TW200840592A - New Aβ conformer selective anti-Aβ globulomer monoclonal antibodies - Google Patents

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TW200840592A
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Heinz Hillen
Andreas R Striebinger
Boris Labkovsky
Ulrich Ebert
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Abbott Lab
Abbott Gmbh & Co Kg
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Description

200840592 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於可用於治療及診斷阿茲海默氏病 (Alzheimer’s Disease)之單株抗體。詳言之，本發明係關於 稱為10F4及3C5之單株抗體及係關於其他與其具有相似特 性之單株抗體（例如’氣抗體、人類抗體或人源化抗體）。 本申請案主張2006年11月30曰申請之美國臨時申請案第 60/872,156號之優先權，該案之全文以引用的方式併入本 文中。 【先前技術】 在1907年，Alois Alzheimer醫生首先描述一種形式癡呆 之神經病理學特徵，隨後為紀念他將其命名為阿茲海默氏 病（AD) 5羊曰之’ AD為老年人中癡呆之最常見起因，在 彼等65歲以上之人群中發病率約丨〇%。隨著年齡之增加， 疾病之機率亦上升。世界上，約有15〇〇萬人受該疾病影 響，且在未來數十年内預計預期壽命之進一步增加使受疾 病影響之人數增加至約三倍。 、 自分子觀點來看，阿兹海默氏病（AD)特徵為異常聚集之 蛋白質的沈積。在細胞外澱粉樣斑塊之情況下，該等沈積 大多由殺粉樣♦肽纖維組成，且在細胞内神經原纖維纏結 (NFT)之情況下，大多由，白組成。殿粉樣以部）狀藉由 蛋白水解分裂自β-殿粉樣前驅體蛋白中產生。此分裂由數 個命名為α…β-及γ-分泌酵素之蛋白酶的合作活性實現。 刀衣產生大量不同長度之特定片段。殿粉樣斑塊大多由呈 有4〇或42個胺基酸（Α陶、Αβ42)長度之肽組成。顯性分裂 127174.doc 200840592 產物為Αβ40 ·，然而，Αβ42具有更強的毒性作用。極類似 於在阿兹海默氏病中觀察到之彼等情況之大腦澱粉樣沈積 及認知障礙亦為唐氏症候群（Down’s syndrome)(第21對染 色體二體症（trisomy 21))之標諸，其發生頻率為8 〇〇個出生 人口中約1個。
Hardy及Higgins的澱粉樣級聯假說假設增加Αβ(1-42)之 產生將導致基原纖維及原纖維（亦即，Αβ斑塊之主要組份） 形成’該等原纖維為形成阿茲海默氏病症狀之原因。儘管 礙呆嚴重I*生與沈積之Α β斑塊負何之間的弱相關性，但此假 設直至最近仍受歡迎。AD大腦中可溶性Αβ形式（其與AD 症狀之相關性與斑塊負荷與AD症狀之相關性相比較佳）之 發現已導致經修正之澱粉樣級聯假說。
用Αβ肽之自動免疫導致形成減少以及導致存在之斑塊部 分溶解。同時，其導致ΑΡΡ轉殖基因小鼠模型之認知缺陷 減輕。對於用針對Αβ肽之抗體的被動免疫而言，亦得到 Αβ斑塊負荷之減少。用αν_1792(凝集之原纖維病狀中之 Αβ(1-42)肽）自動免疫之階段„a試驗的結果（ELAN
Corporation Pic，South San Francisco，CA，USA 及
Dublm ’ UK)暗示針對Αβ肽之免疫療法係成功的。在3〇個 患者之子群t，由MMSE&DAD指數量測，使用陽性抗Ap 抗體力價之患者的疾病進程顯著降低。然而，由於呈腦膜 腦炎形式之嚴重副作用已停止此研究（Bennett及
Holtzman ’ 2005，Neurology，64，10_12)。詳言之，腦膜 腦炎特徵為神經發炎及丁細胞滲透至腦中。大概地，此歸 127174.doc 200840592 因於由注射作為抗原之Αβ(1-42)誘導之T細胞免疫反應。 在被動免疫之後不期望該免疫反應。迄今為止，未獲得關 於此之臨床資料。然而，根據該免疫之被動方法，由於對 極老ΑΡΡ23小鼠之臨床前之研究，關於副作用概況之顧慮 已有人予以陳述，在該等研究中該等小鼠每週一次地接受 對準Αβ(1-42)之Ν末端抗原決定基之抗體歷經5個月。詳言 之，與用生理食鹽水處理之對照動物相比該等小鼠顯示微 出血之數量及嚴重性之增加（Pfeifei*等人，2002， Science，298，1379)。亦描述極老（>24個月）之 Tg2576及 PDAPP小鼠中之微出血之相應增加（Racke等人，2005，J Neurosci ，25 ，629-636 ; Wilcock 等人，2004，J.
Neuroinflammation j 1 (1):24 ; De Mattos 等人，2004， Neurobiol. Aging 25(S2):577)。在兩個小鼠菌株中，抗體 注射導致微出血顯著增加。相反，對準Αβ( 1-42)肽中心區 域之抗體並不誘導微出血（de Mattos等人之前述文獻）。誘 導微出血之缺乏與不以CAA形式與所凝集之Αβ肽結合之抗 體治療有關（Racke 等人，J Neurosci，25，629-636)。然 而，仍未理解導致APP轉殖基因小鼠微出血之精確機制。 大概地，大腦澱粉樣血管病變（CAA)誘導或至少加重大腦 出血。CAA幾乎存在於每個阿茲海默氏病腦中且認為約 20%之病例為’’嚴重CAA”。因此被動免疫目的應在於藉由選 擇認出Αβ肽之中心或羧基末端區域之抗體來避免微出血。 國際專利申請公開案第WO 2004/067561號描述穩定的 Αβ(1-42)募聚物（Αβ(1-42)球體）及特定對準該等球體之抗 127174.doc 200840592 體。用非特定蛋白酶消化顯示可由自球狀核心結構伸出之 親水性N末端開始消化Αβ球體（Barghorn等人，2005，J Neurochem，95，83 4-847)。該等N末端截斷之Αβ球體 (Αβ(12-42)及Αβ(20-42)球體）表示此募聚Αβ之基本構造單 元且為用於兔子及小鼠從而導致高抗體力價之自動免疫的 極有效抗原（WO 2004/067561)。活體内Ν末端截斷之Αβ形 式之推定病理學作用已藉由其於AD腦中存在之數個最近 報導提出（Sergeant等人，2003，J Neurochem，85，1581-1591 ; Thai等人，1999，J Neuropathol. Exp Neurol，58，210-216)。在 活體内消化期間，可包括例如奈溶酶（neprilysin)(NEP 24.11)或胰島素降解酶（IDE)之於腦中得到之某些蛋白酶 (Selkoe，2001，Neuron，32，177-180)。 鑒於以上所述，對具有（即使存在任何副作用，亦）極少 副作用（例如，微出血）之阿茲海默氏病治療法存在巨大及 即刻需要。經過該治療之受影響患者可能能夠保持功能的 及主動的生活方式超過未經該治療而可能保持的時間多 年。因此，不僅對於患者亦對於其照顧者而言，不僅存在 用於該治療之財務含義亦存在”生活品質”含義。 本文所參考之所有專利及公開案均以全文引用的方式併 入本文中。 【發明内容】 本發明涵蓋對準Αβ球體之抗體，當同時僅與腦中總體量 Αβ肽之小部分反應時，其改善免疫治療中患者之認識能1 力。該等特性預防大腦Αβ平衡之實質干擾且產生較少副作 用。（舉例而言，已於用Αβ肽自動免疫之研究中在用ΑΝ- 127174.doc 200840592 1792(在凝集之原纖病狀中之Αβ(1·42)肽）自動免疫之凝集 的原纖病狀中觀察到腦體積之治療上可疑之減小（ELAN Corporation Pic，South San Francisco，CA，USA及 Dublin，UK)。 此外，在此試驗中，觀察到呈腦膜腦炎形式之嚴重副作 用）。 詳言之，本發明藉由提供具有高Αβ球體親合力之Αβ球 體抗體來解決以上所記錄之副作用問題。該等抗體能夠區 別其他形式之Αβ肽，尤其為單體、原纖維及sAPPci形式之 Αβ肽。另外，本發明之抗體亦藉由僅與非CSF澱粉樣β結 合來排斥腦脊髓液（CSF)中之澱粉樣β。另外，與已知抗體 (亦即，6Ε10)相比本發明之抗體（例如，10F4及3C5)較少與 Αβ-斑塊及血管Αβ結合。 詳言之，本發明涵蓋與至少一種選自由存在於腦脊髓液 (CSF)中之Αβ(1-42)肽與b)存在於CSF中之Αβ(1-40)肽組成 之群的β澱粉樣蛋白相比對Αβ(1-42)球體具有較高親合力 之經分離抗體。 本發明亦包括對Αβ(1·42)球體具有結合親合力之經分離 抗體，該結合親合力大於對至少一種選自由a)Αβ( 1-42)單 體、b)AP(l-40)單體、〇Αβ(1-42)原纖維及d)可溶性澱粉樣 前驅體蛋白-a(sAPPa)組成之群的β殿粉樣蛋白之結合親合 力。此抗體以與結合至存在於CSF中之β澱粉樣蛋白相比更 大之親合力與存在於非CSF中之β澱粉樣蛋白結合。 上述抗體可為（例如）鼠抗體、單株抗體、重組抗體、人 類抗體及/或人源化抗體。另外，本發明之抗體中之任何 127174.doc -10- 200840592 一或多者可與至少一種抗原決定基結合，其為相同抗原決 定基，單株抗體10F4(可自由美國菌種保存中心（American Type Culture Collection)寄存編號PTA-7808表示之融合瘤 獲得）或單株抗體3C5(可自由美國菌種保存中心存款編號 PTA-7406表示之融合瘤獲得）與其結合。 另外，本發明包括包含SEQ ID NO:5之經分離抗體、包 含SEQ ID NO:6之經分離抗體及包含SEQ ID NO:5與SEQ IDNO:6兩者之經分離抗體。 另外，本發明涵蓋包含SEQ ID ΝΟ·.7之經分離抗體、包 含SEQ ID ΝΟ:8之經分離抗體及包含SEQ ID ΝΟ:7與SEQ IDNO:8兩者之經分離抗體。 上述本發明之抗體可包含至少一個選自由以下胺基酸序 列組成之群的胺基酸序列：a)可自由美國菌種保存中心寄 存編號PTA-7808表示之融合瘤獲得的單株抗體（10F4)之重 鏈CDR3之胺基酸序列及之輕鏈CDR3之胺基酸序列及b)可 自由美國菌種保存中心寄存編號PTA-7406表示之融合瘤獲 得的單株抗體（3C5)之重鏈CDR3之胺基酸序列及之輕鏈 CDR3之胺基酸序列。 另外，上述本發明之抗體可包含至少一個選自由以下胺 基酸序列組成之群的胺基酸序列：a)可自由美國菌種保存 中心寄存編號PTA-7808表示之融合瘤獲得的單株抗體 (10F4)之重鏈CDR2之胺基酸序列及輕鏈CDR2之胺基酸序 列及b)可自由美國菌種保存中心寄存編號PTA-7406表示之 融合瘤獲得的單株抗體（3C5)之重鏈CDR2之胺基酸序列及 127174.doc -11- 200840592 輕鏈CDR2之胺基酸序列。 上述本發明之抗體亦可包含至少一個選自由以下胺基酸 序列組成之群的胺基酸序列：a)可自由美國菌種保存中心 寄存編號PTA-7808表示之融合瘤獲得的單株抗體（10F4)之 重鏈CDR1之胺基酸序列及輕鏈CDR1之胺基酸序列及b)可 自由美國菌種保存中心寄存編號PTA-7406表示之融合瘤獲 得的單株抗體（3C5)之重鏈CDR1之胺基酸序列及輕鏈 CDR1之胺基酸序列。 ® 此外，本發明亦包括包含至少一種選自由以下胺基酸序 列組成之群的CDR之經分離抗體：a)SHYAWN、 b)YIDYSGSTRYLPSLKS、c)GSGYFYGMDY、d)HASQNINVWLS、 e)KASNLHT、f)QQGQSYPYT、g)NYLIE、h)VINPGSGDTNYNENFKG、 i)GVITTGFDY、j)RASGNIHNYLA、k)NAKTLAD及 1)QHFWSSPRT 〇 另外，本發明涵蓋由美國菌種保存中心寄存編號PTA-7808表示 之融合瘤以及 可自由 美國菌 種保存 中心寄 存編號 I PTA-7808表示之融合瘤獲得或由美國菌種保存中心寄存編 號PTA-7808表示之融合瘤產生之單株抗體（10F4)。 本發明亦包括由美國菌種保存中心寄存編號PTA-7406表 示之融合瘤以及可自由美國菌種保存中心寄存編號PTA-7406表示之融合瘤獲得或由美國菌種保存中心寄存編號 PTA-7406表示之融合瘤產生之單株抗體（3C5)。 此外，本發明包括編碼如上所述抗體之經分離核酸分 子。該分子之核苷酸序列可包含至少一個選自由SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 及 SEQ ID NO:4 組成之 127174.doc -12- 200840592 群的序列。本發明亦包括包含經分離核酸分子之載體以及 包含該載體之宿主細胞。 另外，本發明包括製備抗體之方法，其包含在適合於產 生如上所述抗體中之任一者之時間及條件下在培養基中培 養如上所述宿主細胞。依據此方法產生之抗體亦包括於本 發明之範疇内。 本發明亦包括包含如上所述抗體中之任何一或多種之組 合物。此組合物可另外包含醫藥學上可接受之載劑。
另外，本發明涵蓋包含由至少一個選自由SEQ ID ΝΟ··1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 及 SEQ ID NO:4 組成之 群的核音SiL序列編碼之胺基酸序列之单株抗體。此抗體可 選自由藉由以美國菌種保存中心寄存編號pTA_74〇6表示之 融合瘤產生之單株抗體及藉由以美國菌種保存中心寄存編 號PTA-7808表示之融合瘤產生之單株抗體組成的群。抗體 亦可包含至少一個選自由SEQ ID NO:5、SEQ ID N〇:6、 SEQ IDNO:7及SEQ IDNO:8組成之群的胺基酸序列。 本發明亦包括治療或預防需要該治療或預防之患者的殿 粉樣變性病之方法。此方法包含以足以實現治療或預防之 量向患者投與上述抗體（經由被動免疫法）中之一或多者。 殿粉樣變性病可為（例如）阿茲海默氏病或唐氏症候群澱粉 樣變性病。 本發明亦涵蓋在具有澱粉樣變性病之患者腦中與β澱粉 樣蛋白之至少一種抗原決定基結合之經分離抗體。此抗體 可由（例如）具有選自由ΡΤΑ-7406及ΡΤΑ-7808組成之群的 127174.doc •13- 200840592 ATCC寄存編號之融合瘤產生。 本發明亦包括在懷疑患有阿兹海默氏病之患者中診斷阿 兹海默氏病之方法。此方法包含以下步驟：自患者分離生 物樣品（例如，CSF樣品或腦組織樣品）’·在足以形成抗原/ 抗體複合物之時間及條件下使生物樣品與如上所述抗體中 之一或多者接觸；及偵測樣品中抗原/抗體複合物之存 在’複合物之存在指示患者中阿茲海默氏病之診斷。複合 籲 物之抗原可為（例如）球體。 口 另外，本發明涵蓋在懷疑患有阿茲海默氏病之患者中診 斷阿兹海默氏病之另一種方法。此方法包含以下步驟··自 患者分離生物樣品；在足以形成抗體/抗原複合物之時間 及條件下使生物樣品與抗原接觸；在足以使得結合物與細 胞結合性抗體結合之時間及條件下將結合物添加至所得抗 體/抗原複合物中(其中結合物包含與能夠產生可偵測信號 之#號產生化合物連接之本發明之經分離抗體）；及藉由 • ㈣由信號產生化合物產生之信號來债測可能存在於生物 樣品中之抗體的存在，該信號指示患者中阿兹海默氏病之 診斷。用於檢定之抗原可為（例如）球體。 另外，本發Β月包括在懷疑患有阿兹海默氏病之患者中診 斷阿茲海默氏病之其他方法。此方法包含以下步驟：自患 者分離生物樣品；在足以使得形成抗-抗體/抗原複合物之 條件下使生物樣品與抗-抗體接觸（其中該抗_抗體對於本發 明之抗體中之一或多者具特異性），複合物含有存在於生 物樣〇口中之抗體，在足以使得結合物與細胞結合性抗體結 127174.doc -14 - 200840592 合之時間及條件下將結合物添加至所得抗-抗體/抗原複合 物中（其中該結合物包含與能夠產生可偵測信號之信號產 生化合物結合之抗原）；及偵測由信號產生化合物產生之 信號，該信號指示患者中阿茲海默氏病之診斷。 另外，本發明包括包含本發明之抗體中之一或多者及醫 藥學上可接受之佐劑之疫苗。 另外，本發明涵蓋鑑別適於預計將產生阿茲海默氏病之 患者自動免疫之化合物的方法。此方法包含以下步驟··在 足以使一或多種化合物與一或多種抗體結合之時間及條件 下將所關注之一或多種化合物暴露於本發明之抗體中之一 或多者下，及隨後鑑別與一或多種抗體結合之彼等化合 物，該經鑑別化合物將用於預計產生阿茲海默氏病之患者 自動免疫。 本發明亦包括包含以下之套組：本發明抗體中之一或多 者及包含與信號產生化合物連接之抗體的結合物，其中該 結合物之抗體不同於套組内之一或多種抗體。亦可將描述 待使用以進行檢定之程序以及該套組之組份的藥品說明書 包括於套組中。 本發明亦包括包含以下之另一套組：對於本發明之一或 多種抗體之抗-抗體及包含與信號產生化合物連接之抗原 的結合物。抗原可為（例如）球體。此外，可將描述待使用 以進行檢定之步驟以及該套組之組份的藥品說明書包括在 内。 【實施方式】 127174.doc -15- 200840592 用如實例1中所描述之戴斷球體Αβ( 12-42)自免疫來設計 本發明之抗體。詳言之，產生單株抗體3C5及10F4抵抗截 斷之（12-42)球體（與已產生以抵抗Αβ(1-42)球體之單株抗體 8F5 及 8C5相反）。與描述於 Barghorn 等人（J. Neurochem， 95 ’ 834_847)及實例3，第6部分中之程序相反，直接由 Αβ12-42肽產生此Αβ(12-42)球體，其中該（12-42)球體藉由 有限蛋白水解由預存在之1-42球體產生。該等兩個Αβ( 12-42)球體變化在其最終凝集圖案上不同。由Αβ(12-42)肽產 生之Αβ( 12-42)球體僅顯示中間球體形式（如於w〇 2004/067561中所述之”募聚物Α”）且由預存在之Αβ(1-42)球 體產生之Αβ( 12-42)球體為成熟球體（如於w〇 2004/067561 所述之”寡聚物Β”）。 本發明之目的為提供對準Αβ球體之抗體，當同時僅與腦 中Αβ肽之總夏;的小部分反應時，其改善免疫治療中患者之 認識能力。此預計預防大腦Αβ平衡之實質干擾且產生較少 副作用。（舉例而言，如上所述，已在於凝集之原纖病狀 中用Αβ肽自動免疫之研究（使用ανι 792之ELAN試驗）中觀 察到細量之治療上可疑之減小。此外，在此試驗中，觀察 到呈腦膜腦炎形式之嚴重副作用）。本發明藉由提供具有 高Αβ球體親合力之球體—特定抗體來解決此問題。該等抗 體能夠鑑別其他形式之Αβ肽，尤其為單體及原纖維形式之 Αβ肽。另外，該等抗體不與大腦脊髓液中之澱粉樣β結合 (或以與市售抗體（諸如6Ε10)相比較低之親合力結合（Signet 目錄號：9320))。因此，本發明係關於對Αβ球體具有結合 127174.doc •16- 200840592 親合力之抗體。 本文之術語"Αβ(Χ-Υ)"係指由人類β澱粉樣蛋白之胺基酸 位置X至胺基酸位置Υ(包括X與Υ兩者）之胺基酸序列，尤 其係指由以下胺基酸序列之胺基酸位置X至胺基酸位置Υ 之胺基酸序列：胺基酸序列DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV ΙΑΤ(相當於胺基酸位置1至 43)或其自然發生的變化中之任一者之，尤其為具有至少一種 選自由 Α2Τ、H6R、D7N、A21G(nFlemish")、E22G(nArcticn)、 • E22Q("Dutch")、E22K("Italian")、D23N("Iowa")、A42T及 A42V(其 中該等編號與Αβ肽之起始相關）組成之群的突變之彼等胺 基酸序列，其包括位置X及位置Y兩者或具有多達三個其 他胺基酸取代（其任一者均不可能阻止球體形成），較佳在 胺基酸12或X(任一高於12之數字）至胺基酸42或Y(任一低 於42之數字）之部分不具有其他胺基酸取代，且最佳在由 胺基酸20或Χ(任一高於20之數字）至胺基酸40或Υ(任一低 | 於40之數字）之部分不具有其他胺基酸取代之序列，本文 之"其他”胺基酸取代為任何自大體上未發現之規範序列之 偏差。 本文之術語πΑβ(1-42)”係指由人類β澱粉樣蛋白之胺基酸 位置1至胺基酸位置42之胺基酸序列（包括1及42兩者），尤 其係指胺基酸序列 DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV ΙΑ或其自然發生之變化中之任一者，尤其具 有至少一種選自由 Α2Τ、H6R、D7N、A21G("Flemishn)、 E22G(” Arctic”） 、 E22Q(”Dutch") 、 E22K("Italian")、 127174.doc -17- 200840592 D23N(nIowaM)、A42T及A42V(其中編號與Αβ肽之起始相 關）組成之群的突變之彼等胺基酸序列，其包括1及42兩者 或具有多達三個均不可能阻止球體形成之其他胺基酸取 代，較佳在由胺基酸20至胺基酸42之部分不具有其他胺基 酸取代之序列。同樣，此處，術語πΑβ(1-40)’’係指由人類β 澱粉樣蛋白之胺基酸位置1至胺基酸位置40(包括1及40兩 者）之胺基酸序列，尤其係指胺基酸序列DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV或其自然發生之 變化中之任一者，尤其具有至少一種選自由Α2Τ、H6R、 D7N、A21G("Flemish")、E22G(”Arctic”）、E22Q(”Dutch”）、 E22K(’’Italian”）及D23N(nIowa")(其中該等編號與Αβ肽之起 始相關）組成之群的突變之彼等胺基酸序列，其包括1及40 兩者或具有多達三個均不可能阻止球體形成之其他胺基酸 取代，較佳在由胺基酸20至胺基酸40之部分不具有其他胺 基酸取代之序列。 此處，術語”Αβ(12-42)"係指由人類β澱粉樣蛋白之胺基 酸位置12至胺基酸位置42(包括12及42兩者）之胺基酸序 列，尤其係指胺基酸序列VHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV ΙΑ或其自然發生之變化中之任一者，尤其 具有至少一種選自由 A21G("Flemish”）、E22G("Arctic”）、 E22Q(，，Dutch，，）、E22K(’，Italian，’）、D23N(”Iowan)、A42T及 A42V(其中該等編號與Αβ肽之起始相關）組成之群的突變 之彼等胺基酸序列，其包括12及42兩者或具有多達三個均 不可能阻止球體形成之其他胺基酸取代，較佳在胺基酸20 127174.doc -18 - 200840592 至胺基酸42之部分不具有其他胺基酸取代之序列。 本文之術語”Αβ(20-42)”係指由人類β澱粉樣蛋白之胺基 酸位置20至胺基酸位置42(包括20及42兩者）之胺基酸序 列，尤其係指胺基酸序列FAEDVGSNKGA IIGLMVGGVV ΙΑ或其自然發生之變化中之任一者，尤其具有至少一種選 自由 A21G(nFlemish”）、E22G(nArctic")、E22Q(nDutch")、 E22K(nItaliann)、D23N(nIowa，’）、A42T及 A42V(其中該等 編號與Αβ肽之起始相關）組成之群的突變之彼等胺基酸序 ® 列，其包括20及42兩者或具有多達三個均不可能阻止球體 形成之其他胺基酸取代，較佳不具有任何其他胺基酸取代 之序列。 本文之術語ηΑβ(Χ-Υ)球體"（Αβ(Χ-Υ)球狀寡聚物）係指如 上所定義之Αβ(Χ-Υ)肽的可溶球狀非共價締合，其具有均 質性及獨特物理特徵。根據一態樣，Αβ(Χ-Υ)球體為可藉 由用陰離子清潔劑培育獲得之Αβ(Χ-Υ)肽的穩定非原纖寡 聚組合。與單體及原纖維相反，該等球體特徵為子單元之 _ 所定義組合數（例如，如在WO 2004/067561中所述之初期 組合形式，η=4-6，”寡聚物Α”，及後期組合形式，η=12-14，”寡聚物Β")。球體具有3維球型結構（"熔融小球”，參 見 Barghorn 等人，2005，J Neurochem，95，834-847) 〇 其 另外特徵可為以下特徵中之一或多者： 具有產生截斷球體形式之混雜蛋白酶（諸如嗜熱菌蛋白 酶或胞内蛋白酶GluC)之N末端胺基酸X-23的可裂解性； 具有混雜蛋白酶及抗體之C末端胺基酸24-Y之非可達 127174.doc -19- 200840592 性； 該等球體之截斷形式保持在其球體構形中具有較佳核心 抗原決定基Αβ(20-Υ)可達性之該等球體之3維核心結構。
詳言之，根據本發明及為分析本發明抗體之結合親合力 之目的，本文之術語，，Αβ(Χ-Υ)球體π尤其係指可藉由如（例 如）以下存在之實例I中所述之方法獲得之產物。（參見WO 04/067561)。該方法可用以獲得Αβ( 1-42)球體、Αβ(12-42) 球體及Αβ(20_42)球體。較佳地，球體顯示與神經元細胞 之親合力。較佳地，球體亦展示神經調節效應。根據本發 明之另一態樣，球體由11至16個，且最佳12至14個Αβ(Χ-Υ)狀組成。 根據本發明之另一態樣，本文之術$吾π Αβ(Χ-γ)球辦"俾、 指大體上由Αβ(Χ-Υ)子單元組成之球體，其中若平均至小 11或12個子單元具有Αβ(Χ-Υ)類型則為較佳，若小於1〇〇/ 之球體包含任何非Αβ(Χ-Υ)肽則為更佳，且若非Αβ^χ力 肽之含量低於偵測臨限則為最佳。更特定言之，本文 \ <術 語” Αβ(1-42)球體”係指大體上由如上所定義之Αβ(1_42)^ 元組成之球體；本文之術語"Α β (12 - 4 2 )球體”係指大體上由 如上所定義之Αβ( 12-42)單元組成之球體；且本文夕4 八心術語 ” Αβ(20-42)球體”係指大體上由如上所定義之Αβ(2〇·42)單 元組成之球體。 如本文所用之術語丨’交聯Αβ(Χ-Υ)球體”係指可藉由朴、胤 屯％體 組分單元之交聯，較佳化學交聯，更佳醛交聯，最佳戊一 醛交聯自如上所述之Αβ(Χ-Υ)球體獲得之分子。在本發日月 127174.doc -20- 200840592 之另一態樣中’交聯球體大體上為其中單元至少部分藉由 共價鍵連接而非僅藉由非共價相互作用固持於一起之球 體。對於本發明之目的而言，詳言之交聯Ap(1_42)球體為 交聯Αβ(1-42)寡聚物。 詳言之，如本文所用之術語"Αβ(Χ_γ)球體衍生物"係指 藉由與易於偵測之基團，較佳螢光團，例如異硫氰酸螢光 素、藻紅蛋白、維多利亞水母螢光蛋白（Aequ〇rea viet(^a fluorescent protein)、Dictyosoma螢光蛋白或其任何組合或 螢光活性衍生物；發色團；化學發光團，例如螢光素酶， 較佳為螢火蟲螢光素酶、費氏弧菌螢光素酶或其任何組合 或化學發光活性衍生物；酶活性基團，例如過氧化酶（例 如，辣根過氧化酶）或其任何酶活性衍生物；電子緻密美 團，例如含重金屬之基團（例如，含金基團）；半抗原，例 如苯盼衍生之半抗原；強抗原結構’例如，預測為抗原之 肽序列（例如藉由Kolaskar及Tongaonkar之演算法預測為抗 原）；另-分子之適體；螯合基團，<列如六組胺基；調： 其他特殊蛋白·蛋白相互作用之天然或自然衍生之蛋白結 構’例如，fGs/jun對之部分；磁性基團，例如鐵磁性基 團；放射性基團，例如包含1H、、32p、35s或125j 團或其任何組合共價連接而標註之球體；或係指藉由^ 高親合力相互作用或藉由非共價高親合力相互作用，較佳 與易於鈍化、螯合、降解及/或沈澱之基團共價連接標二 之球體’較佳用促進活體内降解之基團標記之球體，更佳 用泛素標記之球體，若此經標記之寡聚物於活體内組合： 127174.doc -21- 200840592 為尤其較佳；或係指藉由任何上述之組合修改之球體。用 於使其與蛋白連接之該標註及標記之基團及方法在此項技 術中已知。可在球體化之前、期間或之後進行標註及/或 在本發明之另一態樣中，球體衍生物為可藉由標註 及/或標記反應自球體獲得之分子。相應地，本文之術語 "Αβ(Χ-Υ)單體衍生物”尤其係指如用於球體所述標註或標 記之Αβ單體。 本文之術^較大親合力"係指相互作用之程度，其中一 方面非結合抗體與非結合球體之間的平衡，另一方面非結 合抗體與抗體球體複合物之間的平衡進一步有利於抗體球 體複合物。同樣本文之術語”較小親合力”係指相互作用之 程度，其中一方面非結合抗體與非結合球體之間的平衡， 另一方面非結合抗體與抗體球體複合物之間的平衡進一步 有利於非結合抗體與非結合球體。術語”較大親合力”與術 語”較高親合力”同義且術語，，較小親合力”與術語，，較低親合 力η同義。 本文之術語”Αβ(Χ-Υ)單體"係指Α|3(χ_γ)肽之經分離形 式’較佳為大體上不參與與其他Ap肽之非共價相互作用之 Αβ^Χ-Υ)肽幵’式。實際上，通常以水溶液形式提供颂X· Υ)單體。在本發明之尤其較佳實施例中，單體水溶液含有 〇·〇5%至0.2%’更佳約0.1%之贿姻。在本發明之另一尤 其較佳實施财，單體水溶液含有〇 〇5%至〇 2%，更佳地 約(Μ%之NaC^當使糊如，用於敎本發明抗體之結 合親合力)時’可利於以適當方式稀釋該溶液。另外，通 127174.doc -22- 200840592 且特別地 常利於在其製備之後2小時内，尤其w小時内 在30分鐘内使用該溶液。
本文之術語•，原纖維”係指包含非共價相關之個別Αβ(χ· 取之組合的分子結構，該等Αβ(χ·γ)肽在電子顯微鏡中 顯示原纖維結構，其結合剛果紅且隨後在偏振光下展示雙 折射率且其X光繞射圖為交W結構。在本發明之另一態樣 :，原纖維為可在不存在清潔劑下（例如，在Μ聰中） 藉由包含合適Αβ肽之自誘導聚合凝集從而導致大於24個單 元’較佳大於1〇〇個單元形成;疑#之方法獲得之分子結 構m在此項技術中熟知。便利地，Αβ(χ_γ)原纖維 以水溶液形式使用。在本發明之_尤其較佳實施例中原 纖維水溶液藉由在〇.1% ΝΗ4〇Η中溶解Αβ肽’將其用2〇 mM NaH2P〇4、14G mM NaCl(PH值為 7,4)以 1:4稀釋，之後
將PH值再調整至7.4,在37t下培育該溶液2〇 h，之後在 10000 g 下離心 10 min 且在 2〇 mM NaH2P〇4、14〇 mM
NaCl(pH值為7·4)中再懸浮來產生。 本文之術語，，Αβ(Χ-Υ)原纖維"係指大體上由Α|3(χ_γ)子單 元組成之原纖維，其中若平均至少9〇%之子單元具有 Αβ(Χ-Υ)類型則為較佳，若至少98%之子單元具有Αβ(χ_γ) 類型則為更佳且若非Αβ(Χ-Υ)肽之含量低於針測臨限則為 最佳。 本發明亦係關於與該等單株抗體（1〇F4及3 c5)中之任一 者具有相似結合概況之抗體。與該等單株抗體中之任一者 具有類似結合概況之抗體包括與相同抗原決定基（如單株 127174.doc -23- 200840592 抗體10F4及3C5)結合之抗體。 本發明亦係關於能夠與至少一種，較佳所有選自由1〇F4 及3C5組成之群的抗體對抗之抗體。本文之術語"對抗抗體，， 係指靶向相同分子或穩定但非共價連接之超分子實體，較 佳相同分子之大量抗體，其中至少一種抗體能夠較佳藉由 空間妨礙其他抗體之通向其目標抗原決定基之通道或藉由 在目標實體中誘導及/或穩定降低目標對於其他抗體之親 合力的構形，更佳藉由由以足夠極接近前者、與前者重疊 或相同於前者與抗原決定基結合來直接封閉通向其他抗體 之目標抗原決定基之通道，最佳與前者重疊或相同於前者 與抗原決定基結合來直接封閉通向其他抗體之目標抗原決 定基之通道，尤其相同於前者與抗原決定基結合來直接封 閉通向其他抗體之目標抗原決定基之通道來特定地降低另 一抗體之可量測的結合。若其共用其化學結構之一部分， 車父佳其胺基酸序列則兩個抗原決定基稱為”重疊"，且若其 化學結構，較佳地其胺基酸序列相同，則稱為，，相同”。因 此’本發明亦係關於其目標抗原決定基與選自由i〇F4及 3C5組成之群的抗體中之至少一者的目標抗原決定基重 4:，較佳相同之抗體。迄今為止，與該等單株抗體l〇F4及 3C5中之任一者具有相似結合概況之抗體包括包含至少一 郤刀該等單株抗體中之任一者之抗原結合部分之抗體。較 佳地’該等部分包含至少一種該等單株抗體中之任一者之 互補决疋區（CDR)。目&，根據其他特$實施例，本發明 係關於刀別包含單株抗體1〇1?4或3C5之重鏈〇〇们之胺基酸 127174.doc -24- 200840592 序列及/或輕鏈CDR3之胺基酸序列之抗體。該等抗體之 特定實例包括亦分別包含單株抗體10F4或3C5之重鏈 COR2之胺基酸序列及/或輕鏈CDR2之胺基酸序列之彼等 抗體。甚至更特定言之，該等抗體包括亦分別包含單株 抗體10F4或3C5之重鏈CDR1之胺基酸序列及/或輕鏈 CDR1之胺基酸序列之彼等抗體。在一態樣中，因此本發 明係關於包含重鏈之抗體，其中CDR3、CDR2及/或CDR1 區域包含單株抗體10F4或3C5之重鏈CDR3、CDR2及/或 CDR1之胺基酸序歹。在另一態樣中，因此本發明係關於 包含輕鏈之抗體，其中CDR3、CDR2及/或CDR1區域包含 單株抗體10F4或3C5之輕鏈CDR3、CDR2及/或CDR1之胺 基酸序列。 在一實施例中，本發明之抗體包含至少兩個可變區CDR 組。更佳地，兩個可變區CDR組係選自由以下組成之群： VH 10F4 CDR 組與 VL 10F4 CDR 組；VH 3C5 CDR 組與 VL 3C5 CDR組（參見圖 7a-7d) 〇 在另一實施例中，以上揭示之抗體進一步包含人類受體 構架。在一較佳實施例中，抗體為CDR接枝抗體。較佳 地，CDR接枝抗體包含以上所揭示之CDR中之一或多者。 較佳地，CDR接枝抗體包含人類受體構架。 在一較佳實施例中，抗體為人源化抗體。較佳地，人源 化抗體包含以上所揭示之CDR中之一或多者。更佳地，人 源化抗體包含以上所揭示之CDR中之三種或三種以上。最 佳地，人源化抗體包含6種以上所揭示之CDR。在一特定 127174.doc -25- 200840592 實施例中，將CDR併入人類受體構架之人類抗體可變區 中。較佳地，人類抗體可變區為一致人類可變區。更佳 地，人類受體構架包含至少一種在關鍵殘基上之構架區胺 基&L取代，其中關鍵殘基係選自由接近於CDR之殘基；糖 基化位點殘基；稀有殘基；能夠對(：〇11有影響之殘基；標 準殘基；重鏈可變區與輕鏈可變區之間的接觸殘基；微調 區（Vernier zone)内之殘基；及在Ch〇thia定義之可變重鏈 CDR1與Kabat定義之最初重鏈構架之間重疊的區域中之殘 基組成之群。較佳地，人類受體構架包含至少一種構架區 胺基&L取代，其中構架之胺基酸序列與該等人類受體構架 之序列至少65%相同且包含至少7〇個與該人類受體構架相 同之胺基酸殘基。在另一態樣中，本發明係關於包含如上 所定義之重鏈與輕鏈之抗體。較佳地，抗體包含至少一個 如上所述可變區。更佳地，抗體包含兩個如上所述可變 區，其中該等兩個可變區具有如圖7中所記錄之胺基酸序 列。 在另一態樣中，本發明之抗體包含選自由IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgE及人類 IgG1 Ala234 Ala235突變體恆定區組成之群的重鏈恆定區。詳言之，抗 體包含人類恆定區。較佳為包含IgGl重鏈恆定區之抗體。 在另一實施例中，抗體為糖基化的。較佳地，糖基化方 式為人類糖基化方式或由本文所揭示之真核細胞，尤其為 CHO細胞中之任一者產生之糖基化方式。 本發明亦係關於本發明抗體之結合抗原之部分。該等結 127174.doc -26- 200840592 合抗原之部分包括（但不限於）抗體之Fab片段、片段 及單鏈Fv片段。其他結合抗原之部分為Fab，片段、Fv片段 及二硫化物連接之Fv片段。 本發明亦提編碼本文所揭示抗體中之任一者之供經分離 核酸。其他實施例提供包含本文所揭示之經分離核酸之載 體。載體尤其可能係選自由pcDNA ; pTT(Dur〇cher等人，
Nucleic Acids Research 2002，第 30卷，第 2期）；pTT3(具 _ 有其他多個選殖位點之pTT) ; pEFBOS(MizuShima，S·及
Nagata, S·，（1990)Nucleic acids Research，第 18卷，第 17 期），pBV ; pJV ;及pBJ組成之群。 在另一恶樣中，由本文所揭示之載體轉型宿主細胞。較 佳地，佰主細胞為原核細胞。更佳地，宿主細胞為大腸桿 菌。在相關實施例中，宿主細胞為真核細胞。較佳地，該 真核細胞係選自由原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及 真菌細胞組成之群。更佳地，宿主細胞為包括（但不限 φ 於）CH〇及COS之哺乳動物細胞；或諸如釀酒酵母之真菌細 胞；或諸如Sf9之昆蟲細胞。 本發明之另一態樣提供產生本發明抗體之方法，其包含 在適於產生抗體條件下於培養基中培養本文所揭示之宿主 細胞或融合瘤中之任一者。另一實施例提供可由本文所揭 示之方法獲得之抗體。本發明之抗體可以自身已知之方式 獲得。全體含有由無數不同抗體特性組成之抗體清單之b 淋巴細胞為哺乳動物免疫系統之一部分。對特定抗原之正 常免疫反應意謂選擇與該抗原特定結合之該清單的—或多 127174.doc -27- 200840592 種抗體’且免疫反應之結果至少部分基於該等 別U最終消除）刺激抗原及在該等抗體之環境中忽視其他 分子t能力。特定鑑別一種特定目標抗原之抗體有效性已 V致早株抗體技術之發展。頭為彳 %展現在準化融合瘤技術可使得 對於所關心之抗原產生具有單—特性之抗體。近年來4 發展諸如活體外筛檢抗體庫之重組抗體技術。該等技術同 樣可使得產生對於所關注之抗原具有單__特性之抗體。 在本發明之方法中’可使得所關注之抗原活體内或活體 外作用於抗體清單。根據—實施例，可藉由用該抗原活體 内免疫動物使得抗原作用於該清單。此活體内方法可另外 包含自動物之淋巴細胞產生大量融合瘤且選擇分泌與該抗 原特定結合之抗體的特定融合瘤。待免疫之動物可為（例 如）小鼠、大鼠、兔子、雞、駱駝或羊或可為上述動物中 之任一者之轉殖基因型式，例如具有人免疫球蛋白之轉殖 基因小鼠’其在抗原刺激之後產生人類抗體。可免疫之其 Φ 他類型動物包括具有嚴重結合免疫缺陷（SCID)之小鼠，其 已用人類外周單核血細胞（篏合hu-PBMC SCID小鼠）或用淋 巴細胞或其前驅體重組，以及已用致死全身照射處理，隨 後用來自具有嚴重結合免疫缺陷之小鼠的骨髓細胞保護以 抵抗辕射且隨後用功能性人類淋巴細胞（”三聚體”系統）移 植之小鼠。待免疫之另一類型動物為在其基因組中已（例 如）藉由同源重組使編碼所關心抗原之内源性基因斷開（破 壞）’以便在用抗原免疫之後該動物將該抗原鑑別為外來 體的之動物（例如，小鼠）。由此方法產生之多株或單株抗 127174.doc -28 - 200840592 體藉由使用包括（但不限於）ELISA及點潰墨法技術之已知 篩檢方法特性化及選擇。 根據另一實施例，可藉由篩檢具有該抗原之重組抗體庫 使得抗原活體外作用於抗體清單。可（例如）在噬菌體之表 面上或在酵母細胞之表面上或在細菌細胞之表面上表現重 組抗體庫。在各種實施例中，重組抗體庫為（例如）8(：1^庫 或Fab庫。根據另一實施例，抗體庫表示為RNA-蛋白融 合。 馨 產生本發明抗體之另一方法包含活體内及活體外方法之 組合。舉例而言，可藉由活體内用該抗原免疫動物且隨後 用該抗原活體外篩檢由該動物之淋巴細胞（例如，含有重 鏈及/或輕鏈)製備之重組抗體庫或單一區域抗體庫使得抗 原作用於抗體清單。根據另一方法，可藉由用該抗原活體 内免疫動物且隨後使自該動物之淋巴細胞產生之重組抗體 庫或單一區域庫親和力成熟使得抗原作用於抗體清單。根 φ 據另一方法，可藉由用該抗原活體内免疫動物，隨後選擇 分泌所關心抗體之個別抗體產生細胞且自該等經選擇細胞 cDNA獲得重鏈及輕鏈可變區（例如，藉助於pcR)且在哺乳 動物稍主細胞中活體外表現該重鏈及輕鏈可變區（將此稱 為經選擇淋巴細胞抗體方法或SLAM)，藉此能夠進一步選 擇及利用經選擇抗體基因序列來使得抗原作用於抗體清 單。此外，可藉由在哺乳動物細胞中表現重鏈及輕鏈抗體 基因表現選殖及選擇分泌具有所要結合親合力之抗體的彼 等哺乳動物細胞來選擇單株抗體。 127174.doc -29- 200840592 本發明之產生抗體的方法可用於產生各種類型之抗體。 該等抗體包括單株抗體，尤其重組抗體，大體上特別為人 類抗體、嵌合抗體、人源化抗體及CDR接枝抗體，以及其 結合抗原之部分。 本發明進一步係關於能夠產生（分泌）本發明之單株抗體 的融合瘤。本發明之融合瘤包括選自由ρτΑ_78〇8& ρτΑ_ 7406組成之群的藉由美國菌種保存中心寄存編號表示之彼 等融合瘤且彼等融合瘤產生單株抗體丨〇1?4及3C5。
應注意本發明之抗體亦可與除本文所述之Αβ球體外之 Αβ形式反應（亦即結合）。該等抗原可或不可為寡聚的或球 體的。因此，與本發明抗體結合之抗原包括包含與本發明 抗體反應之球體抗原決定基之任何Ap形式。該等Α卩形式 包括載斷及非截斷Αβ(χ_γ)形式（其中乂及γ如以上所定 義），諸如 Αβ(20-42)、Αβ(20-40)、Αβ(12-42)、Αβ(12-40)、 Αβ(1·42)及Αβ(1-40)形式，其限制條件為該等形式包含球 體抗原決定基。 奉發明亦係關於包含如 狖々令〜q w股纨丹結合 抗原之部分之組合物。根據一特定實施例，該組合物為包 含本發明抗體或結合抗原之部分之醫藥組合物及醫藥學上 可接又之載齊卜如上所定義之本發明抗體或結合抗原之邙 分較佳能夠活體外與活體内抑制與其結合之^球體或直; ::之活性。因此該抗體或結合抗原之部分可用於(例如; 里=該球體或其衍生物之製劑中或在其中存在該 ，、竹生物之人類個體或其他哺乳動物中抑制該球體或其衍 127174.doc -30 - 200840592 生物之活性。 根據€知例，本發明係關於抑制該球體或其衍生物活 ϋ之方法，該方法包含使得本發明之抗體或其結合抗原之 一刀作用於球體或其竹生物以致抑制該球體或其衍生物之 活性。例如，可活體外抑制該活性。舉例而言，可將本發 明之抗體或結合抗原之部分添加至諸如來源於含有或懷疑 3有-亥球體或其何生物之受檢者或細胞培養物之樣品的製 劑中’以在該樣品中抑制該球體或其衍生物之活性。或 者’可在個體中活體内抑制球體或其衍生物之活性。因 此，本發明進-步係關於如上所定義之抗體或結合抗原之 部分用於製備治療或預防殿粉樣變性病，尤其選自由阿兹 海默氏病及唐氏症候群殿粉樣變性病組成之群的殺粉樣變 性病之醫藥組合物的用途。因此本發明之該用途的一態樣 為治療或預防類靈盈f^ 4人土 “ 頰而要其之文檢者之澱粉變性病，尤其阿茲 海默氏病或唐氏症候群殿粉樣變性病之方法，其包含向受 檢者投與如上所定義之抗體或結合抗原之部分。使用該抗 體或結合抗原之部分療及尤1 —、 丨刀⑺療及尤其預防澱粉樣變性病，尤其 阿茲海默氏病或唐氏症候群澱粉樣變性病# 庐。田+备 而像欠〖生病尤其用於被動免 :二二療或預防需要其之受檢者之殺粉樣變性 =海默氏病或唐氏症候群殿粉樣變性病之方法 中向文榀者投與抗體或結合抗原之部分 動fi Τ夂口丨刀之一個目的為被 動免焱文檢者以抵抗澱粉樣變性 唐氏症候群殺粉樣變性病。 k阿錄海默氏病或 如上所定義之本發明抗體或結合抗原之部分較佳能夠活 127174.doc -31 - 200840592 體卜^活體内偵測與其結合之Ap球體或其衍生物。因此該 抗體或t合抗原之部分可用於（例如）在含有該球體或其衍 製知丨中或在其中存在該球體或其衍生物之人類個體 或其他哺乳動物中偵測該球體或其衍生物。 根據實施例，本發明係關於偵測該球體或其結合抗原 p刀之方去，該方法包含使得本發明之抗體或其抗原結 σ °卩分作用於球體或其衍生物，以致與該球體或其衍生物 _ 結合（且藉此較佳形成包含抗體或其結合抗原之部分及球 體或其何生物之複合物）。例如，可活體外偵測該球體。 舉例而5，可將本發明之抗體或結合抗原之部分添加至例 如來源於含有或懷疑含有該球體或其衍生物之受檢者或細 胞培養物之樣品的製劑中，以在該製劑中偵測該球體或其 何生物。或者，可在個體中活體内偵測球體或其衍生物。 因此，本發明進一步係關於如上所定義之抗體或結合抗原 之部分用於製備診斷澱粉樣變性病，尤其阿茲海默氏病或 φ 唐氏症候群澱粉樣變性病之組合物的用途。本發明之該用 返的恶樣為诊斷懷疑具有澱粉樣變性病，尤其阿兹海默 氏病或唐氏症候群澱粉樣變性病受檢者之澱粉樣變性病， 尤其阿餘海默氏病或唐氏症候群殿粉樣變性病之方法，其 包含向受檢者投與如上所定義之抗體或結合抗原之部分且 用抗原债測包含抗體或結合抗原之部分之複合物的形成， 在受檢者中複合物之存在指示澱粉樣變性病，尤其阿兹海 默氏病或唐氏症候群澱粉樣變性病。本發明之該用途的第 二態樣為診斷懷疑具有澱粉樣變性病，尤其阿茲海默氏病 127174.doc • 32 - 200840592 或唐氏症候群澱粉樣變性病之受檢者之澱粉樣變性病，尤 其阿茲海默氏病唐氏症候群澱粉樣變性病之方法，其包含 提供來自受檢者之樣品，使樣品與以上所定義之抗體或結 合抗原之部分接觸且用抗原偵測包含抗體或抗原結合部分 之複合物的形成，在受檢者中複合物之存在指示澱粉樣變 性病，尤其阿茲海默氏病或唐氏症候群澱粉樣變性病。 可藉由使用諸如ELISA、點潰墨法或BIAcore分析之標準 化活體外免疫檢定評估本發明抗體之結合親合力（Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden及Piscataway，NJ)。對於進一 步說明而言，參見J6nsson，U·等人（1993)八1111.6丨〇1.(1!1^1· 51:19-26 ; J5nsson，U·等人（1991)Biotechniques 11:620_627 ; Johnsson，Β·等人（1995)J· Mol. Recognit· 8:125-131 ;及 Johnnson，B.等人（1991)Anal· Biochem. 198:268-277 〇 根據 一特定實施例，本文所定義之親合力係指藉由進行點潰墨 法及密度測定法評估其而獲得之值。根據本發明之一特定 實施例，藉由點潰墨法測定結合親合力包含以下：將一定 量抗原（例如如上所定義之Αβ(Χ-Υ)球體、Αβ(Χ-Υ)單體或 Αβ(Χ-Υ)原纖維）或便利地例如於20 mM NaH2P04、140 mM NaCl(pH值為7·4)，0·2 mg/mL BSA中稀釋至抗原濃度為（例 如）100 pmol/pL、10 pmol/pL、1 pmol/pL、0.1 pmol/pL及 〇·〇1 pmol/pL之其適當稀釋液於硝化纖維膜上打點，隨後 用牛奶封閉該膜以阻止非特定結合且洗滌，隨後與所關注 之抗體接觸，之後藉助於酶結合二次抗體及比色反應偵測 後者；在所定義之抗體濃度下，結合之抗體量可使得測定 127174.doc -33· 200840592 親ό力。因此’在另外相 、、主 』點/貝墨法條件下，此處將兩個 不同抗體對一個目標之相斟 不目對親合力或一個抗體對兩個不同 目標之相對親合力定義為新t發 曰 我馬所觀察到之結合目標的抗體之相 應量與兩個抗體目標組合 π门&甘 口 <關係。不同於基於西方墨點法 之類似方法’點潰墨法將測定在後者之天然構形中抗體對 於給疋目標之親合力；;同於EUSA方法，點潰墨法不遭 文不同目標與基質之間的親合力上之差異，藉此考慮不同 目標之間的更精密比較。
如本文所用之術語”Kd”意欲係指此項技術中已知之特定 抗體抗原相互作用之解離常數。 本發明之抗體較佳為經分離抗體。”經分離抗體”意謂具 有如上所述結合親合力之抗體且其大體上不含其他具有不 同結合親合力之抗體。此處術語"大體上不含"係指其中至 少95%之抗體，較佳至少98%之抗體且更佳至少99%之抗 體具有所要結合親合力之抗體製劑。此外，可使經分離抗 體大體上不含其他細胞物質及/或化學製品。 本發明之經分離抗體包括早株抗體。如本文所用之，，單 株抗體π意謂係指抗體分子製劑，與含有不同胺基酸序列 之抗體混合物之"多株"抗體製劑對比，該等抗體共用通用 重鏈及通用輕鏈胺基酸序列。單株抗體可藉由如噬菌體、 細菌、酵母菌或核糖體呈現之數個新穎技術，以及藉由諸 如標準 Kohler及 Milstein融合瘤方法（（1975)NatUre 256:495- 497)之由融合瘤衍生抗體（例如，由藉由融合瘤技術製備之 融合瘤分泌之抗體）例示之經典方法產生。因此，本文中 127174.doc -34- 200840592
雖然單株抗體可能已藉由非經典方法獲得，但具有均勻 序列之非融合瘤衍生抗體仍稱為單株抗體，且術語"單株 "不侷限於融合瘤衍生抗體但用於指來源於—個核酸純系 之所有抗體。因此，本發明單株抗體包括重組抗體。如 本文所用之術語"重組"係指序列之兩個另外分離部分（例 如）藉由化學合成或藉由由遺傳工程技術操作核酸之經分 離部分之任何人為組合》詳言之，術語，，重組抗體"係指 藉由重組方法製備、表現、產生或分離之抗體，諸如使 用轉染m細胞之重组表現載體表現之抗體；自重組 性組合抗體庫分離之抗體；自由人免疫球蛋白基因轉瘦 基因之動物（例如小氣）分離之抗體（參見，例如，Tayi〇r, L.D·等人（1992)iVM/. •办及认 2〇:6287_6295);或以任 何其他方式製備、表現、產生或分離之抗體，其中特定 免疫球蛋白基因序列（諸如人免疫球蛋白基因序列）與其 他DNA序列組合。重組抗體包括（例如）嵌合抗體、cdr 接枝抗體及人源化抗體。熟習此項技術者將意識到在異 種系統中表現習知融合瘤衍生單株抗體將需要產生重組 抗體’即使所得抗體蛋白之胺基酸序列不改變或意謂改 變。 在本發明之-特定實施例中，抗體為人源化抗體。根據 多個實施例，抗體可包含全部源於諸如人類抗體或小鼠抗 體之單一物種之胺基酸序列。根據其他實施例，抗體可為 肷合抗體或CDR接枝抗體或另一形式之人源化抗體。 術語"抗體”意謂係指由4個多肽鏈、2個重（H)鏈及2個輕 127174.doc -35- 200840592 (L)鏈組成之免疫球蛋白分子。該等鏈通常經由雙硫鍵彼 此連接。各重鏈由該重鏈可變區（此處縮寫為HCVR或VH) 及該重鏈丨亙定區組成。重鏈恒定區由3個區域ch 1、CH2及 CH3組成。各輕鏈由該輕鏈可變區（此處縮寫為lc VR或 VL)及該輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由cl區域組成。可 將VH及VL區域進一步分為稱為互補決定區（CDR)之高變 區且用稱為之構架區（FR)之保守區點綴。因此各VH及VL 區域由3個CDR及4個FR組成，其按以下次序由n末端至C 末端安置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、 FR4。此結構為熟習此項技術者所熟知。 術語抗體之π結合抗原之部分，，（或簡單地為”抗體部分，，） 係指本發明抗體之一或多個片段，該（等）片段仍具有如上 所定義之結合親合力。已顯示完整抗體之片段能夠實現抗 體之抗原結合功能。根據術語抗體之"結合抗原之部分，，， 結合片段之實例包括：（i)Fab片段，亦即由vl、VH、CL 及CH1區域組成之單價片段；（π)ρ(α1)»)2片段，亦即包含在 鼓鏈區經由雙硫橋彼此連接之2個Fab片段之二價片段； (iii)由VH及CH1區域組成之Fd片段；（iv)由單一抗體臂之 FL及VH區域組成Fv片段；（v)由VH區域組成或由VH、 CHI、CH2、DH3組成或由VH、CH2、CH3組成之dAb片段 (Ward等人，（1989)A^iwre 341:544-546);及（vi)經分離之 互補決定區（CDR)。雖然Fv片段之兩個區域（亦即VL及VH) 係由分離基因編碼，但其可進一步使用合成連接子（例如 聚-G4S胺基酸序列）及重組方法彼此連接，使其能夠將其 127174.doc -36- 200840592 製備為單一蛋白鏈，其中該等VL及VH區域組合以形成單 價分子（稱為單鏈Fv(ScFv);參見，例如，Bird等人 (1988)5Wence 242:423-426 ;及 Huston 等人（1988)Ρ，ο(· #如/· deal Scz·· t/M 85:5879-5883)。術語抗體之"結合抗 原之部分"亦意謂包含該等單鏈抗體。在此同樣包括其他 形式之單鏈抗體，諸如”雙功能抗體（diabody)"。雙功能抗 體為二價雙特異性抗體，其中在單一多肽鏈上表現VH及 VL區域，但使用過短而使該兩個區域無法在相同鏈上組 合之連接子，藉此強制該等區域與不同鏈之互補區域成對 且形式兩個結合抗原之位點（參見，例如，Holliger，P·等人 (\993)Proc. Natl. Acad. Sci, USA 90:6444-6448 ; Poljak， R.J.等人（1994)Art/dwre 2··1121-1123)。免疫球蛋白恆定區 係指重鏈或輕鏈恆定區。人類IgG重鏈及輕鏈恆定區胺基 酸序列在此項技術中已知。 另外，本發明之抗體或其結合抗原之部分可為由使該抗 體或抗體部分與一或多種其他蛋白或肽共價或非共價締合 而形成之較大免疫黏附分子之一部分。與該等免疫黏附分 子有關者為使用鏈黴抗生物素核心區以製備四聚scFv分子 (Kipriyanov，S.M.等人（1995)Human Antibodies and HybHdomas 6··93-101)及使用半胱胺酸殘基、標記肽及C端聚組胺酸（例 如六組胺酸）標記以產生二價及生物素化之scFv分子 (Kipriyanov，S.M·等人（1994)Μα/· /所所⑽31:1047-1058)。 術語"人類抗體"係指其可變及恆定區對應或衍生自如（例 如）Kabat 等人（參見 Kabat 等人（1991)5^《μ如es o/iVoiez·似 127174.doc -37- 200840592 of Immunological Interest，第5版，美國衛生與公眾月良矛务 部（U.S· Department of Health and Human Services)，NIH 出版品第91-3242號）所述之人類種系免疫球蛋白序列之抗 體。然而，本發明之人類抗體可（例如）在CDR中，且尤其 在CDR3中，含有不由人類種系免疫球蛋白序列編碼之胺 基酸殘基（例如已藉由活體外之隨機或定位突變或藉由活 體内體細胞突變而引入之突變）。本發明之重組人類抗體 具有可變區且亦可含有衍生自人類種系免疫球蛋白序列之 恆定區（參見 Kabat，Ε·Α·等人（1991)&wam — /mm⑽，第5版，美國衛生與公眾服務部 (U.S. Department of Health and Human Services)，NIH出 版品第91-3242號）。然而，根據特定實施例，該等重組人 類抗體可遭受活體外突變（或若使用由人類Ig序列轉殖基因 之動物，則遭受活體内體細胞突變）以使該重組抗體之VH 及VL區域之胺基酸序列為雖然係有關或衍生自人類種系 之VH及VL·序列，但係不天然地活體内存在於人類抗體種 系清單内之序列。根據特定實施例，此種類之重組抗體為 選擇性突變或回復突變或兩者之結果。較佳地，突變可產 生與親本抗體之親合力相比較大之對於目標之親合力，及/或 較小之對於非目標結構之親合力。 術語”嵌合抗體”係指含有來自一種物種之重鏈及輕鏈可 變區序列及來自另一物種（諸如具有與人類恆定區連接之 鼠重鏈及鼠輕鏈可變區之抗體）之恆定區序列的抗體。 術浯"CDR接枝抗體”係指包含來自一種物種之重鏈及輕 127174.doc -38- 200840592 鏈可變區序列之抗體，但其中VH及/或VL之CDR區域中之 一或多者之序列經另一物種之CDR序列置換，諸如具有鼠 重鏈及輕鏈可變區之抗體，其中鼠CDR中之一或多者（例 如，CDR3)已經人類CDR序列置換。 術語π人源化抗體’f係指含有來自非人類物種（例如小鼠、 大鼠、兔子、雞、駱騎、羊或山羊）之重鏈及輕鏈可變區 序列之抗體，但其中至少VH及/或VL序列之一部分已改變 以更”類似於人”，亦即更類似於人類種系之可變序列。一 類人源化抗體為其中已將人類CDR序列插入非人類VH及 VL序列中以置換相應非人類Cdr序列之CDR接枝抗體。 本文中術語"kabat編號，，、"Kabat定義，，及"Kabat標註"可 交替使用。在此項技術中所考慮之該等術語係指編號與抗 體或其結合抗原之部分之重鍵及輕鍵可變區中之其他胺基 酸殘基相比更可變（亦即高變）之胺基酸殘基之系統（Kabat 等人（1971)j亂 5W· 190:382-391 及 Kabat，Ε·Α·等 k{\99\、Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第5版’美國衛生與公眾服務部，nih出版品第9i_3242 號）。 如本文所用之術語，，受體”及，，受體抗體”係指提供或編碼 至V 80/〇，至少85%，至少90%，至少950/〇，至少98%或 100%構架區中之一或多者之胺基酸序列的抗體或核酸序 列。在一些實施例中，術語受體"係指提供或編碼恆定區 之抗體胺基酸或核酸序列。在另一個實施例中，術語"受 體係扣提供或編碼構架區及恆定區中之一或多者之抗體 127174.doc -39- 200840592 胺基酸或核酸序列。在一特定實施例中，術語π受體”係指 提供或編碼至少80%，較佳至少85%，至少90%，至少 95%，至少98%或100%構架區中之一或多者之胺基酸序列 的人類抗體胺基酸或核酸序列。根據此實施例，受體可含 有不存在於人類抗體之一或多個特定位置上之至少1個， 至少2個，至少3個，至少4個，至少5個或至少1 0個胺基酸 殘基。受體構架區及/或受體恆定區可（例如）來源於或獲得 自種系抗體基因、成熟抗體基因、功能性抗體（例如，在 此項技術中熟知之抗體、發展中之抗體或市售抗體）。如 本文所用之術語nCDR”係指抗體可變序列内之互補判定 區。在重鏈及輕鏈可變區中之每一者中存在3個CDR，對 於可變區中之每一者其表示CDR1、CDR2及CDR3。 如本文所用之術語"CDR組"係指存在於能夠結合抗原之 單一可變區中之一組3個CDR。該等CDR之精確邊界已根 據不同系統不同定義。由Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，國立衛生研究院， BethesdaMD(1987)及（1991))描述之系統不僅提供適用於 抗體之任何可變區之清楚殘基編號系統，亦提供定義3個 CDR之精密殘基邊界。可將該等CDR稱為Kabat CDR。 Chothia 及合作者（Chothia & Lesk，J. Mol. Biol· 196:901-917(1987)及 Chothia等人，Nature 342:877-883(1989))發現 Kabat CDR内之某些子部分儘管在胺基酸序列層面上之大 差異，但仍採用幾乎相同之肽主鏈構形。將該等子部分表 示為LI、L2及L3或HI、H2及H3，其中，，L，，及，Ή”分別表示 127174.doc -40- 200840592 輕鏈及重鏈區域。可將該等區域稱為Chothia CDR，其具 有與Kabat CDR重疊之邊界。定義與Kabat CDR重疊之 CDR的其他邊界已由 padlan(FASEB J. 9:133-139(1995))及 MacCallum(J Mol Biol 262(5):732-45(1996))描述。其他 CDR邊界定義可能不嚴格遵從以上所述系統中之一者，但 將仍然與Kabat CDR重疊，雖然其可根據特定殘基或殘基 群或甚至總體CDR不顯著影響抗原結合之預計或實驗數據 縮短或延長。雖然較佳實施例使用Kabat或Chothia定義之 CDR，但本文所用之方法可利用根據任何系統所定義之 CDR。 如本文所用之術語"標準"殘基係指定義如Chothia等人（1· Mol. Biol· 196:901-907(1987) ; Chothia等人，J· Mol· Biol· 227:799(1992)，兩者均以引用的方式併入本文中）所定義 之特定標準CDR結構之CDR或構架中之殘基。根據Chothia 等人，多數抗體之CDR的關鍵部分儘管在胺基酸序列層次 上有較大差異，但仍具有幾乎相同之肽主鏈構形。各標準 結構主要對形式環之胺基酸殘基的接近部分規定一組肽主 鏈扭轉角。 如本文所用之術語”供體”及’’供體抗體”係指提供一或多 個CDR之抗體。在一較佳實施例中，供體抗體為來自物種 之抗體，該物種不同於構架區自其中獲得或來源於其中之 抗體。在人源化抗體之情形中，術語”供體抗體”係指提供 一或多個CDR之非人類抗體。 如本文所用之術語"構架"或"構架序列”係指可變區減去 127174.doc -41- 200840592 CDR之剩餘序列。因為CDR序列之精確定義可使用不同系 統確定，故構架序列之含義須經相應不同解釋。6個 CDR(輕鏈之 CDR-L1、-L2 及-L3及重鏈之CDR-H1、-H2 及-H3)亦將輕鏈及重鏈之構架區按各鏈分為4個子區域 (FR1、FR2、FR3 及 FR4)，其中 CDR1 為 FR1 與 FR2 之間的 位置，CDR2為FR2與FR3之間的位置及CDR3為FR3與FR4 之間的位置。在不將特定子區域規定為FR1、FR2、FR3或 FR4情況下，如由其他所涉及之構架區表示天然存在之免 疫球蛋白鏈之單一可變區内之組合FRfs。如本文所用，FR 表示4個子區域中之一者，且FRs表示構成構架區之4個子 區域中之兩個或兩個以上。人類重鏈及輕鏈受體序列在此 項技術中已知。 如本文所用之術語”種系抗體基因’’或π基因片段’’係指由 未曾經受導致表現特定免疫球蛋白之遺傳重排及突變之成 熟方法的非淋巴細胞編碼之免疫球蛋白序列。（參見，例 如，Shapiro等人，Crit· Rev. Immunol. 22(3) : 183-200(2002); Marchalonis等人，Adv Exp Med Biol. 484:13-30(2001))。 由本發明之各種實施例提供之優勢中之一者源自在物種中 與成熟抗體基因相比種系抗體基因更可能保留個體之主要 胺基酸序列結構特徵，因此當在彼物種中使用時較不可能 認為其係非自身的。 如本文所用之術語"關鍵"殘基係指對抗體、尤其人源化 抗體之結合特性及/或親合力具有較大影響之可變區内之 某些殘基。關鍵殘基包括（但不限於）以下中之一或多者： 127174.doc -42- 200840592 、潛在糖基化位點（其可為义或〇_糖其
之間的接觸殘基、微調區内之殘基、 接近於CDR之殘基、 變重鏈CDR1與Kabat定義之最初重鏈構架之間重疊的區域 小W於音I茂&、能夠對 重鏈可變區與輕鏈可變區 基、及在Chothia定義之可 中之殘基。 如本文所用之術語，，人源化抗體”尤其係指抗體或其變化 形式、衍生物、類似物或片段，其免疫特定地與所關注之 抗原結合且其包含大體上具有人類抗體之胺基酸序列之構 架（FR)區域及大體上具有非人類抗體之胺基酸序列之互補 決定區（CDR)。在CDR之情形下，如本文所用之術語，，大體 上”係指具有至少80%，較佳至少85%，至少90%，至少 950/〇 ’至少98%或至少99%之胺基酸序列與非人類抗體 CDR之胺基酸序列相同之CDR。人源化抗體大體上包含所 有至少一個，且通常兩個可變區（Fab、Fab，、F(ab，）2、 FabC、Fv)，其中與非人免疫球蛋白之彼等可變區相關之 所有或大體上所有CDR區域（亦即，供體抗體）及所有或大 體上所有構架區為人免疫球蛋白一致序列之彼等可變區。 較佳地，人源化抗體亦包含免疫球蛋白恆定區（Fc)之至少 一部分，通常人免疫球蛋白之至少一部分。在一些實施例 中，人源化抗體含有輕鏈以及至少重鏈之可變區兩者。抗 體亦可包括重鏈之CH1、鉸鏈、CH2、CH3及CH4區域。 在一些實施例中，人源化抗體僅含有人源化輕鏈。在一些 實施例中，人源化抗體僅含有人源化重鏈。在特定實施例 127174.doc -43· 200840592 中，人源化抗體僅含有輕鍵及/或人源化重鍵之人源化可 變區。人源化抗體可選自包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE 之任何類免疫球蛋白及包括（不限於）IgGl、IgG2、IgG3及 IgG4之任何子類。人源化抗體之構架及CDR區域無須準確 地與親本序列對應，例如供體抗體CDR或一致構架可藉由 取代、插入及/或刪除至少一個胺基酸殘基突變以便在彼 位點之CDR或構架殘基不精確地與供體抗體或一致構架對 應。然而，在一較佳實施例中，該等突變不為廣泛的。通 常，人源化抗體殘基之至少80%，較佳地至少85%，更佳 地至少90%及最佳至少95%將與親本FR及CDR序列之彼等 殘基對應。如本文所用之術語π —致構架’’係指一致免疫球 蛋白序列中之構架區。如本文所用之術語π —致免疫球蛋 白序列π係指由在相關免疫球蛋白序列族中最常存在之胺 基酸（或核苷酸）形成之序列（參見例如，Winnaker，From Genes to Clones，Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987)。在免疫球蛋白族中，——致序列中之各位置由在族中 之彼位置最常存在之胺基酸佔據。其中兩種胺基酸同等頻 率存在，任一者可包括於一致序列中。 如本文所用之’’微調”區域係指如由Foote及 Winter(1992，J. Mol. Biol· 224:487-499，其以引用的方式 併入本文中）所述可調節CDR結構且調整對抗原之配合的 構架殘基子集。微調區域殘基形成構成CDR之薄層且可影 響CDR之結構及抗體之親合力。 術語”抗原決定基”包括能夠與免疫球蛋白特定結合之任 127174.doc • 44- 200840592 何多肽決定子。在某些實施例中，抗原決定基決定子包括 堵如胺基酸、糖側鍵、構醯基或續醢基之分子的化學活性 表面基團，且在某些實施例中，可具有特定立體結構特徵 及/或射質比特徵。抗原決定基為由抗體結合之抗原的區 域。在某些實施例中，當在蛋白及/或大分子之複雜混合 物中其優先認出其目標抗原時，認為抗體與抗原特定結 合0 _ 如本文所提及之術語，，聚核苷酸"意謂兩種或兩種以上核 苷酸之聚合形式，核糖核苷酸或脫氧核苷酸或任一類核苷 酸之經修改形式。術語包括DNA之單鏈及雙鏈形式，但較 佳為DNA。 如本文所用之術語”經分離聚核苷酸”應意謂藉助於其來 源之聚核苷酸（例如，基因組、cDNA或合成來源或其任何 組合之聚核苷酸），，，經分離聚核苷酸，，不與實質上自其中發 現”經分離聚核苷酸，，之聚核苷酸之所有或一部分相關；可 φ 與實質上不與其連接之聚核苷酸操作地連接；或實質上不 以較大序列之一部分的形式存在。 如本文所用之術語”載體，，意謂係指能夠傳輸已與其連接 之另一核酸之核酸分子。一種類型載體為"質體"，其係指 ’其中其他DNA部分可與病毒基因組接合。
宿主細胞中時，其他載體（例如， 127174.doc 其他DNA部分可與其接合之環形雙鏈DNA。另一類型之^ 體為病奏截體，：Α ^ . 自主複製（例如，細 之細菌來源）。當引 非游離哺乳動物載 -45- 200840592 …合且“隨同…因组- 基因。本文中該等i:通能两定向表現與其操作性連接之 •，表現載體”）。n為"重組表現載體”（或簡單地為 體通常為質體形式之表現载 交使用，儘管質體為2 質體"及"载體"可替 竟…V 體之最常使用形式。然、，本發明
如，複f缺見:：之該等其他形式’諸如病毒載體(例 供等㈣用 病毒、腺病毒及腺相關病毒)，其提 術語"可操作連接"係指併接，其中所述組份處於可使得 ,Γ以料方式作用之關❹。用此方式連接與編碼序列 可麵作連接"之控制序列以致在與控制序列相—致之條件 下達成編碼序列之表現。"可操作連接，，序列包括與所關注 基因接近之表現控制序列與以反式或以—定距離作用以控 制所關庄基因之表現控制序列。如本文所用之術語"表現 控制序列"係指對實絲現及編碼與其連接之序列之方法 必須之聚核序列。表現控制序列包括：適當轉錄起始 序列、終止子序列、啟動子序列及強化子序列；有效通 過程信號（諸如接合）及多聚腺嘌呤信號；穩定細胞質 mRNA之序歹;增強轉譯效率之序列（亦#，K〇zak一致序 列），增強蛋白穩定性之序列；及當需要時，增強蛋白分 泌之序列。該等控制序列之性質視宿主生物體而不同；在 原核生物中，該等控制序列通常包括啟動子序列' 核糖體 結合位點序列及轉錄終止子序列；在真核生物中，該等控 127174.doc -46 - 200840592 制序列通常包括啟動子序 制庠列丨丨立上田& 轉錄終止子序列。術語，，控 制序列忍謂包括其存在對 徑 表見及過私必不可少之細 份，且亦可包括其存在 ♦ J八組 你”有利性之其他組份，例如前導庠 列及融合搭配物序列。 】如則V序 如本文所定義之”轉型”係扣 y ^ 生係扣外生DNA進入宿主細胞之任 何過程。轉型可能在；妙、+ μ或人為條件下使用此項技術中孰 知之各種方法發生。轉帮 ’、、、 、 得2"了依賴於將外來核酸序列插入原
核或真核宿主細胞中之任何已知方法。使方法基於轉型之 佰主細胞選擇且可包括(但不限於)病毒感染、電穿孔、脂 轉染及粒子轟擊。該等"經轉型”細胞包括經穩定轉型細 胞，其中插入之DNA能夠以自主複製質體或宿主染色體之 -部分之形式複製。其亦包括有限時段内瞬間表達插入之 DNA或RNA之細胞。 如本文所用之術語”重組宿主細胞”（或簡單地為”宿主細 胞’’）意謂係指外生DNA已引入其中之細胞。應瞭解該等術 。口不僅思明係指特定目標細胞，但亦係指該細胞之後代。 因為在隨後生產中由於突變或環境影響可發生某些改變， 故事實上該等後代可能不與母細胞一致，但仍包括在如本 文所用之術§吾”宿主細胞”之範壽内。較佳地，宿主細胞包 括選自生命界中之任一者之原核及真核細胞。較佳真核細 胞包括原生生物細胞、真菌細胞、植物細胞及動物細胞。 最佳宿主細胞包括（但不限於）：原核細胞株大腸桿菌；哺 乳動物細胞株CHO、ΗΕΚ 293及COS ;昆蟲細胞株Sf9 ;及 真菌細胞釀酒酵母。 127174.doc -47- 200840592 標準技術可用於重組DN A、低聚核苷酸合成及組織培養 及轉型（例如，電穿孔、脂轉染）。可根據製造商之說明書 或以通常在此項技術中已達成之技術或如本文所述施行酶 促反應及純化技術。可通常根據此項技術中熟知及整個如 本說明書中引用及論述之各種通用及更多特定參考文獻中 所述之習知方法施行先前技術及程序。參見例如，
Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring
Harbor，Ν·Υ·(1989))，為達到任何目的其以引用的方式併 入本文中。 此項技術中已知且如本文所用之’’轉殖基因生物體"係指 具有含有轉基因之細胞的生物體，其中引入生物體（咬生 物體原種）之轉基因表現不在生物體中天然表現之多肽。 ”轉基因”為與產生轉殖基因生物體之細胞的基因組穩定及 可操作結合之DN Α構造’在轉殖基因生物體之一或多種細 胞類型或組織中指導經編碼之基因產物之表現。 以下描述產生本發明抗體之方法。此處在活體内方法、 活體外方法或兩者之組合之間產生區別。 活艘内方法： 依賴於所要抗體之類型，各種宿主動物可用於活體内免 疫。可使用自身表現所關注抗原之内源性形式之宿主。戈 者，可能使用已在所關注抗原之内源形式上產生不足之宿 主。舉例而纟，已顯示在相應内源性基因下已經由同源重 組產生特定内源性蛋白不足之小鼠（亦即，基因剔除小^ 127174.doc -48 - 200840592 以對已用以將其免疫之蛋白產生體液反應且因此以能夠用 於產生對蛋白具有高親合力之單株抗體（參見，例如，
Roes，J·等人（1995)/· 183:231-237 ;
Lunn，Μ·Ρ·等人（2000)J. iVewroc/zem. 75:404-412) 〇 夕數非人類哺乳動物均為合適的以產生本發明之非人類 抗體之抗體產生宿主。其包括（例如）小鼠、大鼠、雞、路 駝、兔子、羊及山羊（及其基因剔除形式），雖然較佳為產 _ 生融合瘤之小鼠。另外，表現人類抗體清單之非人類宿主 動物可用於產生具有雙重特異性之對於人類抗原之實質人 類抗體。此種類非人類動物包括負載人免疫球蛋白轉基因 之轉殖基因動物（例如小鼠）（嵌合hu-PBMC SCID小鼠）及以 下更詳細描述之人類/小鼠輕射喪合體。 根據一實施例，經免疫動物為非人類哺乳動物，較佳為 小鼠，其由人免疫球蛋白基因轉殖基因以便當抗原刺激時 該非人類哺乳動物產生人類抗體。通常，將具有人類種系 鲁 組悲之重鏈及輕鏈免疫球蛋白轉基因引入已改變以致其内 源性重鏈及輕鏈執跡均無效之該等動物中。若用抗原（例 如，用人類抗原）刺激該等動物，則產生來源於人免疫球 蛋白序列之抗體（人類抗體）。可能藉助於標準化融合瘤技 術自該等動物之淋巴細胞產生人類單株抗體。為進一步說 明具有人免疫球蛋白之轉殖基因小鼠及其在產生人類抗體 中之用途，參見，例如，美國專利第5,939,598號、w〇 96/33735、 侧 96/34096、W0 98/24893及购 99/53_(肖_ ^ )，及 美國專利第5,545，祕號、美國專利第5,569,825號、美國專利 127174.doc -49- 200840592 第5,625，126號、美國專利第5,633,425號、美國專利第5,661，016 號、美國專利第5,770,429號、美國專利第5,814,318號、美 國專利第 5,877,397號及 WO 99/45962(Genpharm Inc·);亦參見 MacQuitty，J.J·及 Kay，R.M.(1992)5Wence 257:1 188 ;
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Arai，K.(1998)i/>^ri(i6>7wa 17:41-45 ; Hutchins，W.A.等人 (\ 999)Hybridoma 18:121-129 ; Murphy, W. J.等人 (1999) C7z·/?· 90:22-27 ; Smithson， S.L·等人 (1999)Mo/· /mmwno/· 36:113-124; Chamat，S.等人（1999)J. /π/αί. 180:268-277 ;及 Heard，C·等人（1999)Mo/ec·
Me丄 5:35-45。
根據另一實施例，經免疫動物為已用全身照射之致死操 作處理，隨後用來自具有嚴重結合免疫缺陷（SCID)小鼠之 骨髓細胞保護以不遭受輻射且隨後用功能性人類淋巴細胞 移植之小鼠。使用稱為三聚體系統之此類型嵌合體藉由免 疫具有所關注抗原之該小鼠且隨後藉由使用標準化融合瘤 技術產生單株抗體以產生人類單株抗體。為進一步說明該 等小鼠及其用以產生抗體之用途，參見，例如，Eren，R. 等人(1998)/所饥1/似/(9灯 93:154-161 ; Reisner，Y及 Dagan， S .(\99S)Trends 16:242-246 ; Ilan， Ε·等人 (1999)HepatoIogy 29:553-562 ;及 Bocher， W.O.等人 (1999)/mmww(9/(9gj； 96:634-641 〇 自活體内產生抗體產生細胞開始，單株抗體可藉助於標 準化技術產生，諸如最初由Kohler*及Milstein(1975， Nature 256:495-497)描述之融合瘤技術（亦參見Brown等人 (1981)J· 127:539-46 ; Brown 等人（1980)·/
Chem 255:4980-83 ； Yeh f K{\916)PNAS 76:2927-31 ；及 127174.doc -51 - 200840592
Yeh等人（1982)/此J· Cancer 29:269-75)。充分已知產生單 株抗體融合瘤之技術（一般參見R. H. Kenneth，in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses，Plenum Publishing Corp·，New York，New York(1980) ； E. A. Lerner(1981)7a/e J. Biol Med. ^ 54:387-402 ; M. L· Gefter等人Ce" Genei.，3:231-3 6)。簡要地，用經本發明之Αβ球體或其衍生物免疫哺乳 動物之淋巴細胞（通常為脾細胞或淋巴結細胞或外周血淋 巴細胞）融合永生化細胞株（通常為骨髓瘤），且篩檢所得融 合瘤細胞之培養上清液以鑑別產生本發明單株抗體之融合 瘤。可將多數熟知之用於融合淋巴細胞及永生化細胞株之 協定中之任一者應用於此目的（亦參見G. Galfre等人 (1977)7Vaiwre 266:550_52 ; Gefter 等人，Ce//
Genei.，之前引用；Lerner，Τα/e J· Med.，之前引 用；Kenneth，，之前引用）。此 外，熟練技術者將意識到存在同樣有效之該等方法之不同 變化形式。通常，永生化細胞株（例如，骨髓瘤細胞株）起 源於如淋巴細胞之相同哺乳動物物種。舉例而言’鼠性融 合瘤可藉由用永生化小鼠細胞株融合來自經本發明之免疫 原性製劑免疫之小鼠的淋巴細胞產生。較佳永生化細胞株 為對含有次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷之培養基（HAT培養 基）敏感之小鼠骨髓瘤細胞株。大量骨髓瘤細胞株中之任 一者可藉由預設用作融合搭配物，例如P3-NSl/l-Ag4-l、 P3-x63-Ag8.653或Sp2/0-Agl4骨髓瘤株系。該等骨髓瘤細 127174.doc •52- 200840592 胞株可自美國菌種保存中心（ATCC)(Manassas，Virginia)獲 得。通常，使用聚乙二醇（PEG)將HAT敏感小鼠骨髓瘤細 胞融合至小鼠脾細胞中。隨後使用HAT培養基選擇由融合 得到之融合瘤細胞，藉此處死未融合及非生產性融合之骨 髓瘤細胞（因為其未轉型，故數天之後未融合脾細胞死 亡）。藉由篩檢該等抗體之融合瘤培養上清液鑑別產生本 發明單株抗體之融合瘤細胞，例如藉由使用點潰墨法檢定 以選擇如上所定義之具有結合親合力之彼等抗體。單株抗 體10F4及3 C5全部已使用上述活體内方法產生且其可自如 本文所定義之融合瘤獲得。 同樣地，如下文進一步詳述，該融合瘤可用作編碼輕鏈 及/或重鏈核酸的來源，以重組地產生本發明抗體。 活體外方法： 作為藉由免疫及選擇產生本發明抗體之替代方法，本發 明抗體可藉由篩檢重組組合免疫球蛋白庫以藉此分離具有 所要結合親合力之免疫球蛋白庫成員來鑑別及分離。產生 及篩檢展示庫之套組可購得（例如Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目錄號 27-940-01 ;及 Stratagene SurfZAP® Phage Display Kit > 目錄號 240612)。在多數實 施例中，展示庫為scFv庫或Fab庫。已充分描述篩檢重組 抗體庫之噬菌體展示技術。可尤其有利地用於產生及篩檢 抗體展示庫之方法及化合物之實例可在以下文獻中發現·· (例如）McCafferty 等人之 WO 92/01047、US 5,969，108 及 EP 589 877(尤其描述scFv展示），Ladner等人之美國專利第 127174.doc -53- 200840592 5,223,409號、美國專利第5,403,484號、美國專利第 5,571，698號、美國專利第5,837,500號及EP 436 597(例如 描述pill融合）；Dower等人之WO 91/17271、美國專利第 5,427,908號、美國專利第5,580,717號及EP 527 839(尤其 描述Fab展示）；Winter等人之國際公告WO 92/20791及EP 3 68,684(尤其描述可變免疫球蛋白區域序列之選殖）； Griffiths等人之美國專利第5,885,793號及EP 589 877(尤其 描述藉由使用重組庫之人類抗體對人類抗原之分離）； Garrard等人之WO 92/09690(尤其描述噬菌體表現技術）； Knappik等人之WO 97/08320(描述人類重組抗體庫 HuCal); Salfeld等人之WO 97/29131(描述重組人類抗體對 人類抗原（人類腫瘤壞死因子α)之產生以及活體外重組抗 體之親合力成熟）及Salfeld等人之美國臨時專利申請案第 60/126,603號及基於此之專利申請案（同樣描述重組人類抗 體對人類抗原（人類介白素-12)之產生，以及活體外重組抗 體之親合力成熟）。 重組抗體庫篩檢之其他說明可在科技出版物中發現，諸 如 Fuchs 等人（1991)5b/r%/m0/og3； 9:1370-1372; Hay 等人 (\992)Hum Antibod Hybridomas 3:81-85 ; Huse 等人 (1989)5Wwce 246:1275-1281 ; Griffiths 等人（1993)£M50J 12:725-734 ； Hawkins# A(1992)J Mol Biol 226:889-896 ； Clarkson 等人（1991)Λ^ίζ/Γβ 352:624-628 ; Gram 等人 (1992)iWAS 89:3576-3580 ; Garrard 等人（1991)5zo/：Tec/2no/0g;; 9:1373-1377 ; Hoogenboom 等人（1991)iVwc 127174.doc -54- 200840592 19:4133-4137 ; Barbas 等人（1991#]^$ 88:7978-7982 ; McCafferty 等人 A^iwre(1990)348:552-554 ;及 Knappik 等人 (2000)/· Mo/· 296:57-86。 作為使用噬菌體展示系統之替代方法，重組抗體庫可在 酵母細胞或細菌細胞之表面上表現。WO 99/36569描述製 備及篩檢酵母細胞表面上表現之庫的方法。WO 98/49286 更詳細地描述製備及篩檢細菌細胞表面上表現之庫的方 法。在所有活體外方法中，具有所要特性之富集重組抗體 之選擇方法形成該方法之主要部分，其通常稱為"篩選”且 通常表現為經管柱（其基質已與目標結構連接）之親和層析 法形式。隨後使期望之候選分子經受其絕對及/或相對親 合力之個別測定，較佳地藉助於標準化點潰墨法檢定。 一旦組合庫之所關注抗體已鑑別及充分特性化，編碼該 抗體之輕鏈及重鏈之DNA序列藉助於標準化分子生物技 術，例如藉助於來自在庫篩檢期間已分離之展示包（例 如，噬菌體）之DNA的PCR擴增來分離。可用於製備PCR引 子之輕抗體鏈及重抗體鏈基因之核苷酸序列為一般熟習此 項技術所已知。多數該等序列描述於（例如）Kabat，E. A.等 K{\99\)Sequences of Proteins of Immunological Interest 5 第5版，美國衛生與公眾服務部，NIH出版品第91-3242號 及人類種系VBASE序列之資料庫中。 本發明之抗體或抗體部分可藉由在宿主細胞中重組地表 現輕免疫球蛋白鏈及重免疫球蛋白鏈基因來產生。為重組 地表現抗體，用一或多種承載編碼該抗體之輕免疫球蛋白 127174.doc -55- 200840592
鏈及重免疫球蛋白鏈之DN A片段之重組表現載體轉染宿主 細胞，藉此在宿主細胞中表現輕鏈及重鏈且較佳將其分泌 至培養該等宿主細胞之培養基中。抗體可自此培養基分 離。標準化重組DNA方法用以獲得重抗體鏈及輕抗體鏈基 因，以將該等基因插入至重組表現載體中且將該等載體引 入至宿主細胞中。此種方法描述於（例如）Sambrook、 Fritsch 及 Maniatis(編）Mo/ecw/ar Cloning / A Laboratory Μ_αί，第 2版，Cold Spring Harbor ^ N.Y. ^ (1989)； Ausubel，F.M.等人（編）Cwrrewi 尸/π Mo/eew/ar Biology ^ Greene Publishing Associates 5 (1989)>5. Boss ^ A 之 US 4,816,397 中。 一旦已獲得編碼所關注抗體之VH及VL部分之DNA片 段，該等DNA片段可進一步使用標準化重組DNA技術操作 以（例如）將可變區之基因轉化為全長抗體鏈之基因、Fab片 段之基因或SCFv基因。該等操作包含使編碼VL或VH之 DNA片段與編碼另一蛋白之另一DNA片段，例如恆定抗體 區或可撓性連接子可操作地連接。此處術語”操作性連接” 應理解為意謂兩個DNA片段以該方式連接以致藉由該等兩 個DNA片段編碼之胺基酸序列保持在框架中。可將編碼 VH區域之經分離DNA藉由使編碼VH區域之DNA與編碼重 鏈怪定區之另一 DNA分子操作性連接來轉化為全長重鏈基 因。已熟知人類重鏈恆定區基因之序列（參見，例如，
Kabat，Ε·Α·等人(1991)5^《μ⑼ces 〇/ Proieira 〇/
Mere对，第5版，美國衛生與公眾服務部，NIH出版品第91-127174.doc -56- 200840592 3 242號），且跨越該等區域之DNA片段可藉助於標準化pcR 擴增獲得。重鏈恒定區可為來自IgGl、igG2、IgG3、 IgG4、IgM、IgA、IgE或IgD之恆定區，較佳為來自igG之 恆定區，尤其來自IgGl或IgG4之恆定區。為獲得重鏈Fab 片段之基因，可使編碼VH之DNA與僅編碼重鏈恒定區CH1 之另一 DNA分子操作性連接。可藉由使編碼VL之DNA與 編碼輕鏈恆定區CL之另一 DNA分子操作性連接將編碼VL 區域之經分離DNA轉化為全長輕鏈基因（及Fab輕鏈基 因）。已熟知人類輕鏈恆定區之基因序列（參見Kabat，E.A. 專 k，{\99\、Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，美國衛生與公眾服務部，NIH出版品第91-3242號）， 且跨越該等區域之DNA片段可藉助於標準化PCR擴增獲 得。輕鏈恆定區可為恆定希臘文κ或λ區域，較佳為恆定κ 區域。 為產生scFv基因，可將編碼VH及VL之DNA片段與編碼 可撓性連接子之另一片段操作性連接，例如胺基酸序列 (Gly4-Se〇3以便VH及VL序列表現為連續單一鏈蛋白，VL 及VH區域經由該可撓性連接子彼此連接（參見Bird等人， (1988)5^ζ·βΜ6 242:423-426 ; Huston 等人，（1988)/V〇c· /μ凌心C/Sj 85:5879-5883 ; McCafferty等人， (1990)348:552-554)。 具有如上所述之結合親合力的單一區域VH及VL可藉由 上述方法自單一區域庫中分離。具有所要結合親合力之兩 個VH單一區域鏈（具有或不具有CH1)或兩個VL鏈或一對— 127174.doc •57- 200840592 個VH鏈與一個VL鏈可如本文所述適用於本發明之抗體。 為表現本發明之重組抗體或抗體部分，可將編碼部分或 王長輕鏈及重鏈之DNA插入表現載體中，以致使基因與適 當轉錄及轉譯控制序列操作性連接。關於此點，術語"操 作性連接”將理解為意謂抗體基因與載體以該方式連接以 致載體内之轉錄及轉譯控制序列達到其調節轉錄及轉譯該 抗體基因之預定功能。便利地，選擇表現載體及表現控制 φ 序列以致與所使用之表現宿主細胞一致。可將抗體輕鏈基 因及抗體重鏈基因插入獨立載體中或將基因兩者插入相同 表現載體中，此為常見情況。將抗體基因藉助於標準化方 法（例如藉由連接抗體基因片段及載體上之互補限制裂解 位點，或若不存在限制裂解位點則藉由連接平端）插入表 現載體中。表現載體可能已承載抗體恆定區序列，之後插 入輕鏈及重鏈序列。舉例而言，一種方法為使vh& 乂1序 歹J精由將其插入已分別編碼重鍵及輕鍵恆定區之表現載體 • 中轉化為全長抗體基因，藉此使VH部分與載體内之CH部 分操作性連接以及使v L部分與載體内之c L部分操作性連 接。 另外或者，重組表現載體可編碼易於分泌來自宿主細胞 之抗體鏈的k號肽。該抗體鏈之基因可選殖至載體中，藉 此使框架中之信號肽與抗體鏈基因之N末端連接。信號肽 可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽（亦即，來自非免疫 球蛋白之信號肽）。除抗體鏈基因外，本發明之表現載體 八有在伤主細胞中控制表現抗體鍵基因之調節序列。 127174.doc -58 - 200840592 術語”調節序列”意謂包括控制抗體鏈基因轉錄或轉譯之 啟動子、強化子及其他表現控制因子（例如多聚腺嘌呤信 號）°此種類之調節序列於（例如）Goeddel; 五xpr
Technology: Methods in Enzymology 185 ^ Academic Press ^ San Diego ’ CA(1990)中描述。熟練技術者將鑑別包括選擇調節 序列之表現載體設計可視諸如待轉型之宿主細胞的選擇、 表現蛋白之所要強度等之因素而定。在哺乳動物宿主細胞 中用於表現之較佳調節序列包括在哺乳動物細胞中引起高 效及組成型蛋白表現之病毒因子，諸如來源於細胞巨大病 毒（CMV)之啟動子及/或強化子（諸如CMV啟動子/強化 子）、來源於猴病毒40(SV40)之啟動子及/或強化子（諸如 SV40啟動子/強化子）、來源於腺病毒之啟動子及/或強化子 (例如，腺病毒主要晚期啟動子（AdMLP))及來源於多瘤病 毒之啟動子及/或強化子。為進一步說明病毒調節因子及 其序列，參見（例如）Stinski之美國專利第5，168,062號、 Bell等人之美國專利第4,510,245號及Schaffner等人之美國 專利第4,968,615號。 除抗體鍵及調節序列之基因外，本發明之重組表現載體 可具有諸如在宿主細胞（例如，複製之來源）中調節複製載 體之彼等序列之其他序列及可選標記基因。可選標記基因 易於選擇其中已引入載體之宿主細胞（參見，例如，皆為 Axel等人之美國專利第4,399,216號、美國專利第4,634,665 號及美國專利第5，179,017號）。舉例而言，通常可選標記 基因提供抵抗諸如G418、濕黴素（hygromycin)或曱胺蝶呤 127174.doc -59- 200840592 之、、、田胞毋類藥物之其中已插入載體之宿主細胞。較佳可選 標記基因包括二氫葉酸還原酶（DHFR)基因（以用於經曱胺 蝶吟選擇7擴增之二氫葉酸還原酶宿主細胞中）及新基因（用 於G418選擇）。 為表現輕鏈及重鏈，將編碼該等重鏈及輕鏈之表現載體 藉助於標準化方法轉染至宿主細胞中。術語”轉染’，之各種 形式意欲包含通常用於將外生DNA引入至原核或真核宿主 細胞中之多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE葡 聚糖轉染及其類似技術。雖然理，論上可在原核或真核宿 主細胞中表現本發明之抗體，較佳在真核細胞中表現該抗 體且尤其在哺乳動物宿主細胞中表現該抗體，因為與在原 核細胞中相比’在該等真核細胞且尤其哺乳動物細胞中經 組合及分泌之準確摺疊及免疫活性抗體之概率較高。已報 導抗體基因之原核表現對於產生高產率活性抗體不起作用 (Boss，Μ·Α·及 Wood，C.R.(1985)/mmw/7〇/〇^y 7b心少 6:12-13)。 用於表現本發明重組抗體之較佳哺乳動物宿主細胞包括 CHO細胞（包括描述於 Urlaub及 Chasin，（1980)iVoc· Α^ί/· dead· Scz·. [/以 77:4216-4220 中之 dhfr- CHO細胞，其與如 (例如）R.J. Kaufman及 Sharp(1982)Mo/·別〇/· i59:601_62i 中 所述之DHFR可選標記一起使用）、NSO骨髓瘤細胞、c〇S 細胞及S P 2細胞。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入 哺乳動物宿主細胞中時’藉由培養宿主細胞直至在該宿主 細胞中表現抗體，或較佳使抗體分泌至生長宿主細胞之培 養基中來產生抗體。隨後抗體可精由使用標準化蛋白淨化 127174.doc -60 - 200840592 法自培養基分離。同樣可能使用宿主細胞以產生完整抗體 之部分，諸如Fab片段或scFv分子。上述程序之變化當然 包括於本發明中。舉例而言，可能需要用編碼本發明抗體 之輕鏈或重鏈（而非兩者）之DNA轉染宿主細胞。若存在不 需要與所關注抗原結合之輕鏈或重鏈，可藉助於重組〇1^八 技術部分或完全移除則隨後編碼該輕鏈或該重鏈或兩者之 DNA。由該等截斷之DNA分子表現之分子同樣包括於本發 明之抗體中。另外，可藉由藉助於標準化化學方法使本發 明抗體與第二抗體交聯產生雙功能抗體，其中重鏈及輕鏈 為本發明抗體且其他重鏈及其他輕鏈對於不同於所關注抗 原之抗原具有特異性。 在用於重組表現本發明抗體或其結合抗原之部分之較佳 系統中，藉助於介導磷酸鈣之轉染將編碼抗體重鏈及抗體 輕鏈之重組表現載體引入dhfr· CHO中。在重組表現载體 内，重抗體鏈及輕抗體鏈之基因在各情況下均與調節cMV 強化子/AdMLP啟動子因子操作性連接以實現該等基因之 高效轉錄。重組表現載體亦承載可用於藉由使用甲胺蝶呤 選擇/擴增來選擇經載體轉染之dhfr CHO細胞之DHFR基 因。培養經選擇轉型宿主細胞以便表現重抗體鏈及輕抗體 鏈’且自培養基分離完整抗體。標準化分子生物技術用以 製備重組表現載體，轉染宿主細胞，選擇轉型體，培養該 等宿主細胞且自培養基獲得抗體。因此，本發明係關於藉 由在合適培養基中培養本發明宿主細胞直至已合成本發明 重組抗體來合成本發明重組抗體之方法。該方法可進一步 127174.doc •61 - 200840592 包含自該培養基分離該重組抗體。 作為藉由嗤_體展示師檢重組抗體庫替代方法，熟練技 術者已知之其他方法可用於篩檢較大組合庫以鑑別本發明 抗體。基本上，可使用其中使核酸與藉此編碼之抗體之間 的封閉物理鍵產生且可藉助於其編碼之抗體的特性用以選 擇合適核酸序列之任何表現系統。在替代表現系統系統之 一種類型中，如 Szostak 及 Roberts 之 WO 98/31700，及 Roberts，R.W·及 Szostak，J.W.(1997)Pn % t/M 94:12297-12302中所述，以RNA蛋白融合形式表現重 組抗體庫。在此系統中，承載其3,末端嘌呤黴素之合成 mRNA、肽基受體抗生素的活體外轉譯產生藉由其編碼之 mRNA及肽或蛋白之共價融合。因此，可在經編碼肽或蛋 白（例如抗體或其部分）之特性的基礎上，諸如使該抗體或 其該部分與Αβ(12-42)球體或其衍生物結合，濃縮 mRNA(例如組合庫）複雜混合物之特定mRNA。編碼抗體或 _ 其部分且藉由篩檢該等庫獲得之核酸序列可藉由上述方式 中（例如在哺乳動物宿主細胞中）之重組含義表現且另外可 藉由在其他輪mRNA-肽融合中篩檢，將突變引入至原始經 選擇序列中或在上述方式中使用其他重組抗體之活體外親 合力成熟方法受到進一步親合力成熟。 活體内及活體外方法之組合 本發明之抗體同樣可藉由使用活體内及活體外方法之組 合產生，諸如其中首先可使得Ap(i2-42)球體或其衍生物 在宿主動物中作用於抗體清單上以刺激Ap(i2-42)球體或 127174.doc -62 - 200840592 結合衍生物之抗體產生且隨後藉助於一或多種活體外技術 達到其他抗體選擇及/或抗體成熟之方法。根據一實施 例’此種類之組合方法可首先包含用該A(3(12-42)球體或 其竹生物免疫非人類動物（例如，小鼠、大鼠、兔子、 雞、駱駝、羊或山羊或其轉殖基因形式或嵌合小鼠）以刺 激對抗原之抗體反應且隨後藉由使用已在該Ap(i2_42)球 體或衍生物之作用下活體内刺激之淋巴細胞的免疫球蛋白 序列來製備及篩檢喔菌體展示抗體庫。此組合程序第一步 可以如上所述與活體内方法有關之方式進行，而此程序之 第二步可以如上所述與活體外方法有關之方式進行。由隨 後由該等經刺激淋巴細胞製備之噬菌體展示庫之活體外篩 檢導致超免疫非人類動物之較佳方法包括由Bi〇She Inc•描 述之彼等方法，參見，（例如）wo 98/47343、w〇 91/1727l、us 5,427,908及美國專利第5,580,717號。 根據另一實施例，組合方法包含首先用本發明之Αβ(ΐ2_ 42)球體或其衍生物免疫非人類動物（例如，小鼠、大鼠、 兔子、雞、駱駝、羊、山羊或其基因剔除及/或轉殖基因 形式，或嵌合小鼠）以刺激對該Αβ(12-42)球體或其衍生物 之抗體反應且藉由篩檢融合瘤（例如，由經免疫之動物製 備）來選擇產生具有所要特異性之抗體的淋巴細胞。使抗 體或單域抗體基因自經選擇純系中分離（藉助於標準化選 殖方法，諸如反轉錄酶聚合酶鏈式反應）且經受活體外親 合力成熟以藉此改善經選擇抗體之結合特性。可以如上所 述與活體内方法有關之方式進行此程序之第一步，而可以 127174.doc -63 - 200840592 如上所述與活體外方法有關之方式，尤其藉由使用活體外 親合力成熟之方法（諸如於WO 97/29131及WO 00/56772中 所述之彼等方法）進行此程序之第二步。
在其他組合方法中，藉由使用熟練技術者已知作為選擇 淋巴細胞抗體方法（SLAM)且描述於US 5,627,052、WO 92/02551 及 Babcock，J.S.等人（1996)/Voc· da忒心/· 93:7843-7848中之程序自個別經分離淋巴細胞中產生 重組抗體。在此方法中，首先用Αβ(ΐ2-42)球體或其衍生 物活體内免疫非人類動物（例如，小鼠、大鼠、兔子、 雞、駱駝、羊、山羊或其轉殖基因形式，或嵌合小鼠）以 刺激對該寡聚物或衍生物之免疫反應，且隨後藉由使用抗 原特定溶血斑塊檢定來選擇分泌所關注抗體之個別細胞。 為此目的，可使用諸如生物素之連接子使球體或其衍生物 或所關注之結構上相關之分子與羊紅血球偶合，藉此使能 夠藉由使用溶血性斑塊檢定來鑑別分泌具有合適特異性之 抗體的個別細胞。鑑別分泌所關注抗體之細胞之後，藉由 反轉錄酶PCR自細胞獲得輕鏈及重鏈可變區之cdNA，且 隨後可在諸如COS或CHO細胞之哺乳動物宿主細胞中與合 適免疫球蛋白恆定區（例如，人類恆定區）結合來表現該等 可變區。用來源於經活體内選擇之淋巴細胞的擴增免疫球 蛋白序列轉染之宿主細胞隨後可藉由展開經轉染細胞（例 如）以分離表現具有結合親合力之抗體的細胞來經受進一 步活體外分析及活體外選擇。可另外活體外使用擴增免疫 球蛋白序列。 127l74.doc -64 - 200840592 可藉由施行實質上如上所述之點潰墨法來選擇具有本文 所定義之所需親合力之抗體。簡要地，使抗原與固體基質 連接’較佳以連續稀釋法在硝化纖維膜上打點。隨後使固 定抗原與所關注抗體接觸，之後藉助於結合酶之二次抗體
及比色反應偵測後者；在所定義之抗體及抗原濃度下，所 結合之抗體的量可使得測定親合力。因此，在另外相同點 潰墨法條件下，此處將兩個不同抗體對一個目標之相對親 合力或一個抗體對兩個不同目標之相對親合力定義為所觀 察到之結合目標之抗體的相應量與兩個抗體目標組合之關 係。與如單株抗體10F4或3C5之相同抗原決定基結合之抗 體可以自身已知之方式獲得。 如同如上所述之抗體可得以競爭一樣，若該等結構中之 至少一者能夠較佳藉由提供重疊或相同抗原決定基，更佳 藉由提供相同抗原決定基特定降低與另一結構之可量測結 合，則不同目標結構在本文中稱為特定抗體之"競爭"。對 抗目標實體適用於藉助於其對該等目標結構之相對親合力 直接選擇抗體。因此相對親合力可藉由使用其中使競爭實 體之可區別形式（例如，不同標註之競爭結構）與所關注之 抗體接觸之料衫直接敎，且自藉由抗聽合之該等 實體之相對量推斷抗體對該等實體中之每_者之相對親人 力。該競爭可用以藉由使希望對其有較大親合力之實體鱼 固體基質支撐物連接且添加適量， 平乂 1土兵耳過置之希望對 ί有較小親合力之競爭實體至培養基中直接富集對目標實 體具有所要相對親合力之抗體。因 、 u此展不所要相對親合 127174.doc -65- 200840592 力之抗體W於與基f結合（與與其他結合相比較幻且可 在洗出較少所需形式之後獲得，（例如）藉由在低鹽濃縮下 洗出且隨後藉由將苴自苴許 对，、目具目祆中猎由使用高鹽濃縮可逆分 開來收集結合抗體。若需要，則可施行數輪富集。在本發 明之一料實施例中，其中（例如）在融合瘤或展示抗原之 嗟菌體或酵母細胞的組合中，構成抗體基礎之基因型物理 上與此抗體連接，可維護相應表型。 在本發明之另-實施例中，使用經修改點潰墨法，其中 固定抗原與抗體結合之經溶解實體競爭，以便抗體之相對 親合力可自與固定抗原結合之百分比推斷。諸如㈣及 F(ab h片段之抗體部分可藉由使用諸如用木瓜蛋白酶或胃 蛋白酶消化之傳統方法自全部抗體中產生。另外，抗體、 抗體部分及免疫黏附分子可藉由使用標準化重組dna技術 獲得。 本發明亦係關於包含本發明抗體之醫藥藥劑（組合物）及 視情況醫藥學上合適之載劑。本發明之醫藥組合物可另外 含有至少一種其他治療劑，（例如）一或多種用於治療本發 明抗體可適於使其減緩之疾病的其他治療劑。若（例如）本 舍明之抗體與本發明球體結合，則醫藥組合物可另外含有 一或多種適於治療病症之其他治療劑，其中該球體之活性 具重要性。醫藥學上合適之載劑包括任何溶劑、分散介 質、塗層、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其 類似物，只要其生理學上相容。醫藥學上可接受之載劑包 括（例如）水、生理食鹽水磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘 127174.doc -66- 200840592 油、乙醇及其類似物及其組合。多數情況下，較佳使用等 張劑（例如）糖、諸如甘露醇或山 罕1便用寺 ^糖醇之多元醇或此外之 氣化納。醫藥學上合適之載劑可另外含有相對小量之助劑 :貝J如機丨或乳化劑、防腐劑或緩衝液，其增加抗 體之h㈣功效。例如m合物可適於非經腸投 藥。此處’抗體較佳製備為抗體含量為〇1_25〇一之
注射溶液。可注射溶液可以液體或;東乾形式製備，劑型為 燧石玻璃或小瓶、安瓶或填充式注射器。緩衝液可含有^ 胺酸（1-50福’較佳地5·1〇福）且具有5〇7〇,較佳 之PH值。其他合適緩衝液包括（而不限於）破王白酸納、捧檬 酸鈉/酸鈉或填酸鉀緩衝液。氯化納可用以將溶液之張 力調節至0-300 mM(對於液體劑型較佳為丨別mM)之濃 度。對於雜劑型，防;東劑亦可包括（例如）餘（例如/〇_ 10%，較佳0.5-1.0%)。其他合適防凍劑為海藻糖及乳糖。 對於凍乾劑型，填充劑亦可包括（例如）甘露醇（例如，^ 10%，較佳2-4%)。（例如）L_甲硫胺酸（例如，51_5〇 ， 較佳5-10 mM)之穩定劑可以液體及凍乾劑型使用。其他合 適填充劑為甘胺酸及精胺酸。亦可使用（例如）聚山梨醇酯 8〇(例如，〇·〇.〇5%，較佳〇.〇〇5·〇 〇1%)之界面活性劑。其 他界面活性劑為聚山梨醇酯20及BRIJ界面活性劑。 本發明之組合物可具有多種形式。該等包括液體、半固 體及固體劑型，諸如液體溶液（例如可注射及能注入之溶 液）、分散液或懸浮液、錠劑、藥丸、粉劑、脂質體及栓 劑。較佳形式視投藥之預定種類及治療劑之應用而定。通 127174.doc -67- 200840592 吊，較佳為可注射或能注入溶液形式之組合物，例如類似 、；用於人類被動免疫之其他抗體之組合物。較佳投藥途徑 2非經腸投藥(例如’靜脈内、皮下、腹膜内或肌肉内投 二根據較佳實施例，抗體藉由靜脈内注入或注射投 與。根據另-較佳實施例，抗體藉由肌肉内《皮下注射投 /、在製備及儲存條件下，治療劑組合物通常必須為無菌 的及穩定的。組合物可調配為溶液、微乳液、分散液、脂 :體或適於高濃度活性物質之其他有序結構。無菌可注射 二j可藉由將活性化合物（亦即，抗體）以所需量引入合適 ，：中中如需要適當具有一種上述成份或上述成份之 組合，且隨後無菌濾過器該溶液來製備。分散液通常藉由 將活性化合物引入含有鹼性分散介質之無菌媒劑中，及若 適田引入其他所需成份來製備。在用於製備無菌可注射溶 ，之無«♦乾㈣之情況下，真空乾燥及喷霧乾燥為較佳 製備方法，其產生活性成份之粉劑及其中適當具有來自先 珂無菌濾液之其他所要成份。溶液之恰當流動性可藉由使 用::丨如)諸如㈣醋之塗層，藉由保持所需粒度(在分散液 之情況下）或藉由使用界面活性劑來保持。可注射組合物 之長期吸收可藉由另外向組合物引入延遲吸收之藥劑（例 如單硬脂酸鹽及明膠）來實現。 、、雖然對於多數治療劑應用而言，投藥之較佳種類為皮下 〜射靜脈内注射或注人，但本發明之抗體可藉由熟練技 :者所已知之多種方法投與。熟練技術者將鐘別視所要之 、口果而疋之投藥途徑及/或種類。根據特定實施例，活性 127174.doc • 68 - 200840592 化曰物可用保護化合物以抵抗快速釋放之載劑（諸如具有 持續或控制釋放之調配物）製備，其包括植入物、經皮膏 藥及微囊密封釋放系統。可使用生物學上可降解之生物相 容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、 膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。製備該等調配物方法已為 熱練技術者所熟知；參見，例如，⑽d 心/e·仏叹仏"卿少办以_，j R R〇bin_編，Mareel Dekker，
Inc·，New York，1978 〇 根據特定實施例，本發明之抗體可（例如）以惰性稀釋劑 或可代謝食品載劑形式經口投與。將抗體（若需要，及其 他成份）亦可密封於硬或軟膠囊中、壓縮為錠劑或直接添 加至食品中。對於口服治療投藥而言，抗體可與賦形劑混 a且以口服錠劑、口腔錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿及 其類似物形式使用。若預定經由除非經腸途徑外之途徑投 與本發明抗體，則自阻止其純化之物質中選擇塗層可能為 必要的。 本發明亦係關於在遭受病症之個體中抑制本發明球體之 活险的方法，其中涉及β澱粉樣蛋白且尤其重要的為本發 明之該等球體之活性。該方法包含向個體投與至少一種本 發明之抗體以抑制與抗體結合之球體的活性。該個體較佳 為人類。為達到治療之目的，可向人類個體投與本發明之 抗體。此外，為獸醫學目的或在具有特定病症動物模型之 範圍内，可將本發明之抗體投與非人類哺乳動物中。該等 動物杈型可適用於評估本發明抗體之治療效能（例如對於 127174.doc •69- 200840592 測試劑量及投與之時間歷程）。 其中本發明球體起重要作用之病症尤其包括本發明球體 包含於其發展及/或進程中之病症。該等尤其為其中本發 明球體明顯或大概地為形成該病症之病理生理學原因之彼 4病症或為促使該病症之發展及/或進程之因素。因此， 此處包括彼等病症，其中抑制本發明球體之活性可減輕病 症之症狀及/或進程。該等病症可藉由（例如）在遭受特定病 症之個體的生物流體中本發明球體濃度之增加（例如，在 血清、血漿、CSF、尿等中其濃度之增加）來驗證。此可藉 由（例如）使用本發明之抗體來偵測。在與多種其中包括神 經變性因子、認知能力不足、神經毒性因子及發炎性因子 之病症相關的病理學中本發明球體起重要作用。 在本發明之另一態樣中，可治療或預防之病症包括與澱 粉樣變性病相關之彼等病症。本文之術語，，澱粉樣變性病，， 表不特徵為在身體之各種組織中特定蛋白之異常摺疊、凝 塊、凝集及/或積聚（澱粉樣蛋白、纖維狀蛋白及其前驅體) 之大量病症。在阿茲海默氏病及唐氏症候群中，神經組織 文影響，且在大腦澱粉樣血管病變（CAA)中，血管受影 響。 如 本發明之醫藥組合物可包括，，治療有效量，，或”預防有效 s之本發明抗體或抗體部分。"治療有效量”係指在劑量 下且經歷一端必要時間有效實現所要治療結果之量。治療 有效劑量之抗體或抗體部分可由熟習此項技術者測定且可 根據諸如個體之疾病狀況、年齡、性別、及重量之因素及 127174.doc 200840592 、固體中抗體或抗體部分引起所要反應之能力而變化。治 =有欢置亦為其中治療上有益效應超過抗體或抗體部分之 π可有I或有害效應之量。"預防有效量"係指在劑量下且 、歷端必要時間有效實現所要預防結果之量。通常，因 為預防劑量在疾病之前或在疾病早期用於受檢者，故預防 有效量將小於治療有效量。
此外，本發明包括預防或治療需要該預防或治療之患者 的阿雔海默氏病之其他方法。此方法包含向患者投與足以 實現預防或治療之量的上述疫苗之步驟。
另外本發明涵蓋鑑別適合於預計將產生澱粉樣變性病 (例如阿茲海默氏病)之患者的自動免疫之化合物的方法。 此方法包含以：υ在足以使一或多種化合物與一或多種抗 體結合之時間及條件下將所關注之一或多種化合物暴露於 ^上所述抗體中之-或多者下；2)鑑別與—或多種抗體結 ^之彼等化合物’該經鑑別化合物將用於預計產生殿粉樣 變性病（例如阿茲海默氏病）之患者的自動免疫。 在抗體之診斷價值之範圍内，定性或定量特定球體測定 尤其適於診斷疾病相關之澱粉樣β形式。關於此點，特異 性思谓能偵測具有充足靈敏度之特定球體或其衍生物，或 其混合物之可能性。本發明之抗體有利地具有樣品之小於 10 ng/mL，較佳樣品之小於！ ng/mL及尤其較佳樣品之小 於1〇〇 Pg/mL之谓測臨界濃度，意謂每品之球體濃度 至少亦有利地指示在各情況下較低之濃度可藉由本發明之 抗體偵測。免疫地進行該偵測。此可大體上藉由使^於其 127174.doc -71 · 200840592 中使用抗體之分析診斷檢定方法來進行，纟包括凝集及沈 澱技術、免疫檢定、免疫組織化學方法及免疫墨點技術， 例如西方墨點法或較佳點潰墨法。此處亦包括例如成像方 法之活體内方法。 在免疫檢定中之使用係有利的。競爭性免疫檢定，亦即 其中抗原及標記抗原（示蹤物）競爭以使抗體結合之檢定； 與夾層免疫檢定，亦即其中特定抗體與抗原之結合藉由第 二通常標註抗體偵測之檢定均合適。該等檢定可為均質的 (亦即不分離為固體及液體相）或異質的（亦即結合標註物 (例如）經由固相結合抗體與非結合標註物分離）。視標註及 測量方法而定，可將各種異質及均質免疫檢定形式區分為 特定種類，例如RIA(放射免疫測定）、ELISA(酶聯免疫吸 附測定）、FIA(螢光免疫檢定）、LIA(發光免疫檢定）、 TRFIA(時差式FIA)、IMAC(免疫活性）、EMIT(酵素多重免 疫測試）、TIA(濁度免疫檢定）、][_pcR(免疫pCR)。 對於本發明之球體量化，較佳為競爭性免疫檢定，其中 所定義量之用作示蹤物之標註球體衍生物與待量化之樣品 球體（含有未知量之未標記球體）競爭以與所用之抗體結 ^即一轉 | 經取代之示蹤物的量來確定。 對於可為達到該等目的購得之標註物，已證明酶類係有 利的。例如，可使用基於過氧化酶，尤其辣根過氧化物 酶、鹼性磷酸酶及β-D-半乳糖苷酶之系統。可光度測定地 監測其轉化之特定受質可（例如）自該等酶類獲得。合適受 127174.doc -72- 200840592
質系統係基於鹼性磷酸酶之對硝基苯磷酸酯（對NPP)、5_ 溴-4-氯引u朵基磷酸酯“肖基藍四唑鏽（BCIp/NpT)、堅固 紅/萘酚-AS-TS磷酸酯；過氧化酶之2,2-次偶氮基雙（3-乙 基苯幷噻唾啉冬磺酸）(ABTS)、鄰苯二胺（OPT)、3,3，，5,5匕 四曱基聯苯胺（ΤΜΒ)、鄰聯茴香胺、5-胺基水揚酸、3_二 甲基胺基苯甲酸（DMAB)及3-甲基-2-苯幷噻唑啉膝 (ΜΒΤΗ) ; β-D-半乳糖苦酶之鄰；5肖基苯_p-D_半乳糖苷（鄰 NPG)、對硝基苯|D_半乳糖苷及4_曱基繳形酮+D_半乳 糖苷（MUG)(4-methylumbelliphenyl+D-galactoside)。在多 數情況下’該等受質系統可以即用形式（例如以錠劑形式） 構得’其亦可含有諸如適當缓衝液及其類似物之其他試 劑。所用之示蹤物可為標註球體。在此意義上，特定球體 可藉由標註待測定之球體及將其用作示蹤物來確定。用於 製備示蹤物之標註物與球體之偶合可以自身已知之方式進 行。以上對本發明球體之衍生作用的註解藉由類比來參 考。此外，可獲得大量用以與蛋白結合之經適當修改之標 註物，例如生物素結合酶、抗生物素蛋白結合酶、超抗生 物素蛋白結合酶或鏈黴抗生物素結合酶、順丁烯二醯亞胺
適萬竹生之球體直接反應以提供不縱物。若使用（例如）鏈 黴抗生物素過氧化酶結合物，則隨後此首先需要生物素化 球體。此相應地應用於相反次序。此目的之合適方法亦為 熟練技術者所已知。 若選擇異質免疫檢定形式，則抗原抗體複合物可藉由使 127174.doc -73- 200840592 其與支撐物結合來分離’例如經由與該支撐物偶人之浐個 體型抗體（例如對準兔子IgG之抗體）。適當支樓:^盆 用適當抗體塗佈之微量滴定盤已知且部分可購得。 ’、 本發明進-步係關於具有至少—種如上所述:體及直他 組份之免疫檢定裝置。該Μ置通f為成套^，用ς進 行本發明球體測定之構件之組合的形式。為達到儘可能容 易於刼作之目的，該等構件較佳以實質上即用之形式 供。有利配置提供以套組形式免疫檢定。套組通常包工 個用於單獨配置組份之容器。所有組份可以㈣稀釋物， 用於稀釋之濃縮物或用於溶解或懸浮之乾燥物質或⑼於 劑形式提供；個別或所有組份可冷;東或在室溫下儲存= 使用。血清較佳震盪冷凍，例如在，。〇下以致在該等情 況下使用之前免疫檢定必須較佳維持凝固點以下溫度 免疫檢定提供之其他組份視該免疫檢定之類型：：。通 常，標準蛋白、可能或不可能需要之示縱物及對照金清一 起為抗血清而提供。另夕卜’亦可包括微量滴定板(較佳姐 抗體=佈）、用於（例如）測試、絲或轉化受質之緩衝液^ S#受質本身。 —H蚊U⑽良核细歎 1 體的產生及用途可（例如）於AntibGdies，A Laborato
ManuaKHaHow, E.^Lane D.^ , c〇ld Spring ^ ?
Cold Spring Harbor，NY，1988)中發現。 本發明亦包括在懷疑具有殿粉樣變性病(例如阿茲海默 氏病）之患者中診岐粉樣變性病（例如阿兹海默氏病）之方 127I74.doc •74- 200840592 法。此方法包含以下步驟·· 1}自患者上分離生物樣品；2) 在足以形成抗原/抗體複合物之時間及條件下使該生物樣 品與如上所述抗體中之至少一者接觸；及3)偵測該樣品中 抗原/抗體複合物之存在，複合物之存在指示患者中澱粉 樣變性病（例如阿茲海默氏病）之診斷。抗原可為（例如）球 體或與完整球體具有相同功能特性（例如，結合活性）之其 部分或片段。 ^ 另外，本發明包括在懷疑患有澱粉樣變性病（例如阿茲 海默氏病）之患者中診斷澱粉樣變性病（例如阿茲海默氏病） 之另一種方法。此方法包含以下步驟：1}自患者上分離生 物樣品·’ 2)在足以形成抗體/抗原複合物之時間及條件下使 該生物樣品與抗原接觸；3)在足以使得結合物與經結合抗 體結合之時間及條件下將結合物添加至所得抗體/抗原複 合物中，其中該結合物包含與能夠產生可偵測信號之信號 產生化合物連接之如上所述抗體中之一者；及句藉由㈣ 由信號產生化合物所產生之信號來偵測可能存在於生物樣 品中之抗體的存在，該信號指示患者切粉樣變性病（例 如，阿茲海默氏病）之診斷。抗原可為球體或與完整球體 本發明包括在懷疑患有澱粉樣變性病（例如阿茲海默氏 病）之患者中診斷澱粉樣變性病（例如阿茲海默氏病）之其他 方法。此方法包含以下步驟：υ自該患者上分離生物樣 品；2)在足以使得形成抗_抗體/抗體複合物之時間及條件 下使生物樣品與抗-抗體接觸（其中該抗-抗體對於如上所述 127174.doc -75- 200840592 抗體中之一者具特異性），該等複合物含有存在於該生物 樣品中之抗體；3 )在足以使得結合物與經結合抗體結合之 日寸間及條件下將結合物添加至所得抗-抗體/抗體複合物 中’其中該結合物包含與能夠產生可偵測信號之信號產生 化合物結合之抗原；及4)偵測由信號產生化合物產生之信 號，該信號指示患者中澱粉樣變性病（例如，阿兹海默氏 病）之診斷。 馨 本發明亦包括包含以下之套組：a)如上所述抗體中之至 少一者及b)包含與信號產生化合物連接之抗體的結合物， 其中該結合物之抗體不同於經分離抗體。 本發明亦涵蓋包含以下之套組：a)對於如上所述抗體中 之一者之抗-抗體及b)包含與信號產生化合物連接之抗原的 結合物。抗原可為球體或與球體具有相同功能特徵（例 如’結合活性）之其片段或部分。 在本發明之一種診斷實施例中，使本發明之抗體或其一 φ 部分塗佈於固相上（或存在於液相中）。隨後使測試或生物 樣°Π (例如’全血、腦脊髓液、血清等）與固相接觸。若抗 原（例如，球體）存在於樣品中，則該等抗原與抗體於固相 合摘測複合物本身之存在及因此抗原之存在。在間接法 中’將結合物添加至所結合之抗原中。結合物包含與信號 產生化合物或標註物連接之第二抗體，其與所結合之抗原 、、ϋ 口。第二抗體應與所結合之抗原結合，信號產生化合物 產生可量測信號。隨後該信號指示測試樣品中抗原之存 127l74.doc •76- 200840592 在。用於診斷免疫檢定之固相之實例為多孔及無孔物質， 乳膠粒子、磁性粒子、微粒（參見美國專利第5,7〇5,33〇 唬）、珠粒、薄膜、測試孔及塑膠管道。固相物質之選擇 及標註存在於結合物中之抗原或抗體之方法（若需要）基於 所要檢定形式效能特徵確定。 如上所述，結合物（或指示劑）將包含與信號產生化合物 或標註物連接之抗體（或可能為抗_抗體，視檢定而定）。此 信號產生化合物或"標註物”本身可偵測或可與一或多種其 他化合物反應以產生可偵測產物。信號產生化合物之實例 包括色原體、放射性同位素（例如，i 25^、η ^ ^、3 2p、 3H、35S及14C)、化學發光化合物（例如，丫錠）、粒子（可 見或螢光的）、核酸、複合劑或諸如酶類（例如，鹼性磷酸 酶、酸性磷酸酶、辣根過氧化物酶、卜半乳糖苷酶及核糖 核酸酶）之催化劑。在使用酶類（例如，鹼性磷酸酶或辣根 過氧化物酶）之情況下，色原、發螢光或發光受質引起可 4貞測h號之產生。諸如時間分辨螢光、内部反射螢光、擴 增（例如，聚合酶鏈式反應）及拉曼光譜法（Raman spectroscopy) 之其他偵測系統亦有效。可藉由上述免疫檢定測試之生物 組織及細胞之水性萃取液或有機水性萃取物。 本發明亦涵蓋在測試樣品中偵測抗體存在之方法。此方 法包含以下步驟：（a)在足以使得形成抗-抗體/抗體複合物 之時間及條件下使測懷疑含有抗體之試樣品與對於患者樣 品中之抗體特定之抗-抗體接觸，其中抗·抗體為與患者樣 127174.doc -77· 200840592 品中之抗體結合之本發明抗體；（b)將結合物添加至所得 抗-抗體/抗體複合物中，結合物包含與能夠偵測可摘測作 號之信號產生化合物連接之抗原（其與抗-抗體結合）·及 (C)藉由偵測由信號產生化合物產生之信號來偵測可能存在 於測試樣品中之抗體的存在。可使用控制器或校準器，其 包含針對抗-抗體之抗體。 八 I組亦包括於本發明之範疇内。更特定言之，本發明包
括確定懷疑患有阿兹海默氏病之患者中抗原(例如，：：) 或特徵為認知能力障礙之另一病狀之存在的套組。詳+ 之’在測試樣品中確定抗原存在之套組包含a)如本文所二 義之抗體或其部分；及b)包含與能夠產生可偵測信號之信 號產生化合物連接之第二抗體（對於抗原具有特異性）之社 :物。套組亦可含有包含與抗原結合之試劑的控制器或二 標器以及描述當進行檢定時待使用之程序的包裝說明書。 本I明亦包括在測試樣品中偵測抗體的套組。套組可包 含a)對所關注抗體特定之抗·抗體（例如，本發明中之一者） =如上所定義之抗原或其部分。亦可包括包含與抗原結 的控制器紋標器。更蚊言之套組可能包含a) 子於抗體特定之抗-抗體（諸如本 能豹姦1 甲之一者）及b)包含與 月匕夠產生可偵測信號之信號產生 如，球體)的結合物。此外，套接之抗原(例 合之試劑的控制器或定標器以及 使用之勺壯 及描述套組組份及其將如何 條帶二：說明書。套組亦可包含-個諸如小瓶、瓶子或 w(各容器具有預置固相）及其他含有相應結合物 127174.doc -78· 200840592 之谷裔。該專套組亦可含有小瓶或具有需要施行檢定之其 他試劑（諸如洗滌試劑、加工試劑及指示劑）之容器。 亦應注意本發明不僅包括如上所述全長抗體且亦包括其 部分或片段，例如其Fab部分。另外，本發明涵蓋對於所 存在抗體在（例如）結合特異性、結構等方面具有相同特性 之任何抗體。 本發明之優點： 藉由用Αβ( 12-42)球體免疫（如實例I中所述）可獲得不同 單株抗體，其在其對於如藉由如上所述比較點潰墨法確定 之不Αβ(1-42)募聚物及Αβ(χ_42)募聚物之容許度或鑑別上 有差異。此可使得顯影指向Αβ募聚物之抗體，該等寡聚物 具有認識增強效應（所要特性超過其他Αβ形式）及極小副作 用概況之間的最佳關係。相同保持對用於被動免疫之單株 抗體成立。用於免疫（主動及被動）之該特定策略之優點為 其不誘導抵抗Αβ單體、凝集之原纖狀態之肽或sAppa之 免疫反應。此在數個方法中為有利的： 1) 在不浴Αβ斑塊之形式下，凝集之原纖狀態之肽相當 於AD腦中總體Αβ肽組合之主要部分。認為藉由溶解經 抗Αβ抗體與该專斑塊反應誘導之Αβ斑塊來大規模釋放 Αβ係有吾的。此大規模釋放Αβ隨後將穿過血腦障壁， 進入血流中且可能增加微出血之風險。此外，在上述 ELAN試驗中，由於有6%病例發作腦膜腦炎，用原纖 Αβ形式免疫之此特殊策略需要取消該試驗。 2) 指向單體Αβ肽形式之免疫反應係不良的，因為其可表 127174.doc -79- 200840592 明後者可發揮認識增強效應。 )扣向sAPPa之免疫反應同樣不良，因為此可能導致具 有生理孚上出現前驅體蛋白App之反應且因此導致自 身免疫反應。此外，sAPP(^^顯示發揮認識增強效 應。 4) 避免以CAA形式指向血管Αβ肽之反應以避開微出血之 不良副作用（亦即，當與該抵抗Ν末端相比時，抗體對 準Αβ之中心部分且其此外不與以CAA形式凝集之Αβ肽 結合誘導較少微出血，參見上文）。 5) 對於病理生理學上相應之Α(3物種，特定與八口寡聚物反 應之抗體將具有較高生物可用性，因為其將不與（例 如）原纖或單體Αβ結合且因此使對於治療效應無效。 此外，應注意本發明之抗體及尤其1〇]?4及3(：：5不（或與可 購付之類抗體6Ε10相比具有較低結合親合力（Signet，目錄 唬· 9320))偵測腦脊髓液中之澱粉樣β。因此，由於cSF中 之澱粉樣β之高周轉率，故抗體與CSF中之澱粉樣β之此結 合不足阻止抗體之消耗，以及引起與與體内（例如，腦及 CSF)發現之所有澱粉樣β結合之彼等抗體相比更有效及更 八込擇性之系統。另外，本發明抗體之此特性可使得減少 待投與之抗體的量（與被動免疫有關），降低副作用之風險 (口為背j里較低藉此限制針對目標之抗體），增加功效以及 增加治療指數。另外，亦降低微出血之風險。另外，因為 抗體不偵測澱粉樣β之原纖形式，故亦降低與該複合物形 成相關之風險。 127174.doc 200840592 寄存資訊： 在2006年2月28曰，將產生單株抗體3C5之融合瘤 (1^[[45-3〇5.5 0：10)依據布達佩斯條約（]811(1叩6^1^&以）寄存 於美國菌種保存中心，10801 University Boulevard ’ Manassas ’ Virginia 20110，且指定 ATCC編號為 PTA-7406。在 2006 年8 月16日，將產生單株抗體10F4之融合瘤（ML43-10F4.3H8) 依據布達佩斯條約寄存於美國菌種保存中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110，且指定 ATCC編號為 PTA-7808。 本發明可藉由使用以下非限制性實例來說明：
實例I 製備用於免疫之Αβ(12-42)球體
使 Αβ(12-42)合成肽（AnaSpec Inc· ; Lot # 40443)以 40 mg/mL(於 125 μί HFIP 中 5 mg)懸浮於 100% (v/v)l，l，l，3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP)中且為使其完全溶解在 37°C下在震盪下培育1 h。HFIP作為氫結合解聚劑且用以 消除Αβ肽中預存在之結構多相性。在1 〇〇〇〇 g下離心1 〇 min之後，用6·1 mL磷酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS)(2〇 mM
NaH2P04 ’ 140 mM NaCl ’ pH 值為 7.4)稀釋 HFIP 溶解之 Αβ(12-42)之上清液且添加625 pL 2% (w/v)之十二烷基硫 酸鈉（SDS)(於H20中）（最終濃度為〇·4% (w/v)SDS)且在37它 下進一步培育3h。用7mL H^O稀釋溶液且在37。〇下培育 16 h。在 3000 g下離心 1〇 min之後，用 15 mL pBS(2〇 mM
NaH2P〇4，140 mM NaCl ’ pH值為7·4)進一步稀釋上清液 127I74.doc -81 - 200840592 且藉由超濾（截留分子量5 kDa)濃縮至0.65 mL，在室溫下 經 20 mM NaH2P04，140 mM NaCl，0.05% (w/v)SDS(pH值 為7·4)透析16 h，在10000 g下離心10 min且抽取包含 Αβ(12-42)球體之上清液。將樣品等分且儲存於-80°C下直 至進一步使用。
實例II 製備單株抗體3C5及10F4 將Balb/c小鼠用50 pg於CFA(Sigma)中之如實例I中所述 Αβ(12-42)球體皮下免疫且在一個月間隔時間内加強兩 次。收集脾且藉由PEG程序以5:1比率使小鼠骨髓瘤SP2/0 細胞與脾細胞融合。以2χ 105細胞/mL、每孔200 mL將融 合細胞塗於96孔板上偶氮絲胺酸/次黃嘌呤選擇培養基 中。可使得細胞生長以形成可見菌落且上清液藉由直接 ELIS A檢定來檢定Αβ募聚物反應性。藉由限制稀釋法次選 殖分泌針對Αβ寡聚物之抗體的融合瘤，直至抗體表現顯得 穩定。
實例III 抗Αβ球體抗體選擇性之點潰墨法概況 為特性化單株抗Αβ球體抗體之選擇性，用不同Αβ形式 探測其以鑑別。為此目的，產生100 pmol/pL至0.01 pmol/pL範圍内之於用0.2 mg/mL BSA補充之PBS中之個別 Αβ形式的連續稀釋物。將1 μί各樣品塗於硝化纖維薄膜 上。為偵測，使用相應抗體（0.2 pg/rnL)。使用結合抗小鼠 IgG及染色劑BM Blue POD受質（Roche)之過氧化酶進行 127174.doc -82- 200840592 免疫染色。 用於點潰墨法之Ap標準物： 1·Αβ(1·42)單體，0·1%ΝΗ4ΟΗ 將 1 mg Ap(l-42)(Bachem Inc.，目錄號：η-1368)溶解於 0.5 mL 於 Η20 中之 0.1% ΝΗ40Η(新製備）（=2 mg/mL)中且立 即在室溫下震盪30 sec以獲得澄清溶液。為進一步使用將 樣品儲存於-20°C下。 2.Αβ(1-40)單體，0·1%ΝΗ4ΟΗ 將 1 mg Ap(l-40)(Bachem Inc.，目錄號：η_13 68)溶解於 0.5 mL於 Η2Ο 中之 〇· 1% ΝΗ4〇Η(新製備）(=2 mg/mL)中且立 即在室溫下震盪3〇 sec以獲得澄清溶液。為進一步使用將 樣品儲存於-20°C下。
3·Αβ(1-42)單體，0.1%NaOH 將 2·5 mg Ap(l-42)(Bachem Inc·，目錄號：H-1368)溶解 於0.5 mL於中H20之0.1% NaOH(新製備）(=5 mg/mL)中且 立即在室溫下震盪30 sec以獲得澄清溶液。為進一步使用 將樣品儲存於-20°C下。
4·Αβ(1_40)單體，0.1%NaOH 將 2·5 mg Ap(l-40)(Bachem Inc·，目錄號：H-1368)溶解 於0.5 mL於H20中之0.1% NaOH(新製備）（=5 mg/mL)中且 立即在室溫下震盪30 sec以獲得澄清溶液。為進一步使用 將樣品儲存於-20°C下。 5· Αβ(1-42)球體 使 Αβ(1-42)合成肽（Η-1368，Bachem，Bubendorf， 127174.doc -83 - 200840592
Switzerland)以 6 mg/mL懸浮於中 100% 1，1，1，3,3,3·六氟 _2-丙醇(HFIP)中且為使其完全溶解在37°C下在震盪下培養1.5 h。 將HFIP用作氫結合解聚劑且用以消除Αβ肽中預存在之結 構多相性。藉由在SpeedVac中蒸發來移除HFIP且Αβ(1-42) 以5 mM之濃度再懸浮於二曱亞砜中且超聲處理20 s。將 HFIP預處理之Αβ(1-42)於磷酸鹽缓衝生理食鹽水（PBS)(20 mM NaH2P04，140 mM NaCl，pH值為 7.4)中稀釋至 400 μΜ且添加1/10體積2%十二烷基硫酸鈉（SDS)(於H20中）（最 終濃度為0.2% SDS)。在37°C下培育6 h產生16/20-kDa Αβ(1-42)球體（球狀募聚物之簡略形式）中間體。38/48-kDa Αβ(1-42)球體藉由用3倍體積之H20進一步稀釋物產生且在 37°C下培育18 h。在3000 g下離心20 min之後，樣品藉由 超濾（截留分子量30-kDa)濃縮，經5 mM NaH2P04、35 mM NaCl(pH值為7.4)透析，在10000 g下離心10 min且取出含 有38/48-kDa Αβ(1-42)球體之上清液。作為透析之替代方 法，38/48-kDa Αβ(1-42)球體亦可在4°C下藉由九倍過量 (v/v)之冰冷甲醇/乙酸溶液（33%甲酵，4%乙酸）沈澱1 h。 隨後將38/48-kDa Αβ(1-42)球體顆粒化（在16200 g下10 min)，再懸浮於5 mM NaH2P04，35 mM NaCl(pH值為 7.4) 中，且將pH值調節至7·4。 6· Αβ(12-42)球體 使2 mL根據實例3 ·5(參見上文）製備之Αβ(1 -42)球體製劑 與38 mL緩衝液（5 mM磷酸鈉、35 mM氯化鈉，pH值為7.4) 及150 μΐ於H20中之1 mg/mL GluC胞内蛋白酶（Roche)混 127174.doc -84· 200840592 合。在室溫下將反應混合物攪拌6 h，且另外隨後添加15() μ!>於H20中之1 mg/mL GluC胞内蛋白酶（R0che)。在室溫ητ 將反應混合物再搜拌16 h，之後添加8 pL 5 M DIFP(二異 丙基氟磷酸鹽）溶液。將反應混合物15 mL 3〇 kDa Centdprep管濃縮至約1 mL。將濃縮物與9 mL緩衝液（5 mM磷酸鈉，35 mM氣化鈉，pH值為7.4)摻合且再濃縮至 1 mL。在6°C下於透析管中經1 L緩衝液（5 mM磷酸鈉，35 mM NaCl)透析濃縮物16 h。用於H20中之1〇/0濃度之SDS溶 液將透析液調節至S D S含量為0 · 1 %。藉由在1 〇 〇 〇 〇 g下離心 10 min移除樣品且移除上清液。 7· Αβ(20-42)球體 使1.59 mL根據實驗2·5(參見上文）製備之Αβ( 1-42)球體 製劑與38 mL緩衝液（50 mM MES/NaOH，pH值為7.4)及200 pL於出0中之1 mg/mL嗜熱菌蛋白酶溶液（Roche)摻合。在 室溫下攪拌反應混合物20 h。隨後添加80 pL於H20中之 100 mM EDTA溶液（pH值為7.4)且用400 pL 1%濃度之SDS 溶液將混合物再調節至SDS含量為0.01%。經由15 mL 30 kDa Centriprep管將反應混合物濃縮至大約1 mL。將濃縮 物與 9 mL缓衝液（50 mM MES/NaOH，0.02% SDS，pH值為 7.4)摻合且再濃縮至1 mL。在6°C下於透析管中經1 L緩衝 液（5 mM填酸鈉，35 mM NaCl)透析濃縮物16 h。用於H20 中之2%濃度之SDS溶液將透析液調節至SDS含量為0·1%。 藉由在10000 g下離心10 min移除樣品且移除上清液。 8. Αβ(1-42)原纖維 127174.doc -85- 200840592 將1!1^人0(1-42)(6&〇1^111111(：.，目錄號：11-1368)溶解於 500 mL水性0.1% NH4OH(Eppendorff管）中且在室溫下將樣 品攪拌 1 min。用 300 μΕ 20 mM NaH2P04 ; 140 mM NaCl(pH值為7·4)中和100 pL此新製備之Αβ(1·42)溶液。用 1% HC1將pH值調節至pH值為7.4。在37°C下將樣品培育 24 h且離心（在10000 g下10 min)。去除上清液且用400 μί 20 mM NaH2P04 ; 140 mM NaCl(pH值為 7.4)藉由渦動 1 min 將原纖維顆粒再懸浮。 9. sAPPa 由 Sigma提供（目錄號：S9564 ;於 20 mM NaH2P04 ; 140 mM NaCl(pH值為 7.4)中 25 pg)。用 20 mM NaH2P04，140 mM NaCl(pH 值為 7.4)，0.2 mg/mL BSA 將 sAPPa 稀釋至 0·1 mg/mL(= 1 pmol/pL) ο 用於點溃墨法之物質： Αβ-標準物： 用 20 mM NaH2P04，140 mM NaCl(pH 值為 7·4)+ 0·2 mg/mL BSA連續稀釋Αβ抗原
1) 100 pmol/pL
2) 10 pmol/pL
3) 1 pmol/pL
4) 0，1 pmol/pL 5) 0,01 pmol/pL 硝化纖維：
轉印槽轉移介質，純硝化纖維膜（0·45 μπι) ; BIO-RAD 127174.doc -86 - 200840592 抗小鼠POD : 目錄號：715-035-150(Jackson Immuno Research) 偵測劑： BM Blue POD受質，沈殿（Roche) 牛血清白蛋白，（BSA): 目錄號：A-7888(SIGMA) 阻斷劑： 於TBS中之5%低月旨肪牛奶 ® 緩衝溶液：
TBS 25 mM Tris/HC,l 緩衝液（pH 值為 7.5)
+ 150 mM NaCl TTBS 25 mM Tris/HCl緩衝液（pH值為 7_5) + 150 mM NaCl + 0.05%吐溫 20(Tween 20)
PBS + 0.2 mg/mL BSA 20 mM NaH2P04緩衝液（pH值為 7.4) + 140 mM NaCl + 0.2 mg/mL BSA 抗體溶液I : 0.2 pg/mL在20 mL於TBS中之1%低脂肪牛奶中稀釋之 抗體 抗體溶液II : 127174.doc -87- 200840592 1:5000之稀釋液 在於TBS中之1%低脂肪牛奶中之抗小鼠p〇D 點潰墨法程序： 1) 將1 μί不同Αβ標準物（於其5次連續稀釋中）中之每一 者以距彼此約1 cm之距離塗於硝化纖維膜上。 2) 可使得Αβ標準物點在室溫（RT)下於空氣中在硝化纖 維膜上乾燥至少1 〇 min(=點潰墨）。 3) 阻斷： 春 在室溫下用30 mL於TBS中之5%低脂肪牛奶培育點 潰墨1.5 h。 4) 洗滌： 丢棄阻斷液且在室溫下在震盪下用20 mL TTBS培育 點潰墨10 m i η。 5) 抗體溶液I : 丟棄洗滌緩衝液且在室溫下用抗體溶液〗培育點潰墨 2 h 〇 ^ • … 6) 洗滌： 丟棄抗體溶液I且在室溫下在震盪下用2〇 mL ttbs 培育點潰墨10 min。丟棄洗滌液且在室溫下在震盪 下用20 mL TTBS培育點潰墨1〇 min。丟棄洗務液且 在室溫下在震盪下用20 mL TBS培育點漬墨〗〇爪比。 7) 抗體溶液II : 丟棄洗滌緩衝液且在室溫下用抗體溶液育點潰 墨隔夜。 127174.doc -88 - 200840592 8) 洗滌： 丟棄抗體溶液II且在室溫下在震盪下用2〇 mL TTBS 培育點潰墨10 min。丟棄洗滌液且在室溫下在震盪 下用20 mL TTBS培育點潰墨10耵比。丟棄洗滌液且 在室溫下在震盪下用20 mL TBS培育點潰墨1〇 min。 9) 顯影： 丟棄洗滌液。用10 mL BM Blue POD受質顯影點潰 墨10 min。藉由用H2〇劇烈洗滌點潰墨停止顯影。使 • 用點密度之密度測量分析（GS800密度計（BioRad)及 軟件成套設備Quantity one，4.5.0版本（BioRad))進 行定量評價。僅評價具有Αβ(20-42)球體之最後光學 上清楚鑑別之點的相對密度大於20%之相對密度之 點。對於每一點潰墨獨立地測定此臨限值。計算值 指示Αβ(1-42)球體鑑別與抗體給定之相應β形式之間 的關係。 測試之單株抗體藉由用Αβ(1 2-42)球體（如實例Ϊ中所述製 ^ 備）自動免疫小鼠獲得（除6Ε10外），之後選擇融合之融合瘤 細胞。將個別Αβ形式應用於連續稀釋中且用對於免疫反應 之相應抗體培育。 1. Αβ(1-42)單體，〇·1%ΝΗ4ΟΗ 2. Αβ(1-40)單體，0·1%ΝΗ4ΟΗ 3· Αβ(1-42)單體，0.1%NaOH 4· Αβ(1-40)單體，0.1% NaOH 5. Αβ(1-42)球體 127174.doc -89- 200840592 6· Αβ(12-42)球體 7· Αβ(20-42)球體 8. Αβ(1-42)原纖維製劑 9· sAPPa(Sigma);(第一點：1 pmol) 結果顯示於圖1中。 基於點潰墨法結果之分析，抗Αβ球體mAbs 10F4及3C5 對諸如Αβ(1-42)球體、Αβ(12_42)球體及Αβ(20-42)球體之 Αβ球體形式具有高親合力。其在某種程度上鑑別諸如Αβ 單體之其他Αβ形式且不顯著辨別Αβ(1-42)原纖維或 sAPPa。因此可將抗體10F4及3C5精壓為，抗Αβ球體抗體，。
實例IV 藉由10F4及3C5偵測阿茲海默氏病腦中之Ap球體抗原決定基 A :萃取程序 試劑清單： 3 % S D S緩衝液： -50 mM Tris/HCl ^ 150 mM NaCl ^ 0.5% Triton X-100，1 mM EGTA，3% SDS，1%脫氧膽酸鈉（pH值 為 7·4) 完全蛋白酶抑制劑混合物： -將溶解1片完全抑制劑混合物（Roche Diagnostics GmbH ;目錄號：1697498)於1 mL H20中；新製備 PMSF溶液： -於甲醇中之500 mM PMSF 3% SDS萃取緩衝液： 127174.doc -90- 200840592 -將1/100完全抑制劑混合物溶液添加至3% SDS緩衝 液中 將1/500 PMSF溶液添加至3% SDS緩衝液中 -在使用之前在室溫下立即製備萃取緩衝液 抗體： -mAb 10F4 -mAb 3C5 -mAb 6E10(Signet ；目錄號·· 9320) -mAb IgG2b(對照抗體，經合成半抗原產生， Dianova，純系 NCG2B.01，目錄號：DLN-05812) 程序： 在室溫下將0.2 g -80°C冷凍之死後人類AD及相當年齡之 對照腦組織樣品添加至1.8 mL新製備之3% SDS萃取緩衝液 中。在冰中藉由玻璃棒立即使樣品均勻。將均勻化樣品轉 移至反應小瓶中且在g下離心5 min。小心收集上清液（=3% SDS腦萃取液）且為進一步使用將其在-80°C下儲存於反應 小瓶中。 B :用單株小鼠抗體活化動力粒子（Dynabead) -將動力粒子（動力粒子M-280羊抗小鼠IgG， 11^11：1'〇8611;目錄號：112.02)之儲備懸浮液小心震盪 至不起泡 -無菌移除1 mL且轉移至1.5 mL反應小瓶中 -用1 mL免疫沈澱（IP)洗滌緩衝液（IP洗滌緩衝液： PBS(20 mM NaH2P04，140 mM NaC卜 pH值為 7.4)， 127174.doc -91 · 200840592 0.1 % BS A)洗務動力粒子3次，5 min。在洗條程序期 間，小心移除上清液同時用磁力分離器架（MSS)將動 力粒子固定於反應小瓶之側面 -於1 mL PBS，0.1% BSA中用40 pg Αβ抗體培育經洗滌 動力粒子 -藉由在4°C下在震盪下隔夜培育進行活化 -用 1 mL IP洗滌緩衝液（PBS(20 mM NaH2P04，140 mM NaCl，pH值為7·4)，0.1% BSA)洗滌活化動力粒子4 次，30 min(再使用MSS) -用1 mL PBS，0，1°/〇 BSA，0·02%疊氮化鈉將活化動力 粒子再懸浮；渦動且短暫離心 -將抗體活化動力粒子儲存於4°C下直至進一步使用 C :免疫沈澱（IP) -用 975 μι 20 mM NaH2P04，140 mM NaCl ; 0.05%吐 溫20(pH值為7.5)(=1:40稀釋液）稀釋25 3% SDS腦 萃取液。 -將25 pL以下列舉之各抗體活化動力粒子用1 mL 1:40 稀釋之3%SDS腦萃取液培育： _ 6E10-動力粒子 _ 3C5-動力粒子 1 0F4-動力粒子
IgG2b-動力粒子 -藉由在6°C下在震盪下隔夜培育（〜20 h)進行免疫沈澱 -用MPS固定動力粒子 127174.doc -92- 200840592 -小心移除上清液且丟棄 -如下洗滌動力粒子： •用 500 μί 20 mM NaH2P04，140 mM NaCl(pH值為 7.5)+ 0.1% BSA洗滌2次，5分鐘 用 500 μΕ 2 mM NaH2P04，14 mM NaCl(pH值為 7.5) 洗滌1次，3分鐘 要點：在最後移除洗務緩衝液之後，將反應小瓶離 心，放回MSS中且小心移除剩餘滴流體 ⑩ 將 10 pL於 H20 中之 50% CH3CN，0.5°/〇 TFA添加至 反應小瓶中且滿動 •在RT下在震盪下培育反應小瓶10分鐘 用MSS固定動力粒子 小心取出包含免疫沈澱洗脫之Αβ物種之上清液（=IP 洗脫液） D :表面增強雷射脫附離子化質譜法（SELDI-MS): -將1 pL IP洗脫液打點於H4蛋白晶片組合上 (Ciphergen ;目錄號：C573-0028)。 -可在溫熱恆溫箱板上使斑點乾燥 -CHCA溶液： •將5mgCHCA溶解於150pL乙腈+ 150pLl%三氟乙 酸=儲備溶液中；儲存於-20°C下 用20 pL乙腈及20 pL 1% TFA=工作CHCA溶液稀釋 10 pL儲備溶液 將2 pL工作CHCA溶液塗覆於斑點上 127174.doc -93· 200840592 -可在溫熱恆溫箱板上使斑點乾燥且藉由SELDI-MS分 析（表面增強雷射脫附離子化質譜法） 條件：雷射強度200 ;感度6 ;質量範圍800 Da- 10000 Da ;位置 20-80 ;收集 5 分析：量化相應Αβ質量峰之MZ領域 Ε:免疫沈澱AD腦萃取液之西方墨點分析： SDS-PAGE ： SDS樣品緩衝液：
-0.3 g SDS -4 mL 1 M Tris/HCl pH值為 6.8 -8 mL甘油 -70 μί於乙醇中之1%溴酚藍
- 添加Η2〇至50 mL 電泳緩衝液： -7.5 g Tris -3 6 g甘胺酸 -2.5 g SDS -添加H20至2.5 L SDS-PAGE凝膠系統： -18% Tris/甘胺酸凝膠：（Invitrogen Inc.，目錄號： EC65055BOX) 將5 pL IP洗脫液添加至13 μί樣品緩衝液（300 pL SDS樣 品緩衝液+ 10 μί於H20中之1 M Tds溶液+ 20 pL 8 5%甘油） 中。將所得18 pL樣品加載至18% Tris/甘胺酸凝膠 127174.doc -94- 200840592 (Invitrogen Inc,，目錄號：EC65055BOX)中。使SDS-PAGE 在2〇 mA之恆定電流下導電。 西方墨點法程序： 電泳之後，在75 mA下使用半乾墨點腔室（BioRad)將凝膠 塗於琐化纖維膜上（7.5 cm><9 cm，0.2 μηι，BioRad)45分鐘。 塗點緩衝液： -6 g Tris -28.1 g甘胺酸 籲 -500 mL曱醇 -添加H20至2.5 L 西方墨點法免疫染色： 物質： -抗 Αβ 抗體 6E10(Signet;目錄號 9320) -抗小鼠 POD(Jackson ImmunoResearch，目錄號：715-035-150) -偵測劑： ^ Super Signal West Pico 受質（Pierce，目錄號： 34077) -牛血清白蛋白（BSA，Serva，目錄號：11926) -低脂肪牛奶粉劑（Lasana) - 阻斷劑： 於 PBST 中之 2% BSA -TBS : 25 mM Tris/HCl 127174.doc -95- 200840592 150 mM NaCl緩衝液，pH值為 7.5 -TTBS : • 25 mM Tris/HCl 150 mM NaCl緩衝液 _ 0.05% 吐溫 20，pH 值為 7.5 -PBS ： 20 mM NaH2P04緩衝液 140 mM NaCl 緩衝液，pH 值為 7·5 -PBST ： 20 mM NaH2P04緩衝液 140 mM NaCl緩衝液 0.05% 吐溫 20，pH 值為 7.5 -抗體溶液I : 1 pg/mL 6E10 =在20 mL於TBS中之3%低脂肪牛奶中 為 1:1000 -抗體溶液II :
_在20 mL於TBS中之3%低脂肪牛奶以1:10000稀釋之 抗小鼠POD 程序： 1) 將西方墨點在PBS中煮沸10分鐘。 2) 阻斷： 在6°C下用50 mL阻斷劑培育西方墨點16 h。 3) 洗滌： -丟棄阻斷溶液且在室溫下用50 mL TTBS洗滌西方 127174.doc -96- 200840592 墨點1 0分鐘。 •丟棄阻斷溶液且在室溫下用50 TBS洗務西方墨 點1 0分鐘。 4) 抗體溶液I : -丢棄洗滌液且在室溫下用抗體溶液培育西方墨點4h。 5) 洗滌： 丟棄阻斷〉谷液且在室溫下用5〇 mL 丁丁6§洗滌西方 墨點1 0分鐘。 _丟棄阻斷溶液且在室溫下用5〇 mL TTBS洗滌西方 墨點1 0分鐘。 -丟棄阻斷溶液且在室溫下用50 mL TBS洗滌西方墨 點1 0分鐘。 6) 抗體溶液π : 丢棄洗務液且在室溫下用抗體溶液Η培育西方墨點1 h。 7) 洗滌： -丟棄阻斷溶液且在室溫下用5〇 mL TTBS洗滌西方 墨點1 0分鐘。 -丟棄阻斷溶液且在室溫下用50 丁丁38洗滌西方 墨點1 0分鐘。 -丟棄阻斷溶液且在室溫下用5〇 mLTBS洗滌西方墨 點1 0分鐘。 8) 顯影及定量分析： -丟棄洗滌液。 -使2 mL· Super Signal West Pico受質強化子與2 127174.doc -97- 200840592 過氧化物溶液混合。 -將所得4 mL溶液添加至西方墨點中且在黑暗中培育 墨點5分鐘。 -使用化學發光成像系統（VersaDoc，BioRad)分析墨 點。在30、97.5、165、232.5及300秒採集時間獲得 5幅照片。 -使用套裝軟體Quantity one，4.5.0版本（BioRad)定 量分析其中無飽和Αβ蛋白條帶之迹線（強度X mm) _ 存在之照片。 結果顯示於圖2中。因為緩衝液組合物不充分溶解凝集 之原纖維形式之Αβ肽，故認為具有本文所用之3% (w/v)之 萃取程序萃取腦中之總Αβ肽組合之可溶性形式。結合於阿 茲海默氏病腦中藉由單株抗體3C5及10F4萃取之Αβ肽因此 為可溶性Αβ肽。認為該等可溶性Αβ物種為阿茲海默氏病 相關物種，因為與發現於AD腦中之Αβ斑塊形式之原纖維 Αβ相比其與疾病之嚴重性相關性較佳（Kuo等人，1996，J. 鲁 Biol. Chem. 271，4077-4081 ; Lue 等人，1999，Am. J. PathoL 155，853-862)。因此，抗體10F4及3C5靶向疾病相 關Αβ物種。此外，與全Αβ抗體6E10相比，單株抗體3C5及 1 0F4僅與阿茲海默氏病腦萃取液中之總可溶性Αβ組合之亞 組份結合。剩餘Αβ形式明顯不具有藉由3C5及10F4辨別之 Α β球體抗原決定基。由於不認為該等Αβ形式為係神經病 源性的這一事實，有利地不藉由治療抗體攻擊其而降低副 作用且不降低CNS中循環之抗體的有效濃度。因此，可降 127174.doc -98- 200840592 低治療抗體之投與從而產生較佳治療指數。 實例v
抗Αβ球體抗體對Αβ(1-42)原織維之辨別力的由SDS-PAGE 檢驗之半定量分析 Αβ(1-42)原纖維製劑： 將 1 mg Ap(l-42)(Bachem，目錄號：Η-1368)溶解於 500 gL於H20中之0·1% NH4OH中且在周圍溫度下擾動1 min。 將樣品在10000 g下離心5 min。收集上清液。根據布萊德 福方法（Bradford’s method)測定上清液中之Αβ(1-42)濃度 (BIO-RAD Inc·，檢定程序）。 使 100 μΕ於 0.1% NH4OH 中之 Αβ(1-42)與 300 pL 20 mM NaH2P04，140 mM NaCl(pH值為 7.4)混合且用 2% HC1將其 調節至pH值為7·4。隨後在37°C下培育樣品20小時。之 後，使樣品在10000 g下離心10 min。丟棄上清液，且使殘 餘物與 400 μί 20 mM NaH2P04，140 mM NaCl(pH 值為 7·4) 混合，藉由劇烈攪動（渦動）1 min使其再懸浮且在10000 g 下離心10 min。再次丟棄上清液，且使殘餘物與400 μΐ^ 20 mMNaH2PO4，140mMNaCl(pH值為7,4)混合，藉由劇烈 攪動（”渦動n)l min再懸浮且在10000 g下離心10 min。丟棄 上清液。將殘餘物再懸浮於380 μι 20 mM NaH2P04，140 mM NaCl(pH值為7.4)中且藉由劇烈攪動（”渦流π)促使。 使抗Αβ抗體與Αβ(1-42)原纖維結合： 用 160 20 mM NaH2P04，140 mM NaC卜 0,05%吐溫 20(pH值為7.4)稀釋40 μι Αβ(1-42)原纖維製劑且在周圍溫 127174.doc -99- 200840592 度下攪動5 min，且隨後在10000 g下離心樣品10 min。丟 棄上清液，且將殘餘物再懸浮於95 μί 20 mM NaH2P〇4， 140 mM NaCM，0.05%吐溫20(pH值為7·4)中。由劇烈攪動 (”渦動π)促進再懸浮。將10 μί原纖維製劑之等分試樣各自 與以下物質混合： a) 10 20 mM NaH2P04，140 mM NaCl，pH值為 7·4 b) 10 pL於 20 mM NaH2P04，140 mM NaCl(pH值為 7·4) 中之 0·5 pg/pL 3C5 _ c) 1 0 pL於 20 mM NaH2P〇4 ’ 140 mM NaCl(pH值為 7·4) 中之 0·5 μ§/μί 1 0F4 d) 10 pL於 20 mM NaH2P04，140 mM NaCl(pH 中之 7.4) 中之 0.5 pg/gL 6E10(Signet，目錄號·· 9320) 在37°C下培育樣品20小時，且隨後在10000 g下離心1〇 min。收集上清液且與20 pL SDS-PAGE樣品緩衝液混合。 使殘餘物與 50 pL 20 mM NaH2P04，140 mM NaCl， 0.025%吐溫20(pH值為7.4)混合物且藉由’’渦動”再懸浮。隨 _ 後，使樣品在10000 g下離心10 min。丟棄上清液，且使殘 餘物與 20 pL 20 mM NaH2P〇4，140 mM NaC卜 0.025%吐 溫20(pH值為7.4)混合，隨後與20 μί SDS-PAGE樣品緩衝 液混合。為電泳將樣品塗覆於4-20% Tris/甘胺酸凝膠上。 SDS-PAGE之參數：
SDS樣品緩衝液：0.3 g SDS 4 mL 1 M Tris/HCl pH值為 6.8 8 mL甘油 127174.doc -100- 200840592
1 mL於乙醇中之1%溴酚藍 充滿H20至50 mL 4-20% Tris/甘胺酸凝膠：(Invitrogen，目錄號： EC6025BOX)
電泳緩衝液：7.5 g Tris 3 6 g甘胺酸 2.5 g SDS 充滿H20至2.5 L 在20 mA之恆定電流下使凝膠流動。 染色凝膠：庫馬斯藍R250 結果顯示於圖3中。 半定量分析不同抗Αβ抗體及其對Αβ(1-42)原纖維之辨別 力： 在凝膠邊緣標記抗體、Αβ(1-42)原纖維抗體重鏈、抗體 輕鏈及Αβ(1-42)單體之位置。由於其尺寸，故Αβ(1-42)原 纖維不能進入SDS-PAGE凝膠且可將其引入凝膠開槽中。 1. 標記 2. Αβ(1-42)原纖維製劑；對照組 3· Αβ(1-42)原纖維製劑；+ mAb 6Ε10 ; 20 h 37°C ;上清液 4. Αβ(1-42)原纖維製劑；+ mAb 6E10 ; 20 h 37°C ;顆粒 5· Αβ(1-42)原纖維製劑；+ mAb 3C5 ; 20 h 37°C ;上清液 6. Αβ(1-42)原纖維製劑；+ mAb 3C5 ; 20 h 37°C ;顆粒 7· Αβ(1-42)原纖維製劑；+ mAb 10F4 ; 20 h 37°C ;上清液 8· Αβ(1-42)原纖維製劑；+ mAb 10F4 ; 20 h 3 7°C ;顆粒 127174.doc -101 - 200840592 由SDS-PAGE分析藉由量測所結合之原纖維（顆粒部份） 及離心後之上清液部份之抗體重鏈的光學密度（OD)值來評 估與原纖維型Αβ之相對結合。與Αβ原纖維結合之抗體應 該與Αβ原纖維共顆粒化且因此在顆粒部份發現，然而無 Αβ原纖維結合（游離）抗體在上清液中發現。根據下式計算 抗體與Αβ原纖維結合之百分比： 與Αβ原纖維結合之抗體百分比== OD原纖維部分xlOO%/(OD原纖雉部分+ OD上清液部分)〇 結果顯示於圖3中。與認出且與在AA1-17之間的直鏈Αβ 抗原決定基結合之可購得之抗體6E10(Signet，目錄號： 9320)相反，Αβ球體抗體3C5及10F4與在共顆粒實驗中具有 較低親合力之Αβ(1-42)原纖維結合。此藉由在用Αβ(1-42) 原纖維培育之後3C5及10F4抗體在於上清液中顆粒化階段 之後大體上維持原樣且由於與Αβ( 1-42)原纖維結合故不共 顆粒化之事實證明。 在阿茲海默氏病腦中，Αβ原纖維為總Αβ肽組合之主要 組份。藉由經抗Αβ抗體攻擊該等原纖維，由於放出隨後可 能增加微出血風險之大量Αβ故提高消極副作用之風險。在 使用Αβ肽之原纖維凝集體之自動免疫方法中觀察到微出血 風險增加（Bennett 及 Holtzman，2005，Neurology，64，10-12 ； Orgogozo J，Neurology，2003，61,46-54 ; Schenk 等 人，2004，Curr Opin Immunol，16，599-606) o
實例VI 當場分析抗體10F4及3C5對老APP轉殖基因小鼠及阿茲海 127174.doc -102- 200840592 默氏病患者之腦膜血管中之呈澱粉樣斑塊及澱粉樣蛋白形 式之原纖維Ap肽之特定反應 抗體10F4及3C5顯示對原纖維Αβ肽沈積物之染色降低， 建議其治療效應由與可溶性球體形式而非Αβ肽之原纖維沈 殿形式之結合介導。因為與原纖維Αβ肽結合之抗體可導致 快速溶解凝集體且隨後增加可溶性Αβ濃度，繼而認為其具 神經毒性且可導致微出血，影響可溶性球體而非單體之抗 體療法係較佳的。 方法： 對於該等實驗而言，使用數個腦物質樣品：來自2個AD 患者之皮層組織（RZ16及RZ55)及來自19個月大Tg2576小 鼠（APPSWE # 001349，Taconic，Hudson，NY，USA)或 12 個月大APP/L 小鼠（ReMYND，Leuven，Belgium)之皮層組 織。 小鼠過度表現具有家族阿兹海默氏病突變之人類App且 在約11月齡時在腦軟組織中形成β_殿粉樣蛋白沈積物且在 約1 8月齡時在較大大腦血管中形成β澱粉樣蛋白沈積物。 將動物洙度麻醉且用〇· 1 Μ填酸鹽緩衝生理食鹽水（pB s)經 賁門灌注以沖洗血液。隨後，將腦自顱腔移除且縱向分 割。將腦之一個半球急速冷凍且其他藉由浸入4%三聚甲 醛中固定。浸入固定之半球藉由在PBS中滲入3〇%蔗糖防 冷凍且裝於冷凍切片機上。將總體前腦切割為4〇 μηι橫切 片’將其收集於PBS中且用於隨後染色程序。 自Brain-Net，Munich，Germany獲得呈冷凍組織形式之 127174.doc -103- 200840592 來自阿茲海默氏病患者之新皮質樣品，在解凍期間浸入固 定於三聚甲醛中，且隨後類似小鼠組織來處理。 個別切片使用以下協定用剛果紅（congo Red)染色： 材料： ;属又物樣蛋白染料剛果紅套組（Sigma-Aidrich ; ，
其由NaCl酒精溶液、Na0H酒精溶液及剛果紅酒精溶液組成 染色比色J3TL 顯微鏡載玻片Superfrost Plus及蓋玻片 乙醇、二曱苯、包埋介質 試劑： 用NaCl溶液以1:100稀釋Na〇H產生鹼性生理食鹽水 用剛果紅溶液以1:100稀釋鹼性生理食鹽水產生鹼性剛 果紅溶液（不超過使用之前丨5 min製備，過濾） 於載玻片上安裝切片且使其乾燥 在染色比色皿中培育載玻片，首先於鹼性生理食鹽水中 培育30-40分鐘，然後於鹼性剛果紅溶液中培育3〇_4〇分鐘 用新鮮乙醇沖洗3次且埋入經二甲苯包埋 將染色首先使用Zeiss Axioplan顯微鏡（Zeiss，Jena， Germany)拍照且定性評估。紅色指示呈斑塊形式與在較大 細膜血官中之澱粉樣蛋白沈積物。稍後，評估集中於該等 結構中之抗體染色。 染色藉由根據以下協定用含有0·07_0·7 μ§/ιη丨之相應抗體 的溶液培育切片來進行： 材料： 127174.doc 200840592 1:10於重蒸餾水中之TBST洗滌液（具有吐溫20之Tris緩衝 生理食鹽水；l〇x濃縮；DakoCytomation S3306，DAKO， Hamburg，Germany) 於曱醇中之0.3% H2〇2 於丁8 8丁中5%之驢血清（861*(^(：，0触61(1€^，〇61*111&11}〇，作 為阻斷血清 在給定濃度下於TBST中稀釋之單株小鼠抗球體抗體 二次抗體：生物素標記驢抗小鼠抗體（Jackson 鲁 Immuno/Dianova ? Hamburg j Germany ； 715-065-150 ί 1:500 於TBST中稀釋）
StreptABComplex(DakoCytomation K 0377，DAKO， Hamburg，Germany) 過氧化酶受質套組二胺基聯苯胺（=DAB ; SK-4100 ; Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)
SuperFrost Plus顯微鏡載玻片及蓋玻片 無二曱苯包埋介質（Medite，Burgdorf，Germany ; X-tra ® Kitt) 程序： 將浮動切片轉移至冰冷0.3% H202中且培育30 min 於TBST緩衝液中洗條5 min 用驢血清/TBST培育20分鐘 在室溫下用第一抗體培育24小時 於TBST緩衝液中洗滌5分鐘 用阻斷血清培育20分鐘 127174.doc -105- 200840592 於TBST緩衝液中洗滌5分鐘 在周圍溫度下用二次抗體培育60分鐘 於TBST缓衝液中洗滌5分鐘 在周圍温度下用StreptABComplex培育60分鐘 於TBST緩衝液中洗滌5分鐘 用DAB培育20分鐘 在載玻片上安裝切片，空氣乾燥載玻片，用醇使載玻片 脫水且包埋載玻片 ® 除在顯微鏡下目測檢驗切片外，澱粉樣蛋白染色另外藉 由使用ImagePro 5.0圖像分析系統自組織學影像中視覺上 切除10任意選擇之斑塊及測定其平均灰度值來量化。光學 密度值藉由自澱粉樣蛋白斑塊之密度減去經染色物質之構 件構件背景密度自灰度值來計算（〇%表示無斑塊染色高於 周圍背景，100%表示無透射/最大染色）。為得到統計學意 義用ANOVA分別測試抗體6E10/4G8與6G1、10F4與3C5之 間的差異。 ^結果： 以下描述之所有抗體染色物質經證明為嗜剛果紅澱粉樣 蛋白沈積物（圖4(a))。球體（較佳實質染色之抗體10F4及 3C5)及Αβ肽之腦膜嗜剛果紅沈積物在0.7 pg/mL之相同濃 度下顯著少於抗體6G1及6E10(圖4(b，c，h))。實質澱粉樣斑 塊染色之定量分析揭示所有抗體與斑塊（統計學上高於對 照組之顯著密度）之結合，但抗體10F4及3C5之結合顯著低 於參考抗體6E10之結合（由Αβ之N末端序列引起）且等於或 127174.doc -106- 200840592 低於參考抗體4G8(由Αβ之N末端序列引起）（圖4(d-g))。 抗體10F4及3C5與澱粉樣蛋白沈積物之結合小於與辨別 Αβ單體或Αβ序列之一部分抗體之結合。用與原纖維Αβ肽 結合之抗體處理可導致腦組織中澱粉樣蛋白斑塊之快速溶 解且隨後增加可溶性Αβ濃度，繼而認為其具神經毒性且可 導致微出血，及/或快速溶解亦可導致微出血之血管澱粉 樣蛋白。因此，較佳為影響可溶性球體而非單體之抗體療 法。
實例VII 用抗ΑΡ球體抗體10F4且3C5免疫沈澱之後在AD患者之CSF 中内源性Αβ(1·42)及Ap(l_40)含量 用動力粒子M-280羊抗小鼠IgG免疫沈澱（IP)來自AD腦 CSF之Αβ物種 使以下mAb與動力粒子Μ-280羊抗小鼠IgG固定： mAb 6E10(Signet Inc.，目錄號：9320) mAb 3C5 mAb 10F4 mAb 8F5 動力粒子M-280羊抗小鼠IgG : 羊抗小鼠18〇(111¥丨1：1*〇8611111(：.，目錄號：112.02)與共價 結合磁性粒子（動力粒子）。 用單株小鼠抗體活化動力粒子 將動力粒子（動力粒子M-280羊抗小鼠IgG，Invitrogen ; 生產號：112.02)之儲備懸浮液小心震盪至不起泡 127174.doc -107- 200840592 無菌移除1 mL且轉移至1.5 mL反應小瓶中 用1 mL免疫沈澱（IP)洗滌緩衝液（IP洗滌緩衝液：PBS(20 mM NaH2P04，140 mM NaC卜 pH值為 7·4)，0·1% (w/v)BSA) 洗滌動力粒子3次，5 min。在洗滌程序期間，小心移除上 清液同時用磁力分離器架（MSS)將動力粒子固定於反應小 瓶之側面 於 1 mL PBS，0.1% (w/v)BSA中用 40 pg Αβ抗體培育經 洗務動力粒子 ® 藉由在4°C下在震盪下隔夜培育進行活化 用 1 mL IP 洗滌緩衝液（PBS(20 mM NaH2P04，140 mM NaCl，pH值為7·4)，0.1% (w/v)BSA)洗滌活化動力粒子4 次，30 min(再使用MSS) 用 1 mL PBS、0·1ο/〇 (w/v)BSA、0.02% (w/v)疊氮化鈉再 懸浮活化動力粒子；渦動且短暫離心 將抗體活化動力粒子儲存於4°C下直至進一步使用 C S F樣品製備： ® 將來自阿茲海默氏病患者之400 pL CSF添加至4 μί完全 蛋白酶抑制劑混合物中（Roche Inc.，目錄號：1697498， 將1片溶解於1 mL水中）且將0.8 μΐ 500 mM PMSF溶解於甲 醇中。在 10 min之後添加 1·6 mL 20 mM NaH2P04，140 mM NaCl，0.05%吐溫 20(pH值為 7.4)(PBST)。 來自人類AD-CSF之Αβ物種之免疫沈澱： 將250 所製備之CSF樣品之等分試樣添加至25 0抗 Αβ動力粒子懸浮液中 127174.doc -108- 200840592 在6°C下攪拌16小時發生免疫沈澱。隨後用1 mL PBS/0.1% (w/v)BSA進行洗務珠粒3次，5 min，且最後用1 mL 10 mM Tris/HCL(pH值為7.5)緩衝液1次3 min。在洗滌 程序期間，小心移除上清液同時用磁力分離器架（MSS)將 動力粒子固定於反應小瓶之側面 在最終洗滌步驟之後徹底移除剩餘上清液。 藉由在無β-巯基乙醇之情況下將25 pL樣品緩衝液（0.36 M Bistris、0.16 M Bicine、1% SDS (w/v)、15% (w/v)蔗 糖、0·004% (w/v)溴紛藍）添加至Eppendorff管中且在95°C 下於加熱塊中加熱5 min自動力粒子移除Αβ肽及相應抗 體。冷卻至室溫之後，用磁力分離器架（MSS)將動力粒子 固定於反應小瓶之側面且將上清液轉移至另一 Eppendorff 管中（IP洗脫液）。 藉由尿素-PAGE分析Αβ免疫沈澱，之後西方墨點法程序： 藉由8 Μ尿素聚丙烯醯胺凝膠電泳系統進行Αβ1-40及 Αβ1-42物種之量化且隨後根據首先藉由H.W. Klafki等人， Analytical Biochemistry 237.，24-29(1996)描述且隨後亦 由 J. Wiltfang等人，J. of Neurochemistry 81，481-496， 2002使用之程序進行西方墨點分析。在實驗程序中僅產生 2個較小改變： 1) 將於堆疊凝膠中之SDS濃度調節至0.25%(w/v)而非 0· 1 %(w/v) 〇 2) 對於西方墨點法而言，抗體lE8(Senetek Drug Delivery Technologies Inc·，St. Louis，MO，USA) 127174.doc -109 - 200840592 經抗人類澱粉樣蛋白β(Ν)(82Ε1)小鼠IgG mAb(IBL， 目錄號：10323)置換 將15 gL免疫沈澱樣品之IP洗脫液等分試樣負載於8 Μ尿 素PAGE上。在100 V下進行電泳（15 min)且在60 V下持 續。當負載染料之藍色樣品之流向與凝膠之末端相距0.5 cm時停止電泳。 西方墨點法程序： 在半乾墨腔室（BioRad Inc.，在75 mA下45 min)中於7·5 cm><9 cm石肖化纖維0·45 pm(BioRad Inc·)上進行西方墨點分 析 墨點緩衝液：6 g Tris、28·1 g甘胺酸、500 mL曱醇，用 水調節至2.5 L。 在100°C下於PBS中煮沸硝化纖維墨點10 min。在室溫下 藉由於PBST中用50 mL 5 % (w/v)處理1小時使墨點浸透。 在移除液相之後，進行兩次以下洗滌步驟：在室溫下用50 mL TTBS(25 mM Tris/Ηα、150 mM NaCl緩衝液、0.05% 吐溫20(pH值為7.5))洗滌10 min且隨後在室溫下用50 mL TBS(25 mM Tris/HCl、150 mM NaCl緩衝液（pH值為 7·5))洗 務 1 0 min 〇 為進一步顯影，自墨點中清除最終洗滌緩衝液且在6它 下添加15 mL抗體溶液1(於15 mL TBS中之0.2 pg/mL 82E1 = 1:500於3% (w/v)脫脂奶粉（Lasana Inc·)中）20小時。移除 緩衝液，接著進行如上所述3個洗滌步驟。在室溫下用抗 體溶液Π(於15 mL TBS中之以1:10000於15 mL 3%(w/v)脫 127174.doc -110- 200840592 脂奶粉中稀釋之抗小鼠POD)培育墨點1小時。移除緩衝 液，接著進行如上所述3個洗滌步驟。 在移除最後洗務緩衝液之後，使2 mL Super Signal West Femto超靈敏型受質與2 mL過氧化物溶液混合。將新製備 溶液傾倒於在黑暗中預培育5 min之墨點上。使用 VersaDoc成像系統（BioRad)記錄化學發光。 成像參數： 曝光時間180 sec 30 sec、60 sec、120 sec及 180 sec之後記錄照片 結果自180 sec曝光時間之圖片中獲得。
與可購得之抗體6E10(在文獻中，認為無論Αβ形式之構 形其辨別所有Αβ形式）相比，本發明之抗球體抗體10F4及 3C5對阿茲海默氏病患者CSF中之Αβ(1-42)肽及Αβ(1-40)肽 具有較低親合力。CSF Αβ肽形式經受高周轉率（Bateman等 人，Nature Medicine，2006，12(7) ·· 856-61)且因此未必 可能為疾病相關物種。因此，在為降低不當副作用之風險 阿茲海默氏病之被動免疫處理策略中不應靶向CSF Αβ形 式。應注意，在較早研究（Barghorn等人，J Neurochem. 2005 ; 95(3) : 834-847)中抗Αβ球體抗體8F5不辨別阿茲海 默氏病患者CSF中之Αβ肽且與阿茲海默氏病患者CSF中之 Αβ肽結合。使用夾層ELISΑ方法進行此較早研究。相反， 當使用如上所述免疫沈澱及尿素PAGE方法時，相同抗體 8F5辨別阿茲海默氏病患者CSF中之Αβ肽（參見圖5)。因 此，夾層ELISA方法產生偽陰性結果；因此對於偵測CSF 127174.doc -111 - 200840592 中之Αβ肽而言，應使用本文所述免疫沈澱及尿素Page方 法。 【圖式簡單說明】 圖1 圖1(a)顯示不同抗Αβ抗體（-6E10、-3C5、10F4)特性之點 潰墨法分析。此處所測試之單株抗體藉由用Αβ(12_42)球 體（如貫例I中所述製備）對小鼠進行自動免疫，之後選擇融 合之融合瘤細胞獲得（除市售之6E1〇，signet，目錄號： _ 9320外）。將個別Αβ形式以連續稀釋形式應用且與相應單 株抗體一起培育以進行免疫反應：
1. Αβ(1-42)單體，〇.1%ΝΗ4ΟΗ 2· Αβ(1«·40)單體，〇·1%ΝΗ4ΟΗ 3· Αβ(1-42)單體，0.1%NaOH 4· Αβ(1-40)單體，0.1% NaOH 5· Αβ(1-42)球體 _ 6· Αβ(12-42)球體 7· Αβ(20-42)球體 8· Αβ(1-42)原纖維製劑 9· sAPPa(Sigma)(第一點：1 pmol) 圖1(b)說明使用強度之密度測量分析進行之定量評估。 對於各Αβ形式而言，僅評估與最低抗原濃度對應之圓點， 其限制條件為其具有對於Αβ(1 -42)球體之最終光學上清楚 鑑別之圓點的相對密度而言大於2〇%之相對密度（臨限^。 對於每一點潰墨獨立地測定此臨限值。該值指二Αβ(^42) 127174.doc -112- 200840592 球體鑑別與給定抗體之相應Αβ形式之間的關係。 圖2 圖2說明自阿茲海默氏病腦組織免疫沈澱之Αβ-肽的結 果。 圖2(a)表示用於分析之患者物質的詳細說明。 圖2(b)說明如對於具有抗體6Έ10、3C5、10F4及對照抗 體IgG2b之不同患者及對照腦樣品由SELDI-MS分析所量化 之Αβ( 1-40)-肽及Αβ( 1-42)-肽的免疫沈殿量。 圖2(c)說明如與具有全Αβ抗體6Ε10相比對於具有抗體 3C5、10F4及對照抗體IgG2b之不同患者及對照腦樣品由 SELDI-MS分析所量化之Αβ(1-40)肽及Αβ(1-42)肽的相對免 疫沈澱量（以百分比計）。將藉由抗體6Ε10免疫沈澱之Αβ肽 的總量設定為100〇/〇。 圖2(d)說明如對於具有抗體6Ε10、3C5、10F4及對照抗 體IgG2b之不同患者及對照腦樣品由西方墨點分析所量化 之Αβ肽的免疫沈殿量。 圖2(e)說明如與具有全Αβ-抗體6Ε10相比對於具有抗體 3C5、10F4及對照抗體IgG2b之不同患者及對照腦樣品由西 方墨點分析所量化之Αβ肽的相對免疫沈澱量（以百分比 計）°將藉由抗體6Ε10免疫沈澱之Αβ肽之總量設定為 100% 〇 圖3 圖3〇)顯示以下之經庫馬斯（Coomassie)染色之S〇S PAGE ： 127174.doc -113- 200840592 1) 標準蛋白（分子標記之蛋白） 2) Αβ(卜42)原纖維製劑；對照組 3) Αβ(1-42)原纖維製劑+ mAb 6E1〇，2〇 h，37。〇，上清液 4) Αβ(1-42)原纖維製劑 + mAb 6E1〇，2〇 h，37。〇，顆粒 5) Αβ(1-42)原纖維製劑+ mAb 3C5，20 h，37°C，上清液 6) Αβ(1-42)原纖維製劑 + mAb 3C5，2〇 h，37°C，顆粒 7) Αβ(1_42)原纖維製劑+ mAb 1〇F4，2〇 h，37。〇，上清液 8) Αβ(1-42)原纖維製劑 + mAb 10F4，20 h，37°C，顆粒 _ 圖3(b)顯示活體外與Αβ-原纖維結合之抗體的密度測量 定量分析。 圖4 圖4顯示不同濃度抗體與阿兹海默氏病（AD)患者或老 APP轉殖基因小鼠之新皮層橫斷面之結合。 圖4(a)表示在APP轉殖基因小鼠品系Tg2576中及在ad患 者（RZ5 5)中，由剛果紅（c〇ng0 Red)在腦組織中染色為斑塊 及在腦血管中染色為大腦澱粉樣血管病變（CAA)之澱粉樣 沈積之驗證。 圖4(b)顯示當10F4及3C5顯示相對較弱之染色時，在AD 患者（RZ16)中僅發生使用6G1及市售抗體6E10之Αβ(澱粉 樣斑塊）的實質性沈積深染色。在〇·7 pg/niL之濃度下測試 所有抗體。 圖4(c)顯示當i〇F4及3C5顯示相對較弱之染色時，在 TG2576小氣中僅發生使用6G1及市售抗體6E10之Αβ(澱.粉 樣斑塊）的實質性沈積深染色。在〇·7 gg/mL之濃度下測試 127174.doc -114- 200840592 所有抗體。 圖4(d)-4(g)顯示在使用影像分析之組織學影像中對Αβ斑 塊染色之分析的量化。光密度值（0%二無染色）由斑塊之灰 度值減去背景組織之灰度值來計算。（圖4(d)顯示在Tg2576 小鼠中0·7 pg/mL抗體之結合。圖4(e)顯示在app/l小鼠中 0.07-0.7 pg/mL抗體之結合。圖4(f)顯示在ad患者（RZ55) 中0.7 pg/mL抗體之結合’且圖4(g)顯示在ad患者（RZ16) 中0.07-0.7 pg/mL抗體之結合。）統計學評估市售抗體 _ 6E10(起始）及4G8(^%)及抗體6G1、l〇F4及3C5之染色之 間的差異（與對照組比較一個星號/循環：p < 〇.〇5，兩個星 號/環繞：p < 0.01，且三個星號/環繞：p < 〇 〇〇1 ;方差分 析之後的事後龐費洛尼t測試（B〇nferroni，s t_test)為p < 0.001)(圖4(d)及（e))。在圖4(e)及4(g)中，與市售抗體6E10 及4G8相比，抗體10F4及3C5總是顯示顯著較少染色（在方 差分析中P < 0.001後之事後t測試中p < 0,05)。 圖4(h)顯示當用8F5或8C5染色更弱時，僅發生用6G1及 市售抗體6E10之Αβ(箭頭）的血管沈積深染色。在ο·? pg/mL之濃度下測試所有抗體。在Tg2576小鼠中發現定性 地相似之狀況（此處未圖示）。 圖5 圖5(a)、（c)、（e)及（g)顯示藉由單株抗體6e10 、10F4 、 3C5及8F5自阿茲海默氏病患者CSF免疫沈澱之Αβ(ι_4〇)& Αβ(1-42)肽之量。顯示4個單獨阿茲海默氏病cSF樣品之結 果（(a)二阿兹海默氏病患者# 05〇4〇〇9 ; (c)=阿兹海默氏病患 127174.doc -115- 200840592 者# 30027 ; (e)=阿茲海默氏病患者# 30026 ; (g)=阿茲海默 氏病患者# 26748015)。 圖5(b)顯示與藉由抗體6E10免疫沈澱之Αβ-肽之量相 比，藉由抗體10F4、3C5及8F5自阿茲海默氏病患者CSF免 疫沈澱之Αβ(1-40)及Αβ(1-42)肽之相對量（以百分比計）。 將藉由mAb 6Ε1 0抗體免疫沈澱之Αβ肽的總量設定為 100%。顯示4個單獨阿茲海默氏病CSF樣品之結果（（b)=阿 茲海默氏病患者# 0504009 ; (d)=阿茲海默氏病患者# 3 0027 ; (f)=阿茲海默氏病患者# 30026 ; (h)=阿茲海默氏病 患者# 26748015)。 圖5(i)表示在圖5(a)-5(i)中用於分析之阿茲海默氏病患者 CSF物質之詳細說明。 圖6 圖6(a)說明編碼本文稱為”3C5n之單株抗體之可變重鏈的 DNA序列（SEQ ID ΝΟ:1)。 圖6(b)說明編碼本文稱為”3C5n之單株抗體之可變輕鏈的 DNA序列（SEQ ID NO:2)。 圖6(c)說明編碼本文稱為’’10F4”之單株抗體之可變重鏈 的 DNA序列（SEQ ID NO:3)。 圖6(d)說明編碼本文稱為”10F4”之單株抗體之可變輕鏈 的 DNA序列（SEQ ID ΝΟ··4)。 圖7 圖7(a)說明編碼本文稱為"3C5”之單株抗體之可變重鏈的 胺基酸序列（SEQ ID ΝΟ:5)。 127174.doc -116- 200840592 圖7(b)說明編碼本文稱為”3C5”之單株抗體之可變輕碼的 胺基酸序列（SEQ ID ΝΟ··6)。 圖7(c)說明編碼本文稱為”10F4”之單株抗體之可變重鏈 的胺基酸序列（SEQ ID ΝΟ:7)。 圖7(d)說明編碼本文稱為”10F4”之單株抗體之可變輕鏈 的胺基酸序列（SEQ ID ΝΟ:8)。（在各所述序列中將互補判 定區（CDR)加底線）。
127174.doc 117-
200840592 序列表 <110> 1.美商亞培公司 2.德商亞培公司 <120>新穎Αβ構造異構體選擇性抗-Αβ球體之單株抗體 <130> 8503.TW.01 <140〉 096145472 <141〉2007-11-29 <150> 60/872,156 ； 11/945,124 <151> 2006-11-30 ； 2007-11-26 <160> 23 <170> Patentln version 3.4 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213>鼠科動物 <400> 1 gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc acctgcactg tcgctggctc ctcaatcacc agtcattatg cctggaactg gatccggcag tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacatagact atagtggtag cactcgctac ctcccctctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aaggggtagt ggttatttct atggtatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca <210> 2 <211〉 324 <212> DNA <213>鼠科動物 <400> 2 gacatccaga tgaaccagtc tccatccagt ctgtctccat cccttggaga cacaattacc atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gtctggttaa gctggtacca gcagaaacca ggaaatattc ctaaactatt gatctataag gcttccaact tgcacacagg cgtcccatca aggtttagtg gcagtggatc tggaataggt tttacattaa ccatccgcag cctgcagcct gaagacattg ccacttactt ctgtcaacag ggtcaaagtt atccgtacac gttcggaggg gggactaagc tggaaataaa acgg <210> 3 <211> 354 <212> DNA <213>鼠科動物 <400> 3 caggtccagc tgcagcagtc tggagctgag ctggtaaggc ctgggacttc agtgagggtg tcctgcaagg cttctggata cgccttcact aattacttga tagagtgggt aaagcagagg cctggacagg gccttgagtg gattegagtg attaatcctg gaagtggtga tactaactac aatgagaatt tcaagggcaa ggcaacactg actgcagaca aatcctccag cactgcctac atgcacctca gcagcctgac atctgatgac tctgcggtct atttctgtac aagaggcgtg attacgacgg gttttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacaatctc ctca 127174·序列表.doc 60 120 180 240 300 357 60 120 180 240 300 324 60 120 180 240 300 354 60 200840592 <210> 4 <211> 324 <212> DNA <21；3>鼠知動物 <400〉 4 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc atcacatgtc gagcaagtgg gaatattcac aattatttag catggtatca gcagaaacag ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcagcct gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggagta gtcctcggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa acgg <210〉 5 <211> 119 <212> PRT <213>鼠科動物 <400〉5
Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ala Gly Ser Ser He Thr Ser His 20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45
Met Gly Tyr lie Asp Tyr Ser Gly Ser Thr Arg Tyr Leu Pro Ser Leu 50 55 60
Lys Ser Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe 65 70 75 80
Leu Gin Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Ser Gly Tyr Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 108 <212> PRT <213>鼠科動物 <400> 6
Asd lie Gin Met Asn Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Pro Ser Leu Gly 1 5 10 15
Asd Thr He Thr lie Thr Cys His Ala Ser Gin Asn lie Asn Val Trp 20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Asn He Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 -2- 120 180 240 300 324 127174-序列表.d〇c 200840592
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly lie Gly Phe Thr Leu Thr lie Arg Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 GIu Asp lie Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Gly Gin Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213>鼠科動物 <400〉 7
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 15 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30
Leu lie Glu Tip Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He 35 40 45
Gly Val lie Asn Pro Gly Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95
Thr Arg Gly Val lie Thr Thr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Thr Leu Thr lie Ser Ser 115 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213>鼠科動物 <400> 8
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Glu Thr Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn lie His Asn Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val 35 40 45 127174-序列表.doc 200840592
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Giy Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Leu Lys He Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His Phe Trp Ser Ser Pro Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 9 <211〉 6 <212> PRT <213>鼠科動物 <400〉 9
Ser His Tyr Ala Trp Asn
<210> 10 <211> 16 <212> PRT <213>鼠科動物 <400〉 10
Tyr lie Asp Tyr Ser Gly Ser Thr Arg Tyi Leu Pro Ser Leu Lys Ser 15 10 15 <210> 11 <211〉 10 <212> PRT <213>鼠科動物 <400> 11
Gly Ser Gly Tyr Phe Tyr Gly Met Asp Tyr 1 5 10
<210> 12 <211> 11 <212> PRT <213>鼠科動物 <400> 12
His Ala Ser Gin Asn lie Asn Val Trp Leu Ser 1 5 10 <210〉 13 <211〉7 <212> PRT <213>鼠科動物 <400> 13
Lys Ala Ser Asn Leu His Thr <210〉 14 <211〉 9 <212> PRT <213>鼠科動物 127174-序列表.doc 200840592 <400> 14
Gin Gin Gly Gin Ser Tyr Pro Tyr Thr <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213>鼠科動物 <400> 15
Asn Tyr Leu lie Glu <210> 16 <211〉17 <212> PRT <21i>鼠科動物 <400> 16
Val lie Asn Pro Gly Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys 15 10 15
Gly <210〉 17 <211> 9 <212〉 PRT <213>鼠科動物 <400> 17
Gly Val lie Thr Thr Gly Phe Asp Tyr <210〉 18 <211> 11 <212> PRT <213>鼠科動物 <400> 18
Arg Ala Ser Gly Asn lie His Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213>氣科動物 <400> 19
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213>鼠科動物 <400> 20
Gin His Phe Trp Ser Ser Pro Arg Thr 127174-序列表.doc 200840592 <210> 21 <211> 43 <212> PRT <213>鼠科動物 <400〉 21
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val He Ala Thr 35 40
<210〉 22 <211〉 40 <212> PRT <213>鼠科動物 <400> 22
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 15 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Giy Ser Asn Lys Gly Ala He lie 20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 23 <211> 31 <212> PRT <213>鼠科動物 <400> 23
Val His His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn 15 10 15
Lys Gly Ala He lie Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala 20 25 30 -6 - 127174-序列表.doc

Claims (1)

  1. 200840592 十、申請專利範圍： 1· 一種經分離抗體，其對於Αβ(1-42)球體（globulomer)的親 合力高於其對於至少一種選自由存在於腦脊髓液（CSF) 中之Αβ(1-42)肽及b)存在於CSF中之Αβ(1-40)肽組成之群 的β殿粉樣蛋白的親合力。 2. 一種經分離抗體，其對於Αβ(1-42)球體的結合親合力大 於其對於至少一種選自由α)Αβ(1-42)單體、1>)Αβ(1-40)單 體、c)Ap(l-42)原纖維（fibril)及d)可溶性澱粉樣前驅體蛋 白a(sAPPa)組成之群的β澱粉樣蛋白的結合親合力。 3. 如請求項2之經分離抗體，其中該抗體以低於結合存在 於CSF中之β澱粉樣蛋白的親合力結合至存在於非CSF中 之β澱粉樣蛋白。 4·如請求項1或2之經分離抗體，其中該抗體為單株抗體。 5·如請求項4之經分離抗體，其中該抗體為重組抗體。 6.如請求項1或2之經分離抗體，其中該抗體為人類抗體或 人源化抗體。 7·如請求項1或2之經分離抗體，其中該抗體係作為選自由 以下單株抗體組成之群的單株抗體與至少一種抗原決定 基結合：可自美國囷種保存中心（American Type Culture Collection)寄存編號PTA-7808所表示之融合瘤獲得之單 株抗體10F4及可自美國菌種保存中心寄存編號PTA-7406 所表示之融合瘤獲得之單株抗體3C5。 8. —種經分離抗體，其包含SEQ ID NO: 5。 9. 一種經分離抗體，其包含SEQIDN0:6。 127174.doc 200840592 10·如請求項9之經分離抗體，其進一步包含SEQ ID NO·5。 11. 一種經分離抗體，其包含SEQ ID N0:7。 12. —種經分離抗體，其包含SEQ ID NO: 8。 13·如請求項12之經分離抗體，其進一步包含SEQ ID N0:7。 14·如請求項1或2之經分離抗體，其中該抗體包含至少一種 選自由以下胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：a)可自 美國菌種保存中心寄存編號PTA-7808所表示之融合瘤獲 — 得的單株抗體（10F4)之重鏈CDR3之胺基酸序列及輕鏈 CDR3之胺基酸序列及b)可自美國菌種保存中心寄存編號 PTA-7406所表示之融合瘤獲得的單株抗體（3C5)之重鏈 CDR3之胺基酸序列及輕鏈CDR3之胺基酸序列。 15. 如請求項1或2之經分離抗體，其中該抗體包含至少一種 選自由以下胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：a)可自 美國菌種保存中心寄存編號PTA-7808所表示之融合瘤獲 $ 得的單株抗體（10F4)之重鏈CDR2之胺基酸序列及輕鏈 CDR2之胺基酸序列及b)可自美國菌種保存中心寄存編號 PTA-7406所表示之融合瘤獲得的單株抗體（3C5)之重鏈 CDR2之胺基酸序列及輕鏈CDR2之胺基酸序列。 16. 如請求項1或2之經分離抗體，其中該抗體包含至少一種 選自由以下胺基酸序列組成之群的胺基酸序列：a)可自 美國菌種保存中心寄存編號PTA-7808所表示之融合瘤獲 得的單株抗體（10F4)之重鏈CDR1之胺基酸序列及輕鏈 CDR1之胺基酸序列及b)可自美國菌種保存中心寄存編號 127174.doc 200840592 PTA-7406所表示之融合瘤獲得的單株抗體（3C5)之重鏈 CDR1之胺基酸序列及輕鏈CDR1之胺基酸序列。 17· —種經分離抗體，其包含至少一種選自由以下胺基酸序 列組成之群的 CDR : a)SHYAWN ; b)YIDYSGSTRYLPSLKS ; c)GSGYFYGMDY ； d)HASQNINVWLS ； e)KASNLHT ； f)QQGQSYPYT ； g)NYLIE ； h)VINPGSGDTNYNENFKG ； i)GVITTGFDY ； j)RASGNIHNYLA ； k)NAKTLAD 及 OQHFWSSPRT。 1 8. —種融合瘤，其係由美國菌種保存中心寄存編號PTA-7808表示。 19. 一種單株抗體（10F4)，其可自美國菌種保存中心寄存編 號PTA-7808所表示之融合瘤獲得。 20. —種融合瘤，其係由美國菌種保存中心寄存編號PTA-7406表示。 21· —種單株抗體（3C5)，其可自美國菌種保存中心寄存編號 PTA-7400所表示之融合瘤獲得。 22· —種經分離核酸分子，其編碼如請求項1或2之抗體。 23.如請求項22之經分離核酸分子，其中該分子之核苷酸序 列包含至少一種選自由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、 SEQIDNO:3及SEQIDNO:4組成之群的序歹ij。 24· —種載體，其包含如請求項23之該經分離核酸分子。 25. —種宿主細胞，其包含如請求項24之該載體。 26. —種產生抗體之方法，其包含在適合於產生該抗體之時 間及條件下，在培養基中培養如請求項25之該宿主細 127174.doc 200840592 胞。 27. —種經分離抗體，其係由如請求項26之該方法產生。 2 8 · —種組合物，其包含如請求項1之該抗體、如請求項2之 該抗體或其組合。 29. 如請求項28之組合物，其中該組合物為醫藥組合物且進 一步包含醫藥學上可接受之載劑。 30. —種單株抗體，其包含由至少一種選自由SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3及 SEQ ID NO:4組成 ® 之群的核苷酸序列編碼之胺基酸序列。 31. 如請求項30之經分離抗體，其中該抗體係選自由美國菌 種保存中心寄存編號PTA-7406所表示之融合瘤產生的單 株抗體及美國菌種保存中心寄存編號PTA-7808所表示之 融合瘤產生的單株抗體組成之群。 32. 如請求項30之經分離抗體，其中該抗體包含至少一種選 自由 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及 SEQ 0 ID NO:8組成之群的胺基酸序列。 3 3. —種治療或預防需要該治療或預防之患者的澱粉樣變性 病之方法，其包含以足以實現該治療或預防之量向該患 者投與如請求項1或請求項2之該抗體。 34. 如請求項33之方法，其中該澱粉樣變性病為阿茲海默氏 病（Alzheimer’s disease)或唐氏症候群（Down’s syndrome) 之澱粉樣變性病。 35. —種經分離抗體，其與患有澱粉樣變性病之患者腦中之 β澱粉樣蛋白之至少一種抗原決定基結合。 127174.doc 200840592 36.如請求項35之經分離抗體，其中該抗體由具有選自由 PTA-7406及ΡΤΑ·7808組成之群的ATCC寄存編號之融合 瘤產生。 θ 37·種在疑似患有阿茲海默氏病之患者中診斷該疾病之方 法’其包含以下步驟： a•自該患者分離生物樣品；
    b·在足以形成抗原/抗體複合物之時間及條件下使該生 物樣品與如請求項1或請求項2之該經分離抗體接觸；及 * c.偵測該樣品中是否存在該等抗原/抗體複合物，該 等複合物之存在表明該患者患有阿兹海默氏病之診斷。 38.如請求項37之方法，其中該抗原為球體。 39. —種在疑似患有阿兹海默氏病之患者中診斷該疾病之方 法，其包含以下步驟： a·自違患者分離生物樣品； 汰在足以形成抗體/抗原複合物之時間及條件下使該 生物樣品與抗原接觸； 在足以使得結合物與該經結合抗體結合之時間及條 件下將該結合物添加至該等所得抗體/抗原複合物中，其 中該結合物包含與能夠產生可偵測信號之信號產生化合 物附接之如請求項丨或請求項2之該經分離抗體；及 /·藉由偵測由該信號產生化合物產生之信號來偵測可 能存在於該生物樣品中之抗體是否存在，該信號表明該 患者患有阿茲海默氏病之診斷。 4〇·如請求項28之方法’其中該抗原為球體。 127174.doc 200840592 41·種在疑似患有阿兹海默氏病之患者中診斷阿兹海默氏 病之方法，其包含以下步驟： a·自該患者分離生物樣品； b. 在足以使得形成抗-抗體/抗體複合物之時間及條件 =使該生物樣品與抗·抗體接觸，其中該抗·抗體對於如 請求項1或請求項2之該抗體具有特異性，該等複合物含 有存在於該生物樣品中之抗體； c. 在足以使得結合物與經結合抗體結合之時間及條件 下將該結合物添加至所得抗·抗體/抗體複合物中，其中 該結合物包含抗原’其與能夠產生可❹】信號之信號產 生化合物結合；及 d·偵測由該信號產生化合物產生之信 场π观表明 該患者患有阿茲海默氏病之診斷 42. :種疫苗，其包含：a)如請求们之該經分離抗體、如請 求項2之該經分離抗體或其組合及b)醫藥學上可接受之佐
    劑。 43. -種鑑別適合於對預期會呈現阿兹海默氏病之患者進行 自動免疫之化合物的方法，其包含以下步驟： 丁 a)在足以使-或多種所關注之化合物與如請求項碱 明求項2之該經分離抗體結合之時間及條件下使該一或 多種化合物暴露於該請求们或請求項2之該㈣計 體；及 b)鑑別與如請求項1或請求項2之該經分離抗體結合之 彼專化合物，該等經鑑別之化合物制於對預期會呈現 127174.doc 200840592 阿兹海默氏病之患者的自動免疫。 44· 一種套組，其包含·· a)如請求項i或請求項2之該經分離 抗體及b)包含與信號產生化合物附接之抗體的結合物， 其中該結合物之該抗體不同於該經分離抗體。 45· —種套組’其包含：a)對於如請求項1或請求項2之該經 分離抗體之抗-抗體及b)包含與信號產生化合物附接之抗 原的結合物。 46·如明求項％之套組，其中該抗原為球體。
    127174.doc
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