CN118271465B

CN118271465B - Trx-SPRR2A蛋白及其在制备抗肿瘤药物中的应用

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Publication number: CN118271465B
Application number: CN202410692933.5A
Authority: CN
Inventors: 丁国斌; 王盼; 刘红瑞; 何品龙; 任璐雅; 叶佳琪
Original assignee: Inner Mongolia University
Current assignee: Inner Mongolia University
Priority date: 2024-05-31
Filing date: 2024-05-31
Publication date: 2024-09-03
Anticipated expiration: 2044-05-31
Also published as: CN118271465A

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及Trx‑SPRR2A蛋白及其在制备抗肿瘤药物中的应用。所述Trx‑SPRR2A蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述Trx‑SPRR2A蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明使用大肠杆菌Rosetta‑gami(DE3)pLysS原核表达系统成功表达了富含二硫键的融合蛋白Trx‑SPRR2A。所述Trx‑SPRR2A可有效抑制乳腺癌和肝癌细胞的增殖，并触发细胞凋亡，该结果为新型抗肿瘤药物的研发提供新思路和理论依据。

Description

Trx-SPRR2A蛋白及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及Trx-SPRR2A蛋白及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

正常细胞生长与分化失去控制而引发的癌症是影响全球生命健康的主要威胁，癌症具有较高的发病率与死亡率，仅次于心血管疾病。尽管医学研究取得了显著进步，但是癌症治疗依然是一个巨大的医学挑战。为了应对癌症带来的伤害，全球科学家、医疗工作者一直在积极探索和研发更有效的治疗策略以提高癌症患者的生存率。化学治疗是一种通过使用单一或多种化学药物来干扰肿瘤细胞生长和分裂的治疗方法，然而，大多数化疗药物具有非特异性，这意味着它们在随血液循环分布到达全身各处时，除了能杀死癌症细胞，还对正常细胞和组织具有毒性。除此以外，化疗药物还具有溶解性较差、循环半衰期短、潜在耐药性等特点，这些特性使得化疗药物在治疗过程中会产生强烈的副作用，进一步限制了其治疗效果和临床应用。为了克服这些问题，科研工作者将目光投向了新型抗肿瘤药物的研究与开发，以及药物抗肿瘤作用模式的革新。此举不仅能够解决化疗药物在安全性、疗效、耐药性和预后性等方面的难题，还有助于实现彻底治愈肿瘤的目标。这是一项至关重要的课题，也是科研工作者所面临的严峻挑战。

近几年，单克隆抗体、蛋白质和多肽等药物凭借其独特的生物选择性而成为癌症治疗领域中的核心研究对象。相较于传统化疗药物，抗癌多肽类药物展现出明显的优越性：其分子量较小，从而简化了合成与修饰过程，有效提高了药物在体内的稳定性；展现出强烈的靶向性，多样化的给药途径；在保持显著疗效的同时，其副作用相对较小。经过科学研究和严格审批，截至目前，已有若干多肽类药物顺利进入癌症治疗的临床试验阶段，更值得一提的是，其中部分药物如杆菌肽（Bacitracin）、硫酸粘菌素（Colistin sulphate）已成功通过审批，获得了上市资格，为癌症治疗领域带来了新的希望与突破。

研究报道，小蛋白2A(SPRR2A）是一种富含脯氨酸及和二硫键的肠道杀菌蛋白，然而，SPRR2A在抗肿瘤方面的作用尚未见报道。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷和不足，本发明提供了Trx-SPRR2A蛋白及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

第一方面，本发明提供一种Trx-SPRR2A蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述Trx-SPRR2A蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

更进一步地，所述Trx-SPRR2A蛋白的制备方法包括如下步骤：

1）合成SEQ ID NO.3所示SPRR2A基因；

2）以SEQ ID NO.4~5所示引物线性扩增pET32a载体；

3）通过无缝克隆将线性化的pET32a载体与目的基因连接，得到pET32a-SPRR2A重组质粒；

4）将pET32a-SPRR2A重组质粒转化至宿主菌；

5）获得的重组表达菌经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，然后纯化表达产物，获得所述Trx-SPRR2A蛋白。

更进一步地，所述宿主菌为大肠杆菌Rosetta-gami (DE3) pLysS。

更进一步地，采用镍柱亲和柱层析纯化表达产物。

第二方面，本发明提供所述Trx-SPRR2A蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，所述肿瘤为乳腺癌。

进一步地，所述肿瘤为肝癌。

进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

更进一步地，所述辅料包括常规的稀释剂（如注射用水、微晶纤维素等至少一种），填充剂（如甘露醇、蔗糖、乳糖、聚乙二醇、吐温80、山梨醇、薄荷脑、液体石蜡、凡士林、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂、矿物油、二甲基亚砜等至少一种），稳定剂（如乙二胺四乙酸二钠、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、乙醇胺、碳酸氢钠、醋酸钠、烟酰胺、维生素C等至少一种），渗透压调节剂（如氯化钠、葡萄糖等至少一种），pH调节剂（如三乙醇胺、氢氧化钠、枸橼酸钠等至少一种），防腐剂（如三氯叔丁醇、尼泊金酯、羟苯乙酯、苯扎溴铵等至少一种）。

本发明具有如下有益效果：

本发明利用大肠杆菌Rosetta-gami (DE3) pLysS原核表达系统成功表达了富含二硫键的融合蛋白Trx-SPRR2A。所述Trx-SPRR2A能够抑制MCF-7细胞和HepG2细胞的活力，在弱酸性条件下可有效抑制两种肿瘤细胞的增殖，此研究为Trx-SPRR2A在乳腺癌和肝癌治疗中的应用奠定了基础，并为后续的深入研究提供了宝贵的参考依据。

附图说明

图1为线性化载体pET32a与SPRR2A基因扩增，泳道1为线性化载体pET32a，泳道2为SPRR2A基因。

图2为利用通用引物（a）与特异性引物（b）的PCR鉴定。

图3为12% SDS-PAGE分析Trx-SPRR2A表达。M表示分子量范围在10~150 kDa的蛋白Marker；泳道1为经过IPTG诱导后，含有空质粒pET32a的Rosetta-gami (DE3) pLysS菌体裂解产生的上清液；泳道2呈现的是未经IPTG诱导，但含有重组质粒pET32a-SPRR2A的Rosetta-gami (DE3) pLysS菌体裂解后的上清液。泳道3、4、5则分别呈现了经过IPTG诱导后，含有重组质粒pET32a-SPRR2A的Rosetta-gami (DE3) pLysS菌体裂解液、上清液以及沉淀。

图4为经过镍柱亲和柱层析纯化后，Trx-SPRR2A的SDS-PAGE电泳分析结果。（a）12%SDS-PAGE检测Trx-SPRR2A的纯化摸索。泳道M代表14~120 kDa的Marker。泳道1-8分别为用8mL含20 mM、40 mM、60 mM、80 mM、100 mM、150 mM、200 mM、300 mM的Wash buffer洗脱目的蛋白留样。（b）12% SDS-PAGE检测纯化的Trx-SPRR2A。泳道M代表10~250 kDa的Marker。

图5为分别溶解于pH 7.4的PB缓冲液（a）和pH 5.5的MES缓冲液（b）的Trx-SPRR2A在25℃下的CD光谱。

图6为Trx-SPRR2A的血清稳定性检测。（a、c)20 μM的Trx-SPRR2A与pH值为7.4或6.5且含有10%胎牛血清的细胞培养基在37 ℃条件下孵育不同时间（0, 2, 6, 12, 24, 48h）后，通过SDS-PAGE检测蛋白稳定性。泳道M是分子量在20~200 kDa范围内的蛋白Marker；FBS是含有10％FBS的细胞培养基。图中箭头明确指出了Trx-SPRR2A的位置。（b、d）分别为a、c中目的条带的定量分析结果。

图7为溶于PBS缓冲液（pH 7.4）的FITC-Trx-SPRR2A（a）、溶于MES缓冲液（pH 5.5）的FITC-Trx-SPRR2A（b）的紫外可见吸收光谱图。

图8为通过流式细胞术检测MCF-7细胞对FITC-Trx-SPRR2A的摄取（标尺：50 μm）。

图9为MTT检测细胞活力。在pH 7.4和pH 6.5的条件下，分别使用不同浓度的Trx-SPRR2A处理（a）MCF-7细胞和（b）HepG2细胞，持续时间为12小时。随后，通过MTT法来检测这些细胞的相对活力。

图10为结晶紫染色检测细胞活力。（a）不同处理组细胞的结晶紫染色图片。标尺是200 μm。（b）图a的定量分析结果。

图11为 Trx-SPRR2A在中性和酸性环境下处理MCF-7细胞后，通过Calcein-AM/PI染色采集图像（标尺：500 μm）。

图12为流式细胞仪检测细胞膜通透性。在pH 6.5条件下将不同浓度（0、10、20、30μM）的Trx-SPRR2A分别与MCF-7细胞过夜孵育，PI染色后，通过流式细胞仪进行检测。

图13为 Annexin V-FITC/PI 双染法分析细胞凋亡。在pH 7.4和pH 6.5两种环境下将不同浓度（0、10、20、40 μM）的Trx-SPRR2A分别与MCF-7细胞过夜孵育，利用Annexin V-FITC/PI 试剂盒对细胞进行染色。（a）利用流式细胞术研究细胞凋亡状况。（b）荧光倒置显微镜观察细胞凋亡状况（标尺：200 μm）。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供了一种富含二硫键的融合蛋白Trx-SPRR2A及其在制备抗肿瘤药物方面的应用，所述Trx-SPRR2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因序列如SEQ IDNO.2所示。

实施例1：Trx-SPRR2A的原核表达

1 实验方法

1.1 构建pET32a-SPRR2A重组质粒

1.1.1 合成SPRR2A基因

基因SPRR2A（SEQ ID NO.3所示）由生工生物工程（上海）股份有限公司全基因合成。

1.1.2 线性化扩增pET32a载体

采用SEQ ID NO.4~5所示引物pET32a-F和pET32a-R对pET32a载体进行线性化扩增，回收PCR产物并纯化，获得线性化pET32a载体。

pET32a-F：5′- CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAG -3′；

pET32a-R：5′- GGCCAGGTTAGCGTCGAGGAACTCTTTC -3′。

1.1.3 利用无缝克隆构建pET32a-SPRR2A 重组质粒

根据表1所示体系，将各类试剂加入已灭菌的1.5 mL离心管中，并确保充分混合均匀，随后，将离心管放入预先设定为50 ℃的恒温水浴锅中，维持反应时长20 min。反应结束后，立即将离心管转移到冰上进行冷却，以便进行转化步骤。

表1无缝克隆反应体系

1.1.4 pET32a-SPRR2A重组反应产物转化至E.coli DH5α

（1）将预先在-80 ℃条件下储存的E.coli DH5α感受态细胞取出，并放置在冰上缓慢融化；

（2）将50 μL感受态细胞与10 μL预冷的重组反应产物轻柔混合均匀，随后将混合物置于冰上静置30 min；

（3）将待处理的混合物缓慢而谨慎地转移至预先设定为42 ℃的恒温水浴锅中，待其经历45秒的热激时间后，迅速转移至冰上，静置2 min；

（4）在超净工作台中，取600 μL未添加抗性的LB培养基，并将其转移至（3）中，随后在37 ℃恒温摇床中振荡1 h，转速设置为210 rpm；

（5）复苏后的菌液以4000 rpm离心2 min，弃400 μL上清液，然后将剩余上清与菌体沉淀混匀后均匀涂布于含有100 ng/μL Amp的LB固体培养基表面，随后将其放入恒温培养箱中，在37 ℃的条件下进行过夜培养。

（6）阳性克隆鉴定，确定无误后将pET32a-SPRR2A重组质粒送往Sangon Biotech公司测序。

1.2 Trx-SPRR2A蛋白异源表达

在确定测序结果无误后，将pET32a-SPRR2A重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta- gami (DE3) pLysS感受态细胞中，这一操作旨在构建具有异源表达Trx-SPRR2A能力的工程菌，以满足后续实验需求。

（1）从过夜培养Rosetta-gami (DE3) pLysS的LB固体培养基中挑取单菌落于2支5mL LB培养基试管中（含100 ng/μL Amp与CAP），编号为①-②；在1支含5 mL LB液体培养液（含100 ng/μL Amp）中接种含重组质粒pET-32a的Rosetta-gami (DE3) pLysS，编号为③，三根试管置于恒温台式摇床中培养8 h，温度设置为37 ℃，转速为210 rpm；

（2）将培养后的菌液分别接种于3瓶0.4 L的LB液体培养基中进行扩大培养，编号分别为④-⑥温度设置为37 ℃，转速为220 rpm；

（3）当OD₆₀₀接近1.0时，④与⑥各加入200 μL的IPTG（终浓度为0.5 mM），随后三瓶菌液培养12 h，温度设置为16 ℃，转速为180 rpm；

（4）将经过培养后的菌液分别于大型离心机以8000 rpm离心15 min，随后，去除上清液，收集菌体沉淀并进行称重；

（5）分别将经过称重后的菌体沉淀以1:12（W/V）的比例与20 mM Tris缓冲液混合，制备成均匀的悬浮液。随后，采用超声破碎技术以40%的功率对菌体进行破碎处理，直至菌体变得透亮，在此过程中，以工作4 s、间歇6 s的模式运行；

（6）分别取超声破碎后的40 μL菌液这样，剩余部分于4 ℃、12000 rpm离心40 min后，取40 μL上清液这样，沉淀由20 mM Tris缓冲液以1:12（W/V）的比例重悬制成样品。

（7）将含有质粒pET-32a且经过诱导处理的上清液、未加IPTG诱导剂含重组质粒的上清液、加IPTG诱导剂含重组质粒的全菌、上清液以及沉淀样品通过SDS-PAGE检测，以比较不同情况下Trx-SPRR2A的表达水平。

1.3 Trx-SPRR2A蛋白的纯化

（1）使用30 mL的100 mM NiSO₄将镍离子填充到层析柱中；

（2）用40 mL的20 mM Tris缓冲液对镍柱进行平衡处理；

（3）将经过超声破碎和离心处理后的蛋白上清液进行两次重复的挂注操作；

（4）用2倍柱体积的20 mM Tris缓冲液过柱去除样品中的杂蛋白；

（5）用200 mL的50 mM咪唑溶液通过层析柱，以进一步去除杂蛋白；

（6）用40 mL的200 mM咪唑溶液通过层析柱进行洗脱，以收集目标蛋白Trx-SPRR2A；

（7）利用40 mL EDTA（pH 8.0）与镍柱上的镍以及蛋白发生化学反应，进而达到去镍与残存蛋白的目的；

（8）用200 mL去离子水冲洗柱材料；

（9）通过20 mL的100 mM NiSO₄再镀镍，封柱；

（10）将洗脱后的Trx-SPRR2A通过超滤离心管除盐浓缩，以溶解于MES缓冲液中，随后用0.22 μm的滤器除菌并用BCA法测定Trx-SPRR2A的浓度。

1.4 Trx-SPRR2A的SDS-PAGE鉴定

（1）将纯化后的Trx-SPRR2A蛋白样品与5×Loading buffer以1：4的比例混合，在振荡器上振荡均匀，混合好的样品在100 ℃金属浴中煮沸6 min；

（2）蛋白Marker和煮沸过的样品上样于预先准备好的SDS-PAGE蛋白胶上样孔中（15%的分离胶和5%的浓缩胶），样品于浓缩胶中时电泳仪以60 V运行，溴酚蓝指示剂显示蛋白样品已经到达分离胶时，以恒定的120 V继续电泳，溴酚蓝迁移至距离前沿1～2 cm的位置后停止电泳；

（3）电泳结束后，将凝胶置于考马斯亮蓝染色液中，进行2小时的染色处理。随后，将染色液去除；使用蒸馏水把凝胶表面清洗几次，随后加入脱色液以及不定时更换脱色液，直至蛋白质条带清晰可见；

（4）利用凝胶扫描仪观察与扫描，使用Image J图像处理软件分析Trx-SPRR2A蛋白的纯度。

1.5 Trx-SPRR2A的质谱鉴定

将考马斯亮蓝染色的纯化Trx-SPRR2A条带切割下来置于EP管中，寄往SangonBiotech公司利用高质量、高灵敏度、高精确度和高分辨率的基质辅助激光解析离子化串联飞行时间质谱仪（MALDI-TOF/TOF）进行质谱分析。

1.6 圆二色谱分析

1.6.1 Trx-SPRR2A的二级结构检测

（1）经过纯化处理的Trx-SPRR2A，通过超滤离心管进行除盐与浓缩操作。

（2）利用圆二色谱（Circular Dichroism, CD）对Trx-SPRR2A进行分析，选取0.05cm光程的比色皿，于25 ℃，1 nm/s的速度下在波长为195~260 nm的区间内扫描；

（3）以5 mM PB缓冲液（pH 7.4）与10 mM MES缓冲液（pH 5.5）为基线，扫描Trx-SPRR2A的CD光谱；

（4）根据CD光谱数据，利用CDNN软件分析Trx-SPRR2A的二级结构类型与含量。

1.6.2 Trx-SPRR2A的热稳定性分析

（1）用10 kD的超滤离心管对纯化后的Trx-SPRR2A进行除盐浓缩处理，分别置换到PB缓冲液（pH 7.4）以及MES缓冲液（pH 5.5），蛋白终浓度均为15 μM；

（2）在25~95 ℃的范围内通过圆二色谱仪以每上升5 ℃扫描一次的频率采集Trx-SPRR2A的CD光谱，圆二色谱仪的加热速率为2 ℃/min；

（3）根据CD光谱数据，绘制Trx-SPRR2A的温度变化曲线。

1.7 Trx-SPRR2A蛋白的二硫键鉴定

（1）收集经纯化、除盐、浓缩最后置换到10 mM MES缓冲液的Trx-SPRR2A；

（2）寄往Sangon Biotech公司进行蛋白质二硫键配对分析。

1.8 Trx-SPRR2A的血清稳定性检测

（1）经过纯化处理的Trx-SPRR2A，通过超滤离心管（10 kD）进行除盐与浓缩操作。随后，将其置换至20 mM Tris缓冲液中；

（2）将Trx-SPRR2A按照20 μM的终浓度，分别添加到pH值为6.5和7.4的细胞培养液中，这两种培养液均含有10%的胎牛血清；

（3）将其放置在CO₂细胞培养箱中，严格控制孵育温度为37 ℃，并分别在0、2、6、12、24、48小时的时间点取出。在每个预定时间点，使用5×Loading Buffer制备SDS-PAGE蛋白样品，制备好的样品储存于-20 ℃，以备后续实验使用；

（4）通过SDS-PAGE进行检测。随后，利用Image J软件对这些蛋白条带的灰度值进行分析，基于这些分析数据，进一步计算相对强度，该相对强度即为不同孵育时间点的蛋白条带灰度值与0 h时条带灰度值的比值。

2 结果

2.1 重组质粒的构建

2.1.1 线性化载体与目的基因的PCR扩增

将扩增产物和DNA Loading以1：5的体积比吹吸均匀后通过1%琼脂糖凝胶进行了电泳，电压设置为120 V，时间设置为35 min，最后用核酸成像仪成像分析PCR产物的长度。如图1所示，分别在泳道1与泳道2的5000 bp-8000 bp、100 bp-250 bp之间出现了明显的电泳条带，这和线性化载体pET32a（5698 bp）与目的基因SPRR2A（216 bp）的理论值相符。由此表明，线性化载体pET32a与目的基因SPRR2A扩增成功。

2.1.2 重组质粒pET32a-SPRR2A的鉴定与测序验证

利用无缝克隆技术将线性化载体pET32a与目的基因SPRR2A通过同源序列之间的配对形成闭环以得到重组质粒pET32a-SPRR2A。重组质粒转化至E.coli DH5α，选取琼脂糖凝胶电泳检测中最亮条带相对应的菌液进行重组质粒的提取，然后分别利用通用引物与特异性引物进行PCR鉴定。PCR产物与6×DNA loading buffer以1：5的体积比混合均匀后上样至核酸胶点样孔，电压设置为90 V，时间设置为35 min，最后用核酸成像仪成像分析PCR产物的长度。如图2a所示，可以观察到泳道1-4在500 bp-750 bp的范围内均显示出清晰的条带，这些条带的长度与pET32a-SPRR2A重组质粒中通用引物之间片段长度的理论值（721bp）相吻合。如图2b所示，泳道1-3均在100 bp-250 bp的范围内均呈现出清晰的条带，这些条带的长度与pET32a-SPRR2A重组质粒中特异性引物间的片段SPRR2A长度的理论值（216bp）相吻合。经过测序验证，所得结果与预期的目的基因SPRR2A的理论序列吻合，由此可确认，我们已成功构建了重组质粒pET32a-SPRR2A。

2.3.2 Trx-SPRR2A的异源表达

将诱导表达且超声破碎后的Trx-SPRR2A进行SDS-PAGE检测。如图3所示，泳道3在分子量大约为20 kDa的区域呈现出特有的目标条带，这与Trx-SPRR2A蛋白的预期分子量非常接近。与泳道1和2相比较，泳道3所展现出的这一条带为成功诱导表达提供了确凿证据。泳道4目的蛋白条带亮度显著高于泳道5，表明Trx-SPRR2A目标蛋白主要以可溶性形式表达，而非以包涵体形式存在。

2.3.3 Trx-SPRR2A的纯化

如图4所示，在图4a中，用不同浓度的咪唑溶液进行清洗并留样进行SDS-PAGE检测，最终确定用含50 mM咪唑的wash buffer洗杂，而含200 mM咪唑的wash buffer则用于洗脱目标蛋白。为确保洗脱效果，我们对洗脱下来的目标蛋白进行了保留，并进行SDS-PAGE检测。在图4b中，经过纯化处理的Trx-SPRR2A于20-25 kDa之间呈现出了一条清晰的单一条带，该结果与Trx-SPRR2A的理论分子量21 kDa相吻合。通过Image J对蛋白的纯度进行评估，结果显示Trx-SPRR2A的纯度为94.5%，说明通过镍柱亲和层析技术可以有效地使目标蛋白从复杂的蛋白质混合物中被选择性地分离出来。使用BCA法测量蛋白质浓度后，计算得出Trx-SPRR2A的产量为7.18 mg/L，这表明蛋白质的表达和纯化已经达到了相对较高的效率。

2.3.4 Trx-SPRR2A 的质谱鉴定

对考马斯亮蓝染色的条带进行质谱鉴定，表2的结果显示，Trx-SPRR2A的序列覆盖率为89%，分子量为21547 Da，这与理论值和SDS-PAGE的实验数据相一致。说明Trx-SPRR2A蛋白成功表达。

表2 Trx-SPRR2A的质谱鉴定

2.3.5 Trx-SPRR2A的二级结构分析

图5为Trx-SPRR2A在25 ℃时的CD光谱图，为我们提供了关于其二级结构的初步信息。为了更深入地了解Trx-SPRR2A的二级结构，采用CDNN软件对数据进行处理以得到Trx-SPRR2A在两种缓冲液中各类二级结构的比例。结果表明，当Trx-SPRR2A存在于pH 7.4的5mM PB缓冲液时，其二级结构包括11.3%的α－螺旋、35.9%的β-折叠（平行与反平行）、19.5%的β－转角和34.2%的无规卷曲。当Trx-SPRR2A存在于pH 5.5的10 mM MES缓冲液时，其二级结构包含12.9%的α－螺旋、31.8%的β-折叠（平行与反平行）、20.1%的β-转角和34.8%的无规卷曲。由此可见，Trx-SPRR2A的二级结构主要是β-折叠与无规卷曲。

2.3.6 圆二色谱分析Trx-SPRR2A的热稳定性

为了深入研究蛋白的热稳定性，利用圆二色谱仪对Trx-SPRR2A在25~95 ℃范围内的CD光谱进行了全面检测，在这个温度区间内，每5 ℃进行一次检测，以便更准确地揭示蛋白质在不同温度下的结构变化。25~80 ℃时Trx-SPRR2A的CD光谱呈现出高度的相似性，表明Trx-SPRR2A在该温度区间内能够保持良好的热稳定性；然而，当温度超过85 ℃时，可以观察到两种缓冲液中的Trx-SPRR2A的CD光谱呈现出明显的变化，这一现象表明，高温条件下，Trx-SPRR2A的二级结构会经历改变，这表明Trx-SPRR2A具有较好的热稳定性。

2.3.7 Trx-SPRR2A蛋白的二硫键鉴定

二硫键是一种普遍的蛋白翻译后修饰，蛋白质的二硫键对其结构和功能至关重要，因此精确测定二硫键的数量和位置有利于为相关研究和应用提供有价值的信息。我们采用高分辨质谱Q-Exactive（Thermo Fisher）质谱对Trx-SPRR2A蛋白进行二硫键的分析，在非还原条件下，对蛋白质进行酶切，利用高分辨质谱鉴定含二硫键的肽段，进而确认二硫键的连接方式。如表3所示为二硫键分析结果，结果表明，Trx-SPRR2A共有7对二硫键，其位点分别是C132-C136（或C141-C145)、C172/C172（链间二硫键）、C121-C127、C132，C136,C141，C145、C150,C154,C159/C172、C117/C172、C33-C36，包含真核表达SPRR2A所形成的五对二硫键。

表3 Trx-SPRR2A的二硫键分析

2.8 Trx-SPRR2A的血清稳定性分析

如图6所示，Trx-SPRR2A经过48 h的CO₂细胞培养箱中孵育后，在预期的位置均成功检测到清晰的目的蛋白条带。这一结果表明，Trx-SPRR2A在两种不同pH值的情况下均具有较高的稳定性。为了更精确地评估Trx-SPRR2A的稳定性，我们进行了灰度分析，结果显示，经过48小时与不同pH值的完全培养基共同孵育后，Trx-SPRR2A未表现出显著的降解现象。值得注意的是，目的蛋白的条带强度始终保持在90%以上，这一数据充分说明，无论是在中性还是酸性环境下，Trx-SPRR2A均展现出了卓越的血清稳定性，为进一步探索Trx-SPRR2A在生物医学领域的应用奠定了基础。

实施例2：Trx-SPRR2A的抗肿瘤活性评价

1 实验方法

1.1 细胞培养

选择两种常见的细胞系：乳腺癌细胞系（MCF-7细胞）与肝癌细胞系（HepG2细胞）。为了保证细胞的正常生长，我们需要为它们提供合适的培养基。MCF-7细胞通过含有10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素的DMEM 培养基培养，HepG2细胞则使用RPMI 1640培养基进行培养。二者均置于37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱。利用倒置显微镜定期观察细胞的贴壁情况与生长状态，当细胞生长达到80%的覆盖率时，进行新鲜培养基的更换或者传代，这样可以保证细胞继续正常生长，同时避免细胞过度拥挤导致生长受限。

1.2 FITC标记Trx-SPRR2A

（1）将FITC-SCN完全溶解于PBS缓冲液中，以配置1 mg/mL的FITC标记液。

（2）分别在含有1 mg Trx-SPRR2A的PBS缓冲液（pH 7.4）与MES缓冲液（pH 5.5）中，按照1:2的摩尔比例加入FITC标记液。随后利用相应的缓冲液使总体系达到1 mL。混合液在避光条件下置于三维摇床上，并在4 ℃温度下反应过夜。

（3）在反应完成后，将反应液用14 mL缓冲液进行稀释，并利用10 kDa的超滤离心管进行浓缩，使得体积降至1 mL以下，以除去未反应的FITC-SCN，经过上述操作，最终制备了FITC标记的蛋白样品，即FITC-Trx-SPRR2A。

（4）利用紫外可见分光光度计扫描获得吸收光谱，以评估标记效果。

1.3 荧光倒置显微镜检测Trx-SPRR2A的细胞内化行为

（1）在12孔板中放置已灭菌且完全干燥的盖玻片，将MCF-7细胞接种在12孔板中，每孔密度设定为1×10⁶个细胞，将此培养板置于37 ℃的恒温环境下进行过夜培养，以确保细胞的正常生长；

（2）通过pH值为7.4或6.5的无血清培养基将FITC-Trx-SPRR2A溶液稀释至1 μM；

（3）将原有培养基从细胞孔中彻底移除，随后将细胞分别置于以下四种培养基中进行培养：①pH值为7.4且不含胎牛血清的中性培养基；②pH值为6.5且不含胎牛血清的酸性培养基；③含有1 μM FITC-Trx-SPRR2A且pH 值为7.4的培养基；④含有1 μM FITC-Trx-SPRR2A且pH值为6.5的培养基，最后在细胞培养箱中静置孵育12小时；

（4）移除孔中原有的培养基，将4%的多聚甲醛加入其中，并在室温条件下保持30分钟，确保细胞得到充分固定；

（5）利用PBS缓冲液对细胞进行两次温和清洗，随后加入浓度为10 μg/mL的DAPI溶液160 μL，在室温下保持10分钟以完成孵育过程；

（6）从孔板中吸出DAPI，并用PBS对细胞进行两次温和洗涤，同时在载玻片上滴加10 μL抗荧光衰减封片剂，轻轻除去爬片上的多余液体，将其放置在已滴有抗荧光衰减封片剂的载玻片上，确保细胞面与封片剂充分接触，最后采用指甲油轻轻覆盖爬片周围，确保封片剂不会溢出并固定封片；

（7）采用荧光倒置显微镜进行观测，并捕获相关图像。

1.4 流式细胞术分析Trx-SPRR2A的细胞内化行为

（1）将MCF-7细胞分别以2×10⁶个细胞的密度均匀接种至6孔板，并将之置于CO₂培养箱中，进行过夜培养；

（2）将FITC-Trx-SPRR2A溶液在无血清培养基中稀释至1 μM，培养基的pH值分别为7.4和6.5。同时，设立不含FITC-Trx-SPRR2A的中性和酸性培养基作为阴性对照。所有样品均置于恒温37 ℃的环境中，进行为期12 h的孵育；

（3）废弃培养基，利用PBS进行两次温和洗涤，随后利用0.25%的胰蛋白酶消化与含10%血清的正常培养基中止消化过程，之后，将细胞悬液小心转移至4 mL EP管中，3000 rpm离心5 min；

（4）倒掉培养液的上清部分，用PBS溶液对细胞进行两次清洗；

（5）利用流式细胞仪进行检测和分析。

1.5 MTT检测细胞活力

（1）将MCF-7细胞和HepG2细胞以每孔3×10³个细胞的密度均匀接种在96孔板中，随后将此板放入温度设定为37 ℃培养箱中，进行过夜培养。

（2）通过含有10%胎牛血清（FBS）的pH 7.4或pH 6.5培养基，将Trx-SPRR2A按照40μM、20 μM、10 μM、5 μM的浓度依次进行梯度稀释。

（3）废弃培养基，每孔分别加入100 μL含不同浓度Trx-SPRR2A的pH 7.4或pH 6.5的培养基，置于CO₂培养箱中培养12 h。

（4）移除液体，使孔内无残留，随后，在每孔中加入100 μL 无血清培养基，同时加入20 μL MTT溶液，该溶液的浓度为5 mg/mL，接着将96孔板放置于37 ℃培养箱持续孵育4小时。

（5）移除孔内混合物，各孔加入150 μL DMSO，并在室温下进行10 min的振荡处理。

（6）使用酶标仪在570 nm波长下测量细胞的光吸收值，并基于这些数据计算细胞的相对活力。

1.6 结晶紫染色检测细胞活力

（1）以每孔5×10³个细胞的密度，将MCF-7细胞均匀接种至96孔板中，随后将板置于37 ℃的培养箱中进行过夜培养。

（2）通过含有10%胎牛血清（FBS）的pH 7.4或pH 6.5的DMEM培养基，将Trx-SPRR2A按照40 μM、20 μM、10 μM、5 μM的浓度依次进行梯度稀释。

（4）移除液体，使孔内无残留，随后，用PBS溶液对细胞进行两次清洗后在各孔中加入50 μL的5%结晶紫溶液，将96孔板放置于37 ℃摇床中孵育20 min，以确保结晶紫能够充分染色。

（5）将结晶紫溶液吸出，并PBS进行3次清洗。

（6）将96孔板倒置放置在滤纸上方，于室温下晾晒一晚使其干燥。

（7）在完成显微镜图像采集后，向每孔加入200 μL甲醇以使其中的结晶紫得到充分溶解。接着，将孔板置于振荡器中进行15分钟的振荡处理。

（8）采用酶标仪对570 nm波长的吸光度进行测定，同时以阴性对照作为基准，设定其吸光度为100%。进一步推算出细胞的相对活力。

1.7 Calcein-AM/PI染色检测细胞活力

（2）利用pH 7.4和pH 6.5的含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基将Trx-SPRR2A稀释至40 μM，同时设立不含Trx-SPRR2A的pH 7.4和pH 6.5的含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基作为阴性对照。置于CO₂培养箱与细胞共孵育12 h。

（3）分别将染色液A与染色液B以1:10的比例通过试剂C进行稀释。随后将经过稀释的染色液A按100:1的比例利用无血清培养基再次稀释混合，从而制备染色工作液A（Calcein-AM）。同样地，按照1000:1的比例，将经过稀释的染色液B利用无血清培养基进行再次的稀释与混合，进而制备染色工作液B（PI）。

（4）将96孔板置于离心机中，以1000 rpm的转速进行离心，持续时间为5 min。离心结束后，吸走孔中的液体。接着，用PBS溶液进行温和洗涤，重复此操作两次。每次洗涤后，将96孔板再次进行离心。自此步骤起，任何PBS洗涤环节均需进行离心。

（5）向每个孔内添加50 μL Calcein-AM染色工作液，进行30分钟的避光染色处理。完成染色后，将染色液吸出。接着，利用50 μL PI染色工作液染色后PBS清洗两次。最后采用荧光倒置显微镜捕捉图像。

1.8 细胞膜通透性检测

（1）以每孔1×10⁶个细胞的密度，将MCF-7细胞均匀接种至12孔板中，随后将板置于37 ℃的培养箱中进行过夜培养。

（2）通过含有10%胎牛血清（FBS）的pH 6.5的DMEM培养基，将Trx-SPRR2A按照30 μM、20 μM、10 μM的浓度依次进行梯度稀释。使用不含Trx-SPRR2A的酸性培养基作为阴性对照，置于37 ℃环境中，进行过夜孵育。

（3）胰酶消化细胞后离心收集细胞，利用PBS进行两次温和洗涤。

（4）向每个孔内添加50 μL PI染色工作液，4 ℃避光孵育5分钟，弃去染色液。

（5）运用流式细胞术对细胞膜通透性进行检测。

1.9 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡

通过流式细胞仪对细胞凋亡进行分析：

（2）通过pH值为7.4或6.5的无血清DMEM培养基将Trx-SPRR2A溶液稀释至10、20和40 μM，使用不含Trx-SPRR2A的中性或酸性培养基作为阴性对照，置于37 ℃环境中，进行过夜孵育。

（3）胰酶消化细胞后通过离心操作收集细胞，为确保细胞的纯净度，利用PBS对细胞进行两次温和洗涤。

（4）Annexin V-FITC染色液与1×Annexin V结合液以1：200的比例混合，然后将400 μL的稀释液添加至各平行细胞中，在4 ℃环境下，将样品置于避光条件下进行孵育，持续时间为15 min。接下来，向样品中加入适量的PI染液，并在相同条件下继续孵育5 min。

（5）运用流式细胞技术对各类细胞的粘比进行定量统计和分析。

荧光倒置显微镜观察细胞凋亡：

（1）以每孔1×10⁵个细胞的密度，将MCF-7细胞均匀接种至24孔板中，随后将板置于37 ℃的培养箱中进行过夜培养。

（3）移除液体，使孔内无残留，利用PBS进行两次温和洗涤。

（4）Annexin V-FITC染色液与1×Annexin V结合液按照1：200的体积比进行混合，然后将200 μL的稀释液添加至各平行细胞中，4 ℃下避光孵育15分钟。随后加入PI染液，继续孵育5分钟。

（5）利用荧光倒置显微镜捕获相关图像。

2 结果

2.1 FITC标记Trx-SPRR2A

我们对Trx-SPRR2A进行了FITC标记，并借助紫外可见分光光度计对标记后的蛋白进行了检测。如图7所示，未标记的Trx-SPRR2A在280 nm处呈现出强烈的蛋白质特征吸收峰。而对于经过FITC标记的Trx-SPRR2A，除了保留蛋白的280 nm特征峰外，还在495 nm附近显现出FITC的信号峰，这一结果证实FITC已成功连接到Trx-SPRR2A上，使我们能通过荧光显微镜或流式细胞仪对FITC-Trx-SPRR2A进行观察与检测。

2.2 Trx-SPRR2A的细胞内化行为

为了检验Trx-SPRR2A能否成功进入肿瘤细胞内，我们对MCF-7细胞的Trx-SPRR2A的摄取状况进行了检测。首先，在pH 7.4和pH 6.5条件下，分别将FITC-Trx-SPRR2A与MCF-7细胞共同培养3小时。我们利用流式细胞仪对细胞的FITC荧光强度进行测定。如图8所示，在中性环境下，Trx-SPRR2A处理组的荧光强度相对较低。然而，在弱酸性条件下，Trx-SPRR2A处理组的荧光信号明显增强，上述结果与荧光倒置显微镜检测结果相互印证，表明在正常生理条件下，FITC-Trx-SPRR2A不易进入细胞；而在酸性环境下，FITC-Trx-SPRR2A能够有效地内化至细胞内。同样，我们使用倒置荧光显微镜对细胞内化情况进行了检测。我们观察到在不同pH条件下，FITC-Trx-SPRR2A的摄取情况存在明显差异。在中性条件下，FITC-Trx-SPRR2A处理组的细胞内荧光信号较弱，表明FITC-Trx-SPRR2A在正常生理环境下不易进入细胞。然而，在pH 6.5的酸性环境下，FITC-Trx-SPRR2A处理组的细胞内绿色荧光信号明显增强，这一结果表明，在酸性条件下，FITC-Trx-SPRR2A能够有效地进入细胞。总之，本研究通过检测不同条件下FITC-Trx-SPRR2A被MCF-7细胞内的摄取状况，证实了酸性环境有助于该蛋白进入肿瘤细胞。由于肿瘤微环境呈弱酸性特征，这对于Trx-SPRR2A发挥抗肿瘤活性是十分有利的。

2.3 MTT检测细胞活力

如图9所示，Trx-SPRR2A对两种细胞的抑制作用均呈现出一定的剂量依赖性，即随着药物浓度的增加，Trx-SPRR2A对两种细胞的抑制作用逐渐增强。且弱酸性环境下的Trx-SPRR2A比pH 7.4时具有更强的肿瘤杀伤力。具体而言，在酸性条件下，40 μM的Trx-SPRR2A处理后，MCF-7细胞和HepG2细胞的存活率分别为46.91%、52.85%，表明MCF-7细胞对Trx-SPRR2A的敏感性较高。综上所述，本研究证实了Trx-SPRR2A在弱酸性条件下可有效抑制两种肿瘤细胞的增殖。同时，我们也认识到不同类型肿瘤细胞对Trx-SPRR2A的敏感性可能存在差异，这为后续的抗肿瘤活性研究提供了参考。

2.4 结晶紫染色检测细胞活力

如图10a所示，在两种pH条件下，Trx-SPRR2A对MCF-7细胞生长的抑制均表现出浓度依赖性。但在弱酸性条件下，Trx-SPRR2A对MCF-7细胞生长的抑制作用更加明显。进一步地定量分析也证实了这一现象。如图10b所示，与中性条件相比，pH 6.5条件下的Trx-SPRR2A均表现出对MCF-7细胞更为显著的细胞毒性，尤其是在40 μM的浓度下，Trx-SPRR2A使得细胞存活率降低至49.28%。这些结果表明，在酸性环境下，Trx-SPRR2A对肿瘤细胞生长的抑制效果更加明显。

2.5 Calcein-AM/PI染色检测细胞活力

如图11显示，在pH7.4的条件下，Trx-SPRR2A处理组的大部分细胞呈现绿色荧光，少数细胞显示微弱的红色荧光；而在酸性条件下，大部分细胞发出强烈的红色荧光，这说明大部分细胞已经死亡。此结果表明，Trx-SPRR2A在弱酸性条件下对MCF-7细胞的杀伤效果尤为显著。

2.6 细胞膜通透性检测

结果如图12所示，在酸性条件下，经20 μM与30 μM Trx-SPRR2A处理1 h后，MCF-7细胞中的PI摄取率显著高于对照组，PI阳性细胞率分别达到41.29%和65.99%，表明Trx-SPRR2A可以在1 h之内快速有效地破坏细胞膜，从而导致细胞死亡。此外，我们还观察到Trx-SPRR2A引起的细胞膜通透性具有剂量依赖性。该结果证实：Trx-SPRR2A通过破坏细胞膜的完整性来发挥抗肿瘤效应。

2.7 Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡

如图13a所示，弱酸性环境下，Trx-SPRR2A处理组的细胞凋亡率相较于中性条件有所提高，且在40 μM时达到30.86%。为了进一步验证这一结果，我们通过荧光倒置显微镜采集了细胞图像，如图13b所示，与流式细胞仪检测结果一致。当细胞与含有Trx-SPRR2A的pH6.5的DMEM培养基中孵育后，胞内的绿色荧光和红色荧光强度均显著增强，表明凋亡细胞比例增加；而中性条件下处理组细胞中的绿色荧光和红色荧光强度均相对较弱。以上研究结果表明，Trx-SPRR2A可在弱酸性条件下有效诱导MCF-7细胞凋亡。这为进一步研究Trx-SPRR2A的抗肿瘤作用机制提供了实验依据。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形在内。

Claims

1.Trx-SPRR2A蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述Trx-SPRR2A蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌和肝癌。

3.根据权利要求2所述Trx-SPRR2A蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

4.根据权利要求3所述Trx-SPRR2A蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述辅料选自稀释剂、填充剂、稳定剂、渗透压调节剂、pH调节剂和防腐剂中的一种或多种。