores adecuados incluyen vectores virales, plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales (cromosomas artificiales humanos, cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de una levaduras, etc)., mini cromosomas y similares. Se pueden usar vectores retrovirales, adenovirales y adeno asociados.
Los técnicos en la materia disponen de una diversidad de vectores de expresión con el propósito de producir un polipéptido de interés en una célula e incluye vectores de expresión que se pueden adquirir comercialmente (por ejemplo a Invitrogen, Carlsbad, CA; Clontech, Mountain View, CA; Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores de expresión que se pueden adquirir comercialmente incluyen, a modo de ejemplo no limitante, vectores basados en el promotor CMV. Un vector de expresión adecuado es pCMV. El vector de expresión puede ser adenoviral. Un ejemplo de vector adenoviral se puede comprar como AdEasyTM a Qbiogene (Carlsbad, CA) (He TC et al, Proc Nati Acad Sci USA (1998) 95:2.509-2.514; y US Patent N° 5,922,576; cuya divulgación se incorpora aquí por referencia en su totalidad). Otros vectores de expresión adecuados serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia.
Los ácidos nucleicos de la presente comprenden generalmente un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de interés de la presente, sin embargo, en ciertas modalidades, puesto que la célula huésped para la expresión del polipéptido de interés puede ser una célula eucariota, por ejemplo, una célula de un mamífero, como una célula de un ser humano, el marco de lectura abierto puede estar interrumpido por intrones. Los ácidos nucleicos de la presente son típicamente partes de una unidad transcripcional que puede contener, además del ácido nucleico de la presente, regiones sin traducir (UTR) 3' y 5' que pueden dirigir la estabilidad del ARN, la eficacia de la traducción, etc. El ácido nucleico de la presente también puede ser parte de un cásete de expresión que contiene, además del ácido nucleico de la presente un promotor, que dirige la transcripción y expresión de un polipéptido de interés, y un terminador de la transcripción.
Los promotores eucariotas pueden ser cualquier promotor que sea funcional en una célula huésped eucariota, incluidos los promotores virales y los promotores derivados de genes eucariotas. Los ejemplos de promotores eucariota incluyen, pero no exclusivamente, los siguientes: el promotor de la secuencia génica de la metalotioneína I de ratón (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288, 1982); el promotor de TK del Herpes virus (McKnight, Cell 31:355-365, 1982); el promotor precoz de SV40 (Benoist et al., Nature (Londres) 290:304-310, 1981); el promotor gall de la secuencia génica de una levadura (Johnston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 79:6.971-6.975, 1982); Silver et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 81.5951-59SS, 1984), el promotor de CMV, el promotor de EF- 1, los promotores que responden a Ecdisona, el promotor que responde a tetraciclina y similares. Los promotores virales pueden ser de particular interés puesto que generalmente son promotores particularmente fuertes. En ciertas modalidades, se usa un promotor que es un promotor del patógeno destinatario. Los promotores para usar en la presente invención se seleccionan de modo que sean funcionales en el ti po de célula (y/o animal ) en el cual van a ser introducidos. En ciertas modalidades, el promotor es un promotor de CMV.
En ciertas modalidades, un vector de la presente también pued e disponer la expresión de un marcador seleccionable. Los vectores y los marcadores seleccionables adecuados son bien conocidos en la técnica y se tratan en Ausubel , et al , (Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed . , Wiley & Son s , 1 995) y Sambrook, et al . , (Molecular Cloning : A Laboratory Manual , Tercera Edición , (2001 ) Cold Spring Harbor, N .Y).. Varios genes diferentes han sido empleados como marcadores seleccionables, y el gen particular empleado en los vectores de la presente como un marcador seleccionable se elige principalmente por conveniencia. Lo genes marcadores seleccionables conocidos incluyen : el gen de la timidina quinasa , el gen de la dihid rofolato red uctasa , el gen de la xantina-guanina fosforribosil transferasa, CAD, el gen de la adenosina desaminasa , el gen de la asparragina si ntasa , los genes de resistencia a los antibióticos, pore j . , tetr, ampr, Cmr o cat, kanr o neor (genes de aminoglucósido fosfotransferasa ), el gen de la higromicina B fosfotransferasa y similares.
Como se mencionó precedentemente, los poli péptido de interés pueden ser proteínas de fusión que contienen un dominio de afinidad y/o un dominio reportero. Los métodos para preparar fusiones entre un reportero o una etiqueta y un GPCR, por ejemplo, en el extremo C- o N-terminal del GPCR, forman parte de los conocimientos prácticos de los expertos en la materia (e.g. McLean et al, Mol. Pharma. Mol Pharmacol. 1999 56:1.182-91; Ramsay et al., Br. J. Pharmacology, 2001, 315-323) y no se describirán más detalladamente. Se contempla expresamente que una proteína de fusión como esa puede contener un dominio heteróiogo N-terminal (un ejemplo, un etiqueta de epítopo) fusionado en fase con un GPCR cuyo residuo de metionina N-terminal haya sido suprimido o sustituido con un aminoácido alternativo. Se aprecia que un polipéptido de interés se puede preparar primero a partir de un polipéptido nativo y después unirlo operablemente a un reportero/etiqueta adecuados como se describió antes.
Los ácidos nucleicos de la presente también pueden contener sitios de restricción, sitios de clonación múltiple, sitios de unión al cebador, extremos unibles, sitios de recombinación, etc., generalmente para facilitar la construcción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés. b. Células huésped La invención estipula además células huésped que comprenden un vector que contiene un ácido nucleico de la presente. Las células huésped adecuadas incluyen células procariotas, por ejemplo, células bacterianas (por ejemplo E. coli), así como células eucariotas, por ejemplo, una célula animal (por ejemplo una célula de un insecto, mamífero, pez, anfibio, ave o reptil), una célula de una planta (por ejemplo una célula de maíz o de Arabidopsis), una célula fúngica (por ejemplo las células de S. cerevisiae). En ciertas modalidades, cualquier célula adecuada para la expresión de un polipéptido de interés que codifique un ácido nucleico se puede usar como célula huésped. Generalmente, se usa una línea celular huésped animal, ejemplos de las cuales son las siguientes: células de riñon de mono (células COS), células CVI DE riñon de mono transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 165 1); células embrionarias de riñon humano (HEK-293 ["293"], Graham et al. J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células HEK-293T ["293T"]; células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 77:4.216, (1980); células de hámster dorado o sirio MCB3901 (ATCC CRL-9595); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CVI ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL- 1587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (hep G2, HB 8065); tumor mamrio de ratón (MMT 060562, ATCC CCL 51); células TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci 383:44-68 (1982)); células NIH/3T3 (ATCC CRL-1658); y células L de ratón (ATCC CCL- 1).
En ciertas modalidades, se usan melanóforos. Los melanóforos son células de la piel de los vertebrados inferiores. Los materiales y métodos pertinentes se seguirán de acuerdo con la divulgación de U .S . Patent N° 5,462,856 y U .S. Patent N° 6,051 ,386. Estas divulgaciones de patentes se incorporan aqu í por referencia en su totalidad .
Otras líneas celulares serán evidentes para expertos en la materia, y una amplia variedad de l íneas celulares se pueden obtener de American Type Culture Collection , 1 0801 University Boulevard , Manassas, VA. 201 1 0-2209.
C. Selección de los compuestos candidatos 1. Técnicas del ensayo genérico de detección selectiva de GPCR Cuando un receptor de proteína G se torna activo, se une a una proteina G (por ejemplo. , Gq , Gs, Gi , Gz, Go) y esti mula l a unión de GTP a la proteína G. Después la proteína G actúa como una GTPasa e hidroliza lentamente el GTP a GDP , por lo cual el receptor, en condiciones normales, se desactiva. Sin embargo, los receptores activados continúan cambiando GDP a GTP. Se puede usar un análogo no hidrolizable de GTP, [35S]GTPyS, para controlar el aumento de la unión a las membranas que expresan receptores activados. Se informa que ese [35S]GTPyS se puede usar para controlar el acoplamiento de la proteína G a las membranas, en ausencia y presencia de ligando. Un ejemplo de este control, entre otros ejemplos bien conocidos y disponibles para los técnicos en la materia, fue informado por Traynor y Nahorski en 1 995. Un uso preferido de este sistema de ensayo es la detección selectiva inicial de los compuestos candidatos porque el sistema es genéricamente aplicable a todos los receptores acoplados a proteínas G independientemente de la proteína G particular que interactúa con el dominio intracelular del receptor. 2. Técnicas del ensayo específico de detección selectiva de G PCR Una vez que se han identificado los compuestos candidatos usando el ensayo "genérico" del receptor acoplado a proteína G (es decir, un ensayo para seleccionar compuestos que son agonistas o agonistas inversos), en algunas modalidades se prefiere llevar a cabo otra detección para confirmar que los compuestos interactuaron en el sitio del receptor. Por ejemplo, un compuesto identificado por el ensayo "genérico" puede no unirse al receptor, pero puede en cambio simplemente "desacoplar" la proteína G del dominio intracelular. a. Gs. Gz v Gi.
Gs estimula la enzima adenililciclasa. Gi (y Gz y Go), por otra parte, inhiben la adenililciclasa. La adenililciclasa cataliza la conversión de ATP a AMPc; por consiguiente, los GPCR activados que se acoplan a la proteína Gs se asocian con un aumento de los niveles de AMPc intracelular. Por otra parte, los GPCR activados que se acoplan a la proteína Gi (o Gz, Go) se asocian con una disminución de los niveles celulares de AM Pc. Consulte, generalmente, "Indirect Mechanisms of Synaptic Transmisasion," Cap. 8, From Neuron To Brain (3* Ed). Nichols, J .G . et al eds. Sinauer Associates, I nc. ( 1992). Por consiguiente, se pueden utilizar los ensayos que detectan AMPc para determinar si un compuesto candidato es, por ejemplo , un agonista inverso del receptor (es decir, un compuesto tal que disminuiría los niveles de AMPc). Se pueden utilizar diversos métodos conocidos en la técnica para medir el AM Pc; en algunas modalidades se prefiere un método que se basa en el uso de anticuerpos anti-AM Pc en un formato basado en EL ISA. Otro tipo de ensayo que se puede utilizar es un sistema reportero de segundo mensajero en célula entera. Los promotores de los genes conducen la expresión de las proteínas que codifica un gen particular. El AM P cíclico impulsa la expresión génica al promover la unión de una proteína de unión a ADN que responde a AM Pc o factor de transcripción (CREB) que después se une al promotor en sitios específicos denominados elementos de respuesta de AM Pc e impulsa la expresión génica. Se pueden construir sistemas reporteros que tienen un promotor que contiene múltiples elementos de respuesta de AMPc antes del gen reportero, por ejemplo, ß-galactosidasa o luciferasa. Por lo tanto, un receptor unido a Gs activado causa la acumulación de AMPc que después activa el gen y la expresión de la proteína reportera. La proteína reportera como ß-galactosidasa o luciferasa se puede detectar después usando ensayos bioquímicos estándar (Chen et al . 1995). b. Go v Gq .
Gq y Go se asocian con la activación de la enzima fosfolipasa C, la cual a su vez hidroliza al fosfolípido PI P2, liberando dos mensajeros intracelulares: diaciclglicerol (DAG) y 1 ,4,5-trifosfato de inositol (I P3). El aumento en la acumulación de I P3 se asocial con la activación de los receptores asociados con Gq y Go. Consulte, generalmente, "Indirect Mechanisms of Synaptic Transmisasion," Cáp. 8, From Neuron To Brain (3° Ed). Nichols, J .G . et al eds. Sinauer Associates, Inc. (1992). Se pueden utilizar los ensayos que detectan la acumulación de I P3 para determinar si un compuesto candidato es, por ejemplo, un agonista inverso de un receptor asociado a Gq o Go (es decir, un compuesto tal que disminuiría los niveles de I P3). Los receptores asociados a Gq también se pueden examinar usando un ensayo de AP1 reportero en el que la fosfolipasa C dependiente de Gq causa la activación de genes que contienen elementos de AP1 , de este modo los receptores asociados a Gq activados evidenciarán un aumento en la expresión de dichos genes, por lo cual los agonistas inversos de ellos evidenciarán una disminución en dicha expresión y los agonistas evidenciarán un aumento en dicha expresión . Se pueden adquirir en el comercio ensayos para dicha detección . 3. Proteína de fusión de GPCR El uso de un GPCR constitutivamente activo endógeno o un GPCR constitutivamente activado no endógeno, para usar en la detección selectiva de compuestos candidatos para la identificación directa de agonistas inversos o agonistas proporciona una interesante provocación de la detección en que, por definición, el receptor es activo incluso en ausencia de un ligando endógeno unido a él . Por consiguiente, para diferenciar entre, por ejemplo, el receptor no endógeno en presencia de un compuesto candidato y el receptor no endógeno en ausencia de ese compuesto, con el propósito de tal diferenciación para permitir la comprensión de cómo tales compuestos pueden ser un agonista i nverso o agonista o no tener efecto sobre un receptor de ese tipo , en algunas modalidades se prefiere la utilización de un método que pueda mejorar dicha diferenciación . En algunas modal idades, un método preferido es el uso de una proteína de fusión de GPCR .
Generalmente , una vez que se determina que un GPCR no endógeno ha sido activado constitutivamente usando las técnicas de ensayo expuestas antes (as í como otras conocidas por los expertos en la materia), es posible determinar la proteína G predominante que se acopla con el G PCR endógeno . Acoplar la proteína G al GPCR proporciona una vía de señalización que puede ser evaluada. En algunas modalidades, se prefiere que la detección selectiva tenga lugar usando un sistema de expresión de un mamífero o de un melanóforo , puesto que se espera que tal sistema tenga dentro una proteína G endógena. Por consiguiente, por definición, en tal sistema, el GPCR no endógeno, constitutivamente activado enviará señales continuamente . En algunas modalidades se prefiere que esta señal sea potenciada de modo que en presenci a , por ejemplo, de un agonista inverso del receptor, sea más probable que se pueda diferenciar más fácilmente , particularmente en el contexto de la detección selectiva, entre el receptor cuando está en contacto con el agonista inverso.
Se pretende que la proteína de fusión de GPCR mejore la eficacia de la proteína G que se acopla con el GPCR. La proteína de fusión de GPCR puede ser preferida para la detección selectiva ya sea con un GPCR constitutivamente activo endógeno o con un GPCR constitutivamente activado no endógeno, porque dicho método aumenta la señal que es generada en dichas técnicas de detección. Esto es importante para facilitar una relación "señal-ruido" significativa , se prefiere dicha relación significativa para la detección selectiva de los compuestos candidatos como los divulgados aquí.
La construcción de un constructo útil para la expresión de una proteína de fusión de GPCR forma parte de los conocimientos prácticos de los expertos en la materia. Los vectores y sistemas de expresión de que se dispone comercialmente ofrecen una variedad de enfoques que pueden ajustarse a las necesidades particulares de un investigador. Los criterios importantes en la construcción de tal constructo de proteína de fusión de GPCR incluyen, pero no exclusivamente, que la secuencia de GPCR y la secuencia de la proteína G estén ambas en fase (preferentemente, la secuencia del GPCR endógeno es secuencia arriba de la secuencia de la proteína G), y que el codón de "parada" del GPCR sea suprimido o reemplazado de modo que luego de la expresión del GPCR, la proteína G también se puede expresar. El GPCR se puede unir directamente a la proteína G, o puede haber residuos espaciadores entre los dos (preferentemente, no más de aproximadamente 1 2, aunque este número puede ser fácilmente determinado por un experto en el tema). Basándose en la conveniencia, se prefiere usar un espaciador. En algunas modalidades, se prefiere que la proteína G que se acopla al GPCR no endógeno sea identificada antes de la creación del constructo de la proteína de fusión de GPCR.
Como se indicó precedentemente, se espera que los GPCR activados que se acoplan a Gi , Gz y Go inhiban la formación de AM Pc haciendo ensayos basados en estos tipos de G PCR problemáticos (es decir, la señal de AM Pc disminuye después de la activación , haciedo asi la identificación directa, por ejemplo, de agonistas (que disminuirán aún más esta señal ) problemática). Como se divulgará aquí, se ha determinado que para esos tipos de receptores , es posible crear una proteína de fusión de GPCR que no se base en la proteína G del GPCR endógeno, en un esfuerzo por establecer un ensayo basado en ciclasa viable. De este modo, por ejemplo, un receptor acoplado a Gi endógeno se puede fusionar con una proteína Gs, tal constructo de fusión, después de la expresión "estimula" o "fuerza" al GPCR endógeno a acoplarse, por ejemplo, con Gs en vez de con la proteína "natural" Gi , de modo que se puede establecer dicho ensayo basado en ciclasa. Por consiguiente, para los receptors acoplados a Gi , Gz y Go, en algunas modalidades se prefiere que cuando se usa una proteína de fusión de GPCR y el ensayo se basa en la detección de la actividad de adenililciclasa, el constructo de fusión se establezca con Gs (o una proteína G equivalente que estimule la formación de la enzima adenililciclasa).
Tabla C Efecto de la Efecto de la producción de acumulación Efecto de la AMPc sobre la de IP3 sobre producción activación de la activación Efecto de la de AMPc GPCR (es de GPCR (es acumulación de Proteína sobre el decir, decir, IP3 sobre el G contacto con activación activación contacto con un un agonista constitutiva o constitutiva o agonista inverso inverso unión del unión del agonista) agonista) Gs Aumenta N/A Disminuye N/A G¡ Disminuye N/A Aumenta N/A Gz Disminuye N/A Aumenta N/A Go Disminuye Aumenta Aumenta Disminuye Gq N/A Aumenta N/A Disminuye Igualmente eficaz es un constructo de proteína de fusión de G que utiliza una proteína Gq fusionada con una proteína Gs, Gi , Gz o Go. En algunas modalidades un constructo de fusión preferido se puede llevar a cabo con una proteína Gq en la que los seis (6) primeros aminoácidos de la subunidad a de la proteína G ("Gaq") son suprimidos y los cinco (5) últimos aminoácidos en el extremo C- terminal de Gaq son reemplazados con los correspondientes aminoácidos de la Ga de la proteína G de interés. Por ejemplo, un constructo de fusión puede tener una Gq (deleción de 6 aminoácidos) fusionada con una proteína Gi , que da como resultado un "constructo de fusión Gq/G¡". Este constructo de fusión forzará al receptor acoplado a Gi endógeno a acoplarse con su prote ína G no endógena, Gq , de modo que se puede med ir el segundo mensajero , por ejemplo , trifosfato de inositol o diacilglicerol , en lugar de la producción de AM Pc. 4. Co-transfección de un GPCR acoplado a Gi destinatatio con un GPCR potenciador de la señal acoplado a Gs (Ensayos basados en AMPc) Se sabe que un receptor acoplado a Gi inhibe la adenililciclasa , y, por consiguiente, disminuye el nivel de producción de AM Pc, lo que puede hacer la evaluación de los niveles de AM Pc problemática. En ciertas modalidades, se puede llevar a cabo una técnica eficaz para medi r la d isminución en la producción de AM Pc como una ind icación de la activación de un receptor que se acopla predomi nantemente a Gi después de la activación , mediante la co-transfección de un potenciador de la señal, por ejemplo u n receptor no endógeno , activado constitutivamente que se acopla predomi nantemente a Gs luego de la activación (por ejemplo, TSHR-A623I ; ver infra), al GPCR unido a Gi . Como es evidente , la activación de un receptor acoplado a Gs se puede determinar basándose en un aumento en la producción de AM Pc . La activación de un receptor acoplado a Gi conduce a la dismi nución en la producción de AM Pc. De este modo, el método de co-transfección pretende explotar ventajosamente estas influencias "opuestas". Por ejemplo, la co-transfección de un receptor no endógeno , activado constitutivamente acoplado a Gs (el "potenciador de la señal") con el vector de expresión solo, proporciona una señal basal de AMPc (es decir, aunque el receptor acoplado a Gi disminuirá los niveles de AM Pc, esta "disminución" estará en relación con el aumento sustancial en los niveles AMPc establecidos por el potenciador de la señal constitutivamente activado acoplado a Gs). Para entonces la co-transfección del potenciador de la señal con el "receptor destinatario", un agonista inverso del receptor destinatario acoplado a Gi aumentará la señal de AM Pc medida, mientras que un agonista del receptor destinatario acoplado a Gi disminuirá esta señal .
Los compuestos candidatos que son identificados directamente usando este método deben ser evaluados independientemente para garantizar que éstos no enfocan al receptor potenciador de la señal (esto se puede hacer antes o después de la detección selectiva frente a los receptores co-transfectados).
Composición/Formulación y Métodos de tratamiento Se puede formular un compuesto de la invención, por ejemplo un agonista de GPR1 19, un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, en composiciones farmacéuticas y medicamentos para usar de conformidad con la presente invención usando técnicas bien conocidas en la materia. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida. En ciertas modalidades, dicha administración es a un vertebrado no humano o a un mamífero no humano.
Con relación a las terapias de la presente invención, concretamente las terapias que se relacionan con agonistas de GPR1 1 9, los compuestos de acuerdo con la invención se pueden administrar de cualquier manera adecuada. Las vías de administración adecuadas incluyen la administración oral, nasal , rectal , transmucosa, transdérmica o intestinal, el suministro parenteral, incluidas las inyecciones intramuscular, subcutánea e intramedular, así como inyecciones por vía intratecal , intraventricuiar directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal , intrapulmonar (inhalada) o intraocular usando métodos conocidos en la técnica. Otras vías de administración adecuadas son la formulación en aerosol y de liberación sostenida ("depot"). Las formulaciones de liberación sostenida, particularmente el depot, de los fármacos de la invención están expresamente contempladas. En ciertas modalidades preferidas, los compuestos de acuerdo con la presente invención se administran por vía oral . Los compuestos de acuerdo con la presente invención se pueden preparar en forma sólida o líquida, como comprimidos, cápsulas, polvos, jarabes, elixires y similares, aerosoles, soluciones, suspensiones o emulsiones estériles y similares. En ciertas modalidades, el agonista de GPR1 19 se administra por vía oral .
En ciertas modalidades preferidas, los compuestos de acuerdo con la presente invención, por ejemplo los agonistas de GPR1 19, se administran por vía oral. En ciertas modalidades preferidas, los compuestos de acuerdo con la presente invención , por ejemplo los agonistas de GPR1 19, se administran de manera que permitan la estimulación de la secreción de PYY en las células enteroendocrinas intestinales. En ciertas modalidades preferidas, los compuestos de acuerdo con la presente invención , por ejemplo los agonistas de GPR1 19, se administran por vía oral de manera que permitan la estimulación de la secreción de PYY en las células enteroendocrinas intestinales.
En ciertas modalidades preferidas, los compuestos de acuerdo con la presente invención , por ejemplo los secretagogos de PYY , los compuestos útiles para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY o los compuestos útiles para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo, se administran por vía oral. En ciertas modalidades preferidas, los compuestos de acuerdo con la presente invención , por ejemplo los agonistas de G PR1 1 9, se administran de manera que permitan la estimulación de la secreción de PYY en las células enteroendocrinas intestinales. En ciertas modalidades preferidas, los compuestos de acuerdo con la presente invención , por ejemplo los agonistas de GPR1 1 9, se administran por vía oral de manera que permitan la estimulación de la secreción de PYY en las células enteroendocrinas intestinales.
Las formulaciones para administración oral pueden estar en forma de soluciones y suspensiones acuosas, además de en formulaciones sólidas como comprimidos y cápsulas. Las soluciones y suspensiones acuosa se pueden preparar a partir de polvos o gránulos estériles. Los compuestos se pueden disolver en agua, polietilenglicol, propilenglicol , etanol , aceite de maíz, aceite de semilla de algodón , aceite de man í, aceite de sésamo, alcohol bencílico, cloruro de sodio y/o varios tampones. Otros adyuvantes son bien y ampliamente conocidos en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas de los agonistas de GPR1 1 9 se pueden preparar por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo mediante los procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, preparación de grageas, pulverización, emulsión , encapsulación, atrapamiento, liofilización o deshidratación por aspersión.
Las composiciones farmacéuticas para usar de conformidad con la presente invención se pueden formular de la manera convencional usando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los principios activos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados están disponibles para los técnicos del área (consulte, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (Gennaro et al. , eds). , 20' Edición , 2000, Lippincott Williams & Wiikins; y Handbook of Pharmaceutical Excipiente (Rowe et al . , eds), 4° Edición , 2003, Pharmaceutical Press; cuyas divulgaciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad). La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.
El término material "portador" o material "excipiente" significa aquí cualquier sustancia, no un agente terapéutico en sí mismo, utilizada como un portador y/o diluyente y/o adyuvante, o un vehículo para el suministro de un agente terapéutico a un sujeto o agregado a una composición farmacéutica para mejorar sus propiedades de manipulación o almacenamiento o para permitir o facilitar la formación de una unidad de dosificación de la composición en un artículo discreto como una cápsula o un comprimido adecuado para la administración oral . Los excipientes pueden incluir, a título ilustrativo y no limitante, diluyentes, desintegrantes, aglutinantes, adhesivos, humectantes, polímeros, lubricantes, deslizantes, sustancias agregadas para enmascarar o contrarrestar un sabor u olor desagradable, saborizantes, colorantes, fragancias y sustancias agregadas para mejorar el aspecto de la composición. Los excipientes aceptables incluyen ácido esteárico , estearato de magnesio, óxido de magnesio, sales de sodio y calcio de los ácidos fosfórico y sulfúrico, carbonato de magnesio, talco, gelatina, goma acacia, alginato de sodio, pectina, dextrina, manitol , sorbitol , lactosa, sacarosa, almidones, gelatina, materiales celulósicos, como ésteres de celulosa de ácidos alcanoicos y ésteres alquílicos de celulosa, cera, manteca de cacao o polvos de bajo punto de fusión, pol ímeros, como polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico y polietilenglicoles y otros materiales farmacéuticamente aceptables. Los componentes de la composición farmacéutica se pueden encapsular o comprimir para una administración conveniente.
Farmacéuticamente aceptable se refiere a las propiedades y/o sustancias que son aceptables para el paciente desde un punto de vista farmacológico/toxicológico y para la fabricación química farmacéutica desde un punto de vista físico/qu ímico con referencia a la composición, formulación , estabilidad , aceptación del paciente y biodisponibilidad.
Los núcleos de las grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este propósito, se pueden usar soluciones concentradas de azúcar que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona , gel de carbopol , polietilenglicol , y/o dióxido de titanio, soluciones de lacas, y solventes orgánicos o mezclas de solventes adecuados. Se pueden agregar colorantes o pigmentos a los recubrimientos de los comprimidos o las grajeas para identificar o caracterizar diferentes combinaciones de dosis de principios activos.
Las composiciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los principios activos mezclados con un relleno como lactosa, un aglutinantes como almidón y/o un lubricante como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los principios activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, como aceites grasos, parafina l íquida , polietilenglicoles líquidos, cremofor, capmul, mono-, di- o triglicéridos de cadena media o larga. También se pueden agregar estabilizantes en estas formulaciones.
Además, se puede suministrar un agonista de GPR1 1 9 usando un sistema de liberación sostenida. Se han determinado varios materiales de liberación sostenida y son bien conocidos por los expertos en la materia. Se prefieren particularmente los comprimidos o cápsulas de liberación sostenida. Por ejemplo, se puede emplear un material retardador como monoesterato de * glicerilo o diesterato de glicerilo. La forma farmacéutica también puede recubrirse mediante las técnicas descritas en las patentes estadounidenses N° 4,256, 1 08, 4, 1 66,452, y 4,265,874 para formar comprimidos terapéuticos osmóticos para liberación controlada.
Se contempla expresamente que las terapias de la presente invención, concretamente las terapias que se relacionan con un agonista de GPR1 1 9, se pueden administrar o proporcionar solas o en combinación con uno o más de otros compuestos farmacéutica o fisiológicamente aceptables. En un aspecto de la presente invención , el otro compuesto farmacéutica o fisiológicamente aceptable no es un agonista de GPR1 1 9. En un aspecto de la presente invención, el otro compuesto farmacéutica o fisiológicamente aceptable es un agente farmacéutico seleccionado del grupo que consiste en: calcio, vitamina D, estrógeno, tibolona, modulador selectivo del receptor de estrógeno (SERM ; por ejemplo, raloxifeno, tamoxifeno), bifosfonato (por ejemplo, etidronato, alendronato, risedronato) , calcitonina, metabolito 1 a-hidroxilado de la vitamina D, fluoruro , tiazida, esteroide anabólico, ipriflavona, vitamina K, hormona paratiroidea (PTH ), estroncio, estatina, osteoprotererina , agonista selctivo del receptor EP4, agonista selectivo del receptor canabinoide tipo 2 (CB2) e inhibidor de quinasa MAP p38. (Consulte, por ejemplo, World Health Organization Technical Report Series 921 (2003), Prevention and Management of Osteoporosis).
En un aspecto, la presente invención describe una composición que comprende o consiste esencialmente en una cantidad de agonista de GPR1 1 9 de acuerdo con la presente invención. En un aspecto, la presente invención describe una composición farmacéutica que comprende o consiste esencialmente en una cantidad de agonista de GPR1 19 de acuerdo con la presente invención y al menos un portador farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto, la presente invención describe una composición que comprende o consiste esencialmente en una cantidad de agonista de GPR1 19 de acuerdo con la presente invención. En un aspecto, la presente invención describe una composición farmacéutica que comprende o consiste esencialmente en una cantidad de agonista de GPR1 1 9 de acuerdo con la presente invención y al menos un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención también se refiere a una forma farmacéutica de la composición o de la composición farmacéutica donde el agonista de GPR1 19, el secretagogo de PYY, el compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o el compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo está en una cantidad suficiente para aumentar un nivel de PYY en un individuo, como el nivel plasmático de PYY total o el nivel plasmático de ???3-36· La presente invención también se refiere a una forma farmacéutica de la composición o de la composición farmacéutica donde el agonista de GPR119 está en una cantidad suficiente para producir un efecto de tratamiento o prevención de una afección caracterizada por baja masa ósea, como osteoporosis y/o de aumento de la masa ósea en un individuo.
En un aspecto, la presente invención describe una composición que comprende o consiste esencialmente en una cantidad de un agonista de GPR119 de acuerdo con la presente invención. En un aspecto, la presente invención describe una composición farmacéutica que comprende o consiste esencialmente en una cantidad de agonista de GPR119 de acuerdo con la presente invención y al menos un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención también se refiere a una forma farmacéutica de la composición o de la composición farmacéutica donde el agonista de GPR119 está en una cantidad suficiente para producir un efecto de aumento de un nivel de PYY en un individuo. La presente invención también se refiere a una forma farmacéutica de la composición o de la composición farmacéutica donde el agonista de GPR119 está en una cantidad suficiente para producir un efecto de aumento de un nivel de PYY total (inclusive de PYYi-36 y PYY3-36) en un individuo. La presente invención también se refiere a una forma farmacéutica de la composición o de la composición farmacéutica donde el agonista de GPR1 19 está en una cantidad suficiente para producir un efecto de aumento de un nivel de PYY3-36 en un individuo.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para usar en la presente invención incluyen composiciones en las que los principios activos están contenidos en una cantidad suficiente para lograr el propósito buscado. En algunas modalidades, se sobreentiende que una composición farmacéutica de la presente invención es útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY. Las afecciones moduladas por PYY están de acuerdo con la presente invención . En algunas modalidades, se sobreentiende que una composición farmacéutica de la presente invención es útil para aumentar un nivel de PYY en un individuo. Con relación a la presente invención, la determinación de la cantidad suficiente de un agonista de GPR1 9 para lograr el propósito de acuerdo con la invención forma parte de los conocimientos prácticos de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la divulgación detallada que se provee en ésta.
Los datos obtenidos de los estudios en animales, incluidos, pero no exclusivamente, los estudios que usan ratones, ratas, conejos, cerdos y primates no humanos, se pueden usar para formular un rango de dosificación para usar en seres humanos. En general , un experto en el tema sabe cómo extrapolar ¡n vivo los datos obtenidos de un modelo animal a otro, como un ser humano. En algunas circunstancias, estas extrapolaciones se pueden basar sólo en el peso del modelo animal en comparación con otro, como un ser humano, en otras circunstancias, estas extrapolaciones no se basan simplemente en los pesos sino que incorporan una diversidad de factores. Los factores representativos incluyen el tipo , la edad , el peso, el sexo, el régimen alimentario y el estado del paciente, la gravedad de la enfermedad , la vía de administración, consideraciones farmacológicas como la actividad , la eficacia, los perfiles farmacocinéticos y toxicológícos del compuesto particular empleado , si se utiliza un sistema de administración de fármacos, si se está tratando un estado agudo o crónico de la enfermedad o se está llevando a cabo profilaxis o si se están administrando otros principios activos además de los compuestos de la presente invención y como parte de una combinación de fármacos. El régimen de dosificación para tratar una enfermedad con los compuestos y/o las composiciones de esta invención se selecciona de acuerdo con una diversidad de factores como los citados anteriormente. Por lo tanto, el régimen de dosificación real empleado puede variar mucho y por consiguiente se puede apartar del régimen de dosificación preferido y un experto en el tema reconocerá que se puede probar una dosis y un régimen de dosificación fuera de estos rangos típicos y que, llegado el caso, se puede usar en los métodos de esta invención .
Un ejemplo de modelo animal es el modelo de pérdida ósea posterior a la ovariectom ía en ratas (OVX) La rata ovariectomizada es un modelo animal precl ínico excelente que emula correctamente la importante característica clínica de la reducción de estrógeno en el esqueleto humano y la respuesta de los agentes terapéuticos. En este modelo, se logra la eficacia terapéutica cuando la pérdida ósea asociada con ovariectomía se puede prevenir parcial o completamente. (Consulte, por ejemplo, Bollag et al, Mol Cell Endocrinol (2001) 177:35-41; y Jee et al, J Musculoskel Neuron Interact (2001) 1:193-207). En ciertas modalidades, la eficacia terapéutica se alcanza cuando la pérdida ósea asociada con la ovariectomía se evita al menos en aproximadamente 10%, se evita al menos en aproximadamente 20%, se evita al menos en aproximadamente 30%, se evita al menos en aproximadamente 40%, se evita al menos en aproximadamente 50%, se evita al menos en aproximadamente 60%, se evita al menos en aproximadamente 70%, se evita al menos en aproximadamente 75%, se evita al menos en aproximadamente 80%, se evita al menos en aproximadamente 85%, se evita al menos en aproximadamente 90%, se evita al menos en aproximadamente 95% o se evita en un 100%.
Otro ejemplo de modelo animal es el aumento de un nivel de PYY sanguíneo después de la prueba de provocación con glucosa en ratones. En ciertas modalidades, el nivel sanguíneo de PYY es un nivel plasmático de PYY. En ciertas modalidades, el nivel de PYY es un nivel de PYY independiente de glucosa. En ciertas modalidades, el nivel de PYY es un nivel de PYY dependiente de glucosa. En ciertas modalidades, el PYY es PYY total, inclusive de PYYi-36 y PYY3-36. En ciertas modalidades, PYY es PYY3-36- Se dispone de kits comerciales para medir PYY total o PYY3-36 en roedores o humanos, por ejemplo de Phoenix Pharmaceuticals, Inc. (Burlingame, CA). También, se pueden medir PYYi-36 y YY3-36 independientemente por medios bioquímicos (Eberlein et al, Peptides (1989) 10:797-803; Grandt et al, Regul Pept (1994) 51:151-159; Cruze et al, Peptides (2007) 28:269-280). En ciertas modalidades, una actividad relacionada con PYY de la invención es una actividad relacionada con PYY3-36- En ciertas modalidades, la eficacia terapéutica se logra cuando un nivel sanguíneo o plasmático de PYY se aumenta en al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 100%, al menos aproximadamente 150%, al menos aproximadamente 200%, al menos aproximadamente 300%, al menos aproximadamente 400%, al menos aproximadamente 500%, al menos aproximadamente 600%, al menos aproximadamente 700%, al menos aproximadamente 800%, al menos aproximadamente 900% o al menos aproximadamente 1.000%.
Está expresamente contemplado que un agonista de GPR119 se puede administrar en una base diaria o periódica para lograr un aumento del nivel de PYY en un individuo. En ciertas modalidades, un agonista de GPR119 se administra en una base diaria o periódica para lograr un aumento de un nivel sanguíneo (por ejemplo, plasmático) de PYY en un individuo. En ciertas modalidades, un agonista de GPR119 se administra en una base diaria o periódica para lograr un aumento de un nivel sanguíneo (por ejemplo, plasmático) de PYY en un individuo que es al menos aproximadamente 1 0%, al menos aproximadamente 25% , al menos aproximadamente 50% , al menos aproximadamente 1 00% , al menos aproximadamente 1 50%, al menos aproximadamente 200% , al menos aproximadamente 300% , al menos aproximadamente 400% , al menos aproximadamente 500%, al menos aproximadamente 600% , al menos aproximadamente 700%, al menos aproximadamente 800% , al menos aproximadamente 900% o al menos aproximadamente 1 000% un nivel sanguíneo normal (por ejemplo, plasmático) de PYY (por ejemplo, un nivel plasmático normal de PYY antes de una comida (por ejemplo, el nivel plasmático de PYY total ) o un nivel plasmático de PYY (por ejemplo, el nivel plasmático de PYY total ) entre los niveles normales de PYY antes y después de una comida) en un individuo o el nivel sanguíneo (por ejemplo, plasmático) de PYY (por ejemplo, plasmático de PYY total) en el individuo antes del tratamiento. Se destaca que esos rangos de aumento del nivel sangu íneo (por ejemplo plasmático) de PYY (por ejemplo plasmático de PYY total) son ejemplos de rangos y no se supone que sean limitantes de la invención .
Está expresamente contemplado que un agonista de GPR1 1 9 se puede administrar a diario o periódicamente para lograr un aumento del nivel de PYY en un individuo. En ciertas modalidades, un agonista de GPR1 1 9 se administra a diario o periódicamente para lograr un aumento de un nivel sanguíneo (por ejemplo, plasmático) de PYY en un individuo. En ciertas modalidades un agonista de GPR1 1 9 se administra a diario o periódicamente para lograr un aumento de un nivel sangu íneo (por ejemplo, plasmático) de PYY en un individuo dentro de un rango de concentración de 0, 1 ng/ml a 10 ng/ml o 1 00 ng/ml, 0,2 ng/ml a 10 ng/ml o 1 00 ng/ml , 0,3 ng/ml a 10 ng/ml o 1 00 ng/ml, 0,4 ng/ml a 10 ng/ml o 1 00 ng/ml , 0,5 ng/ml a 10 ng/ml o 1 00 ng/ml, 0,6 ng/ml a 10 ng/ml o 1 00 ng/ml , 0 ,7 ng/ml a 10 ng/ml o 1 00 ng/ml , 0,8 ng/ml a 10 ng/ml o 1 00 ng/ml , 0,9 ng/ml a 10 ng/ml o 1 00 ng/ml , 1 ng/ml a 10 ng/ml o 100 ng/ml , 2 ng/ml a 1 0 ng/ml o 1 00 ng/ml, 3 ng/ml a 10 ng/ml o 100 ng/ml , o 5 ng/ml a 10 ng/ml o 1 00 ng/ml . Se destaca que esos rangos de concentración sanguínea (por ejemplo plasmática) de PYY (por ejemplo concentración plasmática de PYY total) son ejemplos de rangos y no se supone que sean limitantes de la invención .
La cantidad de la dosis y el intervalo de dosificación se pueden ajustar para proporcionar el efecto terapéutico pretendido. Se apreciará que la dosis exacta de un agonista de GPR1 1 9 de conformidad con la presente invención variará dependiendo del agonista de GPR1 19, su potencia, el modo de administración, la edad y el peso del paciente y la gravedad de la afección que se va a tratar. La formulación exacta, la rute de administración y la dosis pueden ser elegidas por cada médico a la vista del estado del paciente. A título ilustrativo y no limitante, una cantidad de un agonista de GPR1 19 de conformidad con la presente invención es una cantidad menor de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso corporal , menor de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 0,01 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 0,05 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 0,5 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal o menor de aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal.
Un rango de dosis preferido para la cantidad de un compuesto de la invención (por ejemplo un agonista de GPR119, un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY en un individuo), que se puede administrar a diario o periódicamente para lograr los resultados deseados es de 0,1-100 mg/kg de masa corporal. Otro rango de dosis preferido es de 0,1-30 mg/kg de masa corporal. Otro rango de dosis preferido es de 0,1-10 mg/kg de masa corporal. Otro rango de dosis preferido es de 0,1-3,0 mg/kg de masa corporal. El ejemplo de dosis preferida se selecciona del grupo que consiste en 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg. Por supuesto, esas dosis diarias se pueden suministrar o administrar en pequeñas cantidades periódicamente durante el transcurso de un día. Se destaca que esos rangos de dosis son sólo rangos preferidos y no pretenden ser limitantes de la invención. Se destaca que esos rangos de dosis son sólo dosis preferidas y no pretenden ser limitantes de la invención .
La cantidad de la dosis y el intervalo de dosificación pueden ser ajustados individualmente para proporcionar niveles plasmáticos del agonista de GPR1 19 de acuerdo con la presente invención que alcancen el efecto terapéutico pretendido. Los intervalos de dosificación también se pueden determinar usando el valor para un rango seleccionado del agonista de GPR1 1 9 de modo de alcanzar el efecto terapéutico pretendido. Un agonista de GPR1 1 9 se debe administrar usando un régimen que mantenga los niveles plasmáticos dentro del rango seleccionado de concentración del agonista de GPR1 1 9 d urante 10-90% del tiempo, preferentemente entre 30-99% del tiempo y muy preferentemente entre 50-90% del tiempo. En los casos de administración local o absorción selectiva, el rango de concentración de agonista de GPR1 19 que proporciona el efecto terapéutico pretendido puede no estar relacionado con la concentración plasmática.
La cantidad de la composición administrada dependerá, por supuesto, del individuo que está en tratamiento, del peso del individuo, de la gravedad de la afección, del modo de administración y del juicio del médico que la prescribe.
En un aspecto, la presente invención describe en consecuencia un método para tratar o prevenir una afección caracterizada por baja masa ósea, como osteoporosis, o por un aumento de la masa ósea que comprende administrar a un individuo que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende o consiste esencialmente en una cantidad de un agonista de GPR1 19 de acuerdo con la presente invención . En ciertas modalidades, la composición es una composición farmacéutica.
En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para tratar o prevenir una afección caracterizada por baja masa ósea, como osteoporosis, o por un aumento de la masa ósea que comprende administrar a un individuo que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende o consiste esencialmente en una cantidad de un agonista de GPR1 1 9 de acuerdo con la presente invención. En un aspecto relacionado, la presente invención describe dicho método donde el agonista de GPR1 1 9 se administra en una cantidad suficiente para produci r un efecto de aumento de un nivel de PYY en un individuo. En ciertas modalidades, la composición es una composición farmacéutica.
Las terapias de la presente invención , como las terapias que se relacionan con un agonista de GPR1 1 9, son útiles en el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY.
En ciertas modalidades, la afección modulada por PYY es una afección ósea.
En ciertas modalidades, la afección ósea es una afección que se caracteriza por baja masa ósea. En ciertas modalidades, la afección ósea que se caracteriza por baja masa ósea se selecciona del grupo que consiste en osteopenia, osteoporosis, artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad periodontal , pérdida ósea alveolar, osteotomía por pérdida ósea, pérdida ósea ididopática infantil , enfermedad de Paget, pérdida ósea debida a cáncer metastásico, lesiones ósteol íticas, curvatura de la columna vertebral y pérdida de altura.
En ciertas modalidades, la afección ósea es una fractura ósea. En ciertas modalidades, la fractura ósea se selecciona del grupo que consiste en una fractura ósea traumática, una fractura ósea de largo plazo y una fractura ósea osteoporósica.
En ciertas modalidades, la afección ósea es una enfermedad ósea. En ciertas modalidades, la enfermedad ósea se selecciona del grupo que consiste en osteopenia, osteoporosis, artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad periodontal , pérdida ósea alveolar, osteotomía por pérdida ósea, pérdida ósea ididopática infantil, enfermedad de Paget, pérdida ósea debida a cáncer metastásico, lesiones ósteolíticas, curvatura de la columna vertebral y pérdida de altura.
En ciertas modalidades, la afección ósea es un aumento de la cicatrización ósea o el crecimiento óseo, donde dicho aumento de la cicatrización ósea o el crecimiento óseo se selecciona del grupo que consiste en aumento de la cicatrización ósea luego de una reconstrucción facial , reconstrucción maxilar, reconstrucción mandibular, enfermedad periodontal o extracción dental , aumento de la extensión de huesos largos, aumento de la osteointegración protésica y aumento de la sinostosis ósea.
En ciertas modalidades, la afección modulada por PYY es un trastorno metabólico.
En ciertas modalidades, el trastorno metabólico se selecciona del grupo que consiste en sobrepeso, obesidad, hiperfagia, diabetes (inclusive diabetes de tipo 1 y diabetes de tipo 2), diabetes tipo 1 , diabetes tipo 2 , intolerancia a la glucosa, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, dislipidemia, hipertensión y síndrome metabólico.
En ciertas modalidades, la afección modulada por PYY es una afección relacionada con angiogenesis.
En ciertas modalidades, la afección relacionada con angiogenesis se selecciona del grupo que consiste en arteriopatía periférica, cicatrización de heridas e isquemia.
En ciertas modalidades, la afección modulada por PYY es una afección isquémica.
En ciertas modalidades, la afección isquémica se selecciona del grupo que consiste en isquemia cerebral, accidente cerebrovascular isquémico, cardiopatía isquémica , infarto de miocardio, lesión por isquemia-reperfusión, remodelación post infarto de miocardio, insuficiencia card íaca e insuficiencia cardíaca congestiva.
En ciertas modalidades, la afección modulada por PYY es un trastorno por mala absorción.
En ciertas modalidades, el trastorno por mala absorción se selecciona del grupo que consiste en síndrome del intestino corto, enterocolitis, enfermedad de Crohn , colitis ulcerosa, síndrome I intestino irritable, cólera y un trastorno acompañado de diarrea.
En ciertas modalidades, la afección modulada por PYY es un trastorno convulsivo.
En ciertas modalidades, el trastorno convulsivo es epilepsia. En ciertas modalidades, la afección modulada por PYY es un cáncer.
En ciertas modalidades, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de páncreas, mama, colon y adenocarcinoma de Barrett.
En ciertas modalidades, la afección modulada por PYY es un trastorno inflamatorio.
En ciertas modalidades, el trastorno inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en aterosclerosis, aterotrombosis, psoriasis, artritis psoriásica, arthritis reumatoide, osteoartritis, resistancia a la insulina, diabetes (inclusive diabetes de tipo 1 y diabetes de tipo 2), diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, síndrome metabólico, obesidad, colesterol HDL inferior al normal, hipertensión, hiperlipidemia, cardiopatía isquémica, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, osteoporosis, osteoclastogénesis superior a la normal, pancreatitis, nefritis intersticial, rechazo agudo de trasplante, hepatitis crónica, esteatosis hepática, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico (LES), reestenosis, lesión por isquemia- reperfusión, inflamación alérgica, enfermedad de Parkinson, enfermedad priónica, lesión excitotóxica, enfermedad de Alzheimer, deficiencia cognitiva leve (DCL), coagulación intravascular diseminada, choque séptico, una enfermedad pulmonar inflamatoria y una enfermedad intestinal inflamatoria. En ciertas modalidades, la enfermedad pulmonar inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en asma, enfisema, enfermedad pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar idiopática, síndrome de bronquiolitis obliterans, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) e hipertensión arterial pulmonar. En ciertas modalidades, la enfermedad intestinal inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en enteritis, enterocolitis, enfermedad de Crohn , colitis granulomatosa, ileítis, colitis de Crohn, colitis ulcerosa, sigmoiditis, pancolitis y proctitis ulcerosa.
En ciertas modalidades, el trastorno inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en aterosclerosis, aterotrombosis , resistencia a la insulina, pancreatitis, reestenosis, una enfermedad pulmonar inflamatoria y una enfermedad intestinal inflamatoria. En ciertas modalidades, la enfermedad pulmonar inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en asma, enfisema e hipertensión arterial pulmonar. En ciertas modalidades, la enfermedad intestinal inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en enteritis, enterocolitis, enfermedad de Crohn, colitis granulomatosa , ileítis, colitis de Crohn, colitis ulcerosa, sigmoiditis, pancolitis y proctitis ulcerosa.
Las afecciones caracterizadas por baja masa ósea incluyen, pero no exclusivamente, osteopenia, osteoporosis, artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad periodontal , pérdida ósea alveolar, osteotomía por pérdida ósea, pérdida ósea ididopática infantil , enfermedad de Paget, pérdida ósea debida a cáncer metastásico, lesiones osteol íticas, curvatura de la columna vertebral y pérdida de altura. En ciertas modalidades, la afección que se caracteriza por baja masa ósea es osteoporosis. En ciertas modalidades, la afección que se caracteriza por baja masa ósea es osteoporosis. En ciertas modalidades, la osteoporosis es osteoporosis primaria. En ciertas modalidades, la osteoporosis es osteoporosis secundaria. Las afecciones caracterizadas por baja masa ósea también incluyen, pero no exclusivamente, las complicaciones a largo plazo de la osteoporosis, como curvatura de (a columna vertebral, pérdida de altura y cirugía protésica. Se comprende que las afecciones caracterizadas por baja masa ósea se pueden incluir en las modalidades, individualmente o en cualquiera de sus combinaciones. En ciertas modalidades, la afección que se caracteriza por baja masa ósea es osteoporosis primaria.
En ciertas modalidades, el individuo que necesita incrementar su masa ósea tiene una densidad mineral ósea (DMO) mayor de 1 (puntuación T < -1 ), mayor o igual de 1 ,5 (puntuación T < -1 ,5), mayor o igual de 2 (puntuación T < -2) o mayor o igual de 2,5 (puntuación T < -2,5) desviaciones estándar por debajo de la media de referencia del adulto joven . En ciertas modalidades, el individuo que necesita incrementar su masa ósea necesita tratamiento para una fractura ósea. En ciertas modalidades, el individuo que necesita tratamiento para una fractura ósea tiene una fractura ósea traumática, una fractura ósea de largo plazo o una fractura ósea osteoporósica. En ciertas modalidades, el individuo necesita tratamiento para una enfermedad ósea . En ciertas modalidades, el individuo que necesita tratamiento para una enfermedad ósea tiene osteopenia, osteoporosis, artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad periodontal , pérdida ósea alveolar, osteotomía por pérdida ósea, pérdida ósea ididopática infantil , enfermedad de Paget, pérdida ósea debida a cáncer metastásico, lesiones osteol íticas, curvatura de la columna vertebral o pérdida de altura. En ciertas modalidades, el individuo que necesita tratamiento para una enfermedad ósea tiene osteoporosis. En ciertas modalidades, la osteoporosis es osteoporosis primaria. En ciertas modalidades, la osteoporosis es osteoporosis secundaria. Los trastornos óseos destructivos que pueden ser tratados de acuerdo con la invención, incluyen , pero no exclusivamente, osteoporosis, osteoartritis y lesiones osteol íticas como las causadas por enfermedad neoplásica, radioterapia o quimioterapia. En ciertas modalidades, la osteoporosis es osteoporosis primaria. En ciertas modalidades, la osteoporosis es osteoporosis secundaria.
Las terapias de la presente invención, como las terapias que se relacionan con un agonista de GPR1 19 son útiles además para aumentar la cicatrización ósea luego de reconstrucción facial , reconstrucción maxilar, reconstrucción mandibular, enfermedad periodontal o extracción dental, aumentar la extensión de los huesos largos, aumentar el crecimiento hacia adentro protésico o aumentar la sinostosis ósea en un individuo.
Las terapias de la presente invención, como las terapias que se relacionan con un agonista de GPR119, son útiles en la modulación de una actividad relacionada con PYY, en un individuo. En ciertas modalidades, la modulación de una actividad relacionada con PYY se selecciona del grupo que consiste en (a) aumentar el PYY plasmático; (b) aumentar la masa ósea; (c) disminuir la pérdida de masa ósea; (d) aumentar la formación de hueso; (e) disminuir el consumo de alimentos; (f) disminuir el peso corporal; (g) aumentar la saciedad (h) aumentar la eliminación de glucosa; (i) disminuir la glucosa plasmática; (j) aumentar la angiogénesis; (k) disminuir la secreción en el epitelio intestinal; (I) aumentar la absorción en el epitelio intestinal; y (m) aumentar la adiponectina plasmática.
En ciertas modalidades, el individuo es un vertebrado. En ciertas modalidades, el individuo que es un vertebrado es un pez, un anfibio, un reptil, un ave o un mamífero. En ciertas modalidades, el individuo o vertebrado es un mamífero. En ciertas modalidades, el individuo o vertebrado que es un mamífero es un ratón, una rata, un hámster, un conejo, un cerdo, un gato, un caballo, una vaca, una oveja, una cabra, un primate no humano o un ser humano. En ciertas modal idades, el individuo es un ser humano . En ciertas modalidades, el ser humano es una mujer posmenopáusica o un hombre de más de 50 años de edad .
Si n más elaboración , se cree que un experto en la materia puede, usando la descripción precedente, practicar la presente i nvención en toda su extensión . La descripción precedente se proporciona sólo a efectos de claridad y comprensión , y no se debe entender de ella ninguna limitación innecesaria, puesto que para los expertos en la materia serán evidentes modificaciones comprendidas por el campo de aplicación de la invención .
En toda esta solicitud , se citan varias publicaciones, patentes y sol icitudes de patentes. Las divulgaciones de estas publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en esta solicitud se incorporan por referencia en su totalidad en la presente divulgación . La cita en ésta por el solicitante de una publicación , patente o sol icitud de patente no significa que el solicitante admita que dicha publicación , patente o solicitud de patente constituyan estado anterior de la técnica.
Ejemplos Sin más elaboración , se cree que un experto en la materia puede, usando la descripción precedente, practicar la presente i nvención en toda su extensión . Los ejemplos detallados siguientes deben interpretar como meramente ilustrativos, y no como limitaciones de la divulgación precedente en modo alguno. Los expertos en l a materia reconocerán rápidamente variaciones apropiadas de los procedimientos.
Ejemplo 1 El receptor GPR1 19 presenta actividad constitutiva para aumentar la acumulación de AM Pc en cél ulas HEK293 transfectadas El receptor GPR1 19 ha demostrado presentar actividad constitutiva en el ensayo de AMPc. Las mediciones de AM Pc se hicieron con un estuche de adenililciclasa Flash Píate (NEN Life Science Products, Boston, MA) de acuerdo con el protocolo del proveedor. En resumen , las células HEK293 se transfectaron con un vector de ADN vacío ("Vector") o ADN plasm ídico de expresión del receptor GPR1 19 humano ("GPR1 1 9") usando Lipofectamina ( Invitrogen, Carlsbad , CA). Después de 24 h , las células transfectadas se cosecharon en tampón de disociación celular G I BCO (Gaithersburg , M D) (N° de catalogo 1 31 51 -01 4) y se resuspendieron en tampón del ensayo (50% 1 X PBS/50% tampón de estimulación). La incubación se llevó a cabo con 1 05 células por pocilio durante 60 min a temperatura ambiente. Después de otras 2 h de incubación con trazador en el tampón de detección , las placas se contaron en un contador de centelleo MicroBeta Wallac (Gaithersburg, MD). Los valores de AM Pc por pocilio se extrapolaron de una curva estándar de AMPc que se incluyó en cada placa de ensayo. Los resultados se presentan en la Figura 1. A partir de los resultados que se muestran en la Figura 1, es evidente que el receptor GPR1 1 9 tiene actividad constitutiva para aumentar la acumulación de AMPc en células HEK293 transfectadas.
Ejemplo 2: El compuesto 1 es un agonista del receptor GPR1 19 como lo prueba, por ejemplo, la estimulación de la acumulación de AMPc en GPR1 19-células HEK293 transfectadas Se demostró en el ensayo de AMPc que el Compuesto 1 (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina es un agonista del receptor GPR1 1 9. Las mediciones de AMPc se hicieron con un estuche de adenililciclasa Flash Píate (NEN Life Science Products, Boston, MA) de acuerdo con el protocolo del proveedor. En resumen , las células HEK293 se transfectaron con vector de ADN vacío ("Vector") o ADN plasmídico de expresión del receptor GPR1 1 9 humano ("GPR1 19") usando Lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad , CA). Después de 24 h, las células transfectadas se cosecharon en tampón de disociación celular GIBCO (Gaithersburg, M D) (N° de catalogo 1 31 51 -014) y se resuspendieron en tampón del ensayo (50% 1 X PBS/50% tampón de estimulación). El Compuesto 1 se incubó con 105 células por pocilio durante 60 min a temperatura ambiente. Después de otras 2 h de incubación con trazador en el tampón de detección, las placas se contaron en un contador de centelleo MicroBeta Wallac (Gaithersburg, MD). Los valores de AMPc por pocilio se extrapolaron de una curva estándar de AMPc que se incluyó en cada placa de ensayo. Los resultados se presentan en la Figura 2. A partir de los resultados que se muestran en la Figura 2, es evidente que el Compuesto 1 es un agonista del receptor GPR1 1 9.
Ejemplo 3 Efecto de la admi nistración de un agon ista de GPR1 19 sobre el PYY plasmático en ratones silvestres Se dejaron en ayunas durante 18 horas ratones C57BL/6 machos (de aproximadamente 8 semanas de edad ; obtenidos de Harían , Indianápolis, IN), y se asignaron al azar en ocho grupos con n = 6 por cada grupo. A los ratones se les administró por vía oral vehículo (polietilenglicol 400 al 80%/Tween 80 al 1 0% /etanol al 10%) o agonista de GPR1 1 9 (Compuesto 1 ; (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1 ,2,4]oxadiazol-5-il )-piperidin-1 -il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina, 10 mg/kg, como se indica en la Figura 3. Treinta minutos después del tratamiento, se les administró por vía oral un bolo de glucosa, 3 g/kg , y se les extrajo sangre a los 0 minutos (sin bolo de glucosa), 2 minutos, 5 minutos y 10 minutos después del bolo de glucosa. Se determinaron los niveles plasmáticos de PYY total (inclusive de PYYi-36 y PYY3-36 ) usando un estuche de EIA de PYY comprado a Phoenix Pharmaceuticals, I nc. Estuche de EIA (Péptido YY (PYY) (Rata, Ratón, Cerdo, Canino), N° de catálogo EK-059-03) de acuerdo con las instrucciones provistas con el estuche. A partir de los resultados que se muestran en la Figura 3, es evidente que la administración del agonista de GPR1 19 (Compuesto 1 ) aumenta el PYY plasmático total en los ratones. A partir de los resultados que se muestran en la Figura 3, es evidente que la administración del agonista de GPR1 19 (Compuesto 1 ) aumenta el PYY plasmático total en los ratones . El Compuesto 1 es idéntico al compuesto divulgado en la Solicitud de Patente Internacional N° PCT/US2004/001267 (publicada como WO 2004/065380).
Ejemplo 4 Efecto de la administración del agonista de GPR1 19 sobre el PYY plasmático en ratones que carecen de GPR1 19 (con genes inactivados) en comparación con los ratones silvestres Se dejan en ayunas durante 18 horas ratones machos que carecen de GPR1 19 (Chu et al , Endocrinology (2007) 148:2.601 -2.609) y littermates de tipo silvestre. A los ratones se les administra, por vía oral, vehículo (polietilenglicol 400 al 80%/etanol al 10%/Tween 80 al 10%) o agonista de GPR1 19 de conformidad con la presente invención (Compuesto 1 ; (2-fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[ ,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1 -il]-5-nitro- pirimidin-4-il}-amina, 20 mg/kg . Treinta minutos después del tratamiento, se les extrae sangre ( 100 microlitros) de la vena retroorbital del ojo (tiempo 0 minutos) seguido de un bolo de glucosa, 3 g/kg (por vía oral ). Cinco minutos después de la administración de la glucosa, se les extrajo otra muestra de sangre ( 100 microlitros) (tiempo 5 minutos). Se les recoge el plasma después de la centrifugación y se determinan los niveles plasmáticos de PYY total usando un estuche de EIA de PYY comprado a Phoenix Pharmaceuticals, I nc. Estuche de EIA (Péptido YY (PYY) (Rata, Ratón, Cerdo, Canino), N° de catálogo EK-059-03) de acuerdo con las instrucciones provistas con el estuche. Se puede demostrar además que el receptor GPR119 funcional es necesario para que el. agonista de GPR119 administrado aumente el nivel plasmático de PYY total en los ratones. Se puede demostrar que el Compuesto 1 estimula el PYY total plasmático en los ratones silvestres pero no en los que carecen de GPR119. El Compuesto 1 es idéntico al compuesto divulgado en la Solicitud de Patente Internacional N° PCT/US2004/001267 (publicada como WO 2004/065380).
Ejemplo 5 Efecto de la administración de un agonista de GPR119 sobre la masa ósea en ratas ovariectomizadas Se puede demostrar que un agonista de GPR119 de conformidad con la presente invención es eficaz para tratar o prevenir una afección caracterizada por baja masa ósea, como osteoporosis y/o de aumentar la masa ósea en un individuo usando el modelo in vivo de rata ovariectomizada (OVX) que se describe a continuación (consulte, por ejemplo, Bollag et al, Mol Cell Endocrinol (2001) 177:35-41).
Se compran veinte ratas hembra Sprague-Dawley vírgenes OVX y 20 vírgenes no OVX (150-175 g), de 8 semanas de edad, a Harían Sprague-Dawley, Inc. (Indianapolis, IN). Los animales se alimentan ad libitum con una dieta comercial normal en pélet, Teklab Rodent diet (1,46% de calcio), con libre acceso al agua. Las ratas se dividen al azar en cuatro grupos experimentales emparejados por peso y se seleccionan para recibir vehículo o agonista de GPR119 por vía oral de conformidad con la presente invención. El tratamiento se continúa diariamente durante 6 semanas. 1 . Control. A diez ratas no OVX se les administra vehículo por vía oral . 2. Control + Tratamiento. A diez ratas no OVX se les administra agonista de GPR1 1 9 por vía oral . 3. OVX. A diez ratas OVX se les administra vehículo por vía oral . 4. OVX + Tratamiento. A diez ratas OVX se les administra agonista de GPR1 1 9 por vía oral.
Las ratas se pesan diariamente y se les mide la longitud al inicio y nuevamente a las 6 semanas. Se realiza una absorciometría de rayos X de energía dual (AXD) usando un equipo Hologic QDR 1 000/W (Waltham, MA) en todos los animales antes de iniciar el tratamiento y a las 6 semanas, y se analizan los datos usando el programa informático Rat Whole Body versión 5.53. Se determina la densidad mineral ósea (DMO) en la columna vertebral.
Se determina el porcentaje de cambio en la densidad mineral ósea vertebral después de 6 semanas de tratamiento. Se demuestra que la administración de un agonista de GPR1 1 9 atenúa los efectos negativos de la ovariectomía sobre la densidad mineral vertebral. La atenuación de los efectos negativos de la ovariectomía sobre la densidad mineral vertebral indica que el tratamiento es eficaz para tratar o prevenir una afección caracterizada por baja masa ósea, como osteoporosis, y/o aumentar la masa ósea en un individuo.
Ejemplo 6 Efecto de la Administración de un Agonista de GPR1 19 sobre la Consolidación de una Fractura Ósea Se puede demostrar que un agonista de GPR1 1 9 de conformidad con la presente invención es eficaz en el tratamiento de una fractura ósea usando el ensayo in vivo que se describe a continuación.
Técnica de fractura Se anestesian ratas Sprague-Dawley a los 3 meses de edad con ketamina. Se les practica una incisión de 1 cm en la cara anteromedial de la parte proximal de la tibia o el fémur derechos. A continuación se describe la técnica quirúrgica tibial . La incisión se lleva a cabo a través del hueso, y se taladra un orificio de 1 mm, 4 mm proximal con respecto la cara distal de la tuberosidad tibial, 2 mm medial con respecto al borde anterior. Se coloca un clavo intramedular con un tubo de acero inoxidable de 0,8 mm (carga máxima 36,3 N, resistencia máxima 61 ,8 N/mm, probado en las mismas condiciones que los huesos). No se realiza escariación del canal medular. Se produce una fractura cerrada estandarizada 2 mm por encima de la articulación tibiofibular mediante flexión de tres puntos usando pinzas ajustables especialmente diseñadas con mordazas romas. Para reducir al mínimo el daño al tejido; se tiene cuidado de no desplazar la fractura. La piel se cierra con suturas de nailon de monofilamento. La operación se lleva a cabo en condiciones asépticas. Se toman radiografías de todas las fracturas inmediatamente después de colocar el clavo, y se excluyen las ratas con fracturas fuera del área diafisaria especificada o con desplazamiento del clavo. Los restantes animales se dividen al azar en los grupos siguientes con 10-12 animales por cada subgrupo por cada tiempo de toma de datos para comprobar la consolidación de la fractura. A las ratas se les administra, diariamente, vehículo o agonista de GPR1 19, por vía oral . El agonista de GPR1 1 9 se usa en una cantidad entre 0,001 mg/kg de peso corporal y 1 00 mg/kg de peso corporal . El tratamiento se continúa durante 1 0, 20, 40 y 80 días.
A los 1 0, 20, 40 y 80 días, 1 0-12 ratas de cada grupo son anestesiadas con Ketamina y sacrificadas por desangrado. Se retiran ambos huesos tiofibulares por disección y se extrae todo el tejido blando. Se almacenan los huesos de 5-6 ratas por cada grupo en etanol 70% para análisis histológico y los huesos de las otras 5-6 ratas de cada grupo se almacenan en solución tamponada de Ringer (+4 °C, pH 7,4) para radiografías y se les realiza una prueba biomecánica.
Análisis histológico Los métodos para el análisis histológico de huesos fracturados fueron publicados previamente por Mosekilde y Bak (Bone (1 993) 14: 1 9-27 ). En resumen, el sitio de fractura se corta con una sierra a 8 mm a cada lado de la línea de fractura, se incluye no descalcificado en metilmetacrilato y se cortan cortes frontales de 8 pm de espesor con un micrótomo Reichert-Jung Polycut. Los cortes medio-frontales (incluidas tanto tibia como fíbula) teñidas con Masson-Trichome se usan para la visualización de la respuesta celular y tisular a la consolidación de la fractura con y sin tratamiento. Los cortes teñidos con rojo sirio se usan para demostrar las características de la estructura callosa y para diferenciar entre hueso reticular y hueso lamelar en el sitio de fractura. Se realizan las mediciones siguientes: ( 1 ) fisura de la fractura, medida como la distancia más corta entre los extremos del hueso cortical en la fractura, (2) longitud del callo y diámetro del callo, (3) volumen óseo total del área del callo, (4) tejido óseo por área de tejido dentro del área del callo, (5) tejido fibroso en el callo, y (6) área de cartílago en el callo.
Análisis biomecánico Los métodos para el análisis biomecánico fueron publicados previamente por Bak y Andreassen (Calcif Tissue I nt (1 989) 45:292-297 ). En resumen , se toman radiografías de todas las fracturas antes de la prueba biomecánica. Las propiedades mecánicas de las fracturas que están consolidándose se analizan mediante un procedimiento destructivo de flexión de tres o cuatro puntos. Se determinan la carga máxima, la resistencia, la energ ía en la carga máxima , la deflexión en la carga máxima y el estrés máximo.
Ejemplo 7 Clonación de todo el GPR119 humano endógeno Se clonó el polinucleótido que codifica el GPR1 1 9 humano endógeno mediante PCR usando los cebadores específicos para GPR119. 5'-GTCCTGCCACTTCGAGACATGG-3' (SEQ. ID N°: 3; sentido, ATG como codón de iniciación) 5'-GAAACTTCTCTGCCCTTACCGTC-3' (SEQ. ID N°: 4; antisentido, 3' de codón de parada) y ADN genómico humano como plantilla. Se usó la ADN polimerasa TaqPlus Precisión™ (Stratagene) para la amplificación mediante el ciclo siguiente con los pasos 2 a 4 repetidos 35 veces: 94 °C, 3 minutos; 94 °C, 1 minuto; 58 °C, 1 minuto; 72 °C, 2 minutos; 72 °C, 10 minutos.
Se aisló un fragmento por PCR de 1,0 Kb del tamaño previsto y se clonó en el vector pCRII-TOPO™ (Invitrogen) y se secuenció completamente usando el estuche T7 DNA sequenase (Amersham). Consulte, SEQ. ID N°: 1 por la secuencia de ácidos nucleicos y SEQ. ID N°: 2 por la secuencia de aminoácidos deducida.
Ejemplo 8 Expresión del receptor Aunque en la técnica se dispone de una diversidad de células para la expresión de los receptores acoplados a proteína G, se prefiere la utilización de células eucariotas. En ciertas modalidades, se usan las células de mamíferos o melanóforas. Las técnicas siguientes son ilustrativas; los expertos en la materia tienen la capacidad de determinar las técnicas que son preferentemente beneficiosas para las necesidades del técnico. Consulte, por ejemplo, el Ejemplo 12, infra, que se refiere a melanóforos. a. Transfección transitoria El día uno, se siembran 6 x 106células 293/placa de 10 cm. El día dos, se preparan dos tubos de reacción (las proporciones para cada tubo son por placa): el tubo A se prepara mezclando 4 µ de ADN (por ejemplo, vector pCMV; vector pCMV con el ADNc del receptor, etc). en 0,5 mi de DMEM exento de suero (Gibco BRL); el tubo B se prepara mezclando 24 µ? de lipofectamina (Gibco BRL) con 0,5 mi de DMEM exento de suero. Los tubos A y B se mezclan por inversión (varias veces), seguido de incubación a temperatura ambiente durante 30-45 min. La mezcla se denomina "mezcla de transfección". Las células 293 sembradas en placas se lavan con 1 X PBS, seguido de la adición de 5 mi de DMEM exento de suero. Se agrega 1 mi de la mezcla de transfección a las células, seguido de incubación durante 4 h a 37 °C/5% de C02. La mezcla de transfección se extrae por aspiración, seguido de la adición de 10 mi de DMEM/10% de suero de feto de bovino. Las células se incuban a 37 °C/5% de C02. Después de 48 h de incubación, las células se cosechan y se utilizan para el análisis. b. Líneas celulares estables Aproximadamente 12 x 106 células 293 se siembran en una placa de cultivo tisular de 15 cm. Se cultivan en medio DME rico en glucosa que contiene diez por ciento de suero de feto de bovino y uno por ciento de piruvato de sodio, L-glutamina y antibióticos. Veinticuatro horas después de la siembra en placa de las células 293 (o hasta -80% de confluencia), las células se transfectan usando 12 µ9 de ADN (por ejemplo, vector pCMV-neor con ADNc del receptor). Los 12 µg de ADN se combinan con 60 µ? de lipofectamina y 2 mi de medio DME rico en glucosa sin suero. Se aspira el medio de las placas y las células se lavan una vez con medio sin suero. Se agregan a la placa el ADN, la lipofectamina y la mezcla de medio junto con 10 mi de medio sin suero. Luego de la incubación a 37 °C durante cuatro a cinco horas, se aspira el medio y se agregan 25 mi de medio que contiene suero. Veinticuatro horas después de la transfección, se vuelve a aspirar el medio y se agrega medio con suero recién preparado. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se aspira el medio y se agrega el medio con suero que contiene geneticina (fármaco G4 8) a una concentración final de aproximadamente Se siembran 12 x 106 células 293 en una placa de cultivo tisular de 15 cm. Se cultivan en medio DME rico en glucosa que contiene diez por ciento de suero de feto de bovino y uno por ciento de piruvato de sodio, L-glutamina y antibióticos. Veinticuatro horas después de la siembra en placas de las células 293 (o hasta ~80% de confluencia), las células se transfectan usando 12 µg de ADN (por ejemplo, vector pCMV con ADNc del receptor). Los 12 µg de ADN se combinan con 60 µ? de lipofectamina y 2 mi de medio DME rico en glucosa sin suero. Se aspira el medio de las placas y las células se lavan una vez con medio sin suero. Se agregan a la placa el ADN, la lipofectamina y la mezcla de medio junto con 10 mi de medio sin suero. Luego de la incubación a 37 °C durante cuatro a cinco horas, se aspira el medio y se agregan 25 mi de medio que contiene suero. Veinticuatro horas después de la transfección, se vuelve a aspirar el medio, y se agrega medio con suero recién preparado. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se aspira el medio y se agrega el medio con suero que contiene geneticina (fármaco G41 8) a una concentración final de 500 g/ml . Las células transfectadas se someten a selección para determinar las células transfectadas positivamente que contienen el gen de resistencia a G41 8. El medio se reemplaza cada cuatro a cinco d ías mientras se produce la selección. Durante la selección, las células se cultivan para crear mezclas estables, o se dividen para selección de clonación estable.
Ejemplo 9 Ensayos para la detección selectiva de compuestos candidatos como, por ejemplo, agonistas de GPR119 Se dispone de varios métodos para detectar selectivamente compuestos candidatos como, por ejemplo, agonistas de GPR1 1 9. Las técnicas siguientes son ilustrativas; los expertos en la materia tienen la capacidad de determinar las técnicas que son preferentemente beneficiosas para las necesidades del técnico. Las técnicas para la detección selectiva de compuestos como agonistas de un receptor acoplado a proteína G son bien conocidas por los técnicos con experiencia (consulte, por ejemplo, la Solicitud Internacional WO 02/42461 ). 1. Ensayos de unión a la membrana: Ensayo de r35S1GTPvS Cuando un receptor acoplado a proteína G está en su estado activo, ya sea como resultado de la unión del ligando o de activación constitutiva, el receptor se acopla a la proteína G y estimula la liberación de GDP y la subsiguiente unión de GTP a la proteína G. La subunidad alfa del complejo receptor-proteína G actúa como una GTPasa e hidroliza lentamente el GTP a GDP, punto en el cual el receptor normalmente se desactiva. Los receptores activados continúan intercambiando GDP por GTP. El análogo de GTP no hidrolizable, [35S]GTPyS, se puede utilizar para demostrar un aumento de la unión de [35S]GTPyS a las membranas que expresan receptores activados. La ventaja de usar la unión de [35S]GTPyS para medir la activación es que: (a) es genéricamente aplicable a todos los receptores acoplados a proteína G ; (b) es proximal a la superficie de la membrana haciendo menos probable que se tomen moléculas que afectan a la cascada intracelular.
El ensayo utiliza la capacidad de los receptores acoplados a proteína G para estimular la unión de [35S]GTPyS a las membranas que expresan los receptores pertinentes. El ensayo es genérico y tiene aplicación para el descubrimiento de fármacos en todos los receptores acoplados a proteína G.
Preparación de la membrana En algunas modalidades, las membranas que comprenden un receptor acoplado a proteína G de la invención y que se usan en la identificación de compuestos candidatos como , por ejemplo, agonistas del receptor, se preparan preferentemente de la manera siguiente: a. Materiales "Tampón de raspado de la membrana" compuesto de H EPES 20 mM y EDTA 1 0 mM , pH 7 ,4; "tampón de lavado de la membrana" compuesto de HEPES 20 mM y EDTA 0, 1 mM , pH 7 ,4; "tampón de unión" compuesto de HEPES 20 mM , NaCI 1 00 mM y MgCI2 10 mM , pH 7,4. b. Proced imiento Todos los materiales se mantendrán en hielo durante todo el procedimiento. En primer lugar, se aspirarán los medios de una monocapa de células confluyentes, seguido de enjuague con 10 mi de PBS frío, seguido de aspiración. A continuación , se agregarán 5 mi de tampón de raspado de la membrana para raspar las células; esto será seguido de la transferencia del extracto celular a tubos de centrífuga de 50 mi (centrifugados a 20.000 rpm durante 1 7 minutos a 4 °C). Posteriormente, se aspirará el sobrenadante y el sedimento se resuspenderá en 30 mi de tampón de lavado de la membrana seguido de centrifugación a 20.000 rpm durante 1 7 minutos a 4 °C. Después se aspirará el sobrenadante y el sedimento se resuspenderá en tampón de unión. Después esto se homogeneizará usando un homogenizador Brinkman Polytron™ ( 1 5-20 segundos hasta que todo el material esté en suspensión). A esto se denomina "proteína de membrana" Ensayo de proteína de Bradford Después de la homogeneización, se determinará la concentración de proteínas en las membranas usando el ensayo de proteína de Bradford (la proteína se puede diluir hasta aproximadamente 1 , 5 mg/ml , separar en alícuotas y congelar (-80 °C) para usar posteriormente; una vez congelada, el protocolo de uso es el siguiente: el día del ensayo, la proteína de membrana congelada se descongela a temperatura ambiente, seguido de agitación en vértex y después se homogeneiza con un Polytron a aproximadamente 12 x 1 .000 rpm durante aproximadamente 5-1 0 segundos; es de destacar que para múltiples preparaciones, el homogenizador se debe limpiar cuidadosamente entre la homogeneización de las diferentes preparaciones). a. Materiales Se utilizarán tampón de unión (como antes); reactivo de tinción de Bradford ; estándar de proteína de Bradford , siguiendo las instrucciones del fabricante (Biorad, N° de cat. 500-0006). b. Procedimiento Se prepararán tubos por duplicado, uno que incluya la membrana y uno como "testigo" de control . Cada uno con 800 µ? de tampón de unión. Posteriormente, se agregarán 10 pl de estándar de proteína de Bradford ( 1 mg/ml) a cada tubo, y después se agregarán 1 0 pl de proteína de membrana a un sólo tubo (no al testigo). Posteriormente, se agregarán 200 pl de reactivo de tinción de Bradford a cada tubo, seguido de agitación en vórtex de cada tubo. Después de cinco (5) minutos, los tubos se volverán a agitar en vórtex y el material se transferirá a cubetas. Las cubetas se leerán después usando un espectrofotómetro CECIL 3041 , a una longitud de onda de 595.
Ensayo de identificación a. Materiales El tampón de GDP consiste en 37,5 mi de tampón de unión y 2 mg de GDP (Sigma, N° de cat. G-7127), seguido de una serie de diluciones en tampón de unión para obtener GDP 0 ,2 µ? (la concentración final de GDP en cada pocilio fue GDP 0, 1 µ? ); cada pocilio comprende un compuesto candidato, tiene un volumen final de 200 µ? que consiste en 1 00 µ? tampón de GDP (concentración final , GDP 0, 1 µ ), 50 µ? de proteína de membrana en tampón de unión y 50 µ? de [35S]GTPyS (0,6 nM) en tampón de unión (2,5 µ? de [35S]GTPyS por 1 0 mi de tampón de unión). b. Proced i m iento Los compuestos candidatos se probarán preferentemente usando un formato de placa de 96 pocilios (éstos se pueden congelar a -80 °C). La proteína de membrana (o membranas con vector de expresión excluido el GPCR destinatario, como control ), se homogeneizará brevemente hasta que esté en suspensión. La concentración de proteína se determinará usando el ensayo de proteína de Bradford expuesto antes. La proteína de membrana (y el control) se diluirán a 0,25 mg/ml en tampón de unión (concentración final del ensayo, 1 2 ,5 pg/pocillo). Posteriormente, se agregaron 100 µ? de tampón de GDP a cada pocilio de un Wallac Scintistrip™ (Wallac). Se usará una herramienta tipo alfiler de 5 µ? para transferir 5 µ? de un compuesto candidato en dicho pocilio (es decir, 5 µ? en el volumen total del ensayo de 200 µ? es una relación 1 :40 de modo que la concentración final de detección selectiva del compuesto candidato es 10 µ?). Nuevamente, para evitar la contaminación, después de cada paso de transferencia la herramienta tipo alfiler se debe enjuagar en tres recipientes que contengan agua ( 1 X), etanol ( 1 X) y agua (2 X); se debe eliminar el exceso de l íquido por agitación de la herramienta después de cada enjuague y secar con papel y toallitas absorbentes. A partir de entonces, se agregarán 50 µ? de proteína de membrana a cada pocilio (también se utilizó un pocilio de control que contenía membranas sin el GPCR destinatario), y se preincubarán durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se agregarán 50 µ? de [35S]GTPyS (0,6 nM) en tampón de unión a cada pocilio, seguido de incubación en un agitador durante 60 minutos a temperatura ambiente (nuevamente, en este ejemplo, las placas se recubrieron con lámina metálica). Después el ensayo se detendrá mediante rotación de las placas a 4.000 rpm durante 1 5 minutos a 22 °C. Después las placas se aspirarán con un múltiple de 8 canales y se taparán con tapas para placas. Las placas se leerán en un Wallac 1450 usando el ajuste "Prot. N° 37" (según las instrucciones del fabricante). 2. Ensayo de adenililciclasa Se puede modificar un estuche de adenililciclasa Flash Píate™ (New England Nuclear; N° de cat. S P004A) diseñado para ensayos basados en células para usar con membranas plasmáticas crudas. Los pocilios Flash Píate pueden contener un recubrimiento centelleante que también contiene un anticuerpo específico que reconoce el A Pc. El AM Pc generado en los pocilios se puede cuantificar mediante una competición directa por la unión del trazador de AMPc radiactivo al anticuerpo de AM Pc. Lo que sigue sirve como un protocolo breve para la medición de los cambios en los niveles de AM Pc en las células que expresan los receptores.
En ciertas modalidades, se utiliza un estuche de adenililciclasa Flash Píate™ modificado (New England Nuclear; N° de cat. SM P004A) para la identificación de compuestos candidatos como, por ejemplo, agonistas de GPR1 19 de conformidad con el protocolo siguiente.
Las células transfectadas con un receptor acoplado a proteína G de la invención se cosechan aproximadamente tres días después de la transfección. Las membranas se preparan por homogeneización de las células suspendidas en tampón que contiene HEPES 20 mM , pH 7,4 y MgCI2 1 0 mM. La homogeneización se lleva a cabo en hielo usando un Brinkman Polytron™ durante aproximadamente 10 segundos. El homogeneizado resultante se centrifuga a 49.000 X g durante 1 5 minutos a 4 °C. Después el sedimento resultante se resuspende en tampón que contiene HEPES 20 mM , pH 7 ,4 y EDTA 0, 1 mM , se homogeneiza durante 1 0 segundos, seguido de centrifugación a 49.000 x g durante 1 5 minutos a 4 °C. Después el sedimento resultante se almacena a -80 °C hasta su utilización. El día de la detección selectiva por identificación directa, el sedimento de membrana se descongela lentamente a temperatura ambiente, se resuspende en tampón que contiene HEPES 20 mM, pH 7,4 y MgCI2 10 mM, para obtener una concentración final de proteína de 0,60 mg/ml (las membranas resuspendidas se colocan en hielo hasta su utilización).
Se preparan y se mantienen los estándares de AMPc y el tampón de detección (que comprende 2 pCi de trazador ([125l]cAMP (100 µ?) para 11 mi de tampón de detección)) de conformidad con las instrucciones del fabricante. El tampón del ensayo se prepara en el momento para la detección selectiva y contenía HEPES 20 mM, pH 7,4, MgCI2 10 mM, fosfocreatina 20 mM (Sigma), 0,1 unidades/ml de creatina fosfoquinasa (Sigma), GTP 50 µ? (Sigma) y ATP 0,2 mM (Sigma); después el tampón del ensayo se almacenó en hielo hasta su utilización.
Se agregan los compuestos candidatos, preferentemente, por ejemplo, a pocilios de placas de 96 pocilios (3 µ?/pocillo; concentración final del ensayo 12 µ?), junto con 40 µ? de proteína de membrana (30 pg/pocillo) y 50 µ? de tampón del ensayo. Esta mezcla se incuba después durante 30 minutos a temperatura ambiente, con agitación suave.
Después de la incubación, se agregan 100 µ? de tampón de detección a cada pocilio, seguido de la incubación durante 2-24 horas. Después las placas se cuentan en un lector de placas MicroBeta™ Wallac usando "Prot. N° 31" (según las instrucciones del fabricante). 3. Ensayo del reportero CRE-Luc Se siembran células 293 y 293T en placas de 96 pocilios a una densidad de 2 x 104 células por pocilio y al día siguiente se transfectaron usando reactivo de Lipofectamina (BRL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se prepara una mezcla de ADN/lípido para cada transfección de 6 pocilios de la manera siguiente: se mezclan suavemente 260 ng de ADN plasmídico en 100 µ? de D EM con 2 µ? de lípido en 100 µ? de DMEM (los 260 ng de ADN plasmídico consisten en 200 ng de plásmido reportero 8xCRE-Luc, 50 ng de pCMV que comprenden un receptor acoplado a proteína G de la invención o pCMV solo, y 10 ng de un plásmido de expresión GPRS (GPRS en pcDNA3 (Invitrogen)). El plásmido reportero 8XCRE-Luc se preparó de la manera siguiente: se obtuvo el vector SRIF-p-gal mediante clonación del promotor de somatostatina de rata (-71/+51) en el sitio BgIV-Hindill en el vector pPgal-Basic (Clontech). Se obtuvieron ocho (8) copias del elemento de respuesta de AMPc por PCR de una plantilla de adenovirus AdpCF126CCRE8 [consulte, Suzuki et al., Hum Gene Ther (1996) 7:1.883-1.893; cuya divulgación se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) y se clonó en el vector SRIF-p-gal en el sitio Kpn-BglV, que dio por resultado el vector reportero 8xCRE-p- gal. El plásmido reportero 8xCRE-Luc se generó por reemplazo del gen de beta-galactosidasa en el vector reportero 8xCRE-p-gal con el gen de luciferasa obtenido del vector pGL3-basic (Promega) en el sitio HindIII-BamHI. Después de 30 min de incubación a temperatura ambiente, la mezcla ADN/lípido se diluye con 400 µ? de DMEM y se agregan 1 00 µ? de la mezcla diluida a cada pocilio . Se agregan 100 µ? de DM EM con 1 0% de FCS a cada pocilio después de 4 h de incubación en una estufa de incubación de cultivo celular. Al día siguiente las células transfectadas se cambian con 200 µ?/pocillo de DM EM con 10% de FCS. Ocho (8) horas después, los pocilio se cambian a 100 µ? /pocilio de DMEM sin rojo fenol, después de un lavado con PBS. Se mide la actividad de luciferasa al día siguiente usando el estuche del ensayo del gen reportero LucLite™ (Packard) siguiendo las instrucciones del fabricante y se lee en un contador de centelleo y luminiscencia 1450 MicroBeta™ (Wallac).
Ejemplo 10 Ensayo de adenililciclasa en célula entera para determinar, por ejemplo, actividad agonista de GPR1 19 Las mediciones de AMP cíclico se hacen con un estuche de adenililciclasa Flash Píate™ (New England Nuclear) de acuerdo con el protocolo del proveedor. Se siembran células HEK293 en placas de cultivo tisular de 15 cm a una concentración de 1 2 x 106 células por placa en medio de crecimiento corriente (DMEM/10% de FBS). Al día siguiente, se transfectan 1 0 pg de vector de ADN vacío o de ADN plasmídico de expresión en células con lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad , CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 24 horas de cultivo, las células transfectadas se cosechan en tampón de disociación celular GIBCO (N° de cat.131 51 -014), se sedimentan por centrifugación durante 5 minutos a 1 .100 rpm , y se resuspenden con cuidado en un volumen apropiado del tampón del ensayo (50% de 1 x PBS y 50% de tampón de estimulación) para dar un recuento celular final de 2 x 1 06 células/ml . Se preparan los compuestos de prueba en 50 µ? de tampón del ensayo a la concentración de ensayo deseada cuando se indica, y se transfieren con pipeta a pocilios de una placa de 96 pocilios Flash Píate. Después se agregó la suspensión celular preparada antes (50 µ? por pocilio). Después de un tiempo de incubación de 60 minutos a temperatura ambiente, se ag regan 1 00 µ? de mezcla de detección que contiene trazador [1 25l] -AMPc a los pocilio. Las placas se incuban durante otras 2 horas seguido de recuento en un contador de centelleo MicroBeta Wallac. Los valores de AM Pc/pocillo se extrapolan de una curva estándar de AMPc que se incluye en cada placa de ensayo.
Un aumento en el nivel de AMPc en células HEK293 transfectadas con GPR1 1 9 con respecto al de las células HEK293 transfectadas con un vector vacío indica que el compuesto de prueba es un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor GPR1 19.
Ejemplo 1 1 Ensayo Homogéneo De Fluorescencia Resuelta En El Tiempo (HTRF® Para La Medición Directa De AMPc Se prueban los compuestos para ver qué compuestos estimulan al receptor GPR1 1 9, por ejemplo se buscan agonistas del receptor GPR1 1 9, usando el ensayo HTRF® para la medición directa de AM Pc (Gabriel et al, ASSAY and Drug Development Technologies, 1 :291 - 303, 2003) y células CHO-K1 recombinantes transfectadas establemente con el receptor GPR1 1 9. Se prueban los compuestos en busca de agonistas del receptor GPR1 19 , usando el ensayo HTRF® para la medición directa de AM Pc (Gabriel et al , ASSAY and Drug Development Technologies, 1 :291 -303, 2003) y células CHO-K1 recombinantes transfectadas establemente con el receptor GPR1 19. Las células CHO-K1 se obtienen de ATCC® (Manassas, VA; N° de catálogo CCL-61 ). Un agonista del receptor GPR1 1 9 se detecta en el ensayo HTRF® para la medición directa de AM Pc como un compuesto que aumenta la concentración de AMPc. El ensayo HTRF® también se usa para determinar los valores de CE50 para los agonistas del receptor GPR1 19.
Principio del ensayo : Se compra un estuche del ensayo HTRF® a Cisbio-US , Inc. (Bedford, MA; N° de catálogo 62AM4PEC). El ensayo HTRF® del estuche es un inmunoensayo competitivo entre AMPc endógeno producido por las células CHO-K1 y AMPc del trazador marcado con el colorante d2. La unión al trazador se visualiza como un anticuerpo monoclonal anti-AMPc marcado con Criptato. La señal específica (es decir, la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, FRET) es inversamente proporcional a la concentración de AMPc sin marcar en el estándar o la muestra.
Curva estándar: La relación de fluorescencia (665 nm/620 nm) de los estándares (0, 1 7 a 712 nM AMPc) incluida en el ensayo se calcula y se usa para generar una curva estándar de AMPc de acuerdo con las instrucciones del fabricante del estuche. La relación de fluorescencia de las muestras (compuestos de prueba o tampón del compuesto) se calcula y se usa para deducir las concentraciones de AM Pc respectivas por referencia a la curva estándar de AM Pc.
Montaje del ensayo: El ensayo HTRF® se lleva a cabo usando un protocolo de dos pasos esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante del estuche, en un volumen total de 20 pl por pocilio en un formato de placas de 384 pocilios (ProxiPlates; PerkinElmer, Fremont, CA; N° de catálogo 6008280). A cada uno de los pocilios experimentales se le transfieren 3.000 células CHO-K1 recombinantes en 5 µ? de tampón del ensayo (solución salina tamponada con fosfato que contiene cloruro de calcio y cloruro de magnesio ( I nvitrogen , Carlsbad , CA; N° de catálogo 1 4040) complementado con IBMX (1 00 µ?) y rolipram ( 10 µ? ) (inhibidores de la fosfodiesterasa; Sigma-Aldrich , St. Louis, MO; N° de catálogo I 5879 y N° de catálogo R6520, respectivamente) y 0, 1 % de fracción V de albúmina sérica bovina (BSA) (Sigma-Aldrich; N° de catálogo A3059)), seguido del compuesto de prueba en 5 µ? del tampón de ensayo o 5 µ? del tampón de ensayo. La placa se incuba después a temperatura ambiente durante 1 hora. A cada pocilio se le agregan después 5 µ? de conjugado de cAMP-d2 en tampón de lisis y 5 µ? de conjugado de Criptato en tampón de lisis y de acuerdo con las instrucciones del fabricante del estuche. La placa se incuba después a temperatura ambiente durante 1 hora, después de lo cual se lee la placa del ensayo.
Lectura del ensayo: La lectura del HTRF® se lleva a cabo usando un lector de microplacas PHERAstar (BMG LABTECH Inc. , Durham , NC) o EnVision™ (PerkinElmer, Fremont CA).
Ejemplo 12 Ensayo de melanóforos para, por ejemplo, actividad agonista de GPR1 19 Los melanóforos se mantienen en cultivo según informan Potenza et al [Pigment Cell Research ( 1 992) 5:372-378] y se transfectan con un vector de expresión que codifica un receptor GPR1 1 9 (GPR1 19; por ejemplo, GPR1 19 humano, N° de registro GenBank® AAP72 25 y sus alelos) usando electroporación . Después de la electroporación, las células transfectadas se distribuyen en placas de 96 pocilios para el ensayo . A contin uación , las cél ulas se cultivan durante 48 horas para que se recuperen del procedimiento de electroporación y para, que logren los máximos niveles de expresión del receptor.
El día del ensayo, el medio de cultivo de las células se reemplaza por un tampón sin suero que contiene melatonina 1 0 nM. La melatonina actúa en los melanóforos a través de un GPCR acoplado a Gi endógeno para reducir los niveles intracelulares de AM Pc. En respuesta a los menores niveles de AMPc, los melanóforos traslocan su pigmento al centro de la célula . El efecto neto de esto es una importante disminución en la lectura de absorbancia de la monocapa de células en el pocilio, medida a 600- 650 nM .
Después de 1 hora de incubación en melatonina, las células tienen el pigmento completamente agregado. En este punto se toma u na lectura de absorbancia inicial . Después se agregan diluciones seriadas de los compuestos de prueba a la placa y los compuestos que tienen actividad agonista de G P R 1 1 9 producen aumentos de los niveles intracelulares de AM Pc. En respuesta a estos mayores niveles de AM Pc, los melanóforos traslocan su pigmento nuevamente a la periferia celular. Después de una hora , las células estimuladas tienen el pigmento totalmente disperso . La monocapa de células en el estado disperso absorbe mucha más luz en el rango de 600-650 nm . El aumento medido de la absorbancia en comparación con la lectura inicial le permite a uno cuantificar el grado de estimulación del receptor y trazar una curva dosis-respuesta Los materiales y métodos que se refieren al ensayo con melanóforos se encuentran en U .S. Pat. N° 5,462 ,856 y 6 ,051 ,386 , cuyas divulgaciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad .
Un aumento en la dispersión del pigmento en los melanóforos transfectados con GPR1 1 9 con respecto al de los melanóforos transfectados con un vector vacío indica que el compuesto de prueba es un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor GPR1 19.
Otros ensayos para identificar un compuesto como agonista de GPR1 19 serán fácilmente evidentes para los técnicos con experiencia (consulte , por ejemplo, el Ejemplo 9, supra).
Ejem plo 13 Ensayo del reportero de levadura para, por ejemplo, actividad agonista de GPR1 19 Los ensayos de reportero basados en células de levadura fueron descritos previamente en la bibliografía (por ejemplo, consulte Miret et al, J Biol Chem (2002) 277:6.881 -6.887; Campbell et al , Bioorg Med Chem Lett ( 1999) 9:2.4 3-2.41 8; King et al, Science ( 1 990) 250: 1 21 -1 23; WO 99/1 4344; WO 00/1 2704; y US 6, 1 00,042). En resumen , las células de levadura fueron modificadas genéticamente de modo que G-alpha endógeno de levadura (GPA1 ) fue suprimido y reemplazado con G-proteínas quimeras construido usando múltiples técnicas. Además, el alfa-GPCR endógeno de levadura, Ste3 fue suprimido para permitir la expresión homologa de un GPCR de mamífero de elección . En la levadura , los elementos de la vía de transducción de la señal de feromonas, que están conservados en las células eucariotas (por ejemplo, la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno), conducen la expresión de Fus1 . Colocando la ß-galactosidasa (LacZ) bajo el control del promotor de Fus1 (Fusl p), se ha desarrollado un sistema medíante el cual la activación del receptor conduce a una lectura enzimática.
Las células de levadura son transformadas mediante una adaptación del método de acetato de litio descrito por el protocolo de Agatep et al (Agatep et al, 1998, Transformation of Saccharomyces cerevisiae by the lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol (LiAc/ss-DNA/PEG). Technical Tips Online, Trends Journals, Elsevier). En resumen, las células de levadura se cultivan durante toda la noche en placas de triptona levadura (YT).
Se transfieren con pipeta el ADN de una sola hebra del portador (10 pg), 2 pg de dos plásmidos reporteros Fus1p-LacZ (uno con marcador de selección URA y uno con TRP), 2 pg de GPR119 (por ejemplo, receptor humano) en el vector de expresión de levadura (2 pg origen de la replicación) y un tampón de acetato de litio/polietilenglicol/TE a un tubo Eppendorf. El plásmido de expresión de la levadura que contiene el control receptor/no tiene un marcador LEU. Se inoculan células de levadura en esta mezcla y la reacción se desarrolla a 30 °C durante 60 min. Después las células de levadura se someten a un choque de calor a 42 °C durante 15 min. A continuación las células se lavan y se extienden en placas de selección. Las placas de selección son de medio definido sintético para levaduras menos LEU, URA y TRP (SD-LUT). Después de la incubación a 30 °C durante 2-3 días, las colonias que crecen en las placas de selección son probadas en el ensayo de LacZ.
Para llevar a cabo ensayos enzimáticos fluorimétricos para ß- galactosidasa, se cultivan células de levadura que transportan el receptor GPR119 de la presente, durante toda la noche, en medio SD-LUT líquido hasta una concentración insaturada (es decir las células todavía se dividen y no alcanzaron todavía la fase estacionaria). Se diluyen en medio recién preparado hasta una concentración óptima del ensayo y se agregan 90 µ? de células de levadura a placas de poliestireno de fondo negro de 96 pocilios (Costar). Se agregan a las placas los compuestos de prueba, disueltos en DMSO y diluidos en una solución de DMSO al 10% hasta una concentración 10 X, y las placas se colocan a 30 °C durante 4 h. Después de 4 h, se agrega el sustrato para la ß-galactosidasa a cada pocilio. En estos experimentos, se usa Fluoresceína di (ß-D-galactopiranosida) (FDG), un sustrato para la enzima que libera fluoresceína, permitiendo una lectura fluorimétrica. Se agregan 20 µ? por pocilio de FDG 500 µ?/Triton al 2 ,5% X100 (el detergente es necesario para tornar las células permeables). Después de la incubación de las células con el sustrato durante 60 min, se agregan 20 µ? por pocilio de carbonato de sodio 1 M para terminar la reacción y potenciar la señal fluorescente. Después las placas se leen en un fluorímetro a 485/535 nm .
Un aumento en la señal fluorescente en las células de levadura transformadas con GPR1 1 9 con respecto a las transformadas con vector vacío indica que el compuesto de prueba es un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor GPR1 19 (por ejemplo, un compuesto que es un agonista o un agonista parcial de GPR1 19). En ciertas modalidades, los compuestos de la invención producen un aumento en la señal fluorescente por encima de la señal de fondo (la señal obtenida en presencia de vehículo solo).
Ejemplo 14 Compuesto Radiomarcado En ciertas modalidades, se radiomarca un compuesto que se sabe que es un ligando de un receptor acoplado a proteína G de la invención . Se puede usar un compuesto radiomarcado como el descrito aquí en un ensayo de cribado para identificar/evaluar compuestos. En términos generales, se puede evaluar la capacidad de un compuesto recién sintetizado o identificado (es decir, un compuesto de prueba) para reducir la unión al receptor del ligando conocido radiomarcado, mediante su capacidad para reducir la formación del complejo entre el ligando conocido radiomarcado y el receptor. Dichos radionúclidos que se pueden incorporar en los compuestos de la presente invención incluyen , pero no exclusivamente 3H (que también se escribe T), 1 C, 4C, 1 8F , 12 l , 82Br, 123l , 124l , 125l , 131 l , 75Br, 76Br, 1 50, 1 3N , 35S y 77Br. Los compuestos que incorporan 3H, 14C, 125l , 1 31 l , 35S o 82Br serán generalmente los más útiles.
Se comprende que un "compuesto radiomarcado" es un compuesto que ha incorporado al menos un radionúclido. En algunas modalidades, el radionúclido se selecciona del grupo que consiste en 3H , 1 4C, 1 25l , 35S y 82Br. En algunas modalidades, el radionúclido es 3H o C. Por otra parte, se debe entender que todos los átomos representados en los compuestos que son ligandos conocidos del receptor acoplado a proteína G de la invención, pueden ser o el isótopo que más comúnmente se da de dichos átomos o el radioisótopo o el isótopo no radiactivo más escaso.
Los métodos de síntesis para incorporar radioisótopos en compuestos orgánicos incluso los que se aplican a los compuestos que son ligandos conocidos del receptor acoplado a proteína G de la invención , son bien conocidos en la técnica e incluyen la incorporación de niveles de actividad de tritio en moléculas destinatarias: A. Reducción catalítica con gas tritio - Este procedimiento produce normalmente productos con una actividad específica alta y requiere precursores halogenados o insaturados. B. Reducción con borohidruro de sodio [3H] - Este procedimiento es más bien de bajo costo y requiere precursores que contienen grupos funcionales reducibles como los aldehidos, las cetonas, las lactonas, los ásteres y similares. C. Reducción con hidruro de litio y aluminio [3H] - Este procedimiento ofrece productos de casi todas las actividades específicas teóricas. También requiere precursores que contienen grupos funcionales reducibles como los aldehidos, las cetonas, las lactonas, los ésteres y similares. D. Marcado por exposición a gas tritio - Este procedimiento implica la exposición de los precursores que contienen protones intercambiables a gas tritio, en presencia de un catalizador adecuado. E. N-metilación usando yoduro de metilo [3H] - Este procedimiento se emplea habitualmente para preparar productos O-metilo o N-metilo (3H) tratando precursores apropiados con yoduro de metilo (3H) de actividad específica alta. Este método permite en general una actividad específica alta, como por ejemplo, de aproximadamente 80-87 Ci/mmol .
Los métodos de síntesis para incorporar niveles de actividad de 125l en las moléculas destinatarias incluyen: A. Reacciones de Sandmeyer y similares - Este procedimiento transforma un arilo o heteroarilamina en una sal de diazonio, como una sal de tetrafluoroborato y posteriormente en un compuesto marcado con 125l usando Na . Un procedimiento representativo fue informado por Zhu , D.-G y colaboradores en J. o0rg. Chem. , 2002, 67, 943-948. B. Orto 1 25Yodación de fenoles - Este procedimiento permite la incorporación de 1 25l en la posición orto de un fenol como fue informado por Collier, T. L. y colaboradores en J. Labelled Compd. Radiopharm. 1999, 42, S264-S266. C. I ntercambio de bromuro de arilo y heteroarilo con 125l - Este método es en general un proceso en dos pasos. El primer paso es la conversión del bromuro de arilo o heteroarilo en el correspondiente producto intermedio de tri-alquilestaño usando, por ejemplo, una reacción catalizada por Pd [es decir Pd(Ph3P)4] o a través de un aril o heteroaril litio, en presencia de un haluro de tri-alquilestaño o hexaalquildiestaño [por ejemplo, (CH3)3SnSn(CH3)3]. Un procedimiento representativo fue informado por Bas, M .-D. y colaboradores en J. Labelled Compd. Radiopharm. 2001 , 44, S280-S282.
Las técnicas precedentes están destinadas a ser ilustrativas y no limitantes. Otras técnicas para radiomarcar un compuesto que es un ligando conocido de un receptor acoplado a proteína G de la invención son bien conocidas por los técnicos con experiencia .
Ejemplo 1 5 Ensayo de Unión al Receptor Se puede evaluar la capacidad de un compuesto de prueba para reducir la formación del complejo entre un compuesto que se sabe que es un ligando del receptor acoplado a proteína G de la invención y el receptor. En ciertas modalidades, el ligando conocido esta radiomarcado. Se puede usar un ligando conocido radiomarcado en un ensayo de cribado para identificar/evaluar compuestos. En términos generales, se puede evaluar la capacidad de un compuesto recién sintetizado o identificado (es decir, un compuesto de prueba) para reducir la unión al receptor del ligando conocido radiomarcado, mediante su capacidad para reducir la formación del complejo entre el ligando conocido radiomarcado y el receptor.
Un nivel de unión específica del ligando conocido radiomarcado en presencia del compuesto de prueba menor que un nivel de unión específica del ligando conocido radiomarcado en ausencia del compuesto de prueba indica que se forma menos del complejo entre dicho ligando conocido radiomarcado y dicho receptor en presencia del compuesto de prueba que en ausencia del compuesto de prueba.
Protocolo del ensayo para detectar el complejo entre un compuesto que es un ligando conocido del receptor acoplado a proteína G de la invención v el receptor A. Preparación del receptor Se transfectan transitoriamente células 293 con 10 pg de vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un receptor acoplado a proteína G de la invención usando 60 µ? de lipofectamina (por placa de 1 5 cm). Las células transfectadas transitoriamente se cultivan en la placa durante 24 horas (75% de confluencia) con un cambio de medio y se extraen de la placa con 10 ml/placa de tampón Hepes-EDTA (Hepes 20 mM + EDTA 10 mM , pH 7,4). A continuación las células se centrifugan en una centrífuga Beckman Coulter durante 20 minutos, 17.000 rpm (rotor JA-25.50). Posteriormente, el sedimento se resuspende en Hepes 20 mM + EDTA 1 mM, pH 7,4 y se homogeneiza con un homogenizador Dounce de 50 mi y se vuelve a centrifugar. Después de separar el sobrenadante, los sedimentos se almacenan a -80 °C, hasta que se usan en el ensayo de unión. Cuando se usan en el ensayo, las membranas se descongelan en hielo durante 20 minutos y después se les agregan 10 ml_ de tampón de incubación (Hepes 20 mM, MgCI2 1 mM, NaCI 100 mM, pH 7,4). Después las membranas se agitan en un vértex para resuspender el sedimento de membranas crudas y se homogeneizan con un homogenizador Brinkmann PT-3100 Polytron durante 15 segundos en la posición 6. La concentración de proteína de membrana se determina usando el ensayo de proteína BRL Bradford.
B. Ensayo de unión Para una unión total, s§ agrega un volumen total de 50 pl de membranas apropiadamente diluidas (diluidas en tampón del ensayo que contiene Tris HCI 50 mM (pH 7,4), MgCI2 10 mM y EDTA 1 mM; 5-50 pg de proteína) a placas de microtitulación de polipropileno de 96 pocilios seguido de la adición de 100 µ? de tampón del ensayo y 50 pl de un ligando conocido radiomarcado. Para una unión no específica, se agregan 50 µ? de tampón del ensayo en vez de 100 µ? y otros 50 µ? de 10 µ? dicho ligando conocido que no está radiomarcado se agrega antes de que se agreguen 50 µ? del ligando conocido radiomarcado. Después se incuban las placas a temperatura ambiente durante 60-1 20 minutos. La reacción de unión se termina filtrando las placas de ensayo a través de una placa filtrante de Microplate Devices GF/C Unifilter con un cosechador de placas de 96 pocilios Brandell seguido de lavado con Tris HCI 50 mM frío, pH 7,4 que contiene NaCI al 0,9 % . Luego, el fondo de la placa de filtración se sella, se agregan 50 µ? de Optiphase Supermix a cada pocilio, la parte superior de las placas se sella y las placas se cuentan en un contador de centelleo Trilux MicroBeta. Para determinar si se forma menos del complejo entre dicho ligando conocido radiomarcado y dicho receptor en presencia de un compuesto de prueba, en vez de agregar 1 00 µ? de tampón del ensayo, se agregan 100 µ? de dicho compuesto de prueba apropiadamente diluido a los pocilios correspondientes, seguido de la adición de 50 µ? de dicho ligando conocido radiomarcado.
C. Cálculos Los compuestos de prueba se ensayan inicialmente a concentraciones de 10, 1 y 0, 1 µ? y después a un rango de concentraciones elegido de modo que la dosis del medio cause aproximadamente un 50% de inhibición de la unión del ligando conocido radiomarcado (es decir, Cl50). La unión específica en ausencia del compuesto de prueba (B0) es la diferencia entre la unión total (BT) y la unión no específica (NSB) y de la misma manera la unión específica (en presencia del compuesto de prueba) (B) es la diferencia entre la unión de desplazamiento (BD) y la unión no específica (NSB). Cl50 se determina a partir de una curva de respuesta a la inhibición, graficando logit-log de B/B0 en % frente a la concentración del compuesto de prueba.
K¡ se calcula mediante la transformación de Cheng y Prustoff: K¡ =CI50/( 1 + [L]/KD) donde [L] es la concentración del ligando conocido radiomarcado usado en el ensayo y KD es la constante de disociación del ligando conocido radiomarcado determinada independientemente en las mismas condiciones de unión .
Ejemplo 16 Efecto de un agonista de GPR1 19 sobre la secreción de PYY en células enteroendocrinas o en célu las de tejido derivado de una región del intestino que contiene células L o en células capaces de secretar PYY Se puede demostrar que un agonista de GPR1 19 de conformidad con la presente invención estimula la secreción de PYY en una célula enteroendocrina, por ejemplo, una línea celular enteroendocrina, o en células como las células enteroendocrinas de tejido derivado de una región del intestino que contiene células L [por ejemplo, tejido de duodeno, yeyuno, íleo, colon, o recto; consulte, por ejemplo, Lundberg et al , PNAS USA ( 1982) 79:4471 - 4475; Adrián et al , Gastroenterol (1 985) 89: 1070-1077; Ekblad et al , Peptides (2002) 23:251 -261 ; Ueno et al, Regul Pept (2008) 145: 12- 16)] o en células capaces de secretar PYY usando el ensayo in vitro descrito aquí. Se siembran células enteroendocrinas o células como las células entero-endocrinas de tejido derivado de una región del intestino que contiene células L en placas de 24 pocilios el día uno en medio de cultivo completo (DM EM/1 0% de FBS ). El día dos se reemplaza el medio de cultivo con medio con bajo contenido de glucosa (DM EM/glucosa 3 mM/1 0% de FBS). El día tres las células se lavan dos veces con 1 x PBS. Las células lavadas son estimuladas con vehículo o con agonista de GPR1 1 9 a diferentes concentraciones (por ejemplo, en el rango de 1 nM a 20 µ? ) o con foskolin ( 1 µ ?) como un control positivo en DMEM exento de suero con glucosa 1 5 mM , durante una hora a 37 °C y 5% de C02, en una estufa de incubación de cultivo tisular. Después se recogen los sobrenadantes y se clarifican por centrifugación a 500 g y 4 °C durante 5 minutos. Se determina el PYY total liberado en el sobrenadante usando un estuche de EIA de PYY comprado a Phoenix Pharmaceuticals, I nc. Estuche de EIA (Péptido YY (PYY) (Rata, Ratón, Porcino, Canino), N° de catálogo EK-059-03) de acuerdo con las instrucciones provistas con el estuche.
Está expresamente contemplado que las células capaces de secretar PYY incluyen, pero no exclusivamente, una célula enteroendocrina, como puede ser una línea celular enteroendorina , una célula como puede ser una célula enteroendocrina de tejido derivado de una región del intestino que contiene células L, una célula alfa de los islotes de Langerhans, una línea celular derivada de los islotes de Langerhans como puede ser RI Nm5F (Bargsten , Arch Histol Cytol (2004) 67:79-94), una célula como una célula neuronal como puede ser de tejido de la médula oblongada, una línea celular neuronal y una célula recombinante.
Ejemplo 17 Efectos in vivo de un agonista de GPR119 sobre aterogénesis en ratones Se alimentan ratones machos apoE"'" (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) con comida normal. El ratón que carece de apolipoproteina (apoE"'") es un modelo animal establecido de aterosclerosis, que desarrolla extensas lesiones ateroscleróticas con una dieta de comida [Zhang et al, Science (1992) 258:468-471]. A las 12 semanas de edad, se les administra un agonista de GPR119 o vehículo solo diariamente por vía oral. Una dosis preferida del agonista de GPR119 es 0,1-100 mg/kg. Otra dosis preferida se selecciona del grupo que consiste en 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg.
Los ratones se anestesian con una inyección intraperitoneal de pentobarbital (50 mg/kg) y se extraen los corazones que contienen el seno aórtico y el arco aórtico 14 días después de la administración del agonista de GPR119. También se extraen los corazones de ratones sin manipular al comienzo del experimento. Se usan diez ratones para cada uno de los tres grupos experimentales.
Los cortes transversales (10 µ? de espesor) de seno aórtico congelados incluidos en compuesto Optimal Cutting Temperature (OCT; Sakura Finetechnical Co., Ltd) después de la fijación durante toda la noche en formalina al 10% se montan en portaobjetos. Para el análisis del tamaño de la placa, se tiñeron 3 cortes ( 1 00 µ? cada pedazo) de cada ratón con Rojo-O al aceite. El tamaño de las lesiones y el diámetro de las gotas de lípido en las lesiones se cuantifican con un programa informático de análisis de imágenes, y se determinan los valores medios. El valor medio para el grupo al que se le administró el agonista de GPR1 19 se compara con el valor medio del grupo al que se le administró vehículo solo.
Los datos se presentan como medias + EEM y se analizan mediante la prueba t de Student o la prueba U de Mann-Whitney, dependiendo de su patrón de distribución. Un valor de P<0,05 se considera estad ísticamente significativo. Consulte, por ejemplo, Okamoto et al , Circulation (2002) 106:2.767-2.770.
Estos resultados pueden demostrar que el agonista de GPR1 1 9 es un inhibidor de la aterogénesis.
Está expresamente contemplado que en otra modalidad se pueda demostrar que un agonista de GPR1 1 9 es un inhibidor de la aterogénesis en los ratones ApoE"'" usando una técnica in vivo no invasiva [consulte, por ejemplo, Fayad et al , Circulation (1 998) 98: 1 541 -1 547]. Está expresamente contemplado que en otra modalidad, la administración del agonista no sea oral , por ejemplo que la administración del agonista sea intraperitoneal o intravenosa. Está expresamente contemplado que en otra modalidad , el tratamiento no comienza a las 1 2 semanas de edad, comienza o bien antes o bien después de las 12 semanas de edad. Está expresamente contemplado que en otra modalidad el tratamiento continúe durante más o menos de 14 días. Está expresamente contemplado que la administración no sea diaria.
Ejemplo 18 Efectos in vivo de un agonista de GPR119 sobre artritis inflamatoria crónica en ratones Se usan ratones MRL-/pr tanto machos como hembras (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) a las 13-14 semanas de edad. Los ratones MRL-lpr desarrollan espontáneamente una artritis inflamatoria crónica con características similares a la artritis reumatoide humana que incluye infiltración celular, formación de paño, ruptura ósea o de cartílago y la presencia de factor reumatoide sérico. La enfermedad se presenta normalmente hacia el final de la vida del animal; sin embargo, la inyección con adyuvante completo de Freund (ACF) "inicia un comienzo precoz y aumenta la gravedad de la artritis [Rakay et al, J Immunol (1993) 151:5081-5087].
El día 0 de cada experimento, a todos los grupos de ratones se les inyecta por vía intradérmica ACF en un sito torácico e inguinal con 0,05 mi de AFC complementado hasta 10 mg/ml con H37 Ra de Mycobacterium tuberculosis inactivado por calor (Difco, Detroit, MI). Inmediatamente, se les administra un agonista de GPR119 o vehículo solo diariamente por vía oral. Una dosis preferida del agonista de GPR119 es 0,1-100 mg/kg. Otra dosis preferida se selecciona del grupo que consiste en 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg.
El tratamiento se continúa durante 30 días. Para cuantificar la inflamación , se miden los anchos de los tobillos con un micrómetro. La comparación estadística de conjuntos apareados de medidas del ancho del tobillo se lleva a cabo usando la prueba f de Student.
Análisis histopatolóq ico El día 30 después de cebar con ACF, se fijan las patas traseras en formalina tamponada. Después de la descalcificación en ácido fórmico al 10% durante 48 horas, los tejidos se procesan para la inclusión en parafina. Los cortes seriados de las articulaciones tarsometatarsianas se cortan de un espesor de 5 mm y se tiñen con hematoxilina y eosina. Los cortes son examinados por un individuo sin conocimiento del protocolo experimental . Se evalúa un mínimo de 10 cortes/articulación y se puntúan para proporcionar una medida semicuantitativa de la inflamación subsinovial (0, normal; 1 infiltrados inflamatorios focales; 2, infiltrado inflamatorio que domina la histología celular), hiperplasia sinovial (0, normal ; 1 , uñ recubrimiento sinovial continuo de un mínimo de tres capas de espesor visto en una articulación; 2, un recubrimiento sinovial de un mínimo de tres capas de espesor en varias articulaciones), formación de paño y erosión de cartílago (0, normal; 1 , superficies del cartílago parcialmente cubiertas por paño sin pérdida evidente de cartílago; 2, paño conectado a una pérdida evidente de cartílago), destrucción ósea *(0, normal; 1 , destrucción ósea detectable por el paño o la actividad osteoclástica; 2, el paño o la actividad osteoclástica destruyeron una parte importante del hueso), y finalmente, toda la patología es la evaluación general derivada de la sumatoria de los valores de estos criterios [consulte, por ejemplo, Gong et al, J Exp Med (1997) 186:131-137]. El análisis estadístico de los índices histopatológicos se hace usando la prueba f de Student.
Estos resultados pueden demostrar que el agonista de GPR119 es un inhibidor de una artritis inflamatoria crónica, por ejemplo que el agonista de GPR119 es un inhibidor de la artritis reumatoide.
Está expresamente contemplado que en otra modalidad, la administración del agonista no sea oral, por ejemplo que la administración del agonista sea intraperitoneal o intravenosa. Está expresamente contemplado que en otra modalidad, el tratamiento no comience a las 13-14 semanas de edad, comience o bien antes o bien después de las 13-14 semanas de edad. Está expresamente contemplado que en otra modalidad el tratamiento continúe durante más o menos de 30 días. Está expresamente contemplado que la administración no sea diaria.
Ejemplo 19 Reducción de una lesión en el colon de un modelo animal para enfermedad intestinal inflamatoria Se demostró que un agonista de GPR119 confiere protección contra la enfermedad inflamatoria intestinal usando un modelo animal esencialmente como el descrito en WO 03/105763.
Métodos Preparación de los animales: Se alojan ratas HSD machos de 10-11 semanas de edad, que pesan 250-300 gramos, en un ciclo 12:12 luz:oscuridad, y se les permite el acceso ad libitum a una dieta para roedores estándar (Taklad L M 485, Madison, Wl) y agua. Los animales se dejan en ayunas durante 24 horas antes del experimento.
Procedimiento: Un modelo simple y reproducible de inflamación de colon crónica en ratas fue descrito previamente por Morris et al (Gastroenterology (1989) 96:795-803). Presenta una duración relativamente larga de la inflamación y la ulceración, ofreciendo una oportunidad para estudiar la fisiopatología de la enfermedad inflamatoria del colon de manera específicamente controlada, y para evaluar nuevos tratamientos potencialmente aplicables a la enfermedad inflamatoria intestinal en los seres humanos.
Se anestesia a las ratas con isoflurano al 3% y se las coloca sobre una almohadilla de calor regulado fijada a 37 °C. Se introduce una aguja de alimentación rectalmente en el colon 7 cm. Se suministra el hapteno ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) disuelto en etanol al 50% (v/v) en el lumen del colon a través de la aguja de alimentación a una dosis de 30 mg/kg , en un volumen total de 0,4-0,6 mL. Los grupos de control reciben solución salina (NaCI 0,9%) intracolónicamente.
Cuatro días después de la inducción de la colitis, se diseca el colon de las ratas anestesiadas que después son sacrificadas por decapitación . Se miden los pesos del colon y el bazo extirpados y el colon se fotografía para puntuar el daño morfológico grueso de acuerdo con la escala de clasificación (0 = no hay daño, 1 = hiperemia localizada pero sin úlceras, 2 = úlceras lineales sin una inflamación importante, 3 = úlceras lineales con inflamación en un sitio, 4 = dos o más sitios de ulceración y/o inflamación , 5 = dos o más sitios importantes de inflamación y ulceración o un sitio importante de inflamación y ulceración que se extiende >1 cm a lo largo de la longitud del colon) antes de la división en 3 partes. El segmento de colon a 1 cm del ciego se fija en formalina al 1 0% Otros segmentos se congelan inmediatamente en hielo seco .
La inflamación se define como regiones de hiperemia y engrosamiento de la pared intestinal Los cólones son observados independientemente por varios observadores a ciegas con respecto al tratamiento experimental .
Para este ensayo, se establecen 5 grupos de tratamiento de la manera siguiente: Grupo A (n = 3): solución salina intracolónica con con tratamiento oral solución salina; Grupo B (n = 8): tratamiento oral de solución salina antes de la inducción de colitis mediante 30 mg/kg de TNBS; Grupo C (n = 1 0): Grupo experimental : tratamiento oral de agonista de GPR1 19 (a una dosis por ejemplo de 30 mg/kg) dos veces al día durante: 2 días antes, 2 días después y 30 min antes de la inducción de colitis mediante 30 mg/kg de TNBS.
Grupo D (n = 9), Control positivo: inyección intramuscular de Depo- edrol 600 pg/kg 60 min antes de la inducción de colitis mediante 30 mg/kg de TNBS; Grupo E (n = 10), Control positivo, administración intracolónica de suspensión de ácido 5-amino saiicíiico (Sigma) a 200 mg/kg en 0,5 mL de solución salina, 60 min antes de la inducción de colitis y diariamente a partir de entonces.
Una dosis preferida del agonista de GPR1 19 es 0, 1 -100 mg/kg.
Otra dosis preferida se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 mg/kg , 0,3 mg/kg , 1 ,0 mg/kg, 3,0 mg/kg , 10 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg .
Está expresamente contemplado que en otra modalidad, la administración del agonista no sea oral, por ejemplo que la administración del agonista sea subcutánea o intravenosa.
Ejemplo 20 Efecto de un agonista de GPR1 19 sobre las convulsiones por kai nate en ratones Se puede demostrar que un agonista de GPR1 1 9 confiere protección contra las convulsiones kainate en ratones usando el modelo animal esencialmente como describen Woldbye et al (Neurobiology of Disease (2005) 20:760-772).
Se administra a ratones N RI machos (Taconic M&B , DK; 23- 30 g) por vía oral un agonista de GPR1 1 9 a dosis, por ejemplo, de 0,2, 1 , 10, 20 ó 30 mg/kg (n = 7-8) en un vehículo que contiene albúmina de suero bovino al 0,05% en solución salina tamponada con fosfato 1 0 mM (PBS , NaCI 0, 1 3 , Na2HP04 7 mM , NaH2P04 3 mM ). Un grupo de control recibe sólo vehículo por vía oral (n = 28). Cinco minutos más tarde, todos los animales reciben una inyección subcutánea de kainate disuelto en solución salina isotónica ajustada a pH 7,4 (30 mg/kg; N° 2020, Ocean Produce International , Canadá); la intensidad de las convulsiones se puntúa de acuerdo a la escala de clasificación modificada de Marsh et al (PNAS USA ( 1 999) 96: 1 3.51 8-1 3.523): 0 = sin actividad convulsiva, 1 = ausencias o movimientos faciales, 2 = cabeceos o temblores aislados, 3 = convulsión motora con temblores en las patas delanteras, 4 = convulsión motora con empinamiento, 5 = convulsión motora con pérdida de la postura o estado epiléptico (al menos 1 0 minutos de actividad convulsiva motora continua), 6 = muerte. El puntaje de la convulsión y las latencias para la primera convulsión motora (cuando el puntaje es al menos 3) y la convulsión motora con pérdida de la postura son determinadas para cada grupo de tratamiento por un observador que está a ciegas respecto a la identidad de los ratones.
Una dosis preferida del agonista de G PR1 19 es 0, 1 -1 00 mg/kg.
Otra dosis preferida se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 mg/kg , 0,3 mg/kg, 1 ,0 mg/kg , 3,0 mg/kg, 1 0 mg/kg , 30 mg/kg y 100 mg/kg .
Está expresamente contemplado que en otra modalidad , la administración del agonista no sea oral, por ejemplo que la administración del agonista sea intraperitoneal o intravenosa. Está expresamente contemplado que la inyección subcutánea de kainate pueda aplicarse alternativamente en algún momento posterior a la administración del agonista de GPR1 1 9 mayor a 5 minutos.
Ejemplo 21 Efecto de un agonista de GPR119 sobre el consumo de alimentos en ratones magros Se puede demostrar que un agonista de GPR1 1 9 disminuye el consumo de alimentos usando ratones magros que ayunaron-se volvieron a alimentar esencialmente como describen Ortiz et al (J PET (2007) 323:692-700).
Se aclimataron ratones magros C57BL/6 (Taconic Farms, Germantown, NY) durante un mínimo de una semana con temperatura y humedad controladas en un ciclo de 12 h de luz/oscuridad. Los ratones se alojan en pares en jaulas con piso de rejilla con alimento y agua (con una dieta de comida en pélet estándar) continuamente disponibles. Un estudio incluye 20 razones por grupo de tratamiento. Los ratones se mantienen en ayunas durante toda la noche (18 h) con agua disponible durante la fase de oscuridad y se les administra por vía oral agonista de GPR1 19 (a una dosis, por ejemplo, de 30 mg/kg) en solución salina USP o sólo vehículo. Se les proporciona comida prepesada 30 min después de la dosificación y se mide el consumo acumulativo de alimentos en el transcurso de 72 h (por ejemplo, a 1 h , a las 2 h, a las 4 h , a las 24 h, a las 48 h y a las 72 h).
Una dosis preferida del agonista de GPR1 19 es 0, 1 -1 00 mg/kg. Otra dosis preferida se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 mg/kg , 0,3 mg/kg , 1 ,0 mg/kg , 3,0 mg/kg, 1 0 mg/kg , 30 mg/kg y 100 mg/kg .
Está expresamente contemplado que en otra modalidad, la administración del agonista no sea oral , por ejemplo que la administración del agonista sea intraperitoneal o intravenosa.
Ejemplo 22 Efecto del agonista de GPR1 19 sobre el peso corporal y la adiponectina plasmática en ratones con obesidad inducida por la dieta (OID) Se puede demostrar que un agonista de GPR1 1 9 proporciona una reducción en el peso corporal y un aumento de la adiponectina plasmática usando ratones con obesidad inducida por la dieta (OI D) esencialmente como describen Ortiz et al (JPET (2007) 323:692-700).
Se alimentan ratones C57BL/6 machos (Taconic Farms) con una dieta rica en grasas que contiene 45% de calorías provenientes de las grasas (dieta para roedores D12451 ; Research Diets, Inc. , New Brunswick, NJ) durante 20 a 22 semanas, y tienen un peso corporal promedio más de aproximadamente 5 DE mayor que los ratones alimentados con una dieta de comida en pélet estándar (5% de calorías provenientes de las grasas). Un estudio incluye 10 ratones por grupo de tratamiento. Los ratones se mantienen en bioterios estándar a temperatura y humedad controladas en un ciclo de 12/12 h de luz y oscuridad . El agua y la comida están continuamente disponibles. Los animales se adaptan a las jaulas de piso de rejilla durante 4 días y se les administra vehículo (solución salina USP) durante otros 4 d ías antes del registro de 2 días de peso corporal inicial y 24 h de consumo de comida y agua. A los ratones se los asigna a grupos de tratamiento basándose en sus pesos corporales de modo que la media inicial y el error estándar de la media del peso corporal sea similar. A los animales se les administra agonista de GPR1 1 9 (a una dosis, por ejemplo, de 30 mg/kg) en solución salina USP o sólo vehículo por vía oral cada d ía antes la fase de oscuridad, y se miden el peso corporal y el consumo de comida y agua. Los animales son dosificados diariamente durante 40 d ías.
Se les extrae sangre el día 40 mediante sangrado retroorbital para el análisis de adiponectina; se mide la adiponectina plasmática usando un estuche de ELISA para adiponectina de ratón (N° de catálogo EZMADP-60K; Millipore Corp. , Billerica , MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Una dosis preferida del agonista de GPR1 19 es 0, 1 -100 mg/kg . Otra dosis preferida se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 ,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg .
Está expresamente contemplado que en otra modalidad, la administración del agonista no sea oral , por ejemplo que la administración del agonista sea subcutánea o intravenosa .
Ejemplo 23 Efecto de un agonista de GPR1 19 sobre la glucosa plasmática, la insulina plasmática v la eliminación de glucosa en ratones con obesidad inducida por la dieta (OID) Se puede demostrar que un agonista de GPR1 1 9 proporciona mejoras favorables en los parámetros metabólicos de ratones con obesidad i nd ucida por la dieta (OI D ) asociados con riesgo de diabetes tipo 2 , como la eliminación de glucosa (para au mentar la el imi nación de glucosa en ratones en ayunas, por ejemplo, la elimi nación de glucosa después de una prueba de TGO), el nivel de gl ucosa plasmático (para dismi nui r la glucosa sangu ínea en ratones alimentados), el nivel de i nsulina plasmática (para aumentar la insulina plasmática en ratones en ayunas), esencialmente como describen Ortiz et al (JPET (2007) 323:692-700).
Se alimentan ratones C57BL/6 machos (Taconic Farms) con una dieta rica en grasas que contiene 45% de calorías provenientes de las grasas (dieta para roedores D 1 2451 ; Research Diets , Inc. , New Brunswick, NJ ) durante 20 a 22 semanas, y tienen un peso corporal promedio de más de 5 DE mayor que los ratones alimentados con una dieta de comida en pélet estándar (5% de calorías provenientes de las grasas). Un estudio i ncluye 1 0 ratones por grupo de tratamiento. Los ratones se mantienen en bioterios para animales estándar a temperatura y humedad controladas en un ciclo de 1 2/1 2 h de luz y oscuridad . El agua y la comida están continuamente disponibles. Los animales se adaptan a las jaulas de piso de rejilla durante 4 días y se les administra veh ículo (solución salina US P) d urante otros 4 días antes del registro de 2 d ías de peso corporal inicial y 24 h de consumo de comida y ag ua. A los ratones se los asigna a los grupos de tratamiento basándose en sus pesos corporales de modo que la media i nicial y el error estándar de la media del peso corporal sea similar.
A los animales se les administra agonista de GPR119 por vía oral (a una dosis, por ejemplo, de 30 mg/kg) en solución salina USP o sólo vehículo, cada día, antes de la fase de oscuridad. Los animales son dosificados diariamente durante 11 días. Se extraen muestras de sangre de la cola de los ratones alimentados y se analizan con un glucosímetro Ascensia (Bayer Healthcare, Tarrytown, NY) el día 10 del tratamiento. Se les retira la comida 5 h en la fase de alimentación, y los animales se dejan en ayunas durante 14 h antes de la extracción de sangre por sangrado retroorbital para el análisis de insulina. Se realiza una prueba de tolerancia a la glucosa oral (TGO) 2 h después del sangrado retroorbital luego de la administración de glucosa 2 g/kg, y se mide la glucosa en sangre de la cola a intervalos de 30 min durante 3 h. Se mide la insulina mediante un ensayo de enzimoinmunoanálisis de adsorción (EIA) (Alpco Diagnostics, Windham, NH).
Una dosis preferida del agonista de GPR119 es 0,1-100 mg/kg. Otra dosis preferida se selecciona del grupo que consiste en 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg.
Está expresamente contemplado que en otra modalidad, la administración del agonista no sea oral, por ejemplo que la administración del agonista sea subcutánea o intravenosa. Está expresamente contemplado en otra modalidad, que la prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT) se realice 2 h después del sangrado retroorbital luego de la administración intraperitoneal de 2 g/kg de glucosa Ejem plo 24 Efecto de un agonista de GPR1 19 sobre la circulación sanguínea depend iente de la colateral en un modelo de insuficiencia arterial periférica en ratas N Se puede demostrar que un agonista de GPR1 1 9 aumenta la circulación sangu ínea dependiente de la colateral usando un modelo de insuficiencia arterial periférica de comienzo agudo en ratas, que es característica de una enfermedad oclusiva de los grandes vasos que se presenta a menudo con síntomas de claudicación intermitente, esencialmente como describen Cruze et al (Peptides (2007) 28:269-280).
Se estableció insuficiencia arterial periférica en ratas Sprague Dawley machos adultas (325-350 g; Taconic Farms, Inc). con oclusión bilateral de las arterias femorales distal respecto al ligamento inguinal . En el mismo procedimiento quirúrgico, se introduce un catéter conectado a una bomba osmótica (Alzet®) de 1 4 días en la arteria il íaca para infusión cerca del sitio de la expansión colateral, para el suministro sistémico de factor de crecimiento vascular-A (residuos 1 -165) (VEGF 65) a una dosis de 1 5 g/kg/d ía; se administran el agonista de GPR1 1 9 (a una dosis, por ejemplo, de 30 mg/kg) y vehículo solo (solución salina tamponada con fosfato, citrato de sodio al 10%, glicerol al 1 ,6% , Tween 20 al 0,008%) diariamente por vía oral . Todos los agentes se suministran y administran a ciegas para los investigadores. Se mide la circulación sanguínea el día 16 para eliminar cualquier efecto agudo del agonista de GPR119 o de VEGF165 sobre la circulación sanguínea. Se determina la circulación sanguínea muscular a ciegas, utilizando microesferas radiomarcadas durante la corrida en cinta sin fin, según describen Yang et al (Am J Physiol Heart Circ Phys (2000) 278:H1966-H1973). La dosis de VEGF165 utilizada (15 pg/kg/día) produce un aumento en la circulación sanguínea dependiente de la colateral próximo al máximo en este modelo (Cruze et al, Peptides (2007) 28:269-280).
Una dosis preferida del agonista de GPR119 es 0,1-100 mg/kg. Otra dosis preferida se selecciona del grupo que consiste en 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg.
Está expresamente contemplado que en otra modalidad, la administración del agonista no sea oral, por ejemplo la administración del agonista sea por infusión intravenosa a una dosis, por ejemplo, de 30 mg/kg/día. Una dosis preferida de infusión del agonista de GPR119 es 0,1-100 mg/kg/día. Otra dosis preferida de infusión se selecciona del grupo que consiste en 0,1 mg/kg/día, 0,3 mg/kg/día, 1,0 mg/kg/día, 3,0 mg/kg/día, 10 mg/kg/día, 30 mg/kg/día y 100 mg/kg/día.
Ejemplo 25 Efecto de un agonista de GPR119 sobre las secreciones vevunales inducidas por péptido intestinal vasoactivo (PiV in vivo en un modelo de ratas Se puede demostrar que un agonista de GPR119 disminuye la secreción en el epitelio intestinal usando un modelo in vivo de secreciones yeyunales inducidas por el péptido intestinal vasoactivo (PIV) en ratas, especialmente como describen Balasubramaniam et al (J Med Chem (2000) 43:3.420-3.427) y Souli et al (Peptides (1997) 18:551-557). Balasubramaniam et al (J Med Chem (2000) 43:3420-3427) también describen análogos de PYY que tienen actividad en este ensayo.
Se anestesian ratas Wistar machos (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) y se les coloca una cánula en la vena safena para infundir fármacos. Se abre el abdomen, y se delimita un asa del yeyuno (-20 cm de largo) mediante dos ligaduras. En el tiempo cero, se instilan 2 ml_ de solución salina al 0,9% precalentada a 37 °C en el asa del yeyuno. Luego el asa se retorna al abdomen y se cierra. Se infunde PIV (30 pg/kg/hora) a , través de la vena safena a una velocidad de 2,5 mL/hora durante 30 minutos comenzando en el tiempo cero. Se administran por vía oral el agonista de GPR119 (a una dosis, por ejemplo, de 30 mg/kg) o solución salina (controles) como dosis en bolos, 15 min antes empezar las infusiones de PIV. Al final del experimento las ratas se sacrifican se extrae el asa yeyunal. Después el asa se mide y se pesa antes retirar el líquido instilado. Se calcula el flujo de agua neto expresado como pL/cm/30 min usando la fórmula (F-E -2.000)/L, donde F y E son los pesos (mg) del asa antes y después de vaciar el l íquido remanente, L es la longitud del asa en cm, y 2.000 es el volumen en µ?_ del líquido instilado inicialmente. La absorción neta se indica por un valor negativo y la secreción neta por un valor positivo. Cada dosis se investiga en 6-8 animales.
Una dosis preferida del agonista de G PR1 1 9 es 0, 1 -100 mg/kg.
Otra dosis preferida se selecciona del grupo que consiste en 0 ,1 mg/kg , 0, 3 mg/kg, 1 ,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 10 mg/kg , 30 mg/kg y 100 mg/kg .
Está expresamente contemplado que en otra modalidad, la administración del agonista no sea oral , por ejemplo que la administración del agonista sea subcutánea o intravenosa.
Ejemplo 26 Efecto de un agonista de GPR1 19 sobre la absorción intestinal en un modelo in vivo en perros Se puede demostrar que un agonista de GPR1 1 9 aumenta la absorción en el epitelio intestinal usando un modelo in vivo en perros, esencialmente como describen Balasubramaniam et al (J Med Chem (2000) 43:3.420-3.427). Balasubramaniam et al (J Med Chem (2000) 43:3420-3427) también describe análogos de PYY que tienen actividad en este ensayo.
Se investigan los efectos in vivo del agonista de GPR1 19 sobre la absorción de agua y electrolitos por el yeyuno, el íleo y el colon en condiciones básales en perros despiertos con asas de Thiry-Vella en yeyuno, íleo y/o colon esencialmente como describen en gran detalle Bilchik et al (Gastroenterology (1 993) 1 05: 1 .441 -1 .448) y Bilchik et al (Am J Surg ( 1 994) 167:570-574). Cada experimento consiste en un periodo basal de 90 min seguido de un período experimental de 1 50 min. Se perfunde el segmento de intestino delgado a través de una cánula proximal a una velocidad de 2 mL/min usando una bomba de rodillos. El perfundido, de pH 7,4 mantenido a 37 °C, contiene (en nmol/L) 1 40 de Na+, 5,2 de K\ 1 1 9,8 de CP, 25 de HC03, 1 ,2 de Ca2+, 1 ,2 de Mg2+, 2,4 de HP024, 0,4 de H2PO4-, 10 de glucosa y 10 pC de [14C]poli(etilenglicol) en 5 g/L de poli(etilenglicol). Después de un período de lavado de 20 min , se recoge el perfundido cada 1 5 minutos para la determinación del contenido de Na+, CI" y agua.
Se administra el agonista de GPR1 19 a una dosis, por ejemplo, de 30 mg/kg en el tiempo cero.
Una dosis preferida del agonista de GPR1 1 9 es 0, 1 -100 mg/kg. Otra dosis preferida se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 ,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 10 mg/kg , 30 mg/kg y 100 mg/kg.
Está expresamente contemplado que en otra modalidad, la administración del agonista no sea oral, por ejemplo que la administración del agonista sea por infusión intraluminal a una dosis, por ejemplo, de 30 mg/kg/hora comenzando en el tiempo cero. Una dosis preferida de infusión del agonista de GPR1 1 9 es 0, 1 -100 mg/kg/hora. Otra dosis preferida de infusión se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 mg/kg/hora, 0,3 mg/kg/hora, 1 ,0 mg/kg/hora, 3,0 mg/kg/hora, 1 0 mg/kg/hora, 30 mg/kg/hora y 1 00 mg/kg/hora.
Ejem plo 27 In hi bición de diarrea de defecación inducida por aceite de ricino y síntoma diarreico en ratones Se puede demostrar que un agonista de GPR1 1 9 inhibe el síntoma diarreico usando un modelo de defecación inducida por aceite de ricino y síntoma diarreico en ratones, esencialmente como se escribe en EP 1 902730.
Se usan ratones C57BL/6. Los ratones se alojan individualmente en jaulas con piso de esterilla en un bioterio con ambiente controlado (temperatura: 23 °C, humedad relativa: 55%, horas de luz: de 7:00 a 19:00) con acceso ad libitum a comida para roedores (CE-2, Nippon CLEA) y agua para beber.
Se administran el agonista de GPR1 1 9 (a una dosis, por ejemplo , de 30 mg/kg), el antidiarreico convencional loperamida (1 mg/kg ), el antidiarreico convencional atropina (1 0 mg/kg), o sólo vehículo, por vía oral, intraperitoneal , intraperitoneal y oral, respectivamente, a los ratones, y a los 1 5 minutos de la administración, se administra aceite de ricino (0,3 ml/animal) por vía oral a los ratones. Se miden el peso fecal y el puntaje de diarrea (normal : 0, heces blandas: 1 , heces l íquidas: 2) de manera dependiente del tiempo (1 , 2 y 4 horas después de la administración). Al mismo tiempo, se lleva a cabo la misma medición para los ratones a los que se les administró sólo vehículo y no se les administró aceite de ricino.
Una dosis preferida del agonista de GPR1 1 9 es 0, 1 -100 mg/kg .
Otra dosis preferida se selecciona del grupo que consiste en 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg.
Está expresamente contemplado que en otra modalidad, la administración del agonista no sea oral, por ejemplo que la administración del agonista sea intraperitoneal o intravenosa.
Ejemplo 28 Biodisponibilidad Oral Los métodos analíticos fisicoquímicos para evaluar directamente la biodisponibilidad oral de un compuesto de la invención, como un agonista de GPR119, un secretagogo de PYY, un compuesto útil para el tratamiento o la prevención de una afección modulada por PYY, o un compuesto útil para la modulación de una actividad relacionada con PYY, son bien conocidos por los expertos en la materia y se pueden usar: (consulte, por ejemplo, sin limitación, Wong PC et al., Cardiovasc Drug Rev (2002) 20:137-52; y Buchan P et al., Headache (2002) Suppl 2:S54-62; cuyas divulgaciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad). A título ilustrativo y no limitante, dichos métodos analíticos alternativos pueden comprender cromatografía liquida-espectrometría de masas en tándem (Chavez-Eng CM et al., J ChromatogrB Analyt Technol Biomed Life Sci (2002) 767:117-29; Jetter A et al., Clin Pharmacol Ther (2002) 71:21-9; Zimmerman JJ et al., J Clin Pharmacol (1999) 39:1155-61; y Barrish A et al., Rapid Commun Mass Spectrom (1996) 10:1033-7; cuyas divulgaciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad). Recientemente, se ha utilizado con éxito la tomografía por emisión de positrones (PET) para tener mediciones directas de la distribución de los fármacos, que incluye la biodisponi bilidad oral, en el organismo de los mamíferos luego de la administración oral del fármaco (Gulyas et al . , Eur J Nucí Med Mol Imaging (2002) 29:1 .031 -8; cuya divulgación se incorpora aqu í por referencia en su totalidad).
Si bien la especificación precedente enseña los principios de la presente invención , con ejemplos provistos con el propósito de ilustrar, se sobreentenderá que la práctica de la invención abarca todas las variaciones, adaptaciones o modificaciones habituales, puesto que están comprendidas por el campo de aplicación de las reivindicaciones siguientes y sus equivalentes.

Claims (50)

RE IVI N DICACION ES
1 . Un método para identificar un secretagogo del péptido YY (PYY), que comprende: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una célula huésped o con la membrana de una célula huésped que contiene un receptor acoplado a proteína G, donde el receptor acoplado a proteína G comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i ) aminoácidos 1 -335 de SEQ. I D N°: 2; (ii ) aminoácidos 2-335 de SEQ. I D N°: 2; (iii) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de (i ) por sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos definida en (i); (iv) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G codificado por un polinucleótido capaz de hibridarse en condiciones rigurosas al complemento de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ. I D N°: 1 ; (v) la secuencia de aminoácidos de una variante de SEQ. I D N°: 2 seleccionada del grupo que consiste en: (a') la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ. I D N° : 2; y (b' ) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ . I D N°: 2 ; (vi) la secuencia de aminoácidos de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado a proteína G que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ. I D N°: 2; y (vii) un fragmento biológicamente activo de cualquiera de (i) a (vi); y (b) determinar la capacidad del compuesto de prueba para estimular la funcionalidad del receptor; donde la capacidad del compuesto de prueba para estimular la funcionalidad del receptor indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY;
2. Uso tal y como se describe en la reivindicación 1 , y que comprende además: (c) poner en contacto un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor en el paso (b) in vitro con una célula enteroendocrina de un vertebrado o con una célula capaz de secretar PYY; y (d) determinar si el compuesto estimula la secreción de PYY de la célula enteroendocrina del vertebrado o de la célula capaz de secretar PYY; donde la capacidad del compuesto de prueba para estimular la secreción de PYY de la célula enteroendocrina del vertebrado o de la célula capaz de secretar PYY además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY.
3. Uso tal y como se describe en la reivindicación 1 , y que comprende además: (c) determinar si el compuesto aumenta el nivel de PYY en una muestra, habiendo sido obtenida dicha muestra de un vertebrado al cual se le administró previamente un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor en el paso (b); donde la capacidad del compuesto de prueba para aumentar el nivel de PYY en el vertebrado además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY.
4. Uso tal y como se describe en la reivindicación 1 , y que comprende además: (c) administrar a un vertebrado un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor en el paso (b); y (d ) determinar si el compuesto aumenta el nivel de PYY en un vertebrado; caracterizado además porque la capacidad del compuesto de prueba para aumentar el nivel de PYY en el vertebrado además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY.
5. Uso tal y como se describe en la reivindicación 3 o 4, caracterizado además porque el vertebrado es un vertebrado no humano.
6. Uso al y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizado además porque el receptor es recombinante.
7. Uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizado además porque la célula huésped comprende un vector de expresión, dicho vector de expresión comprende un polinucleótido que codifica el receptor acoplado a la proteína G .
8. Uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7 , caracterizado además porque dicha determinación es mediante la medición del nivel de un segundo mensajero.
9. Uso tal y como se describe en la reivindicación 8, caracterizado además porque el segundo mensajero se selecciona del grupo que consiste en: AM P cíclico (AMPc), GM P cíclico (GMPc), 1 ,4,5-trifosfato de inositol (I P3), diacilglicerol (DAG), actividad MAP quinasa, actividad MAPK/ERK quinasa-quinasa-1 (M EKK1 ) y Ca2+.
10. Uso tal y como se describe en la reivindicación 9, caracterizado además porque el nivel de AMPc es mayor.
1 1 . Uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7, caracterizado además porque dicha determinación es a través del uso de un ensayo de melanóforos, a través de la medición de la unión de GTPyS a una membrana que contiene el receptor acoplado a proteína G, o a través de un ensayo de reportero.
12. Uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 1 1 , caracterizado además porque la célula huésped es una célula huésped de un mamífero, o donde la célula huésped es una célula huésped de una levadura , o donde la célula huésped es una célula huésped melanófora.
13. Uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 12, caracterizado además porque el compuesto de prueba es una molécula pequeña.
- 14. Uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, caracterizado además porque el receptor comprende la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 80% de identidad con SEQ. ID N°: 2.
15. Uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13, caracterizado además porque el receptor comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID N°: 2.
16. Un método para identificar un secretagogo del péptido YY (PYY), que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una célula huésped o con ia membrana de una célula huésped que contiene un receptor acoplado a proteína G, donde el receptor acoplado a proteína G comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) aminoácidos 1-335 de SEQ. ID N°: 2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ. ID N°: 2; (iii) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de (i) por sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos definida en (i); (iv) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G codificado por un polinucleótido capaz de hibridarse en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. I D N°: 1 ; (v) la secuencia de aminoácidos de una variante de SEQ. ID N°: 2 cuando se selecciona del grupo que consiste en : (a' ) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ . I D N°: 2; y (b' ) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que contiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. I D N°: 2; (vi) la secuencia de aminoácidos de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado a proteína G que tiene SEQ. I D N°: 2; y (vii) un fragmento biológicamente activo de cualquiera de (i) a (vi); y (b) determinar la capacidad del compuesto de prueba para estimular la funcionalidad del receptor; donde la capacidad del compuesto de prueba para estimular la funcionalidad del receptor acoplado a proteína G indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY;
1 7. Un método para identificar un secretagogo de PYY, que comprende el paso de: (a) determinar si el nivel de PYY aumenta en una muestra en comparación con una muestra de referencia de vertebrado al que no se le administró previamente un agonista de GPR 1 19, habiendo sido obtenida dicha muestra de un vertebrado al que se le administró previamente un agonista de GPR119; caracterizado además porque la capacidad del agonista de GPR119 para aumentar el nivel de PYY en la muestra indica que el agonista de GPR119 es un secretagogo de PYY.
18. Un método para identificar un secretagogo de PYY, que comprende los pasos de: (a) administrarle a un vertebrado un agonista de GPR119; y (b) determinar si el agonista de GPR119 aumenta el nivel de PYY en el vertebrado; donde la capacidad del agonista de GPR119 para aumentar un nivel de PYY en el vertebrado indica que agonista de GPR119 es un secretagogo de PYY.
19. Un método para identificar un secretagogo de PYY, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un agonista de GPR119 in vitro con una célula enteroendocrina de un vertebrado o con una célula capaz de segregar PYY; y (b) determinar si el agonista de GPR119 estimula la secreción de PYY de la célula endocrina o de la célula capaz de segregar PYY; donde la capacidad del agonista de GPR119 para estimular la secreción de PYY de la célula enteroendocrina de vertebrado o la célula capaz de segregar PYY indica que el agonista de GPR119 es un secretagogo de PYY.
20. El método de la reivindicación 1 4, donde el vertebrado es un vertebrado no humano.
21 . Uso de un receptor acoplado a proteína G para identificar un secretagogo de PYY, en un método que comprende: (a) poner en contacto un receptor acoplado a proteína G con un ligando conocido, marcado opcionalmente para el receptor en la presencia o en ausencia de un compuesto de prueba , donde un ligando para el receptor es un ligando para GPR1 19 y en donde el receptor acoplado a proteína G comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) aminoácidos 1 -335 de SEQ. ID N°: 2; (ii) aminoácidos 2-335 de SEQ. ID N°: 2 ; (iii ) una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido derivado de (i ) por sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos definida en (i); (iv) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G codificado por un polinucleótido capaz de hibridarse en condiciones rigurosas al complemento de SEQ. I D N°: 1 ; (v) la secuencia de aminoácidos de una variante de SEQ. I D N°: 2 seleccionada del grupo que consiste en: (a') la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad con SEQ. I D N°: 2; y (b' ) la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ. ID N°: 2; (vi) la secuencia de aminoácidos de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado a proteína G que tiene SEQ. I D N°: 2; y (vii ) un fragmento biológicamente activo de cualquiera de (i) a (vi); y (b) detectar el complejo entre dicho ligando conocido y dicho receptor; y (c) determinar si se forma menos de dicho complejo en la presencia del compuesto de prueba que en la ausencia del compuesto de prueba; en donde dicha determinación indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY.
22. Uso tal y como se describe en la reivindicación 21 , caracterizado porque dicho uso comprende además (d ) poner en contacto un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo en el paso (c) in vitro con una célula enteroendocrina de vertebrado o una célula capaz de segregar PYY; y (e) determinar si el compuesto estimula la secreción de PYY de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de segregar PYY; en donde la capacidad del compuesto de prueba para estimular la secreción de PYY indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY.
23. Uso tai y como se describe en la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho método comprende además (d ) determi nar si el cumpuesto aumenta un nivel de PYY en una muestra obtenida de un vertebrado, habiéndosele ad mi nistrado a d icho vertebrado un compuesto en la presencia del cual se forma dicho compuesto en el paso (c); donde la capacidad del compuesto de prueba para aumentar un nivel de PYY en el vertebrado además indica que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY .
24. Uso tal y como se describe en la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho método comprende además: (d ) administrar un compuesto en la presencia del cual se forma menos de dicho complejo en el paso (c) a un vertebrado; y (e) determinar si el compuesto aumenta un nivel de PYY en el vertebrado; en donde la capacidad del compuesto de prueba para aumentar un nivel de PYY en el vertebrado indica además que el compuesto de prueba es un secretagogo de PYY.
25. Uso tal y como se describe en la reivind icación 21 o 22 , caracterizado además porque el vertebrado es vertebrado no humano.
26. Uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 21 hasta 25 , caracterizado además porque el receptor es recombi nante.
27. Uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 21 hasta 26, caracterizado además porque la célula huésped comprende un vector de expresión y dicho vector de expresión comprende un polinucleótido que codifica al receptor acoplado a proteína G.
28. Uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 21 hasta 27, caracterizado además porque el ligando para GPR119 es un agonista de GPR119.
29. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 16 hasta 20, o el uso tal y como se describe en la reivindicación 28, caracterizado además porque el agonista de GPR119 es un agonista de GPR119 humano.
30. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 16 hasta 20 o 29, o el uso tal y como se describe en la reivindicación 28 o en la reivindicación 29, caracterizado además porque dicho agonista de GPR119 es un agonista selectivo de GPR119.
31. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 16 hasta 20, 29 o 30, o el uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 28 hasta 30, caracterizado además porque el agonista de GPR119 tiene una CE50 de menos de un valor seleccionado del grupo constituido por 10 µ?, 1 µ y 100 nM.
32. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 17 hasta 20 o 29 hasta 31, o el uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 28 hasta 31, caracterizado además porque el agonista de GPR119 es una molécula pequeña.
33. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 17 hasta 20 o 29 hasta 32, o el uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 28 hasta 32, caracterizado además porque el agonista de GPR119 está biodisponible por vía oral.
34. Uso tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 21 hasta 33, o el método tal y como se describe en la reivindicación 16, caracterizado además porque el compuesto de prueba es una molécula pequeña.
35. Uso o método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 21 hasta 34, caracterizado además porque el receptor comprende la secuencia de aminoácidos de un receptor acoplado a proteína G que tiene al menos 80% de identidad con la secuencia de SEQ. ID N°: 2.
36. Uso o método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 21 hasta 35, caracterizado además porque el receptor comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ. ID N°: 2.
37. El uso de un agonista de GPR119 en el tratamiento o prevención de una condición modulada por un péptido YY (PYY).
38. El uso de un agonista de GPR119 en el tratamiento o prevención de una condición modulada por estimulación de un receptor Y2 de NPY (Y2R).
39. Un método para tratar o prevenir una condición modulada por péptido YY (PYY), el método comprende administrar una composición farmacéutica que comprende un agonista de GPR1 1 9 a un individuo que necesita de ello.
40. Un método para tratar una condición mejorada por estimulación de un receptor Y2 de N PY (Y2R), el método comprende administrar una composición farmacéutica que comprende un agonista de GPR1 19 a un individuo que necesita de ello.
41 . El método tal y como se describe en la reivindicación 39 o 40, caracterizado además porque el agonista de GPR1 9 se administra en una forma o cantidad capaz de estimular la expresión de PYY en una célula enteroendocrina del individuo.
42. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 6 hasta 20 o 29 hasta 33, que además comprende producir o sintetizar el secretagogo de PYY identificado.
43. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 6 hasta 20, 29 hasta 33, o 42, que además comprende producir o sintetizar el secretagogo de PYY identificado como una composición.
44. El método tal y como se describe en la reivindicación 16, caracterizado además porque el compuesto de prueba es una molécula pequeña.
45. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindiaciones 13, 16, 32, 34 o 44, caracterizado además porque la molécula pequeña tiene un peso de menos de 10,000 gramos por mol .
46. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 3, 1 6, 32, 34 o 44, caracterizado además porque la molécula pequeña tiene un peso de menos de 5 ,000 gramos por mol .
47. Una forma de dosis que contiene un agonista de GPR1 19, caracterizada porque el agonista de GPR1 1 9 está presente en una cantidad suficiente para aumentar los niveles de PYY en un sujeto.
48. La forma de dosis tal y como se describe en la reivindicación 47, caracterizada además porque la cantidad es suficiente para aumentar los niveles de PYY en una célula enteroendocrina en un sujeto.
49. El uso o método tal y como se describe en las reivindicaciones 38 hasta 41 , caracterizado además porque el tratamiento o la prevención comprende una influencia seleccionada del grupo que comprende: (a) aumentar el PYY plasmático; (b) aumentar la masa ósea; (c) disminuir la pérdida de masa ósea; (d ) aumentar la formación de hueso; (e) disminuir el consumo de alimentos; (f) disminuir el peso corporal; (g) aumentar la saciedad (h) aumentar la eliminación de glucosa; (i) disminuir la glucosa plasmática; (j ) aumentar la angiogenesis; (k) disminuir la secreción en el epitelio intestinal ; (I ) aumentar la absorción en el epitelio intestinal; y (m) aumentar la adiponectina plasmática.
50. Un agonista de GPR1 19 para uso en un método para el tratamiento de una condición, caracterizado porque la condición puede ser tratada aumentando los niveles de PYY en un individuo.
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