DE69829966T2

DE69829966T2 - Ein monoether von probucol und methoden zur hemmung der vcam-1 expression

Info

Publication number: DE69829966T2
Application number: DE69829966T
Authority: DE
Inventors: K. Patricia SOMERS; K. Lee HOONG; Q. Charles MENG
Original assignee: Atherogenics Inc
Current assignee: Atherogenics Inc
Priority date: 1997-05-14
Filing date: 1998-05-14
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2018-05-15
Also published as: NO995544L; AU7571198A; NO20032254D0; CA2289851C; KR100919883B1; IL132797A0; JP2006232848A; CZ301302B6; DE69837295D1; KR20070008725A; US6617352B2; CN1496740A; IL164568A; ATE294158T1; CZ301313B6; KR20070007207A; DK0981343T3; HU226611B1; NO316221B1; PL194329B1

Description

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Verbindungen und Zusammensetzungen für die Behandlung von Krankheiten, die durch VCAM-1 vermittelt werden, einschließlich Kardiovaskular- und Entzündungskrankheiten.
Hintergrund der Erfindung
Koronare Herzkrankheit (CHD) bleibt die vorwiegende Todesursache in den Industrieländern. Der Hauptgrund von CHD ist Arteriosklerose, eine Krankheit, die gekennzeichnet ist durch die Ablagerung von Lipiden in der arteriellen Gefäßwand, was zu einer Verschmälerung der Gefäßdurchgänge und letztlich zur Verhärtung des vaskulären Systems führt.
Arteriosklerose wie in ihrer klinischen Hauptkomplikation manifestiert, der isochemischen Herzkrankheit, bleibt weiter eine Haupttodesursache in den Industrieländern. Man akzeptiert wohl nun, dass Arteriosklerose mit einer lokalen Verletzung des arteriellen Endothels, gefolgt von Proliferation von arteriellen glatten Muskelzellen aus der mediale Schicht hin zur intimate Schicht zusammen mit der Abscheidung von Lipid und Ansammlung von Schaumzellen in der Läsion. Wenn sich der arteriosklerotische Plaque entwickelt, verstopft er fortschreitend mehr und mehr die beeinträchtigten Blutgefäße und kann gegebenenfalls zu Ischämie oder Infarkt führen. Daher ist es wünschenswert, Verfahren zum Inhibieren des Fortschreitens von Arteriosklerose in Patienten zu liefern, die dessen bedürfen.
Kardiovaskuläre Krankheit ist mit verschiedenen Faktoren der Verursachung in Zusammenhang gebracht worden, welche Hypercholesterinämie, Hyperlipidämie und Expression von VCAM-1 in vaskulären Endothelzellen einschließen.
Expression von VCAM-1
Adhäsion von Leukozyten an das Endothel stellt ein fundamentales frühes Ereignis in einer großen Vielzahl von Entzündungszuständen dar, einschließlich Arteriosklerose, Autoimmunstörungen und bakteriellen und viralen Infektionen. Leukozytenrekrutierung an das Endothel wird begonnen, wenn induzierbare Adhäsions-Molekülrezeptoren an der Oberfläche der Endothelzellen mit Gegenrezeptoren an Immunzellen wechselwirken. Vaskuläre Endothelzellen bestimmen, welcher Typ von Leukozyten (Monozyten, Lymphozyten oder Neutrophile) durch selektive Expression spezifischer Adhäsionsmoleküle rekrutiert werden wie vaskuläres Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1), intrazelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) und E-Selectin. Im frühesten Stadium der arteriosklerotischen Läsion ist endotheliale Expression von VCAM-1 lokalisiert und selektives Rekrutieren von mononuklearen Leukozyten, welche den Integrin-Gegenrezeptor VLA-4 exprimieren. Aufgrund der selektiven Expression von VLA-4 an Monozyten und Lymphozyten, aber nicht neutrophilen, ist VCAM-1 wichtig beim Vermitteln der selektiven Adhäsion an mononuklearen Leukozyten. Anschließende Umwandlung von Leukozyten zu schaumigen Makrophagen führt zur Synthese einer großen Vielzahl von Entzündungscytokinen, Wachstumsfaktoren und Stimulantien, welche helfen, den Leukozyten und Blutplättchen-Rekrutierung, glatte Muskelzellproliferation, endotheliale Zellaktivierung und extrazelluläre Matrixsynthese, gekennzeichnet durch Reifen von arteriosklerotischem Plaque zu fördern.
VCAM-1 ist ein Mediator bei chronischen Entzündungsstörungen wie Asthma, rheumatoider Arthritis und Autoimmundiabetes. Zum Beispiel ist es bekannt, dass die Expression von VCAM-1 und ICAM-1 in Asthma verstärkt ist. Pilewski, J.M., et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12, 1-3 (1995); Ohkawara, Y., et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12, 4-12 (1995). Die Blockierung der Integrinrezeptoren für VCAM-1 und ICAM-1 (VLA-4 und LFA-1, jeweils) unterdrückte Antworten sowohl früher als auch später Phasen in einem ovalbumin-sensitivierten Rattenmodell von allergischen Atemwegsantworten. Rabb, 11. A., et a., Am. J. Respir. Care Med. 149, 1186-1191 (1994). Es gibt auch eine verstärkte Expression von endothelialen Adhäsionsmolekülen, einschließlich VCAM-1 in der Mikrovaskulatur von rheumatoidem Synovium bzw. rheumatoider Gelenksinnenhaut. Koch, A.E. et al., Lab. Invest. 64, 313-322 (1991); Morales- Ducret, J. et al., Immunol. 149, 1421-1431 (1992). Die Neutralisierung von Antikörpern, gegen VCAM-1 oder seinen Gegenrezeptor, VLA-4, kann den Ausbruch von Diabetes in einem Mausmodell (NOD Maus) verzögern, welches die Krankheit spontan entwickelt. Yang, X.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 10494-10498 (1993); Burkly, L.C. et al., Diabetes 43, 523-534 (1994); Baron, J.L. et al., J. Clin. Invest. 93, 1700-1708 (1994). Monoklonale Antikörper von VCAM-1 können auch zuträgliche Wirkungen in Tiermodellen von Allograftabstoßung aufweisen, was nahe legt, dass die Inhibitoren von VCAM-1-Expression Verwendung beim Verhindern von Transplantatabstoßung haben können. Oroez, C.G. et al., Immunol. Lett. 32, 7-12 (1992).
VCAM-1 wird exprimiert durch Zellen sowohl als eine membrangebundene Form als auch als eine lösliche Form. Von der löslichen Form von VCAM-1 zeigte man, dass sie Chemotaxis vaskulärer Endothelzellen in vitro induziert und eine angiogene Antwort im Rattencornea. Koch, A.F. et al., Nature 376, 517-519 (1995). Inhibitoren der Expression von löslichem VCAM-1 haben potenziellen therapeutischen Wert bei der Behandlung von Krankheiten mit einer starken angiogenen Komponente, einschließlich Tumorwachstum und Metastase. Folkman, J. und Shing, Y., Biol. Chem. 10931-10934 (1992).
VCAM-1 wird exprimiert in kultivierten menschlichen vaskulären Endothelzellen nach Aktivierung durch Lipopolysaccharin (LPS) und Cytokinen wie Interleukin-1 (IL-1) und Tumornekrosefaktor (TNF-α). Diese Faktoren sind nicht selektiv für die Aktivierung von Zelladhäsionsmolekülexpression.
US-Patent Nr. 5,380,747 auf Medford et al. lehrt die Verwendung von Dithiocarbamaten wie Pyrrolidindithiocarbamat die Behandlung von kardiovaskulären und anderen Entzündungskrankheiten.
US-Patent Nr. 5,750,351 auf Medford et al. und WO93/30415 auf die Emory Universität beschreiben die Entdeckung, dass polyungesättigte Fettsäuren ("PUFAs") und deren Hydroperoxide ("ox-PUFAs"), welche wichtige Komponenten von oxidativ modifiziertem Niedrigdichte-Lipoprotein (LDL) sind, die Expression von VCAM-1, aber nicht von intrazellulärem Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) oder E-Selectin in menschlichen Aortaendothelzellen durch einen Mechanismus induzieren, welcher nicht durch Cytokine oder andere Nicht-Cytokin-Signale vermittelt wird. Dies ist eine fundamentale Entdeckung und ein wichtiger, vorher unbekannter biologischer Stoffwechselweg in VCAM-1-vermittelten Immunantworten.
Als nicht begrenzende Beispiele induzieren Linolsäure, Linolensäure, Arachidonsäure, Linoleylhydroperoxid (13-HPODE) und Arachidonhydroperoxid (15-HPETE) Zelloberflächengenexpression von VCAM-1, aber nicht ICAM-1 oder E-Selectin. Gesättigte Fettsäuren (wie Stearinsäure) oder monoungesättigte Fettsäuren (wie Oleinsäure) induzieren nicht die Expression von VCAM-1, ICAM-1 oder E-Selectin.
Bei der Induktion von VCAM-1 durch PUFAs und deren Fettsäurehydroperoxiden wird unterdrückt durch Dithiocarbamate, einschließlich Pyrrolidindithiocarbamate (PDTC). Dies zeigt an, dass die Induktion durch ein oxidiertes Signalmolekül vermittelt wird und dass die Induktion verhindert wird, wenn die Oxidation des Moleküls blockiert ist (das heißt, die Oxidation tritt nicht auf), umgekehrt ist (das heißt, das Signalmolekül ist reduziert) oder wenn das redoxmodifizierte Signal andernfalls vom Wechselwirken mit seinem regulatorischen Ziel gehindert ist.
Zellen, die chronisch gegenüber höheren als normalen Gehalten von polyungesättigten Fettsäuren oder deren oxidierten Gegenstücken exponiert werden können eine Immunantwort initiieren, die nicht normal ist und welche gegenüber der vorliegenden Bedrohung überverhältnismäßig ist und zu einem Krankheitszustand führt. Die Übersensitivierung von vaskulären Endothelzellen gegenüber PUFAs und ox-PUFAs können die Bildung von zum Beispiel arteriosklerotischem Plaque beschleunigen.
Basierend auf diesen Entdeckungen wurde ein Verfahren zur Behandlung von Arteriosklerose, postangioplastischer Restenose, koronaren Gefäßerkrankungen, Angina, Mikroangiopathie und anderen kardiovaskulären Erkrankungen sowie nicht-kardiovaskulären Entzündungskrankheiten, die durch VCAM-1 vermittelt werden, beschrieben in WO95/30415, welches die Entfernung, Konzentrationsverminderung oder Vorbeugung der Bildung von oxidierten polyungesättigten Fettsäuren umfasst, einschließend, aber nicht begrenzt auf oxidierte Linol- (C₁₈ Δ^9,12), Linolen- (C₁₈ Δ ^6,9,12), Arachidon- (C₂₀ Δ ^5,8,11,14) und Eikosatriensäuren (C₂₀ Δ ^8,11,14).
Nicht begrenzende Beispiele von nicht-kardiovasklären Entzündungskrankheiten, die vermittelt werden durch VCAM-1, schließen Rheuma, Osteoarthritis, Asthma, Dermatitis und Multiple Sklerose ein.
Hypercholesterinämie und Hyperlipidämie
Hypercholesterinämie ist ein bedeutender Risikofaktor, verbunden mit kardiovaskulärer Krankheit. Serumlipoproteine sind die Träger von Lipiden im Kreislauf. Lipoproteine werden gemäß deren Dichte klassifiziert: Chylomikrone, Lipoproteine sehr niedriger Dichte (VLDL), Lipoproteine niedriger Dichte (LDL) und Lipoproteine hoher Dichte (HDL). Chylomikrone nehmen vorwiegend beim Transport von Nahrungstriglyceriden und Cholesterin aus dem Darm zum Fettgewebe und Leber teil. VLDL liefern endogen synthetisierte Triglyceride aus der Leber an Fettgewebe oder an andere Gewebe. LDL transportiert Cholesterin zu Periphergeweben und regulieren endogene Cholesteringehalte in solchen Geweben. HDL transportiert Cholesterin aus peripheren Geweben zur Leber. Arterienwandcholesterin wird fast ausschließlich aus LDL abgeleitet. Brown und Guldstein, Ann. Rev. Biochem. 52, 223 (1983); Miller, Ann. Rev. Med. 31, 97 (1980). In Patienten mit geringen Gehalten an LDL ist die Entwicklung von Arteriosklerose gering.
Steinberg et al., (N. Eng. J. Med. 1989; 320:915-924) stellten die Hypothese auf, dass Modifikation von Niedrigdichte-Lipoproteinen (LDL) in oxidativ modifiziertes LDL (ox-LDL) durch reaktive Sauerstoffspezies das Zentralereignis ist, welches Arteriosklerose startet und verbreitet. Oxidiertes LDL ist eine komplexe Struktur, die aus wenigstens mehreren chemisch verschiedenen oxidierten Materialien besteht, von denen jedes alleine oder in Kombination Cytokin-aktiverte Adhäsionsmolekülgenexpression modulieren kann. R-Fettsäure-Hydroperoxide wie Linoleylhydroperoxid (13-HPODE) werden von freien Fettsäuren durch Lipoxygenasen erzeugt und sind ein wichtiger Bestandteil von oxidiertem LDL.
Man hat vorgeschlagen, dass eine Erzeugung von oxidierten Lipiden gebildet wird durch die Wirkung des Zelllipoxygenasesystems und dass die oxidierten Lipide anschließend zu LDL überführt werden. Es gibt danach eine Vermehrungsreaktion innerhalb der LDL in dem Medium, katalysiert durch Übergangsmetalle und/oder Sulfohydrylverbindungen. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass Fettsäuremodifikation von kultivierten Endothelzellen deren Neigung verändern können, oxidativer Verletzung zu unterliegen, wohingegen die Ergänzung mit polyungesättigten Fettsäuren (PUFA) die Neigung zu oxidativer Verletzung verstärkt. Die Ergänzung von gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren bei kultivierten Endothelzellen vermindert deren Neigung zu oxidativer Verletzung, wohingegen die Ergänzung mit polyungesättigten Fettsäuren (PUFA) die Neigung zu oxidativer Verletzung verstärkt.
Unter Verwendung von HPLC-Analyse mit umgekehrten Phasen (reverse Phase HPLC) von nativen oder verseiften Flüssigextrakten von LDL zeigte man, dass 13-HPODE die vorwiegende oxidierte Fettsäure in LDL ist, oxidiert durch aktivierte menschliche Monozyten. Chronisches Aussetzen gegenüber oxidiertem LDL ergibt ein oxidatives Signal an vaskuläre Endothelzellen, möglicherweise ein spezifisches Fettsäurehydroperoxid, das selektiv Cytokin-induzierte VCAM-1-Genexpression verstärkt.
Durch einen Mechanismus, der nicht wohldefiniert ist, beschlagnahmen Bereiche von Gefäßwänden, die für Arteriosklerose prädisponiert sind, bevorzugt zirkulierendes LDL. Über einen wenig verstandenen Stoffwechselweg wandeln Endothel-, Glattmuskel- und/oder Entzündungszellen dann LDL in oxidative LDL um. Im Gegensatz zu LDL, welches durch den LDL-Rezeptor aufgenommen wird, nehmen Monozyten begierig ox-LDL durch einen „Aufkehr"-Rezeptor auf, dessen Expression anders als der LDL-Rezeptor, nicht inhibiert wird, wenn der intrazelluläre Lipidgehalt ansteigt. Daher fahren Monozyten fort, ox-LDL aufzunehmen und werden zu mit Lipiden vollgesaugten Makrophagen-Schaumzellen, welche die Fettschliere bildet.
Es gibt nun sehr viele Beweise, die demonstrieren, dass Hypercholesterinämie ein wichtiger Risikofaktor ist, der mit Herzkrankheit verbunden ist. Zum Beispiel folgerte im Dezember 1984 ein Konferenzgremium des National Institute of Health Consensus Development Conference Panel, dass die Erniedrigung eindeutig erhöhter Blutcholesterin-Pegel (spezifisch Blutspiegel mit Niedrigdichte-Cholesterinlipoprotein) das Risiko von Herzinfarkten aufgrund von koronarer Herzkrankheit vermindern wird.
Typischerweise wird Cholesterin im Blut von warmblütigen Tieren in bestimmten Lipid-Proteinkomplexen transportiert wie Chylomikronen, Lipoproteinen sehr niedriger Dichte (VLDL), Lipoprotein niedriger Dichte (LDL) und Lipoprotein hoher Dichte (HDL). Es ist weitgehend akzeptiert, dass LDL in einer Weise wirkt, die direkt zur Abscheidung des LDL-Cholesterins an der Blutgefäßwand führt und das HDL in einer Weise wirkt, welche zur HDL-Aufnahme von Cholesterin von der Gefäßwand und seinem Transport zur Leber führt, wo es metabolisiert wird [Brown und Goldstein, Ann. Rev. Biochem. 52, 223 (1983); Miller, Ann.Rev.Med. 31, 97 (1980)]. In verschiedenen epidemiologischen Studien korrelierten zum Beispiel die LDL-Cholesterin-Gehalte gut mit dem Risiko koronarer Herzkrankheit, wohingegen die HDL-Cholesteringehalte umgekehrt mit koronaren Herzkrankheit verbunden sind (Patton et al., Clin. Chem. 29, 1980 (1983)]. Von Fachleuten ist es allgemein akzeptiert, dass die Verminderung abnormal hoher LDL-Cholesteringehalte eine effiziente Therapie nicht nur bei der Behandlung von Hypercholesterinämie, sondern auch bei der Behandlung von Arteriosklerose ist.
Weiterhin gibt es Beweise, basierend auf Tier- und Laborergebnissen, dass die Peroxidierung von LDL-Lipid wie ungesättigten Fettsäureteilen von LDL-Cholesterinestern und Phospholipiden die Ansammlung von Cholesterin in Monozyten/Makrophagen erleichtert, welche gegebenenfalls zu Schaumzellen umgewandelt werden und im Subendothelialraum der Gefäßwand abgeschieden werden. Die Ansammlung von Schaumzellen in der Gefäßwand wird als ein früheres Ereignis bei der Bildung eines arteriosklerotischen Plaques erkannt. Man vermutet daher, dass die Peroxidierung von LDL-Lipid eine wichtige Voraussetzung für erleichterte Ansammlung von Cholesterin an der Gefäßwand ist und die nachfolgende Bildung eines arteriosklerotischen Plaques. Zum Beispiel hat man gezeigt, dass diese Monozyten/Makrophagen natives LDL bei relativ niedrigen Geschwindigkeiten und ohne merkliche Ansammlung von Cholesterin aufnehmen und abbauen. Im Gegensatz dazu wird oxidiertes LDL von diesen Monozyten /Makrophagen bei sehr viel höheren Geschwindigkeiten und mit merklicher Ansammlung von Cholesterin aufgenommen [Parthasarathy et al., J. Clin. Invest, 77,641 (1986)]. Es ist daher wünschenswert, Verfahren zum Inhibieren von LDL-Lipid-Peroxidierung in einem Patienten bereitzustellen, der dieser bedarf.
Erhöhte Cholesteringehalte sind verbunden mit einer Anzahl von Krankheitsstadien, einschließlich Restenose, Angina, cerebrale Atheriosklerose und Xanthom. Es ist wünschenswert, ein Verfahren zum Verminderung von Plasmacholesterin in Patienten mit oder bei Risiko des Entwickelns von Restenose, Angina, cerebraler Arteriosklerose, Xanthom und anderen Krankheitszuständen bereitzustellen, die mit erhöhten Cholesteringehalten verbunden sind.
Da man bestimmt hat, dass Hypercholesterinämie erhöhten LDL (Hyperlipidämie) zuzuschreiben ist, wird die Erniedrigung von LDL gehalten durch Diättherapie versucht. Es gibt mehrere Medikamentenklassen, die man gewöhnlich verwendet, um LDL-Gehalte zu erniedrigen, einschließlich Gallensäureauffängern, Nikotinsäure (Niacin) und 3-Hydroxy-3-Methylglutarylcoenzym-A-Reduktase-Inhibitoren (HMG CoA). Man verwendet manchmal Probucol und die Fibratderivate als Zusatztherapie, gewöhnlich in Kombination mit anderen Medikationen. Die HMG CoA-Reduktase-Inhibitoren sind Statine oder Vastatine genannt worden. Statine sind unter den effizientesten Reagenzien, die derzeit auf dem Markt für Hypercholesterinämie sind und schließen ein Pravastatin (Pravchol, Bristol Myers Squibb), Atorvastatin (Warner Lambert/Pfizer), Simvastatin (Zcor, Merck), Lovastatin (Mevacr, Merck) und Fluvastatin (Lescol).
Beweise schlagen vor, dass atherogene Wirkungen von Lipoprotein niedriger Dichte (LDL) teilweise durch oxidative Modifikation vermittelt werden können. Von Probucol zeigte man, dass es mächtige Antioxidationseigenschaften hat und die oxidative Modifikation von LDL blockiert. Konsistent mit diesen Befunden zeigte man, dass Probucol tatsächlich das Fortschreiten von Atheriosklerose in LDL-Rezeptordefizienten Kaninchen verlangsamt wie diskutiert in Carew et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7725-7729 (1987). Am wahrscheinlichsten ist Probucol wirksam aufgrund seiner hohen Lipidlöslichkeit und wird durch Lipoproteine transportiert, was daher zu ihrem Schutz gegen oxidative Beschädigung führt.
Probucol ist chemisch verwandt mit den weit verwendeten Nahrungszusätzen 2,[3]-Tert-Butyl-4-Hydroxyanisol (BHA) und 2,6-di-Tert-Butyl-4-Methylphenol (BHT). Sein vollständiger chemischer Name ist 4,4'-(Isopropylidendithio)-bis-(2,6-di-Tert-Butylphenol).
Man verwendet Probucol vorwiegend, um Serumcholesteringehalte in Nypercholesterinämie-Patienten zu erniedrigen. Man verabreicht Probucol gewöhnlich in Form von Tabletten, die unter der Marke Lorelco^TM erhältlich sind. Unglücklicherweise ist Probucol nahezu unlöslich in Wasser und kann daher nicht intravenös injiziert werden. Tatsächlich ist Probucol schwierig für Zellen in vitro zu absorbieren aufgrund seiner schwachen Mischbarkeit und in Puffern oder Medium für Zellkultur. Festes Probucol wird schwach in das Blut absorbiert und es wird exkretiert in im Wesentlichen unveränderter Form. Weiterhin wird die Tablettenform von Probucol bei signifikant unterschiedlichen Geschwindigkeiten und unterschiedlichen Mengen durch verschiedene Patienten absorbiert. In einer Studie (Heeg et al., Plasma Levels of Probucol in Man After Single and Repeated Oral Doses, La Nouvelle Presse Medicate, 9:2990-2994 (1980)), wurden Spitzengehalte von Probucol in Seren als sich sogar durch einen Faktor 20 von Patient zu Patient unterscheidend gefunden. Eine andere Untersuchung, Kazuya et al. J. Lipid Res. 32; 197-204 (1991) beobachtete ein Einverleiben von weniger als etwa 1 μg Probucol/10⁶ Zellen, wenn Endothelzellen für 24 h mit 50 μM Probucol inkubiert wurden.
Das Patent U.S. Patent Nr. 5,262,439 auf Parthasarathy offenbart Analoga von Probucol mit verstärkter Wasserlöslichkeit, in welchen eine oder beide Hydroxygruppen durch Estergruppen ersetzt sind, welche die Wasserlöslichkeit der Verbindung erhöhen. In einer Ausführung wählt man das Derivat aus der Gruppe, die besteht aus Mono- oder Diprobucolether von Succinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Suberinsäure, Sebazinsäure, Azelainsäure oder Maleinsäure. In einer anderen Ausführungsform ist das Probucolderivat ein Mono- oder Diester, in welchem der Ester eine Alkyl- oder Alkenylgruppe enthält, die eine Funktionalität enthält, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus einer Carboxylsäuregruppe, Amingruppe, Salz einer Amingruppe, Amidgruppen und Aldehydgruppen.
Farmaco, Ed. Sci., 1985, Vol.40, S. 833-844 und US 5,262,439 betreffen jeweils Monoether und Monoester von Probucolderivaten.
Eine Reihe von französischen Patenten offenbart, dass bestimmte Probucolderivate Hypercholesterinämie- und Hypolipämie-Reagenzien sind: FR 2168137 (Bis-4-Hydroxyphenylthioalkanester); FR 2140771 (Tetralinyl-Phenoxy-Alkanester von Probucol); FR 2140769 (Benzofuryloxyalkansäurederivate von Probucol), FR 2134810 (Bis-(3-Alkyl-5-t-Alkyl-4-Thiazol-S-Carboxy)Phenylthio)Alkane; FR 2133024 (Bis-(4-Nicotinoyloxyphenylthio)Propane; und FR 2130975 (Bis(4-Phenoxyalkanoyloxy)-Phenylthio)Alkane).
U.S. Patent Nr. 5,155,250 auf Parker et al., offenbart, dass 2,6-Dialkyl-4-Silylphenole antiatheriosklerotische Mittel sind. Dieselben Verbindungen sind offenbart als Serumcholesterin-erniedrigende Mittel in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 95/15760, veröffentlicht am 15. Juni 1995. U.S. Patent Nr. 5,608,095 auf Parker et al. offenbart, dass alkylierte 4-Silylphenole die Peroxidierung von LDL inhibieren, Plasmacholesterin erniedrigen und die Expression von VCAM-1 inhibieren und daher verwendbar bei der Behandlung von Atheriosklerose sind.
Eine Reihe Europäischer Patentanmeldungen auf Shionogi Seiyaku Kabushiki Kaisha offenbaren phenolische Thioether zum Gebrauch bei der Behandlung von Arteriosklerose. Die Europäische Patentanmeldung Nr. 348 203 offenbart phenolische Thioether, welche die Denaturierung von LDL und das Einverleiben von LDL durch Makrophagen inhibieren. Die Verbindungen sind nützlich als antiarteriosklerotische Mittel. Hydroxamsäurederivate dieser Verbindungen sind offenbart in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 405 788 und sind verwendbar bei der Behandlung von Arteriosklerose, Geschwüren, Entzündung und Allergie. Carbamyol- und Cyanoderivaten von phenolischen Thioethern sind offenbart in U.S. Patent Nr. 4,954,514 auf Kita et al.
U.S. Patent Nr. 4,752,616 auf Hall et al. offenbart Arylthioalkylphenylcarboxylsäuren für die Behandlung von thrombotischer Krankheit. Die offenbarten Verbindungen sind nützlich als Bluttplättchenaggregationsinhibitoren für die Behandlung von koronarer oder cerebraler Thrombosen und die Inhibierung von Bronchokonstriktion.
Eine Reihe von Patenten auf Adir et Compagnie offenbart substituierte Phenoxylisobuttersäuren und Ester, die nützlich als Antioxdationsmittel und Hypolipämiemittel sind. Diese Reihe umfasst U.S. Patent Nr. 5,206,247 und 5,627,205 auf Regnier et al. (welche der Europäischen Patentanmeldung Nr. 622 255 entspricht) und der Europäischen Patentanmeldung Nr. 763 527 entsprechen.
WO97/15546 auf Nippon Shinyaku Co. Ltd. offenbart Carboxylsäurederivate für die Behandlung von Arteriosklerose, ischämischen Herzkrankheiten, cerebralem Infarkt und post-PTCA-Restenose.
Die Dow Chemical Company ist Abtretungsempfänger der Patente auf hypolipidämische 2-(3,5-di-Tert-Butyl-4-Hydroxyphenyl)-Thiocarboxamide. Zum Beispiel U.S. Patent Nr. 4,029,812, 4,076,841 und 4,078,084 auf Wagner et al. offenbaren diese Verbindungen zum Vermindern von Blutserumlipiden, insbesondere Cholesterin- und Triglyceridgehalten.
Da kardiovaskuläre Krankheit die derzeit überwiegende Todesursache in den Vereinigten Staaten ist und man derzeit neunzig Prozent kardiovaskulärer Krankheit als Atheriosklerose diagnostiziert, besteht ein großer Bedarf an der Identifizierung von neuen Verfahren und pharmazeutischen Mitteln für deren Behandlung. Wichtig für dieses Ziel ist die Identifizierung und Handhabung der spezifischen oxidierten biologischen Verbindungen, die als selektive Regulatoren für die Expression von Mediatoren des Entzündungsvorgangs sind und insbesondere VCAM-1. Ein allgemeineres Ziel besteht darin, selektive Verfahren zum Unterdrücken der Expression von redoxsensitiven Genen oder Aktivieren redoxsensitiver Gene, welche unterdrückt sind, zu identifizieren.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verbindungen und Zusammensetzungen für die Behandlung von kardiovaskulären und Entzündungskrankheiten bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verbindungen und Zusammensetzungen bereitzustellen, welche man als Inhibitoren von LDL-Lipidperoxidierung verwenden kann.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verbindungen und Zusammensetzungen bereitzustellen, welche man als, antiatheriosklerotische Mittel verwenden kann.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verbindungen und Zusammensetzungen bereitzustellen, welche man als LDL-Lipid-Erniedrigungsmittel verwenden kann.
Zusammensetzung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ergibt eine Verbindung und Zusammensetzung zum Inhibieren der Expression von VCAM-1 und kann daher bei der Behandlung einer Krankheit verwendet werden, die durch VCAM-1 vermittelt wird, welche die Verabreichung der Verbindung der Erfindung oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes, optional in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Demgemäß ergibt die vorliegende Erfindung eine Verbindung der folgenden Formel:
oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon.
Die Erfindung liefert auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Behandlungsmenge der Verbindung der Erfindung oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon umfasst.
Die Erfindung liefert auch die Verwendung der Verbindung der Erfindung oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Entzündungsstörung oder einer kardiovaskulären Krankheit oder einer Störung, gewählt aus Asthma, Dermatitis, multipler Sklerose, Psoriasis, rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis oder einer Störung, gebildet aus Atheriosklerose, postangioplastischer Restenose, koronarer Herzerkrankung (Coronary Arten Disease), Angina und Mikroangiopathie.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Ausdruck Alkyl, wie hierin verwendet, wenn nicht anders angegeben, bezieht sich auf einen gesättigten geraden, verzweigten oder zyklischen primären, sekundären oder tertiären Kohlenwasserstoff von C₁ bis C₁₀ und umfasst spezifisch Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Cyclopropyl, Butyl, Isobutyl, T-Butyl, Pentyl, Cyclopentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl, Isohexyl, Cyclohexyl, Cyclohexylmethyl, 3-Methylpentyl 2,2-Dimethylbutyl und 2,3-Dimethylbutyl. Die Alkylgruppe kann optional substituiert werden mit einer oder mehreren Einheiten, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus Alkyl, Halogen, Hydroxyl, Carboxyl, Acyl, Acyloxy, Amino, Alkylamino, Arylamino, Alkoxy, Aryloxy, Nitro, Cyano, Sulfonsäure, Sulfat, Phosphonsäure, Phosphat oder Phosphonat, entweder ungeschützt, oder geschützt, wenn notwendig, wie Fachleuten bekannt, zum Beispiel wie gelehrt in Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Second Edition, 1991, welches hier als Bezugnahme eingefügt ist.
Der Ausdruck Niederalkyl wie hierin verwendet, und sofern nicht anders spezifiziert, betrifft C₁ bis C₅-gesättigte geradkettige oder verzweigte, oder wenn geeignet, eine zyklische (zum Beispiel Cyclopropyl) Alkylgruppe.
Entsprechend betrifft der Ausdruck Alkylen einen gesättigten Kohlenwasserstoffdiylrest von gerader oder verzweigter Konfiguration, gemacht aus 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Innerhalb des Bereichs dieses Ausdruck umfasst sind Methylen, 1,2-Ethandiyl, 1,1-Ethandiyl, 1,3-Propandiyl, 1,2-Propandiyl, 1,3-Butandiyl, 1,4-Butandiyl und dergleichen. Die Alkylengruppe kann man optional substituieren mit einer oder mehreren Einheiten, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus Alkyl, Halogen, Hydroxyl, Carboxyl, Acyl, Acyloxy, Amino, Alkylamino, Arylamino, Alkoxy, Aryloxy, Nitro, Cyano, Sulfonsäure, Sulfat, Phosphonsäure, Phosphat oder Phosphonat, entweder ungeschützt, oder geschützt, wenn notwendig, wie Fachleuten bekannt, zum Beispiel gelehrt in Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Second Edition, 1991, welches hier als Bezugnahme eingefügt ist.
Der Ausdruck „-(CH₂)n-" stellt einen gesättigten Kohlenwasserstoffdiylrest von geradkettiger Konfiguration dar. Der Ausdruck „n" ist definiert als 0 bis 10. Die Einheit „-(CH₂)n" stellt daher eine Bindung (das heißt, wenn n=0), Methylen, 1,2-Ethandiyl- oder 1,3-Propandiyl-, usw. dar.
Der Ausdruck Aryl, wie hierin verwendet und wenn nicht anders spezifiziert, betrifft Phenyl, Biphenyl oder Naphthyl und vorzugsweise Phenyl. Der Ausdruck Aralkyl, wie hierin verwendet und wenn nicht anders spezifiziert, betrifft eine Arylgruppe, wie oben definiert, verbunden mit dem Molekül über eine Alkylgruppe wie oben definiert. Der Ausdruck Alkaryl, wie hierin verwendet, wenn nicht anders spezifiziert, betrifft eine Alkylgruppe, wie oben definiert, verknüpft an ein Molekül über eine Arylgruppe wie oben definiert. In jeder dieser Gruppen kann die Alkylgruppe optional substituiert sein wie oben beschrieben und die Arylgruppe kann optional substituiert sein mit einer oder mehr Einheiten, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus Alkyl, Halogen, Hydroxyl, Carboxyl, Acyl, Acyloxy, Amino, Alkylaminio, Arylamino, Alkoxy, Aryloxy, Nitro, Cyano, Sulfonsäure, Sulfat, Phosphonsäure, Phosphat oder Phosphonat, entweder ungeschützt oder geschützt, wenn notwendig, wie Fachleuten bekannt, zum Beispiel wie gelehrt in Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Second Edition, 1991. Spezifisch eingeschlossen in den Schutzbereich des Ausdrucks Aryl sind Phenyl; Naphthyl; Phenylmethyl; Phenylethyl; 3,4,5-Trihydroxyphenyl; 3,4,5-Trimethoxyphenyl, 3,4,5-Triethoxyphenyl; 4-Chlorphenyl; 4-Methylphenyl; 3,5-Ditetiarybutyl-4-Hydroxyphenyl; 4-Fluorphenyl; 4-Chlor-1-Nahphthyl; 2-Methyl-1-Naphthylmethyl; 2-Naphthylmethyl; 4-Chlorphenylmethyl; 4-Tert.-Butylphenyl; 4-Tert.-Butylphenylmethyl und dergleichen.
Der Ausdruck „geschützt" wie hierin verwendet und wenn nicht anders definiert, betrifft eine Gruppe, die zu einem Sauerstoff, Stickstoff oder Phosphoratom zugefügt wird, um seine weitere Reaktion zu verhindern oder für andere Zwecke. Eine große Varianz von Sauerstoff- und Stickstoffschützende Gruppen sind Fachleuten der organischen Synthese bekannt.
Der Ausdruck Halogen, wie hier verwendet, umfasst Chlor, Brom, Iod und Fluor.
Der Ausdruck Alkoxy, wie hier verwendet, und wenn nicht anders spezifiziert, betrifft eine Einheit der Struktur -O-Alkyl, worin Alkyl wie oben definiert ist.
Der Ausdruck Acyl, wie hierin verwendet, betrifft eine Gruppe der Formel C(O)R', worin R' eine Alkyl-Aryl, Alkyl-, Alkaryl- oder Aralkylgruppe ist oder substituiertes Alkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkaryl, worin diese Gruppen wie oben definiert sind.
Wie hierin verwendet betrifft der Ausdruck polyungesättigte Fettsäure (PUFA) eine Fettsäure (typischer C₈ bis C₂₄), die wenigstens zwei Alkenylbindungen hat und schließt ein, aber ist nicht begrenzt auf Linol- (C₁₈ Δ^9,12), Linolen- (C₁₈ Δ ^6,9,12), Arachidonsäuren (C₂₀ Δ^,8,11,14).
Der Ausdruck oxidierte polyungesättigte Fettsäure (ox-PUFA) betrifft eine ungesättigte Fettsäure, in welche wenigstens eine der Alkenylbindungen zu einem Hydroperoxid umgewandelt worden ist. Nicht begrenzende Beispiele sind 13-HPODE und 15-HPETE.
Der Ausdruck pharmazeutisch verträgliche Salze oder Komplexe betrifft Salze oder Komplexe, welche die gewünschte biologische Aktivität der Verbindungen der vorliegenden Erfindung beibehalten und minimale unerwünschte toxikologische Wirkungen zeigen. Nicht begrenzte Beispiele solcher Salze sind (a) Säureadditionssalze, gebildet mit organischen Säuren (zum Beispiel Salzsäure, Bromwasserstoff, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dergleichen) und Salze, die gebildet werden mit den organischen Säuren wie Essigsäure, Oxasäure, Weinsäure, Succinsäure, Maleinsäure, Ascorbinsäure, Benzoesäure, Tanninsäure, Pamoasäure bzw. Embonsäure, Algininsäure, Polyglutaminsäure, Naphthalinsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure und Polygalacturonsäure; (b) Baseadditionssalze, gebildet mit Metallkationen wie Zink, Calcium, Bismuth, Barium, Magnesium, Aluminium, Kupfer, Kobalt, Nickel, Kadmium, Natrium, Kalium und dergleichen oder mit einem Kation, gebildet aus Ammoniak, N,N-Dibenzylethylendiamin, D-Glucosamin, Tetraethylammonium oder Ethylendiamin; oder (c) Kombinationen von (a) und (b); zum Beispiel ein Zinktannatsalz oder dergleichen. Auch eingeschossen in diese Definition sind pharmazeutisch verträgliche quaternäre Salze, die Fachleuten bekannt sind, welche spezifisch einschließen die quaternären Ammoniumsalze der Formel -NR⁺A^–, worin R ein Alkyl, substituiertes Alkyl, Alkenyl, substituiertes Alkenyl, Alkynyl, substituiertes Alkynyl, Aryl, substituiertes Aryl, Alkyl-COOH, Alkyl-COOAlkyl, Alkyl-COOAyl, Heteroaryl oder substituiertes Heteroaryl ist; und A ist ein Gegenion, einschließend Chlorid, Bromid, Iodid, -O-Alkyl. Toluolsulfonat, Methylsulfonat, Sulfonat, Phosphat oder Carboxylat (wie Benzoat, Succinat, Acetat, Glykolat, Maleat, Malat, Citrat, Tartrat, Asorbat, Benzoat, Cinnamat, Mandelat, Benzylat und Diphenylacetat).
Krankheiten, die vermittelt werden durch VCAM-1, umfassen, aber sind nicht begrenzt auf Atheriosklerose, postangioplastische Restenose, Koronararterienkrankheit, Angina, Mikroangiopathie, und andere kardiovaskuläre Krankheiten sowie nicht kardiovaskuläre Entzündungskrankheiten wie rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Asthma, Dermatitis, Multiple Sklerose und Psoriasis.
Man kann die Verbindungen der Erfindung durch bekannte Verfahren und Techniken herstellen oder Routinemodifikationen davon. Ein allgemeines Syntheseschema zur Herstellung von Verbindungen der Erfindung ist in Schema A dargelegt, worin alle Substituenten, wenn nicht anders angezeigt, wie oben definiert sind.
Schema A
Die Menge Probucol (kommerziell verfügbar von Sigma Chemicals) in 0,1 M Lösung von Tetrahydrofuran wird behandelt mit 2 Äquivalenten Natriumhydrid und bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch werden 3 Äquivalente eines primären Alkylbromids oder -iodids gegeben und die Reaktion wird bei Raumtemperatur für 16 Stunden gerührt. Die Reaktion wird mit 1 N wässriger HCl abgeschreckt und mit Ethylacetat verdünnt. Die wässrige Schicht wird entfernt und die Ethylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen und dann mit einer wässrigen gesättigten Natriumchloridlösung. Die Acetatlösung wird über Magnesiumsulfat getrocknet oder vakuumfiltriert und dann konzentriert. Das Produkt wird durch Silicagelchromatographie gereinigt.
Ein alternatives Verfahren zur Herstellung der Verbindung ist die Behandlung von Probucol mit einem primären Alkohol gemäß dem Verfahren von Mitsunobu (Synthesis, 1981, 1).
Ein zweites alternatives Verfahren für die Herstellung der Verbindung der Erfindung ist die Behandlung von Probucol mit einem primären Alkylbromid oder -iodid in Acetonitril in Gegenwart von Kaliumfluorid, absorbiert auf Aluminiumoxid gemäß dem Verfahren von Ando et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 55, 1982, 2504-2507).
Ausgangsmaterialien zum Gebrauch bei den allgemeinen Syntheseverfahren, die bei den obigen Reaktionsschemata umrissen sind, sind direkt verfügbar oder können leicht gemäß Standardtechniken und -verfahren hergestellt werden. Probucol ist fertig verfügbar von Sigma Chemicals.
Das folgende Beispiel zeigt eine typische Synthese wie in Schema A beschrieben. Dieses Beispiel wird als veranschaulichend lediglich verstanden und ist nicht vorgesehen, um den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung irgendwie zu begrenzen.
Beispiel 1
[4-[[1-[[3,5-bis(1,1-Dimethylethyl)-4-Hydroxyphenyl]-Thio]-1-Methylethyl]-Thio]2,6-bis-(1,1-Dimethylethyl)-Phenoxy]-Essigsäure
Reaktionsbeschreibung
Dimethylformamid (1,5 mL) wurde mit Probucol (0,5 g, 0,967 mmol) und Ethyl-2-Iodacetat (0,31 g, 1,45 mmol) und 40 % Kaliumfluorid auf Aluminiumoxid (0,7 g) versetzt und die Reaktion wurde für 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde verdünnt mit Ether (25 mL), filtriert und mit Wasser gewaschen (2 × 5 mL). Die Etherschicht wurde getrocknet über MgSO₄, filtriert und konzentriert. Das resultierende Öl wurde durch radiale Silicagelchromatographie gereinigt durch Elution mit 5:95 Ether/Hexan, um 160 mg Ethylester des Produkts zu ergeben. Der Ethylester, gelöst in THF:H₂O:MeOH(4:1:1) (4 mL) und LiOH-N₂O (50 mg) wurden zugegeben und die Reaktion für 1 Stunde gerührt. Die Reaktion wurde neutralisiert mit 1N HCl und extrahiert mit Ether (2 × 10 mL), getrocknet über MgSO₄, filtriert und konzentriert. Silicagelchromatographie und Elution mit 50:50 Ether/Hexane ergab 90 mg Produkt. 1H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7,55 (s, 2H), 7,40 (s, 2H), 5,35 (s, 1 H), 4,40 (s, 2 H), 1,43 (s, 6 H), 1,41 (s, 9 H), 1,39 (s, 9 H).
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Verwendung der Verbindung gemäß der Erfindung. Diese Beispiele sind lediglich veranschaulichend, und nicht vorgesehen, um den Schutzbereich der Erfindung irgendwie zu begrenzen.
Beispiel 2
Lipidscreen und IC₅₀-Bestimmungsprotokoll
Herstellung von HEPG2:
HEPG2-Zellen wurden gestartet in 10 ml MEM, 10% FBS, 1 mM Natriumpyruvat. Die Zellen wurden in einem Gewebekulturinkubator inkubiert. Die Zellen wurden aufgeteilt in 4 × 96-Lochplatten in MEM, 10% FBS, 1 mM Natriumpyruvat und man ließ sie auf etwa 50% Konfluenz wachsen und sie wurden dann entfernt.
Tag 1 der Behandlung:
Die Zellen wurden mit der gewünschten Konzentration von Verbindungen in 100 μl DMEM, 1% RSA für 24 h behandelt. Die Verbindungen werden gelöst in DMSO. Für IC50 ist der Konzentrationsbereich von 10 μM – 40 μM mit jeder Konzentration drei Mal genommen.
Am gleichen Tag wird die 4 × 96-Loch NunclmmunoSorb-Platte mit 100 μl monoclonalem Maus-Anti-Mensch-ApoB 1D1 (1:1000-Verdünnung in 1 × PBS, pH 7,4) beschichtet. Die Beschichtung belässt man über Nacht.
Tag 2 ApoB ELISA:
Die beschichtete Platte wurde 3-mal mit 1 × PBS, pH 7,4, -0,05% Tween20 gewaschen. 100 μl des Standards werden auf die ausgewählten Löcher gegeben. ApoB-Standards werden hergestellt bei 6,25, 3,12, 1,56, 0,78, 0,39 ng und jede Konzentration wird drei Mal genommen.
Als Proben:
90 μl von 1 × PBS, pH 7,4, -0,05% Tween20 wird zu jedem Loch entsprechend der Probe zugegeben. 10 μl Medium werden von den behandelten HPEG2-Platten zu der Apo-B-ELISA-Platte. Die Platte wird bei Raumtemperatur für 2 Stunden unter leichtem Schütteln inkubiert.
Wasche die beschichtete Platte 3 × mit 1 × PBS, pH, 7,4, 0,05% Tween20. Gebe 100 μl Schaf-Anti-Mensch-ApoB- polyklonalen Antikörper von Boehringer Mannheim zu (1:2000 Verdünnung in 1 × PBS, pH, 7,4, 0,05% Tween20) von Boehringer Mannheim. Inkubiere bei Raumtemperatur für 1 Stunde unter leichtem Schütteln. Wasche die beschichtete Platte 3 × mit 1 × PBS, pH, 7,4, 0,05% Tween20. Gebe 100 μl Kaninchen-Anti-Schaf-IgG zu (1:2000 Verdünnung in einem 1 × PBS, pH, 7,4, 0,05% Tween20). Inkubiere bei Raumtemperatur für 1 Stunde unter leichtem Schütteln. Wasche die beschichtete Platte 3 × PBS, pH, 7,4, 0,05% Tween20. Gebe 100 μl Substrat zu (10 ml destilliertes Wasser, 100 μl TMB (10 mg/ml) und 1 μl Wasserstoffperoxid). Lasse Farbe auftreten und stoppe die Reaktion mit 25 μl 8 N Schwefelsäure. Die Löcher werden behandelt mit MicroPIateReader^® 450 nM. Trage die Ansammlung von ApoB in Medium als Prozentanteil der Kontrolle für jede Probe und deren Konzentration auf. Eine Bestimmung des IC50 wird aus dem Graph erhalten.
Beispiel 3
VCAM-1-Test
Aufteilen der Zellen:
Zwei bis vier konfluente P150-Platten werden trypsiniert und die Zellen auf 50 mL konische Zentrifugenröhren überführt. Die Zellen werden pelletiert, resuspendiert und unter Verwendung des Trypanblau-Ausschluss-Verfahren gezählt.
Die Zellen werden resuspendiert zu einer Konzentration von 36000 Zellen/ mL und 1 mL wird pro Loch portioniert.
Die Zellen werden aufgeteilt in 24 Lochgewebekulturplatten. Die Zellen in jedem Loch sollten annähernd 90-95 % konfluent mit dem folgenden Tag sein. Die Zellen sollten nicht älter als Durchlauf 8 sein.
Herstellung von Verbindungen:
Wasserlösliche Verbindungen
Verbindungen werden anfangs gescreent bei 50 μM und 10 μm. Eine 50 mM-Stammlösung für jede Verbindung wird im Kulturmedium hergestellt. Die Stammlösung wird verdünnt zu 5 mM und 1 mM. Wenn 10 μL der 5 mM-Lösung zu dem Loch zugegeben werden (1 mL Medium/Loch) wird die Endkonzentration 50 μM sein. Das Zugeben von 10 μL der 1 mM-Lösung zu dem Loch wird eine Konzentration von 10 μm ergeben.
Wasserunlösliche Verbindungen
Verbindungen, welche nicht in dem Kulturmedium in Lösung gehen, werden in DMSO bei einer Konzentration von 25 mM resuspendiert. Die Stammlösung wird dann zur Endkonzentration im Kulturmedium verdünnt. Das alte Medium wird abgesaugt und 1 mL des neuen Mediums mit der Verbindung wird zugegeben. Zum Beispiel, wenn die Endkonzentration 50 μm ist, werden 2 μl des 25 mM-Stamms zugegeben pro ml Kulturmedium. Die 50 μM-Lösung wird verdünnt, um die Konzentrationen zu erniedrigen.
Zugeben der Verbindungen
Die Verbindungen werden zu der Platte zugegeben (jede Verbindung wird zweimal genommen). Eine Platte wird gemacht für VCAM-Expression und eine Platte wird gemacht für ICAM-Expression.
Unmittelbar nachdem die Verbindungen zugegeben sind, wird TNF zu jedem Loch zugegeben. 100 Einheiten/ mL TNF werden gewöhnlich zu jedem Loch zugegeben. Da jeder Ansatz von TNF in der Anzahl von Einheiten variiert, wird jeder neue Ansatz titriert, um die Optimumkonzetnration zu bestimmen. Daher wird sich diese Konzentration ändern. Wenn 100 Einheiten/ mL verwendet werden, verdünne das TNF auf 10 Einheiten/ μL und gebe 10μL zu jedem Loch zu.
Die Platten werden bei 37°C, 5% CO₂ über Nacht (annähernd 16 Stunden) inkubiert.
Am nächsten Tag werden die Platten unter dem Mikroskop geprüft, um zu erkennen, ob es sichtbare Zeichen von Toxizität gibt. Aufzeichnungen werden von Zelltod, Debris oder Morphologieänderungen sowie unlöslichen Verbindungen (Partikel oder Trübheit) gemacht.
Beispiel 4
ELISA-Test
Um MCP-1 einzuschätzen, wird das Medium (500 μL) aufbewahrt und gefroren bei – 70°C. Waschlöcher, einmal mit annähernd 1 ml/Loch Hanks' gepufferte Salzlösung (HBSS) oder PBS werden gewaschen. Entleere die Waschlösung leicht und klopfe die Platte dann auf Papiertücher. Gebe 250 μL/ Loch HBSS + 5% FCCS zu der leeren Platte zu (keine primären Antikörperlöcher) oder 250 μL/Loch primären Antikörper, verdünnt in HBSS + 5% FCS. Inkubiere 30 Minuten bei 37°C. Wasche die Löcher zweimal mit 5 mL/ Loch HBSS oder PBS und klopfe die Platte leicht auf Papiertücher nach wenigstens einer Waschung. Gebe 250 uL/ Loch HRP-konjugierten zweiten Antikörper, verdünnt in HBSS + 5% FCS zu jedem Loch, einschließlich leeren Löchern (kein primärer Antikörper). Inkubiere bei 37°C für 30 Minuten. Wasche die Löcher viermal mit 5 mL/ Loch HBSS oder PBS, klopfe die Platten leicht auf Papiertücher nach der letzten Waschung. Gebe 250 μL/Loch Natriumsubstrat zu. Inkubiere bei Raumtemperatur im Dunkeln, bis es adäquate Farbentwicklung (Blau) gibt. Vermerke die Dauer, über die die Inkubation ausgeführt wird (typischerweise 15-30 Minuten). Gebe 75 μL/ Loch Stopplösung (8 N Schwefelsäure) zu und lese A450 nm.
Antikörper und Lösungen

1. Substratlösung wird unmittelbar vor dem Gebrauch angefertigt und enthält:

Wasser 10 mL

30% Wasserstoffperoxid 1 μL

TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) 100 μL

TMB-Stammlösung: zu 10 mg TMB gebe 1 mL Azeton. Lagere bei 4°C, geschützt vor Licht.

2. VCAM-1 Antikörper: Stamm.1 μg/μL Endkonzentration 0,25 μg/mL

Mische 25 μL Stamm VCAM-1 (Southern Biotechnology) und 10 mL HBNSS + 5% FCS

3. ICAM-1 Antikörper: Stamm.1 μg/μL Endkonzentration 0,25 μg/mL

Mische 25 μL Stamm ICAM-1 (Southern Biotechnology) und 10 mL HBSS + 5% FCS.
4. Sekundärer Antikörper: HRP-konjugierte Ziege-Antimaus IgG, verdünnt 1:500 Mische 20 μL Stamm (Southern Biotechnology) und 10 mL HBSS + 5% FCS

Der Grad der Inhibierung der Verbindung der Erfindung wurde bestimmt durch die in Beispielen 2-4 beschriebenen Tests. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Säugetiere und spezifisch Menschen, die unter einem der oben beschriebenen Zuständen leiden, können durch topische, systemische oder transdermale Verabreichung einer Zusammensetzung behandelt werden, die wirksame Menge der Verbindung der Erfindung, optional in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Die Zusammensetzung wird subkutan, intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, parenteral, oral, submukosal, durch Inhalation, transdermal über ein Pflaster zur langsamen Freisetzung oder topisch in einem wirksamen Dosierungsbereich verabreicht, um den Zielzustand zu behandeln. Eine wirksame Dosis kann leicht durch Verwendung konventioneller Techniken bestimmt werden und durch Beobachten von Ergebnissen, die unter analogen Bedingungen erhalten werden.
Beim Bestimmen der effektiven Dosis wird eine Anzahl von Faktoren berücksichtigt, einschließlich, aber nicht begrenzt auf: die Spezies Patient; seine Größe, Alter, allgemeine Gesundheit, spezifische involvierte Krankheit, Grad der Beeinträchtigung oder Ernstheit der Krankheit, Antwort des individuellen Patienten, spezielle verabreichte Verbindung, Verabreichungsart, Bioverfügbarkeitsmerkmale der verabreichten Präparation, gewählte Dosisdiät und Verwendung von zusammenwirkender Medikation. Typische systemische Dosierungen für alle hier beschriebenen Zustände sind jene, die von 0,1 mg/kg bis 500 mg/kg Körpergewicht pro Tag in einer täglichen Einmaldosis oder aufgeteilt auf mehrere tägliche Dosen reichen. Bevorzugte Dosierungen für die beschriebenen Zustände reichen von 5-1500 mg pro Tag. Eine insbesondere bevorzugte Dosierung für die gewünschten Zustände reicht von 25-750 mg pro Tag. Typische Dosierungen für topische Verabreichungen sind jene, die von 0,001 bis 100 Gew.-% der wirksamen Verbindung reichen.
Die Verbindung wird für einen ausreichenden Zeitraum verabreicht, um die unerwünschten Symptome und klinischen Zeichen erleichtern, welche mit dem zu behandelnden Zustand verbunden sind.
Die aktive Verbindung ist eingeschlossen in dem pharmazeutisch verträglichem Träger oder Verdünnungsmittel in einer Menge, die ausreichend ist, um einem Patienten eine therapeutische Menge der Verbindung in vivo in Abwesenheit von ernsten toxischen Wirkungen zu verabreichen.
Die Konzentration der wirksamen Verbindung in der Medikamentenzusammensetzung wird von Absorptions-, Inaktivierungs- und Exkretionsgeschwindigkeiten des Medikaments abhängen sowie anderen, Fachleuten bekannten Faktoren. Es ist anzumerken, dass die Dosierungswerte auch in der Ernstheit des zu erleichternden Zustands variieren werden. Es ist weiter zu verstehen, dass für jedes spezielle Subjekt, spezifische Dosisdiäten über die Zeit gemäß dem individuellen Bedürfnis und der professionellen Einschätzung der Verabreichenden oder die Verabreichung der Zusammensetzungen überwachenden Person eingestellt werden sollte und dass die hier dargelegten Dosierungsbereiche nur beispielhaft sind und nicht vorgesehen sind, um den Schutzbereich oder Praxis der beanspruchten Zusammensetzung zu begrenzen. Der aktive Inhaltsstoff kann einmal verabreicht werden oder kann in eine Anzahl kleinerer Dosen aufgeteilt werden, die bei variierenden Zeitintervallen verabreicht werden müssen.
Eine bevorzugte Verabreichungsart der wirksamen Verbindung für systemische Abgabe ist oral. Orale Zusammensetzungen werden allgemein ein inertes Verdünnungsmittel oder einen essbaren Träger umfassen. Sie können eingeschlossen sein in Gelatinekapseln oder in Tabletten gepresst. Zum Zwecke von oraler therapeutischer Verabreichung kann die wirksame Verbindung mit Hilfsstoffen einverleibt sein und verwendet in Form von Tabletten, Ampullen oder Kapseln. Pharmazeutisch verträgliche Bindemittel und/oder Adjuvansmaterialien können als Teil der Zusammensetzung eingeschlossen sein. Tabletten, Pillen, Kapseln, Ampullen und dergleichen können einen der folgenden Inhaltsstoffe oder Verbindungen ähnlicher Natur enthalten: ein Bindemittel wie mikrokristalline Zellulose, Tragacanthgummi oder Gelatine, einen Hilfsstoff wie Stärke oder Laktose, ein Trennmittel wie Algininsäure, Primogel oder Kornstärke; ein Gleitmittel wie Magnesiumstearat oder Sterote; ein Gleitmittel wie kolloidales Siliziumdioxid, ein Süßungsmittel wie Sucrose oder Saccharin; oder ein Aromamittel wie Pfefferminz, Methylsalicylat oder Orangenaroma.
Wenn die die Dosierungseinheitsform eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zum Material des obigen Typs einen Flüssigträger wie Fettöl enthalten. Zusätzlich können die Dosierungseinheitsformen verschiedene andere Materialien enthalten, welche die physikalische Form der Dosierungseinheit modifizieren, zum Beispiel Beschichtungen von Zucker, Shellac oder anderen enterischen Mitteln.
Die Verbindungen oder ihre Salze können als Bestandteil eines Elixiers, Suspension, Sirups, Plätzchens, Kaugummis oder dergleichen verabreicht werden. Ein Sirup kann zusätzlich zu den wirksamen Verbindungen Sucrose als Süßungsmittel und einige Konservierungsstoffe, Farbstoffe und Kolorierungen und Aromen enthalten.
Die Verbindung kann auch gemischt werden mit anderen wirksamen Materialien, die die gewünschte Wirkung nicht beeinträchtigen oder mit Materialien, die die gewünschte Wirkung ergänzen. Die wirksamen Verbindungen können zusammen mit anderen Medikationen verabreicht werden, die zur Behandlung von kardiovaskulärer Krankheit verwendet werden, einschließlich Lipidsenkern wie Probucol und Nikotinsäure, Blutplättchenaggregationsinhibitoren wie Aspirin, antithrombotische Reagenzien wie Coumadin; Calciumkanalblockern wie Varapamil, Diltiazem und Nifedipin, Angiotensin umwandelndes Enzym (ACE)-Hemmer wie Captopril und Enalopril und β-Blockern wie Propanalol, Terbutalol und Labetalol. Die Verbindungen können auch in Kombination mit nicht-steroidalen Anti-Entzündungsmitteln verabreicht werden wie Ibuprofen, Indomethacin, Fenoprofen, Mefenaminsäure, Flufenaminsäure, Sulindac. Die Verbindung kann auch mit Corticosteroiden verabreicht werden.
Lösungen oder Suspensionen, verwendet zur parenteralen, intradermalen, subkutanen oder topischen Anwendung können die folgenden Komponenten umfassen: ein steriles Verdünnungsmittel wie Wasser zur Injektion, Salzlösung, feste Öle, Polyethylenglykole, Glyzerin, Propylenglykol oder andere synthetische Lösungsmittel, antibakterielle Mittel wie Benzylalkohol oder Methylparabene, Antioxidationsmittel wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit, Chelatiermittel wie Ethylendiamintetraessigsäure, Puffer wie Acetate, Citrate oder Phosphate und Mittel zum Einstellen der Tonizität wie Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH kann mit Säuren oder Basen wie Salzsäure oder Natriumhydroxid eingestellt werden. Die parenterale Präparation kann in Ampullen eingeschlossen sein, Einwegspritzen oder Mehrfachdosisgefäßen, die aus Glas oder Plastik hergestellt sind.
Wenn intravenös verabreicht, sind bevorzugte Träger physiologische Salzlösung, bakteriostatisches Wasser, Cremophor EL^TM (BASF, Parsippany, NJ) oder phosphatgepufferte Salzlösung (PBS).
In einer bevorzugten Ausführung werden die wirksamen Verbindungen mit Trägern hergestellt, welche die Verbindung gegen schnelle Entfernung aus dem Körper schützen werden wie eine kontrollierte Freisetzungszusammensetzung, einschließend Implantate und mikroverkapselte Abgabesysteme. Bioabbaubbare, bioverträgliche Polymere können verwendet werden wie Ethylenphenylacetat, Polyanhydride, Polyglykolsäure, Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen werden Fachleuten offensichtlich sein. Die Materialien können auch kommerziell erhalten werden von Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc. Liposomale Suspensionen (einschließlich Liposomen, die auf infizierten monoklonalen Antikörper auf viralen Antigenen abgezielt sind), sind bevorzugt als pharmazeutisch verträgliche Träger. Diese können gemäß Verfahren hergestellt werden, die Fachleuten bekannt sind, zum Beispiel wie beschrieben in U.S. Patent Nr. 4,522,811. Zum Beispiel können Liposomformulierungen hergestellt werden durch Lösen geeigneter Lipid(e) (wie Stearoylphosphatidylethanolamin, Stearoylphosphatidylcholin, Arachadoylphosphatidylcholin und Cholesterin) in einem anorganischen Lösungsmittel, das dann unter Zurücklassen eines dünnen Films des getrockneten Lipids an der Oberfläche des Behälters verdampft wird. Eine wässrige Lösung der Verbindung wird dann in den Behälter eingeführt. Der Behälter wird dann von Hand geschüttelt, um Lipidmaterial von den Seiten des Containers freizusetzen und Lipidaggregate zu dispergieren, wobei sich eine liposomale Suspension bildet.
Geeignete Vehikel oder Träger für topische Anwendung können durch konventionelle Techniken hergestellt werden, wie Lotionen, Suspensionen, Salben, Cremes, Gels, Tinkturen, Sprays, Pulver, Pasten, langsam freisetzende Transdermalpflaster, Zäpfchen zur rektalen, vaginalen, nasalen Verabreichung oder Oralschleimhautverabreichung. Zusätzlich zu den anderen oben zur systemischen Verabreichung aufgelisteten Materialien können Verdickungsmittel, Weichmacher und Stabilisatoren verwendet werden, um topische Zusammensetzungen herzustellen. Beispiele von Verdickungsmitteln schließen ein Petrolatum, Bienenwachs, Xanthangummi oder Polyethylen, Feuchtigkeitsstabilisatoren wie Sorbitol, Weichmacher wie Mineralöl, Lanolin und seine Derivate oder Squalen.

Claims

Eine Zusammensetzung gemäß folgender Formel:
oder ein pharmazeutisch brauchbares Salz dessen.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Behandlungsmenge der Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 enthält.
Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, die für eine orale Gabe brauchbar ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, die für topische oder transdermale Gabe brauchbar ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, die zur intravenösen, subkutanen, intraperitonealen oder intramuskulären Gabe brauchbar ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, die zur submukosalen Gabe brauchbar ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, die zur Inhalation brauchbar ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 zur therapeutischen Verwendung.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer entzündlichen Störung.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer kardiovaskulären Krankheit.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer der folgenden Störungen: Asthma, Dermatitis, Multiple Sklerose, Psoriasis, rheumathoide Arthritis und Osteoarthritis.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von rheumatoider Arthritis.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer der folgenden Störungen: Arteriosklerose, postangioplastische Restenose, coronare Herzkrankheit, Angina, Mikroangiopathie.
Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 in Verbindung mit einer weiteren entzündungshemmenden Arznei zur therapeutischen Verwendung.
Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 in Verbindung mit einer nicht steroidalen entzündungshemmenden Arznei, gewählt aus der Reihe: Ibuprofen, indomethacin, Fenoprofen, Mefenaminsäure, Flufenaminsäure und Sulindac zur therapeutischen Verwendung.
Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 in Verbindung mit einem Cortiosteroid zur therapeutischen Verwendung.
Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 in Verbindung mit einem kardiovaskulären Medikament zur therapeutischen Verwendung.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 in Verbindung mit einem kardiovaskulären Medikament, gewählt aus der Reihe lipidsenkender Mittel, Thrombozytenaggregationshemmern, antithrombotischer Mittel, Kalziumkanalblockern, Angiotensin wandelnde Enzym (ACE)Hemmern und β-Blockern zur therapeutischen Verwendung.