JP4047853B2 - 新規マンナナーゼ - Google Patents
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Description
例えば、清浄組成物又は異なった産業工程に適用される場合、またはアルカリ性pH範囲においてマンナナーゼ活性を示す新規且つ効果的な酵素を提供することが、本発明の目的である。
本発明のさらなる観点は、(a)配列番号2に示されるアミノ酸残基31〜アミノ酸残基330のアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチド分子;(b)上記(a)の種相同体;及び(c)マンナナーゼ活性を示す第1ポリペプチド部分及びセルロース結合機能を示す第2ポリペプチド部分を含んで成るマンナナーゼ活性を有する融合タンパク質(前記第2ポリペプチドは好ましくは、セルロース結合ドメイン(CBD),例えば配列番号4により示される結合タンパク質である)から成る群から選択されたマンナナーゼ活性を有する、単離されたポリペプチドを提供する。
本発明のもう1つの観点においては、上記に開示されるような発現ベクターを導入されている細胞を培養し、(それにより、前記細胞が前記DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する)、そして前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法が提供される。
従って、さらなる観点においては、本発明は、本発明の酵素を含んで成る清浄又は洗剤組成物;及びセルロース含有ファイバー、糸、織布又は不織布、及び合成又は一部合成布の処理、例えば清浄のためへの本発明の酵素の使用に関する。
本発明を、さらに詳細に論じる前、次の用語をまず定義するであろう。
用語“オルト体(ortholog)”(又は“種相同体”)とは、異なった種からの類似するポリペプチド又はタンパク質に対して相同性を有する1つの種から得られたポリペプチド又はタンパク質を示す。
用語“パラ体(paralog)”とは、同じ種からの異なったポリペプチド又はタンパク質に対して相同性を有する所定の種から得られたポリペプチド又はタンパク質を示す。
さらにより好ましくは、SDS−PAGEにより決定される場合、高く精製された形、すなわち80%以上、より好ましくは95%以上、及びさらにより好ましくは99%以上の純粋な形でタンパク質を提供することが好ましい。
用語“相同不純物”(homologous impurity)とは、本発明のポリペプチドが最初に得られる相同細胞に起因するいずれかの不純物(例えば、本発明のポリペプチド以外の他のポリペプチド)を意味する。
用語“〜から得られた”とは、特定の微生物源に関して本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチド及び/又はポリペプチドが特定源(相同発現)により、又はその源からの遺伝子が挿入されている細胞(非相同発現)により生成されることを意味する。
用語“ポリヌクレオチド”とは、5'から3'末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを示す。ポリヌクレオチドはRNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、1又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を示す(ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチド分子に比較して)。縮重コドンは、異なったヌクレオチドトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする(すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれ、Aspをコードする)。
用語“分泌シグナル配列”とは、より大きなポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌経路を通してそのより大きなポリペプチドを方向づけるポリペプチド(“分泌ペプチド”)をコードするDNA配列を示す。大きなペプチドは、通常、分泌経路を通して、遷移の間、分泌ペプチドを除去するために分解される。
用語“酵素コア”とは、修飾又は変更されているか又はされていないが、しかしその元の活性を保持している単一ドメイン酵素を示し;当業界において知られているような触媒ドメインは損なわれていないまま及び機能的のまま存続した。
他の関連する配列を得るためへの本発明の配列の使用法:本発明のマンナナーゼをコードするポリヌクレオチド配列に関連する本発明に開示される配列情報が他の相同マンナナーゼを同定するための手段として使用され得る。例えば、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)が、種々の微生物源、特に異なったバチルス種からの他の相同マンナナーゼをコードする配列を増幅するために使用され得る。
マンナナーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、当業界において知られている標準の試験方法に従って、例えば0.2%のAZCLガラクトマンナン(carob)、すなわちMegazymeの会社(Megazymeのインターネットアドレス:http://www.megazyme.com/Purchase/Index.html)からカタログNo.I-AZGMAとして入手できるエンド−1,4−D−マンナナーゼのアッセイのための基質を含む寒天プレートに押しぬかれた4mmの直径の穴に試験されるべき溶液を適用することによって試験され得る。
本発明の好ましい態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも中位の緊縮条件下で、配列番号1の類似する大きさの領域にハイブリダイズするであろう。
オリゴヌクレオチドプローブがそれらの条件下でハイブリダイズする分子は、X−線フィルムを用いて検出される。
他の有用な単離されたポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29もしくは31の類似するサイズの領域、又はそれらに対して相補的な配列に、少なくとも中位の緊縮条件下でハイブリダイズするであろうそれらのポリヌクレオチドである。
配列番号1に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号1の位置91〜990に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖DNAプローブ、又は少なくとも約100個の長さの塩基対を有する、配列番号1の位置91〜990に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド;
次に、本発明のマンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが同定され、そして、例えばハイブリダイゼーション又はPCRにより単離される。
E.コリDSM12197に存在するプラスミドpBXM3中にクローン化されるDNA配列(配列番号1)及び本発明の類似するDNA配列のマンナナーゼコード部分は、細菌種バチルスsp.I633の株、又は本明細書に記載されるようなもう1つの又は関連する生物からクローン化され得る。
配列番号2の位置31〜490におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号2のアミノ酸番号1〜30の配列は、シグナルペプチドである。配列番号2の位置31〜330におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、位置331〜342においてリンカー及び位置434〜490において未知の機能の少なくとも1つのC−末端ドメインを含んで成ると思われる。
配列番号20のアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列の部分的配列形成部分である。本発明は、配列番号20のアミノ酸番号1〜132の配列を含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
配列番号26の位置30〜815におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号26のアミノ酸番号1〜29の配列は、シグナルペプチドである。配列番号26の位置301〜625におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、位置44〜166及び195〜300において未知の機能の少なくとも2つのN−末端ドメイン、及び位置626〜815において未知の機能のC−末端ドメインを含んで成ると思われる。
配列番号2のアミノ酸番号33〜340もしくは33〜490に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体;
配列番号6のアミノ酸番号32〜344もしくは32〜494に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体;
配列番号10のアミノ酸番号32〜362もしくは32〜586に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体;
配列番号12のアミノ酸番号33〜331に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体;
配列番号16のアミノ酸番号68〜369もしくは32〜369に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体;
配列番号18のアミノ酸番号1〜305に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体;
配列番号20のアミノ酸番号1〜132に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体;
配列番号22のアミノ酸番号29〜320に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体;
配列番号24のアミノ酸番号29〜188に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体;
配列番号28のアミノ酸番号166〜496もしくは38〜496に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体;
配列番号30のアミノ酸番号26〜361に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体;又は
配列番号32のアミノ酸番号593〜903もしくは23〜903に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体;
に対して65%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、及びさらにより好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを示すために、本明細書において使用される。
配列番号6のアミノ酸番号32〜344もしくは32〜494に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体;配列番号10のアミノ酸番号32〜362もしくは32〜586に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体;
配列番号12のアミノ酸番号33〜331に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体;配列番号14のアミノ酸番号166〜488もしくは22〜488に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体;
配列番号16のアミノ酸番号68〜369もしくは32〜369に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体;
配列番号20のアミノ酸番号1〜132に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体;
配列番号22のアミノ酸番号29〜320に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体;
配列番号24のアミノ酸番号29〜188に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体;
配列番号28のアミノ酸番号166〜496もしくは38〜496に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体;
配列番号30のアミノ酸番号26〜361に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体;又は
配列番号32のアミノ酸番号593〜903もしくは23〜903に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体;
に対して少なくとも95%、及び最も好ましくは98%又はそれ以上同一であろう。
本発明の酵素調製物は好ましくは、微生物、好ましくは細菌、原生生物、又は菌類、特に細菌、例えばバチルス、好ましくは、バチルスsp.種、及びすべての種が好ましくは、整列された16S rDNA配列に基づいて、バチルスsp.I633, バチルス・ハロジランス又はバチルスsp.AAIに対して少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも98%相同である高い関連性のバチルス種から成る群から選択され得るバチルス株に属する細菌に由来する。
しかしながら、上記変更が好ましくは,マイナーな性質のものであったとしても、そのような変更はまた、大きな性質のもの、例えば、本発明のマンナナーゼポリペプチドへの、300個までのアミノ酸の大きなポリペプチドの融合、又は両アミノ−又はカルボキシル−末端延長としての融合でもあり得る。
CBD−MR−X
により記載され、ここで前記CBDは少なくともセルロース−結合ドメインに対応するアミノ酸配列のN−末端又はC−末端領域であり;MRは中間領域(リンカー)であり、そして結合、又は好ましくは、約2〜約100個の炭素原子、より好ましくは2〜40個の炭素原子の短い結合基であり得;又は好ましくは約2〜約100個のアミノ酸、より好ましくは2〜40個のアミノ酸であり得;そしてXは本発明のマンナナーゼ分解酵素のN−末端又はC−末端の領域である。配列番号4は、マンナナーゼ酵素コア及びCBDの酵素ハイブリッドのアミノ酸配列を開示する。
好ましくは、本発明の清浄組成物は、例えば、機械洗浄工程の洗浄サイクルの間、布を処理するために使用される場合、典型的には、約8〜約10.5のpHを有する洗浄溶液を提供する。典型的には、そのような洗浄溶液は、約20℃〜約95℃、好ましくは約20℃〜約60℃、好ましくは約20℃〜約50℃の温度で使用される。
十分な長さのタンパク質、そのフラグメント及び融合タンパク質を包含する本発明のタンパク質及びポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝子的に構築された宿主細胞において生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性DNAにより形質転換され、又はトランスフェクトされ、そして培養において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含する。
発現された組換えポリペプチドが分泌される場合、そのポリペプチドは増殖培地から精製され得る。好ましくは、発現宿主細胞は、ポリペプチドの精製の前、培地から除かれる(例えば、遠心分離による)。
発現された組換えポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、宿主細胞は好ましくは、破壊され、そしてポリペプチドは、そのような精製技法の第1段階である水性“抽出物”中に開放される。好ましくは、発現宿主細胞は、細胞破壊の前、培地から除去される(例えば遠心分離による)。
発現された組換えポリペプチド(又はキメラポリペプチド)が分泌されても又はされなくても、それは、分別及び/又は従来の精製方法を用いて、精製され得る。
本発明のポリペプチド又はそのフラグメントはまた、化学合成を通して調製され得る。本発明のポリペプチドは、モノマー又はマルチマーであり;グリコシル化され又は非グリコシル化され得;ペギル化され(pegylated)又は非ペギル化され得;そして最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでも又は含まなくても良い。
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号9に示されるDNA配列、少なくとも位置94〜位置1086のDNA配列、又は他方では、位置94〜位置1761のDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列;
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号11に示されるDNA配列、少なくとも位置97〜位置993のDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列;
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号15に示されるDNA配列、少なくとも位置204〜位置1107のDNA配列、又は他方では、位置76〜位置1107のDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列;
本発明のマンナナーゼを部分的にコードし、そして配列番号17に示されるDNA配列を含んで成るDNA配列;本発明のマンナナーゼを部分的にコードし、そして配列番号19に示されるDNA配列を含んで成るDNA配列;
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号21において少なくとも位置88〜位置960に示されるDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列;
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号25に示されるDNA配列中の少なくとも位置904〜位置1875のDNA配列、又は他方では、位置88〜位置2445のDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列;
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号27に示されるDNA配列中の少なくとも位置498〜位置1488のDNA配列、又は他方では、位置112〜位置1488のDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列;
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号31に示されるDNA配列中の少なくとも位置1779〜位置2709のDNA配列、又は他方では、位置67〜位置2709のDNA配列を含んで成る十分な長さのDNA配列がクローン化され得る。
−バチルス株、特にB.sp.I633, B.sp.AAI12, B.sp.AA349, バチルス・アガラドハエレンス、バチルス・ハロジュランス、バチルス・クラウジ及びバチルス・リケニホルミスから選択された株、又は菌株、特にヒューミコラ・インソレンス株からゲノムライブラリーを調製し;
−配列番号1, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29又は31のいずれかに基づいてのプローブを用いて、標準のハイブリダイゼーション技法により、本発明のポリヌクレオチド配列を含んで成るクローンを同定し;又は
−配列番号1, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29又は31からの配列情報に基づいてのプライマーを用いて、逆PCR法により、前記ゲノムライブラリーからクローンを同定することによって行われる。逆PCRに関する追加の詳細は、M.J. MCPherson など:(“PCR A Practical Appraach" Information Press, Ltd, Oxford England) に言及される。
さらにもう1つの観点においては、本発明は、上記に記載される性質を有し、そして相同不純物を有さず、そして従来の組換え技法を用いて生成される、単離されたマンナナーゼに関する。
免疫学的交差反応性の決定に使用されるべきポリクローナル抗体は、精製されたマンナナーゼ酵素の使用により調製され得る。より特定には、本発明のマンナナーゼに対する抗血清が、N. Axelsen など., A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 23, 又はA. Johnstone and R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (より詳しくは、p.27-31) に記載される方法に従って、ウサギ(又は他のゲッ歯動物)を免疫化することによって生ぜしめられ得る。
さらなる観点においては、本発明は、本発明のマンナナーゼ又はマンナナーゼ調製物を含んで成る洗剤組成物、本発明のマンナナーゼ又はマンナナーゼ調製物を含む洗浄溶液により、機械洗浄の洗浄サイクルの間、布を処理することを含んで成る、布の機械処理のための方法、及び卓越した清浄性能、すなわち卓越したしみの除去性能、黒ずんだ物の清浄及び白色度の維持を提供する、本発明のマンナナーゼ及び任意には、セルラーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択されたもう1つの酵素を含んで成る清浄組成物、例えば洗濯、皿洗い、硬質表面クリーナー、個人用洗浄及び経口/歯用組成物に関する。
本発明の清浄組成物は、少なくとも1つの追加の洗剤成分を含むべきである。それらの追加の成分の正確な性質、及びその導入のレベルは、組成物の物理形、及びそれが使用される洗浄操作の性質に依存するであろう。
本発明の清浄組成物は、液体、ペースト、ゲル、棒状、錠剤、スプレー、発泡体、粉末又は粒質物であり得る。粒状組成物はまた、“圧縮”形でも存在することができ、そして液体組成物はまた、“濃縮された”形でも存在することができる。
必要とされる場合、洗濯洗剤組成物の密度は、20℃で測定される組成物1L当たり400〜1200g、好ましくは500〜950gの範囲である。
界面活性剤系:
本発明の洗浄又は洗剤組成物は界面活性剤系を含んで成り、ここで前記界面活性剤は、非イオン性、及び/又はアニオン性及び/又はカチオン性、及び/又は両性及び/又は両性イオン性、及び/又は半極性界面活性剤から選択され得る。
本発明への使用のための適切な界面活性剤系は、本明細書に記載される1又は複数の非イオン性及び/又はアニオン性界面活性剤を界面活性剤として含んで成る。
R2O (CnH2nO)t (グリコシル)x
[式中、R2は、アルキル、アルキルフェニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルフェニル、及びそれらの混合物(ここで、アルキル基は約10〜約18、好ましくは約12〜約14個の炭素原子を含む)から成る群から選択され;nは、2又は3、好ましくは2であり;tは0〜約10、好ましくは0であり;そしてxは約1.3〜約10、好ましくは約1.3〜約3、最も好ましくは約1.3〜約2.7である]を有する。
で表されるポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤、又はそのアルコキシル化された誘導体が、非常に好ましい非イオン性界面活性剤である。好ましくは、R1はメチルであり、R2は直鎖のC11-15又はC16-18アルキル、又はアルケニル鎖、例えばヤシアルキル又はそれらの混合物であり、そしてZは還元糖、例えばグルコース、フルクトース、マルトース又はラクトースから還元アミノ化反応において誘導される。
さらなる例は、“Surface Active Agents and Detergents”(Vol. I and II by Schwartz, Perry and Berch)に記載される。種々のそのような界面活性剤はまた、一般的に、アメリカ特許第3,929,678号(第23頁左欄、第58行〜第29頁左欄、第23行;引用により本明細書に組み込まれる)にも開示される。
本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、約1〜約40重量%、好ましくは約3〜約20重量%のそのようなアニオン性界面活性剤を含んで成る。
本発明の洗濯洗剤組成物への使用のために適切なカチオン性洗剤海面活性剤は、1つの長鎖ヒドロカルビル基を有すそれらのものである。そのようなカチオン性界面活性剤の例は、次のものを包含する:アンモニウム海面活性剤、例えばアルキルトリメチルアンモニウムハロゲン化物、及び下記式:
[式中、R2は、アルキル又はアルキル鎖に約8〜約18個の炭素原子を有するアルキルベンジル基であり;個々のR3は、-CH2CH2-, -CH2CH(CH3)-, -CH2CH2(CH2OH)-, -CH2CH2CH2-及びそれらの混合物から成る群から選択され;個々のR4は、C1-C4アルキル、C1-C4ヒドロキシアルキル、2つのR4基を連結することによって形成されるベンジル環構造体、
R1R2R3R4N+X-(i)
[式、C6-C16アルキルであり、個々のR2, R3, 及びR4は独立して、C1-C4アルキル、C1-C4ヒドロキシアルキル、ベンジル及び-(C2H40)XH(ここで、Xは2〜5の値である)であり、Xはアニオンである]で表される本発明の組成物において有用な水溶性第四アンモニウム化合物である。多くとも1つのR2, R3又はR4がベンジルであるべきである。
R2R3及びR4のための好ましい基は、メチル及びヒドロキシエチル基であり、そしてアニオンXは、ハロゲン化合物、メトスルフェ−ト、アセテート及びホスフェートイオンから選択され得る。
本明細書に包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、0.2〜約25重量%、好ましくは1〜約8重量%のそのようなカチオン性界面活性剤を含んで成る。
本明細書において包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、0.2〜約15重量%、好ましくは約1〜約10重量%のそのような両性界面活性剤を含んで成る。
本明細書において包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、0.2〜約15重量%、好ましくは約1〜約10重量%のそのような両性イオン性界面活性剤を含んで成る。
本明細書に包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は、典型的には、0.2〜約15重量%、好ましくは約1〜約10重量%のそのような半−極性非イオン性界面活性剤を含んで成る。
本発明の組成物はさらに、ビルダー系を含むことができる。次のいずれかの従来のビルダー系が、本発明への使用のために適切である:アルミノシリケート材料、シリケート、ポリカルボキシレート及び脂肪酸、材料、例えばエチレンジアミンテトラアセテート、金属イオン封鎖剤、例えばアミノポリホスホネ−ト、特にエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸及びジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸。明らかな環境の理由のためにほとんど好ましくはないけれども、ホスフェートビルダーもまた、本発明において使用され得る。
もう1つの適切な無機ビルダー材料は、積層されたシリケート、例えばSKS-6(Hoechst)である。SKS−6は、珪酸ナトリウムから成る積層された結晶性シリケート(Na2Si2O5)である。
本発明の組成物への使用のための好ましいビルダー系は、水不溶性アルミノシリケートビルダー、例えばゼオライトA,又は積層されたシリケート(SKS-6),及び水溶性カルボキシレートキレート剤、例えばクエン酸の混合物を包含する。
粒質組成物への使用のためのビルダー系の一部を形成することができる他のビルダー材料は、無機材料、例えばアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素塩、珪酸塩、及び有機材料、例えば有機ホスホネート、アミノポリアルキレンホスホネート及びアミノポリカルボキシレートを包含する。
このタイプのポリマーは、GB-A-1,596,756号に開示される。そのような塩の例は、MW2000〜5000のポリアクレレート、及び無水マレイン酸とのそれらのコポリマーであり、そのようなコポリマーは、20,000〜70,000、特に約40,000の分子量を有する。
酸素:
マンナナ−ゼは、本発明の洗浄又は洗剤組成物中に、好ましくは、0.0001〜2重量%、より好ましくは0.0005〜0.5重量%、最も好ましくは0.001〜0.1重量%のレベルで、純粋な酵素形で導入され得る。
本発明のための好ましいセルラーゼは、アルカリセルラーゼ、すなわち7〜12の範囲のpHで、それらの最大活性の少なくとも25%、より好ましくは少なくとも40%の活性を有する酵素である。より好ましいセルラーゼは、7〜12の範囲のpHで、それらの最大活性を有する酵素である。好ましいアルカリセルラーゼは、商標Carezyme(商標)としてNovo Nordisk A/Sから市販されるセルラーゼである。
特定の用途のための好ましいアミラーゼは、アルカリアミラーゼ、すなわち7〜12の範囲のpHで、それらの最大活性の少なくとも10%、好ましくは少なくとも25%、より好ましくは少なくとも40%の酵素活性を有する酸素である。より好ましいアミラーゼは、7〜12に範囲のpHでそれらの最大活性を有する酵素である。
デンプン分解酵素は、組成物の0.0001〜2重量%好ましくは0.00018〜0.06重量%、より好ましくは0.00024〜0.048重量%の純粋の酵素レベルで、本発明の洗剤組成物に組込まれる。
ペクチン分解酵素は、好ましくは合計組合物の0.0001〜2重量%、より好ましくは0.0005〜0.5重量%、最も好ましくは0.001〜0.1重量%(純粋な酵素)のレベルで、本発明に従って組成物中に導入される。
特定用途のための好ましいキシログルカナーゼは、アルカリキシログルカナーゼ、すなわち7〜12の範囲のpHで、それらの最大活性の少なくとも10%、好ましくは少なくとも25%、より好ましくは40%の酵素活性を有する酵素である。より好ましいキシログルカナーゼは、7〜12の範囲のpHで、それらの最大活性を有する酵素である。
本発明の洗剤組成物に含まれ得る追加の任意の洗剤成分は、漂白剤、例えばPB1,PB4, 及び400〜800μの粒子サイズを有するペルカルボネートを包含する。それらの漂白剤成分は、1又は複数の酸素漂白剤、及び選択される漂白剤に依存して、1又は複数の漂白活性化剤を含むことができる。存在する場合、酸素漂白化合物は典型的には、約1%〜約25%のレベルで存在するであろう。一般的に、漂白化合物は、非液体配合物、例えば粒状洗剤において任意の添加される成分である。
本発明のための適切な漂白剤は、活性化された又は活性化されていない漂白剤であり得る。
過酸化水素はまた、洗浄及び/又はすすぎ工程の開始又はその間、過酸化水素を発生できる酵素系(すなわち、酵素及びそのための基質)を添加することによって存在することができる。そのような酵素系は、ヨーロッパ特許出願0537381号に開示される。
漂白剤はまた、マンガン触媒を含むことができる。このマンガン触媒は、“Efficient mangamese catalysts for low-Temperature bleaching”、Nature 369 1994, pp.637-639に記載される化合物の1つであり得る。
もう1つの任意の成分は、シリコーン及びシリカ−シリコーン混合物により例示される石鹸の泡抑制剤である。シリコーンは一般的に、アルキル化されたポリシロキサン材料により表され得るが、ところがシリカは通常、細かく分割された形で使用され、シリカエーロゲル及びキセロゲル、及び種々のタイプの疎水性シリカにより例示される。それらの材料は粒質物として導入され得、ここで石鹸の泡抑制剤は好都合には、水溶性又は水分散性、実質的には非界面活性剤不透明過性キャリヤーに開放できるように導入される。他方では、石鹸の泡抑制剤は、液体キャリヤーに溶解され又は分散され、そして1又は複数の他の成分上に噴霧することによって適用され得る。
特に好ましいシリコーン石鹸の泡抑制剤は、ヨーロッパ特許出願第92201649.8号に記載されている。前記組成物は、ヒュームド非孔性シリカ、例えばAerosilRと組合して、シリコーン/シリカ混合物を含んで成る。
上記石鹸の泡抑制剤は通常、組成物の0.001〜2重量%、好ましくは0.01〜1重量%のレベルで使用される。
洗剤組成物に使用される他の成分、例えば土壌−沈殿防止剤、土壌−開放剤、蛍光増白剤、研磨剤、殺菌剤、曇り抑制剤、着色剤、及び/又は封入された又は封入されていない香料が使用され得る。
特に適切な封入材料は、イギリス特許第1,464,616号に記載されるような、多糖及びポリヒドロキシ化合物のマトリックスから成る水溶性カプセルである。
(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[(T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75
[式中、PEGは-(OC2H4)O-であり、POは(OC3H6O)であり、そしてTは(pOOC6H4CO)である]を有する。
本明細書における選択されたポリエステルは、約46重量%のジメチルテレフタル酸、約16重量%の1,2−プロパンジオール、約10重量%のエチレングリコール、約13重量%のジメチルスルホ安息香酸及び約15重量%のスルホイソフタル酸を含み、そして約3,000の分子量を有する。ポリエステル及びそれらの調製方法は、ヨーロッパ特許第311342号に記載されている。
布軟化剤もまた、本発明に従って、洗濯洗剤組成物中に導入され得る。それらの剤は、無機又は有機型のものであり得る。無機軟化剤は、GB-A-1 400898号及びアメリカ特許第5,019,292号に開示されるスメクタイトクレー(smectite clays)により例示される。有機布軟化剤は、GB-A1 514276号及びヨーロッパ特許第0011340号に開示されるように水不溶性第三アミンを含み、そしてモノC12-C14第四アンモニウム塩とのそれらの組み合わせがEP-B-0026528号に開示されており、そして前記剤は、ヨーロッパ特許第0242919号に開示されるように2つの長鎖アミドを含む。布軟化システムの他の有用な有機成分は、ヨーロッパ特許第0299575号及び第0313146号に開示されるように高分子量ポリ酸化エチレン材料を含む。
本発明の界面活性剤組成物は、0.001重量%〜10重量%、好ましくは0.01重量%〜2重量%、さらに好ましくは0.05重量%〜1重量%のポリマー性色素移動阻害物質を含む。該ポリマー性色素移動阻害物質は通常、界面活性剤組成物に取り込まれて、着色布地から、該界面活性剤組成物で洗浄される布地へ色素が移動するのを阻害する。これらのポリマーは、色素が洗濯物中の他の物質に結合する機会を有する前に、着色布地から離れていく色素と複合体を生成するかまたはこれを吸着する能力を有する。
このようなポリマーはまた、本発明の酵素の性能を増強する。
さらに、本発明のマンナナーゼは、製紙パルプ(化学パルプ、半パルプ、機械パルプまたはクラフトパルプ)の塩素を含まない漂白プロセスにおいて、これらの輝きを上昇させ、こうして漂白プロセスにおける過酸化水素のニーズを低減または排除するのに有用である。
本発明のマンナナーゼは、繊維の製造または界面活性剤と組合せた繊維のクリーニングのために、他の炭水化物分解酵素(例えば、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、種々のペクチナーゼ)と組合せて使用することができる。
本発明において「セルロース性材料」という用語は、綿、混紡綿、または天然もしくは人工セルロース物質(例えば、木材パルプのようなキシラン含有セルロース繊維由来)またはこれらの混紡から作られた、繊維、織布や不織布(ニット、織物、デニム、ヤーン、およびタオル地を含む)を意味する。
元糊の分解
グアールガムやローカストビーンガムのようなガラクトマンナンは、Tシャツへの捺染のような繊維の捺染、例えば食品や捺染糊のような増粘剤として広く使用されている。本発明の酵素または酵素調製物は、加工装置の残存食物の粘度を低下させ、従って加工後のクリーニングを促進するのに使用することができる。さらに、この酵素または酵素調製物は、捺染糊の粘度を低下させ、従って繊維の捺染後の過剰の捺染糊の洗浄を促進するのに有用であると考えられる。
本発明の酵素または酵素調製物は好ましくは、植物由来の物質を含有するマンナン、ガラクトマンナン、グルコマンナンまたはガラクトグルコマンナンの分解または修飾ための物質として有用である。このような物質の例としては、グアールガムやローカストビーンガムがある。
本発明のマンナナーゼは、植物由来の物質の物理化学的性質(例えば、粘度)を修飾するのに使用できる。例えばマンナナーゼは、マンナンを含有する飼料や食物の粘度を低下させ、粘性のあるマンナン含有物質の加工を促進するのに有用である。
本発明の酵素または酵素調製物はまた、液体コーヒー抽出物中に存在するガラクトマンナンの加水分解に、好ましくは(インスタント)コーヒーの凍結乾燥中のゲル形成を阻害するために使用される。好ましくは本発明のマンナナーゼは、酵素消費を低減させ、コーヒーの汚染を避けるために、固定化される。この使用はさらに、EP-A-676145で説明されている。
さらに、本発明の酵素は、ビージェイサービシーズ社(BJ Services Company) (米国テキサス州ヒューストン)の米国特許第5,806,597号,5,562,160号、5,201,370号、および5,067,566号に開示されたように、酵素破壊剤として有用であると考えられる。
活性試験ための測定法
マンナナーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の標準的試験方法により試験され、例えば、被験溶液を、0.2%AZCLガラクトマンナン(carob)(メガザイム(Megazyme)社のカタログ番号I-AZGMZとして入手できるエンド−1,4−ベータ−D−マンナナーゼの測定ための基質)(メガザイム(Megazyme)社のインターネットアドレス:http://www.megazyme.com/Purchase/index.html))を含有する寒天プレート中に開けた直径4mmの穴に適用する。
基質:0.1Mグリシン緩衝液(pH10.0)中のcarob由来の0.2%AZCLガラクトマンナン(メガザイム(Megazyme)、オーストラリア)。
この測定法は、サーモミキサー上のエッペンドルフマイクロチューブ1.5ml中で攪拌しながら温度を40℃に制御して行われる。0.750mlの基質を0.05mlの酵素と20分間インキュベートし、15000rpmで4分遠心分離して反応を停止させる。基質の色を、1cmのキュベット中で600nmで測定する。
1ManU(マンナナーゼ単位)は、1cmで0.24の吸光度を与える。
前述のバチルス・スペーシスI633は、配列番号1に示すDNA配列をコードするベータ−1,4−マンナナーゼを含む。
大腸菌DSM12197は、本発明のベータ−1,4−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む(配列番号1)。
前述のバチルス・アガラダエレンス(Bacillus agaradhaerens)NCIMB40482は、配列番号5に示すDNA配列をコードするベータ−1,4−マンナナーゼを含む。
大腸菌DSM12180は、本発明のベータ−1,4−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む(配列番号5)。
大腸菌DSM12433は、本発明のベータ−1,4−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む(配列番号9)。
前述のバチルス・ハロデュランス(Bacillus halodurans)は、配列番号11に示すDNA配列をコードするベータ−1,4−マンナナーゼを含む。
大腸菌DSM12441は、本発明のベータ−1,4−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む(配列番号11)。
前述のフミコラ・インソレンス(Humicola insolens)は、配列番号13に示すDNA配列をコードするベータ−1,4−マンナナーゼを含む。
前述のバチルス・スペーシスAA349は、配列番号15に示すDNA配列をコードするベータ−1,4−マンナナーゼを含む。
大腸菌DSM12432は、本発明のベータ−1,4−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む(配列番号15)。
大腸菌DSM12847は、本発明のベータ−1,4−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む(配列番号17)。
大腸菌DSM12848は、本発明のベータ−1,4−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む(配列番号19)。
大腸菌DSM12849は、本発明のベータ−1,4−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む(配列番号21)。
大腸菌DSM12850は、本発明のベータ−1,4−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む(配列番号23)。
バチルス・スペーシスは、配列番号25に示すDNA配列をコードするベータ−1,4−マンナナーゼを含む。
大腸菌DSM12846は、本発明のベータ−1,4−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む(配列番号25)。
大腸菌DSM12851は、本発明のベータ−1,4−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む(配列番号27)。
前述のバチルス・リケニホルミス(licheniformis)は、配列番号29に示すDNA配列をコードするベータ−1,4−マンナナーゼを含む。
大腸菌DSM12852は、本発明のベータ−1,4−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む(配列番号29)。
バチルス・スペーシスは、配列番号31に示すDNA配列をコードするベータ−1,4−マンナナーゼを含む。
大腸菌DSM12436は、本発明のベータ−1,4−マンナナーゼをコードするDNAを含有するプラスミドを含む(配列番号31)。
microbiology)、p. 618)。
特に明記しないバチルスIIは、DNA操作と形質転換は、分子生物学の標準的方法を使用して行った(サムブルーク(Sambrook)ら、モレキュラークローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨーク:アウスベル(Ausubel, F.M.)ら(編)、「分子生物学の現代のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ(John Wiley and Sons)、1995:ハーウッド(Harwod, C.R.)とカッティング(Cutting, S.M.)(編)「バチルス(Bacillus)ための分子生物学的方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ(John Wiley and Sons)、1990)。
pSJ1678:(WO94/19454として発行された国際特許出願を参照されたい)。
pBK-CMV(ストラタジーン社(Stratagene inc)、ラホヤ、カリホルニア州)
pMOL944。このプラスミドは、プラスミドを枯草菌(Bacillus subtilis)中で繁殖できるようにする成分と、カナマイシン耐性遺伝子を実質的に含有し、バチルス・リケニホルミス(B. licheniformis)ATCC14580由来の強いプロモーターとシグナルペプチドを有する、pUB110誘導体である。シグナルペプチドは、SacII部位を含有し、シグナルペプチドと融合したタンパク質の成熟部分をコードするDNAをクローン化するのに便利である。このため、細胞の外側に対するプレ−プロテインが発現される。
このプラスミドは、通常の遺伝子操作法により作製され、以下に簡単に説明する。
pUB110プラスミド(マッケンジー(McKenzie, T.)ら、1986, Plasmid 15:93-103)を、ユニークな制限酵素NciIで消化した。プラスミドpDN1981(ジョルゲンセン(P.L. Jorgensen)ら、1990, Gene, 96, p37-41)にコードされたamyLプロモーターから増幅したPCR断片を、NciIで消化し、NciI消化したpUB110中に挿入して、プラスミドpSJ2624を得た。
使用した2つのPCRプライマーは以下の配列を有する:
# LWN5494 5'-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3'
# lwn5495 5'-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3'
次にプラスミドpSJ2624をSacIとNotIで消化し、pDN1981上にコードされたamyLプロモーターで増幅したPCR断片を、SacI-NotI消化pSJ2624中に挿入して、プラスミドpSJ2670を得た。
このクローニングは、同じプロモーターで、しかし反対方向で最初のamyLプロモーターを置換している。PCR増幅に使用された2つのプライマーは以下の配列を有する:
#LWN5938 5'-GTCGGCGGCCGTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3'
#LWN5939 5'-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3'
#LWN7864 5'-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3'
#LWN7901 5' -AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3'
プライマー#LWN7901は、プラスミド中にSacII部位を挿入する。
バチルスの関連する株(例えば、バチルス(Bacillus)種I633)を、500mlのTY当たり50mlの1Mナトリウム−セスキカルボナートを添加して、pHを約9.7に調整したTY中で増殖させた。30℃、300rpmで24時間インキュベート後、細胞を採取し、ピッチャー(Pitcher)らが記載した方法によりゲノムDNAを単離した[ピッチャー(Pitcher, D. G.), サンダース(Saunders, N.A.), オーウェン(Owen, R. J);チオシアン酸グアニジウムによる細菌性ゲノムDNAの迅速抽出;Lett Appl Microbil 1989 8 151-156]。
TY(アウスベル(Ausubel, F.M.)ら(編)、「分子生物学の現代のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ(John Wiley and Sons)、1995に記載)。
LB寒天(アウスベル(Ausubel, F.M.)ら(編)、「分子生物学の現代のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ(John Wiley and Sons)、1995に記載)。
LBPGは、0.5%グルコースと0.05Mリン酸カリウム(pH7.0)を補足したLB寒天。
BPX培地は、EP0506780(WO91/09129)に記載されている。
NZY寒天(1リットル当たり) 5gのNaCl、2gのMgSO4、5gの酵母エキス、10gのNZアミン(カゼイン加水分解物)、15gの寒天;脱イオン水を加えて1リットルにし、NaOHでpHを7.5に調整し、オートクレーブする。
NZY上層寒天(1リットル当たり) 5gのNaCl、2gのMgSO4、5gの酵母エキス、10gのNZアミン(カゼイン加水分解物)、0.7%(w/v)アガロース;脱イオン水を加えて1リットルにし、NaOHでpHを7.5に調整し、オートクレーブする。
以下の非限定例により本発明を説明する。
ラムダザペクスプレス(lamdaZAPExpress)ベクター中のバチルス(Bacillus)I633由来のゲノムライブラリーの作製
バチルス(Bacillus)I633のゲノムDNAを、制限酵素Sau3Aで部分的に消化し、0.7%アガロースゲル(シーケム(SeaKem)アガロース、FMC、米国)で電気泳動によりサイズ分画した。1.5〜10kbの大きさの断片を単離し、DNA断片を1.5%アガロースゲルに逆に流して1つのDNAバンドに濃縮し、次にキアクイック(Qiaquick)ゲル抽出キットを製造業者(キアゲン社(Quiagen Inc.)、米国)の説明書に従って使用して、アガロースゲルスライスから断片を抽出した。
ゲノムライブラリーからの約5000プラーク形成単位(pfu)を、大腸菌XL1-Blue MRF'(ストラタジーン(Stratagene)、米国)を宿主として使用して、次にプレートを37℃で24時間インキュベートして、0.1%AZCL−ガラクトマンナン(メガザイム(MegaZyme)、オーストラリア、カタログ番号I-AZGMA)を含有するNZY−寒天プレート上に広げた。マンナナーゼ陽性ラムダクローンを、陽性ファージクローンの周りに青い加水分解輪を形成させて同定した。
大腸菌XL1-Blue細胞(ストラタジーン(Stratagene)、ラホヤ、カリホルニア州)を調製し、ストラタジーン(Stratagene)が推奨するように10mM MgSO4中に再懸濁した。マンナナーゼ陽性クローンからの純粋なファージストックの250μlのアリコートを、ファルコン2059試験管中で、200μlのXL1-Blue MRF'細胞(OD600=1.0)と>106 pfu/mlのエクサシスト(ExAssist)M13ヘルパーファージ(ストラタジーン(Stratagene))と一緒にし、混合物を37℃で15分間インキュベートした。3mlのMNYブロスを各試験管に加え、試験管を37℃で2.5時間インキュベートした。
ゲノムベータ−1,4−マンナナーゼクローンpBXM3のヌクレオチド配列を、両方の鎖からジデオキシ鎖停止法(サンガー(Sanger, F)., ニックレン(Nicklen, S.)、およびクールソン(Coulson, A. R.) (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467)により、500μgのキアゲン(Quiagen)精製した鋳型(キアゲン(Quiagen)、米国)、Taqデオキシ末端サイクル配列決定キット(パーキン・エルマー(Perkin-Elmer)、米国)、蛍光標識ターミネーター、および5pmolのpBK-CMVポリリンカープライマー(ストラタジーン(Stratagene)、米国)または合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、決定した。配列データの解析は、デベロー(Devereux)ら、1984(デベロー(Devereux, J.)、ヘベルリ(Haeberli, P.)、およびスミシーズ(Smithies, O.)、 (1984) Nucleic Acids Res. 387-395)に従って行った。
本発明のバチルス(Bacillus)種I633(すなわち、配列番号2)、バチルス・シルクランス(Bacillus circulans)(ジーンバンク(GenBank)/EMBL 受け入れ番号O66185)、ビブリオ種(受け入れ番号O69347)、ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)(受け入れ番号P51529)、およびカルジセルロシルプトー・サッカロリチカス(Caldicellulosiruptor saccharolyticus(受け入れ番号P22533)のグリコヒドロラーゼファミリー5ベータ−1,4−マンナナーゼの複数の配列の整列。複数の配列整列は、GCGウィスコンシン(Wisconsin)ソフトウェアパッケージ、バージョン8.1のPileUpプログラムを使用して、ギャップ作成ペナルティ3.00とギャップ伸長ペナルティ0.10を用いて、作成した。
バチルス(Bacillus)種I633からクローン化した本発明のファミリー5ベータ−1,4−マンナナーゼの推定アミノ酸配列は、バチルス・シルクランス(Bacillus circulans)(ジーンバンク(GenBank)/EMBL 受け入れ番号O66185)のベータ−1,4−マンナナーゼと75%の類似性と60.1%の同一性を示し、ビブリオ種(受け入れ番号O69347)のベータ−1,4−マンナナーゼと64.4%の類似性と44.6%の同一性を示し、
枯草菌(B.subtilis)中の触媒コアマンナナーゼ酵素のサブクローニングと発現
本発明のDNA配列をコードするマンナナーゼを、以下の2つのオリゴヌクレオチドからなるPCRプライマーセットを使用して増幅した:
BXM2.upper.SacII
5'-GTT GAG AAA GCG GCC GCC TTT TTT CTA TTC TAC AAT CAC ATT ATC-3'
BXM2.core.lower.NotI
5'-GAC GAC GTA CAA GCG GCC GCT CAC TAC GGA GAA GTT CCT CCA TCA G-3'
制限部位SacIIとNotIに下線を引いてある。
上記のように作成したPCR産物の45μlのアリコートを、キアクイック(QIAquick)PCR精製キット(キアゲン(Quiagen)、米国)を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。精製したDNAを、50μlの10mMトリス−塩酸(pH8.5)中で溶出した。5μgのpMOL944と25μlの精製PCR断片を、SacIIとNotIで消化し、0.8%低温ゲル化アガロース(シープラーク(SeqPlaque)GTG、FMC)ゲル中で電気泳動し、関係のある断片をゲルから切り出し、キアクイックゲル(QIAquick Gel)抽出キット(キアゲン(Quiagen)、米国)を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。
連結混合物を使用して、コンピタントな枯草菌(B. subtilis)PL2306を形質転換した。形質転換した細胞を、LBPG-10μg/mlカナマイシン−寒天プレート上に広げた。37℃で18時間インキュベート後、プレート上にコロニーが見られた。一晩培養ブロスからプラスミドDNAを単離して、いくつかのクローンを解析した。
発現
本発明のDNA配列をコードするマンナナーゼを、以下の2つのオリゴヌクレオチドからなるPCRプライマーセットを使用してPCR増幅した:
BXM2.upper.SacII
5'-CAT TCT GCA GCC GCG GCA AAT TCC GGA TTT TAT GTA AGC GG-3'
BXM2.lower.NotI
5'-GTT GAG AAA GCG GCC GCC TTT TTT CTA TTC TAC AAT CAC ATT ATC-3'
制限部位SacIIとNotIに下線を引いてある。
上記のように作成したPCR産物の45μlアリコートを、キアクイック(QIAquick)PCR精製キット(キアゲン(Quiagen)、米国)を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。精製したDNAを、50μlの10mMトリス−塩酸(pH8.5)中で溶出した。5μgのpMOL944と25μlの精製PCR断片を、SacIIとNotIで消化し、0.8%低温ゲル化アガロース(シープラーク(SeqPlaque)GTG、FMC)ゲル中で電気泳動し、関係のある断片をゲルから切り出し、キアクイックゲル(QIAquick Gel)抽出キット(キアゲン(Quiagen)、米国)を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。次に、単離したPCR DNA断片を、SacII-NotI消化し精製したpMOL944に連結した。連結は、0.5μgの各DNA断片、1UのT4 DNAリガーゼおよびT4リガーゼ緩衝液(ベーリンガーマンハイム(Boehringer-Mannheim)、ドイツ)を使用して、16℃で一晩行った。
クローンMB643を、2枚の邪魔板の付いた500mlの振盪フラスコ中で10μg/mlのカナマイシンとともに25×200mlのBPX培地中で、37℃、300rpmで5日間増殖させた。
実施例1で材料と方法に記載されたように得られたクローンMB748を、2枚の邪魔板の付いた500mlの振盪フラスコ中で10μg/mlのカナマイシンとともに25×200mlのBPX培地中で、37℃、300rpmで5日間増殖させた。
クローンMB748の振盪フラスコ培養液4500mlを採取し、pHを5.6に調整した。陽イオン性物質(10% C521)100mlと陰イオン性物質(A130)180mlを、凝集のために攪拌中に加えた。ソ−バル(Sorval)RC 3B遠心分離機を使用して6℃、9000rpmで20分遠心分離して、凝集した物質を分離した。上清を、ワットマンガラスフィルターGF/DとCを使用して清澄化し、最後にフィルトロンでカットオフ10kDaで濃縮した。
純粋な酵素は、SDS-PAGEで分子量34kDaの単一のバンドを与えた。
異なる量の基質ローカストビーンガムを使用して、0.1Mグリシン緩衝液中でpH10で40℃で20分インキュベートし、次に還元糖の生成を測定することにより測定を行った。定常状態中の還元糖のマイクロモルの生成の計算のために、グルコースを標準物質として使用した。
KCatは467/秒で標準偏差が13;
kMは0.7で標準偏差は0.07。
エリタクスソフトウェア・ユーケー(Erithacus Software U.K.)のレザーバロー(Leatherbarrow)によるコンピュータープログラムグラフィット(grafit)を、計算のために使用した。還元糖は、PHBAH法(レバー(Lever, M.)(1972), 炭水化物の比色法定量ための新しい反応、Anal. Biochem. 47, 273-279)を使用して測定した。
安定性:マンナナーゼは、室温で2日間インキュベート後、pH6.0〜11で充分安定であった。
pH活性プロフィールは、酵素がpH7.5〜pH10の間で60%以上の活性を有することを示す。
最適温度は、pH10で50であった。
DSC示差走査熱量測定は、酢酸ナトリウム緩衝液中でpH6.0で融点として66℃を与え、このマンナナーゼ酵素は熱安定性であることを示していた。
免疫学的性質:デンマークの会社DAKOの通常の技術を使用して、高度に精製したクローン化マンナナーゼに対して、ウサギポリクローナル単一特異性血清を作成した。血清は、本発明の粗の精製していないマンナナーゼとともにアガロースゲル中で好ましい単一の沈殿物を生成した。
緩衝液の代わりに市販の界面活性剤を使用して、前記したようにcarob度から0.2%AZCL−ガラクトマンナン(メガザイム(Megazyme)、オーストラリア)で40℃で20分インキュベートし、次に青色を測定することにより、実施例2に記載したように得られた酵素は、グリシン緩衝液中で、ヨーロッパ粉末界面活性剤Ariel Future中で60%の相対活性を有し、ヨーロッパ液体界面活性剤Ariel Future中で80%の相対活性を有し、US Tide粉末中で45%の相対活性を有し、US Tide液体界面活性剤中で37%の相対活性を有していた。これらの試験において界面活性剤濃度は、市販の界面活性剤のパッケージで推奨されたものであり、洗浄水は、ヨーロッパ(Ariel Future)条件で18度の硬度を有し、US条件(US Tide)で9度の硬度を有した。
クロストリジウム・サーモセルム(Clostridium thermocellum)YS株(プール(Poole D M);モラグ(Morag E);ラメド(Lamed R);バイアー(Bayer EA);ヘーズルウッド(Hazlewood GP);ギルバート(Gilbert HJ)(1992)、 クロストリジウム・サーモセルム(Clostridium thermocellum)YSからのセルロソームサブユニットS1のセルロース結合ドメインの同定、Fems Microbiology Letters Vol. 78, No. 2-3 pp. 181-186)からのCipB遺伝子のDNA配列をコードするCBDは、すでにベクターpMOL1578中に導入されていた。
マンナナーゼ.Upper.SacII
5'-CAT TCT GCA GCC GCG GCA AAT TCC GGA TTT TAT GTA AGC GG-3'
マンナナーゼ.Lower.NheI
5'-CAT CAT GCT AGC TGT AAA AAC GGT GCT TAA TCT CG-3'
制限部位NheIとNotIに下線を引いてある。
上記のように作成したPCR産物の45μlのアリコートを、キアクイック(QIAquick)PCR精製キット(キアゲン(Quiagen)、米国)を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。精製したDNAを、50μlの10mMトリス−塩酸(pH8.5)中で溶出した。5μgのpMOL993と25μlの精製PCR断片を、SacIIとNheIで消化し、0.7%低温ゲル化アガロース(シープラーク(SeqPlaque)GTG、FMC)ゲル中で電気泳動し、関係のある断片をゲルから切り出し、キアクイックゲル(QIAquick Gel)抽出キット(キアゲン(Quiagen)、米国)を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。
連結混合物を使用して、コンピタントな枯草菌(B. subtilis)PL2306を形質転換した。形質転換した細胞を、LBPG-10μg/mlカナマイシン−寒天プレート上に広げた。37℃で18時間インキュベート後、プレート上にコロニーが見られた。一晩培養ブロスからプラスミドDNAを単離して、いくつかのクローンを解析した。
すなわち最終濃度は、以下の発現関連成分を含有する:(amyL−プロモーター)−(amyL−シグナルペプチド)−マンナナーゼ−リンカー−CBDを含有する。
MB1014をTY-培地中で37℃、250rpmで20時間インキュベートした。1mlの無細胞上清を、ミリポアH20中の200μlの10%Avicel(メルク、ダームスタット(Darmstadt)、ドイツ)と混合した。この混合物を0℃で0.5時間インキュベートした。AvicelへのこのBXM2−リンカー−CBD融合タンパク質の結合後、結合タンパク質を5000gで5分遠心分離した。ペレットを100μlのSDS-PAGE緩衝液中に再懸濁し、95℃で5分間沸騰させ、5000gで5分遠心分離し、25μlを4〜20%リームリ(Laemmli)トリス−グリシン、SDS-PAGE NOVEXゲル(Novex、米国)にのせた。
約53kDaのタンパク質バンドの出現は、プラスミドpMB1014上にコードされた完全長マンナナーゼ−リンカー−CGD融合体の枯草菌(B. subtilis)での発現を証明していた。
バチルス・アガラダエレンス(Bacillus agaradhaerens)からのマンナナーゼ遺伝子のクローニング
ゲノムDNA調製
バチルス・アガラダエレンス(Bacillus agaradhaerens)NCIMB40482を、WO94/01532に記載されているように、液体培地中で繁殖させた。30℃、300rpmで16時間インキュベート後、細胞を採取し、ピッチャー(Pitcher)らの方法によりゲノムDNAを単離した(ピッチャー(Pitcher, D. G.), サンダース(Saunders, N.A.), オーウェン(Owen, R. J)(1989), チオシアン酸グアニジウムを用いる細菌性ゲノムDNAの迅速抽出、Lett. Appl. Microbiol,, 8, 151-156)。
ゲノムDNAを制限酵素Sau3Aで部分的に消化し、0.7%アガロースゲル上で電気泳動によりサイズ分画した。2〜7kbの大きさの断片を、電気泳動によりDEAE−セルロースペーパー(ドレッツェン(Dretzen, G.), ベラード(Bellard, M.), サッソン−コルシ(Sassone-Corsi, P.),チャンボン(Chambon, P.)(1981)、 アガロースとアクリルアミドゲルからのDNA断片の回収ための信頼できる方法, Anal. Biochem., 112, 295-298)上に単離した。
単離したDNA断片を、BamHI消化したpSJ1678プラスミドDNAに連結し、連結混合物を使用して、大腸菌SJ2を形質転換した。
上記のように作製した大腸菌中のDNAライブラリーを、0.2%AZCL−ガラクトマンナン(メガザイム(Megazyme))と9μg/mlクロラムフェニコールを含有するLB寒天プレート上でスクリーニングし、37℃で一晩インキュベートした。マンナナーゼ活性を示すクローンは、青い拡散輪とともに現れた。これらのクローンの1つからのプラスミドDNAを、1mlの一晩培養ブロス上でキアゲンプラスミドスピンプレップにより単離した(細胞は、37℃で9μg/mlのクロラムフェニコールとともにTY中で250rpmでインキュベートした)。
配列データの解析は、デベロー(Devereux)ら(1984)Nucleic Acids Res. 12, 387-395に従って行った。マンナナーゼをコードする配列を配列番号5に示す。得られたタンパク質配列を、配列番号6に示す。
本発明のDNA配列をコードするマンナナーゼは、これらの2つのオリゴヌクレオチドからなるPCRプライマーセットを使用してPCR増幅した。
マンナナーゼ.upper.SacII
5'-CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCA AGT ACA GGC TTT TAT GTT GAT GG-3'
マンナナーゼ.lower.NotI
5'-GAC GAC GTA CAA GCG GCC GCG CTA TTT CCC TAA CAT GAT GAT ATT TTC G-3'
制限部位SacIIとNotIIに下線を引いてある。
上記のように作成したPCR産物の45μlアリコートを、キアクイック(QIAquick)PCR精製キット(キアゲン(Quiagen)、米国)を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。精製したDNAを、50μlの10mMトリス−塩酸(pH8.5)中で溶出した。
実施例5のように得られたクローンMB594を、2枚の邪魔板の付いた500mlの振盪フラスコ中で10μg/mlのカナマイシンとともに25×200mlのBPX培地中で、37℃、300rpmで5日間増殖させた。
純粋な酵素は、SDS-PAGEで分子量38kDaの単一のバンドを与えた。
マンナナーゼ酵素のアミノ酸配列(すなわち、翻訳されたDNA配列)を配列番号6に示す。
基質:ローカストビーンガム(carob)と還元糖分析(PHBAH)。ローカストビーンガムはシグマ(Sigma)から(G-0753)。
異なる濃度のローカストビーンガムを使用し40℃、pH10で20分インキュベートして、速度論測定を行うと以下が得られた:
KCat:467/秒。
Km:0.08g/L
MW:38kDa
pI(等電点):4.2
マンナナーゼの最適温度は60℃であった。
DSC示差走査熱量測定は、トリス緩衝液中でpH7.5で融点として77℃を与え、この酵素が熱安定性であることを示している。
carobからの0.2%AZCL−ガラクトマンナンを基質として使用して、上記したように40℃でインキュベートした洗剤適合性は、従来の液体洗剤と極めて良好な適合性を示し、従来の粉末洗剤と良好な適合性を示した。
実施例6に記載したように得られた精製酵素(バッチ#9813)は、従来の市販の液体洗剤を使用したミニ洗浄試験で1ppmのレベルで試験した時、改良したクリーニング性能を示した。試験は、従来の北アメリカ洗浄条件で行った。
バチルス(Bacillus)種AAI12からのゲノムライブラリーの作製
バチルス(Bacillus)種のゲノムDNAを、制限酵素Sau3Aで部分的に消化し、0.7%アガロースゲル(シーケム(SeaKem)アガロース、FMC、USA)で電気泳動によりサイズ分画した。1.5〜10kbの大きさの断片を単離し、DNA断片を1.5%アガロースゲルに逆に流して1つのDNAバンドに濃縮し、次にキアクイック(Qiaquick)ゲル抽出キットを製造業者(キアゲン社(Quiagen Inc.)、米国)の説明書に従って、アガロースゲルスライスから断片を抽出した。
ゲノムライブラリーからの約5000プラーク形成単位(pfu)を、大腸菌XL1-Blue MRF'(ストラタジーン(Stratagene)、米国)を宿主として使用して、次にプレートを37℃で24時間インキュベートして、0.1%AZCL-ガラクトマンナン(メガザイム(MegaZyme)、オーストラリア、カタログ番号I-AZGMA)を含有するNZY-寒天プレート上に広げた。マンナナーゼ陽性ラムダクローンを、陽性ファージクローンの周りに青い加水分解輪を形成させて同定した。
大腸菌XL1-Blue細胞(ストラタジーン(Stratagene)、ラホヤ、カリホルニア州)を調製し、ストラタジーン(Stratagene)が推奨するように10mM MgSO4 中に再懸濁した。マンナナーゼ陽性クローンからの純粋なファージストックの250μlのアリコートを、ファルコン2059試験管中で、200μlのXL1-Blue MRF'細胞(OD600=1.0)と>106 pfu/mlのエクサシスト(ExAssist)M13ヘルパーファージ(ストラタジーン(Stratagene))と一緒にし、混合物を37℃で15分間インキュベートした。
ゲノムベータ−1,4−マンナナーゼクローンpBXM1のヌクレオチド配列を、両方の鎖からジデオキシ鎖停止法(サンガー(Sanger, F)., ニックレン(Nicklen, S.)、およびクールソン(Coulson, A. R.) (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467)により、500μgのキアゲン(Quiagen)精製した鋳型(キアゲン(Quiagen)、米国)、Taqデオキシ末端サイクル配列決定キット(パーキン・エルマー(Perkin-Elmer)、米国)、蛍光標識ターミネーター、および5pmolのpBK-CMVポリリンカープライマー(ストラタジーン(Stratagene)、米国)または合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、決定した。配列データの解析は、デベロー(Devereux)ら、1984(デベロー(Devereux, J.)、ヘベルリ(Haeberli, P.)、およびスミシーズ(Smithies, O.)(1984)、Nucleic Acids Res. 387-395)に従って行った。
本発明のバチルス(Bacillus)種AAI12(すなわち、配列番号10)、カルジセルロシルプトー・サッカロリチカス(Caldicellulosiruptor saccharolyticus)(ジーンバンク(GenBank)/EMBL 受け入れ番号P77847)、ディクチオグロムス・サーモフィルム(Dictyoglomus thermophilum)(受け入れ番号O30654)、ロードサーマス・マリヌス(受け入れ番号P49425)、ManAによりコードされるピロミセス(Piromyces)種(受け入れ番号P55296)、バチルス(Bacillus)種(受け入れ番号P91007)、枯草菌(Bacillus subtilis)(受け入れ番号O05512)、およびシュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)(受け入れ番号P49424)からのグリコヒドロラーゼファミリー26の複数の配列の整列を、GCGウィスコンシン(Wisconsin)ソフトウェアパッケージ、バージョン8.1(前記参照)のPileUpプログラムを使用して、ギャップ作成ペナルティ3.00とギャップ伸長ペナルティ0.10を用いて、作成した。
バチルス(Bacillus)種AAI12からクローン化した本発明のファミリー26ベータ−1,4−マンナナーゼの推定アミノ酸配列は、カルジセルロシルプトー・サッカロリチカス(Caldicellulosiruptor saccharolyticus)(ジーンバンク(GenBank)/EMBL 受け入れ番号P77847)のベータ−1,4−マンナナーゼと45%の類似性と19.8%の配列同一性を示し、ディクチオグロムス・サーモフィルム(Dictyoglomus thermophilum)(受け入れ番号O30654)のベータ−1,4−マンナナーゼと49%の類似性と25.1%の同一性を示し、
枯草菌(B.subtilis)中のマンナナーゼのサブクローニングと発現
本発明のDNA配列をコードするマンナナーゼを、以下の2つのオリゴヌクレオチドからなるPCRプライマーセットを使用して増幅した:
BXM1.upper.SacII
5'-CAT TCT GCA GCC GCG GCA TTT TCT GGA AGC GTT TCA GC-3'
BXM1.lower.NotI
5'-CAG CAG TAG CGG CCG CCA CTT CCT GCT GGT ACA TAT GC-3'
制限部位SacIIとNotIに下線を引いてある。
上記のように作成したPCR産物の45μlのアリコートを、キアクイック(QIAquick)PCR精製キット(キアゲン(Quiagen)、米国)を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。精製したDNAを、50μlの10mMトリス−塩酸(pH8.5)中で溶出した。5μgのpMOL944と25μlの精製PCR断片を、SacIIとNotIで消化し、0.8%低温ゲル化アガロース(シープラーク(SeqPlaque)GTG、FMC)ゲル中で電気泳動し、関係のある断片をゲルから切り出し、キアクイックゲル(QIAquick Gel)抽出キット(キアゲン(Quiagen)、米国)を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。
連結混合物を使用して、コンピタントな枯草菌(B. subtilis)PL2306を形質転換した。形質転換した細胞を、LBPG-10μg/mlカナマイシン−寒天プレート上に広げた。37℃で18時間インキュベート後、プレート上にコロニーが見られた。一晩培養ブロスからプラスミドDNAを単離して、いくつかのクローンを解析した。
上記のように得られたクローンMB747を、2枚の邪魔板の付いた500mlの振盪フラスコ中で10μg/mlのカナマイシンとともに25×200mlのBPX培地中で、37℃、300rpmで5日間増殖させた。
クローンMB747の4100mlの振盪フラスコ培養液を採取し、pHを7.0に調整し、2mMになるようにEDTAを加えた。凝集のために攪拌しながら185mlの陽イオン物質(10% C521)と370mlの陰イオン性物質(A130)を加えた。ソ−バル(Sorval)RC 3B遠心分離機を使用して6℃、9000rpmで20分遠心分離して、凝集した物質を分離した。上清を、ワットマンガラスフィルターGF/DとCを使用して清澄化し、最後にフィルトロンでカットオフ10kDaで濃縮した。
純粋な酵素は、SDS-PAGEで分子量62kDaの単一のバンドを与えた。
マンナナーゼ酵素のアミノ酸配列(すなわち、翻訳されたDNA配列)を配列番号10に示す。
pI(等電点):4.5
DSC示差走査熱量計は、酢酸ナトリウム緩衝液中でpH6.0で融点として64℃を与え、このマンナナーゼ酵素は熱安定性であることを示していた。
触媒活性はイオン強度とともに上昇したため、高イオン強度のリン酸緩衝液の塩を使用することにより、酵素の比活性が上昇するかも知れないことを示している。
本発明のポリペプチドのマンナナーゼ活性は、カルシウムイオンにより阻害される。
バッファーおよびの代わりに市販の洗浄剤を用い、上記のイナゴマメ等級由来の0.2%AZCL−ガラクトマンナン(Megazyme, Australia)とともに40℃にて20分間インキュベートした後、青色の形成を調べたところ、実施例8に記載のようにして得られた酵素は、グリシンバッファーで測定された活性に対して、欧州の粉末洗剤Ariel Futurでは比活性132%、米国のTide粉末洗剤では比活性108%、米国のTide液体洗剤では比活性86%で活性を示した。これらの試験では洗剤濃度は市販の洗剤パッケージで推奨されている通りとし、洗浄水はドイツ硬度が欧州条件(Ariel Futur)下では18度、米国条件(米国Tide)下では9度である水道水であった。
pSJ1678ベクター内でのバチルス・ハロデュランス由来ゲノムライブラリーの構築
バチルス・ハロデュランスのゲノムDNAを制限酵素Sau3Aで部分消化し、0.7%アガロースゲル(SeaKemアガロース、FMC、USA)における電気泳動によりサイズ分画した。2ないし10kbの間のサイズのDNA断片をDEAE−セルロースペーパーにおける電気泳動により単離した(Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corsi, P., Chambon, P. (1981) アガロースおよびアクリルアミドゲルからDNA断片を回収する信頼性のある方法 Anal. Biochem., 112, 295-298)。単離されたDNA断片をBamHIで消化したpSJ1678プラスミドDNAと連結し、この連結混合物を用いて大腸菌(E. coli)SJ2を形質転換した。
宿主として大腸菌SJ2を用い、ゲノムライブラリーから約10,000コロニー形成単位(cfu)を9μg/mlクロラムフェニコールおよび0.1%AZCL-ガラクトマンナン(Megazyme, Australia, カタログ番号I-AZGMA)を含有するLB寒天プレートに置き、次いでこのプレートを37℃で24時間インキュベートした。
ゲノムβ−1,4−マンナナーゼクローンpBXM5のヌクレオチド配列は、Qiagenにより精製された鋳型(Qiagen, USA)500ngおよびTaqデオキシ末端サイクルシーケンシングキット(Perkin-Elmer, USA)、蛍光標識ターミネーター、およびpBK-CMVポリリンカープライマー(Stratagene, USA)または合成オリゴヌクレオチドプライマーのいずれか5pmolを用い、ジデオキシチェーンターミネーション法(Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467)により両鎖から決定した。配列データの解析はDevereux et al., 1984 (Devereux, J., Haeberli, P., and Smithies, O. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387-395)に従って行った。
本発明のバチルス・ハロデュランス(すなわち、配列番号12)、バチルス・シルクランス(Bacillus circulans)(GenBank/EMBL受託番号066185)、ビブリオ種(受託番号069347)、ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)(受託番号P51529)およびカルジセルロシルプトル・サッカロリチカス(Caldicellulosiruptor saccharolyticus)(受託番号P22533)由来のグリコヒドロラーゼファミリー5 β−1,4−マンナナーゼの多重配列アライメント。多重配列アライメントはGCGウィスコンシンソフトウェアパッケージ、バージョン8.1のPileUpプログラムを用い、ギャップ形成ペナルティー3.00およびギャップ伸長ペナルティー0.10で作製した。
バチルス・ハロデュランスからクローニングされた本発明のファミリー5 β−1,4−マンナナーゼの推定アミノ酸配列は、バチルス・シルクランス(GenBank/EMBL受託番号066185)のβ−1,4−マンナナーゼと77%の類似性および60%の配列同一性を、ビブリオ種(受託番号069347)由来のβ−1,4−マンナナーゼと64.2%の類似性および46%の配列同一性を、ストレプトミセス・リビダンス(受託番号P51529)由来のβ−1,4−マンナナーゼと63%の類似性および41.8%の配列同一性を、カルジセルロシルプトル・サッカロリチカス(受託番号P22533)由来のβ−1,4−マンナナーゼと60.3%の類似性および42%の配列同一性を示す。これらの配列はGCGウィスコンシンソフトウェアパッケージ、バージョン8.1のGAPプログラムを用い、ギャップ形成ペナルティー3.00およびギャップ伸長ペナルティー0.10で作製した。
B.サブチリス(B. subtilis)における成熟型全長マンナナーゼのサブクローニングおよび発現
本発明のマンナナーゼをコードするDNA配列はこれら2つのオリゴヌクレオチドからなるPCRプライマーセットを用いてPCR増幅した。
BXM5 上流 SacII
5'-CAT TCT GCA GCC GCG GCA CAT CAC AGT GGG TTC CAT G-3'
BXM5 下流 NotI
5'-GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT TAT TGA AAC ACA CTG CTT CTT TTA G-3'
制限部位SacIIおよびNotIは下線で示されている。
上記のようにして作製されたPCR産物のアリコート45μlを製造業者の指示に従いQIAクイックPCR増幅キット(Qiagen, USA)を用いて精製した。精製したDNAを10mM Tris-HCl、pH8.5 50μlに溶出した。
pMOL944 5μlおよび精製PCR断片25μlをSacIIおよびNotIで消化し、0.8%低固化温度アガロース(SeaPlaque GTG, FMC)ゲルで電気泳動に付し、適切な断片をゲルから切り取り、製造業者の指示に従いQIAクイックゲル抽出キット(Qiagen, USA)を用いて精製した。次いで、単離したPCR断片をSacII-NotIで消化して精製したpMOL944に連結した。連結は、各DNA断片0.5μl、T4 DNAリガーゼ1単位およびT4 リガーゼバッファー(Boehringer Mannheim, Germany)を用いて16℃で一晩行った。
上記のようにして得られたクローンMB878を、2個のバッフル付き500ml振盪フラスコにて、10μg/mlカナマイシンを含む25×200mlBPX培地中で、37℃、300rpmで5日間増殖させた。
この精製酵素はSDS-PAGEで、分子量34kDaの単一バンドを示した。
このマンナナーゼ酵素のアミノ酸配列、すなわち翻訳されたDNA配列は配列番号12に示されている。
精製タンパク質の下記N末端配列が決定された:AHHSGFHVNGTTLYDA。
至適温度(ManUアッセイ;グリシンバッファーを使用)はpH10では60℃〜70℃の間であることが分かった。
免疫学的特性:Danish社DAKOの常法を用い、高純度クローン化マンナナーゼに対してウサギポリクローナル単一特異性血清を作製した。この血清はアガロースゲル中で本発明の未精製マンナナーゼと良好な単一の沈殿を形成した。
バッファーおよびの代わりに市販の洗浄剤を用い、上記のイナゴマメ等級由来の0.2%AZCL-ガラクトマンナン(Megazyme, Australia)とともに40℃にて20分間インキュベートした後、青色の形成を調べたところ、実施例10に記載のようにして得られたマンナナーゼ酵素は、欧州の液体洗剤Ariel Futur、米国のTide粉末および液体洗剤において、バッファーにおける活性に対して40%より高い活性で活性を示した。これらの試験では洗剤濃度は市販の洗剤パッケージで推奨されている通りとし、洗浄水はドイツ硬度が欧州条件(Ariel Futur)下では18度、米国条件(米国Tide)下では9度である水道水であった。
バチルス種(AA349)マンナナーゼ遺伝子のクローニング
B.サブチリスにおける触媒核マンナナーゼ酵素のサブクローニングおよび発現
本発明のマンナナーゼをコードするDNA配列は以下の2つのオリゴヌクレオチドからなるPCRプライマーセットを用いてPCR増幅した。
BXM7 上流 SacII
5'-CAT TCT GCA GCC GCG GCA AGT GGA CAT GGG CAA ATG C-3'
BXM7 下流 NotI
5'-GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT TAT TTT TTG TAT ACA CTA ACG ATT TC-3'
制限部位SacIIおよびNotIは下線で示されている。
上記のようにして作製されたPCR産物のアリコート45μlを製造業者の指示に従いQIAクイックPCR増幅キット(Qiagen, USA)を用いて精製した。精製したDNAを10mM Tris-HCl、pH8.5 50μlに溶出した。pMOL944 5μlおよび精製PCR断片25μlをSacIIおよびNotIで消化し、0.8%低固化温度アガロース(SeaPlaque GTG, FMC)ゲルで電気泳動に付し、適切な断片をゲルから切り取り、製造業者の指示に従いQIAクイックゲル抽出キット(Qiagen, USA)を用いて精製した。次いで、単離したPCR断片をSacII-NotIで消化して精製したpMOL944に連結した。連結は、各DNA断片0.5μl、T4 DNAリガーゼ1単位およびT4 リガーゼバッファー(Boehringer Mannheim, ドイツ)を用いて16℃で一晩行った。
上記のようにして得られたクローンMB879を、2個のバッフル付き500ml振盪フラスコにて、10μg/mlカナマイシンを含む25×200mlBPX培地中で、37℃、300rpmで5日間増殖させた。
クローンMB879の振盪フラスコ培養液400mlを回収し、pHを6.5に調整した。フロキュレーションのための振盪の間に、陽イオン物質(10% C521)19mlおよび陰イオン物質(A130)38mlを加えた。フロキュレートした材料を、Sorval RC 3B遠心分離機を用い、5000rpm、6℃にて25分間遠心分離することにより分離した。
このマンナナーゼ酵素のアミノ酸配列、すなわち翻訳されたDNA配列は配列番号16に示されている。
至適温度(ManUアッセイ;グリシンバッファーを使用)はpH10では60℃〜70℃の間であることが分かった。
免疫特性:Danish社DAKOの常法を用い、高純度クローン化マンナナーゼに対してウサギポリクローナル単一特異性血清を作製した。この血清はアガロースゲル中で本発明の未精製マンナナーゼと良好な単一の沈殿を形成した。
バッファーおよびの代わりに市販の洗浄剤を用い、上記のイナゴマメ等級由来の0.2%AZCL−ガラクトマンナン(Megazyme, Australia)とともに40℃にて20分間インキュベートした後、青色の形成を調べたところ、実施例12に記載のようにして得られたマンナナーゼ酵素は、欧州の液体洗剤Ariel Futur、および米国のTide液体洗剤において、バッファーにおける活性に対して65%より高い活性で活性を示した。このマンナナーゼは欧州のAriel Futur製粉末洗剤および米国のTide粉末洗剤においては35%より高い活性であった。これらの試験では洗剤濃度は市販の洗剤パッケージで推奨されている通りとし、洗浄水はドイツ硬度が欧州条件(Ariel Futur)下では18度、米国条件(米国Tide)下では9度である水道水であった。
フミコーラ・インソレンス由来ファミリー26 β−1,4−マンナナーゼの発現クローニング
真菌株および培養条件
フミコーラ・インソレンスDMS1800株は、WO97/32014に記載のようにして発酵させ、26℃で5日間増殖させた後に菌糸を採取し、直ちに液体窒素中で凍結させ、-80℃で保存した。
RNAの単離に使用するすべてのガラス製品は220℃で少なくとも12時間燃焼処理した。エッペンドルフ管、ピペットチップおよびプラスチックカラムはEtOh中0.1%ジエチルピロカーボネート(DEPC)で12時間処理してオートクレーブにかけた。バッファー類および水はすべて(ただし、Tris含有バッファーは除く)0.1%DEPCで37℃にて12時間処理してオートクレーブにかけた。
全RNAは、クアニジウムチオシアネートで抽出した後、以下の改良を用いた5.7M CsClクッション(Chirgwin et al., 1979)で超遠心分離を行うことによって調製した。凍結菌糸を液体窒素中、乳鉢と乳房で粉砕して微粉末とした後、予め冷却したコーヒーミルで粉砕し、直ちに5容量のRNA抽出バッファー(4M GuSCN、0.5%Na−ラウリルサルコシン、25mM クエン酸ナトリウム、pH7.0、0.1M β−メルカプトエタノール)に懸濁した。
ポリ(A)+RNAはオリゴ(dT)セルロースアフィニティークロマトグラフィー(Aviv & Leder, 1972)により単離した。典型的には、0.2gのオリゴ(dT)セルロース(Boehringer Mannheim, 結合能の確認用)を10mlの1×カラム充填バッファー(20mM Tris-HCl、pH7.6、0.5M NaCl、1mM EDTA、0.1%SDS)中で予め膨潤させ、DEPC処理したプラグプラスチックカラム(Poly Prepクロマトグラフィーカラム、Bio Rad)に充填し、20mlの1×充填バッファーで平衡化した。この全RNAを65℃で8分間加熱し、5分間氷上でクエンチし、1容量の2×カラム充填バッファーを添加した後、RNAサンプルをカラムに装填した。
第一鎖の合成
F. S. Hagen (pers. comm.)により開発されたヘアピン改良法を用いたRNアーゼH法(Gubler & Hoffman 1983, Sambrook et al., 1989)により、5mgのフミコーラ・インソレンスポリ(A)+RNAから二本鎖cDNAを合成した。ポリ(A)+RNA(DEPC処理水5ml中5mg)を70℃で8分間加熱して氷上でクエンチし、各dNTP(Pharmacia)1mM、40単位のヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤(RNasin, Promega)、10mgのオリゴ(dT)12-18プライマー(Pharmacia)および1000単位のSuperScript II RNアーゼ H-逆転写酵素(Bethesda Research Laboratories)を含有する1mM逆転写酵素バッファー(50mM Tris-Cl、pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT、Bethesda Research Laboratories)で最終量50mlとした。反応混合物を45℃で1時間インキュベートすることにより、第一鎖cDNAを合成した。
合成後、30mlの10mM Tris-Cl、pH7.5、1mM EDTAを加え、40mgのグリコーゲン担体(Boehringer Mannheim)、20容量の10M NH4Acおよび2.5容量の96%EtOHを添加することにより、mRNA:cDNAハイブリッドを-20℃で12時間、エタノール沈殿させた。このハイブリッドを遠心分離により回収し、70%EtOHで洗浄し、風乾し、各dNTP100m、44単位の大腸菌DNAポリメラーゼI(Amersham)、6.25単位のRNアーゼ H(Bethesda Research Laboratories)および10.5単位の大腸菌DNAリガーゼ(New England Biolabs)を含有するM250mlの第二鎖バッファー(20mM Tris-Cl、pH7.4、90mM KCl、4.6mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、16mM βNAD+)に再懸濁した。第二鎖cDNAの合成は、反応試験管を16℃で3時間インキュベートすることにより行い、EDTAを添加して最終濃度20mMとすることにより反応を停止した後、フェノール抽出した。
2容量の96%EtOH、0.1容量の3M NaAc、pH5.2を添加することにより、二本鎖(ds)cDNを-20℃で12時間エタノール沈殿させ、遠心分離により回収し、70%EtOHで洗浄し、乾燥させ(SpeedVac)、36単位のマングマメヌクレアーゼ(Bethesda Research Laboratories)を含有する30mlのマングマメヌクレアーゼバッファー(30mM NaAc、pH4.6、300mM NaCl、1mM ZnSO4、0.35mM DTT、2%グリセロール)に再懸濁した。反応物を30℃で30分間インキュベートした後、70mlの10mM Tris-Cl、pH7.5、1mM EDTAを添加し、フェノール抽出して、2容量の96%EtOhおよび0.1容量の3M NaAc、pH5.2で-12℃にて12時間エタノール沈殿させることで一本鎖ヘアピンDNAをクリッピングした。
二本鎖cDNAを、各dNTP0.5mM、および7.5単位のT4 DNAポリメラーゼ(Invitrogen)を含有する50mlのT4 DNAポリメラーゼバッファー(20mM Tris-酢酸、pH7.9、10mM MgAc、50mM KAc、1mM DTT)中、37℃で15分間反応混合物をT4 DNAポリメラーゼとともにインキュベートすることにより平滑末端化した。EDTAを添加して最終濃度20mMとすることにより停止した後、フェノール抽出し、エタノール沈殿させた。
充填反応の後、600pmolのBst Iアダプターおよび5単位のT4リガーゼ(Invitrogen)を含有する30mlの連結反応バッファー(50mM Tris-Cl、pH7.8、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP、25mg/mlウシ血清アルブミン)中、反応混合物を16℃で12時間インキュベートすることにより、cDNAを非パリンドロームBstX Iアダプター(1mg/ml、Invitrogen)に連結した。70℃で5分間加熱することにより反応を停止させ、アダプターを付加したcDNAをアガロースゲル電気泳動(0.8%HSB−アガロース、FMC)でサイズ分画して連結していないアダプターと小cDNAを分離した。cDNAを排除限界0.7kbでサイズ選択し、10mM Tris-Cl、pH7.5、1mM EDTA中、100ボルトで1時間、cDNAをアガロースゲルから電気溶出し、フェノール抽出し、上記のように-20℃で12時間エタノール沈殿させた。
アダプターを付加した二本鎖cDNAを遠心分離により回収し、70%EtOH中で洗浄し、25mlのDIWに再懸濁した。大スケールライブラリー連結に先立ち、各々、1mlの二本鎖cDNA(#1〜#3)、2単位のT4リガーゼ(Invitorgen)および50ng(試験管#1)、100ng(試験管#2)また200ng(試験管#3および#4)Bst XIで切断したpYES 2.0ベクター(Invitrogen)を含有する連結反応バッファー(上記と同様)10ml中で4種の試験連結反応を行った。
個々のプールからの精製プラスミドDNA(100ng/ml)のアリコート1mlをエレクトロコンピテントS.セレビシエW3124(MATa;ura 3-52;leu 2-3、112;his 3-D200;pep 4-1137;prcl::HIS3、prb1::LEU2;cir+)細胞40ml(500mlYPD中OD600=1.5、冷DIW中で2回、冷1Mソルビトール中で1回洗浄し、1Mソルビトール0.5mlに再懸濁した、Becker & Guarante, 1991)へエレクトロポレーションした。
全長H.インソレンス β−1,4−マンナナーゼcDNAクローンpC1M59のヌクレオチド配列は、500ngのQiagen精製鋳型(Qiagen, USA)、Taqデオキシターミナルサイクルシーケンシングキット(Perkin-Elmer, USA)、蛍光標識ターミネーターおよび5pmolのpYES2.0ポリリンカープライマー(Invitrogen, USA)を用い、ジデオキシチェーンターミネーション法(Sanger et al. 1977)によって両鎖から決定した。配列データの解析はDevereue et al. (1984)に従って行った。
アスペルギルス・オリゼの形質転換
アスペルギルス・オリゼの形質転換は、Christensen et al., (1988), Biotechnology 6, 1419-1422によって記載されたように行った。
アスペルギルス発現のβ−1,4−マンナナーゼ発現カセットの構築
標準法を用いてマンナナーゼクローンpC1M59からプラスミドDNAを単離し、制限酵素解析により解析した。適当な制限酵素を用いてcDNA挿入部を切り出し、プラスミドp77の誘導体であるアスペルギルス発現ベクターpHD414に連結した(EP238023に記載)。pHD414の構築はWO93/11249にさらに記載されている。
一般法:100mlのYPD(Sherman et al., Methods in Yeast Gnetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981)にA.オリゼまたはA.ニゲルの胞子を接種し、37℃で約2日間振盪しながらインキュベートする。ミラクロスで濾過して菌糸を採取し、200mlの0.6M MgSO4で洗浄する。菌糸を15mlの1.2M MgSO4、10mMNaH2PO4、pH=5.8に懸濁する。この懸濁液を氷上で冷却し、120mgのノボザイム(登録商標)234を含有するバッファー1mlを加える。
Amds+-プレート(+0.01%Triton X-100)上の分生胞子によって精製し、YPM中、30℃で3日間増殖させた。
マンナナーゼ陽性アスペルギルス・オリゼ形質転換体の確認
アスペルギルス・オリゼ形質転換体からの上清を、基質として0.2%AZCl−ガラクトマンナン(MegaZyme, Australia)を含有する寒天プレート上でβ−1,4−マンナナーゼ活性に関して分析した。陽性形質転換体は、30℃で24時間インキュベートした後にプレートを青い加水分解ハローに関して分析することで確認した。
β−1,4−マンナナーゼを産生するアスペルギルス・オリゼ形質転換体からの上清のSDS-PAGE解析。形質転換体を5mlのYPM中で3日間増殖させる。10μlの上清を12%SDS-ポリアクリルアミドゲルに適用し、その後これをクマシーブリリアントブルーで染色した。
上記のように遺伝子をA.オリゼに形質転換し、形質転換株を、マルトースシロップ、スクロース、MgSO4、Ka2PO4、K2SO4、クエン酸酵母抽出物および微量の金属からなる標準培地を用い、発酵槽で増殖させた。インキュベーションは通気しながら34℃で6日間行った。
発酵液(5000ml)を回収し、濾過により液体から菌糸を分離した。この清澄な液体をフィルトロンで濃縮して275mlとした。
配列番号13のDNA配列は1〜21番にシグナルペプチドをコードしている。またその他のマンナナーゼに見られる機能が不明のドメインも、配列番号14のアミノ酸配列の22〜159番に示されており、触媒活性ドメインは配列番号14の160〜488番に見られる。
最も高い配列相同性は、DICTYOGLOMUS THERMOPHILUM(49%の同一性);マンナナーゼ配列EMBL;1997年7月にREEVES R.A., GIBBS M.D., BERGQUIST P.L.により寄託されたAF013989に対して認められた。
DSC(酢酸ナトリウムバッファー pH6.0中)は65°であった。
pH活性プロフィール(ManUアッセイを使用(40℃で20分間インキュベーション))は酵素がpH8で至適活性を有することを示している。
至適温度(ManUアッセイを使用;基質としてはMegaZyme AZCLローカストビーンガム)は、pH10では70℃であることが分かった。
免疫特性:Danish社DAKOの常法を用い、高純度クローン化マンナナーゼに対してウサギポリクローナル単一特異性血清を作製した。この血清はアガロースゲル中で本発明の未精製マンナナーゼと良好な単一の沈殿を形成した。
洗浄性能は、ローカストビーンガムで被覆した布帛を本発明のマンナナーゼを含む洗浄溶液中で洗浄することで評価した。洗浄後、布帛を酸化鉄で汚染することにより効果を視覚化した。
ローカストビーンガム布帛の準備:清浄な綿の布帛を2g/lのローカストビーンガムの溶液に浸し、室温で一晩乾燥させた。これらの布帛を水で予備洗浄し、再び乾燥させた。
汚染:これらの布帛を0.25g/lのFe2O3の入ったビーカーに入れ、3分間攪拌した。これらの布帛を水道水ですすぎ、乾燥させた。
評価:MacBath ColorEye 7000規約反射率分光光度計を用いて布帛の規約反射率を400nmで測定した。
Δ規約反射率=(R洗浄後−R洗浄前)酵素−(R洗浄後−R洗浄前)対照
(式中、Rは440nmでの規約反射率である)
として表した。
本発明のマンナナーゼは、バチルス種I633由来の対照マンナナーゼよりも若干良好な洗浄性能で、ローカストビーンガム布帛において明らかに有効である。
Δ規約反射率として示される、バチルス種I633由来のマンナナーゼ(実施例1〜3)と比較したフミコーラ・インソレンスファミリー26マンナナーゼの洗浄特性:
以下の例は本発明の組成物を例示するものであり、本発明の範囲を必ずしも制限または規定するものではない。
洗剤組成物において、酵素レベルは全組成物に対する純酵素重で表し、特に断りのない限り洗剤成分は全組成物に対する重量で表す。そこで略記された成分は以下の意味を有する。
Claims (36)
- (a)配列番号12の位置33〜331に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
(b)配列番号11の位置97〜993に示されるDNA配列によりコードされるポリペプチド、あるいは
(c)上記(a)又は(b)に定義されるポリペプチドと少なくとも90%のアミノ酸配列の同一性を有する、前記ポリペプチドの類似体、
であるマンナナーゼ。 - バチルスsp. (Bacillus sp.) の株に由来する請求項1記載のマンナナーゼ。
- i)40℃で測定される場合、7.5〜10のpH範囲で少なくとも40%の相対マンナナーゼ活性、ここで当該相対マンナナーゼ活性は、7.5〜10のpH範囲にある最適pHにおける活性を100%としたものである;
ii) SDS−PAGEにより決定される場合、34kDaの分子量;及び/又は
iii) N−末端配列AHHSGFHVNGTTLYDA;
を有する請求項2記載のマンナナーゼ。 - マンナナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含んで成るポリヌクレオチド分子であって、前記DNA配列が、
(a)配列番号11における位置97〜993に示されるDNA配列又はその相補的鎖;
(b)前記(a)におけるDNAと少なくとも90%相同である、上記(a)に定義されるDNA配列の類似体;
(c)高い緊縮下で、配列番号11における位置97〜993に示される配列を含んで成る二本鎖DNAプローブとハイブリダイズするDNA配列;
(d)遺伝子コードの縮重性のために、上記(a)〜(c)の配列とハイブリダイズしないが、しかしそれらのDNA配列のいずれかによりコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を正確に有するポリペプチドをコードするDNA配列;
を含んで成るポリヌクレオチド分子。 - マンナナーゼ活性を示す酵素をコードする前記DNA配列が、糸状菌、酵母又は細菌から得られる、請求項4記載のポリヌクレオチド分子。
- 前記細菌がバチルス(Bacillus)又はカルジセルロシルプトル(Caldicellulosiruptor)であり、そして前記糸状菌がヒューミコラ(Humicola)である、請求項5記載のポリヌクレオチド分子。
- 高い緊縮条件下で、変性された二本鎖DNAプローブにハイブリダイズする、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子であって、前記プローブが、配列番号11の位置97〜993に示される配列を含んで成るDNAプローブ、及び少なくとも約100個の長さの塩基対を有する配列番号11の位置97〜993の副配列を含んで成るDNAプローブから成る群から選択される、当該ポリヌクレオチド分子。
- 次の作用可能に連結された要素:転写プロモーター;上記(a)配列番号11に示されるヌクレオチド97〜ヌクレオチド993のヌクレオチド配列を含んで成る、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、(b)配列番号12のアミノ酸残基33〜アミノ酸残基331のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一である、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、及び(c)上記(a)又は(b)の縮重ヌクレオチド配列から成る群から選択されたDNAセグメント;及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクター。
- DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する、請求項8記載の発現ベクターを導入されている培養された細胞。
- (a)配列番号12に示されるアミノ酸残基33〜アミノ酸残基331のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド分子;及び(b)配列番号12のアミノ酸残基33〜アミノ酸残基331のアミノ酸配列に対して少なくとも90%のアミノ酸配列の同一性を有するポリペプチド分子、から成る群から選択されたマンナナーゼ活性を有するポリペプチド。
- バチルス・ハロドダンス(Bacillus halodurans)により生成される請求項10記載のポリペプチド。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のマンナナーゼ又は請求項10若しくは11記載のポリペプチドを含んで成る酵素調製物。
- マンナナーゼ活性を有するポリペプチドを生成するための方法であって、請求項8記載の発現ベクターを導入されている細胞又は請求項9に記載の細胞を培養し、それにより、前記細胞がDNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現し;そして前記ポリペプチドを回収する、ことを含んで成る方法。
- プロテアーゼ、セルラーゼ(エンドグルカナーゼ)、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、他のマンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はそれらの混合物から成る群から選択された1又は複数の酵素をさらに含んで成る請求項12記載の酵素調製物。
- (i)同種不純物を有さず、そして(ii)請求項13記載の方法により生成される、マンナナーゼ活性を有する酵素。
- 有効量の請求項12若しくは14記載の酵素調製物、有効量の請求項1〜3のいずれか1項記載のマンナナーゼ又は有効量の請求項15に記載の酵素により、セルロース、合成ファイバー、糸、織布又は不織布を処理することを含んでなる、セルロース、合成ファイバー、糸、織布又は不織布の性質を改良するための方法。
- 前記酵素調製物又は酵素が糊抜工程段階に使用される請求項16記載の方法。
- 植物材料の変性又は修飾のための方法であって、前記植物材料を有効量の請求項12若しくは14記載の酵素調製物、有効量の請求項1〜3のいずれか1項記載のマンナナーゼ又は有効量の請求項15に記載の酵素により処理する方法。
- 前記植物材料が、リサイクル故紙;機械的、化学的、半化学的クラフト又は他のクラフト紙製造用パルプ;浸水工程にゆだねられたファイバー;又はグアーガムもしくはイナゴマメガム含有材料である請求項18記載の方法。
- 液体コーヒー抽出物を処理するための方法であって、前記コーヒー抽出物を有効量の請求項12若しくは14記載の酵素調製物、有効量の請求項1〜3のいずれか1項記載のマンナナーゼ又は有効量の請求項15に記載の酵素により処理する方法。
- 請求項12若しくは14記載の酵素調製物、請求項1〜3のいずれか1項記載のマンナナーゼ又は請求項15に記載の酵素を含んで成る洗浄組成物。
- セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼ;並びに従来の洗剤成分から選択された酵素をさらに含んで成る請求項21記載の洗浄組成物。
- 前記酵素調製物又はマンナナーゼが、組成物合計の0.0001〜2重量%(純粋な酵素)のレベルで存在する請求項21又は22記載の洗浄組成物。
- 前記酵素調製物又はマンナナーゼが、組成物合計の0.0005〜0.5重量%(純粋な酵素)のレベルで存在する請求項23記載の洗浄組成物。
- 前記酵素調製物又はマンナナーゼが、組成物合計の0.001〜0.1重量%(純粋な酵素)のレベルで存在する請求項24記載の洗浄組成物。
- 前記酵素がアミラーゼである請求項22記載の洗浄組成物。
- セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択されたさらにもう1つの酵素をさらに含んで成る請求項26記載の洗浄組成物。
- アニオン性、非イオン性、カチオン性界面活性剤、及び/又はそれらの混合物から選択された界面活性剤を含んで成る請求項21〜27のいずれか1項記載の洗浄組成物。
- 漂白剤を含んで成る請求項21〜28のいずれか1項記載の洗浄組成物。
- ビルダーを含んで成る請求項21〜29のいずれか1項記載の洗浄組成物。
- 2つの長い鎖を含んで成るカチオン性界面活性剤を含んで成る繊維製品軟化用の、請求項21〜30のいずれか1項記載の洗浄組成物。
- 布の機械処理のための方法であって、請求項12若しくは14項記載の酵素調製物、請求項1〜3のいずれか1項記載のマンナナーゼ又は請求項15に記載の酵素を含む洗浄溶液により、機械洗浄工程の洗浄サイクルの間、繊維製品を処理することを含んで成る方法。
- セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択された酵素と共に、請求項12若しくは14項記載の酵素調製物、請求項1〜3のいずれか1項記載のマンナナーゼ又は請求項15に記載の酵素の、繊維製品清浄及び/又は繊維製品しみぬきのためのクリーニング組成物への使用。
- セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択された酵素と共に、請求項12若しくは14記載の酵素調製物、請求項1〜3のいずれか1項記載のマンナナーゼ又は請求項15に記載の酵素の、硬質表面、例えば床、壁、浴室のタイル及び同様のものを清浄するためのクリーニング組成物への使用。
- セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択された酵素と共に、請求項12若しくは14記載の酵素調製物又は請求項1〜3のいずれか1項記載のマンナナーゼの、手による及び機械皿洗いのためのクリーニング組成物への使用。
- セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及び/又はキシログルカナーゼから選択された酵素と共に、請求項12もしくは14記載の酵素調製物、請求項1〜3のいずれか1項記載のマンナナーゼ又は請求項15に記載の酵素の、経口、歯、コンタクトレンズ及び身辺清浄用途のための洗浄組成物への使用。
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