JP2004500004A - 新規マンナナーゼ - Google Patents

Abstract

例えば配列番号２の３１〜３３０番で示されるアミノ酸配列を含んでなる新規なマンナナーゼ、もしくはそれらの相同体は、例えばバチルス種Ｉ６３３から誘導してもよいし、あるいは配列番号１のヌクレオチド９１番〜ヌクレオチド９９０番で示されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド分子、配列番号２のアミノ酸残基３１番〜アミノ酸残基３３０番のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を持つポリペプチドをコードする、またはそのポリヌクレオチド配列を変性するポリヌクレオチド分子によりコードされていてもよい。該マンナナーゼはアルカリ性であり、例えば洗浄組成物、植物材料の改良およびセルロース繊維の処理のため地下系の形成を破壊するのに有用な破壊液において有用である。

Description

【０００１】
本発明は、微生物マンナナーゼ、より具体的には、中性及びアルカリｐＨ範囲でそれらの主要酵素活用そしてマンナナーゼ活性を示す微生物酵素；そのような酵素を生成する方法；及びパルプ、布、油田掘削、清浄、洗濯、洗剤及びセルロース繊維加工産業へのそのような酵素の使用方法に関する。
【０００２】
発明の背景：
マンナン含有多糖類は、木材におけるヘミセルロース画分、及び多くのマメ科種子及び非マメ科植物のいくつかの成熟種子における内胚乳の主要成分である。実質的に置換されていない線状β−１、４−マンナンは、いくつかの非マメ科植物に見出される。例えば、ゾウゲヤシに存在する置換されていないβ−１、４−マンナンは、個々の多糖鎖の配座においてセルロースに似ており、そして水不溶性である。マメ科種子において、水溶性ガラクトマンナンは、合計乾量の２０％までを構成する主要貯蔵炭水化物である。
【０００３】
ガラクトマンナンは、単一のα−１，１，６−ガラクトースにより置換された、任意にはアセチル基により置換された線状β−１，４−マンナン主鎖を有する。マンナンはまた、いくつかの単子葉植物にも見出され、そしてヤシ種子粉における細胞壁材料において最も豊富な多糖である。グルコマンナンは、多かれ少なかれ、規則的な態様で交互にβ−１，４−結合のマンノース及びグルコースの主鎖を有する線状多糖類であり、前記主鎖は任意には、ガラクトース及び／又はアセチル基により置換されている。マンナン、ガラクトマンナン、グルコマンナン及びガラクトグルコマンナン（すなわち、枝分かれガラクトースを有するグルコマンナン主鎖）は、軟木ヘミセロースの５０％以上に寄与する。
【０００４】
さらに、多くの赤藻類のセルロースは、有意な量のマンノースを含む。マンナナーゼは、いくつかのバチルス生物に同定されている。例えば、Ｔａｌｂｏｔなど．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．５６， Ｎ．１１， ｐｐ．３５０５−３５１０ （１９９０） は、１６２ｋＤａの分量及び５．５〜７．５の最適ｐＨを有するダイマー形での、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するβ−マンナナーゼを記載する。Ｍｅｎｄｏｚａなど．， Ｗｏｒｌｄ Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， Ｖｏｌ． １０， Ｎｏ．５， ｐｐ．５５１−５５５ （１９９４） は、３８ｋＤａの分子量、ｐＨ５．０及び５５℃での最適ｐＨ及び４．８のｐＩを有する、バチルス・サブチリスに由来するβマンナナーゼを記載する。
【０００５】
日本特許出願第０３０４７０７６号は、ゲル濾過により測定される３７±３ｋＤａの分子量、３〜８の最適ｐＨ及び５．３〜５．４のｐＩを有する、バチルスｓｐ． に由来するβマンナナーゼを開示する。日本特許出願第６３０５６２８９号は、例えばマンナンのβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド結合を加水分解し、そしてマンノ−オリゴ糖を生成するアルカリ性熱安定βマンナナーゼの生成を記載する。日本特許出願第６３０３６７７５号は、アルカリ性ｐＨでβ−マンナナーゼ及びβ−マンノシダーゼを生成するバチルス微生物ＦＥＲＭ　Ｐ−８８５６を言及する。日本特許出願第０８０５１９７５号は、４３±ｋＤａ及び５７±３ｋＤａの分子量及び８〜１０の最適ｐＨを有する、好アルカリバチルスｓｐ． ＡＭ−００１に由来するアルカリβ−マンナナーゼを開示する。
【０００６】
パルプ及び紙の漂白において有用なバチルス・アミロリクエファシエンスからの精製されたマンナナーゼ、及びその生成方法が、ＷＯ９７／１１１６４に開示される。ＷＯ９１／１８９７４号は、極端なｐＨ及び温度で活性的なヘミセルラーゼ、例えばグルカナーゼ、キシラナーゼ又はマンナナーゼを記載する。ＷＯ９４／２５５７６号は、植物又は藻類細胞壁材料の分解又は変性のために有用であるマンナナーゼ活性を示す、アスペルギラス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）ＣＢＳ１０１．４３からの酵素を開示する。ＷＯ９３／２４６２２号は、リグノセルロース性パルプの漂白のために有用なトリコダーマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｅｅｉ）から単離されたマンナナーゼを開示する。
【０００７】
ＷＯ９５／３５３６２号は、植物起源のしみの除去のためのペクチナーゼ及び／又はヘミセルラーゼ及び任意にはセルラーゼ活性を有する植物細胞壁酵素を含む清浄組成物を開示し、そしてさらに、Ｃ１１ＳＢ．Ｇ１７株からのアルカリマンナナーゼを開示する。
例えば、清浄組成物又は異なった産業工程に適用される場合、またはアルカリ性ｐＨ範囲においてマンナナーゼ活性を示す新規且つ効果的な酵素を提供することが、本発明の目的である。
【０００８】
発明の要約：
本発明者は、実質的なマンナナーゼ活性を有する新規酵素、すなわちバチルス属の細胞株から得られる、マンナナーゼ活性を示す酵素を現在見出しており、そしてそのような酵素ををコードするＤＮＡ配列の同定に成功した。前記ＤＮＡ配列は、配列番号１， ５， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９及び３１として列挙する配列に列挙され；そして推定されるアミノ酸配列は、配列番号２， ６， １０， １２， １４， １６， １８， ２０， ２２， ２４， ２６， ２８， ３０及び３２として列挙する配列に列挙される。前記新規酵素は酵素分類ＥＣ３．２．１．７８における酵素命名法に従って分類されると思われる。
【０００９】
第１の観点においては、本発明は，ｉ） バチルスｓｐ．Ｉ６３３により生成されるポリペプチド、ｉｉ）配列番号２の位置３１〜３３０に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又はｉｉｉ）上記 ｉ） もしくはｉｉ） に定義されるポリペプチドと少なくとも６５％相同であり、１又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失又は付加により前記ポリペプチドから誘導され、又は精製された形での前記ポリペプチドに対して生ぜしめられたポリクローナル抗体と免疫学的に反応する前記定義されたポリペプチドの類似体であるマンナナーゼに関する。
【００１０】
１つの観点においては、本発明は、（ａ）マンナナーゼ活性を有し、そしてヌクレオチド９１〜ヌクレオチド９９０の配列番号１に示されるようなヌクレオチドの配列を含んで成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；（ｂ）上記（ａ）の種相同体；（ｃ）配列番号２のアミノ酸残基３１〜アミノ酸残基３３０のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％同一であるマンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポイヌクレオチド分子；上記（ｄ）（ａ），（ｂ）もしくは（ｃ）に対して相補的な分子；及び（ｅ）上記（ａ），（ｂ），（ｃ）又は（ｄ）の変性ヌクレオチド配列から成る群から選択された，単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１１】
本発明のマンナナーゼをコードするポリヌクレオチド分子（ＤＮＡ配列）を含んで成るプラスミドｐＢＸＭ３を用いて、寄託番号ＤＳＭ１２１９７として１９９８年５月２９日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ でのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ にブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたＥ．コリの株を形質転換した。
【００１２】
本発明のもう１つの観点においては、次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；（ａ）ヌクレオチド９１〜ヌクレオチド９９０の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成る、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、（ｂ）（ａ）の種相同体；（ｃ）アミノ酸残基３１〜アミノ酸残基３３０の配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％同一である、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の変性ヌクレオチド配列から成る群から選択されたＤＮＡセグメント；及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターが提供される。
【００１３】
本発明のさらにもう１つの観点においては、上記に開示されるような発現ベクターを導入されている培養された細胞が提供され、ここで前記細胞はＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する。
本発明のさらなる観点は、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸残基３１〜アミノ酸残基３３０のアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチド分子；（ｂ）上記（ａ）の種相同体；及び（ｃ）マンナナーゼ活性を示す第１ポリペプチド部分及びセルロース結合機能を示す第２ポリペプチド部分を含んで成るマンナナーゼ活性を有する融合タンパク質（前記第２ポリペプチドは好ましくは、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ），例えば配列番号４により示される結合タンパク質である）から成る群から選択されたマンナナーゼ活性を有する、単離されたポリペプチドを提供する。
【００１４】
本発明のもう１つの観点においては、他のポリペプチドと組合して、本発明の精製されたポリペプチドを含んで成る組成物が提供される。
本発明のもう１つの観点においては、上記に開示されるような発現ベクターを導入されている細胞を培養し、（それにより、前記細胞が前記ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する）、そして前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法が提供される。
【００１５】
本発明の新規酵素は、セルロース材料、特にセルロース含有ファイバー、糸、織布又は不織布の処理、機械紙−製造パルプ、クラフト紙又は再循環された故紙の処理、及び繊維の浸水のために有用である。　前記処理は、紙、又は被服又は布の製造の準備のための材料へのセルロース材料の加工の間（後者は、例えば糊抜き又は精練段階において存在する）；又はそのような布又は被服の産業用又は家庭用洗浄の間に実施され得る。
従って、さらなる観点においては、本発明は、本発明の酵素を含んで成る清浄又は洗剤組成物；及びセルロース含有ファイバー、糸、織布又は不織布、及び合成又は一部合成布の処理、例えば清浄のためへの本発明の酵素の使用に関する。
【００１６】
本発明の酵素は、続く染色操作における正しい応答のためのセルロース材料の調製における酵素精練工程及び／又は糊抜き（マンナン糊剤の除去）において有用である。前記酵素又は、マンナン含有プリント用ペーストの除去のためにも有用である。さらに、新規酵素を含んで成る洗剤組成物は、洗濯物上に存在する土壌又はしみ、特にマンナン含有食品、植物及び同様のものに起因する土壌及びスポトを除去し又は漂白することができる。さらに、新規酵素を含んで成る清浄又は洗剤組成物による処理は、白色度を改良し、そしてセルロース材料への土壌の結合を妨げる。
【００１７】
従って、本発明はまた、本発明のマンナナーゼを含んで成る清浄組成物、例えば洗濯、皿洗い、硬質表面クリーナー、身辺用クレンジング及び経口／歯用組成物にも関する。さらに、本発明は、マンナナーゼ、及びセルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択された酵素を含んで成るそのような清浄組成物にも関し、そのような組成物は、卓越した清浄性能、すなわち卓越したしみの除去、ディンギー清浄又は白色性維持を付与する。
【００１８】
定義：
本発明を、さらに詳細に論じる前、次の用語をまず定義するであろう。
用語“オルト体（ ｏｒｔｈｏｌｏｇ ）”（又は“種相同体”）とは、異なった種からの類似するポリペプチド又はタンパク質に対して相同性を有する１つの種から得られたポリペプチド又はタンパク質を示す。
用語“パラ体（ ｐａｒａｌｏｇ ）”とは、同じ種からの異なったポリペプチド又はタンパク質に対して相同性を有する所定の種から得られたポリペプチド又はタンパク質を示す。
【００１９】
用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連結された対象ポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る、線状又は環状ＤＮＡ分子を示す。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列を包含することができ、そして任意には、１又は複数の複製起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを含むことができる。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスＤＮＡに起因し、又は両要素を含むことができる。
【００２０】
本発明の発現ベクターは、組換えＤＮＡ方法に便利にゆだねられるいずれかの発現ベクターであり得、そしてベクターの選択はしばしば、それが導入される予定である宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわちその複製が染色体複製に無関係である、染色体外実存体として存在するベクター、例えばプラスミドであり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組込まれ、そしてそれが組込まれている染色体と共に複製されるベクターであり得る。
【００２１】
用語“組換え発現される”又は“組換え的に発現される”とは、ポリペプチド又はタンパク質の発現に関して本明細書において使用される場合、当業界における標準の定義に従って定義される。タンパク質の組換え的発現は一般的に、上記に記載されるような発現ベクターを用いることによって行われる。
【００２２】
用語“単離された”とは、ポリヌクレオチド分子に適用される場合、そのポリヌクレオチドがその天然の遺伝子環境から除去されており、そして従って他の外来の又は所望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成系内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてｃＤＮＡ及びゲノムクローンを含むそれらの分子である。本発明の単離されたＤＮＡ分子は、それらが通常関連する他の遺伝子を有さないが、しかし天然に存在する５’及び３’側の未翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターは含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明らかであろう（例えば、Ｄｙｎａｎ ａｎｄ Ｔｉｊａｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３１９： ７７４−７８， １９８５を参照のこと）。用語“単離されたポリヌクレオチド”とは他方では、“クローン化されたポリヌクレオチド”とも称することができる。
【００２３】
タンパク質／ポリペプチドに適用される場合、用語“単離された”とは、タンパク質がその天然の環境以外の条件において見出されることを示す。好ましい形においては、単離されたタンパク質は、他のタンパク質、特に他の相同タンパク質（すなわち“相同不純物”（下記参照のこと））を実質的に有さない。４０％よりも高い純粋な形、より好ましくは６０％よりも高い純粋な形でタンパク質を提供することが好ましい。
さらにより好ましくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される場合、高く精製された形、すなわち８０％以上、より好ましくは９５％以上、及びさらにより好ましくは９９％以上の純粋な形でタンパク質を提供することが好ましい。
【００２４】
用語“単離されたタンパク質 ／ ポリペプチド”とは、他方では、“精製されたタンパク質／ポリペプチド”とも呼ばれ得る。
用語“相同不純物”（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｐｕｒｉｔｙ）とは、本発明のポリペプチドが最初に得られる相同細胞に起因するいずれかの不純物（例えば、本発明のポリペプチド以外の他のポリペプチド）を意味する。
用語“〜から得られた”とは、特定の微生物源に関して本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドが特定源（相同発現）により、又はその源からの遺伝子が挿入されている細胞（非相同発現）により生成されることを意味する。
【００２５】
用語“作用可能に連結される”とは、ＤＮＡセグメントに言及する場合、そのセグメントが、それらの意図された目的に関して機能するよう、例えば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行するよう配列されることを意味する。
用語“ポリヌクレオチド”とは、５’から３’末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを示す。ポリヌクレオチドはＲＮＡ及びＤＮＡを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。
【００２６】
用語“ポリヌクレオチド分子の相補体”とは、対照配列に比較して、相補的な塩基配列及び逆の配向を有するポリヌクレオチドを示す。例えば、配列５’ ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ ３’は、５’ ＣＣＣＧＴＧＣＡＣ ３’に対して相補的である。
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を示す（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチド分子に比較して）。縮重コドンは、異なったヌクレオチドトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵ及びＧＡＣトリプレットはそれぞれ、Ａｓｐをコードする）。
【００２７】
用語“プロモーター”とは、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の部分を示す。プロモーター配列は通常、遺伝子の５’非コード領域に検出されるが、しかし必ずしもそうではない。
用語“分泌シグナル配列”とは、より大きなポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌経路を通してそのより大きなポリペプチドを方向づけるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするＤＮＡ配列を示す。大きなペプチドは、通常、分泌経路を通して、遷移の間、分泌ペプチドを除去するために分解される。
用語“酵素コア”とは、修飾又は変更されているか又はされていないが、しかしその元の活性を保持している単一ドメイン酵素を示し；当業界において知られているような触媒ドメインは損なわれていないまま及び機能的のまま存続した。
【００２８】
用語“リンカー”又は“スペーサー”とは、複数ドメインタンパク質、例えば酵素コアを含んで成る酵素のドメインと結合ドメイン、例えばセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）又はいずれか他の酵素ハイブリッドとの間に、又は融合ポリペプチド、例えば２種のコア酵素を含んで成る融合タンパク質として発現される２種のタンパク質又はポリペプチド間に存在することができる少なくとも２種のアミノ酸を含んで成るポリペプチドを意味する。例えば、ＣＢＤと酵素コアとの融合タンパク質は、酵素コアをコードするＤＮＡ配列、リンカーをコードするＤＮＡ配列及びＣＢＤをコードするＤＮＡ配列を、１つの読み取り枠中に連続的に融合し、そしてこの構造体を発現することによって供給される。
【００２９】
用語“マンナナーゼ”又は“ガラクトマンナナーゼ”とは、マンナン　エンド−１，４−β−マンノシダーゼと公的に命名され、そして他の名称β−マンナナーゼ及びエンド−１，４−マンナナーゼを有し、そしてマンナン、ガラクトマンナン、グルコマンナン及びガラクトグルコマンナンにおける１，４−β−Ｄ−マンノシドの結合の加水分解を触媒するものとして当業界において定義されているマンナナーゼ酵素を示し、この酵素はＥＣ３．２．１．７８としての酵素命名法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ／ｅｎｚｙｍｅ）に従って分類される。
【００３０】
発明の特定の記載：
他の関連する配列を得るためへの本発明の配列の使用法：本発明のマンナナーゼをコードするポリヌクレオチド配列に関連する本発明に開示される配列情報が他の相同マンナナーゼを同定するための手段として使用され得る。例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）が、種々の微生物源、特に異なったバチルス種からの他の相同マンナナーゼをコードする配列を増幅するために使用され得る。
【００３１】
活性試験についてのアッセイ：
マンナナーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、当業界において知られている標準の試験方法に従って、例えば０．２％のＡＺＣＬガラクトマンナン（ｃａｒｏｂ）、すなわちＭｅｇａｚｙｍｅの会社（Ｍｅｇａｚｙｍｅのインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｇａｚｙｍｅ．ｃｏｍ／Ｐｕｒｃｈａｓｅ／Ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）からカタログＮｏ．Ｉ−ＡＺＧＭＡとして入手できるエンド−１，４−Ｄ−マンナナーゼのアッセイのための基質を含む寒天プレートに押しぬかれた４ｍｍの直径の穴に試験されるべき溶液を適用することによって試験され得る。
【００３２】
ポリヌクレオチド：
本発明の好ましい態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも中位の緊縮条件下で、配列番号１の類似する大きさの領域にハイブリダイズするであろう。
【００３３】
特に、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示される十分な配列又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号１の位置９１〜９９０に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖ＤＮＡプローブ、又は少なくとも約１００個の長さの塩基対を有する、配列番号１の位置９１〜９９０に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろう。
【００３４】
ヌクレオチドプローブと相同ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の間の、中位又は高い緊縮下でのハイブリダイゼーションを決定するための適切な実験条件は、５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム、Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， １９８９）において、ハイブリダイズするＤＮＡフラグメント又はＲＮＡを含むフィルターの１０分間のプレソーキング、及び５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶液（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， １９８９）、０．５％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性され、音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， １９８９）の溶液におけるフィルターのプレハイブリダイゼーション、続いて、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のランダム−プライムされた（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ， Ａ． Ｐ． ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ， Ｂ． （１９８３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３２： ６−１３）、^３２Ｐ−ｄＣＴＰ−ラベルされた（１×１０^９ｃｐｍ／μｇよりも高い比活性）プローブを含む同じ溶液における約４５℃で１２時間のハイブリダイゼーションを包含する。
【００３５】
次に、フィルターは、２×ＳＳＣ， ０．５％ＳＤＳにより、少なくとも６０℃（中位の緊縮性）、さらにより好ましくは少なくとも６５℃（中位／た化位緊縮性）、さらにより好ましくは少なくとも７０℃（高い緊縮性）、及びさらにより好ましくは少なくとも７５℃（非常に高い緊縮性）で、３０分間、２度洗浄される。
オリゴヌクレオチドプローブがそれらの条件下でハイブリダイズする分子は、Ｘ−線フィルムを用いて検出される。
他の有用な単離されたポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号５， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９もしくは３１の類似するサイズの領域、又はそれらに対して相補的な配列に、少なくとも中位の緊縮条件下でハイブリダイズするであろうそれらのポリヌクレオチドである。
【００３６】
特に有用なポリヌクレオチドは次のものである：
配列番号１に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号１の位置９１〜９９０に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖ＤＮＡプローブ、又は少なくとも約１００個の長さの塩基対を有する、配列番号１の位置９１〜９９０に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００３７】
配列番号５に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号５の位置９４〜１０３２に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖ＤＮＡプローブ、又は少なくとも約１００個の長さの塩基対を有する、配列番号５の位置９４〜１０３２に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００３８】
配列番号９に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号９の位置９４〜１０８６に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖ＤＮＡプローブ、又は少なくとも約１００個の長さの塩基対を有する、配列番号９の位置９４〜１０８６に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００３９】
配列番号１１に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号１１の位置９７〜９９３に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖ＤＮＡプローブ、又は少なくとも約１００個の長さの塩基対を有する、配列番号１１の位置９７〜９９３に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４０】
配列番号１３に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号１３の位置４９８〜１４６４に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖ＤＮＡプローブ、又は少なくとも約１００個の長さの塩基対を有する、配列番号１３の位置４９８〜１４６４に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４１】
配列番号１５に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号１５の位置２０４〜１１０７に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖ＤＮＡプローブ、又は少なくとも約１００個の長さの塩基対を有する、配列番号１５の位置２０４〜１１０７に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４２】
配列番号１７に示される配列を含んで成る変性された二本鎖ＤＮＡプローブ、又は少なくとも約１００個の長さの塩基対を有する配列番号１７の副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４３】
配列番号１９に示される配列を含んで成る変性された二本鎖ＤＮＡプローブ、又は少なくとも約１００個の長さの塩基対を有する配列番号１９の副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４４】
配列番号２１に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号２１の位置８８〜９６０に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖ＤＮＡプローブ、又は少なくとも約１００個の長さの塩基対を有する、配列番号２１の位置８８〜９６０に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４５】
配列番号２３に示される十分な配列を含んで成る変性された二本鎖ＤＮＡプローブ、又は少なくとも約１００個の長さの塩基対を有する配列番号２３の副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４６】
配列番号２５に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号２５の位置９０４〜１８７４に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖ＤＮＡプローブ、又は少なくとも約１００個の長さの塩基対を有する、配列番号２５の位置９０４〜１８７４に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４７】
配列番号２７に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号２７の位置４９８〜１４８８に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖ＤＮＡプローブ、又は少なくとも約１００個の長さの塩基対を有する、配列番号２７の位置４９８〜１４８８に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４８】
配列番号２９に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号２９の位置７９〜１０８３に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖ＤＮＡプローブ、又は少なくとも約１００個の長さの塩基対を有する、配列番号２９の位置７９〜１０８３に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド；
【００４９】
及び配列番号３１に示される十分な配列、又は本発明のマンナナーゼの触媒的に活性のドメイン又は酵素コアをコードする、配列番号３１の位置１７７９〜２７０９に示されるセグメントを含んで成る部分配列のいずれかを含んで成る変性された二本鎖ＤＮＡプローブ、又は少なくとも約１００個の長さの塩基対を有する、配列番号３１の位置１７９９〜２７０９に示される副配列を含んで成るいずれかのプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下でハイブリダイズするであろうポリヌクレオチド。
【００５０】
前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。ＤＮＡ及びＲＮＡを単離するための方法は、当業界において良く知られている。興味ある遺伝子をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、当業界において知られている方法により、Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋｓ 及びＤＮＡライブラリーにおいてクローン化され得る。
次に、本発明のマンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが同定され、そして、例えばハイブリダイゼーション又はＰＣＲにより単離される。
【００５１】
本発明はさらに、異なった細菌株からの相対ポリペプチド及びポリヌクレオチド（オルト体又はパラ体）を提供する。バチルス ｓｐ． ，バチルス・アガラドハエレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・ハロジェランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・グラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）及びバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を包含するグラム−陽性好アルカリ菌株からのマンナナーゼポリペプチド；及び、カルジセルロジルプトルの種を包含する熱嫌気性細菌グループからのマンナナーゼポリペプチドが特に興味あるものである。また、菌類ヒューミコラ又はスキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、特にヒューミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）又はスキタリジウム・サーモフィラム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）種からのマンナナーゼポリペプチドが興味あるものである。
【００５２】
本発明のマンナナーゼ活性を有するポリペプチドの種相同体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明より提供される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、本発明のＤＮＡ配列は、タンパク質を発現する細胞型から得られる染色体ＤＮＡを用いて、クローン化され得る。適切なＤＮＡ源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザン又はサザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次にライブラリーが、陽性細胞系の染色体ＤＮＡから調製される。
【００５３】
次に、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明のＤＮＡ配列が、種々の方法により、例えば本明細書に開示される配列から企画されたプローブにより、又は開示される配列に基づいて１又は複数組みの変性プローブによりプローブすることによって単離され得る。本発明のＤＮＡはまた、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓ， アメリカ特許第４，６８３，２０２号）を用いて、又は本明細書に開示される配列からの企画されたプライマーを用いてクローン化され得る。
【００５４】
さらなる方法においては、ＤＮＡライブラリーは、宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され得、そして興味あるＤＮＡの発現が、材料及び方法、及び例１に記載のようにして、バチルス・ｓｐ．からクローン化され、発現され、そして精製された、マンナナーゼに対して生ぜしめられた抗体（モノクローナル又はポリクローナル）により、又はマンナナーゼ活性を有するポリペプチドに関連する活性試験により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノムクローンの単離に適用され得る。
Ｅ．コリＤＳＭ１２１９７に存在するプラスミドｐＢＸＭ３中にクローン化されるＤＮＡ配列（配列番号１）及び本発明の類似するＤＮＡ配列のマンナナーゼコード部分は、細菌種バチルスｓｐ．Ｉ６３３の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００５５】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号５のＤＮＡ配列）を用いて、寄託番号ＤＳＭ１２１８０として１９９８年５月１８日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ ＧｅｒｍａｎｙのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたＥ．コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号５のＤＮＡ配列）及び／又はその類似するＤＮＡ配列は、細菌バチルス・アガラドハエレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）の株、例えばＤＳＭ８７２１株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００５６】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号９のＤＮＡ配列）を用いて、寄託番号ＤＳＭ１２４３３として１９９８年１０月７日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ ＧｅｒｍａｎｙのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたＥ．コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号９のＤＮＡ配列）及び／又はその類似するＤＮＡ配列は、細菌バチルス・ｓｐ． ＡＡＩ１２の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００５７】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号１１のＤＮＡ配列）を用いて、寄託番号ＤＳＭ１２４４１として１９９８年１０月９日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ ＧｅｒｍａｎｙのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたＥ．コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号１１のＤＮＡ配列）及び／又はその類似するＤＮＡ配列は、細菌バチルス・ハロヂュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００５８】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号１３のＤＮＡ配列）を用いて、寄託番号ＤＳＭ９９８４として１９９５年５月１１日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ ＧｅｒｍａｎｙのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたＥ．コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号１３のＤＮＡ配列）及び／又はその類似するＤＮＡ配列は、菌類種ヒューミコラ・インソレンスの株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００５９】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号１５のＤＮＡ配列）を用いて、寄託番号ＤＳＭ１２４３２として１９９８年１０月５日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ ＧｅｒｍａｎｙのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたＥ．コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号１５のＤＮＡ配列）及び／又はその類似するＤＮＡ配列は、細菌バチルス・ｓｐ．ＡＡ３４９の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６０】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号１７のＤＮＡ配列）を用いて、寄託番号ＤＳＭ１２８４７として１９９９年６月４日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ ＧｅｒｍａｎｙのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたＥ．コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号１７のＤＮＡ配列）及び／又はその類似するＤＮＡ配列は、細菌バチルス・ｓｐ．の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６１】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号１９のＤＮＡ配列）を用いて、寄託番号ＤＳＭ１２８４８として１９９９年６月４日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ ＧｅｒｍａｎｙのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたＥ．コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号１９のＤＮＡ配列）及び／又はその類似するＤＮＡ配列は、細菌バチルス・ｓｐ．の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６２】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号２１のＤＮＡ配列）を用いて、寄託番号ＤＳＭ１２８４９として１９９９年６月４日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ ＧｅｒｍａｎｙのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたＥ．コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号２１のＤＮＡ配列）及び／又はその類似するＤＮＡ配列は、細菌バチルス・ｓｐ．の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６３】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号２３のＤＮＡ配列）を用いて、寄託番号ＤＳＭ１２８５０として１９９９年６月４日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ ＧｅｒｍａｎｙのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたＥ．コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号２３のＤＮＡ配列）及び／又はその類似するＤＮＡ配列は、細菌バチルス・ｓｐ．の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６４】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号２５のＤＮＡ配列）を用いて、寄託番号ＤＳＭ１２８４６として１９９９年６月４日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ ＧｅｒｍａｎｙのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたＥ．コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号２５のＤＮＡ配列）及び／又はその類似するＤＮＡ配列は、細菌バチルス・ｓｐ．の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６５】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号２７のＤＮＡ配列）を用いて、寄託番号ＤＳＭ１２８５１として１９９９年６月４日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ ＧｅｒｍａｎｙのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたＥ．コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号２７のＤＮＡ配列）及び／又はその類似するＤＮＡ配列は、細菌バチルス・ｓｐ．の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６６】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号２９のＤＮＡ配列）を用いて、寄託番号ＤＳＭ１２８５２として１９９９年６月４日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ ＧｅｒｍａｎｙのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたＥ．コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号２９のＤＮＡ配列）及び／又はその類似するＤＮＡ配列は、細菌バチルス・リケニホルミスの株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６７】
ポリヌクレオチド分子のマンナナーゼコード部分（配列番号３１のＤＮＡ配列）を用いて、寄託番号ＤＳＭ１２４３６として１９９８年１０月５日、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ， Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ ｌｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ ＧｅｒｍａｎｙのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ に、ブダペスト条約に従って、本発明者により寄託されたＥ．コリの株を形質転換し；前記ポリヌクレオチド分子のこのマンナナーゼコード部分（配列番号３１のＤＮＡ配列）及び／又はその類似するＤＮＡ配列は、細菌カルジセルロシルプトルｓｐ．の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００６８】
他方では、類似する配列は、Ｅ．コリＤＳＭ１２１９７に存在するプラスミド（結合された配列番号１に同一であると思われる）、Ｅ．コリＤＳＭ１２１８０に存在するプラスミド（結合された配列番号５に同一であると思われる）、Ｅ．コリＤＳＭ１２４３３に存在するプラスミド（結合された配列番号９に同一であると思われる）、Ｅ．コリＤＳＭ１２４４１に存在するプラスミド（結合された配列番号１１に同一であると思われる）、Ｅ．コリＤＳＭ９９８４に存在するプラスミド（結合された配列番号１３に同一であると思われる）、
【００６９】
Ｅ．コリＤＳＭ１２４３２に存在するプラスミド（結合された配列番号１５に同一であると思われる）、Ｅ．コリＤＳＭ１２８４７に存在するプラスミド（結合された配列番号１７に同一であると思われる）、Ｅ．コリＤＳＭ１２８４８に存在するプラスミド（結合された配列番号１９に同一であると思われる）、Ｅ．コリＤＳＭ１２８４９に存在するプラスミド（結合された配列番号２１に同一であると思われる）、Ｅ．コリＤＳＭ１２８５０に存在するプラスミド（結合された配列番号２３に同一であると思われる）、Ｅ．コリＤＳＭ１２８４６に存在するプラスミド（結合された配列番号２５に同一であると思われる）、
【００７０】
Ｅ．コリＤＳＭ１２８５１に存在するプラスミド（結合された配列番号２７に同一であると思われる）、Ｅ．コリＤＳＭ１２８５２に存在するプラスミド（結合された配列番号２９に同一であると思われる）又はＥ．コリＤＳＭ１２４３６に存在するプラスミド（結合された配列番号３１に同一であると思われる）から得られるＤＮＡ配列、例えばその副配列に基づいて、前記ＤＮＡ配列によりコードされるマンナナーゼのもう１つのアミノ酸配列を生ぜしめないが、しかし酵素の生成のために意図された宿主生物のコドン使用法に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なったアミノ酸配列（すなわち、本発明のマンナン分解酵素の変異体）を生ぜしめることができるヌクレオチド置換の導入により構成され得る。
【００７１】
ポリペプチド：
配列番号２の位置３１〜４９０におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号２のアミノ酸番号１〜３０の配列は、シグナルペプチドである。配列番号２の位置３１〜３３０におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、位置３３１〜３４２においてリンカー及び位置４３４〜４９０において未知の機能の少なくとも１つのＣ−末端ドメインを含んで成ると思われる。
【００７２】
本発明の目的はマンナナーゼ活性を示すポリペプチドを得ることであるので、本発明は、配列番号２のアミノ酸番号３１〜３３０の配列、すなわち任意には、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメインに、Ｎ−末端で又はＣ−末端で作用可能に結合される触媒ドメインを含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。配列番号２のアミノ酸番号３４３〜４９０の副配列を有するドメインは、未知の機能のマンナナーゼ酵素のドメインであり、このドメインは既知のマンナナーゼにおける類似するドメインと非常に相同性である。
【００７３】
配列番号６の位置３２〜４９４におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号６のアミノ酸番号１〜３１の配列は、シグナルペプチドである。配列番号６の位置３２〜３４４におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、位置４３５〜４９４において未知の機能の少なくとも１つのＣ−末端ドメインを含んで成ると思われる。本発明の目的はマンナナーゼ活性を示すポリペプチドを得ることであるので、本発明は、配列番号６のアミノ酸番号３２〜３４４の配列、すなわち任意には、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメインに、Ｎ−末端で又はＣ−末端で操作可能的に結合される触媒ドメインを含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
【００７４】
配列番号１０の位置３２〜５８６におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号１０のアミノ酸番号１〜３１の配列は、シグナルペプチドである。配列番号１０の位置３２〜３６２におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、位置４６３〜５８６において未知の機能の少なくとも１つのＣ−末端ドメインを含んで成ると思われる。本発明の目的はマンナナーゼ活性を示すポリペプチドを得ることであるので、本発明は、配列番号１０のアミノ酸番号３２〜３６２の配列、すなわち任意には、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメインに、Ｎ−末端で又はＣ−末端で操作可能的に結合される触媒ドメインを含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
【００７５】
配列番号１２の位置３３〜３３１におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号１２のアミノ酸番号１〜３２の配列は、シグナルペプチドである。配列番号１２の位置３３〜３３１におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインでると思われる。配列番号１２のアミノ酸番号３３〜３３１の配列、すなわち触媒ドメインを含んで成るこのマンナナーゼ酵素コアは、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメイン、すなわち融合タンパク質の一部に、Ｎ−末端で又はＣ−末端で操作可能的に結合されても又はされなくても良い。
【００７６】
配列番号１４の位置２２〜４８８におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号１４のアミノ酸番号１〜２１の配列は、シグナルペプチドである。配列番号１４の位置１６６〜４８８におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、位置２２〜１６４において未知の機能の少なくとも１つのＣ−末端ドメインを含んで成ると思われる。本発明の目的はマンナナーゼ活性を示すポリペプチドを得ることであるので、本発明は、配列番号１４のアミノ酸番号１６６〜４８８の配列、すなわち任意には、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメインに、Ｎ−末端で又はＣ−末端で操作可能的に結合される触媒ドメインを含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
【００７７】
配列番号１６の位置２６〜３６９におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号１６のアミノ酸番号１〜２５の配列は、シグナルペプチドである。配列番号１６の位置６８〜３６９におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、位置２６〜６７において未知の機能の少なくとも１つのＮ−末端ドメインを含んで成ると思われる。本発明の目的はマンナナーゼ活性を示すポリペプチドを得ることであるので、本発明は、配列番号１６のアミノ酸番号６８〜３６９の配列、すなわち任意には、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメインに、Ｎ−末端で又はＣ−末端で操作可能的に結合される触媒ドメインを含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
【００７８】
配列番号１８のアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列の部分的配列形成部分である。本発明は、配列番号１８のアミノ酸番号１〜３０５の配列を含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
配列番号２０のアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列の部分的配列形成部分である。本発明は、配列番号２０のアミノ酸番号１〜１３２の配列を含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
【００７９】
配列番号２２の位置２９〜３２０におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号２２のアミノ酸番号１〜２８の配列は、シグナルペプチドである。配列番号２２の位置２９〜３２０におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであると思われる。配列番号２２のアミノ酸番号２９〜３２０の配列、すなわち触媒ドメインを含んで成るこのマンナナーゼ酵素コアは、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメイン、すなわち融合タンパク質の一部に、Ｎ−末端で又はＣ−末端で操作可能的に結合されても又はされなくても良い。
【００８０】
配列番号２４のアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列の部分的配列形成部分である。本発明は、配列番号２４のアミノ酸番号２９〜１８８の配列を含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
配列番号２６の位置３０〜８１５におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号２６のアミノ酸番号１〜２９の配列は、シグナルペプチドである。配列番号２６の位置３０１〜６２５におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、位置４４〜１６６及び１９５〜３００において未知の機能の少なくとも２つのＮ−末端ドメイン、及び位置６２６〜８１５において未知の機能のＣ−末端ドメインを含んで成ると思われる。
【００８１】
本発明の目的はマンナナーゼ活性を示すポリペプチドを得ることであるので、本発明は、配列番号２６のアミノ酸番号３０１〜６２５の配列、すなわち任意には、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメインに、Ｎ−末端で又はＣ−末端で操作可能的に結合される触媒ドメインを含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
【００８２】
配列番号２８の位置３８〜４９６におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号２８のアミノ酸番号１〜３７の配列は、シグナルペプチドである。配列番号２８の位置１６６〜４９６におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、位置３８〜１６５において未知の機能の少なくとも１つのＣ−末端ドメインを含んで成ると思われる。本発明の目的はマンナナーゼ活性を示すポリペプチドを得ることであるので、本発明は、配列番号２８のアミノ酸番号１６６〜４９６の配列、すなわち任意には、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメインに、Ｎ−末端で又はＣ−末端で操作可能的に結合される触媒ドメインを含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
【００８３】
配列番号３０の位置２６〜３６１におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号３０のアミノ酸番号１〜２５の配列は、シグナルペプチドである。配列番号３０の位置２６〜３６１におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであると思われる。配列番号３０のアミノ酸番号２６〜３６１の配列、すなわち触媒ドメインを含んで成るこのマンナナーゼ酵素コアは、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメイン、すなわち融合タンパク質の一部に、Ｎ−末端で又はＣ−末端で操作可能的に結合されても又はされなくても良い。
【００８４】
配列番号３２の位置２３〜９０３におけるアミノ酸の配列は、成熟マンナナーゼ配列である。配列番号３２のアミノ酸番号１〜２２の配列は、シグナルペプチドである。配列番号３２の位置５９３〜９０３におけるアミノ酸の副配列はマンナナーゼ酵素の触媒ドメインであり、そして成熟酵素はさらに、それぞれ位置２３〜２１４、２２４〜４２４及び４３４〜５９２において未知の機能の少なくとも３個のＮ−末端ドメインを含んで成ると思われる。本発明の目的はマンナナーゼ活性を示すポリペプチドを得ることであるので、本発明は、配列番号３２のアミノ酸番号５９３〜９０３の配列、すなわち任意には、異なった官能性の１又は２種の、又は２種以上の他のドメインに、Ｎ−末端で又はＣ−末端で操作可能的に結合される触媒ドメインを含んで成るいずれかのマンナナーゼ酵素に関する。
【００８５】
本発明はまた、それぞれ、配列番号２，６，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０及び３２のポリペプチドに対して実質的に相同であるマンナナーゼポリペプチド、及びそれらの種相同体（パラ体又はオルト体）も提供する。用語“実質的に相同である”とは、
配列番号２のアミノ酸番号３３〜３４０もしくは３３〜４９０に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号６のアミノ酸番号３２〜３４４もしくは３２〜４９４に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号１０のアミノ酸番号３２〜３６２もしくは３２〜５８６に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号１２のアミノ酸番号３３〜３３１に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
【００８６】
配列番号１４のアミノ酸番号１６６〜４８８もしくは２２〜４８８に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号１６のアミノ酸番号６８〜３６９もしくは３２〜３６９に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号１８のアミノ酸番号１〜３０５に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
配列番号２０のアミノ酸番号１〜１３２に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
配列番号２２のアミノ酸番号２９〜３２０に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
配列番号２４のアミノ酸番号２９〜１８８に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
【００８７】
配列番号２６のアミノ酸番号３０１〜６２５もしくは３０〜６２５に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号２８のアミノ酸番号１６６〜４９６もしくは３８〜４９６に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号３０のアミノ酸番号２６〜３６１に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；又は
配列番号３２のアミノ酸番号５９３〜９０３もしくは２３〜９０３に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
に対して６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、及びさらにより好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを示すために、本明細書において使用される。
【００８８】
そのようなポリペプチドは、より好ましくは、配列番号２のアミノ酸番号３１〜３３０もしくは３１〜４９０に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号６のアミノ酸番号３２〜３４４もしくは３２〜４９４に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；配列番号１０のアミノ酸番号３２〜３６２もしくは３２〜５８６に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号１２のアミノ酸番号３３〜３３１に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；配列番号１４のアミノ酸番号１６６〜４８８もしくは２２〜４８８に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号１６のアミノ酸番号６８〜３６９もしくは３２〜３６９に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
【００８９】
配列番号１８のアミノ酸番号１〜３０５に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
配列番号２０のアミノ酸番号１〜１３２に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
配列番号２２のアミノ酸番号２９〜３２０に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
配列番号２４のアミノ酸番号２９〜１８８に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；
【００９０】
配列番号２６のアミノ酸番号３０１〜６２５もしくは３０〜６２５に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号２８のアミノ酸番号１６６〜４９６もしくは３８〜４９６に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
配列番号３０のアミノ酸番号２６〜３６１に示される配列、又はそのオルト体もしくはパラ体；又は
配列番号３２のアミノ酸番号５９３〜９０３もしくは２３〜９０３に示される配列、又はそれらのオルト体もしくはパラ体；
に対して少なくとも９５％、及び最も好ましくは９８％又はそれ以上同一であろう。
【００９１】
％配列同一性は、従来の方法、すなわち当業者において知られているコンピュタープログラムパッケージプログラム、例えば引用により本明細書に組込まれる、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ， Ｓ． Ｂ． ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｃ． Ｄ．， （１９７０）， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４８： ４４３−４５３において開示されるようなＧＣＧプログラムパッケージ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ８， Ａｕｇｕｓｔ １９９４， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ ５３７１１）に提供されるＧＡＰにより決定される。ＧＡＰは、ポリペプチド配列比較のために次の設定を用いて使用される：３．０のＧＡＰ創造ペナルティー及び０．１のＧＡＰ延長ペナルティー。
【００９２】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、ＤＮＡ配列比較に関して次の設定でのＧＡＰを用いて類似する方法により決定される：５．０のＧＡＰ創造ペナルティー及び０．３のＧＡＰ延長ペナルティー。
本発明の酵素調製物は好ましくは、微生物、好ましくは細菌、原生生物、又は菌類、特に細菌、例えばバチルス、好ましくは、バチルスｓｐ．種、及びすべての種が好ましくは、整列された１６Ｓ ｒＤＮＡ配列に基づいて、バチルスｓｐ．Ｉ６３３， バチルス・ハロジランス又はバチルスｓｐ．ＡＡＩに対して少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％相同である高い関連性のバチルス種から成る群から選択され得るバチルス株に属する細菌に由来する。
【００９３】
それらの種は、ＲＤＰ （Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ） （Ｂｏｎｎｅ Ｌ． Ｍａｉｄａｋ， Ｎｅｉｌｓ Ｌａｒｓｏｎ， Ｍｉｃｈａｅｌ Ｊ． ＭｃＣａｕｇｈｅｙ， Ｒｏｓｓ Ｏｖｅｒｂｅｅｋ， Ｇａｒｙ Ｊ． Ｏｌｓｅｎ， Ｋａｒｌ Ｆｏｇｅｌ， Ｊａｍｅｓ Ｂｌａｎｄｙ， ａｎｄ Ｃａｒｌ Ｒ． Ｗｏｅｓｅ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｃｈ， １９９４， Ｖｏｌ． ２２， Ｎｏ１７， ｐ．３４８５−３４８７， Ｔｈｅ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ） からの整列された１６Ｓ ｒＤＮＡ 配列から同定される系統発生学的関係に基づいて請求されている。
【００９４】
表ＩＩに由来する情報は、バチルスｓｐ．Ｉ６３３ に対して９３％以上相同であるすべての種が請求されている高い関連性のバチルス種からのすべての５種のファミリーのマンナナーゼについての請求に基づかれている。それは次のものを包含する：バチルス・スポロサーモジュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｏｒｏｔｈｅｒｍｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・アカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・プソイドアルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）及びバチルス・クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）を包含する。図１：バチルスｓｐ．Ｉ６３３に最も密接に関連するＡＲＰプログラムから生成される系統発生学的系図を参照のこと。１６Ｓ ＲＮＡは配列番号３３に示す。
【００９５】
【表１】

【００９６】
他の有用なファミリーの５種のマンナナーゼは、すべての種が整列された１６Ｓ配列に基づいてバチルス・ハロジュランスに対して９３％以上の相同性を示す高い関連性のバチルス種に由来するそれらのものである。それらのバチルス種は次のものを包含する：スポロラクトバチルス・ラエビス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｉｓ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）及びマリノコーカス・ハロフィラス（Ｍａｒｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）。図２：バチルス・ハロジュランス に最も密接に関連するＡＲＰプログラムから生成される系統発生学的系図を参照のこと。
【００９７】
【表２】

【００９８】
他の有用なファミリーの５種のマンナナーゼは、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）種、及びすべての種が好ましくは、整列された１６Ｓ ｒＤＮＡに基づいて、バチルス・アガラドハエレンスＤＳＭ８７２１に対して少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％相同である高い関連性のバチルス種から成る群から選択された株に由来するそれらのものである。
【００９９】
有用なファミリーの２６種のマンナナーゼは、例えば、バチルス、ｓｐ．ＡＡＩ１２に対して９３％以上相同であるすべての種が請求されている高い関連性のバチルス種に由来するそれらのものである。それらは次のものを包含する：バチルス・スポロサーモジュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｏｒｏｔｈｅｒｍｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・アカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・プソイドアルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）及びバチルス・グラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）。図３：バチルスｓｐ．ＡＡＩ１２に最も密接に関連するＡＲＰプログラムから生成される系統発生学的系図を参照のこと。１６Ｓ ＲＮＡは、配列番号３４に示されている。
【０１００】
【表３】

【０１０１】
他の有用なファミリーの２６種のマンナナーゼは、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）種、及びすべての種が好ましくは、整列された１６Ｓ ｒＤＮＡ配列に基づいて、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に対して少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％相同である高い関連性のバチルス種から成る群から選択された株に由来するそれらのものである。
【０１０２】
実質的に相同のタンパク質及びポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は好ましくは、保存性アミノ酸置換（表２を参照のこと）及びタンパク質又はポリペプチドの折りたたみ又は活性に対して実質的に影響を与えない他の置換であるマイナーな性質のもの；典型的には、１〜約３０個の少数のアミノ酸の欠失；及び短いアミノ−又はカルボキシル−末端延長、例えば、アミノ酸−末端メチオニン残基、約２０〜２５個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は精製を促進する小さな延長（親和性標識）、例えばポリ−ヒスチジン路、プロテインＡの延長である（Ｎｉｌｓｓｏｎ など．， ＥＭＢＯ Ｊ． ４： １０７５， １９８５； Ｎｉｌｓｓｏｎ など．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９８： ３， １９９１）。
【０１０３】
一般的には、Ｆｏｒｄなど．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２： ９５−１０７，１９９１ （引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。親和性標識をコードするＤＮＡは、商業的供給者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ； Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）から入手できる。
しかしながら、上記変更が好ましくは，マイナーな性質のものであったとしても、そのような変更はまた、大きな性質のもの、例えば、本発明のマンナナーゼポリペプチドへの、３００個までのアミノ酸の大きなポリペプチドの融合、又は両アミノ−又はカルボキシル−末端延長としての融合でもあり得る。
【０１０４】
【表４】

【０１０５】
２０個の標準的アミノ酸の他に、非標準的アミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン及びα−メチルセリン）は、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基により置換され得る。制限された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、アミノ酸残基により置換され得る。“不自然なアミノ酸”は、タンパク質合成の後、修飾され、そして／又は標準のアミノ酸の側鎖とは異なるそれらの側鎖に化学的構造を有する。不自然なアミノ酸は、化学的に合成され得、又は好ましくは、市販されており、そしてピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン及び３，３−ジメチルプロリンを包含する。
【０１０６】
本発明のマンナナーゼポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発、又はアラニン−走査突然変異誘発に従って同定され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５， １９８９）。後者の技法においては、単一のアラニンの突然変異が分子におけるあらゆる残基に導入され、そして得られる変異体分子は、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、生物学的活性（すなわち、マンナナーゼ活性）について試験される。また、Ｈｉｌｔｏｎ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ４６９９−４７０８， １９９６を参照のこと。
【０１０７】
酵素又は他の生物学的相互作用の活性部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、構造の物理的分析によっても決定され得る。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ３０６−３１２， １９９２； Ｓｍｉｔｈ など．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４： ８９９−９０４， １９９２； Ｗｌｏｄａｖｅｒ など．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３０９： ５９−６４， １９９２を参照のこと。必須アミノ酸の本体はまた、本発明のポリペプチドに関連するポリペプチドとの相同性の分析からも推定され得る。
【０１０８】
複数のアミノ酸置換は、突然変異誘発、組換え及び／又はシャフリング、続く適切なスクリーニング方法、例えばＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ５３−５７， １９８８）， Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ２１５２−２１５６， １９８９）， ＷＯ９５／１７４１３号又はＷＯ９５／２２６２５号により開示される既知の方法を用いて、生成され、そして試験され得る。
【０１０９】
手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数位置の同時ランダム化、又は組換え／異なった突然変異のシャフリング（ＷＯ９５／１７４１３号、ＷＯ９５／２２６２５号）、続いての機能的ポリペプチドについての選択、及び次に、個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドの配列決定のための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Ｌｏｗｍａｎ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０： １０８３２−１０８３７， １９９１； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９号；Ｈｕｓｅ， ＷＩＰＯ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ９２／０６２０４号）及び特定領域の突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ など．， Ｇｅｎｅ ４６： １４５， １９８６； Ｎｅｒ など．， ＤＮＡ ７： １２７， １９８８）を包含する。
【０１１０】
上記に開示されるような突然変異誘発／シャフリング方法は、宿主細胞においてクローン化され、突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために、高い処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発されたＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収され、そして近代装置を用いて急速に配列決定され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける重要な個々のアミノ酸残基の急速な決定を可能にし、そして未知の構造体のポリペプチドに適用され得る。
【０１１１】
上記で論じられた方法を用いて、当業者は、配列番号２の残基３３〜３４０又は３３〜４９０；配列番号６の残基３２〜３４４又は３２〜４９４；配列番号１０の残基３２〜３６２又は３２〜５８６；配列番号１２の残基３３〜３３１；配列番号１４の残基１６６〜４８８又は２２〜４８８；配列番号１６の残基６８〜３６９又は３２〜３６９；配列番号１８の残基１〜３０５；配列番号２０の残基１〜１３２；配列番号２２の残基２９〜３２０；配列番号２４の残基２９〜１８８；配列番号２６の残基３０１〜６２５又は３０〜６２５；配列番号２８の残基１６６〜４９６又は３８〜４９６；配列番号３０の残基２６〜３６１；配列番号３２の残基５９３〜９０３又は２３〜９０３に対して実質的に相同であり、そして野生型タンパク質のペクチン分解活性を保持する種々のポリペプチドを同定し、そして／又は調製することができる。
【０１１２】
本発明のマンナナーゼ酵素は、触媒的活性ドメインを含んで成る酵素コアの他に、また、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を含んで成り、前記酵素のセルロース結合ドメイン及び酵素コア（触媒的活性ドメイン）は操作可能的に連結される。そのセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）はコードされた酵素の内部部分として存在することができ、又は他の起源からのＣＢＤはマンナン分解酵素中に導入され、従って酵素ハイブリッドを創造する。この場合、用語“セルロース−結合ドメイン”とは、Ｐｅｔｅｒ Ｔｏｍｍｅなど．，“Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ： Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ” ｉｎ “Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ”， Ｊｏｈｎ Ｎ， Ｓａｄｄｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈ． Ｐｅｎｎｅｒ （Ｅｄｓ．）， ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｎｏ．６１８， １９９６により定義されるとおりであるものとして理解されるべきである。
【０１１３】
この定義は、１２０よりも多くのセルロース−結合ドメインを１０種のファミリー（Ｉ−Ｘ）に分類し、そしてＣＢＤが種々の酵素、例えばセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ及びキチナーゼに見出されることを示す。ＤＢＤはまた、藻類、例えば赤藻類ポルフィラ・パーピュレア（Ｐｏｒｐｈｙｒａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）において、非加水分解性多糖−結合タンパク質として見出されている（Ｔｏｍｍｅなど．，前記を参照のこと）。しかしながら、ＣＢＤのほとんどは、セルラーゼ及びキシラナーゼであり、ＣＢＤはタンパク質のＮ及びＣ末端で見出され、又は内部に存在する。
【０１１４】
酵素ハイブリッドは当業界において知られており（例えば、ＷＯ９０／００６０９号及びＷＯ９５／１６７８２号を参照のこと）、そしてマンナン分解酵素をコードするＤＮＡ配列に、リンカーを伴って又は伴わないで、連結されるセルロース−結合ドメインをコードするＤＮＡのフラグメントを少なくとも含んで成るＤＮＡ構造体を用いて、宿主細胞を形質転換し、そして融合された遺伝子を発現するために宿主細胞を増殖することによって調製され得る。
【０１１５】
酵素ハイブリッドは、次の式：
ＣＢＤ−ＭＲ−Ｘ
により記載され、ここで前記ＣＢＤは少なくともセルロース−結合ドメインに対応するアミノ酸配列のＮ−末端又はＣ−末端領域であり；ＭＲは中間領域（リンカー）であり、そして結合、又は好ましくは、約２〜約１００個の炭素原子、より好ましくは２〜４０個の炭素原子の短い結合基であり得；又は好ましくは約２〜約１００個のアミノ酸、より好ましくは２〜４０個のアミノ酸であり得；そしてＸは本発明のマンナナーゼ分解酵素のＮ−末端又はＣ−末端の領域である。配列番号４は、マンナナーゼ酵素コア及びＣＢＤの酵素ハイブリッドのアミノ酸配列を開示する。
【０１１６】
好ましくは、本発明のマンナナーゼ酵素は、少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも８．５、より好ましくは少なくとも９、より好ましくは少なくとも９．５、より好ましくは少なくとも１０、さらにより好ましくは少なくとも１０．５、特に少なくとも１１のｐＨでその最大の触媒活性を有し；そして好ましくは、酵素の最大活性は、少なくとも４０℃、より好ましくは少なくとも５０℃、さらにより好ましくは少なくとも５５℃の温度で得られる。
好ましくは、本発明の清浄組成物は、例えば、機械洗浄工程の洗浄サイクルの間、布を処理するために使用される場合、典型的には、約８〜約１０．５のｐＨを有する洗浄溶液を提供する。典型的には、そのような洗浄溶液は、約２０℃〜約９５℃、好ましくは約２０℃〜約６０℃、好ましくは約２０℃〜約５０℃の温度で使用される。
【０１１７】
タンパク質生成：
十分な長さのタンパク質、そのフラグメント及び融合タンパク質を包含する本発明のタンパク質及びポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝子的に構築された宿主細胞において生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性ＤＮＡにより形質転換され、又はトランスフェクトされ、そして培養において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含する。
【０１１８】
細菌細胞、特に、グラム−陽性生物の培養された細胞が好ましい。バチルス属からの次のグラム−陽性細胞が特に好ましい：バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｎｔｕｓ）、バチルス・クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・リケニホルミス、又はバチルス ｓｐ．特に、バチルス ｓｐ．ＡＡＩ１２。
【０１１９】
もう１つの好ましい態様においては、宿主細胞は菌類細胞である。“菌類”とは、本明細書において使用される場合、門アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、バシジオミコタ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、キトリジオミコタ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）及びヅイゴミコタ（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ など．， Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ， ８^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９５， ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫにより定義される）、及びオーミコタ（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ など．， １９９５， 前記、１７１ページに引用される）、並びに栄養胞子菌（Ｈａｗｋｓｗｏｒｈ など．， １９９５， 前記）を包含する。
【０１２０】
アスコミコタの代表的なグループは、例えばニュウロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ユウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（＝ペニシリウム（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ））、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）（＝アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、ユウロチウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）（＝アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、及び上記に列挙される真の酵母を包含する。バシジオミコタの例は、マッシュルーム、サビ菌及び黒穂病菌を包含する。
【０１２１】
キトリジオミコタの代表的なグループは、例えばアロマイセス（Ａｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ブラストクラジエラ（Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｅｌｌａ）、コエロモマイセス（Ｃｏｅｌｏｍｏｍｙｃｅｓ）及び水性菌類を包含する。オーミコタの代表的なグループは、例えばサプロェグニオマイセトウス（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ）水性菌類（水カビ）、例えばアキヤ（Ａｃｈｌｙａ）を包含する。栄養胞子菌の例は、アスペルギラス、ペニシリウム、カンジダ及びアルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）を包含する。ヅイゴミコタの代表的なグループは、例えばリゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）及びムコル（Ｍｕｃｏｒ）を包含する。
【０１２２】
さらにもう１つの好ましい態様においては、菌類宿主細胞は糸状菌細胞である。“糸状菌”とは、ユーミコタ（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及びオーミコタ（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）のすべての糸状形を包含する（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈなど．， １９９５， 前記により定義されるような）。より好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ヒューミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオプソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネウロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）又はトリコダーマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種の細胞であるが、但しそれらだけには限定されない。
【０１２３】
特に、前記細胞は、ＰＣＴ／ＵＳ／９５１０７７４３に記載されるように、トリコダーマの種、好ましくはトリコダーマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）又はトリコダーマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、又はアスペルギラスの種、最も好ましくはアスペルギラス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、又はフサリウムの種、最も好ましくはフサリウムＡＴＣＣ２０３３４の特徴を有するフサリウム ｓｐ． に属する。
【０１２４】
菌類細胞は、それ自体既知の態様でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を包含する方法により形質転換され得る。アスペルギラス宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ＥＰ２３８０２３号及びＹｅｌｔｏｎなど．， １９８４， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ８１： １４７０−１４７４に記載される。フサリウム種を形質転換するための適切な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ など．， １９８９， Ｇｅｎｅ ７８： １４７−１５６又は米国特許同時継続出願０８／２６９，４４９号により記載される。
【０１２５】
酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ， Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ， Ｊ．Ｎ． ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ， Ｍ．Ｉ．， ｅｄｉｔｏｒｓ， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １９４， ｐｐ１８２−１８７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｉｔｏ など．， １９８３， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３： １６３； 及びＨｉｎｎｅｎなど．， １９７８， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ７５： １９２０に記載される方法を用いて形質転換され得る。哺乳類細胞は、Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ （１９７８， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２： ５４６） のリン酸カルシウム沈殿法を用いて、直接的な摂取により形質転換され得る。
【０１２６】
クローン化された分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性ＤＮＡを導入するための技法は、次の文献に開示されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２^ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ など． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ， １９８７； 及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ， Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｍ など．， １９９３， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ． （それらは引用により本明細書中に組込まれる）。
【０１２７】
一般的に、本発明のマンナナーゼをコードするＤＮＡ配列は、一般的に発現プロモーター内に転写プロモーター及びターミネーターを含む、その発現のために必要とされる他の遺伝子要素に作用可能に連結される。前記ベクターはまた、通常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製起点を含むが、但し当業者は、一定のシステム内において、選択マーカーが別々のベクター上に供給され得、そして外因性ＤＮＡの複製が宿主ゲノムへの組み込みにより提供され得ることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び他の要素の選択は、当業者のレベル内の通常のことである。多くのそのような要素は、文献に記載されており、そして商業的供給者から入手できる。
【０１２８】
宿主細胞の分泌経路中にポリペプチドを向けるためには、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、発現ベクターに提供される。分泌シグナル配列はポリペプチドの配列であり得、又は他の分泌されたタンパク質に起因し、又は新たに合成され得る。多くの適切な分泌シグナル配列が当業界において知られており、そして特に、バチルス宿主細胞における分泌のための適切な分泌シグナル配列のさらなる記載については、次の文献を参照のこと：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ， Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｍ など．， １９９３， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．；及びＣｕｔｔｉｎｇ， Ｓ． Ｍ． （ｅｄｓ．） ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９０。
【０１２９】
分泌シグナル配列は、ＤＮＡ配列に正しく読み取り枠を整合して連結される。分泌シグナル配列は、通常、興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側に位置し、但しあるシグナル配列は興味のＤＮＡ配列の他の場所に位置することができる（例えば、Ｗｅｌｃｈ など．， アメリカ特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄ など．， アメリカ特許第５，１４３，８３０号を参照のこと）。
【０１３０】
本発明の発現ベクターは、組換えＤＮＡ方法に便利にゆだねられるいずれかの発現ベクターであり、そしてベクターの選択はしばしば、そのベクターが導入される宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち染色体外存在物（その複製は染色体複製に無関係である）として存在するベクター、例えばプラスミドであり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。
【０１３１】
糸状菌宿主細胞への使用のための適切なプロモーターの例は、例えばＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔなど．， Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ． ４ （１９８５）， ２０９３−２０９９）又はｔｐｉＡプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、アスペルギラス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギラス・ニガー中性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・アワモリグルコアミラーゼ（ｇｌｕＡ）、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、アスペルギラス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ又はアスペルギラス・ニジュランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するそれらのものである。
【０１３２】
形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞は、栄養物、及び選択された宿主細胞の増殖のために必要とされる他の成分を含む培養培地において、従来の方法に従って培養される。定義された培地及び複合培地を包含する種々の適切な培地が、当業界において知られており、そして一般には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要な場合、成長因子のような成分を含むことができる。薬物選択、又は発現ベクター上に担持され、又は宿主細胞中に同時にトランスフェクトされる選択マーカーにより補充される必須栄養物における栄養不足により、増殖培地は、外因的に付加されたＤＮＡを含む細胞を選択するであろう。
【０１３３】
タンパク質単離：
発現された組換えポリペプチドが分泌される場合、そのポリペプチドは増殖培地から精製され得る。好ましくは、発現宿主細胞は、ポリペプチドの精製の前、培地から除かれる（例えば、遠心分離による）。
発現された組換えポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、宿主細胞は好ましくは、破壊され、そしてポリペプチドは、そのような精製技法の第１段階である水性“抽出物”中に開放される。好ましくは、発現宿主細胞は、細胞破壊の前、培地から除去される（例えば遠心分離による）。
【０１３４】
細胞破壊は、従来の技法、例えばリゾチーム消化により、又は細胞に高圧力を付与することにより行われ得る。そのような細胞破壊技法のさらなる説明のためには、Ｒｏｂｅｒｔ Ｋ． Ｓｃｏｂｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照のこと。
発現された組換えポリペプチド（又はキメラポリペプチド）が分泌されても又はされなくても、それは、分別及び／又は従来の精製方法を用いて、精製され得る。
【０１３５】
硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロープ抽出が、サンプルの分別のために使用され得る。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣ及び逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なアニオン交換媒体は、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカ及び同様のものを含む。ＰＥＩ， ＤＥＡＥ， ＱＡＥ及びＱ誘導体が好ましく、そしてＤＥＡ Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗ セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）が特に好ましい。
【０１３６】
典型的なクロマトグラフィー媒体は、フェニル、ブチル、又はオクチル基により誘導体化されたそれらの媒体、例えばフェニル−セファロース　ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌブチル６５０（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ， Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＰＡ）、オクチル−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及び同様のもの；又はポリアクリル酸樹脂、例えばＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ７１ （Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ）及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基材のビーズ樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂、及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様のものを包含する。
【０１３７】
それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基により変性され得。カップリング化学の例は、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、及びカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシル及びアミノ誘導体を包含する。それらの及び他の固体媒体が、良く知られており、そして当業界において広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。
【０１３８】
特定方法の選択は、日常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部決定される。例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ， １９８８を参照のこと。
本発明のポリペプチド又はそのフラグメントはまた、化学合成を通して調製され得る。本発明のポリペプチドは、モノマー又はマルチマーであり；グリコシル化され又は非グリコシル化され得；ペギル化され（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）又は非ペギル化され得；そして最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでも又は含まなくても良い。
【０１３９】
本明細書に開示される配列情報に基づけば、本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号１に示されるＤＮＡ配列、少なくとも位置９４〜位置９９０のＤＮＡ配列、又は他方では、位置９４〜位置１４７０のＤＮＡ配列を含んで成る十分な長さのＤＮＡ配列がクローン化され得る。
【０１４０】
同様に、本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号５に示されるＤＮＡ配列、少なくとも位置９４〜位置１０３２のＤＮＡ配列、又は他方では、位置９４〜位置１４８２のＤＮＡ配列を含んで成る十分な長さのＤＮＡ配列；
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号９に示されるＤＮＡ配列、少なくとも位置９４〜位置１０８６のＤＮＡ配列、又は他方では、位置９４〜位置１７６１のＤＮＡ配列を含んで成る十分な長さのＤＮＡ配列；
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号１１に示されるＤＮＡ配列、少なくとも位置９７〜位置９９３のＤＮＡ配列を含んで成る十分な長さのＤＮＡ配列；
【０１４１】
本発明のマンナナーゼをコードし、そして本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号１３に示されるＤＮＡ配列、少なくとも位置４９８〜位置１４６４のＤＮＡ配列、又は他方では、位置６４〜位置１４６４のＤＮＡ配列を含んで成る十分な長さのＤＮＡ配列；
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号１５に示されるＤＮＡ配列、少なくとも位置２０４〜位置１１０７のＤＮＡ配列、又は他方では、位置７６〜位置１１０７のＤＮＡ配列を含んで成る十分な長さのＤＮＡ配列；
本発明のマンナナーゼを部分的にコードし、そして配列番号１７に示されるＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ配列；本発明のマンナナーゼを部分的にコードし、そして配列番号１９に示されるＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ配列；
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号２１において少なくとも位置８８〜位置９６０に示されるＤＮＡ配列を含んで成る十分な長さのＤＮＡ配列；
【０１４２】
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号２３に示されるＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ配列；
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号２５に示されるＤＮＡ配列中の少なくとも位置９０４〜位置１８７５のＤＮＡ配列、又は他方では、位置８８〜位置２４４５のＤＮＡ配列を含んで成る十分な長さのＤＮＡ配列；
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号２７に示されるＤＮＡ配列中の少なくとも位置４９８〜位置１４８８のＤＮＡ配列、又は他方では、位置１１２〜位置１４８８のＤＮＡ配列を含んで成る十分な長さのＤＮＡ配列；
【０１４３】
本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号２９に示されるＤＮＡ配列中の少なくとも位置７９〜位置１０８３のＤＮＡ配列を含んで成る十分な長さのＤＮＡ配列；及び　本発明のマンナナーゼをコードし、そして配列番号３１に示されるＤＮＡ配列中の少なくとも位置１７７９〜位置２７０９のＤＮＡ配列、又は他方では、位置６７〜位置２７０９のＤＮＡ配列を含んで成る十分な長さのＤＮＡ配列がクローン化され得る。
【０１４４】
クローニングは、当業界において知られている標準の方法により、例えば、
−バチルス株、特にＢ．ｓｐ．Ｉ６３３， Ｂ．ｓｐ．ＡＡＩ１２， Ｂ．ｓｐ．ＡＡ３４９， バチルス・アガラドハエレンス、バチルス・ハロジュランス、バチルス・クラウジ及びバチルス・リケニホルミスから選択された株、又は菌株、特にヒューミコラ・インソレンス株からゲノムライブラリーを調製し；
【０１４５】
−そのようなライブラリーを、適切な基質プレート上にプレートし；
−配列番号１， ５， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９又は３１のいずれかに基づいてのプローブを用いて、標準のハイブリダイゼーション技法により、本発明のポリヌクレオチド配列を含んで成るクローンを同定し；又は
−配列番号１， ５， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９又は３１からの配列情報に基づいてのプライマーを用いて、逆ＰＣＲ法により、前記ゲノムライブラリーからクローンを同定することによって行われる。逆ＰＣＲに関する追加の詳細は、Ｍ．Ｊ． ＭＣＰｈｅｒｓｏｎ など：（“ＰＣＲ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒａａｃｈ” Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ） に言及される。
【０１４６】
本明細書に開示される配列情報（配列番号１， ２， ５， ６， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７， １８， １９， ２０， ２１， ２３， ２４， ２５， ２６， ２７， ２８， ２９， ３０， ３１， ３２）に基づいて、本発明の相同マンナナーゼをコードする相同ポリヌクレオチド配列を、関連する微生物、特にバチルス属、例えばバチルスｓｐ．の好アルカリ種の他の株、又は菌類株、例えばヒューミコラの種からのゲノムライブラリーを用いて、類似する方法により単離することは、当業者のための日常の作業である。
【０１４７】
他方では、本発明のマンナン又はガラクトマンナン−分解性酵素をコードするＤＮＡは、良く知られている方法によれば、便利には、適切な源、例えば上記生物のいずれかから、Ｅ．コリＤＳＭ１２１９７， ＤＳＭ１２１８０， ＤＳＭ１２４３３， ＤＳＭ１２４４１， ＤＳＭ９９８４， ＤＳＭ１２４３２， ＤＳＭ１２４３６， ＤＳＭ１２８４６， ＤＳＭ１２８４７， ＤＳＭ１２８４８， ＤＳＭ１２８４９， ＤＳＭ１２８５０， ＤＳＭ１２８５１及びＤＳＭ１２８５２のいずれかに存在するプラスミドから得ることができるＤＮＡ配列に基づいて調製された合成オリゴヌクレオチドプローブの使用によりクローン化され得る。
【０１４８】
従って、本発明のポリヌクレオチド分子は、Ｅ．コリＤＳＭ１２１９７， ＤＳＭ１２１８０， ＤＳＭ１２４３３， ＤＳＭ１２４４１， ＤＳＭ９９８４， ＤＳＭ１２４３２， ＤＳＭ１２４３６， ＤＳＭ１２８４６， ＤＳＭ１２８４７， ＤＳＭ１２８４８， ＤＳＭ１２８４９， ＤＳＭ１２８５０， ＤＳＭ１２８５１及びＤＳＭ１２８５２のいずれかから単離され、ここで上記のようにしてクローニングすることによって得られるプラスミドは寄託される。また、本発明は、Ｅ．コリＤＳＭ１２１９７， ＤＳＭ１２１８０， ＤＳＭ１２４３３， ＤＳＭ１２４４１， ＤＳＭ９９８４， ＤＳＭ１２４３２， ＤＳＭ１２４３６， ＤＳＭ１２８４６， ＤＳＭ１２８４７， ＤＳＭ１２８４８， ＤＳＭ１２８４９， ＤＳＭ１２８５０， ＤＳＭ１２８５１及びＤＳＭ１２８５２のいずれかの単離された、実質的に純粋な生物学的培養物にも関する。
【０１４９】
本明細書において、用語“酵素調製物”とは、微生物の単一種から、たぶん単離され、そして精製された従来の酵素発酵生成物（そのような調製物は通常、多くの異なった酵素活性を含んで成る）；又は単一成分酵素、好ましくは細菌又は菌類種から従来の組換え技法を用いることによって誘導された酵素の混合物（前記酵素は、発酵され、そしてたぶん単離され、そして別々に精製されており、そして異なった種、好ましくは菌類又は細菌種に起因する）；又は組換えマンナナーゼ酵素の発現のための宿主細胞として作用するが、しかし他の酵素、例えばペクチン分解酵素、プロテアーゼ又はセルラーゼを同時に生成する微生物の発酵生成物（微生物の天然に存在する発酵生成物、すなわちその対応する天然に存在する微生物により従来通りに生成される酵素複合体である）のいずれかを意味する。
【０１５０】
本発明のマンナナーゼ調製物はさらに、下記から成る群から選択された１又は複数の酵素を含んで成る：プロテアーゼ、セルラーゼ（エンド−β−１，４−グルカナーゼ）、β−グルカナーゼ（エンド−β−１，３（４）−グルカナーゼ）、リパーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシログルナナ−ゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はそれらの混合物。
【０１５１】
好ましい態様においては、調製物中の１又は複数の、又はすべての酵素は、組換え技法を用いて生成され、すなわち酵素は所望する酵素ブレンドにより酵素調製物を形成するために、他の酵素と共に混合される単一成分酵素である。
【０１５２】
さらなる観点においては、本発明はまた、本発明の酵素調製物を生成するための方法にも関し、ここで前記方法は、マンナナーゼを生成することができる微生物，例えば野生型株を前記酵素の生成を可能にする条件下で培養し、そして培養物から酵素を回収することを含んで成る。培養は、従来の発酵技法、例えばマンナナーゼ酵素の生成を誘発する増殖培地を十分に確保するために撹拌しながら、振盪フラスコ又は発酵器においての培養を用いて実施され得る。
【０１５３】
増殖培地は、従来のＮ−源、例えばペプトン、酵母抽出物又はカザミノ酸、低められた量の従来のＣ−源、例えばデキストロース又はスクロース、及びインデューサー、例えばグアーガム又はイナゴマメガムを含むことができる。回収は、従来の技法、例えばバイオマス及び上清液の遠心分離又は濾過による分離、上清液の回収、又は興味ある酵素が細胞内に存在する場合、細胞の破壊、たぶん続いて、ヨーロッパ特許第０４０６３１４号に記載されるようなさらなる精製、又はＷＯ９７／１５６６０号に記載のような結晶化により実施され得る。
【０１５４】
本発明の酵素又は酵素調製物を生成する有用な細菌の例は、好ましくはバチルス／ラクトバチルスサブディビジョン（ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ）からのグラム−陽性細菌、好ましくはバチルス属からの株、より好ましくはバチルス ｓｐ．の株である。
さらにもう１つの観点においては、本発明は、上記に記載される性質を有し、そして相同不純物を有さず、そして従来の組換え技法を用いて生成される、単離されたマンナナーゼに関する。
【０１５５】
免疫学的交差反応性：
免疫学的交差反応性の決定に使用されるべきポリクローナル抗体は、精製されたマンナナーゼ酵素の使用により調製され得る。より特定には、本発明のマンナナーゼに対する抗血清が、Ｎ． Ａｘｅｌｓｅｎ など．， Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， １９７３， Ｃｈａｐｔｅｒ ２３， 又はＡ． Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ ａｎｄ Ｒ． Ｔｈｏｒｐｅ， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， １９８２ （より詳しくは、ｐ．２７−３１） に記載される方法に従って、ウサギ（又は他のゲッ歯動物）を免疫化することによって生ぜしめられ得る。
【０１５６】
精製された免疫グロブリンは、例えば塩沈殿（（ＮＨ_４）_２ ＳＯ_４）、続いて透析、及びＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ上でのイオン交換クロマトグラフィーにより、抗血清から得られる。タンパク質の免疫化学特徴化が、Ｏｕｔｃｈｅｒｌｏｎｙ 二重拡散分析（Ｏ． Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｄ． Ｍ． Ｗｅｉｒ， Ｅｄ．）， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， １９６７， ｐｐ．６５５−７０６）、架橋された免疫電気泳動（Ｎ． Ａｘｅｌｓｅｎ など．， 前記， Ｃｈａｐｔｅｒｓ ３ａｎｄ ４）、又はロケット免疫電気泳動（Ｎ． Ａｘｅｌｓｅｎ など．， Ｃｈａｐｔｅｒ ２）のいずれかにより行われ得る。
【０１５７】
洗剤産業への使用：
さらなる観点においては、本発明は、本発明のマンナナーゼ又はマンナナーゼ調製物を含んで成る洗剤組成物、本発明のマンナナーゼ又はマンナナーゼ調製物を含む洗浄溶液により、機械洗浄の洗浄サイクルの間、布を処理することを含んで成る、布の機械処理のための方法、及び卓越した清浄性能、すなわち卓越したしみの除去性能、黒ずんだ物の清浄及び白色度の維持を提供する、本発明のマンナナーゼ及び任意には、セルラーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択されたもう１つの酵素を含んで成る清浄組成物、例えば洗濯、皿洗い、硬質表面クリーナー、個人用洗浄及び経口／歯用組成物に関する。
【０１５８】
論理的ではないが、本発明のマンナナ−ゼは、ガラクトマンナンを含む土壌又はしみを効果的に分解し、又は加水分解することができ、そして従って、そのような土壌又はしみを含んで成る洗濯物を清浄することができると思われる。
本発明の清浄組成物は、少なくとも１つの追加の洗剤成分を含むべきである。それらの追加の成分の正確な性質、及びその導入のレベルは、組成物の物理形、及びそれが使用される洗浄操作の性質に依存するであろう。
【０１５９】
本発明の清浄組成物は好ましくは、選択された界面活性剤、他の酵素ビルダー及び／又は漂白系から選択された洗浄成分をさらに含んで成る。
本発明の清浄組成物は、液体、ペースト、ゲル、棒状、錠剤、スプレー、発泡体、粉末又は粒質物であり得る。粒状組成物はまた、“圧縮”形でも存在することができ、そして液体組成物はまた、“濃縮された”形でも存在することができる。
【０１６０】
本発明の組成物は、手動及び機械皿洗い組成物、手動及び機械洗濯洗剤組成物、例えば洗濯用添加剤組成物、及び染色された布のソーキング及び／又は前処理への使用のために適切な組成物、添加されるすすぎ用布軟化剤組成物、及び一般的な家庭用硬質表面洗浄操作への使用のための組成物として配合され得る。そのようなカルボヒドラーゼを含む組成物はまた、衛生用製品、コンタクトレンズ清浄剤、及び健康及び美容ケアー製品、例えば経口／歯用ケアー及び身辺用洗浄組成物としても配合され得る。
【０１６１】
手動皿洗い方法のための組成物として配合される場合、本発明の組成物は、好ましくは、界面活性剤、及び好ましくは、有機ポリマー化合物、石鹸水増強剤、第ＩＩ族金属イオン、溶媒、ヒドロトロープ及び追加の酵素から選択された他の洗剤化合物を含む。
【０１６２】
洗濯機洗浄方法への使用のために適切な組成物として配合される場合、本発明の組成物は好ましくは、界面活性剤及びビルダー化合物の両者、及びさらに、好ましくは、有機ポリマー化合物、漂白剤、追加の酵素、石鹸水の泡抑制剤、分散剤、石灰石鹸分散剤、土壌懸濁及び抗−再沈殿剤、及び腐食防止剤から選択された１又は複数の洗剤成分を含む。洗濯組成物はまた、追加の洗剤成分として軟化剤も含むことができる。カルボヒドラーゼを含むそのような組成物は、洗濯洗剤組成物として配合される場合、布の清浄、しみの除去、白色度の維持、軟化、発色、染料移行の阻害、及び消毒を提供することができる。
【０１６３】
本発明の組成物はまた、固体又は液体形で、洗剤添加剤製品としても使用され得る。そのような添加剤製品は、従来の洗剤組成物の性能を補充し、又は高めることが意図され、そして清浄工程のいずれの段階ででも添加され得る。
必要とされる場合、洗濯洗剤組成物の密度は、２０℃で測定される組成物１Ｌ当たり４００〜１２００ｇ、好ましくは５００〜９５０ｇの範囲である。
【０１６４】
本明細書における組成物の“圧縮”形は、密度により、及び組成物に関しては、無機充填剤塩の量により最良に影響され；無機充填剤塩は、粉末形での洗剤組成物の従来の成分であり；従来の洗剤組成物においては、充填剤塩は、実質的な量で、典型的には、合計組成物の１７〜３５重量％で存在する。圧縮組成物においては、充填剤塩は、合計組成物の１５重量％を越えない量で、好ましくは１０重量％を越えない量で、最も好ましくは５重量％を越えない量で存在する。無機充填剤塩は、本発明の組成物に存在する場合、アルカリ及びアルカリ土類金属の硫酸塩及び塩化物塩から選択される。好ましい充填剤塩は、硫酸ナトリウムである。
【０１６５】
本発明の液体洗剤組成物は、“濃縮された形”でも存在することができ、そのような場合、本発明の液体組成物は、従来の液体洗剤に比較して、低量の水を含むであろう。典型的には、濃縮された液体洗剤中の水含有率は、洗剤組成物中、４０重量％以下、より好ましくは３０重量％以下、最も好ましくは２０重量％以下である。
【０１６６】
クリーニング組成物：
界面活性剤系：
本発明の洗浄又は洗剤組成物は界面活性剤系を含んで成り、ここで前記界面活性剤は、非イオン性、及び／又はアニオン性及び／又はカチオン性、及び／又は両性及び／又は両性イオン性、及び／又は半極性界面活性剤から選択され得る。
【０１６７】
界面活性剤は典型的には、０．１〜６０重量％のレベルで存在する。界面活性剤は好ましくは、組成物に存在する酵素ハイブリッド及び酵素成分と適合できるよう配合される。液体又はゲル組成物においては、界面活性剤は最も好ましくは、それが、それらの組成物における酵素ハイブリッド又は酵素の安定性を促進するか又は少なくとも分解しないような態様で配合される。
本発明への使用のための適切な界面活性剤系は、本明細書に記載される１又は複数の非イオン性及び／又はアニオン性界面活性剤を界面活性剤として含んで成る。
【０１６８】
アルキルフェノールのポリエチレン、ポリプロピレン及びポリブチレンオキシド縮合物が、本発明の界面活性剤系の非イオン界面活性剤としての使用のために適切であり、そしてポリエチレンオキシド縮合物が好ましい。それらの化合物は、直鎖又は枝分かれ鎖形状において、約６〜約１４個の炭素原子、好ましくは約８〜約１４個の炭素原子を含むアルキル基を有するアルキルフェノールと酸化アルキレンとの縮合生成物を包含する。
【０１６９】
好ましい態様においては、酸化エチレンは、アルキルフェノール１モル当たり、約２〜約２５モル、より好ましくは約３〜約１５モルに等しい量で存在する。このタイプの市販の非イオン性界面活性剤は、ＧＡＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより市販されているＩｇｅｐａｌ（商標）ＣＯ−６３０ ； 及びＲｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ Ｃｏｍｐａｎｙにより市販されているＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−４５， Ｘ−１１４， Ｘ−１００， 及びＸ−１０２を包含する。それらの界面活性剤は、通常、アルキルフェノールアルコキシレート（例えば、アルキルフェノールエトキシレート）として言及される。
【０１７０】
約１〜約２５モルの酸化エチレンと第一および第二脂肪族アルコールとの結合生成物は、本発明の非イオン性界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用のために適切である。脂肪族アルコールのアルキル鎖は、直鎖又は枝分かれ鎖の第一又は第二アルコールであり、そして一般的には、約８〜約２２個の炭素原子を含む。アルコール１モル当たり約２〜約１０モルの酸化エチレンと、約８〜約２０個の炭素原子、より好ましくは約１０〜約１８個の炭素原子を含むアルキル基を有するアルコールとの縮合生成物が好ましい。アルコール１モル当たり、約２〜約７モルの酸化エチレン及び最も好ましくは、２〜５モルの酸化エチレンが、前記縮合生成物に存在する。
【０１７１】
このタイプの市販の非イオン性界面活性剤の例は、次のものを包含する：Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）１５−Ｓ−９ （９モルの酸化エチレンとＣ_１１−Ｃ_１５線状アルコールとの縮合生成物）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）２４−Ｌ−６ＮＭＷ （狭い分子量分布を有する、６モルの酸化エチレンとＣ_１２−Ｃ_１４第一アルコールとの縮合生成物） （両者ともＵｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより市販されている）；Ｎｅｏｄｏｌ（商標）４５−９ （９モルの酸化エチレンとＣ_１４−Ｃ_１５線状アルコールとの縮合生成物）、Ｎｅｏｄｏｌ（商標）２３−３ （３．０モルの酸化エチレンとＣ_１２−Ｃ_１３線状アルコールとの縮合生成物）、Ｎｅｏｄｏｌ（商標）４５−７ （７モルの酸化エチレンとＣ_１４−Ｃ_１５線状アルコールとの縮合生成物）、Ｎｅｏｄｏｌ（商標）４５−５ （５モルの酸化エチレンとＣ_１４−Ｃ_１５線状アルコールとの縮合生成物） （Ｓｈｅｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ により市販されている）；Ｋｙｒｏ（商標）ＥＯＢ （９モルの酸化エチレンとＣ_１３−Ｃ_１５アルコールとの縮合生成物） （Ｔｈｅ Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏｍｐａｎｙ により市販されている）；及びＧｅｎａｐｏｌ ＬＡ０５０（５モルの酸化エチレンとＣ_１２−Ｃ_１４アルコールとの縮合生成物）（Ｈｏｅｃｈｓｔにより市販されている）。それらの生成物におけるＨＬＢの好ましい範囲は８〜１１、及び最も好ましくは８〜１０である。
【０１７２】
また、約６〜約３０個の炭素原子、好ましくは約１０〜約１６個の炭素原子を含む疎水性基を有する、アメリカ特許第４，５６５，６４７号に開示されるアルキル多糖類、及び約１．３〜約１０、好ましくは約１．３〜約３、最も好ましくは約１．３〜約２．７のサッカリド単位を含む親水性基を有する多糖、例えばポリグリコシドが、本発明の界面活性剤系の非イオン性界面活性剤として有用である。
【０１７３】
５〜６個の炭素原子を含むいずれかの還元サッカリドが使用され得、例えばグルコース、ガラクトース、及びガラクトシル成分がグルコシル成分により置換され得る（任意には、疎水性基が２−，３−，４−，等の位置で結合され、従って、グルコシド又はガラクトシドとは対照的に、グルコース又はガラクトースが得られる）。サッカリド間結合は、例えば、追加のサッカリド単位の１つの位置と先に存在するサッカリド単位上の２−，３−，４−及び／又は６−位置との間で存在することができる。
【０１７４】
好ましいアルキルポリグリコシドは、下記式：
Ｒ^２Ｏ （Ｃ_ｎＨ_２ｎＯ）_ｔ （グリコシル）ｘ
［式中、Ｒ^２は、アルキル、アルキルフェニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルフェニル、及びそれらの混合物（ここで、アルキル基は約１０〜約１８、好ましくは約１２〜約１４個の炭素原子を含む）から成る群から選択され；ｎは、２又は３、好ましくは２であり；ｔは０〜約１０、好ましくは０であり；そしてｘは約１．３〜約１０、好ましくは約１．３〜約３、最も好ましくは約１．３〜約２．７である］を有する。
【０１７５】
グリコシルは好ましくは、グルコースに由来する。それらの化合物を調製するためには、アルコール又はアルキルポリエトキシアルコールが最初に形成され、そして次に、グルコース、又はグルコース源と反応せしめられ、グルコースが形成される（１−位置での結合）。次に、追加のグリコシル単位が、それらの１−位置と、先に存在するグルコシル単位２−，３−，４−，及び／又は６−位置、好ましくは、優力的には２−位置との間に結合され得る。
【０１７６】
酸化プロピレンとプロピレングリコールとの縮合により形成される疎水性基と酸化エチレンとの縮合生成物がまた、本発明の追加の非イオン性界面活性剤系としての使用のために適切である。それらの化合物の疎水性部分は、好ましくは、約１５００〜約１８００の分子量を有し、そして水不溶性を示すであろう。この疎水性部分へのポリオキシエチレン成分の付加は、全体として分子の水溶性を高める傾向があり、そして生成物の液体特性は、ポリオキシエチレン含有率が縮合生成物の合計重量の約５０％であり、約４０モルまでの酸化エチレンとの縮合に対応する点まで維持される。このタイプの化合物の例は、ＢＡＳＦにより市販されている一定のＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）界面活性剤を包含する。
【０１７７】
酸化プロピレン及びエチレンジアミンの反応に起因する生成物と酸化エチレンとの縮合生成物はまた、本発明の非イオン性界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用のためにも適切である。それらの生成物の疎水性成分は、エチレンジアミン及び過剰の酸化プロピレンの反応生成物から成り、そして一般的には、約２５００〜約３０００の分子量を有する。この疎水性成分は、縮合生成物が約４０〜約８０重量％のポリオキシエチレンを含み、そして約５，０００〜約１１，０００の分子量を有する程度まで、酸化エチレンにより縮合される。このタイプの非イオン性界面活性剤の例は、ＢＡＳＦから市販されているＴｅｔｒｏｎｉｃ（商標）化合物を包含する。
【０１７８】
アルキルフェノールのポリ酸化エチレン縮合物、すなわち約１〜約２５モルの酸化エチレン、アルキル多糖類及びそれらの混合物と第一及び第二脂肪族アルコールとの縮合生成物は、本発明の界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用のために好ましい。３〜１５個のエトキシ基を有するＧ_９−Ｃ_１４アルキルフェノールエトキシレート、及び２〜１０個のエトキシ基を有するＣ_８−Ｃ_１８アルコールエトキシレート（好ましくは、Ｃ_１０平均）、及びそれらの混合物が最も好ましい。
【０１７９】
下記式：
【化１】

【０１８０】
［式中、Ｒ^１はＨであり、又はＲ^１はＣ_１−４ヒドロカルビル、２−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシプロピル又はそれらの混合であり、Ｒ^２はＣ_５−３１ヒドロカルビルであり、そしてＺは線状ヒドロカルビル鎖に直接的に結合される少なくとも３個のヒドロキシルを有するそのヒドロカルビル鎖を有するポリヒドロキシヒドロカルビルである］
で表されるポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤、又はそのアルコキシル化された誘導体が、非常に好ましい非イオン性界面活性剤である。好ましくは、Ｒ^１はメチルであり、Ｒ^２は直鎖のＣ_{１１−１５}又はＣ_{１６−１８}アルキル、又はアルケニル鎖、例えばヤシアルキル又はそれらの混合物であり、そしてＺは還元糖、例えばグルコース、フルクトース、マルトース又はラクトースから還元アミノ化反応において誘導される。
【０１８１】
非常に好ましいアニオン性界面活性剤は、アルキルアルコキシル化されたスルフェート界面活性剤を包含する。その例は、式ＲＯ（Ａ）ｍＳＯ_３Ｍ ［式、Ｒは置換されていないＣ_１０−Ｃ_２０アルキル又はＣ_１０−Ｃ_２４アルキル成分を有するヒドロキシアルキル基、好ましくはＣ_１２−Ｃ_２０アルキル又はハロ−キシアルキル、より好ましくはＣ_１２−Ｃ_１８アルキル又はヒドロキシアルキルであり、Ａはエトキシ又はプロポキシ単位であり、ｍはゼロよりも大きく、典型的に約０．５〜約６、より好ましくは約０．５〜約３であり、そしてＭはＨ， 又は例えば、金属カチオンであり得るカチオン（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、等）、アンモニウム、又は置換されたアンモニウムカチオンである。
【０１８２】
アルキルエトキシル化されたスルフェート及びアルキルプロポキシル化されたスルフェートが本明細書において企画される。置換されたアンモニウムカチオンの特定の例は、メチル−、ジメチル−、トリメチル−アンモニウムカチオン、及び第四アンモニウムカチオン、例えばテトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペルジニウムカチオン、及びアルキルアミン、例えばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、それらの混合物から誘導されたそれらのもの、及び同様のものを包含する。
【０１８３】
典型的な界面活性剤は、Ｃ_１２−Ｃ_１８アルキルポリエトキシレート（１．０）スルフェート（Ｃ_１２−Ｃ_１８Ｅ（１．０）， Ｃ_１２−Ｃ_１８アルキルポリエトキシレート（２．２５）スルフェート（Ｃ_１２−Ｃ_１８（２．２５）Ｍ）及びＣ_１２−Ｃ_１８アルキルポリエトキシレート（３．０）スルフェート（Ｃ_１２−Ｃ_１８Ｅ（３．０）Ｍ）、Ｃ_１２−Ｃ_１８アルキルポリエトキシレート（４．０）スルフェート（Ｃ_１２−Ｃ_１８Ｅ（４．０）Ｍ）（ここで、Ｍは便利には、ナトリウム及びカリウムから選択される）である。
【０１８４】
使用される適切なアニオン性界面活性剤は、“Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ ＡｍｅｒｉｃａｎＯｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ”５２（１９７３）， ｐｐ．３２３−３２９に従って、気体ＳＯ_３によりスルホン化されたＣ_８−Ｃ_２０カルボン酸（すなわち、脂肪酸）の線状エステルを含むアルキルエステルスルホネート界面活性剤である。適切な出発材料は、牛脂、ヤシ油、等から誘導されるような天然の脂肪物質を包含する。
【０１８５】
特に、洗濯用途のための好ましくはアルキルエステルスルホネート界面活性剤は、下記式：
【化２】

【０１８６】
［式中、Ｒ^３はＣ_８−Ｃ_２０ヒドロカルビル、好ましくはアルキル又はそれらの組み合わせであり、Ｒ^４はＣ_１−Ｃ_６ヒドロカルビル、好ましくはアルキル、又はそれらの組み合わせであり、そしてＭはアルキルエステルスルホネートと共に水溶性塩を形成するカチオンである］で表される構造を有するアルキルエステルスルホネート界面活性剤を含んで成る。適切な塩形成カチオンは、金属、例えばナトリウム、カリウム及びリチウム、及び置換された又は置換されていないアンモニウムカチオン、例えばモノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンを包含する。好ましくは、Ｒ^３はＣ_１０−Ｃ_１６アルキルであり、そしてＲ^４はメチル、エチル又はイソプロピルである。Ｒ^３がＣ_１０−Ｃ_１６アルキルであるメチルエステルスルホネートが特に好ましい。
【０１８７】
他の適切なアニオン性界面活性剤は、式ＲＯＳＯ_３Ｍ［式中、Ｒは好ましくは、Ｃ_２０−Ｃ_２４ヒドロカルビル、好ましくはＣ_１０−Ｃ_２０アルキル成分を有するアルキル又はヒドロキシアルキル、より好ましくはＣ_１２−Ｃ_１８アルキル又はヒドロキシアルキルであり、そしてＭは、Ｈ、又はカチオン、例えばアルカリ金属カチオン（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム）、又はアンモニウム、又は置換されたアンモニウム（例えば、メチル−、ジメチル−及びトリメチルアンモニウムカチオン、及び第四アンモニウムカチオン、例えばテトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペリジニウム、及びアルキルアミン、例えばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン及びそれらの混合物から誘導された第四アンモニウムカチオン、及び同様のもの）である］で表される水溶性塩又は酸であるアルキルスルフェート界面活性剤を包含する。典型的には、Ｃ_１２−Ｃ_１６のアルキル鎖は、低い洗浄温度（例えば、約５０度以上）のために好ましい。
【０１８８】
洗浄目的のために有用な他のアニオン性界面活性剤はまた、本発明の洗濯洗剤組成物にも含まれ得る。それらは、次のものを包含する：石鹸の塩（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、及び置換されたアンモニウム塩、例えばモノ−、ジ−及びトリエタノール塩）、Ｃ_８−Ｃ_２２第一又は第二アルカンスルホネート、Ｃ_８−Ｃ_２４オレフィンスルホネート、イギリス特許第１，０８２，１７９号明細書に記載されるような、アルカリ土類金属クエン酸塩の熱分解された生成物のスルホン化により調製されたスルホン化さえたポリカルボン酸、Ｃ_８−Ｃ_２４アルキルポリグリコールエーテルスルホネート（１０モルまでの酸化エチレンを含む）、
【０１８９】
アルキルグリセロールスルホネート、脂肪アシルグリセロールスルホネート、脂肪オレイルグリセロールスルホネート、アルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルホネート、パラフィンスルホネート、アルキルホスホネート、イセチオネート、例えばアシルイセチオネート、Ｎ−アシルタウレート、アルキルスクシナメート及びスルホスクシネート、スルホスクシネートのモノエステル（特に、飽和及び不飽和Ｃ_１２−Ｃ_１８モノエステル）及びスルホスクシネートのジエステル（特に、飽和及び不飽和Ｃ_６−Ｃ_１２ジエステル）、
【０１９０】
アシルサルコシネート、アルキル多糖類のスルフェート、例えばアルキルポリグルコシドのスルフェート（非イオン性の硫酸化されていない化合物は下記に記載される）、枝分かれ鎖の第一アルキルスルフェート、及びアルキルポリエトキシカルボキシレート、例えば式ＲＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｋ−ＣＨ_２ＣＯＯ−Ｍ^＋［式中、ＲはＣ_８−Ｃ_２２アルキルであり、ｋは１〜１０の整数であり、そしてＭは可溶性塩形成カチオンである］で表されるそれらのもの。樹脂酸及び水素化された樹脂酸、例えばロジン、水素化されたロジン、及びタル油に存在するか又はその油から誘導された樹脂酸及び水素化された樹脂酸がまた適切である。
【０１９１】
アルキルベンゼンスルホネートが非常に好ましい。線状（直鎖）アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）（ここで、アルキル基は好ましくは、１０〜１８個の炭素原子を含む）が特に好ましい。
さらなる例は、“Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ”（Ｖｏｌ． Ｉ ａｎｄ ＩＩｂｙ Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｂｅｒｃｈ）に記載される。種々のそのような界面活性剤はまた、一般的に、アメリカ特許第３，９２９，６７８号（第２３頁左欄、第５８行〜第２９頁左欄、第２３行；引用により本明細書に組み込まれる）にも開示される。
本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、約１〜約４０重量％、好ましくは約３〜約２０重量％のそのようなアニオン性界面活性剤を含んで成る。
【０１９２】
本発明は清浄又は洗濯洗剤組成物はまた、カチオン性、両性、両性イオン及び半極性界面活性剤、並びに本明細書においてすでに記載されたもの以外の非イオン性及び／又はアニオン界面活性剤を含むことができる。
本発明の洗濯洗剤組成物への使用のために適切なカチオン性洗剤海面活性剤は、１つの長鎖ヒドロカルビル基を有すそれらのものである。そのようなカチオン性界面活性剤の例は、次のものを包含する：アンモニウム海面活性剤、例えばアルキルトリメチルアンモニウムハロゲン化物、及び下記式：
【０１９３】
［Ｒ^２（ＯＲ^３）ｙ］ ［Ｒ^４（ＯＲ^３）ｙ］_２Ｒ^５Ｎ^＋Ｘ⁻
［式中、Ｒ^２は、アルキル又はアルキル鎖に約８〜約１８個の炭素原子を有するアルキルベンジル基であり；個々のＲ^３は、−ＣＨ_２ＣＨ_２−， −ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）−， −ＣＨ_２ＣＨ_２（ＣＨ_２ＯＨ）−， −ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−及びそれらの混合物から成る群から選択され；個々のＲ^４は、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４ヒドロキシアルキル、２つのＲ^４基を連結することによって形成されるベンジル環構造体、
【０１９４】
及び−ＣＨ_２ＣＨＯＨＣＨＯＨＣＯＲ^６ＣＨＯＨＣＨ_２ＯＨ（ここで、Ｒ^６は、約１０００以下の分子量を有するいずれかのヘキソース又はヘキソースポリマー、及びｙが０でない場合、水素である）から成る群から選択され；Ｒ^５は、Ｒ^４と同じであるか、又はアルキル鎖であり、ここで炭素原子の合計数、又はＲ^２＋Ｒ^５ガが約１８よりも大きくなく；個々のｙは０〜約１０であり、そしてｙ値の合計０〜約１５であり；そしてＸがいずれかの適合できるアニオンである］を有するそれらの海面活性剤。
【０１９５】
非常に好ましいカチオン性界面活性剤は、下記式：
Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３Ｒ_４Ｎ^＋Ｘ⁻（ｉ）
［式、Ｃ_６−Ｃ_１６アルキルであり、個々のＲ_２， Ｒ_３， 及びＲ_４は独立して、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４ヒドロキシアルキル、ベンジル及び−（Ｃ_２Ｈ_４０）ＸＨ（ここで、Ｘは２〜５の値である）であり、Ｘはアニオンである］で表される本発明の組成物において有用な水溶性第四アンモニウム化合物である。多くとも１つのＲ_２， Ｒ_３又はＲ_４がベンジルであるべきである。
【０１９６】
Ｒ_１のための好ましいアルキル鎖長は、特に、アルキル基がヤシ脂肪に由来する鎖長の混合物、又はオレフィン増成又はＯＸＯアルコール合成により合成的に誘導される場合、Ｃ_１２−Ｃ_１５である。
Ｒ_２Ｒ_３及びＲ_４のための好ましい基は、メチル及びヒドロキシエチル基であり、そしてアニオンＸは、ハロゲン化合物、メトスルフェ−ト、アセテート及びホスフェートイオンから選択され得る。
【０１９７】
本明細書において使用するための式（ｉ）の適切な第四アンモニウム化合物の例は、次のものである：ココナッツ・トリメチルアンモニウム塩化合物又は臭化物；ココナッツ・メチルジヒドロキシエチルアンモニウム塩化物又は臭化物；デシルトリエチルアンモニウム塩化物；デシルジメチルヒドロキシエチルアンモニウム塩化物又は臭化物；Ｃ_１２−Ｃ_１５ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム塩化物又は臭化物；ココナッツ・ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム塩化物又は臭化物；ミリスチルトリメチルスルフェート；ラウリルジメチルベンジルアンモニウム塩化物又は臭化物；ラウリルジメチル （エテノキシ）_４アンモニウム塩化物又は臭化物；コリンエステル［式（ｉ）（式中、Ｒ_１は
【０１９８】
【化３】

　であり、そしてＲ_２Ｒ_３Ｒ_４はメチルである）で表される化合物］；ジアルキルイミダゾリン［式（ｉ）の化合物］。
【０１９９】
本明細書において有用な他のカチオン性界面活性剤は、アメリカ特許第４，２２８，０４４号及びヨーロッパ特許第０００２２４号に記載される。
本明細書に包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、０．２〜約２５重量％、好ましくは１〜約８重量％のそのようなカチオン性界面活性剤を含んで成る。
【０２００】
両性界面活性剤はまた、本発明の洗濯洗剤組成物への使用のためにも適切である。それらの界面活性剤は、第二又は第三アミンの脂肪族誘導体、又は複素環式第二及び第三アミンの脂肪族誘導体として広く記載され得、ここで前記脂肪族基は直鎖又は枝分かれ鎖であり得る。脂肪族置換基の１つは少なくとも約８個の炭素原子、典型的には、約８〜約１８個の炭素原子を含み、そして少なくとも１つは、アニオン性水溶性基、例えばカルボキシ、スルホネート又はスルフェートを含む。例えば、両性界面活性剤については、アメリカ特許第３，９２９，６７８号（第１９頁左欄、第１８〜３５行）を参照のこと。
本明細書において包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、０．２〜約１５重量％、好ましくは約１〜約１０重量％のそのような両性界面活性剤を含んで成る。
【０２０１】
両性イオン性界面活性剤はまた、洗濯洗剤組成物への使用のためにも適切である。それらの界面活性剤は、第二及び第三アミンの誘導体、複素環式第二及び第三アミンの誘導体、又は第四アンモニウム、第四ホスホニウム又は第三スルホニウム化合物の誘導体として広く記載され得る。例えば、両性イオン性界面活性剤については、アメリカ特許第３，９２９，６７８号（第１９頁左欄、第３８行〜第２２頁右欄、第４８行）を参照のこと。
本明細書において包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、０．２〜約１５重量％、好ましくは約１〜約１０重量％のそのような両性イオン性界面活性剤を含んで成る。
【０２０２】
半−極性非イオン性界面活性剤は、約１０〜約１８個の炭素原子の１つのアルキル成分及び約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された２つの成分を含む水溶性アミン酸化物；約１０〜約１８個の炭素原子の１つのアルキル成分及び約１〜約３個の炭酸原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された２つの成分を含む水溶性ホスフィン酸化物；及び約１０〜約１８個の炭素原子の１つのアルキル成分及び約１〜約３個の炭酸原子のアルキル及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された１つの成分を含む水溶性スルホキシドを含む、特定カテゴリーの非イオン性界面活性剤である。
【０２０３】
半−極性非イオン性洗剤界面活性剤は、下記式：
【化４】

【０２０４】
［式中、Ｒ^３は、約８〜約２２個の炭素原子を含む、アルキル、ヒドロキシアルキル又はアルキルフェニル基、又はそれらの混合物であり；Ｒ^４は、約２〜約３個の炭素原子を含むアルキレン又はヒドロキシアルキレン基、又はそれらの混合物であり；Ｘは０〜約３であり；そして個々のＲ^５は、約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル又はヒドロキシアルキル基、又は約１〜約３個の酸化エチレン基を含むポリ酸化エチレンである］で表される酸化アミン界面活性剤を含む。Ｒ^５基は、環構造を形成するために、例えば酸素又は窒素原子を通して、お互い結合され得る。
【０２０５】
それらのアミンの界面活性剤は特に、Ｃ_１０−Ｃ_１８アルキルジメチルアミン酸化物及びＣ_８−Ｃ_１２アルコキシエチルジヒドロキシエチルアミン酸化合物を含む。
本明細書に包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は、典型的には、０．２〜約１５重量％、好ましくは約１〜約１０重量％のそのような半−極性非イオン性界面活性剤を含んで成る。
【０２０６】
ビルダー系：
本発明の組成物はさらに、ビルダー系を含むことができる。次のいずれかの従来のビルダー系が、本発明への使用のために適切である：アルミノシリケート材料、シリケート、ポリカルボキシレート及び脂肪酸、材料、例えばエチレンジアミンテトラアセテート、金属イオン封鎖剤、例えばアミノポリホスホネ−ト、特にエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸及びジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸。明らかな環境の理由のためにほとんど好ましくはないけれども、ホスフェートビルダーもまた、本発明において使用され得る。
【０２０７】
適切なビルダーは、無機イオン交換材料、通常、無機水和化されたアルミノシリケート材料、より特定には、水和化された合成ゼオライト、例えば水和化されたゼオライトＡ，Ｘ， Ｂ， ＨＳ又はＭＡＰであり得る。
もう１つの適切な無機ビルダー材料は、積層されたシリケート、例えばＳＫＳ−６（Ｈｏｅｃｈｓｔ）である。ＳＫＳ−６は、珪酸ナトリウムから成る積層された結晶性シリケート（Ｎａ_２Ｓｉ_２Ｏ_５）である。
【０２０８】
１つのカルボキシ基を含む適切なポリカルボキシレートは、ベルギー特許第８３１， ３６８号、第８２１、３６８号及び第８２１、３７０号に開示されるように、乳酸、グリコール酸及びそれらのエーテル誘導体を包含する。２つのカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、琥珀酸、マロン酸、（エチレンジオキシ）ニ酢酸、マレイン酸、ジグリコール酸、酒石酸、タルト酸及びフマル酸の水溶性塩、及びドイツ特許第２，４４６，６８６号及び第２，４４６，４８７号、及びアメリカ特許第３，９３５，２５７号に記載されるエーテルカルボキシレート、及びベルギー特許第８４０，６２３号に記載されルスルフィニルカルボキシレートを包含する。
【０２０９】
３個のカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、特に水溶性シトレート、アコニトレート及びトラコネート、及びスクシネート誘導体、例えばイギリス特許第１，３７９，２４１号に記載さえるカルボキシメチルオキシスクシネート、オランダ特許出願第７２０５８７３号に記載されるラクトオキシスクシネート、及びイギリス特許第１，３８７，４４７号に記載されるオキシポリカルボキシレート材料、例えば２−オキサ−１，１，３−プロパントリカルボキシレートを包含する。
【０２１０】
４個のカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、イギリス特許第１，２６１，８２９号に開示されるオキシジスクシネート、スルホ置換基を含む１，１，３，３−プロパンテトラカルボキシレート、例えばイギリス特許第１，３９８，４２１号及び第１，３９８，４２２号及びアメリカ特許第３，９３６，４４８号に開示されるスルホスクシネート誘導体、及びイギリス特許第１，０８２，１７９号に記載されるスルホン化され、熱分解されたシトレートを包含し、そしてホスホン置換基を含むポリカルボキシレートはイギリス特許第１，４３９，０００号に開示される。
【０２１１】
脂環式及び複素環式ポリカルボキシレートは、次のものを包含する：シクロペンタン−シス、シス、シス−テトラカルボキシレート、シクロペンタジエニドペンタカルボキシレート、２，３，４，５−テトラヒドロ−フラン−シス、シス、シス−テトラカルボキシレート、２，５−テトラヒドロ−フラン−シス−ジスカルボキシレート、２，２，５，５−テトラヒドロフラン−テトラカルボキシレート、１，２，３，４，５，６−ヘキサン−ヘキサカルボキシレート、及び多価アルコール、例えばソルビトール、マンニトール及びキシリトールのカルボキシメチル誘導体。芳香族ポリカルボキシレートは、イギリス特許第１，４２５，３４３号に開示される、メリット酸、ピロメリット酸及びフタル酸誘導体を包含する。
【０２１２】
上記のうち、好ましいポリカルボキシレートは、分子当たり３個までのカルボキシ基を含むヒドロキシカルボキシレート、より特定には、シトレートである。　本発明の組成物への使用のための好ましいビルダー系は、水不溶性アルミノシリケートビルダー、例えばゼオライトＡ，又は積層されたシリケート（ＳＫＳ−６），及び水溶性カルボキシレートキレート剤、例えばクエン酸の混合物を包含する。
【０２１３】
本発明の洗剤組成物への包含のための適切なキレ−ト化剤は、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ニ琥珀酸（ＥＤＤＳ），そのアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム又は置換されたアンモニウム塩、又はそれらの混合物である。好ましいＥＤＤＳ化合物は、遊離酸形及びそのナトリウム又はマグネシウム塩である。ＥＤＤＳのそのような好ましいナトリウム塩の例は、Ｎａ_２ＥＤＤＳ及びＮａ_４ＥＤＤＳを包含する。ＥＤＤＳのそのような好ましいマグネシウム塩の例は、ＭｇＥＤＤＳ及びＭｇ_２ＥＤＤＳを包含する。マグネシウム塩は、本発明の組成物への包含のために最も好ましいものである。
【０２１４】
好ましいビルダー系は、水不溶性アルミノシリケートビルダー、例えばビオライトＡ，及び水溶性カルボキシレートキレート化剤、例えばクエン酸の混合物を包含する。
粒質組成物への使用のためのビルダー系の一部を形成することができる他のビルダー材料は、無機材料、例えばアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素塩、珪酸塩、及び有機材料、例えば有機ホスホネート、アミノポリアルキレンホスホネート及びアミノポリカルボキシレートを包含する。
【０２１５】
他の適切な水溶性有機塩は、ホモー又はコ−ポリマー酸又はそれらの塩であり、ここで前記ポリカルボン酸は２個よりも多くない炭素原子によりお互い分離された少なくとも２つのカルボキシ基を含んで成る。
このタイプのポリマーは、ＧＢ−Ａ−１，５９６，７５６号に開示される。そのような塩の例は、ＭＷ２０００〜５０００のポリアクレレート、及び無水マレイン酸とのそれらのコポリマーであり、そのようなコポリマーは、２０，０００〜７０，０００、特に約４０，０００の分子量を有する。
【０２１６】
洗浄ビルダー塩は通常、組成物の５〜８０重量％の量で含まれる。液体洗剤のためのビルダーの好ましいレベルは、５〜３０％である。
酸素：
マンナナ−ゼは、本発明の洗浄又は洗剤組成物中に、好ましくは、０．０００１〜２重量％、より好ましくは０．０００５〜０．５重量％、最も好ましくは０．００１〜０．１重量％のレベルで、純粋な酵素形で導入され得る。
【０２１７】
本発明の清浄組成物はさらに、セルラーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから成る群から選択されたカルボヒドラーゼを必須要素として含むことができる。好ましくは、本発明の清浄組成物は、マンナナーゼ、アミラーゼ、及びセルラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから成る群から選択されたもう１つの生物精練型酵素を含むであろう。
【０２１８】
本発明において使用できるセルラーゼは、細菌又は菌類セルラーゼを含む。好ましくは、それらは、５〜１２のｐＨ最適値及び５０ＣＥＶＵ／ｍｇ（セルラーゼ粘度単位）以上の比活性を有するであろう。適切なセルラーゼは、アメリカ特許第４，４３５，３０７号、Ｊ６１０７８３８４号及びＷＯ９６／０２６５３号に開示されており、それらの特許はそれぞれ、ヒューミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、トリコダーマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）及びスポロトリカム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）から生成される菌類セルラーゼを開示する。ＥＰ７３９９８２号は、新規バチルス種から単離されたセルラーゼを記載する。適切なセルラーゼはまた、ＧＢ−Ａ−２０７５０２８号；ＧＢ−Ａ−２０９５２７５号；ＤＥ−ＯＳ−２２４７８３２号及びＷＯ９５／２６３９８号にも開示される。
【０２１９】
そのようなセルラーゼの例は、ヒューミコラ・インソレンスの株（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ ｖａｒ． ｔｈｅｒｍｇｉｄｅａ）、特に株ヒューミコラ・インソレンスＤＳＭ１８００により生成されるセルラーゼである。他の適切なセルラーゼは、約５０ｋＤの分子量、５．５の等電点を有し、そして４１５個のアミノ酸を含むヒューミコラ・インソレンス起源のセルラーゼ；及びヒューミコラ・インソレンス、ＤＳＭ１８００に由来する約４３ｋＤのエンド−β−１，４−グルカナーゼであり；好ましいセルラーゼはＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／１７２４３号に開示されるアミノ酸配列を有する。
【０２２０】
また、適切なセルラーゼは、ＷＯ９４／２１８０１号に記載されるトリコダーマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）からのＢＧＩＩＩセルラーゼである。特に適切なセルラーゼは、色彩保護利点を有するセルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、ＷＯ９６／２９３９７号、ＥＰ−Ａ−０４９５２５７号、ＷＯ９１／１７２４３号、ＷＯ９１／１７２４４号及びＷＯ９１／２１８０１号に記載されるセルラーゼである。布の保護及び／又は洗浄性質についての他の適切なセルラーゼは、ＷＯ９６／３４０９２号、ＷＯ９６／１７９９４号及びＷＯ９５／２４４７１号に記載される。
【０２２１】
前記セルラーゼは通常、洗剤組成物の０．０００１〜２重量％の純粋な酵素のレベルで洗剤組成物に導入される。
本発明のための好ましいセルラーゼは、アルカリセルラーゼ、すなわち７〜１２の範囲のｐＨで、それらの最大活性の少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも４０％の活性を有する酵素である。より好ましいセルラーゼは、７〜１２の範囲のｐＨで、それらの最大活性を有する酵素である。好ましいアルカリセルラーゼは、商標Ｃａｒｅｚｙｍｅ（商標）としてＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓから市販されるセルラーゼである。
【０２２２】
アミラーゼ（α及び／又はβ）は、炭水化物基材のしみの除去のために含まれ得る。１９９４年２月３日に公開されたＷＯ９４／０２５９７号、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｄは、変異体アミラーゼを組込む清浄組成物を記載する。また、１９９５年４月２０日に公開されたＷＯ９５／１０６３０号、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓも参照のこと。清浄組成物への使用のための既知の他のアミラーゼは、α−及びβ−アミラーゼの両者を包含する。α−アミラーゼは当業界において知られており、そして次の特許に開示されるものを包含する：アメリカ特許第５，００３，２５７号；ＥＰ２５２，６６６号；ＷＯ９１／００３５３号；ＦＲ２，６７６，４５６号；ＥＰ２８５，１２３号；ＥＰ５２５，６１０号；ＥＰ３６８，３４１号；及びイギリス特許出願第１，２９６，８３９号（Ｎｏｖｏ）。
【０２２３】
他の適切なアミラーゼは、１９９４年８月１８日に公開されたＷＯ９４／１８３１４号及び１９９４年２月２２日に公開されたＷＯ９６／０５２９５（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）に記載される安定性−増強されたアミラーゼ、及び１９９５年４月に公開されたＷＯ９５／１０６０３号に公開される、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓから入手できる特許における、追加の修飾を有するアミラーゼ変異体である。また適切なアミラーゼは、ＥＰ２７７２１６号及びＷＯ９６／２３８７３号（すべては、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ による）に記載される。
【０２２４】
市販のα−アミラーゼ生成物の例は、ＧｅｎｅｎｃｏｒからのＰｕｒａｆｅｃｔ ＯＸ ＡＭ（商標）， 及びＴｅｒｍａｍｙｌ（商標）， Ｂａｎ（商標）， Ｆｕｕｇａｍｙｌ（商標）， 及びＤｕｒａｍｙｌ（商標）（すべては、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ Ｄｅｎｍａｒｋ から入手できる）である。ＷＯ９５／２６３９７号は、他の適切なアミラーゼ、すなわちＰｈａｄｅｂａｓ（商標） α−アミラーゼ活性アッセイにより測定される場合、２５℃〜５５℃の温度範囲、及び８〜１０の範囲のｐＨ値で、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）の比活性よりも少なくとも２５％高い比活性を有することによって特徴づけられるα−アミラーゼを記載する。ＷＯ９６／２３８７３号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）に記載される上記酵素の変異体が適切である。活性レベルに関して、改良された性質、及び熱安定性及びより高い活性レベルの組み合わせを有するほかのデンプン分解酵素が、ＷＯ９５／３５３８２号に記載される。
【０２２５】
本発明のための好ましいアミラーゼは、商標Ｔｅｒｍａｍｙｌ， Ｄｕｒａｍｙｌ 及びＭａｘａｍｙｌとして市販さえているアミラーゼ、及び／又はＷＯ９６／２３８７３号において配列番号２として開示される、高められた熱安定性を示すα−アミラーゼ変異体である。
特定の用途のための好ましいアミラーゼは、アルカリアミラーゼ、すなわち７〜１２の範囲のｐＨで、それらの最大活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも４０％の酵素活性を有する酸素である。より好ましいアミラーゼは、７〜１２に範囲のｐＨでそれらの最大活性を有する酵素である。　デンプン分解酵素は、組成物の０．０００１〜２重量％好ましくは０．０００１８〜０．０６重量％、より好ましくは０．０００２４〜０．０４８重量％の純粋の酵素レベルで、本発明の洗剤組成物に組込まれる。
【０２２６】
用語“ペクチン分解酵素”とは、次のものを包含することが意図される：アラビナナーゼ（ＥＣ ３．２．１．９９）、ガラクタナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８９）、ポリガラクツロナーゼ（ＥＣ ３．２．１．１５）、エキソ−ポリガラクツロナーゼ（ＥＣ ３．２．１．６７）、エキソ−ポリ−α−ガラクツロニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．８２）、ペクチンリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．１０）、ペクチンエステラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１１）、ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．２）、エキソ−ポリガラクツロナーゼリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．９）及びヘミセルラーゼ、例えばエンド−１，３−β−キシロシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３２）、キシラン−１，４−β−キシロシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３７）及びα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．５５）。
【０２２７】
ペクチン分解酵素は、上記酵素活性の天然の混合物である。従って、ペクチン酵素は、ペクチンエチルエステル結合を加水分解するペクチンメチルエステラーゼ、ガラクツロン酸分子間グリコシド結合を分解するポリガラクツロナーゼ、及びガラクツロン酸の不飽和誘導体を形成するためにα−１→４グリコシド結合の非加水分解性切断をもたらすようペクチン酸に対して作用するペクチントランスエリミナーゼ又はリアーゼを包含する。
ペクチン分解酵素は、好ましくは合計組合物の０．０００１〜２重量％、より好ましくは０．０００５〜０．５重量％、最も好ましくは０．００１〜０．１重量％（純粋な酵素）のレベルで、本発明に従って組成物中に導入される。
【０２２８】
特定の用途のための好ましいペクチン分解酵素は、アルカリペクチン分解酵素、すなわち７〜１２のｐＨで、それらの最大活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも４０％の酵素活性を有する酵素である。より好ましいペクチン分解酵素は、７〜１２のｐＨでそれらの最大活性を有する酵素である。アルカリペクチン分解酵素は、好アルカリ微生物、例えば細菌、菌類及び酵素、例えばバチルス種により生成される。好ましい微生物は、日本特許第５６１３１３７６号及び第５６０６８３９３号に記載されるように、バチルス・ファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【０２２９】
アルカリペクチン分解酵素は、ガラクツラン−１，４−α−ガラクツロナーゼ（ＥＣ ３．２．１．６．７）、ポリ−ガラクツロナーゼ活性（ＥＣ ３．２．１．１５）、ペクチンエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１．１１）、ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．２）及びそれらのイソ酵素を包含し、そしてそれらはエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）種により生成され得る。日本特許第５９０６６５８８号、日本特許第６３０４２９８８号、及びＷｏｒｌｄ Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （８， ２， １１５−１２０） １９９２に記載されるように、Ｅ．クリサンテミ（Ｅ． ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、Ｅ．カロトボラ（Ｅ． ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、Ｅ．アミロボラ（Ｅ． ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、Ｅ．ヘルビコラ（Ｅ． ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、Ｅ．ジソルベンス（Ｅ． ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ）が好ましい。前記アルカリペクチン酵素はまた、日本特許第７３００６５５７号及びＡｇｒ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９７２）， ３６ （２） ２８５−９３に開示されるように、バチルス種によって生成され得る。
【０２３０】
用語キシログルカナーゼは、Ｖｉｎｃｋｅｎ ａｎｄ Ｖｏｒａｇｅｎ ａｔ Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ［ｖｉｎｃｋｅｎ など． （１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １０４， ９９−１０７］ により記載される酵素ファミリーを包含し、そしてＨａｙａｓｈｉなど． （１９８９） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４０， １３９−１６８に記載されようなキシログルカンを分解できる。Ｖｉｎｃｋｅｎ などは、トリコダーマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）から精製されたキシログルカナーゼ（エンド−ＩＶ−グルカナーゼ）による、単離されたリンゴ細胞壁のセルラーゼからのキシログルカン被膜の除去を示した。この酵素は、細胞壁−埋封されたセルロースの酵素分解を増強し、そしてペクチン酵素と共同して作用する。Ｇｉｓｔ−ＢｒｃａｄｅｓからのＲａｐｉｄａｓｅ ＬＩＱ＋は、キシログルカナーゼ活性を含む。
【０２３１】
このキシログルカナーゼは、好ましくは、組成物の０．０００１〜２重量％．，より好ましくは０．０００５〜０．５重量％、最も好ましくは０．００１〜０．１重量％の純粋な酵素レベルで、本発明の清浄組成物中に導入される。
特定用途のための好ましいキシログルカナーゼは、アルカリキシログルカナーゼ、すなわち７〜１２の範囲のｐＨで、それらの最大活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは４０％の酵素活性を有する酵素である。より好ましいキシログルカナーゼは、７〜１２の範囲のｐＨで、それらの最大活性を有する酵素である。
【０２３２】
上記酵素は、いずれか適切な起源のもの、例えば植物、動物、細菌、菌類及び酵母起源のものであり得る。起源はさらに、中温性又は高温性（ｅｘｔｒｅｍｐｈｉｌｉｃ）（好冷性、向冷性、好熱性、好圧性、好アルカリ、好酸性、好ハロゲン性、等）であり得る。それらの酵素の精製された又は精製されない形が使用され得る。現在、本発明の清浄組成物において野生型酵素の性能効率を最適化するためにタンパク質又は遺伝子工学技法を通してそれらの酵素を修飾することは、通常の実施である。例えば、変異体は、そのような組成物中の通常遭遇する成分に対する酵素の適合性が高められるように企画され得る。他方では、変異体は、酵素変異体の最適ｐＨ、漂白剤又はキレート剤安定性、触媒活性及び同様のものが特定の清浄用途に適合するよう調整され得る。
【０２３３】
特に、漂白剤安定性の場合、酸化に対して敏感なアミノ酸に対して、及び表面適合性のための表面の電荷に対して注意が払われるべきである。そのような酵素の等電点はいくつかの荷電されたアミノ酸の置換により修飾され、例えば等電点の上昇はアニオン性界面活性剤との適合性の改良を助けることができる。酵素の安定性は、キレート剤安定性を高めるために、例えば追加の塩架橋及び強い金属結合部位の創造によりさらに高められ得る。
【０２３４】
漂白剤：
本発明の洗剤組成物に含まれ得る追加の任意の洗剤成分は、漂白剤、例えばＰＢ１，ＰＢ４， 及び４００〜８００μの粒子サイズを有するペルカルボネートを包含する。それらの漂白剤成分は、１又は複数の酸素漂白剤、及び選択される漂白剤に依存して、１又は複数の漂白活性化剤を含むことができる。存在する場合、酸素漂白化合物は典型的には、約１％〜約２５％のレベルで存在するであろう。一般的に、漂白化合物は、非液体配合物、例えば粒状洗剤において任意の添加される成分である。
【０２３５】
本発明に使用するための漂白剤成分は、洗剤組成物のために有用な漂白剤、例えば酸素漂白剤、及び当業界において知られている他のもののいずれかであり得る。
本発明のための適切な漂白剤は、活性化された又は活性化されていない漂白剤であり得る。
【０２３６】
使用され得る酸素漂白剤の１つのカテゴリーは、過カルボン酸漂白剤及びその塩を包含する。この種類の剤の適切な例は、マグネシウムモノペルオキシフタレート・６水和物、すなわちメタ−クロロ過安息香酸、４−ノニルアミノ−４−オキソペルオキシ酪酸及びジペルオキシドデカンジオール酸を包含する。そのような漂白剤は、アメリカ特許第４，４８３，７８１号、アメリカ特許第７４０，４４６号、ヨーロッパ特許第０１３３３５４号及びアメリカ特許第４，４１２，９３４号に開示される。非常に好ましい漂白剤はまた、アメリカ特許第４，６３４，５５１号に記載されるように、６−ノニルアミノ−６−オキソペルオキシカプロン酸も包含する。
【０２３７】
使用され得るもう１つのカテゴリーの漂白剤は、ハロゲン漂白剤を包含する。次亜ハロゲン化合物漂白剤の例は、トリクロロイソシアヌル酸、及びナトリウム及びカリウムジクロロイソシアヌレ−ト、及びＮ−クロロ及びＮ−ブロモアルカンスルホンアミドを包含する。そのような材料は通常、最終生成物の０．５〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％で添加される。
【０２３８】
次の過酸化水素離型剤が、漂白活性化剤と一緒に使用され得る：テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、ノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ；アメリカ特許第４，４１２，９３４号に記載される）、３，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート（ＩＳＯＮＯＢＳ；ヨーロッパ特許第１２０５９１号に記載される）又はペンタアセチルグルコース（ＰＡＧ）、ここでそれらは、活性漂白種として過酸を形成するために過加水分解され、改良された漂白効果がもたらされる。
【０２３９】
さらに、次の漂白活性剤が非常に適切である：Ｃ８（６−オクタアミド−カプロイル）オキシベンゼン−スルホネート、Ｃ９（６−ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート及びＣ１０（６−デカンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート又はそれらの混合物。または適切な活性化因子は、アシル化されたシトレートエステル、例えばヨーロッパ特許出願第９１８７０２０７．７号に開示されるようなものである。
【０２４０】
本発明の清浄組成物への使用のための漂白活性化剤及び過酸漂白化合物を含んで成る漂白系及び過オキシ酸を含む有用な漂白剤が、ＵＳＳＮ出願０８／１３６，６２６号に記載される。
過酸化水素はまた、洗浄及び／又はすすぎ工程の開始又はその間、過酸化水素を発生できる酵素系（すなわち、酵素及びそのための基質）を添加することによって存在することができる。そのような酵素系は、ヨーロッパ特許出願０５３７３８１号に開示される。
【０２４１】
酸素漂白剤以外の漂白剤もまた、当業界において知られており、そして本発明において使用され得る。特に興味ある１つのタイプの非酸素漂白剤は、光活性化された漂白剤、例えばスルホン化された亜鉛及び／又はアルミニウムフタロシアニンを包含する。それらの材料は、洗浄工程の間、支持体上に沈着され得る。日中の光下で乾燥するために布を吊り下げることによって、酸素の存在下で光による照射に基づいて、スルホン化された亜鉛フタロシアニンが活性化され、そして従って、支持体が漂白される。
【０２４２】
好ましい亜鉛フタロシアニン及び光活性化された漂白工程は、アメリカ特許第４，０３３，７１８号に記載されている。典型的には、洗剤組成物は、約０．０２５〜約１．２５重量％のスルホン化された亜鉛フタロシアニンを含むであろう。
漂白剤はまた、マンガン触媒を含むことができる。このマンガン触媒は、“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｎｇａｍｅｓｅ ｃａｔａｌｙｓｔｓ ｆｏｒ ｌｏｗ−Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｂｌｅａｃｈｉｎｇ”、Ｎａｔｕｒｅ ３６９ １９９４， ｐｐ．６３７−６３９に記載される化合物の１つであり得る。
【０２４３】
石鹸の泡抑制剤：
もう１つの任意の成分は、シリコーン及びシリカ−シリコーン混合物により例示される石鹸の泡抑制剤である。シリコーンは一般的に、アルキル化されたポリシロキサン材料により表され得るが、ところがシリカは通常、細かく分割された形で使用され、シリカエーロゲル及びキセロゲル、及び種々のタイプの疎水性シリカにより例示される。それらの材料は粒質物として導入され得、ここで石鹸の泡抑制剤は好都合には、水溶性又は水分散性、実質的には非界面活性剤不透明過性キャリヤーに開放できるように導入される。他方では、石鹸の泡抑制剤は、液体キャリヤーに溶解され又は分散され、そして１又は複数の他の成分上に噴霧することによって適用され得る。
【０２４４】
好ましいシリコーン石鹸の泡抑制剤はアメリカ特許第３，９３３，６７２号に開示される。他の特に有用な石鹸の泡抑制剤は、ドイツ特許出願（ＤＴＯＳ）第２，６４６，１２６号に記載される自己乳化性シリコーン石鹸の泡抑制剤である。そのような化合物の例は、シロキサン−グリコールポリマーである、ＤＯＷ Ｃｏｒｎｉｎｇから市販されているＤＣ−５４４である。特に好ましい石鹸の泡抑制剤は、シリコーン油及び２−アルキル−アルケノールの混合物を含んで成る石鹸の泡抑制剤系である。適切な２−アルキル−アルカノールは、商標名Ｉｓｏｆｏｌ １２Ｒとして市販されている２−ブチル−オクタノールである。
【０２４５】
そのような石鹸の泡抑制剤系は、ヨーロッパ特許出願第０５９３８４１号に記載されている。
特に好ましいシリコーン石鹸の泡抑制剤は、ヨーロッパ特許出願第９２２０１６４９．８号に記載されている。前記組成物は、ヒュームド非孔性シリカ、例えばＡｅｒｏｓｉｌ^Ｒと組合して、シリコーン／シリカ混合物を含んで成る。
上記石鹸の泡抑制剤は通常、組成物の０．００１〜２重量％、好ましくは０．０１〜１重量％のレベルで使用される。
【０２４６】
他の成分：
洗剤組成物に使用される他の成分、例えば土壌−沈殿防止剤、土壌−開放剤、蛍光増白剤、研磨剤、殺菌剤、曇り抑制剤、着色剤、及び／又は封入された又は封入されていない香料が使用され得る。
特に適切な封入材料は、イギリス特許第１，４６４，６１６号に記載されるような、多糖及びポリヒドロキシ化合物のマトリックスから成る水溶性カプセルである。
【０２４７】
他の適切な水溶性封入材料は、アメリカ特許第３，４５５，８３８号に記載されるような、置換ジカルボン酸のゲル化されていないスターチ酸エステルに由来するデキストリンを含んで成る。それらの酸−エステルデキストリンは、好ましくは、モチ状トウモロコシ、モチ状モロコシ、サゴ、タピオカ及びジャガイモのようなスターチから調製される。前記封入材料の適切な例は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｒｃｈにより製造されるＮ−Ｌｏｋを包含する。Ｎ−Ｌｏｋ封入材料は、変性されたトウモロコシスターチ及びグルコースから成る。スターチは、一官能価置換された基、例えばオクテニル無水琥珀酸を添加することによって変性される。
【０２４８】
本発明において適切な再付着防止剤及び土壌沈殿防止剤は、セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロース、及びホモ−又はコ−ポリマーポリカルボン酸又はそれらの塩を包含する。このタイプのポリマーは、ビルダーとして前に言及された、ポリアクリレート及び無水マレイン酸−アクリル酸コポリマー、及びエチレン、メチルビニルエーテル又はメタクリル酸と無水マレイン酸とのコポリマー（前記無水マレイン酸は、コポリマーの少なくとも２０％モル％を構成する）を包含する。それらの材料は通常、組成物の０．５〜１０重量％より好ましくは０．７５〜８重量％、最も好ましくは１〜６重量％のレベルで使用される。
【０２４９】
好ましい蛍光増白剤は、特徴的にはアニオン性であり、それらの例としては、次のものを列挙することができる：二ナトリウム４，４’−ビス−（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２’−ジスルホネート；ニナトリウム４，４’−ビス−（２−モルホリノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ−スチルベン−２：２’−ジスルホネート；二ナトリウム４，４’−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２’−ジスルホネート；一ナトリウム４’，４”−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２−スルホネート；
【０２５０】
二ナトリウム４，４’−ビス−（２−アニリノ−４−（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネ−ト；二ナトリウム４，４’−ビス−（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール−２−イル）スチルベン−２，２’−ジスルホネ−ト；二ナトリウム４，４’−ビス−（２−アニリノ−４−（１−メチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート；ナトリウム−２−（スチルビル−４”−（ナフト−１’， ２’：４，５）−１，２，３−トリアゾール−２”−スルホネート；４，４’−ビス（２−スルホスチリル）ビフェニル。
【０２５１】
他の有用なポリマー材料は、ポリエチレングリコール、特に１，０００〜１０，０００の分子量、より特定には２，０００〜８，０００の分子量及び最も特定には、約４，０００の分子量のものである。それらは、０．２０〜５重量％、より好ましくは０．２５〜２．５重量％のレベルで使用される。それらのポリマー及び前記のホモ−又はコ−ポリマー性ポリカルボキシレート塩は、白色度の維持、布への灰の付着、及び遷移金属不純物の存在下での、粘土、タンパク質性及び酸化性土壌に対して清浄性能を改良するために価値あるものである。
【０２５２】
本発明の組成物において有用な土壌開放剤は従来、種々の割合でのエチレングリコール及び／又はプロピレングリコール単位とテレフタル酸とのコポリマー又はターポリマーである。そのようなポリマーの例は、アメリカ特許第４，１１６，８８５号及び第４，７１１，７３０号、及びヨーロッパ特許第０２７２０３３号に開示される。ヨーロッパ特許第０２７２０３３号による特に好ましいポリマーは、下記式：
（ＣＨ_３（ＰＥＧ）_４３）_０．７５（ＰＯＨ）_０．２５［（Ｔ−ＰＯ）_２．８（Ｔ−ＰＥＧ）_０．４］Ｔ（ＰＯＨ）_０．２５（（ＰＥＧ）_４３ＣＨ_３）_０．７５
［式中、ＰＥＧは−（ＯＣ_２Ｈ_４）Ｏ−であり、ＰＯは（ＯＣ_３Ｈ_６Ｏ）であり、そしてＴは（ｐＯＯＣ_６Ｈ_４ＣＯ）である］を有する。
【０２５３】
ジメチルテレフタレート、ジメチルスルホイソフタレート、エチレングリコール及び１，２−プロパンジオールのランダムコポリコーとしての変性されたポリエステルがまた、非常に有用であり、ここで末端基は、第１に、スルホルベンゾエート及び第２に、エチレングリコール及び／又は１，２−プロパンジオールのモノエステルから成る。目的は、“主に”、スルホベンゾエート基により両端でキャップされたポリマーを得ることであり、本明細書においては、本明細書における前記コポリマーのほとんどは、スルホベンゾエート基によりキャップされるであろう。
【０２５４】
しかしながら、いくつかのコポリマーは十分にはキャップされず、そして従って、それらの末端基はエチレングリコール及び／又は１，２−プロパンジオールのモノエステルから成り、従って、第２に、そのような種から成ることができる。
本明細書における選択されたポリエステルは、約４６重量％のジメチルテレフタル酸、約１６重量％の１，２−プロパンジオール、約１０重量％のエチレングリコール、約１３重量％のジメチルスルホ安息香酸及び約１５重量％のスルホイソフタル酸を含み、そして約３，０００の分子量を有する。ポリエステル及びそれらの調製方法は、ヨーロッパ特許第３１１３４２号に記載されている。
【０２５５】
軟化剤：
布軟化剤もまた、本発明に従って、洗濯洗剤組成物中に導入され得る。それらの剤は、無機又は有機型のものであり得る。無機軟化剤は、ＧＢ−Ａ−１ ４００８９８号及びアメリカ特許第５，０１９，２９２号に開示されるスメクタイトクレー（ｓｍｅｃｔｉｔｅ ｃｌａｙｓ）により例示される。有機布軟化剤は、ＧＢ−Ａ１ ５１４２７６号及びヨーロッパ特許第００１１３４０号に開示されるように水不溶性第三アミンを含み、そしてモノＣ_１２−Ｃ_１４第四アンモニウム塩とのそれらの組み合わせがＥＰ−Ｂ−００２６５２８号に開示されており、そして前記剤は、ヨーロッパ特許第０２４２９１９号に開示されるように２つの長鎖アミドを含む。布軟化システムの他の有用な有機成分は、ヨーロッパ特許第０２９９５７５号及び第０３１３１４６号に開示されるように高分子量ポリ酸化エチレン材料を含む。
【０２５６】
スメクタイトクレーのレベルは通常、５〜１５重量％、より好ましくは８〜１２重量％の範囲であり、そして前記材料は配合物の残りに混合された乾燥成分として添加される。有機布軟化剤、例えば水不溶性第三アミン又は２つの長鎖アミド材料は、０．５〜５重量％、通常１〜３重量％のレベルで導入され、そして高分子量ポリ酸化エチレン材料及び水溶性カチオン性材料は、０．１〜２重量％、通常０．１５〜１．５重量％のレベルで添加される。それらの材料は通常、組成物の噴霧乾燥された部分に添加されるが、但し多くの場合、それは乾燥混合された粒質物としてそれらを添加し、又は組成物の他の固体成分上に溶融された液体としてそれらを噴霧することがより便利であり得る。
【０２５７】
ポリマー性色素移動阻害物質：
本発明の界面活性剤組成物は、０．００１重量％〜１０重量％、好ましくは０．０１重量％〜２重量％、さらに好ましくは０．０５重量％〜１重量％のポリマー性色素移動阻害物質を含む。該ポリマー性色素移動阻害物質は通常、界面活性剤組成物に取り込まれて、着色布地から、該界面活性剤組成物で洗浄される布地へ色素が移動するのを阻害する。これらのポリマーは、色素が洗濯物中の他の物質に結合する機会を有する前に、着色布地から離れていく色素と複合体を生成するかまたはこれを吸着する能力を有する。
【０２５８】
特に好適なポリマー性色素移動阻害物質は、ポリアミンＮ−オキソドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとの共重合体、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリビニルオキサゾリドンとポリビニルイミダゾール、またはこれらの混合物である。
このようなポリマーはまた、本発明の酵素の性能を増強する。
【０２５９】
製紙パルプ産業における使用
さらに、本発明のマンナナーゼは、製紙パルプ（化学パルプ、半パルプ、機械パルプまたはクラフトパルプ）の塩素を含まない漂白プロセスにおいて、これらの輝きを上昇させ、こうして漂白プロセスにおける過酸化水素のニーズを低減または排除するのに有用である。
【０２６０】
繊維産業およびセルロース繊維加工産業における使用
本発明のマンナナーゼは、繊維の製造または界面活性剤と組合せた繊維のクリーニングのために、他の炭水化物分解酵素（例えば、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、種々のペクチナーゼ）と組合せて使用することができる。
本発明において「セルロース性材料」という用語は、綿、混紡綿、または天然もしくは人工セルロース物質（例えば、木材パルプのようなキシラン含有セルロース繊維由来）またはこれらの混紡から作られた、繊維、織布や不織布（ニット、織物、デニム、ヤーン、およびタオル地を含む）を意味する。
【０２６１】
混紡の例には、綿またはレーヨン／ビスコースと、羊毛、合成繊維（例えば、ポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリビニルクロリド繊維、ポリビニリドンクロリド繊維、ポリウレタン繊維、ポリ尿素繊維、アラミド繊維）およびセルロース含有繊維（例えば、レーヨン／ビスコース、ラミー、アサ、アマ／リネン、ジュート、酢酸セルロース繊維、リオセル）のような１つまたはそれ以上のコンパニオン材料との混紡がある。
【０２６２】
例えば綿繊維を衣類の製造に使用可能な材料にするような、繊維産業のセルロース材料の加工には、以下のいくつかの工程がある：繊維を紡糸してヤーンにする：ヤーンから織布またはニットの作成および以後の製品化、染色、仕上げ操作。織布品は、一連の縦糸の間に横糸を織ることにより作成され、これらの糸のタイプは異なっていてもよい。
【０２６３】
糊抜き：整経速度を上昇させるために、織る前に高分子糊（例えば、マンナン、デンプン、ＣＭＣまたはＰＶＡ）が加えられる。この材料は、さらに加工する前に除去しなければならない。本発明の酵素は、マンナン含有糊の除去に有用である。
元糊の分解
グアールガムやローカストビーンガムのようなガラクトマンナンは、Ｔシャツへの捺染のような繊維の捺染、例えば食品や捺染糊のような増粘剤として広く使用されている。本発明の酵素または酵素調製物は、加工装置の残存食物の粘度を低下させ、従って加工後のクリーニングを促進するのに使用することができる。さらに、この酵素または酵素調製物は、捺染糊の粘度を低下させ、従って繊維の捺染後の過剰の捺染糊の洗浄を促進するのに有用であると考えられる。
【０２６４】
植物物質の分解または修飾
本発明の酵素または酵素調製物は好ましくは、植物由来の物質を含有するマンナン、ガラクトマンナン、グルコマンナンまたはガラクトグルコマンナンの分解または修飾ための物質として有用である。このような物質の例としては、グアールガムやローカストビーンガムがある。
本発明のマンナナーゼは、植物由来の物質の物理化学的性質（例えば、粘度）を修飾するのに使用できる。例えばマンナナーゼは、マンナンを含有する飼料や食物の粘度を低下させ、粘性のあるマンナン含有物質の加工を促進するのに有用である。
【０２６５】
コーヒー抽出
本発明の酵素または酵素調製物はまた、液体コーヒー抽出物中に存在するガラクトマンナンの加水分解に、好ましくは（インスタント）コーヒーの凍結乾燥中のゲル形成を阻害するために使用される。好ましくは本発明のマンナナーゼは、酵素消費を低減させ、コーヒーの汚染を避けるために、固定化される。この使用はさらに、ＥＰ−Ａ−６７６１４５で説明されている。
【０２６６】
地下部の破砕における使用（石油掘穿）
さらに、本発明の酵素は、ビージェイサービシーズ社（ＢＪ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ） （米国テキサス州ヒューストン）の米国特許第５，８０６，５９７号，５，５６２，１６０号、５，２０１，３７０号、および５，０６７，５６６号に開示されたように、酵素破壊剤として有用であると考えられる。
【０２６７】
従って本発明のマンナナーゼは、井戸掘穿において地下部の破壊法として有用であり、ここでは、水性液体、水和可能ポリマー、水和可能ポリマーを架橋するための適当な架橋剤を混合して、ポリマーゲルと酵素破壊物質（すなわち、本発明の酵素）を形成する。架橋ポリマーゲルは、地下部を破壊するのに充分な圧力下で、井戸穴中にポンプで入れられる。酵素破壊物は、時間とともに架橋ポリマーを分解して液体の粘度を低下させるため、液体を地下部から井戸の表面にポンプで送ることができる。
【０２６８】
酵素破壊物は、分解性液体または分解剤−架橋剤−ポリマー複合体（これはさらに、水和可能ポリマーと架橋剤を含む）の成分でもよい。分解性液体または複合体は、ゲルまたはゲル化可能なものである。複合体は、周りの地下部を分解するのに充分な圧力下で、井戸穴内の液体を所望の位置にポンプで送ることにより、井戸穴の周りの地下部を分解するのに、分解性液体中の複合体の使用方法に有用である。液体が井戸穴中に入れられ、所望の分解が完了する時まで、ｐＨと温度の具体的な条件を維持することにより、複合体は実質的に非反応性状態で維持される。いったん分解が完了すれば、複合体が不活性である特定の条件は、もう維持されない。条件が充分に変化すると複合体が活性になり、分解物はポリマー分解の触媒を始め、分解性液体が、地下部から井戸の表面に液体を充分に送られるようにする。
【０２６９】
材料と方法
活性試験ための測定法
マンナナーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の標準的試験方法により試験され、例えば、被験溶液を、０．２％ＡＺＣＬガラクトマンナン（ｃａｒｏｂ）（メガザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）社のカタログ番号Ｉ−ＡＺＧＭＺとして入手できるエンド−１，４−ベータ−Ｄ−マンナナーゼの測定ための基質）（メガザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）社のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｇａｚｙｍｅ．ｃｏｍ／Ｐｕｒｃｈａｓｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ））を含有する寒天プレート中に開けた直径４ｍｍの穴に適用する。
【０２７０】
マンナナーゼ比色法の触媒活性（ ＭａｎＵ ）の測定
基質：０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１０．０）中のｃａｒｏｂ由来の０．２％ＡＺＣＬガラクトマンナン（メガザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）、オーストラリア）。
この測定法は、サーモミキサー上のエッペンドルフマイクロチューブ１．５ｍｌ中で攪拌しながら温度を４０℃に制御して行われる。０．７５０ｍｌの基質を０．０５ｍｌの酵素と２０分間インキュベートし、１５０００ｒｐｍで４分遠心分離して反応を停止させる。基質の色を、１ｃｍのキュベット中で６００ｎｍで測定する。
１ＭａｎＵ（マンナナーゼ単位）は、１ｃｍで０．２４の吸光度を与える。
【０２７１】
株とドナー生物
前述のバチルス・スペーシスＩ６３３は、配列番号１に示すＤＮＡ配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌ＤＳＭ１２１９７は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号１）。
前述のバチルス・アガラダエレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）ＮＣＩＭＢ４０４８２は、配列番号５に示すＤＮＡ配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌ＤＳＭ１２１８０は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号５）。
【０２７２】
前述のバチルス・スペーシスＡＡＩ１２は、配列番号９に示すＤＮＡ配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌ＤＳＭ１２４３３は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号９）。
前述のバチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）は、配列番号１１に示すＤＮＡ配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌ＤＳＭ１２４４１は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号１１）。
前述のフミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）は、配列番号１３に示すＤＮＡ配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
【０２７３】
大腸菌ＤＳＭ９９８４は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号１３）。
前述のバチルス・スペーシスＡＡ３４９は、配列番号１５に示すＤＮＡ配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌ＤＳＭ１２４３２は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号１５）。
大腸菌ＤＳＭ１２８４７は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号１７）。
大腸菌ＤＳＭ１２８４８は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号１９）。
【０２７４】
前述のバチルス・クラウジイー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）は、配列番号２１に示すＤＮＡ配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌ＤＳＭ１２８４９は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号２１）。
大腸菌ＤＳＭ１２８５０は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号２３）。
バチルス・スペーシスは、配列番号２５に示すＤＮＡ配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌ＤＳＭ１２８４６は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号２５）。
【０２７５】
バチルス・スペーシスは、配列番号２７に示すＤＮＡ配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌ＤＳＭ１２８５１は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号２７）。
前述のバチルス・リケニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）は、配列番号２９に示すＤＮＡ配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌ＤＳＭ１２８５２は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号２９）。
バチルス・スペーシスは、配列番号３１に示すＤＮＡ配列をコードするベータ−１，４−マンナナーゼを含む。
大腸菌ＤＳＭ１２４３６は、本発明のベータ−１，４−マンナナーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを含む（配列番号３１）。
【０２７６】
大腸菌株：大腸菌ＳＪ２の細胞（ヂデリクセン（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ， Ｂ．）， ウェドステッド（Ｗｅｄｓｔｅｄ， Ｕ．）， ヘデガード（Ｈｅｄｅｇａａｒｄ， Ｌ．）， ジェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ， Ｂ． Ｒ．）， スジョホルム（Ｓｊｏｈｏｌｍ， Ｃ．）、（１９９０）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）のエクソ酵素であるアルファ−アセトラクテートデカルボキシラーゼをコードするａｌｄＢのクローニング、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７２， ４３１５−４３２１）を調製し、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のジーンパルサー（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）（登録商標）を使用して、電気穿孔法により、製造業者の説明書に従って形質転換した。
【０２７７】
枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰＬ２３０６。この株は、既知の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）セルラーゼ遺伝子の転写単位中で破壊されたａｐｒ遺伝子とｎｐｒ遺伝子（ヂデリクセン（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ， Ｂ．）， ウェドステッド（Ｗｅｄｓｔｅｄ， Ｕ．）， ヘデガード（Ｈｅｄｅｇａａｒｄ， Ｌ．）， ジェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ， Ｂ． Ｒ．）， スジョホルム（Ｓｊｏｈｏｌｍ， Ｃ．）、 （１９９０）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）のエクソ酵素であるアルファ−アセトラクテートデカルボキシラーゼをコードするａｌｄＢのクローニング、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７２， ４３１５−４３２１）を有するため、セルラーゼ陰性細胞となっている枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＮ１８８５である。この破壊は基本的に既に記載されているように行われた（ソネンシェイン（Ａ．Ｌ． Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ）， ホッホ（Ｊ．Ａ． Ｈｏｃｈ）とリチャードロシック（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｌｏｓｉｃｋ）（１９９３）、 枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）と他のグラム陽性細菌、アメリカ微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ｐ． ６１８）。
【０２７８】
ヤスビン（Ｙａｓｂｉｎ， Ｒ． Ｅ．）， ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ， Ｇ．Ａ．）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ， Ｆ． Ｅ．）（１９７５）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の溶原性株中の形質転換とトランスフェクション：コンピタント細胞中のプロファージの選択的誘導の証拠、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １２１： ２９６−３０４に記載したように、コンピタント細胞を調製し形質転換した。
【０２７９】
一般的分子生物学的方法：
特に明記しないバチルスＩＩは、ＤＮＡ操作と形質転換は、分子生物学の標準的方法を使用して行った（サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、モレキュラークローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク：アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．）ら（編）、「分子生物学の現代のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、１９９５：ハーウッド（Ｈａｒｗｏｄ， Ｃ．Ｒ．）とカッティング（Ｃｕｔｔｉｎｇ， Ｓ．Ｍ．）（編）「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ための分子生物学的方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、１９９０）。
【０２８０】
ＤＮＡ操作の酵素は、製造業者の説明書に従って使用される（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼなどは、ニューイングランドバイオラボズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）から入手できる）。
【０２８１】
プラスミド
ｐＳＪ１６７８：（ＷＯ９４／１９４５４として発行された国際特許出願を参照されたい）。
ｐＢＫ−ＣＭＶ（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｉｎｃ）、ラホヤ、カリホルニア州）　ｐＭＯＬ９４４。このプラスミドは、プラスミドを枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中で繁殖できるようにする成分と、カナマイシン耐性遺伝子を実質的に含有し、バチルス・リケニホルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ１４５８０由来の強いプロモーターとシグナルペプチドを有する、ｐＵＢ１１０誘導体である。シグナルペプチドは、ＳａｃＩＩ部位を含有し、シグナルペプチドと融合したタンパク質の成熟部分をコードするＤＮＡをクローン化するのに便利である。このため、細胞の外側に対するプレ−プロテインが発現される。
このプラスミドは、通常の遺伝子操作法により作製され、以下に簡単に説明する。
【０２８２】
ｐＭＯＬ９４４ の作製：
ｐＵＢ１１０プラスミド（マッケンジー（ＭｃＫｅｎｚｉｅ， Ｔ．）ら、１９８６， Ｐｌａｓｍｉｄ １５：９３−１０３）を、ユニークな制限酵素ＮｃｉＩで消化した。プラスミドｐＤＮ１９８１（ジョルゲンセン（Ｐ．Ｌ． Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ）ら、１９９０， Ｇｅｎｅ， ９６， ｐ３７−４１）にコードされたａｍｙＬプロモーターから増幅したＰＣＲ断片を、ＮｃｉＩで消化し、ＮｃｉＩ消化したｐＵＢ１１０中に挿入して、プラスミドｐＳＪ２６２４を得た。
使用した２つのＰＣＲプライマーは以下の配列を有する：
＃ ＬＷＮ５４９４ ５’−ＧＴＣＧＣＣＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＡＴＣＴＣＡＧＣ−３’
＃ ｌｗｎ５４９５ ５’−ＧＴＣＧＣＣＣＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＡＴＣＡＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＡＧＧＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴ−３’
【０２８３】
プライマー＃ＬＷＮ５４９４は、プラスミド中にＮｏｔＩ部位を挿入する。
次にプラスミドｐＳＪ２６２４をＳａｃＩとＮｏｔＩで消化し、ｐＤＮ１９８１上にコードされたａｍｙＬプロモーターで増幅したＰＣＲ断片を、ＳａｃＩ−ＮｏｔＩ消化ｐＳＪ２６２４中に挿入して、プラスミドｐＳＪ２６７０を得た。
このクローニングは、同じプロモーターで、しかし反対方向で最初のａｍｙＬプロモーターを置換している。ＰＣＲ増幅に使用された２つのプライマーは以下の配列を有する：
＃ＬＷＮ５９３８ ５’−ＧＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＴＧＡＴＣＡＣＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＡＧＧＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴ−３’
＃ＬＷＮ５９３９ ５’−ＧＴＣＧＧＡＧＣＴＣＴＡＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＡＴＣＴＣＡＧＣ−３’
【０２８４】
プラスミドｐＳＪ２６７０を、制限酵素ＰｓｔＩとＢｃｌＩで消化し、アルカリ性アミラーゼＳＰ７２２（特許＃ＷＯ９５２６３９７−Ａ１）をコードするクローン化したＤＮＡ配列から増幅したＰＣＲ断片を、ＰｓｔＩとＢｃｌＩで消化し、挿入して、プラスミドｐＭＯＬ９４４を得た。ＰＣＲ増幅に使用された２つのプライマーは以下の配列を有する：
＃ＬＷＮ７８６４ ５’−ＡＡＣＡＧＣＴＧＡＴＣＡＣＧＡＣＴＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣ−３’
＃ＬＷＮ７９０１　　　 ５’ −ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＣＡＣＡＴＣＡＴＡＡＴＧＧＧＡＣＡＡＡＴＧＧＧ−３’
プライマー＃ＬＷＮ７９０１は、プラスミド中にＳａｃＩＩ部位を挿入する。
【０２８５】
ドナー株の培養とゲノム ＤＮＡ の単離
バチルスの関連する株（例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種Ｉ６３３）を、５００ｍｌのＴＹ当たり５０ｍｌの１Ｍナトリウム−セスキカルボナートを添加して、ｐＨを約９．７に調整したＴＹ中で増殖させた。３０℃、３００ｒｐｍで２４時間インキュベート後、細胞を採取し、ピッチャー（Ｐｉｔｃｈｅｒ）らが記載した方法によりゲノムＤＮＡを単離した［ピッチャー（Ｐｉｔｃｈｅｒ， Ｄ． Ｇ．）， サンダース（Ｓａｕｎｄｅｒｓ， Ｎ．Ａ．）， オーウェン（Ｏｗｅｎ， Ｒ． Ｊ）；チオシアン酸グアニジウムによる細菌性ゲノムＤＮＡの迅速抽出；Ｌｅｔｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｌ １９８９ ８ １５１−１５６］。
【０２８６】
培地
ＴＹ（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．）ら（編）、「分子生物学の現代のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、１９９５に記載）。
ＬＢ 寒天（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．）ら（編）、「分子生物学の現代のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、１９９５に記載）。
ＬＢＰＧは、０．５％グルコースと０．０５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．０）を補足したＬＢ寒天。
【０２８７】
ＡＺＣＬ −ガラクトマンナンを、ＬＢＰＧ−寒天に０．５％になるように加える。ＡＺＣＬ−ガラクトマンナンは、メガザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）（オーストラリア）から得られる。
ＢＰＸ 培地は、ＥＰ０５０６７８０（ＷＯ９１／０９１２９）に記載されている。
ＮＺＹ 寒天（１リットル当たり）　５ｇのＮａＣｌ、２ｇのＭｇＳＯ_４、５ｇの酵母エキス、１０ｇのＮＺアミン（カゼイン加水分解物）、１５ｇの寒天；脱イオン水を加えて１リットルにし、ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整し、オートクレーブする。
【０２８８】
ＮＺＹ ブロス（１リットル当たり）　５ｇのＮａＣｌ、２ｇのＭｇＳＯ_４、５ｇの酵母エキス、１０ｇのＮＺアミン（カゼイン加水分解物）；脱イオン水を加えて１リットルにし、ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整し、オートクレーブする。
ＮＺＹ 上層寒天（１リットル当たり）　５ｇのＮａＣｌ、２ｇのＭｇＳＯ_４、５ｇの酵母エキス、１０ｇのＮＺアミン（カゼイン加水分解物）、０．７％（ｗ／ｖ）アガロース；脱イオン水を加えて１リットルにし、ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整し、オートクレーブする。
以下の非限定例により本発明を説明する。
【０２８９】
実施例１．バチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）種（ Ｉ６３３ ）由来のマンナナーゼ
ラムダザペクスプレス（ ｌａｍｄａＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ ）ベクター中のバチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）Ｉ６３３由来のゲノムライブラリーの作製
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｉ６３３のゲノムＤＮＡを、制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分的に消化し、０．７％アガロースゲル（シーケム（ＳｅａＫｅｍ）アガロース、ＦＭＣ、米国）で電気泳動によりサイズ分画した。１．５〜１０ｋｂの大きさの断片を単離し、ＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲルに逆に流して１つのＤＮＡバンドに濃縮し、次にキアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キットを製造業者（キアゲン社（Ｑｕｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）、米国）の説明書に従って使用して、アガロースゲルスライスから断片を抽出した。
【０２９０】
ゲノムライブラリーを作製するために、上記から精製し分画した約１００ｎｇのＤＮＡを、１μｇのＢａｍＨＩ切断し脱リン酸化したラムダザペクスプレス（ｌａｍｄａＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ）ベクターアーム（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラホヤ、カリホルニア州、米国）に、製造業者の説明書に従って、＋４℃で２４時間連結した。製造業者（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、米国）の説明書に従って、ギガパックＩＩＩゴールドパッケージングエキストラクト（ＧｉｇａＰａｃｋＩＩＩ Ｇｏｌｄ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して、連結混合物の３μｌのアリコートを直接パッケージングした。ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（米国）の大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ−株を使用して、ゲノムラムダザペクスプレス（ｌａｍｄａＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ）ファージライブラリーを力価測定した。増幅しなかったゲノムライブラリーは、１％未満のベクターバックグランドを有する３×１０^７ プラーク形成単位（ｐｆｕ）からなる。
【０２９１】
ラムダザペクスプレス（ ｌａｍｄａＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ ）中の機能性発現によるベータ−マンナナーゼクローンのスクリーニング
ゲノムライブラリーからの約５０００プラーク形成単位（ｐｆｕ）を、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、米国）を宿主として使用して、次にプレートを３７℃で２４時間インキュベートして、０．１％ＡＺＣＬ−ガラクトマンナン（メガザイム（ＭｅｇａＺｙｍｅ）、オーストラリア、カタログ番号Ｉ−ＡＺＧＭＡ）を含有するＮＺＹ−寒天プレート上に広げた。マンナナーゼ陽性ラムダクローンを、陽性ファージクローンの周りに青い加水分解輪を形成させて同定した。
【０２９２】
これらを、目的のプラークを含有するＴＯＰ寒天スライスの芯を抜いて、５００μｌのＳＭ緩衝液と２０μｌのクロロホルム中に入れることにより、スクリーニングプレートから回収した。上記の０．１％ＡＺＣＬ−ガラクトマンナンを含有するＮＺＹプレートに、芯を抜いたファージストックのアリコートを広げることにより、マンナナーゼ陽性ラムダザペクスプレス（ｌａｍｄａＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ）クローンをプラーク精製した。単一のマンナナーゼ陽性ラムダクローンを、芯を抜いて、５００μｌのＳＭ緩衝液と２０μｌのクロロホルム中に入れ、上記したようにもう一回広げて、精製した。
【０２９３】
マンナナーゼ陽性ラムダザペクスプレス（ ｌａｍｄａＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ ）クローンからのファージミドの単一クローンインビボ切断
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラホヤ、カリホルニア州）を調製し、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が推奨するように１０ｍＭ　ＭｇＳＯ_４中に再懸濁した。マンナナーゼ陽性クローンからの純粋なファージストックの２５０μｌのアリコートを、ファルコン２０５９試験管中で、２００μｌのＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’細胞（ＯＤ６００＝１．０）と＞１０^６ ｐｆｕ／ｍｌのエクサシスト（ＥｘＡｓｓｉｓｔ）Ｍ１３ヘルパーファージ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））と一緒にし、混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。３ｍｌのＭＮＹブロスを各試験管に加え、試験管を３７℃で２．５時間インキュベートした。
【０２９４】
試験管を２０分間６５℃で加熱して、大腸菌細胞とバクテリオファージラムダを死滅させた。ファージミドは加熱に対して耐性である。試験管を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、細胞破片を除去し、上清をきれいなファルコン２０５９試験管中にデカントした。切断した１本鎖ファージミドを含有する上清のアリコートを使用して、２００μｌの大腸菌ＸＬＯＬＲ細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、１０ｍＭのＭｇＳＯ_４中でＯＥ６００＝１．０）を、３７℃で１５分間インキュベートすることにより感染させた。細胞に３５０μｌのＮＺＹブロスを加え、試験管を３７℃で４５分間インキュベートした。
【０２９５】
細胞のアリコートを、ＬＢカナマイシン寒天プレートに広げ、３７℃で２４時間インキュベートした。５つの切断した単一のコロニーを、０．１％ＡＺＣＬ−ガラクトマンナン（メガザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）、オーストラリア）を含有するＬＢカナマイシン寒天プレートに再度画線培養した。マンナナーゼ陽性ファージミドクローンを、陽性コロニーの周りの青い加水分解輪の形成により解析した、これらは、単離したファージミドＤＮＡ（キアスピン（ＱｉａＳｐｉｎ）キット、キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、米国）のＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩによる制限酵素分解物、次にアガロースゲル電気泳動によりさらに解析した。
【０２９６】
ヌクレオチド配列の解析
ゲノムベータ−１，４−マンナナーゼクローンｐＢＸＭ３のヌクレオチド配列を、両方の鎖からジデオキシ鎖停止法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ， Ｆ）．， ニックレン（Ｎｉｃｋｌｅｎ， Ｓ．）、およびクールソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ， Ａ． Ｒ．） （１９７７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４， ５４６３−５４６７）により、５００μｇのキアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）精製した鋳型（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、米国）、Ｔａｑデオキシ末端サイクル配列決定キット（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、米国）、蛍光標識ターミネーター、および５ｐｍｏｌのｐＢＫ−ＣＭＶポリリンカープライマー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、米国）または合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、決定した。配列データの解析は、デベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら、１９８４（デベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．）、ヘベルリ（Ｈａｅｂｅｒｌｉ， Ｐ．）、およびスミシーズ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ， Ｏ．）、 （１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３８７−３９５）に従って行った。
【０２９７】
配列の整列（ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ）
本発明のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種Ｉ６３３（すなわち、配列番号２）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）／ＥＭＢＬ 受け入れ番号Ｏ６６１８５）、ビブリオ種（受け入れ番号Ｏ６９３４７）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）（受け入れ番号Ｐ５１５２９）、およびカルジセルロシルプトー・サッカロリチカス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ（受け入れ番号Ｐ２２５３３）のグリコヒドロラーゼファミリー５ベータ−１，４−マンナナーゼの複数の配列の整列。複数の配列整列は、ＧＣＧウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）ソフトウェアパッケージ、バージョン８．１のＰｉｌｅＵｐプログラムを使用して、ギャップ作成ペナルティ３．００とギャップ伸長ペナルティ０．１０を用いて、作成した。
【０２９８】
配列の類似性
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種Ｉ６３３からクローン化した本発明のファミリー５ベータ−１，４−マンナナーゼの推定アミノ酸配列は、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）／ＥＭＢＬ 受け入れ番号Ｏ６６１８５）のベータ−１，４−マンナナーゼと７５％の類似性と６０．１％の同一性を示し、ビブリオ種（受け入れ番号Ｏ６９３４７）のベータ−１，４−マンナナーゼと６４．４％の類似性と４４．６％の同一性を示し、
【０２９９】
ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）（受け入れ番号Ｐ５１５２９）のベータ−１，４−マンナナーゼと６３％の類似性と４３．２％の同一性を示し、カルジセルロシルプトー・サッカロリチカス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ（受け入れ番号Ｐ２２５３）のベータ−１，４−マンナナーゼと５２．５％の類似性と３４．４％の同一性を示す。配列は、ＧＣＧウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）ソフトウェアパッケージ、バージョン８．１のＧＡＰプログラムを使用して、ギャップ作成ペナルティ３．００とギャップ伸長ペナルティ０．１０を用いて、整列させた。
【０３００】
バチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）種（ Ｉ６３３ ）マンナナーゼ遺伝子のクローニング
枯草菌（ Ｂ ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）中の触媒コアマンナナーゼ酵素のサブクローニングと発現
本発明のＤＮＡ配列をコードするマンナナーゼを、以下の２つのオリゴヌクレオチドからなるＰＣＲプライマーセットを使用して増幅した：
ＢＸＭ２．ｕｐｐｅｒ．ＳａｃＩＩ
５’−ＧＴＴ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＴＴＴ ＴＴＴ ＣＴＡ ＴＴＣ ＴＡＣ ＡＡＴ ＣＡＣ ＡＴＴ ＡＴＣ−３’
ＢＸＭ２．ｃｏｒｅ．ｌｏｗｅｒ．ＮｏｔＩ
５’−ＧＡＣ ＧＡＣ ＧＴＡ ＣＡＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＣ ＴＡＣ ＧＧＡ ＧＡＡ ＧＴＴ ＣＣＴ ＣＣＡ ＴＣＡ Ｇ−３’
制限部位ＳａｃＩＩとＮｏｔＩに下線を引いてある。
【０３０１】
上記のようにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種Ｉ６３３から単離した染色体ＤＮＡを、製造業者の説明書に従ってアンプリタク（Ａｍｐｌｉｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））を使用して、ＰＣＲ反応中の鋳型として使用した。ＰＣＲ反応は、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２．５単位のアンプリタク（Ａｍｐｌｉｔａｑ）ポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、シータス（Ｃｅｔｕｓ）、米国）および１００ｐｍｏｌの各プライマーを含有するＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）中で作成した。
【０３０２】
ＰＣＲ反応は、ＤＮＡサーマルサイクラー（ランドグラフ（ｌａｎｄｇｒａｆ）、ドイツ）を使用して行った。９４℃で１分間のインキュベートを１回行った後、９４℃で３０秒の変性、６０℃で１分のアニーリング、７２℃で２分の伸長のサイクルプロフィールを使用して、ＰＣＲを３０サイクル行った。増幅産物の５μｌのアリコートを、０．７％アガロースゲル（ヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）、ＦＭＣ）で電気泳動して解析した。１．０ｋｂの大きさのＤＮＡ断片の出現は、遺伝子セグメントが正しく増幅されたことを意味した。
【０３０３】
ＰＣＲ 断片のサブクローニング：
上記のように作成したＰＣＲ産物の４５μｌのアリコートを、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。精製したＤＮＡを、５０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）中で溶出した。５μｇのｐＭＯＬ９４４と２５μｌの精製ＰＣＲ断片を、ＳａｃＩＩとＮｏｔＩで消化し、０．８％低温ゲル化アガロース（シープラーク（ＳｅｑＰｌａｑｕｅ）ＧＴＧ、ＦＭＣ）ゲル中で電気泳動し、関係のある断片をゲルから切り出し、キアクイックゲル（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ）抽出キット（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。
【０３０４】
次に、単離したＰＣＲ ＤＮＡ断片を、ＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩ消化し精製したｐＭＯＬ９４４に連結した。連結は、０．５μｇの各ＤＮＡ断片、１ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼおよびＴ４リガーゼ緩衝液（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）を使用して、１６℃で一晩行った。
連結混合物を使用して、コンピタントな枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰＬ２３０６を形質転換した。形質転換した細胞を、ＬＢＰＧ−１０μｇ／ｍｌカナマイシン−寒天プレート上に広げた。３７℃で１８時間インキュベート後、プレート上にコロニーが見られた。一晩培養ブロスからプラスミドＤＮＡを単離して、いくつかのクローンを解析した。
【０３０５】
そのような陽性クローンの１つは、上記で使用したように寒天プレート上で数回画線培養し、このクローンをＭＢ７４８と呼んだ。クローンＭＢ７４８をＴＹ−１０μｇ／ｍｌカナマイシン中で３７℃で一晩増殖させ、翌日１ｍｌの細胞を使用して、枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プラスミド調製物についての製造業者の説明書に従って、キアプレップスピンプラスミドミニプレップ（Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キット＃２７１０６を使用して、細胞からプラスミドを単離した。このＤＮＡを配列決定し、配列番号１中の塩基対１２０１〜１２０３位に対応するアミノ酸残基Ｎｏ３３１を置換する停止コドンが導入されたマンナナーゼの成熟部分に対応するＤＮＡ配列が明らかになった（配列番号１の追加ＤＮＡ配列中の９１〜９９０位と、配列番号２中の追加タンパク質配列中の３１〜３３０位に対応する）。
【０３０６】
Ｂ．枯草菌（ Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）中の成熟完全長マンナナーゼのサブクローニングと
発現
本発明のＤＮＡ配列をコードするマンナナーゼを、以下の２つのオリゴヌクレオチドからなるＰＣＲプライマーセットを使用してＰＣＲ増幅した：
ＢＸＭ２．ｕｐｐｅｒ．ＳａｃＩＩ
５’−ＣＡＴ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＧＣＧ ＧＣＡ ＡＡＴ ＴＣＣ ＧＧＡ ＴＴＴ ＴＡＴ ＧＴＡ ＡＧＣ ＧＧ−３’
ＢＸＭ２．ｌｏｗｅｒ．ＮｏｔＩ
５’−ＧＴＴ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＴＴＴ ＴＴＴ ＣＴＡ ＴＴＣ ＴＡＣ ＡＡＴ ＣＡＣ ＡＴＴ ＡＴＣ−３’
制限部位ＳａｃＩＩとＮｏｔＩに下線を引いてある。
【０３０７】
上記のようにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種Ｉ６３３から単離した染色体ＤＮＡを、製造業者の説明書に従ってアンプリタク（Ａｍｐｌｉｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））を使用して、ＰＣＲ反応中の鋳型として使用した。ＰＣＲ反応は、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２．５単位のアンプリタク（Ａｍｐｌｉｔａｑ）ポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、シータス（Ｃｅｔｕｓ）、米国）および１００ｐｍｏｌの各プライマーを含有するＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）中で作成した。
【０３０８】
ＰＣＲ反応は、ＤＮＡサーマルサイクラー（ランドグラフ（ｌａｎｄｇｒａｆ）、ドイツ）を使用して行った。９４℃で１分間のインキュベートを１回行った後、９４℃で３０秒の変性、６０℃で１分のアニーリング、７２℃で２分の伸長のサイクルプロフィールを使用して、ＰＣＲを３０サイクル行った。増幅産物の５μｌのアリコートを、０．７％アガロースゲル（ヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）、ＦＭＣ）で電気泳動して解析した。１．０ｋｂの大きさのＤＮＡ断片の出現は、遺伝子セグメントが正しく増幅されたことを意味した。
【０３０９】
ＰＣＲ 断片のサブクローニング：
上記のように作成したＰＣＲ産物の４５μｌアリコートを、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。精製したＤＮＡを、５０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）中で溶出した。５μｇのｐＭＯＬ９４４と２５μｌの精製ＰＣＲ断片を、ＳａｃＩＩとＮｏｔＩで消化し、０．８％低温ゲル化アガロース（シープラーク（ＳｅｑＰｌａｑｕｅ）ＧＴＧ、ＦＭＣ）ゲル中で電気泳動し、関係のある断片をゲルから切り出し、キアクイックゲル（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ）抽出キット（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。次に、単離したＰＣＲ ＤＮＡ断片を、ＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩ消化し精製したｐＭＯＬ９４４に連結した。連結は、０．５μｇの各ＤＮＡ断片、１ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼおよびＴ４リガーゼ緩衝液（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）を使用して、１６℃で一晩行った。
【０３１０】
連結混合物を使用して、コンピタントな枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰＬ２３０６を形質転換した。形質転換した細胞を、ＬＢＰＧ−１０μｇ／ｍｌカナマイシン−寒天プレート上に広げた。３７℃で１８時間インキュベート後、プレート上にコロニーが見られた。一晩培養ブロスからプラスミドＤＮＡを単離して、いくつかのクローンを解析した。
【０３１１】
そのような陽性クローンの１つは、上記で使用したように寒天プレート上で数回画線培養し、このクローンをＭＢ６４３と呼んだ。クローンＭＢ６４３をＴＹ−１０μｇ／ｍｌカナマイシン中で３７℃で一晩増殖させ、翌日１ｍｌの細胞を使用して、枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プラスミド調製物についての製造業者の説明書に従って、キアプレップスピンプラスミドミニプレップ（Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キット＃２７１０６を使用して、細胞からプラスミドを単離した。このＤＮＡを配列決定し、配列番号１中のマンナナーゼ３１７〜１６９３と配列番号２中の３３〜４９０の成熟部分に対応するＤＮＡ配列が明らかになった。
クローンＭＢ６４３を、２枚の邪魔板の付いた５００ｍｌの振盪フラスコ中で１０μｇ／ｍｌのカナマイシンとともに２５×２００ｍｌのＢＰＸ培地中で、３７℃、３００ｒｐｍで５日間増殖させた。
【０３１２】
アミノ酸残基第３４１番からアミノ酸残基第４９０番までの未知の機能を有するＣ末端ドメインをコードするＤＮＡ配列は、既知のマンナナーゼからのＸ１８と呼ぶドメインと高い相同性を有する。このＸ１８は、ヨシダ（Ｙｏｓｈｉｄａ Ｓ．）， サコ（Ｓａｋｏ Ｙ．）， ウチダ（Ｕｃｈｉｄａ Ａ．）：Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：５１４−４２０ （１９９８）中の「グアールガムを分解するバチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｋ−１の酵素をコードする遺伝子の大腸菌中のクローニング、配列解析、および発現」から、ＥＭＢＬエントリーＡＢ００７１２３中に見いだされる。この遺伝子は、シグナルペプチド（ａａ１〜３４）、ファミリー５マンナナーゼの触媒性コア（ａａ３５〜３３５）、リンカー（ａａ３３６〜３６２）および最後に未知の機能を有するＸ１８ドメイン（ａａ３６３〜５１６）をコードする。
【０３１３】
このＸ１８ドメインはまた、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ベータ−マンナナーゼスイスプロテインデータベースエントリーＰ５５２７８中に見いだされ、これは、シグナルペプチド（ａａ１〜２６）、ファミリー２６マンナナーゼの触媒性コア（ａａ２７〜３６０）、およびこの未知の機能のＸ１８タンパク質ドメイン（ａａ３６１〜５１３）を開示する（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＭ−３９からのベータ−マンナナーゼ遺伝子のクローニングと配列決定、メンドーザ（Ｍｅｎｄｏｚａ ＮＳ）； アライ（Ａｒａｉ Ｍ）；スギモト（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｋ）；ウエダ（Ｕｅｄａ Ｍ）；カワグチ（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｔ）；ジョソン（Ｊｏｓｏｎ ＬＭ）， フィリピン、ＩＮ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ Ｖｏｌ． １２４３， Ｎｏ． ３ ｐｐ． ５５２−５５４ （１９９５））。
【０３１４】
実施例２．バチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）種 Ｉ６３３ からのマンナナーゼの発現、精製および性状解析
実施例１で材料と方法に記載されたように得られたクローンＭＢ７４８を、２枚の邪魔板の付いた５００ｍｌの振盪フラスコ中で１０μｇ／ｍｌのカナマイシンとともに２５×２００ｍｌのＢＰＸ培地中で、３７℃、３００ｒｐｍで５日間増殖させた。
クローンＭＢ７４８の振盪フラスコ培養液４５００ｍｌを採取し、ｐＨを５．６に調整した。陽イオン性物質（１０％ Ｃ５２１）１００ｍｌと陰イオン性物質（Ａ１３０）１８０ｍｌを、凝集のために攪拌中に加えた。ソ−バル（Ｓｏｒｖａｌ）ＲＣ ３Ｂ遠心分離機を使用して６℃、９０００ｒｐｍで２０分遠心分離して、凝集した物質を分離した。上清を、ワットマンガラスフィルターＧＦ／ＤとＣを使用して清澄化し、最後にフィルトロンでカットオフ１０ｋＤａで濃縮した。
【０３１５】
この濃縮液７００ｍｌを、水酸化ナトリウムを使用してｐＨ７．５に調整した。清澄な溶液を、５０ｍｌのトリス（ｐＨ７．５）で平衡化した１０００ｍｌのＱ−セファロースカラムを使用して陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。結合したマンナナーゼ活性を、塩化ナトリウム勾配を使用して、１１００ｍｌ中に溶出した。これを、フィルトロン膜を使用して４４０ｍｌに濃縮した。高純度のマンナナーゼを得るために、この濃縮物を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で平衡化したスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００カラムに通した。
純粋な酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量３４ｋＤａの単一のバンドを与えた。
【０３１６】
ローカストビーンガムを使用する定常状態速度論：
異なる量の基質ローカストビーンガムを使用して、０．１Ｍグリシン緩衝液中でｐＨ１０で４０℃で２０分インキュベートし、次に還元糖の生成を測定することにより測定を行った。定常状態中の還元糖のマイクロモルの生成の計算のために、グルコースを標準物質として使用した。
【０３１７】
以下のデータは、本発明の高度に精製したマンナナーゼについて得られた：
ＫＣａｔは４６７／秒で標準偏差が１３；
ｋＭは０．７で標準偏差は０．０７。
エリタクスソフトウェア・ユーケー（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｕ．Ｋ．）のレザーバロー（Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ）によるコンピュータープログラムグラフィット（ｇｒａｆｉｔ）を、計算のために使用した。還元糖は、ＰＨＢＡＨ法（レバー（Ｌｅｖｅｒ， Ｍ．）（１９７２）， 炭水化物の比色法定量ための新しい反応、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４７， ２７３−２７９）を使用して測定した。
【０３１８】
精製したタンパク質の以下のＮ末端配列を決定した：ＡＮＳＧＦＹＶＳＧＴＴＬＹＤＡＮＧ。
安定性：マンナナーゼは、室温で２日間インキュベート後、ｐＨ６．０〜１１で充分安定であった。
ｐＨ 活性プロフィールは、酵素がｐＨ７．５〜ｐＨ１０の間で６０％以上の活性を有することを示す。
最適温度は、ｐＨ１０で５０であった。
ＤＳＣ 示差走査熱量測定は、酢酸ナトリウム緩衝液中でｐＨ６．０で融点として６６℃を与え、このマンナナーゼ酵素は熱安定性であることを示していた。
免疫学的性質：デンマークの会社ＤＡＫＯの通常の技術を使用して、高度に精製したクローン化マンナナーゼに対して、ウサギポリクローナル単一特異性血清を作成した。血清は、本発明の粗の精製していないマンナナーゼとともにアガロースゲル中で好ましい単一の沈殿物を生成した。
【０３１９】
実施例３．界面活性剤中の実施例２の酵素の使用
緩衝液の代わりに市販の界面活性剤を使用して、前記したようにｃａｒｏｂ度から０．２％ＡＺＣＬ−ガラクトマンナン（メガザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）、オーストラリア）で４０℃で２０分インキュベートし、次に青色を測定することにより、実施例２に記載したように得られた酵素は、グリシン緩衝液中で、ヨーロッパ粉末界面活性剤Ａｒｉｅｌ Ｆｕｔｕｒｅ中で６０％の相対活性を有し、ヨーロッパ液体界面活性剤Ａｒｉｅｌ Ｆｕｔｕｒｅ中で８０％の相対活性を有し、ＵＳ Ｔｉｄｅ粉末中で４５％の相対活性を有し、ＵＳ Ｔｉｄｅ液体界面活性剤中で３７％の相対活性を有していた。これらの試験において界面活性剤濃度は、市販の界面活性剤のパッケージで推奨されたものであり、洗浄水は、ヨーロッパ（Ａｒｉｅｌ Ｆｕｔｕｒｅ）条件で１８度の硬度を有し、ＵＳ条件（ＵＳ Ｔｉｄｅ）で９度の硬度を有した。
【０３２０】
実施例４．バチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）種 Ｉ６３３ （実施例１と２）とセルロース結合ドメイン（ ＣＢＤ ）との融合タンパク質の作製と発現
クロストリジウム・サーモセルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＹＳ株（プール（Ｐｏｏｌｅ Ｄ Ｍ）；モラグ（Ｍｏｒａｇ Ｅ）；ラメド（Ｌａｍｅｄ Ｒ）；バイアー（Ｂａｙｅｒ ＥＡ）；ヘーズルウッド（Ｈａｚｌｅｗｏｏｄ ＧＰ）；ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ ＨＪ）（１９９２）、 クロストリジウム・サーモセルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＹＳからのセルロソームサブユニットＳ１のセルロース結合ドメインの同定、Ｆｅｍｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｖｏｌ． ７８， Ｎｏ． ２−３ ｐｐ． １８１−１８６）からのＣｉｐＢ遺伝子のＤＮＡ配列をコードするＣＢＤは、すでにベクターｐＭＯＬ１５７８中に導入されていた。
【０３２１】
ＣＢＤをコードする染色体ＤＮＡは、プール（Ｐｏｏｌｅ Ｄ Ｍ）；モラグ（Ｍｏｒａｇ Ｅ）；ラメド（Ｌａｍｅｄ Ｒ）；バイアー（Ｂａｙｅｒ ＥＡ）；ヘーズルウッド（Ｈａｚｌｅｗｏｏｄ ＧＰ）；ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ ＨＪ）（１９９２）、 クロストリジウム・サーモセルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＹＳからのセルロソームサブユニットＳ１のセルロース結合ドメインの同定、Ｆｅｍｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｖｏｌ． ７８， Ｎｏ． ２−３ ｐｐ． １８１−１８６に記載されたように得られる。ＣＢＤをコードするＤＮＡ試料を、ＰＣＲの鋳型として使用し、ＣＢＤを、ｐＭＯＬ９４４ベクターに基づく適当なプラスミドｐＭＢ９９３中でクローン化した。
【０３２２】
ｐＭＢ９９３ベクターは、ＣｉｐＢ ＣＢＤを含有し、ペプチドリンカーがＣＢＤに先行する。このリンカーは、以下の配列ＡＳＰＥＰＴＰＥＰＴからなり、直後にＣｉｐＢ ＣＢＤが続く。ＡＳアミノ酸は、制限エンドヌクレアーゼ部位ＮｈｅＩを構成するＤＮＡ配列から得られ、これは以下で、本発明のマンナナーゼをクローン化するために使用される。マンナナーゼ．Ｕｐｐｅｒ．ＳａｃＩＩ
５’−ＣＡＴ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＧＣＧ ＧＣＡ ＡＡＴ ＴＣＣ ＧＧＡ ＴＴＴ ＴＡＴ ＧＴＡ ＡＧＣ ＧＧ−３’
マンナナーゼ．Ｌｏｗｅｒ．ＮｈｅＩ
５’−ＣＡＴ ＣＡＴ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＧＴ ＡＡＡ ＡＡＣ ＧＧＴ ＧＣＴ ＴＡＡ ＴＣＴ ＣＧ−３’
制限部位ＮｈｅＩとＮｏｔＩに下線を引いてある。
【０３２３】
上記のようにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種Ｉ６３３から単離した染色体ＤＮＡを、製造業者の説明書に従ってアンプリタク（Ａｍｐｌｉｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））を使用して、ＰＣＲ反応中の鋳型として使用した。ＰＣＲ反応は、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２．５単位のアンプリタク（Ａｍｐｌｉｔａｑ）ポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、シータス（Ｃｅｔｕｓ）、米国）および１００ｐｍｏｌの各プライマーを含有するＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）中で作成した。
【０３２４】
ＰＣＲ反応は、ＤＮＡサーマルサイクラー（ランドグラフ（ｌａｎｄｇｒａｆ）、ドイツ）を使用して行った。９４℃で１分間のインキュベートを１回行った後、９４℃で３０秒の変性、６０℃で１分のアニーリング、７２℃で２分の伸長のサイクルプロフィールを使用して、ＰＣＲを３０サイクル行った。増幅産物の５μｌのアリコートを、０．７％アガロースゲル（ヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）、ＦＭＣ）で電気泳動して解析した。０．９ｋｂの大きさのＤＮＡ断片の出現は、遺伝子セグメントが正しく増幅されたことを意味した。
【０３２５】
ＰＣＲ 断片のサブクローニング：
上記のように作成したＰＣＲ産物の４５μｌのアリコートを、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。精製したＤＮＡを、５０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）中で溶出した。５μｇのｐＭＯＬ９９３と２５μｌの精製ＰＣＲ断片を、ＳａｃＩＩとＮｈｅＩで消化し、０．７％低温ゲル化アガロース（シープラーク（ＳｅｑＰｌａｑｕｅ）ＧＴＧ、ＦＭＣ）ゲル中で電気泳動し、関係のある断片をゲルから切り出し、キアクイックゲル（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ）抽出キット（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。
【０３２６】
次に、単離したＰＣＲ ＤＮＡ断片を、ＳａｃＩＩ−ＮｈｅＩ消化し精製したｐＭＢ９９３に連結した。連結は、０．５μｇの各ＤＮＡ断片、１ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼおよびＴ４リガーゼ緩衝液（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）を使用して、１６℃で一晩行った。
連結混合物を使用して、コンピタントな枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰＬ２３０６を形質転換した。形質転換した細胞を、ＬＢＰＧ−１０μｇ／ｍｌカナマイシン−寒天プレート上に広げた。３７℃で１８時間インキュベート後、プレート上にコロニーが見られた。一晩培養ブロスからプラスミドＤＮＡを単離して、いくつかのクローンを解析した。
【０３２７】
そのような陽性クローンの１つは、上記で使用したように寒天プレート上で数回画線培養し、このクローンをＭＢ１０１４と呼んだ。クローンＭＢ１０１４をＴＹ−１０μｇ／ｍｌカナマイシン中で３７℃で一晩増殖させ、翌日１ｍｌの細胞を使用して、枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プラスミド調製物についての製造業者の説明書に従って、キアプレップスピンプラスミドミニプレップ（Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キット＃２７１０６を使用して、細胞からプラスミドを単離した。このＤＮＡを配列決定し、配列番号３に示すマンナナーゼ−リンカー−ｃｂｄと配列番号４に示す追加タンパク質配列の成熟部分に対応するＤＮＡ配列が明らかになった。
すなわち最終濃度は、以下の発現関連成分を含有する：（ａｍｙＬ−プロモーター）−（ａｍｙＬ−シグナルペプチド）−マンナナーゼ−リンカー−ＣＢＤを含有する。
【０３２８】
マンナナーゼ− ＣＢＤ 融合タンパク質の発現と検出
ＭＢ１０１４をＴＹ−培地中で３７℃、２５０ｒｐｍで２０時間インキュベートした。１ｍｌの無細胞上清を、ミリポアＨ_２０中の２００μｌの１０％Ａｖｉｃｅｌ（メルク、ダームスタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、ドイツ）と混合した。この混合物を０℃で０．５時間インキュベートした。ＡｖｉｃｅｌへのこのＢＸＭ２−リンカー−ＣＢＤ融合タンパク質の結合後、結合タンパク質を５０００ｇで５分遠心分離した。ペレットを１００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中に再懸濁し、９５℃で５分間沸騰させ、５０００ｇで５分遠心分離し、２５μｌを４〜２０％リームリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）トリス−グリシン、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＮＯＶＥＸゲル（Ｎｏｖｅｘ、米国）にのせた。
【０３２９】
試料をエクセル（Ｘｃｅｌｌ）（登録商標）ミニセル（Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ）（ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）、米国）中で、製造業者が推奨するように電気泳動し、ゲルの以後のすべての操作（クマシーによる染色、脱染色と乾燥）は、製造業者が記載するように行った。
約５３ｋＤａのタンパク質バンドの出現は、プラスミドｐＭＢ１０１４上にコードされた完全長マンナナーゼ−リンカー−ＣＧＤ融合体の枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）での発現を証明していた。
【０３３０】
実施例５．バチルス・アガラダエレンス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ ）由来のマンナナーゼ
バチルス・アガラダエレンス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ ）からのマンナナーゼ遺伝子のクローニング
ゲノムＤＮＡ調製
バチルス・アガラダエレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）ＮＣＩＭＢ４０４８２を、ＷＯ９４／０１５３２に記載されているように、液体培地中で繁殖させた。３０℃、３００ｒｐｍで１６時間インキュベート後、細胞を採取し、ピッチャー（Ｐｉｔｃｈｅｒ）らの方法によりゲノムＤＮＡを単離した（ピッチャー（Ｐｉｔｃｈｅｒ， Ｄ． Ｇ．）， サンダース（Ｓａｕｎｄｅｒｓ， Ｎ．Ａ．）， オーウェン（Ｏｗｅｎ， Ｒ． Ｊ）（１９８９），　チオシアン酸グアニジウムを用いる細菌性ゲノムＤＮＡの迅速抽出、Ｌｅｔｔ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，， ８， １５１−１５６）。
【０３３１】
ゲノムライブラリー作製
ゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分的に消化し、０．７％アガロースゲル上で電気泳動によりサイズ分画した。２〜７ｋｂの大きさの断片を、電気泳動によりＤＥＡＥ−セルロースペーパー（ドレッツェン（Ｄｒｅｔｚｅｎ， Ｇ．）， ベラード（Ｂｅｌｌａｒｄ， Ｍ．）， サッソン−コルシ（Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ， Ｐ．），チャンボン（Ｃｈａｍｂｏｎ， Ｐ．）（１９８１）、 アガロースとアクリルアミドゲルからのＤＮＡ断片の回収ための信頼できる方法， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １１２， ２９５−２９８）上に単離した。
単離したＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ消化したｐＳＪ１６７８プラスミドＤＮＡに連結し、連結混合物を使用して、大腸菌ＳＪ２を形質転換した。
【０３３２】
陽性クローンの同定
上記のように作製した大腸菌中のＤＮＡライブラリーを、０．２％ＡＺＣＬ−ガラクトマンナン（メガザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅ））と９μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート上でスクリーニングし、３７℃で一晩インキュベートした。マンナナーゼ活性を示すクローンは、青い拡散輪とともに現れた。これらのクローンの１つからのプラスミドＤＮＡを、１ｍｌの一晩培養ブロス上でキアゲンプラスミドスピンプレップにより単離した（細胞は、３７℃で９μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとともにＴＹ中で２５０ｒｐｍでインキュベートした）。
【０３３３】
このクローン（ＭＢ５２５）を、クローン化Ｓａｕ３ＡＤＮＡ断片のＤＮＡ配列決定によりさらに解析した。ＤＮＡ配列決定は、Ｔａｑデオキシ−末端サイクル配列決定キット（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、米国）を使用し、蛍光標識ターミネーターと適当なオリゴヌクレオチドをプライマーとして、プライマー歩行により行った。
配列データの解析は、デベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２， ３８７−３９５に従って行った。マンナナーゼをコードする配列を配列番号５に示す。得られたタンパク質配列を、配列番号６に示す。
【０３３４】
枯草菌（ Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）中のバチルス・アガラダエレンス（ Ｂ． ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ ）のサブクローニングと発現
本発明のＤＮＡ配列をコードするマンナナーゼは、これらの２つのオリゴヌクレオチドからなるＰＣＲプライマーセットを使用してＰＣＲ増幅した。
マンナナーゼ．ｕｐｐｅｒ．ＳａｃＩＩ
５’−ＣＡＴ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＧＣＧ ＧＣＡ ＧＣＡ ＡＧＴ ＡＣＡ ＧＧＣ ＴＴＴ ＴＡＴ ＧＴＴ ＧＡＴ ＧＧ−３’
マンナナーゼ．ｌｏｗｅｒ．ＮｏｔＩ
５’−ＧＡＣ ＧＡＣ ＧＴＡ ＣＡＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＧ ＣＴＡ ＴＴＴ ＣＣＣ ＴＡＡ ＣＡＴ ＧＡＴ ＧＡＴ ＡＴＴ ＴＴＣ Ｇ−３’　制限部位ＳａｃＩＩとＮｏｔＩＩに下線を引いてある。
【０３３５】
上記のようにバチルス・アガラダエレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）ＮＣＩＭＢ４０４８２から単離した染色体ＤＮＡを、製造業者の説明書に従ってアンプリタク（Ａｍｐｌｉｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））を使用して、ＰＣＲ反応中の鋳型として使用した。ＰＣＲ反応は、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２．５単位のアンプリタク（Ａｍｐｌｉｔａｑ）ポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、シータス（Ｃｅｔｕｓ）、米国）および１００ｐｍｏｌの各プライマーを含有するＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）中で作成した。
【０３３６】
ＰＣＲ反応は、ＤＮＡサーマルサイクラー（ランドグラフ（ｌａｎｄｇｒａｆ）、ドイツ）を使用して行った。９４℃で１分間のインキュベートを１回行った後、９４℃で３０秒の変性、６０℃で１分のアニーリング、７２℃で２分の伸長のサイクルプロフィールを使用して、ＰＣＲを３０サイクル行った。増幅産物の５μｌのアリコートを、０．７％アガロースゲル（ヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）、ＦＭＣ）で電気泳動して解析した。１．４ｋｂの大きさのＤＮＡ断片の出現は、遺伝子セグメントが正しく増幅されたことを意味した。
【０３３７】
ＰＣＲ 断片のサブクローニング：
上記のように作成したＰＣＲ産物の４５μｌアリコートを、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。精製したＤＮＡを、５０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）中で溶出した。
【０３３８】
５μｇのｐＭＯＬ９４４と２５μｌの精製ＰＣＲ断片を、ＳａｃＩＩとＮｏｔＩで消化し、０．８％低温ゲル化アガロース（シープラーク（ＳｅｑＰｌａｑｕｅ）ＧＴＧ、ＦＭＣ）ゲル中で電気泳動し、関係のある断片をゲルから切り出し、キアクイックゲル（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ）抽出キット（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。次に、単離したＰＣＲ ＤＮＡ断片を、ＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩ消化し精製したｐＭＯＬ９４４に連結した。連結は、０．５μｇの各ＤＮＡ断片、１ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼおよびＴ４リガーゼ緩衝液（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）を使用して、１６℃で一晩行った。
【０３３９】
連結混合物を使用して、コンピタントな枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰＬ２３０６を形質転換した。形質転換した細胞を、ＬＢＰＧ−１０μｇ／ｍｌカナマイシン−寒天プレート上に広げた。３７℃で１８時間インキュベート後、プレート上にコロニーが見られた。一晩培養ブロスからプラスミドＤＮＡを単離して、いくつかのクローンを解析した。
【０３４０】
そのような陽性クローンの１つは、上記で使用したように寒天プレート上で数回画線培養し、このクローンをＭＢ５９４と呼んだ。クローンＭＢ５９４をＴＹ−１０μｇ／ｍｌカナマイシン中で３７℃で一晩増殖させ、翌日１ｍｌの細胞を使用して、枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プラスミド調製物についての製造業者の説明書に従って、キアプレップスピンプラスミドミニプレップ（Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キット＃２７１０６を使用して、細胞からプラスミドを単離した。
【０３４１】
このＤＮＡを配列決定し、配列番号７中のマンナナーゼ９４〜１４０４と配列番号７中の９４〜１４０４の成熟部分に対応するＤＮＡ配列が明らかになった。得られた成熟タンパク質を配列番号８に示す。配列番号５の配列によりコードされるマンナナーゼの３’末端は、ＰＣＲで使用した低プライマーの設計に従って、配列番号７に示すものに変換された。得られたアミノ酸配列を配列番号８に示し、配列番号６のＣ末端（ＳＨＨＶＲＥＩＧＶＱＦＳＡＡＤＮＳＳＧＱＴＡＬＹＶＤＮＶＴＬＲ）を、配列番号８のＣ末端（ＩＩＭＬＧＫ）に変換されることが明らかである。
【０３４２】
実施例６．バチルス・アガラダエレンス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ ）からのマンナナーゼの発現、精製および性状解析
実施例５のように得られたクローンＭＢ５９４を、２枚の邪魔板の付いた５００ｍｌの振盪フラスコ中で１０μｇ／ｍｌのカナマイシンとともに２５×２００ｍｌのＢＰＸ培地中で、３７℃、３００ｒｐｍで５日間増殖させた。
【０３４３】
クローン５９４（バッチ＃９８１３）の６５００ｍｌの振盪フラスコ培養液を採取し、ｐＨを５．５に調整した。凝集のために攪拌しながら１４６ｍｌの陽イオン物質（Ｃ５２１）と２９２ｍｌの陰イオン性物質（Ａ１３０）を加えた。ソ−バル（Ｓｏｒｖａｌ）ＲＣ ３Ｂ遠心分離機を使用して６℃、９０００ｒｐｍで２０分遠心分離して、凝集した物質を分離した。上清を、ワットマンガラスフィルターＧＦ／ＤとＣを使用して清澄化し、最後にフィルトロンでカットオフ１０ｋＤａで濃縮した。
【０３４４】
この濃縮液７５０ｍｌを、水酸化ナトリウムを使用してｐＨ７．５に調整した。清澄な溶液を、５０ｍｌのトリス（ｐＨ７．５）で平衡化した９００ｍｌのＱ−セファロースカラムを使用して陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。結合したマンナナーゼ活性を、塩化ナトリウム勾配を使用して溶出した。
純粋な酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量３８ｋＤａの単一のバンドを与えた。
マンナナーゼ酵素のアミノ酸配列（すなわち、翻訳されたＤＮＡ配列）を配列番号６に示す。
【０３４５】
速度論定数の測定：
基質：ローカストビーンガム（ｃａｒｏｂ）と還元糖分析（ＰＨＢＡＨ）。ローカストビーンガムはシグマ（Ｓｉｇｍａ）から（Ｇ−０７５３）。
異なる濃度のローカストビーンガムを使用し４０℃、ｐＨ１０で２０分インキュベートして、速度論測定を行うと以下が得られた：
ＫＣａｔ：４６７／秒。
Ｋｍ：０．０８ｇ／Ｌ
ＭＷ：３８ｋＤａ
ｐＩ（等電点）：４．２
マンナナーゼの最適温度は６０℃であった。
【０３４６】
ｐＨ活性プロフィールは、ｐＨ８〜１０で最大活性を示した。
ＤＳＣ示差走査熱量測定は、トリス緩衝液中でｐＨ７．５で融点として７７℃を与え、この酵素が熱安定性であることを示している。
ｃａｒｏｂからの０．２％ＡＺＣＬ−ガラクトマンナンを基質として使用して、上記したように４０℃でインキュベートした洗剤適合性は、従来の液体洗剤と極めて良好な適合性を示し、従来の粉末洗剤と良好な適合性を示した。
【０３４７】
実施例７．洗剤中の本発明の酵素の使用
実施例６に記載したように得られた精製酵素（バッチ＃９８１３）は、従来の市販の液体洗剤を使用したミニ洗浄試験で１ｐｐｍのレベルで試験した時、改良したクリーニング性能を示した。試験は、従来の北アメリカ洗浄条件で行った。
【０３４８】
実施例８．バチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）種 ＡＡＩ１２ から得られるマンナナーゼ
バチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）種 ＡＡＩ１２ からのゲノムライブラリーの作製
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種のゲノムＤＮＡを、制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分的に消化し、０．７％アガロースゲル（シーケム（ＳｅａＫｅｍ）アガロース、ＦＭＣ、ＵＳＡ）で電気泳動によりサイズ分画した。１．５〜１０ｋｂの大きさの断片を単離し、ＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲルに逆に流して１つのＤＮＡバンドに濃縮し、次にキアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キットを製造業者（キアゲン社（Ｑｕｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）、米国）の説明書に従って、アガロースゲルスライスから断片を抽出した。
【０３４９】
ゲノムライブラリーを作製するために、上記から精製し分画した約１００ｎｇのＤＮＡを、１μｇのＢａｍＨＩ切断し脱リン酸化したラムダザペクスプレス（ｌａｍｄａＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ）ベクターアーム（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラホヤ、カリホルニア州、米国）に、製造業者の説明書に従って、＋４℃で２４時間連結した。製造業者（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、米国）の説明書に従って、ギガパックＩＩＩゴールドパッケージングエキストラクト（ＧｉｇａＰａｃｋＩＩＩ Ｇｏｌｄ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して、連結混合物の３μｌのアリコートを直接パッケージングした。
【０３５０】
ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（米国）の大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ−株を使用して、ゲノムラムダザペクスプレス（ｌａｍｄａＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ）ファージライブラリーを力価測定した。増幅しなかったゲノムライブラリーは、１％未満のベクターバックグランドを有する７．８×１０^７ プラーク形成単位（ｐｆｕ）からなる。
【０３５１】
ラムダザペクスプレス（ ｌａｍｄａＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ ）中の機能性発現によるベータ−マンナナーゼクローンのスクリーニング
ゲノムライブラリーからの約５０００プラーク形成単位（ｐｆｕ）を、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、米国）を宿主として使用して、次にプレートを３７℃で２４時間インキュベートして、０．１％ＡＺＣＬ−ガラクトマンナン（メガザイム（ＭｅｇａＺｙｍｅ）、オーストラリア、カタログ番号Ｉ−ＡＺＧＭＡ）を含有するＮＺＹ−寒天プレート上に広げた。マンナナーゼ陽性ラムダクローンを、陽性ファージクローンの周りに青い加水分解輪を形成させて同定した。
【０３５２】
これらを、目的のプラークを含有するＴＯＰ寒天スライスの芯を抜いて、５００μｌのＳＭ緩衝液と２０μｌのクロロホルム中に入れることにより、スクリーニングプレートから回収した。上記の０．１％ＡＺＣＬ−ガラクトマンナンを含有するＮＺＹプレートに、芯を抜いたファージストックのアリコートを広げることにより、マンナナーゼ陽性ラムダザペクスプレス（ｌａｍｄａＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ）クローンをプラーク精製した。単一のマンナナーゼ陽性ラムダクローンを、芯を抜いて、５００μｌのＳＭ緩衝液と２０μｌのクロロホルム中に入れ、上記したようにもう一回広げて、精製した。
【０３５３】
マンナナーゼ陽性ラムダザペクスプレス（ ｌａｍｄａＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ ）クローンからのファージミドの単一クローンインビボ切断
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラホヤ、カリホルニア州）を調製し、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が推奨するように１０ｍＭ　ＭｇＳＯ_４ 中に再懸濁した。マンナナーゼ陽性クローンからの純粋なファージストックの２５０μｌのアリコートを、ファルコン２０５９試験管中で、２００μｌのＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’細胞（ＯＤ６００＝１．０）と＞１０^６ ｐｆｕ／ｍｌのエクサシスト（ＥｘＡｓｓｉｓｔ）Ｍ１３ヘルパーファージ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））と一緒にし、混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。
【０３５４】
３ｍｌのＭＮＹブロスを各試験管に加え、試験管を３７℃で２．５時間インキュベートした。試験管を６５℃で２０分間加熱して、大腸菌細胞とバクテリオファージラムダを死滅させた。ファージミドは加熱に対して耐性である。試験管を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、細胞破片を除去し、上清をきれいなファルコン２０５９試験管中にデカントした。切断した１本鎖ファージミドを含有する上清のアリコートを使用して、２００μｌの大腸菌ＸＬＯＬＲ細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、１０ｍＭのＭｇＳＯ_４ 中でＯＥ６００＝１．０）を、３７℃で１５分間インキュベートすることにより感染させた。細胞に３５０μｌのＮＺＹブロスを加え、試験管を３７℃で４５分間インキュベートした。
【０３５５】
細胞のアリコートを、ＬＢカナマイシン寒天プレートに広げ、３７℃で２４時間インキュベートした。５つの切断した単一のコロニーを、０．１％ＡＺＣＬ−ガラクトマンナン（メガザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）、オーストラリア）を含有するＬＢカナマイシン寒天プレートに再度画線培養した。マンナナーゼ陽性ファージミドクローンを、陽性コロニーの周りの青い加水分解輪の形成により解析した、これらは、単離したファージミドＤＮＡ（キアスピン（ＱｉａＳｐｉｎ）キット、キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、米国）のＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩによる制限酵素分解物、次にアガロースゲル電気泳動によりさらに解析した。
【０３５６】
ヌクレオチド配列の解析
ゲノムベータ−１，４−マンナナーゼクローンｐＢＸＭ１のヌクレオチド配列を、両方の鎖からジデオキシ鎖停止法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ， Ｆ）．， ニックレン（Ｎｉｃｋｌｅｎ， Ｓ．）、およびクールソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ， Ａ． Ｒ．） （１９７７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４， ５４６３−５４６７）により、５００μｇのキアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）精製した鋳型（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、米国）、Ｔａｑデオキシ末端サイクル配列決定キット（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、米国）、蛍光標識ターミネーター、および５ｐｍｏｌのｐＢＫ−ＣＭＶポリリンカープライマー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、米国）または合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、決定した。配列データの解析は、デベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら、１９８４（デベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．）、ヘベルリ（Ｈａｅｂｅｒｌｉ， Ｐ．）、およびスミシーズ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ， Ｏ．）（１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３８７−３９５）に従って行った。
【０３５７】
配列の整列
本発明のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＡＡＩ１２（すなわち、配列番号１０）、カルジセルロシルプトー・サッカロリチカス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）／ＥＭＢＬ 受け入れ番号Ｐ７７８４７）、ディクチオグロムス・サーモフィルム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）（受け入れ番号Ｏ３０６５４）、ロードサーマス・マリヌス（受け入れ番号Ｐ４９４２５）、ＭａｎＡによりコードされるピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）種（受け入れ番号Ｐ５５２９６）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（受け入れ番号Ｐ９１００７）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（受け入れ番号Ｏ０５５１２）、およびシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（受け入れ番号Ｐ４９４２４）からのグリコヒドロラーゼファミリー２６の複数の配列の整列を、ＧＣＧウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）ソフトウェアパッケージ、バージョン８．１（前記参照）のＰｉｌｅＵｐプログラムを使用して、ギャップ作成ペナルティ３．００とギャップ伸長ペナルティ０．１０を用いて、作成した。
【０３５８】
配列の類似性
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＡＡＩ１２からクローン化した本発明のファミリー２６ベータ−１，４−マンナナーゼの推定アミノ酸配列は、カルジセルロシルプトー・サッカロリチカス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）／ＥＭＢＬ 受け入れ番号Ｐ７７８４７）のベータ−１，４−マンナナーゼと４５％の類似性と１９．８％の配列同一性を示し、ディクチオグロムス・サーモフィルム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）（受け入れ番号Ｏ３０６５４）のベータ−１，４−マンナナーゼと４９％の類似性と２５．１％の同一性を示し、
【０３５９】
ロードサーマス・マリヌス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）（受け入れ番号Ｐ４９４２５）のベータ−１，４−マンナナーゼと４８．２％の類似性と２６．８％の同一性を示し、ＭａｎＡによりコードされるピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）種（受け入れ番号Ｐ５５２９６）のベータ−１，４−マンナナーゼと４６％の類似性と１９．５％の配列同一性を示し、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（受け入れ番号Ｐ９１００７）のベータ−１，４−マンナナーゼと４７．２％の類似性と２２％の同一性を示し、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（受け入れ番号Ｏ０５５１２）のベータ−１，４−マンナナーゼと５２．４％の類似性と２７．５％の配列同一性を示し、
【０３６０】
およびシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（受け入れ番号Ｐ４９４２４）のベータ−１，４−マンナナーゼと６０．６％の類似性と３７．４％の同一性を示す。配列は、ＧＣＧウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）ソフトウェアパッケージ、バージョン８．１のＧＡＰプログラムを使用して、ギャップ作成ペナルティ３．００とギャップ伸長ペナルティ０．１０を用いて、整列させた。
【０３６１】
バチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）種（ ＡＡＩ１２ ）マンナナーゼ遺伝子のクローニング
枯草菌（ Ｂ ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）中のマンナナーゼのサブクローニングと発現
本発明のＤＮＡ配列をコードするマンナナーゼを、以下の２つのオリゴヌクレオチドからなるＰＣＲプライマーセットを使用して増幅した：
ＢＸＭ１．ｕｐｐｅｒ．ＳａｃＩＩ
５’−ＣＡＴ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＧＣＧ ＧＣＡ ＴＴＴ ＴＣＴ ＧＧＡ ＡＧＣ ＧＴＴ ＴＣＡ ＧＣ−３’
ＢＸＭ１．ｌｏｗｅｒ．ＮｏｔＩ
５’−ＣＡＧ ＣＡＧ ＴＡＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＣＡ ＣＴＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＧＴ ＡＣＡ ＴＡＴ ＧＣ−３’
制限部位ＳａｃＩＩとＮｏｔＩに下線を引いてある。
【０３６２】
上記のようにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＡＡＩ１２から単離した染色体ＤＮＡを、製造業者の説明書に従ってアンプリタク（Ａｍｐｌｉｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））を使用して、ＰＣＲ反応中の鋳型として使用した。ＰＣＲ反応は、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２．５単位のアンプリタク（Ａｍｐｌｉｔａｑ）ポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、シータス（Ｃｅｔｕｓ）、米国）および１００ｐｍｏｌの各プライマーを含有するＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ 、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）中で作成した。
【０３６３】
ＰＣＲ反応は、ＤＮＡサーマルサイクラー（ランドグラフ（ｌａｎｄｇｒａｆ）、ドイツ）を使用して行った。９４℃で１分間のインキュベートを１回行った後、９４℃で３０秒の変性、６０℃で１分のアニーリング、７２℃で２分の伸長のサイクルプロフィールを使用して、ＰＣＲを３０サイクル行った。増幅産物の５μｌのアリコートを、０．７％アガロースゲル（ヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）、ＦＭＣ）で電気泳動して解析した。１．０ｋｂの大きさのＤＮＡ断片の出現は、遺伝子セグメントが正しく増幅されたことを意味した。
【０３６４】
ＰＣＲ 断片のサブクローニング：
上記のように作成したＰＣＲ産物の４５μｌのアリコートを、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。精製したＤＮＡを、５０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）中で溶出した。５μｇのｐＭＯＬ９４４と２５μｌの精製ＰＣＲ断片を、ＳａｃＩＩとＮｏｔＩで消化し、０．８％低温ゲル化アガロース（シープラーク（ＳｅｑＰｌａｑｕｅ）ＧＴＧ、ＦＭＣ）ゲル中で電気泳動し、関係のある断片をゲルから切り出し、キアクイックゲル（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ）抽出キット（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、米国）を製造業者の説明書に従って使用して、精製した。
【０３６５】
次に、単離したＰＣＲ ＤＮＡ断片を、ＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩ消化し精製したｐＭＯＬ９４４に連結した。連結は、０．５μｇの各ＤＮＡ断片、１ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼおよびＴ４リガーゼ緩衝液（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）を使用して、１６℃で一晩行った。
連結混合物を使用して、コンピタントな枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰＬ２３０６を形質転換した。形質転換した細胞を、ＬＢＰＧ−１０μｇ／ｍｌカナマイシン−寒天プレート上に広げた。３７℃で１８時間インキュベート後、プレート上にコロニーが見られた。一晩培養ブロスからプラスミドＤＮＡを単離して、いくつかのクローンを解析した。
【０３６６】
そのような陽性クローンの１つは、上記で使用したように寒天プレート上で数回画線培養し、このクローンをＭＢ７４７と呼んだ。クローンＭＢ７４８をＴＹ−１０μｇ／ｍｌカナマイシン中で３７℃で一晩増殖させ、翌日１ｍｌの細胞を使用して、枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プラスミド調製物についての製造業者の説明書に従って、キアプレップスピンプラスミドミニプレップ（Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キット＃２７１０６を使用して、細胞からプラスミドを単離した。このＤＮＡを配列決定し、配列番号９中のマンナナーゼの成熟部分に対応するＤＮＡ配列が明らかになった。
【０３６７】
バチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）種 ＡＡＩ１２ からのマンナナーゼの発現、精製および性状解析
上記のように得られたクローンＭＢ７４７を、２枚の邪魔板の付いた５００ｍｌの振盪フラスコ中で１０μｇ／ｍｌのカナマイシンとともに２５×２００ｍｌのＢＰＸ培地中で、３７℃、３００ｒｐｍで５日間増殖させた。
クローンＭＢ７４７の４１００ｍｌの振盪フラスコ培養液を採取し、ｐＨを７．０に調整し、２ｍＭになるようにＥＤＴＡを加えた。凝集のために攪拌しながら１８５ｍｌの陽イオン物質（１０％ Ｃ５２１）と３７０ｍｌの陰イオン性物質（Ａ１３０）を加えた。ソ−バル（Ｓｏｒｖａｌ）ＲＣ ３Ｂ遠心分離機を使用して６℃、９０００ｒｐｍで２０分遠心分離して、凝集した物質を分離した。上清を、ワットマンガラスフィルターＧＦ／ＤとＣを使用して清澄化し、最後にフィルトロンでカットオフ１０ｋＤａで濃縮した。
【０３６８】
この濃縮液１５００ｍｌを、水酸化ナトリウムを使用してｐＨ７．５に調整した。清澄な溶液を、２５ｍｌのトリス（ｐＨ７．５）で平衡化した１０００ｍｌのＱ−セファロースカラムを使用して陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。結合したマンナナーゼ活性を、塩化ナトリウム勾配を使用して１１００ｍｌで溶出した。これを、フィルトロン膜を使用して４４０ｍｌに濃縮した。高純度のマンナナーゼを得るために、濃縮物を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で平衡化したスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）カラムに通した。
純粋な酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量６２ｋＤａの単一のバンドを与えた。
マンナナーゼ酵素のアミノ酸配列（すなわち、翻訳されたＤＮＡ配列）を配列番号１０に示す。
【０３６９】
以下のＮ末端配列を決定した：ＦＳＧＳＶＳＡＳＧＱＥＬＫＭＴＤＱＮ。
ｐＩ（等電点）：４．５
ＤＳＣ示差走査熱量計は、酢酸ナトリウム緩衝液中でｐＨ６．０で融点として６４℃を与え、このマンナナーゼ酵素は熱安定性であることを示していた。
触媒活性はイオン強度とともに上昇したため、高イオン強度のリン酸緩衝液の塩を使用することにより、酵素の比活性が上昇するかも知れないことを示している。
本発明のポリペプチドのマンナナーゼ活性は、カルシウムイオンにより阻害される。
【０３７０】
免疫学的性質：デンマークの会社ＤＡＫＯの通常の技術を使用して、本発明の高度に精製したマンナナーゼに対して、ウサギポリクローナル単一特異性血清を作成した。血清は、本発明の粗マンナナーゼとともにアガロースゲル中で好ましい単一の沈殿物を生成した。
【０３７１】
実施例９．洗剤における実施例８の酵素の使用
バッファーおよびの代わりに市販の洗浄剤を用い、上記のイナゴマメ等級由来の０．２％ＡＺＣＬ−ガラクトマンナン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）とともに４０℃にて２０分間インキュベートした後、青色の形成を調べたところ、実施例８に記載のようにして得られた酵素は、グリシンバッファーで測定された活性に対して、欧州の粉末洗剤Ａｒｉｅｌ Ｆｕｔｕｒでは比活性１３２％、米国のＴｉｄｅ粉末洗剤では比活性１０８％、米国のＴｉｄｅ液体洗剤では比活性８６％で活性を示した。これらの試験では洗剤濃度は市販の洗剤パッケージで推奨されている通りとし、洗浄水はドイツ硬度が欧州条件（Ａｒｉｅｌ Ｆｕｔｕｒ）下では１８度、米国条件（米国Ｔｉｄｅ）下では９度である水道水であった。
【０３７２】
実施例１０．バチルス・ハロデュランス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ） 由来マンナナーゼ
ｐＳＪ１６７８ ベクター内でのバチルス・ハロデュランス由来ゲノムライブラリーの構築
バチルス・ハロデュランスのゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分消化し、０．７％アガロースゲル（ＳｅａＫｅｍアガロース、ＦＭＣ、ＵＳＡ）における電気泳動によりサイズ分画した。２ないし１０ｋｂの間のサイズのＤＮＡ断片をＤＥＡＥ−セルロースペーパーにおける電気泳動により単離した（Ｄｒｅｔｚｅｎ， Ｇ．， Ｂｅｌｌａｒｄ， Ｍ．， Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ， Ｐ．， Ｃｈａｍｂｏｎ， Ｐ． （１９８１）　アガロースおよびアクリルアミドゲルからＤＮＡ断片を回収する信頼性のある方法　Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １１２， ２９５−２９８）。単離されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで消化したｐＳＪ１６７８プラスミドＤＮＡと連結し、この連結混合物を用いて大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＳＪ２を形質転換した。
【０３７３】
大腸菌における機能的発現によるβ−マンナナーゼクローンのスクリーニング
宿主として大腸菌ＳＪ２を用い、ゲノムライブラリーから約１０，０００コロニー形成単位（ｃｆｕ）を９μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび０．１％ＡＺＣＬ−ガラクトマンナン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ， カタログ番号Ｉ−ＡＺＧＭＡ）を含有するＬＢ寒天プレートに置き、次いでこのプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。
【０３７４】
マンナナーゼ陽性大腸菌コロニーは陽性プラスミドコロニー周囲の青い加水分解ハローの形成によって確認した。ｐＳＪ１６７８のマンナナーゼ陽性コロニーを、単離コロニーを上記の９μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび０．１％ＡＺＣＬ−ガラクトマンナンＬＢプレート上で再び画線培養することによりコロニー純化した。単一のマンナナーゼ陽性プラスミドコロニーを、プラスミドＤＮＡの精製のため、９μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する５ｍｌのＬＢ培地に接種した。
【０３７５】
ヌクレオチド配列解析
ゲノムβ−１，４−マンナナーゼクローンｐＢＸＭ５のヌクレオチド配列は、Ｑｉａｇｅｎにより精製された鋳型（Ｑｉａｇｅｎ， ＵＳＡ）５００ｎｇおよびＴａｑデオキシ末端サイクルシーケンシングキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， ＵＳＡ）、蛍光標識ターミネーター、およびｐＢＫ−ＣＭＶポリリンカープライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＵＳＡ）または合成オリゴヌクレオチドプライマーのいずれか５ｐｍｏｌを用い、ジデオキシチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ， Ｆ．， Ｎｉｃｋｌｅｎ， Ｓ．， ａｎｄ Ｃｏｕｌｓｏｎ， Ａ． Ｒ． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ７４， ５４６３−５４６７）により両鎖から決定した。配列データの解析はＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９８４ （Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， Ｈａｅｂｅｒｌｉ， Ｐ．， ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ， Ｏ． （１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２， ３８７−３９５）に従って行った。
【０３７６】
配列のアライメント
本発明のバチルス・ハロデュランス（すなわち、配列番号１２）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ受託番号０６６１８５）、ビブリオ種（受託番号０６９３４７）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）（受託番号Ｐ５１５２９）およびカルジセルロシルプトル・サッカロリチカス（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）（受託番号Ｐ２２５３３）由来のグリコヒドロラーゼファミリー５　β−１，４−マンナナーゼの多重配列アライメント。多重配列アライメントはＧＣＧウィスコンシンソフトウェアパッケージ、バージョン８．１のＰｉｌｅＵｐプログラムを用い、ギャップ形成ペナルティー３．００およびギャップ伸長ペナルティー０．１０で作製した。
【０３７７】
配列の類似性
バチルス・ハロデュランスからクローニングされた本発明のファミリー５　β−１，４−マンナナーゼの推定アミノ酸配列は、バチルス・シルクランス（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ受託番号０６６１８５）のβ−１，４−マンナナーゼと７７％の類似性および６０％の配列同一性を、ビブリオ種（受託番号０６９３４７）由来のβ−１，４−マンナナーゼと６４．２％の類似性および４６％の配列同一性を、ストレプトミセス・リビダンス（受託番号Ｐ５１５２９）由来のβ−１，４−マンナナーゼと６３％の類似性および４１．８％の配列同一性を、カルジセルロシルプトル・サッカロリチカス（受託番号Ｐ２２５３３）由来のβ−１，４−マンナナーゼと６０．３％の類似性および４２％の配列同一性を示す。これらの配列はＧＣＧウィスコンシンソフトウェアパッケージ、バージョン８．１のＧＡＰプログラムを用い、ギャップ形成ペナルティー３．００およびギャップ伸長ペナルティー０．１０で作製した。
【０３７８】
バチルス・ハロデュランス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ ）マンナナーゼ遺伝子のクローニング
Ｂ．サブチリス （Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ） における成熟型全長マンナナーゼのサブクローニングおよび発現
本発明のマンナナーゼをコードするＤＮＡ配列はこれら２つのオリゴヌクレオチドからなるＰＣＲプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した。
ＢＸＭ５　上流　ＳａｃＩＩ
５’−ＣＡＴ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＧＣＧ ＧＣＡ ＣＡＴ ＣＡＣ ＡＧＴ ＧＧＧ ＴＴＣ ＣＡＴ Ｇ−３’
ＢＸＭ５　下流　ＮｏｔＩ
５’−ＧＣＧ ＴＴＧ ＡＧＡ ＣＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＧＡ ＡＡＣ ＡＣＡ ＣＴＧ ＣＴＴ ＣＴＴ ＴＴＡ Ｇ−３’
制限部位ＳａｃＩＩおよびＮｏｔＩは下線で示されている。
【０３７９】
上記のようなバチルス・ハロデュランスから単離された染色体ＤＮＡを、製造業者の指示に従いＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いるＰＣＲ反応において鋳型として用いた。ＰＣＲ反応は、各ｄＮＴＰ ２００μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｃｅｔｕｓ， ＵＳＡ）２．５単位、および各プライマー１００ｐｍｏｌを含有するＰＣＲバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）中で設定した。
【０３８０】
ＰＣＲ反応はＤＮＡターミナルサイクラー（Ｌａｎｄｇｒａｆ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。一度９４℃で１時間インキュベートした後、９４℃で３０秒間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、および７２℃で２分間の伸長といったサイクルプロフィールを用いて３０サイクルのＰＣＲを行った。増幅産物のアリコート５μｌを０．７％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ， ＦＭＣ）における電気泳動によって解析した。０．９ｋｂのサイズのＤＮＡ断片が現れ、遺伝子セグメントが適切に増幅されていることを示した。
【０３８１】
ＰＣＲ 断片のサブクローニング
上記のようにして作製されたＰＣＲ産物のアリコート４５μｌを製造業者の指示に従いＱＩＡクイックＰＣＲ増幅キット（Ｑｉａｇｅｎ， ＵＳＡ）を用いて精製した。精製したＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５ ５０μｌに溶出した。
ｐＭＯＬ９４４ ５μｌおよび精製ＰＣＲ断片２５μｌをＳａｃＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、０．８％低固化温度アガロース（ＳｅａＰｌａｑｕｅ ＧＴＧ， ＦＭＣ）ゲルで電気泳動に付し、適切な断片をゲルから切り取り、製造業者の指示に従いＱＩＡクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ， ＵＳＡ）を用いて精製した。次いで、単離したＰＣＲ断片をＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩで消化して精製したｐＭＯＬ９４４に連結した。連結は、各ＤＮＡ断片０．５μｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１単位およびＴ４　リガーゼバッファー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１６℃で一晩行った。
【０３８２】
この連結混合物を用いてコンピテントＢ．サブチリス　ＰＬ２３０６を形質転換した。形質転換細胞をＬＢＰＧ−１０μｇ／ｍｌカナマイシン−寒天プレート上に置いた。３７℃で１８時間インキュベートした後、プレート上にコロニーが認められた。いくつかのクローンを、一晩培養した培養液からプラスミドＤＮＡを単離することにより解析した。
【０３８３】
かかる１つの陽性コロニーを数回、上記の寒天プレートで画線培養した。このクローンをＭＢ８７８と称した。クローンＭＢ８７８をＴＹ−１０μｇ／ｍｌカナマイシンで３７℃で一晩培養し、翌日、細胞１ｍｌを用い、Ｂ．サブチリスプラスミド調製物に関する製造業者の推奨に従いＱｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ ＃２７１０６を用いて細胞からプラスミドを単離した。このＤＮＡをＤＮＡ配列決定したところ、配列番号１１における９７〜９９３番および配列番号１２における３３〜３３１番のマンナナーゼ成熟部分に相当するＤＮＡ配列が明らかになった。
【０３８４】
バチルス・ハロデュランス由来マンナナーゼの発現、精製および同定
上記のようにして得られたクローンＭＢ８７８を、２個のバッフル付き５００ｍｌ振盪フラスコにて、１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２５×２００ｍｌＢＰＸ培地中で、３７℃、３００ｒｐｍで５日間増殖させた。
【０３８５】
クローンＭＢ８７８の振盪フラスコ培養液５０００ｍｌを回収し、ｐＨを６．０に調整した。フロキュレーションのための振盪の間に、陽イオン物質（１０％ Ｃ５２１）１２５ｍｌおよび陰イオン物質（Ａ１３０）２５０ｍｌを加えた。フロキュレートした材料を、Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ ３Ｂ遠心分離機を用い、９０００ｒｐｍ、６℃にて２０分間遠心分離することにより分離した。上清をＮａＯＨでｐＨ８．０に調整し、ワットマンガラスフィルターＧＦ／ＤおよびＣで清澄化した。
【０３８６】
次いで、５０ｇのＤＥＡＥ Ａ−５０ Ｓｅｐｈａｄｅｘを０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化して濾液に加え、酵素を結合させ、室温で一晩放置した。結合した酵素は、酢酸バッファー中０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出した。次いで、水酸化ナトリウムでｐＨを８．０に調整した後、排除限界１０ｋＤａのＦｉｌｔｒｏｎで濃縮して４５０ｍｌとし、２０％グリセロール、２０％ＭＰＧおよび２％Ｂｅｒｏｌで安定化させた。この産物を増幅試験に用いた。
【０３８７】
この濃縮物２ｍｌを水酸化ナトリウムでｐＨ８．５に調整した。高純度マンナナーゼを得るため、濃縮物を０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．５で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘカラムに通した。
この精製酵素はＳＤＳ−ＰＡＧＥで、分子量３４ｋＤａの単一バンドを示した。
このマンナナーゼ酵素のアミノ酸配列、すなわち翻訳されたＤＮＡ配列は配列番号１２に示されている。
精製タンパク質の下記Ｎ末端配列が決定された：ＡＨＨＳＧＦＨＶＮＧＴＴＬＹＤＡ。
【０３８８】
ｐＨ活性プロフィール（ＭａｎＵアッセイ（４０℃にて２０分間のインキュベーション）を使用）は、この酵素がｐＨ７．５〜ｐＨ１０の間で５０％より高い比活性を持つことを示す。
至適温度（ＭａｎＵアッセイ；グリシンバッファーを使用）はｐＨ１０では６０℃〜７０℃の間であることが分かった。
免疫学的特性：Ｄａｎｉｓｈ社ＤＡＫＯの常法を用い、高純度クローン化マンナナーゼに対してウサギポリクローナル単一特異性血清を作製した。この血清はアガロースゲル中で本発明の未精製マンナナーゼと良好な単一の沈殿を形成した。
【０３８９】
実施例１１．洗剤における実施例 １０ のマンナナーゼ酵素の使用
バッファーおよびの代わりに市販の洗浄剤を用い、上記のイナゴマメ等級由来の０．２％ＡＺＣＬ−ガラクトマンナン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）とともに４０℃にて２０分間インキュベートした後、青色の形成を調べたところ、実施例１０に記載のようにして得られたマンナナーゼ酵素は、欧州の液体洗剤Ａｒｉｅｌ Ｆｕｔｕｒ、米国のＴｉｄｅ粉末および液体洗剤において、バッファーにおける活性に対して４０％より高い活性で活性を示した。これらの試験では洗剤濃度は市販の洗剤パッケージで推奨されている通りとし、洗浄水はドイツ硬度が欧州条件（Ａｒｉｅｌ Ｆｕｔｕｒ）下では１８度、米国条件（米国Ｔｉｄｅ）下では９度である水道水であった。
【０３９０】
実施例１２．バチルス種 ＡＡ３４９ 由来のマンナナーゼ
バチルス種（ ＡＡ３４９ ）マンナナーゼ遺伝子のクローニング
Ｂ．サブチリスにおける触媒核マンナナーゼ酵素のサブクローニングおよび発現
本発明のマンナナーゼをコードするＤＮＡ配列は以下の２つのオリゴヌクレオチドからなるＰＣＲプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した。
ＢＸＭ７　上流　ＳａｃＩＩ
５’−ＣＡＴ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＧＣＧ ＧＣＡ ＡＧＴ ＧＧＡ ＣＡＴ ＧＧＧ ＣＡＡ ＡＴＧ Ｃ−３’
ＢＸＭ７　下流　ＮｏｔＩ
５’−ＧＣＧ ＴＴＧ ＡＧＡ ＣＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＴＴ ＴＴＧ ＴＡＴ ＡＣＡ ＣＴＡ ＡＣＧ ＡＴＴ ＴＣ−３’
制限部位ＳａｃＩＩおよびＮｏｔＩは下線で示されている。
【０３９１】
上記のようなバチルス種ＡＡ３４９から単離された染色体ＤＮＡを、製造業者の指示に従いＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いるＰＣＲ反応において鋳型として用いた。ＰＣＲ反応は、各ｄＮＴＰ ２００μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｃｅｔｕｓ， ＵＳＡ）２．５単位、および各プライマー１００ｐｍｏｌを含有するＰＣＲバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）中で設定した。
【０３９２】
ＰＣＲ反応はＤＮＡターミナルサイクラー（Ｌａｎｄｇｒａｆ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。一度９４℃で１時間インキュベートした後、９４℃で３０秒間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、および７２℃で２分間の伸長といったサイクルプロフィールを用いて３０サイクルのＰＣＲを行った。増幅産物のアリコート５μｌを０．７％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ， ＦＭＣ）における電気泳動によって解析した。１．０ｋｂのサイズのＤＮＡ断片が現れ、遺伝子セグメントが適切に増幅されていることを示した。
【０３９３】
ＰＣＲ 断片のサブクローニング
上記のようにして作製されたＰＣＲ産物のアリコート４５μｌを製造業者の指示に従いＱＩＡクイックＰＣＲ増幅キット（Ｑｉａｇｅｎ， ＵＳＡ）を用いて精製した。精製したＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５ ５０μｌに溶出した。ｐＭＯＬ９４４ ５μｌおよび精製ＰＣＲ断片２５μｌをＳａｃＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、０．８％低固化温度アガロース（ＳｅａＰｌａｑｕｅ ＧＴＧ， ＦＭＣ）ゲルで電気泳動に付し、適切な断片をゲルから切り取り、製造業者の指示に従いＱＩＡクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ， ＵＳＡ）を用いて精製した。次いで、単離したＰＣＲ断片をＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩで消化して精製したｐＭＯＬ９４４に連結した。連結は、各ＤＮＡ断片０．５μｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１単位およびＴ４　リガーゼバッファー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， ドイツ）を用いて１６℃で一晩行った。
【０３９４】
この連結混合物を用いてコンピテントＢ．サブチリス　ＰＬ２３０６を形質転換した。形質転換細胞をＬＢＰＧ−１０μｇ／ｍｌカナマイシン−寒天プレート上に置いた。３７℃で１８時間インキュベートした後、プレート上にコロニーが認められた。いくつかのクローンを、一晩培養した培養液からプラスミドＤＮＡを単離することにより解析した。
【０３９５】
かかる１つの陽性コロニーを数回、上記の寒天プレートで画線培養した。このクローンをＭＢ８７９と称した。クローンＭＢ８７９をＴＹ−１０μｇ／ｍｌカナマイシンで３７℃で一晩培養し、翌日、細胞１ｍｌを用い、Ｂ．サブチリスプラスミド調製物に関する製造業者の推奨に従いＱｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ ＃２７１０６を用いて細胞からプラスミドを単離した。このＤＮＡをＤＮＡ配列決定したところ、マンナナーゼの成熟部分に相当するＤＮＡ配列が明らかになった（添付のＤＮＡ配列の配列番号１５における２０４〜１１０７番および添付のタンパク質配列の配列番号１６における２６〜３６９番に相当）。
【０３９６】
バチルス・スペーシス ＡＡ３４９ 由来マンナナーゼの発現、精製および同定
上記のようにして得られたクローンＭＢ８７９を、２個のバッフル付き５００ｍｌ振盪フラスコにて、１０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２５×２００ｍｌＢＰＸ培地中で、３７℃、３００ｒｐｍで５日間増殖させた。
クローンＭＢ８７９の振盪フラスコ培養液４００ｍｌを回収し、ｐＨを６．５に調整した。フロキュレーションのための振盪の間に、陽イオン物質（１０％ Ｃ５２１）１９ｍｌおよび陰イオン物質（Ａ１３０）３８ｍｌを加えた。フロキュレートした材料を、Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ ３Ｂ遠心分離機を用い、５０００ｒｐｍ、６℃にて２５分間遠心分離することにより分離した。
【０３９７】
次いでこれを濃縮し、水で洗浄し、排除限界１０ｋＤａのＦｉｌｔｒｏｎで伝導率を低くし、１５０ｍｌとした。その後ｐＨを４．０に調整し、その液体を５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４．０にてＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィーに適用した。カラムはまず０．５ＭまでのＮａＯＨ勾配で溶出し、次ぎに０．１ＭグリシンバッファーｐＨ１０でマンナナーゼを溶出した。マンナナーゼ活性画分をプールしたところ、それらはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量３８ｋＤａの単一バンドを示した。
このマンナナーゼ酵素のアミノ酸配列、すなわち翻訳されたＤＮＡ配列は配列番号１６に示されている。
【０３９８】
ｐＨ 活性プロフィール（ＭａｎＵアッセイ（４０℃にて２０分間のインキュベーション）を使用）は、この酵素がｐＨ５〜ｐＨ１０の間で３０％より高い比活性を持つことを示す。
至適温度（ＭａｎＵアッセイ；グリシンバッファーを使用）はｐＨ１０では６０℃〜７０℃の間であることが分かった。
免疫特性：Ｄａｎｉｓｈ社ＤＡＫＯの常法を用い、高純度クローン化マンナナーゼに対してウサギポリクローナル単一特異性血清を作製した。この血清はアガロースゲル中で本発明の未精製マンナナーゼと良好な単一の沈殿を形成した。
【０３９９】
実施例１３．洗剤における実施例 １３ のマンナナーゼ酵素の使用
バッファーおよびの代わりに市販の洗浄剤を用い、上記のイナゴマメ等級由来の０．２％ＡＺＣＬ−ガラクトマンナン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）とともに４０℃にて２０分間インキュベートした後、青色の形成を調べたところ、実施例１２に記載のようにして得られたマンナナーゼ酵素は、欧州の液体洗剤Ａｒｉｅｌ Ｆｕｔｕｒ、および米国のＴｉｄｅ液体洗剤において、バッファーにおける活性に対して６５％より高い活性で活性を示した。このマンナナーゼは欧州のＡｒｉｅｌ Ｆｕｔｕｒ製粉末洗剤および米国のＴｉｄｅ粉末洗剤においては３５％より高い活性であった。これらの試験では洗剤濃度は市販の洗剤パッケージで推奨されている通りとし、洗浄水はドイツ硬度が欧州条件（Ａｒｉｅｌ Ｆｕｔｕｒ）下では１８度、米国条件（米国Ｔｉｄｅ）下では９度である水道水であった。
【０４００】
実施例１４．真菌フミコーラ・インソレンス （Ｈｕｍｉｓｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ） ＤＳＭ１８００株由来のマンナナーゼ
フミコーラ・インソレンス由来ファミリー２６　β−１，４−マンナナーゼの発現クローニング
真菌株および培養条件
フミコーラ・インソレンスＤＭＳ１８００株は、ＷＯ９７／３２０１４に記載のようにして発酵させ、２６℃で５日間増殖させた後に菌糸を採取し、直ちに液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。
【０４０１】
ＲＮ アーゼフリーガラス製品、チップおよび溶液の準備
ＲＮＡの単離に使用するすべてのガラス製品は２２０℃で少なくとも１２時間燃焼処理した。エッペンドルフ管、ピペットチップおよびプラスチックカラムはＥｔＯｈ中０．１％ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で１２時間処理してオートクレーブにかけた。バッファー類および水はすべて（ただし、Ｔｒｉｓ含有バッファーは除く）０．１％ＤＥＰＣで３７℃にて１２時間処理してオートクレーブにかけた。
【０４０２】
全ＲＮＡの抽出
全ＲＮＡは、クアニジウムチオシアネートで抽出した後、以下の改良を用いた５．７Ｍ ＣｓＣｌクッション（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９７９）で超遠心分離を行うことによって調製した。凍結菌糸を液体窒素中、乳鉢と乳房で粉砕して微粉末とした後、予め冷却したコーヒーミルで粉砕し、直ちに５容量のＲＮＡ抽出バッファー（４Ｍ ＧｕＳＣＮ、０．５％Ｎａ−ラウリルサルコシン、２５ｍＭ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．１Ｍ β−メルカプトエタノール）に懸濁した。
【０４０３】
この混合物を室温で３０分間攪拌し、遠心分離（室温、５０００ｒｐｍ、３０分、Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｅｇａｆｕｇｅ １．０ Ｒ）して細胞残渣をペレットとした。上清を回収し、５．７Ｍ ＣｓＣｌクッション（５．７Ｍ ＣｓＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、０．１％ＤＥＰＣ；使用前にオートクレーブ処理）上に、ＣｓＣｌクッション１２．０ｍｌにつき上清２６．５ｍｌを用い、注意深く積層して遠心分離し、全ＲＮＡを得た（Ｂｅｃｋｍａｎ， ＳＷ ２８ローター、２５００ｒｍｐ、室温、２４時間）。遠心分離後、上清を注意深く除去し、ＲＮＡペレットを含有するチューブの底を切り取り、７０％ＥｔＯＨですすいだ。全ＲＮＡペレットをエッペンドルフ管に移し、５００ｍｌＴＥ、ｐＨ７．６に懸濁し（困難であれば、５分間６５℃で時折加熱する）、フェノール抽出を行い、−２０℃で１２時間エタノールで沈殿させた（２．５容量のＥｔＯＨ、０．１容量の３Ｍ ＮａＡｃ、ｐＨ５．２）。このＲＮＡを遠心分離により回収し、７０％ＥｔＯＨ中で洗浄し、最小量のＤＥＰＣ−ＤＩに再懸濁した。ＲＮＡ濃度はＯＤ_{２６０／２８０}を測定することにより求めた。
【０４０４】
ポリ （Ａ） ^＋ ＲＮＡ の単離
ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）セルロースアフィニティークロマトグラフィー（Ａｖｉｖ ＆ Ｌｅｄｅｒ， １９７２）により単離した。典型的には、０．２ｇのオリゴ（ｄＴ）セルロース（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， 結合能の確認用）を１０ｍｌの１×カラム充填バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）中で予め膨潤させ、ＤＥＰＣ処理したプラグプラスチックカラム（Ｐｏｌｙ Ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラム、Ｂｉｏ Ｒａｄ）に充填し、２０ｍｌの１×充填バッファーで平衡化した。この全ＲＮＡを６５℃で８分間加熱し、５分間氷上でクエンチし、１容量の２×カラム充填バッファーを添加した後、ＲＮＡサンプルをカラムに装填した。
【０４０５】
溶出液を回収し、毎装填前に上記のようにしてサンプルを加熱して氷上でクエンチすることにより、２、３回再装填した。このオリゴ（ｄＴ）カラムを１０容量の１×充填バッファーで、次いで３容量の塩媒質バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、 ｐＨ７．６、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）で洗浄し、その後、ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを６５℃に予熱した３容量の溶出バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ＳＤＳ）を溶出し、５００ｍｌの画分を回収した。回収した各画分についてＯＤ_２６０を読み取り、ｍＲＮＡ含有画分をプールし、−２０℃で１２時間エタノール沈殿を行った。ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡは遠心分離により回収し、ＤＥＰＣ−ＤＩＷに再懸濁し、−８０℃で５ないし１０ｍｇアリコートとして保存した。
【０４０６】
ｃＤＮＡの合成
第一鎖の合成
Ｆ． Ｓ． Ｈａｇｅｎ （ｐｅｒｓ． ｃｏｍｍ．）により開発されたヘアピン改良法を用いたＲＮアーゼＨ法（Ｇｕｂｌｅｒ ＆ Ｈｏｆｆｍａｎ １９８３， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）により、５ｍｇのフミコーラ・インソレンスポリ（Ａ）^＋ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成した。ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ（ＤＥＰＣ処理水５ｍｌ中５ｍｇ）を７０℃で８分間加熱して氷上でクエンチし、各ｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１ｍＭ、４０単位のヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮａｓｉｎ， Ｐｒｏｍｅｇａ）、１０ｍｇのオリゴ（ｄＴ）_{１２−１８}プライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および１０００単位のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮアーゼ　Ｈ−逆転写酵素（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有する１ｍＭ逆転写酵素バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．３、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で最終量５０ｍｌとした。反応混合物を４５℃で１時間インキュベートすることにより、第一鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０４０７】
第二鎖の合成
合成後、３０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡを加え、４０ｍｇのグリコーゲン担体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、２０容量の１０Ｍ ＮＨ_４Ａｃおよび２．５容量の９６％ＥｔＯＨを添加することにより、ｍＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドを−２０℃で１２時間、エタノール沈殿させた。このハイブリッドを遠心分離により回収し、７０％ＥｔＯＨで洗浄し、風乾し、各ｄＮＴＰ１００ｍ、４４単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、６．２５単位のＲＮアーゼ　Ｈ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および１０．５単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有するＭ２５０ｍｌの第二鎖バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、９０ｍＭ ＫＣｌ、４．６ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１６ｍＭ βＮＡＤ^＋）に再懸濁した。第二鎖ｃＤＮＡの合成は、反応試験管を１６℃で３時間インキュベートすることにより行い、ＥＤＴＡを添加して最終濃度２０ｍＭとすることにより反応を停止した後、フェノール抽出した。
【０４０８】
マングマメ（ Ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ）ヌクレアーゼ処理
２容量の９６％ＥｔＯＨ、０．１容量の３Ｍ ＮａＡｃ、ｐＨ５．２を添加することにより、二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮを−２０℃で１２時間エタノール沈殿させ、遠心分離により回収し、７０％ＥｔＯＨで洗浄し、乾燥させ（ＳｐｅｅｄＶａｃ）、３６単位のマングマメヌクレアーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有する３０ｍｌのマングマメヌクレアーゼバッファー（３０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．６、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ_４、０．３５ｍＭ ＤＴＴ、２％グリセロール）に再懸濁した。反応物を３０℃で３０分間インキュベートした後、７０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、フェノール抽出して、２容量の９６％ＥｔＯｈおよび０．１容量の３Ｍ ＮａＡｃ、ｐＨ５．２で−１２℃にて１２時間エタノール沈殿させることで一本鎖ヘアピンＤＮＡをクリッピングした。
【０４０９】
Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼによる平滑末端化
二本鎖ｃＤＮＡを、各ｄＮＴＰ０．５ｍＭ、および７．５単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する５０ｍｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸、ｐＨ７．９、１０ｍＭ ＭｇＡｃ、５０ｍＭ ＫＡｃ、１ｍＭ ＤＴＴ）中、３７℃で１５分間反応混合物をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベートすることにより平滑末端化した。ＥＤＴＡを添加して最終濃度２０ｍＭとすることにより停止した後、フェノール抽出し、エタノール沈殿させた。
【０４１０】
アダプターの連結およびサイズ選択
充填反応の後、６００ｐｍｏｌのＢｓｔ Ｉアダプターおよび５単位のＴ４リガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する３０ｍｌの連結反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）中、反応混合物を１６℃で１２時間インキュベートすることにより、ｃＤＮＡを非パリンドロームＢｓｔＸ Ｉアダプター（１ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。７０℃で５分間加熱することにより反応を停止させ、アダプターを付加したｃＤＮＡをアガロースゲル電気泳動（０．８％ＨＳＢ−アガロース、ＦＭＣ）でサイズ分画して連結していないアダプターと小ｃＤＮＡを分離した。ｃＤＮＡを排除限界０．７ｋｂでサイズ選択し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、１００ボルトで１時間、ｃＤＮＡをアガロースゲルから電気溶出し、フェノール抽出し、上記のように−２０℃で１２時間エタノール沈殿させた。
【０４１１】
フミコーラ・インソレンス ｃＤＮＡ ライブラリーの構築
アダプターを付加した二本鎖ｃＤＮＡを遠心分離により回収し、７０％ＥｔＯＨ中で洗浄し、２５ｍｌのＤＩＷに再懸濁した。大スケールライブラリー連結に先立ち、各々、１ｍｌの二本鎖ｃＤＮＡ（＃１〜＃３）、２単位のＴ４リガーゼ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）および５０ｎｇ（試験管＃１）、１００ｎｇ（試験管＃２）また２００ｎｇ（試験管＃３および＃４）Ｂｓｔ ＸＩで切断したｐＹＥＳ ２．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する連結反応バッファー（上記と同様）１０ｍｌ中で４種の試験連結反応を行った。
【０４１２】
連結反応は、１６℃で１２時間インキュベートすることにより行い、７０℃で５分間加熱し、各連結反応物１ｍｌを４０ｍｌのコンピテント大腸菌１０６１細胞（ＬＢ培養液１リットル中ＯＤ_６００＝０．９、冷ＤＩＷ中で２回、１０％グリセロール２０ｍｌ中で１回洗浄し、１０％グリセロール２ｍｌに再懸濁させる）にエレクトロポレーションした（２００Ｗ、２．５ｋＶ、２５ｍＦ）。各形質転換混合物に１ｍｌのＳＯＣを添加した後、細胞を３７℃で１時間増殖させ、ＬＢ＋アンピシリンプレート（１００ｍｇ／ｍｌ）に５０ｍｌをプレーティングし、３７℃で１２時間増殖させた。
【０４１３】
至適条件を用い、９単位のＴ４リガーゼを含有する４０ｍｌの連結反応バッファーにて大スケール連結反応を設定し、反応物を１６℃で１２時間インキュベートした。７０℃で５分間加熱することによって連結反応を停止し、−２０℃で１２時間エタノール沈殿させ、遠心分離により回収し、１０ｍｌのＤＩＷに再懸濁した。上記と同じエレクトロポレーション条件を用いて１ｍｌアリコートをエレクトロコンピテント大腸菌１０６１細胞に形質転換し、形質転換細胞を滴定し、そのライブラリーをＬＢ＋アンピシリンプレートに５０００〜７０００ｃ．ｆ．ｕ．／プレートにプレーティングした。１×１０^６組換えクローンを含むｃＤＮＡライブラリーは１）−８０℃にて２０％グリセロール中で個々のプール（５０００〜７０００ｃ．ｆ．ｕ．／プールとして、２）−２０℃にて同プールの細胞ペレットとして、また３）−２０℃にて個々のプール由来のＱｉａｇｅｎ精製プラスミドＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ Ｔｉｐ １００， Ｄｉａｇｅｎ）として保存した。
【０４１４】
フミコーラ・インソレンス由来β−１，４−マンナナーゼ ｃＤＮＡ のサッカロミセス・セレビシエ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｉｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） における発現クローニング
個々のプールからの精製プラスミドＤＮＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）のアリコート１ｍｌをエレクトロコンピテントＳ．セレビシエＷ３１２４（ＭＡＴａ；ｕｒａ ３−５２；ｌｅｕ ２−３、１１２；ｈｉｓ ３−Ｄ２００；ｐｅｐ ４−１１３７；ｐｒｃｌ：：ＨＩＳ３、ｐｒｂ１：：ＬＥＵ２；ｃｉｒ＋）細胞４０ｍｌ（５００ｍｌＹＰＤ中ＯＤ_６００＝１．５、冷ＤＩＷ中で２回、冷１Ｍソルビトール中で１回洗浄し、１Ｍソルビトール０．５ｍｌに再懸濁した、Ｂｅｃｋｅｒ ＆ Ｇｕａｒａｎｔｅ， １９９１）へエレクトロポレーションした。
【０４１５】
１Ｍ冷ソルビトール１ｍｌを添加した後、８０ｍｌアリコートをＳＣ＋グルコース−ウラシル上にプレーティングしてプレート当たり２５０〜４００コロニー形成単位を得、３０℃で３〜５日間インキュベートした。これらのプレートを、寒天プレートに配合されたＡＺＣｌ−ガラクトマンナン（ＭｅｇａＺｙｍｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含有するＳＣ＋ガラクトース−ウラシルプレート上に再びプレーティングした。Ｈ．インソレンスライブラリー由来の総数約５０，０００個の酵母コロニーをマンナナーゼ陽性コロニーに関してスクリーニングした。
【０４１６】
陽性コロニーは、相当する酵母コロニー周囲の青い加水分解ハローの形成によって確認した。単一のコロニーとしてクローンを得、ビオチニル化ｐＹＥＳ２．０ポリリンカープライマーを用いて酵母細胞溶解物から直接ｃＤＮＡ挿入部を増幅し、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄ Ｍ−２８０， Ｄｙｎａｌ）系によって精製し、チェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７７）およびＳｅｑｕｅｎａｓｅ系（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて各ｃＤＮＡクローンの５’末端を配列決定することにより個々に同定した。
【０４１７】
マンナナーゼ陽性酵母コロニーを５０ｍｌ試験管内でＹＤＰ培養液２０ｍｌに接種した。試験管を３０℃で２日間振盪し、３０００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離により細胞を回収した。ＷＯ９４／１４９５３に従い全酵母ＤＮＡを単離し、オートクレーブ処理した水５０ｍｌに溶解し、上記のようなエレクトロポレーションにより大腸菌へ形質転換した。ｐＹＥＳ２．０ｃＤＮＡクローンを含有する挿入部をＬＢ＋アンピシリン寒天プレートにプレーティングするこによりレスキューし、標準法を用いて大腸菌からプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素で消化することにより解析した。
【０４１８】
ヌクレオチド配列解析
全長Ｈ．インソレンス　β−１，４−マンナナーゼｃＤＮＡクローンｐＣ１Ｍ５９のヌクレオチド配列は、５００ｎｇのＱｉａｇｅｎ精製鋳型（Ｑｉａｇｅｎ， ＵＳＡ）、Ｔａｑデオキシターミナルサイクルシーケンシングキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， ＵＳＡ）、蛍光標識ターミネーターおよび５ｐｍｏｌのｐＹＥＳ２．０ポリリンカープライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＵＳＡ）を用い、ジデオキシチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． １９７７）によって両鎖から決定した。配列データの解析はＤｅｖｅｒｅｕｅ ｅｔ ａｌ． （１９８４）に従って行った。
【０４１９】
アスペルギルス・オリゼ （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ） における異種発現
アスペルギルス・オリゼの形質転換
アスペルギルス・オリゼの形質転換は、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８）， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６， １４１９−１４２２によって記載されたように行った。
アスペルギルス発現のβ−１，４−マンナナーゼ発現カセットの構築
標準法を用いてマンナナーゼクローンｐＣ１Ｍ５９からプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素解析により解析した。適当な制限酵素を用いてｃＤＮＡ挿入部を切り出し、プラスミドｐ７７の誘導体であるアスペルギルス発現ベクターｐＨＤ４１４に連結した（ＥＰ２３８０２３に記載）。ｐＨＤ４１４の構築はＷＯ９３／１１２４９にさらに記載されている。
【０４２０】
アスペルギルス・オリゼまたはアスペルギルス・ニゲル （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ） の形質転換
一般法：１００ｍｌのＹＰＤ（Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｎｅｔｉｃｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８１）にＡ．オリゼまたはＡ．ニゲルの胞子を接種し、３７℃で約２日間振盪しながらインキュベートする。ミラクロスで濾過して菌糸を採取し、２００ｍｌの０．６Ｍ ＭｇＳＯ_４で洗浄する。菌糸を１５ｍｌの１．２Ｍ ＭｇＳＯ_４、１０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ＝５．８に懸濁する。この懸濁液を氷上で冷却し、１２０ｍｇのノボザイム（登録商標）２３４を含有するバッファー１ｍｌを加える。
【０４２１】
５分後に１ｍｌの１２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを加え、３７℃で１．５〜２．５時間、顕微鏡下で観察したサンプルに多数のプロトプラストが見られるまで穏やかに浸透しながらインキュベートを続ける。この懸濁液をミラクロスで濾過し、濾液を滅菌試験管に移し、５ｍｌの０．６Ｍソルビトール、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．０で覆った。１００ｇで１５分間遠心分離を行い、ＭｇＳＯ_４クッションの上層からプロトプラストを回収する。このプロトプラスト懸濁液に２容量のＳＴＣを加え、混合物を１０００ｇで５分間遠心分離する。プロトプラストペレットを３ｍｌのＳＴＣに再懸濁し、再びペレットとする。これを繰り返す。
【０４２２】
最後に、プロトプラストを０．２〜１ｍｌのＳＴＣに再懸濁する。１００μｌのプロトプラスト懸濁液を、１０μｌのＳＴＣ中適当なＤＮＡ５〜２５μｇと混合した。プロトプラストをｐ３ＳＲ２（Ａ．ニデュランス（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ遺伝子含有プラスミド）と混合する。この混合物を室温で２５分間放置し、０．２ｍｌの６０％ＰＥＧ４０００、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２および１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を加え、注意深く混合し（２回）、最後に０．８５ｍｌの同溶液を加え、注意深く混合する。
【０４２３】
この混合物を室温で２５分間放置し、２５００ｇで１５分間遠心分離し、ペレットを２ｍｌの１．２Ｍソルビトールに再懸濁する。さらに１回沈降を行った後、プロトプラストを適当なプレートに拡げる。プロトプラストを最小プレートに拡げてバックグラウンドの増殖を阻害する。３７℃で４〜７日間インキュベートした後、胞子を選び取り、拡げて単一コロニーとする。この手順を繰り返し、２回目の再単離の後に単一コロニーの胞子を所定の形質転換体として保存する。
【０４２４】
アスペルギルス・オリゼ形質転換体の精製
Ａｍｄｓ＋−プレート（＋０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）上の分生胞子によって精製し、ＹＰＭ中、３０℃で３日間増殖させた。
マンナナーゼ陽性アスペルギルス・オリゼ形質転換体の確認
アスペルギルス・オリゼ形質転換体からの上清を、基質として０．２％ＡＺＣｌ−ガラクトマンナン（ＭｅｇａＺｙｍｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含有する寒天プレート上でβ−１，４−マンナナーゼ活性に関して分析した。陽性形質転換体は、３０℃で２４時間インキュベートした後にプレートを青い加水分解ハローに関して分析することで確認した。
【０４２５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 解析
β−１，４−マンナナーゼを産生するアスペルギルス・オリゼ形質転換体からの上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。形質転換体を５ｍｌのＹＰＭ中で３日間増殖させる。１０μｌの上清を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに適用し、その後これをクマシーブリリアントブルーで染色した。
【０４２６】
フミコーラ・インソレンスマンナナーゼの精製および同定
上記のように遺伝子をＡ．オリゼに形質転換し、形質転換株を、マルトースシロップ、スクロース、ＭｇＳＯ_４、Ｋａ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、クエン酸酵母抽出物および微量の金属からなる標準培地を用い、発酵槽で増殖させた。インキュベーションは通気しながら３４℃で６日間行った。
発酵液（５０００ｍｌ）を回収し、濾過により液体から菌糸を分離した。この清澄な液体をフィルトロンで濃縮して２７５ｍｌとした。
【０４２７】
マンナナーゼは陽イオンクロマトグラフィーを用いて精製した。Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを２５ｍＭクエン酸ｐＨ４．０で平衡化し、カラムに結合したマンナナーゼを塩化ナトリウム勾配（０〜０．５Ｍ）を用いて溶出した。マンナナーゼ活性画分をプールし、ｐＨを７．３に調整した。次いで、プールしたマンナナーゼ１００ｍｌを５ｍｌまで濃縮し（ｍｌ当たり１３ｍｇのタンパク質を含む）、これを適用試験に用いた。さらなる精製のため、２ｍｌを、酢酸ナトリウムバッファーｐＨ６．１を用いたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００におけるサイズクロマトグラフィーに適用した。マンナナーゼ活性画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて染色されたバンドと同じ分子量４５ｋＤａおよび３８ｋＤａであることを示し、このことはＮ末端非触媒ドメインのタンパク質分解的変性を示すものである。
【０４２８】
マンナナーゼ酵素のアミノ酸配列、すなわち翻訳されたＤＮＡ配列は配列番号１４に示されている。
配列番号１３のＤＮＡ配列は１〜２１番にシグナルペプチドをコードしている。またその他のマンナナーゼに見られる機能が不明のドメインも、配列番号１４のアミノ酸配列の２２〜１５９番に示されており、触媒活性ドメインは配列番号１４の１６０〜４８８番に見られる。
最も高い配列相同性は、ＤＩＣＴＹＯＧＬＯＭＵＳ ＴＨＥＲＭＯＰＨＩＬＵＭ（４９％の同一性）；マンナナーゼ配列ＥＭＢＬ；１９９７年７月にＲＥＥＶＥＳ Ｒ．Ａ．， ＧＩＢＢＳ Ｍ．Ｄ．， ＢＥＲＧＱＵＩＳＴ Ｐ．Ｌ．により寄託されたＡＦ０１３９８９に対して認められた。
【０４２９】
分子量：３８ｋＤａ
ＤＳＣ（酢酸ナトリウムバッファー　ｐＨ６．０中）は６５°であった。
ｐＨ 活性プロフィール（ＭａｎＵアッセイを使用（４０℃で２０分間インキュベーション））は酵素がｐＨ８で至適活性を有することを示している。
至適温度（ＭａｎＵアッセイを使用；基質としてはＭｅｇａＺｙｍｅ ＡＺＣＬローカストビーンガム）は、ｐＨ１０では７０℃であることが分かった。
免疫特性：Ｄａｎｉｓｈ社ＤＡＫＯの常法を用い、高純度クローン化マンナナーゼに対してウサギポリクローナル単一特異性血清を作製した。この血清はアガロースゲル中で本発明の未精製マンナナーゼと良好な単一の沈殿を形成した。
【０４３０】
実施例１５．フミコーラ・インソレンスファミリー２６マンナナーゼの洗浄評価
洗浄性能は、ローカストビーンガムで被覆した布帛を本発明のマンナナーゼを含む洗浄溶液中で洗浄することで評価した。洗浄後、布帛を酸化鉄で汚染することにより効果を視覚化した。
ローカストビーンガム布帛の準備：清浄な綿の布帛を２ｇ／ｌのローカストビーンガムの溶液に浸し、室温で一晩乾燥させた。これらの布帛を水で予備洗浄し、再び乾燥させた。
【０４３１】
洗浄：１５°ｄＨの水中６、７ｇ／ｌのＡｒｉｅｌ Ｆｕｔｕｒ液の入ったビーカーに小さな円形のローカストビーンガム布帛を置き、磁気攪拌しながら４０℃で３０分間インキュベートした。これらの布帛を水道水ですすぎ、乾燥させた。
汚染：これらの布帛を０．２５ｇ／ｌのＦｅ_２Ｏ_３の入ったビーカーに入れ、３分間攪拌した。これらの布帛を水道水ですすぎ、乾燥させた。
評価：ＭａｃＢａｔｈ ＣｏｌｏｒＥｙｅ ７０００規約反射率分光光度計を用いて布帛の規約反射率を４００ｎｍで測定した。
【０４３２】
結果は
Δ規約反射率＝（Ｒ洗浄後−Ｒ洗浄前）酵素−（Ｒ洗浄後−Ｒ洗浄前）対照
（式中、Ｒは４４０ｎｍでの規約反射率である）
として表した。
本発明のマンナナーゼは、バチルス種Ｉ６３３由来の対照マンナナーゼよりも若干良好な洗浄性能で、ローカストビーンガム布帛において明らかに有効である。
Δ規約反射率として示される、バチルス種Ｉ６３３由来のマンナナーゼ（実施例１〜３）と比較したフミコーラ・インソレンスファミリー２６マンナナーゼの洗浄特性：
【０４３３】
【表５】

【０４３４】
実施例１６〜４０．
以下の例は本発明の組成物を例示するものであり、本発明の範囲を必ずしも制限または規定するものではない。
洗剤組成物において、酵素レベルは全組成物に対する純酵素重で表し、特に断りのない限り洗剤成分は全組成物に対する重量で表す。そこで略記された成分は以下の意味を有する。
【０４３５】
【表６】

【０４３６】
【表７】

【０４３７】
【表８】

【０４３８】
【表９】

【０４３９】
【表１０】

【０４４０】
【表１１】

【０４４１】
【表１２】

【０４４２】
【表１３】

【０４４３】
【表１４】

【０４４４】
【表１５】

【０４４５】
【表１６】

【０４４６】
【表１７】

【０４４７】
【表１８】

【０４４８】
【表１９】

【０４４９】
【表２０】

【０４５０】
【表２１】

【０４５１】
【表２２】

【０４５２】
【表２３】

【０４５３】
【表２４】

【０４５４】
【表２５】

【０４５５】
【表２６】

【０４５６】
【表２７】

【０４５７】
【表２８】

【０４５８】
【表２９】

【０４５９】
【表３０】

【０４６０】
【表３１】

【０４６１】
【表３２】

【０４６２】
【表３３】

【０４６３】
【表３４】

【０４６４】
【表３５】

【０４６５】
【表３６】

【０４６６】
【表３７】

【０４６７】
【表３８】

【０４６８】
【表３９】

【０４６９】
【表４０】

【０４７０】
【表４１】

【０４７１】
【表４２】

【０４７２】
【表４３】

【０４７３】
【表４４】

【０４７４】
【表４５】

【０４７５】
【表４６】

【０４７６】
【表４７】

【０４７７】
【表４８】

【０４７８】
【表４９】

【０４７９】
【表５０】

【０４８０】
【表５１】

【０４８１】
【表５２】

【０４８２】
【表５３】

【０４８３】
【表５４】

【０４８４】

Claims (35)

1. （ａ）エスシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１２１９７に存在するプラスミド中にクローン化されたＤＮＡ配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
   （ｂ）配列番号２の位置３１〜３３０に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
   （ｃ）配列番号１の位置９１〜９９０又は位置９１〜１４７０に示されるようなＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチド、あるいは
   （ｄ）上記（ａ）もしくは（ｂ）に定義されるポリペプチドと少なくとも６５％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は上記（ａ），（ｂ）もしくは（ｃ）のフラグメント、である単離されたマンナナーゼ。
2. バチルスｓｐ． （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．） の株に由来する請求項１記載のマンナナーゼ。
3. ｉ）４０℃で測定される場合、７．５〜１０のｐＨ範囲で少なくとも６０％の相対マンナナーゼ活性；
   ｉｉ） ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される場合、３４±１０ｋＤａの分子量；及び／又は
   ｉｉｉ） Ｎ−末端配列ＡＮＳＧＦＹＶＳＧＴＴＬＹＤＡＮＧを有する請求項２記載のマンナナーゼ。
4. マンナナーゼ活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子であって、前記ＤＮＡ配列が、
   （ａ）Ｅ．コリＤＳＭ １２１９７に存在するプラスミド中にクローン化されたＤＮＡ配列のマンナナーゼ酵素コード部分；
   （ｂ）配列番号１における位置９１〜１４７０，好ましくは位置９１〜９９０に示されるＤＮＡ配列、又はその相補的鎖；
   （ｃ）前記ＤＮＡと少なくとも６５％相同である、上記（ａ）又は（ｂ）に定義されるＤＮＡ配列の類似体；
   （ｄ）低い緊縮下で、配列番号１における位置９１〜９９０に示される配列を含んで成る二本鎖ＤＮＡプローブとハイブリダイズするＤＮＡ配列；
   （ｅ）遺伝子コードの縮重性のために、上記（ｂ）もしくは（ｄ）の配列とハイブリダイズしないが、しかしそれらのＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を正確に有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列；又は
   （ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）又は（ｅ）に特定されるＤＮＡ配列のフラグメントであるＤＮＡ配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子。
5. マンナナーゼ活性を示す酵素をコードする前記ＤＮＡ配列が、微生物、好ましくは糸状菌、酵母又は細菌；好ましくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、カルジセルロシルプトル（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ）又はヒューミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）から得られる請求項４記載のクローン化されたＤＮＡ配列。
6. 中位の緊縮条件下で、変性された二本鎖ＤＮＡプローブにハイブリダイズする、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子であって、前記プローブが、配列番号１の位置９１〜９９０に示される配列、又は配列番号１の位置９１〜１４７０に示される配列を含んで成るＤＮＡプローブ、及び少なくとも約１００個の長さの塩基対を有する配列番号１の位置９１〜９９０の副配列を含んで成るＤＮＡプローブから成る群から選択される単離されたポリヌクレオチド分子。
7. 次の操作可能的に連結された要素：転写プロモーター；上記（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド９１〜ヌクレオチド９９０のヌクレオチド配列を含んで成る、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基３１〜アミノ酸残基３３０のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％同一である、マンナナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、及び（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）の変性ヌクレオチド配列から成る群から選択されたＤＮＡセグメント；及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクター。
8. ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する、請求項７記載の発現ベクターを導入されている培養された細胞。
9. （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸残基３１〜アミノ酸残基３３０のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド分子；及び（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基３１〜アミノ酸残基３３０のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％同一であるポリペプチド分子から成る群から選択されたマンナナーゼ活性を有する単離されたポリペプチド。
10. バチルスｓｐ． Ｉ６３３ により生成される請求項９記載のポリペプチド。
11. 請求項９記載の精製されたポリペプチドを含んで成る酵素調製物。
12. マンナナーゼ活性を有するポリペプチドを生成するための方法であって、請求項７記載の発現ベクターを導入されている細胞を培養し、それにより、前記細胞がＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現し；そして前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
13. プロテアーゼ、セルラーゼ（エンドグルカナーゼ）、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、他のマンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はそれらの混合物から成る群から選択された１又は複数の酵素をさらに含んで成る請求項１１記載の調製物。
14. （ｉ）同種不純物を有さず、そして（ｉｉ）請求項１２記載の方法により生成される、マンナナーゼ活性を有する単離された酵素。
15. 有効量の請求項１１記載の調製物又は有効量の請求項１もしくは２記載の酵素により処理される、セルロース、又は合成ファイバー、糸、織布又は不織布の性質を改良するための方法。
16. 前記酵素調製物又は酵素が糊抜工程段階に使用される請求項１５記載の方法。
17. 植物材料の変性又は修飾のための方法であって、前記植物材料を有効量の請求項１１記載の調製物又は有効量の請求項１もしくは２記載の酵素により処理する方法。
18. 前記植物材料が、リサイクル故紙；機械的、化学的、半化学的クラフト又は他のクラフト紙製造用パルプ；浸水工程にゆだねられたファイバー；又はグアーガムもしくはイナゴマメガム含有材料である請求項１７記載の方法。
19. 液体コーヒー抽出物を処理するための方法であって、前記コーヒー抽出物を有効量の請求項１１記載の調製物又は有効量の請求項１又は２記載の酵素により処理する方法。
20. 請求項１１記載の酵素調製物又は請求項１もしくは２記載の酵素を含んで成るクリーニング用組成物。
21. セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼ；並びに従来の洗剤成分から選択された酵素をさらに含んで成る請求項２０記載の洗浄組成物。
22. 前記酵素又は酵素調製物が、組成物合計の０．０００１〜２重量％、好ましくは０．０００５〜０．５重量％、より好ましくは０．００１〜０．１重量％（純粋な酵素）のレベルで存在する請求項２０記載の清浄組成物。
23. 前記酵素又は酵素調製物が、組成物合計の０．０００１〜２重量％、好ましくは０．０００５〜０．５重量％、より好ましくは０．００１〜０．１重量％（純粋な酵素）のレベルで存在する請求項２１記載の清浄組成物。
24. 前記酵素がアミラーゼである請求項２１記載の清浄組成物。
25. セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択されたさらにもう１つの酵素をさらに含んで成る請求項２４記載の清浄組成物。
26. アニオン性、非イオン性、カチオン性界面活性剤、及び／又はそれらの混合物から選択された界面活性剤を含んで成る請求項２１記載の清浄組成物。
27. 漂白剤を含んで成る請求項２１記載の清浄組成物。
28. ビルダーを含んで成る請求項２１記載の清浄組成物。
29. ２つの長い鎖を含んで成るカチオン性界面活性剤を含んで成る請求項２１記載の繊維製品軟化組成物。
30. 布の機械処理のための方法であって、請求項１１記載の酵素調製物又は請求項１もしくは２記載の酵素を含む洗浄溶液により、機械洗浄工程の洗浄サイクルの間、繊維製品を処理することを含んで成る方法。
31. セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択された酵素と共に、請求項１１記載の酵素調製物又は請求項１もしくは２記載の酵素の、繊維製品清浄及び／又は繊維製品しみぬきのためのクリーニング組成物への使用。
32. セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択された酵素と共に、請求項１１記載の酵素調製物又は請求項１もしくは２記載の酵素の、硬質表面、例えば床、壁、浴室のタイル及び同様のものを清浄するためのクリーニング組成物への使用。
33. セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及びキシログルカナーゼから選択された酵素と共に、請求項１１記載の酵素調製物又は請求項１もしくは２記載の酵素の、手による及び機械皿洗いのためのクリーニング組成物への使用。
34. セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素及び／又はキシログルカナーゼから選択された酵素と共に、請求項１１記載の酵素調製物又は請求項１もしくは２記載の酵素の、経口、歯、コンタクトレンズ及び身辺清浄用途のための清浄組成物への使用。
35. （ａ１）Ｅ．コリＤＳＭ１２１８０に存在するプラスミド中にクローン化されたＤＮＡ配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
    （ｂ１）配列番号６の位置３２〜３４４に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
    （ｃ１）上記（ａ１）もしくは（ｂ１）に定義されるポリペプチドと少なくとも８５％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は（ａ１），（ｂ１）もしくは（ｃ１）のフラグメント；
    （ａ２）Ｅ．コリＤＳＭ１２４３３に存在するプラスミド中にクローン化されたＤＮＡ配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
    （ｂ２）配列番号１０の位置３２〜３６２に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
    （ｃ２）上記（ａ２）もしくは（ｂ２）に定義されるポリペプチドと少なくとも８５％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は上記（ａ２），（ｂ２）もしくは（ｃ２）のフラグメント；
    （ａ３）Ｅ．コリＤＳＭ１２４４１に存在するプラスミド中にクローン化されたＤＮＡ配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
    （ｂ３）配列番号１２の位置３３〜３３１に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
    （ｃ３）上記（ａ３）又は（ｂ３）に定義されるポリペプチドと少なくとも８５％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は上記（ａ３），（ｂ３）もしくは（ｃ３）のフラグメント；
    （ａ４）Ｅ．コリＤＳＭ９９８４に存在するプラスミド中にクローン化されたＤＮＡ配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
    （ｂ４）配列番号１４の位置１６６〜４８８に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
    （ｃ４）上記（ａ４）もしくは（ｂ４）に定義されるポリペプチドと少なくとも８５％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は上記（ａ４），（ｂ４）もしくは（ｃ４）のフラグメント；
    （ａ５）Ｅ．コリＤＳＭ１２４３２に存在するプラスミド中にクローン化されたＤＮＡ配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
    （ｂ５）配列番号１６の位置６８〜３６９に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
    （ｃ５）上記（ａ５）もしくは（ｂ５）に定義されるポリペプチドと少なくとも８５％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は（ａ５），上記（ｂ５）もしくは（ｃ５）のフラグメント；
    （ａ６）Ｅ．コリＤＳＭ１２８４９に存在するプラスミド中にクローン化されたＤＮＡ配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
    （ｂ６）配列番号２２の位置２９〜３２０に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
    （ｃ６）上記（ａ６）もしくは（ｂ６）に定義されるポリペプチドと少なくとも８５％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は上記（ａ６），（ｂ６）もしくは（ｃ６）のフラグメント；
    （ａ７）Ｅ．コリＤＳＭ１２１８０に存在するプラスミド中にクローン化されたＤＮＡ配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
    （ｂ７）配列番号２６の位置３０１〜６２５に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
    （ｃ７）上記（ａ７）又は（ｂ７）に定義されるポリペプチドと少なくとも８５％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は上記（ａ７），（ｂ７）もしくは（ｃ７）のフラグメント；
    （ａ８）Ｅ．コリＤＳＭ１２８５１に存在するプラスミド中にクローン化されたＤＮＡ配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
    （ｂ８）配列番号２８の位置１６６〜４９６に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
    （ｃ８）上記（ａ８）もしくは（ｂ８）に定義されるポリペプチドと少なくとも８５％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は上記（ａ８），（ｂ８）もしくは（ｃ８）のフラグメント；
    （ａ９）Ｅ．コリＤＳＭ１２８５２に存在するプラスミド中にクローン化されたＤＮＡ配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
    （ｂ９）配列番号３０の位置２６〜３６１に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
    （ｃ９）上記（ａ９）もしくは（ｂ９）に定義されるポリペプチドと少なくとも８５％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は（ａ９），（ｂ９）もしくは（ｃ９）のフラグメント；
    （ａ１０）Ｅ．コリＤＳＭ１２４３６に存在するプラスミド中にクローン化されたＤＮＡ配列のマンナナーゼ酵素コード部分によりコードされるポリペプチド、又は
    （ｂ１０）配列番号３２の位置５９３〜９０３に示されるようなアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド、又は
    （ｃ１０）上記（ａ１０）もしくは（ｂ１０）に定義されるポリペプチドと少なくとも８５％相同である、前記ポリペプチドの類似体、又は上記（ａ１０），（ｂ１０）もしくは（ｃ１０）のフラグメント、である単離されたマンナナーゼ。