NO155106B - Fremgangsmaate og apparat for gjennomfoering av en atomsjiktsepitaksivekst. - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av nye antibiotisk virksomme

forbindelser av rifamycingruppen.

Oppfinnelsens gjenstand er fremstil-

lingen av nye anibiotisk virksomme for-

bindelser med de generelle formler

som adskiller seg fra rifamycin O, som ifølge publikasjoner i Experientia 20

(1964), 336, 339 har følgende formel:

idet de nye forbindelser istedetfor delfor-melen I hvor X står for NH, eller O, og hvor R sammen med kullstoff atomene d og e står for en rest av en aromatisk forbindelse eller en heterocyklisk forbindelse av aromatisk karakter, samt deres 16, 17, 18, 19-tetrahydroderivater. Den ovenfor beskrevne formel II b gjelder også, i tilfelle X=NH, for de tautomere former med struktur II c.

R betyr sammen med kullstoff-atomene d og e tetrahydronaftylen-, en fenylen-, naftylen-, pyridylen- eller pyri-midylenrest, som også kan være mono-eller disubstituert. Substituenter er f. eks. hydroksy-, merkapto-, lavere-alkyl-, lavere-alkoksy-, nitro-, amino-, eller karboksyl-grupper eller halogenatomer. Særlig må følgende forbindelser svarende til ovennevnte formel II b nevnes, hvori

1. X=NH, edR = fenylen

2. X=NH, edR = fenylen substituert med klor i p-stilling til e eller d 3. X=NH, edR = pyridylen med formlene 5. X=NH, edR = fenylen substituert med metyl i p-stilling til e eller d 6. X=NH, edR = fenylen substituert med metyl i o-stilling til e eller d 7. X=NH, edR = fenylen substituert med etyl i o-stilling til e eller d 8. X=NH, edR = fenylen substituert i p-stilling til e eller d hver med metyl 9. X=NH, edR = naftylen med formlene

10. X=0, edR = fenylen

11. X=0, edR = fenylen substituert med

klor i p-stilling til e

12. X=0, edR = fenylen substituert med

. en nitrogruppe i p-stilling. til e

13. X=0, edR — fenylen substituert med -klor i o-stilling til e og med en nitrogruppe i p-stilling til d 14. X=0, edR = fenylen substituert med en karboksylgruppe i o-stilling til d 15. X=0, edR = naftylen med formel 16. X=0, edR = fenylen substituert med metyl i o-stilling til e 17. X=0, edR = fenylen substituert med metyl i p-stilling til d 18. X = 0, edR = fenylen substituert med metyl i p-stilling til e 19. X=NH, edR = tetrahydronaftylen med formel 20. 16, 17, 18, 19-tetrahydroderivatet av ovenfor nevnte forbindelse 1, samt de tilsvarende hydrochinonderivater i-følge formel II a, som skal betegnes med numrene 1'—20'.

Av særlig betydning er ovenfor nevnte forbindelse 1, som har formel eller i tautomer form

og som betegnes som rifamycin PH.

De nye forbindelser er dypfarvede stoffer. Chinonene (Hb) og hydrochinon-ene (Ila) kan lett overføres i hverandre. Av begge kan man fremstille vannløselige salter ved omsetning med alkalier, når X=NH i formel II, fortrinnsvis av den chinoide form b, og når X—O i formel II, fortrinnsvis av den hydrochinoide form a. Hvis forbindelsene av form a eller b har basiske substituenter, kan de også danne syreaddisjonssalter, hvortil man fremfor alt bruker syrer som er egnet til dannelse av terapeutisk anvendbare salter. Slike er f.eks.: halogenvannstoffsyre, svovelsyrer, fosforsyrer, salpetersyre, perklorsyre, ali-fatiske, alicykliske, aromatiske eller hete-rocykliske karbonsyrer eller sulfonsyrer, som maursyre, eddiksyre, propionsyre, ravsyre, glykolsyre, melkesyre, eplesyre, vinsyre, sitronsyre, ascorbinsyre, malein-syre, hydroksymaleinsyre eller pyrodrue-syre, fenyleddiksyre, benzoesyre, p-amino-benzoesyre, antranilsyre, p-hydroksyben-zoesyre, salicylsyre eller p-aminosalisyl-syre, embonsyre, metansulfonsyre, etansul-fonsyre, hydroksyetansulfonsyre, etylen-sulfonsyre, halogenbenzolsulfonsyre, tolu-olsulfonsyre, naftalinsulfonsyre eller sulfa-nilsyre, metionin, tryptofan, lysin eller ar-ginin.

Disse eller andre salter av de nye forbindelser, som f.eks. pikratene, kan også brukes til ren-fremstilling av de oppnådde baser, idet man overfører basene i salter, adskiller disse fra forurensninger, og derpå igjen frigjør basene. På grunn av den intime sammenheng mellom basene i fri form og i form av deres salter, forstås i det forangående og i det følgende med de frie baser hensiktsmessig også eventuelt de tilsvarende salter.

Forbindelsene ifølge formel Ila eller II b, deres 16, 17, 18, 19-tetrahydroderivater, blandinger av disse og deres salter utmerker seg ved en høy antibiotisk virkning. Således oppviser de en høy antibakte-riell effekt mot grampositive bakterier og mot tuberkulosebasiller og en god virkning mot gramnegative bakterier. En særlig ut-preget virkning oppviser det ovenfor beskrevne rifamycin PH, idet dette såvel in vitro som in vivo er overlegent ovenfor be-kjente antibiotika som f.eks. rifamycin SV, hvilket fremgår av følgende tabell.

In vitro- aktivitet av rifamycin PH sammenlignet med rifamycin SV.

Minimal hemmende konsentrasjon i y/ ml.

S. = staphylococcus E. = Escherichis Ps. Aer. = Pseudomonas aeruginosa Str. = streptococcus Tbc. = Mycobac.tubercolosis

Kjemoterapi på mus ved rifamycin PH og SV.

Et annet fortrinn med rifamycin PH ligger i at det ved oral administrasjon oppnås en relativt høy blodspeilverdi og en god organfordeling. F.eks. får man følg-ende verdier, når man anvender dette stoff i doser på 10, henholdsvis 20 mg/kg på mus:

Produktene ifølge oppfinnelsen kan ved siden av bruk som antibiotika innen human- og dyremedisinen også anvendes som matvaretilsats og til konservering av næringsmidler.

De nye forbindelser blir oppnådd når man omsetter rifamycin O eller rifamycin S eller deres 16, 17, 18, 19-tetrahydroderivater med en forbindelse med formel III

hvor R og X har den angitte betydning, og om ønsket, uansett rekkefølge, oksyderes dannede hydrochinoner til chinoner og/ eller dannede chinoner reduseres til hydrochinoner og/eller dannede forbindelser hydreres med katalytisk aktivert vannstoff til deres 16, 17, 18, 19-tetrahydroderivater og eventuelt overføres de oppnådde forbindelser til sine salter. Alt etter reaksjons- og opparbeidelsesbetingelsene fås det ønskede reaksjonsprodukt som chinon (II b) eller som hydrochinon (Ila). Disse to forbindelser går lett over i hverandre ved oksy-dasjon, henholdsvis reduksjon, og lar seg på den måte skille fra hverandre. Til ok-sydering er det allerede nok med luftens surstoff. Til reduksjon kan man f.eks. bruke ascorbinsyre eller ditionit.

Kondensasjonen, idet man går ut fra rifamycin O, blir utført i nærvær av et oppløsningsmiddel, fortrinnsvis et polart oppløsningsmiddel, eller en blanding av oppløsningsmidler, f.eks. i kloroform-metanol-vann, vannmettet n-butanol, dioksan, tetrahydrofuran eller deres blandinger med metanol og/eller vann. Man arbeider ved værelsestemperatur, eller, om nødven-dig, ved høyere temperatur (dampbad). Reaksjonens endepunkt, henholdsvis ende-punkter, som gir maksimalt utbytte, kan bestemmes ved tynnskiktkromatografi. Ved siden av det ønskede kondensasjonsprodukt kan oppløsningen inneholde redu-sert utgangsmateriale, rifamycin B. Kondensasjonsproduktet kan renses ved fraksjonert ekstraksjon, ved absorpsjonskro-matografi og/eller krystallisasjon eller re-krystallisasjon fra metanol-vann.

Til kondensasjon, idet man går ut fra rifamycin S, anvendes ekvivalente mengder rifamycin S og den annen kondensa-sjonskomponent i upolare oppløsningsmid-ler (benzol, toluol, eter etc), idet kompo-nentene løses opp i disse og reaksjonsblandingen settes tilside så lenge til alt det tilsatte rifamycin S har reagert. Dette har som regel skjedd etter noen dager. Reaksjonstiden kan forkortes ved oppvarm-ning. Oppløsningen inneholder nå, ved siden av det ønskede kondensasjonsprodukt, også rifamycin SV og oksydert reagens. Til fremstilling av det rene kondensasjonsprodukt er det hensiktsmessig å foreta en forrensning: A) Ved kondensasjonsproduktet av fenoksazintypen (X = O i formel II) opp-løser man residuet etter inndampning av reaksjonsløsningen i metanol eller aceton og feller ut kondensasjonsproduktet ved forsiktig tilsetning av konsentrert soda-oppløsning, mens rifamycin SV og delvis også andre forurensninger forblir i opp-løsning. B) Ved kondensasjonsproduktet av fenazintypen (X = NH i formel II) må — på grunn av disse forbindelsers høyere aciditet — den ovenfor beskrevne omkrystallisering fra metanol eller aceton foretas med vann istedetfor sodaoppløsning. Når de anrikede kondensasjonsprodukter fra denne omfelling ikke kan krystalliseres direkte, kan man deretter utsette produktet for adsorpsjonskromatografi. Dette er nødvendig i de tilfeller hvor det oppstår en blanding av isomere kondensasjonsprodukter på grunn av usymmetri av den kon-denserende reagens, og man ønsker en adskillelse av disse komponenter. Hertil kan som adsorbens anvendes kiselgel, som er forbehandlet med 1-2%-ig oppløsning av eddiksyre i kloroform. Som elueringsmid-del brukes ved fenazinstoffene kloroform med 1% iseddik, ved fenoksazinstoffene kloroform med 5% aceton. Som regel er det tilstrekkelig med 1 kg kiselgel til kromatografering av ca. 20 g råkondensa-sjonsprodukt.

I de fleste tilfeller er det fordelaktig å foreta en filtrering gjennom korte kisel-gelkolonner før den egentlige rensing. Isomerblandinger av fenazinstoffer som er oppstått ved kondensering med usymme-trisk reagens av typen III (X = NH), lar seg bare adskille ved gjentatte kromato-graferinger ifølge ovenfor angitte betin-gelser.

Til rensing av kondensasjonsprodukter med både rifamycin 0 og rifamycin S som utgangsstoffer, kan man benytte seg av kromatografi på polyamidkolonner eller fraksjonert adsorpsjons-eluering på polyamidpulver i «batch-metoden». Reaksjonsblandingen, f.eks. den oppståtte blanding av rifamycin PH og rifamycin B fra kondensasjonen av rifamycin 0 med fenylendiamin, blir adsorbert på polyamid fra metanolisk oppløsning og eluert fraksjonert ved eluering med iseddikmetanol med varierende sammensetning.

Når man ved kondenseringen går ut fra rifamycin O, kan det være en fordel å foreta anrikningen av kondensasjonsprodukt ved fraksjonert ekstraksjon, hvorved man utnytter reaksjonsproduktenes forskjellige aciditet. Således kan man eksem-pelvis fra en eddikesteroppløsning av reaksjonsblandingen, oppstått ved kondensering av rifamycin O med o-fenylendiamin, ekstrahere det overskytende o-fenylendiamin ved pH 3-3,5, og ekstrahere rifamycin B ved pH 7,3. Den tilbakeværende eddik-esterfase inneholder da nesten rent rifamycin PH. Ved denne anrikningsmetode kan det være nyttig i alle tilfelle å redusere uomsatt utgangsstoff rifamycin O til rifamycin B før adskillelsen, idet rifamycin B lettere lar seg skille fra det ønskede kondensasjonsprodukt enn rifamycin O. Det fraskilte rifamycin B kan vinnes tilbake som utgangsstoff, rifamycin O, ved oksy-dasjon gjennom et separat reaksjonstrinn.

Omvendt er det mulig å oksydere re-dusert utgangsstoff, rifamycin B, (som foreligger ved siden av det ønskede kondensasjonsprodukt) tilbake til utgangsstoffet rifamycin 0 i selve reaksjonsblandingen uten adskillelse eller isolering, og likeledes å oksydere rifamycin SV tilbake til rifamycin S, hvis dette er utgangsstoffet. Etter fornyet tilsetning av reagens, f.eks. o-fenylendiamin, kan man la reaksjonen løpe videre. Til disse omdannelser anvender man fortrinnsvis oksydasjons-midler som f.eks. ammoniumpersulfat eller kaliumferricyanid, og reduksjonsmidler som f.eks. ascorbinsyre. Man kan utføre Redoxprosessene i heterogen blanding eller i homogen fase. F.eks. kan det rifamycin SV som er dannet etter kondensasjon mellom rifamycin S og o-fenylendiamin i benzolisk oppløsning, og som foreligger ved siden av rifamycin PH, oksyderes tilbake til rifamycin S ved utrysting med en vandig oppløsning av kaliumferricyanid.

Etter den kromatografiske rensing av kondensasjonsproduktene kan man foreta en krystallisering. Som oppløsningsmiddel for krystalliseringen av kondensasjonsproduktene, har man funnet at metanol, aceton, iseddik, aceton-eter-benzol-eter-, metanol-vann-blanding samt 80%-ig eddiksyre egner seg. Blandinger av isomere fe-nazinforbindelser danner ofte blandkry-staller.

Kondensasjonsprodukter ifølge formel

II a eller II b, fremstilt ved ovennevnte metode fra rifamycin O eller S, kan reduseres til tetrahydroderivater, hvori de to dobbeltbindinger i 16,17 og 18,19-stilling er mettet. Denne reduksjon kan foretas ved hjelp av katalytisk aktivisert hydrogen, f.eks. ved hydrogen i nærvær av en palla-diumkatalysator, særlig palladium-kull, eller Raney-nikkel.

Oppfinnelsen vil beskrives ved de føl-gende eksempler. Temperaturen er angitt i Celsiusgrader.

De tynnskikt-kromatogrammer som er nevnt i eksemplene 1—9, er utført på kiselgel i systemet kloroformaceton (15 : 1). Platene blir utsatt for eddiksyredamper i 15 sek. før utviklingen. • De tynnskiktkromatogrammer som er anført i eksemplene 10—27 og 30—33, er utført på kiselgel i system A eller B: System A: Kloroform-metanol 100 : 3, plate impregnert med sitronsyre (52 ml 5% vandig sitronsyreoppløsning pr. 25 g kiselgel).

System B: Kloroform-aceton 5 : 1.

Rf-verdiene er oppført med Rf-verdien for rifamycin 0 = 1 som referanse, og betegnes heretter som Rf,.0.

Strukturen for de forbindelser som fås ifølge eksemplene er angitt i eksemplene ved henvisning til formlene på side 3, 4 og 5.

Eksempel 1.

Man blander en oppløsning av 1,52 g rifamycin O i 150 ml kloroform med en oppløsning av 0,22 g o-fenylendiamin i 200, ml metanol. Blandingen f arves raskt mørkegrønn. Man lar stå 30 min. ved rom-témperatur og avdamper deretter i vakuum ved 20°. Residuet løses i kloroform og filtreres gjennom en kort kiselgelkolonne. Etter avdamping av kloroformen får man et grønt pulver, som renses ved gjentatt omkrystallisering fra metanol-vann (0,84 g). Det fremstilte pulver kokes i 30 min. i metanolisk oppløsning. Deretter inndampes i vakuum og residuet kromatograferes på kiselgel med elueringsmiddelet kloroform-aceton (10 : 1) som inneholder 5 % iseddik. Man oppsamler de forskjellige elu-atporsjoner, og grønnfarven forvandler seg til lyserød med lut. Etter inndamping fås tilbake et kromatografisk rent kondensasjonsprodukt av rifamycin O og o-fenylendiamin; rifamycin PH. Utbyttet 0,68 g, Rfjjo = 0,28. Formel 1.

Eksempel 2.

1,52 g rifamycin O og 0,29 g 4-klor-o-fenylendiamin oppløses i 400 ml kloroform-metanol (1:1). Man koker kort opp på vannbad og avdamper den dypt grønnfar-vede oppløsning til tørrhet i vakuum. Residuet blir som i eksempel 1, renset ved

kiselgel og ved omkrystallisering fra metanol-vann. Det oppnådde kondensasjonsprodukt av rifamycin O og 4-klor-o-fenylendiamin er et amorft grønt pulver, som ifølge tynnskiktkromatografi er enhetlig. Rfu0 = 1,1. Formel 2.

Eksempel 3.

Man oppløser 3,0 g rifamycin O i 500 ml metanol, tilsetter 0,5 g 2,3-diaminopyridin og lar stå 36 timer ved værelsestemperatur. Deretter inndampes den mørk-farvede reaksjonsblanding til tørrhet i vakuum, og residuet ble renset ved gjentatt kromatografering på kiselgel. Med elueringsmiddelet kloroform-aceton (10 : 1) får man først brungrønne eluater, senere fås eluater med rent blå farve. Etter opp-arbeidelse av alle de blå eluater fås tilbake 1,50 g av et kondensasjonsprodukt av rifamycin O og 2,3-diaminopyridin, som krystalliseres fra 80%-ig vandig metanol. Det dannes violet-svarte krystaller som opp-løser seg i organiske oppløsningsmidler med blå farve, utbyttet ca. 50%. Stoffet f arves rødt med alkali. Smeltepunkt: 175°

(dekomposisjon). Rf K0 = 0,30. Formel 3.

Eksempel lf.

0,76 g rifamycin O og 0,15 g 4,5-diamino-2-tiouracil oppløses i 100 ml kloroform, tilsettes 300 ml metanol og man lar stå i 3 dager ved romtemperatur. Deretter inndampes oppløsningen i vakuum og kromatograferes på kiselgel. Med kloroform-aceton (10 : 1) elueres gult og rødbrunt stoff. Med kloroform-aceton (5 : 1) elueres deretter et rent grønnblått kondensasjonsprodukt av rifamycin O og 4,5-diamino-2-tio-uracil. Utbyttet 390 mg (50%). RfR0 = 0,17. Formel 4.

Eksempel 5.

En oppløsning av 5,4 g rifamycin O i 150 ml kloroform ble blandet med en opp-løsning av 0,8 g o-aminofenol i 200 ml 75%-ig vandig metanol, og kokt på vannbad under tilbakeløp. Derved farves reaksjonsblandingen raskt violett. Etter 15 min. koketid inndampes den i mellomtiden vin-rødt farvede oppløsning i vakuum. Man oppløser residuet i eter, filtrerer, og ryster den eteriske oppløsning flere ganger med vandig sodaoppløsning, og til slutt med kokesaltoppløsning. Etter tørring over natriumsulfat og irindampning av den eteriske oppløsning, gjenstår 3,1 g residuum, som ved siden av forurensninger inneholder to hovedprodukter. For å kunne skille disse, blir blandingen kromatografert på kiselgel med kloroform som oppløsnings-middel. Etter uttapning av gule forfrak-sjoner elueres et violett produkt. Man oppsamler alle violett-farvede reaksjoner og kromatograferer deretter flere ganger, for å kunne skille ut alle spor av gule og røde stoffer. Endelig omkrystalliseres to ganger fra metanol-vann og man får derved en tynnskiktkromatografisk enhetlig violett pulver. Rfu0 — 1,1. Stoffet omdannes i vandig metanolisk oppløsning etter noen tid, raskere ved kort oppkokning, til det rødfarvede hovedprodukt nr. 2 i den ovenfor beskrevne blanding.

Hovedprodukt nr. 2 fås også når man oppløser ovennevnte residuum (3,1 g) i 50%-ig vandig metanol og lar oppløsnin-gen stå 12 timer ved romtemperatur. Man fortynner sterkt med kokesaltoppløsning og ekstraherer med eter. To gangers kromatografering av ekstraktet og 100 g kiselgel hver gang (mrk. løpemiddel kloroform-aceton (5%) fører til et rødt produkt. Man oppløser dette i 30 ml metanol (rød oppløsning) og tilsetter oppløsningen ct overskudd av ascorbinsyre (farveom-slag til brunt). Ved langsom tildrypning av over 50 ml vann utskiller hydrochinon-forrnen av kondensasjonsproduktet seg i svartglinsende krystaller. Samtlige forurensninger befinner seg i den rødbrune moderlut. Krystallene er tynnskiktkromatografisk rene. Rf,!0 = 0,61. Utbyttet: 2,4 g (45%). Smeltepunkt under dekom-ponering (opp-esing): 180°. Forbindelsen har formel 10.

Til fremstilling av natriumsaltet opp-slemmes krystallene i så lite vann som mulig og tilsettes under sterk røring og dråpevis en ekvivalent mengde l-n natronlut. Ved potentiometrisk pH-kontroll blir til-drypningshastigheten utmålt slik at det unngås en sterk alkalisk reaksjon for blandingen. Etter avsluttet lufttilsetning, er alle krystallene oppløst. Man filtrerer den vinrøde oppløsning og isolerer det opp-løste natriumsaltet ved frysetørkning.

Eksempel 6.

3,04 g rifamycin O og 0,58 g 4-klor-2-aminofenol oppløses i 400 ml kloroform-metanol (1:1) og oppløsningen kokes 15 min. på vannbad. Den først violette, siden vinrøde oppløsning dampes inn, residuet løses i eter, og eteroppløsningen rystes ut gjentatte ganger med sodaoppløsning og til slutt med kokesaltoppløsning. Etter tør-ring over natriumsulfat og inndamping av eterløsningen, kromatograferes residuet gjentatte ganger på kiselgel (oppløsnings-middel kloroform-aceton (15 : 1)). Derved lykkes det å få en violett og en rød sub-stans som er adskilt fra alle forurensninger. Når de gule forurensninger vanskelig lar seg skille, fører også omkrystallisering av sterkt anrikede stoffer ut fra metanol-vann til rene produkter. Det violette produkt fås med dårlig utbytte. Det har Rf|i0-verdien 1,1. Det rødfargede kondensasjonsprodukt oppnås i 55-60%-ig utbytte, og har RfH0-verdien 0,64. Det violette produktet går ved koking i vandig metanol nesten kvantitativt over i det røde produkt. Dette tilsvarer formel 11.

Eksempel 7.

1,52 g rifamycin O blir sammen med 0,31 g 4-nitro-2-aminofenol oppløst i kloroform, tilsatt 300 ml metanol og kokt 30 min. på vannbad. Deretter inndampes og man kromatograferer residuet med kloroform-aceton (10 : 1) på kiselgel. Man får etter fraskillelse av brune og gule stoffer et brunrødlig materiale, som allerede er sterkt oppkonsentrert. Omkrystallisering fra metanol-vann fjerner de siste forurensninger og man får et rustrødt pulver som tynnskiktkromatografisk er enhetlig (kiselgel, kloroform-aceton (15 : 1)). RfR0 = 1,0. Utbyttet 50-60%. Produktet tilkommer formel 12.

Eksempel 8.

1,52 g rifamycin O og 0,38 g 2-amino-6-klor-5-nitrofenol oppløses i 50 ml kloroform, tilsettes 300 ml metanol og man koker oppløsningen raskt opp på vannbad. Den straks mørke rødbrun-farvede opp-løsning inndampes og kromatograferes raskt på kiselgel med kloroform-aceton

(10 : 1). På grunn av at reaksjonsproduk-tet med denne kromatografering delvis blir ødelagt, nøyer man seg med en sterk an-rikning av det rustrøde reaksjonsprodukt. ' Dette blir derpå oppnådd i kromatografisk

ren form ved tre gangers omkrystallisering fra metanol-vann. Ffuo = 1,0. Utbyttet 60%. Produktet tilkommer formel 13.

Eksempel 9.

En oppløsning av 1,52 g rifamycin O og 0,31 g 3-hydroksy-antranilsyre i 300 ml kloroform-metanol (1 : 1) oppkokes en time. Derpå damper man inn og kromatograferer residuet flere ganger på kiselgel med kloroform-aceton-iseddik (20 : 1 : 1). Man' isolerer 0,780 g kondensasjonsprodukt som polar brunt stoff (tilnærmet 50 % utbytte). RfR0 = 0,42. Produktet tilkommer formel 14.

Eksempel 10.

Man oppløser 7,54 g rifamycin 0 oe: 1,11 men med 1,59 g l-amino-2-naftol i 70 ml kloroform, tilsetter 400 ml metanol og lar oppløsningen, som raskt mørkfarves, stå så lenge ved værelsestemperatur til alt det tilsatte rifamycin 0 har reagert, (tynnskikt-kromatogram). Så inndampes det meste av oppløsningsmiddelet i vakuum, og man lar stå. Etter noen tid utkrystalliserer fra løs-ningen blåsvarte, glinsende krystaller av kondensasjonsproduktet ut, som etter omkrystallisering fra metanol smelter ved 210—212°. Utbyttet 3,7 g. Rfli0 = 0,91

(system B). Produktet har formel 15.

Eksempel 11.

Man oppløser 7,94 g rifamycin 0 og 1,11 g 3-amino-2-hydroksytoluen i 70 ml kloroform, tilsetter 400 ml metanol og lar blandingen stå ved værelsestemperatur så lenge at alt det tilsatte rifamycin 0 har reagert (tynnskikt-kromatogram). Deretter damper man inn, oppløser residuet i metanol og lar igjen stå, til det til å begynne med violett-farvet kondensasjonsprodukt er gått fullstendig over i et rødfarvet produkt. Nå felles kondensasjonsproduktet med konsentrert natriumkarbonatoppløs-ning, fellingen filtreres, vaskes med vann og krystalliseres endelig ut fra metanol. Etter gjentatt omkrystallisering fra metanol fåes 3,5 g kondensasjonsprodukt i mør-ke, brunrøde krystaller, som smelter ved 172—174°. Rfli0 = 0,89 (System B). Formel 16.

Forbindelsen' lar seg omdanne til dets hydrokinon (formel 16) ved reduksjon med askorbinsyre (sammenlign eksempel 5) i alkoholisk oppløsning, og hydrokinonet fåes' fra metanol i fiolettsvarte krystaller , med smeltepunkt 183—184°. |

Eksempel 12.

Man oppløser 7,54 g rifamycin 0 og 1,11 g 4-amino-3-hydroksytoluen 70 ml kloroform. Oppløsningen tilsettes 400 ml

metanol og får stå så lenge ved værelsetemperatur at alt tilsatt rifamycin 0 omsettes. Så damper man inn, oppløser residuet i metanol og lar igjen dette stå så lenge at det primært dannede produkt fullstendig omdannes til et rødfarvet kondensasjonsprodukt. Så felles det røde produkt med konsentrert sodaoppløsning og fellingen kromatograferes til renfremstilling på 500 g kiselgel med elueringsmiddelet kloroform-metanol (20:1). Det rødfarvede kondensasjonsprodukt krystalliserer ut fra vandig metanol i mørkerøde, rombiske plater med smeltepunkt 185—187° C. RfI{0

= 0,98 (System B). Utbytte: 3,0 g. Formel 17.

Stoffet lar seg omdanne til dets hydrokinon med askorbinsyre på den måte som er angitt i eksempel 5. (Formel 17').

Eksempel 13.

Fra 7,54 g Rifamycin 0 og 1,11 g 3-amino-4-hydroksytoluen fåes etter fremgangsmåten i eksempel 12 2,80 g kondensasjonsprodukt som rødt, amorft stoff. RfH0 = 0,98 (System B). Formel 18.

Stoffet lar seg omdanne til dets hydrokinon med askorbinsyre på den måte som er angitt i eksempel 5 (formel 18').

Eksempel lJf.

7,54 g Rifamycin 0 og 1,10 g 3,4 diaminotoluen løses i 70 ml kloroform. Man tilsetter oppløsningen 400 ml metanol og lar oppløsningen stå så lenge ved romtemperatur at alt tilsatt rifamycin 0 er omsatt. Deretter inndampes i vakuum, residuet oppløses i metanol og man setter igjen til' side så lenge til det primært dannede skittengrønne materiale i så stor mengde som mulig er gått over til et kondensasjonsprodukt med rød alkalif arvning. Dette kondensasjonsprodukt felles flere ganger fra metanoloppløsning med kok-saltoppløsning og man renser det på denne måte anrikede materiale ved gjentatt kromatografering på kiselgel, forbehandlet med 1 % eddiksyre, og elueringsmidlet kloroform (inneholdende 1 % eddiksyre), hvorunder under kromatograferingens for-løp kan tilsettes noe-aceton eller metanol. Man får to isomere, mørkegrønne kondensasjonsprodukter, som tilkommer formel .5.

Hovedmengden har RfK0-verdi 0,42

(System A), krystalliserer fra 80 %-ig eddiksyre i små mørkegrønne glinsende kry-stallblader, som smelter ved 199—201°C. Utbyttet: 1,40 g.

Den annen isomer med RfR0-verdi 0,51 (system A) fåes ved denne arbeidsmåte likeledes rent. Smeltepunkt 192—193°.

Eksempel 15.

7,54 g rifamycin 0 og 1,10 g 2,3-diaminotoluen oppløses i 70 ml kloroform. Man tilsetter oppløsningen 400 ml metanol og lar oppløsningen stå så lenge ved værelsetemperatur, til det tilsatte rifamycin 0 er omsatt. Deretter opparbeides som under eksempel 14. Etter omhyggelig kromatografering fåes et kondensasjonsprodukt som omkrystalliseres fra metanol, metanolvann og aceton. Det fåes mørkegrønne krystaller med smeltepunkt 190—191°C. Utbytte 2,7 g. Rfli0 = 0,51 (System A). Formel 6.

Den annen isomer, som ved kromato-graferingen likeledes oppnås ren og som finnes i moderluten etter krystalliseringen av stoffet med smeltepunkt 190—191°, viser RfR0-verdien = 0,64 (System A).

Eksempel 16.

Ut fraj 7,54 g Rifamycin 0 og 1,24 g 2,3-diamino-etylbenzen fåes etter fremgangsmåten i eksempel 14 en blanding av isomere kondensasjonsprodukter, som lar seg skille i sine komponenter ved kromatografering. som beskrevet i eksempel 14. Hovedproduktet, den isomere med Rfli0 = 0,53 (System A), krystalliserer fra metanol og aceton. Mån får 2,5 g mørkegrønne krystaller, som smelter ved 180—181°. Formel 7.

T moderluten etter krystallisering av den ' isomere med smeltepunkt 180—181°, finnes det annet kondensasjonsprodukt. Dette produkt renf remstillet ved kromatografering på beskreven måte oppviser RfK0

-verdi = 0,73 (System A).

Eksempel 17.

Fra 7,54 g Rifamycin 0 og 1,36 g 4,5-diamirio^l,2-dimetylbenzen fåes etter fremgangsmåten i eksempel 14 et mørkegrønt kondensasjonsprodukt, som renses ved omkrystallisering og kromatografering. Utbytte:' 2,8g RfR0'= 0,43 (system A),Formel 8.

Eksempel 18.

34,8 g rifamycin S oppløses sammen med 5,4 g o-fenylendiamin i 750 ml benzen. Oppløsningen lar man stå så lenge til det ved tynnskiktkromatografi ikke kan påvises noe Rifamycin S i reaksjonsblandingen lengere. Dette er tilfelle etter et par dager. Derpå blir reaksjonsoppløsningen inndampet og residuet renset ved gjentatt omkrystallisering fra metanol. Etter to gangers kromatografering på 300 resp. 1000 g kiselgel (forbehandlet med 1 %-ig kloroformoppløsning av eddiksyre) med oppløsningsmidlet kloroform (inneholdende 1 % iseddik) oppnås 15 g kondensasjonsprodukt, som langsomt krystalliserer ut fra 80 %-ig eddiksyre. Det kromatografiske rene produkt danner små mørke-grønne krystaller som smelter ved 181— 183°. RfK0 = 0,53 (system A) Formel 1.

Eksempel 19.

34,8 g Rifamycin S oppløses sammen med 6,1 g 3,4 diaminotoluen i 750 ml benzen. Oppløsningen lar man stå så lenge ved værelsestemperatur til alt Rifamycin S har reagert (Tynnskiktkromatogram). Deretter dampes reaksjonsoppløsningen inn og residuet renses ved gjentatt omkrystallisering fra metanol med vann. Gjentatt kromatografering på kiselgel forbehandlet med 1 %-ig kloroformoppløsning av eddiksyre og med elueringsmidlet kloroform (inneholdende 1 % iseddik) leverer 9 g av et rent kondensasjonsprodukt med RfR0-verdi 0,42 (system A), som krystalliserer ut fra 80 %-ig eddiksyre i mørkegrønne, glinsende små blader som smelter ved 199

—201°C. Formel 5.

Blant de forbindelser som vandrer raskere i kromatogrammet, finnes 4,5 g av det isomere kondensasjonsprodukt med Rfu0-verdi 0,51 (system A) i ren form. Formel 5.

Eksempel 20.

En oppløsning av 34,8 g rifamycin S og 6,1 g 2,3-diaminotoluen i 750 ml benzen lar man stå ved værelsetemperatur inntil fullstendig reaksjon. Derpå inndampes oppløsningen, residuet felles flere ganger fra metanolvann og man kromatograferer det på denne måte forrensede reaksjonsprodukt på den måte som er beskrevet i eksempel 18. En eneste kromatografering på 1000 g kiselgel leverer et krystallisert, produkt, som etter gjentatt krystallisering (avvekslende) fra metanol, fortynnet metanol og aceton oppstår som den krystalliserte rene isomer med RfK0 = 0>51 i System A. Den isomere fåes i form av mørke-grønne rombiske plater som smelter ved 190—191°C. Utbytte: 10 g. Formel 6.

Moderluten gir etter inndampning en blanding av to isomere kondensasjonsprodukter, hvor den annen isomer med Rf H0 = 0,64 (System A) er sterkt anriket. Denne annen isomer lar seg utvinne ved omhyggelig kromatografering som ovenfor beskrevet. Formel 6.

Eksempel 21.

Fra reaksjonen mellom 34,8 g Rifamycin S og 6,8 g 2,3-diaminoetylben^en fåes etter fremgangsmåten som beskrevet i eksempel 18 og 20, et kondensasjonsprodukt, som oppnåes rent ved gjentatt krystallisering (avvekslende) fra metanol, fortynnet metanol og aceton i form av den rene isomer med RfI!0-verdi lik 0,53 (System A). Mørkegrønne krystaller med smeltepunkt 180—181°. Utbytte: 6 g.

Formel 7.

Moderluten etter krystallisering av den ovennevnte isomer lar tilbake etter inndampning 6,5 g krystallinsk materiale, som består av omtrent like deler av de to isomere kondensasjonsprodukter. Ved kromatografi på den beskrevne måte fremstilles derav i små mengder den oppståtte isomer med RfK0-verdi = 0,73 (System A). Formel 7.

Eksempel 22.

En oppløsning av 3,48 g Rifamycin S og 0,79 g 1,2-diaminonaftalen i 100 ml benzol settes til side ved værelsestemperatur inntil fullstendig reaksjon av det tilsatte Rifamycin S har funnet sted. Deretter inndampes oppløsningen, residuet felles flere ganger fra metanolvann og man kromatograferer det på denne måte forrensede reaksjonsprodukt på den måte som er beskrevet i eksemplene 18—21 (kiselgel, kloroform med 1% eddiksyre). Ved omhyggelig gjentatt kromatografering lar den største del av de oppståtte isomere (Rfl{0 = 0,39 i system A) seg utvinne i kromatografisk ren form og krystalliserer fra metanol og fortynnet metanol. Mørke-grønne tetraedriske krystaller med smeltepunkt 205—210°. Utbytte: 0,35 g.

Eksempel 23.

En oppløsning av 3,48 g rifamycin S og 0,68 g 4,5-diamino-l,2-dimetylbenzen i 100 ml benzen settes til side så lenge ved værelsetemperatur til man har fått en fullstendig reaksjon av det tilsatte rifamycin S. Deretter inndampes oppløsningen, residuet felles flere ganger fra metanolvann og det på denne måte for-rensede reaksjonsprodukt kromatograferes på beskreven måte (kiselgel, kloroform med 1 % eddiksyre). Man får det mørkegrønne kondensasjonsprodukt med Rf no = 0,43 (System A). Formel 8.

Eksempel 2Jf.

34,8 g Rifamycin S og 5,45 g o-aminofenol ble oppløst i 750 ml benzen. Man lar on<p>løsningen stå ved værelsestemperatur så lenge at alt det tilsatte rifamycin S har reagert. Deretter inndampes til tørrhet, residuet oppløses i metanol og lar igjen

stå til det til å begynne med dannede fiolette kondensasjonsprodukt fullstendig er gått over til et rødt produkt. Deretter

felles det røde kondensasjonsprodukt ved tilsetning av sodaoppløsning til den metanoliske oppløsning av reaksjonsblandingen, fellingen vaskes med vann og filtratet kastes, idet hovedmengden av foru-rensningen befinner seg deri. Man renser

det røde kondensasjonsprodukt ved kromatografering på 1000 g kiselgel med elueringsmidlet kloroform-aceton 20:1, idet man øker acetonmengden etter hvert til et forhold på 5:1.

Man får på denne måte 16 g av amorft, rødt kondensasjonsprodukt (Rf|;0 = 0,98, system B), formel 10. Dette overføres på den allerede beskrevne måte

(eksempel 5) ved reduksjon med askorbinsyre i dens krystalliserte hydrokinonform. Hydrokinonet krystalliserer ut fra metanol i svartbrune, glinsende krystaller med smeltepunkt 180°C. Formel 10.

0,211 g av rødt kondensasjonsprodukt med Rf,,0-verdi = 0,98 hydreres i 40 ml

alkohol med 0,6 g 10 %-ig palladiumkull-katalysator. Man avbryter hydreringen

etter opptak av 17,9 ml hydrogen, filtrerer katalysatoren av og fortynner filtratet noe med vann. Nå innledes luft så lenge gjennom oppløsningen inntil alt hydrokinon er oksydert til kinon. Man feller kinonet med vann og krystalliserer flere ganger fra aceton. Den rene forbindelse er 16, 17, 18, 19-tetrahydroderivatet av det ovennevnte kinon med Rf]!0-verdi = 0,98. Det kry-

stalliserer i teglstensrøde prisme med smeltepunkt 260°. Utbytte: 0,150 g Rfli0 = 0,73. (System B).

Eksempel 25.

En oppløsning av 34,8 g Rifamycin S og 6,15 g 3-amino-2-hydroksytoluen i 750 ml benzen settes til side så lenge ved værelsestemperatur til alt det tilsatte Rifamycin S har reagert. Deretter inndampes, residuet oppløses i metanol og begge de to oppståtte kondensasjonsprodukter fra reaksjonen felles med sodaopp-løsning. Man filtrerer det utfelte materiale fra, vasker det med vann og løser det igjen opp i metanol. Ved henstand av den metanoliske oppløsning omdanner det første fiolette kondensasjonsprodukt seg etter hvert til det stabile røde kondensasjonsprodukt og det skiller seg langsomt ut fra metanolet i store, grove, brunrøde krystaller. For å oppnå fullstendig rensing krystalliseres ennu fire ganger fra metanol. Man får 19 g krystaller med smeltepunkt 172—174°. Rf ,.0 = 0,89 (System B).

Forbindelsen kan overføres i hydrokinonet på følgende måte: Man oppløser det krystalline kondensasjonsprodukt ved 60° i en akkurat tilstrekkelig mengde etanol, kjøler noe av og tilsetter derpå dråpevis en vandig-alkoholisk oppløsning av askorbinsyre (overskudd). Etter kort tid skiller det seg ut hydrokinonkrystaller, som kan omkrystalliseres fra metanol. Hydrokinonet smelter ved 183—184°.

Eksempel 26.

Man lar en oppløsning av 11,60 g Rifamycin S og 2,05 g 4-amino-3-hydrok-sytoluen i 200 ml benzen så lenge stå ved værelsestemperatur til alt det tilsatte Rifamycin S har reagert. Deretter inndampes oppløsningen, residuet løses i metanol og man lar igjen stå til det fiolette kondensasjonsprodukt som først dannes fullstendig er omdannet til det stabilere røde kondensasjonsprodukt. Det røde produkt blir felt ut fra sin metanoliske opp-løsning med sodaoppløsning, filtrert, vasket med vann, og for fullstendig rensing kromatografert på 400 g kiselgel (Eluerings-middel kloroform-aceton 20:1). Man får 4 g rødfarvet kondensasjonsprodukt, Rf no = 98. (System B). (Formel 17). Det røde kondensasjonsprodukt kan over-føres til sitt hydrokinon ved reduksjon med askorbinsyre på den måte som er beskrevet i eksempel 5. (Formel 17).

Eksempel 27.

Ved en arbeidsmåte analog til den beskrevne under eksempel 26, fåes fra 11,60 g rifamycin S og 2,05 g 3-amino-4-hydroksytoluen 4,5 g rødt kondensasjonsprodukt med RfKO = 0,98. (System B).

(Formel 18). Med askorbinsyre oppstår

derav det tilsvarende hydrokinon. (Formel 18).

Eksempel 28.

40 g Rifamycin S (spektrofotometrisk

-titer 92 %) og 6,2 g o-fenylendiamin omkrystallisert fra absolutt alkohol, oppløses i 4 liter eter tørket over natriumsulfat og oppløsningen oppbevares 64 timer ved romtemperatur. Den krystallgrøt som danner seg i løpet av dette tidsrom (29,7 g) blir suget fra på porselensnutsch. I filtratet finnes ifølge ultrafiolette absorbsjons-spektra bare små mengder av kondensasjonsproduktet Rifamycin PH ved siden av rifamycin SV. Filtratet kastes og det faste stoff på nutschen, som ifølge polarografisk analyse inneholder 58 % rifamycin PH, løses opp i 6,5 liter eddikester og ekstraheres 18 ganger i skille-trakten hver gang med 4 liter fosfatpuffer med pH 6,24. I løpet av disse ekstraksjoner tilsettes ytterligere 2,4 liter eddikester. Før de to siste ekstraksjoner tilsettes ytterligere 1,5 liter heksan, for å fjerne rifamycin SV fullstendig fra den organiske fase. Ekstraktene blir hele tiden kontrollert spektrofotometrisk og analyt-tisk ved tynnskiktkromatogram. Etter avsluttet ekstraksjon får man et volum på 8,2 liter eddikesteroppløsning, hvori ifølge spektrofotometrisk analyse finnes 15,3 g rifamycin PH (Formel 1). Denne oppløs-ning blir nå tilsatt 6 ml natrium-metylat, inneholdende 8,9 % natrium og 2,5 liter ligroin. Oppløsningen blir oppkonsentrert i vakuum til ca. 1 liter og man får på denne måten et første krystallisat av rifamycin PH's natriumsalt (13 g). Av moderluten fåes ennu 2 krystallisater. Analysen av de forskjellige fraksjoner ga følgende titer av fri rifamycin PH: 1. krystallisat: 13 g: polarografisk titer 84,4%. 2. krystallisat: 1,4 g: polarografisk titer 86,4 %. 3. krystallisat: 1,4 g: polarografisk titer 44,4%.

De spektrofotometriske og polarogra-fiske data for rifamycin PH og rifamycin SV er som følger:

Eksempel 29.

I en 6 liters firhalskolbe med glass-rører, tilbakeløpskjøler, termometer og gassinnledningsrør bringes 3,5 liter ana-lyserent metanol, og deri suspenderes 100 g rifamycin 0 omkrystallisert fra metanol (spektrofotometrisk titer minst 95 % og rifamycin 0-innhold maksimalt 3 %). Suspensjonen blir under røring kjølt utenifra med is inntil suspensjonens temperatur ligger på mellom 0 og 2°C.

Likeledes blir det for å oppnå en fullstendig avlufting av oppløsningsmidlet kjørt igjennom en middels sterk nitrogen-strøm i 40—45 minutter. Under stadig røring og kjøling blir det etter hvert tilsatt 42 ml av en metanolisk oppløsning av natriummetylat med 7,3 % natrium (beregnet mengde i forhold til rifamycin 0 100 %-ig). Man lar nitrogen strømme igjennom i ennå 15 minutter. Derpå dek-kes kolben med svart papir og det tilsettes 15 g av o-fenylendiamin (omkrystallisert som nedenfor angitt (5 % overskudd i forhold til teoretisk beregnet mengde). Blandingen røres ennu i 50 minutter under stadig gjennomledning av nitrogen og sørger for kjøling. Derpå fastslås kromatografisk om reaksjonen er ferdig: Dertil anvendes plater belagt med kiselgel G, ifølge Stahls metode, og det brukes som oppløsnings-middel aceton (rifamycin 0 lager en grå-gul flekk og har en RF-verdi på 0,55, rifamycin PH har en RF-verdi på 0,65 og gir en fiolett langtrukken flekk, rifamycin B har en RF-verdi mellom 0 og 0,4 og gir en langtrukken intensivt gul flekk).

Hvis rifamycin 0 ikke er omsatt fullstendig, må reaksjonstiden forlenges. Etter at reaksjonen er ferdig, helles oppløsningen opp i 15 liter vann som inneholder 50 g askorbinsurt natrium for å redusere tilbakeværende rifamycin 0 til rifamycin B.

Etter kort omrøring (3—5 minutter) surgjøres med 10 %-ig saltsyre til pH3 3 .-og man ekstraherer med en eneste porsjon bestående av 12 liter eddikester renset over fosforpentoksyd (oppvarmet under tilbakebeløp 2 timer over 2 % fosforpentoksyd). Man ryster i ca. 20—25 minutter og kaster deretter den lett farvede vandige fase. Den organiske fase blir, for å fjerne eventuelle tilbakeværende rester av o-fenylendiamin, vasket 2 ganger etter-hverandre med 2 liter og med 0,5 liter, sur-gjort vann (pH 2,5—3).

Derpå blir den organiske fase be-handlet med 5 liter fosfatpuffer, og deretter med 2,5 liter av den samme fosfatpuffer ved pH 7,3 (1/15 molar). Hvis det kan påvises rifamycin B ifølge kromatografisk undersøkelse av det organiske skikt som ovenfor beskrevet, utføres ennå en tredje ekstraksjon med en liter av nevnte puffer. Fra de samlede vandige ekstrakter kan rifamycin B fåes tilbake.

Den organiske fase blir nå tørket over natriumsulfat, filtrert, og konsentrert i vakuum ved 30 til 35°C til et volum på 300—400 ml. Residuet lar man stå i 24 timer ved 5—10°, hvorunder det skilles ut en krystallgrøt. Denne blir suget av på nutsch, vasket 2 ganger med en liten mengde eddikester, renset som ovenfor beskrevet, og tørket ved 40° i vakuum.

På denne måten får man 35,5 g krystallisert, mørkegrønn rifamycin PH med en spektrofotometrisk titer mellom 90 og 95 % (utbytte 32—36 %).

Fremstilling av natriumsaltet.

35,5 g rifamycin PH med titer 92,5 %

(tilsvarende 32,8 g og 100 %-ig rifamycin pH) ble oppløst i 160 ml metanol. Ved en temperatur som ikke overstiger 20° tilsettes denne oppløsning 15,3 ml av en metanolisk oppløsning av natriummetylat med en natrium-titer på 6,5 % (tilsvarende et overskudd på 3 % i forhold til beregnet mengde). Denne oppløsning av natriumsaltet blir fortynnet med 1,3 liter eddikester og blandingen blir konsentrert

til ca. 200—250 ml, residuet blir derpå tilsatt 0,5 liter eddikester og 0,4 liter cyklo-heksan og så inndampet til ca. 200 ml. Allerede under inndampningen utfaller natriumsaltet. Til fullstendig utfelling lar man væsken stå i 12 timer ved 4—5°C. Man frafilterer det fiolettfarvede saltet og vasker det med normal heksan. Produktet tørkes deretter 48 timer ved 35— 40° i vakuum.

Utbytte: 31,4 g; spektrofotometrisk titer (beregnet ut fra syreinnholdet): ca. 90 %. Utbytte beregnet ut fra syreinnholdet 85 %.

Saltet oppløses i vann inntil en konsentrasjon på 15—20 %, og oppløsningen er intenst rødfarvet.

Det anvendte o-fenylendiamin blir fremstillet på følgende måte: 33 g teknisk o-fenylendiamin blir oppløst i 115—120 ml kokende vann, inneholdende 1 g natrium-hydrosulfit. Man tilsetter benkull i et forhold på 10 % av det tilsatte o-fenylendiamin, frafiltrerer, avkjøler med is i mørket og frafiltrerer det hvite krystalline produkt etter 2—3 timer. Man vasker med en liten mengde kaldt vann og tørket stoffet 24 timer i vakuum og i mørke ved 40°C. Man får 28 g av det rene produkt, som smelter ved 100—101°. Denne rensing bør ikke foretas før 20—30 timer før produktet skal brukes.

Eksempel 30.

Man blander en oppløsning av 44,0 g rifamycin 0 i 150 ml kloroform og 1000 ml metanol med en oppløsning av 6,25 g o-fenylendiamin i 1000 ml metanol. Blandingen lar man stå i 5 dager. Etter dette tidsrom inneholder oppløsningen ikke lengere rifamycin 0, men rifamycin PH og rifamycin B. Man inndamper denne blanding i vakuum til ca. 200 ml og kromatograferer på 1 kg av et polyamidpulver som i handelen går under betegnelsen Ultramid BM 228. Rifamycin B holdes fast som en gul sone og rifamycin PH som en rød sone. Man vasker med metanol, inntil eluatet er tilnærmet farveløst. Derpå elueres først rifamycin PH ved metanol, inneholdende 3 % eddiksyre. Så kan det rifamycin B som er blitt tilbake på kolonnen som et gult bånd utvinnes ved eluering med 30 % eddiksyre i metanol. Eluatet inneholdende det grønnfarvede rifamycin PH inndampes i vakuum til tørrhet. Til krystallisering oppløses det grønne amorfe stoff i 100 ml iseddik. Etter noen timer krystalliserer det ut 19 g rent rifamycin PH. Man krystalliserer dette stoff flere ganger fra benzol-eter eller aceton-eter og får krystaller med smeltepunkt 183—184°C (målt i Koflerblokk). Rifamycin PH danner svarte, glinsende krystaller i form av langtrukne prismer eller små blader, som ved utgnidning antar en skittengulgrønn farve. Det er lett oppløselig i metanol, kloroform og acetonitril, mindre lett oppløselig i aceton, iseddik, benzen, metylenklorid, dioksan, og tungt oppløselig i eter, cyklohexan, hexan og vann. Oppløsningen av rifamycin PH i eddiksyre er grønnfarvet, mens diok-sanoppløsninger viser en blå, farve. Rifamycin PH danner med alkalier rødfarvede salter, hvis vandige oppløsninger reagerer nøytralt.

Eksempel 31.

Man lar en oppløsning av 3,48 g rifamycin S og 0,81 g 6,7-diamino-l,2,3,4-tetra-hydronaftalin løse opp i 100 ml benzen ved værelsestemperatur og stå inntil det har funnet sted en fullstendig reaksjon av det tilsatte . rifamycin S. Reaksjonsblandingen blir inndampet, residuet oppløst i metanol og den metanoliske oppløsning filtrert gjennom en kolonne med 100 g av det polyamidpulver som ble anvendt i eksempel 30. Man vasker etter med metanol inntil filtratet er tilnærmet farveløst. Ved vasking av polyamidet med metanol, inneholdende 3 % eddiksyre, utvinnes et grønn-farvet eluat, som etter inndampning inneholder 1,57 g rent kondensasjonsprodukt. RfR0 = 0,53 (System A) formel 19.

Eksempel 32.

Man lar en oppløsning av 3,04 g 16,17, 18,19-tetrahydro-rifamycin S med smeltepunkt 226—228°C og 0,45 g o-fenylendiamin i 100 ml benzen stå ved værelsetemperatur til fullstendig reaksjon av tilsatt tetrahydrorifamycin S. Reaksjonsblandingen blir inndampet, residuet løst i metanol og den metanoliske oppløsning filtrert gjennom en kolonne med 100 g polyamidpulver ifølge eksempel 30. Man vasker etter med metanol inntil filtratet flyter ut tilnærmet farveløst. Ved vasking av kolonnen med metanol, inneholdende 3 % eddiksyre, utvinnes et blågrønt farvet eluat, som etter inndamping lar tilbake 1,2 g rent kondensasjonsprodukt. Dette stoff omkrystalliseres flere ganger fra metanol og fra aceton, og gir 950 mg svartglinsende krystaller med smeltepunkt 188—189°C. Massespektrometrisk béstemt molekyl-vekt: 788 (beregnet: 788). RfK0 = 0,70

(System A).

16, 17, 18, 19-tetrahydrorifamycin PH som oppstår ved hydrering av rifamycin PH (sammenlign eksempel 33), er identisk med kondensasjonsproduktet av 16, 17, 18, 19-tetrahydrorifamycin S og o-fenylendiamin (smeltepunkt og blande-smeltepunkt, tynnskiktkromatografi). Formel 20.

Utgangsstoffet 16, 17, 18, 19-tetrahydrorifamycin S fremstilles på følgende måte: Man hydrerer 5,0 g rifamycin SV i 150 ml alkohol ved værelsestemperatur og atmosfære trykk med 0,5 g 10 %-ig palladium/kull. Etter opptak av 311 ml hydrogen avbrytes hydreringen, man filtrerer katalysatoren fra og fortynner den metanoliske oppløsning med fosfatpuffer med pH 7. Deretter tilsettes overskudd av am-moniumpersulfatoppløsning og man lar stå noen tid. Deretter frafiltreres det utfelte materiale og man krystalliserer flere ganger fra metanolet. Man oppnår 2 g 16,17, 18,19-tetrahydrorifamycin S i langtrukne, gule prismer med smeltepunkt 226— 228°C.

Eksempel 33.

0,784 g rifamycin PH hydreres i 250 ml etanol ved værelsestemperatur og atmosfæretrykk med 200 mg 10 %-ig Pd/C. Etter opptak av 67,5 ml hydrogen (tilsvarende 3 mol) filtreres katalysatoren fra, og man innleder i 20 minutter en kraf-tig luftstrøm gjennom oppløsningen og inndamper deretter. Etter et tynnskikt-kromatogram består residuet av ca. fem komponenter med blå til blågrå farve. For å fraskille de komponenter som tilsvarer de 16,17,18,19-tetrahydrorifamycin PH i eksempel 32, kromatograferes blandingen flere ganger på syrevasket kiselgel med kloroform som oppløsningsmiddel. Man får 0,19 g rent stoff med RfR0 = 0,70 (System A) som krystalliseres om fra aceton

og metanol. Etter smeltepunkt, blande-smeltepunkt og RfH0-verdi er dette stoff identisk med 16,17,18,19-tetrahydrorifamycin PH fremstillet ved kondensering av 16,17,18,19-tetrahydrorifamycin S med o-fenylendiamin. Formel 20.

Eksempel 3Jf.

Man oppvarmer 2,8 g rifamycin S med 0,50 g o-fenylendiamin 200 ml. toluen under nitrogen på kokende vannbad. Etter en time tilsettes oppløsningen 0,15 g o-fenylendiamin og man oppvarmer videre til rifamycin S forsvinner. Etter avkjøling ryster man toluenoppløsningen ut med en vandig oppløsning inneholdende overskudd av kaliumferricyanid. Etter at man for adskillelse av amorft materiale og for lettere å kunne gjennomføre en faseadskillelse har filtrert gjennom celit, vaskes toluen-oppløsningen med koksaltoppløsning, tilsettes 0,25 g o-fenylendiamin og varmes på ny under kvelstoff på vannbad. Etter en time tilsettes 0,04 g o-fenylendiamin og man oppvarmer videre til rifamycin S har forsvunnet. Derpå gjentas hele oksyda-sjonsforløpet, oppløsningen tilsettes på ny 0,12 g o-fenylendiamin og oppvarmes på ny ca. 2 timer. Derpå rystes toluenoppløs-ningen ut med 2-n-saltsyre og med kok-saltoppløsning, og avdampes til tørrhet i vakuum. Residuet oppløses i metanol og man isolerer fra dette rifamycin PH på den måte som er angitt i eksempel 30. Man får 1,85 g rifamycin PH. Dette tilsvarer et utbytte på ca. 66 %.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av nye antibiotisk virksomme forbindelser av rifamycin-gruppen med de generelle formler

hvori X betegner NH eller 0, og R sammen med karbonatomene d og e betegner en fenylen—, naftylen-, tetrahydronaftylen-, pyridylen -eller pyrimidylen-rest, eventuelt mono- eller di-substituert med hydroksy-, merkapto-, lavalkyl-, lavalkoksy-, nitro-, amino- eller karboksyl-grupper eller halogenatomer, samt disse forbindelsers 16,17, 18,19-tetrahydroderivater, eller eventuelt deres tautomere samt metall- og syre-addi- sjonssalter,karakterisert ved at rifamycin O eller rifamycin S eller en av disses 16,17, 18,19-tetrahydroderivater omsettes med en forbindelse med formel hvori R og X har ovennevnte betydning, og om ønsket, utfører en eller flere av de følgende reaksjoner i egnet rekkefølge; oksyderer dannede hydrokinoner til kinoner, eller reduserer dannede kinoner til hydrokinoner, under anvendelse av for disse operasjoner vanlige fremgangsmåter, fortrinnsvis med luft som oksydasjons-middel og ascorbinsyre som reduksjons-middel, hydrogenerer fremstilte forbindelser med hydrogen til deres 16,17,18, 19-tetrahydroderivater under anvendelse av palladium eller Raney-nikkel som kataly-sator og overfører de fremstilte forbindelser til deres salter, metall- eller syreaddisjonssalter.

2. Fremgangsmåte som angitt i på-stand 1, karakterisert ved at omsetningen av rifamycin 0 foretas i et polart oppløs-ningsmiddel eller en polar oppløsningsmid-delblanding, ved temperaturer mellom 20— 100° C.

3. Fremgangsmåte som angitt i på-stand 1, karakterisert ved at omsetningen av rifamycin S foretas i et upolart oppløs-ningsmiddel ved henstand ved romtemperatur med den annen reaksjonskomponent.

4. Fremgangsmåte som angitt i på-stand 1 og 3, karakterisert ved at rifamycin 0 eller rifamycin S omsettes med O-fenylendiamin.