TW201139682A - Production of heteromultimeric proteins - Google Patents

Production of heteromultimeric proteins Download PDF

Info

Publication number
TW201139682A
TW201139682A TW100114160A TW100114160A TW201139682A TW 201139682 A TW201139682 A TW 201139682A TW 100114160 A TW100114160 A TW 100114160A TW 100114160 A TW100114160 A TW 100114160A TW 201139682 A TW201139682 A TW 201139682A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
polypeptide
hinge
domain
cell
Prior art date
Application number
TW100114160A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI586806B (zh
Inventor
Justin Scheer
Christoph Spiess
Daniel G Yansura
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44121029&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TW201139682(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of TW201139682A publication Critical patent/TW201139682A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI586806B publication Critical patent/TWI586806B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/247—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

201139682 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於製造異多聚體蛋白質之方法。 本申請案主張2010年4月23日申請之題為「Production of Heter omul ti meric Proteins」之美國臨時專利申請案第 61/327,302號之優先權，該案之全部内容以引用的方式併 入本文中。 φ 【先前技術】
IgG型單株抗體含有兩個相同抗原結合臂及一個恆定域 (Fc)。結合臂特異性不同之抗體通常不存在於自然界中， 因此，必須藉助於化學工程改造（例如化學交聯等）、重組 DNA及/或細胞融合技術精巧地製作。 雙特異性抗體可同時結合兩種不同抗原。此特性允許開 發用習知單株抗體不可能進行之治療策略。一大組已開發 之想像雙特異性抗體形式反映出對此等分子之強烈關注。 鲁 參見 Berg J，Lotscher E，Steimer KS 等人，「Bispecific antibodies that mediate killing of cells infected with human immunodeficiency virus of any strain」，Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88(11): 4723-4727 及 Fischer N 及 Leger 0·， 「Biospecific Antibodies: Molecules That Enable Novel Therapeutic Strategies」，Pathobiology (2007) 74:3-14。 另一類多特異性分子為重組融合蛋白。重組融合蛋白由 免疫調節蛋白質之細胞外域及免疫球蛋白（Ig)之恆定（Fc) 域組成，其代表一類發展中之人類治療劑。免疫黏附素將 155406.doc 201139682 具有所要特異性之蛋白質序列之結合區與抗體之效應域組 合。免疫黏附素具有兩個對於其作為治療劑之潛能而言有 意義之重要特性：標靶特異性及藥物動力學穩定性（活體 内半衰期，與抗體之活體内半衰期相當）。免疫黏附素可 用作拮抗劑以抑制或阻斷有害相互作用或用作促效劑以模 擬或增強生理學反應。參見Chamow SM，Zhang DZ，Tan XY 等人，「A humanized, bispecific immunoadhesin- antibody that retargets CD3+ effectors to kill HIV-1- 鲁 infected cells」，J Hematother 1995; 4(5): 439-446 o 別處已論述其他多特異性分子。實例包括（但不限 於）Fisher等人，Pathobiology (2007) 74:3-14(各種雙特異 性形式之評述）；2003年12肩9日頒予Feige等人之美國專利 第6,660,843號（肽體）；2002年1月10曰公開之美國專利公 開案第2002-004587號（多特異性抗體）；2009年11月3曰頒 予Wu等人之美國專利第7612181號（雙重可變域形式）；美 國專利第 6,534,628 號，Nord K 等人，Prot Eng (1995) φ 8:601-608，Nord Κ等人，Nat Biotech (1997) 15:772-777及 Gronwall 等人，Biotechnol. Appl Biochem. (2008)6 月； 50(第2部分）：97-112(親和抗體）；Martens等人，Clin Cancer Res (2006)，12: 6144-6152及Jin等人，Cancer Res (2008) 68(11):4360-4368( — 臂抗體）；Bostrom 等人， Science (2009) 323:1610-1 (514(雙重作用 Fab、aka混合價抗 體）。其他形式為熟習此項技術者已知。 對於上述多特異性分子，製造臨床級物質仍具挑戰性。 155406.doc 201139682 如上所述’有多種途徑製造具有混合結合臂(亦即彼此不 一致之結合臂）之分子。此等方法每一者均具有其缺陷。 化學交聯為勞動密集的，因為相關物質可能仍需要自均 二聚體及其他不適宜副產物純化。另外，化學修飾步驟可 改變蛋白質之完整性，從而造成穩定性差。因此，此方法 通常低效且可導致抗體活性喪失。 細胞融合技術（例如雜交融合瘤）表現兩條重鏈及兩條輕 • 鏈，該等重鏈及輕鏈隨機組裝，產生ίο種抗體組合。所要 異多聚體抗體僅為由此製造之抗體的一小部分。純化所要 異多聚體蛋白質會顯著降低製造產量且增加製造成本。 已使用重組DN A技術產生不包含Fc域之各種異多聚體形 式，例如單鏈Fv、雙功能抗體等。此類型抗體分子之主要 缺陷為缺乏Fc域，從而缺乏抗體引發效應功能（例如補體 活化、Fc-受體結合等）之能力。因此，需要一種包含功能 性Fc域之雙特異性抗體。 • 亦可使用重組DNA技術產生『杵臼結構』雙特異性抗 體。參見美國專利申請案20030078385(Aratho〇n等人_ Genentech) »此策略之一限制性為兩個親本抗體之輕鏈必 須一致以防止錯配及因在同一細胞中表現而形成不適宜 及/或無活性分子。 因此’仍需要製造異多聚體蛋白質之替代性方法。本文 所述之發明提供該等方法。本發明之此等及其他態樣及優 點將由本文所提供之發明的描述而顯而易知。 【發明内容】 155406.doc 201139682 使用當前技術製造異多聚體蛋白質（例如多特異性抗體） 存在缺陷，包括尤其產生產物混合物、產量降低及效應功 能降低/消除。因此，需要有效且以高水準製造異多聚體 蛋白質。 一般已充分瞭解用各種方式製造抗體分子。舉例而言， 美國專利6331415(Cabilly等人）描述一種重組製造免疫球 蛋白之方法，其中重鏈及輕鏈同時由單一載體或單一細胞 中之兩個各別載體表現。Wibbenmeyer等人（1999，Biochim Biophys Acta 1430(2): 191-202)及 Lee 及 Kwak(2003，J. Biotechnology 101: 189-198)描述由使用在各別大腸桿菌培 養物中表現之質體各別製造之重鏈及輕鏈製造單株抗體。 與製造抗體有關之各種其他技術描述於例如Harlow等人， ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988) 及WO 2006028936中。然而其各具有缺陷，諸如產量低， 使用化學物質。 本發明之方法提供在不添加還原劑之情況下含鉸鏈異多 聚體蛋白質之各組分（例如抗體之一臂）於各別宿主細胞中 之表現及含鉸鏈異多聚體蛋白質（例如多特異性抗體）之組 裝。 本發明提供一種簡單且有效之製造製程/方法，其允許 經濟地製造異多聚體蛋白質（例如多特異性抗體）。 本發明提供有效且新穎之製造多特異性免疫球蛋白複合 物（例如多特異性抗鱧）及其他多聚體蛋白質（在本文中統稱 155406.doc -6 - 201139682 作異多聚體蛋白質）之方法，其克服傳 方法之限制性。 根據本發明之方法，異多聚體蛋白質 一 員（連如雙特異性抗體） 可以高度均質異之多聚體多肽形式提供。 M 供另外，本文所提 供之方法不依賴於添加還原劑來實現異多聚體蛋白質中之 至少-個、至少兩個、至少三個、至少四個鍵間二硫鍵的 形成。
在第-態樣中’本文所述之方法允許製備 異二聚域之第一含鉸鏈多肽及具有第二異二聚域^第二含 较鏈多狀的異多聚體蛋白質，其中第二異二聚域與第一^ 二聚域相互作用，且其中第一及第二含鉸鏈多肽藉由至少 一個鏈間二硫鍵連接，該方法包含以下步驟： ⑷在表現第-含鉸鏈多肽之條件下培養包含編碼該含较 鍵多狀之第一核酸的第一宿主細胞； (b)在表現第二含韻多肽之條件下培養包含編碼該含 鉸鏈多肽之核酸的第二宿主細胞； (0破壞細胞膜，使得第一及第二含鉸鏈多肽釋放於細胞 外環境中，纟中第—及第二宿主細胞在$一懸浮液中組 合在一起；及 (d)回收異多聚體蛋白質， 其中該方法無需添加還原劑。 在第二態樣中，提供製備異多聚體蛋白質之方法，該異 多聚體蛋白質包含具有第一異二聚域之第一含鉸鏈多肽及 具有第二異二聚域之第二含欽鍵多肽，其中第二異二聚域 與第一異二聚域相互作用，且其中第一及第二含鉸鏈多肽 155406.doc 201139682 藉由至少一個鏈間二硫鍵連接，該方法包含以下步驟： (a) 提供具有第一異二聚域之經純化第一含鉸鏈多肽； (b) 提供具有第二異二聚域之經純化第二含鉸鏈多肽； (c) 將第一及第二含鉸鏈多肽組合； (d) 將第一含鉸鏈多肽及第二含鉸鏈多肽再摺疊；及 (e) 回收異多聚艘蛋白質複合物。 在第三態樣中，本文提供之方法係關於一種製備異多聚 體蛋白質之方法，其包含在允許第一對免疫球蛋白重鍵與 輕鍵多肽及第二對免疫球蛋白重鏈與輕鏈多肽多聚以形成 實質上均質之抗體群之條件下培育該第一及第二對多肽， 其中該等條件不包含添加還原劑；其中第一對多肽能夠結 合第一標靶；其中第二對多肽能夠結合第二標靶分子；且 其中第一重鏈多肽之以多肽與第二重鏈多肽之以多肽在界 面處會合’且第二Fc多肽之界面包含突起，其可置於第一 Fc多肽界面之空腔中。 在第四態樣中，提供一種產生異多聚體蛋白質組合庫之 方法該方法包含具有第一異二聚域之第一含鉸鏈多肽及 具有第二異二聚域之第二含鉸鏈多肽，其中第二異二聚域 與第一異二聚域相互作用，且其中第一及第二含鉸鏈多肽 至夕個鏈間二硫鍵連接，該方法包含以下步驟： ⑷培養第-宿主細胞及至少兩種其他宿主細胞其中 &•該第一宿主細胞包含編碼含第一異二聚域之多肽的 第一核酸；及 該等其他宿主細胞包含構成含第二異二聚域之多肽 155406.doc 201139682 的核酸， (b) 將第一及至少兩種其他宿主細胞組合； (c) 處理該等細胞，以使第一及第二含異二聚域之多肽釋 放於細胞外環境中；及 (d) 回收異多聚體蛋白質， 其中該方法無需添加還原劑。
在第五態樣中，提供藉由本文所述之方法製造之異多聚 體蛋白質。 應瞭解，本發明之方法可包括其他步驟，該等步驟一般 為顯然用於起始及/或完成本文所述之本發明方法所涵蓋 之製程的常規步驟。舉例而言，在一實施例中，本發明方 法之步驟⑷前有如下步驟，#中將編碼第—含鉸鏈多狀之 核酸引入第—宿主細胞中’且將編碼第二含鉸鏈多肽之核 酸引入第二宿主細胞中。在一實施例中，本發明之方法進 步包3純化對至少兩種不同標乾具有結合特異性之異多 聚ϋ蛋白質的步驟β在—實施例中，在純化異多聚體蛋白 質之步驟之前’不超過約1〇%、15〇/。或之經分離多肽 以單體或重鏈-輕鏈二聚體形式存在。 在一實施例中，篦一芬/七银 弟及/或第二含鉸鏈多肽為抗體重 在另實施例中’抗體重鏈與抗體輕鏈配對以提供重 鏈輕鏈#在—些實施例中，重鏈-輕鏈對共價連接。在 另實施例中，重鍵_輕鍵對界定標乾結合臂。在一些實 施例中，標靶結合劈—# . , 貫一致。在一些實施例中，標靶結合臂 各自識別兩種不同標乾。 155406.doc -9- 201139682 在一些實施例中’第一及/或第二含鉸鏈多肽包含Fc 區。在另一實施例中，第一及/或第二含鉸鏈多肽包含至 少一個但定重鏈域。在另一實施例中，第一及/或第二含 鉸鏈多肽包含可變重鏈域。在另一實施例中，第一及/或 第二含鉸鏈多肽包含受體結合域。在一些實施例中，第一 及/或第二含鉸鏈多肽實質上一致（亦即異二聚域可能不一 致，而異二聚域外之區域一致在一些實施例中，第一 及/或第二含欽鏈多肽不一致。 在一些實施例中，異多聚體蛋白質係選自由以下組成之 群：抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、一臂抗體、單 特異性單價抗體、多特異性單價抗體、雙特異性最大抗 體、單抗體、免疫黏附素、肽體、雙特異性肽體、單價肽 體、親和抗體及受體融合蛋白。 在一些實施例中，該等異多聚體蛋白質包含鉸鏈區，其 具有至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個或任何整 數個至所有半胱胺酸殘基，該等殘基通常能夠形成重鏈間 二硫鍵聯（linkage)。在一些實施例中，將其他半胱胺酸引 入较鍵區中。 本發明之異多聚體蛋白質亦可為抗體片段，諸如Fc*Fc 融合多肽，只要其包含免疫球蛋白之鉸鏈區即可。Fc融合 多肽一般包含融合於異源多肽序列（諸如抗原結合域）之以 多肽（或其片段），諸如融合於免疫球蛋白Fc多肽之受體細 胞外域（ECD)(例如融合於lgG2 Fc之Fit受體ECD)。舉例而 言’在一實施例中’ Fc融合多肽包含VEGF結合域，其可 155406.doc •10· 201139682 為包括m、fik等之VEGF受體。本發明之異多聚體蛋白質 一般包含重鏈恆定域及輕鏈恆定域。在一實施例中，本發 明之異多聚體蛋白質包含修飾（例如（但不限於）插入一或多 個胺基酸以例如形成二聚序列（諸如白胺酸拉鏈））以形成重 鏈間二聚或多聚》在一些實施例中，本發明之異多聚體中 缺少Fc多肽之一部分（而非全部），只要其保留免疫球蛋白 之鉸鏈區即可。在一些此等實施例中，以多肽之缺少序列 為CH2及/或CH3域之一部分或全部。在一些此等實施例 中’異多聚體蛋白質包含例如融合於重鏈片段之C端的二 聚域（諸如白胺酸拉鏈序列）。在一些此等實施例中，異多 聚體蛋白質包含含突變之二聚域以提供「杵臼結構」二聚 域（如下文進一步定義）。 在本發明之方法及異多聚體蛋白質的一些實施例中，含 鉸鏈多肽包含至少一個促進第一及第二含錄鍵多肽之異二 聚而使均二聚最小之特徵（例如在重鍵之Fc多肽之間）。該 (等）特徵改良藉由本文所述之本發明方法可獲得的異多聚 體蛋白質群之產量及/或純度及/或均質性。在一實施例 中，第一含鉸鏈多肽及第二含绞鍵多肽之Fc多狀在界面處 會合/相互作用。在第一及第二含鉸鏈多肽之Fc多肽在界 面處會合的一些實施例中，第二Fc多肽之界面包含突起， 其可置於第一 Fc多肽界面之空腔中。在一實施例中，第一 Fc多肽已自模板/初始多肽改變以編碼空腔，或第二Fc多 肽已自模板/初始多肽改變以編碼突起，或編碼空腔與突 起。在一實施例中，第一 Fc多肽已自模板/初始多肽改變 155406.doc -11· 201139682 以編碼空腔’且第二Fc多肽已自模板/初始多肽改變以編 碼突起’或編碼空腔與突起。在一實施例中，第二Fc多肽 之界面包含突起’其可置於第一Fc多肽界面之空腔中，其 中分別將空腔或突起或兩者引入第一及第二以多肽之界面 中。在第一及第一 Fc多肽在界面處會合的一些實施例中， 第一 Fc多肽之界面包含突起，其可置於第二Fc多肽界面之 空腔中。在一實施例中’第二Fc多肽已自模板/初始多肽 改變以編碼空腔’或第一 Fc多肽已自模板/初始多肽改變 以編碼突起，或編碼空腔與突起。在一實施例中，第二Fc 多肽已自模板/初始多肽改變以編碼空腔，且第一 Fc多肽 已自模板/初始多肽改變以編碼突起，或編碼空腔與突 起。在一實施例中，第一 Fc多肽之界面包含突起，其可置 於第二Fc多肽界面之空腔中’其中分別將突起或空腔或兩 者引入第一及第二Fc多肽之界面中。 在一實施例中’突起及空腔各自包含天然存在之胺基酸 殘基。在一實施例中，包含突起之Fc多肽係藉由用側鏈體 積大於模板/初始多肽界面之初始殘基的輸入殘基置換該 初始殘基產生。在一實施例中，包含突起之Fc多肽係藉由 包含如下步驟之方法產生，其中編碼該多肽界面之初始殘 基的核酸經編碼側鏈體積大於該初始殘基之輸入殘基的核 酸置換。在一實施例中，初始殘基為蘇胺酸。在一實施例 中，輸入殘基為精胺酸。在一實施例中，輸入殘基為苯丙 胺酸（F)。在一實施例中，輸入殘基為酪胺酸（Y)。在一實 施例中，輸入殘基為色胺酸（W)。在一實施例中，輸入殘 155406.doc •12· 201139682 基為R、F、Y或W。在一實施例中，突起係藉由置換模板/ 初始多肽中之兩個或兩個以上殘基產生。在一實施例中， 包含突起之Fc多肽包含用色胺酸置換位置366之蘇胺酸， 胺基酸編说係根據Kabat等人（第688-696頁，Sequences of proteins of immunological interest，第 5版，第 1卷（1991; NIH，Bethesda，MD))之EU編號方案。 在一些實施例中，包含空腔之Fc多肽係藉由用側鏈體積 小於模板/初始多肽界面中之初始殘基之輸入殘基置換該 初始殘基產生。舉例而言，包含空腔之Fc多肽可藉由包含 如下步驟之方法產生，其中編碼該多肽界面之初始殘基的 核酸經編碼側鍵體積小於初始殘基之輸入殘基的核酸置 換。在一實施例中，初始殘基為蘇胺酸。在一實施例中， 初始殘基為白胺酸。在一實施例中，初始殘基為酪胺酸。 在一實施例中’輸入殘基不為半胱胺酸在一實施例 中，輸入殘基為丙胺酸（A)。在一實施例中，輸入殘基為 絲胺酸（S)。在一實施例中，輸入殘基為蘇胺酸（τ)。在一 實施例中’輸入殘基為纈胺酸（V)。空腔可藉由置換模板/ 初始多肽之一或多個初始殘基產生。舉例而言，在一實施 例中’包含空腔之Fc多肽包含置換兩個或兩個以上選自由 蘇胺酸、白胺酸及酪胺酸組成之群的初始胺基酸。在一實 施例中’包含空腔之Fc多肽包含兩個或兩個以上選自由丙 胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及纈胺酸組成之群的輸入殘基。在 一些實施例中’包含空腔之Fc多肽包含置換兩個或兩個以 上選自由蘇胺酸、白胺酸及酪胺酸組成之群的初始胺基 155406.doc •13- 201139682 酸’且其中該等初始胺基酸經選自由丙胺酸、絲胺酸、蘇 胺酸及纈胺酸組成之群的輸入殘基置換。在一實施例中， 包含空腔之Fc多肽包含用絲胺酸置換位置366之蘇胺酸， 胺基酸編號係根據前述Kabat等人之EU編號方案。在一實 施例中，包含空腔之Fc多肽包含用丙胺酸置換位置368之 白胺酸，胺基酸編號係根據前述Kabat等人之EU編號方 案。在一實施例中，包含空腔之Fc多肽包含用纈胺酸置換 位置407之酪胺酸，胺基酸編號係根據前述Kabat等人之EU 編號方案。在一實施例中，包含空腔之Fc多肽包含兩個或 兩個以上選自由T366S、L368A及Y407V組成之群的胺基 酸置換，胺基酸編號係根據前述Kabat等人之EU編號方 案。在此等抗體片段之一些實施例中，包含突起之Fc多肽 包含用色胺酸置換位置366之蘇胺酸，胺基酸編號係根據 前述Kabat等人之EU編號方案。 在各種實施例中，第一及第二重鏈多肽之Fc多肽可能一 致或不一致，只要其能夠二聚形成Fc區（如本文所定義）即 可。第一 Fc多肽一般相鄰連接於單一多肽中免疫球蛋白重 鏈之一或多個域，例如與鉸鏈、恆定及/或可變域序列連 接。在一實施例中，第一 Fc多肽包含鉸鏈序列之至少一部 分（包括全部）、CH2域之至少一部分（包括全部）及/或CH3域 之至少一部分（包括全部）。在一實施例中，第一 Fc多肽包 含免疫球蛋白之狡鏈序列及Ch2及Ch3域。在一實施例中， 第二Fc多肽包含鉸鏈序列之至少一部分（包括全部）、Ch2 域之至少一部分（包括全部）及/或Ch3域之至少一部分（包括 155406.doc • 14- 201139682 全部）β在一實施例中，第二Fc多肽包含免疫球蛋白之鉸 鏈序列及CH2及CH3域。在一實施例中，本發明之抗體包含 第一及第二Fc多肽，其各自包含至少一個抗體恆定域之至 少一部分《在一實施例中，抗體恆定域為^以及/或ch3 域。在包含恆定域之本發明抗體之任何實施例中，抗體恆 定域可來自任何免疫球蛋白類型’例如IgG。免疫球蛋白 來源可為任何適合之物種來源（例如IgG可為人類IgGi)或為 φ 合成形式。 在一實施例中，本發明抗體之第一及第二標靶分子結合 臂各別之第一輕鏈多肽及第二輕鏈多肽包含不同/相異抗 原結合決定子（例如不同/獨特可變域序列）。在一實施例 中，本發明抗體之第一及第二標耙分子結合臂各別之第一 輕鏈多肽及第二輕鏈多肽包含相同（亦即共同）抗原結合決 定子（例如相同可變域序列）。 本發明之方法能夠產生高均質性異多聚體分子。因此， 籲本發明提供如下方法，其中至少約40%、45%、50。/。、 55%、6〇%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95〇/〇、 96°/°、97%、98%、99°/〇多肽在包含第广重鏈與輕鏈多肽對 及第二重鏈與輕鏈多肽對之複合物中。在一實施例中，本 發明提供如下方法，其中約6〇0/〇至99〇/〇、7〇0/〇至98〇/〇、75% 至97% ' 80%至96。/。、85%至96%或9〇%至95%多肽在包含 第一重鍵與輕鏈多肽對及第二重鏈與輕鏈多肽對之複合物 中〇 在一實施例中，本發明之抗體係選自由IgG、lgE、 135406.doc -15- 201139682
IgA、IgM及IgD組成之群。在一些實施例中，本發明抗體 之鉸鏈區較佳係來自選自由IgG、IgA及IgD組成之群的免 疫球蛋白。舉例而言，在一些實施例中，抗體或抗體之鉸 键區係來自IgG，在一些 IgG2a或IgG2b)。在一些實施例中，本發明之抗體係選自 由IgG、IgA及IgD組成之群。在一實施例中，抗體來自人 類、人類化、嵌合或非人類（例如鼠類）來源。 本發明之異多聚體蛋白質一般能夠結合、較佳特異性結 合於抗原。該等抗原包括例如腫瘤抗原、細胞存活調節因 子、細胞增殖調節因子、與組織發生或分化有關（例如已 知或懷疑在功能上促進組織發生或分化）之分子、細胞表 面分子、淋巴激素、細胞激素、參與細胞週期調節之分 子、參與血小管生成之分子及與血管生成有關（例如已知 或懷疑在功能上促進血管生成）之分子。本發明之異多聚 體蛋白質能夠結合之抗原可為上述類別之子集的成員其 令該類別之其他子集包含具有相異特徵（相對於相關抗原） 之其他分子/抗原。相關抗原亦可視為屬於兩個或兩個以 上類別。在一實施例中，本發明提供結合較佳特異性結 合不為細胞表面分子之腫瘤抗原的異多聚體蛋白質。在一 另實施:二腫瘤抗原為細胞表面分子’諸如受體多狀。在 二：一些實施例中’本發明之異多聚鍾蛋白質 結合、較佳特異性結合 文貨 為集群（CluSter)分化因子之腫瘤 抗原。在另一實例中，士 jjj 發明之異多聚體蛋白皙能翻社 合、較佳特異性社入於隹 質此夠 °於麵分化时，在-些實施例中， 153406.doc 201139682
該因子不為例如CD3或CD4。在一些實施例中，本發明之 異多聚體蛋白質為抗VEGF抗體。在一些實施例中，本發 明之異多聚體蛋白質為選自由以下組成之群的雙特異性抗 體：IL-la/IL-Ιβ、IL-12/IL-18 ; IL-13/IL-9 ; IL-13/IL-4 ; IL-13/IL-5 ； IL-5/IL-4 ； IL-13/IL-ip ； IL-13/IL-25 ； IL-13/TARC ； IL-13/MDC ； IL-13/MEF ； IL-13/TGF-P ； IL-13/LHR 促效劑；11^12/丁\\^人1^、11^13/(：1^25;11^ 13/SPRR2a ; IL-13/SPRR2b ; IL-13/ADAM8、IL-13/PED2、 IL17A/IL17F、CD3/CD19、CD138/CD20 ; CD138/CD40 ; CD19/CD20 ； CD20/CD3 ； CD38/CD138 ； CD38/CD20 ； CD38/CD40 ； CD40/CD20 ； CD-8/IL-6 ； CD20/BR3、 TNFa/TGF-β、TNFa/IL-Ιβ ； TNFa/IL-2、TNFa/IL-3、 TNFa/IL-4、TNFa/IL-5、TNFa/IL6、TNFa/IL8、TNFa/IL-9 ' TNFa/IL-10 ' TNFa/IL-11 ' TNFa/IL-12 > TNFa/IL-13、TNFa/IL-14、TNFa/IL-15、TNFa/IL-16、TNFa/IL-17、TNFa/IL-18、TNFa/IL-19、TNFa/IL-20、TNFa/IL-23、TNFa/IFNa、TNFa/CD4、TNFa/VEGF、TNFa/MIF、 TNFa/ICAM-1、TNFa/PGE4、TNFa/PEG2、TNFa/RANK 配位體、TNFa/Te38 ; TNFa/BAFF ; TNFa/CD22 ; TNFa/ CTLA-4 ； TNFa/GP130 ； TNFa/IL-12p40 ； VEGF/HER2、 VEGF-A/HER2、VEGF-A/PDGF ' HER1/HER2 ' VEGF-A/VEGF-C、VEGF-C/VEGF-D、HER2/DR5、VEGF/IL-8、 VEGF/MET、VEGFR/MET 受體、VEGFR/EGFR、HER2/ CD64、HER2/CD3、HER2/CD16、HER2/HER3 ; EGFR/ 135406.doc -17- 201139682 HER2、EGFR/HER3、EGFR/HER4、IL-13/CD40L、IL4/ CD40L、TNFR1/IL-1R、TNFR1/IL-6R、TNFR1/IL-18R、
EpCAM/CD3、MAPG/CD28、EGFR/CD64、CSPG/RGM A ； CTLA-4/BTN02 ； IGF1/IGF2 ； IGFl/2/Erb2B ； MAG/ RGM A ； NgR/RGM A ； NogoA/RGM A ； OMGp/RGM A ； PDL-I/CTLA-4 ；及 RGM A/RGM B、IL10/IL18、NRP1/ VEGFA 、VEGFA/NRP2 、cMET/EGFR、ALK1/BMP9 、
VEGFA/a5pl、HER1/HER3-BU 及 CMV。在一些實施例 中，本發明之異多聚體蛋白質結合於至少兩種選自由以下 組成之群的標靶分子：α5β1、ALK1、BMP9、IL-la、IL-1β、TARC、MDC、MEF、TGF-β、LHR 促效劑、 TWEAK、CL25、SPRR2a、SPRR2b、ADAM8、PED2、 CD3 、 CD4 、 CD16 、 CD19 、 CD20 、 CD22 、 CD28 、 CD40、CD38、CD64、CD138、CD-8、BR3、TNFa、TGF· β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、
IL-11 、 IL-12 、 IL-13 、 IL-14 、 IL-15 、 IL-16 、 IL-17 、 IL- 17A、IL-17F、IL-18、IL-19、IL-20、IL-23、IL-25、 IFNa、MIF、ICAM-1、PGE4、PEG2、RANK 配位體、 Te38、BAFF、CTLA-4、GP130、IL-12p40、VEGF、 VEGF-A、PDGF、HER1、HER2、HER3、HER3-BU、 HER4、VEGF-C、VEGF-D、DR5、cMET、MET、MET 受 體、VEGFR、EGFR、CD40L、TNFR1、IL-1R、IL-6R、 IL-18R、EpCAM、MAPG、CSPG、BTN02、IGF1、 IGF2、IGF1/2、Erb2B、MAG、NgR、NogoA、NRP1、 155406.doc -18- 201139682 NRP2、OMGp、PDL-I、RGM A及 RGM B。在一些實施例 中，本發明之異多聚體蛋白質結合於CD3及至少一種選自 以下之其他標靶分子：BLR1、BR3、CD19、CD20、 CD22、CD72、CD79A、CD79B、CD180(RP105)、CR2、 FcRHl、FcRH2、FcRH5、FCER2、FCRL4、HLA-DOB及 NAG14。 本發明方法中之第一及第二宿主細胞可在允許表現及分 離相關多肽之任何環境中培養。舉例而言，在一實施例 中，本發明方法中之第一宿主細胞及第二宿主細胞以各別 細胞培養物形式生長。在另一實施例中，本發明方法中之 第一宿主細胞及第二宿主細胞以包含兩種宿主細胞之混合 培養物形式生長。 在一些實施例中，至少一種、至少兩種、至少三種或三 種以上表現其他含鉸鏈多肽之宿主細胞可在與含第一及/ 或第二鉸鏈宿主細胞相同或分開之培養物中生長。在一些 實施例中，其他含鉸鏈多肽包含與第一含鉸鏈多肽相同之 異二聚域。在一些實施例中，其他含鉸鏈多肽包含與第二 含鉸鏈多肽相同之異二聚域。 異多聚體蛋白質可經修飾以增強及/或添加其他所要特 徵。該等特徵包括生物學功能，諸如免疫效應功能、所需 活體内半衰期/清除率、生物可用性、生物分佈或其他藥 物動力學特徵。該等修飾為此項技術所熟知且亦可憑經驗 確定，且可包括由可能基於肽或不基於肽之部分進行之修 飾。舉例而言，抗體可經糖基化或去糖基化，一般至少部 153406.doc -19- 201139682 分視宿主細胞之性質而定。本發明之抗體較佳經去糖基 化。藉由本發明方法製造之去糖基化抗體可隨後藉由例如 使用此項技術中熟知之活體外糖基化方法來糖基化。如上 文及本文所述，本發明之異多聚體蛋白質可在原核細胞 (諸如大腸桿菌）中製造。大腸桿菌製造之異多聚體蛋白質 一般進行去糖基化且缺乏通常與在哺乳動物宿主細胞（例 如CHO)製造之異多聚體蛋白質中發現之糖基化特徵有關 的生物學功能。 本發明亦提供免疫結合物，其包含本發明之異多聚體蛋 白質與異源部分結合^任何異源部分均適合，只要其與抗 體之結合不會實質上減少抗體之所要功能及/或特徵即 可。舉例而言，在一些實施例中，免疫結合物包含作為細 胞毒性劑之異源部分《在一些實施例中，該細胞毒性劑係 選自由放射性同位素、化學治療劑及毒素組成之群。在一 些實施例中，該毒素係選自由加里刹黴素（caHchemicin)、 美登素（maytansine)及單端孢黴烯（trich〇thene)組成之群。 在一些實施例中，免疫結合物包含作為可偵測標記物之異 源部分《在一些實施例中，該可偵測標記物係選自由以下 組成之群：放射性同位素、配位體_受體對之成員、酶-受 質對之成員及螢光共振能量傳遞對之成員。 在態樣中，本發明提供組合物，其包含本發明之異多 聚體蛋白質及載劑，在—些實施例中，該載劑為醫藥學上 可接受之載劑。 在另-態樣中’本發明提供組合物，其包含本文所述之 155406.doc •20- 201139682 免疫結合物及载劑，在一些實施例中’該載劑為醫 可接受之載劑。 '予 在一態樣中，本發明提供包含本發明之多特異性異多 體蛋白質群的組合物。如熟習此項技術者所顯而易見，一 般而言，此類組合物不完全（亦即i 00%)均質。然而，如本 文所述，本發明之方法能夠製造實質上均質之多特異性異 多聚體蛋白質群。舉例而言，本發明提供包含異多聚體蛋 φ 白質之組合物，其中該等異多聚體蛋白質之至少40%、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、85%、9〇%、 95〇/。、96%、97%、98%、99%為本文所述之本發明多特異 性抗體（例如雙特異性抗體等）。 在一態樣中，本發明提供包含第一宿主細胞與第二宿主 細胞之混合物的細胞培養物，其中第一宿主細胞包含編碼 第一含鉸鏈多肽之核酸，且第二宿主細胞包含編碼第二含 鉸鏈多肽之核酸，且其中該兩對具有不同標靶結合特異 • 性。在一態樣中，本發明提供包含第一宿主細胞與第二宿 主細胞之混合物的細胞培養物，其中第一宿主細胞表現第 一對重鏈與輕鏈多肽，且第二宿主細胞表現第二對重键與 輕鏈多肽，且其中該兩對具有不同標靶結合特異性。 在另一態樣中’本發明提供如下製品，其包含容器及其 中所含之組合物，其中組合物包含本發明之異多聚體蛋白 質（例如抗體）。在另一態樣中，本發明提供如下製品，其 包含容器及其中所含之組合物，其中組合物包含本文所述 之免疫結合物。在一些實施例中，此等製品進一步包含該 155406.doc -21· 201139682 組合物之使用說明。 在另一態樣中’本發明提供編碼本發明之異多聚體蛋白 質的聚核苷酸。在另一態樣中，本發明提供編碼本文所述 之免疫結合物的聚核苷酸。 在一態樣中’本發明提供表現本發明之分子（例如抗體） 的重組載體。在另一態樣中，本發明提供表現本發明之免 疫結合物的重組載體。 多種宿主細胞中之任一者均可用於本發明之方法。該等 細胞為此項技術中已知（其中一些描述於本文中）或可使用 此項技術中已知之常規技術關於對用於本發明方法之適合 性憑經驗確定。在一實施例中’宿主細胞為原核細胞。在 一些實施例中，宿主細胞為革蘭氏陰性細菌細胞（gram_ negative bacterial cell) »在一實施例中，宿主細胞為大腸 桿菌。在一些實施例中’大腸桿菌為缺乏脂蛋白之菌株 (Δίρρ)。在一些實施例中’大腸桿菌宿主細胞之基因型缺 乏degP及prc基因且具有突變spr基因。在一實施例中，宿 主細胞為哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢（CHO)細胞。 在一態樣中’本發明提供包含本發明之聚核苷酸或重組 载體之宿主細胞。在一實施例中，宿主細胞為哺乳動物細 胞，例如中國倉鼠卵巢（CHO)細胞》在一實施例中，宿主 細胞為原核細胞。在一些實施例中，宿主細胞為革蘭氏陰 性細菌細胞，在一些實施例中，其為大腸桿菌。本發明之 宿主細胞可進一步包含編碼在宿主細胞中之表現可提高本 發明方法中異多聚體蛋白質之產量之分子的聚核苷酸或重 155406.doc -22- 201139682 組載體。舉例而言，該分子可為伴隨蛋白。在一實施例 中’該分子為選自由DsbA、DsbC、DsbG及FkpA組成之群 的原核多肽。在一些實施例中，該聚核苷酸或重組載體編 碼DsbA與DsbC。在一些實施例中’大腸桿菌宿主細胞為 缺乏内源蛋白酶活性之菌株。在一些實施例中，大腸桿菌 宿主細胞之基因型為缺乏degP及prc基因且具有突變Spr基
因之大腸才干菌菌株之基因型。在一些實施例中，大腸桿菌 宿主細胞之基因型為Δίρρ。 本發明之異多聚體蛋白質可廣泛應用於多種環境中。在 一實例中，本發明之異多聚體蛋白質為治療抗體。在另一 實例中，本發明之異多聚體蛋白質為促效抗體。在另一實 例中’本發明之異多聚體蛋白質為拮抗抗體。本發明之異 多聚體蛋白質亦可為診斷抗體。在另一實例中本發明之 異多聚體蛋白質為阻斷抗體。在另一實例中，本發明之異 多聚體蛋白質為中和抗體。 、在：’態#中’纟發明提供治療或延緩個體之疾病的方 法’該等方法包含投與該個體本發明之異多聚體蛋白質。 =實施射，該疾病為癌症。在另―實施例中，疾病與 在另—實施射，疾病為免疫病症， 類風濕性關節炎、务游A I k 4 I 斑狼瘡等。 < A疫血小板減少性紫癜、全身性紅 在一態樣中 如抗體）之用途 疾病（諸如癌症 本發明提供本發明之異多聚體蛋白質（例 其係用於製備供治療性及/或預防性處理 _'細胞增殖病、免疫（諸如自體免疫） ]55406.doc • 23 - 201139682 病症及/或血管生成相關病症）之藥物。 在一態樣中，本發明提供本發明之核酸之用途，其係用 於製備供治療性及/或預防性處理疾病（諸如癌症、腫瘤、 細胞增殖病、免疫（諸如自體免疫）病症及/或血管生成相關 病症）之藥物。 在一態樣中，本發明提供本發明之表現載體之用途，其 係用於製備供治療性及/或預防性處理疾病（諸如癌症、腫 瘤、細胞增殖病、免疫（諸如自體免疫）病症及/或血管生成 相關病症）之藥物。 在態樣中’本發明提供本發明之宿主細胞之用途，其 係用於製備供治療性及/或預防性處理疾病（諸如癌症、腫 瘤、細胞增殖病、免疫（諸如自體免疫）病症及/或血管生成 相關病症）之藥物。 在態樣中，本發明提供本發明之製品之用途，其係用 於製備供治療性及/或預防性處理疾病（諸如癌症、腫瘤、 細胞增殖病、免疫（諸如自體免疫）病症及/或血管生成相關 病症）之樂物。 在一態樣中，本發明提供本發明之套組之用途，其係用 於製備供治療性及/或預防性處理疾病(諸如癌症、腫瘤、 細胞增殖病、免疫（諸如自體免疫）病症及/或血管生成相關 病症）之藥物。 本發明之其他目的、特徵及優點將由以下詳細描述顯而 易知。然而，應瞭解’詳細描述及特定實例儘管表明本發 明之較佳實施例，但僅以說明之方式提供因為熟習此項 155406.doc 201139682 技術者由此詳細描述將顯而易知屬於本發明之範疇及精神 内之各種變化及修改。 【實施方式】 縮寫 ADCO抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 API=抗病原體免疫黏附素 BPI=殺菌/通透性增加蛋白 • Clq=補體因子lq CD=分化集群 CDO補體依賴性細胞毒性 CH1或CH1 =重鏈第一恆定域 CH2或CH2=重鏈第二恆定域 CH3或CH3 =重鏈第三恆定域 CH4或CH4=重鏈第四恆定域 CL或Cl=輕鏈怪定域 • CTLA=細胞毒性T淋巴細胞締合分子 Fc=可結晶片段
FcyR=IgG之Fc部分的受體γ HIV=人類免疫缺乏病毒 ICAM=細胞間黏著分子 BsAb=雙特異性抗體 BsDb=雙特異性雙功能抗體 dsFv=二硫基穩定之Fv Fc=抗體之恆定片段 155406.doc -25- 201139682
Fd=抗體之VH+CH1
FcR=Fc受體
Fv=抗體之可變片段
IgG=免疫球蛋白G mAb=單株抗體 PBL=周邊血液淋巴細胞 scDb=單鍵雙功能抗體 scFv=單鍵 Fv (seFv)2 = scFv-scFv 串聯體
Tandab=串聯雙功能抗體 VH或VH=抗體重鏈之可變域 VL或VL=抗體輕鏈之可變域 現僅使用以下定義及實例以參考之方式詳細描述本發 明。本文提及之所有專利及公開案（包括該等專利及公開 案中所揭示之所有序列）均以引用的方式明確併入本文 中〇 除非本文中另外定義，否則本文所用之所有技術及科學 術語均具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所瞭解之含 義相同的含義。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第 2版， John Wiley and Sons，New York (1994)及 Hale及 Marham， THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)為熟習此項技術者提供本發明 中所用之許多術語的通用詞典。儘管可使用任何與本文中 155406.doc -26· 201139682 所述之方法及材料相似或等效的方法及材料來實踐或測試 本發明’但描述較佳方法及材料。數值範圍包括界定範圍 之數值。除非另外指明’否則分別地，核酸以自左至右為 5·至3’取向來書寫；胺基酸序列以自左至右為胺基至緩基 取向來書寫。關於此項技術之定義及術語，從業人士尤其 受教於 Sambrook等人，1989 及 Ausubel FM等人，1993。應 瞭解’本發明並不限於所述特定方法、方案及試劑，因為 其可變化。 數值範圍包括界定範圍之數值》 除非另外指明，否則分別地，核酸以自左至右為5，至3, 取向來書寫；胺基酸序列以自左至右為胺基至羧基取向來 書寫。 本文所提供之標題並不限制本發明之各種態樣或實施 例’其可藉由在整體上查閱本說明書來瞭解❶相應地，下 文緊接著定義之術語藉由在整體上查閱本說明書而更全面 地定義。 I.定義 「異多聚體」、「異多聚體複合物」或「異多聚體蛋白 質」係指包含至少第一含鉸鏈多肽及第二含鉸鏈多肽之分 子’其中第一含鉸鏈多肽與第一含鉸键多肽的胺基酸序列 有至少一個胺基酸殘基不同。異多聚體可包含由第一及第 二含鉸鏈多肽形成之「異二聚體」，或可形成高級三級結 構’其中存在除第一及第二含鉸鏈多肽以外之多肽。異多 聚體之多肽可藉由非肽共價鍵（例如二硫鍵）及/或非共價相 155406.doc -27- 201139682 互作用（例如氫鍵、離子鍵、凡得瓦爾力（van der Waals force)及/或疏水性相互作用）而彼此相互作用。 如本文所用之「異多聚域」係指對生物分子之變化或添 加以促進異多聚體形成及阻礙均多聚體形成。相較於均二 聚體高度優先形成異二聚體之任何異二聚域屬於本發明之 範疇内。說明性實例包括（但不限於）例如美國專利申請案 20030078385(Arathoon 等人- Genentech ;描述杵臼結構）； WO 2007147901(Kjaergaard等人-Novo Nordisk :描述離子 籲 相互作用）；WO 2009089004(Kannan 等人-Amgen:描述靜 電牽引作用）；美國臨時專利申請案61/243，105(Christensen 等人-Genentech ;描述捲曲螺旋）。亦參見例如描述白胺酸 拉鏈之Pack，P·&Plueckthun，A.，Biochemistry31，1579-15 84 (1992)或描述螺旋-轉角-螺旋基元之Pack等人， Bio/Technology 11，1271-1277 (1993)。短語「異多聚域」 及「異二聚域」在本文中可互換使用。 如本文所用之短語「含鉸鏈多肽」係指包含對應於如此 φ 項技術中所瞭解之免疫球蛋白之鉸鏈區的區域（例如重鏈 之CH1與CH2域之間的區域）之多肽。如本文所用之「鉸鏈 區」、「鉸鏈序列」及其變化形式包括此項技術中已知之含 義，其於例如 Janeway’s Immunobiology，（Garland Science, Taylor & Francis Group，LLC，NY)(第 7版，2008) ; Bloom 等人，Proiez·” (1997),.6:407-415 ; Humphreys 等 人，《/. Immunol. (1997)， 209:193-202 中說明。亦 參見例如Burton，Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)及 155406.doc *· 28 · 201139682
Papadea，C·及I· j. Check (1989)「Human immunoglobulin G and immunoglobulin G subclasses: biochemical，genetic， and clinical aspects.」，Crit Rev Clin Lab Sci 27(1): 27- 58。熟習此項技術者應瞭解胺基酸之數目以及可用於鏈間 二硫鍵形成之半胱胺酸殘基之數目在免疫球蛋白之類別及 同型之間變化。所有該等鉸鏈區可在含鉸鏈多肽中且屬於 本發明之範内。 本文之術語「抗體」以最廣泛意義使用且係指包含兩條 重鏈及兩條輕鏈之任何免疫球蛋白（Ig)分子，及其任何片 段、突變體、變異體或衍生物，只要該等片段、突變體、 變異體或衍生物展現所要生物活性（例如抗原決定基結合 活性）即可。抗體之實例包括單株抗體、多株抗體、多特 異性抗體（例如雙特異性抗體）及本文所述之抗體片段。抗 體可為人類抗體、人類化抗體及/或親和力成熟抗體。 作為參考座標，如本文所用，抗體係指免疫球蛋白 G(IgG)之結構。然而，熟習此項技術者應瞭解/認識到任 何免疫球蛋白類別之抗體可用於本文所述之本發明方法 中。為清晰起見，IgG分子含有一對一致重鏈（HC)及一對 一致輕鏈（LC)。各LC具有一可變域（VL)及一恆定域（CL)， 而各HC具有一可變域（VH)及三個恆定域（CH1、CH2及 Ch3)。CH1及CH2域由鉸鏈區連接。此結構為此項技術所熟 知。參考圖1B » 如本文所用之「半抗體」係指一免疫球蛋白重鏈與一免 疫球蛋白輕鍵締合。一例示性半抗體描述於圖1A中。熟習 155406.doc •29· 201139682 此項技術者易瞭解，半抗體亦可具有由單一可變域組成之 抗原結合域。 術語「最大抗體」係指包含scFv融合於Fc多肽之融合蛋 白。參考WO 2009089004之圖8a。對於雙特異性最大抗 體，參考WO 2009089004之圖2。 術語人類IgG Fc區之「CH2域」通常根據EU編號系統自 IgG之約殘基231延伸至約340。CH2域獨特之處在於其不與 另一域緊密配對。相反，兩條N連接之分支碳水化合物鏈 插入完整天然IgG分子之兩個CH2域之間。據推測，碳水化 合物可替代域-域配對且幫助穩定Ch2域。Burton，Mol ec. Immunol. 22:161-206 (1985) ° 術語「CH3域」包含Fc區中C端殘基至CH2域之延伸序列 (亦即根據EU編號系統，IgG之約胺基酸殘基341至約胺基 酸殘基447)。 如本文所用之術語「Fc區」一般係指包含免疫球蛋白重 鏈之C端多肽序列的二聚體複合物，其中C端多肽序列為 可藉由木瓜蛋白酶消化完整抗體而獲得之序列。Fc區可包 含天然或變異Fc序列。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc序列的邊 界可改變，但人類IgG重鏈Fc序列通常定義為自約位置 Cys226處之胺基酸殘基或自約位置Pro230處之胺基酸殘基 延伸至Fc序列之羧基端。除非本文中另外規定，否則Fc區 或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統（亦稱作 EU 索引），如 Kabat 等人，iSegwewcei1 〇/ Proieiws 〇/ Immunological /«iereji，第 5 版，Public Health Service， 155406.doc -30- 201139682
National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991 中所述。 免疫球蛋白之Fc序列一般包含兩個恒定域：ch2域及Ch3 域’且視情況包含Ch4域。本文之「Fc多肽」意謂構成Fc 區之多肽之一’例如單體Fc。可自任何適合免疫球蛋白 (諸如 1经〇丨、IgG2、IgG3 或 IgG4 亞型、IgA、IgE、IgD 或 IgM)獲得Fc多肽。Fc區包含由二硫基結合在一起之兩條Η 鏈之幾基端部分。抗體之效應功能由Fc區中之序列決定； 此區亦為由存在於特定細胞類型上之Fc受體（FcR)識別之 部分。在一些實施例中，Fc多肽包含野生型鼓鍵序列之部 分或全部（通常在其N端）。在一些實施例中，Fc多肽不包 含功能性或野生型鉸鏈序列。 「功能性Fc區」具有天然序列Fc區之「效應功能」。例 示性「效應功能」包括C1 q結合；CDC ; Fc受體結合； ADCC ;吞噬作用；細胞表面受體（例如B細胞受體；BCR) 下調等。該等效應功能一般需要Fc區與結合域（例如抗體 可變域）組合，且可使用例如本文定義中所揭示之各種檢 定來評定。 「天然序列Fc區」包含與自然界中發現之Fc區之胺基酸 序列一致的胺基酸序列。天然序列人類Fc區包括天然序列 人類IgG! Fc區（非A及A異型）；天然序列人類IgG2 Fc區； 天然序列人類IgG3 Fc區；及天然序列人類IgG4 Fc區以及 其天然存在之變異體。 「變異Fc區」包含因至少一個胺基酸修飾、較佳一或多 個胺基酸取代而不同於天然序列Fc區之胺基酸序列的胺基 155406.doc •31- 201139682 酸序列°較佳地，變異Fc區相較於天然序列Fc區或親本多 肽之Fc區具有至少一個胺基酸取代，例如在天然序列以區 中或在親本多肽之FC區中具有約一至約十個胺基酸取代， 且較佳約一至約五個胺基酸取代。本文之變異Fcg較佳與 天然序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區具有至少約8〇0/。同源 性’且最佳與其具有至少約9〇%同源性，更佳與其具有至 少約95%、至少約96%、至少約97。/。、至少約98%或至少約 99%同源性。 如本文所用之「Fc組分」係指Fc區之絞鍵區、CH2域或 Ch3 域。 在某些實施例中，含鉸鏈多肽包含較佳衍生自野生型人 類IgG Fc區之lgG Fcg。「野生型」人類IgG Fc意謂天然存 在於人類群體内之胺基酸序列。當然，正如個體之間以序 列可略微變化，野生型序列可進行一或多個變化且仍然屬 於本發明之範疇内。舉例而言，^區可含有與本發明無關 之其他變化，諸如糖基化位點突變或包括非天然胺基酸。 術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參 與抗體結合於抗原之域。天然抗體之重鏈及輕鏈的可變域 (分別為VH及VL)—般具有類似結構，其中各域包含四個保 守構架區（FR)及三個高變區（HVR)。（參見例如Kindt等人 尺咖/咖麵/⑽，第6版，W.H. Freeman and c〇，第91頁 (2007)卜單一 Vh或Vl域可足以賦予抗原結合特異性。此 外，結合特定抗原之抗體可使用結合該抗原之抗體的Vh或 Vl域分別筛選互補Vl或Vh域之庫來分離。參見例如 155406.doc •32· 201139682
Portolano等人，《/· 150:880-887 (1993) ; Clarkson 等人，iVaiwre 352:624-628 (1991)。 如本文所用之術語「Fab」係指抗體之抗原結合片段。 如上所述’可使用木瓜蛋白酶消化完整抗體。木瓜蛋白酶 消化抗體可產生兩個一致抗原結合片段（亦即「Fab」片段） 及殘餘「Fc」片段（亦即前述fc區）》Fab片段由完整L鏈以 及Η鏈可變區域（VH)及一條重鏈之第一恆定域（Ch1)組成。 如本文所用之短語「抗原結合臂」、「標靶分子結合 臂」、「標乾結合臂」及其變化形式係指本發明之異多聚體 蛋白質中能夠特異性結合相關標乾的組成部分。一般而言 且較佳地’抗原結合臂為免疫球蛋白多肽序列（例如Cdr 及/或免疫球蛋白輕鏈及重鏈之可變域序列）之複合物》 「標起」或「標靶分子」係指由異多聚體蛋白質之結合 臂識別之部分。舉例而言，若異多聚體蛋白質為抗體，則 標乾可為單一分子或不同分子上之抗原決定基，或病原體 或腫瘤細胞，視情形而定。類似地，若異多聚體蛋白質為 受體-Fc融合蛋白’則標靶將為受體之同源結合搭配物。 熟習此項技術者應瞭解’標靶由標靶結合臂之結合特異性 決定且不同標靶結合臂可識別不同標靶。標靶較佳以高於 1 μΜ Kd之親和力結合於本發明之異多聚體蛋白質（根據斯 卡查德分析（scatchard analysis))。標靶分子之實例包括（但 不限於）血清可溶性蛋白及/或其受體，諸如細胞激素及/或 細胞激素受體、黏附素 '生長因子及/或其受體、激素、 病毒粒子（例如RSV F蛋白、CMV、StaphA、流行性感冒' 155406.doc 33- 201139682 c型肝炎病毒）、微生物（例如細菌細胞蛋白質真菌細 胞）、黏附素、CD蛋白及其受體。 「完整」或「全長」抗體之—實例為包含抗原結合臂以 及匕及至少重鏈怪定域CHl、Ch2及Ch3之抗體。恆定域可 為天然序列恆定域（例如人類天然序列恆定域）或其胺基酸 序列變異體。 如本文所用之術語「偶合」係指將第一與第二含欽鍵多 肽彼此連接所需之步驟，例如形成共價鍵。該等步驟包含 將第一及第二含鉸鏈多肽中之半胱胺酸殘基還原、退火 及/或氧化，形成鏈間二硫鍵。偶合可藉由化學交聯或使 用氧化還原系統達成。參見例如Humphreys等人，】
Immunol. Methods (1998) 217:1-10 及 Zhu 等人，cancer Lett·，（1994) 86: 127-134。 術語「多特異性抗體」以最廣泛意義使用且特別涵蓋具 有多抗原決定基特異性之抗體。該等多特異性抗體包括 (但不限於）包含重鏈可變域（Vh)及輕鏈可變域（Vl)之抗 體’其中vHvL單元具有多抗原決定基特異性；具有兩個或 兩個以上VL及VH域之抗體，其中各vHvL單元結合於不同 抗原決定基；具有兩個或兩個以上單一可變域之抗體，其 中各單一可變域結合於不同抗原決定基；全長抗體；抗體 片段，諸如Fab、Fv、dsFv、scFv、雙特異性雙功能抗體 及三功能抗體、共價或非共價連接之抗體片段。「多抗原 決定基特異性」係指特異性結合於相同或不同標靶上之兩 種或兩種以上不同抗原決定基之能力》「單特異性」係指 155406.doc •34· 201139682 僅結合一種抗原決定基之能力。根據一實施例，多特異性 抗體為以 5 μΜ 至 0.001 pM、3 μΜ 至0.001 pM、1 μΜ 至 0.001 ρΜ、0.5 μΜ至 0.001 ρΜ或 0.1 μΜ至 0.001 ρΜ之親和 力結合於各抗原決定基之IgG抗體。雙特異性抗體之示意 圖提供於圖1B中。 「抗體片段」包含完整抗體之一部分，較佳完整抗體之 抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、 F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體（Db);串聯雙功能抗體 (taDb)、線性抗體（例如美國專利第5,641，870號；Zapata等 人，Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)); — 臂抗體、單 可變域抗體、微型抗體、單鏈抗體分子；及由抗體片段形 成之多特異性抗體（例如包括（但不限於）Db-Fc、taDb-Fc、 taDb-CH3及（scFV)4-Fc)。 表述「單域抗體」（sdAb)或「單可變域（SVD)抗體」一 般係指單可變域（VH或VL)可賦予抗原結合之抗體。換言 之，單可變域無需為識別標靶抗原而與另一可變域相互作 用。單域抗體由各抗原結合臂上之單一單體可變抗體域 (VH或VL)組成。單域抗體之實例包括衍生自路駝科（轮馬 及駱駝）及軟骨魚（例如護士鯊）之抗體及由重組方法衍生自 人類及小鼠抗體之抗體（Ward等人，Nature (1989) 341:544-546 ; Dooley及Flajnik，Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56 ; Muyldermans等人，Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235 ; Holt#A，TrendsBiotechnol(2003):21:484-490 ; WO 2005/035572 ; WO 03/035694 ; Davies及Riechmann， 155406.doc -35- 201139682
Febs Lett (1994) 339:285-290 ； WO 00/29004 ； WO 02/ 051870)。單可變域抗體可以含其他可變區或可變域之抗 原結合臂（例如均或異多聚體）形式存在，在該情況下其不 為單域抗體。 表述「線性抗體」一般係指Zapata等人，Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)中所述之抗體。簡言之，此等抗體 包3 對串聯Fd區段（Vh-Ch1-Vh-Ch1)’其連同互補輕鍵 多肽一起形成一對抗原結合區。線性抗體可為雙特異性或 單特異性抗體。
本文提及之術語「杵臼結構」或「KnH」技術係指在活 體外或活體内藉由在多肽相互作用之界面處向一多肽中引 入突起（样）且向另一多肽中引入空腔（臼）來指導兩個多肽 配對在一起的技術。舉例而言，已在抗體之Fc:Fc結合界 面、CL:CH1界面或VH/VL界面中引入KnH(例如US 2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431 及 Zhu 等 人 ’（1997) Protein Science 6:781-788)。此尤其適用於在 製造多特異性抗體期間推動兩個不同重鏈配對在一起。舉 例而言’ Fc區中具有KnH之多特異性抗體可進一步包含單 一可變域連接於各Fc區，或進一步包含不同重键可變域與 類似或不同輕鏈可變域配對》KnH技術亦可用於使兩個不 同受體細胞外域或包含不同標靶識別序列之任何其他多狀 序列（例如包括親和抗體、肽體及其他Fc融合物）配對在— 起。 「Fvj由一個重鏈可變區域與一個輕鍵可變區域緊密非 155406.doc -36 - 201139682 共價締合而成之二聚體組成。此兩個域摺疊產生六個高變 環（Η鏈及L鏈各3個環），其提供用於抗原結合之胺基酸殘 基’且賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單一可變域 (或僅包含三個對抗原具有特異性之CDR的半個Fv)亦具有 識別及結合抗原之能力，但通常親和力比完整結合位點 低。 「單鏈Fv」（亦簡寫為「sFv」或「scFv」）為包含vH及 φ Vl抗體域連接於單一多肽鏈中之抗體片段。sFv多肽較佳 在VH與VL域之間進一步包含使sFv能夠形成抗原結合所要 結構之多肽連接子。關於sFv之評述，參見piuckthun，The
Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113 卷， Rosenburg及 Moore編 ’ Springer-Verlag，New York，第 269-3 15 頁（1994) ; Malmborg等人，J. Immunol. Methods 183:7-13, 1995 。 術語「雙功能抗體」係指藉由在VH與VL域之間用短連 • 接子（約5-10個殘基）構築sFv片段（參見前段），以達成V域 之鏈間而非鏈内配對，從而得到二價片段（亦即具有兩個 抗原結合位點之片段）而製備的小抗體片段。雙特異性雙 功能抗體為兩個「交叉」sFv片段之異二聚體，其中兩個 抗體之VH域及VL域存在於不同多肽鏈上》雙功能抗體更詳 細地描述於例如 EP 404,097、WO 93/11161 及 Hollinger 等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90:6444-6448 (1993)中。 術語「一臂抗體」係指包含以下之抗體：（1)藉由肽鍵 接合於包含CH2域、CH3域或CH2-CH3域之多肽的可變域； 155406.doc -37- 201139682 及（2)第二CH2、CH3或CH2-CH3域，其中可變域未藉由肽鍵 接合於包含第二CH2、CH3或CH2-CH3域之多肽。在一實施 例中’ 一臂抗體包含3種多肽：（1)包含可變域（例如VH)、 CH1、CH2及CH3之第一多肽，（2)包含可變域（例如VL)&CL 域之第二多肽’及（3)包含CH2及CH3域之第三多肽。在另 一實施例中，一臂抗體具有含兩個半胱胺酸殘基之部分鉸 鏈區’該兩個半胱胺酸殘基形成連接恆定重鏈之二硫鍵。 在一實施例中，一臂抗體之可變域形成抗原結合區。在另 一實施例中，一臂抗體之可變域為單一可變域，其中各單 一可變域為抗原結合區。在一實施例中，一臂抗體為單可 變域抗體。 本發明之抗體可為「嵌合」抗體，其中重鏈及/或輕鏈 之一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類之抗 體的相應序列一致或同源，而該（等）鍵之其餘部分與源自 另一物種或屬於另一抗體類別或亞類之抗體的相應序列一 致或同源；以及該等抗體之片段，只要其展現出所要生物 活性即可（美國專利第4,816,567號；及Morrison等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。本文之 相關嵌合抗體包括「靈長類化」抗體，其包含源自非人類 靈長類動物（例如舊大陸狼（Old World Monkey)、猿等）之 可變域抗原結合序列及人類恆定區序列。 非人類（例如齧齒動物）抗體之「人類化」形式為含有源 自非人類抗艎之最小序列的嵌合抗體。在大多數情況下， 人類化抗體為如下人類免疫球蛋白（接受者抗體），其中接 155406.doc •38· 201139682 受者高變區之殘基置換為具有所要抗體特異性、親和力及 能力之非人類物種（諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類 動物）(供者抗體）高變區之殘基。在一些情況下，人類免疫 球蛋白之構架區（FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外， 人類化抗體可包含接受者抗體或供者抗體中未發現之殘 基°可進行此等修飾以進一步改善抗體效能。一般而言， 人類化抗體包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全 部’其中所有或實質上所有高變環對應於非人類免疫球蛋 白之高變環’且所有或實質上所有FR為人類免疫球蛋白序 列之FR。人類化抗體視情況亦包含免疫球蛋白恆定區（Fc) 之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白恆定區之至少一部 分。關於其他詳情，參見jones等人，Nature 321:522-525 (1986) ; Riechmann等人，Nature 332:323-329 (1988);及 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。 「肽體j係指隨機產生之肽與Fc域之融合物，參見2〇〇3 年12月9日頒予Feige等人之美國專利第6,660,843號（以全文 引用的方式併入本文中）。其包括一或多種肽連接於N端、 C端、胺基酸側鏈或一個以上此等位點。肽體技術使設計 併入乾向一或多種配位體或受體之肽、腫瘤導向肽、膜輸 送肽及其類似物的治療劑成為功能^肽體技術已證明適用 於設計多種該等分子，包括線性及二硫基限制肽、「串聯 肽多聚體」（亦即Fc域單鏈上之一個以上肽）。參見例如美
國專利第6,660,843號；2003年10月16日公開之美國專利申 請案第2003/0195156號（對應於2〇〇2年11月21日公開之WO 155406.doc •39- 201139682 02/092620) ; 2003年9月18日公開之美國專利申請案第 2003/0176352號（對應於2003年4月17日公開之WO 03/ 031589) ; 1999年10月22日申請之美國第09/422,838號（對 應於2000年5月4日公開之WO 00/24770) ; 2003年12月11日 公開之美國專利申請案第2003/0229023號；2003年7月17 日公開之WO 03/057134 ; 2003年12月25日公開之美國專利 申請案第2003/0236193號（對應於2004年4月8日申請之 PCT/US04/010989) ; 2003 年 9月 18 日申請之美國第 10/ ^ 666,480號（對應於2004年4月1日公開之WO 04/026329)，其 各以全文引用的方式併入本文中。 「親和抗體」係指使用藉由肽鍵連接於Fc區之蛋白質， 其中該蛋白質用作提供標靶分子之結合表面的骨架。該蛋 白質通常為天然存在之蛋白質，諸如葡萄球菌蛋白 A(staphylococcal protein A)或IgG結合B域或衍生自其之Z 蛋白（參見 Nilsson等人，（1987)，Prot Eng 1，107-133及美國 專利第5，143,844號）或其片段或衍生物。舉例而言，親和 φ 抗體可由對標靶分子之結合親和力改變之Z蛋白變異體產 生，其中Z蛋白之區段已藉由隨機突變誘發而突變，產生 能夠結合標靶分子之變異體之庫。親和抗體之實例包括美 國專利第 6,534,628號；Nord K等人，Prot Eng 8:601-608 (1995);及 Nord K等人，Nat Biotech 15:772-777 (1997); Biotechnol Appl Biochem. 2008年 6 月；50(第 2部分）：97-112 » 如本文所用之術語「免疫黏附素」表示組合異源蛋白質 15S406.doc • 40- 201139682 (「黏附素」）之結合特異性與免疫球蛋白恆定域之效應功 能的分子。在結構上，免疫黏附素包含具有所要結合特異 性之胺基酸序列（該胺基酸序列不為抗體之抗原識別及結 合位點，亦即相較於抗體之恆定區為「異源」）與免疫球 蛋白恆定域序列（例如IgG之Ch2及/或Ch3序列）之融合物。 例不性黏附素序列包括包含結合於相關蛋白質之受體或配 位體之^部分的相鄰胺基酸序列。黏附素序列亦可為結合 相關蛋白質但不為受體或配位體序列的序列（例如肽體中 之黏附素序列）。該等多肽序列可藉由各種方法選擇或鑑 別’包括f菌體呈現技術及高通量分選方法。免疫黏附素 中之免疫球蛋白‘⑨定域序列可獲自任何免疫球蛋白諸如 IgGl、IgG2、IgG3 或 IgG4 亞型、lgA(包括 IgA]^IgA2)、 IgE、IgD或 IgM 〇 如本文所用之複合」係指兩個或兩個以上分子彼此經 由非肽鍵之鍵及/或力（例如凡得瓦爾力、疏水性力、親水 性力）相互作用而締合。在一實施例中複合為異多聚。 應瞭解，如本文所用之術語「蛋白質複合物」&「多肽複 〇物」包括蛋白質複合物中具有非蛋白質實體（例如包括 (但不限於）化學分子’諸如毒素或偵測劑）結合於蛋白質的 複合物。 結合相關抗原之本發明異多聚體蛋白質為以；i以使得異 多聚體蛋白質適用作靶向表現標靶之蛋白質或細胞或組織 之診斷及/或治療劑的親和力結合標靶且不與其他蛋白質 顯著交叉反應的蛋白質。在該等實施例中，如螢光活化細 155406.doc •41· 201139682 胞刀選（FACS)分析或放射免疫沈澱（RIA)或EUSA所測 定，異多聚體蛋白質結合於「非標靶」蛋白質之程度應小 於抗體結合於其特定標靶蛋白質的約10。/〇。關於異多聚鳢 蛋白質結合於標靶分子，術語「特異性結合」或「特異性 、、’於」或「特異性針對」特定多肽或特定多肽標靶上之 抗原決疋基意謂顯著不同於非特異性相互作用（例如非特 異性相互作用可為結合於牛血清白蛋白或酪蛋白）之結 合。特異性結合可例如藉由測定分子之結合，與對照分子 之結合相比較來量測。舉例而言，特異性結合可藉由與類 似於標靶之對照分子（例如過量未標記標靶）競爭來測定。 在此情況下，若經標記標靶與探針之結合受過量未標記標 靶競爭性抑制’則表明特異性結合。如本文所用之術語 「特異性結合」或「特異性結合於」或「特異性針對」特 定多肽或特定多肽標靶上之抗原決定基可例如由對標靶之 Kd值為至少約200 ηΜ、或者至少約15〇 ηΜ、或者至少約 100 ηΜ或者至少約60 ηΜ、或者至少約5〇 ηΜ、或者至 少約40 ηΜ、或者至少約3〇 ηΜ、或者至少約2〇 ηΜ、或者 至少約10 ηΜ、或者至少約8 ηΜ、或者至少約6 ηΜ、或者 至少約4 ηΜ、或者至少約2 ηΜ、或者至少約i ηΜ或更大 的分子展現。在一實施例中，術語「特異性結合」係指如 下結合’其中異多聚體蛋白質結合於特定多狀或特定多肽 上之抗原決定基而不會實質上結合於任何其他多肽或多肽 抗原決定基。 「結合親和力」一般係指分子（例如抗體）之單一結合位 155406.doc -42- 201139682 點與其結合搭配物（例如抗原）之間的非共價相互作用的總 強度。除非另外指明，否則如本文所用之「結合親和力」 係指反映結合對（例如抗體與抗原）成員之間1:1相互作用之 固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由 解離常數（Kd)表示。舉例而言，Kd值可為約200 nM、150 nM、100 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、 10 nM、8 nM、6 nM、4 nM、2 nM、1 nM 或更強。可藉由 此項技術中已知之通用方法（包括本文所述之方法）量測親 和力。低親和力抗體一般緩慢地結合抗原且傾向於容易解 離，而高親和力抗體一般較快地結合抗原且傾向於保持較 長時間結合。此項技術中已知多種量測結合親和力之方 法，任一方法均可用於達成本發明之目的。 在一實施例中，藉由在25°C下，用約10個反應單位（RU) 之固定標靶（例如抗原）CM5晶片，使用BIAcoreTM-2000或 BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)，使用表面 電漿子共振檢定來量測根據本發明之「Kd」或「Kd值」。 簡言之，根據供應商之說明，用N-乙基_N'-(3-二甲基胺基 丙基）-碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC)及N-羥基丁二醯亞胺（NHS) 活化羧曱基化聚葡萄糖生物感測器晶片（CM5，BIAcore 111(：.)。用1〇111]^乙酸鈉（？114.8)稀釋抗原至5 4§/1111(約0_2 μΜ)，隨後以5 μΐ/min之流速注射，獲得約10個反應單位 (RU)之偶合蛋白質。注射抗原後，注射1 Μ乙醇胺以阻斷 未反應之基團。為進行動力學量測，在25°C下以約25 μΐ/min之流速注射Fab於含0.05% Tween 20之PBS (PBST)中 155406.doc -43· 201139682 之兩倍連續稀釋液（例如〇·78 nM至500 nM) »使用簡單一 對一朗谬爾結合模型（one-to-one Langmuir binding model)(BIAcore評估軟體3.2版），藉由同時擬合締合與解 離感測器圖譜來計算締合速率（kd及解離速率（kw) 平衡 解離常數（Kd)計算為比率。參見例如Chen等人，J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)。若藉由上述表面電漿子共 振檢定，締合速率超過1〇6 M·1 S·1，則締合速率可藉由使 用螢光淬滅技術量測，該技術係在25°C下，在濃度增大之 抗原存在下，如光譜儀（諸如具有攪拌式比色管之停流裝 備型分光光度計（Aviv Instruments)或8000-系列SLM-Aminco分光光度計（ThermoSpectronic))中所量測，量測 PBS (pH 7.2)中之20 nM抗抗原抗體（Fab形式）之螢光發射 強度（激發=295 nm;發射=340 nm，16 nm帶通）之增加或 減少。 除非另外規定，否則有關本發明異多聚體蛋白質（諸如 抗體、片段或其衍生物）之「生物學活性」及「生物特 徵」意謂具有結合於生物分子之能力。 「經分離」在用於描述各種異多聚體多肽時意謂已自表 現其之細胞或細胞培養物分離及/或回收之異多聚體。其 天然環境之污染組分為將干擾異多聚體之診斷或治療用途 之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶 質。在某些實施例中，異多聚體（1)如藉由勞立法（Lowry method)所測定，純化至大於95重量％，且最佳大於99重量 °/〇蛋白質；（2)純化至足以藉由使用旋杯式定序儀獲得n端 I55406.doc • 44- 201139682 或内部胺基酸序列之至少個殘基的程度；或（3)純化至藉 由SDS-PAGE在還原或非還原條件下❹μ (Coomassie blue)或較佳銀染色法得知之均質性。然而通 常經分離多肽藉由至少一個純化步驟製備。 本發明之異多聚體一般純化至實質上「 上均質」、「實質上均質形式」及「實質上均質性:用^ 不產物實質上不含源自不需多肽組合（例如均多聚體）之副 ^ 產物。 在純度方面表述之實質上均質性意謂副產物之量不超過 10重量％、9重量％、8重量％、7重量％、6重量％、4重量 %、3重量。/。、2重量％或丨重量％或小於丨重量％。在一實施 例中，副產物少於5%。 「生物分子」係指核酸、蛋白質、碳水化合物、脂質及 其組合。在一實施例中，生物分子存在於自然界中。 如本文所用之「連接」意謂第一與第二胺基酸序列之間 • 的直接肽鍵鍵聯，或涉及第三胺基酸序列之鍵聯，該第三 胺基酸序列以肽鍵鍵結於第一及第二胺基酸序列且鍵結於 第一與第二胺基酸序列之間。舉例而言，連接子以肽鍵鍵 結於一胺基酸序列之C端且鍵結於另一胺基酸序列之N 端。 如本文所用之「連接子」意謂長度為兩個或兩個以上胺 基k之胺基酸序列。連接子可由中性極性或非極性胺基酸 組成。連接子長度可為例如2至1〇〇個胺基酸，諸如長度為 2至50個胺基酸’例如長度為3、5、1〇、15、20、25、 155406.doc -45. 201139682 的、35、40、45或50個胺基酸。連接子可為「可裂解 如藉由自裂解或酶法或化學裂解。胺基酸序列中 術所孰/點及在該等位點處裂解之酶及化學物質為此項技 術所熟知且亦描述於本文令。 本文所用之冑栓」意謂接合兩個其他胺基酸序列之 胺基酸連接子。本域述之繫栓可連接免疫球蛋自重鏈可 變域之N端與免疫球蛋白輕靠定域之^在特定實施 例中’繫栓長度為約15至5〇個胺基酸，例如長度為2〇至26 個胺基酸(例如長度為20、21、22、23、24、25或26個胺 基酸）。繫栓可為「可裂解的」，例如藉由自裂解或使用此 項技術中之標準方法及試劑酶法或化學裂解。 「連接子」或「繫栓」之酶法裂解可涉及使用内狀酶， 諸如 Lys-C、Asp-N、Arg-C、V8、Glu-C、胰凝乳蛋白 酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝血酶、 Genenase、因子Xa、TEV(菸草蝕刻病毒半胱胺酸蛋白 酶）、腸激酶、HRV C3(人類鼻病毒C3蛋白酶）、激肽原酶 以及枯草桿菌蛋白酶樣原蛋白轉化酶（例如弗林蛋白酶 (PCI)、PC2或PC3)或N-精胺酸二元轉化酶。化學裂解可涉 及使用例如羥基胺、N·氯丁二醯亞胺、N-溴丁二醯亞胺或 溴化氰。 如本文所用之「Lys-C内肽酶裂解位點」為胺基酸序列 中可藉由Lys-C内肽酶在C端側裂解之離胺酸殘基。Lys_c 内肽酶在離胺酸殘基之C端側裂解。 「離液劑」意謂藉由干擾穩定分子内相互作用（例如氫 155406.doc -46- 201139682 鍵、凡得瓦爾力或疏水性作用）而破壞蛋白質（例如抗體）之 三維結構的水溶性物質。例示性離液劑包括（但不限於）尿 素、鹽酸胍、過氣酸鋰、組胺酸及精胺酸。 「溫和清潔劑」意謂藉由干擾穩定分子内相互作用（例 如氫鍵、凡得瓦爾力或疏水性作用）而破壞蛋白質（例如抗 體）之三維結構’但不會永久破壞蛋白質結構而造成生物 活性喪失（亦即不會使蛋白質變性）的水溶性物質。例示性 籲 溫和清潔劑包括（但不限於）Tween(例如Tween-20)、 Triton(例如Triton X-100)、NP-40(壬基苯氧基聚乙氧基乙 醇）、Nonidet P-40(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）及十二烷基 硫酸鈉（SDS)。 抗體「效應功能」係指可歸因於抗體之以區（天然序列 Fc區或胺基酸序列變異體以區）的生物活性，且其隨抗體 同型而變化。抗體效應功能之實例包括：Clq結合及補體 依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細 籲胞毒性（ADCC);吞噬作用；細胞表面受體（例如B細胞受 體）下調；及B細胞活化。 「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCc」係指 如下細胞毒性形式，其中結合於某些細胞毒性細胞（例如 自然殺手（NK)細胞、嗜中性白血球及巨嗤細胞）上所存在 之Fc受體（FCR)的分泌型1§使此等細胞毒性效應細胞能夠特 異性結合於帶有抗原之標乾細豸且隨後用細胞毒性劑殺死 乾’、田胞抗體「裝備」該等細胞毒性細胞且為該殺死絕 對需要。用於介導ADCC之初級細胞Νκ細胞僅表現 155406.doc •47- 201139682
FcyRIII，而單核細胞表現 FcyRI、FcyRII 及 FcyRIII e FcR 在造血細胞上之表現概括於Ravetch及Kinet，Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)第464頁表3中。為評定相關分子 之ADCC活性，可執行活體外ADCC檢定，諸如美國專利 第5,500,362號或第5,821，337號中所述之檢定。適用於該等 檢定之效應細胞包括周邊血液單核細胞（PBMC)及自然殺 手（NK)細胞》或者或另外，可例如在動物模型（諸如 Clynes等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998) 中所揭示之動物模型）中活體内評定相關分子之ADCC活 性。 「Fc受體」或「FcR」描述結合於抗體Fc區之受體。較 佳FcR為人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體之FcR(y 受體）且包括FcyRI、FcyRII及FcyRIII亞類之受體，包括此 等受體之對偶基因變異體及替代性拼接形式。FcyRII受體 包括FcyRIIA(「活化受體」）及FcYRIIB(「抑制受體」）， 兩者具有類似胺基酸序列，主要不同之處在其細胞質域。 活化受體FcyRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺 酸之活化基元（ITAM)。抑制受體FcyRIIB在其細胞質域中 含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元（ITIM)(參見評述M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)) o FcR評 述於 Ravetch 及 Kinet，Annu. Rev. Immunol 9:457-492 (1991) ; Capel等人，Immunomethods 4:25-34 (1994);及 de Haas等人，J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)。本文 之術語「FcR」涵蓋其他FcR，包括將來待鑑別之FcR。該 155406.doc • 48 - 201139682 術語亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎 兒（Guyer 等人，J. Immunol. 117:587 (1976)及 Kim等人，J·
Immunol. 24:249 (1994)) ° 「人類效應細胞」為表現一或多種FcR且執行效應功能 之白血球。該等細胞較佳至少表現FqRin且執行ADCC效 應功能。介導ADCC之人類白血球之實例包括周邊血液單 核細胞（PBMC)、自然殺手（NK)細胞、單核細胞、細胞毒 性T細胞及嗜中性白血球；其中pBMC及NK細胞為較佳》 效應細胞可自天然來源（例如血液）分離。 「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指在補體存在下 標靶細胞之溶解。經典補體路徑之活化係由補體系統之第 一組分（Clq)結合於與其同源抗原結合之（適當亞類）抗體而 開始。為評定補體活化，可執行CDC檢定，例如Gazzano-
Santoro 等人，J. Immunol. Methods 202:163 (1996)中所 述。 術語「治療有效量」係指抗體、抗體片段或衍生物治療 個體之疾病或病症的量。在腫瘤（例如癌性腫瘤）之情況 下’治療有效量之抗體或抗體片段（例如多特異性抗體或 抗體片段）可減少癌細胞之數目；減小原發性腫瘤尺寸； 抑制（亦即在某種程度上減緩且較佳停止）癌細胞向周邊器 官浸潤；抑制（亦即在某種程度上減緩且較佳停止）腫瘤轉 移；在某種程度上抑制腫瘤生長；及/或在某種程度上緩 解與病症有關之一或多種症狀。在抗體或抗體片段可阻止 生長及/或殺死所存在之癌細胞的程度上，該抗體或抗體 155406.doc • 49· 201139682 片段可具有細胞生長抑制性及/或細胞毒性。對於癌症療 法，可例如藉由評定存活持續時間、疾病進展時間 (TTP)、反應率（RR)、反應持續時間及/或生活品質來量測 活體内功效。 「減小或抑制」意謂能夠引起整體降低較佳20%或20% 以上，更佳50%或50%以上且最佳75%、85%、90%、95% 或95以上。減小或抑制可指所治療病症之症狀、轉移之 存在或尺寸、原發性腫瘤之尺寸或血管生成病症中血管之 尺寸或數目。 術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中通常特 徵為不受調控之細胞生長/增殖的生理病狀。此定義包括 良性及惡性癌症。癌症之實例包括（但不限於）：癌瘤、淋 巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病。該等癌症之更特定實例 包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、 肺鱗癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（包括胃腸癌）、胰臟 癌、膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝 癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮 内膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌（例如腎細胞癌）、肝 癌、前列腺癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝癌瘤、肛門癌、陰 莖癌、黑色素瘤及各類型頭頸癌。「早期癌症」意謂非侵 襲性或轉移性或歸屬於〇、I或II期癌症的癌症。術語「癌 症前期J係指通常在癌症之前或發展成癌症之病狀或生 長。非轉移性」意謂癌症為良性的或保持在原發性位點 且尚未滲透至淋巴或血管系統中或除原發性位點以外之組 155406.doc 201139682 織中。非轉移性癌症一般為0、工或]^期癌症且有時ΠΙ期癌 症之任何癌症。 本文之「過敏或發炎病症」為由個體之免疫系統過度活 化而引起之疾病或病症。例示性過敏或發炎病症包括（但 不限於）哮喘、牛皮癬、類風濕性關節炎、異位性皮膚 炎、多發性硬化症、全身性紅斑狼瘡、濕疹、器官移植、 年齡相關之黃斑變性、克羅恩氏病（Crohn，s disease)、潰瘍 性結腸炎、嗜伊紅血球性食道炎及與發炎有關之自體免疫 疾病。 本文之「自體免疫疾病」為由個體自身組織引起且針對 個體自身組織的疾病或病症或其共分離或表現形式或由其 所引起之病狀。自體免疫疾病或病症之實例包括（但不限 於）關節炎（類風濕性關節炎，諸如急性關節炎 '慢性類風 濕性關節《、痛風性關節炎、急性痛風性關節炎、慢性發 炎性關節<、退化性關節炎、傳染性關節炎、萊姆關節炎 (Lyme arthritis)、增生性關節炎、牛皮癖性關節炎、脊椎 關節炎及幼年發作型類風濕性關節炎、骨關節炎、慢性漸 進性關節《、變形性關節炎、慢性原發性多發性關節炎、 反應性關節炎及僵直性脊椎炎）、發炎性過度增殖皮膚 病、牛皮癬（諸如斑塊狀牛皮癬、滴狀牛皮癖、膿跑型牛 皮癖及指曱牛皮癬)、皮膚炎(包括接觸性皮膚炎、慢性接 觸性皮膚炎、過敏性皮膚炎、過敏性接觸性皮膚炎、疱疹 樣皮膚炎及異位性皮膚炎）、x連鎖高IgM症候群、蓴麻療 (諸如慢性過敏性蓴麻疹及慢性特發性蓴麻疹包括慢性 155406.doc •51· 201139682 自體免疫性蓴麻療）' 多發性肌炎/皮肌炎、青少年皮肌 炎、中毒性表皮壞死溶解、硬皮病（包括全身性硬皮病）、 硬化症（諸如全身性硬化症、多發性硬化症（MS)(諸如脊髓-眼MS、原發性進行性ms(PPMS)及復發緩解性MS (RRMS))、進行性全身性硬化症、動脈粥樣硬化、動脈硬 化、播散性硬化及共濟失調硬化）、發炎性腸道疾病 (IBD)(例如克羅恩氏病、自體免疫介導之胃腸病、結腸炎 (諸如潰瘍性結腸炎、顯微鏡下結腸炎、膠原性結腸炎、 息肉狀結腸炎、壞死性小腸結腸炎及透壁性結腸炎）及自 體免疫性發炎性腸道疾病）、壞疽性膿皮病、結節性紅 斑、原發性硬化性膽管炎、上鞏膜炎、呼吸窘迫症候群 (包括成人或急性呼吸窘迫症候群（ARDS))、腦膜炎、葡萄 膜全部或部分發炎、虹膜炎、脈絡膜炎、自體免疫性血液 病症、類風濕性脊椎炎、突發性耳聱、IgE介導之疾病（諸 如全身性過敏反應及過敏性及異位性鼻炎）、腦炎（諸如拉 氏腦炎（Rasmussen’s encephalitis)及邊緣葉腦炎及/或腦幹 腦炎）、葡萄膜炎（諸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉 芽腫性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡 萄膜炎、後葡萄膜炎或自體免疫性葡萄膜炎）、有或無腎 病症候群之腎小球腎炎（GN)(諸如慢性或急性腎小球腎 炎’諸如原發性GN、免疫介導之gn、膜性GN(膜性腎 病）、特發性膜性GN或特發性膜性腎病、膜或膜性增生性 GN(MPGN)(包括I型及II型）及快速進行性gn)、過敏性病 狀、過敏反應、濕疹（包括過敏性或異位性濕療）、哮喘（諸 155406.doc -52· 201139682 如支氣管哮喘及自體免疫性哮喘）、涉及τ細胞浸潤及慢性 發炎反應之病狀、慢性肺部發炎疾病、自體免疫性心肌 炎、白無球黏著缺陷病、全身性紅斑狼瘡（SLE)(諸如皮膚 SLE)、亞急性皮膚紅斑狼瘡、新生兒狼瘡症候群（Nle)、 播散性紅斑狼瘡、狼瘡（包括狼瘡性腎炎、狼瘡性大腦 炎、兒童狼瘡、非腎狼瘡、腎外狼瘡、盤狀狼瘡、狼瘡脫 髮）、青少年發作型（I型）糖尿病（包括兒童胰島素依賴型糖 尿病（IDDM))、成年發作型糖尿病（11型糖尿病）、自體免疫 性糖尿病、特發性尿崩症、與由細胞激素及T淋巴細胞介 導之急性及遲發性過敏反應有關的免疫反應、結核病、類 肉瘤病、肉芽腫（包括淋巴瘤樣肉芽腫、韋格納氏肉芽腫 (Wegener’s granulomatosis))、顆粒性球缺乏症、血管炎病 (包括血管炎，包括大血管血管炎（包括風濕性多肌痛及巨 細胞（高安氏（Takayasu’s))動脈炎）、中等血管血管炎（包括 川崎氏病（Kawasaki's disease)及結節性多動脈炎）、顯微鏡 下多動脈炎、CNS血管炎、壞死性血管炎、皮膚▲管炎或 過敏性血管炎、全身性壞死性血管炎及ANCA相關之血管 炎（諸如丘格-斯特勞斯血管炎（Churg-Strauss vasculitis)或 丘格-斯特勞斯症候群（CSS)))、顳動脈炎、再生障礙性貧 血、自體免疫性再生障礙性貧血、庫姆陽性貧企（coombs positive anemia)、戴-布二氏貧血（Diam〇nd Blackfan anemia)、溶血性貧血或免疫性溶血性貧血（包括自體免疫 性溶血性貧血（AIHA))、惡性貧血、愛迪森氏病（Addis〇nis disease)、純紅血球貧企或發育不全（pRCA)、因子缺 155406.doc •53· 201139682 陷病、A型血友病、自體免疫性嗜中性白血球減少症、全 部血球減少症、白血球減少症、涉及白血球滲出之疾病、 CNS發炎病症、多發性器官損傷症候群（諸如因敗血病創 傷或出血繼發之多發性器官損傷症候群）、抗原抗體複合 物介導之疾病、抗腎小球基底膜病、抗磷脂抗體症候群、 過敏性神經炎、白塞氏病（如(^6/如11(^,8£1^咖）、卡 氏症候群（Castleman’s syndrome)、古柏氏症候群 (Goodpasture’s syndrome)、雷諾氏症候群（Reynaud，s syndrome)、休格連氏症候群（Sj〇gren，s syndrome)、史蒂 务-強森症候群（Stevens-Johnson syndrome)、類天范瘡（諸 如大皰性類天疱瘡及皮膚類天疱瘡）、天疱瘡（包括尋常天 癌瘡、落葉狀天癌瘡、天癌瘡黏膜類天疮瘡及紅斑性天疮 瘡）、自體免疫性多内分泌病、雷特氏病（Reiteris disease) 或雷特氏症候群、免疫複合物性腎炎、抗體介導之腎炎、 視神經脊髓炎、多發性神經病、慢性神經病（諸如IgM多發 性神經病或IgM介導之神經病）、血小板減少症（如例如心 肌梗塞患者發展之血小板減少症’包括血栓性血小板減少 性紫癜（TTP)及自體免疫或免疫介導之血小板減少症（諸如 特發性血小板減少性紫癜（ITP) ’包括慢性或急性ITP))、 睪丸及卵巢之自體免疫疾病（包括自體免疫性睪丸炎及印 巢炎）、原發性曱狀腺功能低下、副甲狀腺機能減退症、 自體免疫内分泌疾病（包括甲狀腺炎，諸如自體免疫性曱 狀腺炎、橋本氏病（Hashimoto's disease)、慢性曱狀腺炎 (橋本氏甲狀腺炎）或亞急性甲狀腺炎）、自體免疫性曱狀腺 155406.doc •54- 201139682 病、特發性曱狀腺功能低下、格雷夫斯氏病（Grave's disease)、多腺症候群（諸如自體免疫性多腺症候群（或多腺 内分泌病症候群））、副腫瘤症候群（包括神經性副腫瘤症候 群’諸如朗伯-伊頓肌無力症候群（Lambert-Eaton myasthenic syndrome)或伊頓-朗伯症候群）、僵人症候群、 腦脊髓炎（諸如過敏性腦脊髓炎及實驗性過敏性腦脊趙炎 (EAE))、重症肌無力（諸如胸腺瘤相關之重症肌無力）、小 • 腦退化、神經性肌強直、斜視眼陣攣或斜視眼陣攣性肌陣 攣症候群（OMS)及感覺神經病、多灶性運動神經病、席漢 氏症候群（Sheehan’s syndrome)、自體免疫性肝炎、慢性肝 炎、狼瘡樣肝炎、巨細胞性肝炎、慢性活動性肝炎或自體 免疫性慢性活動性肝炎、淋巴間質性肺炎、阻塞性細支氣 管炎（非移植）伴有NSIP、格林巴利症候群（Guillain_Barr0 syndrome)、伯傑氏病（Berger’s disease)(IgA腎病）、特發性
IgA腎病、線狀lgA皮膚病、原發性膽汁性肝硬化、肺硬 • 化、自體免疫性腸病症候群、乳糜病、乳糜瀉、口炎性腹 瀉（麩質腸病）、難治性脂肪瀉、特發性脂肪瀉、冷球蛋白 企症、肌肉萎縮性側索硬化（ALS ;盧格里格氏病（L〇u Gehrig’s disease))、冠狀動脈病、自體免疫性耳病（諸如自 體免疫性内耳病（AIED))、自體免疫性耳聾、斜視眼陣攣 性肌陣攣症候群（OMS)、多軟骨炎（諸如難治性或復發性多 軟骨炎）、肺泡性蛋白沈積症、澱粉樣變性、鞏膜炎、非 癌性淋巴細胞增多、原發性淋巴細胞增多（其包括單株]3細 胞淋巴細胞增多（例如良性單株球蛋白症及意義未明之單 155406.doc -55- 201139682 株球蛋白症（MGUS)))、周邊神經病、副腫瘤症候群、通道 病變（諸如痛癇、偏頭痛、心律不整、肌肉性病症、聲、 盲、週期性麻痒及CNS之通道病變）、自閉、發炎性肌病、 局部節段性腎小球硬化（FSGS)、内分泌眼病、葡萄膜視網 膜炎、脈絡膜視網膜炎、自體免疫性肝臟病症、肌肉纖維 疼痛、多發性内分泌失調、施密特氏症候群（Schmidt，s syndrome)、腎上腺炎、胃萎縮、早老性癡呆、脫趙鞘疾 病（諸如自體免疫性脫髓鞘疾病）、糖尿病性腎病、德雷斯 勒氏症候群（Dressler's syndrome)、斑形脫髮、CREST症候 群（角質沈積症、雷諾現象（Raynaud’s phenomenon)、食道 蠕動異常、指硬皮病及毛細血管擴張）、男性及女性自體 免疫性不孕症、現合型結締組織疾病、卡格氏病（Chagas, disease)、風濕熱、反覆流產、農民肺（fanner，s lung)、多 形性紅斑、心臟切開術後症候群、庫欣氏症候群 (Cushing’s syndrome)、飼鳥者肺（bird-fancier's lung)、過 敏性肉芽腫性血管炎、良性淋巴細胞性金管炎、阿爾波特 氏症候群（Alport's syndrome)、肺泡炎（諸如過敏性肺泡炎 及纖維化肺泡炎）、間質性肺病、輸血反應、麻風、瘧 疾、利什曼體病（leishmaniasis)、錐蟲病、血吸蟲病、蛔 蟲病、麯黴病、森普特氏症候群（Sampter，s syndrome)、卡 潘氏症候群（Caplan’s syndrome)、登革熱、心内膜炎、心 内膜心肌纖維化、彌漫性間質性肺纖維化、肺間質纖維 化、特發性肺纖維化、囊腫性纖維化、内眼炎、持久性隆 起性紅斑、胎兒紅血球母細胞增多症、嗜伊紅血球筋膜 155406.doc •56- 201139682 炎、舒爾曼氏症候群（Shulman’s syndrome)、費爾提氏症候 群（Felty's syndrome)、絲蟲病、睫狀體炎（諸如慢性睫狀體 炎、異色性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎或福斯氏睫狀鱧炎 (Fuch’s cyclitis))、亨諾-許蘭紫癜（Henoch-Schonlein purpura)、人類免疫缺乏病毒（HIV)感染、埃可病毒感染、 心肌病、阿茲海默氏病（Alzheimer’s disease)、小病毒感 染、風疹病毒感染、疫苗接種後症候群、先天性風疹感 染、愛巴病毒感染（Epstein-Barr virus infection)、勝腺 炎、埃文氏症候群（Evan’s syndrome)、自體免疫性生殖腺 失調、西氏舞蹈病（Sydenham’s chorea)、鏈球菌感染後腎 炎、閉塞性血栓性金管炎、甲狀腺毒症、脊趙療、脈絡膜 炎、巨細胞多肌痛、内分泌眼病、慢性過敏性肺炎、乾燥 性角膜結膜炎、流行性角膜結膜炎、特發性腎炎症候群、 微小病變性腎病、良性家族性及缺血再灌注損傷、視網膜 自體免疫、關節發炎、支氣管炎、慢性阻塞性氣管病、發 沉著病、口瘡、口瘡性口炎、動脈硬化症、不形成精子 症、自體免疫性溶金、伯克氏病（Boeck’s disease)、冷球蛋 白血·症、杜氏攣縮（Dupuytren’s contracture)、晶狀體過敏 性眼内炎、過敏性腸炎、麻風結節性紅斑、特發性面神經 麻痺、慢性疲勞症候群、風濕熱、哈曼-里奇氏病 (Hamman-Rich's disease)、感音神經性聽力損失、陣發性 血紅素尿、性腺低能症、區域性迴腸炎、白血球減少症、 傳染性單核細胞增多症、橫貫性脊髓炎、原發性特發性黏 液水腫、腎炎、交感性眼炎、肉芽腫性睪丸炎、胰腺炎、 155406.doc -57· 201139682 急性多神經根炎' 壞疽性腹皮病、魁文氏甲狀腺炎 (Quervain’s thyreoiditis)、後天性脾萎縮、由抗精細胞抗 體所致之不孕症、非惡性胸腺瘤、白斑症、SCID及愛巴病 毒相關疾病、後天性免疫缺乏症候群（AIDS)、寄生性疾病 (諸如利什曼原蟲病）、中毒性休克症候群、食物中毒涉 及T細胞浸潤之病狀、白血球黏著缺陷病、與由細胞激素 及T淋巴細胞介導之急性及遲發性過敏反應有關的免疫反 應、涉及白血球滲出之疾病、多發性器官損傷症候群抗 原-抗體複合物介導之疾病、抗腎小球基底膜病、過敏性 神經炎、自體免疫性多内分泌病、卵巢炎、原發性黏液水 腫、自體免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、風濕性疾病、 混合型結締組織疾病、腎病症候群、胰島炎、多内分泌腺 失調、周邊神經病、自體免疫性多腺症候群、成年發 作型特發性副甲狀腺機能減退症（A0IH)、全禿、擴張型心 肌病、後天性大皰性表皮鬆懈（EBA)、血色素沉著症、心 肌炎、腎病症候群、原發性硬化性膽管炎、化膿性或非化 膿性竇炎、急性或慢性竇炎、篩竇炎、額竇炎、上頜竇炎 或蝶寶炎、嗜伊紅血球相關病症（諸如嗜伊紅血球過多、 肺部浸潤性嗜伊紅血球過多、嗜伊紅血球過多-肌痛症候 群、呂弗勒氏症候群（Loffler’s syndrome)、慢性嗜伊紅血 球肺炎、熱帶肺嗜伊紅血球過多、支氣管肺麯黴病、麯黴 腫或含有嗜伊紅血球之肉芽瘤）、全身性過敏反應、血清 陰性脊椎關節炎、多内分泌腺自體免疫疾病、硬化性膽管 炎、鞏膜、上鞏膜、慢性皮膚黏膜念珠菌病、布魯頓氏症 155406.doc • 58 - 201139682 群（Bnu〇n，s synd_e)、嬰兒暫時性低丫球蛋白血症威 斯科特·奥爾德里奇症候群（Wisk0tt-Aldrieh syndrGme)、共
濟失調毛細血管擴張、與膠原性疾病有關之自體免疫病 ；几濕病神經病、缺血再灌注病症、血壓反應降低、 血管功能障礙、血管擴張、組織損傷、心血管缺血、痛覺 過敏、大腦缺血及伴有血管生成之疾病、過敏症、腎小球 腎炎、再灌注損傷、心肌或其他組織之再灌注損傷、含急 性發炎組分之皮膚病、急性化膿性腦膜炎或其他中樞神經 系統發炎性病症、眼睛及眼眶發炎性病症、顆粒球輸注相 關症候群、細胞激素誘發之毒性、急性嚴重性發炎、慢性 難治性發炎、腎盂炎、肺硬化、糖尿病性視網膜病、糖尿 病性大動脈病症、動脈内膜過度增生、消化性潰瘍、瓣膜 炎及子宮内膜異位。 如本文所用之術語「細胞毒性劑」係指一種抑制或阻止 細胞之功能及/或引起細胞破壞的物質。該術語意欲包括 放射性同位素（例如 At211、I131、I125、Y90、Re!86、Rei88、
Sm153、Bi212、Ra223、P32及Lui放射性同位素）、化學治療 劑（例如甲胺喋呤（methotrexate)、阿黴素（adriamicin)、長 春花生物驗（vinca alkaloid)(長春新鹼（vincristine)、長春鹼 (vinblastine) ' 依託泊苷（etoposide))、小紅莓（d〇xorubicin)、 美法侖（melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氣 芥（chlorambucil)、道諾黴素（daunorubicin))或其他插入 劑、酶及其片段（諸如核分解酶）、抗生素及毒素（諸如小分 子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素，包 15S406.doc •59- 201139682 括其片段及/或變異體）及本文所揭示之各種抗腫瘤、抗癌 及化學治療劑。其他細胞毒性劑描述於本文中。殺腫瘤劑 可引起腫瘤細胞破壞。 「化學治療劑」為適用於治療癌症之化合物。化學療劑 之實例包括烷化劑，諸如噻替派（thiotepa)及CYTOXAN® 環麟醢胺（cyclosphosphamide);項酸烧SI，諸如白消安 (busulfan)、英丙舒凡（improsulfan)及略泊舒凡 (piposulfan);氮丙咬，諸如苯佐多巴（benzodopa)、卡波酿 (carboquone)、米特多巴（meturedopa)及尤利多巴 (uredopa);伸乙基亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺 (altretamine)、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基鱗醯胺、三 伸乙基硫代磷酿胺及三羥甲基三聚氰胺；乙醯精寧 (acetogenin)(尤其為布拉他辛（bullatacin)及布拉他辛酮 (bull at acinon e)) ; δ-9-四氣大麻盼（屈大麻紛（dronabinol)， MARINOL®) ; β-拉帕酮（beta-lapachone);拉帕醇 (lapachol);秋水仙驗（colchicine);樺木酸（betulinic acid);喜樹驗（camptothecin)(包括合成類似物拓朴替康 (topotecan)(HYCAMTIN®)、CPT-11(伊立替康（irinotecan)， CAMPTOSAR®)、乙酿喜樹驗（acetylcamptothecin)、斯考 普萊汀（scopolectin)及9-胺基喜樹驗）；苔蘚蟲素 (bryostatin);卡利他 ί丁（callystatin) ; CC-1065(包括其阿多 來新（adozelesin)、卡折來新（carzelesin)及比折來新 (bizelesin)合成類似物）；鬼臼毒素（podophyllotoxin);鬼 臼毒素酸（podophyllinic acid);替尼泊普（teniposide);念 155406.doc -60- 201139682
(daunorubicin)、地托比星（detorubicin)、6-重氮基-5-側氧 基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN®小紅莓（包括N-嗎啉基-小 紅莓、氰基（N-嗎啉基）-小紅莓、2-N-吡咯基-小紅莓及去 氧小紅每）、表柔比星（epirubicin)、依索比星（esorubicin)、 依達比星（idarubicin)、麻西羅黴素（marcellomycin)、絲裂 黴素（mitomycin)(諸如絲裂黴素C)、黴紛酸、諾拉黴素 (nogalamycin)、橄欖黴素（olivomycins)、培洛黴素 (peplomycin)、泊非徽素（potfiromycin)、嘌黴素 (puromycin)、三鐵阿黴素（quelamycin)、羅多比星 (rodorubicin)、鏈黑黴素（streptonigrin)、鏈佐星 (streptozocin)、殺結核菌素（tubercidin)、烏苯美司 (ubenimex)、淨司他汀（zinostatin)、左柔比星（zorubicin); 抗代謝劑，諸如甲胺嗓吟及5-氣尿嘴咬（5-fluorouracil，5-FU);葉酸類似物，諸如迪諾特寧（denopterin)、甲胺嗓 吟、嗓羅呤（pteropterin)、三甲曲沙（trimetrexate);嗓呤類 似物，諸如氟達拉濱（fludarabine)、6-疏基嘌吟 (mercaptopurine)、嘆口米嗓吟（thiamiprine)、硫鳥嗓吟 (thioguanine);嚷咬類似物，諸如安西他濱（ancitabine)、 阿紮胞苦（azacitidine)、6·氮尿苷（azauridine)、卡莫氣 (carmofur)、阿糖胞苷（cytarabine)、雙去氧尿苷 (dideoxyuridine)、去氧氟尿苷（doxif+luridine)、依諾他濱 (enocitabine)、氟尿苷（floxuridine);雄激素，諸如卡普睪 酮（calusterone)、丙酸屈他雄酮（dromostanolone propionate)、環硫雄醇（epitiostanol)、美雄烧 155406.doc -62- 201139682 珠藻環肽（cryptophycins)(尤其為念珠藻環肽1及念珠藻環 肽8);海兔毒素（dolastatin);多卡米辛（duocarmycin)(包括 合成類似物 KW-2189 及 CB1-TM1);艾榴素（eleutherobin); 水鬼蕉驗（pancratistatin);沙考的汀（sarcodictyin);海綿 他汀（spongistatin);氮芥，諸如苯丁酸氮芥、萘氣芥、氣 碟醯胺、雌莫司汀（estramustine)、異環麟醯胺 (ifosfamide)、二氣曱基二乙胺（mechlorethamine)、鹽酸氧 化二氣甲基二乙胺、美法舍、新恩比興（novembichin)、苯 芬膽甾醇（phenesterine)、潑尼莫司汀（prednimustine)、曲 洛填胺（trofosfamide)、尿,咬氮芬（uracil mustard);亞石肖 基腺，諸如卡莫司汀（carmustine)、 氣腺黴素 (chlorozotocin)、福莫司汀（fotemustine)、洛莫司汀 (lomustine)、 尼莫司汀（nimustine)及拉甯司汀 (ranimnustine);抗生素，諸如稀二炔抗生素（例如刺孢黴 素（calicheamicin)，尤其為刺抱黴素γΐ(參見例如Agnew， Chem Inti. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994));達内黴素 (dynemicin)，包括達内黴素A;埃斯培拉黴素 (esperamicin);以及新制癌菌素發色團及相關色蛋白稀二 炔抗生素發色困）、阿克拉黴素（aclacinomysin)、放線菌素 (actinomycin)、安麯黴素（authramycin)、偶氮絲胺酸 (azaserine)、博萊黴素（bleomycins)、放線菌素 C (cactinomycin)、卡拉比星（carabicin)、洋紅黴素 (carminomycin)、嗜癌菌素（carzinophilin)、色徽素 (chromomycinis)、放線菌素 D(dactinomycin)、道謹黴素 155406.doc -61 - 201139682
(mepitiostane)、睪内 S旨酮（testolactone);抗腎上腺素，諸 如胺魯米特（aminoglutethimide)、米托坦（mitotane)、曲洛 司坦（trilostane);葉酸補充物，諸如夫羅林酸（frolinic acid); 醋葡搭内醋（aceglatone); 酿填醢胺糖苦 (aldophosphamide glycoside);胺基乙醯丙酸 (aminolevulinic acid);恩尿，咬（eniluracil);安 °丫咬 (amsacrine);貝司他布（bestrabucil);比生群（bisantrene); 埃達曲卡（edatraxate);得弗伐胺（defofamine);秋水仙胺 (demecolcine);地 α丫酿（diaziquone):伊弗尼辛 (elfornithine);依利醋按（elliptinium acetate);埃坡黴素 (epothilone);依託格魯（etoglucid);頌酸鎵；經基脲；香 蒜多糖（lentinan);羅尼達寧（lonidainine);類美登素 (maytansinoid)，諸如美登素（maytansine)及美登木素 (ansamitocins);米托脈腙（mitoguazone)；米托蒽酿 (mitoxantrone)；莫比達摩（mopidanmol);石肖爾靈 (nitraerine)；喷司他汀（pentostatin);蛋胺氛茶 (phenamet) ; β比柔比星（pirarubicin);洛索蒽酿 (losoxantrone) ; 2-乙基醢肼；丙卡巴拼（procarbazine); PSK® 多醣複合物（JHS Natural Products，Eugene, OR);雷 佐生（razoxane);根瘤菌素（rhizoxin);西佐喃（sizofiran); 鍺螺胺（spirogermanium);細交鍵抱菌嗣酸（tenuazonic acid);三亞胺酿（triaziquone) ; 2,2'，2''-三氣三乙胺；新月 毒素（trichothecenes)(尤其為T-2毒素、韋拉庫林 A(verracurin A)、桿孢菌素 A(roridin A)及安奎定 155406.doc -63- 201139682
(anguidine));烏拉坦（urethan);長春地辛（vindesine) (ELDISINE®、FILDESIN®);達卡巴嗪（dacarbazine);甘 露莫司汀（mannomustine);二溴甘露醇（mitobronitol);二 溴衛矛醇（mitolactol) ; 底泊溴炫（pipobroman);伽托辛 (gacytosine);阿拉伯糖苦（arabinoside)(「Ara-C」）；β塞替 派；紫杉醇，例如TAXOL®太平洋紫杉醇（paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、 ABRAXANETM無十六醇聚氧乙烯醚且經白蛋白工程改造 之太平洋紫杉醇之奈米粒子調配物（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, IL)及 TAXOTERE® 多 西他赛（doxetaxel)(Rh0ne-Poulenc Rorer，Antony，France); 苯丁酸氮芬（chloranbucil);吉西他濱（GEMZAR®) ; 6-硫鳥 嘌吟；疏基嘌吟；曱胺嗓吟；翻類似物，諸如順銘 (cisplatin)及卡始（carboplatin);長春驗（VELBAN®);翻； 依託泊苷（VP-16);異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼 (ONCOVIN®);奥赛力始（oxaliplatin);曱酿四氫葉酸 鲁 (leucovovin);長春瑞濱（vinorelbine)(NAVELBINE®);諾 凡特龍（novantrone);依達曲沙（edatrexate);道諾黴素； 胺基嗓吟（aminopterin);伊班膦酸擊（ibandronate);拓撲 異構酶抑制劑RFS 2000 ;二氟甲基鳥胺酸（DMFO);類視 黃素，諸如視黃酸；卡培他濱（capecitabine) (XELODA®);上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或 衍生物；以及以上兩者或兩者以上之組合，諸如CHOP(環 填酿胺、小紅每、長春新驗及潑尼松龍（prednisolone)之組 155406.doc -64- 201139682 合療法的縮寫）及F0LF0X(使用奥赛力鉑（ELOXATINTM) 與5-FU及甲醯四氫葉酸之組合的治療方案的縮寫）。 此定義中亦包括用於調節、減少、阻斷或抑制可促進癌 症生長之激素的作用且通常呈全身性或全身治療形式的抗 激素劑。其可為激素本身。實例包括抗雌激素及選擇性雌 激素受體調節劑（SERM)，包括例如他莫昔芬 (tamoxifen)(包括 NOLVADEX® 他莫昔芬）、EVISTA® 雷洛 昔芬（raloxifene)、曲洛昔芬（droloxifene)、4-經基他莫昔 芬（4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬（trioxifene)、雷洛昔芬 鹽酸鹽（keoxifene)、LY117018、奥那司酮（onapristone)及 FARESTON®托瑞米芬（toremifene);抗孕酮；雌激素受體 下調劑（ERD);用於抑制或封阻卵巢之藥劑，例如黃體生 成激素釋放激素（LHRH)促效劑，諸如LUPRON®及 ELIGARD®乙酸亮丙瑞林（leuprolide acetate)、乙酸戈舍瑞 林（goserelin acetate)、乙酸布舍瑞林（buserelin acetate)及 曲特瑞林（tripterelin);其他抗雄激素，諸如氟他胺 (flutamide)、尼魯胺（nilutamide)及比卡魯胺（bicalutamide); 及抑制調節腎上腺中之雌激素產生之芳香酶的芳香酶抑制 劑，諸如4(5)-咪唑、胺魯米特、MEGASE®乙酸甲地孕酮 (megestrol acetate)、AROMASIN®依西美坦（exemestane)、 弗米斯坦（formestanie)、法屈0坐（fadrozole)、RIVISOR® 伏 羅0坐（vorozole)、FEMARA® 來曲坐（letrozole)及 ARIMIDEX® 阿那曲吐（anastrozole)。另外，化學治療劑之該定義包括 雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽（clodronate)(例如BONEFOS® lSS406.doc -65- 201139682 或 OSTAC®)、DIDROCAL® 依替膦酸鹽（etidronate)、NE-58095、ZOMETA® °坐來膦酸（zoledronic acid)/峻來膦酸鹽 (zoledronate)、FOSAMAX® 阿侖膦酸鹽（alendronate)、 AREDIA® 帕米膦酸鹽（pamidronate)、SKELID® 替魯膦酸 鹽（tiludronate)或 ACTONEL® 利塞膦酸鹽（risedronate);以 及曲沙他濱（troxacitabine)(l，3-二氧雜環戊烧核苷胞响咬類 似物）；反義募核苷酸，尤其抑制與異常細胞增殖相關之 信號傳導路徑中之基因表現的反義寡核苷酸，諸如PKC· $ a、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體（EGF-R);疫苗，諸如 THERATOPE®疫苗及基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN® 疫苗、LEUVECTIN®疫苗及VAXID®疫苗；LURTOTECAN® 拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH ;拉帕替尼二甲 苯磺酸鹽（lapatinib ditosylate)(ErbB-2與 EGFR雙重酪胺酸 激酶小分子抑制劑，亦稱GW5 72016);及上述任一者之醫 藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。 「生長抑制劑」在用於本文中時係指活體外或活體内抑 φ 制細胞生長之化合物或組合物。因此，生長抑制劑可為顯 著降低S期細胞百分率之生長抑制劑。生長抑制劑之實例 包括阻斷細胞週期進程（除S期外之其他位置）之藥劑，諸 如誘導G1停滞及Μ期停滯之藥劑。經典Μ期阻斷劑包括長 春花類（例如長春新鹼及長春鹼）、紫杉烷及拓撲異構酶II 抑制劑（諸如小紅莓、表柔比星、道諾黴素、依託泊苷及 博萊黴素）。能使G1停滯之藥劑亦擴大到能使S期停滯，例 如DNA烧化劑，諸如他莫昔芬、潑尼松（prednisone)、達 155406.doc -66- 201139682 卡巴嗪、二氣曱基二乙胺、順鉑、曱胺喋呤、5-氟尿嘧啶 及阿拉伯糖苷（ara-C)。其他資訊可見於The Molecular Basis of Cancer，Mendelsohn及 Israel編，第 1章，Murakami 等人之題為「Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs」(W.B. Saunders: Philadelphia, 1995)， 尤其第13頁中。紫杉烷（太平洋紫杉醇及多西他赛）為衍生 自紫杉樹之抗癌藥。源自歐洲紫杉之多西他赛 (TAXOTERE®，Rhone-Poulenc Rorer)為太平洋紫杉醇 (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb)之半合成類似物。太平洋 紫杉醇及多西他赛促進自微管蛋白二聚體組裝微管且藉由 防止解聚作用而使微管穩定，從而抑制細胞中之有絲分 裂。 如本文所用之「抗癌療法」係指減少或抑制個體之癌症 的療法。抗癌療法之實例包括細胞毒性放射療法以及投與 個體治療有效量之細胞毒性劑、化學治療劑、生長抑制 劑、癌症疫苗、血管生成抑制劑、前藥、細胞激素、細胞 激素拮抗劑、皮質類固醇、免疫抑制劑、抗嘔吐劑、抗體 或抗體片段或止痛劑。
本申請案申所用之術語「前藥」係指醫藥活性物質之前 驅物或衍生形式，其對腫瘤細胞的細胞毒性小於母體藥物 且能夠以酶法活化或轉化為較具活性之母體形式。參見例 如 Wilman，「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」’ Biochemical Society Transactions，14，第 375-382 頁， 615th Meeting Belfast (1986)及 Stella等人，「Prodrugs: A 155406.doc -67· 201139682
Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」，Directed Drug Delivery, Borchardt等人（編），第 247-267頁，Humana
Press (1985)。前藥包括（但不限於）：含磷酸鹽之前藥、含 硫代破酸鹽之前藥、含硫酸鹽之前藥、含肽之前藥、經D· 胺基酸修飾之前藥、糖基化前藥、含β_内醯胺之前藥、含 視需要經取代之苯氧基乙醯胺之前藥或含視情況經取代之 苯基乙醯胺之前藥、可轉化為更具活性之無細胞毒性藥物 的5-氟胞嘧啶及其他5-氟尿苷前藥。可衍生成用於本發明 之前藥形式的細胞毒性藥物之實例包括（但不限於）上述彼 等化學治療劑。 術語「細胞激素」為由一細胞群體釋放，作為細胞間介 體作用於另一細胞的蛋白質之通用術語。該等細胞激素之 實例為淋巴激素、單核球激素及傳統多肽激素。細胞激素 包括生長激素，諸如人類生長激素（HGH)、Ν-甲硫胺酿基 人類生長激素及牛生長激素；副甲狀腺激素；甲狀腺素； 胰島素；前胰島素；鬆弛素；前鬆弛素；醣蛋白激素，諸 如促濾泡激素（FSH)、促曱狀腺激素（TSH)及促黃體激素 (LH) ’表皮生長因子（EGF);肝臟生長因子；纖維母細胞 生長因子（FGF);促乳素；胎盤生乳素；腫瘤壞死因子α及 β ;苗勒抑制物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；活 化素；血管内皮生長因子；整合素；血小板生成素 (ΤΡ0);神經生長因子，諸如NGF_a ;血小板生長因子； 轉型生長因子（TGF)，諸如TGF-a及TGF-β ;胰島素樣生長 因子I及II;紅血球生成素（EP0);骨誘導因子；干擾素， 155406.doc -68 - 201139682 諸如干擾素α、β及γ;群落刺激因子（CSF)，諸如巨噬細 胞-CSF(M-CSF);顆粒球-巨噬細胞-CSF(GM-CSF);及顆 粒球-CSF(G-CSF);介白素（IL)，諸如11^1、11^-1〇1、1[-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、 IL-10、IL-11、IL-12、IL-18 ;腫瘤壞死因子，諸如 TNF-a 或TNF-β ;及其他多肽因子，包括LIF及kit配位體（KL)。 如本文所用之術語細胞激素包括來自天然來源或來自重組 細胞培養物之蛋白質及天然序列細胞激素之生物活性等效 物。 「細胞激素拮抗劑」意謂部分或完全阻斷、抑制或中和 至少一種細胞激素之生物活性的分子。舉例而言，細胞激 素拮抗劑可藉由抑制細胞激素表現及/或分泌或藉由結合 於細胞激素或細胞激素受體而抑制細胞激素活性。細胞激 素拮抗劑包括結合於細胞激素或細胞激素受體之抗體、合 成或自然序列肽、免疫黏附素及小分子拮抗劑。細胞激素 拮抗劑視情況與細胞毒性劑結合或融合。例示性TNF拮抗 劑為依那西普（etanercept)(ENBREL®)、英利昔單抗 (infliximab)(REMICADE®)及阿達木單抗（adalimumab) (HUMIRAtm)。 如本文所用之術語「免疫抑制劑」係指用於抑制或遮蔽 所治療個體之免疫系統的物質。其包括抑制細胞激素產 生、下調或抑制自體抗原表現或遮蔽MHC抗原之物質。免 疫抑制劑之實例包括2-胺基-6-芳基-5-取代之嘧啶（參見美 國專利第4,665,077號）；黴紛酸嗎淋乙g旨（mycophenolate 155406.doc •69· 201139682 mofetil)，諸如 CELLCEPT® ;硫唑嘌呤（IMURAN®， AZASAN®/6-疏基嗓呤）；漠隱定（bromocryptine);達那唾 (danazol);胺苯礙（dapsone);戍二酸（glutaraldehyde)(其遮 蔽MHC抗原，如美國專利第4，120,649號中所述）；MHC抗 原及MHC片段之抗個體基因型抗體；環孢素A;類固醇， 諸如皮質類固醇及糖皮質類固醇，例如潑尼松、潑尼松 龍，諸如PEDIAPRED® (潑尼松龍磷酸鈉）或ORAPRED® (潑尼松龍碟酸鈉口服溶液）、甲潑尼龍（methylprednisolone) ^ 及地塞米松（dexamethasone);曱胺嗓吟（經口或皮下） (RHEUMATREX®、TREXALL™);羥基氯喹（hydroxycloroquine)/ 氣喧（chloroquine);柳氮續°比咬（sulfasalazine);來戴米特 (leflunomide);細胞激素或細胞激素受體拮抗劑，包括抗 干擾素γ、β或α抗體、抗腫瘤壞死因子α抗趙（英利昔單抗 或阿達木單抗）、抗TNFa免疫黏附素（ENBREL®，依那西 普）、抗腫瘤壞死因子β抗體、抗介白素2抗體及抗IL-2受體 抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CDlla及抗CD18抗體；抗 φ L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；多株或泛Τ抗體，或 單株抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含LFA-3結合域之可溶性 肽（W090/08187);鏈球菌激酶；TGF-β ;鏈球菌去氧核糖 核酸酶；宿主之RNA或DNA ; FK506 ; RS-61443 ;去氧史 帕胍淋（deoxyspergualin);雷帕黴素（rapamycin) ; T細胞受‘ 體（Cohen等人，美國專利第5，114,721號）；T細胞受體片段 (Offner 等人，Science 251: 430-432 (1991) ; WO 90/ 11294 ; Ianeway，Nature 341: 482 (1989);及 WO 91/ 155406.doc -70· 201139682 01133) ; T細胞受體抗體（EP 340,109)，諸如T10B9 ;環磷 醯胺（CYTOXAN®);胺苯颯；青黴胺（penicillamine) (CUPRIMINE®);血漿交換；或靜脈内免疫球蛋白 (IVIG)。此等免疫抑制劑可單獨使用或彼此組合使用，尤 其類固醇與另一免疫抑制劑組合，或該等組合後為維持劑 量的非類固醇藥劑以減少對類固醇之需要。 「止痛劑j係指用於抑制或抑止個體疼痛的藥物。例示 性止痛劑包括非類固醇消炎藥（NSAIDs)，包括布洛芬 (ibuprofen)(MOTRIN®)、萘普生（naproxen)(NAPROSYN®)、 乙酿水楊酸（acetylsalicylic acid)、0弓丨°朵美辛（indomethacin)、 舒林酸（sulindac)及托美丁（tolmetin)，包括其鹽及衍生 物，以及各種用於降低可能發生之刺痛的其他藥物，包括 抗驚厥劑（加巴喷丁（gabapentin)、苯妥英（phenyloin)、卡 馬西平（carba-mazepine))或三環抗抑營劑。特定實例包括 乙醯胺紛（acetaminophen)、阿司匹林（aspirin)、阿米替林 (amitriptyline)(ELAVIL®)、卡馬西平（TEGRETOL®)、苯 妥英（phenyltoin)(DILANTIN®)、加巴喷丁（NEURONTIN®)、 (E)-N-香草基-8-甲基_6_壬醯胺（CAPSAICIN®)或神經阻斷 劑。 「皮質類固醇」係指模擬或加強天然存在之皮質類固醇 作用之具有類固醇通用化學結構的數種合成或天然存在物 質之任一者。合成皮質類固醇之實例包括潑尼松、潑尼松 龍（包括甲潑尼龍）、地塞米松、曲安西龍（triamcino-lone) 及倍他米松（betamethasone)。 155406.doc -71- 201139682 如本文所用’「癌症疫苗」為刺激個體對癌症之免疫反 應的組合物。癌症疫苗通常由個體自體（來自自身）或同種 異體（來自他者）的癌症相關物質或細胞來源（抗原）連同進 -步刺激及加強針對抗原之免疫反應的其他組分（例如佐 劑）一起組成。癌症疫苗可刺激個體之免疫系統對一或數 種特異性抗原產生抗體及/或產生殺手τ細胞以襲擊具有此 專抗原之癌細胞。 如本文所用，術語「細胞毒性放射療法」係指抑制或阻 止細胞之功能及/或引起細胞破壞的放射療法。放射療法 可包括例如體外光束照射或用放射性標記藥劑（諸如抗體） 治療。該術語意欲包括使用放射性同位素（例如At2"、 1 丨3 丨、1125、γ9°、Re186、Re188、Sm丨53、Bi2丨2、Ra223、 P32，及Lu之放射性同位素）β 個體」為脊椎動物’諸如哺乳動物，例如人類。哺乳 動物包括（但不限於）家畜（諸如母牛）、競技動物（sp〇rt animals)、寵物（諸如貓、狗及馬）、靈長類動物、小鼠及 大鼠。 除非另外指明，否則術語「第一」多肽及r第二」多肽 及其變化形式僅為一般標識符，不應視為鑑別本發明抗體 之特定或特別多肽或組分。 除非另外指明，否則實例中所提及之市售試劑係根據製 造商之說明書使用。以下實例及說明書通篇中由ATCC寄 存編號標識的彼等細胞之來源為美國菌種保存中心 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) » 除非 ·η· 155406.doc 201139682 另外說明，否則本發明使用重組DNA技術之標準程序，諸 如上文及以下教科書中所述之標準程序：上述Sambrook等 人；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989) ; Innis等人，PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc., NY，1990) ; Harlow等 人，Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988) ； Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press, Oxford, 1984) ； Freshney, Animal Cell Culture, 1987 ; Coligan 等人，Current Protocols in Immunology，1991 0 在本說明書及申請專利範圍中，詞語「包含」應理解為 意味包括所述整數或整數組但不排除任何其他整數或整數 組。 II.構築異多聚體蛋白質 通常，本文所述之異多聚體蛋白質包含抗體Fc區之重要 部分。然而，在其他態樣中，重鏈僅包含CH1、CH2及/或 CH3域之一部分。 異多求域 異多聚體蛋白質包含異多聚域。為產生實質上均質之異 二聚體分子群，異二聚域必須高度優先形成異二聚體，勝 過均二聚體。儘管本文例示之異多聚體蛋白質使用杵臼結 構技術來促進異多聚，但熟習此項技術者應瞭解其他異多 聚域亦適用於本發明。 155406.doc -73- 201139682 杵臼結構 使用杵臼結構作為製造多特異性抗體之方法為此項技術 所熟知。參見1998年3月24日頒予且受讓於Genentech之美 國專利第5,731，168號、2009年7月16日公開且受讓於 Amgen之PCT公開案第WO 2009089004號及2009年7月16日 公開且受讓於Novo Nordisk A/S之美國專利公開案第 20090182127 號。亦參見Marvin 及 Zhu，Acta Pharmacologica Sincia (2005) 26(6):649-658 及 Kontermann (2005) Acta Pharacol. Sin.，26:1-9。本文提供簡要論述。 「突起」係指如下至少一個胺基酸側鏈，其自第一多肽 之界面突出，因此可置於相鄰界面（亦即第二多肽之界面） 之補償性空腔中以穩定異多聚體，從而例如相較於均多聚 體形成，更有利於異多聚體形成。突起可存在於初始界面 中或可以合成方式（例如藉由改變編碼界面之核酸）引入。 通常，改變編碼第一多肽之界面的核酸以編碼突起。為達 成此目的，將編碼第一多肽界面中之至少一個「初始」胺 基酸殘基的核酸置換為編碼至少一個側鏈體積大於初始胺 基酸殘基之「輸入」胺基酸殘基的核酸。應暸解，可存在 一個以上初始殘基及相應輸入殘基》可置換之初始殘基數 目之上限為第一多肽界面中之殘基總數。各種胺基殘基之 侧鏈體積展示於下表中。 155406.doc • 74· 201139682 表1 胺基酸殘基之特性 胺基酸 一字母縮寫 質量a (道爾頓 (dalton)) 體積b (埃(Angstrom)3) 可及表面積e (埃2) 丙胺酸(Ala) A 71.08 88.6 115 精胺酸(Arg) R 156.20 173.4 225 天冬醯胺(Asn) N 114.11 117.7 160 天冬胺酸(Asp) D 115.09 111.1 150 半胱胺酸(Cys) C 103.14 108.5 135 麩醯胺酸(Gin) Q 128.14 143.9 180 麩胺酸(Glu) E 129.12 138.4 190 甘胺酸(Gly) G 57.06 60.1 75 組胺酸(His) Η 137.15 153.2 195 異白胺酸(lie) I 113.17 166.7 175 .白胺酸(Leu) L 113.17 166.7 170 離胺酸(Lys) K 128.18 168.6 200 甲硫胺酸(Met) Μ 131.21 162.9 185 苯丙胺酸(Phe) F 147.18 189.9 210 脯胺酸(Pro) Ρ 97.12 122.7 145 絲胺酸(Ser) s 87.08 89.0 115 蘇胺酸(Thr) τ 101.11 116.1 140 色胺酸(Tip) w 186.21 227.8 255 路胺酸(Tyr) Υ 163.18 193.6 230 纈胺酸(Val) V 99.14 140.0 155
&胺基酸分子量減去水之分子量。值來自Handbook of
Chemistry and Physics，第 43 版，Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co.，1961。 b 值來自 A.A. Zamyatnin，Prog. Mo/· 5/<?厂 24:107-123, 1972 。 c值來自 C. Chothia，丄 Mo厂 厂 105:1-14，1975。可及 表面積在此參考文獻之圖6-20中定義。 形成突起之較佳輸入殘基一般為天然存在之胺基酸殘 155406.doc -75- 201139682 基，且較佳選自精胺酸（R)、苯丙胺酸（F)、酪胺酸（γ)及色 胺酸（w)。最佳為色胺酸及酪胺酸。在一實施例中，形成 突起之初始殘基具有小側鏈體積，諸如丙胺酸、天冬醯 胺、天冬胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸。 「空腔」係指如下至少一胺基酸側鏈，其自第二多肽之 界面凹陷，因此可容納第一多肽相鄰界面上之相應突起。 空腔可存在於初始界面中或可以合成方式（例如藉由改變 編碼界面之核酸）引入。通常，改變編碼第二多肽之界面 的核酸以編碼空腔。為達成此目的，將編碼第二多肽界面 中之至少一個「初始」胺基酸殘基的核酸置換為編碼至少 一個側鏈體積小於初始胺基酸殘基之「輸入」胺基酸殘基 的DNA。應瞭解，可存在一個以上初始殘基及相應輸入殘 基。可置換之初始殘基數目之上限為第二多肽界面中之殘 基總數。各種胺基殘基之側鏈體積展示於上表1中。形成 空腔之較佳輸入殘基通常為天然存在之胺基酸殘基，且較 佳選自丙胺酸（Α)、絲胺酸（S)、蘇胺酸（Τ)及纈胺酸（V)。 最佳為絲胺酸、丙胺酸或蘇胺酸。在一實施例中，形成空 腔之初始殘基具有大側鏈體積，諸如酪胺酸、精胺酸、苯 丙胺酸或色胺酸。 「初始」胺基酸殘基為經側鏈體積小於或大於初始殘基 之「輸入」殘基置換的胺基酸殘基。輸入胺基酸殘基可為 天然存在或非天然存在之胺基酸殘基，但較佳為前者。 「天然存在」之胺基酸殘基為由遺傳密碼編碼且列於上表 1中之彼等殘基。「非天然存在」之胺基酸殘基意謂並非由 155406.doc -76 - 201139682 遺傳密碼子編碼但能夠共價結合多肽鏈中之相鄰胺基酸殘 基的殘基。非天然存在之胺基酸殘基的實例為正白胺酸、 鳥胺酸、正纈胺酸、高絲胺酸及諸如Ellman等人，Me/；?. 五202:301-336 (1991)中所述之其他胺基酸殘基類似 物°為產生該等非天然存在之胺基酸殘基，可使用Noren 等人’《Sc化wee 244: 182 (1989)及前述Ellman等人之程序。 簡言之’此包含用非天然存在之胺基酸殘基以化學方式活 φ 化抑制tRNA，繼而活體外轉錄及轉譯RNA。本發明之方 法包含置換至少一個初始胺基酸殘基，但亦可置換一個以 上初始殘基。通常’置換之初始胺基酸殘基不超過第一或 第二多肽界面中之全部殘基。通常，將用於置換之初始殘 基「埋藏」。「埋藏」意謂使殘基基本上不可接近溶劑。一 般而a，輸入殘基不為半胱胺酸以防止二硫鍵可能氧化或 錯配。 突起「可置於」空腔中’此意謂分別在第—多肽及第二 肽之界面上之突起及空腔的空間位置及突起及空腔之尺 寸使得突起可位於空腔中而不會顯著干擾第一及第二多狀 在界面處之正常結合。因為突起（諸如Typ心及⑽通常 不自界面之軸垂直延伸且具有較佳構形’所以突起與相應 空腔之對準依靠基於三維結構（諸如藉由乂射線結晶法或核 磁共振（NMR)獲得之三維結構）模製突起/空腔對。此可使 用此項技術中普遍接受之技術達成。 初始或模板核酸」意謂編碼相關多狀之核酸，其可經 「改變」（亦即遺傳工程改造或突變)以編碼突起或空腔。 155406.doc -77- 201139682 初始或起始核酸可為天然存在之核酸或可包含已進行預先 改變之核酸（例如人類化抗體片段）。「改變」核酸意謂初始 核酸藉由插入、缺失或置換至少一個編碼相關胺基酸殘基 之密碼子而突變。通常，將編碼初始殘基之密碼子置換為 編碼輸入殘基之密碼子。以此方式遺傳修飾DNA之技術已 評述於Mutagenesis: a Practical Approach，M.J. McPherson 編，（IRL Press, Oxford, UK. (1991)中，且包括例如定點突 變誘發、盒式突變誘發及聚合酶鏈反應（PCR)突變誘發。 藉由使初始/模板核酸突變，由初始/模板核酸編碼之初始/ 模板多肽由此相應地改變。 突起或空腔可藉由合成方式，例如藉由重組技術、活體 外肽合成、引入前述非天然存在之胺基酸殘基的技術、藉 由肽之酶法或化學偶合或此等技術之一些組合來「引入」 第一或第二多肽之界面中。因此，所「引入」之突起或空 腔為「非天然存在」或「非天然」的，此意謂其不存在於 自然界中或初始多肽（例如人類化單株抗體）中。 一般而言’形成突起之輸入胺基酸殘基具有相對小數目 之「旋轉異構體」（例如約3_6個）《>「旋轉異構物」為胺基 酸側鏈之能量有利構形。各種胺基酸殘基之旋轉異構體數 口顧於 Ponders 及 Richards，*/. ΜοΛ 5ζ·σ/. 193: 775-791 (1987)中。 HI·載體、宿主細胞及重組方法 為重組製造本發明之異多聚體蛋白質（例如抗體），將編 碼其之核酸分離且插入可複製載體中以進一步選殖（擴增 155406.doc 201139682 DNA)或表現。易於分離編碼抗體之DNA且使用習知程序 (例如藉由使用能夠特異性結合於編碼抗體重鏈及輕鏈之 基因的寡核苷酸探針）測序。可利用多種載體。載體之選 擇部分取決於所用宿主細胞。一般而言，較佳宿主細胞具 有原核或真核（一般為哺乳動物，但亦包括真菌（例如酵 母）、昆蟲、植物及來自其他多細胞生物體之有核細胞）來 源。應瞭解’任何同型之悝定區可用於達成此目的，包括 IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且該等恆定區可由任 何人類或動物物種獲得。 a·使用原核宿主細胞產生異多聚體蛋白質 i，載體構築 可使用標準重組技術獲得編碼本發明異多聚體蛋白質 (例如抗體）之多肽組分的聚核苷酸序列《所要聚核普酸序 列可自例如抗體產生細胞（諸如融合瘤細胞）分離且測序。 或者，可使用核苷酸合成儀或PCR技術合成聚核苷酸。在 獲得編碼多肽之序列後，將其插入能夠在原核宿主中複製 且表現異源聚核苷酸之重組載體中。可獲得且為此項技術 中已知之多種載體可用於達成本發明之目的。適當載體之 選擇主要視欲插入載體中之核酸的尺寸及欲用載體轉型之 特定宿主細胞而定。每一載體均含有多種組分，視其功能 (擴增或表現異源聚核苷酸或兩者）及其與其所處之特定宿 主細胞的相容性而定。載體組分一般包括（但不限於）複製 起點、選擇標記基因、啟動子、核糖體結合位點（RBS)、 信號序列、異源核酸插入物及轉錄終止序列。 155406.doc -79- 201139682 一般而言，衍生自與宿主細胞相容之物種的含有複製子 及控制序列之質體載體與此等宿主結合使用。載體通常具 有複製位點以及能夠於經轉型細胞中提供表型選擇之標記 序列。舉例而言，大腸桿菌通常使用衍生自大腸桿菌物種 之質體pBR322轉型。pBR322含有編碼胺节西林 (ampicillin ’ Amp)及四環素（tetracycline，Tet)抗性之基 因，因此提供容易地鑑別經轉型細胞之方式。pBR322、 其衍生物或其他微生物質體或噬菌體亦可含有或經修飾以 含有可由微生物使用以表現内源蛋白質之啟動子。用於表 現特定抗體之pBR322衍生物之實例詳細描述於Carter等 人’美國專利第5,648,237號中》 另外，與宿主微生物相容之含有複製子及控制序列的噬 菌體載體可作為轉型載體結合此等宿主使用。舉例而言， 可利用諸如λΟΕΜ.ΤΜ.-11之噬菌體製備可用於轉型易感宿 主細胞（諸如大腸桿菌LE392)的重組载體。 本發明之表現載體可包含兩個或兩個以上啟動子-順反 子對，編碼各多肽組分。啟動子為位於調節其表現之順反 子上游⑺之非轉課調節序列。原核啟動子通常分成兩 類：誘導型與組成型。誘導型啟動子為在其控制下響應於 培養條件之變化（例如營養物之存在或不存在或溫度變 化）’起始順反子轉錄水準增加的啟動子。 大量由多種潛在宿主細胞識別之啟動子為吾人所熟知。 可藉由經由限㈣消化將所選啟動子自來源麵移出且將 所分離之啟動子序列插人本發明之裁體中，使該啟動子可 155406.doc -80- 201139682 操作地連接於編碼例如輕缝或重鍵之順反子DN A。可使用 天然啟動子序列與多種異源啟動子指導標靶基因之擴增 及/或表現。在一些實施例中，使用異源啟動子，因為其 相較於天然標輕多肽啟動子’ 一般可使所表現之標乾基因 轉錄更多且產率更高。
適用於原核宿主之啟動子包括Ph〇 A啟動子、β_半乳糖酶 及乳糖啟動子系統、色胺酸（trp)啟動子系統及雜合啟動子 (諸如ίπ或ire啟動子）。然而，在細菌中具有功能性之其他 啟動子（諸如其他已知之細菌或噬菌體啟動子）亦適用。其 核苷酸序列已公開，從而使得熟習此項技術者能夠使用連 接子或接附子提供任何所要限制位點將其可操作地接合於 編碼異多聚體蛋白質（例如標靶輕鏈及重鏈）之基因的順反 子（Siebenlist等人，（1980) Cell 20: 269)。 在本發明之一態樣中，重組載體内之各順反子包含指導 所表現之多肽跨膜易位之分泌信號序列組分。一般而言， 佗號序列可為載體之組分，或其可為插入載體中之標把多 肽DNA之-部分。出於本發明之目的而選擇之信號序列應 為可由宿主細胞識別及加工（亦即由信號肽酶裂解）之信號 序列。對於不識別及加卫異源多肽之天然信號序列的原核 宿主細胞’信號序列經例如選自由以下組成之群的原核信
Ipp或熱穩定性腸 號序列取代：鹼性磷酸酶、青黴素酶、
PhoE、peiB、OmpA 及
毒素II(STII)前導序列、LamB MBP。在本發明之_實施例中，表現系統之兩種順反子中 所用之信號序列為STII信號序列或其變異體。 155406.doc -81- 201139682 在另一態樣中’本發明之免疫球蛋白可在宿主細胞之細 胞質中產生，因此無需各順反子内存在分泌信號序列。就 此而言，免疫球蛋白之輕鏈及重鏈在細胞質内表現、摺疊 且組裝形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株（例如大腸 桿菌irW菌株）提供有利於二硫鍵形成之細胞質條件，從 而允許適當摺疊及組裝所表現之蛋白質次單元β參見 Proba^. Pluckthun Gene, 159:203 (1995) 〇 適用於表現本發明之異多聚體蛋白質（例如抗體）的原核 宿主細胞包括古細菌（Archaebacteria)及真細菌 (Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體。適用 細菌之實例包括埃希氏桿菌（Escherichia)(例如大腸桿 菌）、桿菌（Bacilli)(例如枯草桿菌（b. subtilis))、腸細菌、 假单胞菌（Pseudomonas)屬（例如綠腹桿菌（p. aeruginosa))、 鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)、黏質沙雷氏菌 (Serratia marcescans)、克雷伯氏桿菌（Klebsiella)、變形桿 菌（Proteus)、志賀氏菌（Shigella)、根瘤菌（Rhizobia)、透 明顫菌（Vitreoscilla)或副球菌（paracoccus)。在一實施例 中’使用革蘭氏陰性細胞。在一實施例中，使用大腸桿菌 細胞作為本發明之宿主。大腸桿菌菌株之實例包括菌株 W3110 (Bachmann，Cellular and Molecular Biology，第 2 卷（Washington，D,C·: American Society for Microbiology， 1987)，第1190-1219頁；ATCC寄存編號27,325)及其衍生 物，包括具有基因型W3110 /ac lacL8 ΧοτηρΊΆ (nmpc-fepE) degP41 kanRl 亀殊33Ό3(矣鐵 15S406.doc • 82 · 201139682 專利第5,639,635號）。其他菌株及其衍生物（諸如大腸桿菌 294 (ATCC 31，446)、大腸桿菌B、大腸桿菌〇776 (ATCC 31，537)及大腸桿菌RV308 (ATCC 31，608))亦適合。在一實 施例中’大腸桿菌J/pp尤其適用。此等實例為說明性而非 限制性的。具有指定基因型之任何上述細菌之衍生物的構 築方法為此項技術中已知且描述於例如Bass等人， Proteins，8:309-314 (1990)中。一般需要考慮複製子在細 • 菌細胞中之可複製性來選擇適當細菌。舉例而言，當使用 熟知之質體（諸如pBR322、pBR325、pACYC177或 PKN410)提供複製子時，大腸桿菌、沙雷氏菌（Serratia)或 沙門氏菌（Salmonella)屬可適用作宿主。宿主細胞通常應 分泌最少量之蛋白水解酶，且其他蛋白酶抑制劑可適宜地 併入細胞培養物中。 多肽製造 用上述表現載體將宿主細胞轉型，且培養於視需要改良 _ t習知營養培養基中以誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編 碼所要序列之基因。 轉型意謂將DNA引入原核宿主中使得DNA可作為染色體 t元件或藉*$色體組成部分複製。視所用帛主細胞而 使用適合於該等細胞之標準技術進行轉型。使用氯化 轉進行鈣處理—般用於含有實質細胞壁障壁之細菌細胞。 另一轉型方法採用聚乙三賴MSO〇利之另—技術為電 穿孔。 :製U本發明多肽之原核細胞於此項技術中已知且適 155406.doc -83- 201139682 於培養所選宿主細胞之培養基中生長。適當培養基之實例 包括加有必需營養補充物之魯利亞培養液（Luria broth， LB)。在一些實施例中’培養基亦含有基於構築表現載體 而選擇之選擇試劑，以選擇性允許含有表現載體之原核細 胞生長舉例而§，將胺节西林添加至培養基中以使表現 胺苄西林抗性基因之細胞生長。 亦可包括除碳、氮及無機磷酸鹽來源以外之任何必需補 充物，其單獨或以與另一補充物或培養基（諸如複合氮源） 之混合物形式以適當濃度引入。視情況，培養基可含有一 或多種選自由以下組成之群的還原劑：麩胱甘肽、半胱胺 酸、胱胺、毓基乙酸鹽、二硫赤蘚糖醇及二硫蘇糖醇。 在適合溫度下培養原核宿主細胞。為使大腸桿菌生長， 舉例而言，較佳溫度範圍為約2(rc至約39t>c，更佳為約 25°C至約37°C，甚至更佳為約3(TC。培養基之ΡΗ值可為範 圍在約5至約9之任何PH值，主要視宿主生物體而定。對於 大腸桿菌，pH值較佳為約6.8至約7·4，且更佳為約7 〇。 若本發明之表現載體中使用誘導型啟動子，則在適於活 化該啟動子之條件下誘導蛋白質表現。在本發明之一態樣 中’ PhoA啟動子用於控制多肽轉錄。因此，於罐酸鹽限制 性培養基中培養經轉型宿主細胞以進行誘導。磷酸鹽限制 险培養基較佳為C.R.A.P培養基（參見例如，§immons等 人，丄 (2〇〇2)，263:133-147)。如此項技 術中已知，可根據所用載體構築體使用多種其他誘導劑。 在實施例中’各別培養第一及第二含较鏈宿主細胞， 155406.doc -84· 201139682 且所表現之本發明多肽各別分泌於宿主細胞之周質中且自 周質回收。在第二實施例中’各別培養第一及第二含鉸鏈 宿主細胞’且在分離含鉸鏈多肽之前，將兩種宿主細胞培 養物混合在一起且將細胞粒化。在第三實施例中，各別培 養第一及第二含鉸鏈宿主細胞’離心且各別再懸浮，隨後 混合在一起，接著分離含鉸鍵多肽。在第四實施例_，將 第一及第二含鉸鏈宿主細胞一起於同一培養容器中培養。 蛋白質回收通常包含一般藉由諸如滲壓衝擊、音波處理或 溶解之方式破壞微生物細胞模。細胞破壞之後，可藉由離 心或過遽移除細胞碎片或全細胞。蛋白質可例如藉由親和 樹脂層析進一步純化。或者，可將蛋白質輸送至培養基中 且在其中進行分離。可自培養物移除細胞，過濾培養物上 清液且濃縮以進一步純化所產生之蛋白質。可使用諸如聚 丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE)及西方墨點檢定之通常已知之方 法進一步分離且鑑別所表現之多肽。所分離之多肽將用於 製造異多聚體蛋白質。 在本發明之一態樣中，異多聚體蛋白質（例如抗體）製造 藉由醱酵製程大量進行。可利用各種大規模饋料-分批醱 酵程序來製造重組蛋白f。大規模醋酵具有至少！，_公 升之令量，較佳為約1〇〇〇至1〇〇〇〇〇公升之容量。此等醱 酵罐使用授拌器葉輪來分配氧氣及營養物，尤其葡萄糖 (較佳碳源/能源）。小規模醱酵一般係指在容量不超過約 100公升且範圍可為約丨公升至約1〇〇公升之醱酵罐中醱 酵。 155406.doc -85- 201139682 在酸酵製程中，通常在細胞已於適合條件下生長至所要 密度（例如OD^o為約180-220，在此階段細胞處於穩定期早 期）後起始誘導蛋白質表現。如此項技術中已知且如上文 所述’可根據所用載體構築體使用各種誘導劑β可在誘導 之前使細胞生長較短時期。通常誘導細胞約12-50小時， 但亦可使用更長或更短之誘導時間。 為改良本發明多肽之製造產率及品質，可改良各種醱酵 條件。舉例而言，為改良所分泌之異多聚體蛋白質（例如 抗體）之適當組裝及摺疊，可使用過度表現伴隨蛋白（諸如
Dsb蛋白（DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及或 DsbG)或 FkpA( — 種具有伴隨蛋白活性之肽基脯胺醯基順，反·異構酶））之其 他載趙將宿主原核細胞共轉型。已證實伴隨蛋白促進細菌 宿主細胞中所產生之異源蛋白質之適當摺疊及可溶性。
Chen等人 ’（1999) 价〇 CAem 274:19601-19605 ; Georgiou 等人’美國專利第6,083,715號；Georgiou等人，美國專利 第 6,027,888 號；Bothmann 及 Pluckthun (2000) «/· 5ζ·ο/. CAew. 275:17100-17105 ; Ramm及 Pluckthun (2000) «/.价〇/· C/zem. 275:17106-17113; Arie 等人（2001) Μσ/· Mz.㈣6fo/· 39:199-210 〇 為使所表現之異源蛋白質（尤其對蛋白水解敏感之蛋白 質）之蛋白水解達最小，某些缺乏蛋白水解酶之宿主菌株 可用於本發明。舉例而言’宿主細胞菌株可經修飾以實現 編碼已知之細菌蛋白酶之基因（諸如蛋白酶ln、〇mpT、
DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶v、蛋白酶vi及 155406.doc -86- 201139682 其組合）的遺傳突變。可利用一些缺乏大腸桿菌蛋白酶之 菌株且其描述於例如Joly等人（1998)，iVoc. iVai厂<SW. 95:2773-2777; Georgiou等人，美國專利第 5,264,365 號；Georgiou等人，美國專利第5,508,192號；Hara等人， Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996) t 。 在一實施例中，缺乏蛋白水解酶且用過度表現一或多種 伴隨蛋白之質體轉型的大腸桿菌菌株用作本發明表現系統 φ 中之宿主細胞。在第二實施例中，大腸桿菌菌株缺乏外膜 之脂蛋白（Δίρρ)。 iii.異多聚體蛋白質純化 在一實施例中，本文製造之異多聚體蛋白質可進一步純 化以獲得實質上均質之製劑供其他檢定及用途使用。可使 用此項技術中已知之標準蛋白質純化方法。以下程序為例 不性適合純化程序：免疫親和管柱或離子交換管柱分級分 離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽或陽離子交換樹脂 鲁（諸如DEAE)層析、層析聚焦、SDS_pAGE、硫酸銨沈澱及 使用例如SephadexG-75之凝膠過遽。 在一態樣中，固定於固相上之蛋白A用於免疫親和純化 例如本發明之全長抗體產物。蛋白A為來自金黃色葡萄球 菌awewi)之41 kD細胞壁蛋白質，其以高 親和力結合於抗體之Fc區。Undmark等人（1983)汄 —.从滅62:1_13。固定蛋白八之固相較佳為包含玻 璃或二氧化石夕表面之管柱，更佳為可控孔隙玻璃管柱或碎 酸管柱。在-些應用中，管柱塗佈有諸如甘油之試劑以防 155406.doc •87- 201139682 止污染物之非特異性黏著。 作為純化之第一步驟，將上述源自細胞培養物之製劑塗 覆於固定蛋白A之固相上以使相關抗體特異性結合於蛋白 A °接著洗滌固相以移除非特異性結合於固相之污染物。 藉由溶離自固相回收異多聚體蛋白質（例如抗體）。 b.使用真核宿主細跑產生異多聚體蛋白質· 載體組分一般包括（但不限於）以下一或多者：信號序 列、複製起點、一或多個標記基因、強化子元件、啟動子 及轉錄終止序列。 i-信號序列組分 用於真核宿主細胞之載體亦可含有信號序列或在相關成 熟蛋白質或多肽之N端具有特異性裂解位點的其他多肽。 所選異源信號序列較佳為可由宿主細胞識別及加工（亦即 由k號肽裂解）之信號序列。在哺乳動物細胞表現中， 可利用哺乳動物彳§號序列以及病毒分泌型前導序列（例如 單純疱疹gD信號）》該前驅區域之DNA在閱讀框架中接合 於編碼所要異多聚體蛋白質（例如抗體）之Dna。 ii. 複製起點 一般而言’哺乳動物表現載體無需複製起點組分。舉例 而言，通常可使用SV40起點’但僅係因為其含有早期啟動 子。 iii. 選擇基因組分 表現及選殖載體可含有選擇基因，亦稱作可選標記物。 典型選擇基因編碼如下蛋白質：（a)賦予對抗生素或其他毒 155406.doc • 88 - 201139682 素（例如胺苄西林、新黴素（neomycin)、甲胺嗓呤或四環 素）之抗性的蛋白質；（b)補充營養缺陷（適當時）之蛋白 質，或（c)提供不能自複合培養基獲得之關鍵營養物的蛋白 質。 選擇方案之一實例利用藥物使宿主細胞之生長停滯。用 異源基因成功轉型之彼等細胞產生賦予抗藥性之蛋白質且 因此在選擇方案中存活。該顯性選擇之實例使用藥物新黴 素、黴紛酸及潮徽素（hygromycin)。 適用於哺乳動物細胞之可選標記物的另一實例為能夠鑑 別可接納抗體核酸之細胞的可選標記物，諸如DHFR、胸 苷激酶、金屬硫蛋白I及Π(較佳為靈長類動物金屬硫蛋白 基因）、腺苷去胺酶、鳥胺酸去羧酶等。 舉例而言，首先藉由在含有曱胺喋呤（Mtx)(DHFR之競 爭性拮抗劑）之培養基中培養所有轉型體來鑑別用DHFR選 擇基因轉型的細胞。當使用野生型DHFR時適當之宿主細 胞為缺乏DHFR活性的中國倉鼠卵巢（ch〇)細胞株（例如 ATCC CRL-9096)。 或者’用編瑪抗體、野生型DHFR蛋白及另一可選標記 物（諸如胺基糖苷3’-磷酸轉移酶（ΑΡΗ))之DNA序列轉型或 共轉型之宿主細胞（尤其為含有内源DHFR之野生型宿主） 可藉由在含有針對該可選標記物之選擇試劑（諸如胺基糖 苷抗生素，例如卡那黴素（kanamycin)、新黴素或G418)的 培養基中進行細胞生長來選擇。參見例如美國專利第 4,965，199 號。 155406.doc -89- 201139682 iv.啟動子組分 表現及選殖載體通常含有由宿主生物體識別且可操作地 連接於所要含鉸鏈多肽（例如抗體）核酸的啟動子。已知用 於真核生物之啟動子序列。實際上所有真核基因均具有位 於轉錄起始位點上游大約25至3〇個鹼基處之富八丁區。發現 於多種基因轉錄起點上游70至8〇個鹼基處的另一序列為 CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。大部分真核基因的3, 端處為AATAAA序列，該序列可為編碼序列之3,端增加 poly A尾的信號《所有此等序列均適於插入真核表現載體 中。 哺乳動物宿主細胞中所要含鉸鏈多肽（例如抗體）自載體 轉錄例如由獲自以下之啟動子來控制：病毒基因組，竑等 病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（諸如腺病毒2)、牛 礼突狀瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄病 毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒40(SV4〇);異源哺乳動物啟 動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子；或熱休 克啟動子’只要該等啟動子與宿主細胞系統相容即可。 便利地獲得SV40病毒之早期及晚期啟動子，其為亦含 有SV40病毒複製起點之SV40限制片段。便利地獲得人類 巨細胞病毒之即刻早期啟動子’其為Hindlll E限制片段。 美國專利第4,419,446號中揭示一種使用牛乳突狀瘤病毒作 為载體在哺乳動物宿主中表現DNA之系統。美國專利第 4,601，978號中描述此系統之改良》關於在單純疱療病毒之 胸苷激酶啟動子控制下在小鼠細胞中表現人類β_干擾素 155406.doc -90- 201139682 cDNA’ 亦參見Reyes等人，297:598-601 (1982)。 或者’可使用勞斯肉瘤病毒（rous Sarcoma Virus)之長末端 重複序列作為啟動子。 '^強化子元件組分 由高等真核生物轉錄編碼所要含鉸鏈多肽（例如抗體）之 DNA可藉由將強化子序列插入載體中加強。現已知多種來 自哺乳動物基因（例如血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、 α-胎蛋白及胰島素基因）之強化子序列。亦可使用來自真 核細胞病毒之強化子。實例包括複製起點（bp 1〇〇_27〇)後 側之SV40強化子、巨細胞病毒早期啟動子強化子、複製起 點後侧之多瘤病毒強化子及腺病毒強化子。關於用於強化 真核生物啟動子活化之元件的描述，亦參見Yaniv， 297:17-18 (1982)。強化子可在抗體多肽編碼序列之位置5, 或3'處拼接於載體中，其限制條件為實現強化，但一般位 於啟動子之5·位點處。 vi. 轉錄終止組分 用於真核宿主細胞之表現载體通常亦含有終止轉錄及穩 定mRNA所需之序列。此等序列通常可獲自真核生物或病 毒DNA或cDNA之5,及有時3,非轉譯區。此等區域含有轉錄 為編碼抗體之mRNA之非轉譯部分中的聚腺苷酸化片段之 核苷酸區段。一種適用之轉錄終止組分為牛生長激素聚腺 苷酸化區。參見WO94/11026及其中所揭示之表現載體。 vii. 宿主細胞之選擇及轉型 適用於選殖或表現本文載體中之DNA的宿主細胞包括本 155406.doc 201139682 文所述之高等真核生物細胞，包括脊椎動物宿主細胞。在 培養物（組織培養物）中繁殖脊椎動物細胞已成為常規程 序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為由SV40轉型之猴腎 CV1細胞株（COS-7，ATCC CRL 1651);人類胚腎細胞株 (293細胞或經次選殖以在懸浮培養物中生長之293細胞， Graham等人，·/. Gew Wro/_ 36:59 (1977));幼倉鼠腎細胞 (BHK，ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細胞 /-DHFR(CHO， Urlaub等人，Proc. Scz·. CASJ 77:4216 (1980)); 小鼠足細胞（TM4，Mather，Biol. Reprod. 23:243-251 (1980));猴腎細胞（CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞 (VERO-76，ATCC CRL-1587);人類子宮頸癌細胞 (HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34);布法羅大鼠肝細胞（buffalo rat liver cell)(BRL 3A， ATCC CRL 1442);人類肺細胞（W138，ATCC CCL 75);人 類肝細胞（Hep G2，HB 8065);小鼠乳房腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51) ； TRI 細胞（Mather 等人 « Annals 见K <Scz·· 383:44-68 (1982)); MRC 5細胞；FS4細 胞；及人類肝腫瘤細胞株（Hep G2)。 將宿主細胞用上述用於製造所要含鉸鏈多肽（例如抗體） 之表現或選殖載體轉型，且培養於視需要經改良之習知營 養培養基中以誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所要序 列之基因。 viii.培養宿主細胞 用於製造本發明之含鉸鏈多肽（例如抗體）之宿主細胞可 155406.doc •92· 201139682 培養於多種培養基中。諸如哈姆氏F10 (Ham's FIO) (Sigma)、最低必需培養基（MEM)(Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)及杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養基（Dulbecco's Modified Eagle’s Medium，DMEM)(Sigma)之市售培養基適 於培養宿主細胞。另外，以下中所述之任何培養基均可用 作宿主細胞之培養基：Ham等人，58:44 (1979) ; Barnes等人，Jna/· 102:255 (1980);美國 φ 專利第 4,767,704號；第 4,657,866號；第 4,927,762號；第 4,560,655號；或第 5，122,469號；WO 90/03430 ; WO 87/ 00195 ;或美國專利Re.3〇,985 »任何此等培養基均可視需 要補充激素及/或其他生長因子（諸如胰島素 '轉鐵蛋白或 表皮生長因子）、鹽（諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽）、緩衝 液（諸如HEPES)、核苷酸（諸如腺苷及胸苷）、抗生素（諸如 GENTAMYCIN™藥物）、痕量元素（定義為通常以在微莫耳 濃度範圍内之最終濃度存在之無機化合物）及葡萄糖或等 • 效能源。亦可包括熟習此項技術者已知之適當濃度的任何 其他必需補充物。培養條件（諸如溫度、pH值及其類似條 件）為選擇用於表現之宿主細胞先前所用的條件，且為一 般技術者所瞭解。 ix·純化異多聚體蛋白質 當使用重組技術時，含鉸鏈多肽可於細胞内產生，或直 接刀/*必於培養基中。若含鉸鏈多肽於細胞内產生，則作為 第-步驟’例如藉由離心或超濾移除微粒碎片（宿主細胞 或溶解片段）。若含鉸鏈多肽分泌於培養基中，則一般首 155406.doc -93· 201139682 先使用市售蛋白質濃縮過濾器（例如Amicon或Millipore Pemcon超濾單元）濃縮該等表現系統之上清液。在任何先 前步驟中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水 解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。 由該等細胞製備之異多聚體組合物可使用例如羥磷灰石 層析、凝膠電泳、透析及親和層析來純化，其中親和層析 為較佳純化技術。蛋白A作為親和配位體之適用性取決於 物種及存在於抗體中之任何免疫球蛋白FC域的同型。蛋白 A可用於純化基於人類γΐ、γ2或γ4重鏈的抗體（Lindmark等 人，乂 /讲则⑽/· Λ/W/z. 62:1-13 (1983))。蛋白G推薦用於所 有小鼠同型及人類y3(Guss等人，«/. 5:15671575 (1986))。雖然親和配位體所連接之基質最常為瓊脂糖，但 亦可利用其他基質。與用瓊脂糖所達成之流速及加工時間 相比’機械穩定性基質（諸如可控孔徑玻璃或聚（苯乙稀二 乙烯基）苯）允許流速更快且加工時間更短。當抗體包含 CH3 結構域時 ’ Bakerbond ABXTM 樹脂（J. T. Baker, Phillipsburg，NJ)適用於純化。視欲回收抗體而定，亦可利 用其他用於蛋白質純化之技術，諸如離子交換管柱分級分 離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽層析、肝素 SEPHAROSEtm層析、陰離子或陽離子交換樹脂（諸如聚天 冬胺酸管柱）層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。
繼任何初步純化步驟之後，可使用pH值為約2.5-4.5的溶 離緩衝液對包含相關抗體及污染物之混合物進行低pH值疏 水性相互作用層析，且較佳在低鹽濃度（例如約〇_〇 25 M 155406.doc -94· 201139682 鹽）下進行。異多聚體蛋白質之製造可或者或另外（對於任 何上述特定方法）包含透析包含多肽混合物之溶液。 X.使用桿狀病毒製造抗體 重組桿狀病毒可藉由使用例如脂質體（可購自GIBCO-BRX)將編碼抗體或抗體片段之質體及BaculoGoldTM病毒 DNA (Pharmingen)共轉染於昆蟲細胞（諸如草地夜蛾 (Spodoptera frugiperda)細胞（例如 Sf9 細胞；ATCC CRL 1711)或黑腹果繩（Drosophila melanogaster)S2細胞）中而產 生。在一特定實例中，將抗體序列融合於桿狀病毒表現載 體内所含之抗原決定基標記的上游。該等抗原決定基標記 包括poly-His標記。可採用多種質體，包括來源於市售質 體（諸如 pVL1393 (Novagen)或 pAcGP67B (Pharmingen))之 質體。簡言之，編碼抗體或其片段之序列可藉由PCR用與 5'及3'區互補之引子擴增》5'引子可併入側面（所選）限制酶 位點。產物可隨後用所選限制酶消化且次選殖於表現載體 中。 用表現載體轉染之後，在28°C下培育宿主細胞（例如Sf9 細胞）4-5天，且收集所釋放之病毒並用於進一步擴增。病 毒感染及蛋白質表現可如例如O'Reilley等人（Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual. Oxford: Oxford University Press (1994))所述執行。 隨後可例如藉由Ni2+螯合親和層析如下純化所表現之經 poly-His 標記之抗體。可如 Rupert 等人（Nature 362:175-179 (1993))所述由重組病毒感染之Sf9細胞製備提取物。簡言 155406.doc -95- 201139682 之，洗滌Sf9細胞，再懸浮於音波處理緩衝液（25 mL HEPES (pH 7.9) ; 12.5 mM MgCl2 ; 0.1 mM EDTA ; 10%甘 油；0.1% NP-40 ; 0.4 M KC1)中，且於冰上音波處理兩 次，歷時20秒。藉由離心淨化音波處理物，且用負載緩衝 液（50mM磷酸鹽；300 mMNaCl;10%甘油，pH7.8)50倍 稀釋上清液且經由0.45 μιη過濾器過濾。製備床體積為5 mL之Ni2 + -NTA壤脂糖管柱（可購自Qiagen)，用25 mL水洗 滌且用25 mL負載緩衝液平衡。將經過濾之細胞提取物以 0.5 mL/min負載於管柱上。用負載緩衝液洗滌管柱至基線 A280，此時開始收集溶離份。隨後，用第二洗滌緩衝液 (50 mM磷酸鹽；300 mM NaCl ; 10%甘油，pH 6.0)洗滌管 柱，此溶離出非特異性結合之蛋白質。再次達成A280基線 之後，用第二洗滌緩衝液中〇至500 mM咪唑梯度發展管 柱。收集1 mL溶離份，且藉由SDS-PAGE及銀染色或西方 墨點法用結合於驗性破酸酶之Ni2+-NTA(Qiagen)分析。彙 集含所溶離之經HislO標記之抗體的溶離份且針對負載緩 衝液透析。 或者，抗體純化可使用已知之層析技術（包括例如蛋白A 或蛋白G管柱層析）執行。在一實施例中，相關抗體可藉由 用含離液劑或溫和清潔劑之溶液溶離自管柱固相回收。例 示性離液劑及溫和清潔劑包括（但不限於）鹽酸胍、尿素、 過氣酸鋰、精胺酸、組胺酸、SDS(十二烷基硫酸鈉）、 Tween、Triton及NP-40，均可購得。 IV.異多聚體蛋白質形成/組裝 155406.doc -96- 201139682 '成;^整異多聚體蛋白質包含藉由形成二硫鍵再被装第 與第一含鉸鏈多肽，此在本發明中稱作再摺疊。再摺疊 l括第含鉸鏈多肽與第二含鉸鏈多肽締合及形成鏈間二 硫鍵。在本發明中’再指疊（亦稱作複性）在活體外在不^ 加還原劑下進行。 * 宿主細胞可使用上述方法以各別培養物或單一培養物形 式培養。m中，帛—宿主細胞及第二宿主細胞在同 一培養容器中生長（在本文中有時稱作共培養或混合培養 物）。在另一方法中，第一及第二宿主細胞在各別培養容 器中生長。在一方法中，各別加工各別培養物，隨後混 合/組合，接著破壞細胞膜。在另一方法中，混合各別培 養物，隨後加工，接著破壞細胞膜。在一方法中，混合各 別培養物，不進行進一步加工，接著破壞細胞膜。在一方 法中，在破壞細胞膜之前，加工包含第一及第二宿主細胞 之單一培養物。在另一方法中，在破壞細胞膜之前，不加 工共培養之細胞。細胞之加工包含離心及再懸浮於適當緩 衝液（例如提取緩衝液）中。 提取緩衝液為此項技術中已知，且熟習此項技術者應能 夠不經過度實驗而確定使用何種緩衝液。 伯主細胞膜可使用此項技術中已知之方法破壞。該等方 法包括細胞膜滲透及細胞膜崩解。細胞膜滲透係指在不破 壞膜整體完整性以使細胞仍有活力下例如藉由引入孔使膜 滲漏」。換言之’滲透使大分子跨細胞膜移動且保留足 以允許細胞活力延續之細胞結構。相比之下，細胞膜崩解 155406.doc .97· 201139682 使細胞内含物釋放至細胞外環境中且造成細胞死亡。 破壞細胞膜之方法包括（但不限於）：酶法溶解、音波處 理、渗壓衝擊、通過微流化機、添加EDTA、使用各種清 潔劑、溶劑（諸如甲苯、二甲亞颯等）、界面活性劑（諸如 Triton-X 100、Tween 20等）、低滲透壓緩衝液、使用冷凍/ 解凍技術、電穿孔及通過不鏽鋼球均質機。 含鉸鏈多肽自細胞釋放（藉由滲透或崩解）之後，異多聚 域將驅使異多聚體蛋白質締合。在不添加還原劑下，締合 φ 之含鉸鏈多肽形成鏈間二硫基。隨後純化所得經二硫基連 接之異多聚體蛋白質。視情況，其可經調配以用於研究、 診斷、治療或其他目的。 V.標靶分子 可由本發明異多聚體蛋白質靶向之分子之實例包括（但 不限於）可溶性血清蛋白及其受體及其他膜結合蛋白質（例 如黏附素）。 在另一實施例中，本發明之異多聚體蛋白質能夠結合一 φ 種、兩種或兩種以上選自由以下組成之群的細胞激素、細 胞激素相關蛋白及細胞激素受體：BMP1、BMP2、BMP3B (GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、CSF1 (M-CSF)、CSF2 (GM-CSF)、CSF3 (G-CSF)、EPO、FGF1 (aFGF)、FGF2 (bFGF)、FGF3 (int-2)、FGF4 (HST)、FGF5、FGF6 (HST-2)、FGF7 (KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、 FGF12B ' FGF14 、 FGF16 、 FGF17 、 FGF19 、 FGF20 、 FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、 155406.doc • 98 · 201139682 IFNA5 、 IFNA6 、 IFNA7 、IFNBl 、IFNG 、IFNWl 、 FEL1、FEL1 (ε)、FEL1 (ζ)、ILIA、IL1B、IL2、IL3、 IL4、IL5、IL6、IL7、IL8 ' IL9、IL10、IL11、IL12A、 IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、 IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、 IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、
TGFB1、TGFB2、TGFB3、LTA (TNF-b)、LTB、TNF (TNF-a)、TNFSF4 (0X40 g己位體）、TNFSF5 (CD40 配位 體）、TNFSF6 (FasL)、TNFSF7 (CD27 配位體）、TNFSF8 (CD30 S己位體）、TNFSF9 (4-1BB 配位體）、TNFSF10 (TRAIL)、TNFSF11 (TRANCE)、TNFSF12 (AP03L)、 TNFSF13 (April)、TNFSF13B、TNFSF14 (HVEM-L)、 TNFSF15 (VEGI)、TNFSF18、HGF (VEGFD)、VEGF、 VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、LL1RL2、 IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、 IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、 IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、 IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、 IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、 IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、 LEP(痩素）、PTN及 THPO。 在另一實施例中，標靶分子為選自由以下組成之群的趨 化因子、趨化因子受體或趨化因子相關蛋白：CCL1 (I-309)、CCL2 (MCP-1/MCAF)、CCL3 (MIP-la)、CCL4 155406.doc -99- 201139682 (MIP-lb)、CCL5 (RANTES) ' CCL7 (MCP-3)、CCL8 (mcp-2)、CCLH(嗜酸性粒細胞趨化因子）、CCL13 (MCP-4)、 CCL15 (MIP-ld)、CCL16 (HCC-4)、CCL17 (TARC)、 CCL18 (PARC) > CCL19 (MDP-3b)、CCL20 (MIP-3a)、 CCL21 (SLC/次級非淋巴組織趨化因子-2) 、 CCL22 (MDC/STC-1) ' CCL23 (MPIF-1)、CCL24 (MPIF-2/嗜酸性 粒細胞趨化因子-2)、CCL25 (TECK)、CCL26(嗜酸性粒細 胞趨化因子-3)、CCL27 (CTACK/ILC)、CCL28、CXCL1 籲 (GR01) ' CXCL2 (GR02) ' CXCL3 (GR03) ' CXCL5 (ENA-78) ' CXCL6 (GCP-2) ' CXCL9 (MIG) ' CXCL10 (IP 10) ' CXCL11 (I-TAC)、CXCL12 (SDF1)、CXCL13、CXCL14、 CXCL16、PF4 (CXCL4)、PPBP (CXCL7)、CX3CL1 (SCYD1)、SCYE1、XCL1(淋巴細胞趨化因子）、XCL2 (SCM-lb)、BLR1 (MDR15)、CCBP2 (D6/JAB61)、CCR1 (CKR1/HM145)、CCR2 (mcp-IRB/RA)、CCR3 (CKR3/ CMKBR3)、CCR4、CCR5 (CMKBR5/ChemRl3) ' CCR6 · (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7 (CKR7/EB11)、 CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9 (GPR-9-6)、 CCRL1 (VSHK1)、CCRL2 (L-CCR)、XCR1 (GPR5/ CCXCR1)、CMKLR1 、CMKOR1 (RDC1)、CX3CR1 (V28)、CXCR4、GPR2 (CCR10)、GPR31 、GPR81 (FKSG80)、CXCR3 (GPR9/CKR-L2)、CXCR6 (TYMSTR/ STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA (IL8Ra)、IL8RB (IL8Rb)、 LTB4R (GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、 155406.doc -100- 201139682 CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、 C5R1、CSF3、GRCC10 (CIO)、EPO、FY (DARC)、 GDF5、HDF1A、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、 SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2及 VHL。 在另一實施例中，本發明之異多聚體蛋白質能夠結合一 或多種選自由以下組成之群的標靶：ABCF1 ; ACVR1 ; ACVR1B ; ACVR2 ; ACVR2B ; ACVRL1 ; AD0RA2A ;聚 蛋白聚糖；AGR2 ; AICDA ; AIF1 ; AIG1 ; AKAP1 ; AKAP2 ； AMH ； AMHR2 ； ANGPT1 ； ANGPT2 ； ANGPTL3 ； ANGPTL4 ； ANPEP ； APC ； APOC1 ； AR ； AZGP1(辞-a-糖蛋白）；Β7·1 ； B7.2 ； BAD ； BAFF (BLys) ； BAG1 ； BAI1 ； BCL2 ； BCL6 ； BDNF ； BLNK ； BLR1 (MDR15) ; BMP1 ； BMP2 ； BMP3B (GDF10)； BMP4 ； BMP6 ； BMP8 ； BMPR1A ； BMPR1B ； BMPR2 ； BPAG1(網蛋白）；BRCA1 ; C19orfl0 (IL27w) ； C3 ； C4A ； C5 ； C5R1 ； CANT1 ； CASP1 ； CASP4 ； CAV1 ； CCBP2 (D6/JAB61) ; CCL1 (1-309) ; CCL11(嗜酸性粒細胞 趨化因子）；CCL13 (MCP-4) ; CCL15 (MIP-ld) ; CCL16 (HCC-4) ; CCL17 (TARC) ; CCL18 (PARC) ; CCL19 (MIP-3b) ； CCL2 (MCP-1) ； MCAF ； CCL20 (MIP_3a) ; CCL21 (MTP-2) ; SLC ;次級非淋巴組織趨化因子-2 ; CCL22 (MDC/STC-1); CCL23 (MPIF-1); CCL24 (MPIF-2/嗜酸性 粒細胞趨化因子-2) ; CCL25 (TECK) ; CCL26(嗜酸性粒細 月包趨 4匕因子-3) ; CCL27 (CTACK/ILC) ； CCL28 ； CCL3 15S406.doc • 101 - 201139682 (MTP-la) ； CCL4 (MDP-lb) ； CCL5 (RANTES) ； CCL7 (MCP-3) ； CCL8 (mcp-2) ； CCNA1 ； CCNA2 ； CCND1 ； CCNE1 ； CCNE2 ； CCR1 (CKR1/HM145) ； CCR2 (mcp-1RB/RA) ； CCR3 (CKR3/CMKBR3) ； CCR4 ； CCR5 (CMKBR5/
ChemR13) ； CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6) CCR7 (CKR7/EBI1) ; CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-L1) CCR9 (GPR-9-6) ； CCRL1 (VSHK1) ； CCRL2 (L-CCR)
CD164 ； CD19 ； CD1C ； CD20 ； CD200 ； CD22 ； CD24
CD28 ； CD3 ； CD37 ； CD38 ； CD3E ； CD3G ； CD3Z CD4 ； CD40 ； CD40L ； CD44 ； CD45RB ； CD52 ； CD69 CD72 ； CD74 ； CD79A ； CD79B ； CD8 ； CD80 ； CD81 CD83 ; CD86 ; CDH1(E-鈣黏素）；CDH10 ; CDH12 CDH13 ； CDH18 ； CDH19 ； CDH20 ; CDH5 ； CDH7 CDH8 ； CDH9 ； CDK2 ； CDK3 ； CDK4 ； CDK5 ； CDK6
CDK7 ; CDK9 ； CDKN1A (p21 Wapl/Cipl) ； CDKN1B
(p27Kipl) ； CDKN1C ； CDKN2A (P16INK4a) ； CDKN2B ； CDKN2C ; CDKN3 ; CEBPB ; CER1 ; CHGA ; CHGB ;殼 質酶；CHST10 ； CKLFSF2 ; CKLFSF3 ； CKLFSF4 ； CKLFSF5 ； CKLFSF6 ； CKLFSF7 ； CKLFSF8 ; CLDN3 ； CLDN7(緊密連接蛋白-7) ; CLN3 ; CLU(簇蛋白）； CMKLR1 ； CMKOR1 (RDC1) ； CNR1 ； COL18A1 ； COLIA1 ； COL4A3 ； COL6A1 ; CR2 ； CRP ； CSF1(M-CSF) ； CSF2 (GM-CSF) ； CSF3 (GCSF) ； CTLA4 ； CTNNB1 (b-連環素）；CTSB(組織蛋白酶 B) ; CX3CL1 155406.doc -102- 201139682
(SCYDl) ； CX3CR1 (V28) ； CXCL1 (GROl) ； CXCL10 (IP-10) ；CXCL11 (I-TAC/IP-9) ； CXCL12 (SDF1) ； CXCL13 ； CXCL14 ； CXCL16 ； CXCL2 (GR02) ； CXCL3 (GR03)； CXCL5 (ENA-78/LIX) ； CXCL6 (GCP-2) ； CXCL9 (MIG)； CXCR3 (GPR9/CKR-L2) ； CXCR4 ； CXCR6 (TYMSTR/ STRL33/Bonzo) ； CYB5 ； CYC1 ； CYSLTR1 ； DAB2IP ； DES ； DKFZp451J0118 ； DNCL1 ； DPP4 ； E2F1 ； ECGF1 ； EDG1 ； EFNA1 ； EFNA3 ； EFNB2 ； EGF ； EGFR ； ELAC2 ； ENG ； ENOl ； EN02 ； EN03 ； EPHB4 ； EPO ； ERBB2 (Her-2) ； EREG ； ERK8 ； ESR1 ； ESR2 ； F3 (TF)； FADD ； FasL ； FASN ； FCER1A ； FCER2 ； FCGR3A ； FGF ； FGF1 (aFGF) ； FGF10 ； FGF11 ； FGF12 ； FGF12B ； FGF13 ； FGF14 ； FGF16 ； FGF17 ； FGF18 ； FGF19 ； FGF2 (bFGF) ； FGF20 ； FGF21 ； FGF22 ； FGF23 ； FGF3 (int-2) ； FGF4 (HST) ； FGF5 ； FGF6 (HST-2) ； FGF7 (KGF)； FGF8 ； FGF9 ； FGFR3 ； FIGF (VEGFD) ； FEL1 (ε) ； FIL1 (ζ) ; FLJ12584 ; FLJ25530 ; FLRT1(纖維結合蛋白）； FLT1 ； FOS ； FOSL1 (FRA-1) ; FY (DARC) ； GABRP (GABAa) ； GAGEB1 ； GAGEC1 ； GALNAC4S-6ST ； GATA3 ； GDF5 ； GFI1 ； GGT1 ； GM-CSF ; GNAS1 ； GNRH1 ； GPR2 (CCR10) ； GPR31 ； GPR44 ； GPR81 (FKSG80) ； GRCC10 (CIO) ; GRP ; GSN(膠溶素）； GSTP1 ； HAVCR2 ； HDAC4 ； HDAC5 ； HDAC7A ； HDAC9 ; HGF ; HIF1A ; HDP1 ;組胺及組胺受體；HLA_ 15S406.doc •103- 201139682 A ； HLA-DRA ； HM74 ； HMOX1 ； HUMCYT2A ； ICEBERG ； ICOSL ； ID2 ； IFN-a ； IFNA1 ； IFNA2 ； IFNA4 ； IFNA5 ； IFNA6 ； IFNA7 ； IFNB1 ； IFNy ； DFNW1 ； IGBP1 ; IGF1 ； IGF1R ； IGF2 ； IGFBP2 ； IGFBP3 ； IGFBP6 ； IL-I ； IL10 ； IL10RA ； IL10RB ； IL11 ； IL11RA ； IL-12 ； IL12A ； IL12B ； IL12RB1 ； IL12RB2 ； IL13 ； IL13RA1 ； IL13RA2 ； IL14 ； IL15 ； IL15RA ; IL16 ; IL17 ; IL17B ; IL17C ; IL17R ; IL18 ; IL18BP ; IL18R1 ; IL18RAP ; IL19 ; ILIA ; IL1B ; IL1F10 ； IL1F5 ； IL1F6 ； IL1F7 ； IL1F8 ； IL1F9 ； IL1HY1 ； IL1R1 ； IL1R2 ； IL1RAP ； IL1RAPL1 ； IL1RAPL2 ； IL1RL1 ; IL1RL2、IL1RN ; IL2 ; IL20 ; IL20RA ； IL21R ； IL22 ； IL22R ； IL22RA2 ； IL23 ； IL24 ； IL25 ； IL26 ； IL27 ； IL28A ； IL28B ； IL29 ； IL2RA ； IL2RB ； IL2RG ； IL3 ； IL30 ； IL3RA ； IL4 ； IL4R ； IL5 ； IL5RA ; IL6 ; IL6R ; IL6ST(醣蛋白 130) ; EL7 ; EL7R ; EL8 ; IL8RA ; DL8RB ; IL8RB ; DL9 ; DL9R ; DLK ; INHA ； INHBA ； INSL3 ； INSL4 ； IRAKI ； ERAK2 ； ITGA1 ; ITGA2 ; ITGA3 ; ITGA6(a6整合素）；ITGAV ; ITGB3 ; ITGB4(b4整合素）；JAG1 ; JAK1 ; JAK3 ; JUN ; K6HF ； KAI1 ； KDR ； KITLG ； KLF5(GC Box BP)； KLF6 ； KLK10 ； KLK12 ； KLK13 ； KLK14 ； KLK15 ； KLK3 ; KLK4 ; KLK5 ; KLK6 ; KLK9 ; KRT1 ; KRT19(角 蛋白19) ; KRT2A ; KHTHB6(毛髮特異性H型角蛋白）； 155406.doc •104- 201139682
LAMAS ; LEP(瘦素）；Lingo-p75 ; Lingo_Troy ; LPS ; LTA (TNF-b) ； LTB ； LTB4R (GPR16) ； LTB4R2 ； LTBR ； MACMARCKS ; MAG 或 Omgp ; MAP2K7 (c-Jun) ; MDK ; MIB1 ;中期因子；MEF ; MIP-2 ; MKI67 ; (Ki-67); MMP2 ; MMP9 ; MS4A1 ; MSMB ; MT3(金屬硫結合蛋白-III (metallothionectin-III)) ; MTSS1 ; MUC1(黏蛋白）； MYC ; MYD88 ; NCK2 ;神經黏蛋白；NFKB1 ; NFKB2 ; NGFB (NGF) ; NGFR ; NgR-Lingo ; NgR-Nogo66 (Nogo); NgR-p75 ； NgR-Troy ； NME1 (NM23A) ； N0X5 ； NPPB ； NR0B1 ； NR0B2 ； NR1D1 ； NR1D2 ； NR1H2 ； NR1H3 ； NR1H4 ； NR1I2 ； NR1I3 ； NR2C1 ； NR2C2 ； NR2E1 ； NR2E3 ； NR2F1 ； NR2F2 ； NR2F6 ； NR3C1 ； NR3C2 ； NR4A1 ； NR4A2 ； NR4A3 ； NR5A1 ； NR5A2 ； NR6A1 ； NRP1 ； NRP2 ； NT5E ； NTN4 ； ODZ1 ； OPRD1 ； P2RX7 ； PAP ； PARTI ； PATE ； PAWR ； PCA3 ； PCNA ； PDGFA ； PDGFB ; PECAM1 ; PF4 (CXCL4) ; PGF ; PGR ;磷酸蛋白 聚糖；PIAS2 ; PIK3CG ; PLAU(uPA) ; PLG ; PLXDC1 ; PPBP (CXCL7) ； PPID ； PR1 ； PRKCQ ； PRKD1 ； PRL ； PROC ； PROK2 ； PSAP ； PSCA ； PTAFR ； PTEN ； PTGS2 (COX-2) ； PTN ； RAC2 (p21Rac2) ； RARB ； RGS1 ； RGS13 ； RGS3 ； RNF110 (ZNF144) ； ROB02 ； S100A2 ； SCGB1D2 (親脂蛋白B) ; SCGB2A1 (乳腺珠蛋白2); SCGB2A2 (乳腺珠蛋白1) ; SCYE1(内皮單核細胞活化細胞 激素）；SDF2 ; SERPINA1 ; SERPINA3 ; SERP1NB5(乳腺 155406.doc •105- 201139682 絲氨酸蛋白酶抑制劑）；SERPINEl (PAI-I) ; SERPDMFl ; SHBG ； SLA2 ； SLC2A2 ； SLC33A1 ； SLC43A1 ； SLIT2 ； SPP1 ； SPRR1B (Sprl) ; ST6GAL1 ; STAB1 ; STAT6 ; STEAP ； STEAP2 ； TB4R2 ； TBX21 ； TCP10 ； TDGF1 ； TEK ； TGFA ； TGFB1 ； TGFB111 ； TGFB2 ； TGFB3 ； TGFBI ; TGFBR1 ; TGFBR2 ; TGFBR3 ; TH1L ; THBS1(血 小板反應蛋白-1) ; THBS2 ; THBS4 ; THPO ; TIE (Tie-1) ; TMP3 ;組織因子；TLR10 ; TLR2 ; TLR3 ; TLR4 ; TLR5 ； TLR6 ； TLR7 ； TLR8 ； TLR9 ； TNF ； TNF-a ； TNFAEP2 (B94) ； TNFAIP3 ； TNFRSF11A ； TNFRSF1A ； TNFRSF1B ； TNFRSF21 ； TNFRSF5 ； TNFRSF6 (Fas)； TNFRSF7 ； TNFRSF8 ； TNFRSF9 ； TNFSF10 (TRAIL)； TNFSF11 (TRANCE) ； TNFSF12 (AP03L) ； TNFSF13 (April) ； TNFSF13B ； TNFSF14 (HVEM-L) ； TNFSF15 (VEGI) ； TNFSF18 ； TNFSF4 (0X40 酉己位體）；TNFSF5 (CD40西己位體）；TNFSF6 (FasL) ; TMFSF7 (CD27酉己位體）； TNFSF8 (CD30 配位體）；TNFSF9 (4-1BB 配位體）； TOLLIP ； Toll樣受體；T0P2A(拓撲異構酶Ea) ; TP53 ； TPM1 ； TPM2 ； TRADD ； TRAF1 ； TRAF2 ； TRAF3 ； TRAF4 ； TRAF5 ； TRAF6 ； TREM1 ； TREM2 ； TRPC6 ； TSLP ; TWEAK ; VEGF ; VEGFB ; VEGFC ;多功能蛋白 聚糖；VHL C5 ; VLA-4 ; XCL1(淋巴細胞趨化因子）； XCL2 (SCM-Ib) ; XCR1 (GPR5/CCXCR1) ; YY1 ;及 ZFPM2 ° 155406.doc -106- 201139682 本發明涵蓋之抗體的較佳分子標靶分子包括CD蛋白， 諸如 CD3、CD4、CD8、CD16、CD19、CD20、CD34、 CD64、CD200 ; ErbB受體家族之成員，諸如EGF受體、 HER2、HER3或HER4受體；細胞黏著分子，諸如LFA-1、 Macl、pl50.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7整合素 及αν/β3整合素，包括其α或β次單元（例如抗CDlla、抗 CD18或抗CDllb抗體）；生長因子，諸如VEGF-A、VEGF-C ;組織因子（TF) ; α干擾素（「alFN」）；TNFa ;介白素， 諸如 IL-Ιβ、IL-3、IL-4、IL-5、IL-8、IL-9、IL-13、 IL17A/F、IL-18、IL13Ral、IL13Ra2、IL-4R、IL-5R、 IL-9R ; IgE ;血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖（〇B)受體； mpl受體；CTLA-4 ; RANKL、RANK、RSV F蛋白、蛋白 C 等。 在一實施例中，本發明之異多聚體蛋白質結合低密度脂 蛋白受體相關蛋白（LRP)-l或LRP-8或轉鐵蛋白受體，及至 少一種選自由以下組成之群的標靶：1)β-分泌酶（BACE1或 BACE2)、2)α-分泌酶、3)γ-分泌酶、4)τ-分泌酶、5)殿粉 樣前驅蛋白（ΑΡΡ)、6)死亡受體6 (DR6)、7)澱粉樣β肽、 8)α-突觸核蛋白（alpha-synuclein)、9)帕金蛋白（parkin)、 10)亨廷頓蛋白（Huntingtin)、ll)p75 NTR及12)卡斯蛋白 酶-6。 在一實施例中，本發明之異多聚體蛋白質結合於至少兩 種選自由以下組成之群的標靶分子：IL-la及IL-Ιβ、IL-12 及 IL-18 ; IL-13 及 IL-9 ; IL-13 及 IL-4 ; IL-13 及 il-5 ; IL-5 155406.doc 107· 201139682 及 IL-4 ; IL-13及 IL-Ιβ ; IL-13及 IL-25 ; IL-13及 TARC ; IL-13 及 MDC ; IL-13 及 MEF ; IL-13 及 TGF-β ; IL-13 及 LHR促 效劑；IL-12 及 TWEAK、IL-13 及 CL25 ; IL-13 及 SPRR2a ; IL-13 及 SPRR2b ; IL-13 及 ADAM8、IL-13 及 PED2、IL17A 及 IL17F、CD3及 CD19、CD138及 CD20 ; CD138及 CD40 ; CD19及 CD20 ; CD20及 CD3 ; CD38及 CD138 ; CD38及 CD20 ; CD38及 CD40 ; CD40及 CD20 ; CD-8及 IL-6 ; CD20
及 BR3、TNFa 及 TGF-β、TNFa 及 IL-Ιβ ; TNFa 及 IL-2、 TNFa 及 IL-3、TNFa及 IL-4、TNFa及 IL-5、TNFa及 IL6、 TNFa及 IL8、TNFa及 IL-9、TNFa及 IL-10、TNFa及 IL-11、 TNFa及 IL-12、TNFa及 IL-13、TNFa及 IL-14、TNFa及 IL- 15、TNFa及 IL-16、TNFa及 IL-17、TNFa及 IL-18、TNFa 及 IL-19、TNFa 及 IL-20、TNFa 及 IL-23、TNFa 及 IFNa、 TNFa及 CD4、TNFa及 VEGF、TNFa及 MIF、TNFa及 ICAM-1、TNFa及 PGE4、TNFa及 PEG2、TNFa及 RANK配位體、 TNFa 及 Te38 ; TNFa 及 BAFF ; TNFa 及 CD22 ； TNFa 及· CTLA-4 ; TNFa 及 GP130 ； TNFa 及 IL-12p40 ; VEGF 及 HER2、VEGF-A 及 HER2、VEGF-A 及 PDGF、HER1 及 HER2、VEGF-A及 VEGF-C、VEGF-C 及 VEGF-D、HER2 及 DR5、VEGF及 IL-8、VEGF及 MET、VEGFR及 MET 受體、 VEGFR 及 EGFR、HER2 及 CD64、HER2 及 CD3、HER2 及 CD16、HER2 及 HER3 ; EGFR (HER1)及 HER2、EGFR 及 HER3、EGFR 及 HER4、IL-13 及 CD40L、IL4 及 CD40L、 TNFR1 及 IL-1R、TNFR1 及 IL-6R 及 TNFR1 及 IL-18R、 155406.doc -108 - 201139682
EpCAM及 CD3、MAPG及 CD28、EGFR及 CD64、CSPGs及 RGM A ; CTLA-4 及 BTN02 ; IGF1 及 IGF2 ; IGF1/2 及 Erb2B ; MAG 及 RGM A ; NgR及 RGM A ; NogoA及 RGM A ; OMGp及 RGM A ; PDL-I及 CTLA-4 ;及 RGM A及 RGM B。 視情況結合於其他分子之可溶抗原或其片段可用作產生 抗體之免疫原。對於跨膜分子’諸如受體’其片段（例如 受體之細胞外域）可用作免疫原。或者，表現跨膜分子之 細胞可用作免疫原。該等細胞可源自天然來源（例如癌細 胞株）或可為藉由重組技術轉型以表現跨膜分子之細胞。 適用於製備抗體之其他抗原及其形式為熟習此項技術者將 顯而易知。 VI.活性檢定 本發明之異多聚體蛋白質的物理/化學特性及生物學功 能可藉由此項技術中已知之各種檢定表徵。 可藉由一系列檢定進一步表徵經純化之異多聚體蛋白 質，包括（但不限於）N端測序、胺基酸分析、非變性尺寸 排阻高壓液相層析（HPLC)、質譜分析、離子交換層析及木 瓜蛋白酶消化。 在本發明之某些實施例中，分析本文所製造之免疫球蛋 白之生物活性。在一些實施例中，測試本發明免疫球蛋白 之抗原結合活性。此項技術中已知且可用於本文中之抗原 結合檢定包括（但不限於）使用諸如西方墨點法、放射免疫 檢定、ELISA(酶聯免疫吸附檢定）、「夾心」免疫檢定、免 155406.doc •109· 201139682 疫沈澱檢定、螢光免疫檢定及蛋白A免疫檢定之技術的任 何直接或競爭性結合檢定。下文在實例部分提供說明性抗 原結合檢定。 在一實施例中，本發明涵蓋具有一些而非所有效應功能 的經改變抗體，此使該抗體成為諸多應用之適宜候選者， 在該等應用中活體内抗體之半衰期很重要，但某些效應功 能（諸如補體及ADCC)為不必要或有害的。在某些實施例 中，量測所製造之異多聚體蛋白質之Fc活性以確保僅維持 | 所要特性。可進行活體外及/或活體内細胞毒性檢定以證 實CDC及/或ADCC活性減少/去除。舉例而言，可進行Fc受 體（FcR)結合檢定以確保異多聚體蛋白質缺乏FcYR結合能 力（從而可能缺乏ADCC活性），但保留FcRn結合能力。介 導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcyRIII，而單核細胞表 現FcyRI、FcyRII及FcyRIII。FcR在造血細胞上之表現概述 於 Ravetch及 Kinet，/wawwwo/ 9:457-92 (1991)第 464頁表3中。評定相關分子之ADCC活性之活體外檢定的 φ 一實例描述於美國專利第5,500,362號或第5,821，337號中。 適用於該等檢定之效應細胞包括周邊血液單核細胞 (PBMC)及自然殺手（ΝΚ)細胞。或者或另外，例如可在動 物模型（諸如 Clynes 等人 PAMS (C/SW 95:652-656 (1998)中 所揭示之動物模型）中活體内評定相關分子之ADCC活性。 亦可進行Clq結合檢定以確認抗體不能結合Clq且因此缺 乏CDC活性。為評定補體活化，可執行CDC檢定，例如 Gazzano-Santoro 等人，·/_ /wwwwo/· 202:163 155406.doc -110- 201139682 已知之方法進行FcRn (1996)中所述。亦可使用此項技術中 結合及活體内清除率/半衰期測定。 VII.結合之蛋白質 之異多聚體蛋白質（例如根 本發明亦提供包含本文所述 據本文所述之方法製得之抗體）的結合之蛋白質諸如結 合之抗體或免疫結合物（例如「抗體_藥物結合物」或 「ADC」），其中輕鏈或重鏈之恆定區之_結合於化學分
子，諸如染料或細胞毒性劑，諸如化學治療劑、藥物、生 長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶 活性毒素或其片段）或放射性同位素（亦即放射性結合物）。 詳言之，如本文所述，使用異多聚域能夠構築含有兩條不 同重鏈（HC1及HC2)以及兩條不同輕鏈（LC丨及LC2)之抗 體。使用本文所述之方法構築的免疫結合物可含有細胞毒 性劑結合於僅一條重鏈（HC丨或HC2)或僅一條輕鏈（LC】或 LC2)之恆定區》此外，因為免疫結合物可具有細胞毒性劑 連接於僅一條重鏈或輕鏈，所以投與個體之細胞毒性劑之 量相對於投與細胞毒性劑連接於兩條重鏈或輕鏈之抗體減 少。減少投與個體之細胞毒性劑之量可限制與細胞毒性劑 有關之不良副作用。 在治療癌症時使用抗體-藥物結合物局部傳遞細胞毒性 劑或細胞生長抑制劑（亦即殺死或抑制腫瘤細胞之藥 物）（Syrigos 及 Epenetos，Anticancer Research 19:605-614 (1999)，Niculescu-Duvaz及 Springer，Adv· Drg. Del. Rev. 26:151-172 (1997);美國專利第4,975,278號）允許藥物部分 155406.doc -111- 201139682 靶向腫瘤傳遞且在其中進行細胞内累積，其中全身性投與 此等未結合之藥劑可能對正常細胞以及設法去除之腫瘤細 胞造成不可接受之毒性程度（Baldwin等人’ Lancet (1986年 3 月 15 曰）：603-605 (1986) ; Thorpe, (1985)「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」，Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera 等人（編），第 475-506 頁）。因此設法使功效最大而毒性最小。已報導多株抗體 φ 與單株抗體均適用於此等策略（Rowland等人，Cancer Immunol. Immunother. 21:183-187 (1986)) 0 此等方法中戶斤 用之藥物包括道諾黴素、小紅莓、曱胺喋呤及長春地辛 (前述Rowland等人，（1986))。抗體-毒素結合物中所用之 毒素包括細菌毒素，諸如白喉毒素；植物毒素，諸如蓖麻 毒素；小分子毒素，諸如格爾德黴素（geldanamycin) (Mandler等人，Jour, of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581 (2000) ； Mandler 等人，Bioorganic & Med. Chem. · Letters 10:1025-1028 (2000) ; Mandler等人，Bioconjugate Chem. 13:786-791 (2002))、類美登素（EP 1391213 ; Liu 等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996))及刺 孢黴素（Lode等人，Cancer Res. 58:2928 (1998) ; Hinman 等 人，Cancer Res.53:3336-3342 (1993))。該等毒素可藉由包 括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制之機制來實 現其細胞毒性及細胞生長抑制作用。一些細胞毒性藥物在 與大抗體或蛋白質受體配位體結合時趨向於無活性或活性 155406.doc •112· 201139682 降低。 適用於產生免疫結合物之化學治療劑描述於本文（例如 上文）中。可使用之酶活性毒素及其片段包括：白喉A鏈、 白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈（來自綠膿桿菌 (Psewi/owcmas aerwg/wosa))、篦麻毒素A鍵、相思子毒素A 鍵、莫迪素A鍵、α-帚麴菌素、油桐（d/eMr/ies /orc?/z·)蛋 白 '康乃馨蛋白、美洲商陸蛋白 (PAPI、PAPII及 PAP-S)、苦瓜（momordica charantia)抑制 劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草（sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素、有絲分裂素、侷限麴菌素 (restrictocin)、酴黴素、伊諾黴素（enomycin)及黴菌毒素 (tricothecene)。參見例如1993年10月28日公開之WO 93/21232。多種放射性核素可用於製造放射性結合之抗 體。實例包括212Bi、131I、131In、9QY及186Re。抗體與細胞 毒性劑之結合物可使用多種雙官能蛋白質偶合劑製得，該 等蛋白質偶合劑諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫氫） 丙酸酯（SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷（IT)、醯亞胺酯之雙官 能衍生物（諸如二亞胺代己二酸二曱酯鹽酸鹽）、活性酯（諸 如辛二酸二丁二醯亞胺酯）、醛（諸如戊二醛）、雙疊氮基化 合物（諸如雙（對疊氮基苯曱醯基）己二胺）、雙重氮鏽衍生 物（諸如雙（對重氮鏽苯曱醯基）-乙二胺）、二異氰酸酯（諸如 甲苯2,6-二異氰酸酯）及雙活性氟化合物（諸如1，5-二氟-2,4-二硝基苯）。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等 人，Science，238:1098 (1987)中所述來製備。碳14標記之 155406.doc -113- 201139682 1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸（MXDTpA)為 一種用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參 見例如 WO 94/11026。 本文亦涵蓋抗體與一或多種小分子毒素（諸如刺胞黴 素、類美登素、海兔毒素、奥瑞他汀（aurostatin)、新月毒 素及CC1065及此等毒素之具有毒素活性之衍生物）的結合 物〇 i.美登素及類美登素 在一些實施例中，免疫結合物包含本發明之抗體（全長 或片段）結合於一或多個類美登素分子。 類美登素為藉由抑制微管蛋白聚合發揮作用之有絲分裂 抑制劑。美登素最先自東非灌木齒葉美登木 serrae)分離（美國專利第3,896，iii號）。隨後，發現某些微 生物亦產生類美登素，諸如美登醇及C-3美登醇酯（美國專 利第4，1 51,042號）^合成美登醇及其衍生物及類似物揭示 於例如美國專利第4，137,230號；第4,248,870號；第 4,256,746 號；第 4,260,608 號；第 4,265,814 號；第 4,294,757 號；第 4,307,016 號；第 4,308,268 號；第 4,308,269 號；第 4 309,428 號；第 4,313,946 號；第 4,315,929 號；第 4,317,821 號；第 4,322,348 號；第 4,331，598 號；第 4,361，650 號；第 4,364,866 號；第 4,424,219 號；第 4,45〇 254 號；第 4,362,663 號；及第 4,371，533 中。 類美登素藥物部分在抗體-藥物結合物中為具吸引力之 155406.doc 114 201139682 分，因為其：⑴相對易於藉由礙酵或醱酵產物之化 ^ 、衍生而獲得；(ii)易於用適於經由非二硫基連接 子結合於抗體的官能基衍生；㈣在血製中穩定；及（iv) 有效針對多種腫瘤細胞株。 含有類美登素之免疫結合物、其製備方法及其治療用途 揭示於例如美國專利第5 2〇8 〇2〇號第5 41⑽僅及歐洲 專利EP 〇 425 235 B1中，該等專利之揭示内容以引用的方 籲式月確併入本文中。Llu等人，Proc. Natl· Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)描述包含命名為DM1i類美登素連接 於針對人類結腸直腸癌之單株抗體C242的免疫結合物。發 現該結合物對所培養之結腸癌細胞具有高細胞毒性且在活 體内腫瘤生長檢定中展示抗腫瘤活性。Chari等人，Cancer
Research 52:127-131 (1992)描述如下免疫結合物，其中類 美登素經由二硫基連接子與結合於人類結腸癌細胞株上之 抗原的鼠類抗體A7結合，或與結合HER-2/neu致癌基因之 修另一鼠類單株抗體TA. 1結合。在活體外，於每個細胞表現 3><105個11£11-2表面抗原之人類乳癌細胞株8〖-811-3上測試 ΤΑ. 1 -類美登素結合物之細胞毒性。該藥物結合物所達成 之細胞毒性程度與游離類美登素藥物類似，可藉由增加每 個抗體分子之類美登素分子數目而提高^ A7-類美登素結 合物在小鼠中展示低全身細胞毒性。 可藉由在不顯著降低抗體或類美登素分子之生物活性的 情況下將抗體化學連接於類美登素分子來製備抗體-類美 登素結合物。參見例如美國專利第5,208,020號（其揭示内 155406.doc -115· 201139682 容以引用之方式明確併人本文中）。平均每個抗體分子結 合3-4個類美登素分子已展示增強標靶細胞之細胞毒性的 功效且不會負面影響抗體之功能或溶解性，但預期甚至每 個抗體1個毒素分子相較於使用裸抗體亦可增強細胞毒 性。類美登素為此項技術中所熟知，且可藉由已知之技術 合成或自天然來源分離。適合之類美登素揭示於例如美國 專利第5,208’020號及上文提及之其他專利及非專利公開案 中。較佳之類美登素為美登醇及在美登醇分子之芳環中或 其他位置處改質之美登醇類似物（諸如各種美登醇酯）。 此項技術中已知多種連接基團可用於製備抗體-類美登 素結合物，包括例如美國專利第5,2〇8,〇2〇號或歐洲專利 〇 425 235 Bl ; Chari等人，Cancer Research 52:127-131 (1992)及美國專利申請公開案第2005/0169933號中所揭示 之連接基團’該等參考文獻之揭示内容以引用的方式明確 併入本文中。包含連接子組分SMCC之抗體-類美登素結合 物可如美國專利申請公開案第2005/0169933號中所揭示而 製備。連接基團包括如上文所確定之專利中所揭示之二硫 基、硫醚基、酸不穩定基图、光不穩定基團、肽酶不穩定 基團或酯酶不穩定基團，二硫基及硫醚基為較佳。本文中 描述且例示其他連接基團。 抗體與類美登素之結合物可使用多種雙官能蛋白質偶合 劑製得，該等蛋白質偶合劑諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡 啶基二硫基）丙酸酯（SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二 醯亞胺基甲基）環己烷-1-甲酸酯（SMCC)、亞胺基硫雜環戊 155406.doc • 116· 201139682 烧（it)、酿亞胺醋之雙官能衍生物（諸如二亞胺代己二酸二 甲酯鹽酸鹽）、活性醋（諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯）、醛 (諸如戊二搭）、雙疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基苯甲醯 基）己二胺）、雙重氮衍生物（諸如雙（對重氮鑌笨甲醯基）乙 二胺）、二異氰酸酯（諸如2,6-二異氰酸甲苯酯）及雙活性氟 化合物（諸如1，5-二氟-2,4·二硝基笨）。特別較佳之偶合劑 包括提供二硫鍵聯之Ν- 丁二醯亞胺基_3_(2_吡啶基二硫基）
丙酸酯（SPDP)(Carlsson 等人，Bi〇chem. j ι73:723_737 (1978))及N- 丁二酿亞胺基-4-(2-"比咬基硫基）戊酸醋 (SPP)° 連接子可連接於類美登素分子之各個位置，視連接類型 而定。舉例而言，可藉由使用習知偶合技術與羥基反應形 成酯鍵。反應可發生於具有羥基之C-3位置、經羥基甲基 修飾之C-14位置、經羥基修飾之C-15位置及具有羥基之c-20位置。在一較佳實施例中’在美登醇或美登醇類似物之 C-3位置處形成鍵聯。 U·奥瑞他汀及海兔毒素 在一些實施例中，免疫結合物包含本發明抗體結合於海 兔毒素或海兔毒素之肽類似物及衍生物奧瑞他汀（美國專 利第5,635,483號及第5,780,588號）。已展示海兔毒素及奥 瑞他汀干擾微管動力學、GTP水解及核及細胞分裂（Woyke 等人 ’ Antimicrob. Agents and Chemother· 45(12):3580-3584 (2001))且具有抗癌活性（美國專利第5,663,149號）及抗 真菌活性（Pettit 等人，Antimicrob. Agents Chemother. 155406.doc • 117- 201139682 42:2961-2965 (1998))。海兔毒素或奥瑞他汀藥物部分可經 由該肽藥物部分之N(胺基）端或C(羧基）端連接於抗體（WO 02/088172)。 例示性奥瑞他汀實施例包括「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」，美國申請 公開案第2005/023 8649號（其揭示内容以全文引用的方式明 確併入本文中）中所揭示的N端連接之單甲基奥瑞他汀藥物 部分DE及DF〇 · 通常，基於肽之藥物部分可藉由在兩個或兩個以上胺基 酸及/或肽片段之間形成肽鍵而製備。該等肽鍵可例如根 據肽化學領域中熟知之液相合成法（參見E. Schr0der及1(：· Ltibke,「The Peptides」，第 1 卷，第 76-136 頁，1965， Academic Press)製備。奥瑞他汀/海兔毒素藥物部分可根據 以下中之方法製備：美國專利第5,635,483號及第5,780,588 號；Pettit等人，J. Nat. Prod. 44:482-485 (1981) ; Pettit等 人，Anti-Cancer Drug Design 13:47-66 (1998) ； Poncet, 鲁
Curr. Pharm. Des. 5:139-162 (1999);及 Pettit, Fortschr.
Chem. Org. Naturst. 70:1-79 (1997)。亦參見Doronina，Nat. Biotechnol. 21 (7):778-784 (2003);及「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」，美國申請 公開案第2005/0238649號（以全文引用的方式併入本文 中）(揭示例如製備單曱基纈胺酸化合物（諸如結合於連接子 之MMAE及MMAF)之連接子及方法）》 iii.刺孢黴素 13S406.doc -118· 201139682 在其他實施例中，免疫結合物包含本發明抗體結合於一 或多個刺孢黴素分子。刺孢黴素家族之抗生素能夠在低於 皮莫耳濃度下產生雙股DNA斷裂。關於刺孢黴素家族之結 合物之製備，參見美國專利第5,712,374、第5,714,586號' 第 5,739，116 號、第 5,767,285 號、第 5,770,701 號、第 5,770,710 號、第 5,773,001 號及第 5,877,296 號（均屬於 American Cyanamid Company)»可使用之刺胞黴素之結構 類似物包括（但不限於）γ丨1、a/、α/、N-乙醯基·γ丨1、PSAG 及 eVHinman 等人，Cancer Research 53:3336-3342 (1993); Lode等人，Cancer Research 58:2925-2928 (1998) 及上述屬於American Cyanamid之美國專利）。可與抗體結 合之另一抗腫瘤藥物為QFA ’其為抗葉酸藥。刺胞黴素與 QFA均具有細胞内作用位點且不易於跨過質膜。因此，經 由抗體介導之内化作用，細胞吸收此等藥劑，從而大大增 強其細胞毒性作用。 iv.其他細胞毒性劑 可結合於本發明或根據本文所述之方法製得之抗體的其 他抗腫瘤劑包括BCNU、鏈佐星、長春新鹼及5-氟尿嘧 啶、美國專利第5,053,394號及第5,770,710號中所述之統稱 為LL-E3 3288複合物的藥劑家族以及埃斯培拉黴素（美國專 利第 5,877,296號）。 可用酶活性毒素及其片段包括：白喉A鏈、白喉毒素之 非結合活性片段、外毒素A鏈（來自綠膿桿菌）、篦麻毒素A 鏈、相思子毒素A鏈、莫迪素A鏈、α-帚麴菌素、油桐蛋 155406.doc -119- 201139682 白、康乃馨蛋白、美洲商陸蛋白（PAPI、PAPII及PAP-S)、 苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、 白樹素、有絲分裂素、侷限麴菌素、盼黴素、伊諾黴素及 徽菌毒素（參見例如1993年10月28曰公開之WO 93/ 21232)。 本發明進一步涵蓋抗體與具有核分解活性之化合物（例 如核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，諸如去氧核糖核酸酶； DNA酶）之間所形成的免疫結合物。 為選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。可利 用多種放射性同位素產生放射性結合抗體。實例包括 At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32、
Pb212及Lu之放射性同位素。當使用結合物進行偵測時，其 可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如tc"m或 I123 ;或用於核磁共振（NMR)成像（亦稱為磁共振成像， mri)之自旋標記，諸如碘_123(再次）及碘-131、銦-111、 氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、亂、猛或鐵。 可以已知之方式將放射性標記或其他標記併入結合物 中。舉例而言’肽可生物合成’或可藉由使用包含例如 氟-19替代氫之適合胺基酸前驅物進行化學胺基酸合成來 合成。標記（諸如忱991"或1丨23、Re186、Re188及In111)可經由 肽中之半胱胺酸殘基連接。釔-90可經由離胺酸殘基連 接。IODOGEN 法（Fraker 等人 ’ Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57 (197έ))可用於併入碘-123 。 「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」 (Chatal， 155406.doc -120- 201139682 CRC Press 1989)詳細描述其他方法。 抗體與細胞毒性劑之結合物可使用多種雙官能蛋白質偶 合劑製得，該等蛋白質偶合劑諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基）丙酸酯（SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯 二醯亞胺基甲基）環己烷-1-甲酸酯（SMCC)、亞胺基硫雜環 戊烷（IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物（諸如二亞胺代己二酸 二甲酯鹽酸鹽）、活性酯（諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯）、醛 (諸如戊二醛）、雙疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基苯甲醯 基）己二胺）、雙重氮衍生物（諸如雙（對重氮鑌苯甲醯基）-乙 二胺）、二異氰酸酯（諸如2,6-二異氰酸甲苯酯）及雙活性氟 化合物（諸如1，5-二氟-2,4-二硝基苯）^舉例而言，蓖麻毒 素免疫毒素可如Vitetta等人，Science，238:1098 (1987)中 所述來製備。碳14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-曱基二伸乙 三胺五乙酸（MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸與抗體 結合之例示性螯合劑。參見例如WO 94/11026。該連接子 可為促進細胞中細胞毒性藥物釋放之「可裂解連接子」。 舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、 光不穩定連接子、二曱基連接子或含二硫基連接子（Chari 等人，Cancer Research 52:127-131 (1992);美國專利第 5,208,020號）° 本發明之化合物特別涵蓋（但不限於）用如下交聯試劑製 備之 ADC : BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、 MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、 SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、 155406.doc • 121 - 201139682 磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB及SVSB(丁二酿亞胺基_(4_乙烯基硬）苯甲酸酯），該 等交聯试劑可購得（例如賭自Pierce Biotechnology，Inc.，
Rockford, IL.，U.S.A)。參見 2003-2004 Applications Handbook and Catalog第 467-498 頁 β 製備結合之抗體 在本發明之結合之抗體中，抗體視情況經由連接子結合 於一或多個部分（例如藥物部分），例如每個抗體結合約1至 約20個部分。結合之抗體可藉由數種途徑使用熟習此項技 術者已知之有機化學反應、條件及試劑製備，包括：（丨）使 抗體之親核基團與二價連接子試劑經由共價鍵反應，繼而 與相關部分反應；及（2)使部分之親核基團與二價連接子試 劑經由共價鍵反應，繼而與抗體之親核基團反應。製備結 合之抗體的其他方法描述於本文中。 連接子試劑可由一或多個連接子組分構成。例示性連接 子組分包括6-順丁烯二醯亞胺基己醯基（「mc」）、順丁烯 二酿亞胺基丙醯基（「MP」）、纈胺酸-瓜胺酸（「vai_ cit」）、丙胺酸-苯丙胺酸（r aia_phe」）、對胺基苯甲氧基 幾基（「PAB」）、4-(2-»比啶基硫基）戊酸N-丁二醯亞胺酯 (「SPP」）、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基）環己烷+甲酸 N-丁二醯亞胺酯（「SMCC」）及（4-碘·乙醯基）胺基苯甲酸 N- 丁二酿亞胺酯（「SIAB」）》其他連接子組分為此項技術 中已知且些為述於本文中。亦參見「Monomethylvaline
Compounds Capable of Conjugation to Ligands」，美國申請 155406.doc -122- 201139682 公開案第2005/023 8649號’其内容以全文引用的方式併入 本文中。 在一些實施例中’連接子可包含胺基酸殘基。例示性胺 基酸連接子組分包括一肽、三肽、四肽或五肽。例示性二 肽包括绳胺酸-瓜胺酸（vc或val-cit)、丙胺酸·苯丙胺酸（af 或ala-phe) »例示性三肽包括甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸（gly_ Val-Cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸（gly_gly_gly)。包含胺基 φ 酸連接子組分之胺基酸殘基包括天然存在之胺基酸以及次 要胺基酸及非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。可 在胺基酸連接子組分對由特定酶（例如腫瘤相關蛋白酶、 組織蛋白酶B、C及D或纖維蛋白溶酶蛋白酶）酶法裂解的 選擇性方面對胺基酸連接子組分進行設計及最佳化。 抗體上之親核基團包括（但不限於广（i)N端胺基；側 鏈胺基，例如離胺酸；（iii)側鏈硫氫基，例如半胱胺酸； 及（iv)糖羥基或胺基’其中抗體經糖基化。胺基、硫氫基 • 及羥基具有親核性且能夠與連接子部分及連接子試劑上之 親電子基團反應形成共價鍵，該等親電子基團包括：（丨）活 性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基曱酸酯及酸鹵化物； (η)烧基及苯甲基鹵化物，諸如鹵基乙醯胺；（Ui)醛、酮、 羧基及順丁烯二醯亞胺基》某些抗體具有可還原之鏈間二 硫基’亦即半胱胺酸橋。抗體可藉由用諸如DTT(二硫蘇糖 醇）之還原劑處理而具有與連接子試劑結合之反應性。因 此’理論上各半胱胺酸橋將形成兩個反應性硫氫基親核 體。可經由離胺酸與2-亞胺基硫雜環戊烷（喬特試劑 155406.doc -123- 201139682 (Trails reagent))反應使胺轉化為硫氩基，將其他親核基 團引入抗體中。可藉由引入一個、兩個、三個、四個或四 個以上半胱胺酸殘基（例如製備包含一或多個非天然半胱 胺酸胺基酸殘基之突變抗體）而將反應性硫氫基引入抗體 (或其片段）中。 本發明之結合之抗體亦可藉由修飾抗體，引入可與連接 子試劑或藥物或其他部分上之親核取代基反應之親電子部 分來製造。糖基化抗體之糖可例如用過碘酸鹽氧化劑氧 化’形成可與連接子試劑或藥物或其他部分之胺基反應的 醛基或酮基。所得亞胺席夫鹼（Schiff base)基團可形成穩 定鍵聯，或可例如經硼氫化物試劑還原，形成穩定胺鍵 聯。在一實施例中’糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳 糖氧化酶或偏過碘酸鈉之反應可於蛋白質中產生可與藥物 或其他部分上之適當基團反應的羰基（醛基及酮 基）（Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一實施例 中’含有N端絲胺酸或蘇胺酸殘基之蛋白質可與偏過碘酸 納反應’得到搭而非第一胺基酸（Geoghegan及Stroh， Bioconjugate Chem. 3:138-146 (1992);美國專利第 5,362,852號）。該醛可與藥物部分或連接子親核體反應。 同樣’部分（諸如藥物部分）上之親核基團包括（但不限 於）：能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反 應形成共價鍵之胺、硫氫基、羥基、醯肼、肟、肼、硫縮 胺基脲、羧酸肼及芳肼基團，該等親電子基團包括：（i)活 性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物； 155406.doc -124- 201139682 (Η)烧基及苯曱基鹵化物，諸如鹵基乙醯胺；及（in)醛、 酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基。 或者’可例如藉由重組技術或肽合成製得包含抗體及細 胞毒性劑之融合蛋白。DNA之長度可包含編碼結合物之兩 個部分的各別區域’該等區域可彼此相鄰或由編碼不破壞 結合物所要特性之連接子肽之區域分隔。在另—實施例 中’抗體可結合於「受體」（諸如抗生蛋白鏈菌素）以用於 腫瘤預靶向’其中投與個體抗體-受體結合物，繼而使用 清除劑自循環中移除未結合之結合物，隨後投與結合於細 胞毒性劑（例如放射性核苷酸）之「配位體」（例如抗生物素 蛋白）。 ' VIII·效用 本文提供之本發明方法在工業上適用於製造異多聚體蛋 白質。本發明之方法減少兩個各別礙酵及分離中所涉及之
工作量’且減少兩個各別礙酵中所固有之技術困難。此 外，去除先前方法程序中之退火及氧化還原步驟可提高產 量且降低加工複雜性及成本。 本文所述之異多聚體蛋白f可用於例如活體外、離體及 =體内治療方法。本發明提供各種基於使用-或多個此等 。在某些病理病狀中，必需及/或需要利用異 铲截恭占⑯ 抗體）。本發明提供此等異多 聚體蛋白質，其可用於達成多 ^ 夕種目的，例如作為治療劑、 預防劑及診斷劑。舉例而言， ° 本發明提供治療疾病之古 法，該等方法包含投與需要·、Α “ 、 方 興需要/α療之個體本發明之異多聚體 】55406.doc -125- 201139682 蛋白質，從而治療疾病。本文所述之任何本發明異多聚體 蛋白質可用於本文所述之治療（或預防或診斷）方法。 舉例而言，當異多聚體蛋白質為多價時，重要益處為其 對抗原之結合力（avidity)增強。除基於結合單元（亦即Fab) 對抗原具有固有高親和力以外，正常IgG抗體亦由於對標 乾二價結合而利用該結合力作用來提高其與抗原之結合。 針對同一抗原分子上之兩各別抗原決定基的異多聚體蛋 白質不僅可提供增強結合力（binding avidity)之益處（由於 二價結合）’而且亦可獲得與任一親本抗體無關之新穎特 性。因此，本發明之異多聚體蛋白質可用於例如阻斷受 體-配位體相互作用。 本文所述之異多聚體蛋白質亦可用於以一個分子同時阻 斷兩個標靶之信號傳導路徑的應用。 IX·治療用途 本文所述之異多聚體蛋白質（諸如抗體及抗體片段）（例如 根據本文所述方法製得之抗體及/或其片段）可用於治療應 用。舉例而言’該等異多聚體蛋白質可用於治療腫瘤，包 括癌前、非轉移性、轉移性及癌性腫瘤（例如早期癌症）， 用於治療過敏或發炎病症’或用於治療自體免疫疾病，或 用於治療有發生癌症（例如乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎 細胞癌、神經膠質瘤或卵巢癌）、過敏或發炎病症或自體 免疫疾病風險的個體。 術語癌症涵蓋多種增生性病症，包括（但不限於）癌前生 長、良性腫瘤及惡性腫瘤。良性腫瘤保持位於起始位點且 155406.doc •126- 201139682 不能浸潤、侵襲或轉移至遠端位點。惡性腫瘤會侵襲且破 壞周圍的其他組織。其亦能夠脫離起始位置’且通常經由 血流或經由淋巴結所在之淋巴系統，擴散至身體其他部分 (轉移）。原發性腫瘤係由發生之組織類型分類；轉移性腫 瘤係由癌細胞來源之組織類型分類。惡性腫瘤之細胞隨時 間變得愈異常且顯得愈不像正常細胞。此癌細胞外觀之改 變稱作腫瘤等級，且癌細胞描述為良好分化、中等分化、 不良分化或未分化。良好分化之細胞外觀相當正常且類似 於來源之正常細胞。未分化細胞為已變得異常以致不再能 夠確定細胞來源之細胞。 腫瘤可為實體腫瘤或非實體腫瘤或軟組織腫瘤。軟組織 腫瘤之實例包括白血病（例如慢性骨髓性白血病、急性骨 髓性白血病、成人急性淋巴母細胞性白血病、急性骨髓性 白血病、成熟B細胞急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴 細胞性白jk病、幼淋巴細胞性白血病或毛細胞白血病）或 淋巴瘤（例如非霍奇金氏淋巴瘤（non_H〇dgkin,s lymphoma)、皮膚τ細胞淋巴瘤或霍奇金氏病）。實體腫瘤 包括除血液、骨髓或淋巴系統以外的身體組織之任何癌 症。實體腫瘤可進一步分為上皮細胞來源之腫瘤及非上皮 細胞來源之腫瘤。上皮細胞實體腫瘤之實例包括胃腸道、 結腸、乳房、前列腺、肺、腎臟、肝臟、胰臟、卵巢、頭 頸、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、膽囊、 唇、鼻咽、皮膚、子宮、男性生殖器、泌尿器官、膀胱及 皮膚之腫瘤》非上皮來源之實體腫瘤包括肉瘤、腦腫瘤及 155406.doc •127· 201139682 骨腫瘤》 上皮癌一般自良性腫瘤發展為侵襲前階段（例如原位 癌）、穿透基底膜且侵襲上皮下基質之惡性癌症。 多特異性蛋白質複合物亦可用於此等治療應用，且結入 HER2之抗體尤其可用於治療乳癌、結腸直腸癌、肺癌、 腎細胞癌、神經膠質瘤或卵巢癌。 作為接受本發明組合物之候選者的其他個體患有如下疾 病或具有出現如下疾病之風險：纖維小管組織異常增生、 痤瘡、後天性免疫缺乏症候群、動脈閉塞、異位性角膜 炎、細菌性潰瘍、白塞氏病、血源性腫瘤、頸動脈阻塞性 疾病、脈絡膜新血管生成、慢性發炎、慢性視網膜脫離、 慢性葡萄膜炎、慢性玻璃體炎、隱形眼鏡超戴症、角膜移 植排斥反應、角膜新血管生成、角膜移植物新血管生成、 克羅恩氏病、伊爾斯氏病（Eales disease)、流行性角膜妹 膜炎、真菌性潰瘍、單純疱疹感染、帶狀疱疹感染、高黏 滯症候群、卡波西氏肉瘤（Kaposi’s sarcoma)、白血病、脂 質變性、萊姆氏病、邊緣角質層分離、木雷潰瘍（M〇〇ren ulcer)、非麻風性分枝桿菌感染（MyC〇bacteria infecti〇n other than leprosy)、近視、眼部新生血管疾病、視盤小 凹、奥斯勒-韋伯症候群（Osler-Weber syndrome)(奥斯勒-韋 伯-朗迪（Osler-Weber-Rendu))、骨關節炎、佩吉特氏病 (Paget's disease)、平坦部炎、類天疱瘡、泡性角結膜炎、 多動脈炎、雷射後併發症、原蟲感染、彈性假黃瘤、翼狀 胬肉乾性角膜炎、放射狀角膜切開術、視網膜新血管生 155406.doc -128- 201139682 成、早產兒視網膜病、晶狀體後纖維組織增生、類肉瘤、 鞏膜炎、鐮狀細胞貧血、休格連氏症候群（s〇grenis
Syndr〇me)、實體腫瘤、斯特格氏病（Stargart，s disease)、 史蒂力強森病、上緣角膜炎、梅毒、全身性狼瘡、特两安 氏角膜邊緣變性（Terrien，s marginal㈣咖⑽仙）、弓蟲 尤文氏肉瘤（Ewing sarcoma)之腫瘤、神經母細胞瘤之 腫瘤骨肉瘤之腫冑、視網膜母細胞瘤之踵冑、橫紋肌肉 籲瘤之腫瘤、潰瘍性結腸炎 '靜脈閉塞、維生素A缺乏症、 韋格納氏類肉瘤病（Wegener，s s_id(5sis)、與糖尿病有關 之不良血管生成、寄生性疾病、異常創口癒合、外科手術 後肥大、損傷或創傷（例如急性肺損傷/ARDS)、抑制毛髮 生長、抑制排卵及黃體形成、抑制植入及抑制子宮中之胚 胎發育。 可使用根據本文所述方法製得之抗體治療的過敏或發炎 病症或自體免疫疾病或病症之實例包括（但不限於）關節炎 •(類風濕性關節炎，諸如急性關節炎、慢性類風濕性關節 炎、痛風性關節炎、急性痛風性關節炎、慢性發炎性關節 炎退化性關節炎、傳染性關節炎、萊姆關節炎、增生性 關節炎、牛皮癬性關節炎 '脊椎關節炎及幼年發作型類風 濕性關節炎、骨關節炎、慢性漸進性關節炎、變形性關節 炎、慢性原發性多發性關節炎、反應性關節炎及僵直性脊 椎炎）、發炎性過度增殖皮膚病、牛皮癬（諸如斑塊狀牛皮 癬、滴狀牛皮癬、膿皰型牛皮癬及指甲牛皮癖）、皮膚炎 (包括接觸性皮膚炎、慢性接觸性皮膚炎、過敏性皮膚 155406.doc •129· 201139682 炎、過敏性接觸性皮膚炎、疱疹樣皮膚炎及異位性皮膚 炎）、X連鎖高IgM症候群、蓴麻疹（諸如慢性過敏性蓴麻療 及慢性特發性蓴麻疹，包括慢性自體免疫性尊麻疹）、多 發性肌炎/皮肌炎、青少年皮肌炎、中毒性表皮壞死溶 解、硬皮病（包括全身性硬皮病）、硬化症（諸如全身性硬化 症、多發性硬化症（MS)(諸如脊髓-眼MS、原發性進行性 MS(PPMS)及復發緩解性MS(RRMS))、進行性全身性硬化 症、動脈粥樣硬化、動脈硬化、播散性硬化及共濟失調硬 化）、發炎性腸道疾病（IBD)(例如克羅恩氏病、自體免疫介 導之胃腸病、結腸炎（諸如潰瘍性結腸炎、顯微鏡下結腸 炎、膠原性結腸炎、息肉狀結腸炎、壞死性小腸結腸炎及 透壁性結腸炎）及自體免疫性發炎性腸道疾病）、壞疽性膿 皮病、結節性紅斑、原發性硬化性膽管炎、上鞏膜炎、呼 吸窘迫症候群（包括成人或急性呼吸窘迫症候群（ARDS))、 腦膜炎、葡萄膜全部或部分發炎、虹膜炎、脈絡膜炎自 趙免疫性血液病症、類風濕性脊椎炎、突發性耳聾、IgE 介導之疾病（諸如全身性過敏反應及過敏性及異位性鼻 炎）、腦炎（諸如拉氏腦炎及邊緣葉腦炎及/或腦幹腦炎）、 葡萄膜炎（諸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性 葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜 炎、後葡萄膜炎或自體免疫性葡萄膜炎）、有或無腎病症 候群之腎小球腎炎（GN)(諸如慢性或急性腎小球腎炎，諸 如原發性GN、免疫介導之GN、膜性GN(膜性腎病）、特發 性膜性GN或特發性膜性腎病、膜或膜性增生性gn 155406.doc -130- 201139682 (MPGN)(包括I型及Π型）及快速進行性GN)、過敏性病狀、 過敏反應、濕疹（包括過敏性或異位性濕疹）、哮喘（諸如支 氣管哮喘及自體免疫性哮喘）、涉及T細胞浸潤及慢性發炎 反應之病狀、慢性肺部發炎疾病、自體免疫性心肌炎、白 血球黏著缺陷病、全身性紅斑狼瘡（SLE)(諸如皮膚SLE)、 亞急性皮膚紅斑狼瘡、新生兒狼瘡症候群（NLE)、播散性 紅斑狼瘡、狼瘡（包括狼瘡性腎炎、狼瘡性大腦炎、兒童 狼瘡、非腎狼瘡、腎外狼瘡、盤狀狼瘡、狼瘡脫髮）、青 少年發作型（I型）糖尿病（包括兒童胰島素依賴型糖尿病 (IDDM))、成年發作型糖尿病（II型糖尿病）、自體免疫性糖 尿病、特發性尿崩症、與由細胞激素及T淋巴細胞介導之 急性及遲發性過敏反應有關的免疫反應、結核病、類肉瘤 病、肉芽腫（包括淋巴瘤樣肉芽腫、韋格納氏肉芽腫）、顆 粒性球缺乏症、脈管炎（包括血管炎，包括大血管血管炎 (包括風濕性多肌痛及巨細胞（高安氏）動脈炎）、中等血管 企管炎（包括川崎氏病及結節性多動脈炎）、顯微鏡下多動 脈炎、CNS血管炎、壞死性血管炎、皮膚血管炎或過敏性 丘管炎 '全身性壞死性血管炎及ANCA相關之血管炎（諸如 丘格-斯特勞斯血管炎或丘格-斯特勞斯症候群（css)))、顳 動脈炎、再生障礙性貧血、自體免疫性再生障礙性貧血、 庫姆陽性貧血、戴-布二氏貧血、溶血性貧血或免疫性溶 血性貧血（包括自體免疫性溶血性貧血（AIHA))、惡性貧 血、愛迪森氏病、純紅血球貧血或發育不全（pRCA)、因子 VIII缺陷病、A型血友病、自體免疫性嗜中性白血球減少 155406.doc •131· 201139682 症、全部血球減少症、白血球減少症涉及白血球滲出之 疾病、CNS發炎病症、多發性器官損傷症候群（諸如因敗血 病、創傷或出血繼發之多發性器官損傷症候群）、抗原·抗 體複合物介導之疾病、抗腎小球基底膜病、抗鱗脂抗體症 候群、過敏性神經炎、白塞氏病、卡氏症候群、古柏氏症 候群、雷諾氏症候群、休格連氏症候群、史蒂芬-強森症 候群、類天疱瘡（諸如大皰性類天疱瘡及皮膚類天疱瘡）、 天疱瘡(包括尋常天疱瘡、落葉狀天疱瘡、天疱瘡黏膜類 天疱瘡及紅斑性天疱瘡）、自體免疫性多内分泌病、雷特 氏病或雷特氏症候群、免疫複合物性腎炎、抗體介導之腎 炎、視神經脊髓炎、多發性神經病、慢性神經病（諸如igM 多發性神經病4IgM介導之神經病）、血小板減少症（如例 如心肌梗塞患者發展之血小板減少症，包括血栓性血小板 減少性紫癜（TTP)及自體免疫或免疫介導之血小板減少症 (諸如特發性血小板減少性紫癜（ITP)，包括慢性或急性 ΙΤΡ))、睪丸及卵巢之自體免疫疾病（包括自體免疫性睪丸 炎及印巢炎）、原發性甲狀腺功能低下、副曱狀腺機能減 退症、自體免疫内分泌疾病（包括甲狀腺炎，諸如自體免 疫性甲狀腺炎、橋本氏病、慢性曱狀腺炎（橋本氏甲狀腺 炎）或亞急性甲狀腺炎）、自體免疫性甲狀腺病、特發性甲 狀腺功能低下、格雷夫斯氏病、多腺症候群（諸如自體免 疫性多腺症候群（或多腺内分泌病症候群)）、副腫瘤症候群 (包括神經性副腫瘤症候群，諸如朗伯·伊頓肌無力症候群 或伊頓-朗伯症候群）、僵人症候群、腦脊髓炎（諸如過敏性 155406.doc •132· 201139682 腦脊髓炎及實驗性過敏性腦脊髓炎（EAE))、重症肌無力 (諸如胸腺瘤相關之重症肌無力）、小腦退化、神經性肌強 直、斜視眼陣攣或斜視眼陣攣性肌陣攣症候群（〇MS)及感 覺神經病、多灶性運動神經病、席漢氏症候群、自體免疫 性肝炎、慢性肝炎、狼瘡樣肝炎、巨細胞性肝炎、慢性活
動性肝炎或自體免疫性慢性活動性肝炎、淋巴間質性肺 炎、阻塞性細支氣管炎（非移植）伴有NSIP、格林-巴利症候 群、伯傑氏病（IgA腎病）、特發性igA腎病、線狀IgA皮膚 病、原發性膽汁性肝硬化、肺硬化、自體免疫性腸病症候 群、乳糜病、乳糜瀉、口炎性腹瀉（麩質腸病）、難治性脂 肪瀉特發性脂肪瀉、冷球蛋白血症、肌肉萎縮性側索硬 化（ALS ;盧格里格氏病）、冠狀動脈病、自體免疫性耳病 (諸如自體免疫性内耳病（AIED))、自體免疫性耳聾、斜視 眼陣攣性轉攣症候群（〇MS)、多軟骨炎（諸如難純或復 發性多軟骨炎）、肺泡性蛋白沈積症、澱粉樣變性、鞏膜 ^非癌陡淋巴細胞增多、原發性淋巴細胞增多（其包括 單株B細胞淋巴細胞增多（例如良性單株球蛋自症及意義未 明之單株球蛋自症（MGUS)))、周邊神經病、㈣瘤症候 群、通道病變（諸如癲痛、偏頭痛、心律不整、肌肉性病 症聾、盲、週期性麻痒及CNS之通道病變）、自閉、發炎 性肌病、局部節段性腎小球硬化（觸）、内分泌眼病葡 萄膜視網膜炎、脈㈣視賴炎、自體免疫性肝臟病症、 肌肉纖維疼痛、多發性内分泌失調 '施密特氏症候群、腎 上腺炎、胃萎縮、早老性癡呆、脫趙鞠疾病（諸如自體免 155406.doc -133· 201139682 疫性脫髓鞘疾病）、糖尿病性腎病、德雷斯勒氏症候群、 斑形脫髮、CREST症候群（齊質沈積症、雷諾現象、食道 蝶動異常、指硬皮病及毛細血管擴張）、男性及女性自體 免疫性不孕症、混合型結締組織疾病、卡格氏病、風濕 熱、反覆流產、農民肺、多形性紅斑、心臟切開術後症候 群、庫欣氏症候群、飼鳥者肺、過敏性肉芽腫性血管炎、 良性淋巴細胞性血管炎、阿爾波特氏症候群、肺泡炎（諸 如過敏性肺泡炎及纖維化肺泡炎）、間質性肺病、輸血反 應 '麻風、瘧疾、利什曼體病、錐蟲病、血吸蟲病、蛔蟲 病、麯黴病、森普特氏症候群、卡潘氏症候群、登革熱、 心内膜炎、心内膜心肌纖維化、彌漫性間質性肺纖維化、 肺間質纖維化、特發性肺纖維化、囊腫性纖維化、内眼 炎、持久性隆起性紅斑、胎兒紅血球母細胞增多症、嗜伊 紅血球筋膜炎、舒爾曼氏症候群、費爾提氏症候群、絲蟲 病、睫狀體炎（諸如慢性睫狀體炎、異色性睫狀體炎、虹 膜睫狀體炎或福斯氏睫狀體炎）、亨諾_許蘭紫癜、人類免 疫缺乏病毒（HI V)感染、埃可病毒感染、心肌病、阿兹海 默氏病、小病毒感染 '風疹病毒感染、疫苗接種後症候 群、先天性風疹感染、愛巴病毒感染、腮腺炎、埃文氏症 候群、自體免疫性生殖腺失調、西氏舞蹈病、鏈球菌感染 後腎炎、閉塞性血栓性血管炎、甲狀腺毒症、脊髓癆、脈 絡膜炎、巨細胞多肌痛、内分泌眼病、慢性過敏性肺炎、 乾燥性角膜結膜炎、流行性角膜結膜炎、特發性腎炎症候 群、微小病變性腎病、良性家族性及缺血再灌注損傷、視 155406.doc •134- 201139682 網膜自體免疫、關節發炎、支氣管炎、慢性阻塞性氣管 病、矽沉著病、口瘡、口瘡性口炎、動脈硬化症、不形成 精子症、自體免疫性溶血、伯克氏病、冷球蛋白血症杜 氏攣縮、晶狀體過敏性眼内炎、過敏性腸炎、麻風結節性 紅斑、特發性面神經麻痒、慢性疲勞症候群、風濕熱、哈 曼-里奇氏病、感音神經性聽力損失、陣發性血紅素尿、 性腺低能症、區域性迴腸炎、白血球減少症、傳染性單校 • 細胞增多症、橫貫性脊髓炎、原發性特發性黏液水腫、腎 炎、交感性眼炎、肉芽腫性睪丸炎、胰腺炎、急性多神經 根炎、壞疽性膿皮病、魁文氏甲狀腺炎、後天性脾萎縮、 由抗精細胞抗體所致之不孕症、非惡性胸腺瘤、白斑症、 SCID及愛巴病毒相關疾病、後天性免疫缺乏症候群 (AIDS)、寄生性疾病（諸如利什曼原蟲病）、中毒性休克症 候群、食物中毒、涉及T細胞浸潤之病狀、白血球黏著缺 陷病、與由細胞激素及T淋巴細胞介導之急性及遲發性過 ® 敏反應有關的免疫反應、涉及白血球滲出之疾病、多發性 器S損傷症候群、抗原-抗體複合物介導之疾病、抗腎小 球基底膜病、過敏性神經炎、自體免疫性多内分泌病、印 巢炎、原發性黏液水腫、自體免疫性萎縮性胃炎、交感性 眼炎、風濕性疾病、混合型結缔組織疾病、腎病症候群、 胰島炎、多内分泌腺失調、周邊神經病、自體免疫性多腺 症候群I型、成年發作型特發性副曱狀腺機能減退症 (AOIH)、全禿、擴張型心肌病、後天性大皰性表皮鬆懈 (EBA)、血色素沉著症、心肌炎、腎病症候群、原發性硬 155406.doc • 135· 201139682 化性膽管炎、化膿性或非化膿性f炎、急性或慢性f炎、 筛竇炎、額竇炎、上頜寶炎或蝶竇炎、嗜伊紅血球相關病 症（諸如嗜伊紅血球過多、肺部浸潤性嗜伊紅血球過多、 嗜伊紅血球過多·肌痛症候群、呂弗勒氏症候群、慢性嗜 伊紅血球肺炎、熱帶肺嗜伊“球過多、支氣管肺麯黴 病、麯黴腫或含有嗜伊紅血球之肉芽瘤）、全身性過敏反 應、血清陰性脊椎關節炎、多内分泌腺自體免疫疾病、硬 化性膽管炎、鞏膜、上鞏祺、慢性皮膚黏膜念珠菌病、布 魯頓氏症候群、嬰兒暫時性低丫球蛋白血症、威斯科特奥 爾德里奇症候群、共濟失調毛細血管擴張、與膠原性疾病 有關之自體免疫病症、風濕病、神經病、缺企再灌注病 症、血壓反應降低、血管功能障礙、血管擴張、組織損 傷、心血管缺血、痛覺過敏、大腦缺血及伴有血管生成之 疾病、過敏症、腎小球腎炎、再灌注損傷、心肌或其他組 織之再灌注損傷、含急性發炎組分之皮膚病急性化腹性 腦膜炎或其他令樞神經系統發炎性病症、眼睛及眼眶發炎 性病症、顆粒球輸注相關症候群、細胞激素誘發之毒性、 急性嚴重性發炎、慢性難治性發炎、腎盂炎、肺硬化、糖 尿病性視網膜病、糖尿病性大動脈病症、動脈内膜過度增 生、消化性潰瘍、瓣膜炎及子宮内膜異位。 除2療用途以外，本發明之抗體可用於達成其他目的， 包括0斷方法’諸如本文所述之疾病及病狀的診斷方法。 χ·粼量、調配物及持續時間 本發明之蛋白質將以與良好醫療實踐一致之方式調配、 155406.doc •136· 201139682 給與及投與。在此情形中所考慮之因素包括所治療之特定 病症、所治療之特定哺乳動物、個別個體之臨床狀況、病 症之原因、藥劑傳遞位點、投藥方法、投藥時程及開業醫 師已知之其他因素。欲投與之蛋白質的「治療有效量」應 受該等考慮因素控制，且為預防、改善或治療特定病症 (例如癌症、過敏或發炎病症或自體免疫病症）所必需之最 小量。蛋白質無需但視情況可與一或多種當前用於預防或 φ 治療該病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量視存 在於調配物中之蛋白質之量、病症或治療之類型及上述其 他因素而定。其一般以與上文所用相同之劑量及投藥途徑 使用或以迄今所用劑量之約1〇/。至99%使用。一般而言，減 輕或治療癌症包含減輕一或多個與癌症有關之症狀或醫學 問題。治療有效量之藥物可實現以下之一或組合：減少癌 細胞之數目（至少 10%、20%、30%、40%、50%、60〇/〇、 70%、80%、90%、100%或1〇〇%以上）；減少或抑制腫瘤尺 春寸或腫瘤負荷；抑制（亦即在某種程度上減少及/或停止）癌 細胞向周邊器官浸潤；在腺瘤之情況下減少激素分泌；降 低血管密度；抑制腫瘤轉移，·減弱或抑制腫瘤生長；及/ 或在某種程度上緩解一或多種與癌症有關之症狀。在一些 實施例中’蛋白質用於預防個體之癌症或自體免疫病症發 生或復發。 在一實施例中，本發明可用於延長易患或經診斷患有癌 症或自體免疫病症之人類個體的存活持續時間。存活持續 時間定義為自首次投與藥物至死亡之時間。存活持續時間 155406.doc -137- 201139682 亦可藉由治療組相對於對照組之分層風險比（HR)量測，該 風險比表示治療期間個體死亡之風險。 在另一實施例中，本發明之治療顯著提高易患或經診斷 患有癌症且用各種抗癌症療法治療之人類個體組的反應速 率。反應速率定義為經治療個體中對治療起反應之百分 比。在一態樣中，相較於用外科手術、輻射療法或化學療 法單獨治療之組’使用本發明之蛋白質與外科手術、輻射 療法或一或多種化學治療劑的本發明組合治療顯著提高經 治療個體組之反應速率，該提高之卡方p_ value)小於0.005。癌症治療中治療功效之其他量度描述於 美國專利申請公開案第20050186208號中》 使用此項技術中已知之標準方法，藉由混合具有所要純 度之活性成分與視情況選用之生理學上可接受之载劑、賦 形劑或穩定劑來製備治療調配物（Remingt〇n，s
Pharmaceutical Sciences (第 20版），A. Gennaro編，2000, Lippincott，Williams & Wilkins，Philadelphia，PA)。可接受 之載劑包括生理食鹽水，或緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸 鹽及其他有機酸；抗氧化劑’包括抗壞血酸；低分子量 (小於約10個殘基）多狀；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠 或免疫球蛋白’親水性聚合物，諸如聚乙稀η比格咬胺 基酸’諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺 酸，單酷、一酶及其他碳水化合物’包括葡萄糖、甘露糖 或糊精；螯合劑’諸如EDTA ;糖醇，諸如甘露糖醇或山 梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；及/或非離子型界面活 155406.doc -138- 201139682 性劑’諸如 TWEEN™、PLUR0NICSTM4 PEG。 視情況但較佳地’該調配物含有醫藥學上可接受之鹽， 較佳為氣化鈉，且在約生理學濃度下。視情況，本發明之 調配物可含有醫藥學上可接受之防腐劑。在某些實施例 中’防腐劑濃度範圍為〇.丨％至2.0%(通常v/v)。適合防腐劑 包括醫藥技術中已知之防腐劑。笨甲醇、苯酚、間曱酚、 對經基苯甲酸曱酯及對羥基苯甲酸丙酯為較佳防腐劑。視 % 情況’本發明之調配物可包括濃度為0.005%至0.02%之醫 藥學上可接受之界面活性劑。 如所治療之特定適應症所需，本文之調配物亦可含有一 種以上活性化合物’較佳為具有互補活性且不會不利地彼 此影響的活性化合物。該等分子適合以有效達成預期目的 之量組合存在。 活性成分亦可包埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合 製備之微膠囊（分別例如羥甲基纖維素微膠囊或明膠微膠 籲囊及聚-(曱基丙烯酸曱酯）微膠囊）中；包埋於膠態藥物傳 遞系統（例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子 奈平膠囊）中’或包埋於巨乳液中。前述Remington's
Pharmaceutical Sciences 中揭示該等技術。 可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含 有異多聚體蛋白質之固體疏水性聚合物的半滲透性基質， 該等基質呈成型物品（例如薄膜或微膠囊）之形式。持續釋 放基質之實例包括聚酯、水凝膠（例如聚（2-羥基乙基-曱基 丙稀酸i曰）或聚（乙烯醇））、聚丙交酯（美國專利第3,773 919 155406.doc -139- 201139682 號）、L-麩胺酸與γ乙基丄·麩胺酸酯之共聚物、不可降解之 乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸_乙醇酸共聚物（諸如 LUPRON DEPOT，由乳酸乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林 構成的可注射微球體））及聚羥基丁酸。儘管聚合 物（諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸_乙醇酸）能夠釋放分子超 過100天，但某些水凝膠釋放蛋白質時間較短。當囊封之 異多聚體蛋白質長時間保留於體内時，其可能會因在37。〇 下暴露於水分而變性或凝集，從而導致生物活性喪失及免 疫原性可旎改變。視所涉及之機制而定可設計合理的穩 疋策略β舉例而言，若發現凝集機制為經由硫基-二硫基 互換（thio-disulfide interchange)形成分子間s_s鍵，則可藉 由修飾氫硫基殘基、自酸性溶液;東乾、控制水分含量、使 用適當添加劑及開發特;^聚合物基質組合物來實現穩定。 本文所述之蛋白質（例如異多聚體蛋白#，諸如根據本 文所述之方法製得之多特異性抗體）可根據已知之方法投 與人類個體，諸如以快速注射形式或藉由經—段時間連續 輸注靜脈内投與’藉由肌肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮 下、關節内、滑膜内、勒内、經口、局部或吸入途徑投 與。若廣泛副作用或毒性伴隨對蛋白f所識別之標乾分子 的拮抗作用，則可能尤其適宜局部投^離體策略亦可用 於治療應用。離體策略包含用編廡太双ηΗ π , _ _
酸轉染或轉; 胞返回個趙 骨趙細胞、J 155406.doc 201139682 細胞）、纖維母細胞、上皮細胞、内皮細胞、角質細胞或 肌細胞之多種類型中之任一種。 在一實例中’當病症或腫瘤位置允許時，蛋白質複合物 (例如異多聚體蛋白質，諸如根據本文所述方法製得之多 特異性抗體）可例如藉由直接注射來局部投與，且該注射 可週期性重複。在手術切除腫瘤之後，蛋白質複合物亦可 向個體全身傳遞或直接傳遞至腫瘤細胞（例如腫瘤或腫瘤 床）以預防或減少局部復發或轉移。 XI·製品 本發明之另一實施例為含有一或多種本文所述之蛋白質 複合物及適用於治療或診斷病症（例如自體免疫疾病或癌 症）之物質的製品。該製品包含容器及在該容器上或與該 容器相連之標籤或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、 小瓶、注射器等。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形 成。該容器容納有效治療病狀之組合物，且可具有無菌入 孔（例如容器可為具有皮下注射針可刺穿之塞子的靜脈内 溶液袋或小瓶）。組合物中之至少-種活性劑為本發明之 異多聚體蛋白質（例如抗體或抗體片段）。標籤或藥品說明 書指示該組合物係用於治療特定病狀m藥品說明書 進-步包含關於向個體投與異多聚體蛋白質組合物之說： 書。亦涵蓋包含本文所述之組合療法的製品及套組。 藥品說明書係指通常包括在治療產品之商f包裝中的說 明書’其含有關於適應症、用法、劑量、投藥、禁忌症及/ 或有關使用該等治療產品之警告的資訊。在某㈣㈣ 155406.doc 201139682 中’藥品說明書指示該組合物係用於治療乳癌、結腸直腸 癌、肺癌、腎細胞癌、神經膠質瘤或卵巢癌。 此外，製品可進一步包含第二容器，該容器包含醫藥學 上可接受之緩衝液，諸如抑菌性注射用水（BWFI)、磷酸鹽 緩衝鹽水、林格氏溶液（Ringer’s solution)及右旋糖溶液。 其可進一步包括由商業及使用者觀點考慮之其他物質，包 括其他緩衝液、稀釋液、過濾器、針及注射器。 亦提供適用於各種目的之套組，例如用於抗原（例如 HER2或EGFR)自細胞純化或免疫沈澱。為分離及純化抗原 (例如HER2或EGFR)，套組可含有異多聚體蛋白質（例如 EGFR/HER2)偶合於珠粒（例如環脂糖珠粒）。可提供如下 套組，其含有用於例如在ELISA或西方墨點法中活體外偵 測及定量抗原的異多聚體蛋白質。如製品般，套組包含容 器及在該容器上或與該容器相連之標籤或藥品說明書。該 容器容納包含至少一種本發明異多聚體蛋白質（例如多特 異性抗體或抗體片段）之組合物。可包括含有例如稀釋液 及緩衝液或對照抗體之其他容器。標籤或藥品說明書可提 供組合物之描述以及用於所欲活體外或診斷用途之說明 書。 認為上述書面描述足以使得熟習此項技術者能夠實施本 發明。以下實例僅出於說明之目的而提供，且不欲以任何 方式限制本發明之範疇。實際上，熟習此項技術者由上述 描述顯而易知除本文所示及所述以外的本發明之各種修改 且該等修改屬於隨附申請專利範圍之範疇内。 155406.doc -142· 201139682 在以下實驗揭示内容中，以下縮寫適用：eq(當量）； Μ(莫耳濃度）；μΜ(微莫耳濃度）；N(當量濃度）；m〇i(莫 耳）；mmol(毫莫耳）；μιη〇ΐ(微莫耳）；nm〇l(奈莫耳）；g(公 克）；mg(毫克）；kg(公斤）；(微克）；L(公升）；mi(毫 升）；μΐ(微升）；cm(公分）；mm(毫米）；μπι(微米）；nm(奈 米）；°C(攝氏度）；h(小時）；min(分鐘）；sec(秒）；msec(毫 秒）；ADCC(抗體依賴性細胞毒性）；BsAb(雙特異性抗 φ 體）；Cl(輕鏈之恆定域）；CH(重鏈之恆定域）；CMC(補體 介導之細胞毒性）；F_ab(抗原結合片段）；Fc(結晶片段）； Fv(可變片段（VL+VH)) ; EGFR(表皮生長因子受體）；HC(重 鍵）；IGFR(胰島素樣生長因子受體）；lc(輕鏈）；scFv(單 鏈可變片段（由胺基酸連接子繫栓之VL與vH)) ; VEGF (血管 内皮生長因子）；VEGFR2(血管内皮生長因子受體2); VH(可變重鏈域）；VL(可變輕鏈域）。 實例 鲁在以下實例中進一步詳細說明本發明，該等實例不欲以 任何方式限制所主張之本發明範疇。附圖意欲視為本發明 之說明及描述的組成部分。所引用之所有參考文獻_所述 的全部内容以引用的方式特別地併入本文中。提供以下實 例說明而非限制所主張之本發明。 實例1 構築表現載體 此實例說明用於使宿主細胞轉型之核酸構築體。 一般而言，重鏈與輕鏈DNA編碼序列均選殖於表現質體 155406.doc •143· 201139682 中，該表現質體含有用於各序列之各別啟動子元件及用於 選擇含有表現質體之細菌細胞的抗生素抗性。載體構築體 亦編碼熱穩定性腸毒素n(STII)分泌信號（Picken等人， 1983，Infect. Immun. 42:269-275及 Lee 等人，1983，Infect. Immun. 42:264-268)以將抗體多狀輸出至細菌細胞之周質 空間中。各鏈之轉錄由phoA啟動控制（Kikuchi等人， 1981，Nucleic Acids Res.，9:5671-5678)，且先前所述之具 有所量測之相對轉譯強度的STII信號序列變異體提供轉譯 | 控制，該等STII信號序列變異體在轉譯起始區（TIR)含有沉 默密瑪子變化（Simmons 及 Yansura， 1996, Nature Biptechnol. 14:629-634及 Simmons等人，2002，J. Immunol Methods，263:133-147)。圖2A及2B分別展示杵及臼質體之 示意圖。 儘管本發明不依賴於特異性抗體結合序列且適用於任何 半抗體組合，但本文之實例係關於針對c-met、EGFR、IL-4及IL-13之異多聚體抗體。美國專利第7,472,724號及美國 φ 專利第7,498,420號中給出抗c-met抗體之實例。美國臨時 申請案61/210,562(2009年3月20曰申請）、美國專利申請公 開案第20080274114號（2008年11月6日公開）及美國專利第 5,844,093號（1998年12月1日頒予）中給出抗EGFR抗體。美 國專利第7,501，121號（2009年3月10日頒予）、美國專利第 7,615,213 號（2009 年 11 月 1〇 日頒予）、WO 2006/085938 (2006年8月17曰公開）、美國專利申請公開案第 20,090,214,523號（2009年8月27曰公開）及美國專利第 155406.doc 201139682 7,674,459號（2010年3月9日頒予）中描述抗IL-13抗體之實 例。美國專利申請公開案第US 20080241160號（2008年10 月2日公開）及美國專利第6,358,509號（2002年3月19曰頒予） 中描述抗IL-4抗體之實例。 各半抗體具有經工程改造於重鏈中之杵（突起）或臼（空 腔），如美國專利第7,642,228號中所述。簡言之，首先產 生CH3杵突變體。隨後藉由隨機化接近搭配物ch3域上之杵 的殘基366、368及407產生CH3臼突變體之庫。在以下實例 中’在IgGl骨架中，杵突變為T366w，且臼具有突變 T366S、L368A及Y407V。熟習此項技術者容易確定其他 免疫球蛋白同型中之同等突變。此外’熟習此項技術者應 易瞭解’用於雙特異性抗體之兩個半抗體較佳為相同同 型。可使用不同同型之半抗體，但可能需要其他突變。 儘管此實例中所述之載體係用於抗c-Met或抗EGFR半抗 體’但熟習此項技術者應易瞭解質體中可編碼任何抗體。 本文所用之所有構築體的起始質體為先前所述之抗組織因 子各別順反子質體paTF50，其中重鏈之相對TIR為1且輕鍵 之相對TIR為 l(Simm〇nS等人 ’ 2002, J_ lmmun〇1 Meth〇ds， 263:133-147及美國專利第6,979,556號）。相對TIR強度增加 用於提高此等半抗體之表現力價。 實例2 使用各別細胞培養物製造異多聚趙蛋白質 以下實例展示當表現單體組分之細胞在各別培養物中生 長時異多聚體蛋白質之製造。在此方法中，細胞在各別培 155406.doc -145- 201139682 養物中生長且誘導其表現半抗體。在一方法中，可在蛋白 質純化之前組合宿主細胞培養物。在另一方法中，可首先 純化組分，隨後組合形成異多聚體蛋白質。 在兩種方法中，將編碼第一含鉸鏈多肽（例如半抗體 (杵））之核酸引入第一宿主細胞中’且將編碼第二含狡鏈多 肽（例如半抗體（臼））之核酸引入第二宿主細胞中。儘管此 實例說明BsAb之形成，但熟習此項技術者應易瞭解所述方 法適用於包含鉸鏈區之任何異多聚體蛋白質（例如親和抗 體等）。 方法#1-在各別培養物中獨立製造杵半抗體及臼半抗體， 各別純化該等半抗體，混合且氧化還原形成完整BsAb 藉由使用實例1中所述之構築體在細菌宿主細胞（例如大 腸桿菌）中表現重鏈及輕鏈而在各別培養物中產生含有样 或臼突變之半抗體。參見圖3B及4A。在此方法#1中，杵 半抗體為抗EGFR且臼半抗體為抗c_met。將實例1之表現 質體引入大腸桿菌宿主菌株33D3 (Ridg way等人，（1999) 59 (11): 2718)或 64B4 (W3110 Δ//^ Δ/7/zd Z/VG+ Aprc spr43Hl NdegP AmanA laclq ^ompT)今，瓦於含後笮西林 (carbenicillin)之LB平板上選擇轉型體。隨後使用轉型體接 種含羧苄西林之LB起始培養物，且使其在3〇°c下在震盪下 生長隔夜。用含羧苄西林之磷酸鹽限制培養基 C.R.A.P.(Simmons等人，2002，J. Immunol Methods，263: 133-147)稀釋起始培養物loo倍，且使其在3〇1下在震盪下 生長24小時。將培養物離心，且冷凍細胞小球，直至開始 15S406.doc •146· 201139682 抗體純化。使小球解凍，且再懸浮於含有25 mM經鹽酸調 節至 pH 7.5 之 Tris 鹼、125 mM NaCl 及 5 mM EDTA 的提取 緩衝液（TEB或Tris提取緩衝液）（其中體積與重量比為每5公 克細胞小球100 mL TEB)中，且藉由使用微流化技術，使 再懸浮混合物三次通過Microfluidics Corporation 110F型微 流化機（Newton，ΜΑ)破壞細胞來提取。隨後藉由在 15,000xg下離心20分鐘來淨化細菌細胞提取物，且收集上 清液並經由0.22微米乙酸酯過濾器過濾，隨後進行純化。 分別藉由蛋白A捕捉，繼而陽離子交換層析來純化各半 抗體。將杵半抗體之經淨化細胞提取物以2 mL/min負載於 1 mL 來自 GE Healthcare(Pistcataway, NJ)之 HiTrap MabSelect SURE管柱上。負載之後，用10管柱體積（CV)40 mM檸檬酸鈉（pH 6.0)、125 mM氯化鈉及5 mM EDTA，繼 而5管柱體積20 mM檸檬酸鈉（pH 6.0)洗滌管柱，以促進陽 離子交換管柱捕捉。用10管柱體積（CV)0.2 mM乙酸（pH 2-3)溶離親和力捕捉之半抗體，且直接捕捉於1 mL來自GE Healthcare之HiTrap SP-HP強陽離子交換管柱上。用10 CV 含25 11114 2-〇^-嗎啉基）乙烷磺酸（^1£8)(?115.8)之緩衝液八 洗滌管柱。用0-50°/〇緩衝液B(25 mM MES(pH 5.8)及1 Μ氯 化鈉（NaCl))之線性梯度溶離半抗體。兩種蛋白質均在 20%-40% B之間溶離，且藉由280 nm下之UV吸光度及藉由 非還原性SDS-PAGE分析所收集之溶離份而確定的溶離峰 分別作為杵或臼半抗體彙集。兩種蛋白質一般展現主溶離 峰，且含有經氧化連接於彼此之重鏈及輕鏈物質的所有溶 155406.doc •147- 201139682 離份均包括於彙集物中。藉由還原性及非還原性SDS_ PAGE對經純化半抗體之分析展示於圖4B中。結果表明， 大多數所表現且捕捉之蛋白質的大小為75 kD。藉由圖4C 中所示之ESI-TOF質譜分析證實此。半抗體之質量為預期 質量’表明任何半胱胺酸（包括鉸鏈區中之兩個半胱胺酸 殘基）上均不存在二硫基加合物。為判定较鍵半胱胺酸是 否經還原而展現反應性游離硫氫基，使蛋白質在中性pH值 下與1 mM N-乙基順丁烯二醯亞胺（Nem)反應1小時，隨後 藉由質譜分析進行分析，蛋白質之質量不變，表明欽鏈半 胱胺酸很可能以鏈内二硫基（例如環狀二硫基）之形式經氧 化連接於彼此。為使用此兩個半抗體（杵及臼）組裝完整雙 特異性抗體’需要首先還原较鍵區之鍵内二硫基以釋放半 耽胺酸游離硫氫基’以使其可隨後經氧化連接於另一重鏈 而形成150 kD雙特異性抗體。 為實現兩個形成完整雙特異性分子之互補半抗體之退 火、還原及再氧化，研發出以下程序。獨立分離之後，在 程序（圖5A中所示）之彙集步驟中將經純化蛋白質以等質量 合併在一起，藉由添加1/1〇體積之11^7'出化117.5)調節彙 集物之pH值至7.5，且在室溫下用0.5 mM Tris[2·羧基乙基] 膦（TCEP)還原蛋白質。還原2小時之後，使用5 mL Zeba去 鹽離心管柱（Pierce, Rockford，IL)將所彙集之蛋白質緩衝 液更換成25 1!11；11[1^(?117.5)及125 111]^&(：卜得到約4 1111^ 趙積之濃度為1 mg/mL之蛋白質。隨後藉由加熱混合物至 52°C，維持25分鐘，繼而冷卻至室溫（約2〇。〇，使蛋白質 155406.doc •148· 201139682 退火。使用10 kD MW截留離心濃縮器將經退火之抗體濃 縮至0.5 mL體積之濃度為約8 mg/mL之蛋白質，且藉由向 反應混合物添加300微莫耳濃度來自100 mM DHAA溶解於 二甲亞砜中之儲備溶液的去氫抗壞血酸（DHAA)來氧化。 添加用於氧化之DHAA之量約10倍過量於蛋白質莫耳濃 度。在室溫下氧化隔夜之後，將經氧化物質於S-200凝膠 過渡管柱（22 mL S200 Tricorn，來自 GE Healthcare)上於含 25 mM MES(pH 6·0)及300 mM NaCl之緩衝液中操作。彙 集完整抗體且用水稀釋10倍。隨後藉由弱陽離子交換層 析，使用羧甲基（CM)樹脂（1 mL HiTrap CM-FF，GE Healthcare)，用4.5至9.2之pH梯度溶離來純化BsAb蛋白 質。緩衝液A及B組合物由20 mM擰檬酸鈉、30 mM MES、 20 mM HEPES、20 mM咪唑、20 mM Tris、20 mM CAPS及 25 mM NaCl組成，其中A緩衝液用HC1調節至pH 4.2，且B 緩衝液使用NaOH調節至pH 9·2(或10.4)。藉由質譜分析來 分析在CM層析之後獲得之經純化物質，以確定精確分子 組成（圖4D)。質譜分析表明，唯一可偵測完整抗體產物之 MW為146,051.89，其與理論MW為145,051.75之異二聚體 杵-臼物質抗EGFR/抗c-met幾乎完全匹配。以約2 mg杵及2 mg臼開始之此程序的產量為約0.5-1 mg。 為大規模製造抗體以供活體内實驗（諸如測定於非人類 靈長類動物中之藥物動力學特性），需要100 mg至公克規 模數量之抗體。如圖5A中所示，研發出針對各半抗體使用 各別獨立培養物之程序以製造此等數量之完整雙特異性抗 155406.doc -149· 201139682 體°為進行此等製備，需要10公升醱酵以產生具有足夠數 量抗趙之細胞小球或全培養液（Simmons等人，2002. J.
Immunol. Methods, 263:133-147 及美國專利第 6,979,556 號）°在實驗過程中，細胞小球或細菌全培養液用於含有 所表現半抗體之生物質。在一些情況下，大部分抗體漏至 培養基中’其中全培養液提供較高產量。對於細胞小球， 將物質再懸浮於含有25 mM Tris (pH 7.5)、5 mM EDTA及 125 mM NaCl之提取緩衝液中，且藉由使用來自 Microfluidics (Newton，MA)之 HC80003A 型微流化機進行 微流化來溶解。全培養液無需添加添加劑即可直接微流 化。在兩種情況下，使物質通過儀器三次。在此實例中， 製備500 mg兩種形式之靶向細胞激素介白素_4(杵）及介白 素-13(臼）之雙特異性抗體。 第一形式之雙特異性抗體含有人類IgGla Fc，其僅具有 杵及臼突變，而第二形式含有進一步修飾之Fc，其具有兩 種突變T307Q及N434A，該等突變使得其對新生兒Fc受體 (FcRn)具有更大親和力。預期第二形式賦予抗體較慢之清 除率及較長之半衰期。兩種形式之FC(前者為WT-Fc，後者 為FcRn變異體）的臼抗體（把向il-4)與杵抗體（把向il-13)分 別以10公升醱酵生長，且將含有生長培養基及細菌細胞之 全培養液均質化且獨立純化。全培養液微流化之後，用相 同體積之0.4%聚伸乙基亞胺（PEI)(pH 9.〇)處理提取物以製 備供離心淨化用之提取物。在室溫下攪拌混合物3小時或 在4°C下隔夜。PEI造成提取物大量沈澱，藉由在15〇〇〇xg 155406.doc •150· 201139682 下離心45分鐘淨化。隨後藉由0·22微米過濾器過濾上清 液，接著負載於100 mL Mab Select SURE蛋白Α捕捉管柱 上。以20 ml/rpin負載提取物，且用40 mM檸檬酸納（pH 6.0)及lOOmMNaCl洗滌，直至280下之UV吸光度達到穩定 基線，一般為約10管柱體積（CV)。將洗滌緩衝液更換為20 mM檸檬酸鈉（pH 6.0)且用約2 CV洗滌。使用0.2 Μ乙酸溶 離捕捉之半抗體。藉由蛋白Α分離之後，藉由陽離子交換 • 層析使用S-FF樹脂（GE Healthcare)或凝膠過濾層析使用 S200樹脂（GE Healthcare)移除雜質及凝集物來純化抗體。 如圖5B所示，經純化半抗體大部分為約75 kD之物質。第 二分離步驟之後，將500 mg 1 mg/mL濃度之各半抗體彙集 在一起且使用1 M Tris (pH 7.5)調節pH值至7 5。於培育箱 中加熱混合物至37°C，且藉由凝膠過濾監視15() kD抗體物 質之出現。2小時後，完成退火，展示完全轉化為二聚15〇 kD物質，且混合物冷卻至室溫。藉由在24。〇下經2小時添 ® 加2 mM DTT來還原蛋白質，隨後使用1〇 kD截留離心過濾 器濃縮至20 mg/mL。藉由於僅含25 mM Tris (8 〇)之緩衝 液中透析隔夜來氧化經濃縮之溶液。隨後分析經氧化物質 之純度及凝集情況。藉由質譜分析確定完整抗體物質為完 整的完全氧化之異二聚體雙特異性分子，然而，凝膠過濾 及SDS-PAGE分析表明存在大量凝集物，其中一些顯然為 二硫基連接之多聚體之結果（資料未示）。為進一步純化雙 特異性抗體以供活體内實驗，經S_2〇〇凝膠過濾管枉於Tris (pH 7.5)及125 mM NaCl中分離抗體。經純化物質展現歸因 155406.doc -151- 201139682 於移除所引入之凝集物的超過30%之物質損失。對於製備 之最後階段，將蛋白質黏著於陽離子交換管柱’用含〇·1% ΤΧ114之50 mM乙酸鈉（pH 5.0)洗滌以移除污染性内毒素， 且用含5〇 mM Tris(pH 8.0)之高pH值緩衝液溶離。隨後藉 由於適於活體内實驗之缓衝液中透析來調配經溶離蛋白 質，且儲存在4°C下。藉由SDS-PAGE、質譜分析、測定污 染性内毒素含量之LAL檢定及凝膠過濾分析來分析由WT-Fc及FcRn變異體組成之最終物質。SDS-PAGE之結果展示 於圖5C中，且表明主要物質為150 kD之完整雙特異性抗 雜。圖6A展示測試細胞激素IL-4及IL-13之中和的TF-2細 胞增殖檢定中抗體之生物活性。對於該檢定，使用起始濃 度為25 pg/ml之抗IL-4/IL-13雙特異性抗體、抗IL-4及抗 IL-13抗體，且於96孔培養板（Falcon，目錄號353072)中用 檢定培養基（無rhGM-CSF之培養基）或含有0.4 ng/ml人類 IL-4 (R&D Systems，目錄號 204-IL)以及 20 ng/ml 人類 IL-13 (Genentech Inc.) 之 檢定培養基連 續稀釋 10 倍至 0.025 pg/ml之最終濃度，最終體積為每孔50 μΐ。在37°C下預培 育經稀釋抗體30分鐘。 預培育之後，用檢定培養基洗滌於RPMI 1640 (Genentech，Inc.)、10% 胎牛 jk 清（HyClone，目錄號 SH300071.03)、2 mM L-麩醯胺酸、100單位/毫升青黴素 (Penicillin)、100 pg/mL鏈黴素（Streptomycin)(Gibco，目 錄號 10378)及 2 ng/mL rhGM-CSF (R&D Systems，目錄號 215-GM)中培養之TF-1細胞2次，且再懸浮於檢定培養基 I55406.doc •152· 201139682 中’獲得每毫升2xl05個細胞之最終濃度。將50 μΐ細胞添 加至含有經稀釋抗體、加有IL-4及IL-13細胞激素之檢定培 養基（最大增殖對照組）或單獨檢定培養基（本底對照組）的 各孔中。所有樣品均一式兩份接種。在37°C、5% C02下培 育板4天。在最後4小時培育期間，將1 μ(：ί 3H胸苷（Perkin Elmer，目錄號NET027005MC)添加至各孔中。使用 Packard Filtermate 將培養板收集於 Unifilter-96 GF/C (Perkin Elmer，目錄號 6005174)上，使用 TopCount NXT (Perkin Elmer)量測3H胸苷併入。使用KaleidaGraph將數據 繪製成曲線。結果表明，在中和IL-4及IL-13活性方面， WT抗IL-4/抗IL-13雙特異性抗體與IL-4與IL-13之IgG抗體 組合同等有效。 隨後測試兩種抗體（WT抗IL-4/抗IL-13及FcRn變異體抗 IL-4/抗 IL-13)於石蟹獼猴（cynomologous monkey)中之藥物 動力學（PK)特性。使用單次劑量注射，藉由靜脈内注射投 與於20 mM組胺酸-乙酸鹽（pH 5.5)、240 mM蔗糖及0.02% Tween 20中調配之10.8 mg/mL及1 mg/mL WT分子’以及於 20 mM鱗酸納（pH 7_5)、240 mM蔗糖及0.02% Tween 20 中 調配之10.5 mg/mL FcRn變異體。對於兩種WT濃度，劑量 為20 mg/kg及2 mg/kg，且對於FcRn變異體，劑量為20 mg/kg。經42天之時程，自注射該三種治療之兩隻雌猴及 兩隻雄狼週期性採集血清樣品。藉由ELISA檢定金清樣品 中之完整雙特異性抗體，其中將IL-4或IL-13之一種抗原塗 佈於培養板上’且隨後自血清捕捉抗體。藉由用第二生物 155406.doc -153- 201139682 素標記配位體IL-13或IL-4(任何一個未塗佈於培養板上之 配位體）及酶偶合之抗生蛋白鏈菌素偵測來測定存在的本 發明之所捕捉雙特異性抗體之量。圖6B之結果展示三個樣 品之預期二室清除。兩種不同形式之抗體相較於源自CHO 產生宿主且含有Fc糖基化之兩種其他抗體（阿瓦斯汀 (Avastin)及赫赛汀（Herceptin))的PK特性展示於表2中。顯 然，大腸桿菌產生之雙特異性抗體類似於標準方法之源自 CHO之抗體，且FcRn變異體具有較長半衰期。 表2 群體平均值(％ RSE) Vc(毫升/公斤） CL(毫升/公斤/天） Tl/2(天) WT 29.0(9.48) 4.49(7.66) 約10 FcRn 15.8(5.72) 2.11(2.47) 約18 阿瓦斯汀 4.3 約12 赫赛汀 5.5 約9 方法#2-在不添加還原劑下，於各別（亦即獨立）培養物中製 造杵半抗體及臼半抗體，混合全培養液，接著純化半抗體 且溶解，形成完整BsAb 此方法嘗試藉由同時純化杵與臼半抗體來減少製程中之 步驟數目。因此，混合醱酵液，隨後粒化及再懸浮於提取 緩衝液中。認為在細胞膜破壞之後各宿主細胞將釋放其所 表現之鉸鏈區内含有環狀二硫基之半抗體至提取緩衝液 中。隨後，可同時進行兩種半抗體之純化，繼而進行氧化 還原-退火步驟以形成完整BsAb。意外地發現杵-臼抗體獨 自異二聚且氧化，形成全長抗體（約150 kD)，該全長抗體 超過完整抗體與半抗體（約75 kD)合併總數之20%(參見表 I55406.doc -154- 201139682 3)。 使用前述方法#1中所述之製程，使表現杵半抗體及臼半 抗體之佰主細胞生長於各別培養物中且誘導。將各培養物 之全細胞醱酵液與另一培養物之全細胞醱酵液以三種不同 體積比混合，隨後離心形成單細胞小球。將全細胞醱酵液 以1:1、2:1或1:2之（抗c-met):(抗EGFR)比率混合在一起以 使最終體積為500 mL，意欲匹配兩種抗體以相對同等之豐 • 度回收’且瞭解，在相同條件下抗EGFR半抗體類似於 cMet抗體表現》將各細胞小球再懸浮於提取緩衝液中且溶 解。提取蛋白質且藉由蛋白A層析繼而陽離子交換層析來 純化，如實例2方法1中所述《提取緩衝液含有25 mM Tj>is (pH 7.5)、125 mM NaCl及 5 mM EDTA。在分別純化時， 各杵半抗體及臼半抗體在鉸鏈區内形成環狀二硫基，亦即 鏈内二硫基’從而防止杵與臼重鏈共價締合。然而，發現 當在共培養之後或在混合全礙酵液之後且在離心之前第一 鲁及第二宿主細胞在一起溶解時，存在一定程度之完整抗體 物質組裝。圖7展示三種比率下觀察到之完整抗體物質。 此表明對程序之修改可能引起自發性形成完整雙特異性抗 體，此實質上可排除對其他化學步驟之需要。 藉由用SDS-PAGE使用Novex 4-20% Tris-甘胺酸凝膠 (Invitrogen，Carlsbad CA)分離5微克蛋白質來定量兩種蛋 白質物質。電泳之後’使用含有150 mM硫酸録、1.74 Μ乙 酸、10〇/〇曱醇及0.4 g/L庫馬斯染料（Coomassie Dye)R250於 水中之膠態庫馬斯染色劑（C〇〇massie stain)對凝膠染色。 155406.doc -155- 201139682 用10%乙酸水溶液將凝膠脫色，隨後於Gel_Dry乾燥溶液 (Invitrogen)中平衡且在兩片塞璐芬（cell〇phane)之間乾 燥。凝膠乾燥之後，藉由Odyssey IR成像系統（LI-COR Biosciences，Lincoln，NE)在 700 nm下定量蛋白質條帶。 表3.混合來自兩種分別生長之杵及臼培養物的分離物後完 整抗體及半抗體之Licore螢光信號。[此為较鍵之量度] 體積比 (c-met:EGFR) 150kDRFU 75kDRFU 合併之 RFU 150RFU/總數 ％ 1:1 36.01 98.78 134.8 26.72 2:1 36.8 107 143.8 25.59 1:2 34.64 107.83 142.5 24.31 方法#3-在不添加還原劑下，於獨立培養物中製造杵半抗 趙及臼半抗趙，獨立離心，混合小球且再懸浮，雄而溶 解，且純化BsAb。 此方法嘗試藉由同時純化样與臼來減少製程中之步驟數 目。 將細胞獨立培養且藉由離心粒化。混合小球且一起再懸 浮於提取緩衝液中。咸信半抗體將在破壞細胞膜後釋放至 提取緩衝液中’且將看到類似於上述方法#2之產物概況。 實例3 使用單一混合之細胞培養物製造異多聚體蛋白質 此實例說明由包含兩種宿主細胞群體之培養物形成異多 聚體蛋白質，其中在該製程中不添加還原劑。 方法#4-在不添加還原劑下，於同一培養物中由不同細胞 群體製造杵半抗體及臼半抗體，形成完整BsAb 155406.doc •156· 201139682 首先於0.5公升搖瓶中用含有杵半抗體或臼半抗體之兩 種不同大腸桿菌轉型體執行共培養實驗》對於此實驗，藉 由在30°C下於含LB培養基（100 pg/ml羧苄西林）之5 mL培養 物中隔夜培養產生杵（抗EGFR)半抗體與臼（抗cMet)半抗體 之起始培養物。使用OD6〇0相等之隔夜培養物以三種不同 比率（抗 EGFR :抗 cMet : 1.5:1、1:1及 1:1.5)接種 500 ml 完 全CRAP培養基（100 pg/inl羧苄西林），保持總接種量為培 養物之1/100。使細胞在30 °C、200 rpm下生長24小時。隨 後藉由離心（675〇xg，10分鐘’ 4°C )將細胞粒化且用於純 化。 將細胞以每10 g細胞小球100 mL之比率再懸浮於含有25 mM Tris (pH 7.5)、5 mM EDTA及 125 mM NaCl之提取緩衝 液中。如實例2中所述藉由微流化提取且製備用於層析之 後’三種不同比率之細胞提取物藉由首先於Mab Select SURE 1 mL HiTrap管柱（GE Healthcare, S. San Francisco, C A)上捕捉雙特異性抗體來純化，且管柱洗滌緩衝液僅含 有40 mM檸檬酸鈉（pH 6.0)。如實例2中所述洗滌且溶離之 後，將蛋白A捕捉彙集物負載於SP-HP陽離子交換管柱上 且如實例2中所述純化。藉由陽離子交換分離之後，彙集 三種純化物各自之層析峰且濃縮至約50_100微升之體積， 且蛋白質濃度為約15 mg/mL。初始接種比率似乎使最終完 整抗體之量產生差異，且相較於在37°C下隔夜培養之後將 細胞小球混合在一起時所觀察到之結果，此得到完整雙特 異性抗體與較低分子量形式之較高比例。參見表4。 155406.doc •157- 201139682 表4. 接種比率 150kDRFU 75kDRFU 合併之RFU 150 RFU/總數 ％ 1.5:1 11.71 10.28 22.0 53.25 1:1 9.09 8.96 18.1 50.36 1:1.5 7.28 8.71 16.0 45.53 為判定共培養是否可擴展為10公升醱酵規模（此對於擴 大程序很關鍵）’可用抗EGFR及抗cMet半抗體進行若干實 驗。對於10公升醱酵’使用含有1:1抗EGFR與抗cMet細胞 比之接種起始培養物。使10公升共培養物在如實例2中所 述之單一半抗體培養物的相同條件下生長。亦如上所述， 使用細胞小球或全培養液進行抗體物質之提取及分離。為 自細胞小球提取物質’由一次1 〇公升醱酵產生約2 · 5 kg糊 狀物。將細胞小球再懸浮於5公升含有25 mM Tris(pH 7.5) 及125 mM NaCl之緩衝液中。用p〇iytron混合器處理小球2 分鐘，隨後使小球再懸浮’接著微流化、淨化且製備以供 蛋白A捕捉，如實例2中所述。再重複醱酵實驗兩次，且來 自10公升醱酵罐之共培養分離之結果展示於圖8〇中。使用 質譜分析表徵約150 kD蛋白質及約75 kD蛋白質以確定分 子組分。出乎意料地，主要的較高MW蛋白質為雙特異性 抗體，且約75 kD蛋白質主要為CMet半抗體，此歸因為其 差異之表現概況。此表明無需其他化學步驟即可完整形成 雙特異性抗體。因為雙特異性抗體為杵與臼半抗體之1:1 化學計量組合，所以僅存在75 kD蛋白質表明大部分限制 性半抗體已自發地併入完整雙特異性抗體中。 155406.doc -158- 201139682 由此觀察結果可開發出如圖8D中所示之簡化之表現及純 化流程。蛋白A捕捉之後，用含有1.5 Μ硫酸銨及25 mM磷 酸鈉（pH 6.5)之緩衝液1:1稀釋抗體，且負載於疏水性相互 作用管柱（HIC)Dionex Pro Pac HIC-10 4.6 mmxlOO mm (Sunnyvale，CA)上。梯度為30%-60% B，其中A緩衝液由 25 mM磷酸鈉（pH 6.95)及1.5 M硫酸銨構成，且B緩衝液由 25 mM磷酸鈉（pH 6.95)及25%異丙醇構成。用15 CV梯度分 離蛋白質。蛋白質分離為兩大物質，一種含有完整雙特異 性抗體，且另一種含有過量抗EGFR半抗體。層析分離之 結果展示於圖8E中。彙集含有完整抗體之溶離份且藉由黏 著於S-FF管柱25 mM乙酸鈉緩衝液（pH 5.0)中，用含0.1% Triton XII4之相同乙酸鹽緩衝液洗滌，隨後藉由用起始乙 酸鹽緩衝液洗滌移除清潔劑而進行處理，以移除任何剩餘 之污染性内毒素。由S-FF管柱使用25 mM Tris (pH 8.0)溶 離蛋白質，彙集且藉由SDS-PAGE、質譜分析及針對内毒 素之LAL檢定分析。在最終製劑中，蛋白質含有0.076 EU/mg内毒素，表明其適於活體内應用。圖8F中展示最終 表徵結果。SDS-PAGE分析展示大多數蛋白質為最終完整 雙特異性抗體，且質譜分析展示雙特異性抗體之預期分子 量，且無任何污染性物質，尤其可能存在之均二聚體形 式。圖8G中展示使用共培養之修改程序相較於需要退火及 氧化還原化學之程序的比較結果。 方法#5-使用不同杵：臼比率，於同一培養物中製造杵半抗 體及臼半抗體，形成完整BsAb 155406.doc -159- 201139682 此實例展不使用類似表現構築體（不同之處僅為欲表現 之半抗體）之宿主細胞不會生長超過彼此且可產生完整
BsAb 〇 實驗證實控制任一鏈之比率易於藉由在擴增及表現之前 調節接種比率而進行。兩種菌株不會生長超過彼此。 為判定接種比率在共培養物之醱酵期間是否保持，進行 實驗以測定含不同細胞比率之共培養物24小時醱酵結束時 所存在的杵或臼重鏈之量。具有杵（抗EGFR)或臼（抗c· Met)質體之細胞分別在3〇t下於lb培養基（1〇〇 μβ/ιη1羧苄 西林）中生長隔夜》使用含不同比率之隔夜培養物的起始 培養物接種完全CRAP培養基（1〇〇 pg/mi羧苄西林），保持 合併之接種體積為最終培養物之U00 ^測試之抗EGFR:抗 c-Met之比率為 i〇:i、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5及 1:1〇。在
30°C下培養24小時之後’獲得細胞樣品，且藉由非還原性 SDS-PAGE (12% Tris甘胺酸）’繼而西方墨點法用山羊抗 人類 IgG-Fc 抗體 HRP 結合物（Bethyl Laboratories, Inc.， Montgomery，TX)來分析》兩種物質之重鏈藉由SDS-PAGE 解析且結果展示於圖8B中。各半抗體之量與共培養物之接 種比率相關，表明具有編碼不同半抗體之質體的細胞在共 培養物中不會生長超過彼此》 方法#6-於同一培養物中製造杵半抗體及臼半抗體，形成 完整BsAb-膜滲透 此實例展示膜滲透使半抗體釋放至培養基中，且隨後無 需其他化學作用（例如氧化還原或偶合）即可形成完整 155406.doc 201139682
BsAb 〇 已知導致脂蛋白合成喪失之突變可改變大腸桿菌之細胞 膜，使周質蛋白質漏至培養基中，且亦使大腸桿菌對 EDTA 高度敏感（Hirota，Υ·等人，PNAS 74:1417-1420 (1977))。比較在添加及不添加EDTA之情況下所表現之抗 體自菌株65G4 (W3110 Δ/Τζμ」Ap/zoJ ζ·/ν(7+ Aprc AdegP AmanA laclq ^ompT Alpp)的釋故。如方法 #4 今所 述，以1:1比率共培養表現a-IL-4(臼）或a-IL-13(杵）之細 胞，且在30°C下在200 rpm下於培育震盪器中生長20小 時。在培育結束時，將培養物分成三等份。一個樣品充當 對照組，其中不添加EDTA »向其他兩個樣品中添加EDTA (pH 8.0)至10 mM最終濃度。所有樣品繼續培育30分鐘， 之後向EDTA處理樣品之一中添加MgCl2至20 mM最終濃 度。再於培育震盪器中培育所有樣品30分鐘，隨後藉由離 心（920〇xg，20分鐘，4°C)移除細胞，且經由GF/F過濾器 (Whatman, Piscataway，NJ)及 0.2 μηι PES過渡器（Nalgene, Rochester，NY)過滤上清液。可添加牛姨臟DNA酶I(Sigma， St. Louis，MO)至4 mg/1來改良過濾。 隨後如先前所述直接將經過濾之上清液負載於1 mL蛋白 A MabSelect SURE HiTrap 管柱（GE Healthcare)上。如上所 述用乙酸溶離所捕捉之蛋白質，且圖9A中可見蛋白質之峰 回收。結果展示在EDTA處理樣品中整個UV吸光度提高。 此吸光度為完整雙特異性抗體及過量半抗體。參見圖9B及 9C。 155406.doc -161- 201139682 在各別實驗中，分別表現或以65G4細胞之1:1共培養物 之形式表現抗IL-4及抗IL-13半抗體。如上所述（方法#4)培 養細胞，其中例外為向完全CRAP培養基補充聚矽氧消泡 劑（Fluka，Buchs，Switzerland)至 0.02% (v/v)。在 30°C 及 200 rpm下於培育震盪器中培養細胞24小時之後，添加EDTA (pH 8.0)至10 mM最終濃度且繼續培育1小時，隨後添加 MgCl2至20 mM。藉由離心（675〇xg，10分鐘，4。〇收集細 胞，過滤（0.2 μ PES，Nalgene，Rochester, NY)上清液’且 _ 如上所述藉由蛋白A捕捉抗體，且藉由SDS-PAGE及質譜分 析來分析。圖9D所示之結果表明僅在雙特異性抗體之兩種 半抗體存在下觀察到完整雙特異性抗體形成。另外’大部 分抗IL-13抗體併入雙特異性抗體中而無任何其他氧化還 原化學，因為質譜分析表明75 kD蛋白質條帶主要為抗IL-4半抗體。用硫酸銨緩衝液1:1稀釋經蛋白A純化之雙特異 性抗體，且使用與實例3中所述相同之程序用7.5 mmx 150 mm ProPac HIC-10管柱（Dionex, Sunnyvale, CA)進一步純 鲁 化。發現完整雙特異性抗體在99.68之滯留時間時溶離。 彙集此峰，且藉由SDS-PAGE在非還原性條件下分析，且 發現幾乎完全由完整抗體物質構成。為證實此蛋白質為純 異二聚體雙特異性分子，藉由ESI-TOF LC/MS分析該蛋白 質。將約10微克雙特異性抗體注射於PLRP-S 300 A 3微米 5〇x2.1 mm 逆相管柱（Polymer Laboratories)上，且藉由 4.3 分鐘340/〇-45% 0.05% TFA及乙腈之梯度，使用Agilent 1200 系列HPLC及0.5 mL/min之流速及80°C下之管柱加熱器分 15S406.doc •162- 201139682 離。藉由Agilent 6210 TOF分析自LC溶離之蛋白質。觀察 到含單峰之蛋白質’且使用Agilent Mass Hunter軟體 B.02.00版，使用50,000-160,000之質量範圍、1 〇 Da步 長、30.0 S/N臨限值、90之平均質量、未限制之質量範圍 及設定為自動之同位素寬度對此峰反卷積。大部分信號呈 現出雙特異性分子之預期質量。由胺基酸序列計算出之完 整異二聚體雙特異性抗體之質量為144,〇44 ,其在量測質 φ 量之I-2道爾頓範圍内，而可能之均二聚體蛋白質之計算 質量對於抗11：-4為144,954.6且對於抗11^13為145，133.4。 測試不同接種比率在此組抗體以及65G4缺失之情形 下培養期間是否會再次持續。使用〇〇6⑽相等之含有抗^· 4(臼）或抗IL-13 (knob)的種子培養物以2:1及1:2之比率接種 500 ml CRAP培養基，培養且在醱酵結束時滲透，如先前 所述（參見方法#6)。如上所述，藉由蛋白a捕捉，繼而mc 分離來純化兩種不同培養基製劑’其t例外為HICUB緩 •衝液之PH值降至6.5。兩種不同起始培養物比率之結果展 示於圖9E中。觀察到大部分蛋白質為完整雙特異性抗體。 其他學藉由質譜分析表徵且在圖9E上標記。偵測到極少抗 IL_13半抗體’且可見大量抗1L-4。在抗IL-4與抗IL-13之 比率為33/66時，觀察到較多抗几七，且剩餘少量抗心 4此處可見，在培養期間可維持接種比率，且製程之最 佳化可藉由經由操縱起始培養物比率，平衡所表現之半抗 體之比率來達成。 繼續用多種不同抗體變異體測制仲細胞中之此共培養 155406.doc 201139682 表現過程。圖9F展示在數種例示性半抗體HIC層析後進行 調配之後’最終經純化之蛋白質。 實例4 異多聚體蛋白質庫 此實例說明異多聚體蛋白質庫之構築。 可使用某些方法篩選雙特異性抗體之混合物或利用所述 方法快速產生大量雙特異性抗體。 方法#7 在一些情況下，所選雙特異性抗體未知，但可為多種不 同半抗體組合之結果。或者，可能需要特異性標靶組合， 例如抗IL-4/抗IL-13，但可選自多種候選半抗體。發現產 生最佳結合或功效之特異性半抗體組合可藉由以矩陣格式 組合半抗體來實現，從而可快速產生多種雙特異性抗體變 異體。對於此實驗，可以超過需要篩選之抗體之量約1〇倍 (或10倍以上）製造一種抗體（諸如抗CD3)o此分子可隨後 使用實例#1中所述之程序退火及氧化。如圖1〇所繪，可使 用約1/10總量之第一抗體與等量之約10個靶向不同抗原之 半抗體（諸如抗CD19、抗CD20等）組合。若需要另一第一 半抗體與第二半抗體譜系組合，則此可進行以產生一組篩 選分子。 在該方法之第二修改形式中，第一抗體（諸如抗CD3)可 以使用「正常」大腸桿菌宿主細胞或具有非功能性脂蛋白 表型之突變株的共培養物形式生長。此半抗體可隨後系統 地添加至各可變半抗體中’得到一系列雙特異性分子，均 155406.doc •164· 201139682 含有第一靶向半抗體。 方法#8 第一半抗體可與大量替代性搭配半抗體以由製造足夠數 量之此半抗體以與欲組合之所有其他抗體半抗體組合組成 之方式組合。可隨後在單一反應中執行整體退火，使得第 一半抗體為杵或臼型之重鏈，且第二靶向半抗體組為互補 突變體。在此情形下，可製造抗體之複合混合物，其可組 合用於治療疾病。 或者，可使用利用上述實例中所述之方法的共培養方法 來製造含一組第一半抗體及可變第二半抗體之雙特異性抗 體之複合混合物。該混合物可隨後成批分離且用作筛選物 質，使得雙特異性變異體彙集物中之陽性結果可隨後反卷 積以確定活性雙特異性抗體物質，或組合之混合物可用作 更有效之治療性混合物。
實例S 活體外活性 此實例說明本文所述之雙特異性抗體在活體外系統中具 有活性。兩種細胞株用於此實例5及以下實例6中。在此等 實驗中’ KP4(胰臟導管癌細胞株）與A431(表皮樣癌細胞 株）均分別由Met或EGFR強力驅動，因此此等細胞株為獨 立探查bsAb針對各標靶之功效的優良細胞株及腫瘤異種移 植物。 KP4細胞株獲自理研生物資源中心細胞庫（Riken
BioResource Center Cell Bank)(細胞株編號：rcb 1005 ; 3- 155406.doc •165- 201139682 1-1 Koyadai, Tuskuba_shi，Ibaraki 305-0074 Japan)。A431 細胞株（CRL-1555)獲自美國菌種保存中心（ATCC, Manassas, VA) ° 用PBS洗滌癌細胞A431—次，再懸浮於無血清培養基 中，計數，隨後添加至96孔板中（每孔2500個細胞）°隨後 用人類HGF (0.5 nM)及TGFa (0.05 nM)單獨處理細胞或連 同一定劑量範圍之以下處理：（1)抗EGFR、（2)抗c-met抗體 (「一臂」c-met)、（3)抗EGFR與抗c-met抗體之組合或（4) 雙特異性抗EGFR/抗c-met抗體。根據製造商之建議執行三 天 AlamarBlue™ 檢定（BioSource International; Camarillo, CA)。藉由非線性回歸分析用四參數模型（KaleidaGraph 3.6版，Synergy Software ; Reading，PA)測定 IC5〇值。 在活體外及活體内具有Met依賴性之KP4細胞檢定中， 藉由用TGF-α及HGF處理刺激之生長可由抗c-met抗體、抗 c-met抗體與抗EGFR之組合及雙特異性抗體抑制。用抗 EGFR處理展示單一藥劑在此等細胞中之活性有限。然 而，雙特異性抗體在KP4細胞中達成之抑制比單獨抗c-met 或分別添加之抗c-met加上抗EGFR Ab有效。在主要由 EGFR驅動之A431細胞中，單獨抗EGFR抗體與單獨抗c-met抗體均不能顯著抑制細胞增殖》兩種分子之組合展示 對細胞增殖之一定程度之抑制，然而，相同濃度下之雙特 異性抗體展現更高活性。除抗增殖以外，細胞亦展現出細 胞凋亡。 在此等檢定中，雙特異性抗體展示相對於單獨其他抗體 155406.doc -166- 201139682 或分別添加之抗Met與抗EGFR抗體組合改良之效能。此等 資料表明，抗Met抗體與抗EGFR抗體一起於一個抗體上之 配置使得雙特異性抗體優良》結果展示於圖11中。 實例6 活體內活性 此實例證實本文所述之雙特異性抗體在活體内模型中具 有活性。 自 Charles River Laboratories, Inc.(Hollister，CA)獲得 6-8 週齡且重22-30 g之雌性裸小鼠。將小鼠置於Genentech標 準齧齒動物微型隔離籠中，且使其適應研究條件至少3 天，隨後植入腫瘤細胞。僅看似健康且無明顯異常之動物 用於研究。所有實驗程序均遵循美國生理學協會 (American Physiology Society)之指導性原貝’J ，且經 Genentech的實驗動物護理及使用委員會（Institutional Animal Care and Use Committee)批准。用人類KP4胰臟癌 細胞（每隻小鼠用含5百萬個細胞之漢克氏平衡鹽溶液 (Hank's Balanced Salt Solution，HBSS)加基質膠（BD Biosciences))或人類A431表皮樣癌細胞（每隻小鼠用含5百 萬個細胞之HBSS加基質膠）皮下注射小鼠。當腫瘤達約 150 mm3時，將小鼠隨機化且用媒劑或雙特異性EGFR/c-met (bsEGFR/c-met)(50 mg/kg，腹膜内，每週 1次）處理2 週。 使用 Ultra Cal-IV 測徑規（54-10-111 型；Fred V. Fowler Co.; Newton, ΜΑ)以兩個尺寸（長度及寬度）量測腫瘤體 155406.doc -167- 201139682 積，且使用 Excel 11.2 版（Microsoft Corporation; Redmond WA)分析。使用 KaleidaGraph 3.6 版（Synergy Software; Reading，PA)繪製腫瘤抑制曲線。腫瘤體積用下式計算： 腫瘤尺寸（mm3)=(較長量測值X較短量測值2)x〇.5,。 資料藉由下述混合模型化方法分析。此處，不計算嚴格 平均偏差及標準偏差。使用信賴區間而非提供標準偏差來 說明可變性。信賴區間在表格中緊靠每天AUC (% TGI)以 括號中上限及下限形式報導。使用Adventura Pro AV812天 平（Ohaus Corporation; Pine Brook, NJ)量測動物體重。使 用KaleidaGraph 3·6版產生圖。使用下式計算重量變化°/〇 : 組重量變化％=(新重量-初始重量）/初始重量χΙΟΟ。 為適當地分析同一動物之腫瘤體積隨時間之重複量測， 使用混合模型化方法（Pinheiro等人，Linear and Nonlinear
Mixed Effects Models· (2008) R套裝 3.1-89版）。此方法解 決了重複量測與歸因於研究結束之前任何非處理相關動物 死亡之適度中途退出的問題。 使用三次回歸樣條擬合各劑量下log2腫瘤體積對時程之 非線性曲線。此等非線性曲線隨後與混合模型内之劑量相 關。呈媒劑百分比形式之腫瘤生長抑制（％TGI)使用下式計 算為每天各別給藥組之擬合曲線下面積（AUC)相對於媒劑 組之百分比： %TGI=10〇x(l-AUC給 */AUC媒劑）。 為確定％TGI之不定區間（UI)，使用擬合曲線及擬合協方 差矩陣產生近似％101分佈之隨機樣本。隨機樣本由擬合- 155406.doc •168· 201139682 混合模型之1000個模擬實現構成，其中針對各次實現，再 計算％TGI。報導之UI為95%時間下％TGI之再計算值落在 給定擬合模型下之此區域中的值。使用模擬分佈之2.5及 97.5百分位數作為上限及下限UI。 繪製曲線且使用 R 2.8.1 版（R Development Core Team 2008; R Foundation for Statistical Computing; Vienna, Austria)及 Excel 12.0.1 版（Microsoft Corporation)產生。使 用R 2.8.1版分析資料，且在R内使用nlme套裝3.1-89版 (Pinheiro等人，2008)擬合混合模型。 圖12及13分別展示抗EGFR/c-met雙特異性抗體在KP4胰 臟異種.移植模型及A43 1表皮樣癌異種移植模型中之活體内 活性。相較於僅接受媒劑作為處理之對照動物，雙特異性 抗體能夠抑制兩種模型的活體内腫瘤生長。該等圖表明腫 瘤體積因投與雙特異性抗體而減小，其中線性混合效應 (Linear Mixed Effect，LME)擬合之腫瘤體積在KP4異種移 植物中在處理後20天時為505 mm3，相較之下僅接受媒劑 組為1710 mm3，且在A431異種移植物中在20天後為328 mm3，相較之下僅接受媒劑對照組為495 mm3。整體而 言，以％TGI表示之每天AUC存在顯著變化。對於雙特異 性抗體處理，在KP4異種移植中存在85%腫瘤生長抑制 (TGI)，且在A43 1異種移植模型中存在68% TGI。 實例7 使用CHO細胞培養物製造異多聚體蛋白質 此實例說明自包含兩種宿主CH0細胞群體之培養物形成 155406.doc -169- 201139682 異多聚體蛋白質。 在各別培養物中藉由使用此項技術中熟知之構築體及技 術短暫表現重鏈及輕鏈來產生含有杵或臼突變之半抗體。 (參見例如 Ye 等人，Biotechnol Bioeng. 2009年 6 月 15 日； 103 (3):542-51)。在1公升培養基（參見例如Wong等人，J.
Biol. Chem. 2007 282 (31):22953-22963)中培養細胞且在 14 天後收集。 於5 mL MabSURE SELECT管柱上捕捉各半抗體。隨後 _ 用10管柱體積（CV)平衡緩衝液、繼而10 CV檸檬酸鈉低電 導缓衝液洗滌管柱（平衡緩衝液由50 mM TRIS (pH 8.0)、 150 mM NaC卜 0.05% Triton X-100、0.05% Triton X-114組 成；低電導洗滌緩衝液由25 mM檸檬酸鈉（pH 6.0)組成）。 用0.15 Μ乙酸鈉（pH 2.7)溶離各組。 將各半抗體以1:300之比率於50 mM TRIS (pH 8.0)、150 mM NaCl、1 mM EDTA中透析隔夜。隨後離心各組，使用 0.22微米乙酸纖維素過濾器過濾且以1:1之比率將兩組混合 φ 在一起（總濃度小於2 mg/mL)。隨後以如下兩種方式之一 處理該混合物： 氧化還原（有水浴）：隨後在水浴中37°C下加熱混合物。1 小時後，自水浴移除氧化還原混合物且靜置，冷卻至室 溫。混合物達到室溫後，添加新鮮製備之還原劑二硫蘇糖 醇（DTT)，使DTT之最終濃度達2 mM。混合物置於室溫下 2小時，隨後使用Amicon Ultracell離心過濾器（10K)濃縮至 11 mg/mL，且於 50 mM TRIS (pH 8.0)、150 mL NaCl 中透 155406.doc -170- 201139682 析（1:300)隔夜。 氧化還原（無水浴）：混合物置於室溫下3小時，之後添 加新鮮製備之還原劑二硫蘇糖醇（DTT)，使DTT之最終濃 度達2 mM。混合物置於室溫下2小時，使用Amicon Ultracell離心過濾器（10K)濃縮至11 mg/mL，且於50 mM TRIS (pH 8.0)、150 mL NaCl 中透析（1:300)隔夜。 氧化還原後，於15 mL HIC ProPac 10管柱上使用20 CV 梯度類似於先前部分純化所組裝之物質。操作緩衝液為25 mM填酸鉀、〇·7 Μ硫酸敍（pH 6.5) ’且溶離緩衝液為25 mM填酸卸（pH 6.5)、25%異丙醇。收集1 mL溶離份且藉由 4%-20% Tris-甘胺酸SDS PAGE分離峰溶離份以分析純度， 且相應地彙集。隨後使用Amicon Ultracell離心過遽器 (10K)濃縮彙集物至約1.5 mg/mL，且於50 mM TRIS (pH 8.0)、150 mM NaCl中透析並進行0.22 μπι過遽。 藉由質譜分析證實各組裝之雙特異性抗體的身分。藉由 4%-20% Tris-甘胺酸SDS PAGE凝膠及生物分析儀分析純 度。藉由SEC-MALS測定凝集物含量。 結果展示於圖14-19中。此實例證實雙特異性抗體可使 用CHO宿主細胞製造。熟習此項技術者應認識到該方法可 用於製造其他異多聚體蛋白質。 【圖式簡單說明】 圖1A說明完全氧化之半抗體。未展示「杵」或「臼」或 其他異二聚域。此圖中所描繪之半抗體為IgGl同型。熟習 此項技術者應暸解，其他免疫球蛋白同型可視為具有相應 155406.doc -171- 201139682 鏈間及鏈内鍵之半抗體。在完整Ab中，鉸鏈半胱胺酸將形 成鏈間二硫鍵； 圖1B說明全長雙特異性抗體》未描繪较鍵區中之重鏈間 —硫鍵， 圖2Α及2Β分別說明編碼杵及臼半抗體之質體； 圖3 Α說明使用通用輕鏈法製造異多聚體蛋白質（例如雙 特異性抗體）。所製造之BsAb具有兩條不同重鏈，各與一 通用輕鏈配對； 圖3B說明使用分別工程改造及表現之半抗體製造異多聚 體蛋白質（例如雙特異性抗體）^所製造之BsAb通常具有兩 條不同重鏈，各與其同源輕鏈配對。在此方法中，對於各 半抗體，各輕鏈不必相同； 圖4A為使用分別工程改造及表現之半抗體製造雙特異性 抗體之流程圖。在此方法中，使用氧化還原化學； 圓4B展不庫馬斯染色之凝膠。藉由8〇8_1>八(^在還原性 及非還原性條件下分析兩種半抗體。在非還原性條件下， 各半抗體之主要溶離份為75 kD輕鏈-重鏈對。在還原性條 件（例如用DTT處理）下，各鏈以各別條帶可見； 圖4C展示經或未經！ mM Ν·乙基順丁稀二酿亞胺⑽⑷ 處理之半抗體的ESI-TOF質譜分析結果。在用麵處理後 觀察到半抗體之質量不變，表明所有半胱胺酸均完全氧 化。在所描繪之胺基酸序列中，經氧化之鉸鏈半胱胺酸表 示為環狀二硫基。半抗體之預期質量為72 548道爾頓，此 為質譜分析所觀察到之結果，表明無共價加合物； 155406.doc •172· 201139682 圖4D展示關於製造抗EGFR/抗c-met雙特異性抗體之羧 曱基（CM)層析圖、SDS-PAGE凝膠像片及反卷積質量。CM 層析得到單峰，隨後由SDS-PAGE分析。凝膠上之主要條 帶為全長（亦即完整）雙特異性抗體。在75 kD範圍亦可見次 要條帶。隨後藉由質譜分析來分析主要條帶，且表明唯一 可偵測之完整抗體產物與抗EGFR/抗c-met雙特異性抗體之 理論MW—致； 圖5A為使用分別工程改造及表現之半抗體大規模製造雙 特異性抗體之流程圖； 圖5B為凝膠之像片，其展示在非還原性條件下經純化之 半抗體主要為約75 kD物質。在還原性條件（例如用DTT處 理）下，各鏈以各別條帶可見； 圖5C展示移除凝集物之後，經純化雙特異性抗體之 SDS-PAGE分析結果，表明主要物質為150 kD之完整雙特 異性抗體。亦展示還原性條件下之相同樣品，表明所有經 分離產物為輕鏈或重鏈抗體鏈； 圖6A為展示測試細胞激素IL-4及IL-13之中和的TF-2細 胞增殖檢定中抗體之生物活性的圖。該圖展示雙特異性抗 體具有類似於兩種哺乳動物產生之全長抗體加在一起或各 別之活性； 圖6B為一組三張圖，其展示野生型Fc及突變Fc之抗IL-4/抗IL-13雙特異性抗體在石蟹獼猴中之藥物動力學（PK)特 性，如ELISA所測定。第一張圖展示野生型Fc在2 mg/kg劑 量下之PK特性。中間一張圖展示野生型Fc又在20 mg/kg劑 155406.doc -173- 201139682 量.下之PK特性。最後一張圖展示突變Fc在20 mg/kg劑量下 之PK特性。在測試之動物中雙特異性抗體展現預期二室清 除°雌性動物由閉合符號表示且雄性動物由開放符號表 示。在三種動物中，如第21天血清中量測之抗體急劇減少 所示’可見抗治療反應； 圖7為聚丙烯醯胺凝膠之像片。以不同比率混合全醱酵 液’隨後溶解。溶解之後提取蛋白質且在非還原性條件下 負載於凝膠上。此程序期間所形成之經純化雙特異性抗體 以凝膠頂部條帶可見； 圖8A為兩種聚丙烯醯胺凝膠之像片，其比較細胞分別培 養時之雙特異性抗體製造與共培養表現半抗體之細胞時之 雙特異性抗體製造。在共培養條件下形成之完整雙特異性 抗體含量高得多。當獨立表現半抗體且純化、隨後混合 時’半抗體形成少於5%之完整雙特異性抗體。在共培養 條件下’超過40%為完整雙特異性抗體，如使用 白質測定由150 kD/(150 kD+75 kD)所確定； 圖8B為改變初始接種之細胞群體的共培養實驗之示意 圖°所用比率及全長雙特異性抗體之相對量展示於該圖之 底部； 圖8C為抗EGFR與抗c-Met之細胞比率為1:1的三個各別 10公升礙酵操作的凝膠像片。各操作產生全長雙特異性抗 體作為主產物，表明該製程之再現性； 圖8D為製造異多聚體蛋白質（例如雙特異性抗體）之共培 養製程之流程圖； 155406.doc •174- 201139682 圖8E為280 nm下之UV吸光度之層析圖，其在滞留時間 91.79及102.35鑑別出兩個主峰。隨後藉由質譜分析來分 析，指示完整雙特異性抗體與過量半抗體有效分離； 圖8F展示藉由SDS-PAGE及質譜分析來分析圖8E之峰 91.79。將質譜分析資料反卷積，得到146,051.89道爾頓之 單峰，其與雙特異性抗體之預期質量一致。未偵測到污染 性均二聚體物質； 圖8G為獨立製造與共培養製造異多聚體蛋白質之工作流 程的比較； 圖9 A展示三個層析圖。頂部層析圖展示無EDTA之樣品 溶離期間無吸收峰。中間層析圖展示含EDTA之樣品具有 獨特溶離峰，由此溶離♦回收約1.5 mg蛋白質。下部層析 圖展示用EDTA及Mg處理之樣品亦展示類似溶離峰，由此 溶離峰回收1.1 mg蛋白質。在還原性及非還原性條件下藉 由SDS-PAGE分析來自EDTA樣品、EDTA加Mg樣品及未處 理EDTA樣品中相同滯留時間之溶離份彙集物的回收蛋白 質； 圖9B為圖9A中所述之SDS-PAGE凝膠之像片。用EDTA 處理之樣品產生完整雙特異性抗體，其已釋放於培養基 中； 圖9C-1至9C-3展示圖9A中回收且描述之樣品的質譜分析 層析圖。含EDTA之樣品展示雙特異性抗體之預期質量及 過量半抗體之質量； 圖9D為SDS-PAGE凝膠之像片及所示條帶之質量層析 155406.doc -175- 201139682 圖。泳道1為MW標記物，泳道2為獨立表現之抗比_13，泳 道3為獨立表現之抗il-4且泳道4為兩種細胞之共培養物。 所有三種樣品之質譜分析均展示共培養物產生完整雙特異 性抗體及一種過量半抗體_抗江_4。此表明抗IL-13半抗體 為化學計量有限的。當獨立地表現且純化半抗體、隨後混 合時，半抗體形成約2% (抗IL-13)及3%(抗IL-4)完整雙特異 性抗體。在共培養條件下，約6〇%為完整雙特異性抗體， 如使用Li-Core蛋白質測定由15〇 kD/(150 kD+75 kD)所確 定； 圖9E-1及9E-2展示如所示初始醱酵接種物中具有不同細 胞比率之兩種共培養物的兩個Hi c層析圖。觀察到反映初 始接種物比率之產物明顯差異。使用此方法顯而易見，可 改變初始接種物比率以獲得最佳製造異多聚體蛋白質； 圖9F為展示在還原性及非還原性條件下由本文所述之共 培養製程製造之八種不同雙特異性抗體之SDS-PAGE分析 的一組四個像片。抗CD3/抗CD19異多聚體蛋白質之非還 原性凝膠未展示。箭頭指示完整雙特異性抗體； 圖10為篩選異多聚體蛋白質之矩陣方法的示意圖； 圖11展示使用本文所述之方法製造之雙特異性抗體的活 體外活性之兩張圖； 圖12為展示抗EGFR/抗c-met雙特異性抗體在KP4胰臟異 種移植活體内模型中具有抗腫瘤活性的圖； 圖13為展示抗EGFR/抗e-met雙特異性抗體在A431表皮 樣癌異種移植活體内模型中具有抗腫瘤活性的圖； 155406.doc -176· 201139682 圖14展示A)組裝前之杵的HIC、B)組裝前之臼的HIC、 C)組裝後之雙特異性抗體的HIC。圖14D為組裝前各組之 凝膠； 圖15展示經組裝物質之電泳圖，其表明86%之物質完全 氧化； 圖16 :經組裝雙特異性抗體之表徵：A)經退火雙特異性 抗體之HIC層析圖表明該物質中超過90.5%為雙特異性抗 • 體，B)經純化物質之凝膠，C)最終樣品之質譜分析反卷 積，及D)理論質量表； 圖17為氧化還原程序（加熱）之示意圖：a)加熱樣品1小時 以使二硫鍵環化，b)隨後冷卻，且使用2 mM DTT還原半 胱胺酸，歷時2小時，及c)隨後濃縮，且藉由在室溫下透 析使半胱胺酸經空氣氧化； 圖18為氧化還原程序（不加熱）之示意圖：a)混合樣品2小 時’ b)使用2 mM DTT還原半胱胺酸，歷時2小時，及幻隨 ® 後濃縮，且藉由在室溫下透析使半胱胺酸經空氣氧化，同 時移除EDTA ;及 圖19 :分析經組裝之雙特異性抗體：A)使用具有加熱步 驟之氧化還原程序之HIC層析圖，B)使用無加熱步驟之氧 化還原程序之HIC層析圖。 155406.doc •177·

Claims (1)

  1. 201139682 七、申請專利範圍： 1. 一種製備異多聚體蛋白質之方法，該異多聚體蛋白質包 含具有第一異二聚域之第一含鉸鏈多肽及具有第二異二 聚域之第二含鉸鏈多肽，其中該第二異二聚域與該第一 異二聚域相互作用，且其中該第一含鉸鏈多肽與該第二 含鉸鏈多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接，該方法包含以 下步驟： (a) 包含編碼該第一含鉸鏈多肽之第一核酸的第一宿主 細胞在表現該含鉸鏈多肽之條件下培養； (b) 包含編碼該第二含鉸鏈多肽之核酸的第二宿主細胞 在表現該含鉸鏈多肽之條件下培養； (c) 破壞該第一宿主細胞及該第二宿主細胞之細胞膜， 其中該第一宿主細胞及該第二宿主細胞已在單一懸 浮液中組合在一起；及 (d) 回收該異多聚體蛋白質， 其中該方法無需添加還原劑。 2. -種製備異多聚體蛋白質之方法該異多聚體蛋白質包 含具有第一異二聚域之第一含鉸鏈多肽及具有第二異二 聚域之第二含鉸鏈多肽’其中該第二異二聚域與該第一 異一聚域相互作用，且其中該第一含鉸鏈多肽與該第二 a鉸鏈多肽由至少一個鏈間二硫鍵連接該方法包含以 下步驟： (a) 提供具有第一異二聚域之經純化第一含鉸鏈多肽； (b) 提供具有第二異二聚域之經純化第二含鉸鍵多狀； 155406.doc 201139682 ⑷將該第一含鉸鏈多肽與該第二含鉸鏈多肽組合； ⑷該第—含较鏈多肽與該第二含鉸鏈多肽在活體外在 允許該等分離多肽多聚合之條件下再指疊；及 (e)回收該異多聚體蛋白質複合物。 3. 如請求項1或2之方法，其中該第—異二聚域與該第二異 一聚域在界面會合(meet)，且該第二異二聚域之界面部 分包含突起’該突起可置於該第一異二聚域之界面部分 的空腔中》 4.如請求項1或2之方法，其中該第二異二聚域為包含突起 之Fc多肽，或該第-異二聚域為包含空腔之&多肽或 兩者。 5.如請求項1或2之方法，其巾該第一 &多肽與該第二^多 肽在界面會合’其中該第二以多肽之界面包含突起該 突起可置於該第一 Fc多肽界面的空腔中，且其中該空腔 或該突起或兩者已分別引入該第一 Fc多肽與該第二Fc多 肽之界面中。 6·如請求項1或2之方法，其中該第一異二聚域及該第二異 二聚域包含白胺酸拉鏈。 7. 如請求項1或2之方法，其中該第一異二聚域及該第二異 二聚域包含捲曲螺旋。 8. 如凊求項1或2之方法，其中該鏈間二硫鍵在抗體之鉸鏈 區中。 9. 如請求項1或2之方法，其中該鏈間二硫鍵聯⑴心牦勻在 欽鏈區之間。 155406.doc -2 - 201139682 10. 如請求項1或2之方法，其中該二硫鍵聯為分子間二硫鍵 聯。 11. 如請求項1或2之方法’其中該分子間二硫鍵聯在兩個含 免疫球蛋白鉸键之多肽鍵的半耽胺酸之間。 12. 如請求項1或2之方法，其中該含鉸鏈多肽包含域或其 變異體。 ^ 13. 如請求項1或2之方法，其中該含鉸鏈多肽包含Fc區或其 變異體。 ' 14·如請求項1或2之方法’其中該第一含鉸鏈多肽為抗體重 鏈0 15.如請求項1或2之方法，其中該篦-冬妨姑交 弟一 3鉸鏈多肽為抗體重 鏈0 16_如請求項1或2之方法’其中該第一冬妨处交 六丁》茨弟3鉸鏈多肽為抗體重 鍵，其與抗體輕鏈配對》 17·如請求項1或2之方法，其中該箆_冬始紐々 开τπ弟一含鉸鏈多肽為抗體重 鏈，其與抗體輕鏈配對。 18.如請求項16之方法’其中該会妨絲玄叫也仏 丁邊兮狡鏈多肽與抗體輕鏈多肽 配對以形成標靶結合臂。 19·如請求項17之方法’丨中該含鉸鍵多狀與抗體輕鍵多肽 配對以形成標靶結合臂。 20. 如請求項1或2之方法，中蚌冬始鉍 八甲及3鉸鏈多肽包含人類Ch2 及/或Ch3域之至少一部分。 21. 如請求項1或2之方法，装 吳中一或兩對含鉸鏈及輕鏈多肽 經人類化。 155406.doc 201139682 22. 如請求項1之*“ <万法’其中該含鉸鏈及輕鏈多肽編碼在各 別表現質體上。 23. 如請求項1之古 <万法’其中該含鉸鏈及輕鏈多肽編碼在同 一表現質體上。 24. 如清求項1夕士、Α ^ 1 <万法’其中該宿主細胞係選自由原核細 胞真核旧胞、哺乳動物細胞及植物細胞組成之群。 25·如明求項1之方法’其中該宿主細胞為原核細胞。 26_如請求項1 ^ 之方法，其中該原核細胞為大腸桿菌（£ co")細胞。 27. 如請求項26之方法，其中該大腸桿菌細胞缺乏lpp。 28. 如請求項 万法’其中該宿主細胞為哺乳動物細胞。 29. 如請求項28之方法，其中該哺乳動物細胞為CHO細胞》 30. 如請求項 哨1之方法’其中該第一宿主細胞及該第二宿主 細胞在各別細胞培養物中。 31_如清求項1之方法’其中步驟⑷及（b)之該等細胞在包含 兩種宿主細胞之混合培養物中。 32. 如請求項3〇之方法，其中步驟⑷及⑼之該等細胞組合、 離％且再懸浮於緩衝液中，隨後破壞該細胞膜。 33. 如請求項30之方法’其中步驟（a)及（b)之該等細胞離心且 再懸浮於緩衝液中，隨後組合，接著破壞該細胞膜。 34. 如清求項1之方法，其中破壞該細胞膜係選自由滲透該 細胞膜及細胞膜崩解組成之群。 35. 如清求項1之方法’其中破壞該細胞膜係選自由以下組 成之群：細胞溶解、音波處理、滲壓衝擊（shock)、通過 155406.doc 201139682 微流化機’添加EDTA、各種清潔劑、溶劑（諸如甲苯、 二甲亞碾等）、界面活性劑（諸如Triton-X 1〇〇、Tween 20 等）、低滲透壓緩衝液，使用冷凍/解凍技術、電穿孔’ 及通過不鏽鋼球均質機。 36. 如清求項1或2之方法，其中該回收步驟進一步包含至少 一個純化步驟。 37. 如請求項1或2之方法，其進一步包含以下步驟： • (a)該抗體捕捉於包含蛋白A之管柱上， (b)自該管柱溶離該抗體，及 (C)該溶離抗體稀釋於含有離液劑（chaotropic agent)或溫 和清潔劑之溶液中β 38. 如請求項丨或2之方法，其中該異多聚體蛋白質係選自由 以下組成之群：抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、 臂抗體、多特異性單價抗體、雙特異性最大抗體 (maxibody)、單抗體（m〇n〇b〇dy)、免疫黏附素、狀體 籲 （pepUbody)、雙特異性狀體、單價肤體及親和抗體 (affibody) 〇 39·如凊求項38之方法，其中該異多聚體蛋白質為抗體。 40. 如凊求項38之方法，其中該異多聚體蛋白質為雙特異性 抗體。 41. 如睛求項38之方法，其中該異多聚體蛋白質為多特異性 抗體。 42. 如請求項38之方法，盆由 乃凌，其中該異多聚體蛋白質為一臂 體。 155406.doc 201139682 43·如請求項38之方法’其中該抗體包含重鏈恆定域及輕鏈 恆定域。 44. 如請求項38之方法，其中該抗趙經人類化。 45. 如請求項38之方法，其中該抗體為全長抗體❶ 46_如請求項45之方法，其中該全長抗體包含重鏈及輕鏈。 47. 如請求項16之方法’其中一或兩對重鏈與輕鏈多肽為人 類多肽。 48. 如清求項17之方法’其中一或兩對重鏈與輕鏈多肽為人 類多肽。 49. 如凊求項38之方法，其中該抗體為人類抗體。 50. 如請求項38之方法’其中該抗體為包含人類Ch2及/或 CH3域之至少一部分的抗體片段。 51. 如睛求項50之方法，其中該抗體片段為Fc融合多肽。 52. 如凊求項38之方法，其中該抗體係選自由IgG、IgA及 IgD組成之群。 53. 如凊求項52之方法，其中該抗體為IgG。 54. 如請求項53之方法，其中該抗體為IgGl。 55. 如請求項53之方法，其中該抗體為IgG2。 56·如凊求項38之方法，其中該抗體為治療抗體。 57·如凊求項38之方法’其中該抗體為促效（agonist)抗體。 58·如4求項38之方法其中該抗體為括抗抗體。 59·如請求項38之方法，其中該抗體為診斷抗體。 6〇·如請求項38之方法，其中該抗體 為阻斷抗體。 61·如凊求項38之方法，其中該抗體為中和抗體。 155406.doc -6 - 201139682 62.如請求項38之方法，其中該抗體能夠結合於腫瘤抗原。 03·如明求項62之方法’其中該腫瘤抗原不為細胞表面分 子。 64. 如請求項62之方、土 ^ 去其中該腫瘤抗原不為集群（cluster) 分化因子。 65. 如请求項38之方法，其中該抗體能夠結合於集群分化因 子。 籲66.如請求項38之方法，其中該抗體能夠結合於細胞存活調 節因子。 67. 如凊求項38之方法，其中該抗體能夠特異性結合於細胞 增殖調節因子。 68. 如请求項38之方法，其中該抗體能夠結合於與組織發生 或分化有關之分子。 69. 如請求項38之方法，其中該抗體能夠結合於細胞表面分 子。 籲70.如4求項38之方法，其中該抗體能夠結合於淋巴激素。 71·如請求項38之方法’其中該第-對及該第二對之輕鏈包 含不同可變域序列。 72·如請求項38之方法’其中該等多肽之至少45%形成該雙 特異性抗體。 73. 如請求項40之方法，其中該雙特異性抗體能夠特異性結 合兩種標乾分子。 74. 如請求項1或2之方法，其中該等多肽之至少45%在包含 該第-含鉸鏈多肽與輕鏈對及該第二含鉸鏈多肽與輕鏈 155406.doc 201139682 對之複合物中。 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. 83. 84. 85. 如凊求項1或2之方法，其中在純化該等抗體步驟之前該 等經分離多肽之不超過10%以單體或均二聚體存在。 一種異多聚體蛋白質，其係由如請求項丨至2中任一項之 方法製造。 如請求項76之異多聚體蛋白質，其中該異多聚體蛋白質 為多特異性抗體。 如請求項76之異多聚體蛋白質，其中該異多聚體蛋白質 能夠結合至少兩種標靶分子。 如請求項76之異多聚體蛋白質，其中該異多聚體蛋白質 為能夠結合同一抗原上至少兩種抗原決定基的抗雜。 一種雙特異性抗體，其係如請求項丨或2之方法製造。 -種雙特異性抗體，其包含第—對重鍵與輕鏈多脉及笫 二對重鏈與輕鏈多& ’其中該等輕鏈多肽包含不同町變 域序列β -種組合物’其包含如請求項76之異多聚體蛋白質及戴 劑。 一種組合物，其包含至少1〇%如請求項％之艨步 白質。 、 一種醫藥組合物’纟包含如請求項76之異多聚雜爹白 -種產生組合異多聚體蛋白質庫之方法該庫包含具务 第一異二聚域之第一含鉸鏈多肽及具有第二異二聚威之 第二含鉸鏈多肽，其中該第二異二聚域與：第：異>聚 155406.doc 201139682 域相互作用 多肽由至少 驟： ’且其中該第一含鉸鏈多肽與該第二含鉸鏈 一個鏈間二硫鍵連接，該方法包含以下步 ⑷培養第-宿主細胞及至少兩種其他宿主細胞，其中 該第一宿主細胞包含編碼含第一異二聚域之多肽 的第一核酸；及 11·該等其他宿主細胞包含編碼含第二異二聚域之多 狀的核酸， (b) 破壞該第一宿主細胞及至少兩種其他宿主細胞之細 胞膜，以使該含第一異二聚域之多肽及該含第二異 二聚域之多肽釋放於細胞外環境中，其中該第一宿 主細胞及至少兩種其他宿主細胞已在單一懸浮液中 組合在一起；及 (c) 回收該等異多聚體蛋白質複合物， 其中該方法無需添加還原劑。 86.如請求項1或2之方法，其中該第一含鉸鏈多肽與抗體輕 鏈多肽配對以形成第一標靶結合臂，及該第二含鉸鏈多 肽與抗體輕鏈多肽配對以形成第二標靶結合臂。 87·如請求項86之方法，其中每一個或兩個結合臂可結合一 種以上標靶。 88.如請求項86之方法，其中該第一臂特異性結合第一標靶 分子’及該第二臂特異性結合第二標靶分子。 89_如請求項86之方法，其中該第一對及該第二對之輕鏈包 含不同可變域序列。 155406.doc 201139682 90. 如請求項86之方法，其中該第一重鏈-輕鏈對及該第二重 鏈-輕鏈對各包含連接彼此之重鏈及輕鏈二硫基。 91. 如請求項86之方法，其中該第一對與該第二對之間的pi 值差異為至少0.5。
    155406.doc •10-
TW100114160A 2010-04-23 2011-04-22 異多聚體蛋白質之製造 TWI586806B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32730210P 2010-04-23 2010-04-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201139682A true TW201139682A (en) 2011-11-16
TWI586806B TWI586806B (zh) 2017-06-11

Family

ID=44121029

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW100114160A TWI586806B (zh) 2010-04-23 2011-04-22 異多聚體蛋白質之製造
TW106108666A TW201742925A (zh) 2010-04-23 2011-04-22 異多聚體蛋白質之製造

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW106108666A TW201742925A (zh) 2010-04-23 2011-04-22 異多聚體蛋白質之製造

Country Status (15)

Country Link
US (5) US9637557B2 (zh)
EP (1) EP2560683B2 (zh)
JP (2) JP6048972B2 (zh)
KR (2) KR20180053775A (zh)
CN (2) CN102946906B (zh)
AR (2) AR080942A1 (zh)
BR (1) BR112012027001A2 (zh)
CA (1) CA2796633C (zh)
DK (1) DK2560683T4 (zh)
ES (1) ES2617777T5 (zh)
HK (2) HK1182624A1 (zh)
MX (1) MX346731B (zh)
RU (1) RU2624027C2 (zh)
TW (2) TWI586806B (zh)
WO (1) WO2011133886A2 (zh)

Families Citing this family (288)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3050963B1 (en) 2005-03-31 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
WO2007114319A1 (ja) 2006-03-31 2007-10-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の血中動態を制御する方法
ES2654040T3 (es) 2006-03-31 2018-02-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método de modificación de anticuerpos para la purificación de anticuerpos biespecíficos
EP2626372B1 (en) 2007-03-29 2018-03-21 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
WO2009041613A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体定常領域改変体
CN101874042B9 (zh) 2007-09-26 2019-01-01 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
EP2409991B1 (en) 2009-03-19 2017-05-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
TWI544077B (zh) 2009-03-19 2016-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody constant region change body
RU2598248C2 (ru) 2009-04-02 2016-09-20 Роше Гликарт Аг Полиспецифичные антитела, включающие антитела полной длины и одноцепочечные фрагменты fab
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
JP5837821B2 (ja) 2009-09-24 2015-12-24 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
US10435458B2 (en) 2010-03-04 2019-10-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
CA2796633C (en) * 2010-04-23 2020-10-27 Genentech, Inc. Production of heteromultimeric proteins
AU2011283694B2 (en) 2010-07-29 2017-04-13 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
MX340558B (es) 2010-08-24 2016-07-14 F Hoffmann-La Roche Ag * Anticuerpos biespecificos que comprenden fragmento fv estabilizado con disulfuro.
RS59589B1 (sr) 2010-11-05 2019-12-31 Zymeworks Inc Dizajniranje stabilnog heterodimernog antitela sa mutacijama u fc domenu
KR101398363B1 (ko) 2010-11-17 2014-05-22 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 혈액응고 제viii 인자의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자
JP5766296B2 (ja) 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
JP6101638B2 (ja) 2011-03-03 2017-03-22 ザイムワークス，インコーポレイテッド 多価ヘテロマルチマー足場設計及び構築物
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
AU2012308320C1 (en) 2011-09-14 2018-08-23 Translate Bio Ma, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
HRP20240230T1 (hr) * 2011-10-11 2024-04-26 F. Hoffmann - La Roche Ag Poboljšani sklop bispecifičnih protutijela
EP3674320A3 (en) 2011-10-27 2020-08-12 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
US11851476B2 (en) 2011-10-31 2023-12-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule having regulated conjugation between heavy-chain and light-chain
JP6326371B2 (ja) 2011-11-04 2018-05-16 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメインにおける変異を有する安定なヘテロ二量体抗体デザイン
TW201326193A (zh) 2011-11-21 2013-07-01 Genentech Inc 抗－ｃ－ｍｅｔ抗體之純化
SI2794905T1 (sl) * 2011-12-20 2020-08-31 Medimmune, Llc Modificirani polipeptidi za ogrodja bispecifičnega protitelesa
JP6605202B2 (ja) * 2011-12-22 2019-11-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド イオン交換膜クロマトグラフィー
KR20140127854A (ko) 2012-02-10 2014-11-04 제넨테크, 인크. 단일-쇄 항체 및 다른 이종다량체
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
MX2019001355A (es) 2012-05-10 2023-01-17 Bioatla Llc Anticuerpos monoclonales multiespecíficos.
WO2013174873A1 (en) * 2012-05-24 2013-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
US9249182B2 (en) 2012-05-24 2016-02-02 Abbvie, Inc. Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
JP6628966B2 (ja) 2012-06-14 2020-01-15 中外製薬株式会社 改変されたＦｃ領域を含む抗原結合分子
US9499634B2 (en) 2012-06-25 2016-11-22 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
WO2014001325A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
RU2639287C2 (ru) 2012-06-27 2017-12-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения
CN104640562A (zh) * 2012-07-13 2015-05-20 酵活有限公司 包含抗-cd3构建体的双特异性不对称异二聚体
WO2014012082A2 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design an constructs
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
WO2014035475A1 (en) 2012-09-02 2014-03-06 Abbvie Inc. Methods to control protein heterogeneity
US9535071B2 (en) 2012-09-07 2017-01-03 The Governors Of The University Of Alberta Methods and compositions for diagnosis of inflammatory liver disease
EP2895200B1 (en) * 2012-09-14 2019-11-06 Translate Bio MA, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
KR20140036905A (ko) * 2012-09-18 2014-03-26 삼성전자주식회사 이중특이 항체를 포함하는 단백질 복합체
US9695228B2 (en) 2012-11-21 2017-07-04 Janssen Biotech, Inc. EGFR and c-Met fibronectin type III domain binding molecules
CA3206122A1 (en) 2012-11-28 2014-06-05 Zymeworks Bc Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
US20150329587A1 (en) * 2012-12-27 2015-11-19 Spiber Inc. Extraction method for hydrophilic recombinant protein
WO2014103847A1 (ja) * 2012-12-27 2014-07-03 スパイバー株式会社 親水性組換えタンパク質の粗精製方法
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10738132B2 (en) 2013-01-14 2020-08-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2014113510A1 (en) 2013-01-15 2014-07-24 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
EP2951209A4 (en) 2013-01-31 2016-06-22 Univ Jefferson CD40 OX40 AGONIST FUSION PROTEIN AND USES THEREOF
EP2830651A4 (en) 2013-03-12 2015-09-02 Abbvie Inc HUMAN ANTIBODIES THAT BIND TNF-ALPHA AND PREPARATION METHODS
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US8921526B2 (en) 2013-03-14 2014-12-30 Abbvie, Inc. Mutated anti-TNFα antibodies and methods of their use
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
PL2968520T3 (pl) * 2013-03-14 2022-01-03 Macrogenics, Inc. Dwuspecyficzne cząsteczki, które są immunoreaktywne wobec immunologicznych komórek efektorowych wykazujących ekspresję receptora aktywującego
EP3421495A3 (en) 2013-03-15 2019-05-15 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
DK2970422T3 (en) 2013-03-15 2018-07-16 Hoffmann La Roche IL-22 POLYPEPTIDES AND IL-22 FC-FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
KR102049990B1 (ko) * 2013-03-28 2019-12-03 삼성전자주식회사 c-Met 항체 및 VEGF 결합 단편이 연결된 융합 단백질
MX2015013901A (es) * 2013-04-05 2015-12-11 Genentech Inc Anticuerpos anti-il-4 y anticuerpos biespecificos y sus usos.
CN104936625A (zh) 2013-04-25 2015-09-23 丝芭博株式会社 多肽水凝胶及其制造方法
JP5796147B2 (ja) 2013-04-25 2015-10-21 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 ポリペプチド多孔質体及びその製造方法
WO2014193973A2 (en) * 2013-05-28 2014-12-04 Dcb-Usa Llc Antibody locker for the inactivation of protein drug
US9879081B2 (en) * 2013-06-25 2018-01-30 Samsung Electronics Co., Ltd. Protein complex, bispecific antibody including the protein complex, and method of preparation thereof
US10370776B2 (en) * 2013-09-25 2019-08-06 Idea Orchard, Llc Antibody like protein
EP3757130A1 (en) 2013-09-26 2020-12-30 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
EP3050896B1 (en) * 2013-09-27 2021-07-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
WO2015057545A2 (en) 2013-10-14 2015-04-23 Janssen Biotech, Inc. Cysteine engineered fibronectin type iii domain binding molecules
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
JPWO2015068847A1 (ja) 2013-11-11 2017-03-09 中外製薬株式会社 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
RU2737882C2 (ru) 2013-11-27 2020-12-04 Займворкс Инк. Биспецифические антигенсвязывающие конструкции против her2
TW201609805A (zh) * 2013-12-23 2016-03-16 美國禮來大藥廠 結合ｅｇｆｒ及ｍｅｔ之多功能抗體
KR102194142B1 (ko) * 2014-01-20 2020-12-23 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체 및 c-Src 저해제를 포함하는 병용 투여용 약학 조성물
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
US10822399B2 (en) * 2014-02-10 2020-11-03 Igm Biosciences, Inc. IgA multi-specific binding molecules
KR20160124165A (ko) 2014-02-21 2016-10-26 제넨테크, 인크. 항-il-13/il-17 이중특이적 항체 및 그의 용도
BR112016022385A2 (pt) 2014-03-28 2018-06-19 Xencor, Inc anticorpos específicos que se ligam a cd38 e cd3
CA2943943C (en) 2014-04-07 2023-01-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Immunoactivating antigen-binding molecule
CN106471117A (zh) * 2014-05-06 2017-03-01 豪夫迈·罗氏有限公司 使用哺乳动物细胞产生异多聚体蛋白
SG11201609370QA (en) 2014-05-13 2016-12-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd T cell-redirected antigen-binding molecule for cells having immunosuppression function
BR112016027888A2 (pt) 2014-05-28 2017-10-24 Zymeworks Inc construto de polipeptídeo de ligação ao antígeno isolado, polinucleotídeo isolado ou um conjunto de polinucleotídeos isolados, vetor ou conjunto de vetores, célula isolada, composição farmacêutica, uso do construto, método para tratar um sujeito com uma doença ou distúrbio, método para obter um construto, método para preparar um construto, meio de armazenamento legível por computador, método para produzir um construto de polipeptídeo de ligação com antígeno bi-específico e método para preparar um construto de polipeptídeo de ligação com antígeno isolado
TWI742423B (zh) 2014-05-29 2021-10-11 美商宏觀基因股份有限公司 特異性結合多種癌症抗原的三特異性結合分子和其使用方法
TWI693232B (zh) 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
WO2015197598A2 (en) * 2014-06-27 2015-12-30 Innate Pharma Multispecific antigen binding proteins
AU2015279316B2 (en) 2014-06-27 2021-03-04 Innate Pharma Multispecific NKp46 binding proteins
US9212225B1 (en) 2014-07-01 2015-12-15 Amphivena Therapeutics, Inc. Bispecific CD33 and CD3 binding proteins
JP6245622B2 (ja) * 2014-08-07 2017-12-13 学校法人兵庫医科大学 Ｉｌ−１８と分子標的抗体とを併用する癌治療薬
AR101846A1 (es) 2014-09-12 2017-01-18 Genentech Inc Anticuerpos anti-cll-1 e inmunoconjugados
KR20170052600A (ko) 2014-09-12 2017-05-12 제넨테크, 인크. 시스테인 가공된 항체 및 콘주게이트
PT3191135T (pt) 2014-09-12 2020-11-12 Genentech Inc Anticorpos anti-her2 e imunoconjugados
JP6681905B2 (ja) 2014-09-13 2020-04-15 ノバルティス アーゲー Ａｌｋ阻害剤の併用療法
JP6730261B2 (ja) 2014-09-17 2020-07-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｈｅｒ２抗体を含む免疫複合体
EA201790719A1 (ru) 2014-09-26 2017-07-31 Макродженикс, Инк. Биспецифические моновалентные диатела, которые способны связывать cd19 и cd3, а также их применения
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
ES2819256T3 (es) 2014-11-05 2021-04-15 Genentech Inc Métodos para producir proteínas bicatenarias en bacterias
AU2015342961B2 (en) 2014-11-05 2021-08-12 Genentech, Inc. Methods of producing two chain proteins in bacteria
EA201791029A1 (ru) 2014-11-10 2017-12-29 Дженентек, Инк. Антитела против интерлейкина-33 и их применение
TWI831044B (zh) 2014-11-11 2024-02-01 日商中外製藥股份有限公司 抗原結合分子、包含抗原結合分子的醫藥組合物以及製造及選擇抗原結合分子之方法
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
EP3221361B1 (en) 2014-11-19 2021-04-21 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor / anti-bace1 multispecific antibodies and methods of use
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
CN110894240B (zh) 2014-11-26 2022-04-15 森科股份有限公司 结合cd3和肿瘤抗原的异二聚体抗体
AU2015353416C1 (en) 2014-11-26 2022-01-27 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CD38
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
MX2017007491A (es) 2014-12-10 2018-05-04 Genentech Inc Anticuerpos del receptor de la barrera hematoencefálica y métodos para su uso.
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
JP6602875B2 (ja) 2015-01-26 2019-11-06 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ｄｒ５結合ドメインを含む多価分子
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
PT3277821T (pt) * 2015-03-31 2019-10-31 Novimmune Sa Método para otimizar a montagem e produção de complexos proteicos hetero-multiméricos
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
EP3277314A4 (en) 2015-04-03 2018-08-29 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting afp peptide/mhc complexes and uses thereof
EP3280444B1 (en) * 2015-04-10 2024-05-08 Adimab, LLC Methods for purifying heterodimeric multispecific antibodies from parental homodimeric antibody species
GB201506869D0 (en) * 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method
CA2987037A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Amphivena Therapeutics, Inc. Use of cd33/cd3 bispecific tandem diabodies for the treatment of acute myeloid leukemia (aml)
EA201792669A1 (ru) 2015-06-04 2018-06-29 Оспедале Сан Раффаэле Срл Igfbp3 и его применение
CA2988011C (en) 2015-06-04 2021-03-23 Ospedale San Raffaele Srl Inhibitor of igfbp3/tmem219 axis and diabetes
TWI773646B (zh) 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
JP6971153B2 (ja) 2015-06-23 2021-11-24 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニムInnate Pharma Pharma S.A. 多重特異的ｎｋエンゲイジャータンパク質
CA2990511A1 (en) * 2015-06-23 2016-12-29 Innate Pharma Multispecific antigen binding proteins
PL3328419T3 (pl) 2015-07-30 2021-12-27 Macrogenics, Inc. Cząsteczki wiążące pd-1 i sposoby ich zastosowania
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
EP3359576A4 (en) 2015-10-08 2019-08-28 Zymeworks Inc. ANTIGENBINDING POLYPEPTIDE CONSTRUCTS WITH KAPPA AND LAMBDA LIGHT CHAINS AND USES THEREOF
RU2731202C2 (ru) 2015-10-08 2020-08-31 Макродженикс, Инк. Комбинированная терапия для лечения рака
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
WO2017075173A2 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Genentech, Inc. Anti-factor d antibodies and conjugates
WO2017079768A1 (en) 2015-11-08 2017-05-11 Genentech, Inc. Methods of screening for multispecific antibodies
US11660340B2 (en) 2015-11-18 2023-05-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Combination therapy using T cell redirection antigen binding molecule against cell having immunosuppressing function
US11649293B2 (en) 2015-11-18 2023-05-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for enhancing humoral immune response
JP7058219B2 (ja) 2015-12-07 2022-04-21 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｐｓｍａに結合するヘテロ二量体抗体
KR102424513B1 (ko) 2015-12-14 2022-07-25 마크로제닉스, 인크. Pd-1 및 ctla-4과의 면역반응성을 가진 이중특이적 분자, 및 이것의 사용 방법
WO2017115773A1 (ja) 2015-12-28 2017-07-06 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域含有ポリペプチドの精製を効率化するための方法
IL299759A (en) 2015-12-30 2023-03-01 Genentech Inc Formulations with reduced polysorbate dissolution
JP7046814B2 (ja) 2015-12-30 2022-04-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド タンパク質製剤のためのトリプトファン誘導体の使用
TW201730212A (zh) 2016-02-17 2017-09-01 宏觀基因股份有限公司 Ｒｏｒ１－結合分子及其使用方法
MX2018010988A (es) 2016-03-14 2019-01-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Farmaco terapeutico que induce lesion celular para usarse en terapia de cancer.
MX2018012433A (es) 2016-04-15 2019-03-01 Macrogenics Inc Moleculas de union b7-h3 novedosas, conjugados anticuerpo-farmaco de los mismos y metodos de uso de los mismos.
KR20230051602A (ko) 2016-04-15 2023-04-18 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Icos 리간드 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도
NZ746934A (en) 2016-04-15 2023-11-24 Alpine Immune Sciences Inc Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN109311949B (zh) 2016-05-11 2022-09-16 思拓凡生物工艺研发有限公司 储存分离基质的方法
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
CN109071613A (zh) 2016-05-11 2018-12-21 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 分离基质
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
WO2017194593A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Method of cleaning and/or sanitizing a separation matrix
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
WO2017201449A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Genentech, Inc. Protac antibody conjugates and methods of use
CN109313200B (zh) 2016-05-27 2022-10-04 豪夫迈·罗氏有限公司 用于表征位点特异性抗体-药物缀合物的生物分析性方法
KR20220119529A (ko) 2016-06-02 2022-08-29 애브비 인코포레이티드 글루코코르티코이드 수용체 작용제 및 이의 면역접합체
US10639378B2 (en) 2016-06-06 2020-05-05 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
CA3026151A1 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
CN109563124A (zh) 2016-06-17 2019-04-02 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性抗体的纯化
EP3471750A4 (en) 2016-06-21 2020-02-26 Janssen Biotech, Inc. CYSTEINE-MODIFIED TYPE III FIBRONECTIN BINDING MOLECULES
EP3475304B1 (en) 2016-06-28 2022-03-23 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
WO2018014260A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
WO2018022946A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
BR112019002394B1 (pt) 2016-08-10 2021-12-21 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Proteína heterodimérica fundida com fc e seu uso
WO2018031662A1 (en) 2016-08-11 2018-02-15 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine prodrugs and antibody conjugates thereof
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CN110139674B (zh) 2016-10-05 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体药物缀合物的方法
WO2018068201A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
PE20191034A1 (es) 2016-10-14 2019-08-05 Xencor Inc Proteinas de fusion heterodimericas biespecificas que contienen proteinas de fusion fc il-15/il-15r y fragmentos de anticuerpo pd-1
BR112019010349A2 (pt) 2016-11-23 2019-10-08 Bioverativ Therapeutics Inc Anticorpos anti-fixa, anti-fxz e antifxa, molécula biespecífica, ácido nulceico, composiçãofarmacêutica e uso dos anteriores
WO2018111978A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Janssen Biotech, Inc. Cd137 binding fibronectin type iii domains
CA3046963A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Janssen Biotech, Inc. Cd8a-binding fibronectin type iii domains
US10597438B2 (en) 2016-12-14 2020-03-24 Janssen Biotech, Inc. PD-L1 binding fibronectin type III domains
AR110424A1 (es) 2016-12-23 2019-03-27 Macrogenics Inc Moléculas de unión a adam9 y métodos de uso de las mismas
WO2018126232A1 (en) * 2016-12-29 2018-07-05 Development Center For Biotechnology Klk6-mediated cns-specific antibody prodrug activation
WO2018132597A1 (en) 2017-01-12 2018-07-19 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting histone h3 peptide/mhc complexes and uses thereof
JP6995127B2 (ja) 2017-02-10 2022-02-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗トリプターゼ抗体、その組成物、及びその使用
CN110325209A (zh) 2017-02-24 2019-10-11 宏观基因有限公司 能够结合cd137和肿瘤抗原的双特异性结合分子及其用途
SG11201907769XA (en) 2017-03-16 2019-09-27 Alpine Immune Sciences Inc Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN110809581A (zh) 2017-03-16 2020-02-18 高山免疫科学股份有限公司 Pd-l2变体免疫调节蛋白及其用途
RS64870B1 (sr) 2017-03-16 2023-12-29 Alpine Immune Sciences Inc Imunomodulatorni proteini varijante pd-l1 i njihove upotrebe
MY201065A (en) 2017-04-26 2024-02-01 Eureka Therapeutics Inc Constructs specifically recognizing glypican 3 and uses thereof
CN108866635B (zh) 2017-05-09 2021-11-26 安升（上海）医药科技有限公司 多特异性蛋白药物及其文库、以及制备方法和应用
AU2018291497A1 (en) 2017-06-30 2020-01-16 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric Fc fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra and antigen binding domains
EP4219540A3 (en) 2017-10-10 2023-12-06 Alpine Immune Sciences, Inc. Ctla-4 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
TW201925223A (zh) 2017-10-18 2019-07-01 美商艾爾潘免疫科學有限公司 變異型icos 配位體免疫調節蛋白及相關組合物及方法
EP3697441B1 (en) 2017-10-20 2023-06-07 F. Hoffmann-La Roche AG Method for generating multispecific antibodies from monospecific antibodies
EP3700672B1 (en) 2017-10-27 2022-12-28 10X Genomics, Inc. Methods for sample preparation and analysis
BR112020007736A2 (pt) 2017-10-30 2020-10-20 F. Hoffmann-La Roche Ag composição e método de tratamento
US11339221B2 (en) 2017-11-01 2022-05-24 Tufts Medical Center, Inc. Bispecific antibody constructs and methods of use
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
EP3706793A1 (en) 2017-11-08 2020-09-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
WO2019106609A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Abbvie Inc. Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
TW201938194A (zh) 2017-12-05 2019-10-01 日商中外製藥股份有限公司 包含結合cd3及cd137的改變的抗體可變區之抗原結合分子
MX2020006155A (es) 2017-12-12 2020-08-13 Macrogenics Inc Moleculas de union a cd-16 biespecificas y su uso en el tratamiento de enfermedades.
JP2021506291A (ja) 2017-12-19 2021-02-22 ゼンコア インコーポレイテッド 改変されたｉｌ−２ ｆｃ融合タンパク質
CA3082280A1 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against tigit
EP3740507A4 (en) 2018-01-15 2022-08-24 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND VARIANTS THEREOF AGAINST PD-1
TWI835772B (zh) 2018-01-26 2024-03-21 美商建南德克公司 Il-22fc融合蛋白及使用方法
KR20200125590A (ko) 2018-01-26 2020-11-04 제넨테크, 인크. 조성물 및 사용 방법
MX2020008095A (es) * 2018-01-31 2020-09-24 Regeneron Pharma Sistemas y métodos para caracterizar variantes de tamaño y carga de impurezas de productos farmacológicos.
AU2019218136A1 (en) 2018-02-08 2020-08-13 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the NKG2D receptor
JP7418337B2 (ja) 2018-02-09 2024-01-19 ジェネンテック， インコーポレイテッド マスト細胞媒介性炎症性疾患の治療法及び診断法
US11685781B2 (en) 2018-02-15 2023-06-27 Macrogenics, Inc. Variant CD3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
SG11202007694UA (en) 2018-02-21 2020-09-29 Genentech Inc DOSING FOR TREATMENT WITH IL-22 Fc FUSION PROTEINS
GB201805142D0 (en) * 2018-03-29 2018-05-16 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
TW202003567A (zh) 2018-03-30 2020-01-16 大陸商南京傳奇生物科技有限公司 針對lag-3之單一結構域抗體及其用途
CA3096052A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
CA3097741A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
US11524991B2 (en) 2018-04-18 2022-12-13 Xencor, Inc. PD-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and PD-1 antigen binding domains and uses thereof
CN110386978A (zh) * 2018-04-19 2019-10-29 上海多米瑞生物技术有限公司 大肠杆菌周质空间表达的蛋白的提取方法
CN117442717A (zh) 2018-06-01 2024-01-26 大有华夏生物医药集团有限公司 治疗疾病或病况的组合物及其用途
WO2019241758A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
SG11202012342WA (en) 2018-06-18 2021-01-28 Eureka Therapeutics Inc Constructs targeting prostate-specific membrane antigen (psma) and uses thereof
CA3106537A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Genentech, Inc. Use of tryptophan derivatives and l-methionine for protein formulation
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
SG11202103192RA (en) 2018-10-03 2021-04-29 Xencor Inc Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
US20210380679A1 (en) 2018-10-11 2021-12-09 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CA3115082A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. B7h3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
WO2020077257A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Pd-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CA3114693A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. 5t4 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
SG11202104136YA (en) 2018-10-23 2021-05-28 Dragonfly Therapeutics Inc Heterodimeric fc-fused proteins
WO2020086858A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Genentech, Inc. Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
CA3117051A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Genentech, Inc. Methods of producing two chain proteins in prokaryotic host cells
WO2020113141A2 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd86 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2020123275A1 (en) 2018-12-10 2020-06-18 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
EP3902557A4 (en) * 2019-01-07 2023-06-07 Shattuck Labs, Inc. HETERODIMER PROTEINS FOR MODULATION OF GAMMA DELTA T CELLS
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
JP2022523946A (ja) 2019-03-01 2022-04-27 ゼンコア インコーポレイテッド Ｅｎｐｐ３およびｃｄ３に結合するヘテロ二量体抗体
CN110068491A (zh) * 2019-04-15 2019-07-30 湖北擎科生物科技有限公司 一种高灵敏度低背景考马斯亮蓝染色液及其使用方法
US20220324933A1 (en) * 2019-07-12 2022-10-13 Proviva Therapeutics (Hong Kong) Limited Il-2 compositions and methods of use thereof
WO2021011864A1 (en) * 2019-07-18 2021-01-21 Memorial Sloan Kettering Cancer Center METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING TGF-β SIGNALING IN CD4+ HELPER T CELLS FOR CANCER IMMUNOTHERAPY
JP2022542240A (ja) 2019-07-26 2022-09-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド ＩＬ－２２ Ｆｃ融合タンパク質による移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防又は治療のための投薬
MX2022003266A (es) 2019-09-20 2022-04-11 Genentech Inc Dosis para anticuerpos anti-triptasa.
WO2021076546A1 (en) 2019-10-14 2021-04-22 Aro Biotherapeutics Company Cd71 binding fibronectin type iii domains
US11781138B2 (en) 2019-10-14 2023-10-10 Aro Biotherapeutics Company FN3 domain-siRNA conjugates and uses thereof
CN110964119A (zh) * 2019-12-05 2020-04-07 沣潮医药科技（上海）有限公司 抗疟二聚体免疫粘附素、药物组合物和用途
MX2022009306A (es) 2020-01-29 2022-09-26 Inhibrx Inc Loseta de nucleo de espuma densificada (dfc) con linea de anticuerpos de dominio individual de cd28 y constructos multivalentes y multiespecíficas de los mismos.
AU2021225920A1 (en) 2020-02-28 2022-09-15 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-CD137 construct and use thereof
IL296256A (en) 2020-03-13 2022-11-01 Genentech Inc Antibodies against interleukin-33 and uses thereof
KR102505383B1 (ko) 2020-03-31 2023-03-02 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Dll3 표적 다중 특이성 항원 결합 분자 및 그의 사용
WO2021207662A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Genentech, Inc. Use of il-22fc for the treatment or prevention of pneumonia, acute respiratory distress syndrome, or cytokine release syndrome
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
WO2022010798A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Kiromic BioPharma, Inc. Mesothelin isoform binding molecules and chimeric pd1 receptor molecules, cells containing the same and uses thereof
MX2023000888A (es) 2020-07-21 2023-02-22 Genentech Inc Inductores quimicos de degradacion conjugados con anticuerpo de brm y metodos de estos.
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
JP2023538891A (ja) 2020-08-19 2023-09-12 ゼンコア インコーポレイテッド 抗ｃｄ２８組成物
KR20230073196A (ko) 2020-09-21 2023-05-25 제넨테크, 인크. 다중특이성 항체의 정제
EP4228697A1 (en) 2020-10-16 2023-08-23 Invisishield Technologies Ltd. Compositions for preventing or treating viral and other microbial infections
WO2022108627A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Kiromic Biopharma, Inc.Kiromic Biopharma, Inc. Gamma-delta t cell manufacturing processes and chimeric pd1 receptor molecules
IL303295A (en) 2020-12-07 2023-07-01 UCB Biopharma SRL Multispecific antibodies and antibody combinations
AU2022232375A1 (en) 2021-03-09 2023-09-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
KR20230154311A (ko) 2021-03-10 2023-11-07 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체
WO2022197877A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Genentech, Inc. Methods and compositions for time delayed bio-orthogonal release of cytotoxic agents
JP2024514306A (ja) 2021-03-31 2024-04-01 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 混合モードクロマトグラフィーによる抗体の精製
BR112023021325A2 (pt) 2021-04-14 2023-12-19 Aro Biotherapeutics Company Domínios de fibronectina tipo iii de ligação a cd71
CN117915950A (zh) * 2021-08-06 2024-04-19 甘李药业股份有限公司 一种多特异性抗体及其用途
CN117897409A (zh) 2021-08-13 2024-04-16 基因泰克公司 抗类胰蛋白酶抗体的给药
EP4430072A1 (en) 2021-11-10 2024-09-18 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
AR128331A1 (es) 2022-01-26 2024-04-17 Genentech Inc Inductores químicos de degradación conjugados con anticuerpos y métodos de estos
AR128330A1 (es) 2022-01-26 2024-04-17 Genentech Inc Inductores químicos de degradación conjugados con anticuerpo y métodos de estos
WO2023172883A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins of variant cd80 polypeptides, cell therapies thereof and related methods and uses
WO2023230488A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 Cereius, Inc. Her2-binding agents and uses thereof
WO2024110905A1 (en) 2022-11-24 2024-05-30 Beigene, Ltd. Anti-cea antibody drug conjugates and methods of use
WO2024151515A2 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Odyssey Therapeutics, Inc. Anti-tnfr2 antigen-binding proteins and uses thereof
WO2024153168A2 (en) 2023-01-19 2024-07-25 Beigene, Ltd. Anti-cmet antibodies and methods of use
WO2024183637A1 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Beigene Switzerland Gmbh Muc1 antibodies and methods of use
WO2024183635A1 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Beigene, Ltd. Muc1 and cd16a antibodies and methods of use
WO2024183636A1 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Beigene Switzerland Gmbh Cd16a antibodies and methods of use
WO2024184810A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 Beigene Switzerland Gmbh Anti-cldn6 and anti-cd3 multispecific antibodies and methods of use
WO2024184811A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 Beigene Switzerland Gmbh Anti-cd3 multispecific antibodies and methods of use
WO2024184812A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 Beigene Switzerland Gmbh Anti-cldn6 antibodies and methods of use
WO2024192065A1 (en) 2023-03-14 2024-09-19 Odyssey Therapeutics, Inc. Anti-cd25 antigen-binding proteins and uses thereof
CN118271465B (zh) * 2024-05-31 2024-09-03 内蒙古大学 Trx-SPRR2A蛋白及其在制备抗肿瘤药物中的应用

Family Cites Families (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
IL47062A (en) 1975-04-10 1979-07-25 Yeda Res & Dev Process for diminishing antigenicity of tissues to be usedas transplants by treatment with glutaraldehyde
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
FR2415708A1 (fr) 1978-01-30 1979-08-24 Renault Dispositif de retenue et de verrouillage pour berceau de roue de secours
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
US4665077A (en) 1979-03-19 1987-05-12 The Upjohn Company Method for treating rejection of organ or skin grafts with 6-aryl pyrimidine compounds
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
SE8505922D0 (sv) 1985-12-13 1985-12-13 Kabigen Ab Construction of an igg binding protein to facilitate downstream processing using protein engineering
DE3650377T2 (de) 1985-12-23 1996-02-22 Hutchinson Fred Cancer Res Regulierung der retroviralen replikation, infektion und pathogenese.
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
IL85746A (en) 1988-03-15 1994-05-30 Yeda Res & Dev Preparations comprising t-lymphocyte cells treated with 8-methoxypsoralen or cell membranes separated therefrom for preventing or treating autoimmune diseases
FI891226A (fi) 1988-04-28 1989-10-29 Univ Leland Stanford Junior Reseptordeterminanter i anti-t-celler foer behandling av autoimmunsjukdom.
EP0435911B1 (en) 1988-09-23 1996-03-13 Cetus Oncology Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
WO1990008187A1 (en) 1989-01-19 1990-07-26 Dana Farber Cancer Institute Soluble two domain cd2 protein
ES2062519T5 (es) 1989-03-21 2003-07-16 Immune Response Corp Inc Vacunacion y metodos contra enfermedades originadas a partir de respuestas patogenicas mediante poblaciones especificas de linfocitos t.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
AU652540B2 (en) 1989-07-19 1994-09-01 Xoma Corporation T cell receptor peptides as therapeutics for autoimmune and malignant disease
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
IL96714A0 (en) 1989-12-20 1991-09-16 Schering Corp Antibody antagonists of human interleukin-4
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
CA2097060A1 (en) † 1990-12-04 1992-06-05 Peter J. Curtis Bifunctional antibodies and method of preparing same
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US6129914A (en) * 1992-03-27 2000-10-10 Protein Design Labs, Inc. Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
DE69329503T2 (de) 1992-11-13 2001-05-03 Idec Pharma Corp Therapeutische Verwendung von chimerischen und markierten Antikörpern, die gegen ein Differenzierung-Antigen gerichtet sind, dessen Expression auf menschliche B Lymphozyt beschränkt ist, für die Behandlung von B-Zell-Lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
UA40577C2 (uk) * 1993-08-02 2001-08-15 Мерк Патент Гмбх Біспецифічна молекула, що використовується для лізису пухлинних клітин, спосіб її одержання, моноклональне антитіло (варіанти), фармацевтичний препарат, фармацевтичний набір (варіанти), спосіб видалення пухлинних клітин
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
DE69529649T2 (de) 1994-03-17 2003-12-18 Merck Patent Gmbh Anti-egfr einkettige fvs und anti-egfr antikoerper
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
AU2660397A (en) 1996-04-05 1997-10-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells
IL132560A0 (en) * 1997-05-02 2001-03-19 Genentech Inc A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
HU228582B1 (en) 1998-10-23 2013-04-29 Kirin Amgen Inc Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to mp1 receptor and having thrombopoietic activity
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
EP1272647B1 (en) 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
EP1297142B1 (en) 2000-06-29 2009-01-14 Abbott Laboratories Dual specificity antibodies and methods of making and using
US6979556B2 (en) 2000-12-14 2005-12-27 Genentech, Inc. Separate-cistron contructs for secretion of aglycosylated antibodies from prokaryotes
EP1345967B1 (en) 2000-12-22 2011-08-10 Grad, Carole, Legal representative of Kaplan, Howard Phage display libraries of human v h fragments
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
JP4516719B2 (ja) 2001-05-11 2010-08-04 アムジエン・インコーポレーテツド Ｔａｌｌ−１と結合するペプチド及び関連分子
CN1966525A (zh) † 2001-06-13 2007-05-23 根马布股份公司 表皮生长因子受体(egfr)的人单克隆抗体
US7205275B2 (en) 2001-10-11 2007-04-17 Amgen Inc. Methods of treatment using specific binding agents of human angiopoietin-2
US7332474B2 (en) 2001-10-11 2008-02-19 Amgen Inc. Peptides and related compounds having thrombopoietic activity
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
CA2965865C (en) * 2002-07-18 2021-10-19 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US6919426B2 (en) 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
MXPA05004022A (es) † 2002-10-17 2005-10-05 Genmab As Anticuerpos monoclonales humanos contra cd20.
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
MXPA05012723A (es) 2003-05-30 2006-02-08 Genentech Inc Tratamiento con anticuerpos anti-vgf.
PT1639011E (pt) 2003-06-30 2009-01-20 Domantis Ltd Anticorpos (dab) de domínio único peguilados
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
US7472724B2 (en) 2003-08-18 2009-01-06 Electrolock, Inc. Method and apparatus for creating, using, and dispensing tubes
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
US20050136051A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-23 Bernard Scallon Methods for generating multimeric molecules
CN104013957B (zh) 2003-12-23 2016-06-29 泰勒公司 用新的抗il13单克隆抗体治疗癌症
AR049390A1 (es) 2004-06-09 2006-07-26 Wyeth Corp Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos
US20070048785A1 (en) 2004-06-09 2007-03-01 Lin Laura L Anti-IL-13 antibodies and complexes
US7501121B2 (en) 2004-06-17 2009-03-10 Wyeth IL-13 binding agents
JP2008512987A (ja) * 2004-07-22 2008-05-01 エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム 結合分子
AR050044A1 (es) 2004-08-03 2006-09-20 Novartis Ag Anticuerpo especifico de il-4
EP1786836A2 (en) * 2004-09-02 2007-05-23 Genentech, Inc. Anti-fc-gamma riib receptor antibody and uses therefor
MX2007002856A (es) 2004-09-02 2007-09-25 Genentech Inc Metodos para el uso de ligandos receptores de muerte y anticuerpos c20.
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
JP2009515878A (ja) 2005-11-12 2009-04-16 イーライ リリー アンド カンパニー 抗ｅｇｆｒ抗体
EP2035456A1 (en) † 2006-06-22 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
EP2626372B1 (en) † 2007-03-29 2018-03-21 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
HUE028536T2 (en) 2008-01-07 2016-12-28 Amgen Inc Method for producing antibody to FC heterodimer molecules using electrostatic control effects
JP5913980B2 (ja) 2008-10-14 2016-05-11 ジェネンテック， インコーポレイテッド 免疫グロブリン変異体及びその用途
RU2504553C2 (ru) 2009-03-20 2014-01-20 Дженентек, Инк. Антитела к her
EP2424567B1 (en) 2009-04-27 2018-11-21 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
CA2781519A1 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
CA2796633C (en) * 2010-04-23 2020-10-27 Genentech, Inc. Production of heteromultimeric proteins

Also Published As

Publication number Publication date
CA2796633A1 (en) 2011-10-27
ES2617777T3 (es) 2017-06-19
RU2624027C2 (ru) 2017-06-30
TW201742925A (zh) 2017-12-16
ES2617777T5 (es) 2022-10-13
US9637557B2 (en) 2017-05-02
US20230357445A1 (en) 2023-11-09
US20210171662A1 (en) 2021-06-10
RU2012149858A (ru) 2014-05-27
US20180282431A1 (en) 2018-10-04
DK2560683T4 (da) 2022-08-29
HK1214277A1 (zh) 2016-07-22
CA2796633C (en) 2020-10-27
WO2011133886A3 (en) 2011-12-22
JP2013529190A (ja) 2013-07-18
DK2560683T3 (en) 2017-03-13
BR112012027001A2 (pt) 2016-07-19
EP2560683B1 (en) 2016-12-14
TWI586806B (zh) 2017-06-11
CN102946906B (zh) 2015-07-15
AR080942A1 (es) 2012-05-16
US20110287009A1 (en) 2011-11-24
HK1182624A1 (zh) 2013-12-06
JP2017061444A (ja) 2017-03-30
EP2560683A2 (en) 2013-02-27
MX2012012119A (es) 2012-12-17
CN105001330B (zh) 2020-05-01
WO2011133886A2 (en) 2011-10-27
US20190185584A1 (en) 2019-06-20
EP2560683B2 (en) 2022-07-20
KR101860963B1 (ko) 2018-05-24
CN105001330A (zh) 2015-10-28
KR20180053775A (ko) 2018-05-23
MX346731B (es) 2017-03-30
CN102946906A (zh) 2013-02-27
KR20130092996A (ko) 2013-08-21
JP6048972B2 (ja) 2016-12-21
AR120511A2 (es) 2022-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230357445A1 (en) Production of heteromultimeric proteins
US9994646B2 (en) Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
JP6161540B2 (ja) Ｆｃ変異体及びそれらの生産方法
RU2727012C2 (ru) Получение гетеромультимерных белков с использованием клеток млекопитающих