KR20140046471A - 생체분자 특성규명용 나노포어 센서 - Google Patents

Abstract

나노포어-함유 막에 의해 생체분자 파라미터를 규명하는 방법 및 장치가 본 명세서에 개시되고, 또한 본 명세서에 개시된 방법 및 장치에서 이용될 수 있는 장치를 제조하는 방법이 개시된다. 나노포어 막은 전도층과 유전체 층의 다층 스택(multilayer stack)이고, 임베디드 전도층(embedded conducting layer) 또는 전도층 게이트가 생체분자를 이동시키는 나노포어 내부 및 주위에 잘-제어되고 측정가능한 전기장을 제공한다. 일 양태에서, 상기 전도층은 그래핀(graphene)이다.

Description

생체분자 특성규명용 나노포어 센서{Nanopore sensors for biomolecular characterization}

관련 출원에 대한 교차 인용

본 출원은 2011년 7월 27일에 제출된 미국 임시출원 제61/512,095호에 기초한 우선권을 주장한다.

연방정부 후원 연구 또는 개발 관련 진술

본 발명은 국립 보건원(the National Institute of Health)에 의해 제공된 계약번호 NIH 5R21CA155863-02 및 NIH R25CA154015 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 권리를 갖는다.

생체분자가 인가된 전기장 하에서 나노포어(nanopore)를 통과할 때, 전기적 파라미터를 모니터링하는 것에 의해 생체분자의 특성을 규명(characterize)하는 방법 및 장치가 제공된다.

미국출원 공개 제2011/0226623에서 검토된 것과 같이, 생거 서열결정(Sanger sequencing), 합성에 의한 서열결정, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 혼성화에 의한 서열결정, MPSS(massively parallel signature sequencing), 및 비-효소적 실시간 단일-분자 서열결정(non-enzymatic real-time single-molecule sequencing)을 포함한, 다수의 통상적 기법이 생체분자의 서열결정을 위해 이용가능하다. 미국출원 공개 제2012/0040343호는 면역침전, 메틸기-민감성 효소에 의한 처리(digestion by methyl-sensitive enzyme), 메틸화 민감성 PCR 및 DNA 메틸화 결합 컬럼을 포함하는 방법을 포함한, 메틸화 수준을 규명하는 기법을 기재한다. 미국특허 제5,795,782호는 단량체-인터페이스 상호작용에 기반한 중합체 분자의 특성규명을 기재한다.

나노포어 내부 및 주위에서, 특히, 생체분자의 나노포어 통과(transit) 또는 나노포어와의 상호작용 동안, 생체분자 통과 및/또는 전기적 파라미터를 더 잘 제어하기 위해 나노포어 내부 및 주위에서 전기적 특성을 정확하게 제어할 수 있는 시스템 및 방법에 대한 요구가 당해 기술 분야에 존재한다. 본 명세서에 개시된 방법 및 장치는 당해 기술 분야에서 공지된 통상적인 시스템에 의해 용이하게 달성되지 않는, 원하는 생체분자의 상이한 양태를 포함한, 광범위한 생체 분자를 규명하도록 구성된다.

요약

나노포어-함유 막에 의해 생체분자를 규명하는 방법 및 장치, 및 본 명세서에 제공된 방법 및 장치에서 사용될 수 있는 장치를 제조하는 방법이 제공된다. 나노포어를 통한 생체분자 통과의 개선된 제어, 생체분자가 나노포어를 통과하는 동안 생성되는 전기적 파라미터의 측정 또는 모니터링을 촉진하도록 배열된 막이 스택 구조(stack configuration)의 복수 개의 층, 예를 들면, 층을 통한 나노포어를 갖는 그래핀/유전체 층(graphene/dielectric layers)을 포함한, 전도체/유전체 층(conductor/dielectric layers)을 포함한다. 구체적으로, 상기 장치의 나머지로부터 독립적으로 바이어싱된 임베딩 전극 게이트로 제공된 전도층 또는 그래핀 층이 생체분자 통과 및/또는 생체분자 통과 동안 전기적 파라미터 측정을 독특하게 제어하는 능력을 제공한다.

일 양태에서, 두 개 이상의 전기 터미널(electrical terminal), 예를 들면, 나노포어 막의 전위차(potential difference across the nanopore membrane)를 제공하는 한 쌍의 전기 터미널 및 상기 막에 통합된 전극, 예를 들면, 그래핀 전극, 또는 기타 원자 두께 박막 전도층(atomically thin conducting layer), 예를 들면, 도핑된 실리콘, 단층 실리콘 또는 실리센, 극박(ultra-thin) 금속, MoS₂ 전극에 동력을 공급하는 또 다른 터미널을 갖는 장치 및 그 장치의 용도가 본 명세서에서 제공된다. 일 구체예에서, 상기 전극은 그래핀 또는 MoS₂ 이다. 일 구체예에서, 복수 개의 전극에 동력이 공급된다. 통합된 전극은 "게이트(gate)" 전극으로 지칭되며, 나노포어를 통한 생체분자의 이동 속도(translocation velocity)를 제어하고, 통과하는 생체분자를 전기적으로 규명하기 위한 마이크로리본(microribbon) 또는 나노리본(nanoribbon)을 포함하는 구체예의 경우, p-형 또는 n-형 거동을 달성하기 위해 독립적으로 바이어싱될 수 있다. 게이트 전극은 나노포어 내 및/또는 그에 인접한 전기장의 독립적인 제어를 제공하기 위해 시스템의 다른 성분들로부터 전기적으로 단리된다. 일 양태에서, 게이트 전극은 소스 전극(source electrod)에 묶인다. 일 양태에서, 임의의 수의 독립적으로 바이어싱된 게이트 전극이 예를 들면, 성형되고 전압 공급원(voltage source)에 전기적으로 연결된 복수 개의 그래핀 층에 의해 내포(incorporate)될 수 있다. 게이트 전극을 제공하기 위해 장치에 임베딩된 그래핀 층은 마이크로리본, 나노리본 및 나노갭(nanogap)으로 성형(shape)될 수 있다. "나노(nano)"는 약 1 ㎛ 미만이고, 약 0.1 nm 초과인 크기를 의미한다. "마이크로(micro)"는 약 1 mm 미만이고, 약 1 ㎛ 초과인 크기를 의미한다.

일 양태에서, 나노리본은 각 뉴클레오티드가 횡 전류(transverse current) 또는 전도도(conductance)를 독특하게 조절(modulate)하는 것인 뉴클레오티드 판독기(reader)로 작용한다. 엑소뉴클레아제, 폴리머라아제, 단백질, 헬리카아제, 또는 개별적인 뉴클레오티드 또는 아미노산 종류, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산의 짧은 특정된 서열에 특이적으로 결합하는 화학적 모이어티(chemical moiety)를 포함한, 특정 뉴클레오티드와 상호작용하는 물질에 의한 나노리본 가장자리(edge)의 관능화(functionalization)는 뉴클레오티드-특이적 상호작용을 더 강화시킬 수 있다.

본 명세서에서 제공된 장치 또는 방법은 선택적으로, 전자 수단에 의해 긴 생체분자 내 다중-유닛 생체분자의 단일 유닛(예를 들면, 유기 또는 합성 뉴클레오티드, 아미노산)의 검출을 가능하게 한다. 장치에 임베딩된 전극을 포함한, 전극들은 전기적 파라미터를 감지 또는 측정할 수 있고, 따라서, 생체분자의 둔화 또는 포획(trapping)을 위한 나노포어의 전계 효과 게이팅(field effect gating)을 가능하게 한다.

본 명세서에서 제공된 하나의 중요한 양태는 유전체 층과 같은 절연층(insultaing layer) 사이에 샌드위치된 포어에 있는 그래핀으로 제조된 제3 나노규모 터미널(nanoscale terminal)이다. 이러한 샌드위치(sandwhiched) 전도층 또는 터미널은 또한 매립 그래핀과 같은 "매립(buried)" 층으로도 지칭된다. 매립 그래핀 층은 나노포어 중 생체분자 또는 나노포어를 통과하는 생체분자를 통한 전류를 측정하기 위한 쉬트로 이용될 수 있거나, 또는 생체분자가 포어를 통과할 때 횡단(transverse) 전도도 또는 임피던스를 측정하거나, 또는 두 개의 그래핀 전극을 통한 터널 전류를 측정하기 위한 나노포어를 갖는 리본으로 형성될 수 있다. 또 다른 평면(planar) 그래핀 전극이 포어를 개폐(gate)하고 이동 속도를 조정하기 위해, 예를 들면, 생체분자 통과 속도를 둔화시켜서, 신호 대 잡음 비(signal to noise ratio)를 증가시키기 위해 이용될 수 있다.

선택적으로, 세개 또는 그 이상의 그래핀 전극이 휘트스톤 브릿지 아키텍쳐(Wheatstone Bridge architecture)에서, 예를 들면, DNA 및 DNA/단백질 복합체의 민감한 검출을 위해 이용될 수 있다. 목적 종(species of interest)이 나노채널 내에 배치된 전극에 인접하여 통과하는 것인 수평 휘트스톤 브릿지(Horizontal Wheatstone Bridge) 구조물이 고려된다. 전극이 나노채널을 따라 정렬된 나노포어를 포함하고, 목적 종이 상기 나노포어를 통과하는 것인 수직 휘트스톤 브릿지 구조물도 고려된다. 따라서, 본 발명의 일 구체예는 나노포어 내 또는 그 주위에서 전기적 파라미터를 측정하기 위한 휘트스톤 브릿지 구조 중, 그래핀 층과 같은 전도층을 연결시키는 것에 관한 것이고, 상기 전기적 파라미터는 차동 임피던스(differential impedance), 터널 전류, 저항, 정전용량(capacitance), 전류 또는 전압 중 하나 이상이다.

일 구체예에서, 상기 장치 및 방법은 DNA 서열결정, RNA 서열결정, 기타 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, LNA, PNA, 또는 XNA의 서열결정, 단백질 또는 아미노산 서열결정, 하플로타입핑(haplotyping), 메틸화 검출 및/또는 맵핑, 및 관련된 적용 중 하나에 관한 것이다.

일 구체예에서, 생체분자 파라미터를 규명(characterize)하는 방법, 예를 들면, 전도체-유전체 스택을 포함하는 막 중 나노포어를 제공하는 것에 의해 생체분자 파라미터를 규명하는 방법이 제공된다. 상기 막은 제1 유체 구획(fluid compartment)을 제2 유체 구획으로부터 분리하고, 나노포어는 상기 제1 유체 구획과 제2 유체 구획을 유체 연결(fluidly connect)한다. "유체 연결(fluidly connect)"은 유체가 나노포어를 통해 구획 간에 이동할 수 있고, 나노포어보다 더 작은 유체 내의 구성성분이 유사하게 이동할 수 있다는 것을 의미한다. 생체분자가 제1 유체 구획에 적용되고, 전기장이 막에 인가된다. 이 방식으로, 생체분자는 전하를 가진 생체분자에 대한 것을 포함한 인가된 전기장 하에, 제1 유체 구획으로부터 제2 유체 구획으로의 방향으로 나노포어를 통과하도록 강제(force)되거나 추진된다. 생체분자가 나노포어를 통과할 때, 막에서 전기적 파라미터가 모니터링되어, 생체분자 파라미터를 규명한다. 대안적으로, 전기적 파라미터가 나노포어에(across the nanopore) 또는 나노포어를 통해(through nanopore) 모니터링된다. 일 양태에서, 전도층(conducting layer)은 하나 이상의 원자 두께 박막 전도층(atomically thin conducting layer)이다. 일 양태에서, 원자 두께 박막(atomically thin)은 수개 이하의 원자의 규모인 층 두께를 의미한다. 일 양태에서, 원자 두께 박막은 약 1 nm 미만의 두께, 또는 약 0.5 nm 미만의 두께인 층 두께를 의미한다.

다층 스택 구조(multilayer stack geometry)는 전기장을 포어 내 및 주변에서 다양한 방향으로 독립적으로 활성화하고, 측정할 수 있는 능력을 포함한, 다수의 기능적 잇점을 제공한다. 예를 들면, 정상적으로 매우 빠르게 나노포어를 통과할 수 있는 생체분자의 통과를 둔화시키거나 또는 단계적으로 이동시키도록(ratchet) 최외각(outermost) 그래핀 층에 동력이 제공될 수 있고, 나노리본을 포함한, 중앙 그래핀층은 전도도, 임피던스, 저항, 전류, 및/또는 전위(potential)와 같은 전기적 파라미터의 변화에 기반하여 생체분자 파라미터를 규명하기 위해 이용된다. 유사하게, 다층 스택 구조는 상부 층(top layer) 또는 하부층(bottom layer)에 해당하는 중앙 그래핀 층 또는 최외각 그래핀 층에 해당하는 임베딩된 전극에 의한 것과 같은 전계 효과 게이팅 및/또는 전계 효과 감지(sensing)을 위한 것을 포함한 게이트 전극을 제공하도록 구성될 수 있다. 다층 스택은 선택적으로, 원하는 전극 영역이 생체분자가 현탁되는 유체에 직접 노출되도록 패턴 층(patterned layer)을 포함한 절연층으로 도포될 수 있다.

일 양태에서, 생체분자 파라미터는 폴리뉴클레오티드 서열; 태깅된 뉴클레오티드(tagged nucleotide), 폴리뉴클레오티드 메틸화 또는 히드록시메틸화 상태, 폴리뉴클레오티드 서열 상의 하나 이상의 메틸화 또는 히드록시메틸화 부위에 결합된 메틸 또는 히드록시메틸-의존적 결합 단백질을 포함한 변형된 뉴클레오티드의 존재; 단백질-폴리뉴클레오티드 결합 사건(binding event)의 존재; 폴리펩티드 서열; 생체분자 이차 구조; 및 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 명세서에서 제공된 방법 및 장치는 규명되는 생체분자 파라미터가 측정될 전기적 파라미터에 영향을 미치는 한, 다양한 생체분자 파라미터에 적합할(compatible) 수 있다. 다층 스택 내 그래핀 층과 같은 전도층의 이용은 하나 이상의 게이트 전극에 의한 것을 포함한, 정확하고 집속된(focused) 전기장 조작(manipulation) 및 제어로의 접근을 제공한다.

본 명세/.l서에서 제공된 방법 및 장치는 단위 반복 구조를 갖는 중합체인 다양한 생체분자, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드를 포함한 유기 또는 합성 핵산, 폴리-아미노산, 단백질, 생중합체, 및 이들의 혼합물에 적합할 수 있다. 일 양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, PNA, LNA 또는 XNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 일 구체예에서, DNA는 단일 가닥이다. 일 구체예에서, DNA는 이중 가닥이다.

본 명세서에서 제공된 방법 및 장치는 복수 개의 그래핀 층을 포함하고, 인접한 그래핀 층은 유전체 층에 의해 분리되는 것인 그래핀-유전체 스택(graphene-dielectric stack)에 관한 것이다. 일 양태에서, 그래핀 층의 갯수는 2, 3, 4, 5 또는 6개이다. 일 양태에서, 그래핀 층의 갯수는 3개 이상이고, 중간 그래핀 층은 나노포어에 의해 형성된 나노통로(nanopassage)에서 전기장의 제어 및/또는 규명을 위해 전기적으로 절연된(electrical isolation)인 하나 이상의 마이크로 또는 나노리본에 해당하고, 외각 그래핀 층은 독립적으로 제어된 게이팅을 제공한다.

일 구체예에서, 그래핀 층 중 하나는 그래핀 마이크로리본, 나노리본, 또는 나노갭을 포함하고, 그를 통해 나노포어가 그래핀 나노리본의 종방향에 대한 가로 방향으로 횡단한다. 이 구체예의 일 양태에서, 상기 방법은 생체분자가 나노포어를 통과하는 동안 그래핀 마이크로리본, 나노리본 또는 나노갭을 따라 전위 또는 횡 전류의 경시(time-course)를 측정하여, 그에 의해 생체분자의 서열 또는 길이를 규명하는 단계를 더 포함한다. 복수 개의 마이크로리본 또는 나노리본이 상이한 파라미터 또는 상이한 생체분자 위치 또는 배향에서 또는 동일한 파라미터를 동시에 측정하여, 그에 의해 이동하는 생체분자의 복수의 동시 판독(read)을 가능하게 하기 위해 이용될 수 있다. 일 구체예에서, 수직으로 인접한(vertically adjacent) 리본은 상호 간에 오프셋(offset)된, 예를 들면, 20°보다 큰 오프셋 각에 의해, 또는 약 10° 내지 180° , 약 30° 내지 약 130°, 또는 약 90°의 범위로부터 선택된 오프셋 각에 의해 오프셋된 종방향을 갖는다. 이 방식으로, 인접한 통전된(electrically energized) 나노리본의 영향이 최소화된다. 일 양태에서, 마이크로 또는 나노리본의 복수 개의 종방향이 평행 구조(parallel configruation)로 배열된다. 일 양태에서, 나노리본 또는 마이크로리본의 일 부분은 상호 간에 평행하게 정렬되고, 또 다른 부분은 상이한 종방향 배향을 갖는다.

복수 개의 그래핀 층을 갖는 구체예를 포함한, 막의 다층(multilayer) 양태는 생체 분자에 관한 것을 포함한, 나노포어의 전기 게이팅을 제공하기 위해 그래핀 층 중 하나 이상을 독립적으로 전기적으로 바이어싱하는 구성(configuration)을 가능하게 한다. 일 양태에서, 바이어싱(biasing)은 그래핀-유전체 스택에 임베딩된 전극을 개별적인 그래핀 층에 전기적으로 연결시키는 것에 의해 수행되고, 상기 바이어싱은 막에 인가된 전기장에 의해 생성된 나노포어 중 전기장을 변형시킨다.

본 명세서에서 제공된 방법 및 장치는 다양한 유전체 물질에 적합하다. 일 양태에서, 본 발명의 방법 및 장치는 산화 알루미늄, 산화 탄탈륨, 산화 티타늄, 이산화규소, 산화 하프늄, 산화 지르코늄, 질화 붕소, 질화 규소, 그의 나노적층물 또는 이들의 조합을 포함하는 유전체 층에 관한 것이다.

특정한 목적 전기적 파라미터는 장치 구성 외에, 상기 방법 또는 장치가 이용되는 환경(context)에 의존적이다. 관련된 전기적 파라미터의 예는 하기를 포함한다: 나노포어를 통한 전류 또는 전류 차단(current blockade); 나노포어에서의 터널 전류(tunneling current across the nanopore); 전도도; 횡 전극(transverse electrode)을 통한 전기화학적 전류(electrochemical current through a transverse electrode); 저항(resistance); 임피던스; 전위(eletric potential); 및 상기 나노포어를 통한 생체분자의 이동 시간 또는 통과 속도(transit speed). 다층에 임베딩된 전극을 나노포어와 관련하여 정확하게 정의하는 능력은 나노포어 전체에 걸친(예를 들면, 그에 직각인) 또는 나노포어의 축 방향에 따라 전기적 파라미터 측정을 가능하게 한다.

본 명세서에서 제공된 방법 및 장치는 화학적 모이어티를 노출된 나노포어 그래핀 가장자리에 부착시키는 것에 의해 나노포어에서 그래핀의 노출된 가장자리를 관능화시키는 단계를 더 포함한다. 화학적 모이어티는 주기적으로 생체분자의 통과 속도를 둔화시킬 수 있는 결합 친화도를 포함한, 생체분자의 일부에 대한 친화도를 가지며, 생체분자의 일부와 상호작용하는 화학적 모이어티는 생체분자가 나노포어를 통과할 때 모니터링되는 전기적 파라미터를 변화시킨다. 화학적 모이어티의 예는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 폴리아미노산, 항체, 수용체, 및 인공적으로 구축된 화학물질 및 표적 분자에 대한 높은 친화도를 갖는 화학적 작용기(chemical group)를 포함한, 생체분자의 특정한 뉴클레오티드, 아미노산 및/또는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열에 대한 인식 분자를 포함한다.

일 양태에서, 화학적 모이어티는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 목적 생체분자 내 서열에 결합하는 서열을 갖는 합성 분자, 단백질 및 폴리뉴클레오티드; 및 폴리뉴클레오티드인 생체분자 내 특정 뉴클레오티드에 대해 결합 친화도를 갖는 화학적 구조물(chemical construct), 예를 들면, A, G, C 또는 T 뉴클레오티드 결합 단백질 또는 화학적 구조물. 선택적으로, 화학적 모이어티와 특정 뉴클레오티드 간의 결합 친화도를 더 강화하기 위해, 화학적 모이어티가 결합된 생체분자 중 특정 뉴클레오티드는 상기 화학적 모이어티와의 친화도를 강화시키는 중원자(heavy atom), 화학적 관능기, 또는 태그(tag)로 표지된다.

일 구체예에서, 상기 방법은 생체분자를 그래핀-유전체 스택에 고정된 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 것에 의해 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 생체분자를 복수 개의 보다 작은 서열로 분해하여, 분해(digestion)에 의한 서열결정을 제공하는 단계를 더 포함한다. 일 양태에서, 복수 개의 보다 작은 서열의 적어도 일부는 폴리뉴클레오티드 서열의 개별적인 염기 또는 뉴클레오티드에 해당한다.

일 구체예에서, 상기 방법은 나노포어를 통과하는 생체분자에 뉴클레오티드를 첨가하는 것에 의해 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하여, 그에 의해 합성에 의한 서열결정을 제공하는 단계를 더 포함한다. 일 양태에서, 합성에 의한 서열결정은 그래핀-유전체 스택에 고정된 폴리머라아제에 의해 이루어지고, 첨가된 뉴클레오티드는 제1 유체 구획 중 뉴클레오티드의 공급원(source)으로부터 유래된다. 선택적으로, 합성에 의한 서열결정은 포어를 통과하는 생체분자에 뉴클레오티드를 첨가하는 동안, 예를 들면, 나노포어 전류 중 변화를 측정하는 것에 의해, 방출된 H⁺ 또는 피로포스페이트(pyrophosphate)를 검출하는 단계를 더 포함한다. 이 방식으로, 모니터링되는 전기적 파라미터는 생체분자에 첨가된 뉴클레오티드 종류를 반영한다. 또 다른 구체예에서, DNA를 풀고, 단일-가닥 DNA를 포어를 통해 통과시키기 위해 헬리카아제가 그래핀-유전체 스택에 고정되어, 가닥 서열결정(strand sequencing)을 가능하게 한다.

본 명세서에서 제공된 방법 및 장치는 생물학적 나노포어인 나노포어에 관한 것이다. 생물학적 나노포어(biological nanopore)는 나노포어인 구멍(aperture)을 포함하는 단백질 구조물(protein construct)을 더 포함하는 나노포어를 의미한다. 단백질은 규명될 생체분자 및 생체분자 파라미터에 따라 선택된다. 일 구체예에서, 단백질은 폴리머라아제, 뉴클레아제, 히스톤, 헬리카아제, 전사 인자, 알파 헤모라이신, 또는 마이코박테리움 스메그마티스 포린 A(Mycobacterium smegmatis porin A) 또는 GP10이다. 일 구체예에서, 단백질은 검출대상 표적 생체분자, 예를 들면, 생체분자의 단백질로의 결합 영역으로 본 명세서에서 지칭된 생체분자의 특정 영역을 포함한, 표적 생체분자에 대한 높은 결합 친화도를 갖는 단백질 나노포어에 근거하여 선택된다.

일 양태에서, 본 명세서에서 제공된 방법 및 장치는 제1 유체 구획과 유체 및 전기적 접촉 상태인 최상부(top-most) 그래핀 층과 같은, 층의 레이아웃 및 포지셔닝(positioning)의 측면에서 특징지워질 수 있다. 이 양태의 구체예에서, 전기적 파라미터는 제1 유체 구획의 유체와 유체 및 전기적 접촉 상태인 그래핀 층에 의한 저항 측정값(resistive measurement)으로부터이다.

일 구체예에서, 본 명세서에서 제공된 방법은 유체 구획 및 나노포어 중 유체로부터 전기적으로 절연된 그래핀 층에 의한 전계 효과 게이팅 또는 전계 효과 센싱에 의해 전기적 파라미터를 측정한다. 이 구체예에서, 그래핀 층은 스택의 내부 층일 수 있고, 하나 이상의 나노리본에 의한 것과 같은, 정확한 게이팅 또는 센싱을 제공하기 위해 포트에서 국소 AC 또는 DC 포텐셜을 인가하도록 형성될 수 있다.

본 명세서에서 제공된 방법은 이중가닥 폴리뉴클레오티드 서열인 생체분자에 관한 것일 수 있고, 상기 방법은 이중가닥 폴리뉴클레오티드 서열을 언지핑(unzip)하고, 상기 이중가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 단일 가닥을 나노포어를 통해 추진시켜, 그에 의해 상기 생체분자의 서열결정을 제공하는 단계를 더 포함한다. 일 양태에서, 언지핑은 다층 스택, 예를 들면, 그래핀-유전체 스택에 고정된 헬리카아제에 의해 이루어진다.

일 양태에서, 또 다른 그래핀 층을 통해 전기화학적 전류를 측정하는 매립 그래핀 층을 포함한, 복수 개의 전도층, 예를 들면, 3개 또는 4개의 층이 제공된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 명세서에서 제공된 방법을 구현하는 장치, 예를 들면, 생체분자 파라미터를 규명하기 위한 장치를 포함한, 장치이다. 일 양태에서, 상기 장치는 막이다. 막은 제1 표면 및 상기 제1 표면에 대향하는(opposite) 제2 표면을 갖고, 상기 막은 제1 유체 구획을 제2 유체 구획으로부터 분리한다. 일 양태에서, 막의 제1 및 제2 표면은 각각 제1 유체 구획 및 제2 유체 구획의 표면을 형성한다. 일 양태에서, 상기 막은 그래핀/유전체/그래핀/유전체 스택, 예를 들면, 제1 구획과 제2 구획을 유체 연결하는 막을 통한 나노포어를 갖는 막의 제1 표면과 제2 표면 사이에 배치된, 그래핀/Al₂O₃/그래핀/Al₂O₃ 스택을 포함한다. 일 양태에서, 그래핀/유전체 다층 스택의 최외각 층은 제1 표면 및 제2 표면을 형성한다. 대안적으로, 그래핀/유전체 다층 스택의 최외각 층 중 하나 또는 두 개 모두 상기 그래핀/유전체 다층 스택의 최외각 층을 유체 구획으로부터 적어도 부분적으로 분리하는 코팅층으로 코팅된다. 일 양태에서, 최외각 그래핀 층은 유전체 층 또는 Al₂O₃ 코팅 층을 포함한, 전기적 절연층 또는 유전체 층으로 적어도 부분적으로 코팅된다. 상기 장치는 또한 제어되고 집속된 전기장 및 나노포어를 통과하거나 또는 그와 상호작용하는 생체분자의 생체분자 파라미터를 규명하기 위해 이용된 전기적 파라미터의 상응하는 검출을 제공하는 성분들을 더 포함할 수 있다. 그와 같은 성분들의 예는 제1 유체 구획과 제2 유체 구획 간 전위차를 제공하기 위한 전원 또는 전압 공급원, 생체분자가 제1 유체 구획과 제2 유체 구획 간 인가된 전위차 하에 생체분자가 나노포어를 통과할 때, 나노포어를 통한 전류, 그래핀 층 또는 횡 전극을 통한 전기화학적 전류를 포함한, 나노포어를 통한 생체분자의 통과와 연관된 전기적 파라미터를 검출하는 검출기, 및 게이트, 센싱, 소스 및 드레인(drain) 전극과 같은 전극을 포함한다.

일 양태에서, 상기 장치는 하나 이상의 게이트 전극을 더 포함하고, 상기 하나 이상의 게이트 전극 각각은 다층 스택 중 그래핀 층이다. 일 양태에서, 게이트 전극은 스택 중 하나 이상의 그래핀 층에 독립적으로 전기적으로 연결된다. 일 양태에서, 게이트 전극은 그래핀 층의 적어도 일부로부터 형성되고, 예를 들면, 전기장 생성 및/또는 전기적 파라미터 검출을 집중시키기 위한 팁 말단 구조(tip end geometry)를 갖거나, 나노리본인 전극이다.

일 양태에서, 전도층, 그래핀 층, 또는 유도체 층은 두께의 측면에서 기술된다. 일 구체예에서, 전도층 또는 그래핀 층은 나노포어에서 3 nm 이하의 두께를 갖는다. 일 구체예에서, 전기 접점(electrical contact)은 전도층 또는 그래핀 층과 전기적으로 접촉한 금속 패드(metal pad), 예를 들면, Ti/Au 패드 및 상기 금속 패드와 전기적으로 접촉한 전도성 와이어(electrically conductive wire)를 포함하고, 상기 금속 패드는 제1 유체 구획 및 제2 유체 구획과 전기적으로 절연된다.

일 구체예에서, 게이트 전극은 전원에 의해 통전된(powered) 소스 전극에 전기적으로 연결된다.

본 명세서에서 제공된 그래핀 층은 나노포어가 나노리본 장축에 대해 가로 방향으로 통과하는 것인 나노리본을 포함할 수 있다. 나노리본은 선택적으로 나노포어를 통한 생체분자의 통과 동안 나노리본을 따라 횡 전류를 측정하기 위한 전기 접점을 포함하고, 그래핀 층 중 또 다른 하나는 그래핀 층을 전기적으로 바이어싱하기 위해 게이트 전극에 연결된다. 일 구체예에서, 본 명세서에서 제공된 나노포어는 나노리본 폭의 5%보다 크거나 또는 나노리본 폭의 5% 내지 95% 범위로부터 선택된 직경을 갖는다. 이 방식으로, 나노리본은 목적 적용에 따라 비교적 좁거나 또는 비교적 넓은 원주 영역에 의해 환상으로(circumferentially) 나노포어를 둘러쌀 수 있다. 나노리본에 전기적으로 연결된 게이트 전극은 시스템에 추가적인 제어를 제공하기 위해 독립적으로 나노리본을 전기적으로 바이어싱하는 능력을 제공한다.

일 양태에서, 상기 검출기는 상호 간에 대면하고, 나노포어에서 생체분자의 통과 방향에 대한 횡 방향으로 나노포어 내에서 중앙에 위치한 한쌍의 전극을 포함하는 터널 검출기(tunneling detector)이고, 상기 생체분자는 상기 쌍의 전극 사이를 통과한다.

대안적인 구체예에서, 본 명세서에서 생체분자 파라미터를 규명하기 위한 나노포어를 포함하는 막을 제조하는 방법이 제공된다. 일 양태에서, 상기 방법은: Al₂O₃ 막을 포함한 독립된(free-standing) 유전체 막에 통로를 형성하는 단계; 화학 증착(chemical vapor deposition)을 통해 그래핀 층을 성장시키는 단계; 상기 그래핀 층의 적어도 일부를 상기 독립된 유전체 막에 코팅하거나 또는 전달하는 단계; 상기 그래핀 층 위에 유전체 층을 형성하는 단계; 상기 그래핀 층 단계를 반복하여 제2 그래핀 층을 생성하는 단계; 유도체 증착(dielectric deposition) 단계를 반복하여 제2 유도체 층을 생성하는 단계; 상기 막의 제1 표면으로부터 상기 막의 제2 표면까지 연장되는 나노포어를 형성하고, 상기 나노포어는 그래핀 층과 유도체 층 각각을 횡단하는 것인 단계를 포함하고, 그에 의해, 그래핀/유도체/그래핀/나노체 스택 중 나노포어를 포함하는 막을 제조한다. 상기 유도체 층을 형성하는 단계 및 전달된 그래핀 층에서 반복하는 단계는 금속 시드 층(metal seed layer)의 존재 또는 부재 하에 수행될 수 있다.

일 양태에서, 상기 방법은 제1 그래핀 층, 제2 그래핀 층 또는 제1 그래핀 층과 제2 그래핀 층 모두를 전기 접점과 전기적으로 접촉시켜 독립적인 전기적으로 게이팅된 나노포어를 제공하는 단계를 더 포함한다.

일 구체예에서, 상기 반복하는 단계는 3개 이상의 그래핀 층을 생성하기 위해 반복되고, 인접한 그래핀 층은 유도체 층에 의해 분리된다. 이 방식으로, 스택은 임의의 갯수의 그래핀 층을 포함할 수 있고, 최상부층과 최하부층 중 어느 것도 그래핀 층을 포함하지 않거나, 최상부층과 최하부층 중 하나 또는 둘 모두가 그래핀 층을 포함하는 것인 스택을 포함한다. 일 양태에서, 그래핀 층 중 하나 이상은 독립적인 전기적 게이트 나노포어를 제공하기 위해 전기적으로 접촉된다.

일 양태에서, 상기 방법은 나노포어 내 및 그에 인접한 국소화된 전기장을 변형시키기 위해 나노포어 막에 게이트 전극을 임베딩시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 방식으로, 본 명세서에서 제공된 장치는 나노포어 내 및 그에 인접한 국소화된 전기장을 변형시키도록 구성된 임베딩된 게이트 전극을 갖는다. 일 양태에서, 임베딩된 게이트 전극은 막의 그래핀 층 중 하나를 포함한다.

일 양태에서, 유도체 층은 원자층 증착(atomic layer deposition)에 의해 증착된 유도체를 포함한다. 일 양태에서, 유도체 층은 Al₂O₃, Ta₂O₅, SiO₂, Si₃N₄, 산화 알루미늄, 산화 탄탈륨, 산화 하프늄, 산화 지르코늄, 이산화규소, 또는 질화 규소, 또는 이들의 조합을 포함한다.

일 구체예에서, 본 명세서에서 제공된 방법 및 장치는 휘트스톤 브릿지 구조의 전기 회로 레이아웃(electrical circuit layout)을 갖는다. 따라서, 상기 방법은 나노포어에서 전기적 파라미터를 측정하기 위한 휘트스톤 브릿지 구조에서 3개 이상의 그래핀 층을 전기적으로 연결시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 휘트스톤 브릿지는 브릿지 회로의 상이한 다리에 균형을 맞추는 것(balance)에 의해 미지의 전기적 파라미터를 측정하는 능력을 제공한다. 일 양태에서, 전기적 파라미터는 차동 임피던스, 터널 전류, 저항, 정전 용량, 전류 또는 전압 중 하나 이상이다.

일 양태에서, 상기 방법은 3개 이상의 그래핀 층의 중앙 그래핀 층을 상기 3개 이상의 그래핀 층의 2개의 외각 그래핀 층 대비 AC 바이어스로 전기적으로 바이어싱하는 단계를 더 포함한다. 이 방식으로, 상기 방법은 중앙 그래핀 층과 외각 그래핀 층간의 임피던스를 모니터링하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 하나 이상의 그래핀 층을 AC 전압 신호로 바이어싱하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 제1 유체 구획을 제2 유체 구획으로부터 분리하는 현탁된 막 중 나노포어를 제공하는 것에 의해 생체분자의 메틸화 또는 히드록시메틸화 상태를 식별, 규명, 또는 정량하는 방법에 관한 것이다. 막은 산화 알루미늄, 산화 탄탈륨, 산화 티타늄, 이산화규소, 산화 하프늄, 산화 지르코늄, 질화 붕소, 질화 규소, 그의 나노적층물(nanolaminate), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 막은 유전체 층에 의해 분리된 그래핀과 같은 복수 개의 전기 전도층을 포함한, 전기 전도층(electrically conducting layer) 및 유전체 층을 포함하는 다층 스택, 또는 본 명세서에서 제공된 스택이다. 특정한 단백질, 올리고뉴클레오티드 또는 화학적 태그가 표적 생체분자 상의 메틸화 또는 히드록시메틸화 부위에 결합된다. 생체분자를 나노포어를 통해 추진시키기 위해, 제1 유체 구획으로부터 제2 유체 구획까지, 막에 전기장이 인가된다. 상기 생체분자 상의 결합된 단백질 또는 태그는 생체분자의 나노포어를 통한 통과 동안 이온 전류, 터널 전류, 전압, 전도도, 또는 임피던스의 변화를 모니터링하는 것에 의해 검출된다.

일 양태에서, 상기 방법은 생체분자가 나노포어를 통과할 때, 생체분자로부터 결합된 단백질 또는 태그를 순차적으로 전단(shear)시키는 단계를 더 포함한다.

일 구체예에서, 본 명세서에서 공개된 장치 및 방법은 단일 분자 수준에서 또는 분자의 집합물(collection) 또는 응집체(aggregate)로부터 생화학적 반응에 따른 피로포스페이트의 생성 및 pH 변화를 검출하기 위해 사용되는 나노스캐일(nanoscale) pH 센서에 관한 것이다.

특정한 이론에 의해 한정되기를 원하지 않으면서, 본 발명의 구체예와 관련된 기본 원칙 또는 메카니즘의 신념 또는 이해의 검토가 있을 수 있다. 설명 또는 가설의 궁극적인 정확도와 관련없이, 본 발명의 구체예는 그럼에도 불구하고 작용하고, 유용할 수 있다.

상세한 설명

"생체분자(biomolecule)"는 본 명세서에서 생물계에 관련된 분자를 의미하는 것으로 광범위하게 사용된다. 상기 용어는, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 폴리펩티드, 단백질, 또는 이들의 조합을 포함한다. 생체분자는 천연(naturally occurring)일 수 있거나, 또는 공학적으로 제조(engineer)되거나 또는 합성일 수 있다. "생체분자 파라미터(biomolecule parameter)"는 생체분자의 측정가능한 또는 정량가능한 특성을 의미한다. 파라미터는 생체분자에 대한 상수(constant), 예를 들면, 서열 또는 서열 부분일 수 있다. 파라미터는 특정한 생체분자에 대해 생체 분자의 상태 또는 조건에 따라 변할 수 있고, 예를 들면, 메틸화 상태, 결합 사건(binding event) 및/또는 이차 구조인 생체 파라미터일 수 있다. "전기적 파라미터(electrical parameter)"는 전기적으로 측정 또는 결정될 수 있고 생체분자 파라미터와 관련된 파라미터를 의미한다. 따라서, 전기적 파라미터는 속성상 전기적일 수 있거나, 또는 속성상 전기적인 근본적 파라미터에 의해 기초하여 결정된 비-전기적(non-electrical) 파라미터, 예를 들면, 통과(transit) 또는 이동(translocation) 시간, 유량(flux), 또는 이동 주파수(translocation frequency)일 수 있다.

"메틸화(methylation)"는 메틸화된 하나 이상의 잔기를 갖는 DNA를 의미한다. 예를 들면, 모든 척추동물 게놈에서, 사이토신 잔기의 일부는 메틸화된다. DNA 메틸화는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있고, 일부 유전자의 경우, DNA 메틸화는 암에 대한 후성적(epigenetic) 마커이다. DNA 메틸화의 두 개의 상이한 양태가 중요할 수 있다: 메틸화 수준 또는 함량 및 메틸화의 패턴. "메틸화 상태(methylation state)"는 후성 유전학(epigenetics), 질병 상태 또는 DNA 상태(status)의 관점에서 관심있는 메틸화의 측면을 의미하는 것으로 본 명세서에서 광범위하게 사용되고, 메틸화 함량, 분포, 패턴, 밀도, 및 DNA 서열에서의 그의 공간적 변화(spatial variation)를 포함한다. 나노포어를 통한 메틸화 검출은 미국출원공개 제2012/0040343호 (168-08)에서 더 검토된다.

또한, 생체분자 파라미터는 측정가능하고 나노포어를 통한 생체분자 통과에 의해 영향받는 정량적 변수, 예를 들면, 나노포어를 통한 이동 속도(translocation speed), 생체분자가 포어에 들어가고 통과하는 것에 따른 나노포어에서의 전기적 파라미터의 변화(예를 들면, 전기장, 이온 전류, 저항, 임피던스, 정전 용량, 전압의 변화), 생체분자와 화학적 모이어티에 의해 관능화된 나노포어 표면 영역 간의 생화학적 반응으로부터 일어나는 변화, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제 기능을 갖는 화학적 모이어티를 통한 것을 포함한 pH 변화를 의미한다.

"유전체(dielectric)"는 비-전도성 또는 절연(insulating) 물질을 의미한다. 일 구체예에서, 무기 절연체는 실질적으로 탄소를 포함하지 않는 유전체 물질을 포함한다. 무기 유전체 물질의 특정한 예는 질화규소, 이산화규소, 질화붕소, 및 알루미늄, 티타늄, 탄탈륨, 또는 하프늄의 산화물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "고-k 유전체(high-k dielectric)"는 유전체 물질의 특정한 종류(class), 예를 들면, 일 구체예에서, 이산화규소보다 더 큰 유전 상수(dielectric constant)를 갖는 유전체 물질을 의미한다. 일부 구체예에서, 고-k 유전체는 이산화규소보다 2배 이상 높은 유전 상수를 갖는다. 유용한 고-k 유전체는 Al₂O₃, HfO₂, ZrO₂, HfSiO₄, ZrSiO₄ 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일 양태에서, 본 명세서에서 제공된 방법 및 장치는 Al₂O₃인 유전체를 갖는다.

"전도체-유전체 스택(conductor-dielectric stack)"은 복수 개의 층으로, 하나 이상의 층은 전기 전도체를 포함하고, 또 다른 층은 유전체를 포함하는 것을 의미한다. 일 구체예에서, 하나의 층(layer)은 기하학적으로 패턴화(patterned)되거나 침착된(deposited) 것, 예를 들면, 나노포어에 의해 형성된 통로를 가로지르는 종 방향을 갖는 전도성 나노리본인 전도층을 포함하는 나노리본 구조일 수 있다. 일 양태에서, 상기 스택은 2개 이상의 층, 3개 이상의 층, 또는 5개 이상 내지 20개 이하의 범위의 층을 포함한다. 일 양태에서, 인접한 전도체 층(conductor layer)은 유전체 층에 의해 서로로부터 분리된다. 일 양태에서, 최외각 층(outermost layer)은 전도층, 유전체 층, 또는 유전체인 하나의 최외각층이고, 스택의 다른 말단에 있는 나머지 최외각층은 전도체이다. 일 양태에서, 통전된(electrically energized) 하부 전도체 층(underlying conductor layer)을 덮는 유전체 층을 선택적으로 패턴화하는 것에 의해 막 주변에 국소 전기장이 인가되고, 제어될 수 있다. 본 명세서에서 제공된 방법 및 장치는 그래핀인 전도층을 갖는다. 본 명세서에 예시된 바와 같이, 용어, 그래핀(graphene)은 원하는 경우, 다른 원자 두께 박막 전도층, 예를 들면, MoS₂, 도핑된 실리콘, 실리센, 또는 극박 금속에 의해 대체될 수 있다.

"유체 소통(fluid communication)" 또는 "유체 연결(fluidly connects)"은 전해질, 구체적으로, 전해질 중 이온을 막의 한 쪽(예를 들면, 제1 유체 구획)으로부터 막의 나머지 쪽(예를 들면, 제2 유체 구획)으로, 또는 반대로 흐를 수 있게 하는 나노통로(nanopassage)를 의미한다. 일 양태에서, 유체 소통 연결(fluid communication connection)은 나노포어를 통한 통과를 용이하게 하기 위한 인가된 전기장 없이 생체분자가 양쪽 면 사이를 통과할 수 있게 하기에 불충분하다. 이는 나노포어 기하학적 구조(예를 들면, 직경), 나노포어 표면 관능화(functionalization), 나노포어 및 생체분자를 통한 인가된 전기장 및 유체 선택의 조합에 의해 제어될 수 있다.

"특이적 결합(specific binding)"은 하나의 성분이 표적화된 특징을 갖는 것인 두 성분 간의 상호작용을 의미한다. 상기 하나의 성분이 표적화된 특징을 갖는 경우에만 결합이 일어나고, 표적화된 특징의 부재 하에 실질적으로 결합이 일어나지 않는 경우에만 결합이 일어난다. 일 구체예에서, 표적화된 특징은 뉴클레오티드 종류(예를 들면, A, T, G, C), 아미노산, 또는 뉴클레오티드의 특정한 서열이다.

본 발명은 하기의 비-한정적 실시예에 의해 더 이해될 수 있다. 본 명세서에서 인용된 모든 참조문헌은 이에 의해 그 개시와 불일치하지 않는 정도까지 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 명세서의 설명은 다수의 특이성을 포함하나, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해되어서는 안 되고, 단지, 본 발명의 바람직한 구체예 중 일부의 예시를 제공하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 본 발명의 범위는 주어진 실시예에 의해서가 아니라, 첨부된 청구항 및 그의 균등물에 의해 결정되어야 한다. PCT 공개 WO 2010/080617 (Atty ref. 168-08WO), 미국출원 공개 제2012/0040343호 및 미국출원 공개 제2011/0226623호 (Atty ref. 56-09, filed Dec. 17, 2010)는 인가된 전기장 하에서 나노포어를 통한 생체분자의 통과에 의한 생체분자 규명(characterization)과 관련된 것으로 본 명세서에서 제공된 시스템, 장치, 및 방법에 대한 것과 불일치하지 않는 정도까지 참조에 의해 구체적으로 포함된다.

도 1. 그래핀-Al₂O₃ 나노포어의 제조(fabrication): (a) 독립된 Al₂O₃ 막에서 FIB(focused ion beam) 도구를 이용하여 300 nm 직경 포어를 먼저 형성한다. (b) CVD 성장 그래핀(CVD grown graphene)을 칩으로 이동시킨다. (c) 시드 층(seed layer)으로서 1.5 nm Al을 증발시키고, 칩 상에 6.5 nm의 ALD Al₂O₃ (d1)를 침착(deposit)시킨다. 금 패드를 이용하여 g2와 접촉시키기 위해 칩의 가장자리(edge)까지 연장되는 또 다른 그래핀 층을 이동시키고 Al/Al₂O₃ 침착(d2)을 반복한다. (d) FEGTEM 나노포어 형성.
도 2. 그래핀-Al₂O₃ 나노포어 전기적 규명(electrical characterization). (a) 다양한 크기의 그래핀-Al₂O₃ 나노포어의 IV 특징은 선형적 반응을 보인다. 막은 무시할 수 있는 정도의 전도도를 갖는다는 것에 유의한다. 적합화된 데이터(fitted data)는 수치적으로 계산된다. (삽도(Inset)) 그래핀-Al₂O₃ 나노포어의 1/f 잡음(noise)은 Al₂O₃ 나노포어보다 우수하지는 않을지라도, 그와 유사하다. (b) 이러한 막 및 나노포어는 나노포어 직경에 의존적인 것으로 표시된 안정한 전도도 값을 보인다.
도 3. 그래핀-Al₂O₃ 나노포어를 통한 λ-DNA 수송. (a) 나노포어를 통한 λ-DNA의 수송(transport)를 보여주는 개략도(schematic). λ-DNA는 ~1.33 ㎛의 회전 반경(radius of gyration)을 갖고, 따라서, 표시된 바와 같이 전해질 용액에서 큰 수퍼코일 볼(supercoiled ball)을 형성한다. (ii) 나노포어 중 DNA 스레딩(threading) 과정. (b) 11.3 nm 그래핀-Al₂O₃ 나노포어를 통한 λ-DNA의 특징적인 이동 사건(translocation event). 명확한 하향 차단(downward blockade)이 관찰된다. (c) 400mV에서 기록된 562 건의 이동 사건으로부터 작성된 사건 전류 막대그래프(event current histogram). 두 개의 별개의 전류 피크가 관찰된다; 포어를 통한 선형 dsDNA 수송을 나타내는 1, 및 포어를 통한 폴딩된 DNA 수송을 나타내는 2. 이 현상은 (d)에 보다 상세하게 예시되고, (e)에서 요약 막대그래프(summary histrogram)로 예시된다.
도 4. DNA-단백질 결합: 그래핀/Al₂O₃ 나노포어를 통한 ERα/ERE의 수송 (a) 단일 ERE를 포함하는 DNA에 결합된 ERα의 개략도. (b) ERE 서열 (c) 낮은 염 농도에서 ERα/ERE 복합체의 형성을 확인하는 겔-이동 분석(gel-shift assay). 320 mM KCl보다 높은 염 농도에서, 단백질-DNA 밴드는 관찰되지 않는다. (d) 나노포어를 통한 dsDNA 수송을 보여주는 개략도. (e) 14 nm 직경 포어로의 ERα/ERE 복합체의 도입은 전류 증강(current enhancement)을 초래했다(상향 스파이크). (f) ERα/ERE 에 대한 이동 시간 대 전류 증강 산점도(scatter plot)(삽도). 전류 증강 막대그래프는 0.4 nA에서 피크를 갖는 가우스 분포를 보여준다. (g) 1M KCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 및 전해질 pH 8에서 500 mV 인가된 전압에서 23 nm 그래핀 Al₂O₃ 나노포어를 통한 RecA-코팅 DNA 이동 시료 전류 기록(trace). I_BL은 기준 전류(baseline current)이고, 하향 스파이크(downward spike)는 포어를 통한 유리 RecA 단백질 또는 단일/복수 RecA-코팅 DNA 분자의 수송에 해당한다. 삽도(inset)는 10 nm의 기준 자(scale bar)를 갖는, 나노포어의 TEM 이미지이다. (h) 500 mV 인가 바이어스(applied bias)에서 전류 차단(current blockage) 대 이동 시간 (t_D)을 보여주는, 1368건의 이동 사건으로부터 작성된 사건 밀도도(event density plot). 범례 막대(legend bar)는 사건의 수를 나타낸다. (i) 3개의 별개의 피크가 관찰되고, 500 mV에서의 전류 차단 막대그래프. 가우스 피트(Gaussian fit)는 결합되지 않은 RecA 단백질, 단일 RecA-코팅 DNA 분자, 및 복수의 RecA-코팅 DNA 분자의 동시 수송을 나타낸다. (j) RecA 코팅 dsDAN의 수송을 보여주는 고 주기 해상도 전류 기록도(high temporal resolution current trace):. i. 유리 RecA 단백질 이동. 사건은 빠르고 낮은 진폭이다. ii. 단일 RecA DNA 이동. 사건은 유리 RecA에 의해 관찰된 것보다 진폭이 더 깊고 길다. iii. 복수 개의 RecA 코팅 DNA 분자의 동시 이동. 이동 사건은 단일 RecA DNA 케이스에서 관찰된 것보다 더 길고 깊은 진폭이다.
도 5. (a) 효소 메틸화 DNA 단편으로 개시한다. (b) 메틸화 DNA 시료에 메틸화 DNA 결합 단백질을 첨가한다. (c) 안정한 MBD 단백질 결합 DNA 복합체를 형성하기 위한 인큐베이션 단계. (d) 나노포어 유체 셋업(nanopore fluidic setup)의 시스(cis) 챔버 내로의 MBD 단백질-DNA 복합체의 도입.
도 6. (a) 비메틸화(unmethylated) DNA의 통과(passage); 얕은 전류 차단(shallow current blockade)이 관찰된다. (b) 단일 메틸화 CpG 디뉴클레오티드에 결합된, MBD2 (MBD1, MeCP도 이용될 수 있음)와 같은, MBD를 갖는 DNA의 통과. 두 개의 차단 수준이 관찰된다: DNA에 의한 얕은 차단, MBD에 의한 깊은 차단. (c) 복수 개의 결합된 MBD 단백질을 갖는 DNA의 통과, 전류 신호(current signature)는 단일 분자에서의 메틸화 정량 및 메틸화 부위의 맵핑을 가능하게 한다.
도 7. (a) 나노포어의 등전점이 5 내지 7의 pH 범위에 있는 것으로 가정한, 높은 pH 및 낮은 pH에서의 포어 표면 상 반대 이온 응축(counterion condensation)을 보여주는 개략도. (b) KCl 농도 및 용액 pH의 함수인 18±1 nm 직경 그래핀-Al₂O₃ 포어의 pH 반응. (c) 포어 크기의 효과: KCl 농도 및 용액 pH의 함수인 8±0.5 nm 직경 그래핀-Al₂O₃ 포어의 pH 반응. 두 경우 모두에서 강한 pH 반응이 관찰된다.
도 8. (a) 그래핀 게이트 나노포어 측정 셋업(graphene gated nanopore measurement setup). 그래핀 층 2 (g2)는 나노포어 칩의 가장자리에서 250 nm Ti/Au 패드를 사용하여 접촉된다. 모든 전류 측정에서 게이트 및 소스는 함께 묶인다. (b) 나노포어 칩을 PCB에 장착(mount)하고, Ti/Au 패드를 In 와이어를 이용하여 접촉시킨다. 터미널(1 및 2)을 통한 저항은 통상적으로 ≤ 15 kΩ이어서, 제조(fabrication) 후 전도성 그래핀 쉬트의 존재를 확인한다. (c) 나노포어 칩을 갖는 PCB를 표시된 바와 같은 유체 셋업으로 장착하고, 이는 전도성 용액으로부터 금속 접촉 패드를 단리한다.
도 9. 부동(floating) 소스 및 게이트에 고정된 게이트(그래핀 층 2)를 갖는 19 nm 직경 그래핀-Al₂O₃ 나노포어의 전류-전압(I-V) 특징. 3개의 행은 10.9, 7.6 및 4의 고정된 pH 값에서 수득된 I-V 측정값을 나타내고 3개의 열은 1 M, 100 mM 및 10 mM의 고정된 KCl 농도에서 수득된 I-V 측정값을 나타낸다. 조사된 모든 농도에서 pH 10.9에서 유의성 있는 전류 정류(current rectification)를 관찰했다. 이 효과는 pH 4에서 크게 감소되었다.
도 10. 단일 분자 DNA 서열결정을 위한 나노포어를 갖는 그래핀 나노리본. (a) 도 1에 표시된 아키텍쳐의 그래핀 층 2(g2)에 패턴화된 그래핀 리본의 SEM 이미지. (i-iii) 증가하는 확대 비율의 리본의 SEM 이미지를 보여준다. (iv) TEM을 이용한 GNR의 중심에 천공된(drilled) 14 nm 포어. (b) 임베딩된 그래핀 게이트를 갖는 고체-상태 나노포어 상의 그래핀 나노리본의 개략도. 그래핀 게이트는 이동 속도를 정전기적으로 제어하기 위해, 예를 들면, 나노포어를 통한 ssDNA 이동 속도를 감소시키기 위해 충분히 작은 리본에 대해 p-형 또는 n-형 거동을 달성할 수 있다. 그래핀 리본은 각각의 뉴클레오티드가 그의 횡 전도도(transverse conductance)를 독특하게 조절(modulate)하는, 뉴클레오티드 판독기(reader)로 작용할 수 있다. 나노포어에서 그래핀 리본 가장자리의 관능화는 뉴클레오티드 특이적 상호작용을 더 강화할 수 있다.
도 11. (a) 전류보다는 전압을 이용하여, 개별적인 DNA 및 단백질을 측정하는 나노채널 중 휘트스톤 브릿지 전극 아키텍쳐(Wheatstone Bridge electrode architecture). (b) 이 시스템의 등가 회로(equivalent circuit).
도 12. (a) 스택에 패턴화된 나노포어를 갖는 다층 그래핀/Al₂O₃ 구조물. 각 그래핀 층은 (b)에 표시된 바와 같이 층 간의 오버랩(overlap)을 최소화하도록 패터닝된다. 그래핀 층은 (b)에 표시된 바와 같이 전압 측정을 이용하여 나노포어에서 개별적인 분자가 감지될 수 있게 수직 휘트스톤 브릿지 아키텍쳐(vertical Wheatstone Bridge architecture)를 형성하기 위해 바이어싱된다. 또한, 이 아키텍쳐는 분자의 길이를 따라 지형 정보(topographic information)의 민감한 검출을 용이하게 한다.
도 13. 나노포어 어레이 제조(Nanopore Array Fabrication) (a) i. 현수된 (suspended) Al₂O₃/SiN 막으로 개시하고, ii. e-빔 리소그래피를 이용하여 ZEP520을 패터닝하며, iii. RIE를 이용하여 SiN으로 패턴을 이동시키고, iv. ICP-RIE에서 수행된 BCl₃ 에치(etch)를 이용하여 Al₂O₃로 패턴을 이동시킨다. (b) Al₂O₃ 및 SiN 층의 두께를 보여주는, (a) 파트 i로부터의 윤곽이 표시된(outlined) 영역의 SEM 단면도. (c) 이 공정을 이용하여 형성된 15 nm 직경 포어의 어레이. (d) 이 공정을 이용하여 형성된 65 nm 미만(sub-65 nm) 직경 포어의 어레이.
도 14. 극박(ultra-thin) 그래핀/Al₂O₃ 막 중 단일 나노포어의 제조. (a) ~300 nm 직경 FIB 포어를 (b)의 TEM 이미지에 의해 표시된 바와 같이 먼저 형성한다. (c) 그 후, 그래핀을 이동시켜서, 회절 이미징 (d) 및 라만 분광법(Raman spectroscopy) (e)을 이용하여 확인된 현수된 단층 두께 막을 얻는다. (f) 15 Å 두께의 Al 시드 층을 침착시키고, 뒤이어 60 Å의 ALD Al₂O₃를 침착시킨다. (g) 집속 수렴성 전자 빔(focused convergent electron beam)을 이용하여 이 현수된 막에 단일 나노포어를 분해적으로(decompositionally) 스퍼터링한다. (h) 이 공정을 이용하여 형성된 25 nm 직경 포어의 TEM 이미지.
도 15. 나노포어 DNA 분석의 경향. DNA 이동을 조절(regulate)하는 방법은 α-헤모라이신 및 고체-상태 나노포어 모두에 대해, 이 기술의 개시 이후 매년 DNA 이동 속도의 상당한 감소를 가져왔다. 생물학적 나노포어(biological nanopore)의 최근 진보는 ~0.1 nt/ms 만큼 낮은 ssDNA 수송 속도를 초래하고, 민감도를 (단일 뉴클레오티드까지) 개선시키고, 천연(native) α-헤모라이신의 부위-특이적 돌연변이유발(mutagenesis)를 통해 DNA 가공 효소의 내포(incorporation), 뉴클레오티드의 화학적 표지화, 및 아미노사이클로덱스트린 어댑터의 부착을 달성하여, DNA 서열결정을 가능하게 했다. 유사한 경향이 고체-상태 나노포어에서 관찰된다; 이동 속도의 감소 및 개선된 민감도가 용액 조건(온도, 점도, pH)의 최적화, 화학적 관능화, 표면 전하 조작(engineering), 막의 두께 및 조성 변화, 및 보다 작은 직경의 나노포어의 사용(그에 의해 중합체-포어 상호작용을 강화함)에서 기인되는 것으로 고려된다. 고체-상태 나노포어를 이용한 DNA의 신속한 전자 서열결정(electronic sequencing)을 가능하게 하기 위해 DNA 속도의 추가적인 감소(1 내지 10 nts/ms의 속도가 고해상도 DNA 분석을 위해 이상적임) 및 민감도의 실질적인 개선이 요구된다. 새로운 감지 방법(sensing modality) 및 아키텍쳐(터널 접합(tunneling junction), 용량성 나노포어 구조(capacitive nanopore structure), 그래핀 게이트 등)의 개발이 이 목적을 위한 연구에서 매우 중요할 것이고, 그러나, 이러한 기술의 개발에서 여전히 상당한 도전과제에 직면하고 있다(표 1). 이 도면은 DNA 수송의 둔화 또는 강화된 민감도를 보고한 주요한 나노포어 개발을 포함하나, 완전한 목록은 결코 아니다. 이 도면의 각 데이터는 참조된 연구(referenced study)에서 검출된 참조 번호(reference number) 및 가장 짧은 분자를 포함한다.
도 16. DNA 서열결정용 생물학적 나노포어. (a) i. α-헤모라이신의 구조적 단면도. 1.4 nm 협착부(constriction)는 ssDNA의 통과를 가능하게 하나, dsDNA의 통과는 허용하지 않는다. ii. 개별적인 뉴클레오티드가 아미노사이클로덱스트린 변형 α-헤모라이신 나노포어를 횡단할 때 개별적인 뉴클레오티드에 의해 유도된 통상적인 전류 차단 수준. iii. 최적화된 조건 하에서 α-헤모라이신의 뉴클레오티드 분리 효율. 엑소뉴클레아제와 결합된, 분해(digestion)에 의한 서열결정 방식이 제시된다. (b) i. MspA의 구조적 단면도. ii. MspA를 통한 듀플렉스 단절 DNA(duplex interrupted DNA)의 이동에 의해 유도된 통상적인 전류 차단. 듀플렉스 단절 분자의 뉴클레오티드의 각 트리플렛(triplet)에 대해 고유한 전류 수준이 관찰된다. iii. α-헤모라이신 대비, MspA의 증가된 분리 효율을 보여주는 막대그래프.
도 17. DNA 분석을 위한 고체-상태 나노포어 아키텍쳐. (a) Al₂O₃ 나노포어 i. FEB(focused electron beam)을 이용한, ALD Al₂O₃ 막 중 나노포어의 형성 및 제어된 수축. 서브-nm 정확도가 달성가능하다. ii. 선형의 폴딩되지 않은(unfolded) dsDNA 수송에 해당하는 단일 차단 수준을 보여주는, 5 nm 직경 Al₂O₃ 포어를 통한 5 kbp dsDNA 이동의 산점도. (b) 그래핀 나노포어 i. 그래핀의 1 내지 2개의 단층(monolayer) 중 TEM 기반 나노포어의 형성. ii. 산점도는 포어를 통해 이동하는 상이한 DNA 구조(폴딩된 DNA 및 폴딩되지 않은 DNA)를 나타내는 고유의 전도도 신호(unique conductance signature)를 보여준다. (c) i. 그래핀의 ~10개의 단층에 형성된 계단식 나노포어(terraced nanopore)의 TEM 이미지. ii. 다층 영역에 의해 둘러싸인 주로 암체어 가장자리(arm-chair edge)를 갖는 그래핀의 단층 중 나노포어. iii. 다층 그래핀 중 나노포어의 TEM 이미지; 포어 가장자리의 파문(ripple)이 계단식 구조를 보여준다.
도 18. 서열결정 이외의 나노포어 적용(nanopore applications outside sequencing). (a) 조직으로부터 서열 특이적 miRNA의 검출: 조직 시료로부터 특정한 miRNA를 분리하고 농축하기 위해 이용된 프로브-특이적 혼성화 및 뒤이은 나노포어 기반 정량화. 이 기법은 통상적인 마이크로어레이 기법에 비해 증가된 민감도를 제공한다. (b) SNP의 검출: 단백질 (EcoR1) 결합 dsDNA 복합체를 전기 영동에 의해 ~2 nm 직경 나노포어로 추진시키고, 그 후, i에 표시된 바와 같이 전단(shear) 시킨다. SNP의 단백질 결합 서열로의 도입은 정량적 PCR (ii)에 의해 확인된 바와 같이, 전단 역치 전압(shearing threshold voltage)의 검출가능한 변화를 가져와서, SNP의 민감한 검출을 가능하게 한다. (c) 유전형 분석(genotyping) 및 게놈 프로파일링(genomic profiling): i에 표시된 바와 같이, PNA 태깅된 dsDNA 산물은 나노포어 측정에서 고유의 전류 순간정지(unique current transient)를 생성했다. 분자당 PNA 태그의 수가 용이하게 정량될 수 있어서, DNA 분자의 신속한 전기적 프로파일링(electrical profiling)을 가능하게 한다.
도 19. 하이브리드 생물학적 고체-상태 나노포어 (a) 헤어핀 DNA 관능화 SiO₂ 나노포어 ii. 단일 염기 불일치(mismatch) 서열(1MM) 대비 완전한 상보성 ssDNA(헤어핀 서열에 상보적인 ssDNA)의 이동은 표시된 바와 같이, 이봉 분포(bimodal distribution)를 초래하여, SNP의 민감한 검출을 가능하게 한다. (b) 유체 지질 액체 측벽(fluid liquid side wall)을 갖는 지질 이중층 코팅 SiN 나노포어는 고도로 민감한 단백질 검출 요소로 기능한다. ii. 이 표면 관능화 나노포어를 이용하여 다양한 단백질 분석물을 검출하고 구별하기 위해 전류 차단 막대그래프가 이용될 수 있다. (c) α-헤모라이신의 SiN 포어로의 직접적인 삽입. i. dsDNA 테일(tail)로 화학적으로 변형된 α-헤모라이신의 개략도. ii. 최종적으로 지질 이중층 중 α-헤모라이신과 일치하는 전도도 수준 (III)을 초래하는, 하이브리드 포어 형성의 세 단계가 도시된다.
도 20. 가능한 신규한 서열결정용 나노포어 아키텍쳐. (a) 나노포어에 임베딩된 터널 검출기의 단면도. 검출기는 중간에 포어가 존재하고, ~ 1 nm 떨어진 두 개의 전극을 포함한다. 상기 나노포어는 검출기를 통한 ssDNA/뉴클레오티드의 선형 통과를 용이하게 하고, 검출기는 뉴클레오티드 특이적 터널 전류를 측정하는 것에 의해 서열 정보를 해독하기 위해 이용된다. (삽도) 나노갭에 뉴클레오티드가 배치된 터널 전극의 평면도(top view). (b) 임베딩된 그래핀 게이트를 갖는 고체-상태 나노포어 위의 그래핀 나노리본. 그래핀 게이트는 충분히 작은 리본에 대해 p-형 또는 n-형 거동을 달성하고 ssDNA를 정전기적으로 둔화시키기 위해 이용된다. 그래핀 리본은 뉴클레오티드 판독기로 작용할 있고, 각 뉴클레오티드가 그의 횡 전도도(transverse conductance)를 고유하게 조절한다. 나노포어 중 그래핀 리본 가장자리의 관능화는 뉴클레오티드 특이적 상호작용을 더 강화시킬 수 있다.
도 21a는 생체분자의 규명을 위한 막 및 관련된 성분의 일 구체예의 개략도이다. 도 21b는 도 21a와 유사하고, 또한 게이트 전극에서 바이어스를 갖는다.
도 22는 파선 화살표에 의해 표시된 방향으로 나노포어를 통과하는 생체분자에 횡단하는 방향으로 상호 간에 대면하는 한 쌍의 전극을 포함하는 터널 검출기의 개략적 클로즈업(schematic close-up)이다. 이 구조(configuation)에서, 장치는 뉴클레오티드 판독기로 묘사될 수 있다.

실시예 1: 그래핀-Al₂O₃ 나노포어

2차원 벌집 격자(honeycomb lattice)로 조밀하게 채워진 탄소 원자의 원자 두께의 얇은 쉬트(atomically thin sheet)인 그래핀은 놀라운 기계적, 전기적 및 열 특성을 갖는다. 그래핀 단층(monolayer)의 ssDNA 중 뉴클레오티드 간 0.32 내지 052 nm 간격(spacing)에 유사한 두께는 이 물질이 전자 DNA 서열결정을 위해 특히 매력적이게 한다. 본 실시예는 DNA 및 DNA-단백질 복합체의 분석을 위한 신규한 그래핀 기반 Al₂O₃ 나노포어 센서의 개발 및 특성규명을 기술한다. 나노포어는 그래핀-유전체-그래핀-유전체 스택으로 제조되어, 각 그래핀 층의 독립적인 바이어싱을 용이하게 한다. 이 구조는 기계적으로 강건하고(robust), 이온성 용액에서 안정한 전도도를 보이며, pH 민감성이고, 그래핀 기반 나노포어 DNA 서열결정을 위한 그래핀 나노리본과 터널 전극의 통합에 적합하다. 또한, 이 플랫폼의 용액 pH에 대한 놀라운 반응은 이온 전류만을 사용한 합성 접근법에 의한 서열결정을 가능하게 한다. 이 플랫폼은 또한 본 명세서에서 나타난 바와 같이 입증된 단일 단백질 민감성, 특히, 암 진단에 적용가능한 메틸화 검출에서의 단일 단백질 민감성으로 인해 진단에서의 사용에 적절하다.

그래핀-Al₂O₃ 나노포어의 제조. 먼저 독립된(free standing) Al₂O₃ 막에 FIB(focused ion beam)을 이용하여 300 nm 직경 포어를 형성한다 (도 1a). 화학 증착(chemical vapor deposition, CVD)을 통해 성장한 그래핀을 그 후 300 nm Al₂O₃ 포어에 놓인 이 기판(substrate) 위로 옮긴다 (도 1b). 이 층을 그래핀 1 또는 g1로 지칭한다. 그래핀 성장 조건은 하기와 같다: CVD 그래핀은 1.4 mil 구리 호일(copper foil) 상에서 성장시킨다. 상기 호일을 Ar/H₂ 흐름 하에 45분 동안 어닐링(anneal)시키고, 그래핀을 CH₄/H₂ 흐름 하에, 1000℃,

500 mTorr로 20분 동안 성장시킨다. 결과적으로 수득되는 Cu/그래핀 기판을 Ar 흐름 하에 ~20℃/분의 속도로 실온까지 냉각시킨다. 수취 기판(receiving substrate)으로의 이동은 하기와 같이 진행된다: 그래핀을 PMMA (495 K 및 950 K)의 이중층으로 코팅하고, 구리 호일 상의 후면 그래핀(backside graphene)을 O₂ 플라즈마에서 제거하고, 그 후, 후면 구리를 1 M FeCl₃ 용액에서 에칭시킨다. 결과적으로 수득되는 PMMA/그래핀 필름을 유리 슬라이드로 옮기고(wick), 탈이온수(DI water)로 세정하고 DI 중 10% HCl로 세정하여 잔류 금속 입자를 제거하고 수취 기판으로 옮긴다. 수취 기판 상에서 그래핀을 건조시킨 후, PMMA를 1:1 메틸렌 클로라이드:메탄올 용액에서 제거한다. 옮겨진 필름을 잔류 PMMA를 제거하기 위해 Ar/H₂ 흐름 하에 CVD 노(furnace)에서 400℃에서 어닐링시킨다. 어닐링 단계 후에, 그래핀의 품질을 평가하기 위해 전자 회절 이미징(electron diffraction imaging) 및 라만 분광분석법을 이용한다(도 1b 우측 컬럼). 그 후, 1.5 nm의 금속 알루미늄을 그래핀 상으로 증발시켜 접착층(adhesion layer) 및 뒤이어 원자층 증착(atomic layer deposition, ALD)을 통해 증착된 6.5 nm의 Al₂O₃ (유전체 층 1 또는 d1)를 형성한다. 공정 단계 1b 및 1c를 1회 이상 반복하고, 즉, 제2 그래핀 층 (g2)의 성장 및 전달 및 Al/Al₂O₃ 증착 (d2)을 반복하여, 결과적으로, 도 1c에 도시된 바와 같이, 그래핀/ Al₂O₃/그래핀/Al₂O₃ 스택을 형성한다. 금 패드를 사용하여 그의 가장자리에서 g2 층과 접촉하여, 전도성 g2 층에 게이트 전위(gate potential)의 적용을 가능하게 한다는 것에 주목한다. 최종적으로, 도 1d에 도시된 바와 같이 전계 방출 총(field emission gun) TEM을 사용하여 이 스택에 나노포어를 형성한다.

그래핀-Al₂O₃ 나노포어의 전기적 특성규명. 1M KCl, 10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8에서 다양한 크기의 포어에 대해 그래핀-Al₂O₃ 나노포어의 전류-전압 특징이 도 2에 도시된다. 선형 IV 곡선이 일반적으로 관찰되어, Al₂O₃ 나노포어에 대해 이전에 보고된 바와 같은 대칭형 나노포어 구조를 시사한다. 다양한 직경의 4개의 포어의 IV 특징이 도 2에 도시된다. 또한 수치 시뮬레이션(numerical simulations)을 이용하여 구축된 데이터로의 적합도(fit)가 도시된다. 도 2는 또한 시간의 함수로서 이러한 동일한 포어의 전도도 안정성을 보여준다. 안정한 전도도 값이 60분에 걸쳐 수득되어, 이온성 유체에서 이러한 포어의 안정성을 확인한다. 나노포어를 천공(drilling)한 후 전도도 값은 도 2b에 도시된 바와 같이, 포어가 없는 그래핀-Al₂O₃ 막(흑색 정사각형(solid square))의 전도도보다 수 차수(several orders of magnitude) 더 높다.

그래핀-Al₂O₃ 나노포어를 이용한 dsDNA의 검출. 그래핀-Al₂O₃ 나노포어의 수송 특성을 연구하기 위해, 플라스미드로부터 추출되고 정제된 48.5 kbp 길이의 dsDNA 단편인 λ-DNA의 이동(translocation)을 포함하는 실험을 수행한다. dsDNA의 상대적으로 작은 지속 길이(persistence length)(54±2 nm)를 고려할 때, λ-DNA는 고염 용액에서 도 3a (i)에 표시된 회전 반경,

을 갖는 고도로 코일된 볼(highly coiled ball)의 형태를 취할 것으로 예상된다. 나노포어 중 포획(capture) 후, 신장 및 스레딩(threading) 과정이 파트 (ii)에 도시된 바와 같이 일어난다. 도 3b는 λ-DNA가 1M KCl, 10mM Tris, 1mM EDTA pH 10.4에서 400 mV의 인가된 전압에서 11.3 nm 직경 포어를 통해 이동될 때 λ-DNA에 의해 유도된 상응하는 전류 차단(current blockade)을 예시한다. 이 실험에서 사용된 λ-DNA 농도는 100 ng/㎕이다. 나노포어의 하부 그래핀 표면(bottom graphene surface)과 음전하로 하전된 dsDNA 분자 간의 정전기적 상호작용을 최소화하기 위해 고 pH 완충액이 사용된다. 또한, 이 pH 값에서 Al₂O₃는 음전하를 갖고(Al₂O₃의 등전점은 8-9임) 따라서, 정전기적으로 DNA에 결합하지 않을 것이라는 것에 주목하는 것이 중요하다. 따라서, 이러한 실험 조건은 그래핀-Al₂O₃ 나노포어를 통한 반복가능한 DNA 이동을 가져온다.

두 개의 별개의 차단 수준이 λ-DNA 이동 실험에서 관찰되고, 도 3b 및 도 3c의 전류 차단 막대그래프에 표시된 바와 같이, 얕은 차단은 선형 dsDNA 수송에 해당하고, 보다 깊은 차단 수준은 폴딩된 DNA 수송에 해당한다. 여기서 △I는 특정 전압(이 경우, 400 mV)에서 기준 전류(baseline current) 대비 dsDNA에 의해 유도된 전류 차단을 나타낸다. 도 3c의 전류 막대그래프는 562건의 개별적인 DNA 이동 사건으로부터 작성된 것이다. 이러한 사건이 실제로 DNA 이동에 의한 것이며 단순히 포어 표면과의 상호작용에 의한 것이 아니라는 것을 확인하기 위해, 이동 시간(translocation time)에 대한 전압의 효과를 조사한다. 전압 의존적 DNA 수송이 관찰되고, 이동 시간, t_D은 증가된 전기영동 추진력(electrophoretic driving force)에 해당하는 전압 증가에 따라 감소한다. 이동 시간에 대한 측정값은 n=1119 사건으로부터, 400 mV에서 t_D = 1.81±2.77 ms (도 3(e))이고 250 mV에서 t_D = 2.66±4.08 ms이다 (도 3(e) 삽도(inset)). 이동 시간의 넓은 분포는 포어 표면과의 유의성 있는 상호작용을 수반한 이동을 나타낸다.

이 실시예에 기재된 λ-DNA 이동 실험은 그래핀-Al₂O₃ 나노포어가 단일 분자의 존재를 검출하고, 및 그의 미묘한 이차 구조(폴딩 또는 언폴딩)를 구별하는데 매우 민감하다는 것을 보여준다. 실제로, 이 시스템은 단백질 결합 DNA 단편의 지형 구조(topographic strcuture) 및/또는 ssRNA로 형성된 이차 구조를 판독할 수 있다. 하기에, 에스트로겐 수용체 α의 동족(cognate) 결합 서열로의 결합을 수반한 단백질-DNA 결합 실험이 기재된다.

실시예 2: 단일 단백질 해상도(single protein resolution)에 의한 단백질-DNA 복합체의 검출:

단일 단백질 해상도를 갖는 그래핀/Al₂O₃ 나노포어를 통한 단백질-DNA 복합체의 이동이 도 4에 도시된다. 이 연구에서 사용된 모델 DNA-단백질 시스템은 ERα단백질에 대한 동족(cognate) 결합 서열, 단일 ERE를 포함하는 50 bp 길이의 프로브에 결합된 ERα이다. DNA-결합 ERα는 주로 단백질 복합체의 동원(recruitment)을 위한 핵형성 인자(nucleating factor)로 작용하고 산화적 스트레스 반응, DNA 수선, 및 전사 조절을 포함한, 주요한 생물학적 과정에 수반된다. ERα의 단일 ERE를 포함하는 dsDNA 및 ERE 서열 자체로의 결합을 보여주는 개략도가 각각 도 4a 및 4b에 도시된다. 도 4c는 겔 이동 분석(gel shift assay)를 보여주고, ERα/ERE 결합이 낮은 염 농도에서만 관찰된다. 나노포어를 이용한 단백질-DNA 복합체의 검출이 도 4d에 도시된 dsDNA 검출과 유사하다. 특히, 80 mM KCl에서 ~14 nm 직경 포어를 통한 ERα-ERE 복합체의 수송은 전류 증강을 가져오고(도 4e), 아마도, 저염에서의 DNA 수송 연구에서 이전에 보고된 바와 같이 수송 동안 국소적으로 포어 전도도를 증가시키는 복합체 상의 반대 이온 응축(counterion condensation)에서 기인될 것이다. 이동 시간 대 전류 증강 산점도가 도 4f에 도시된다. 하나의 결합된 ERα단백질을 갖는 500 mV에서의 이 50 bp 길이의 DNA 프로브의 가장 개연성 있는 이동 시간은 ~3 ms이고, 이는 50 bp dsDNA 단독에 대해 추정된 이동 시간보다 100배(two orders of magnitude) 더 느리다.

또 다른 시스템은 마그네슘 및 ATPγS의 존재 하에 이중-가닥 DNA 상에서 안정한 핵단백질(nucleoprotein) 필라멘트를 형성하는 것으로 알려진 재조합 단백질 A를 조사한다. 이 모델 단백질은 원핵생물에서 상동성 재조합 및 DNA 수선에서 중심적 역할을 수행한다. RecA-코팅 DNA 분자가 기록된 방법(Smeets et al. Nano Lett. 2008, 9:3089-3095)을 이용하여 NABsys (Providence, RI, USA)에 의해 제조되고 제공되었다. 이 단백질-DNA 복합체의 그래핀-Al₂O₃ 나노포어를 통한 수송은 이 핵단백질 필라멘트의 유효 직경이 7.5±0.5 nm이므로, 천연(native) dsDNA 대비 유의성 있게 더 깊은 전류 차단을 유도할 것이다. 도 4g는 500 mV의 인가된 전압에서 1 M KCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 전해질 중 23 nm 직경 그래핀-Al₂O₃ 나노포어를 통한 8 kbp 길이의 RecA-코팅 dsDNA 분자의 수송을 위한 시간 대 나노포어 전류를 보여준다. 천연 dsDNA 대비 유의성 있게 더 높은 신호-대-잡음 비(SNR)로 포어를 통한 핵단백질 필라멘트의 이동 동안 깊은 전류 차단이 관찰된다(보다 높은 기간적 해상도 기록도가 도 4j에 표시됨). 도 4h는 1368건의 개별적인 RecA-관련 이동 사건으로부터 작성된, 전류 차단 대 이동 시간(tD)의 사건 밀도도를 도시한다; 상응하는 사건 진폭 막대그래프(event amplitude histogram)이 도 4i에 도시된다. 수송 사건의 두 개의 범주가 명확하게 구별가능하다: 빠르고, 낮은 진폭 사건은 SiN 나노포어에서 이전에 확인된 바와 같이 결합되지 않은 또는 유리 RecA 단백질의 수송에 해당하고, 더 느리고, 더 높은 진폭 전류 차단 사건은 단일 RecA-코팅 DNA 분자의 수송에 해당한다. 전술된 두 개의 사건 범주에 대한 이동 시간 규모(translocation time scale)는 SiN 나노포어에서의 RecA-DNA 이동 실험에서 보고된 것과 일치한다 (Smeets et al.; Kowalczyk et al. Nano Lett. 2009 10:324-328). 흥미롭게도, 약 18 nA의 전류 차단 값에서 제3 고-진폭 피크가 또한 도 4i에서 관찰된다. 이는 나노포어를 통한 복수 개의 RecA-코팅 DNA 분자의 동시 수송에 해당할 수 있다.

이 실시예는 다층 그래핀/Al₂O₃ 나노포어가 dsDNA에 결합된 단일 단백질과 관련된 생물학적 파라미터를 측정할 수 있고, DNA 분자 상에서 단일 결합 단백질을 검출하고 공간적으로 맵핑하기 위한 적용에서 이용될 수 있다는 것을 확인한다.

실시예 3: 메틸화 분석.

유전자 기반 메틸화 분석을 위한 현재의 방법은 매우 노동 집약적이고 큰 시료 부피를 요구하고, 1회당 높은 비용 (high per run cost)이 소요되고, 대부분의 경우 유용한 임상적 결과를 얻기 위해 필요한 민감성이 부족하다. 대조적으로, 조기 암 검출을 위한 메틸화 분석에 대한 나노포어-기반 방식은 현재의 임상적 패러다임으로부터 급진적 변화이기는 하나, 환자 결과와 관련된, 유용한 임상적 정보를 추출하기 위해 요구되는 민감성 및 속도를 가져올 수 있다. 나노포어 기반 기법은 (1) 극미한 시료 부피로부터 매우 낮은 농도의 표적 분자를 검출하고, (2) 다양한 유전자에 대해 메틸화 이상(methylation aberration)의 조합을 검출하며 (질병 진행 및 예후의 모니터링을 위해 중요함), (3) PCR 및 겔-전기영동과 같은 벌크 총체적 평균측정(bulk ensemble averaging) 방법을 이용하여 검출되지 않는 대립인자들에 대한 메틸화 패턴의 미묘한 변화를 검출하고, (4) 신속한 메틸화 분석을 수행하며 (동일한 유전자의 수백 개의 카피를 수분 내에 분석함), (5) 비용을 낮추고(소량의 시약이 요구됨), (6) 부담스러운 PCR, DNA 서열결정 및 비술피트 변환 단계를 제거하는 것에 의해 실험 및 분석 단계를 단순화하는 능력 때문에 유전자 기반 메틸화 분석에 적절하다.

전류 분광법(Electrical Current Spectroscopy)을 이용한 단백질 결합 메틸화 DNA의 분석. 나노포어 기반 메틸화 분석 방법이 도 5에 예시된다. 먼저, 메틸화 DNA 분자를 메틸-CpG 결합 단백질과 조합하여 단백질 결합 DNA 복합체를 형성한다(도 5b 및 5c). 메틸-CpG-결합 단백질 패밀리(MBD)는 5개의 단백질, MeCP2, MBD1, MBD2, MBD3 및 MBD4로 구성되고, 각각은 메틸화 DNA에 결합할 수 있게 하는 메틸-CpG-결합 도메인 (MBD)를 포함한다. 이들은 메틸화 CpG 디뉴클레오티드를 표지하기 위해 이용된다.

MeCP, MBD1 및 MBD2는 인 비트로에서 단일의 메틸화 CpG 디뉴클레오티드에 특이적으로 및 배타적으로 결합하고, 전사 억제(transcriptional repression)에서 중대한(critical) 성분으로 확인되었기 때문에 선택된다. 이들 단백질의 특이성이 메틸화 DNA 분자에서 메틸화 부위를 표지하기 위해 이용된다. MBD-DNA 복합체를 도 5d에 도시된 바와 같은 나노포어 유체 셋업의 시스 챔버(cis chamber) 내로 도입한다. 인가된 전위 하에, 이러한 단백질 결합, 메틸화 DNA 단편은 포어를 통해 이동되어, 특징적인 전류 차단을 초래하고, 이는 해당 분자의 메틸화 상태를 나타낸다.

메틸화 결정: 나노포어 기반 전류 분광법을 이용한, 동일한 길이의 비메틸화(unmethylated) DNA 단편으로부터의 단일 메틸화 DNA 분자 (도 6). 포어를 통한 비메틸화 DNA의 통과는 도 6a에 도시된 바와 같이 기준 전류에서의 작은 편차(deviation)를 생성한다. 그러나, 포어를 통한 MBD 단백질 결합 DNA 단편의 통과는 매우 상이한 전류 신호(current signature)를 초래한다 (도 6b). 포어 전류의 감소는 이동 분자의 단면적과 관련되기 때문에, 큰, 결합된 분자가 포어를 횡단하는 경우, 더 깊은 차단이 관찰된다. 두 개의 별개의 차단 수준이 나타나고, 제1 수준은 결합된 단백질을 포함하지 않는 DNA의 영역에 해당하고(I_DNA), 제2 수준은 MBD 단백질을 포함하는 영역에 해당한다(I_MBD). 겔 이동 분석은 복수 개의 메틸화 CpG 디뉴클레오티드에 해당하는 복수 개의 결합된 MBD 단백질을 갖는 단편은 겔을 통해 더 느리게 이동하고 단일 단백질 해상도로 분해될 수 있다는 것을 보여주었다. 또한, 각각의 추가적인 결합된 단백질은 겔에서 복합체의 이동성(mobility)을 상당히 감소시킨다. 이는 두 개의 인자에서 기인될 수 있다; (1) 짧은 DNA 단편 대비 MBD2의 높은 분자량, (2) pH 8.0 완충액에서 MBD2의 양전하(9.1의 등전점). 따라서, 정상적인 포어 작동 조건 (pH 7-8) 하에서, MBD 결합 DNA 이동이 예상된다.

메틸화 정량 및 맵핑: 전류 분광법은 특정한 DNA 단편의 메틸화 부위의 맵핑 및 메틸화의 전체 수준을 정량할 수 있게 한다. 이 방법이 도 6c에 예시된다. 단일 DNA 분자에서 복수 개의 완전히 메틸화된 CpG 디뉴클레오티드의 존재는 DNA 당 복수 개의 MBD 단백질의 결합을 가능하게 하고, 각각은 이동 동안 깊은 전류 차단을 생성한다. 복수 개의 결합된 단백질을 갖는 단편의 이동은 그 단편에서의 단백질의 공간적 분포를 닮은 도 6에 도시된 바와 같은 전기적 판독물(electrical readout)을 초래한다. 이는 검사되는 DNA 단편에서의 메틸화 CpG 디뉴클레오티드의 분포를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 전류 신호는 또한 사건 당 깊은 전류 차단의 갯수에 근거하여 메틸화의 정도를 정량하기 위해 이용될 수 있다.

이는 이 기법의 공간적 해상도(spatial resolution)에 대한 의문을 제기한다. DNase I 족문감식(footprinting)은 MeCP2의 MBD가 단일 메틸화 CpG 쌍 주위의 총 12 내지 14개의 뉴클레오티드를 보호한다는 것을 확인한다. MeCP2의 MBD와 MBD2는 상동이므로, 본 발명자들은 MBD2가 결합시 DNA의 약 12 내지 14 bp를 뒤덮을 것으로 예상한다. 이 12 내지 14 bp 도메인 내의 추가적인 메틸 CpG 디뉴클레오티드는 다른 MBD2 분자에 결합하기 위해 이용될 수 없어서, 이 기법의 공간적 해상도를 제한한다. 따라서, 나노포어 플랫폼은 그의 높은 신호-대-잡음 비를 고려할 때, 우수한 해상도로 단일 DNA 가닥을 따라 배치된 개별적인 MBD 분자를 분해(resolve)할 수 있을 것으로 예상된다. 본 실시예에 기재된 길이 지형 판독(length-wise topographic reading) 과정은 메틸화 수준의 정량 및 단일 DNA 단편에서의 메틸화 분포를 맵핑할 수 있게 하고, 특정한 유전자의 분석까지 확장될 수 있다. 이러한 고 민감성 나노포어-기반 메틸화 분석 기법은 의학적 진단에서 유용하다.

실시예 4: 그래핀-Al₂O₃ 나노포어의 pH 의존적 반응.

나노포어의 높은 표면적-대-부피 비 때문에, 표면은 잠재적으로, 낮은 염 농도에서 포어 전도도에 대해 매우 큰 영향을 갖는다. 그래핀-Al₂O₃ 나노포어의 표면 전하 특징 및 pH 반응은 특히 DNA 폴리머라아제를 이용한 뉴클레오티드의 내포(incorporation) 동안 H⁺ 이온의 방출을 통한 pH의 국소 변화를 모니터링하는 것에 의해 합성 방식에 의한 서열결정을 용이하게 할 수 있다. 높은 염 농도에서, 용액 중 전하 운반체(charge carrier)가 포어를 통한 이온 전류를 지배한다. 전도도는 실험적으로 관찰된 바와 같이, 전하 운반체의 갯수에 따라 선형적으로 증가(scale)되고, 표면 전하는 미미한 효과를 갖는다. 낮은 KCl 농도에서, 그러나, 나노포어를 통한 총 전류는 용액 중 이온의 벌크 농도와 표면 전하를 차폐(shield)하는 반대이온(전기삼투 유동(electroosmotic flow))의 기여의 조합이다. 도 7a에 도시된 바와 같이, Al₂O₃의 등전점(~pH 8-9)보다 높은 경우, 포어의 표면 전하는 음전하여서, 응축된 K 이온의 이중층(double layer)를 초래하고, 등전점 미만에서, 표면 전하는 양전하여서, 응축된 Cl 반대이온의 이중층을 초래한다. KCl 농도와 pH의 함수인 포어 전도도가 18±1 nm 직경 및 8±0.5 nm 직경 그래핀-Al₂O₃ 나노포어에 대해 각각 도 7b 및 7c에 도시된다. 명확하게, 그래핀-Al₂O₃ 나노포어의 전도도는 국소 pH에 의해 강하게 영향을 받는다.

염 농도가 감소되면서 전도도 포화(conductance saturation) pH 10.9에서 명확하게 관찰되어, 이러한 높은 pH 조건 하에서 높은 음 전하의 포어 표면(highly charged, negative pore surface)의 존재를 시사한다. 대조적으로, 매우 낮은 KCl 농도에서도 pH 4에서 전도도 포화는 관찰되지 않고(도 7), 이는 포어가 이 pH에서 약하게만 하전된다는 것을 시사한다. pH 4 반응은 채널 전도도에 대한 표면 전하의 효과가 미미한 경우 벌크 거동(bulk behavior)을 더 가깝게 닮는다. 도 7c는 보다 작은 8±0.5 nm 직경 포어의 pH 반응을 보여준다. 유사한 경향이 도 7b에서와 같이 관찰되고, 보다 낮은 포어 전도도가 보다 낮은 pH에서 관찰된다. 흥미롭게도, pH 10.9에서 전도도의 포화/정체(plateauing)가 10 mM에서 시작하는 KCl 농도에서 관찰되고, 이는 도 7b에서보다 10배(an order of magnitude) 더 높다. Debye 층 중첩(overlap) 및 표면 효과가 보다 작은 포어에서 보다 높은 염 농도에서 우세하기 시작할 것이므로, 이 결과가 예상된다. Debye 스크리닝 길이는 10 mM KCl에서 약 3 nm이고 따라서, 도 7c에서의 포어의 8 nm 직경과 유사하다. 따라서, 표면 전하 효과가 이와 같이 상대적으로 높은 염 농도에서 유의할 것으로 예상된다.

그래핀-Al₂O₃ 나노포어의 pH 반응은 SiN 및 TiO₂ 나노포어 및 SiO₂ 나노채널의 pH 반응보다 훨씬 더 현저하다. 이는 부분적으로 Al₂O₃의 높은 표면 전하 밀도와 함께 그래핀의 존재 때문일 수 있다. 용액 pH를 이용하여 나노포어의 표면 전위를 조절(modulate)하는 것은 실제로 포어의 전도도를 조절할 수 있다. 이 플랫폼은 DNA 폴리머라아제를 이용한 단일 뉴클레오티드의 내포 동안 국소 pH를 모티터링하기에 적합하여, 합성 방식에 의한 서열결정을 용이하게 한다.

실시예 5: 그래핀 게이트 나노포어(Graphene Gated Nanopore) 및 형성된 그래핀 층.

전기적 게이트(electrically gated) 고체-상태 나노포어의 개념이 검토되었으나, 게이트 물질로서의 그래핀의 용도 및 그러한 시스템의 구현은 이전에 입증되지 않았다. 나노포어에 임베딩된 제3 전극은 포어에서 전기장을 변형시키기 위해 이용되고 나노포어 서열결정 구현의 핵심 단계인 이동되는 DNA 분자를 둔화시키거나 또는 포획하기 위해 이용될 수 있기 때문에, 특히 매력적이다. 절연된 제3 전극(30 nm 두께의 TiN 층)의 나노채널 및 나노포어의 전도도에 대한 효과가 기술되었다. 그러나, 본 실시예는 나노포어 전극 또는 게이트 전극으로서, 단지 수개의 단층 두께인 그래핀을 이용하는 것을 검토한다. 이러한 구조의 실현은 도 8a에 도시된 아키텍쳐(도 1c에도 도시됨)에 대한 변형을 수반한다. 이러한 변형은 도 1c에 도시된 바와 같이, 유전체 2(d2)의 원자층 증착 전에 도 1의 그래핀 층 2 (g2)와 250 nm 증발(evaporated) Ti/Au 패드의 접촉을 포함한다. 그 후, 접촉된 스택에 나노포어를 천공한다. 포어를 천공한 후, 나노포어 칩을 맞춤 설계된(custom designed) PCB에 에폭시로 부착시키고(epoxy) 그래핀 게이트와 접촉하는 Ti/Au 패드를 도 8b에 도시된 바와 같이 외부 PCB 패드 (1 및 2)로 인듐 와이어를 이용하여 연결시킨다. 도 21b는 전원 및 검출기에 연결된 Ti/Au 패드를 통해 통전가능하고(energizable) 검출가능한 게이트 전극을 예시한다. 칩을 연결한 후, 패드(1 및 2) 전체의 저항은 통상적으로 5 내지 15 ㏀ 범위이어서, 제조(fabrication) 후 나노포어 칩 상에서 전도성 그래핀 쉬트의 존재를 확인한다. PCB 실장 나노포어 칩(PCB mounted nanopore chip)을 그 후 도 8c에 도시된 바와 같은 맞춤 설계된 유체 셋업에 삽입한다. 누설 전류(leakage current)를 방지하기 위해 Ti/Au 패드를 유체로부터 분리하도록 주의를 기울여야 한다.

그래핀 게이트에 의한 나노포어 측정은 도 8a의 개략도에 도시된 바와 같이, 게이트 노드(node)를 소스 전극에 묶는 것에 의해 수행된다. 소스와 게이트는 누설 전류가 소스와 게이트 노드 간에 흐르는 것을 방지하기 위해 묶는다. 그래핀이 낮은 인가된 바이어스 하에서 이온성 용액에서 매우 적은 전자 교환이 일어나는, 비-패러데이(non-Faradaic) 전극으로 작용해야 하나, CVD 성장 그래핀의 특징적인, 결함과 결정경계(grain boundary)의 존재가 이러한 누설 전류를 생성할 수 있다.

도 9는 다양한 염 조건 및 pH 값 하에서, 그래핀-Al₂O₃ 나노포어에서 그래핀 게이트를 연결시키는 것(묶인 게이트-소스)과 그 게이트를 부유 상태로 유지시키는 것의 효과를 예시한다.

부유 케이스(floating case) 대비 연결된 게이트로 pH 10.9 및 pH 7.6에서 보다 높은 전도도 수준이 관찰된다. 대조적으로, 부유 게이트 케이스 대비, 연결된 게이트로 pH 4에서 보다 낮은 전도도가 관찰된다. 이러한 전류 증강 및 감소가 염 농도가 낮아지면 보다 현저하여 정전기적 효과를 시사하나, 이 결과가 포어에서 전계(field)의 정전기적 조절에 전적으로 기인될 수 없다. 또한 접촉된 g2 층을 통해 흐르는 전기화학적 전류가 있을 것으로 보이며, 이는 더 높은 pH에서 보다 현저하다. 이는 이 농도에서 Debye 스크리닝 길이가 ~ 0.3 nm에 불과하나, 1M KCl, pH 10.9 조건에서 관찰된 유의성 있는 전류 증폭을 잠재적으로 설명한다. 이는 높은 pH에서, OH-가 그래핀의 sp² 결합을 파괴시켜, 그래핀 유체 인터페이스에서 전하 전달을 초래할 수 있다는 개념과 일치한다. 이러한 효과는 낮은 pH 값에서는 일어나지 않으며, 이는 본 발명자들의 실험에서 관찰된 전류 증강의 부재와 일치한다. 연결된 게이트를 갖는 포어를 통한 전류 조절은 또한 누설 전류에 전적으로 기인될 수 없다. 게이트 나노포어 측정에서 조사된 것과 동일한, 전압 범위(-100 mV 내지 100 mV)에서 pH의 함수인 누설 전류의 적은 변화가 관찰된다. 본 출원서에 기재된 결과는 또한 g2 층이 실제로 이 인터페이스에서 관찰되는 상당한 전류 이동(current transfer)을 고려할 때, 포어에서 트랜스 전극으로 이용될 수 있다는 것을 시사한다. 이 층은 미래의 DNA 이동 실험에서 민감성 전극으로 작용할 수 있다. 이러한 제3 전극을 통한 포어에서의 국소 전위의 적용은 또한 포어에서 DNA 분자의 둔화 또는 포획(trapping)에서 유용하다.

DNA 검출 및 서열결정을 위한 그래핀 나노리본-나노포어: 나노포어를 갖는 그래핀 나노리본 (GNR)을 이용한 뉴클레오티드 구별의 이론적 타당성(theoretical-only feasibility)이 최근에 입증되었다. 나노리본을 통한 뉴클레오티드 특이적 횡 전류가 그러한 이론적 연구에서 보고된다. 이 실시예는 단일 분자 DNA 서열결정을 위한 유사한 아키텍쳐를 이용한다. 도 10a는 GNR의 제조 및 나노리본에서 직접적인 나노포어의 형성을 보여주는 일련의 SEM 이미지를 보여준다. GNR은 도 1에 도시된 g2 층을 패터닝하는 것에 의해 형성된다는 것에 주목한다. 도 10a 및 20b는 ssDNA 서열결정에 대한 방법을 보여준다. ssDNA의 통과 동안 리본(132)을 통한 횡 전류를 측정하는 것에 의해, GNR은 뉴클레오티드 판독기로 작용할 수 있다. 임베딩된 그래핀 게이트 (층 g1) (602)는 p-형 또는 n-형 거동을 위해 GNR을 바이어싱하기 위한 수단을 제공하고 정전기적으로 DNA 전위를 둔화시킬 수 있다.

전압 센서인 나노채널의 나노전극. 나노채널에서 하기의 전극 아키텍쳐(휘트스톤 브릿지)는 매우 높은 공간적 해상도(spatial resolution)로 개별적인 DNA 분자 및 DNA/단백질 복합체의 감지(sensing)를 용이하게 할 수 있어서, 전압 센싱 방식을 이용한 DNA의 장거리 하플로타입 맵핑(long range haplotype mapping) 및 서열결정을 용이하게 한다. 여기에 기술된 아키텍쳐가 도 11a에 도시되며, 나노채널 내에 배치된 3개의 전극을 포함하고, 상기 나노채널은 상기 전극의 위 또는 아래를 통과한다. AC 신호가 중심 전극(전극 3)에 인가되고, 좌측 전극(전극 1) 및 우측 전극 (전극 2)이 접지된다(grounded). 전극 1과 전극 3 간의 임피던스가 Z1에 의해 주어지고, 전극 2와 전극 3 사사이의 임피던스가 Z2에 의해 주어진다. DNA 및 기타 종의 부재 하에 용액에서, Z1과 Z2는 아키텍쳐의 대칭성 때문에 균형을 이루어, Vout = V1 - V2 = 0의 출력 전위(output potential)를 초래한다. 등가 회로가 도 11b에 도시된다. DNA 또는 단백질의 도입은 하기를 초래한다: DNA 분자 또는 단백질이 전극 1과 전극 3 사이의 영역을 통과하면, Z1을 조절/변화시키고 출력 전압에서 전압 스파이크(voltage spike)로서 검출된다. 유사하게, 분자가 전극 3과 전극 2 사이의 영역을 지나가면, Z2를 조절/변화시키고, 반대 극성의 전압 스파이크를 초래한다. 이는 이동 분자가 나노채널을 통과할 때, 이동 분자의 이중 계수(double count)를 가능하게 한다. 또한, 스파이크의 진폭을 비교하고 나노규모(nanoscale)에서 전극 분리를 조절하는 것에 의해, DNA 분자의 길이에 따라 민감한 지형 정보, 예를 들면, 앱타머 또는 결합된 단백질 정보를 분석(resolve)할 수 있다. 이러한 아키텍쳐는 또한 오류 확인 및 길이에 따른 지형 정보를 제공하기 위한 목적으로 단일 분자에서 복수의 독립적인 계수를 제공하기 위해 채널의 길이를 따라 배열(array)될 수 있다.

전압 센서인 나노포어의 그래핀 나노전극. 이 실시예는 2층 그래핀/유도체 아키텍쳐를 도 12a에 도시된 것과 같은 적용을 위해 3층까지 확장한다. 도 12(a)를 참조하면, 막 (100)은 전도층(예를 들면, 그래핀)(140) 및 유도체(150) 층, 이 실시예에서, Al₂O₃의 다층 스택(130)을 포함한다. 제1 표면(110)과 제2 표면(120)이 각각 제1 유체 구획 및 제2 유체 구획을 대면하는 스택(130)의 상부 및 하부를 정의한다. 나노포어 (160)가 제1 표면(110)으로부터 제2 표면(120)까지 막(100)을 통과한다. 각각의 그래핀 층은 도 12b에 도시된 바와 같이 패터닝되고, 중첩 영역(overlap region)에 나노포어가 천공된다(유전체층은 도 12b에 도시되지 않음). 도 12b를 참조하면, 나노포어(160)가 나노포어 통과 방향(162)을 정의한다. 각 그래핀 층(140)은 종축(522)을 따라 배향되고(각 나노리본의 긴 가장자리(long edge)의 방향에 해당함), 164로 표지된 화살표에 의해 표시된 나노리본 폭을 갖는 나노리본 그래핀 층(132)으로 패터닝되는 것을 포함하여, 원하는 대로 패터닝된다. 도 12b로부터, 나노리본의 세로 방향은 나노리본 통과 방향(162)에 대해 가로이거나 또는 직각인 것으로 특징지워질 수 있는 것으로 이해된다. 그래핀 층은 서로에 대해 각 오프셋(angular offset)을 가질 수 있고, 이 구체예에서, 인접한 층은 서로에 대해 90°의 각 오프셋을 갖는다. 중첩 영역은 면적이 100 nm x 100 nm의 규모이고, 패터닝된 그래핀 층은 다시 ALD를 통해 증착된 박막 유전체 층(thin dielectric layer)에 의해 분리될 것이다. 그래핀 층은 도 11에 도시된 수평 구조 대비 수직 휘트스톤 브릿지 아키텍쳐를 달성하기 위해 도 12b에 도시된 바와 같이 바이어싱된다. 중심 전극은 다시 그에 인가된 AC 신호를 가지며 전극 1과 전극 2에 걸쳐 출력 전위가 측정된다. Z1(전극 1과 전극 3의 임피던스) 및 Z2(전극 2와 전극 3의 임피던스)의 조절(modulation)을 측정하는 것에 의해, 분자가 나노포어를 통과할 때 전기 임피전스를 이용한 분자의 검출 및 공간적 맵핑이 가능하다. 여기에 도시된 수직 구조는 옹스트롬 규모에서 전극간 간격(inter-electrode spacing)에 대한 정확한 제어의 부가된 장점을 가져서, 도 11에 도시된 평면 아키텍쳐에 비해 분자에 대해 보다 민감한 지형적 측정(topographical measurement)을 가능하게 한다.

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실시예 6: DNA 및 DNA-단백질 복합체의 민감한 검출을 위한 나노-제조(Nano-Fabricated) 그래핀-Al₂O₃ 나노포어 및 나노포어 어레이

이 실시예는 단일 DNA 분자 및 DNA-단백질 복합체의 민감한 검출을 위한 나노포어 및 나노포어 어레이의 제조를 기술한다. ~15 nm 직경 나노포어의 고밀도 어레이를 SiN/Al₂O₃ 막에서 전자빔 리소그래피 및 반응성 이온 에칭(reactive ion etch) 단계를 이용하여 제조하여, 단일 DNA 분자의 고효율 분석(high throughput analysis)을 가능하게 한다. 극박 그래핀/Al₂O₃ 막에서 단일 나노포어들의 제조가 또한 DNA-단백질 복합체의 검출에 대해 보고된다. 낮은 염 농도에서 단일 단백질 해상도(single protein resolution)가 입증된다.

나노포어 DNA 분석은 용액에서 나노-규모 포어를 통해 DNA 분자를 전기영동에 의해(electrophoretically) 추진시키고 이온성 포어 전류에서 상응하는 변화를 모니터링하는 것을 수반하는, 최근에 개발된 기법이다. 이러한 다용도(versatile) 방식은 서브-nm 해상도로 단일 뉴클레오티드에서 킬로베이스 길이의 긴 게놈 DNA 단편에 이르기까지 다양한 길이의 하전된 중합체(단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA 및 RNA)의 표지-불포함, 증폭-불포함 분석(label-free, amplification-free analysis)을 가능하게 한다. 나노포어에서의 최근 진보는 이러한 저비용, 고 확장성(highly scalable) 기술이 3세대 DNA 서열결정 기술의 개발에 적합하여, $1000 미만으로 인간 이배체 게놈의 신속하고 신뢰할 수 있는 서열결정을 가능하게 할 수 있다. 고체-상태 나노포어를 이용한 고효율 멀티플렉스 서열결정(high throughput multiplexed sequencing)을 가능하게 하기 위해, 고밀도 나노포어 어레이의 제조가 요구된다. 이 실시예는 병렬 DNA 분석에 적합한 플랫폼 기술인 전자빔 리소그래피 및 건식 에칭(dry etch) 방법을 이용하여 현수된(suspended) Al₂O₃/SiN 막에서 ~15 nm 직경 나노포어 어레이의 제조를 위한 최적화된 방법을 보여준다. 고체 상태 나노포어로의 그래핀의 내포는 또한 많은 가능성을 갖는다. 단일 가닥 DNA (ssDNA)에서 뉴클레오티드간 0.32 내지 0.52 nm 간격에 유사한 그래핀 단층의 두께가 이 물질을 전자 DNA 서열결정으로의 적용을 갖는 단일 뉴클레오티드 검출을 위해 특이 매력적이게 한다. 이 실시예는 강건한 극박 그래핀/Al₂O₃ 막에서 단일 나노포어의 제조를 기술하고 이 아키텍쳐를 단일 DNA-단백질 복합체의 고 민감성 검출을 위해 이용한다. 이 연구에서 이용된 모델 단백질-DNA 시스템은 그의 동족(cognate) 결합 서열 (에스트로겐 반응 요소(Estrogen Response Element))을 포함하는 50 bp 길이의 프로브에 결합된 에스트로겐 수용체 α(ERα)이다. 이러한 연구는 이 아키텍쳐의 단일 단백질 민감성을 보여주고 전사 인자, 뉴클레아제 및 히스톤을 포함한, 다양한 기타 DNA 결합 단백질의 검출까지 확장될 수 있다.

나노포어 센싱의 원리는 쿨터 카운터(Coulter counter)의 원리와 유사하다. 나노-규모 구멍 또는 나노포어는 전도성 전해질로 채워진 두 개의 챔버를 분리하는 절연막에 형성된다. 고체-상태 막의 경우, 나노포어는 이중가닥(ds) DNA의 2.2 nm 단면 직경에 유사한 단면 직경(cross-sectional diameter)의 포어를 형성하기 위해 집속 수렴성 전자빔을 이용한 분해성 스퍼터링(decompositional sputtering)을 통해 형성된다. 하전된 분자(예를 들면, DNA)를 유체 챔버 중 하나에 삽입하고 하전된 전위 하에 포어를 통해 전기영동에 의해 추진시키고, 그에 의해 포어를 통한 이온 전류를 조절한다. 상응하는 전자 신호(electronic signature)가 이동 분자의 구조 및 동적 운동에 대한 유용한 정보를 밝힌다. 이 개념은 ssDNA 중 각각의 통과하는 뉴클레오티드가 특징적인 잔류 이온 전류를 생성하는 경우, 이 전류 트레이스가 서열 정보를 추출하기 위해 이용될 수 있다는 점에서 서열결정까지 확장될 수 있다.

실험(Experimental). 나노포어 어레이 제조. 독립된 Al₂O₃/SiN 막을 이전에 기록된 제조 방법을 이용하여 형성한다. 막은 원자층 증착 (ALD)을 통해 증착된 350 Å 두께의 Al₂O₃ 층 및 뒤이은 PECVD (plasma enhanced chemical vapor deposition)를 통해 증착된 430 Å 두께의 캡핑(capping) SiN 층을 포함한다. 먼저, ZEP520:아니솔 (2:3)의 비율로 아니솔에 용해된 ZEP520 e-빔 레지스트(resist)를 독립적인 막에 스핀시키고(60초 동안 2000 rpm), ~10 nm 특징형상 정의(feature definition)를 위한 750 Å의 최종 두께로 최적화한다. ZEP520 코팅 칩을 그 후 200℃에서 2분 동안 베이킹하고, 뒤이어 JEOL JBX-6000FS Electron Beam Lithography (선량 = 10,000 μC/cm²)를 이용하여 전자 빔 노출에 적용한다. 자일렌에서 30초 및 뒤이어 IPA에서 30초 동안 어레이 패턴을 현상시킨다. 그 후, 반응성 이온 에칭(RIE) 단계를 이용하여 ZEP520의 어레이 패턴을 SiN으로 옮긴다. 에칭은 60 W의 전력 및 80 mTorr의 압력에서 60 sccm CF₄: 6 sccm CHF₃에서 수행한다. 이러한 조건 하에서 ZEP520에 대해 ~600 Å/min 대 ~200 Å/min의 에칭 속도를 측정한다. ZEP520 및 SiN 에칭 창(etch window)이 PlasmaTherm SLR-770 Inductively Coupled Plasma (ICP) Reactive Ion Etcher에서 수행되는, Al₂O₃의 건식 에칭을 위한 마스크로 작용한다. 에칭은 DC Bias ~65V에서 200 W의 ICP 전력, 20 W의 플래턴(platen) 파워로 10 sccm BCl₃:40 sccm Ar에서 수행된다. 이러한 조건 하에서, SiN에 대해 ~220 Å/min 대 90 Å/min 및 ZEP520에 대해 200 Å/min의 에칭 속도가 관찰된다.

그래핀/Al₂O₃ 막에서 단일 나노포어의 제조. 이전에 기록된 막 제조 방법을 이용하여 독립된 Al₂O₃/SiN 막을 다시 형성한다. 이 막에서 FEI DB235 FIB(focused ion beam) 도구를 이용하여 큰 ~300 nm 직경 포어를 형성(mill)시킨다. Etamota 화학 증착 (CVD) 시스템을 이용하여 Basic Copper로부터 구입한 1.4 mil 구리 호일 상에 그래핀 필름을 성장시킨다. 상기 호일을 Ar/H₂ 흐름 하에 45분 동안 어닐링시키고 1000℃, ~500 mTorr에서 CH₄/H₂/Ar 흐름 하에 20분 동안 성장시킨다. 결과적으로 수득되는 Cu/그래핀 기판을 Ar 흐름 하에 ~20℃/분의 속도로 실온까지 냉각시킨다. 수취 기판(receiving substrate)으로의 그래핀의 전달은 하기와 같이 진행된다: 그래핀을 PMMA (495 K 및 950 K)의 이중층으로 코팅하고, 구리 호일 상의 후면 그래핀(backside graphene)을 O₂ 플라즈마에서 제거하고, 그 후, 후면 구리를 1 M FeCl₃ 용액에서 에칭시킨다. 결과적으로 수득되는 PMMA/그래핀 필름을 유리 슬라이드로 옮기고(wick), 탈이온수(DI water)로 세정하고 DI 중 10% HCl로 세정하여 잔류 금속 입자를 제거하고, 뒤이어 마지막 탈이온수 세정(final DI rinse)을 수행하고 수취 기판으로 옮긴다. 수취 기판 상에서 그래핀을 건조시킨 후, PMMA를 1:1 메틸렌 클로라이드:메탄올 용액에서 제거한다. 옮겨진 필름을 잔류 PMMA를 제거하기 위해 CVD 노(furnace)에서 400℃에서 Ar/H₂ 흐름 하에 어닐링시킨다. 그 후, 15 Å의 금속 Al을 포함한 금속 시드 층과 같은 시드 층을 CHA SEC-600 E-Beam Evaporator를 이용하여 그래핀 코팅 칩 상에 증발시킨다. 이 층은 대기 중에서 완전히 산화되고 ALD Al₂O₃를 위한 시드 층으로 작용한다. 그 후, ALD를 이용하여 60 Å의 Al₂O₃를 증착시킨다. 순수한 Al₂O₃ 막에 포어를 천공하기 위해 이용된 것과 유사한 빔 조건으로 JEOL 2010F FEG-TEM으로부터 집속 수렴성 전자 빔을 이용하여 그래핀/Al₂O₃ 막에 나노포어를 천공한다.

결과 및 검토. 나노포어 어레이 제조 방법이 도 13a에 도시된다. 먼저 전자빔 리소그래피를 이용하여 ZEP520 e-빔 레지스트를 패터닝하고, 그 후, 이 패턴을 일련의 반응성 이온 에칭 단계를 이용하여 SiN 및 Al₂O₃ 층으로 옮기는 것에 의해 어레이를 형성한다. 최적화된 방법은 도 13c에 도시된 바와 같이 100 nm의 피치(pitch)를 갖는, ~15 nm 직경 나노포어의 병렬 제조(parallel fabrication)를 가능하게 한다. 유사하게, 더 큰 어레이가 도 13d에 도시된 바와 같이 상대적 용이성으로 제조될 수 있다. PMMA 대비 높은 건식 에칭 선택성 및 클리어런스(clearance)를 위해 요구되는 ~10x 더 낮은 전자 선량 때문에 이 적용을 위해 ZEP520 전자 빔 레지스트가 선택되어, 나노포어 어레이의 신속한 웨이퍼 규모 제조를 제공한다. 현수된 막에서의 어레이 제조 전에, 서브-10 nm 해상도를 달성하기 위해 평면 기판 상에서 일련의 테스트 노출을 이용하여 전자 선량(electron dose)을 최적화한다. 본 명세서에서 제공된 방법은 3:1의 SiN:ZEP520에 대한 에칭 선택성을 갖는 CF₄/CHF₃ 혼합물을 이용하여 SiN에서 서브-20 nm 특징형상(feature)의 높은 이방성 건식 에칭(highly anisotropic dry-ethcing)을 가능하게 한다. Al₂O₃은 이 처리법(recipe)을 위한 강건한 에칭 단계로 작용한다. Al₂O₃로의 패턴 전달은 2.5:1의 Al₂O₃:SiN에 대한 측정된 선택성을 갖는 BCl₃:Ar 에칭 처리법을 이용하여 달성된다. Al₂O₃의 테이퍼드 에치 프로파일(tapered etch profile)이 ~54°의 원추각(cone angle)으로 도 13a (iv)에 개략적으로 도시된 바와 같이 관찰되고, Al₂O₃에서 최종 포어 직경이 ZEP520에 패터닝된 포어 직경보다 훨씬 더 작을 수 있게 한다. 이 형상특징은 Al₂O₃에서 서브-10 nm 직경 나노포어 어레이의 제조를 용이하게 할 수 있으므로 잠재적으로 매우 유용하다. 개별적으로 어드레스된(addressed) 나노포어의 어레이를 형성하기 위해 나노규모 전극을 그러한 아키텍쳐로 통합시키는 것은 서열결정 적용을 위한 개별적인 DNA 분자의 고효율 검출을 가능하게 한다.

극박 그래핀/Al₂O₃ 막에서 개별적인 나노포어의 제조가 도 14에 도시된다. 먼저, 집속 이온 빔 도구를 이용하여 독립된 SiN/Al₂O₃ 막에 하나의 ~300 nm 포어를 형성한다. 그 후, 실험 섹션에 상술된 바와 같이 FIB 포어를 포함하는 기판으로 CVD 성장 그래핀을 옮긴다. 이동 후, 나노-규모 및 마이크로-규모 모두에서 그래핀의 온전성(integrity)를 TEM 회절 이미징 및 라만 분광법을 이용하여 검사한다. FIB 포어를 포괄하는 그래핀 막으로부터 회절 패턴 (도 14d)에서 관찰되는 육각 대칭성은 단층 그래핀을 시사하는 것으로 보이며, 이는 I(G')/I(G)>2인 도 14e의 라만 스펙트럼으로부터 피크 강도에 의해 더 뒷받침된다.

여기서 이용된 CVD 공정을 이용한 주로 단층 그래핀의 성장이 보고되었다. 도 14e에서 관찰되는 D 피크는 CVD 그래핀에 특징적이고 결함으로부터 초래된다는 것에 주목한다. 15 Å 두께의 Al 시드층을 그 후 그래핀 층 위로 증발시키고 뒤이어 60 Å의 Al₂O₃의 ALD 증착을 수행하여 8 nm 미만의 전체 막 두께를 생성한다. 도 14g 및 14h (TEM 이미지)에 도시된 바와 같이 집속 수렴성 전자 빔을 이용하여 이 극박 그래핀/Al₂O₃ 막에서 단일 나노포어가 형성된다. 이 나노포어는 현저하게 강건하고 선형 IV 특징을 보인다.

그래핀/Al₂O₃ 나노포어를 통한 단백질-DNA 복합체의 이동(translocation)이 도 4에 도시된다. 이러한 연구에서 모델 DNA-단백질 시스템은 ERα단백질에 대한 동족 결합 서열, 단일 ERE를 포함하는 50 bp 길이의 프로브에 결합된 ERα이다. DNA-결합 ERα는 주로 단백질 복합체의 동월을 위한 핵형성 인자로 작용하고 산화적 스트레스 반응, DNA 수선, 및 전사 인자를 포함한 주요한 생물학적 공정에 관여된다. 단일 ERE를 포함하는 dsDNA 및 ERE 서열 자체로의 ERα의 결합을 보여주는 개략도가 각각 도 4a 및 4b에 도시된다. 도 4c는 겔 이동 분석(gel shift assay)을 보여주고, ERα/ERE 결합이 낮은 염 농도에서만 관찰된다. 나노포어를 이용한 단백질-DNA 복합체의 검출이 도 4d에 도시된 dsDNA 검출과 유사하다. 특히, 80 mM KCl에서 ~14 nm 직경 포어를 통한 ERα-ERE 복합체의 수송은 전류 증강을 가져오고(도 4e), 아마도, 저염에서의 DNA 수송 연구에서 이전에 보고된 바와 같이 수송 동안 국소적으로 포어 전도도를 증가시키는 복합체 상의 반대 이온 응축(counterion condensation)에서 기인될 것이다. 이동 시간 대 전류 증강 산점도가 도 4f에 도시된다. 하나의 결합된 ERα단백질을 갖는 500 mV에서의 이 50 bp 길이의 DNA 프로브의 가장 개연성 있는 이동 시간은 ~3 ms이고, 이는 50 bp dsDNA 단독에 대해 추정된 이동 시간보다 100배(two orders of magnitude) 더 느리다. 여기에 제시된 연구는 그래핀/Al₂O₃ 나노포어가 dsDNA에 결합된 단일 단백질을 공간적으로 분해할 수 있다는 것을 확인한다.

단일 DNA-단백질 복합체의 민감한 전기적 검출을 위한 나노포어 및 나노포어 어레이의 제조가 보여진다. 이 제조 방법은 현수된 SiN/Al₂O₃ 막에서 전자빔 리소그래피 및 반응성 이온 에칭(reactive iion etch) 단계를 이용하여 제조된 ~15 nm 이상의 직경 나노포어의 고밀도 어레이의 형성을 가능하게 한다. 상기 방법은 DNA 서열결정으로의 적용을 갖는 고효율 DNA 분석을 용이하게 하기 위해 이 포어들을 개별적으로 나노-규모 전극으로 어드레싱하는 단계를 더 포함할 수 있다. 극박 그래핀/Al₂O₃ 막에서 단일 나노포어들의 제조 및 DNA-단백질 복합체, 구체적으로 ERα/ERE의 검출이 또한 보여진다. 중요하게, 낮은 염 농도에서 이 플랫폼을 이용하여 단일 단백질의 공간적 분해(spatial resolution)가 달성된다.

참조문헌

Venkatesan, B.M. & Bashir, R. Nanopore Sensors for Nucleic Acid Analysis. Nat. Nanotechnol., 6:615-624 (Available online Sept. 18, 2011).

Branton, D. et al. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1146 (2008).

Venkatesan, B.M. et al. Highly Sensitive, Mechanically Stable Nanopore Sensors for DNA Analysis. Adv. Mater. 21, 2771-2776 (2009).

Venkatesan, B.M. et al. Lipid bilayer coated Al2O3 nanopore sensors: towards a hybrid biological solid-state nanopore. Biomed. Microdevices, 1-12 (2011).

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Li, X. et al. Large-Area Synthesis of High-Quality and Uniform Graphene Films on Copper Foils. Science 324, 1312-1314 (2009).

실시예 7: 핵산 분석용 나노포어 센서

나노포어 DNA 분석은 용액에서 나노-규모 포어를 통해 DNA 분자를 전기영동에 의해 추진시키고 이온성 포어 전류에서 상응하는 변화를 모니터링하는 것을 수반하는, 최근에 개발된 기법이다. 이러한 다용도 방식은 서브-nm 해상도로 단일 뉴클레오티드에서 킬로베이스 길이의 긴 게놈 DNA 단편에 이르기까지 다양한 길이의 하전된 중합체(단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA 및 RNA)의 표지-불포함, 증폭-불포함 분석을 가능하게 한다. 나노포어에서의 최근 진보는 이러한 저비용, 고 확장성(highly scalable) 기술이 3세대 DNA 서열결정 기술의 개발에 적합하여, $1000 미만으로 인간 이배체 게놈의 신속하고 신뢰할 수 있는 서열결정을 가능하게 할 수 있다는 것을 시사한다. 서열결정, 게놈 프로파일링, 후성적 분석 및 의학적 진단에서 나노포어의 최근에 개발된 역할이 이 실시예에 기재된다.

인간 게놈의 서열결정은 질병, 유전, 및 특성(individuality)의 추가적 이해에 기여했다. 게놈 서열결정은 멘델유전질환(Mendelian disorder), 복합적 인간 질환과 연관된 유전적 위험 인자의 식별에서 중대하고, 치료제 및 개인 맞춤형 의료에서 이머징 역할을 지속적으로 수행한다. 보다 싸고 신속한 게놈 서열결정에 대한 증가되는 요구가 속도 및 비용의 측면에서 통상적인 Sanger 사슬 종료(chain termination) 방법을 능가하는 새로운 기술의 개발을 촉발했다. 2004년 NIH(the National Institute of Health)에 의해 제안된 $1000 게놈 과제(challenge)에 의해 고무된, 이러한 신규한 2세대 및 3세대 서열결정 기술은 게놈 의학(gemonic medicine)을 변혁시킬 것으로 예상된다. 나노포어 DNA 서열결정은 현재 이러한 원대한 도전에 부응할 충족시킬 새로운 기술 중 하나이다.

나노포어 DNA 서열결정은 고효율 DNA 분석을 위해 확장될 수 있는, 표지-불포함, 증폭-불포함 단일-분자 방식이므로, 매력적이다. 이 기법은 통상적으로 낮은 시약 부피를 요구하고, 상대적으로 낮은 비용의 장점이 있으며, 긴 판독 길이(long read length)를 지지하여, 잠재적으로 신규 서열결정(de novo sequencing) 및 장거리 하플로타입 맵핑을 가능하게 한다. 나노포어 센싱의 원리는 쿨터 카운터의 원리와 유사하다. 나노-규모 구멍(aperture) 또는 나노포어는 전도성 전해질로 채워진 두 개의 챔버를 분리하는 절연막에 형성된다. 하전된 분자를 하전된 전위 하에 포어를 통해 전기영동에 의해 추진시키고, 그에 의해 포어를 통한 이온 전류를 조절한다. 상응하는 전자 신호(electronic signature)가 이동 분자의 구조 및 동적 운동에 대한 유용한 정보를 밝힌다. 이 개념은 ssDNA 중 각각의 통과하는 뉴클레오티드가 특징적인 잔류 이온 전류를 생성하는 경우, 이 전류 트레이스가 서열 정보를 추출하기 위해 이용될 수 있다는 점에서 90년대에 Deamer, Branton, 및 Church에 의해 최초로 제안된 바와 같은 서열결정까지 확장될 수 있다.

생물학적 나노포어의 최근 발전은 나노포어 서열결정이 실제로 실현가능하다는 것을 시사한다. 생물학적 α-헤모라이신 및 MspA 나노포어를 이용한 원리증명 실험은 이러한 방향의 상당한 진전을 보여주었다. 이 실시예는 고체-상태 및 하이브리드 나노포어 기술, 특히, 단일 뉴클레오티드 구별(discrimination) 및 초고속 서열결정(ultrafast sequencing)을 가능하게 할 수 있는 그래핀의 내포(incorporation)에서의 새로운 발전과 함께 이 영역에서의 최근 진보를 기술한다. DNA 이동을 둔화시키기 위한 노력 (도 15) 및 나노포어에 관능성(functionality)을 부가하는 신규한 센싱 아키텍쳐 및 방식(modality)이 또한 검토된다(표 1). 이러한 신규 기법의 서열결정으로의 적용 및 관련된 도전과제가 간략하게 제시된다. 마지막으로, 서열결정 이외의 분야로의 나노포어의 적용, 특히, 의학적 진단에서 이 기술의 떠오르는 역할이 검토된다.

이온 전류 방식(ionic current approach)은 원리 증명 서열결정 실험, 특히, 엑소뉴클레아제 분해에 의한 서열결정 및 DI 서열결정에서 유의한 성공을 보였다. 나노포어 기반 광학적 방식도 가능성을 보이나, DNA의 광범위한 변환(extensive conversion)을 요구한다. 컴퓨터를 사용한 연구(computational study)는 횡방향 전자 터널링(transverse electron tunneling) 및 용량성 나노포어(capacititive nanopore) 방식이 또한 초고속 서열결정을 가능하게 할 수 있다는 것을 시사하나, 이러한 기법의 실험적 실현은 여전히 미결이다.

생물학적 나노포어: 지질 이중층으로 재구성된 생물학적 나노포어는 단일 분자 DNA 분석을 위한 매력적인 옵션을 보여준다. 그의 다능성(versatility)은 여러 인자에서 기인될 수 있다: 먼저, 자연이 반도체 산업에 의해 재현될 수 없는 원자 수준의 정확성으로 생물학적 나노포어를 대량 제조할 수 있는 세포 기구(cellular machinary)를 제공하고; 옹스트롬 수준 해상도로 포어 구조를 밝히는 X-선 결정학적 정보가 이용가능하며; 부위 지향적 돌연변이 유발(site directed mutagenesis)과 같은 기법이 포어의 물리적 및 화학적 특성을 맞추기 위해 이용될 수 있고; 및 크기 및 조성의 측면에서 포어에서 놀라운 이질성(heterogeneity)이 관찰된다. 생물학적 나노포어를 통한 DNA 수송의 인-비트로 연구는 전통적으로 α-헤모라이신을 수반했으며, 이 헵타머 단백질 포어(heptameric protein pore)의 구조가 도 16a에 도시된다. 채널은 단일 가닥 DNA의 통과는 허용하나, 이중 가닥 DNA (dsDNA)의 통과는 허용하지 않는, 1.4-nm 협착부(constriction)를 포함하는, 길이가 ~5 nm인 막관통 β-배럴(barrel)에 연결된 3.6-nm 통로(vestibule)로 이루어진다. Kasianowicz는 최초로 α-헤모라이신을 통한 개별적인 ssDNA 및 ssRNA 분자의 전기영동에 의한 수송을 입증했다. 특히, 초기 결과는 천연(native) α-헤모라이신이 시티딜산과 아데닐산의 자유 이동(freely translocating) RNA 동종 중합체와 ssDNA의 폴리(dA) 및 폴리(dC)를 구별할 수 있는 능력을 보여주어, 차세대 DNA 서열결정 도구로서의 α-헤모라이신의 잠재적 출현을 시사했다. 그러나, 그러한 도구의 실현은 주로 도 15에서 알 수 있는 바와 같이, 통상적인 실험 조건 하에서 ssDNA가 포어를 통해 이동하는, 놀라울 정도의 높은 속도(~ 1 뉴클레오티드/㎲로 추정됨) 때문에 어려운 것으로 입증되었다. 이러한 빠른 시간 규모에서, 이동하는 뉴클레오티드를 올바르게 식별하기 위해서 포어에서 ~100 개의 이온이 이용가능하나, 이는 열역학적 변동(thermodynamic fluctuation)(포어 중 전하 운반체의 수와 뉴클레오티드의 위치의 통계적 변화) 및 뉴클레오티드 간에 존재하는 미묘한 화학적 차이를 고려할 때 어려운 문제이다. 따라서, α-헤모라이신을 이용하여 자유롭게 이동하는 ssDNA의 서열을 결정하는 것은 불가능한 것으로 입증되었다.

현재까지의 대부분의 나노포어 서열결정 전략은 전자 판독(electronic read-out) 전에 ssDNA의 수송을 능동적으로 또는 수동적으로 둔화시키고자 하였다. 능동적 방식은 통상적으로 포어를 통한 DNA 수송을 조절하기 위해 효소를 포함한다. 나노포어에 커플링된 효소 모터는 두 가지 이유에서 매력적이다: (1) 효소-DNA 복합체가 벌크 용액에서 형성되어 포어에서의 전기영동적 포획(electrophoretic capture)을 가능하게 하고, (2) 효소가 DNA 기질을 포어를 통해 전진적으로(processively) 이동하게 할 때, 비교적 느리고 제어된 운동(motion)이 관찰된다. 그의 명쾌한 입증이 DNA 폴리머라아제에 의해 촉매된 α-헤모라이신을 통한 ssDNA의 염기 단위 라체팅(base-by-base ratcheting)이다. 단일 뉴클레오티드 프라이머 연장 사건이 상보적 뉴클레오티드 세트의 존재 시에만 전자적으로 관찰되어, 서열결정을 가능하게 했다. 보다 최근에, Lieberman 등은 phi29 DNA 폴리머라아제를 이용한 α-헤모라이신에서의 ssDNA의 전진적 복제(processive replication)를 보여주었다. 개별적인 촉매 사이클을 분석(resolve)할 수 있는 것 외에, 폴리머라아제 역학이 또한 이온 전류를 이용하여 파악될 수 있었다(dNTP 결합, 폴리머라아제 핑거 개방-폐쇄(polymerase fingers opening-closing)). DNA 가공 효소를 이용한 α-헤모라이신을 통한 DNA의 제어된 수송에 대한 리뷰가 Deamer에 의해 제공된다. DNA를 둔화시키는, 보다 간단한 수동적 방식이 또한 존재하며, 예를 들면, 뉴클레오티드 표지화(labeling), DNA 헤어핀에 의한 ssDNA의 말단 종료(end termination), 막관통 도메인에 양전하로 하전된 잔기들을 배열하는(line) 것에 의한 분자 브레이크(molecular brake)의 포어로의 포함 등이 존재하나, 어느 방식도 고도로 제어되고, 배향된 분자 수송의 원대한 과제를 해결하는 것으로 등장하지 못했다. 뉴클레오티드 표지화는 표지의 화학, 전하, 및 크기가 변할 수 있어서, 잠재적으로 "즉각적인(on the fly)" 서열결정을 가능하게 하므로, 상당히 매력적이나, 큰 게놈 단편에서 연속적인 뉴클레오티드를 표지화하는 것은 과제를 제시한다. 보다 만능의, 표지-불포함 서열결정 방법이 최근에 Bayley 그룹에 의해 입증되었다. 이 연구에서, Clarke 등은 저항성 전류(resistive current) 측정을 이용하여 α-헤모라이신을 통한 원래의 모노뉴클레오티드 (dAMP, dCMP, dGMP, dTMP)를 지속적으로 분해(resolve)하는 능력을 입증했다. 돌연변이 α-헤모라이신 포어를 막관통 도메인의 β-배럴 내에 공유결합에 의해 결합된 아미노사이클로덱스트린 어댑터로 변형시켜, 센서의 화학적 특이성을 강화시키면서, 채널을 수축시키는 것에 의해 염기 선택성이 달성되었다. 최적의 작동 조건 하에서 가공되지 않은(raw) 모노뉴클레오티드를 99% 이상의 신뢰도로 판독했다. 이 염기 식별 플랫폼을 화학적 부착 또는 유전적 융합을 통해 고 가공성(highly processive) 엑소뉴클레아제와 통합시키는 것에 의해, 분해(digestion) 방식에 의한 나노포어 기반 단일 분자 서열결정이 실제로 실현가능하다. 이러한 방식이 Oxford Nanopore (Oxford, UK)에 의한 상업적 서열결정 노력의 기반을 형성한다.

α-헤모라이신이 과거에 생물학적 나노포어 서열결정 분야를 지배했으나, 서열결정을 위한 보다 효율적인 생물학적 나노포어가 이미 등장하기 시작했다. α-헤모라이신의 구조적 단점은 한번에 최대 ~ 10개의 뉴클레오티드까지 수용하는 ~5 nm 길이의 원통형 β-배럴과 관련된다. 이 β-배럴에 위치한 뉴클레오티드는 포어 전류를 상당히 조절하고, 뒤이어 가장 좁은 1.4 nm 포어 협착부에서 단일 뉴클레오티드 특이적 이온 신호를 희석시켜, 서열결정 응용에서 전체 신호-대-잡음비를 감소시킨다. 이러한 내재된 구조적 한계는 나노포어 서열결정 분야에서 비교적 새로운 후보인 채널 포린 마이코박테리움 스메그마티스 포린 A(Mycobacterium smegmatis porin A)(MspA)에 의해 극복된다. MspA는 ~0.5 nm의 채널 길이를 갖는 ~1.2 nm 직경의 단일 협착부를 포함하는 8량체 단백질로, α-헤모라이신의 원통형 구조와 대조적으로, 테이퍼드 깔때기 형태(tapered funnel shape)(구조적 단면도가 도 16b에 도시됨)를 형성한다. Derrington 등은 유전적으로 조작된 MspA가 천연 α-헤모라이신 대비 뉴클레오티드 분리 효율의 인상적인 3.5배 개선으로 트리-뉴클레오티드 셋트 (AAA, GGG, TTT, CCC)를 구별할 수 있는 능력을 입증했다. 흥미롭게도, 고정화된 ssDNA를 포함하는 실험에서, MspA의 협착부 내 또는 근처에 있는 적게는 3개의 뉴클레오티드가 포어 전류에 기여하는 것으로 관찰되었고, 이는 천연 α-헤모라이신에서 이온 전류를 조절하는 것으로 알려진 ~10개의 뉴클레오티드 대비 유의성 있는 개선이다. 저자들은 이것이 미래의 MspA 돌연변이체의 자명한 목표인, 부위 특이적 돌연변이 생성을 통해 단일 뉴클레오티드까지 더 개선시킬 수 있을 것으로 가설을 세운다. MspA의 신생 서열결정(de novo sequencing)으로의 적용도 도전 과제가 없는 것은 아니다. MspA를 통한 방해받지 않는(unimpeded) ssDNA 이동의 속도는 여전히 너무 빨라서 "즉각적으로(on the fly)" ssDNA를 서열결정할 수 없다. 이 한계를 극복하기 위해, DI(duplex interrupted) 나노포어 서열결정이 최근에 제안되었다. DI 서열결정은 분석물 DNA 분자에서 각 뉴클레오티드 사이에 '짧은' 이중-가닥 DNA 세그먼트를 삽입하는 것을 포함한다. 듀플렉스 변환 DNA(duplex converted DNA)는 MspA 나노포어를 통해 추진되고, 각 듀플렉스가 순차적으로 이동(translocation) 과정을 중단시켜, 단일 분석물 뉴클레오티드를 이온 전류를 이용한 식별을 위해 한정된 나노포어 구멍(confining nanopore aperture)에 노출시킨다. 듀플렉스 분리 후, DNA는 다음 분석물 뉴클레오티드가 결정되는 것인 다음 듀플렉스까지 전진하고, 지속한다(and so forth). 이러한 방법은 궁극적으로 신속한 긴 순차적 판독을 가능하게 한다; 그러나, 이 방식을 이용하여 큰 게놈 단편을 높은 정확도(fidelity)로 변환시키고 판독하는 능력은 여전히 확인되어야 한다. DI 서열결정에 대한 대안적인 방식은 ssDNA를 포어를 통해 제어가능하게 전진시키고, 뉴클레오티드 식별이 각 단계에서 일어나도록 효소-모터를 MspA에 커플링시키는 것이고, 이 방법은 스트랜드 서열결정(strand sequencing)으로 지칭된다. 이 적용에 적합한 후보 효소는 T7 DNA 폴리머라아제, DNA 폴리머라아제 1의 Klenow 단편, 및 phi29 DNA 폴리머라아제를 포함하고, 후자는 높은 180 mV 인가 부하(applied load) 하에 α-헤모라이신 구멍에서 순차적인 뉴클레오티드 첨가를 촉매하는데 있어서 놀라울 정도로 안정하고 매우 효율적인 것으로 알려져 있다. 따라서, MspA에 커플링된 phi29 DNA 폴리머라아제가 DNA의 긴 가닥의 서열결정을 가능하게 하는 것이 실현가능하나, 그러한 시스템의 실험적 실현은 아직 입증되지 않았다.

DNA 서열결정 이외의 분야로의 생물학적 나노포어의 적용은 또한 대단한 잠재력을 갖는다. 분자 진단 및 DNA 지문감식(fingerprinting)에서 유용한 적용을 찾을 수 있는 하나의 특정한 생물학적 포어는 박테리오파아지 phi29 DNA 패키징 모터(packaging motor)로부터의 커넥터 단백질이다. 이 단백질 나노포어의 다능성은 그의 상대적 크기로부터 기인되며, 이 단백질 허브는 ~3.6 nm 내경을 갖는 채널을 형성하기 위해 자기-조립되는 12개의 GP10 서브유닛으로 이루어진다. 흥미롭게도, 이 나노포어의 개방 채널 전도도는 유사한 조건 하에서 α-헤모라이신의 전도도보다 ~5배 더 높아서, dsDNA, DNA 단백질 복합체 및 단백질 서열결정을 위한 아미노산 중합체를 포함한 더 큰 분석물의 스크리닝 가능성을 시사한다. 지질 이중층에 임베딩된 유전적으로 조작된 커넥터 채널을 통한 dsDNA의 이동은 Wendell 등에 의해 최근에 입증되었다. 이 채널을 통한 dsDNA의 단방향 이동(N-말단 유입으로부터 C-말단 유출까지)이 관찰되어, 박테리오파아지 phi29 바이러스 성숙 동안 dsDNA 패키징을 보조하는 채널의 정상적인 밸브 메카니즘을 시사한다. 이러한 놀라운 단백질 나노포어의 능력은 앞으로 보다 명확해질 것이다.

고체-상태 나노포어. 생물학적 나노포어의 이질성 및 놀라운 민감성에도 불구하고, 이러한 센서는 일부 내재된 단점을 보인다. 기계적으로 지지하는 지질 이중층의 연약한 속성, 실험 조건(pH, 온도, 염 농도)에 대한 생물학적 포어의 민감성, 및 고효율 DNA 분석/서열결정을 위한 대규모 어레이 통합과 연관된 도전과제가 이러한 생물학적 플랫폼의 다능성을 제한한다. 고체 및 나노포어 기판 상에서 지지되는 이중층의 개발, 이중층 지질 조성의 변화, 및 고정된(tethered) 이중층 아키텍쳐의 개발을 통한 이중층 안정성의 지속적인 개선에도 불구하고, 고체-상태 막의 강건성(robustness) 및 내구성은 그들의 생물학적 대응물을 여전히 상당히 대체한다. 마이크로제조(microfabrication) 기법의 진보와 결합되어, 고체-상태 나노포어는 따라서, 빠르게 생물학적 나노포어에 대한 저렴하고 높은 다능성의 대안이 되고 있다. 고체-상태 기술에 의해 제공되는 다른 장점은 서브-nm 정확도로 나노포어 치수를 조정하는 능력, 고밀도 나노포어 어레이를 제조하는 능력, 지질-기반 시스템 대비 탁월한 기계적, 화학적, 및 열적 특징, 및 전기 및 광학적 탐색(probing) 기법과의 가능한 통합을 포함한다.

고체-상태 나노포어를 이용한 DNA 센싱의 최초 보고서는 2001년 초에 Golovchenko 랩으로부터 등장했다. 포어 크기에 대해 진정한 나노미터 제어를 제공하는 방법인, 맞춤 제작(custom built) 피드백 제어 이온 빔 조각 도구를 이용하여 SiN 박막에 나노포어를 형성했다. 오늘날, 대부분의 그룹은 1980년대 이후 발전한 기법인, 얇은 절연막에 분해에 의해(decompositionally) 나노포어를 스퍼터링하기 위해 FEG(field emission gun) TEM으로부터의 집속된 수렴성 전자 빔을 이용하는 것을 선호한다. 얇은 절연막에서의 고체-상태 나노포어의 제조는 Healy 등에 의해 검토되고, 이 기술의 단일 분자 생물물리학으로의 적용은 Dekker에 의해 검토된다. SiN은 전통적으로 최적화된 저압 화학 증착 공정을 통해 증착되어, 높은 화학적 내성 및 낮은 기계적 스트레스로 인해 선택되는 나노포어 막 물질이었다. 이 공정은 통상적으로 상승된 온도 (~800℃)에서 수행되고 서브-nm 규모에서 두께 제어가 없다. 개별적인 뉴클레오티드의 해상도로 DNA의 국소 구조를 효과적으로 탐색(probe)하기 위해, 서브-nm 두께의 절연막이 요구된다. 이 목표를 위한 연구에서, 원자층 증착(ALD)를 이용하여 극박 절연성 Al₂O₃ 막에 나노포어를 형성하는 방법이 제안되고, 이 방법은 막 두께에 대한 옹스트롬 수준 제어를 제공하는 방법이다. 집속된 전자 빔을 이용한, Al₂O₃ 막에서의 나노포어 제조는 두 가지 흥미로운 현상, 포어 중 나노규모 전극의 직접적인 "기록(write)"에 적용가능한, Al₂O₃의 금속 Al로의 용량-의존적 전환, 및 포어/유체 인터페이스에서 나노-규모 표면 전하 엔지니어링을 가능하게 하는, α 및 γ 나노결정성(nanocrystalline) 도메인의 제어된 형성을 밝혔다. 이러한 파라미터가 1/f 잡음 및 DNA 수송 속도에 대해 갖는 효과를 고려할 때, 포어 및 표면 전하 밀도에서 물질의 화학양론(stoichiometry)을 제어하는 것이 중요하다. 흥미롭게도, 유사한 직경의 SiN 포어에 비해 Al₂O₃ 나노포어에서 보다 느린 DNA 수송이 관찰되었고, 이는 양전하로 하전된 Al₂O₃ 표면과 음전하로 하전된 dsDNA 간의 강한 정전기적 상호작용에서 기인된다. 정전기적으로 또는 화학적으로 이러한 상호작용을 강화하는 것은 또한 나노포어 서열결정의 전제 조건인 DNA 수송 속도를 감소시키는 것에 기여할 수 있다. 이러한 ALD 기반 기법의 다능성은 또한: 1) 각각 고유한 물질 특성을 갖는, TiO₂ 및 HfO₂를 포함한 다양한 기타 고-k 유전체 물질에서 막 및 나노포어의 형성, 및 2) ALD 공정의 낮은 온도 속성(통상적으로 < 250℃)에 의한 금속 접촉 및 그래핀 층의 막으로의 직접적인 통합을 가능하게 한다. 이러한 방식은 큰 가능성을 보였으나, 서브-nm 두께의 강건한, 절연성 ALD 막의 제조는 극박 필름의 핀홀(pinhole)을 통한 이온 전류 누설 때문에 어려운 것으로 입증되었다. 따라서, 서브-nm 두께의 절연막의 형성은 신규한 방식을 요구할 것이다.

그래핀: 이차원 벌집 격자(honeycomb lattice)로 조밀하게 채워진 탄소 원자의 원자 두께의 얇은 쉬트(atomically thin sheet)인 그래핀은 놀라운 기계적, 전기적 및 열 특성을 갖는다. 그래핀 단층(monolayer)의 ssDNA 중 뉴클레오티드 간 0.32 내지 052 nm 간격(spacing)에 유사한 두께는 이 물질이 전자 DNA 서열결정을 이해 특히 매력적이게 한다. 현수된 그래핀 필름에 제조된 단일 나노포어 및 나노포어 어레이의 최초 보고서는 2008년에 Drndic 랩에서 등장했다. Zettl 그룹에 의한 후속 TEM 기반 연구가 인 시투 그래핀에서의 포어 형성의 동역학(kinetics) 및 그래핀 가장자리(graphene edge) 안정성 (지그-재그 대 암체어)을 밝혔다. 그러나, 그래핀 나노포어를 이용한 개별적인 dsDNA 분자의 검출은 최근에서야 입증되었다. 별개의 연구에서, Golovchenko (Harvard) 랩, Dekker (Delft) 랩, 및 Drndic (University of Pennsylvania) 랩은 화학적 증착(CVD) 또는 흑연으로부터의 박리를 통해 제조된, 현수된 그래핀 필름에서 5-25 nm 직경 나노포어의 전자-빔 기반 제조를 보고했다. 나노포어는 적게는 그래핀의 1 내지 2개의 단층에서 형성되고, 막은 고 이온 강도 용액에서 놀라운 내구성 및 절연성을 보였다. 단층 두께의 박막(monolayer thin membrane)에서 포어의 전도도는 일부 독특한 경향을 보였다. 하바드 연구는 두꺼운 SiN 막의 포어에서 통상적으로 관찰되는 d _pore ² 스케일링(scaling)과 대조적으로 단층 두께의 박막(monolayer thin membrane)에서 포어 전도도와 포어 직경, d _pore 의 선형적 스케일링(linear scaling)을 보여주었다. ~0.6 nm의 유효막 두께, h _eff 가 그래핀 단층에서 형성된 나노포어에 대해 도출되었다. 이 결과는 우세한 저항이 포어 저항 자체(R _pore )가 아니고 접근 저항(access resistance) (전극으로부터 나노포어까지 전해질의 잠재적 감소에서 기인된 R _access )이고, R _access 는 d _pore .과 반비례로 조정(scale)되는 것인 h _eff →0 인 극한의 이론과 일치한다. 대조적으로, Delft 연구는 그래핀 단층에서 나노포어의 전도도가 d _pore ² 의 함수로 스케일된다는 것을 보여주었고, 이는 무시할 수 없는 두께의 원통형 나노포어 기하학적 구조(geometry)를 시사하는 흥미로운 결과이다(R _pore > R _access ). 이 d _pore ² 스케일링의 기원은 DNA 흡착을 감소시키기 위해 그래핀에 도입된 폴리머 코팅(6-머캅토헥산산)일 수 있다. 또한, Delft 그룹은 단일 단층에 형성된 동일 직경의 포어 대 최대 8개의 단층 두께의 막에 형성된 포어에 대해 유사한 전도도 값을 보고했다. 다층 그래핀에서 나노포어 형성이 그래핀 층의 수가 포어 중심의 방향으로 방사상으로 단조적으로 감소하고, 단층 두께의 영역이 포어 가장자리를 채우는(line) 것인 테라스 효과(terrace effect)를 유도하는 것으로 알려져 있기 때문에(도 17c) 후자의 결과는 실현가능하다. 이 효과는 최근에 TEM 이미지 분석을 이용하여 확인되었고, 또한 이전의 연구에서 볼 수 있다. 계단식 나노포어 아키텍쳐는 두 가지 이유에서 매우 유용한 것으로 입증될 수 있다: 1) 이는 그래핀 단층 나노포어를 제조하기 위해 대면적 단층의 성장 및 이동의 제한을 잠재적으로 완화하고, 2) 다층 지지는 그래핀 나노포어 센서의 안정성 및 수명을 증가시킬 수 있다.

그래핀 포어를 통한 dsDNA의 이동은 SiN 나노포어에서의 DNA 유도 전류 차단과 유사한, 폴딩된 DNA 구조와 폴딩되지 않은 DNA 구조 모두의 수송을 나타내는 이온 전류의 미묘한 변동을 유도했다. 이동 속도는 10 내지 100 nts/㎲의 범위였고, 이는 개별적인 뉴클레오티드의 전자적 측정에 대해서는 너무 빠르다. 그 결과, Garaj는 컴퓨터를 이용한 분석을 이용하여 그래핀 단층 나노포어의 이론적인 공간적 및 기하학적 해상도(resolution)를 탐색했다. ~0.6 nm 두께의 2.4-nm 직경 그래핀 포어에서의 dsDNA의 의사-정적 시뮬레이션(pseudo-static simulation)은 개별적인 DNA 뉴클레오티드의 크기와 동일한 ~0.35 nm의 해상도를 밝혔다. 이러한 놀라운 결과는 DNA 이동이 그래핀 포어에서 충분히, 예를 들면, ~1 nt/ms까지 둔화되면, 단일 뉴클레오티드 검출이 이론적으로 가능하여, 잠재적으로 전자적 서열결정을 가능하게 한다는 것을 시사한다. 그러나, 이러한 진보를 가능하게 하기 위해, DNA 수송의 정량적 측면이 더 잘 이해되어야 한다. 예를 들면, 정규화된 조건(염 농도, 전압) 하에서, 다층 그래핀(3 내지 15개의 단층)의 나노포어가 단층 그래핀의 포어에 비해 더 깊은 DNA 유도 전류 차단을 생성하는 이유는 여전히 밝혀져야 한다. 그래핀 나노포어 구조, 특성 및 정량적 DNA 수송에 대한 보다 상세한 연구가 요구되나, 하나의 가능한 설명은 앞서 언급된 테라스 효과이다. 서열결정과 관련된 다수의 근본적인 문제가 또한 남아있다. 예를 들면, 단일 뉴클레오티드 해상도가 열역학적 변동 및 전기적 잡음의 존재 하에 실험적으로 실현가능한지 여부가 명확하지 않다. 또한, 퓨린과 피리미딘 간의 화학적 및 구조적 유사성이 노출된 그래핀 포어(bare graphene pore)를 통한 이온 전류만을 이용한 개별적인 뉴클레오티드의 식별을 내재적으로 제한할 수 있다. 뉴클레오티드 특이성을 강화하기 위해, 그래핀 포어의 표면 관능화가 필요할 수 있으나, 그러한 방식은 막 비후화(thickening)로 인해 해상도를 손상시킬 수 있다.

DNA 서열결정 이외의 나노포어 적용. 고체-상태 나노포어에 대한 보다 즉각적인 적용은 의학적 진단일 수 있다. 나노포어 기반 진단 도구는: (1) 극미한 시료 부피로부터 매우 낮은 농도의 표적 분자(환자 혈청 중의 종양 세포로부터 빠져나온 DNA)를 검출할 수 있고; (2) 일련의(panel) 바이오마커/유전자를 동시에 스크리닝할 수 있으며(진단, 진행 및 예후의 모니터링에서 중요함); (3) 비교적 낮은 비용으로 신속한 분석을 제공할 수 있고; 및 (4) PCR, 비술피트 변환, 및 Sanger 서열결정과 같은 부담스러운 증폭 및 전환 단계를 제거할 수 있다. 마이크로RNA (miRNA) 발현 프로파일링은 고체-상태 나노포어 기술이 탁월할 수 있는 하나의 적용이다. 이러한 암 바이오마커의 검출 및 정확한 정량은 중요한 임상적 영향을 가져서, 질병 진단, 병기(staging), 진행, 예후, 및 치료 반응의 파악을 용이하게 할 것이다. Wanunu 등은 최근에 통상적인 마이크로-어레이 기술을 능가하는 민감성으로, 세포 조직으로부터 농축된 특정한 마이크로RNA 서열을 검출하는 나노포어-기반 방법을 입증했다(도 19a). 또 다른 흥미로운 전망은 후성적 분석(epigenetic analysis), 보다 구체적으로 발암에서 초기에 및 빈번하게 관찰되는 사건인 이상 DNA 메틸화의 검출을 위한 고체-상태 나노포어의 사용이다. 특정 유전자의 프로모터 서열의 저메틸화 및 고메틸화가 강건한 암 바이오마커(예를 들면, 전립선 암 케이스의 90% 이상에서 GSTP1 프로모터 과메틸화(hypermethylation)가 관찰됨), 및 다수의 종양 종류에서 질병 중증도 및 전이 가능성의 지표로서 작용한다. 메틸화 및 히드록시메틸화 DNA의 검출을 포함한 나노포어 기반 메틸화 분석을 위한 예비 진전이 Timp 및 Drndic 랩에 의해 입증되었다.

단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)의 검출을 포함하는 유전적 분석은 나노포어에 맞춤화된 또 다른 중요한 진단적 적용이다. SNP 및 점 돌연변이가 낭포성 섬유증 및 헌틴턴병과 같은 다양한 멘델유전병 및 보다 복잡한 질병 표현형과 연관되었다. 원리증명 실험에서, Zhao와 동료들은 ~2 nm 직경 SiN 나노포어를 이용한 SNP의 민감한 검출을 입증했다. 나노포어를 국소 힘 작동기(local force actuator)로 사용하여, DNA 결합 단백질과 SNP 서열 대비 그의 동족(cognate) 서열의 결합 에너지가 구별될 수 있다(도 19b). 이 방식은 전사 인자, 뉴클레아제 및 히스톤을 포함한 다양한 기타 DNA 결합 단백질의 관련된 서열 중 돌연변이를 스크리닝하는 것까지 확장될 수 있다. 고체-상태 나노포어를 사용하여, Meller 랩은 실제로 또 다른 방향을 추구하고 있다; 바이러스 및 인간 병원체의 신속한 유전형분석. 고 침습성 PNA(highly invasive Peptide Nucleic Acid) 프로브의 도입을 포함하는 혁신적인 방식이 높은 친화도 및 서열 특이성으로 표적 게놈을 표지하여, 분자에서 국소 돌출부(local bulge)(P-루프)를 생성하기 위해 이용되었다. 이 표지된 분자의 이동이 이차 DNA-PNA 차단(blockade) 수준(도 19c)을 초래하여, 효과적으로 표적 게놈을 바코딩했다. 이 기법의 궁극적인 공간적 해상도를 결정하기 위해 추가적인 연구가 필요하나, 이 방법은 잠재적으로 C형 간염(Hepatitis C) 바이러스, 뎅기열(Dengue) 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스(West Nile Virus)를 포함한 작은 5-10 kb 바이러스 게놈의 신속하고, 정확하며, 증폭-불포함 식별을 가능하게 할 수 있다.

하이브리드 생물학적/고체-상태 나노포어. 현재 고체-상태 나노포어 기술의 주요한 단점은 동일한 근사적(approximate) 크기의 분석물을 화학적으로 구별할 수 없는 것이다. 이러한 화학적 특이성의 부재는 특정한 인식 서열과 수용체의 부착을 통한 포어의 표면 변형, 즉, 하이브리드 구조를 형성하는 것에 의해 극복될 수 있다. 화학적으로 민감함 나노포어가 서열결정 응용에서 뉴클레오티드를 독특하게 식별하거나 또는 진단 응용에서 표적 단백질을 구별하고 정량하기 위해 필요할 수 있다. 화학적 관능화 및 중합체 나노포어의 전기적 특성에 대한 그의 효과가 최근에 Siwy에 의해 입증되었다. 표면 관능화는 또한 DNA 서열 특이성을 도입하기 위해 이용될 수 있다. DNA 헤어핀 관능화 SiO₂ 나노포어를 포함하는 연구에서, 단일 염기 불일치 프로브(1MM) 대비 완벽한 상보성(PC) ssDNA의 통과에 대해 보다 높은 유량(flux) 및 보다 작은 이동 시간이 관찰되었고, 이는 SNP의 검출을 위한 매우 민감한 전략이다 (도 19a). SiN 중 관능화된 바이오미메틱(biomimetic) 나노포어는 또한 단일-분자 수준에서 핵세포질 수송(nucleocytoplasmic transport) 현상의 연구를 가능하게 했다. 포어의 표면 화학을 변화시키는 것은 또한 단백질의 민감한 검출 및 구별을 가능하게 할 수 있다. 곤충 더듬이의 지질 코팅 후각 감각기(lipid coated olfactory sensilla)로부터 영감을 얻어서, Mayer 랩은 최근에 유체 지질 이중층(fluid lipid bilayer) 코팅 SiN 나노포어를 이용한 단백질의 식별을 입증했다(도 19b). 이동성 리간드(mobile ligand)의 이중층으로의 내포는 포어에 화학적 특이성을 도입하고, 표적 단백질의 이동을 둔화시키고, 포어가 막히는 것(clogging)을 방지하고 비-특이적 결합을 제거하여, 고체-상태 나노포어에 내재된 다수의 이슈를 해소했다. 이러한 속성의 지질 이중층 코팅 나노포어 아키텍쳐 (SiN 또는 Al₂O₃)는 또한 강건한 나노포어 서열결정 요소를 형성하기 위해 생물학적 나노포어와의 미래의 통합을 가능하게 한다.

하이브리드 생물학적 고체-상태 나노포어의 개념이 최근에 Dekker와 동료들에 의해 유전적으로 조작된 α-헤모라이신의 2.4-3.6 nm 직경 SiN 나노포어로의 직접적인 삽입을 통해 최근에 발전되었다. 단순한, 그러나 우아한 전략이 고체-상태 포어에서 α-헤모라이신의 배향(orientation)을 제어하기 위해 고안되었다. 도 19c에 도시된 바와 같이 단백질 포어에 긴 dsDNA 테일을 화학적으로 연결시키는 것에 의해, 이러한 조작된 α-헤모라이신 채널의 SiN 나노포어로의 진입이 동축 정렬 구조(coaxially aligned strcutre)를 형성하도록 전기영동에 의해 가이드될 수 있다. 하이브리드 포어 전도도 및 ssDNA 이동 사건 지속시간은 지질 이중층에 임베딩된 α-헤모라이신과 잘 일치했다. 흥미롭게도, 하이브리드 포어를 통한 ssDNA 차단 진폭은 α-헤모라이신-이중층 시스템에 비해 훨씬 더 낮았고, 이는 고체-상태 포어에 삽입되었을 때, 생물학적 포어의 변형(deformation), 및 그의 몸체 주위의 누설 전류에 기인한다. 또한, 전기적 잡음의 증가가 하이브리드 구조에서 관찰되었다. 이러한 파라미터는 아미노사이클로덱스트린 변형 α-헤모라이신의 단일 뉴클레오티드 민감성에 필적하기 위해 최적화되어야 할 것이다. 그럼에도 불구하고, 이 하이브리드 아키텍쳐는 α-헤모라이신 또는 MspA의 단일 뉴클레오티드 인식 능력을 개별적으로 어드레싱된 고체-상태 나노포어의 웨이퍼-규모 어레이(wafer-scale array)와 커플링시키는 것에 의해 고효율 서열결정의 흥미로운 가능성을 연다.

여기에 기술된 진보는 나노포어가 앞으로 의학적 진단 및 DNA 서열결정에서 증가되는 역할을 수행할 것이라는 것을 시사한다. 나노-챔버의 어레이에서 합성에 의한 서열결정(sequencing-by-synthesis)의 단일 분자 소산장(evanescent field) 검출(Pacific Biosciences), 자가-조립 DNA 나노어레이 상에서의 라이게이션에 의한 서열결정(sequencing by ligation)(Complete Genomics), 및 다중 폴리머라아제-주형 반응으로부터의 실리콘 전계 효과 트랜지스터(silicone field effect transistor) 상에서의 합성에 의한 서열결정 동안 방출되는 H⁺ 이온의 검출(Ion Torrent)을 포함한, DNA 분자의 검출 및 서열결정을 위한 새로운 광학적 및 전자적 방식이 등장하면서, 생물학적 또는 고체-상태 나노포어를 이용한 단일 분자의 직접 판독 '즉각적인(on the fly)' 서열결정의 목표는 여전이 매우 매력적인 중대한 도전과제로 남아있다. 신속하고 비용-효과적인 방식으로 표지되지 않은 ssDNA 분자에서 긴 염기 판독을 수행할 흥미로운 가능성은 유전체학 및 개인 맞춤화 의약을 변혁시킬 것이다. 이러한 대단히 흥미로운 전망이 NIH로부터의 대규모 투자 및 Roche/IBM, Oxford Nanopore, 및 NABsys를 포함한 기업으로부터의 민간 분야 투자를 포함하여, 학계 및 업계 모두에서 혁신을 지속적으로 추진시킨다. 현재의 동향은 서열결정에서 생물학적 나노포어의 사용을 억제하는 유의한 장애 (높은 이동 속도, 뉴클레오티드 특이성의 결여)가 해결되었다는 것을 시사한다. 유사하게, 고체-상태 나노포어를 통한 DNA 이동이 ~3 Å/ms (~3 Å의 공간적 해상도를 갖는 센서 영역을 통해 단일 뉴클레오티드의 길이가 1 밀리세컨드 내에 이동함)까지 둔화될 수 있고, 전자 신호로 뉴클레오티드가 독특하게 식별될 수 있다면, 20분 미만 내에 백만개의 염기로 이루어진 길이의 분자의 서열이 결정될 수 있다. 이 기술을 병렬로 작동되는 100,000개의 개별적으로 어드레싱된 나노포어의 어레이로 확장하는 것은 50배 범위(50 fold coverage)로 30억 bp 인간 게놈의 서열 결정을 1시간 미만 내에 수행할 수 있게 할 수 있다.

이를 달성하기 위해, 나노포어 인터페이스에 관능성을 부가하는 신규한 아키텍쳐, 예를 들면, 본 명세서에서 제공된 전자 게이트 나노포어 및 나노채널, 단일-벽(single walled) 탄소 나노튜브의 통합 및 나노포어에 임베딩된 그래핀 나노리본 및 나노갭이 필요할 것이다. IBM의 DNA 나노포어 트랜지스터 아키텍쳐를 이용한 서열결정 방식도 동일하게 흥미롭다. 분자 동력학(molecular dynamics)을 이용하여, IBM 그룹은 금속층에 인가된 교번 전기장을 이용하여 다층 금속 산화물 막에 형성된 나노포어를 통한 ssDNA의 제어된 염기별 라체팅(base-by-base ratcheting)을 입증했다. 그러나, 이 결과의 실험적 입증은 아직 확인되지 않았다. 주사형 터널링 현미경(scanning tunneling microscopy)을 이용한 최근의 실험적 진보도 또한 흥미롭고 전자 터널링을 이용한 뉴클레오티드의 식별(뉴클레오티드 특이적 터널 전류는 A, C, G, T의 HOMO-LUMO 갭에서의 차이와 연관됨) 및 DNA 올리고머의 부분적 서열결정의 가능성을 시사한다. 뉴클레오티드 특이적 전자 터널 전류를 측정하기 위한 나노제조 금속 갭 접합(nanofabricated metallic gap junctions)의 이용은 이러한 속성의 터널 검출기가 나노포어에 임베딩될 수 있고, DNA가 충분히 둔화될 수 있는 경우, 고체-상태 나노포어 서열결정의 목표가 달성될 수 있다는 점에서 특히 흥미롭다. 모범적인 서열결정용 나노포어 아키텍쳐가 도 20에 도시되며, 전기적으로 연결된 전원 및 검출기를 통해 횡 전류를 측정하기 위해 임베딩된 그래핀 층으로의 전기 접점(604)을 갖는다(도 20a). 도 20b는 나노리본 그래핀 층(132) 및 임베딩된 그래핀 층인 임베딩된 게이트 전극 (602)을 예시한다.

나노갭-나노포어 터널 검출기를 제조하기 위한 노력은 현재 진행 중이나, 나노포어 내에서 염기(ssDNA 중 개별적인 뉴클레오티드 또는 연속된 뉴클레오티드인지 관계없이)의 열적 변동 및 전기적 잡음을 고려할 때, 서열결정까지의 경로가 간단하지 않다. 따라서, 각 뉴클레오티드/분자의 다수의 반복 샘플링 사건을 포함하는 통계적 방식이 서열 정보를 얻기 위해 필요할 것이다. 추가로, 터널 전류는 (유효 터널 거리 및 분자 배향에 기초하여) 장벽 폭 및 높이에 지수적으로 의존하므로, 두 지점 측정(two point measurement)은 내재적으로 제한된 정보만을 제공할 수 있다. 아마도, 4 지점 프로브(4 point probe)에 유사한 측정 셋업이 필요하나, 서브-nm 정확도를 갖는 그러한 구조를 신뢰성있게 제조하는 것은 여전히 어려운 일이다. 또한, 일부 적용의 경우, 모든 4개의 염기가 독특하게 식별되지 않아도 된다는 것에 유의해야 한다. 연구자들은 마커 발견 및 게놈 변화(genomic aletration)의 확인을 위해 짧은 DNA 및 RNA 단편을 게놈에 성공적으로 맵핑하기 위해 뉴클레오티드 서열의 이진 변환(binary conversion)(A/T=0, and G/C=1)을 이용하고 있다. 따라서, 나노포어를 이용한 dsDNA의 뉴클레오티드 상의 이진 식별에 의한 직접적인 서열결정도 유의성 있는 예후 및 진단적 가치를 가질 수 있다.

요약하면, 과거 수년간 DNA 분자의 표지-불포함 '즉각적인(on the fly)' 서열결정을 위한 생물학적 나노포어 및 고체-상태 나노포어 모두에서 유의한 진보가 이루어졌다. 나노포어가 적절하고 개인 맞춤화된(personalized) DNA 서열결정을 위한 노력에서 3세대 서열결정 기술의 중요한 조력인자(enabler)로 남을 것이 분명하다.

특정한 장치 및 방법의 모범적인 구체예가 도 21a, 21b, 및 22에 제공된다. 도 21b를 참조하면, 막(100)은 상호 간에 유전체 층(150)에 의해 분리된 복수 개의 그래핀 층(140)에 의해 형성된 스택(130)을 포함한다. 제1 표면(110)은 제1 유체 구획 (200)의 일 표면을 형성하고 제2 표면(120)은 제2 유체 구획(300)의 일 표면을 형성한다. 나노포어 (160)는 막(100)을 통해 제1 유체 구획(200)과 제2 유체 구획(300)을 유체 연결한다. 전원(400) 및 검출기(500)가 시스템에 동력을 공급하고(energize) 게이트 전극(600) 을 통해 전원 및 검출기에 연결된 임베딩된 게이트 전극(602)을 갖는 것을 포함하여 나노포어에서 전기적 파라미터를 측정하기 위해 이용된다. 소스 전극(700) 및 드레인 전극(800)은 서로에 대해 제1 유체 구획과 제2 유체 구획을 바이어싱할 수 있다. 전기 전도성 와이어(410)가 다양한 전기적 성분을 연결할 수 있다.

도 22를 참조하면, 터널 검출기 (510)는 파선 화살표에 의해 표시된 바와 같이, 나노포어 축 방향(162)을 가로지르거나 또는 직교하는 방향 (520)으로 배향되고, 나노포어에서 상호 간에 대면하는 한 쌍의 전극 (512와 514)에 의해 형성된다. 일 양태에서, 상기 쌍의 전극(512와 514)은 그래핀 층(140)으로부터 형성된다. Ti/Au 패드와 같은, 게이트 전극 (600)이 다른 층으로부터 전기적으로 절연된 임베딩된 그래핀 층에 해당하는 터널 검출기에 전기 접점을 제공하기 위해 터널 검출기에 연결된다. 이 방식으로, 상호작용하는 생체 분자 또는 제1 유체 구획(200)으로부터 제2 유체 구획(300)으로 이동하는 나노포어가 생체분자 파라미터를 반영하는 전기적 파라미터의 모니터링을 통해 규명된다. 단일가닥 DNA가 염기별 이동(base-by-base translocation)에서 끝 사이를 통과하도록 대면하는 전극의 쌍이 배치되어, 터널 검출기가 생체분자 내의 개별적인 염기에 대한 전기적 파라미터를 측정하여, 생체분자에 대한 서열정보를 제공할 수 있기 때문에, 명확성을 위해 도 22는 일정한 비례로 도시되지 않는다.

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본 출원서의 모든 참조문헌, 예를 들면, 발행되거나 또는 허여된 특허 또는 균등물을 포함한 특허 문헌; 특허 출원 공개; 및 비-특허 문헌 또는 기타 출처 자료(other source materials)가 개별적으로 참조에 의해 본 명세서에 포함된 것과 같이, 각 참조문헌이 본 출원의 개시와 적어도 부분적으로 불일치하지 않는 정도까지, 이에 의해 참조에 의해 본 명세서에 포함된다(예를 들면, 부분적으로 불일치하는 참조문헌은 그 참조문헌의 부분적으로 불일치하는 부분을 제외하고 참조에 의해 포함된다).

본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 공개문헌은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자의 기술 수준을 나타낸다. 본 명세서에서 인용된 참조문헌은 종래 기술을 나타내기 위해, 일부 경우에, 출원일 현재 종래 기술을 나타내기 위해 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함되고, 이 정보는 필요한 경우, 선행 기술에 있는 특정한 구체예를 배제(예를 들면, 포기)하기 위해 본 명세서에서 이용될 수 있는 것으로 의도된다. 예를 들면, 화합물이 청구되는 경우, 본 명세서에 개시된 참조 문헌에(특히, 참조된 특허 문헌에) 개시된 일부 화합물을 포함한, 선행 기술에서 공지된 화합물은 청구항에 포함되도록 의도되지 않는 것으로 이해되어야 한다.

구체적으로, 개시가 본 명세서에 제공된 것과 불일치하지 않는 정도까지 참조에 의해 포함된 문헌의 예는: Venkatesan et al. "Stacked Graphene-Al2O3 Nanopore Sensors for Sensitive Detection of DNA and DNA-Protein Complexes." ACS NANO 6(1): 441-450 (2012); PCT 공개 WO 2010/08061; 미국출원 공개 제2012/0040343호 및 제2011/0226623호를 포함한다.

본 명세서에서 마쿠쉬 그룹 또는 기타 그룹핑이 이용되는 경우, 그 그룹의 모든 개별적인 구성물 및 그 그룹의 모든 가능한 조합 및 서브조합(subcombination)은 개시에 개별적으로 포함되도록 의도된다. 달리 명시되지 않으면, 기재되거나 또는 예시된 성분의 모든 제제 또는 조합이 본 발명을 실시하기 위해 이용될 수 있다. 범위, 예를 들면, 수치 범위, 전압 범위, 또는 속도 범위가 본 명세서에 주어지는 경우, 모든 중간 범위 및 하부 범위(subrange), 및 주어진 범위에 포함된 모든 개별적인 값이 개시에 포함되도록 의도된다.

본 명세서에서 사용된, "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)", "함유하는(containing)", 또는 "특징으로 하는(characterized by)"와 동의어이고, 포괄적(inclusive)이거나 또는 확장가능(open-ended)하고, 추가적인, 기재되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 사용된, "구성된(consisting of)"은 청구항 요소로 특정되지 않은 요소, 단계, 또는 성분을 배제한다. 본 명세서에서 사용된, "반드시 구성된(consisting essentially of)"은 청구항의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다. 특히 조성물의 성분의 기재 또는 장치의 요소의 기재에서 용어 "포함하는(comprising)"의 기재는 기재된 성분 또는 요소로 반드시 구성되고, 이들로 구성된 조성물 및 방법을 포괄하는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 적절하게 설명적으로 기재된 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 개시되지 않은 요소 또는 요소들, 한정 또는 한정들의 부재 하에 실시될 수 있다.

표 1. 나노포어 서열결정(nanopore sequencing) 기법 및 잠재적 과제:

센싱 방식(sensing modality)	기법 설명	잠재적 과제
이온 전류	혼성화 보조 나노포어 서열결정	높은 공간적 해상도가 요구됨. 분석을 위해 복잡한 알고리즘이 요구됨.
	엑소뉴클레아제 분해에 의한 서열결정	절단되는 순서로 모노뉴클레오티드의 순차적 통과가 요구됨.
	합성에 의한 서열결정	포어 중 가공 효소(DNA 폴리머라아제)의 유지, 긴 한톡길이 달성 및 전압 부하 하에서 효소 활성의 유지.
	DI(Duplex Interrupted) DNA 서열결정	표적 게놈 ssDNA 단편의 DI 구조로의 변환.
광학적 판독(optical readout)	변환된 DNA의 광학적 인식	복잡하고, 오류-발생이 쉬운 DNA 변환 단계, 고밀도 < 2 nm 나노포어 어레이가 요구됨.
횡 전자 터널링(transverse electron tunneling)	나노포어 상의 터널 검출기 (금속, 그래핀, 탄소 나노튜브)	갭에서 뉴클레오티드의 배향 및 위치의 정확한 제어. 잡음 대비 시료를 위해 충분히 요구되는 느린 이동 속도. 용액의 뉴클레오티드 의존적 터널 전류의 측정이 요구됨.
용량성 센싱(capacitative sensing)	금속-산화물-반도체나노포어 커패시터	무시할 수 있는 정도의 수류(drift) 및 누설(leakage)에서 고 이온 강도 용액 중에서 수행되어야 함. DNA 이동 속도가 상당히 감소되어야 함.

100: 막 200: 제1 유체 구획
110: 제1 표면(first surface) 300: 제2 유체 구획
120: 제2 표면(second surface) 400: 전원
130: 스택(stack) 500: 검출기
132: 나노리본 그래핀 층 600: 게이트 전극
140: 그래핀 층(graphene layer) 700: 소스 전극
150: 유전체 층(dielectric layers) 800: 드레인 전극
160: 나노포어(nanopore)
162: 나포포어 축 방향(nanopore axial direction)
410: 전기 전도성 와이어(electrically conductive wire)
510: 터널 검출기(tunneling detector)
512 및 514: 전극
520: 나노포어 축 방향을 가로지르거나 또는 직교하는 방향
522: 종축
602: 임베딩된 전극
604: 전기 접점(electrical contract)

Claims (46)

1. 생체분자 파라미터를 규명하는 방법으로서, 상기 방법은:
   전도체-유전체 스택(conductor-dielectric stack)을 포함하는 막 중 나노포어를 제공하는 단계로서, 상기 막은 제1 유체 구획을 제2 유체 구획으로부터 분리하고, 상기 나노포어는 상기 제1 유체 구획과 제2 유체 구획을 유체 연결하고(fluidly connect), 상기 전도체는 그래핀 또는 이황화몰리브덴(MoS₂)의 원자두께(atomically thin) 전기 전도층, 도핑된 실리콘, 실리센, 또는 극박(ultra-thin) 금속을 포함하는 것인 단계;
   상기 생체분자를 상기 제1 유체 구획에 제공하는 단계;
   상기 막에 전기장을 인가하는 단계;
   상기 인가된 전기장 하에서 상기 생체분자를 상기 나노포어를 통해 상기 제2 유체 구획으로 추진(drive)시키는 단계; 및
   상기 생체분자가 상기 나노포어를 통과할 때 상기 막에서, 또는 상기 막에 의해 형성된 면을 따라 전기적 파라미터를 모니터링하여, 그에 의해 상기 생체분자 파라미터를 규명하는 단계를 포함하는 것인 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 생체분자 파라미터는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법:
   폴리뉴클레오티드 서열;
   변형된 뉴클레오티드의 존재;
   폴리뉴클레오티드 메틸화 상태;
   폴리뉴클레오티드 히드록시메틸화 상태;
   폴리뉴클레오티드 서열 상의 하나 이상의 메틸화 또는 히드록시메틸화 부위에 결합된 메틸-의존성 또는 히드록시메틸-의존성 결합 단백질;
   단백질-폴리뉴클레오티드 결합 사건(binding event)의 존재;
   폴리펩티드 서열;
   생체분자 이차 구조; 및
   아미노산 서열.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 유기 또는 합성 핵산을 포함하는 것인 방법.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 전도체-유전체 스택은:
   복수의 그래핀 층을 포함하고, 인접한 그래핀 층은 유전체 층에 의해 분리되는 것인 방법.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 그래핀 층 중 하나 이상은 그래핀 마이크로리본, 그래핀 나노리본, 또는 그래핀 나노갭(nanogap)을 포함하고, 상기 나노포어는 상기 그래핀 마이크로리본, 그래핀 나노리본, 또는 그래핀 나노갭의 길이 방향을 가로지르는 방향으로 횡단하고, 상기 방법은:
   상기 생체분자가 상기 나노포어를 통과하는 동안 상기 그래핀 마이크로리본 또는 그래핀 나노리본을 따라, 또는 상기 그래핀 나노갭을 통한 전위 또는 횡전류(transverse current)의 시간-경로(time-course)를 측정하여, 상기 생체분자의 서열, 조성, 유량(flux), 지속시간(duration), 또는 길이를 규명하는 단계을 더 포함하고,
   상기 측정은 이동하는 생체분자의 상이한 위치에서의 복수 개의 동시 측정인 것인 방법.
6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전도층의 하나 이상을 독립적으로 전기 바이어싱하여 상기 나노포어의 전기 게이팅(electrical gating)을 제공하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 바이어싱은 전극을 그래핀-유전체 스택에 임베딩된 개별적인 그래핀 층에 전기적으로 연결시키는 것에 의해 이루어지고, 상기 바이어싱은 상기 막에 인가된 전기장에 의해 생성된 나노포어의 전기장을 변형시키는 것인 방법.
8. 청구항 1 내지 5 또는 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전체 층은 산화 알루미늄, 산화 탄탈륨, 산화 티타늄, 이산화규소, 산화 하프늄, 산화 지르코늄, 질화 붕소, 질화 규소, 그의 나노적층물(nanolaminate), 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 전기적 파라미터는 하기로 구성된 군의 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법:
   상기 나노포어를 통한 전류 또는 전류 차단(current blockade);
   나노포어의 터널 전류(tunneling current across the nanopore);
   횡전극(transverse electrode)을 통한 전기화학적 전류;
   전도도;
   저항;
   임피던스;
   전위(electrical potential);
   상기 나노포어를 통한 상기 생체분자의 이동(translocation) 시간; 및
   생체분자 유량 또는 이동 주파수(translocation frequency).
10. 청구항 1에 있어서, 화학적 모이어티를 노출된 나노포어 그래핀 가장자리(edge)에 부착시키는 것에 의해 나노포어 중 그래핀의 노출된 가장자리를 관능화시키는 단계를 더 포함하고,
    상기 화학적 모이어티는 상기 생체분자의 부분에 대한 친화도를 갖고, 상기 생체분자의 부분과 상호작용하는 상기 화학적 모이어티는 상기 생체분자가 상기 나노포어를 통과할 때 모니터링되는 전기적 파라미터를 변화시키는 것인 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 화학적 모이어티는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법:
    상기 생체분자 내의 서열에 결합하는 서열을 갖는 단백질, 폴리펩티드, 및 폴리뉴클레오티드; 및
    폴리뉴클레오티드인 상기 생체분자 중 특정한 뉴클레오티드에 대한 결합 친화도를 갖는 화학적 구조체(chemical construct).
12. 청구항 11에 있어서, 상기 생체분자 중 특정한 뉴클레오티드는 상기 화학적 모이어티와 상기 특정한 뉴클레오티드 간의 친화도를 증가시키는, 중원자(heavy atom), 화학적 관능기, 또는 태그(tag)로 표지된 것인 방법.
13. 청구항 1에 있어서, 상기 생체분자를 상기 그래핀-유전체 스택에 고정된 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 것에 의해 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 생체분자를 복수의 보다 작은 서열로 분해하여, 분해(digestion)에 의한 서열결정을 제공하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 복수의 보다 작은 서열 중 적어도 일부는 개별적인 염기에 해당하는 것인 방법.
15. 청구항 1에 있어서, 상기 나노포어를 통과하는 생체분자에 뉴클레오티드를 첨가하는 것에 의해 폴리뉴클레오티드를 합성하여, 합성에 의한 서열결정을 제공하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
16. 청구항 15에 있어서, 상기 합성에 의한 서열결정은 상기 그래핀-유전체 스택에 고정된 폴리머라아제에 의해 수행되고, 첨가된 뉴클레오티드 및 시약은 상기 제1 또는 제2 유체 구획 중 뉴클레오티드의 공급원(source)로부터 유래되는 것인 방법.
17. 청구항 16에 있어서, 상기 합성에 의한 서열결정은 상기 포어를 통과하는 생체분자로의 뉴클레오티드 첨가 동안 방출되는 H⁺ 또는 파이로포스페이트(pyrophosphate)를 검출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
18. 청구항 17에 있어서, 상기 방출되는 H⁺ 또는 파이로포스페이트를 검출하는 단계는 나노포어 전류(nanopore current)의 변화를 측정하는 것에 의한 것인 방법.
19. 청구항 1에 있어서, 상기 나노포어는 나노포어인 내부 채널과의 단백질 복합체를 포함하는 생물학적 나노포어이고, 상기 단백질은 전사 인자, 폴리머라아제, 뉴클레아제, 및 히스톤을 포함한 DNA 결합 단백질; 알파 헤모라이신; 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 포린 A 및 GP10으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
20. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 최상부 그래핀 층(top-most graphene layer)은 상기 제1 및/또는 제2 유체 구획 중 유체와 유체 및 전기적 접촉되고, 상기 전기적 파라미터는 상기 생체분자가 상기 포어를 통과할 때 상기 제1 및/또는 제2 유체 구획 중 유체와 유체 및 전기적 접촉되는 그래핀 층에 의한 전기화학적 측정으로부터 유래되는 것인 방법.
21. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전기적 파라미터는 상기 유체 구획 및 상기 나노포어 중 유체로부터 전기적으로 절연된 그래핀 층에 의한 전계 효과 게이팅(field effect gating) 또는 전계 효과 센싱(sensing)에 의해 측정되는 것인 방법.
22. 청구항 1에 있어서, 상기 생체분자는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열이고, 상기 방법은 상기 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열을 언지핑(unzip)하고 상기 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 단일 가닥을 상기 나노포어를 통해 추진시켜, 상기 생체분자의 서열결정을 제공하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
23. 청구항 22에 있어서, 상기 언지핑은 상기 그래핀-절연체 스택(graphene-dielectric stack)에 고정된 헬리카아제에 의해 이루어지는 것인 방법.
24. 청구항 4에 있어서, 매복 그래핀 층(buried graphene layer)은 또 다른 그래핀 층을 통한 전기화학적 전류를 측정하는 것인 방법.
25. 생체분자 파라미터를 규명하는 장치로서, 상기 장치는:
    하기를 포함하는 막;
    제1 표면 및 상기 제1 표면에 대향하는(opposite) 제2 표면으로서, 상기 막은 상기 제1 표면을 포함하는 제1 유체 구획을 상기 제2 표면을 포함하는 제2 유체 구획으로부터 분리하는 것인 제1 표면 및 제2 표면;
    상기 제1 표면과 상기 제2 표면 사이에 위치한 그래핀/유전체/그래핀/유전체 스택; 및
    상기 제1 유체 구획과 상기 제2 구획을 유체에 의해(fluidically) 연결하는 상기 막을 통한 나노포어;
    상기 제1 유체 구획과 상기 제2 유체 구획 간 전위차를 제공하기 위해 상기 막과 전기적으로 접촉된 전원(power supply); 및
    상기 제1 유체 구획과 상기 제2 유체 구획 간에 인가된 전위차 하에서 생체 분자가 상기 나노포어를 통과할 때 상기 나노포어를 통한 전류를 검출하는 검출기.
26. 청구항 25에 있어서, 하나 이상의 게이트 전극을 더 포함하고, 상기 하나 이상의 게이트 전극 각각은 상기 스택 중 그래핀 층인 것인 장치.
27. 청구항 26에 있어서, 상기 그래핀 층은 상기 나노포어에서 3 nm 이하의 두께를 갖고, 상기 전기적 접촉은 상기 그래핀 층과 전기적 접촉된 금속 패드(metal pad)를 포함하고, 상기 금속 패드는 상기 제1 유체 구획과 제2 유체 구획으로부터 전기적으로 단리된 것인 장치.
28. 청구항 27에 있어서, 상기 게이트 전극은 상기 전원에 의해 동력이 공급된(powered) 소스 전극에 전기적으로 연결된 것인 장치.
29. 청구항 25 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그래핀 층 중 하나 이상은 상기 나노포어가 나노리본 종축에 대해 가로 방향으로 통과하는 것인 나노리본을 포함하는 것인 장치.
30. 청구항 29에 있어서, 상기 나노리본은 생체분자가 상기 나노포어를 통과하는 동안 상기 나노리본에서의 횡 전류(transverse curret)를 측정하기 위한 전기 접점(electrical contact)을 더 포함하고, 상기 그래핀 층 중 또 다른 그래핀 층은 상기 그래핀 층의 전기적 바이어스를 위해 게이트 전극에 연결되는 것인 장치.
31. 청구항 29에 있어서, 상기 나노포어는 상기 나노리본 폭의 5%보다 크거나, 또는 상기 나노리본 폭의 5% 내지 95% 범위로부터 선택되는 직경을 갖는 것인 장치.
32. 청구항 25에 있어서, 상기 검출기는 상호 간에 대면하고, 상기 나노포어 중 상기 생체분자 통과 방향에 횡단하는 방향으로 상기 나노포어 내에 중심에 배치된(centered) 한 쌍의 그래핀 전극을 포함하는 터널 검출기(tunneling detector)이고, 상기 생체분자는 상기 쌍의 전극 사이를 통과하는 것인 장치.
33. 생체 파라미터를 규명하기 위한 나노포어를 포함하는 막을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    독립된 유전체 막(free-standing dielectric membrane) 중 통로를 형성하는 단계;
    화학증착(chemical vapor deposition)을 통해 그래핀 층을 키우는 단계;
    상기 그래핀 층의 일부를 상기 독립된 유전체 막으로 이동시키는 단계;
    이동된 그래핀 층 위에 유전체 층을 형성시키는 단계;
    그래핀 층 형성 단계(graphene layer step)를 반복하여 제2 그래핀 층을 생성하는 단계;
    유전체 층 형성 단계를 반복하여 제2 유전체 층을 생성하는 단계;
    상기 막의 제1 표면으로부터 상기 막의제2 표면까지 신장되는 나노포어를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 나노포어는 상기 그래핀 층과 유전체 층 각각을 횡단하여, 그래핀/유전체/그래핀/유전체 스택에 나노포어를 포함하는 막을 제조하는 것인 방법.
34. 청구항 33에 있어서, 상기 제1 그래핀 층, 상기 제2 그래핀 층 또는 상기 제1 그래핀 층과 상기 제2 그래핀 층 모두를 전기 접점과 독립적으로 전기적으로 접촉시켜, 전기적으로 게이트된 나노포어(electrically gated nanopore)를 제공하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
35. 청구항 33에 있어서, 상기 반복 단계는 3개 이상의 그래핀 층을 생성하도록 반복되고, 인접한 그래핀 층은 유전체 층에 의해 분리되는 것인 방법.
36. 청구항 35에 있어서, 상기 그래핀 층 중 하나 이상을 전기 접점과 전기적으로 접촉시켜, 전기적으로 게이트된 나노포어를 제공하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
37. 청구항 33에 있어서, 상기 나노포어 내 및 그에 인접한 국소화된 전기장을 변형시키기 위해 상기 나노포어 막에 게이트 전극을 임베딩시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
38. 청구항 37에 있어서, 상기 임베딩된 게이트 전극은 상기 막의 그래핀 층을 포함하는 것인 방법.
39. 청구항 33에 있어서, 상기 유전체 층은 원자층 증착(atomic layer deposition)에 의해 증착된 유전체를 포함하는 것인 방법.
40. 청구항 33 또는 39에 있어서, 상기 유전체 층은 산화 알루미늄, 산화 탄탈륨, 산화 하프늄, 산화 지르코늄, 이산화규소, 또는 질화규소 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
41. 청구항 33에 있어서, 상기 나노포어에서 전기적 파라미터를 측정하기 위한 휘트스톤 브릿지 구성(Wheatstone Bridge configuration)으로 상기 그래핀 층을 전기적으로 연결시키는 단계를 더 포함하고, 상기 전기적 파라미터는 차동 임피던스(differential impedance), 터널 전류(tunneling current), 저항, 정전 용량(capacitance), 전류, 또는 전압 중 하나 이상인 것인 방법.
42. 청구항 33에 있어서, 하나 이상의 그래핀 층을 AC 전압 신호(voltage signal)로 전기적으로 바이어스시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
43. 청구항 42에 있어서, 중앙 그래핀 층과 외곽 그래핀 층 사이의 임피던스를 모니터링하거나, 또는 그래핀 층 사이의 임피던스 전류 또는 전압을 측정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
44. 생체분자의 메틸화 또는 히드록시메틸화 상태를 식별, 규명, 또는 정량하는 방법으로서, 상기 방법은:
    제1 유체 구획을 제2 유체 구획으로부터 분리하는 현수된 막(suspended membrane) 중 나노포어를 제공하는 단계로서, 상기 막은 산화 알루미늄, 산화 탄탈륨, 산화 티타늄, 이산화규소, 산화 하프늄, 산화 지르코늄, 질화붕소, 질화규소, 그래핀 또는 그의 나노적층물(nanolaminate), 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 단계;
    특이적 단백질, 올리고뉴클레오티드, 또는 화학적 태그(chemical tag)를 표적 생체분자 상의 메틸화 또는 히드록시메틸화 부위에 결합시키는 단계; 및
    상기 제1 유체 구획으로부터 상기 제2 유체 구획까지, 상기 막을 통해 전기장을 인가하여, 상기 생체분자를 상기 나노포어를 통해 추진시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
45. 청구항 44에 있어서, 상기 생체분자에 결합된 단백질 또는 화학적 태그를 이온 전류, 터널 전류, 전압, 정전 용량 또는 임피던스의 변화를 모니터링하는 것에 의해 검출하는 것인 방법.
46. 청구항 44에 있어서, 상기 생체분자가 상기 나노포어를 통과할 때 상기 생체분자로부터 결합된 단백질 또는 태그를 순차적으로 전단(shear)시키는 단계를 포함하는 것인 방법.

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