ES2228697T3 - Anticuerpo monoclonal, mab 1e8, que es especifico para los dos primeros aminoacidos de peptidos beta-amiloides y su utilizacion en la deteccion de peptidos beta-amiloides y/o sapp alfa. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo monoclonal que se refiere como mAb 1E8, que se produce mediante hibridomas que se depositaron en la DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, el 19 de diciembre del 2000, y a los que se les asignó un número DSMZ de entrada DSM ACC2485.

Description

Anticuerpo monoclonal, mAb 1E8, que es específico para los dos primeros aminoácidos de péptidos \beta-amiloides y su utilización en la detección de péptidos \beta-amiloides y/o sAPP \alpha.

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal y a la utilización del anticuerpo para A\beta-péptidos y/o sAPP\alpha. Se refiere en particular al diagnóstico neuroquímico de enfermedades psiquiátricas con la detección de la concentraciones de A\beta-péptido y, en este caso, otra vez en particular al diagnóstico de demencia en fluidos corporales o en muestras de tejidos.

En la revista alemana Psycho, 24 (1998), 726-731, se conoce que se detectan concentraciones reducidas de A\beta1-42 en el CSF de pacientes con la enfermedad de Alzheimer. En estos pacientes existe asimismo una tendencia a que aumente la concentración de A\beta-péptidos A\betax-42 modificados en el N terminal. En contraste, se ha dicho que no existen cambios en la concentración de A\beta-péptido A\beta1-40 a causa de la enfermedad de Alzheimer. Las concentraciones de los A\beta-péptidos A\beta1-42 y A\beta1-40 en el CSF pacientes con Alzheimer no deben mostrar correlación absoluta con parámetros de examen de la gravedad de la demencia clínicos o psicológicos, aunque se dice que deben ser muy constantes intraindividualmente.

Se sabe que existe evidencia que sAPP\alpha está asimismo reducido en la CSF de la enfermedad de Alzheimer.

Para obtener una información más detallada sobre la correlación de las enfermedades de la demencia y de posiblemente otros desórdenes neuropsiquiátricos con la concentración de todos o de determinados A\beta-péptidos en muestras de fluidos o tejidos corporales es necesario poseer medios disponibles para una determinación exacta y reproducible de las concentraciones de los A\beta-péptidos, de forma que las correlaciones existentes no se oscurezcan debido a errores inevitables en las determinaciones de la concentración.

Se conoce un anticuerpo FCA18 en CHEVALLIER N ET AL: "CATHEPSIN D DISPLAYS IN VITRO BETA-SECRETASE-LIKE SPECIFICITY" BRAIN RESEARCH, AMSTERDAM, NL, vol. 750, nº. 1/2, 1997, Págs. 11-19, XP000921314 ISSN: 0006-8993 que sólo reconoce el primer aminoácido N-terminal de la A\beta-proteína, aunque ha sido yuxtapuesto a los primeros ocho aminoácidos N-terminales de la A\beta-proteína.

Se conoce de TAKAOMI COMINGS SAIDO ET AL: "Spatial resolution of the primary beta-amyloideogenic process induced in postischemic hippocampus" THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 269, nº. 21, May 27, 1994 (1994-05-27), págs. 15253-15257, XP002182078, un anticuerpo 9204 que por ejemplo reconoce el A\beta-péptido A\beta1-40 pero no el A\beta-péptido A\beta2-40.

Se describe en ARAI T ET AL: "IMMUNOHISTOCHEMICAL LOCALIZATION OF AMYLOID BETA-PROTEIN WITH AMINO-TERMINAL ASPARATE IN THE CEREBRAL CORTEX OF PATIENTS WITH ALZHEIMER'S DIESEASE" BRAIN RESEARCH, AMSTERDAM, NL, vol. 823, nº. 1/2, 1999, págs. 202-206, XP001021822 ISSN: 0006-8993, un anticuerpo A\beta 1, que reacciona con el péptido A\beta1-42 pero no con el derivado de piroglutamato A-\beta (N3[pE]) acortado en el N terminal por dos aminoácidos. No se describe si el anticuerpo A\beta1 se une a un A\beta-péptido acortado por un aminoácido.

La presente invención se basa por lo tanto en el objetivo primario de proporcionar un medio para la determinación exacta y reproducible de concentraciones de A\beta-péptidos en una muestra de fluido o de tejido corporal. Un objetivo adicional es optimizar la utilización de este medio y derivar de las correlaciones que se pueden medir con él entre las concentraciones de A\beta-péptido y las predicciones de enfermedades neuropsiquiátricas que se pueden utilizar en diagnósticos neuroquímicos futuros de enfermedades neuropsiquiátricas.

El medio con el que se consigue el objetivo de la presente invención es el anticuerpo monoclonal que se refiere como mAb 1E8, que se produce por hibridomas que se depositaron en el DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, el 19 de dic. del 2000, y a los que se les asignó el número de entrada DSMZ ACC2485.

El anticuerpo mAb 1E8 se puede marcar radioactivamente. Sin embargo, se puede asimismo utilizar junto con un anticuerpo secundario para la marcación del mismo.

Ha resultado que el anticuerpo que mAb 1E8 se une con una selectividad elevada y específica a los A\beta-péptidos A\beta1-x y A\beta2-x y a la proteína precursora \beta-amiloide soluble después de cortar la \alpha-secretasa (sAPP\alpha). Esto crea las condiciones por las que es posible determinar la concentración de estos péptidos con el anticuerpo mAb 1E8.

El anticuerpo mAb 1E8 se puede utilizar en un inmunograma obtenido con el equipo Western. Es posible en este caso incrementar la selectividad efectiva del anticuerpo mAb 1E8 mediante el bloqueo no específico de los sitios de unión con un agente bloqueante antes de la utilización del anticuerpo. Un reactivo sintético que se obtiene bajo la denominación comercial "Roti-Block" ha demostrado en este contexto ser muy ventajoso comparado con una utilización convencional de polvo de leche como agente bloqueante, porque aumenta la eficacia avidez- y de este modo la sensibilidad de detección- del anticuerpo mAb 1E8 mientras se retiene sustancialmente la selectividad. Esto no se aplica generalmente porque, por ejemplo, otro mAb (6E10) disponible comercialmente no es compatible con este procedimiento.

Ya que el anticuerpo mAb 1E8 reconoce tanto A\beta-péptidos A\beta1-x y A\beta-péptidos A\beta2-x y sAPP\alpha, estos péptidos se deben separar uno de otro mediante una detección selectiva. Esto es posible mediante electroforesis de gel de poliacrilamida de laurilsulfato de sodio (SDS-PAGE). Sin embargo, en una SDS-PAGE convencional, sólo los A\beta-péptidos A\beta1-x y/o A\beta2-x se separan en conjunto del sAPP\alpha, porque los tamaños moleculares efectivos de los A\beta-péptidos A\beta1-x y/o A\beta2-x no son suficientemente diferentes. Sin embargo, es posible mediante la adición de urea, y dependiendo opcionalmente de la concentración de detergente, tamaño de poro de gel, pH y temperatura, inducir un cambio conformacional de la secuencia específica primaria de un aminoácido en los A\beta-péptidos, lo que hace posible distinguir las distancias de migración en la SDS-PAGE de los A\beta-péptidos A\beta1-x y A\beta2-x, que difieren en la longitud en el carbono terminal. Este procedimiento se refiere asimismo en la presente memoria como A\beta-SDS-PAGE.

Los A\beta-péptidos se pueden separar de otras sustancias presentes en la muestra particular de fluido o de tejido corporal de antemano mediante focalización isoléctrica en una dirección perpendicular a la dirección de la SDS-PAGE.

De este modo es posible utilizar el anticuerpo mAb 1E8 para determinar, en una muestra que se selecciona de entre el grupo que comprende CSF, homogenados de cerebro, plasma y mezclas de los mismos, una concentración de A\beta-péptido A\beta1-42, para la cual ya se conoce que el incremento absoluto en el homogenados de cerebro y la reducción en el CSF del mismo ocurren por ejemplo en correlación con las enfermedades de Alzheimer.

Sin embargo, es posible asimismo con la utilización del anticuerpo mAb 1E8 examinar una muestra que se selecciona de entre el grupo que comprende CSF, homogenados de cerebro, plasma y mezclas de los mismos para la presencia de una concentración detectable del A\beta-péptido A\beta2-42. Tal límite de detección es 100 pg/ml o superior. Cuando se excede, es posible concluir que el paciente a partir del que se origina la muestra posee una enfermedad de demencia del grupo enfermedades caracterizadas por plegado proteínico. El grupo de enfermedades caracterizadas por plegado proteínico incluye no sólo enfermedades de Alzheimer sino asimismo demencia corporal de Lewy y enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. Se detectaron concentraciones elevadas del A\beta-péptido A\beta2-42 en las muestras CSF de muchos pacientes con estas enfermedades.

El análisis de muestra de plasma es difícil aquí, en contraste con las utilizaciones del anticuerpo mAb 1E8 descrito anteriormente, porque la concentración del A\beta-péptido A\beta2-42 está en el límite de detección incluso en el CSF, y la concentración natural de los A\beta-péptidos en plasma es claramente inferior a la de CSF. Para obtener igualmente concentraciones elevadas en las muestras, es por lo tanto necesario siempre llevar a cabo una fase de concentración en el plasma, por ejemplo mediante inmunoprecipitación con el anticuerpo mAb 1E8, antes de la determinación de la concentración real.

Se ha demostrado que es particularmente significativo un aumento en la proporción entre la concentración de A\beta-péptido A\beta2-42 a la concentración del A\beta-péptido A\beta 1-42 en la muestra particular en presencia de una enfermedad de demencia del grupo de enfermedades caracterizadas por plegado proteínico. En estas enfermedades de demencia existe evidentemente un procedimiento que promueve la producción del A\beta-péptido A\beta2-42 a expensas de la producción del A\beta-péptido A\beta1-42.

La utilización del anticuerpo mAb 1E8 abre también otras posibilidades de diagnóstico neuroquímico. De este modo, es posible determinar en una muestra, seleccionada de entre el grupo que comprende CSF, homogenados de cerebro, plasma y mezclas de los mismos, por lo menos una proporción de concentración que se selecciona de entre el grupo que comprende una proporción entre una concentración del A\beta-péptido A\beta1-42 a una concentración del A\beta-péptido A\beta1-40, una proporción entre una concentración del A\beta-péptido A\beta1-42 a una concentración del A\beta-péptido A\beta 1-38 y una proporción entre una concentración del A\beta-péptido A\beta1-38 a una concentración del A\beta-péptido A\beta1-40. Las determinaciones de estas proporciones de concentración se basan en un nuevo descubrimiento que ocurren cambios significativos en esta concentración relativa de los A\beta-péptidos en diversas enfermedades neuropsiquiátricas comparadas con un grupo comparativo de pacientes.

De este modo, si la proporción de concentración A\beta1-38/A\beta1-40 es inferior a un límite determinado previamente en la comparación del mismo con el límite, es posible concluir que está presente la enfermedad de Alzheimer. Este límite en CSF está típicamente entre 0,285 y 0,300. Estos datos numéricos se refieren, como todos los otros datos numéricos, a menos que se indique lo contrario en un caso individual, a muestras CSF que se han congelado una vez en cada caso para su conservación después de su obtención.

A la inversa, si la proporción de concentración A\beta1-38/A\beta 1-40 excede un límite diferente en la comparación es posible concluir que existe una enfermedad inflamatoria crónica del sistema nervioso central. Este límite de CSF está típicamente entre 0,250 y 0,260. De este modo, es de hecho, inferior al límite por debajo del cual se concluye que existe enfermedad de Alzheimer. La superposición es, sin embargo, solo pequeña. En este sentido se debe ver asimismo que los diagnósticos realizados aquí se deben considerar en el marco de un diagnóstico diferencial. De este modo, si se excede el límite para la enfermedad de Alzheimer, se puede concluir previamente con relativa certeza que tal enfermedad está presente. A la inversa, por debajo del límite para una enfermedad inflamatoria crónica del sistema nervioso central es posible concluir que no está presente tal enfermedad.

Cuando la proporción de concentración A\beta1-42/A\beta1-40 es inferior a un nivel determinado previamente indica asimismo que está presente la enfermedad de Alzheimer. El límite en este caso en CSF está típicamente entre 0,130 y 0,145.

Cuando se presenta la proporción de concentración de 1-42/A\beta1-38, se satisface la desigualdad:

A*A\beta1-42/A\beta1-38+B >A\beta1-38/A\beta 1-40

Junto con la proporción de concentración de A\beta1-38/A\beta1-40, se indica la presencia de la enfermedad de Alzheimer, en la que A y B son constantes para las que se aplica en CSF lo siguiente:

0,2 < A < 0,8

y

0,5*A<B<2*A

y

B < 0,9

Hay que admitir que las posibilidades del diagnóstico neuroquímico descritas anteriormente y en lo sucesivo se desarrollaron utilizando el anticuerpo mAb 1E8. Sin embargo, se pueden implementar sólo de la misma manera con otros medios para determinar las concentraciones de los A\beta-péptidos A\beta1-x y A\beta 2-x individuales. En estos casos puede haber cambios en los límites citados debido a especificaciones diferentes de los medios para detectar los A\beta-péptidos individuales relativos a las especificidades del anticuerpo mAb 1E8.

Además de las proporciones de concentración que se han mencionado anteriormente entre las concentraciones de A\beta-péptidos individuales, resultó que las proporciones relativas de A\beta-péptidos individuales en el total de un A\beta-péptido presente se pueden probablemente evaluar en forma de diagnóstico en relación a las enfermedades neuropsiquiátricas. De este modo, en una muestra que se selecciona de entre el grupo que comprende CSF, homogenado de cerebro, plasma y mezclas de los mismos, es posible determinar por lo menos una proporción relativa A\beta1-n% de una concentración de un A\beta-péptido A\beta1-n en una concentración de un A\beta-péptido A\beta1-x, en el que la proporción relativa A\beta1-n% se selecciona de entre el grupo que comprende una proporción relativa A\beta1-42% de una concentración del A\beta-péptido A\beta1-42, una proporción relativa A\beta1-40% de una concentración del A\beta-péptido A\beta1-40 y una proporción relativa A\beta1-38% de una concentración del A\beta-péptido A\beta1-38, y en la que la concentración de los A\beta-péptidos A\beta1-x comprende por lo menos la concentración de los A\beta-péptidos A\beta1-38, A\beta1-40 y A\beta1-42 del grupo de A\beta-péptidos A\beta1-37, A\beta1-38, A\beta1-39, A\beta1-40 y A\beta1-42.

Es posible determinar con el anticuerpo mAb 1E8 y con la metodología adecuada las concentraciones de todos los A\beta-péptidos mencionados además de la de sAPP\alpha. Las concentraciones más elevadas se encuentran con los A\beta-péptidos A\beta1-38, A\beta1-40 y A\beta1-42. Con estos A\beta-péptidos existen asimismo cambios significativos en las proporciones relativas si aparecen enfermedades neuropsiquiátricas. A causa de la dominancia de los A\beta-péptidos A\beta1-38, A\beta1-40 y A\beta1-42 es suficiente determinar las proporciones relativas en relación a este grupo de tres A\beta-péptidos que aparecen principalmente. Sin embargo, es asimismo posible y sensible tener en cuenta los cinco A\beta-péptidos mencionados anteriormente como base para las proporciones relativas. Las concentraciones en sólo los tres A\beta-péptidos que aparecen principalmente hace posible asimismo llevar a cabo el diagnóstico descrito en la presente memoria con la ayuda de otros procedimientos para la determinación de la concentración. De este modo, las concentraciones de los tres A\beta-péptidos A\beta1-38, A\beta1-0 y A\beta1-42 se pueden medir por ejemplo con ensayos específicos para estos tres A\beta-
péptidos.

Del análisis de la proporción relativa A\beta1-38% ha resultado que cuanto este último excede un límite determinado previamente, indica la presencia de una enfermedad inflamatoria crónica del sistema nervioso central, en la que este límite determinado previamente es típicamente, y en la utilización del anticuerpo mAb 1E8 para la determinación de las concentraciones de los A\beta-péptidos en el CSF, entre 15,0 y 15,7%.

El análisis de la proporción relativa A\beta1-42% ha revelado que cuando está por debajo de un límite determinado previamente indica la presencia de la enfermedad de Alzheimer. Este límite predeterminado está entre 8 y 9%. En la utilización del anticuerpo mAb 1E8 para la determinación de concentraciones de los A\beta-péptidos en el CSF se puede restringir al intervalo de 8,3 a 8,8%.

Al mismo tiempo, la presencia de una enfermedad inflamatoria crónica del sistema nervioso central se indica por la proporción relativa A\beta1-42% que excede un límite determinado previamente. Este límite en CSF está entre 9,1 y 9,6%.

La proporción relativa de A\beta1-40% indica la presencia de la enfermedad de Alzheimer si se excede un límite determinado previamente, que está típicamente entre 59 y 61% in CSF.

Existe una correlación positiva entre la gravedad de la enfermedad de Alzheimer reflejada por el examen de estado mini mental (MMSE, puntuación 0-30; 27-20: demencia media; puntuación 19-11: demencia moderada; puntuación 10-0: demencia grave), y A\beta1-40%. Los pacientes con demencia con A\beta1-40% \geq 60 poseen en promedio una gravedad mayor distintamente de demencia (MMSE 15-16) comparada con los pacientes con demencia con A\beta1-40%<60 (MMSE 19-20).

Por otro lado, existe una correlación negativa entre la gravedad de la enfermedad de Alzheimer y A\beta1-38%. Los pacientes con demencia con A\beta1-38% < 17 poseen en promedio una gravedad mayor distintamente de la demencia (MMSE 14-15) comparada con los pacientes con demencia con A\beta1-38% \geq 17 (MMSE 19-20).

Según se esperó sobre la base de la relación (A\beta 1-38%\Downarrow & A\beta1-40%\Uparrow = gravedad de la demencia \Uparrow) la proporción A\beta1-38/A\beta1-40 se correlaciona negativamente con la gravedad de la demencia: los pacientes con demencia con A\beta1-38/A\beta1-40 < 0,28 poseen en promedio una gravedad mayor distintamente de la demencia (MMSE 14-15) comparada con los pacientes con demencia con A\beta1-38/A\beta1-40 \geq 0,28 (MMSE 19-20).

Ha resultado de la utilización del anticuerpo mAb 1E8 que una fracción de los A\beta-péptidos A\beta1-x y A\beta2-x que depende del tratamiento previo es accesible para este anticuerpo. Sería posible maximizar las concentraciones A\beta detectables mediante la digestión de los A\beta-péptidos en las muestras por tratamiento con un detergente. Para este objetivo se ha demostrado adecuada una SDS/desnaturalización térmica.

En este contexto, fue posible establecer adicionalmente que una crioconservación de muestras, que tiene lugar antes de la digestión con un detergente, reduce las concentraciones de los A\beta-péptidos que se pueden determinar posteriormente incluso después de la digestión de la muestra con un detergente. El requisito que se puede deducir de esto es que las muestras se someten a tratamiento de muestra con el detergente incluso antes de la crioconservación y de cualquier otro tratamiento de temperatura baja.

Ha resultado adicionalmente que las porciones del A\beta-péptido A\beta1-42 que no son más accesibles a la detección con el anticuerpo mAb 1E8 después de un tratamiento de temperatura baja, incluso a través de la digestión de la muestra con un detergente, difieren en el tamaño en pacientes con y sin enfermedades caracterizadas por plegado proteínico. Existen evidentemente diferentes fracciones del A\beta-péptido A\beta1-42 en una muestra, y estas fracciones responden de forma diferente al tratamiento de baja temperatura y digestión con un detergente y, al mismo tiempo, varían en sus concentraciones con la presencia de enfermedades caracterizadas por plegado proteínico. La diferencia en el comportamiento de estas fracciones en relación a la temperatura baja indica crioprecipitación, de forma que son posibles asimismo otras técnicas de precipitación para distinguir las dos fracciones.

De este modo, una muestra se puede dividir en por lo menos dos partes de muestra, de las cuales una parte de muestra se somete a un tratamiento de muestra con el detergente antes o en lugar de un tratamiento de precipitación, mientras la segunda parte de muestra se somete al tratamiento de precipitación antes o en lugar del tratamiento de muestra con detergente. Posteriormente, las concentraciones del A\beta-péptido A\beta1-42 determinadas en las dos partes de muestra se comparan una con otra. El tratamiento de precipitación mencionado puede asimismo comprender además de un tratamiento de baja temperatura un procedimiento de inmunoafinidad. Es de particular interés encontrar una diferencia \DeltaA\beta1-42 entre las concentraciones del A\beta-péptido A\beta1-42 determinado en las dos partes de muestra. Este valor es un indicador elevadamente significativo de la presencia de una enfermedad caracterizada por plegado proteínico.

En la utilización práctica del anticuerpo mAb 1E8 es posible etiquetar los A\beta-péptidos a los que se une el anticuerpo mAb 1E8 con un anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo mAb 1E8. El anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo mAb 1E8 ya puede proporcionarse con un marcador cuya cantidad se puede registrar, o se puede proporcionar después de su reacción inmune con el anticuerpo mAb 1E8 con un marcador cuya cantidad se puede registrar.

En el registro de la cantidad del marcador se prefiere llevarlo a cabo fotométricamente con una cámara CCD, porque este procedimiento asegura una linealidad muy elevada entre la señal de la cámara CCD y las cantidades registradas del anticuerpo etiquetado mAb 1E8.

El anticuerpo nuevo es adecuado no sólo por las posibilidades de diagnóstico descritas anteriormente sino asimismo para la concentración pura de los A\beta-péptidos A\beta1-x y/o A\beta1-x y/o A\beta2-x y/o sAPP\alpha.

Una posibilidad adicional de utilización surge de la distinción de los A\beta-péptidos A\beta1-x y A\beta2-x de los A\beta-péptidos A\betan-x con n >2, porque el anticuerpo mAb 1E8 posee una especificidad pronunciada en el N terminal y se une de forma distinta menos (< 5%) a los A\beta-péptidos A\betan-x con n>2 cuando se utiliza bajo las condiciones específicas del A\beta Inmunograma/SDS-PAGE.

La presente invención se explica en más detalle y se describe en lo sucesivo mediante una caracterización y una descripción de un procedimiento para producir el anticuerpo mAb 1E8 y en forma de una descripción de utilizaciones del anticuerpo mAb 1E8.

En las figuras adjuntas se muestra:

Fig. 1: un diagrama de flujo de los grupos de los pacientes en los que los A\beta-péptidos se midieron en el CSF o plasma mediante A\beta Inmunograma/SDS-PAGE. Los grupos de pacientes en un cuadro único son subconjuntos de sus grupos superiores en cuadros dobles. Algunos pacientes están presentes simultáneamente en más de un grupo (véanse tablas 5a-d). Los subgrupos NDC-3 IP plasma-3 (n=5), IP-CSF-3 (n=5) y SDS-CSF-3 (n=5) no se incluyen (véanse 2.9.1).

Fig. 2: un A\beta-IPG 2D-PAGE/inmunograma 2 (lista A, C) y A\beta Inmunograma/SDS-PAGE 2 (lista B) de A\beta-péptidos sintéticos, CSF humana y CSF con la adición de los A\beta-péptidos sintéticos.

Fig. 3: una determinación de los A\beta-péptidos en CSF en NDC-3 mediante A\beta Inmunograma/SDS-PAGE 2 y una comparación entre el gel de resolución con (lista A) y sin urea (lista B). Lo siguiente se aplica a las columnas 1 a 8: 10 \mul de CSF por paciente. Se congeló el CSF sin tratar y a continuación se SDS/desnaturalizó térmicamente. Lo siguiente se aplica a las columnas a a e: Mezcla de los A\beta-péptidos sintéticos (series de dilución).

Fig. 4: un gráfico de A\beta1-42 en CSF en los grupos de pacientes NDC-1 y AD-1, determinado por A\beta Inmunograma/SDS-PAGE-1 y evaluación de la película mediante densitometría.

Fig. 5: un gráfico de la proporción A\beta1-42/A\beta1-40 en CSF en NDC-1 y AD-1, determinada por A\beta Inmunograma/SDS-PAGE 1 y evaluación de la película mediante densitometría.

Fig. 6: un gráfico de una proporción A\beta1-42/A\beta1-38 en CSF en NDC-1 y AD-1, determinada por A\beta Inmunograma/SDS-PAGE 1 y evaluación de la película mediante densitometría.

Fig. 7: un gráfico de A\beta1-42 en CSF en NDC-1 y AD-1, determinada por inmunoprecipitación (IP sin detergente, mAb 6E10) y A\beta Inmunograma/SDS-PAGE 1 con evaluación de la película mediante densitometría.

Fig. 8: una gráfica de las concentraciones del A\beta-péptido, determinadas por A\beta Inmunograma/SDS-PAGE 2 en CSF en OND-3, CID-3 y AD-3.

Fig 9: un gráfico de las concentraciones de A\beta-péptido, determinadas por A\beta Inmunograma/SDS-PAGE 2 en el CSF de pacientes en los grupos de OND-3 y AD-3 con uno o dos alelos ApoE \varepsilon4 (AD-3\varepsilon4más, OND-3\varepsilon4más), comparado con pacientes OND-3 sin el alelo ApoE \varepsilon4 (OND\varepsilon4menos).

Fig. 10: una correlación de A\beta1-38 y A\beta1-40 en CSF en NDC-3 y una matriz de correlación de los A\beta-péptidos.

Fig. 11: un gráfico de A\beta1-38% versus A\beta1-40% en CSF en OND-3, CID-3 y AD-3. La línea de regresión se refiere al grupo AD-3. La gravedad de la demencia aumenta en la dirección de la flecha. Las líneas límite (A\beta1-38%=15,5, A\beta1-42%= 9,6) se refieren al grupo CID-3. Los pacientes individuales se identifican por sus números de código.

Fig. 12: un gráfico de A\beta1-40% versus A\beta1-42% en CSF en OND-3, CID-3 y AD-3. La línea de regresión se refiere al grupo AD-3. La gravedad de la demencia aumenta en la dirección de la flecha. Las líneas límite (A\beta1-40%=63,0, A\beta1-42%= 8,5) se refieren al grupo AD-3. Los pacientes individuales se identifican por sus números de código.

Fig. 13: un gráfico de A\beta1-40% versus A\beta1-38% en CSF en OND-3, CID-3 y AD-3. La línea de regresión se refiere al grupo AD-3. La gravedad de la demencia aumenta en la dirección de la flecha. Las líneas límite (A\beta1-38%=15,5, A\beta1-40%= 60,0) se refieren al grupo CID-3. Las líneas límite discontinuas (A\beta1-38%=16,0, A\beta1-40%= 63,0) identifican pacientes AD-3 con grado de demencia grave. Los pacientes individuales se identifican por sus números de código.

Fig. 14: un box plot (gráfico de campos probabilísticas) del examen MMSE resulta en CSF en AD-3 como función de las proporciones de los A\beta-péptidos como porcentajes del total de la concentración del A\beta-péptido.

Fig. 15: resultado del examen MMSE como una función de la proporción del A\beta-péptido en el CSF como un porcentaje de la concentración total del A\beta-péptido en AD-3.

Fig. 16: un gráfico de A\beta1-38/A\beta1-40 versus A\beta1-42/A\beta1-38 en CSF en OND-3, CID-3 y AD-3. La línea de regresión se refiere al grupo AD-3. La línea límite discontinua es una paralela a la línea de regresión. La gravedad de la demencia aumenta en la dirección de la flecha. Las líneas límite (A\beta1-38/A\beta1-40 =0,26, A\beta1-42/A\beta1-38 = 0,57) se refieren al grupo CID-3. Los pacientes individuales se identifican por sus números de código.

Fig. 17: un gráfico de A\beta1-38/A\beta1-40 versus A\beta1-42/A\beta1-40 en CSF en OND-3, CID-3 y AD-3. La línea de regresión se refiere al grupo AD-3. La gravedad de la demencia aumenta en la dirección de la flecha. Las líneas límite (A\beta1-38/A\beta1-40 =0,26, A\beta1-42/A\beta1-40 = 0,16) se refieren al grupo CID-3. Los pacientes individuales se identifican por sus números de código.

Fig. 18: un gráfico de campos probabilístico de los resultados del examen MMSE en CSF en AD-3 como una función de la proporción A\beta1-38/A\beta1-40.

Fig. 19: un gráfico de A\beta1-42 nativo en CSF en NDC-3CP y AD-3CP versus \DeltaA\beta1-42%, es decir, como una función de la reducción causada por la crioprecipitación en A\beta1-42. Las líneas límite (A\beta1-42 = 2100, \DeltaA\beta1-42% = -17) se refieren al grupo AD-3CP. El eje cero, es decir no hay reducción causada por crioprecipitación en A\beta1-42, se indica por una línea. El genotipo ApoE se indica para los pacientes NDC-3CP. 9/11 de los pacientes AD-3CP tuvieron por lo menos un alelo ApoE \varepsilon4. El genotipo ApoE \varepsilon4 no estuvo disponible para 2/11 de los pacientes AD-3CP.

Fig. 20: un gráfico de A\beta1-42 SDS en CSF en NDC-3CP y AD-3CP como una función de \DeltaA\beta1-42%, es decir como una función de la reducción causada por crioprecipitación en A\beta1-42. Las líneas límite (A\beta1-42 = 2100, \DeltaA\beta1-42% = -17) se refieren al grupo AD-3CP. El eje cero, es decir no hay reducción causada por crioprecipitación en A\beta1-42, se indica por una línea. El genotipo ApoE se indica para los pacientes NDC-3CP. 9/11 de los pacientes AD-3CP tuvieron por lo menos un alelo ApoE \varepsilon4. El genotipo ApoE \varepsilon4 no estuvo disponible para 2/11 de los pacientes AD-4.

Fig. 21a: un A\beta Inmunograma/SDS-PAGE 2: inmunoprecipitados (RIPA-IP, mAb 1E8) de A\beta-péptidos solubles en RIPA a partir de homogenados del córtex temporal en AD comparado con la demencia frontotemporal (FTD). Volumen aplicado 4 \mul. En columnas de la a a la c: mezcla de los A\beta-péptidos sintéticos (series de dilución). En columnas de 1 a 4 y 5: córtex temporal en AD. (*el inmunoprecipitado en AD se diluyó veinte veces en algunos pacientes.). En las columnas 8 a 10: córtex temporal en FTD.

Fig. 21b: un A\beta Inmunograma/SDS-PAGE 2: inmunoprecipitado (RIPA-IP, mAb 1E8) de A\beta-péptidos solubles en RIPA de homogenados del córtex temporal en AD comparado con la demencia frontotemporal (FTD), demencia corporal de Lewy (LBD) y pacientes de control sin demencia (NDC). Volumen aplicado 4 \mul. En las columnas:

a a d:	mezcla de los A\beta-péptidos sintéticos (series de dilución)
5 y 6:	córtex temporal en AD
11 y 12:	córtex temporal en FTD
13 y 15:	córtex temporal en LBD;
	(13) LBD CERAD A, (14) LBD CERAD C, (15) LBD CEBAD C
16:	córtex temporal en NDC
*El inmunoprecipitado en AD se diluyó veinte veces en algunos pacientes.

Fig. 22: un A\beta Inmunograma/SDS-PAGE 2: inmunoprecipitado (mAb 1E8) de los A\beta-péptidos solubles en RIPA en AD de homogenado de cerebro de regiones diferentes del cerebro. Comparación intraindividual del cerebelo y del córtex temporal. Volumen aplicado 4 \mul. En las columnas:

a a c:	mezcla de los A\beta-péptidos sintéticos (series de dilución)
1 a 7:	cerebelo
1* a 7*:	córtex temporal, * inmunoprecipitado diluido veinte veces

Fig. 23a: un A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE, comparando una mezcla de los A\beta-péptidos sintéticos (1) con: (2) sobrenadantes de SDS/cultivos de células desnaturalizados térmicamente de células de neurogliomas H4 humanas transgénicas APP751Sw (volumen aplicado 4 \mul), (3) 10 \mul de CSF de un paciente NDC y (4) 10 \mul de CSF de un paciente AD.

Fig. 23b: un A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE comparando una mezcla de los A\beta-péptidos sintéticos (1) con los inmunoprecipitados (mAb 1E8) de los A\beta-péptidos solubles en RIPA en los homogenados de cerebro siguientes:

(2) córtex temporal en AD

(3) córtex temporal en la demencia frontotemporal

(4) córtex temporal, paciente de control sin demencia

* El inmunoprecipitado en AD se diluyó veinte veces.

Fig. 24: tres A\beta inmunogramas 2/IPG 2D-PAGE:

Superior: un fraccionamiento en dos dimensiones de los A\beta-péptidos sintéticos. El truncamiento del N terminal mediante el aspartato hace el punto isoeléctrico (Ip) una unidad de pH más básica.

Centro: inmunoprecipitación (mAb 1E8) y fraccionamiento en dos dimensiones de CSF de un paciente con AD que mostró la banda con el Rf para A\beta2-42 en el A\beta SDS-PAGE.

Inferior: inmunoprecipitación (mAb 1E8) de los A\beta-péptidos solubles en RIPA fraccionamiento en dos dimensiones del córtex temporal en AD. La banda con Rf para A\beta2-42 en el A\beta SDS-PAGE se identifica como A\beta2-42 en dos dimensiones asimismo.

Fig. 25a: un A\beta inmunograma 2/SDS-AGE de los A\beta-péptidos en el CSF de cobayos. El CSF se SDS/desnaturalizó térmicamente antes de la congelación. En las columnas:

1 a 3:	10 \mul de CSF de cobayos 1,2 y 3
a a d:	series de dilución de los A\beta-péptidos sintéticos.

Fig. 25b: un A\beta inmunograma 2/SDS-AGE de los A\beta-péptidos en el CSF de un conejo. El CSF se SDS/desnaturalizó térmicamente antes de la congelación. En las columnas:

1 a 3:	10 \mul de CSF
a:	A\beta-péptidos sintéticos

Fig. 26: un A\beta inmunograma 2/SDS-AGE de secciones de tejido hipocámpico con cultivo a corto plazo (0-8h) de un cobayo adulto. Dos secciones de tejido (espesor 500 \mum) en cada caso se reunieron, se homogeneizaron en presencia de detergentes de RIPA e inmunoprecipitado (mAb 1E8). Los sobrenadantes de cultivo relevantes (2 x 500 \mul) fueron igualmente reunidos e immunoprecipitados en presencia de RIPA (mAb 1E8). En las columnas:

0 a 8, intracelular: curso de tiempo de la concentración intracelular de los A\beta-péptidos en la sección de tejido hipocámpica inmediatamente después de obtenerse (0) hasta ocho horas (8; medición duplicada) en cultivos de corto periodo.

1 a 8, sobrenadantes: curso de tiempo de los A\beta-péptidos liberados en los sobrenadantes de los cultivos.

A\beta sint.: A\beta1-40 y A\beta1-42 sintéticos.

Fig. 27: dos A\beta inmunogramas 2/SDS-PAGE que muestran un tratamiento de una línea celular de neuroglioma H4 transgénico humano 751APPSw con diversos inhibidores de proteasa (23a) y un efecto dependiente de la dosis de inhibidor de calpain 1 (23b). Se cuantificó la liberación de los A\beta-péptidos en 4 \mul de SDS/sobrenadantes de cultivo celular desnaturalizado térmicamente en cada caso (véase fig. 23 a,b). Por comparación, se determinó la concentración de sAPP\alpha en los sobrenadantes de cultivo celular.

En una lista a: (1) es el control DMSO; (2) es el inhibidor 1 de calpain 50 \muM 1; (3) es el inhibidor 3 calpain 100 \muM; (4) es MG132 5 \muM; (5) es calpeptin 25 \muM; (a-d) es mezcla de los A\beta-péptidos sintéticos.

En la lista b: (1,1*) es control de DMSO; (2,2*) es el inhibidor 1 de calpain 12,5 \muM; (3,3*) es el inhibidor calpain 1 25 \muM; (4,4*) es el inhibidor calpain 1 50 \muM; (a-e) es mezcla de los A\beta-péptidos sintéticos; * determinación duplicada.

Fig. 28a: un A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE, que muestra un tratamiento de una línea celular de neuroglioma H4 transgénico APP751Sw con diversas concentraciones de inhibidor calpain 1 (véase fig. 23b). Se cuantificaron los A\beta-péptidos liberados en 4 \mul de SDS/sobrenadantes de cultivo celular desnaturalizados térmicamente en cada caso. Se investigó el efecto del inhibidor calpain 1 dependiente de la dosis sobre la concentración del A\beta-péptido en el sobrenadante, comparándolo con el control de DMSO.

Fig. 28b: un A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE, que muestra un tratamiento de una línea celular de neuroglioma H4 transgénico APP751 Sw con diversas concentraciones de inhibidor calpain 1 (véase fig. 23b). Se cuantificaron los A\beta-péptidos liberados en 4 \mul de SDS/sobrenadantes de cultivo celular desnaturalizados térmicamente en cada caso. Se investigó el efecto dependiente de la dosis del inhibidor calpain 1 en la proporción de una especie de A\beta-péptido como un porcentaje de la concentración total de A\beta-péptido, comparándolo con el control de DMSO.

Adicionalmente se adjuntan 21 tablas.

0 Producción del anti A\beta anticuerpo 1E8 monoclonal

El anticuerpo monoclonal mAb 1E8 se produjo bajo contrato con Schering AG por la compañía contratante "nano Tools Antiköpertechnik" en Denzlingen mediante los procedimientos estándar de la misma. Se diseñó la estrategia de inmunización y selección en consulta con Schering AG.

Breve descripción: la A\beta-proteína completa (1-42) se utilizó para inmunizar ratones Balb/c (10 \mug/inmunización). Una inmunización primaria fue seguida por 3 inmunizaciones de refuerzo. Las inmunizaciones tuvieron lugar a intervalos de 2 semanas en cada caso. A continuación el animal se sacrificó y se utilizó el bazo para la fusión celular con una línea celular de mieloma de ratón. Las células fusionadas se transfirieron a placas de cultivo tisular de 96 cuencos y se cultivaron en presencia de macrófagos alimentadores.

Para identificar los anticuerpos específicos en el N terminal, el péptido 1-16 se acopló covalentemente a placas de ELISA activadas adecuadamente y se utilizó para la selección con los sobrenadantes de células de hibridoma. Los A\beta-clones1-16-positivos a continuación se clonaron otra vez y se examinaron de nuevo. La expansión de los clones fue seguida por una crioconservación. La concentración del anticuerpo se llevó a cabo mediante cromatografía de intercambio iónico bajo condiciones no desnaturalizantes.

Para la delimitación de la especificidad del anticuerpo, se llevó a cabo un cartografiado de epitopo de péptidos lineales unidos a celulosa (síntesis macular). Para este objetivo, se sintetizó la secuencia primaria de A\beta como una serie de péptidos superpuestos en forma de máculas sobre la membrana de celulosa, y se incubó la membrana utilizando anticuerpos monoclonales en analogía al procedimiento del inmunograma obtenido con el equipo Western. La detección de los anticuerpos unidos específicamente tuvo lugar con un anticuerpo secundario.

Los análisis revelaron que el anticuerpo 1E8 que pertenece a la clase kappa IgG1 detecta un epitopo lineal con N terminal que se forma a partir de los primeros 8 aminoácidos con N terminal de la secuencia A\beta. Este anticuerpo demostró ser adecuado para la detección de A\beta nativo en el inmunograma Western, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica y ELISA en experimentos posteriores.

1 Resumen 1.1 Descripción de los procedimientos

Se describe una electroforesis de gel de poliacrilamida de laurilsulfato de sodio para el fraccionamiento de la proteína precursora \beta-amiloide (APP) y sus metabolitos, en particular los péptidos \beta-amiloides (A\beta-péptidos). La SDS-PAGE específica, denominada en lo sucesivo A\beta SDS-PAGE, utiliza un sistema regulador multifase (bicina/bistris/tris/sulfato), y el mecanismo de separación está basado en un cambio conformacional de los A\beta-péptidos inducido por urea cuando entran en el compartimiento de gel resolvente. El cambio conformacional es elevadamente específico para la secuencia primaria de aminoácido de los A\beta-péptidos respectivos y lleva a un cambio reproducible en el radio molecular efectivo. Es posible de este modo fraccionar un gran número de los A\beta-péptidos que difieren en el N y C terminales en algunos casos mediante sólo un aminoácido presente y no se pueden fraccionar mediante SDS-PAGE convencional a causa de la diferencia de masa pequeña. El cambio conformacional se induce bajo las condiciones de sistema regulador multifase mediante la adición de urea por encima de una concentración 6M. El cambio conformacional específico del A\beta-péptido se determina a un pH y fuerza iónica definidos no sólo mediante la molaridad de la urea utilizada sino asimismo mediante el tamaño de poro del gel de poliacrilamida, la concentración de detergente (SDS) y la temperatura durante la separación. La matriz de gel resolvente óptima para el fraccionamiento de un amplio intervalo de A\beta-péptidos modificados en N y C terminales (Nt, Ct) se encontró con 12%T/5%C/8M urea/0,25%SDS.

El A\beta SDS-PAGE se combinó con la focalización isoléctrica (IEF) dentro de una primera dimensión analítica utilizando vehículos anfolitos o gradientes de pH inmovilizados (IPG) para la electroforesis en dos dimensiones (A\beta 2D-PAGE y A\beta IPG 2D-PAGE). Se utilizaron A\beta SDS-PAGE y A\beta IPG 2D-PAGE para caracterizar el comportamiento de la migración electroforética de los A\beta-péptidos sintéticos A\beta_{1-33}, A\beta_{1-34}, A\beta_{1-35}, A\beta_{1-37}, A\beta_{1-38}, A\beta_{1-39}, A\beta_{1-40}, A\beta_{1-42}, A\beta_{2-40}, A\beta_{3-40}, A\beta_{3p-40}, A\beta_{2-42}, A\beta_{3-42} y A\beta_{3p-42}.

La detección tuvo lugar por medio del inmunograma obtenido con el equipo Western (membrana PVDF) y fosforescencia química aumentada (ECL) (A\beta inmunograma/SDS-PAGE, A\beta inmunograma/2D-PAGE, A\beta inmunograma/IPG 2D-PAGE). Para este objetivo, se utilizó el anticuerpo monoclonal mAb 1E8 para el que se detectó una especificidad de N terminal inusualmente elevada. Bajo las condiciones en las que se utilizó el inmunograma obtenido con el equipo Western, el mAb 1E8 reconoce en ausencia del aspartato con N terminal los A\beta-péptidos 2-x correspondientes (p.ej., A\beta_{2-40}, A\beta_{2-42}) con una sensibilidad de detección similarmente buena como los A\beta-péptidos 1-x (p.ej., A\beta_{1-40}, A\beta_{1-42}). Los A\beta-péptidos A\beta_{3-40} o A\beta_{3-42} sintéticos, en los que el aminoácido alanina está adicionalmente ausente en el N terminal, y sus derivados de piroglutamato por contraste, ya no se detectan en concentraciones fisiológicas relevantes. Fue posible mejorar la sensibilidad de detección en el inmunograma obtenido con el equipo Western selectivamente para el mAb 1E8 utilizando, en lugar de polvo de leche que de lo contrario se utiliza principalmente (inmunograma 1), un reactivo sintético para bloquear los sitios de unión no específicos (inmunograma 2). Un anticuerpo monoclonal específico con N terminal disponible comercialmente (6E10), que de lo contrario se utiliza frecuentemente para detectar los A\beta-péptidos mediante el inmunograma obtenido con el equipo Western, no es compatible con el inmunograma 2. Fue posible mediante la combinación de A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE con la detección de los metabolitos APP por medio de una cámara CCD elevadamente sensible construir un inmunograma cuantitativo obtenido con el equipo Western con una sensibilidad de detección de 1 pg para A\beta_{1-40} y 2 pg para A\beta_{1-42}. Es posible conseguir coeficientes de variación intra- e interanalíticos menores del 10% para 20 pg del A\beta-péptido para la A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE con detección CCD. La sensibilidad de detección para el A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE con película de detección es 0,3 pg para A\beta_{1-40} y 0,6 pg para A\beta_{1-42}. No se han descrito hasta la fecha otros procedimientos de inmunogramas obtenidos con el equipo Western con una sensibilidad de detección igualmente buena ni coeficientes de variación para detectar los A\beta-péptidos. La sensibilidad de detección mencionada anteriormente es una condición previa para el diagnóstico neuroquímico de la demencia en el CSF si los A\beta-péptidos se van a cuantificar directamente después de la SDS/desnaturalización térmica por el inmunograma obtenido con el equipo Western y cámara CCD, es decir, sin concentración selectiva previa por inmunoprecipitación. Fue posible demostrar adicionalmente que la eficacia de la separación de A\beta inmunograma/SDS-PAGE para el diagnóstico neuroquímico de la demencia adicionalmente se puede aumentar considerablemente por este tratamiento previo de la muestra precisamente cuando la SDS/desnaturalización térmica tiene lugar antes de que las muestras CSF se congelen.

1.2 A\beta Inmunograma/SDS-PAGE y diagnóstico neuroquímico de la demencia

El A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE (ver anteriormente) consigue por primera vez la cuantificación directa de sAPP\alpha y de los A\beta-péptidos por medio de una cámara CCD en sólo 10 \mul de muestras de CSF humanos o animales (cobayo, conejo). Fue posible con este procedimiento demostrar por primera vez que, además de A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42}, aparecen de una manera elevadamente conservada en CSF humano y animal otros tres A\beta-péptidos con el carboxi terminal (C-terminal) truncado (A\beta_{1-37}, A\beta_{1-38}, A\beta_{1-39}). Además el segundo A\beta-péptido más corriente después de A\beta_{1-40} en CSF humano no es como se ha asumido anteriormente A\beta_{1-42} sino A\beta_{1-38}. Fue posible mostrar que los tres A\beta-péptidos adicionales con truncado de C terminal se detectan asimismo en plasma humano, pero en una concentración considerablemente inferior y en un modo diferente de distribución allí. En particular, la proporción A\beta_{1-42}/A\beta_{1-38} parece diferir en la manera de un específico CNS.

En algunos pacientes con AD el A\beta-péptido 2-42 truncado en N terminal se detecta adicionalmente en el CSF, que es por lo común aumentado extensamente en los homogenados de cerebro de los pacientes con AD.

Fue posible demostrar que por primera vez, en contraste con las concentraciones absolutas de los A\beta-péptidos en el CSF, las proporciones A\beta1-n% de los A\beta-péptidos A\beta1-n, con n = 37, 38, 39, 40 ó 42, como un porcentaje de su cantidad total de A\beta1-x, identificar pacientes con AD y enfermedades CNS inflamatorias crónicas (CID) con una sensibilidad y especificidad elevadas. En contraste a las concentraciones absolutas, las proporciones relativas de los A\beta-péptidos se correlacionan asimismo significativamente con la gravedad de la demencia. Fue posible adicionalmente mostrar asociaciones específicas entre ciertos porcentajes de proporciones de A\beta-péptido para pacientes con AD. Esto se aplica asimismo a ciertas proporciones del A\beta-péptido y se pueden utilizar las correlaciones correspondientes para diagnósticos neuroquímicos de demencia mejorados. En particular la asociación entre A\beta_{1-38}% y A\beta_{1-42}%, o la correlación entre las proporciones de A\beta-péptido A\beta_{1-38}/A\beta_{ 1-40} y A\beta_{1-42}/A\beta_{1-38}, muestra una correlación comparativamente elevada en AD y es muy prometedora en el diagnóstico. La diferencia sorprendentemente marcada entre las concentraciones absolutas y proporcionadas de las especies de A\beta-péptido en relación a su adecuación para el diagnóstico neuroquímico de la demencia está causada probablemente por la aparición de cambios específicos de la enfermedad en la actividad de la \gamma-secretasa y éstos se describen mejor por el cambio en las proporciones relativas de A\beta-péptido.

Para preparar muestras para A\beta inmunograma/SDS-PAGE, los A\beta-péptidos y otros metabolitos APP experimentan SDS/desnaturalización térmica. Una posibilidad alternativa es llevar a cabo una inmunoprecipitación (IP) de antemano para la concentración selectiva de los A\beta-péptidos. Los resultados muestran que se pueden medir las proporciones diferentes de los A\beta-péptidos que aparecen en los fluidos biológicos dependiendo de la preparación de la muestra. Es posible en este contexto distinguir una proporción que se puede asociar con detergente (SDS) de una fracción del A\beta-péptido que es accesible directamente a anticuerpos en procedimientos de inmunoprecipitación o ELISA, es decir, sin tratamiento simultáneo con detergentes. Esta diferenciación se explica probablemente por la afinidad de unión elevada de los A\beta-péptidos a otras proteínas o A\beta-autoagregados. La proporción que se puede disociar con SDS es además claramente más elevada que la fracción que se puede disociar con los anticuerpos. Este fenómeno es particularmente pronunciado de forma específica para A\beta_{1-42}.

Una reducción causada por la crioprecipitación (CP) a través de la congelación de las muestras CSF se detecta para A\beta_{1-42} - a diferencia de A\beta_{1-40}. La reducción causada por CP es probablemente aportada principalmente por la fracción unida al agregado de A\beta_{1-42} y, en una proporción considerable de pacientes sin enfermedad de Alzheimer (NDC), lleva a una reducción típica en AD en el nivel de A\beta_{1-42} en el CSF. Este efecto se marca particularmente en pacientes con por lo menos un alelo ApoE \varepsilon4 y probablemente explica porque comparativamente se miden bajas concentraciones de A\beta_{1-42} en CSF previamente congelado incluso para pacientes sin AD pero con alelo \varepsilon4.

Es posible evitar eficazmente la reducción causada por CP en A\beta_{1-42} en pacientes sin AD mediante una "protectora" SDS/desnaturalización térmica antes de la congelación de la muestra. En contraste, pacientes con AD muestran bajas concentraciones de A\beta_{1-42} en CSF incluso si la muestra de CSF se trata previamente con SDS/desnaturalización térmica antes de la congelación. Esto significa que la eficacia del diagnóstico de separación del A\beta inmunograma/SDS-PAGE para el diagnóstico neuroquímico de la demencia se mejora mucho considerablemente por la SDS/desnaturalización térmica de las muestras de CSF antes del procedimiento de congelación. El A\beta inmunograma/SDS-PAGE junto con la preparación de la muestra mencionada anteriormente es asimismo muy prometedora para los diagnósticos preclínicos y tempranos de AD porque se espera que marginalmente niveles bajos de A\beta_{1-42} CSF indiquen AD incipiente en particular cuando no se pueden explicar por una reducción en función de CP. Alternativamente, se debería comprobar mediante estudios prospectivos sobre pacientes con desórdenes cognitivos medios si una reducción dependiente de CP pronunciada de A\beta_{1-42} no tiene por si misma valor predictivo para el desarrollo posterior de AD.

La reducción dependiente de CP en A\beta_{1-42} en el CSF en AD se puede explicar por las teorías siguientes:

1.

el CSF de los pacientes con AD contiene menos A\beta_{1-42} selectivamente mientras la concentración total de A\beta-péptido no cambia

2.

la reducción relacionada con CP en A\beta_{1-42} no se puede evitar a pesar de SDS/desnaturalización térmica

3.

A\beta_{1-42} no se reduce en el CSF en AD sino sólo se mide hasta una extensión disminuida debido a la SDS-estable que une agregados a las proteínas vehículo o A\beta-péptido.

En el último caso (3), la fracción de A\beta_{1-42} escaparía asimismo del catabolismo enzimático y de este modo sería fisiológicamente relevante y potencialmente un objetivo molecular para proyectos para encontrar ingredientes activos. En este contexto no es absolutamente necesario para la composición de la estructura primaria molecular de A\beta_{1-42}-proteínas de unión dentro del complejo que se cambien; al contrario, la afinidad de la unión podría variar dependiendo de la conformación de A\beta_{1-42}, mientras la estructura primaria es la misma.

El descubrimiento que una diferencia específica llega a ser detectable en la fracción que se puede disociar por detergente de A\beta_{1-42} en el CSF de pacientes con y sin AD se puede asimismo utilizar para otros procedimientos de diagnóstico de demencia neuroquímico (ELISA, espectroscopia de correlación de fluorescencia).

Particularmente prometedora es la utilización del triplete ELISA A\beta_{1-38}, A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42} con cálculo de las proporciones de A\beta-péptido (38/40, 42/38, 42/40) y determinación de la reducción dependiente de CP en los A\beta-péptidos a través del tratamiento previo de muestra diferencial.

1.3 A\beta inmunograma/SDS-PAGE y diagnóstico neuropatológico

El A\beta inmunograma/SDS-PAGE se puede utilizar para diagnóstico neuropatológico post-mortem de enfermedades de demencia. En el análisis de la fracción de los A\beta-péptidos soluble en el detergente (RIPA) de homogenados de cerebro de pacientes con AD, es posible que otros controles y enfermedades de demencia muestren patrones de expresión de enfermedades y regiones de cerebro específicas de los A\beta-péptidos 1-37, 1-38, 1-40, 1-42 y 2-42. Particularmente vale la pena observar el incremento masivo en A\beta_{2-42} en la fracción soluble en RIPA de los homogenados de cerebro en AD y en pacientes con demencia corporal de Lewy (LBD). Estas concentraciones elevadas de A\beta_{2-42} se observan en LBD cuando los pacientes muestran simultáneamente una patología \beta-amiloide pronunciada (LBD, CERAD C). A\beta_{1-42} aumenta asimismo regular y claramente en AD y en LBD (CERAD C). La concentración de los otros A\beta-péptidos mostró una gran variación interindividual. Esto podría ser la evidencia de subtipos fenotípicos de AD esporádica o indicar la gravedad de la demencia como una función de la progresión.

La mezcla de detergente RIPA utilizada en la presente memoria no es capaz de solubilizar placas \beta-amiloides neuríticas maduras. El gran incremento en las concentraciones de A\beta_{2-42} por lo tanto no se puede explicar por A\beta_{2-42} de esta fracción de placa \beta-amiloide. En la misma medida, es asimismo improbable que A\beta_{2-42} se produzca principalmente mediante modificaciones post-translacionales asociadas a la placa \beta-amiloide no específicas. Las elevadas concentraciones intracerebrales de \beta_{1-42} son relevantes patofisiológicamente porque la ausencia de aspartato incrementa la tendencia de A\beta_{1-42} a agregarse y esta modificación de N terminal precede aparentemente a la formación de placas \beta-amiloides maduras.

1.4 Cuantificación de metabolitos APP mediante A\beta inmunograma/SDS-PAGE en cultivos de células y en modelos de animales

Los A\beta-péptidos 1-37, 1-38 y 1-39 truncados en el carbono terminal fueron detectados frecuentemente en el fluido cisternal de cobayos y conejos. La detección fue asimismo posible en homogeneizados y sobrenadantes (cultivo a corto plazo) de las secciones de tejido del hipocampo de un cobayo adulto.

Ha sido posible asimismo establecer un cultivo primario de pollo (telencefálico) neuronal nuevo y mostrar que el quinteto de A\beta-péptido se libera en los sobrenadantes aquí también con una distribución relativa comparable a la de CSF humano.

El quinteto de A\beta-péptido - y adicionalmente A\beta_{2-42} - se puede asimismo detector en los sobrenadantes de
una línea celular tumoral de neuroglioma (H4) que sobreexpresa APP751humano con la mutación doble sueca (_{humana}APP751_{Sw}). Después del tratamiento de las células con inhibidores de proteasa que son inhibidores potenciales de \beta/\gamma secretasas, fue posible detectar no sólo la reducción dependiente de dosis de A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42} sino asimismo una reducción en los A\beta-péptidos 1-37, 1-38, y 1-39 truncados en el C terminal. Además, se inhibió la formación de A\beta_{2-42}. Fue de interés en este contexto que la producción de A\beta-péptidos truncados en el C terminal fue inhibida
- particularmente de forma clara para A\beta_{1-37} - con diferentes cinéticas y comparada anteriormente con A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42}. Este efecto se volvió particularmente claro en el examen de las proporciones de las especies individuales de A\beta-péptido en la concentración total de las mismas. Una analogía interesante surge en la presente memoria con los cambios específicos de la enfermedad, discutidos anteriormente, en los A\beta-péptidos en el CSF, que fueron asimismo medibles considerablemente de forma más sensitiva vía las proporciones en porcentaje de los péptidos en el CSF. En consecuencia se puede asumir que una heterogeneidad de la actividad de la \gamma-secretasa se puede reflejar mediante cambios en la composición relativa del quinteto de A\beta-péptido. Esto es relevante para proyectos para encontrar ingredientes activos para identificar inhibidores \gamma-secretasa específicos en isoforma.

En el tratamiento del cultivo celular de neuroglioma H4 transgénico con inhibidor calpain 1 fue posible demostrar (paradójicamente) el aumento inicial descrito anteriormente en la concentración de A\beta_{1-42} a una baja concentración del inhibidor de proteasa. Es de interés en este contexto que el aumento en A\beta_{1-42} no se correlacionó con un aumento de la concentración de A\beta_{2-42}. Este descubrimiento está en contra de que exista la producción secundaria de A\beta_{2-42} a partir de A\beta_{1-42} y a favor de la teoría que A\beta_{2-42} se produzca por un corte combinado en la \beta/\gamma-secretasa. La cuestión que se presenta en este contexto con el aumento notable y regularmente de la concentración de A\beta_{2-42} en los homogenados de cerebro en AD y la detección de A\beta_{2-42} en muestras de CSF de pacientes con AD es si una particular isoforma de \beta-secretasa (BACE) se sobreexpresa en AD o se cataboliza menos en AD la producida fisiológicamente A\beta_{2-42}.

2. Antecedentes

La base molecular de AD, su relación a los planteamientos recientes médicos a la enfermedad de demencia y los procedimientos de diagnóstico neuroquímico de la demencia se resumen en dos artículos de revista (Witfang et al., 1998 and 2000).

Otro procedimiento de inmunograma/SDS-PAGE se ha descrito anteriormente para analizar A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42}/1-43 en CSF lumbar humano (Ida et al., 1996). Sin embargo, la diferenciación de los A\beta-péptidos en este caso no es posible por separación electroforética pero tiene lugar en la membrana de transferencia a través de anticuerpos monoclonales selectivos en C terminal. Al mismo tiempo, A\beta_{1-42} se debe concentrar antes de la separación mediante concentración de la muestra. La concentración tiene lugar sin desnaturalización SDS previa, lo que parece hacer el procedimiento problemático debido a la gran tendencia de A\beta_{1-42} a agregarse. La electroforesis separada se debe llevar a cabo para determinar A\beta_{1-40} y 1-42 en este procedimiento.

El sistema regulador multifase utilizado para el A\beta inmunograma/SDS-PAGE (Wiltfang et al., 1991), combina las ventajas de sistemas reguladores específicos para proteína (Laemmli, 1970) y péptidos (Schagger and von Jagow, 1987). Es en consecuencia posible fraccionar con el procedimiento SDS-PAGE con resolución elevada tanto proteínas como péptidos en un sistema de gel resolvente de poliacrilamida homogénea. Además, se ha descrito la separación electroforética de A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42} (Klafki et al., 1996) utilizando la versión de la urea (Wiltfang et al., 1991) del último procedimiento SDS-PAGE. La aplicación de este procedimiento a modelos de cultivo celular de familiares de AD que se han tratado previamente con inhibidores de enzima de escisión de APP (\gamma-secretasa) mostró a través de la detección de los A\beta-péptidos 1-40 y 1-42 radiomarcados in vivo que están implicadas diferentes \gamma-secretasas en la producción enzimática de A\beta_{1-42} (Klafki et al., 1996). Fue posible con una modificación de este sistema conseguir asimismo la separación entre A\beta_{1-42} y A\beta_{1-43} (Wiltfang et al., 1997). La sensibilidad de detección inmunológica máxima del último procedimiento fue 50 pg de A\beta_{1-42}, que está lejos de ser adecuado para las aplicaciones mostradas en la presente memoria. Al mismo tiempo, se ha optimizado la matriz de gel resolvente en el procedimiento presentado en la presente memoria para fraccionar los A\beta-péptidos modificados terminalmente en el N-terminal y en el C-terminal.

La SDS-PAGE se puede combinar como segunda dimensión analítica con focalización isoeléctrica (IEF) en la primera dimensión como 2D-PAGE (O'Farrell, 1975; O'Farrell et al., 1977). Esto consigue un fraccionamiento en dos dimensiones de polipéptidos y proteínas según el punto isoléctrico y radio molecular efectivo. La focalización isoeléctrica es capaz de revelar diferencias mínimas en gradientes de pH inmovilizados altamente ampliados (Gorg et al., 1995; Gorg et al., 1997; Righetti and Bossi, 1997). El A\beta inmunograma/SDS-PAGE en dos dimensiones se puede por lo tanto asimismo utilizar para análisis de resolución elevada de modificaciones post-translacionales de los metabolitos APP. Es posible al mismo tiempo conseguir una sensibilidad de detección en la región femtogramo superior. Las modificaciones post-translacionales pueden influenciar de una manera específica el comportamiento de agregación de los A\beta-péptidos y son de este modo de relevancia patofisiológica y de diagnóstico (Thome et al., 1996; Thome J., 1996; Kuo et al., 1997; Russo et al., 1997; Tamaoka et al., 1997). De relevancia para el diagnóstico de demencia neuroquímico está el hecho que existe un incremento selectivo en la proporción de A\beta_{X-42/43} a A\beta_{1-42/43} modificados en el N-terminal, pero no en la proporción de A\beta_{X-40} a A\beta_{1-40} modificados en el N terminal. (Tamaoka et al., 1997). Además de determinar los A\beta-péptidos, el A\beta inmunograma/SDS-PAGE permite asimismo la cuantificación de sAPP\alpha, que se mide baja en el CSF en AD (Sennvik et al., 2000). Para determinar sAPP\alpha, el compartimiento de gel resolvente que contiene urea se combina con un gel resolvente (catódico) superior sin urea y con un tamaño de por mayor.

El A\beta inmunograma/SDS-PAGE cuantitativo permite una determinación simultánea y ultrasensible de un intervalo de los metabolitos de APP que poseen una gran relevancia para el diagnóstico temprano neuroquímico y patogénesis de AD. El procedimiento se puede asimismo utilizar en experimentación animal y evaluación clínica de nuevos principios activos que intervienen en el metabolismo o catabolismo de los A\beta-péptidos.

3. Materiales y procedimientos 3.1 A\beta SDS-PAGE 3.1.1 Material y reactivos

Bio-RAD (Richmond, CA, Estados Unidos): sistema de electroforesis Mini Protean II, acrilamida (nº de ref: 161-0101), N,N'-metilenbisacrilamida (nº de ref: 161-0201); Merck (Darmstadt, Alemania): peroxodisulfato de amonio (AMPS, nº de ref: 1201.1000), azul de bromofenol (nº de ref: 8122), 0,5 M H_{2}SO_{4} (nº de ref: 1.09072.1000), pastillas de hidróxido de sodio de calidad analítica (NaOH, nº de ref: 6498), carbón activado de calidad analítica (nº de ref: 1.02186.0250), sacarosa (nº de ref: 1.07654.1000).

Paesel+Lorei (Hanau, Alemania): Tris ultra puro (nº de ref: 100840).

Biomol (Hamburg, Alemania): laurilsulfato de sodio, ultra puro, 2x crist. (SDS, nº de ref: 51430), bis(2-hidroxietil)iminotris(hidroximetil)metano (Bis-Tris, nº de ref: 50003), N,N'-bis(2-hidroxietil)glicina de calidad analítica (bicina, nº de ref: 01848); GibcoBRL/Life Technologies (Karlsruhe, Alemania): urea (nº de ref: 15716-012);

Serva (Heidelberg, Alemania): N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TEMED, nº de ref: 35925); Sigma (Steinheim, Alemania): 2-mercaptoetanol (nº de ref: M-7154);

Bachem (Bubendorf, Suiza): A\beta_{1-38}, A\beta_{1-40}, A\beta_{1-42}

Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie (Berlín, Alemania): A\beta_{1-33}, A\beta_{1-34}, A\beta_{1-35}, A\beta_{1-37}, A\beta_{1-39}, A\beta_{2-40}, A\beta_{2-42}, A\beta_{3-40}, A\beta_{3-42}, A\beta_{3p-40}, A\beta_{3-42}.

Amersham Pharmacia Biotech AB (Buckinghamshire, Inglaterra) y Serva (Heidelberg, Alemania): se compraron inhibidor de tripsina de pulmón bovino (M_{r} 6500), melitina (M_{r} 2847) y met-lis-bradyquinina (M_{r} 1320) de Serva y se añadieron a un equipo marcador de bajo peso molecular (LMW) de Amersham Pharmacia. El equipo LMW se compone de: fosforilasa b (M_{r} 94000), albúmina de suero bovino (M_{r} 67000), ovoalbúmina (M_{r} 43000), anhidrasa carbónica (M_{r} 30000), inhibidor de tripsina, soja (M_{r} 20100) y \alpha-lactalbúmina (M_{r} 14400).

3.1.2 Composición de gel y electroforesis

Se llevó a cabo la SDS-PAGE utilizando el sistema de electroforesis mini protean II de Bio-Rad. El tamaño del compartimiento de gel se utilizó como sigue: longitud de gel resolvente aproximadamente 54 mm; longitud de apilado del gel aproximadamente 5 mm (correspondiente a un volumen de 250 \mul); altura de gel peine aproximadamente 12-15 mm; espesor de gel 0,50 mm en cada caso, anchura de gel 85 mm en cada caso. Los geles resolventes y apilados para la segunda dimensión analítica en la A\beta 2D-PAGE poseen un espesor de gel de 1,0 mm.

Para una carga de muestra, se utiliza una columna de carga de muestra de 15-dientes (anchura de los dientes aproximadamente 3 mm, distancia entre dientes 2 mm). El cuenco de carga de muestra que resulta en el gel peine mide aproximadamente 3x10 mm. La cantidad máx. de muestra cargada no debería exceder 10 \mul para ser cierto que se previniese el arrastre entre los cuencos de muestra. Las muestras se introducen como una capa subyacente después de la introducción del regulador del cátodo. Electroforesis: a) 12 mA/0,5 mm de espesor de gel con fuerza actual constante durante 2 h, b) geles de 1,0 mm de la segunda dimensión analítica: 60 volt/1,0 mm de espesor de gel durante 10 min, 120 volt/1,0 mm de espesor de gel durante 1 h y 45 min.

La versión de urea del procedimiento bicina/tris SDS-PAGE de Wiltfang et al. (Wiltfang et al., 1991) se utilizó para el compartimiento de gel resolvente y se modificó en aspectos esenciales para las aplicaciones presentadas. La Tabla 1 resume los reguladores concentrados para el compartimiento de gel, regulador del cátodo, regulador del ánodo y la solución madre de acrilamida. La composición del gel para la A\beta SDS-PAGE para la separación optimizada de metabolitos de APP y los A\beta-péptidos en muestras biológicas humanas o animales se encuentra en la tabla 2.

3.1.3 Preparación de la muestra para A\beta SDS-PAGE 3.1.3.1 Recogida de las muestras de CSF

Se concentraron alícuotas de 300 \mul de SDS-SB-3 sin 2-mercaptoetanol (tabla 3) a sustancia seca en recipientes de muestra de 1,5 ml Eppendorf ("cierre seguro") utilizando un Speed-Vac y se guardaron a temperatura ambiente hasta su utilización. Las muestras de CSF se dividen en alícuotas y se procesan diferentemente utilizando el SDS-SB-3 que se introduce en los recipientes Eppendorf como sustancia seca:

(a) CSF congelado sin tratar

Se congelan sin tratar 330 \mul de CSF centrifugado y se guardan en recipientes de 1,5 ml Eppendorf a -80ºC. Después de la descongelación y un paso de ciclón, el SDS-SB-3 introducido se diluye con 300 \mul de CSF y 2,5% v/v de 2-mercaptoetanol y, después de un paso de ciclón, se calentó a 95ºC durante 5 min. A continuación tiene lugar la A\beta SDSPAGE.

(b) Tratamiento previo mediante SDS/desnaturalización térmica

El SDS-SB-3 que se introduce como una sustancia seca se diluye con 300 \mul de CSF centrifugado y, después de un paso de ciclón, se calentó a 95ºC durante 5 min (sin adición de 2-mercaptoetanol). El CSF SDS/desnaturalizado térmicamente se guardó a continuación a -80ºC. La A\beta SDS-PAGE está precedida por la adición de 2,5% v/v de 2-mercaptoetanol a la muestra y calentamiento a 95ºC durante 5 min.

(c) Concentración de muestras de CSF para la determinación de los A\beta-péptidos

Después de la SDS/desnaturalización térmica, pero antes de la adición de 2-mercaptoetanol, la muestra de CSF, u otras muestras biológicas más, se pueden concentrar a sustancia seca utilizando un SpeedVac y diluyendo con 100 \mul de H_{2}O_{dd} y 2,5% v/v de 2-mercaptoetanol (3 veces concentrado). A\beta SDS-PAGE se precede otra vez por un calentamiento a 95ºC durante 5 min.

La SDS/desnaturalización térmica antes de la concentración de la muestras se pretende que evite la proteólisis, precipitación y autoagregación de los A\beta-péptidos durante la concentración.

La concentración de SDS reducida en SDS-SB-3 es necesaria porque concentraciones de SDS más elevadas llevan a, después de una concentración de tres veces de las muestras con un volumen de carga de aproximadamente 10 \mul, un comportamiento de migración deteriorado de los A\beta-péptidos en el extremo anódico del gel resolvente que contiene urea. Sin embargo, al mismo tiempo, la concentración de SDS de 0,5% p/v en SDS-SB-3 es todavía suficientemente elevada para completar la SDS/desnaturalización térmica de la muestra.

3.1.3.2 Recogida de otras muestras biológicas

Si las muestras están en forma líquida (p.ej., sobrenadantes de cultivos de células, homogenados de células) y si la concentración de A\beta-péptido es suficientemente elevada es posible redisolver una unidad de volumen de muestra con una unidad de volumen de SDS-SB-2 doble concentrado (tabla 3).

3.1.3.3 Recogida de muestras después de la inmunoprecipitación (IP)

Los metabolitos APP que se han inmovilizado utilizando DynaBeads magnéticos (véase a continuación) se eluyen de la unión de antígeno después de la etapa de lavado final a 37ºC durante 10 min en un baño de ultrasonidos utilizando SDS-SB-1 o SDS-PB-3 (sin 2-mercaptoetanol en cada caso). La adición de 2-mercaptoetanol a 2,5% p/v está seguida por un calentamiento a 95ºC durante 5 min. Cuando se utiliza SDS-PB-3, las muestras se pueden concentrar posteriormente tres veces otra vez mediante concentración a sustancia seca y redisolver con H_{2}O_{dd} utilizando un SpeedVac.

3.2 A\beta 2D-PAGE convencional (anfolito vehículo IEF)

El anfolito vehículo IEF en geles cilíndricos de la primera dimensión analítica y de la A\beta SDS-PAGE vertical de la segunda dimensión se lleva a cabo utilizando el sistema celular 2-D mini-protean II 2-D de Bio-Rad.

3.2.1 Materiales y reactivos para el anfolito vehículo IEF

Bio-RAD (Richmond, CA, Estados Unidos): sistema celular 2-D mini-Protean II, tubos de vidrio (\diameter 1 mm), agarosa (162-0017); Merck (Darmstadt, Alemania): CHAPS (nº de ref: 1.11662.0010), pastillas de hidróxido de sodio de calidad analítica (NaOH, nº de ref: 6498), azul de bromofenol (nº de ref: 8122), ácido fosfórico 85% (H_{3}PO_{4}, nº de ref: 1.00573.1000); Serva (Heidelberg, Alemania): Servalyt® pH 5-6 (nº de ref: 42924) pH 4-7 (nº de ref:. 42948) pH 3-10 (nº de ref: 42951); Fluka (Buchs, Suiza): Igepal CA 630 (NP 40, nº de ref: 56741).

GibcoBRL/Life Technologies (Karlsruhe, Alemania): urea (nº de ref: 15716-012);

Sigma (Steinheim, Alemania): 2-mercaptoetanol (nº de ref: M-7154).

Biomol (Hamburg, Alemania): laurilsulfato de sodio, ultra puro, 2x crist. (SDS, nº de ref: 51430), bis(2-hidroxietil)iminotris(hidroximetil)metano (bis-tris, nº de ref: 50003), N,N'-bis(2-hidroxietil)glicina de calidad analítica (bicina, nº de ref: 01848).

3.2.2 Recogida de muestras para el anfolito vehículo IEF

Las muestras se recogieron en IEF-SB (tabla 4a). La sustancia seca y los DynaBeads magnéticamente inmovilizados por medio de MSP (véase a continuación) se recogen directamente con IEF-SB inmediatamente antes de IEF y se incubaron en un baño de ultrasonidos a 37ºC durante 10 min. Para la recogida de las muestras de CSF, se recogieron una unidad de volumen de CSF con una unidad de volumen de IEF-SB y se incubaron en un baño de ultrasonidos a 37ºC durante 10 min.

3.2.3 Primera dimensión analítica: anfolito vehículo IEF en geles cilíndricos

Se cargaron tubos de vidrio (\diameter 1 mm) con la solución de monómero de la tabla 4b para la polimerización de gel. Los geles cilíndricos de IEF se polimerizaron hasta una longitud de 60 mm. Se cargan y se cubren con una capa del electrolito catódico 20 \mul de muestra después de la recogida directa en IEF-SB (10 \mul de CSF más 10 \mul de IEF-SB) o 10 \mul del eluato de la inmunoprocipitación en IEF-SB (tabla 4a). Este lado de los tubos de vidrio se conecta a la cámara del electrolito catódico superior. La composición del anolito y del catolito para el anfolito vehículo IEF se encuentra en la tabla 4c.

Se lleva a cabo a continuación la focalización a temperatura ambiente como sigue: 100V x 1h, 200Vx11h, 500Vx2h, 1000Vx1h (\Sigma 4300 Vxh).

Después de IEF, los geles cilíndricos se expulsan de los tubos de vidrio bajo presión de agua y se incuban en el regulador equilibrador de IEF (tabla 4d) a temperatura ambiente durante 5 min. Los geles IEF se colocan a continuación sobre el apilado del gel (véase anteriormente) del A\beta SDS-PAGE y se fijan en su posición utilizando la solución de agarosa IEF (tabla 4d). Un cuenco de muestra para cargar A\beta-péptidos sintéticos o proteínas marcadoras M_{r} para la comparación se moldean en agarosa caliente utilizando un diente de teflón.

3.2.4 Segunda dimensión analítica: A\beta SDS-PAGE

La A\beta SDS-PAGE tuvo lugar como se ha indicado en las tablas 1 y 2 (gel resolvente: 12%T/5%C/8M urea). No se polimeriza un gel peine. El espesor del gel de los geles resolventes utilizados es 1 mm. La electroforesis tiene lugar a temperatura ambiente: 10 min/60 V, 90 min/120 V.

3.3 A\beta IPG 2D-PAGE 3.3.1 Material y reactivos

GibcoBRL/Life Technologies (Karlsruhe, Alemania): urea (nº de ref: 15716-012).

Merck (Darmstadt, Alemania): CHAPS (nº de ref: 1.11662.0010), azul de bromofenol (nº de ref: 8122), glicerol (100%) (nº de ref: 1.04092.1000).

Biomol (Hamburg, Alemania): laurilsulfato de sodio, ultra puro, 2x crist. (SDS, nº de ref: 51430); Serva (Heidelberg, Alemania): Serdolit MB-1 (nº de ref: 40701), dithiotreitol (DTT, nº de ref: 20710).

Amersham Pharmacia Biotech AB (AB (Buckinghamshire, Inglaterra): Pharmalyte pH 3-10 (nº de ref: 17-0456-01), pharmalyte pH 4-6.5 (nº de ref: 17-0452-01), Immobiline Dry Strip 70 x 3 x 0,5 mm, pH 4-7 L (nº de ref: 17-6001-10);

Sigma (Steinheim, Alemania): yodoacetamida (nº de ref: 1-6125).

BioRAD (Richmond, CA, Estados Unidos): agarosa (162-0017).

3.3.2 Recogida de muestras

Las muestras se recogen en IPG-SB (tabla 5a). La sustancia seca y los DynaBeads inmovilizados magnéticamente por medio de MSP (véase a continuación) se recogen directamente con IPG-SB inmediatamente antes de IEF y se incuban en un baño de ultrasonidos a 37ºC durante 10 min. Recogida de muestras biológicas líquidas: después de la eliminación del intercambiador de iones de lecho mixto (Serdolit MB-1), el IPB-SB se divide en alícuotas (p.ej., 100 \mul) en recipientes de muestra Eppendorf y se concentró a sustancia seca a temperatura ambiente utilizando un SpeedVac. El IPG-SB introducido como sustancia seca se recoge con la muestra con la proporción 1:1 en volumen (p.ej., 100 \mul) y, después de un paso de ciclón (1 min.), se incubó en un baño de ultrasonidos a 37ºC durante 10 min.

3.3.3 IPG-IEF

El IEF que utiliza comercialmente IPG "DryStrips" tuvo lugar según el protocolo de fabricante (Amersham Pharmacia Biotech/breves instrucciones 71-5009-57, edición AA, 99-04). Los IPG "DryStrips" (4-7, gradiente de pH lineal, longitud 7 cm) se rehidrogenaron hasta un espesor de gel de 0,5 mm utilizando la solución de rehidrogenación de la tabla 5a a temperatura ambiente durante toda la noche. El dispositivo de carga de muestra ("sample cups") se coloca en el lado básico de las tiras IPG, a aproximadamente pH 6,5 (carga catódica) y se cargan 30 \mul de muestra. El IPG-IEF tiene lugar durante 30 min/300V, 30 min/800V, 30 min/1400V y 5 h/2000V (\Sigma 12500 Vxh).

3.3.4 Segunda dimensión analítica: A\beta SDS-PAGE

El IPG-IEF es seguido por una equilibración de las "DryStrips" durante 2x10 min. (tabla 5b). La solución de la primera equilibración contiene DTT (50 mg/5 ml), la segunda solución yodoacetamida (240 mg/5 ml) para la neutralización en exceso de DTT, que sino lleva a artefactos de tintura cuando se tiñen los geles de plata. La segunda etapa de equilibración no es necesaria para el inmunograma obtenido con el equipo Western. Los IPG "DryStrips" equilibrados se fijan sobre la superficie del apilado de gel de la A\beta SDS-PAGE utilizando la solución de agarosa (tabla 5c). Un cuenco de muestra para la carga de los A\beta-péptidos sintéticos o proteínas marcadoras M_{r} para la comparación se realiza en agarosa caliente utilizando un diente de teflón. La electroforesis tiene lugar según 3.1.2.

3.4 Inmunoprecipitación 3.4.1 Material y reactivos, anticuerpos

Biochrom KG (Berlin, Alemania): HEPES (nº de ref.: L1603), PBS Dulbecco, sin Ca^{++}, sin Mg^{++} (nº de ref.: L182-50); Merck (Darmstadt, Alemania): pastillas de hidróxido de sodio de calidad analítica (NaOH, nº de ref.: 6498); cloruro de sodio (NaCl, nº de ref.: 1.01540.0500);

Fluka (Buchs, Suiza): Igepal CA 630 (NP 40, nº de ref.: 56741), desoxicolato de sodio (Na-DOC, nº de ref.: 30968); Biomol (Hamburg, Alemania): laurilsulfato de sodio ultra puro, 2x crist. (SDS, nº de ref.: 51430);

Boehringer (Mannheim, Alemania): tabletas de cóctel de inhibidor de la proteinasa, completas™ Mini (nº de ref.: 1836153);

Deutsche Dynal GmbH (Hamburg, Alemania): DynaBeads® M280 IgG anti-ratón para corderos (nº de ref.: 112.02);

Biometra (Göttingen, Alemania): puesto de separación magnética (MPS); Sigma (Steinheim, Alemania): albúmina bovina (BSA, nº de ref.: A-4378), 2-mercaptoetanol (nº de ref.: M-7154), azida de sodio (azida Na, nº de ref.: A-2002);

Paesel+Lorei (Hanau, Alemania): tris ultra puro (nº de ref.: 100840); Schering AG (Berlin, Alemania): mAb 1E8 (IgG1 ratón); Senetek PLC Drug Delivery Technologies, Inc. (St. Louis, Mo, Estados Unidos): mAb 6E10, IgG1 de ratón purificado (nº de ref.: 320-02).

3.4.2 Preparación de DynaBeads M-280 (IgG anti-ratón para cordero)

Se agitan completamente 250 \mul de suspensión (6,7 x 10^{8} micropartículas/ml) sin formar una espuma y se lavan con 1 ml de PBS/BSA (0,15 M NaCl en 0,01 M de fosfato de Na, 0,1% p/v de BSA) durante 3 x 5 min. Las micropartículas se inmovilizan en el puesto de separación magnética (MSP) de Biometra (Göttingen, Alemania) y se elimina el sobrenadante.

3.4.3 Pretratamiento de las muestras biológicas

Se recogen 0,75 unidades de volumen con 0,25 unidades de volumen de la solución madre del cóctel inhibidor de proteína (solución madre PI). Solución madre PI: se disuelve 1 tableta de Complete™ Mini in 1,5 ml H_{2}O_{dd}.

3.4.4 Activación de mAb de las micropartículas magnéticas ("micropartículas") utilizando el procedimiento IP directo

Se inmovilizaron magnéticamente aproximadamente 1,675 x 10^{8} micropartículas (250 \mul de suspensión de micropartículas preparada, véase anteriormente) sobre las paredes de vasos Eppendorf de 1,5 ml en MSP y se incubaron con 7,5 \mug de mAb 6E10 (Senetek Drug Delivery Technologies, Inc., St. Louis, Mo, Estados Unidos) o 10 mug de mAb 1E8 (Schering AG, Berlin, Alemania) en 250 \mul de PBS/BSA a 4ºC durante 20 h. A continuación se lavó con 1 ml de PBS/BSA durante 4 x 30 min y finalmente se recogieron en 250 \mul de PBS/BSA/0,01% de azida Na y se guardaron a 4ºC hasta que se utilizaron para la inmunoprecipitación. Las micropartículas activadas de esta manera se pueden guardar hasta 3 meses con pérdida negligible de capacidad. Inmediatamente antes de utilizarlas en la inmunoprecipitación de muestras biológicas, las micropartículas activadas se lavaron con 250 \mul de PBS/BSA sin adición de azida Na durante 3x3 min.

3.4.5 Inmunoprecipitación de CSF humano a) sin detergentes

Se mezcla 25 \mul de DynaBeads activadas (aproximadamente 1,675 x10^{7} micropartículas) con solución madre de 268 \mul de CSF/PI (200 \mul de CSF + 68 \mul de solución madre PI) y se llevaron hasta 1 ml con 732 \mul de 50 mM regulador HEPES, pH 7,4, en vasos Eppendorf. La incubación tiene lugar en un mezclador por agitación (agitación continua de la muestra) a 4ºC durante 20 h. Las micropartículas se inmovilizaron a continuación en el puesto MSP y se eliminó el sobrenadante. A continuación se lavaron las micropartículas con 1 ml de PBS/0,1%BSA a temperatura ambiente durante 4 x 5 min. Finalmente, se lavaron las micropartículas en 1 ml de 10 mM tris/HCI (pH 7,5) a temperatura ambiente durante 1 x 3 min. Para la A\beta SDS-PAGE, las muestras de micropartículas inmovilizadas magnéticamente se recogieron con 25 \mul de SDS-PB-1 a 95ºC durante 5 min. Para la A\beta 2D-PAGE, se utilizan 25 \mul de IEF-SB o IPG-SB para la recogida, y la incubación tiene lugar en un baño de ultrasonidos a 37ºC durante 10 min. Se cargan 4 \mul de muestra para la A\beta SDS-PAGE, correspondiente a la cantidad de los A\beta-péptidos presentes en un volumen de 32 \mul de CSF. Se cargan 10 \mul para la A\beta 2D-PAGE, correspondientes a la cantidad de A\beta-péptidos presente en un volumen de 80 \mul de CSF.

b) con detergentes (RIPA_{\text{0.5x}}-IP)

Se mezclan 200 \mul de CSF con 200 \mul de regulador RIPA_{\text{0.5x}} 5-veces concentrado (tabla 6) y se llevan hasta 1 ml con 600 \mul de H_{2}O_{dd} en vasos Eppendorf. El procedimiento para la inmunoprecipitación corresponde al procedimiento descrito en A. El regulador RIPA_{\text{0.5x}} contiene inhibidores de proteasa (tabla 6).

3.4.6 Inmunoprecipitación de tejido de cerebro humano (RIPA_{1X}-IP)

Se homogeniza tejido de cerebro (aproximadamente 50 mg) con 1 ml de regulador RIPA_{1x} (tabla 6) en recipientes de reacción Eppendorf de 1,5 ml utilizando una sonda de ultrasonidos y se centrifuga a continuación a 20.000 g durante 5 min (4ºC). Se elimina el sobrenadante y el contenido de proteína del sobrenadante homogenado se ajusta a 3 mg/ml con regulador RIPA_{1x}, y se inmunoprecipita 1 ml de homogenado de cerebro con 50 \mul de DynaBeads activadas (aproximadamente 3,35 x 10^{7} micropartículas) según se describe en (a). El regulador RIPA_{\text{1.0x}} contiene inhibidores de proteasa (tabla 6).

3.4.7 Inmunoprecipitación de sobrenadantes de cultivo celular (RIPA_{\text{0.5x}}-IP)

Se mezclan 400 \mul de sobrenadante de cultivo celular con 100 \mul de regulador RIPA_{\text{0.5x}} concentrado 5 veces (alternativa: 800 \mul de sobrenadante de cultivo celular con 200 \mul de regulador RIPA_{\text{0.5x}} concentrado 5 veces) y 25 \mul de DynaBeads activados y se inmunoprecipitan según se describe en (a). Se cargan 6 \mul de muestra para A\beta SDS-PAGE, correspondiente a la cantidad de los A\beta-péptidos presente en un volumen de 96 \mul de sobrenadante de cultivo celular.

3.5 Fijación y teñido con plata 3.5.1 Reactivos

Merck (Darmstad, Alemania): tiosulfato de sodio pentahidratado de calidad analítica (Na_{2}S_{2}O_{3}, nº de ref.: 1.06516.0500), carbonato de sodio de calidad analítica (Na_{2}CO_{3}, nº de ref.: 1.06392.1000), sustancia reguladora de glicina (nº de ref.: 1.04169.0250), formaldehído mín. 37% de calidad analítica (nº de ref.: 1.04003.1000), glutaraldehído 25% de fuerza (nº de ref.: 8.20603.0100), acetato de sodio anhidro (nº de ref.: 1.06268.1000);

Paesel+Lorei (Hanau, Alemania): nitrato de plata de calidad analítica (nº de ref.: 27-100-601);

Central pharmacy of Göttingen University: etanol 99,9%, desnaturalizado.

3.5.2 Procedimiento

Después de la A\beta SDS-PAGE o A\beta 2D-PAGE, se fijan con glutaraldehído los péptidos y las proteínas en un regulador de borato/fosfato según se ha descrito por Wiltfang et al. (Wiltfang et al., 1997) a temp. ambiente durante 45 min. El procedimiento para el teñido de plata es una ligera modificación del de Heukeshoven et al. (Heukeshoven y Dernick, 1988) (tabla 7).

3.6 Inmunograma obtenido con el equipo Western 3.6.1 Material y reactivos, anticuerpos

Paesel+Lorei (Hanau, Alemania): tris ultra puro (nº de ref.: 100840); Sigma (Steinheim, Alemania): ácido bórico (ácido bórico, nº de ref.: B-7901), azida de sodio (azida Na, nº de ref.: A-2002); J.T.Baker (Deventer, Holanda): metanol (nº de ref.: 9263); BioRad Laboratories (Hercules, CA, Estados Unidos): papel de filtro extra grueso (nº de ref.: 1703960), leche seca no grasa (nº de ref.: 170-6404); Millipore Corporation (Bedford, MA, Estados Unidos): membrana de transferencia immobilon-P (nº de ref.: IPVH00010); Hoefer Pharmacia Biotech Inc. (San Francisco, CA, Estados Unidos): unidad de transferencia semi-seca SemiPhor (nº de ref.: 80-6211-86); Biochrom KG (Berlin, Alemania): PBS Dulbecco, sin Ca^{++}, sin Mg^{++} (nº de ref.: L182-50); Schering AG (Berlin, Alemania):, mAb 1E8 (IgG1 de ratón); Senetek PLC Drug Delivery Technologies, Inc. (St. Louis, Mo, Estados Unidos): purified mAb 6E10, IgG1 de ratón (nº de ref.: 320-02);

Roth (Karlsruhe, Alemania): Roti-Block (nº de ref.: A151.1).

3.6.2 Procedimiento para el inmunograma obtenido con un equipo Western

A\beta SDS-PAGE o A\beta 2D-PAGE son seguidas de una transferencia por medio de un inmunograma semiseco obtenido con un equipo Western y un sistema regulador multifase para las membranas de detección de PVDF. Los reguladores de transferencia se compilan en la tabla 8.

La estructura del sandwich de transferencia del ánodo al cátodo es como sigue: una capa de papel de filtro con regulador A, una capa de papel de filtro y la membrana PVDF con regulador B, y finalmente dos capas de filtro de papel con regulador C. Los geles se incuban en regulador C durante aproximadamente 10 seg. inmediatamente a continuación de la electroforesis. Papel de filtro extra grueso de BioRad se utiliza como papel de filtro. Después del examen de las membranas PVDF de diversos fabricantes, la membrana Immobilon-P de Millipore dio la mínima tintura de fondo y la inmovilización más efectiva de los A\beta-péptidos, especialmente A\beta_{1-42}, con el protocolo de inmunograma. Las membranas Immobilon-P se humectan con metanol antes de su utilización según la información del fabricante, posteriormente se incuban en H_{2}O_{dd} durante 1 min. y a continuación se transfirieren al regulador B. La transferencia tiene lugar durante 30 min. para A\beta SDS-PAGE (\diameter 0,5 mm) o durante 45 min para los geles de A\beta 2D-PAGE (\diameter 1,0 mm) a temperatura ambiente con 1 mA/cm^{2}.

Después de la completación del inmunograma obtenido con el equipo Western, se lava la membrana Immobilon-P en H_{2}O_{dd} durante aproximadamente 30 seg. y se cocina en PBS (sin Tween-20) en un microondas durante 3 min. La etapa de cocción es esencial para conseguir la sensibilidad de detección máxima.

3.6.2.1 Inmunograma 1 (etapa de bloqueo con polvo de leche)

Se resumen en las tablas 9a y b los reguladores, soluciones y anticuerpos que se utilizan para el inmunograma
1.

\bullet

Etapa de bloqueo: en 4 ml de membrana de PBS-T-M/cm^{2} a temperatura ambiente durante 1 h.

\bullet

Incubación con mAb primario: 15 h a 4ºC y finalmente 30 min. a temp. ambiente en una dilución 1:4000 de mAb 1E8 (Schering AG, Berlin, Alemania) o en una dilución 1:1000 de mAb 6E10 (purificada: 1 mg/ml; Senetek Drug Delivery Technologies, Inc., St. Louis, Mo, Estados Unidos) en 0,074 ml de PBS-T-M/cm^{2} (cierre con película de plástico, agitación de frecuencia elevada con mezclador rotatorio).

\bullet

Etapa de lavado 1: con PBS -T (4 ml/cm^{2}) a temperatura ambiente durante 3x10 min.

\bullet

Incubación con mAb secundario: 1 h a temp. ambiente con una dilución 1:3000 de mAb secundario (IgG anti-ratón biotinilado, para caballos, H+L; Vector Laboratories, Burlingame, CA, Estados Unidos) en 0,074 ml de PBS-T-M/cm^{2} de membrana (cierre con película de plástico, agitación de frecuencia elevada con mezclador rotatorio).

\bullet

Etapa de lavado 2: como la etapa de lavado 1.

\bullet

Refuerzo de Streptavidina-avidina: 1 h a temperatura ambiente con una dilución 1:3000 de complejo de peroxidasa RPN 1051 de streptavidina biotinilada para caballos (Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra) en PBS-T con 0,26 ml/cm^{2} de membrana (cierre con película de plástico, agitación de frecuencia elevada con mezclador rotatorio).

\bullet

Etapa de lavado 3: como la etapa de lavado 1.

\bullet

Revelado de ECL: con 0,1 ml/cm^{2} de solución ECLPlus™ (RPN 2132; Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra) a temp. ambiente durante 5 min. según la información del fabricante. Posteriormente eliminación del exceso de reactivo (entre 2 láminas de papel de filtro durante 5 seg.) y envoltorio de la membrana húmeda en lámina transparente de conservación de alimentos.

3.6.2.2 Inmunograma-2 (Roti-Block)

Se resumen en las tablas 9a y b los reguladores, soluciones y anticuerpos que se utilizan en el inmunograma 2.

\bullet

Etapa de bloqueo: en 25 ml de 1:10 Roti-Block/H_{2}O_{dd} a temperatura ambiente durante 1 h.

\bullet

Incubación con el mAb primaria: 15 h a 4ºC y finalmente 30 min. a temp. ambiente en una dilución 1:4000 de mAb 1E8 (Schering AG, Berlín, Alemania). mAb 6E10 no es compatible con Roti-Block a causa de su señal de fondo elevada.

\bullet

Etapa de lavado 1: con PBS-T (4 ml/cm^{2}) a temp. ambiente durante 3x10 min.

\bullet

Incubación con el Ab secundario: 1 h a temp. ambiente con una dilución de 1:3000 del mAb secundario (IgGanti-ratón biotinilado, para caballos, H+L; Vector Laboratories, Burlingame, CA, Estados Unidos) en 0,074 ml de PBS-T-M/cm^{2} de membrana (cierre con película de plástico, agitación de frecuencia elevada con mezclador rotatorio).

\bullet

Etapa de lavado 2: como la etapa de lavado 1.

\bullet

Refuerzo de Streptavidina-avidina: 1 h a temperatura ambiente con una dilución 1:3000 de complejo peroxidasa RPN 1051 de streptavidina biotinilada para caballos (Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra) en PBS-T con 0,26 ml/cm^{2} de membrana (cierre con película de plástico, agitación de frecuencia elevada con mezclador rotatorio).

\bullet

Etapa de lavado 3: como la etapa de lavado 1.

\bullet

Revelado de ECL: con 0,1 ml/cm^{2} de solución de ECLPlus™ (RPN 2132; Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra) a temp. ambiente durante 5 min. según la información del fabricante. Posteriormente eliminación del exceso de reactivo (entre 2 láminas de papel de filtro durante 5 seg.) y envoltorio de la membrana húmeda en lámina transparente de conservación de alimentos.

3.6.3 Cuantificación de la señal ECL mediante evaluación de película densitométrica 3.6.3.1 Material y reactivos

Amersham Pharmacia Biotech AB (Buckinghamshire, Inglaterra): sistema de detección de inmunograma obtenido con el equipo Western de ECL^{Plus} (nº de ref.: RPN 2132), Hyperfilm™ ECL™ (nº de ref.: RPN 2103H);

Schleicher und Schuell (Dassel, Alemania): papel de transferencia de gel (nº de ref.: 426690); Tropix (Bedford, MA, Estados Unidos): carpetas de revelado, 14 cm x 19 cm (nº de ref.: XF030); Biometra (Göttingen, Alemania): programa informático BioDoc Epson Germany GmbH (Düsseldorf, Alemania): scanner de rayo láser Epson GT 9000.

3.6.3.2 Revelado de ECL

Después de la última etapa de lavado en PBS-T, la membrana PVDF se coloca sobre un sustrato de teflón y el exceso de regulador de lavado se elimina poniendo sobre una capa de KIMWIPES® Lite 200 toallitas de laboratorio. Esto es seguido por una incubación con 0,1 ml/cm^{2} de solución de ECLPlus™ a temperatura ambiente durante 5 min. Para eliminar el exceso de solución de ECLPlus™, se coloca la membrana entre dos capas de papel de gel de transferencia y, para la detección de la señal, se transfiere a una carpeta de revelado que asegura la detección óptima y evita que se seque la membrana.

3.6.3.3 Cuantificación

Se cargaron porciones de 8 \mul en la muestra de CSF. Cada gel llevaba series de diluciones de una mezcla A\beta-péptidos 1-40 y 1-42 sintéticos (A\beta_{1-42}: 5,10,15,25 pg; A\beta_{1-40}: 20, 50, 75, 100 pg). Las mediciones se llevaban a cabo como una determinación triplicada. Las concentraciones de A\beta-péptido se calcularon para cada gel sobre la base de una serie de calibración. Se calculó a continuación la media (n=3) y el coeficiente de variación (CV). El coeficiente de variación intraanalítico se calculó sobre la base de las tres únicas determinaciones cada una determinada sobre geles separados en el mismo experimento utilizando soluciones madre idénticas. El coeficiente de variación interanalítico se determinó sobre la base de los medios de A\beta_{1-42} que se midieron en experimentos diferentes (es decir, días de estudio).

Los valores atípicos encontrados mediante la determinación triplicada no se eliminaron cuando se calcularon los dos coeficientes de variación, es decir, todas las bandas de A\beta-péptido técnicamente capaces de la evaluación se incluyeron en el cálculo.

Además, se recogieron los datos en bruto (unidades de área) de las tres bandas por carril para \beta_{1-40}, A\beta_{1-42} y A\beta_{1-38} y se relacionaron una con otra en las proporciones (A\beta_{1-42}/A\beta_{1-40}, A\beta_{1-42}/A\beta_{1-38}).

La detección de ECL después del inmunograma obtenido con el equipo Western (mAb primario: 1E8) tuvo lugar mediante la exposición de Hyperfilm™ durante 5 min. La evaluación densitométrica tuvo lugar utilizando un scanner de rayo láser (Epson GT 9000) y un programa informático de evaluación (Biometra, programa informático BioDoc).

3.6.4 Cuantificación de la señal ECL utilizando una cámara CCD 3.6.4.1 Material y equipo

Bio-RAD Laboratories (Hercules, CA, Estados Unidos): sistema Multilmager Fluor-S MAX (nº de ref.: 170-7720); programa informático Quantity One (nº de ref.: 170-8601).

3.6.4.2 Revelado de ECL

El revelado de ECL se llevó a cabo según se ha descrito en 3.6.3.2.

3.6.4.3 Procedimiento

Se cargaron porciones de 10 \mul de muestra de CSF. Cada gel llevaba series de diluciones de una mezcla de A\beta-péptidos 1-37, 1-38, 1-39, 1-40 y 1-42 sintéticos (A\beta_{1-37}: 5, 10, 20, 40, 80 pg; A\beta_{1-38}: 15, 30, 60, 90, 120 pg; A\beta_{1-39}: 5, 10, 20, 30, 60 pg; A\beta_{1-40}: 25, 50, 100, 200, 300 pg; A\beta_{1-42}: 5, 10, 20, 40, 80 pg). La detección de ECL utilizando una cámara CCD tuvo lugar con una resolución de 80 x 80 \mum por medio de unos tiempos de exposición de series de 5, 20, 60 y 120 segundos. Los geles se cuantificaron relativamente sus series de calibración respectivas utilizando el programa informático de evaluación "Quantity One" (Bio-RAD Laboratories, Hercules, CA, Estados Unidos).

Las mediciones se llevaron a cabo como una determinación cuadriplicada. Las concentraciones de A\beta-péptido se calcularon para cada gel sobre la base de sus series de calibración. Se calculó a continuación la media (n=4) y el coeficiente de variación (CV). Se calculó el coeficiente de variación intranalítico sobre la base de cuatro determinaciones únicas, que cada una se determinó sobre geles separados en el mismo experimento utilizando soluciones madre idénticas. Se determinó el coeficiente de variación internalítico sobre la base de los medios que se midieron en experimentos independientes (es decir, días de estudio). Los valores atípicos encontrados por determinación cuadriplicada no se eliminaron cuando se calcularon los dos coeficientes de variación, es decir, todas las bandas de A\beta-péptido técnicamente capaces de la evaluación se incluyeron en el cálculo.

3.7 Cultivo de pollo primario teleencefálico

Se incubaron en un incubador 37ºC durante 10 días huevos de pollo de raza White Leghorn. En el día 10, se elimina el embrión de pollo en condiciones estériles, y se expone el cerebro. Se eliminan las vesículas cerebrales anteriores, se despojan de las meninges anexas y se recogen en DMEM regulada por HEPES. El tejido obtenido de esta manera se somete a digestión de tripsina durante 15 minutos y, después de lavar con DMEM tres veces, se aspira mediante una aguja varias veces. Después de que el homogenado se haya centrifugado a 550 g durante cinco minutos, se decanta el sobrenadante, la pastilla se recoge en el medio de cultivo (DMEM +5% de suero de ternera fetal + 5% suero de pollo) y otra vez se aspira mediante una aguja. Después de una determinación del contaje de células utilizando una cámara contadora Neubauer, se ajusta la densidad celular de la suspensión a 1,5 millones de células/ml, y esto último se extiende por la superficie de recipientes de cultivo para resultar en una densidad celular de 375 000 células/cm^{2}. Para mejorar la adhesión de las células, los recipientes de cultivo se han recubierto previamente durante 24 horas con una solución poli-L (0,1 mg/ml de poli-L lisina en 0,1M de regulador borato/NaOH, esterilizado mediante filtración, pH 8,4). Se cambia el 50% del medio en el 2º día de cultivo, y se cambia el 100% del medio al 5º día de cultivo con la adición simultánea de la sustancia de examen que se va a investigar. Los tiempos de incubación pueden ser hasta 48 horas.

3.8 Obtención de CSF

Se obtuvieron de tres a 10 ml de CSF lumbar mediante punción de CSF lumbar y se recogieron en recipientes de muestra de polipropileno. Después de la centrifugación (1000 g, 10 min, 4ºC), se guardaron las muestras en alícuotas de 150 \mul en recipientes de polipropileno (Eppendorf, 1,5 ml) a -80ºC dentro de las 24 horas hasta la determinación. Las muestras no deben experimentar múltiples congelaciones y descongelaciones.

3.9 Pacientes

Se investigó en total, el CSF lumbar de 130 pacientes. Se midieron adicionalmente los A\beta-péptidos en el plasma de sangre en cinco de estos pacientes. Los pacientes se distribuyeron en los dos supergrupos de diagnóstico de enfermedades neurospiquiátricas excluyendo la enfermedad de Alzheimer ("controles de enfermedades neuropsiquiátricas", NDC) y los pacientes con enfermedad de Alzheimer (esporádica) clínicamente probable (AD). Determinados por los procedimientos, se investigó una pluralidad de grupos NDC y AD cada uno con diferentes pacientes, y se identificaron grupos asociados de pacientes identificados mediante numerales arábigos consecutivos (p.ej., NDC-1, AD-1). Los grupos NDC-1 y NDC-2 contienen asimismo pacientes con enfermedades de demencia de etiología distinta a la AD. El grupo NDC-3 contiene sólo pacientes con enfermedades neuropsiquiátricas no de demencia. Este grupo se ha diferenciado en pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas del CNS ("enfermedad CNS crónica inflamatoria", CID-3) y el resto de pacientes con otras enfermedades neuropsiquiátricas ("otras enfermedades neuropsiquiátricas", OND-3). Se hizo una diferenciación adicional dentro de los grupos OND-3 y AD-3 dependiendo del genotipo ApoE \varepsilon4. La Fig. 1 resume los grupos de pacientes y su asociación jerárquica. La tabla 10a-d especifica los pacientes presentes simultáneamente en más de un grupo de pacientes.

El diagnóstico clínico tuvo lugar según ICD-10. Se procedió al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer según los criterios, que se utilizan predominantemente a nivel internacional, del "Work Group of the National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke (NINCDS)" y las directrices de la "Alzheimer's Disease and Related Disorders Association (ARDA)" (McKhann et al., 1984). Las muestras se obtuvieron todas durante el diagnóstico clínico rutinario. No se obtuvo volumen adicional de CSF para las mediciones presentadas aquí. En consecuencia, fue posible la investigación retrospectiva sólo si las alícuotas de CSF estaban disponibles después de la completación del diagnóstico de rutina.

3.9.1 NDC-1 y AD-1

Se cuantificaron los A\beta-péptidos en CSF lumbar de 65 pacientes mediante inmunograma 1/A\beta SDS-PAGE y evaluación densitométrica de las películas. La recogida de las muestras previamente congeladas sin tratar después de la punción de CSF y la centrifugación concordó con 3.2.2a. Los diagnósticos y mediciones de los pacientes se muestran en la tabla 12 y se resumen en la tabla 13. Los pacientes representados simultáneamente en otros grupos se encuentran en la tabla 10a y 10c.

\bullet

NDC-1: n = 30, edad = 59,2 \pm 12,6 (media \pm SD), sexo: 19/11 (mujer/hombre).

\bullet

AD-1: n = 35, edad = 69,7 \pm 8,8 (media \pm SD), sexo: 18/17 (mujer/hombre).

Diez de los pacientes AD-1 y 20 de los NDC-1 se investigaron comparativamente por medio de la inmunoprecipitación (mAb 6E10, IP sin detergentes) e inmunograma 1/A\beta SDS-PAGE (véase tablas 12 y 13). Todos los pacientes en el grupo AD-1 se investigaron comparativamente con un ELISA comercial de A\beta_{1-42}.(véase tabla 13).

3.9.2 NDC-2^{CP}

En diez pacientes, la concentración de A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42} en el CSF lumbar se investigó como una función del tratamiento previo de la muestra mediante inmunograma 1/A\beta SDS-PAGE y evaluación densitométrica de las películas. Se investigó asimismo la extensión de la reducción causada por la crioprecipitación (CP) en los A\beta-péptidos. Las muestras de los pacientes se dividieron en alícuotas después de la punción y centrifugación de CSF. Se trató previamente una alícuota antes de congelar con SDS/desnaturalización térmica según se describe en 3.2.2a, denominada en lo sucesivo A\beta_{1-40}SDS o A\beta_{1-42}SDS. La otra alícuota se congeló sin tratamiento previo a -80ºC, denominada A\beta_{1-40} nativa o A\beta_{1-42} nativa en lo sucesivo. Los diagnósticos y las mediciones de los pacientes se resumen en la tabla 16a y 16b. Los pacientes representados simultáneamente en otros grupos se encuentran en la tabla 10a.

\bullet

NDC-2^{CP}: n = 10, edad = 45,8 \pm 13,4 (media \pm SD), sexo: 6/4 (mujer/hombre).

3.9.3 NDC-3 y AD-3 con subgrupos

Se investigó la concentración de los A\beta-péptidos en el CSF lumbar de 49 pacientes en el grupo NDC-3 y 12 pacientes en el grupo AD-3 mediante A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE y cámara CCD. La recogida de muestra de las muestras congeladas sin tratar después de la centrifugación y punción de CSF concordó con 3.2.2a. Los diagnósticos y mediciones de los pacientes se muestran en la tabla 19 y se resumen en la tabla 20. Los pacientes simultáneamente representados en otros grupos se encuentran en las tablas 10b, c y d.

\bullet

NDC-3: n = 47, edad = 45,2 \pm 15,8 (media \pm SD), sexo: 19/28 (mujer/hombre).

\bullet

AD-3: n = 12, edad = 73,0 \pm 7,9 (media \pm SD), sexo: 9/3 (mujer/hombre).

Los subgrupos adicionales dentro del grupo NDC-3 se formaron dependiendo de la naturaleza de la muestra y del tratamiento previo de la muestra: muestras de CSF parejos y de plasma de EDTA se obtuvieron para cinco de los pacientes NDC-3. Estas muestras se investigaron por inmunoprecipitación (RIPA-IP, 1E8) y se denominan IP-CSF-3 y IP-plasma-3 en lo sucesivo. Las concentraciones de los A\beta-péptidos medidas sin inmunoprecipitación previa se han resumido comparativamente para los últimos cinco pacientes como el grupo SDS-CSF-3 (véase tabla 20). La concentración de A\beta_{1-42} en CSF se determinó utilizando un ELISA comercial (Hulstaert et al., 1999) comparativamente para 27 de los pacientes NDC-3. Se realizó una diferenciación dentro del grupo NDC-3 entre pacientes con enfermedades CNS inflamatorias crónicas ("enfermedad CNS crónica inflamatoria" CID) y pacientes con otras enfermedades neuropsiquiátricas ("otra enfermedad neuropsiquiátrica", OND).

\bullet

OND-3: n=37, edad = 45,3 \pm 16,4 (media \pm SD), sexo: 15/22 (mujer/hombre).

\bullet

CID-3: n=10, edad = 44,9 \pm 14,2 (media \pm SD), sexo: 4/6 (mujer/hombre).

El grupo CID-3 se componía de cinco pacientes con esclerosis múltiple y cinco pacientes con una etiología no clara de procedimiento CNS inflamatorio crónico.

El grupo OND-3 se diferenció adicionalmente dependiendo del genotipo ApoE \varepsilon4 en los grupos OND-3\varepsilon4^{plus} (n=6) y OND-3\varepsilon4^{minus} (n=30). Los pacientes en el grupo OND-3\varepsilon4^{plus} poseen uno o dos alelos \varepsilon4, los pacientes en el grupo OND-3\varepsilon4^{minus} les falta este alelo. Ya que 11/12 de los pacientes AD-3 llevan uno o dos tipos de alelos ApoE \varepsilon4, no se puede eliminar la influencia del alelo \varepsilon4 sobre el modelo de CSF de los A\beta-péptidos, pero se encontraron efectos independientes de \varepsilon4 y por lo tanto más específicos de AD mediante comparación de grupos de pacientes AD-3\varepsilon4^{plus} (n=11) y OND-3\varepsilon4^{plus} (n=6).

Los valores de los resultados para el examen MMSE de los pacientes, frecuencias de los alelos ApoE \varepsilon4, y concentraciones de CSF absolutas y relativas del A\beta-péptido se resumen para los grupos NCD-3, AD-3, IP-plasma-3, IP-CSF-3, y SDS-CSF-3 en la tabla 20.

3.9.4 NDC-3^{CP} y AD-3^{CP}

La reducción causada por crioprecipitación (CP) en A\beta_{1-42} en el CSF lumbar se investigó comparativamente para 15 pacientes en el grupo NDC-3 y para 9 pacientes en el grupo AD-3 mediante A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE y cámara CCD. Los grupos se denominan NDC-3^{CP} y AD-3^{CP} en lo sucesivo. NDC-3^{CP} es enteramente un subgrupo de NDC-3. AD-3^{CP} (n=11) contiene nueve pacientes del grupo AD-3 además de dos otros pacientes adicionalmente (NP69, NP197). La preparación de la muestra para determinar A\beta_{1-42} nativo y A\beta_{1-42}SDS tuvo lugar según se ha descrito para el grupo NDC-2^{CP}.

Los diagnósticos y las mediciones de los pacientes se resumen en la tabla 21. Los pacientes representados simultáneamente en otros grupos se encuentran en las tablas 10 b, c y d.

\bullet

NDC-3^{CP}: n=15, edad = 44,6 \pm 15,0 (media \pm SD), sexo: 5/10 (mujer/hombre).

\bullet

AD-3^{CP}: n = 11, edad = 70,9 \pm 9,0 (media \pm SD), sexo: 9/2 (mujer/hombre).

3.10 Estadística

El examen para diferencias significativas entre muestras independientes tuvo lugar mediante la prueba Mann-Whitney U y para las muestras dependientes (parejas) mediante la prueba Wilcoxon. El análisis de regresión no paramétrico tuvo lugar por el procedimiento Spearman (coeficiente de correlación rho o R). El programa informático estadístico utilizado fue Statistika (versión 5.0). El cálculo iterativo del diagnóstico específico y de la sensibilidad para el diagnóstico de AD dependiente de diferentes límites de A\beta-péptido versus el procedido vía un "curva característica operativa del receptor (ROC)" (Metz, 1978). El nivel de significancia bilateral se fijó a p<0,05.

4. Resultados 4.1 Fraccionación y detección de sAPP\alpha y de los A\beta-péptidos 4.1.1 A\beta-SDS-PAGE

Es posible mediante A\beta SDS-PAGE separar A\beta-péptidos sintéticos siguientes a través un cambio conformacional inducido por urea desde el cátodo (superior) al ánodo (inferior):

1-33/1-34

1-35

1-37

1-38

1-39

1-42/2-40/3-40

2-42/3-42

3p-42*/3p-40*

* p = derivados de piroglutamato;

Los A\beta-péptidos en los que falta la separación o sólo es parcial están en línea. La detección tuvo lugar mediante teñido de plata de los geles resolventes.

Es posible separar mediante A\beta IPG-2D-PAGE los A\beta-péptidos 2-40/3-40 de 1-42 porque la ausencia de aspartato cambia el punto isoléctrico en una unidad de pH de 5,37 a 6,37 (véase las figs. 2a y c y fig. 24a).

El mismo cambio de pH surge de los A\beta-péptidos 2-42/3-42 en relación a 1-42. Es posible diferenciar entre 2-40/2-42 y 3-40/3-42 vía mAbs 1E8 y 6E10 selectivos en el N-terminal (véase 3.1.2). Vale la pena notar que las modificaciones en el N y C terminales de los A\beta-péptidos que llevan a un comportamiento de agregación incrementado (N-terminal: ausencia de formación de aspartato y de piroglutamato; C-terminal: extensión por aminoácidos hidrofóbicos) llevan asimismo a una movilidad electroforética incrementada en el sistema de gel resolvente que contiene urea. Existe de este modo una analogía entre las funciones de actividad-estructura in vitro e in vivo.

Comparativamente los cambios menores en la matriz de gel resolvente (tamaño de poro de poliacrilamida, molaridad de la urea, pH, temperatura y fuerza iónica) y en la concentración de SDS catódica alteran significativamente el comportamiento de migración absoluto y relativo de los A\beta-péptidos. Los cambios en la concentración total de monómero de acrilamida (T%) o en la proporción de bisacrilamida en la concentración total (%C) mediante sólo 1-2% con condiciones de otra manera constantes son suficientes para esto. Probablemente, una reducción selectiva en la concentración de urea de 8 a 7 mol/l o una reducción en la concentración de SDS catódica de 0,25% (w/v) a 0,1% lleva a un fraccionamiento alterado.

Por medio de A\beta SDS-PAGE, se fracciona sAPP\alpha en el compartimiento (catódico) superior en el gel resolvente que contiene urea, que se puede detectar por inmunograma 1/2 obtenido con el equipo (mAb 1E8) (véase fig. 3). Debido a la masa molecular de > 100 000, las isoformas de sAPP\alpha se transfieren con una eficacia menor y una variación considerablemente mayor, comparada con los A\beta-péptidos, desde los geles resolventes de poro pequeño que contienen urea sobre la membrana de detección (coeficiente de variación intranalítico en el CSF > 20%).

Sin embargo, la eficacia de transferencia y el fraccionamiento de las isoformas de sAPP\alpha se pueden mejorar considerablemente si el sistema de gel resolvente que contiene urea se combina con un compartimiento de gel resolvente catódico que no contiene urea y con un tamaño de poro mayor pero con la composición de regulador de otra forma la misma (10 T%, 5 C%, sin urea). Con una longitud sin cambiar de gel resolvente en el compartimiento que contiene urea, no se afecta la calidad del fraccionamiento del A\beta-péptido porque los A\beta-péptidos están todavía concentrados en la migración a través de un compartimiento de poro grande dentro de la frontera móvil.

La cuantificación de sAPP\alpha por A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE y cámara CCD parece ser muy prometedora para el diagnóstico de demencia neuroquímico, porque se encontró que sAPP\alpha se reducía en el CSF en AD e ilustra el corte de la \alpha-secretasa. De este modo el A\beta inmunograma/SDS-PAGE permite el cálculo de las proporciones sAPP\alpha/A\beta-péptido, que representan una medida de la proporción de la \alpha-secretasa a la actividad de la \beta/\gamma secretasa.

4.1.2 Inmunograma 1/2 obtenido con el equipo Western

El mAb 1E8 muestra una especificidad en el N terminal sorprendentemente elevada en el inmunograma 1/2 obtenido con el equipo Western porque sólo los A\beta-péptidos truncados por un máximo de un aminoácido (aspartato) en el N terminal se detectan en el intervalo de pg inferior (<200 pg). En consecuencia, los A\beta-péptidos 3-40, 3p-40, 3-42 y 3p-42 no se detectan utilizando mAb 1E8. En estos casos, la detección es posible mediante el mAb 6E10 específico en el N terminal, que está disponible comercialmente pero con el que la detección es aproximadamente de diez a treinta veces menos sensible, dependiendo de las condiciones de transferencia.

La sensibilidad de detección del inmunograma 1 obtenido con el equipo Western (bloqueo de leche de polvo, mAb 1E8) es de 1 pg (A\beta_{1-40}) a 2 pg (A\beta_{1-42}) en la exposición de las películas y de 3 pg (A\beta_{1-40}) a 6 pg (A\beta_{1-42}) en la grabación de la señal con la cámara CCD. La sensibilidad de detección del inmunograma 2 obtenido con el equipo Western (Roti-Block, mAb 1E8) es de 0,3 pg (A\beta_{1-40}) a 0,6 pg (A\beta_{1-42}) en la exposición de las películas y de 1 pg (A\beta_{1-40}) a 2 pg (A\beta_{1-42}) en la grabación de la señal con la cámara CCD. A través del revelado del inmunograma 2 obtenido con el equipo Western fue posible compensar la sensibilidad de la cámara CCD siendo aproximadamente tres veces inferior a la de la exposición de las películas. La sensibilidad de detección del mAb 6E10 selectivo en el N terminal disponible comercialmente en el inmunograma obtenido con el equipo Western con polvo de leche es de 10 pg (A\beta_{1-40}) a 20 pg (A\beta_{1-42}) en la exposición de las películas y de 30 pg (A\beta_{1-40}) a 60 pg (A\beta_{1-42}) en la grabación de la señal con la cámara CCD. El mAb 6E10 no se puede utilizar con el Rotiblock. De este modo fue posible incrementar la sensibilidad de detección hasta 30 veces comparada con el mAb 6E10.

Los sistemas de gel resolvente SDS-PAGE con urea 8 M se pueden cargar, irrespectivamente de las dimensiones de gel utilizadas, con un máximo de aproximadamente 5 \mul de CSF por mm^{2} de superficie de área del gel si la separación electroforética óptima se consigue virtualmente para todas las muestras de pacientes. Esto se aplica al CSF que se ha congelado sin tratar y a continuación SDS/desnaturalizado térmicamente, o CSF que se ha SDS/desnaturalizado térmicamente antes de la congelación. 5 \mul por mm^{2} corresponden en el sistema de minigel utilizado a un volumen de CSF de aproximadamente 10 \mul. La sensibilidad resultante es 200 pg/ml para la detección de A\beta_{1-42} en CSF humano por A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE y cámara CCD. Una sensibilidad de detección de por lo menos 200 pg/ml es una condición previa para el diagnóstico de demencia neuroquímico de AD mediante la determinación de los A\beta-péptidos en el CSF y no se puede conseguir por ejemplo con el mAb 6E10 disponible comercialmente.

La sensibilidad para la detección de A\beta_{1-42} aumenta a < 10 pg/ml en combinación de la inmunoprecipitación (detergentes RIPA, mAb 1E8) con A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE y cámara CCD. Esta es una condición previa para la cuantificación de los A\beta-péptidos en el plasma por inmunograma/A\beta SDS-PAGE. Los coeficientes de variación intra e interanalíticos para el inmunograma 1/A\beta SDS-PAGE con evaluación densitométrica de películas se encuentran en la tabla 11. Los coeficientes de variación correspondientes para el A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE con cámara CCD se encuentran en las tablas 18 a y b. Cada uno de los coeficientes de variación intra e interanalíticos menores de 10% se encontraron para la cuantificación de 20 pg de A\beta-péptido.

La cuantificación utilizando una cámara CCD posee considerables ventajas comparadas con la exposición de películas. La señal de luz en este caso se puede grabar linealmente durante 3,8 potencias de diez y, además, la duración de la señal grabada puede ser controlada exactamente durante un intervalo amplio. En consecuencia, los metabolitos APP con una gran diferencia en su intensidad de señal, tal como, por ejemplo, sAPP\alpha y A\beta_{1-42}, se pueden cuantificar durante dos tiempos de medición (p.ej., 10 s y 3 min).

4.2 Muestras de los pacientes

Se conocía anteriormente que A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42} aparecen frecuentemente y con una concentración relativamente elevada en el CSF humano. Por otro lado, un quinteto de A\beta-péptido característico se puede detectar frecuentemente en CSF humano lumbar mediante A\beta inmunograma 1/2/SDS-PAGE tanto en carga directa después de la SDS/desnaturalización térmica como después de la inmunoprecipitación previa utilizando anticuerpos selectivos para el N terminal (fig. 3). Otros tres A\beta-péptidos de A\beta_{1-40} son evidentes en la parte superior (lado del cátodo) y se refirieron inicialmente como A\beta1-x^{a}, A\beta1-x^{b} y A\beta1-x^{c} y se pudo identificar por A\beta inmunograma/IPG 2D-PAGE con la comigración de A\beta-péptidos sintéticos como A\beta_{1-37/38/39} (fig. 2). Los A\beta-péptidos 1-37, 1-38 y 1-39 no son detectables en el CSF por A\beta inmunograma/SDS-PAGE en la inmunoprecipitación selectiva del carbono terminal contra 1-40 y 1-42. Además de los A\beta-péptidos 1-33, 1-34 y 1-35, fue posible detectar los A\beta-péptidos 1-37/38/39 en CSF humano mediante MALDI-TOF. Los A\beta-péptidos 1-33/1-34 y 1-35 se detectan generalmente sólo en el límite de detección, o son indetectables, en el A\beta inmunograma/SDS-PAGE superior (lado del cátodo) de 1-37 en CSF de pacientes. Los A\beta-péptidos 1-37, 1-38, 1-39, 1-40 y 1-42 se correlacionan elevada y significativamente, como es evidente en la fig. 10. Esto indica una regulación enzimática próxima de su producción. Los A\beta-péptidos 1-37, 1-38 y 1-39 sintéticos no estaban todavía disponibles cuando se investigaron los primeros grupos de pacientes (NCD-1, AD-1, NDC-2^{CP}). En este caso por lo tanto la proporción de A\beta_{1-42} a A\beta_{1-38} se encontró de las proporciones de las unidades de área medidas por densitometría para las respectivas bandas en un carril de gel. En comparación, la proporción A\beta_{1-42}/A\beta_{1-40} se expresó asimismo vía las unidades de área. Ya que A\beta_{1-38}, A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42} muestran, a la misma concentración y a las mismas condiciones en el inmunograma obtenido con el equipo Western, una intensidad diferente de la señal ECL, las proporciones de las unidades de área no se pueden equiparar con las proporciones correspondientes de las concentraciones del A\beta-péptido encontrados vía la línea de calibración.

En algunos pacientes con AD, es detectable abajo (anódicamente) una banda adicional A\beta_{1-41} con el factor de retención (Rf) de A\beta_{2-42} mediante A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE y cámara CCD (Fig 23a). Fue posible identificar esta banda en el CSF en AD como A\beta_{2-42} después de la inmunoprecipitación previa (RIPA-IP, mAb 1E8) mediante A\beta inmunograma 2/IPG 2D-PAGE y cámara CCD (fig. 24 b). Hasta la fecha no ha sido posible detectar A\beta_{2-42} en pacientes de control sin demencia. Existe asimismo un incremento intracerebral masivo en A\beta_{2-42}, con una distribución típica en regiones de cerebro, en pacientes con AD esporádica, (véase 4.2.5). A\beta_{2-42} sintético no estaba todavía disponible para determinar los A\beta-péptidos en el CSF para los grupos de pacientes mencionados en 3.9. En consecuencia, no hay datos cuantitativos de A\beta_{2-42} disponibles para estos pacientes. Sin embargo, desde entones se ha medido otro grupo de pacientes que todavía no se ha mencionado en 3.9. A\beta_{2-42} fue detectable en algunos de los pacientes con AD-4, en algunos pacientes con enfermedades de demencia más que AD (nAD-4) y algunos pacientes con enfermedades de no demencia (NDC-4). Además, la proporción A\beta_{1-42}/A\beta_{1-40} se redujo significativamente en los pacientes A\beta_{2-42}-positivos comparados con otros pacientes.

4.2.1 NDC-1 y AD-1

La tabla 12 proporciona los datos clínicos y las mediciones individuales para los pacientes y la tabla 13 resume las características de los grupos de pacientes AD-1 y NDC-1. Las muestras de CSF se analizaron por inmunograma 1/A\beta SDS-PAGE y se evaluaron densitométricamente las películas.

La reducción significativa de A\beta1-42 de CSF lumbar humano en pacientes con AD-1 comparada con NDC-1 fue evidente en la fig. 4. A\beta_{1-40} se reduce probablemente de forma significativa en AD-1, pero no hasta el extremo evidente para A\beta_{1-42} (véase tabla 14). En la misma medida, la proporción A\beta_{1-42}/A\beta_{1-40} se reduce elevadamente de forma significativa (fig. 5, tabla 14). La probable reducción elevadamente significativa de la proporción A\beta_{1-42}/A\beta_{1-38} no se ha descrito hasta la fecha (fig. 6, tabla 14). Los límites para la comparación de AD-3 versus el grupo NDC-3 se encontraron para A\beta_{1-42} y las dos últimas proporciones de A\beta-péptido vía las respectivas "características de operación del receptor (ROC)" (tabla 15). Fue posible diferenciar los grupos de pacientes AD-1 versus NDC-1 con un límite de 802,5 pg/ml A\beta_{1-42} con una especificidad del 74% y una sensibilidad del 87%. La proporción A\beta_{1-42}/A\beta_{1-40} posee una especificidad de diagnóstico del 71% y una sensibilidad del 93% para diferenciar los grupos AD-1 versus NDC-1. La eficacia y sensibilidad correspondientes para la proporción A\beta_{1-42}/A\beta_{1-38} es 84% y 0,86%.

Se investigó comparativamente A\beta_{1-42} después de la inmunoprecipitación (IP sin detergente, mAb 6E10) y el A\beta inmunograma 1/SDS-PAGE con la evaluación densitométrica de las películas. Como es evidente de la fig. 7 y de la tabla 14, la diferenciación por A\beta_{1-42} de los grupos de pacientes AD-1 y NDC-1 es menos buena que el anterior IP. La concentración de A\beta_{1-42} encontrada en el CSF después de la inmunoprecipitación y el A\beta inmunograma 1/SDS-PAGE con la evaluación densitométrica de películas en un subgrupo de pacientes con AD-1 concuerda bien con la concentración encontrada utilizando ELISAA\beta_{1-42} comercial (Hulstaert et al., 1999) en AD-1 (tabla 13). Al mismo tiempo, el promedio ELISA en AD-1 (412 pg/ml) concuerda bien con los medios ELISA en AD (428 y 487 pg/ml) encontrados en un estudio multicentro internacional (Hulstaert et al., 1999).

La comparación de las concentraciones de A\beta_{1-42} e el CSF que depende del procedimiento de medición (SDS/desnaturalización térmica con A\beta inmunograma 1/SDS-PAGE versus inmunoprecipitación con A\beta inmunograma 1/SDS-PAGE o ELISA_{A\beta 1-42}) hace evidente que se puede extraer considerablemente más A\beta_{1-42} del CSF mediante SDS/desnaturalización térmica que mediante los procedimientos dependientes de anticuerpo (inmunoprecipitación y ELISA). Las concentraciones de A\beta_{1-42} en el CSF medidas en AD después de la SDS/desnaturalización térmica son en promedio 2,3 veces superiores comparadas con la inmunoprecipitación (IP sin detergente, mAb 6E10) y 1,8 veces superiores comparadas con el ELISA (sin detergente). Se muestra en lo sucesivo que esta diferencia entre ELISA y A\beta inmunograma 1/SDS-PAGE es incluso más elevada en los pacientes NDC (véase NDC-3).

4.2.2 NDC-3 y AD-3

La Tabla 19 proporciona los datos clínicos y mediciones individuales para los pacientes y la tabla 20 resume las características estadísticas de los grupos de pacientes AD-1 y NDC-1. Las muestras de CSF se analizaron por A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE y cámara CCD.

4.2.2.1 Dependencia de la concentración de A\beta-péptido en el CSF en el modo de preparación de la muestra

Las alícuotas de CSF de cinco pacientes en el grupo NDC-3 se investigaron comparativamente con inmunoprecipitación previa (RIPA-IP, mAb 1E8) y con recogida directa de las muestras (SDS/desnaturalización térmica) (véase la tabla 20). Las concentraciones de A\beta-péptido resultantes después de la SDS/desnaturalización térmica son algo más elevadas. Este efecto está marcado para A\beta_{1-38} y A\beta_{1-42} pero no alcanza el nivel de significancia. En consecuencia, los niveles de A\beta-péptido comparables se miden en el CSF con ambos procedimientos de tratamiento previo de la muestra cuando la inmunoprecipitación se lleva a cabo con detergentes. En contraste de esto mismo, el nivel de A\beta_{1-42} medido en 27 de los pacientes NDC-3 es aproximadamente 3 veces inferior con el ELISA A\beta_{1-42} comercial (sin detergente) comparado con la SDS/desnaturalización térmica y con el A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE con cámara CCD.

Se ha demostrado anteriormente (véase 4.2.1) para los pacientes del grupo AD-1 que cuando la inmunoprecipitación se lleva a cabo sin detergente las concentraciones medidas son claramente inferiores con la inmunoprecipitación (mAb 6E10) y A\beta inmunograma 1/SDS-PAGE y comparable con la ELISA A\beta_{1-42}.

Esto indica que A\beta_{1-42} está presente en el CSF humano en una fracción que sólo es accesible parcialmente a anticuerpos monoclonales sin tratamiento previo con detergentes.

Los detergentes utilizados son capaces de liberar péptidos de uniones proteína-péptido no covalentes -por ejemplo causadas por la interacción hidrofóbica. En consecuencia, los niveles más elevados de CSF de A\beta_{1-42} después de utilizar detergentes (SDS/desnaturalización térmica, RIPA-IP) comparados con los procedimientos que no utilizan detergentes (IP sin detergente, ELISAA\beta_{1-42}) están causados probablemente por una unión de elevada afinidad y enmascaramiento de epítopo de A\beta_{1-42} sobre otras proteínas o agregados de A\beta-péptido. Como se esperaba de la utilización de detergentes, la utilización del SDS de detergente iónico a concentraciones relativamente elevadas (0,5% p/v) y temperatura (95ºC) relativamente elevadas es incluso más eficaz que la mezcla de detergente RIPA.

Se ha demostrado en lo sucesivo que A\beta_{1-42} es sensible particularmente a la crioprecipitación comparada con A\beta_{1-40}, y muestra una diferencia específica para la enfermedad en el comportamiento de crioprecipitación en pacientes con AD y NDC (véase 4.2.4). El A\beta_{1-42} sintético, disuelto en una concentración comparable en agua, por contraste muestra claramente menos crioprecipitación. Esto hace probable que la reducción causada por crioprecipitación en A\beta_{1-42} de CSF humano deriva predominantemente de la proporción unida al agregado del péptido. En el caso de agregados hidrofóbicos comparativamente - por ejemplo complejos que contienen lipoproteína- no sería sorprendente una pérdida por medio de la crioprecipitación. En este contexto, se muestra a continuación (4.2.4) que los pacientes positivos en \varepsilon4 del grupo NDC-3CP muestran una velocidad particularmente elevada de la reducción relacionada con CP en A\beta_{1-42} y posee niveles de CSF que son aproximadamente tan bajos como los de los pacientes AD-3CP positivos en \varepsilon4. Aproximadamente se han demostrado en lo sucesivo niveles de CSF de A\beta_{1-42} igualmente bajos para pacientes de los grupos OND-3\varepsilon4plus y AD-3\varepsilon4plus.

4.2.2.2 A\beta-péptidos en el plasma

El quinteto A\beta-péptido fue asimismo detectable en el plasma mediante inmunoprecipitación y A\beta inmunograma/SDS-PAGE con cámara CCD. Las concentraciones de plasma son de 30 a 60 veces inferiores comparadas con el CSF, y cada uno de los dos compartimientos muestran modelos específicos de proporciones en porcentaje de los A\beta-péptidos. En particular, la proporción A\beta_{1-42}/A\beta_{1-38} es diferente específicamente en CNS: CSF 0,80 (0,79-0,92), plasma 1,70 (1,69-1,75); media (cuartil).

4.2.2.3 Modelos de A\beta-péptido específicos de la enfermedad y efecto del genotipo ApoE

La Fig. 8 muestra en la sección A las concentraciones de los A\beta-péptidos 1-37/38/39/40/42 en CSF humano en los grupos de pacientes OND-3, CID-3 y AD-3. La sección B muestra la proporción de las especies de A\beta-péptido respectivas como un porcentaje del total de todos los A\beta-péptidos. La representación logarítmica se eligió para que fuera capaz de representar comparativamente las diferencias distintas en los niveles de CSF. Se observa con las concentraciones de CSF de los A\beta-péptidos que el segundo A\beta-péptido más corriente en CSF humano después de A\beta_{1-40} no es A\beta_{1-42} sino A\beta_{1-38}. Además, A\beta_{1-42} se reduce en AD-3. La concentración de A\beta-péptido total investigada en los grupos es sustancialmente idéntica. Por otro lado, se vuelven evidentes las diferencias considerablemente más distintas entre los grupos al considerar las proporciones en porcentajes de los A\beta-péptidos:

\bullet CID-3 y AD-3 muestran proporciones incrementadas de A\beta_{1-38}% y A\beta_{1-39}% comparadas con OND-3

\bullet A\beta_{1-40}% se incrementa significativamente de forma elevada en AD-3

\bullet A\beta_{1-42}% se reduce significativamente de forma elevada en AD-3 y diferencia los pacientes AD claramente mejor que la concentración relevante de A\beta-péptido.

Es conocido de la literatura que existe a menudo la sobreexpresión de A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42} en formas familiares de AD con mutaciones puntuales de APP cerca del sitio de escisión de la \beta-secretasa, mientras que con las mutaciones cerca del sitio de escisión de la \gamma-secretasa existe un incremento en A\beta_{1-42}, y la proporción A\beta_{1-42} a A\beta_{1-40} aumenta notablemente. Puede por lo tanto asumirse que los cambios específicos en la enfermedad en la actividad de la \gamma-secretasa se pueden ilustrar frecuentemente en consideración de las proporciones en porcentaje de los A\beta-péptidos.

Los subgrupos OND-3\varepsilon4minus, OND-3\varepsilon4plus y AD-3\varepsilon4plus se comparan en las figs. 9 A y B según se describe en la fig. 8. De este modo es posible diferenciar entre efectos dependientes de \varepsilon4 y AD en el modelo de A\beta-péptido en el CSF. Existe una tendencia para todos los A\beta péptidos a reducirse en el CSF en OND-3\varepsilon4plus comparado con OND-3\varepsilon4minus, y por consecuencia asimismo la concentración total del A\beta-péptido (fig. 9A). Dentro del quinteto A\beta-péptido, se marca particularmente la reducción en A\beta_{1-42}. Por otro lado, existe una reducción selectiva en A\beta_{1-42} en AD-3\varepsilon4plus, aunque en la misma extensión que en OND-3\varepsilon4plus. La cantidad total de los A\beta-péptidos no se reduce en este caso (fig. 9A). No es posible de este modo para los pacientes NDC-3 positivos en \varepsilon4 ser separados de los AD-3 positivos en \varepsilon4 solamente por la determinación de A\beta_{1-42} en CSF. Sin embargo, es posible vía las proporciones en porcentaje de los A\beta-péptidos (fig. 9B). Debido a la reducción selectiva en A\beta_{1-42} en AD-3\varepsilon4plus, la reducción en A\beta_{1-42}% es particularmente mayor en este caso, y el grupo AD-3\varepsilon4plus se puede separar mediante este parámetro sin superposición de los grupos OND-3\varepsilon4plus y OND-3\varepsilon4minus. Al mismo tiempo, la proporción en porcentaje de A\beta_{1-40} particularmente se incrementa mayormente en AD-3\varepsilon4plus.

Como es evidente de la matriz de correlación en la fig. 10, el quinteto de A\beta-péptido en el CSF se correlaciona íntimamente uno con otro, y las proporciones en porcentajes de los A\beta-péptidos y su concentración total poseen sorprendentemente coeficientes bajos de variación para los parámetros biológicos. Estos descubrimientos sugieren que existe una regulación enzimática estrecha de la concentración de los cinco A\beta-péptidos mediante \beta- y \gamma-secretasas. En este contexto, se demuestra en lo sucesivo (4.5.2) que, además de A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42}, existe una reducción particularmente pronunciada en la producción de los A\beta-péptidos truncados en el carboxi terminal mediante inhibidores sintéticos de la \beta- y \gamma-secretasas.

4.2.2.4 Modelos específicos de enfermedad de las proporciones en porcentaje de los A\beta-péptidos Descripción de los casos individuales en los grupos de pacientes

Se puede inferir de la fig. 11-13 que los pacientes con AD-3 y CID-3 se pueden diferenciar de los pacientes OND-3 vía A\beta_{1-38}%, A\beta_{1-40}% y A\beta_{1-42}%.

La fig. 11 demuestra una correlación negativa significativa entre A\beta_{1-38}% y A\beta_{1-42}% para los pacientes AD-3. El paciente AD-3 143 no se incluyó en el cálculo de la regresión lineal y se identifica aquí, asimismo como en lo sucesivo (véase figs. 12 y 13), como un valor atípico. Este paciente mostró clínicamente una etapa temprana de AD (MMSE 27/30). Se ha discutido una pseudodemencia depresiva en el diagnóstico diferencial en la historia.

La gravedad de la demencia incrementa en la dirección de la punta de la flecha en las líneas de regresión. La asociación entre las proporciones en porcentaje de los A\beta-péptidos y la gravedad de la demencia serán tratados en más detalle en lo sucesivo (véase figs. 14 y 15). Con una concentración límite de A\beta_{1-42}% = 8,5 es posible separar el grupo AD-3 de los grupos CID-3 y OND-3 sin superposición. La asociación específica entre A\beta_{1-38}% y A\beta_{1-42}% en AD sugiere, sin embargo, que los pacientes con AD se pueden diferenciar incluso mejor mediante una función similar a la línea de regresión entre A\beta_{1-38}% y A\beta_{1-42}%. Esto posee una relevancia directa para el diagnóstico neuroquímico de AD, ya que, por ejemplo, un paciente con A\beta_{1-42}% = 9,5 sería diagnosticado como AD vía la línea de regresión como línea límite si, al mismo tiempo, este valor para A\beta_{1-38}% es 13,5, según se predice por la línea de regresión (véase fig. 11). Una afirmación correspondiente se aplica a la asociación, mostrada a continuación, entre las proporciones Ab1-30/A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42}/A\beta_{1-38} (fig. 16). Los límites de concentración para diferenciar el grupo CID-3 son: A\beta_{1-38}% = 15,5 y A\beta_{1-42}% = 9,6%. Se clasificaron seis pacientes de forma incorrecta como CID-3 de esta manera. Estos pacientes se identifican por su código. Vale la pena observar que en un análisis detallado de los descubrimientos clínicos para algunos de estos pacientes (3/6) llega a ser probable un procedimiento inflamatorio crónico retrospectivamente.

La Fig. 12 muestra A\beta_{1-40}% como una función de A\beta_{1-42}%. Aunque la correlación específica en AD entre estos parámetros es significativa (sin paciente 143), es menos próxima. La gravedad de la demencia aumenta en la dirección de la flecha.

Los límites de concentración para AD-3 son: A\beta_{1-40}% =63 y A\beta_{1-42}% = 8,5.

La fig. 13 muestra A\beta_{1-40}% como una función de A\beta_{1-38}%.

Las líneas límite A\beta_{1-38}% = 15,5 y A\beta_{1-40}% = 60,0 se refieren al grupo CID-3. Una correlación específica en AD entre estos parámetros es significativa (sin paciente 143). La gravedad de la demencia aumenta en la dirección de la flecha. Las líneas límite A\beta_{1-38}% = 16,0 y A\beta_{1-40}% = 63 definen pacientes AD-3 con demencia grave. Vale la pena observar en la presente memoria que ningún paciente NDC-3 es superior a A\beta_{1-40}% = 63 y la interceptación de este línea límite con la línea de regresión predice simultáneamente la línea límite A\beta_{1-38}% = 16.

Está claro a partir de la fig. 14 que los pacientes AD-3 con A\beta_{1-38}% < 16,0 o A\beta_{1-40}% > 63 muestran principalmente demencia grave (MMSE \leq 10), pero la gravedad de la demencia es de intermedia a media (MMSE > 10). Esta asociación está particularmente marcada en pacientes con valores simultáneamente inferiores y superiores a los dos límites (fig. 14; véase asimismo fig. 13).

La matriz de correlación para la asociación entre las proporciones en porcentaje de los A\beta-péptidos y la gravedad de la demencia se muestra en la fig. 15. Se han encontrado asociaciones significativas para A\beta_{1-37}% y A\beta_{1-40}%. Vale la pena observar que el grupo de A\beta-péptidos truncados en el carboxi terminal muestra, en contraste con A\beta_{1-40}%, coeficientes de correlación positivos para la asociación última. No se ha encontrado asociación significativa entre las concentraciones absolutas de los A\beta-péptidos en el CSF y la gravedad de la demencia, es decir otra vez las asociaciones específicas a la enfermedad se vuelven claras sólo en el examen de las proporciones en porcentajes de los A\beta-
péptidos.

4.2.2.5 Modelos específicos de la enfermedad de las proporciones de A\beta-péptido Descripción de casos individuales en los grupos de pacientes

Las proporciones de los A\beta-péptido A\beta_{1-38}/A\beta_{1-40}, A\beta_{1-42}/A\beta_{1-38} y A\beta_{1-42}/A\beta_{1-40} permiten la diferenciación entre los grupos AD-3, CID-3 y OND-3. Esto posee la ventaja que ahora es necesario cuantificar sólo tres A\beta-péptidos para diferenciar los tres grupos de pacientes, pero lleva a cierta pérdida de eficacia de separación en el diagnóstico. De este modo es obvio desarrollar un triplete ELISA (A\beta_{1-38}, A\beta_{1-40}, A\beta_{1-42}) para el diagnóstico neuroquímico de la demencia y la identificación de pacientes con enfermedades CNS inflamatorias crónicas. Se pretendió combinar este enfoque con una preparación de muestra dependiente del detergente (véase 4.2.4).

La fig. 16 muestra A\beta_{1-38}/A\beta_{1-40} como una función de A\beta_{1-42}/A\beta_{1-38}. Existe una asociación significativa y específica entre estos dos parámetros en AD. La gravedad de la demencia aumenta en la dirección de la punta de la flecha de la línea de regresión (véase fig. 18). El paciente 143 se identifica otra vez como un valor atípico vía la línea límite A\beta_{1-38}/A\beta_{1-40} = -0,5 (A\beta_{1-42}/A\beta_{1-38}) + 0,52. Los otros pacientes AD-3 se clasifican correctamente y ningún paciente NDC-3 se asigna incorrectamente al grupo AD-3. Las líneas límite A\beta_{1-38}/A\beta_{1-40} = 0,26 y A\beta_{1-42}/A\beta_{1-38} = 0,57 se refieren al grupo CID-3.

La fig. 17 muestra A\beta_{1-38}/A\beta_{1-40} como una función de A\beta_{1-42}/A\beta_{1-40}. Existe una asociación significativa y específica entre estos dos parámetros en AD. La gravedad de la demencia aumenta en la dirección de la punta de la flecha de la línea de regresión (véase fig. 18). Todos los pacientes AD-3 se clasifican correctamente vía la línea límite

\hbox{A \beta_{1-42} /A \beta_{1-42} 
=}

0,14 y ningún paciente NDC-3 se asigna incorrectamente al grupo AD-3. Las líneas límite A\beta_{1-38}/A\beta_{1-40} = 0,26 y A\beta_{1-42}/A\beta_{1-40} = 0,16 se refieren al grupo CID-3.

La fig. 18 deja claro que los pacientes AD-3 con una proporción A\beta_{1-38}/A\beta_{1-40} menor de 0,26 en promedio muestran AD grave (MMSE \leq 10), pero sino muestran demencia de moderada a medio grave (MMSE > 10).

4.2.3 NDC-2^{CP}

Hasta la fecha se ha encontrado la concentración reducida de A\beta_{1-42} en el CSF de pacientes con AD en muestras que ya se habían congelado previamente. Por lo tanto la primera investigación en pacientes en el grupo NCD-2^{CP} fue si el A\beta_{1-42} en el CSF es sensible particularmente a la crioprecipitación comparado con otros A\beta-péptidos. En este contexto, el CSF obtenido fresco se dividió en alícuotas. Una alícuota se congeló sin tratar a -80ºC. La otra alícuota se utilizó para recoger el SDS-SB que se había introducido como sustancia seca en los vasos de muestra Eppendorf. Esta alícuota se congeló después de la SDS/desnaturalización térmica. El análisis comparativo mediante A\beta immunograma 1/SDS-PAGE y la evaluación densitométrica de películas tuvo lugar por lo menos 24 horas después del almacenamiento a -80ºC. Se investigaron diez pacientes de control neuropsiquiátrico sin enfermedad de Alzheimer. Fue posible determinar A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42} en nueve de estos pacientes. La evaluación solo de A\beta_{1-40} fue posible en un paciente.

La tabla 16a deja claro que una proporción del péptido se pierde debido a la crioprecipitación, acentuada selectivamente para A\beta_{1-42} con una gran variación interindividual. La proporción en porcentaje de A\beta_{1-42} que se pierde en el CSF congelado sin tratar cuando la crioprecipitación no se reduce por tratamiento previo con SDS/desnaturalización térmica se calculó como sigue:

%\Delta A\beta _{1-42} = ([A\beta _{1-42}nativa] _{conc.} - [A\beta _{1-42}SDS] _{conc.}) / [A\beta _{1-42}SDS] _{conc.} \ x \ 100.

Un valor de "-10" para %\DeltaA\beta_{1-42} significa, por ejemplo, que A\beta_{1-42} se redujo en un 10% debido a la crioprecipitación por medio de la congelación de CSF no tratado comparado con el tratamiento previo "protectivo" con la SDS/desnaturalización térmica. Ya que las muestras no se pudieron medir antes de la congelación, no se puede descartar que una proporción adicional de A\beta_{1-42} se pierda en las muestras debido a la crioprecipitación y no se puede evitar incluso mediante el tratamiento previo con la SDS/desnaturalización térmica.

La tabla 16b deja claro que A\beta _{1-42} se reduce en promedio mediante aproximadamente 30% debido a la CP después de la congelación de CSF sin tratar (\DeltaA\beta42%: -29,9 \pm 10,9, media \pm SD; p=0,005). El absoluto máximo observado y el porcentaje que disminuye en A\beta_{1-42} son respectivamente -798,3 pg y -44,5%. La pequeña caída en A\beta_{1-40} (\DeltaA\beta40%: -3,5 \pm 6,3; media \pm SD; p=n.s.) es, por otro lado, no significativa, pero correspondientemente a la proporción A\beta_{1-42}/A\beta_{1-40} (\DeltaA\beta42/40%: -27,0 \pm 10.2; media \pm SD; p=0,008).

4.2.4 NDC-3^{CP} y AD-3^{CP}

Fue posteriormente investigado en los grupos de pacientes NDC-3^{CP} y AD-3^{CP} si surgían diferencias específicas de la enfermedad en la crioprecipitación de A\beta_{1-42} en el CSF. Se cuantificó el A\beta_{1-42} en CSF mediante A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE y cámara CCD. El tratamiento previo diferencial tuvo lugar según se ha dicho para el grupo NDC-2^{CP}.

Las concentraciones de A\beta_{1-42} como una función del tratamiento previo de la muestra se resumen para los dos grupos de pacientes en la tabla 21.

La fig. 19 muestra las concentraciones de A\beta_{1-42} después de congelar sin tratar CSF como una función (A\beta_{1-42}nativa) de la crioprecipitación. Fue posible determinar A\beta_{1-42} en CSF congelado sin tratar para separar los grupos de pacientes NDC-3^{CP} y AD-3^{CP} significativamente (p=0,0013). Sin embargo, la fig. 19 muestra una superposición clara de los dos grupos de pacientes. En consecuencia a esto, 6/15 de los pacientes en el grupo NDC-3^{CP} poseen niveles de A\beta_{1-42} en el CSF inferiores a la concentración límite (2100 pg/ml) del grupo AD-3^{CP}. Por otro lado, sólo un paciente NDC-3^{CP} se asigna incorrectamente al grupo AD-3CP cuando el límite de la concentración de \DeltaA\beta_{1-42}% (-17% a -20%) se toma adicionalmente en cuenta. Al mismo tiempo, todos los pacientes del grupo AD-3^{CP} se asignan correctamente.

La reducción en promedio causada por la crioprecipitación en A\beta_{1-42} es -24,6% \pm 18,8 (media \pm SD) en NDC-3^{CP}, lo que concuerda bien con los datos mencionados anteriormente para los pacientes NDC-2^{CP} (-29,9 \pm 10,9, media \pm SD). Está claro otra vez que existe una variación interindividual considerable en la extensión de la reducción causada por la crioprecipitación en A\beta_{1-42} en el CSF de los pacientes NDC-3^{CP}. La extensión de la reducción causada por crioprecipitación en A\beta_{1-42} en los pacientes NDC-3^{CP} es aparentemente determinada esencialmente por la presencia del alelo ApoE \varepsilon4; 3 pacientes de los 4 pacientes con la reducción mayor causada por CP en A\beta_{1-42} (\DeltaA\beta_{1-42}% < -40%) llevan un alelo ApoE \varepsilon4 (véase fig. 19).

En contraste, los pacientes AD muestran una reducción negligible causada por crioprecipitación en A\beta_{1-42}, y es evidente de la fig. 19 que los valores %\DeltaA\beta_{1-42} en este caso son dispersados aproximadamente en el eje cero (-1,6 \pm 10,2, media \pm SD). En la misma medida, la comparación del grupo NDC-3^{CP} versus el grupo AD-3^{CP} es significativa para \DeltaA\beta_{1-42}% (p=0,0025). Vale la pena observar que la reducción causada por CP en A\beta_{1-42} está ausente en AD-3^{CP} aunque 9/11 de los pacientes son positivos en \varepsilon4. El genotipo ApoE de dos pacientes AD-3^{CP} es desconocido. Se observa asimismo que los niveles de A\beta_{1-42} en el CSF de los pacientes AD-3^{CP} y NDC-3^{CP} con por lo menos un alelo \varepsilon4 son aproximadamente igualmente inferiores. Esta asociación fue asimismo clara en lo anterior en la comparación de los niveles de A\beta_{1-42} en el CSF en los grupos OND-3\varepsilon4plus y AD-3\varepsilon4plus (véase 4.2.2.3).

Al mismo tiempo, estos dos subgrupos de pacientes difieren particularmente de forma notable en su reducción causada por CP en A\beta_{1-42}. Esto es particularmente mayor en los pacientes NDC-3CP positivos en \varepsilon4 y está casi completamente ausente de los pacientes AD-3CP positivos en \varepsilon4. En consecuencia, los pacientes positivos en \varepsilon4 del grupo AD-3^{CP} poseen, en contraste a los pacientes positivos en \varepsilon4 del grupo NDC-3^{CP}, niveles bajos de A\beta_{1-42} en el CSF a pesar de la SDS/desnaturalización térmica "protectora" antes de la congelación. En la misma medida, los dos grupos de pacientes AD-3^{CP} y NCD-3^{CP} deberían diferenciarse considerablemente mejor vía la determinación de A\beta_{1-42} en el CSF después del tratamiento previo con SDS/desnaturalización térmica (A\beta_{1-42}SDS). La fig 20 confirma este supuesto:

La reducción causada por CP en A\beta_{1-42} se reduce por la proporción que se puede evitar mediante la SDS/desnaturalización térmica "protectora", llevando a los pacientes NDC-3^{CP} ahora a poseer niveles distintamente superiores a los niveles de A\beta_{1-42} en el CSF (A\beta_{1-42}SDS) en promedio. Los niveles de A\beta_{1-42} en el CSF en AD-3CP por otro lado permanecen bajos, invariables sustancialmente.

En la misma medida, el nivel de significancia de la comparación del grupo NDC-3^{CP} versus el AD-3^{CP} está notablemente mejorada (p=1,81 x10^{-6}) en la diferenciación de los grupos vía A\beta_{1-42}SDS. Todos los pacientes NDC (15/15) y sólo un paciente AD (1/11) están ahora por encima de la concentración límite de A\beta_{1-42}SDS = 2100 pg/ml.

Como se ha mencionado anteriormente, este efecto es particularmente pronunciado en los vehículos de los alelos \varepsilon4 dentro del grupo NDC-3^{CP}. Sin embargo, las figs. 19 y 20 dejan claro que este efecto no se determina exclusivamente por la presencia del alelo \varepsilon4. Algunos pacientes con, por ejemplo, el genotipo ApoE 3/3 probablemente muestran una reducción pronunciada causada por CP en A\beta_{1-42}, que se puede reducir por SDS/desnaturalización térmica antes de congelar. En resumen, los límites del A\beta-péptido pueden afirmarse como sigue:

A\beta_{1-42}nativa = 2100 pg/ml y %\DeltaA\beta_{1-42} = -17%: Todos los pacientes AD (11/11) se clasifican correctamente y un paciente NDC (1/15) se clasifica incorrectamente.

A\beta_{1-42}nativa = 2300 pg/ml y %\DeltaA\beta_{1-42} = -20%: todos los pacientes AD (11/11) se clasifican correctamente y dos pacientes NDC (2/15) se clasifican incorrectamente.

Y

A\beta_{1-42}SDS = 2100 pg/ml y %\DeltaA\beta_{1-42} = -17%: 10/11 de los pacientes AD-3^{CP} se clasifican correctamente y ningún paciente NDC-3^{CP} (0/15) se clasifica incorrectamente.

A\beta_{1-42}SDS = 2300 pg/ml y %\DeltaA\beta_{1-42} = -20%: todos los pacientes AD (11/11) se clasifican correctamente y los dos pacientes NDC (2/15) se clasifican incorrectamente.

La determinación de %\DeltaA\beta_{1-42} además de A\beta_{1-42}SDS se espera que mejore el diagnóstico neuroquímico adicionalmente:

Con un límite de A\beta_{1-42}SDS de 2300 pg/ml en lugar de 2100 pg/ml, tres pacientes NDC (3/15) se clasifican incorrectamente y todos los pacientes AD se clasifican correctamente. Si el límite %\DeltaA\beta_{1-42} = -20% se tiene en cuenta adicionalmente, sólo dos pacientes NDC (2/15) se clasifican incorrectamente y todos los pacientes AD se clasifican correctamente. De este modo es posible para la concentración umbral de A\beta_{1-42}SDS aumentar en 200 pg/ml sin reducir simultáneamente la especificidad del diagnóstico.

En resumen, es posible deducir de los descubrimientos mencionados anteriormente sobre la reducción causada por CP en los A\beta-péptidos las siguientes hipótesis:

En el CSF humano, A\beta_{1-42} está más presente que A\beta_{1-40} en una fracción que se puede reducir de una forma dependiente de CP. A\beta_{1-42} se puede liberar por lo menos parcialmente de esta fracción mediante la utilización de detergentes, y la reducción causada por CP se puede reducir. Esta fracción de unión de A\beta_{1-42} comprende de forma comparativa probablemente complejos de peso molecular elevado hidrofóbicos que implican A\beta_{1-42} y probablemente otras proteínas (p.ej. lipoproteínas).

(Nota: fue posible mostrar mediante el análisis de fracciones de la filtración de gel (SEC-FPLC) de CSF humano por medio de A\beta inmunograma/SDS-PAGE que se transportó una proporción considerable, acentuada selectivamente para A\beta_{1-42}, en una fracción de peso molecular elevado).

En AD - en contraste a NDC - el A\beta_{1-42} se puede desplazar escasamente desde esta fracción incluso mediante detergentes fuertes, indicando una composición específica para AD de este complejo. En este caso, se debería esperar que existiese una reducción específica en A\beta_{1-42} en el CSF en AD incluso si las muestras se fuesen a medir directamente después del tratamiento con el detergente, es decir sin congelación previa. De este modo, las muestras se podrían almacenar después del tratamiento de detergente a temperatura ambiente en presencia de SDS y de inhibidores de proteasa (3.1.3.1b, SDS-SB-3) hasta que se midieran, porque serían muy protegidas de forma muy eficaz de la autoagregación, precipitación, actividad de proteasa no específica y microcolonización.

Se puede asumir, alternativamente, que la reducción en A\beta_{1-42} en AD es esencialmente debido al factor que el CSF contiene menos A\beta_{1-42} en total en AD.

Cuando existe una unión de A\beta_{1-42} al complejo estable al detergente de elevada afinidad, el péptido se escapa de forma creciente del catabolismo enzimático en esta unión. Este complejo por lo tanto representa asimismo un objetivo para el desarrollo de medicamentos para la enfermedad de Alzheimer, porque las sustancias que compiten con la unión de los A\beta-péptidos a este complejo podrían proporcionar de forma incrementada los A\beta-péptidos para el catabolismo enzimático. La reducción de A\beta_{1-42} en el CSF de algunos pacientes con enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, otra amiloidosis o enfermedad caracterizada por plegado proteínico del CNS, sugiere que este complejo podría poseer una composición comparable en los dos desórdenes.

Los descubrimientos mencionados anteriormente son asimismo relevantes al diagnóstico temprano o diagnóstico preclínico de AD. La cuestión que surge aquí es si los pacientes que a pesar de la SDS/desnaturalización térmica "protectora" (A\beta_{1-42}SDS) muestran niveles bajos de A\beta_{1-42} en el CSF y son de notar que simultáneamente debido a la disminución pequeña causada por CP en A\beta_{1-42} (\DeltaA\beta_{1-42}%) poseen particularmente un elevado riesgo de desarrollar AD. Esta cuestión se podría responder mediante un estudio prospectivo de pacientes con desórdenes cognitivos medios (ICD10 F06,7), porque estos pacientes desarrollan una AD dentro de dos años en hasta un 30% de los casos. En tales casos una punción de CSF única con la evaluación posterior del curso (clínico, neuropsicología, imagen) sería suficiente porque el valor predictivo de los parámetros se podría determinar retrospectivamente.

Esto sugiere que en principio una alícuota A (congelada sin tratar) y una alícuota B (SDS/desnaturalizacón térmica antes de congelar) de la muestra de CSF se debería obtener para cada paciente. Es suficiente donde sea apropiado para las muestras enfriarse por ejemplo a 0ºC mientras se monitoriza la temperatura de la muestra individual de una manera estandardizada.

En general será posible combinar la preparación de la muestra diferencial descrita anteriormente con los procedimientos ELISA o la utilización de la espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) para determinar A\beta_{1-42} en CSF.

La sensibilidad de detección en el ELISA BioSource para determinar A\beta_{1-42} en CSF humano es, por ejemplo, 10 pg/ml. Esta sensibilidad de detección permite que el CSF SDS/desnaturalizado térmicamente se diluya a por lo menos cinco veces antes de la medición en la carga de 100 \mul de muestra. La concentración resultante de 0,1% SDS (p/v) no afecta adversamente según nuestros resultados al anticuerpo de captura del N-terminal utilizado en la primera etapa en esta ELISA. Esto puede asimismo demostrarse análogamente para los anticuerpos selectivos para el N-terminal 1E8 y 6E10 utilizados en RIPA-IP.

En el FCS con correlación cruzada utilizando anticuerpos selectivos a N-terminal y C-terminal marcados con fluorescencia, la intensidad de señal es proporcional a los A\beta-péptidos unidos en tales agregados. La sensibilidad del procedimiento otra vez permite que la muestra después de la SDS/desnaturalización térmica se diluya a concentraciones SDS de, por ejemplo, 0,1% p/v. Si A\beta_{1-42} se une en una manera estable al detergente a agregados de peso molecular elevados selectivamente en AD, el tratamiento previo de las muestras de CSF con detergentes aumentará la especificidad de la medición porque los A\beta-péptidos se liberan de los agregados de peso molecular elevado en pacientes NDC en contraste a los pacientes AD. La reducción disminuida en la señal de fluorescencia en el FCS (correlación cruzada) después del tratamiento de detergente en pacientes con AD comparada con pacientes con NDC podría ser de este modo relevante para el diagnóstico neuroquímico de AD.

4.2.5 Homogenados de cerebro de pacientes con AD, demencia frontotemporal, demencia de cuerpo de Lewy y controles

Se homogenizaron en presencia de regulador de detergente RIPA (3.4.6) tejido de cerebro (córtex frontotemporal, cerebelo) de pacientes con AD, demencia frontotemporal (FTD), demencia del cuerpo de Lewy (LBD) y controles de no demencia. Se llevó a cabo posteriormente una inmunoprecipitación en presencia de RIPA. Se detectaron A\beta_{1-38}, A\beta_{1-40}, A\beta_{1-42} y A\beta_{2-42} en una fracción extraíble de detergente RIPA de los A\beta-péptidos (figs. 21a, b). A\beta_{2-42} se identificó por análisis MALDI-TOF directamente de la membrana de transferencia (no se muestran los datos), A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE (fig. 23b) y A\beta IPG inmunograma 2/2D-PAGE (fig. 24c). A\beta_{2-42} se detecta asimismo en las muestras de CSF en AD (fig. 23a) y en los sobrenadantes de células de cultivos (fig. 23a, fig. 28a, b).

Los pacientes con AD se caracterizaron por comparación con controles de no demencia y los pacientes con FTD por un incremento masivo en A\beta_{1-42} y A\beta_{2-42}. Este incremento fue mucho más pronunciado en el córtex frontotemporal que en el cerebelo (fig. 22). Los pacientes con LBD mostraron aumentos en A\beta_{1-42} y A\beta_{2-42} que dependieron de un número de placas \beta-amiloides típicas de Alzheimer presentes adicionalmente, que se grabaron vía la clasificación CERAD (fig. 21b): los pacientes con LBD CERAD A tuvieron menos claramente A\beta_{1-42} y A\beta_{2-42} que los pacientes con LBD CERAD C.

En la enfermedad de Alzheimer valió la pena observar que las concentraciones de A\beta_{1-38} fueron comparativamente elevadas (figs. 21a, b). Al mismo tiempo valió la pena observar que hubo una expresión de A\beta_{1-38} en AD específica del tejido, porque A\beta_{1-38} fue menos claramente, o fue indetectable, en el cerebelo relativo al córtex frontotemporal y, además, una banda previamente no caracterizada se midió por debajo de A\beta_{1-38} en algunos pacientes (fig. 22). Ya que el corte carboxi terminal se efectúa por la \gamma-secretasa(s), esto es una evidencia de una posible diferencia en la expresión de \gamma-secretasa(s) específica del tejido. Ya que es conocido que los pocos cambios neuropatológicos típicos de Alzheimer se han encontrado en el cerebelo comparado con otras regiones del cerebro en AD, este descubrimiento podría ser de relevancia patofisiológica.

Las concentraciones extremadamente elevadas de A\beta_{2-42}, algunas veces al nivel de A\beta_{1-42}, en una preparación de cerebro extraíble en RIPA no se ha descrito previamente. En algunos pacientes hubo un incremento comparativo grande de A\beta_{1-40}.

De este modo el A\beta inmunograma/SDS-PAGE se puede utilizar para el diagnóstico diferencial neuropatológico de las enfermedades de demencia y, donde sea apropiado vía fenotipación bioquímica, contribuye a la diferenciación de los subgrupos de AD esporádico.

4.3 CSF de cisterna de conejos y cobayos

A\beta_{1-37/38/39} son detectables asimismo además de A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42} en el CSF de cisterna del cobayo adulto (fig. 25a) y del conejo (fig. 25b). La variación en las mediciones se reduce claramente si, en analogía a las muestras de los pacientes, se lleva a cabo la SDS/desnaturalización térmica antes de congelar las muestras. Este tratamiento previo de la muestra es relevante para proyectos para encontrar ingredientes activos utilizando cobayos o conejos como animal modelo porque ciertos efectos de sustancias (p.ej. inhibición de la secretasa) se pueden detectar de esta manera claramente con muy pocos animales en cada tratamiento y grupo de control.

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4.4 Secciones de tejido hipocámpico de cobayo adulto con cultivo de corto período

En cultivos de corto periodo de secciones de tejido hipocámpico de cobayo adulto existe secreción de A\beta_{1-37/38/39} además de A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42} en el sobrenadante, y detección intracelular de la misma si es posible (fig. 26).

4.5 Cultivo celular 4.5.1 Cultivo de pollo telencefálico primario

Ya que la secuencia de aminoácido de A\beta-péptido de pollo y la secuencia humana coinciden, se estableció un sistema de cultivo celular neuronal primario de vesículas cerebrales anteriores de embriones de pollo (véase 3.7). Resultó de esto que además de A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42} existe una liberación de A\beta-péptidos 1-37/38/39 truncados en el C terminal dentro de los sobrenadantes de cultivos celulares, y la distribución relativa de los A\beta-péptidos concuerda bien con la del CSF humano.

4.5.2 Línea celular de neuroglioma transgénico APP751_{Sw}

Una investigación comparativa se llevó a cabo sobre un modelo de A\beta-péptido en células de neuroglioma (H4) que se han transfectado con _{human}APP751_{Sw}. Las figs. 28 a y b muestran que en este caso también además de A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42}, existe una liberación de los A\beta-péptidos 1-37/38/39 truncados en el C terminal en los sobrenadantes de cultivos celulares. Se puede asimismo identificar A\beta_{2-42}. Después del tratamiento con inhibidores de \beta/\gamma-secretasas (inhibidor calpain I y II, calpeptin, MG132, leupeptin), además de A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42} existe asimismo una reducción en los A\beta-péptidos 1-37/38/39 truncados en el C terminal y en el N terminal A\beta_{2-42} (fig. 28a, b). La fig. 28b muestra la reducción dependiente de la dosis con inhibidor calpain 1.

En consecuencia se puede asumir que los A\beta péptidos 1-37/38/39 son, según se sabe para 1-40/42, producidos asimismo por el corte de \beta/\gamma-secretasa combinado. La reducción en 2-42 se puede deber a la inhibición de la actividad de \beta/\gamma-secretasa o deberse a un suministro reducido del sustrato (A\beta_{1-42}) para una aminopeptidasa N terminal posterior (pero véase a continuación).

Es evidente de las figs. 29 a y b que las cinéticas de inhibición de los A\beta-péptidos 1-37, 1-38 y 1-39 truncados en el C terminal difieren de las de A\beta_{1-40} y A\beta_{1-42}. La diferencia en las cinéticas está particularmente marcada para A\beta_{1-37}. Este descubrimiento indica que una heterogeneidad de la actividad de la \gamma-secretasa que es relevante para encontrar inhibidores de \gamma-secretasa selectivos se puede revelar a través del modelo de A\beta-péptido. Es de notar que el paradójico incremento de A\beta_{1-42} conocido de la literatura a concentraciones bajas de inhibidor no se correlaciona con un incremento de A\beta_{2-42}. Esto está en contra de una producción secundaria de A\beta_{2-42} de A\beta_{1-42}.

Se debe tener en cuenta una alternativa adicional para la producción de A\beta_{1-37}. Se ha descrito recientemente que la endopeptidasa neutral (NEP) se implica esencialmente a través del corte combinado 10/11 y 37/38 en el catabolismo de los A\beta-péptidos (Iwata et al., 2000). De este modo A\beta_{1-37} se podría asimismo producir por la combinación del corte de BACE y del corte de 37/38 NEP.

Lista de abreviaciones

A\beta-

\beta-amiloide

AD-

Enfermedad de Alzheimer

APP-

proteína precursora amiloide

FAD-

AD familiar, es decir, causada genéticamente

PS-1-

presenilina 1

PS-2-

presenilina 2,

Bis-

N,N'-metilenbisacrilamidas

Bicina-

N,N'-bis[2-hidroxietil]glicina

%T-

concentración total de monómero de acrilamida (p/v)

%C-

proporción de bis en la cantidad total de monómero de acrilamida (p/p)

A\beta SDS-PAGE-

electroforesis de gel de poliacrilamida de laurilsulfato de sodio \beta-amiloide

A\beta 2D-PAGE-

electroforesis de gel de poliacrilamida en dos dimensiones \beta-amiloide

IPG-

gradiente de pH inmovilizado

A\beta1-n-

A\beta_{1-n}

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Wiltfang J., Otto M., Rüther E., Kornhuber J. (1998) Klinisch-chemische Früh-und Differentialdiagnostik der Alzheimer Demenz, psycho 24, 726-31.

Wiltfang J., Esselmann H., Smirnov A., Maler M.J., Bleich S., Otto M., Bibl M., Rüther E., Kornhuber J. (2000) Therapieansätze in der Alzheimer-Demenz, Notfallmedizin 26, 246-51.

TABLA 1 Soluciones madre y reguladores para A\beta SDS-PAGE

1

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TABLA 2 Composición de geles peine, de apilado y resolventes para la A\beta SDS-PAGE

2

TABLA 3 Composición de los reguladores para la recogida de muestras (SDS-SB)

3

TABLA 4a Composición del IEF-SB

4

TABLA 4b Composición del gel cilíndrico IEF vehículo anfolito

5

TABLA 4c Composición del anolito y catolito para el IEF anfolito vehículo

6

TABLA 4d Composición del regulador de equilibrio IEF de la solución de agarosa IEF

7

TABLA 5a Composición del IPG-SB (regulador lisis) y regulador de rehidrogenación IPG

8

TABLA 5b Composición del regulador de equilibración IPG

9

1.

Incubar en regulador de equilibración IPG con 1% (p/v) DTT a temperatura ambiente agitando suavemente durante 10 min

2.

Incubar en regulador de equilibración en IPG con 4,8% (v/v) de yodoacetamida a temperatura ambiente agitando suavemente durante 10 min

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TABLA 5c Composición de la solución de agarosa IPG

10

TABLA 6 Composición del regulador RIPA

11

TABLA 7 Teñido de plata después de la fijación de glutaraldehído

12

TABLA 8 Composición de los reguladores de transferencia para el inmunograma obtenido con el equipo Western

13

TABLA 9a Soluciones madre para el inmunograma

14

TABLA 9b Reguladores, soluciones y anticuerpos para los inmunogramas 1 y 2 obtenidos con el equipo Western

15

TABLA 10a-d Constitución de los grupos con intersecciones de pacientes en común. NDC-3^{CP} es totalmente un subgrupo de NDC-3. AD-3^{Cp} es totalmente un subgrupo de AD-3

16

17

18

19

TABLA 11 A\beta inmunograma 1/SDS-PAGE de los A\beta-péptidos sintéticos después de que las muestras se han recogido directamente en el regulador de muestra de SDS-PAGE y la detección ECL mediante la exposición de películas: coeficientes de variación inter- e intraanalíticos

20

TABLA 12 A\beta inmunograma 1/SDS-PAGE de A\beta-péptidos en CSF humano CSF de NDC-1 y AD-1

21

TABLA 13 A\beta inmunograma/SDS-PAGE de los A\beta-péptidos en CSF lumbar humano CSF en NDC-1 y AD-1 después de que se hayan recogido las muestras en el regulador de muestra de SDS-PAGE o después de la inmunoprecipitación previa (subgrupo). Además, la concentración A\beta_{1-42} en el CSF en AD-1 se midió utilizando un ELISA_{A\beta 1-42} comercial; características estadísticas: N válido, media, intervalo de confianza 95%, mediana, cuartil inferior/superior, desviación estándar

22

TABLA 14 Comparación de los grupos de pacientes de AD-1 y NDC-1 mediante el ensayo Mann-Whitney U

23

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TABLA 15 Sinopsis de las características del diagnóstico (especificidad, sensibilidad, índice Youden máx., límites de concentración) para A\beta_{1-42} y proporciones relevantes de A\beta-péptido para diferenciar los grupos de pacientes AD-1 y NDC-1

24

TABLA 16a A\beta inmunograma 1/SDS-PACE en A\beta_{1-42} y A\beta_{1-40} en CSF, grupo NDC-2^{CP} : Comparación de crioprecipitación después de la congelación de muestras CSF sin tratar (nativo*) versus tratamiento previo con SDS/desnaturalización térmica (SDS**).

25

TABLA 16b Reducción absoluta y porcentaje causado por crioprecipitación en A\beta_{1-40}, A\beta_{1-42} en la proporción de A\beta-péptido para el grupo NDC-2^{CP} (tabla de diferencias de la tabla 10a)

26

TABLA 17 El nivel de significancia de la reducción causada por crioprecipitación en los A\beta-péptidos se determinó por el grupo NDC-2^{CP} mediante el ensayo Wilcoxon para muestras emparejadas (véase tabla l0a)

27

TABLA 18a Coeficiente de variación intraanalítico para A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE utilizando Rotiblock y detección ECL por cámara CCD. Los A\beta-péptidos se cargaron cada uno en cuadriplicado sobre cada inmunograma (M1-M4) obtenido con el equipo Western

28

TABLA 18b Coeficiente de variación interanalítico para A\beta immunoblot 2/SDS-PAGE utilizando Rotiblock y detección ECL mediante cámara CCD. Las mediciones se basan en los conjuntos de datos de volumen de una banda después de la corrección de base y corresponde a las medias(media) de una determinación cuadruplicada en cada inmunograma obtenido con el equipo Western (véase tabla xx). Los inmunogramas obtenidos con el equipo Western (M1-M4) corresponden a electroforesis realizada independientemente

29

TABLA 19 A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE de los A\beta-péptidos en CSF humano en NDC-3 y AD-3

30

31

TABLA 21 Determinación de A\beta_{1-42} en CSF por A\beta inmunograma 2/SDS-PAGE y cámara CCD: Comparación de crioprecipitación después de la congelación de muestras de CSF sin tratar (nativa*) versus tratamiento previo con SDS/desnaturalización térmica (SDS**) para los grupos NDC-3^{CP} y AD-3^{CP}

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Claims (20)

1. Anticuerpo monoclonal que se refiere como mAb 1E8, que se produce mediante hibridomas que se depositaron en la DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, el 19 de diciembre del 2000, y a los que se les asignó un número DSMZ de entrada DSM ACC2485.

2. Anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en la reivindicación 1, que está radiomarcado.

3. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en la reivindicación 1 ó 2 para detectar A\beta-péptidos A\beta 1-x y/o A\beta2-x y/o sAPP\alpha.

4. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en la reivindicación 3 en un inmunograma obtenido mediante un equipo Western.

5. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en la reivindicación 4, caracterizado porque los sitios de unión no específicos se bloquean previamente con un agente bloqueante.

6. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque los A\beta-péptidos y el sAPP\alpha se separan previamente uno de otro mediante una electroforesis de gel de poliacrilamida de laurilsulfato de sodio (SDS-PAGE), induciendo un cambio conformacional específico de la secuencia de aminoácido primario en los A\beta-péptidos mediante la adición de urea.

7. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en la reivindicación 6, caracterizado porque los A\beta-péptidos se separan previamente mediante focalización isoeléctrica.

8. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque una concentración del A\beta-péptido A\beta1-42 se determina en una muestra que se selecciona de entre el grupo que comprende CSF, semilla homogenada de cerebro, plasma y mezclas de los mismos.

9. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque una muestra que se selecciona de entre el grupo que comprende CSF, semilla de homogenado de cerebro, plasma y mezclas de los mismos se investiga para la presencia de una concentración detectable del A\beta-péptido A\beta2-42 que es a 100 pg/ml o superior.

10. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en las reivindicaciones 8 y 9, caracterizado porque se determina una proporción entre la concentración del A\beta-péptido A\beta2-42 a la concentración del A\beta-péptido A\beta1-42 en la muestra.

11. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque por lo menos se determina una proporción de concentración que se selecciona de entre el grupo que comprende una proporción entre una concentración del A\beta-péptido A\beta1-42 a una concentración del A\beta-péptido A\beta1-40, una proporción entre una concentración del A\beta-péptido A\beta1-42 a una concentración del A\beta-péptido A\beta1-38 y una proporción entre una concentración del A\beta-péptido A\beta1-38 a una concentración del A\beta-péptido A\beta1-40 en una muestra que se selecciona de entre el grupo que comprende CSF, semilla homogenada de cerebro, plasma y mezclas de los mismos.

12. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque por lo menos una proporción relativa A\beta1-n% de una concentración de un A\beta-péptido A\beta1-n en una concentración de los A\beta-péptidos A\beta1-x, en el que la proporción relativa A\beta1-n% se selecciona de entre el grupo que comprende una proporción relativa A\beta1-42% de una concentración del A\beta-péptido A\beta1-42, una proporción relativa A\beta1-40% de una concentración del A\beta-péptido A\beta1-40 y una proporción relativa de A\beta1-38% de una concentración del A\beta-péptido A\beta1-38, y en el que la concentración de los A\beta-péptidos A\beta1-x comprende por lo menos la concentración de los A\beta-péptidos A\beta1-38, A\beta1-40 y A\beta1-42 del grupo de los A\beta-péptidos A\beta1-37, A\beta1-38, A\beta1-39, A\beta1-40 y A\beta1-42 se determina en una muestra que se selecciona de entre el grupo que comprende CSF, semilla homogenada de cerebro, plasma y mezclas de los mismos.

13. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque los A\beta-péptidos se digieren previamente mediante tratamiento con un detergente.

14. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en la reivindicación 13, caracterizado porque los A\beta-péptidos se digieren en una SDS-desnaturalización térmica.

15. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en las reivindicaciones 8 y 13 ó 14, caracterizado porque la muestra se divide en por lo menos dos partes-muestra, en la que una primera parte-muestra se somete al tratamiento de muestra con el detergente antes o en lugar de un tratamiento de precipitación que se dirige por lo menos a porciones de parte del A\beta-péptido A\beta1-42, y que una segunda parte muestra se somete al tratamiento de precipitación antes o en lugar del tratamiento de muestra con el detergente, y que se determina una diferencia \DeltaA\beta1-42 entre las concentraciones del A\beta-péptido A\beta1-42 determinada en las dos partes muestra.

16. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada porque los A\beta-péptidos a los que el anticuerpo mAb 1E8 se une están marcados con un anticuerpo secundario dirigido en contra del anticuerpo mAb 1E8.

17. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo secundario dirigido en contra del anticuerpo mAb 1E8 se proporciona ya con un marcador cuya cantidad se graba, o se proporciona después de su reacción inmune con el anticuerpo mAb 1E8 con un marcador cuya cantidad se graba.

18. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en la reivindicación 16 ó 17, caracterizado porque la cantidad del anticuerpo marcado mAb 1E8 se determina mediante fotometría con una cámada CCD.

19. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en las reivindicaciones 1 ó 2 para concentrar los A\beta-péptidos A\beta1-x y A\beta2-x.

20. Utilización del anticuerpo mAb 1E8 según se reivindica en las reivindicaciones 1 ó 2 para distinguir los A\beta-péptidos A\beta1-x y A\beta2-x de A\beta-péptidos A\betan-x con n>2.