ES2272620T3 - Detergentes que contienen celulasas. - Google Patents
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Abstract
Método para proveer celulasas sencillas para aplicaciones detergentes, caracterizado por las etapas de (a) aislamiento de microorganismos tolerantes a condiciones alcalinas productores de celulasa que se pueden obtener a partir de muestras de agua o de suelo de un ambiente alcalino, (b) purificación de las celulasas de estas cepas, (c) determinación de la perdida de resistencia a la tensión (TSL) durante el proceso de lavado, (d) determinación de las propiedades que evitan la formación de bolitas (AP) durante el proceso de lavado, y (e) escogencia de las celulasas con una relación de pérdida de resistencia a la tensión (TSL) con respecto a las propiedades que evitan la formación de bolitas (AP) por debajo de 1.
Description
Detergentes que contienen celulasas.
La presente invención se relaciona con un método
para proveer celulasas sencillas para aplicaciones con
detergente.
Las celulasas, también llamadas enzimas
celulolíticas, son enzimas que son capaces de la hidrólisis de los
enlaces \beta-D-glucosídicos en
las celulosas. Las enzimas celulolíticas han sido divididas
tradicionalmente entres clases: endoglucanasas, exoglucanasas o
celobiohihrolasas y \beta-glucosidasas (Knowles,
J. y colaboradores (1987), TIBTECH 5, 255-261). Las
enzimas celulolíticas pueden ser producidas por un gran número de
bacterias, levaduras y hongos. Los microorganismos que producen
celulasas son descritos, por ejemplo, en
GB-A-2094826.
Se han desarrollado diferentes aplicaciones para
el uso de enzimas celulolíticas:
- -
- degradación de la pulpa de la celulosa(madera) en azúcares para la producción de (bio)etanol;
- -
- diferentes tratamientos textiles tales como el "lavado" a la "a piedra" y el "biopulido";
- -
- aplicación en composiciones detergentes.
El uso de celulasas en composiciones detergentes
se inició con las celulasas capaces de reducir la aspereza, esto
es, reblandecimiento, de las telas que contienen algodón, como se
describe, por ejemplo, en
GB-B-1358599.
Se sabe además que las composiciones detergentes
que contienen celulasas son efectivas para la remoción de la
suciedad, esto es, la limpieza. Se ha reconocido desde hace bastante
tiempo la eficiencia de las enzimas celulolíticas, las celulasas,
en términos de la limpieza del textil
GB-A-2075028,
GB-A-2095275 y
GB-A-2094826 divulgan composiciones
detergentes con celulasa para llevar a cabo una mejor limpieza.
También se conoce en el estado del arte que las
celulasas pueden actuar como un agente para aclaración del color en
los detergentes de lavandería. Después de repetidos lavados de telas
descoloridas, las telas que contienen algodón parecen ser
grisáceas, muy probablemente debido a las fibras rotas causado por
acción mecánica. Las fibras que se destrozan dan como resultado
fibras desordenadas que se rompen. El uso de celulasas como agentes
para aclaración del color para telas coloreadas ha sido descrito en
EP-A-0220016. En realidad, las
mezclas de celulasa de la cepa del hongo Humicola insolens
(DSM 1800) son comúnmente utilizadas en detergentes para dar como
resultado propiedades que evitan la formación de bolitas y reviven
el color. El sistema celulótico enzimático producido por medio de
un microorganismo de tipo silvestre está disponible bajo el nombre
comercial de Celluzyme® de Novo-Nordisk. Además,
también se utiliza en detergentes celulasa (sencilla) clonada con el
mismo origen bajo el nombre comercial de Carezyme®.
La principal desventaja de las celulasas
conocidas en el arte que muestran aclaración del color es que estas
enzimas degradan agresivamente las telas que contienen celulosa lo
cual resulta en un daño por la pérdida indeseable de la resistencia
a la tensión de las telas.
Por otro lado, las celulasas conocidas en el
arte que muestran buenas propiedades de limpieza, muestran apenas
efectos de aclaración del color. El primer detergente comercial con
celulasas en el mundo contenía una celulasa bacterial. Esta enzima
representa a la endoglucanasa alcalina mencionada anteriormente de
una especie de bacilo que no ataca a las fibras de la celulosa. Se
describe que la enzima proporciona un efecto de limpieza durante el
lavado. No se han descrito efectos con respecto a la antiformación
de bolitas o al reavivamiento del color para esta
enzima.
enzima.
A partir de lo anterior será claro que es aún
deseable proveer celulasas mejoradas en aplicaciones detergentes.
Utilizando mezclas con celulasas, como se sugiere en la solicitud
internacional de patente
WO-A-95/02675, se supone que
suministran el desempeño anteriormente mencionado en el lavado en
lavandería, pero en nuestro conocimiento no ha sido posible
utilizar previamente enzimas solas que provean todas estas
características cuando se aplican en el lavado en lavandería.
Sorprendentemente se ha encontrado que el uso de
ciertas celulasas sencillas que son capaces de comportamiento
antiredeposición, de aclaración del color y para la antiformación de
bolitas en el lavado en lavandería no resulta en absoluto en un
daño inaceptable para los textiles lavados.
Por lo tanto, la presente invención se relaciona
con un método para proveer celulasas sencillas para aplicaciones
detergentes, caracterizadas por las etapas de:
- (a)
- aislamiento de microorganismos tolerantes a condiciones alcalinas productores de celulasa que se pueden obtener a partir de muestras de agua o de suelo de un ambiente alcalino,
- (b)
- purificación de las celulasas de estas cepas,
- (c)
- determinación de la perdida de resistencia a la tensión (TSL, como se la define aquí) durante el proceso de lavado,
- (d)
- determinación de las propiedades que evitan la formación de bolitas (AP, como se las define aquí) durante el proceso de lavado, y
- (e)
- escogencia de las celulasas con una relación de pérdida de resistencia a la tensión (TSL) con respecto a las propiedades que evitan la formación de bolitas (AP) por debajo de 1.
El uso de una celulasa sencilla, purificada a
partir de microorganismos tolerantes a condiciones alcalinas
productores de celulasa que se pueden obtener a partir de muestras
de agua o de suelo de un ambiente alcalino o de un derivado de esa
celulasa con una relación de pérdida de resistencia a la tensión
(TSL) con respecto a las propiedades que evitan la formación de
bolitas (AP) por debajo de 1, preferiblemente por debajo de 0,8,
más particularmente en el rango entre 0,001 y 0,5, en soluciones
acuosas de lavandería, es el objetivo de la solicitud europea en
trámite No. 96914993.9, publicación No.
EP-A-827 534.
La medición de la perdida de la resistencia a la
tensión es una forma de medir el daño causado por el estrés
mecánico o la acción enzimática sobre las fibras. Se entiende que
para los propósitos de la presente invención se deben utilizar
fibras de algodón. El método mide la resistencia a la tensión de
fibras sencillas bajo condiciones de humedad. Este método se
describe en la Norma Estándar Alemana DIN 53.857, parte 1, así como
en la Norma Estándar Internacional ISO 2267.
Como el efecto normalmente se observa en una
cantidad significativa solamente aproximadamente después de 20 a 25
ciclos de lavado, existe siempre alguna perdida en la resistencia a
la tensión debido a las fuerzas mecánicas que actúan sobre las
fibras de algodón durante el proceso de lavado. Por lo tanto, se
debe restar la perdida de resistencia a la tensión de una tela de
control lavada sin celulasas utilizando la misma formulación de
detergente y el mismo tipo de máquina de lavado y programa de
lavado. Para calibrar los valores, se utiliza una preparación de
endoglucanasa V (sencilla) de Humicola insolens (EG V) con
cantidades iguales de proteína enzimática en el detergente como
estándar y el valor de la pérdida de resistencia a la tensión para
esta muestra menos el valor de control del detergente sin celulasa
es tomado como un TSL de 100%. Esta celulasa EG V ha sido descrita
por ejemplo en la solicitud internacional de patente WO 91/17243. La
cantidad de proteína se puede medir por ejemplo por medio del uso
del método BCA de Pierce como lo describen R. E. Brown y
colaboradores en Anal. Biochem. 1989, vol. 180, págs. 136 -
139.
Se puede utilizar una preparación de una
celulasa de bacilo mencionada anteriormente que puede obtenerse con
Kao Corp. Bajo la marca registrada KAC® 500 o KAC® 700 como
comparación, resultando en general en una perdida muy baja de
resistencia a la tensión comparado con el experimento de lavado de
control sin celulasa presente.
El ataque de las celulasas sobre las
microfibrillas prominentes, bolitas y pelusa de algodón sobre la
superficie de una tela de algodón resulta en la remoción
óptimamente visible de esas bolitas. Para evaluar el efecto, los
lavados se llevan a cabo utilizando detergente con y sin celulasa,
como se describe para la determinación de TSL. El efecto para la
antiformación de bolitas, se puede observar mejor después de
incrementar el número de ciclos de lavado. Por lo tanto, se
utilizan generalmente de 15 a 40 ciclos de lavado para demostrar
este efecto de las celulasas.
Existen tres métodos diferentes que pueden ser
utilizados para la cuantificación de este efecto:
- 1.
- evaluación visual por medio de un grupo de prueba (panel)
- 2.
- medición de la reflexión de luz (valor L del sistema CIELAB)
- 3.
- determinación de la pelusa de algodón por medio de una medición óptica.
La determinación que utiliza el valor L del
sistema CIELAB (Commission Internationale de l’Èclairage) fue
descrito por U. Hotz en Tenside Surf. Det. 1993, vol. 30, página
388.
El sistema óptico de medición, que se utiliza en
el método preferido para determinar las propiedades para la
antiformación de bolitas, usualmente consiste de una fuente de luz,
un tubo de microscopio y una cámara a color CCD que registra la luz
reflejada a partir de la superficie de una tela. Dependiendo de la
cantidad de bolitas y de pelusa sobre la superficie de la tela,
cambia la cantidad de luz reflejada que se mide por medio de un
análisis de la imagen digital. Tal sistema puede ser utilizado para
medir cuantitativamente la cantidad de bolitas y de pelusa sobre
las telas, normalmente después de 15 a 40 ciclos de lavado
dependiendo del tipo y la actividad de la celulasa añadida al
detergente. Un sistema óptico que puede ser utilizado para medir el
grado de bolitas ha sido descrito por T.
Muller-Kirschbaum y H. Grundmann en SÖFW, vol. 118
(1992), páginas 483-499.
Cualquier sea el método que se utilice para
determinar el efecto para la antiformación de bolitas de la celulasa
que es analizada, tiene que ser analizada la celulasa estándar EG V
bajo las mismas condiciones y su efecto se debe determinar a través
del mismo método, teniendo en cuenta el valor resultante a partir
del uso del detergente sin celulasa. El valor obtenido por EG V se
toma como AP = 100%.
Como se puede observar a partir de esta
definición, la celulasa EG V conocida a partir de Humicola
insolens tiene la relación de TSL a AP de 1. Ya que la celulasa
de bacilos mencionada que se obtiene con Kao Corp. bajo la marca
registrada KAC® 500 o KAC® 700 tiene un AP bajo y un TSL muy bajo,
se puede observar que la proporción para esta celulasa es también
aproximadamente de 1. Las celulasas que, de acuerdo con la
invención, pueden ser escogidas para ser utilizadas en soluciones
acuosas para lavandería, tienen una relación de TSL a AP en lo
posible por debajo de 1, preferiblemente por debajo de 0,8 y más
particularmente en el rango de 0,001 a 0,5. Una relación de TSL a
AP por ejemplo de 0,5 significa que únicamente se observa 50% de la
pérdida de resistencia a la tensión con una concentración
enzimática que produce el mismo efecto que evita a formación de
bolitas que la celulasa estándar.
La solución acusa para lavandería incluye
convenientemente celulasa de acuerdo con la definición dada
anteriormente en concentraciones de 0,01 mg/l hasta 0,2 mg/l, más
particularmente de 0,015 mg/l hasta 0,1 mg/l. Estas concentraciones
se refieren al peso de proteína celulótica. Además, todos los
ingredientes normalmente encontrados en las soluciones de
lavandería pueden estar presentes.
Encontramos que el uso de una celulasa sencilla
proveída por la invención, a diferencia de las mezclas previamente
conocidas de celulasas que ocasionan aclaración del color, no
degradan al algodón hasta un nivel indeseable causando la perdida
de resistencia a la tensión.
Se encontró además que utilizando una celulasa
de la definición de acuerdo con la invención, a diferencia de las
celulasas previamente conocidas que ocasionan aclaración del color,
no se acumula la enzima sobre la tela después de repetidas lavadas
en lavandería.
Como se observó anteriormente, la presente
invención generalmente se relaciona con el suministro de nuevas
celulasas. Sin embargo, antes de divulgar esta invención con más
detalle, se definirán los siguientes términos:
- "Celulasa" es un nombre genérico para las enzimas que actúan sobre la celulosa y sus derivados, y los hidrolizan en glucosa, celobiosa o celooligosacáridos.
- El término celulasa "sencilla" utilizado aquí está destinado a significar una celulasa que es producida por un gen.
- "obtenido a partir de" un organismo en conexión con una celulasa significa que tal celulasa tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde con la secuencia de aminoácidos de una celulasa que se puede obtener a partir de ese organismo.
- "Derivado" está destinado a indicar una proteína que se deriva de una proteína nativa por medio de la adición de uno o más aminoácidos a uno cualquiera o a ambos extremos C y N-terminales de la proteína nativa, la sustitución de uno o más aminoácidos en uno o en una cantidad de sitios diferentes en la secuencia nativa de aminoácidos, la supresión de uno o más aminoácidos en uno cualquiera o en ambos extremos de la proteína nativa o en uno o más sitios en la secuencia de aminoácidos, o la inserción de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la secuencia nativa de aminoácidos. La preparación de un derivado se logra usualmente por medio de la modificación de una secuencia de ADN para formar la proteína derivada. El derivado de la invención incluye péptidos que contienen secuencias alteradas de aminoácidos comparado con una secuencia precursora de aminoácidos de una enzima (por ejemplo, una enzima en estado nativo o de tipo natural de acuerdo con la presente invención) y cuyos péptidos retienen una característica natural de la enzima de la enzima precursora pero que tiene propiedades alteradas en algunos aspectos específicos. Por ejemplo, una celulosa alterada puede tener un pH óptimo mayor o una mayor resistencia a la temperatura pero retendrá su actividad característica de celulasa. Los derivados también incluyen modificaciones químicas de residuos aminoácidos dentro de la molécula de la enzima.
- "Célula huésped" significa una célula que tiene la capacidad de actuar como un vehículo hospedero y de expresión para un vector de ADN recombinante que contiene ADN que codifica para la proteína nativa o un derivado.
- El término "limpieza" significa la remoción de la suciedad vinculada con la lavandería.
- El término "formación de bolitas" en este contexto es la formación de bolitas y de pelusa sobre la superficie de las telas que contiene algodón debido a la rotura o desordenamiento de las fibras.
- El término "antiformación de bolitas" es utilizado para describir la prevención en la formación de bolitas y pelusa sobre la superficie de las telas que contienen algodón así como la remoción de las bolitas y la pelusa de las telas que contienen algodón. La antiformación de bolitas normalmente resulta en la aclaración del color cuando se tratan las telas coloreadas que contienen algodón.
- El término "aclaración del color" en este contexto es el restablecimiento de la apariencia fresca y atractiva de las telas coloreadas que contienen o que consisten de fibras con base en celulosa, que han desarrollado una apariencia grisácea por el tratamiento, especialmente con detergentes de lavandería, de la tela coloreada.
- El término "redeposición" en este contexto es la deposición de suciedad o de componentes coloreados que fueron removidos de estos textiles o telas durante un lavado en lavandería o tratamiento del textil.
- El término "evitar la redeposición" en este contexto es la acción de la celulasa para prevenir o disminuir la redeposición de suciedad y de los componentes de color sobre la tela.
- Por una "solución de lavandería" se entiende una solución acuosa utilizada para lavado, enjuague o acondicionamiento, por ejemplo, reblandecimiento de telas.
La presente invención se relaciona con la
escogencia de una celulasa que pueda ser obtenida a partir de
microorganismos. Como ejemplo exitoso se pueden observar a aquellas
que se depositadas de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el
Reconocimiento Internacional de los Depósitos de Microorganismos
para los Propósitos de Procedimientos de Patente, en la Centraal
Bureau voor Schimmelculturs, Baarn, Los Países Bajos el 23 de
diciembre de 1993, bajo los números de depósito CBS 669.93 y CBS
670.93 (descritos en la solicitud internacional de patente
WO-A-95/18219). Estas cepas han
sido clasificadas como especies nuevas del género Bacillus,
que no pertenecen a ninguno de los grupos de Bacillus con
ARNr actualmente conocidos. Como se lo utiliza aquí, las especies
depositadas serán mencionadas como CBS 669.93 y CBS 670.93.
Los microorganismos de pueden obtener por
ejemplo a partir de muestras de agua y de suelo recolectadas en
ambientes alcalinos tales como suelos alcalinos y lagos de soda.
Se han seleccionado posteriormente los
microorganismos utilizando un ensayo de difusión en
agar-carboximetil celulosa (CMC). Las cepas que
mostraron una zona de aclaración en esta prueba fueron aisladas como
cepas potenciales para la producción de celulasa. Se construyeron
bibliotecas genómicas de genes de las cepas que producen celulasa
tolerante a ambientes alcalinos. Se seleccionaron los clones
recombinantes por medio de difusión en agar sobre
agar-CMC. Se aislaron los clones recombinantes que
mostraron zonas de aclaración alrededor de la colonia. Las
celulasas sencillas se produjeron por medio de fermentación de los
clones recombinantes en medio 4*YEP durante 48 horas a 30ºC. Las
celulasas sencillas obtenidas, opcionalmente purificadas como se
describe en el Ejemplo 1, fueron analizadas en los ensayos
definidos anteriormente para medir TSL y AP.
Sorprendentemente se encontró que las celulasas
que pueden ser obtenidas a partir de CBS 669.93 o CBS 670.93
muestran un buen desempeño en ambos ensayos y tienen una relación de
TSL a AP por debajo de 1.
En un ejemplo para la invención, se describe una
celulasa aproximadamente de 50 kD (calculado con base en la
secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.: 2) de la proteína madura)
derivada de CBS 670.93 (mencionada aquí como "BCE 103"). Se ha
revelado por medio de análisis del gen que codifica a la secuencia
de aminoácidos de la celulasa aproximadamente de 50 kD, que esta
celulasa es 89% idéntica en secuencia y 92,5% similar en secuencia
a la celulasa CelA del Bacillus sp. N-4
(Fukumori y colaboradores, J. Bacter., vol. 168, pp.
479-485) por medio del uso del programa TFastA
(Paquete de Software para el Análisis de Secuencia versión 6.0 de
Genetic Computer Group. University of Wisconsin, Biotechnology
Center, Madison, Wisconsin) como lo describen Pearson y Lipman en
Proc. Nat. Acad. Sci., vol. 85, páginas 2444-2448
(1988).
En otro ejemplo para la invención, se describe
una celulasa aproximadamente de 63 kD (calculada sobre la base de
la secuencia de aminoácidos de la proteína madura) derivada de CBS
669.93 (mencionada aquí como "BCE 113"). Se ha revelado por
medio del análisis del gen que codifica a la secuencia de
aminoácidos de la celulasa de aproximadamente 63 kD que esta
celulasa es 58% idéntica en secuencia y 72% similar en secuencia a
la celulasa CelB del Bacillus lautus (Jorgensen y
colaboradores, Gene, vol. 93 (1990), páginas 55-60)
por medio del uso del programa TFastA (Paquete de Software para el
Análisis de Secuencia versión 6.0 de Genetic Computer Group.
University of Wisconsin, Biotechnology Center, Madison, Wisconsin)
como lo describen Pearson y Lipman en Proc. Nat. Acad. Sci., vol.
85 (1990), páginas 2444-2448. La secuencia de
aminoácidos de BCE 113 se da en la SEQ ID No. 4.
Una celulasa que puede ser útil para detergentes
además de tener una relación de TSL a AP por debajo de 1 usualmente
se desempeña bien en la Prueba para Evitar la Redeposición como se
describe en el Ejemplo 5. El mantenimiento de la blancura de
tejidos blancos se mide por medio de una medición de reflectancia.
Entre más alto el valor de reflectancia, más efectivo el desempeño
de la celulasa analizada para evitar la redeposición. También se
desempeñan bien en la Prueba de Reblandecimiento como se describe en
el Ejemplo 5. La eliminación de bolitas es la remoción de fibrillas
y/o de microfibrillas que se desordenan y/o se rompen lo cual
usualmente hace que una tela que contiene algodón coloreado parezca
grisácea. Entre más se remuevan las fibrillas desordenadas y/o
rotas, lucen mejor las telas que contienen algodón coloreado. La
efectividad de la eliminación de bolitas se puede juzgar por medio
de paneles o se puede cuantificar por medio de un sistema de
análisis de imágenes, como el que se describió anteriormente para
la medición de AP. Las celulasas que cumplen el requisito de la
proporción definida anteriormente usualmente exhiben las siguientes
propiedades: Ellas muestran un REM delta de al menos 4 unidades,
preferiblemente de al menos 5 unidades, en la Prueba para Evitar la
Redeposición como se describe en los Ejemplos, y muestran un
resultado de eliminación de bolitas que es al menos comparable con
aquella de la celulasa que puede ser obtenida a partir de CBS
670.93.
Las celulasas proveídas por medio de la presente
invención pueden ser producidas por medio de un proceso que puede
ser desarrollado utilizando ingeniería genética. Como una primera
etapa se puede clonar al gen que codifica a la celulasa de la
presente invención utilizando vectores (de expresión)
\lambda-fago y células huésped de E. coli.
Alternativamente se puede utilizar clonación por PCR utilizando
iniciadores de consenso diseñados sobre dominios conservados. La
expresión del gen que codifica a la celulasa de la presente
invención en E. coli se muestra que produce una proteína
activa.
Después de una primera etapa de clonación en
E. coli, se puede transferir un gen de celulasa a un huésped
de expresión industrial más preferible tal como especies de
Bacillus o Streptomyces, un hongo filamentoso tal
como Aspergillus, o una levadura. Un alto nivel de expresión
y de secreción obtenibles en estos organismos huéspedes permite la
acumulación de la celulasa de la invención en el medio de
fermentación a partir del cual se la puede recuperar
posteriormente.
Las celulasas proveídas por la invención se
pueden utilizar preferiblemente en cantidades de 8 x 10^{-5}% en
peso (0,8 ppm) hasta 8 x 10^{-3}% en peso (80 ppm), más
particularmente de 1 x 10^{-4}% en peso (1 ppm) hasta 4 x
10^{-3}% en peso (40 ppm), con relación a la proteína celulótica,
en detergentes. Las composiciones de detergente que contienen una
celulasa proveída por la invención, pueden contener adicionalmente
agentes tensoactivos que pueden ser del tipo aniónico, no iónico,
catiónico, anfótero o ión híbrido, así como mezclas de estas clases
de agentes tensoactivos. Tales composiciones detergentes pueden
contener otros ingredientes detergentes conocidos en el arte, como
por ejemplo, constructores, agentes blanqueadores, activadores de
blanqueo, agentes anticorrosivos, agentes secuestrantes, polímeros
liberadores de la suciedad, perfumes, otras enzimas,
estabilizadores enzimáticos, etc.
Los constructores adecuados son en particular
aquellos de las clases de ácidos policarboxílicos, más
particularmente ácidos acrílicos poliméricos, ácidos metacrílicos,
ácidos maléicos, copolímeros de los mismos, y carbohidratos
oxidados, como se describe en la solicitud internacional de patente
WO-A-93/16110, silicatos en capas,
más particularmente bentonitas, alumosilicatos, más particularmente
zeolitas, silicatos cristalinos o amorfos de metal alcalino, más
particularmente silicato de sodio, y carbonatos de metal alcalino,
más particularmente carbonato de sodio. Los ácidos policarboxílicos
mencionados son utilizados normalmente en la forma de sus sales de
metal alcalino, más particularmente en la forma de sus sales de
sodio o de potasio. Las zeolitas incorporadas en forma apropiada
son en particular aquellas del tipo A, P o X o mezclas de los
mismos. Los silicatos adecuados de metal alcalino son aquellos con
relaciones molares de SiO_{2} al óxido de metal alcalino de 1,5 a
3,0. Constructores como estos están convenientemente presentes en
tales detergentes en cantidades del 20% en peso al 80% en peso.
Los agentes tensoactivos no iónicos pueden estar
presentes en los detergentes preferiblemente en cantidades de no
más del 10% en peso y, más preferiblemente, en cantidades del 2% en
peso al 6% en peso, como base en el detergente como un todo. Los
agentes tensoactivos no iónicos adecuados son poliglicósidos de
alquilo que contienen de 10 a 20 átomos de carbono en el componente
alquilo y alcoxilatos, particularmente etoxilatos y/o propoxilatos
de alcoholes lineales o ramificados C_{10-22} y
preferiblemente C_{12-18}. El grado de
alcoxilación de los alcoholes está entre 1 y 20 y preferiblemente
entre 3 y 10. Ellos se pueden preparar en una forma conocida por
medio de la reacción de los correspondientes alcoholes con los
correspondientes óxidos de alquileno. Los derivados de alcohol
graso son particularmente adecuados, aunque sus isómeros de cadena
ramificada, más particularmente los así llamados oxoalcoholes,
pueden ser utilizados para la producción de alcoxilatos utilizables.
Por lo tanto, son particularmente útiles los etoxilatos de
alcoholes primarios que contienen radicales lineales dodecilo,
tetradecilo, hexadecilo u octadecilo y mezclas de los mismos.
Además, también pueden ser utilizados los productos de etoxilación
y/o propoxilación correspondientes de alquil aminas, dioles
vecinales y amidas de ácido carboxílico, que corresponden a los
alcoholes mencionados respecto al componente alquilo, y de fenoles
de alquilo que contienen de 5 a 12 átomos de carbono en el
componente alquilo.
Los agentes tensoactivos aniónicos adecuados son
en particular aquellos del tipo sulfato o sulfonato, aunque se
pueden utilizar también otros tipos, tales como jabones,
N-acil sarcosinatos de cadena larga, sales de
cianamidas de ácido graso o sales de éteres de ácidos carboxílicos,
que se pueden obtener a partir de alquilo de cadena larga, o de
alquil fenil poliglicol éteres y ácido cloroacético. Los agentes
tensoactivos aniónicos se utilizan preferiblemente en la forma de
sales de sodio. Los agentes tensoactivos están presente
preferiblemente en cantidades del 2% en peso hasta el 30% en peso y
más preferiblemente en cantidades del 5% en peso hasta el 20% en
peso.
Los agentes tensoactivos particularmente
adecuados del tipo sulfato son los monoésteres de ácido sulfúrico
de alcoholes primarios de cadena larga de origen natural y sintético
que contienen de 10 a 20 átomos de carbono, esto es, los
monoésteres de ácido sulfúrico de alcoholes grasos tales como, por
ejemplo, alcoholes de ácido graso de coco, alcoholes grasos de
sebo, alcohol oleico o los oxoalcoholes C_{10-20}
y aquellos de alcoholes secundarios de la misma longitud de cadena.
Son particularmente adecuados los monoésteres de ácido sulfúrico de
alcoholes alifáticos primarios, de alcoholes secundarios y de
fenoles de alquilo etoxilados con 1 a 6 moles de óxido de etileno.
Las alcanolamidas sulfatadas de ácido graso y los monoglicéridos
sulfatados de ácido graso también son adecuados.
Los agentes tensoactivos del tipo sulfonato son
principalmente los sulfonatos de alquilbenceno que contienen grupos
alquilo C_{9-15}, los monoésteres y diésteres del
ácido sulfosuccínico que contienen de 6 a 22 átomos de carbono en
los componentes del alcohol y los ésteres de ácidos
\alpha-sulfograsos, por ejemplo los ésteres de
metilo o de etilo \alpha-sulfonados del aceite
hidrogenado de coco, aceite de almendra de palma o ácidos grasos de
sebo. Otros agentes tensoactivos adecuados del tipo sulfonato son
los sulfonatos de alcano obtenibles a partir de alcanos
C_{12-18} por medio de sulfocloración o
sulfoxidación y posterior hidrólisis o neutralización o por medio
de la adición de bisulfito sobre olefinas y también sulfonatos de
olefina, esto es, mezclas de alqueno e hidroxialcano sulfonatos y
también disulfonatos que se obtienen, por ejemplo, a partir de
monoolefinas de cadena larga con un doble enlace interno o terminal
por medio de sulfonación con trióxido de azufre gaseoso y posterior
hidrólisis ácida o alcalina de los productos de sulfonación.
Los agentes de blanqueo se seleccionan
adecuadamente del tipo que contienen peroxígeno, tal como el
peróxido de hidrógeno, perborato alcalino, percarbonato alcalino,
persilicato alcalino y/o persulfato alcalino. Particularmente
adecuados son el monohidrato de perborato de sodio y el percarbonato
de sodio. Los agentes de blanqueo pueden estar presentes en
cantidades del 5% en peso hasta 25% en peso, más particularmente del
7% en peso hasta el 20% en peso.
Los compuestos activadores para blanqueo
incluyen en particular compuestos N- u O-acilo, por
ejemplo diaminas alquilén poliaciladas, más particularmente
tetraacetil etilén diamina, triazinas N-aciladas,
más particularmente
1,5-diacetil-2,4-dioxo-hexahidro-1,3,5-triazina,
glicolurilos acilados, más particularmente tetraacetil glicolurilo,
hidantoinas N-acetiladas, hidrazidas, triazoles,
urazoles, dicetopiperazinas, sulfuril amidas y cianuratos, también
anhídridos carboxílicos, más particularmente anhídrido ftálico,
ésteres de ácido carboxílico, más particularmente isononanoiloxi
benceno sulfonato de sodio, y derivados acilados de azúcar, más
particularmente pentaacetil glucosa. El activador del blanqueador
puede ser recubierto en la forma usual con sustancias que forman
cubiertas o pueden ser granulados, utilizando opcionalmente
auxiliares de granulación, y si se desea puede contener otros
aditivos, por ejemplo colorante. Se utiliza preferiblemente un
activador para blanqueo que forma ácidos peroxicarboxílicos con 2 a
12 átomos de carbono, en particular ácido peroxoacético, bajo las
condiciones de lavado. Un activador para blanqueo particularmente
útil es la tetraacetil etilén diamina (TAED) granulada con
carboximetil celulosa con un tamaño promedio de partícula de 0,01 mm
a 0,8 mm, que se puede producir por medio del proceso descrito en
la patente europea EP-B-0 037 026.
Además de los activadores para blanqueo anteriormente mencionados o
inclusive substituyéndolos, se pueden utilizar los así llamados
catalizadores para blanqueo, que son complejos con metales de
transición.
Las enzimas que pueden estar presentes en los
detergentes, además de la celulasa de acuerdo con la definición,
son proteasas, lipasas, cutinasas, amilasas, pululanasas, otras
celulasas, hemicelulasas, xilanasas, oxidasas y/o peroxidasas.
Ellas pueden estar presentes en cantidades hasta del 5% en peso,
convenientemente 0,2% en peso hasta 2% en peso.
Las composiciones detergentes se pueden formular
en cualquier forma conveniente por ejemplo como un polvo o un
líquido. Para la producción de detergentes con una densidad aparente
alta por ejemplo de 650 g/l hasta 950 g/l, es adecuado un método
que utiliza una etapa de extrusión, como se describe en la patente
europea EP-B-0 486 592.
Las composiciones para reblandecimiento de telas
que contienen la celulasa proveída por la invención pueden contener
además de la celulasa, agentes tensoactivos catiónicos,
preferiblemente de los así llamados del tipo esterquat, que son
capaces de ablandar la tela y que pueden incrementar las propiedades
de reblandecimiento de la tela de las composiciones.
Se aplicaron dos métodos para el aislamiento de
los microorganismos que producen celulasa:
- 1)
- se suspendieron las muestras de suelo y de agua en solución salina al 0,85% y se las utilizó directamente en el ensayo de difusión en agar-carboximetil celulosa (CMC) para la detección de las colonias que producen celulasa.
- 2)
- Se enriquecieron las muestras de suelo y agua para las cepas que contienen celulasa por medio de la incubación en un medio líquido mínimo que contiene celulosa o en medio GAM durante 1 a 3 días a 40ºC. Los cultivos que mostraron crecimiento bacterial fueron analizados por la actividad de la celulasa utilizando el ensayo de difusión en agar-CMC para la detección de las colonias que producen celulasa.
Las cepas que mostraron zonas de aclaración en
el ensayo de difusión en agar se fermentaron en 25 mililitros de
medio GAM en frascos de agitación de 100 mililitros en un Incubator
Shaker (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA), a 250 rpm y
40ºC durante 72 horas. Se determinó la actividad CMCase en el caldo
de cultivo a pH 9 y 40ºC.
Las bibliotecas genómicas del gen de las cepas
tolerantes al medio alcalino que producen celulasa fueron
construidas en el plásmido pTZ18R (Mead, D.A., y colaboradores,
(1986) Protein Engineering 1, 67). Los clones recombinantes fueron
seleccionados por medio de difusión en agar sobre CMCagar como lo
describen Wood, P.J., y colaboradores. (1988) Methods in Enzymology
160, 59-74. Se aislaron las cepas que mostraron
zonas de aclaración alrededor de la colonia. La actividad CMCase
de las cepas recombinantes se determinó después de la fermentación
durante 48 horas a 30°C en medio 4*YEP. El AND plásmico de las
cepas recombinantes fue aislado y se caracterizaron los insertos
por medio del análisis con una enzima de restricción y el análisis
de la secuencia de nucleótidos.
El medio mínimo (pH 9,7) utilizado en el ensayo
de difusión en agar-CMC y el procedimiento de
enriquecimiento, consiste de KNO_{3} al 1%, extracto de Levadura
(Difco) al 0,1%, KH_{2}PO_{4} al 0,1%,
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O al 0,02%, Na_{2}CO_{3} al 1%, NaCl
al 4% y 0,25% de CMC (Sigma C-4888). Para la
solidificación se añadió agar al 1,5%.
El medio complejo (GAM) utilizado para la
producción de la enzima de las cepas donantes consistió de Peptona
(Difco) al 0,5%, extracto de levadura (Difco) al 0,5%,
Glucosa\cdotH_{2}O al 1%, KH_{2}PO_{4} al 0,1%,
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O al 0,02%, Na_{2}CO_{3} al 1%, NaCl
al 4%. Se ajustó el pH en 9,5 con HCl 4M después de lo cual se
añadió 1% de CMC.
El medio complejo (4*YEP) utilizado para la
producción de la enzima en cepas recombinantes de E. coli
consistió de extracto de levadura (Difco) al 4%, Peptona (Difco) al
8%, lactosa al 0,2%, 100 \mug/ml de ampicilina.
Las suspensiones celulares en una solución
salina al 0,85% fueron sembradas en placas sobre medio mínimo que
contenía CMC. Después de la incubación durante 1 a 3 días a 40ºC, se
sembraron nuevamente en placa replicas de las placas y se anegó la
placa original con Rojo Congo al 0,1% durante 15 minutos. Se
decoloraron las placas con NaCl 1 M durante 30 minutos. Se aislaron
las cepas que mostraron una zona de aclaración alrededor de la
colonia como microorganismos potenciales para la producción de
celulasas.
Se pipetearon alícuotas de 40 \mul de solución
enzimática o de caldo de fermentación en pozos perforados a partir
de una capa de 5 mm de medio mínimo en una caja de Petri. Después de
incubación durante 16 horas a 40ºC se detectó la actividad de la
celulasa por medio de tratamiento con Rojo Congo/NaCl. El diámetro
de la zona de aclaración es una medida para la actividad
CMCase.
Estos experimentos dieron como resultado el
aislamiento de un microorganismo productor de celulasa que fue
depositado después como CBS 670.93. El microorganismo se clasificó
como una nueva especie del género Bacillus. Los experimentos
de clonación con la cepa CBS 670.93 como cepa donante dieron como
resultado el aislamiento de un clon de E. coli que fue capaz
de producir una celulasa llamada BCE 103. Se analizó la secuencia de
nucleótidos del gen que codifica para dicha celulasa. A partir de
la celulasa BCE 103 se determinó la secuencia de aminoácidos
N-terminal utilizando métodos estándar para la
obtención y secuenciación de péptidos (Finlay & Geisow (Eds.),
Protein Sequencing - a practical approach, 1989, IRL Press). La
secuencia de aminoácidos de la celulasa se dedujo a partir de la
secuencia de nucleótidos, utilizando la secuencia de aminoácidos
N-terminal para el punto de partida de la proteína
madura.
La secuencia de nucleótidos para BCE 103 se
muestra en la SEQ ID No. 1 y la secuencia de aminoácidos se muestra
en la SEQ ID No. 2.
Después de la fermentación se separaron las
células del cultivo líquido por medio de centrifugación (8000 rpm).
Se precipitó la celulasa presente en el sobrenadante con sulfato de
amonio (65% de saturación). Se disolvió el precipitado en
amortiguador de fosfato 25 mM pH 7 + EDTA 5 mM hasta una
conductividad de 7 mS/cm. Se aplicó esta solución a una columna de
intercambio aniónico Q-Sefarosa FF (diámetro 5 cm,
longitud 10 cm), después de lo cual se lavó la columna con
amortiguador de fosfato 25 mM pH 7 + EDTA 5 mM hasta una
permeabilidad de 0,2 AU. Se aplicó un gradiente de 0 a 0,5 M de
NaCl en fosfato 25 mM pH 7 a la columna en 80 minutos seguido por
un gradiente de 0,5 a 1 M de NaCl en 10 minutos. Dependiendo de
cuál celulasa se aplicó a la columna, la elusión tuvo lugar en el
primero o en el segundo gradiente. Después de la elusión se limpió
la columna (en contracorriente) con NaOH 1 M y se la equilibró
nuevamente con fosfato 25 nM pH 7 + EDTA 5 nM. Dependiendo de la
elusión, la celulasa obtenida tenía una pureza aproximadamente hasta
del 80%.
Los análisis de la actividad de la celulasa
fueron llevados a cabo utilizando métodos modificados del método
PAHBAH (Lever M. Anal. Biochem. 1972, 47,
273-279 and Lever M. Anal. Biochem. 1977, 81,
21-27).
Se llena un tubo de ensayo con 250 \mul de CMC
al 2,5% en amortiguado de glicina 50 mM pH 9 (CMC de baja viscosidad
fue adquirido a Sigma) y las alícuotas de celulasa de 250 \mul se
diluyen en el amortiguador apropiado. El tubo de ensayo se incuba
durante 30 minutos a 40ºC en un baño de agua, después de lo cual se
añaden 1,5 ml de una solución PAHBAH preparada en forma fresca el
mismo día (1% de PAHBAH en 100 ml de NaOH 0,5 M con 100 \mul de
solución de bismuto (que contiene 48,5 g de nitrato de bismuto,
28,2 g de tartrato de sodio y potasio y 12,0 g de NaOH en 100 ml).
Se calienta la mezcla a 70ºC durante 10 minutos, después de lo cual
se la enfría sobre hielo durante 2 minutos. Se mide la absorción a
410 nm. Para eliminar la absorbancia de fondo de las muestras de la
enzima, se lleva a cabo un experimento de control como sigue: se
incuba un tubo con sustrato bajo las mismas condiciones que el tubo
del ensayo. Después de la incubación se añaden 1,5 ml de PAHBAH y la
preparación enzimática (en ese oren). Una unidad (U) se define como
la cantidad de enzima que produce 1 \mumol de glucosa a partir
del equivalente en CMC determinado como azucares reductores por
minuto por gramo de producto.
El amortiguador utilizado para la determinación
de los perfiles de pH/temperatura es un sistema fosfato/citrato.
Los perfiles de pH/temperatura se determinaron utilizando una
concentración fija de enzima que cuadra con el rango lineal del
perfil de respuesta a la dosis medido a pH 7 y 40ºC. Se utilizó esta
concentración de enzima para la medición de la actividad bajo todas
las otras condiciones determinadas.
Los resultados de la celulasa BCE 103 se
muestran el Figura 1. Esta celulasa muestra buena actividad en pH
alcalino, lo cual la hace adecuada para la aplicación en detergentes
con un pH alcalino.
Procedimientos similares empezando con la cepa
CBS 669.93 del bacilo alcalofílico resultaron en la celulasa BCE
113. Los resultados para esta celulasa BCE 113 se muestran en la
Figura 2. Esta celulasa también muestra buena actividad en pH
alcalino, lo cual la hace adecuada para la aplicación en detergentes
con un pH alcalino.
Como se describió para la evaluación de TSL, los
experimentos de lavado se llevaron a cabo utilizando como matriz
detergente un Detergente para Color sin blanqueador, sin perfume ni
enzimas (105 g de detergente por ciclo de lavado, pH 10,5), como
lavadora una del tipo Miele® W 717, temperatura 40ºC, programa
"Normalprogram", con agua de una dureza de 16º dH (dureza
alemana), carga de lavado 3,5 kg, 25 lavadas.
Se llevaron a cabo los experimentos utilizando
una composición de acuerdo con la invención (D1) así como
comparaciones (C1 a C3), en paralelo en máquinas idénticas:
- C1:
- matriz detergente sin celulasa
- C2:
- matriz detergente + 0,288 mg de endoglucanasa V de Humicola insolens
- C3:
- matriz detergente + mezcla de celulasa de Humicola insolens vendida como gránulos Celluzyme® 0,7T
- D1:
- matriz detergente + 0,288 mg de celulasa BCE 103
- D2:
- matriz detergente + 0,288 mg de celulasa BCE 113
| Composición | TSL |
| C1 | 0 |
| C2 | 100 |
| C3 | 38 |
| D1 | 12 |
Utilizando lavadores del tipo Miele® W 914, bajo
otras condiciones idénticas, se obtuvieron los siguientes
resultados:
| Composición | TSL |
| C1 | 0 |
| C2 | 100 |
| D2 | 0,6 |
\vskip1.000000\baselineskip
La evaluación de las propiedades antiformación
de bolitas se hizo con concentraciones crecientes de celulasas para
una mejor evaluación cuantitativa del efecto. Se utilizó un
detergente para color (5 g/l, 10 ciclos de lavado a 40ºC) con la
adición de celulasa como se muestra en la Tabla 3 sobre una camiseta
sudada de material de algodón "con formación de bolitas"
(lavada 25 veces a 60ºC con un detergente sin celulasa). La
evaluación de la formación de bolitas se hizo con el sistema óptico
de medición como se describió anteriormente; se asignó un grado de
formación de bolitas del 0% al material "con formación de
bolitas".
\vskip1.000000\baselineskip
| Concentración de enzima | Grado de formación de bolitas | AP [%] de BCE 103 | |
| EG V | BCE 103 | ||
| 25 \mug/ml | -12,8% | -8,4% | 65% |
| 37,5 \mug/ml | -16,0% | -9,6% | 59% |
| 50 \mug/ml | -22,8% | -15,6% | 68% |
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede calcular un AP promedio del 64% para la
celulasa BCE 103. La celulasa BCE 113 mostró un AP promedio del
100% bajo las mismas condiciones.
Utilizando los valores para TSL en las tablas 1
y 2, las proporciones de TSL a AP para las diferentes celulasas son
como se muestra en la Tabla 4 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
| Enzima | Relación |
| EG V | 1 |
| BCE 103 | \approx0,2 |
| BCE 113 | \approx0,02 |
Se incubaron 20 ml de suelo pigmentado al 0,5%
(preparado en forma fresca, diariamente y consistiendo de 86% de
caolín, 8% de hollín (Flammru\beta 101, obtenido de Degussa AG),
4% de óxido de hierro negro y 2% de óxido de hierro amarillo (de
Henkel Genthin GmbH)), en un detergente (Persil color® sin enzimas,
5 g/l, pH 8,5) bajo condiciones de agitación (90 rpm) con una tela
blanca de algodón (prelavada, 5 cm de diámetro, obtenida con
Windelbleiche, Krefeld). Se añadió celulosa hasta un concentración
final de 1 mU/ml. Se incubó la mezcla durante 30 minutos a 40ºC, 90
rpm. Como control se llevó a acabo la misma incubación sin la
adición de celulosa. Después de la incubación se enjuagó la tela
completamente con agua fría corriente. Después de secar se midió la
blancura de la tela por medio de remisión (4 mediciones por tela)
utilizando un colorímetro Micro coluor Dr. Lange®. Se restó el
valor de control del valor de la muestra. Los resultados, expresados
como delta REM, se muestran en la Tabla 5.
Se incubó una almohadilla de lana de algodón
(100% algodón, Warenhandels GmbH, Buchholz, Marke Olivia, Selling
agency: Aldi) en 40 ml de licor de lavado (Persil color® sin enzima,
5 g/l pH 8,5), se añadió celulasa hasta una concentración final de
1 mU/ml en un frasco sellado y se incubó durante 20 horas a 40ºC
con agitación (90 rpm). Después de la incubación, se monitoreó el
daño de la fibra por medio de la medición de la cantidad de los
azucares reductores en solución, utilizando el método PAHBAH
descrito en el Ejemplo 1. Como control se llevó a cabo la misma
incubación sin la adición de celulasa. Los resultados se muestran en
la Tabla 5.
Se cortó una tela blanca de algodón
(Windelbleiche, Bielefeld) prelavada con Persil® alemán sin enzimas
a 60°C, en redondo con un diámetro de 9 cm (aprox. 0,920 gramos).
Se incubó una muestra de algodón en 50 ml de amortiguador
glicina-NaOH 50 mM pH 9 que incluía 0,1% de SDS y 1
ml de muestra de celulasa (600 mU/ml) durante 60 minutos a 30°C. Se
tomaron muestras de 2 ml a T=0 y a T=60 minutos y se las diluyó
directamente (1:2) con amortiguador MES 50 mM pH 6,5 y se las
incubó a 4°C hasta la medición. Como control se llevó a cabo la
misma incubación sin la adición de textil de algodón. La medición de
la actividad se determinó con un método PAHBAH como se describe en
el Ejemplo 3, pero con un pH 6,5 en amortiguador MES 50 mM. La
adsorción se expresó como adsorción relativa donde se estableció
que la actividad aplicada al inicio del experimento era del 100%,
T=0. 100% del valor de la actividad - la actividad restante (%) =
adsorción (%). Los resultados se muestran en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
| Enzima | Antiredeposición [delta REM] | Daño de la Fibra [mU] | Adsorción [%] |
| BCE 103 | 5,0 | 0,025 | 7 |
| KAC® ^{a)} | 7,5 | 0,006 | 0 |
| EG V | 1,2 | 0,155 | 36 |
| a): Celulasa de Kao Corporation |
\vskip1.000000\baselineskip
La celulasa BCE 113 se desempeñó en estos
ensayos al menos tan bien como la celulasa BCE 103.
El reblandecimiento de las telas tratadas como
en el Ejemplo 3, pero después de 15 ciclos de lavado, fue
clasificado por un panel de expertos (5 personas) quienes
adjudicaron grados entre 0 (tela lavada 25 veces con un detergente
sin celulasa) y 6 (tela antes de cualquier lavado) palpando las
telas. Se utilizaron composiciones como las definidas en el Ejemplo
2 en los lavados. Los valores promedio se dan en la Tabla 6. Se
puede observar que las composiciones de acuerdo con la invención
mostraron el mejor desempeño.
| Composición | Relación |
| C1 | 0 |
| C2 | 2,1 |
| C3 | 1,5 |
| D1 | 2,3 |
| D2 | 2,2 |
La Figura 1 muestra la actividad relativa de la
celulasa BCE 103. En el Ejemplo 1 esta figura hace referencia a
los perfiles de pH/temperatura. Todas las actividades tanto a 40
como a 60ºC están relacionadas con la actividad más alta que se
fijó en 100%.
La Figura 2 muestra las actividades relativas de
la celulasa BCE 113.
La Figura 3 muestra la secuencia de ADN (SEQ ID
No. 1) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID No. 2) de la
celulasa de 50 kD derivada de CBS 670.93 con la secuencia del
péptido líder sombreada, la cual por secreción se escinde para
producir la enzima madura.
La Figura 4 muestra la secuencia de ADN (SEQ ID
No. 3) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID No. 4) de la
celulasa de 63 kD derivada de CBS 669.93 con la secuencia del
péptido líder subrayada, la cual por secreción se escinde para
producir la enzima madura.
<110> Henkel Kommanditgesellschaft auf
Aktien
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Detergentes que contienen
celulasas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> H 1920-1 EP
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP95201115.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1995-04-28
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US614115
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1996-03-12
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/EP96/01755
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1996-04-26
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP96914993.9
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1996-04-26
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1404
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus sp. CBS 670.93
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1404)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido _ señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(78)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido _ maduro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (79)..(1404)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 467
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus sp. CBS 670.93
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1725
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus sp. CBS 669.93
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1725)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(78)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_maduro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (79)..(1725)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 574
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus sp. CBS 669.93
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (6)
1. Método para proveer celulasas
sencillas para aplicaciones detergentes, caracterizado por
las etapas de
- (a)
- aislamiento de microorganismos tolerantes a condiciones alcalinas productores de celulasa que se pueden obtener a partir de muestras de agua o de suelo de un ambiente alcalino,
- (b)
- purificación de las celulasas de estas cepas,
- (c)
- determinación de la perdida de resistencia a la tensión (TSL) durante el proceso de lavado,
- (d)
- determinación de las propiedades que evitan la formación de bolitas (AP) durante el proceso de lavado, y
- (e)
- escogencia de las celulasas con una relación de pérdida de resistencia a la tensión (TSL) con respecto a las propiedades que evitan la formación de bolitas (AP) por debajo de 1.
2. Método de acuerdo a la reivindicación
1, comenzando con la muestra de agua a partir de un ambiente
alcalino.
3. Método de acuerdo a la reivindicación
1, comenzando con la muestra de suelo a partir de un ambiente
alcalino.
4. Método de acuerdo a una de las
reivindicaciones 1 a 3, con las muestras enriquecidas por cepas que
contienen celulasa por medio de incubación en un medio líquido
mínimo que contiene celulosa o en un medio con GAM durante 1 a 3
días a 40ºC.
5. Método de acuerdo a una de las
reivindicaciones 1 a 4, escogiendo las celulasas con una relación
de perdida de resistencia a la tensión (TSL) con respecto a las
propiedades antiformación de bolitas (AP) por debajo de 0,8.
6. Método de acuerdo a la reivindicación
5, escogiendo las celulasas con una relación de perdida de
resistencia a la tensión (TSL) con respecto a las propiedades
antiformación de bolitas (AP) en el rango desde 0,001 hasta
0,5.
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