KR20180129080A - 나노기공 센서를 사용한 dna 농도 측정 장치 및 방법 - Google Patents

나노기공 센서를 사용한 dna 농도 측정 장치 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 나노기공 센서를 사용한 DNA 농도 측정 장치는, 농도를 측정하려고 하는 DNA 용액 투입구를 구비한 용기, 용기를 직렬로 연결된 별개의 공간으로 구분하는 복수개의 나노기공 막, 별개의 공간마다 설치된 복수개의 전극, 복수개의 전극에 각각 전압을 인가하여 DNA가 나노기공 막을 통과하여 이동할 수 있도록 하는 전원부, 복수개의 나노기공 막을 통하는 각각의 이온 전류를 측정하는 검출부 및 검출부에서 측정된 결과로부터 DNA 농도를 구하는 연산부를 포함한다. 복수개의 나노기공 막은 각각 하나씩의 나노기공을 구비하여, 용기의 DNA 용액 투입구 쪽의 DNA가 복수개의 나노기공 막의 나노기공들을 통해서 투입구의 반대편까지 도달할 수 있는 것을 특징으로 한다. 이러한 본 발명에 따르면, 종래 DNA 농도 측정 장치의 단점들을 개선하여, 정확성이 높으며, 분석 속도가 빠르고, 별도의 준비작업이 필요 없어 분석과정이 간편한 DNA 농도 측정을 할 수 있다.

Description

나노기공 센서를 사용한 DNA 농도 측정 장치 및 방법{APPARATUS AND METHOD FOR DNA CONCENTRATION MEASUREMENT USING A NANOPORE SENSOR}
본 발명은 나노기공 센서를 사용한 DNA 농도 측정 장치 및 방법에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 직렬 다중채널 나노기공 센서를 이용하여 DNA의 농도를 간편하고 정밀하게 측정할 수 있는 장치에 대한 것이다.
1953년 왓슨과 크릭에 의해 유전물질인 DNA의 이중 나선 구조가 규명된 이래, 분자 생물학의 많은 분야가 발전하게 되었다. 특히, DNA의 복사, RNA로의 전사, 및 단백질로의 번역에 이르는 과정이 밝혀짐에 따라, DNA를 조작하는 유전공학도 크게 발전해 왔다. 분자생물학의 응용분야로는 백신 개발, 암 진단, 약물 전달, 바이오 신약 개발, 범죄 수사 등이 있으며, 이와 관련된 바이오 관련 시장이 전세계적으로 급격히 성장할 예정이다.
분자생물학에서 이미 알려진 유전자 및 새로운 유전자의 특성을 연구하기 위해 사용하는 대표적인 기법으로는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)과 유전자 복제(cloning)가 있다.
중합효소 연쇄 반응(PCR)은 DNA를 고온에서 변성(denaturation)시켜 단일가닥으로 분리시키고, 프라이머를 결합(annealing)시킨후, 신장(elongation) 과정을 거친다. Taq 중합효소 등 열에 강한 DNA 중합효소를 발견하여 빠른 DNA 증폭이 가능해 졌고, 프라이머에 의해 원하는 부분만 증폭이 가능하다. PCR을 이용하면, 매우 복잡하고 양이 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만 선택적으로 증폭시킬 수 있다.
유전자 복제(cloning)는 DNA를 자르고, 붙이고, 변형시켜서 실험에 필요한 재조합 DNA(recombinant DNA)를 제조하여 유전자의 특성 연구 등 다른 실험에 사용한다. 유전자 복제는 PCR로 증폭시켜 얻은 관심있는 유전자를 제한효소와 리가아제 등을 이용하여 플라스미드 등의 벡터(vector)내에 삽입하는 과정과 벡터를 박테리아 세포 내로 주입하여 증식시키는 과정을 거친다.
이러한 유전자 복제 과정 전반적으로 DNA의 양(Yield)과 순도(Purity)는 이후 수행될 여러가지 실험의 성패를 좌우하는 중요한 요소이다. 예를 들어, DNA 복제시 PCR 반응의 산물인 DNA 농도가 너무 낮으면, 이후 제한효소처리 및 DNA 추출과정에서 DNA 농도가 줄어들어, vector 삽입시 부담이 커진다.
따라서, 실험 진행 중에 수시로 DNA 농도를 측정할 필요가 있으므로, 분석과정이 간편하면서도 정밀한 DNA 농도 측정 장비가 요구된다.
DNA의 농도를 측정하는 방법으로는 대표적으로 UV분광법, 형광법, 겔전기영동법의 3가지가 있다.
UV분광법은 시료에 자외선 영역의 빛을 조사한 후, 시료를 투과 또는 반사한 빛의 양을 측정하여, 시료에서 흡수된 빛의 양을 측정하는 방법이다. DNA는 260 nm의 자외선을 강하게 흡수하므로, 260 nm에서의 흡광도를 측정하여 비율에 의하여 DNA 농도를 산출한다. 특히 단백질의 경우 280 nm의 자외선을 강하게 흡수하므로, 260 nm와 280 nm의 비율에 의해 DNA의 순도를 파악할 수 있는 장점이 있어서 많이 사용된다.
UV분광법은 시료에 별도의 준비작업이 필요없어 분석과정이 간단하고 분석속도도 빠른 장점이 있으나, 흡광도 비율에 의해 농도를 측정하므로 정확성이 낮은 단점이 있다.
형광법은 형광물질에 특정 파장의 빛을 조사한 후 형광물질에서 방출되는 형광을 측정하는 방법이다. 형광물질의 경우 특정 파장의 빛을 흡수하게 되면 들뜬상태가 되고, 다시 낮은 상태로 돌아가면서 입사파장보다 긴 파장의 형광을 방출한다. 이러한 형광법은 입사파장과 형광파장이 다르고 들뜬 상태의 수명이 짧아서 신호간 간섭이 없으므로 측정 감도가 좋고, 농도가 묽은 경우에도 측정이 가능하고, 형광물질간의 파장대가 달라 형광물질의 구분이 가능한 장점이 있어 화학물질 분석이 많이 사용된다.
다만, DNA의 경우에는 형광물질이 아니므로, 직접적으로 형광법을 사용할 수 없고, 형광물질을 DNA에 표지자로 붙여, DNA에 부착된 형광물질의 형광을 측정하는 방법을 사용하여야 한다. 따라서, 형광물질을 표지자로 붙이는 복잡한 과정을 거쳐야 하므로, 분석과정이 복잡하고, 분석속도도 느린 단점이 있다.
겔전기영동법(Gel Electrophoresis Method)은 전하를 가진 시료를 다공성 겔에 넣고, 전류를 흘려보내서 가볍고 작은 시료와 무겁고 큰 시료를 분리하는 방법이다. 수소이온 농도가 중성일 때 DNA는 인산기 때문에 음전하를 띤다. 따라서, 전기영동 장치를 이용하면 작은 DNA절편은 양극쪽으로 더 빠르게 이동하게 된다. 동일한 전류를 흘리면, 분자량이 큰 DNA절편은 이동거리가 짧고, 분자량이 작은 DNA절편은 이동거리가 길다. 즉, DNA의 이동거리를 바탕으로 분자량을 측정할 수 있다.
겔전기영동법은 DNA시료에 대한 사전 준비작업이 필요 없으므로 분석과정이 간편한 장점이 있는 반면, 이동거리가 DNA 형태 등에도 의존하므로 분석 속도나 정확성이 떨어진다.
이상에서 살펴본 것과 같이 현재 DNA 농도 측정하는 대표적인 3가지 방법 모두 단점을 가지고 있다. 따라서, 정확성이 높으며, 분석 속도가 빠르고, 별도의 준비작업이 필요 없어 분석과정이 간편하고, 저가인 새로운 DNA 농도 측정기의 개발이 필요하다.
한편, 근래 나노기공을 이용한 DNA 염기서열 측정에 대한 연구가 활발하다. 미국 국립보건원(NIH) 주관으로 DNA 분석 비용을 $1,000 이하로 낮추기 위한 차세대 유전자 검사 연구가 진행중이며, 그 중 나노기공(nanopore) 센서를 활용한 염기 서열 분석이 차세대 유전자 검사 방법으로 주목받고 있다.
도 1은 나노기공의 종류별 단면도이다. 도 1(a)와 도 1(b)는 바이오 나노기공인데, 도 1(a)는 황색포도상구균 박테리아에서 얻는 α-헤몰리신이고, 도 1(b)는 마이코박테리움에서 얻는 마이코박테리움 스메그마티스 포린 A(MspA)이다. 도 1(c)는 고체 나노기공으로 산화규소(SiO2), 질화규소(SiN), 산화알루미늄(Al2O3) 등으로 구성된다. 도 1(d)는 그래핀 나노기공의 단면도 및 평면도 이다.
바이오 나노기공 센서는 정확도나 민감도에서 우수하나, 대량생산과 단분자 단위 측정이 어려운 단점이 있다. 고체 나노기공은 반도체 공정에서 축적된 노하우를 기반으로 대량생산이 가능하고 내구성이 탁월한 반면, 복잡한 공정을 거치므로 아직 단가가 비싼 단점이 있다.
그리고, 나노기공 센서 연구는 DNA 분자를 나노기공 안에서 제어하기 힘들어 수집된 염기 서열 데이터의 신뢰도가 낮은 상태이다. 최근 옥스포드 나노포어(Oxford Nanopore Technologies)에서 민아이언(MinION)을 미화 1,000달러의 가격으로 판매하고 있으나, 아직 오류가 많으며(5~30%), 길고 반복되는 염기서열을 읽는 데 어려움이 많아서 활성화 되지 않는 실정이다.
본 발명의 목적은 종래 DNA 농도 측정 장치의 단점들을 개선하여, 분석 속도가 빠르고, 별도의 준비 작업이 필요 없어 분석과정이 간편한 DNA 농도 측정기를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 DNA 농도 측정 장치로 DNA의 분자 길이 및 분자량도 함께 측정할 수 있는 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 신뢰성이 높은 DNA 농도 측정기를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 전력 소모가 적고 간섭이나 잡음이 적은 DNA 농도 측정기를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급된 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 이루기 위한 본 발명의 일 양태에 따르면, 나노기공 센서를 사용한 DNA 농도 측정 장치는, 농도를 측정하려고 하는 DNA 용액 투입구를 구비한 용기; 상기 용기를 직렬로 연결된 별개의 공간으로 구분하는 복수개의 나노기공 막; 상기 별개의 공간마다 설치된 복수개의 전극; 상기 복수개의 전극에 각각 전압을 인가하여 DNA가 상기 나노기공 막을 통과하여 이동할 수 있도록 하는 전원부; 상기 복수개의 나노기공 막을 통하는 각각의 이온 전류를 측정하는 검출부; 및 상기 검출부에서 측정된 결과로부터 DNA 농도를 구하는 연산부를 포함하며, 상기 복수개의 나노기공 막은 각각 하나씩의 나노기공을 구비하여, 용기의 DNA 용액 투입구 쪽의 DNA가 상기 복수개의 나노기공 막의 나노기공들을 통해서 투입구의 반대편까지 도달할 수 있는 것을 특징으로 한다.
상기 기술적 과제를 이루기 위한 본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 전원부는, 상기 복수개의 나노기공 막 중에서 DNA 용액 투입구 쪽에 있는 나노기공 막부터 순차적으로, 각 나노기공 막을 사이에 둔 전극 사이에 전압을 인가하고, 정해진 시간 후 그다음 나노기공 막을 사이에 둔 전극 사이에 전압을 인가하여, DNA를 용액 투입구 쪽에서 투입구의 반대편까지 이동시킬 수 있다.
상기 기술적 과제를 이루기 위한 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 검출부는, 트랜스 임피던스 증폭기(TIA)와 멀티플렉서를 구비할 수 있다.
상기 기술적 과제를 이루기 위한 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 나노기공은 α-헤몰리신 채널, 마이코박테리움 스메그마티스 포린 A(MspA) 채널, 실리콘(Si) 나노기공, 질화 실리콘(SiN) 박막 나노기공, 그래핀 나노기공 및 이들을 결합한 복합 나노기공으로 구성된 군으로부터 선택되어질 수 있다.
상기 기술적 과제를 이루기 위한 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 나노기공은 상단에 DNA 분리효소가 결합할 수 있는 구조를 가질 수 있다.
상기 기술적 과제를 이루기 위한 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 나노기공 센서를 사용한 DNA 농도 측정 방법은 (a) DNA 분자 길이가 알려진 기준용액을 사용하여 단일 막의 나노기공을 통과하는 기준 통과 시간을 결정하는 단계; (b) 각각 하나씩의 나노기공을 구비한 복수개의 나노기공 막에 의해 직렬로 연결된 별개의 공간으로 구분된 용기의 한쪽 끝에 있는 DNA 용액 투입구에 농도를 측정하려고 하는 DNA 용액이 투입되는 단계; (c) 검출부가 DNA 용액 투입구 쪽에 있는 나노기공 막부터 순차적으로 측정대상 나노기공 막으로 선택하여, 상기 기준 통과 시간 이상의 정해진 측정시간 동안 나노기공을 통과하는 이온 전류를 측정하는 단계; (d) 전원부가 상기 측정대상 나노기공 막을 사이에 둔 전극 사이에 상기 측정시간 내에 기준 통과 시간 이상의 정해진 전압인가시간 동안 전압을 인가하는 단계; (e) 상기 측정시간 경과 후, 측정대상 나노기공 막으로 투입구 반대편에 있는 나노기공 막이 선택될 때까지, 상기 (c) 및 (d) 단계를 반복하는 단계; 및 (f) 연산부가 상기 검출부에서 측정한 결과를 이용하여, 상기 농도를 측정하려고 하는 DNA 용액의 DNA 농도를 구하는 단계를 포함한다.
상기 기술적 과제를 이루기 위한 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 (a) 단계는, (a-1) 상기 DNA 용액 투입구에 알려진 길이의 DNA 분자가 들어있는 기준용액이 투입되는 단계; (a-2) 상기 검출부가 DNA 용액 투입구 쪽에 있는 나노기공 막의 나노기공을 통과하는 이온전류를 측정하는 단계; (a-3) 상기 DNA 용액 투입구 쪽의 나노기공 막을 사이에 둔 전극 사이에 전압을 인가하는 단계; (a-4) 상기 연산부가 상기 검출부에서 측정한 결과에서 상기 알려진 길이의 DNA 분자의 통과시간을 구하는 단계; 및 (a-5) 상기 연산부가 상기 통과시간을 상기 알려진 길이로 나누어 기준 통과 시간을 계산하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 기술적 과제를 이루기 위한 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 (f)단계는, (f-1) 상기 연산부가 상기 DNA 용액의 측정 결과에서 상기 농도를 측정하려고 하는 DNA의 전체 통과시간을 구하는 단계; (f-2) 상기 연산부가 상기 농도를 측정하려고 하는 DNA의 전체 통과시간을 상기 기준 통과 시간으로 나누어 상기 농도를 측정하려고 하는 DNA의 전체 길이를 구하는 단계; 및 (f-3) 상기 연산부가 상기 DNA의 전체 길이에 염기의 분자량을 곱하여 상기 농도를 측정하려고 하는 DNA의 분자량 및 농도를 계산하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 농도 측정 장치는 나노기공 센서를 사용하여 별도의 준비 작업이 필요 없고, 분석속도가 빠르다.
또한, 본 발명에 따른 DNA 농도 측정 장치는 나노기공 센서를 이용하므로 DNA의 농도 뿐만 아니라, DNA 분자 길이와 분자량도 측정할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 DNA 농도 측정 장치는 직렬 다중채널 나노기공 센서를 이용하므로 측정의 신뢰성이 높다.
또한, 본 발명에 따른 DNA 농도 측정 장치는 직렬 다중채널 나노기공 센서에 멀티플렉서를 이용하여 전력 소모가 적고 간섭이나 잡음이 적다.
도 1은 나노기공 센서의 종류별 단면도이다.
도 2는 나노기공 센서의 구성도 및 측정 데이터를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노기공센서를 이용한 DNA 농도 측정 장치의 구성도 및 측정 데이터를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 직렬 다중채널 나노기공 센서를 이용한 DNA 농도 측정 장치의 개략적인 구성도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 직렬 다중채널 나노기공 센서를 이용한 DNA 농도 측정 장치의 인가 전압과 측정 데이터를 나타낸 타이밍도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 직렬 다중채널 나노기공 센서를 이용한 DNA 농도 측정 장치의 검출부를 자세히 나타낸 구성도이다.
이하, 첨부한 도면들 및 후술되어 있는 내용을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 예들을 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되어지는 실시 예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되어지는 것이다. 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다. 한편, 본 명세서에서 사용된 용어는 실시 예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급되지 않는 한 복수형도 포함된다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자가 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
이하, 도 1 내지 도 6을 참조하여, 본 발명의 각 실시예에 따른 나노기공 센서를 사용한 DNA 농도 측정 장치 및 방법에 대하여 설명한다.
도 2는 나노기공 센서의 구성도 및 측정 데이터를 나타낸 도면이다. 도 2(a)는 그래핀 나노기공 센서의 단면도 이다. 그래핀 나노기공 센서의 구성을 살펴보면 다음과 같다.
용기(100)는 나노기공 막(200)에 의해서 시스 챔버(110)와 트랜스 챔버(120)으로 구분된다. 그래핀 나노기공 센서(200)는 Si 반도체 기판(240)과 SiN 박막(230)그리고 그래핀 막(220)으로 구성되어 있다. 그래핀 막(220)의 가운데에는 나노기공(210)이 뚤려있다. 시스 챔버와 트랜스 챔버 사이에 전압을 인가하기 위한 전원부(330)와 전극(310, 320)이 있고, 나노기공(210)을 통해 흐르는 이온전류를 측정하는 검출부(340)가 있다.
그래핀 나노기공 막(200)의 제조 방법은 일반적으로 다음과 같다. Si 반도체 기판(240)의 위쪽에 SiN 박막(230)을 성장 시킨 후에, Si 기판의 아래쪽에 PR을 도포하여 식각하고, 이온 빔 등을 이용하여 직경 약 200 nm 크기의 홀을 만들어 질화 프레임을 형성한다. 그래핀(220)은 니켈 촉매 등의 표면에서 성장시키고, 니켈 층을 식각하여 제거시킨후, 수중에서 질화 프레임에 부착시킨다. 그래핀 막에 집속 전자 빔(focused ion beam, FIB) 등을 이용하여 나노기공(210)을 형성한다. 나노기공의 크기는 1 nm 내지 20 nm 사이로 형성한다.
도 2(a)를 참고하여 나노기공 센서의 동작원리를 설명한다. 우선 용기(100)에 KCl 수용액을 넣는다. 시스 챔버(110)에 염기 분석하려는 DNA(130)가 포함된 용액을 넣는다. 전원부(330)에서 시스 챔버의 전극(310)과 트랜스 챔버의 전극(320)에 전압을 인가하면, 트랜스 챔버(120)의 K+ 이온은 나노기공(210)을 통해 시스 챔버(110)로 이동하고, 시스 챔버의 Cl- 이온은 나노기공을 통해 트랜스 챔버로 이동한다. 이러한 이온의 이동에 따른 전류는 검출부(340)에 의해 측정된다.
DNA(130)는 수용액 중에서 인산기가 음전하를 띠게 되므로, 시스 챔버에서 트랜스 챔버를 향해 나노기공을 통과하여 이동하게 된다. DNA가 나노기공을 통과하는 경우에는 도 2(b)와 같이 DNA의 염기에 따라 이온전류가 달라지게 되는데, 이러한 이온전류의 변화를 정확히 측정할 경우 염기의 서열도 판독할 수 있다. 다만, DNA가 나노기공을 통과하는 속도가 뉴클레오티드 당 1 μs 정도로 매우 빠르기 때문에, 이를 정확하게 파악하는 것이 어렵고, 오차가 발생할 가능성이 매우 크다.
본 발명에서는 이러한 나노기공 센서를 DNA 농도 측정 장치에 적용하였다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노기공센서를 이용한 DNA 농도 측정 장치의 구성도 및 측정 데이터를 나타낸 도면이다. 도 3을 참조하여 나노기공 센서를 DNA 농도 측정에 사용하는 방법을 설명한다.
도 2의 설명에서처럼 DNA가 나노기공(210)을 통과하면 측정되는 이온전류가 감소한다. 기공 폭이 클수록 감소되는 이온전류는 적어진다. 이중가닥 DNA의 폭이 3 nm이므로, 감도를 높이려면 나노기공의 폭이 3 nm보다 크고 5 nm보다 작은 것이 바람직하다.
기공폭이 동일한 경우, DNA의 길이에 따라 이온전류가 감소되는 시간이 달라진다. 도 3(a)처럼 긴 DNA(131)가 나노기공을 통과하는 경우, 도 3(b)처럼 이온전류가 감소되는 구간이 길어진다. 도 3(c)처럼 짧은 DNA(132)가 나노기공을 통과하는 경우, 도 3(d)처럼 이온전류가 감소되는 구간은 짧아진다.
도 2를 참조하여 DNA 농도 측정 방법을 설명한다.
먼저 용기의 나노기공 크기에 따른 기준 통과시간을 계산하여야 한다. 이를 위해 알려진 길이의 DNA 분자(130)가 나노기공(210)을 통과하는 시간을 측정하여야 한다.
시스 챔버(110)에 DNA 길이(DNA염기 개수)가 알려진 DNA 분자(130)가 들어있는 기준용액을 장착한다. 이후, 알려진 길이의 DNA 분자가 용기의 시스 챔버(110)에서 트랜스 챔버(120)로 이동하도록, 전원부(330)가 용기의 시스 쪽과 트랜스 쪽 사이에 전압을 공급한다.
검출부(340)가 나노기공 센서에 구비된 나노기공에서 발생하는 기준용액의 이온전류를 측정한다. 연산부가 기준용액의 측정 결과에서 알려진 길이의 DNA 분자의 통과시간을 구한다. 연산부가 알려진 길이의 DNA 분자의 통과시간을 알려진 길이로 나누어 DNA염기당 통과시간인 ‘기준 통과 시간’( = 통과시간 / DNA길이 )을 구한다.
다음으로는, 실제 측정하려는 DNA 분자에 대한 측정을 실시한다.
나노기공 막(200)에 의해 시스 챔버(110)와 트랜스 챔버(120)로 구분된 용기(100)의 시스 챔버에 농도를 측정하려고 하는 DNA(130)가 들어있는 시험용액을 장착한다. 이후, 농도를 측정하려고 하는 DNA가 용기의 시스 챔버에서 트랜스 챔버로 이동하도록, 전원부(330)가 용기의 시스 챔버와 트랜스 챔버 사이에 전압을 공급한다. 검출부(340)가 나노기공 센서에 구비된 나노기공에서 발생하는 시험용액의 이온전류를 측정한다. 도 6에 도시된 연산부(500)가 시험용액의 측정 결과를 이용하여 농도를 측정하려고 하는 DNA의 농도를 구한다.
DNA 농도를 구하기 위해서, DNA 분자들을 나노기공에 통과시켜 얻은 측정 결과에서 DNA분자들이 나노기공을 통과하는 데 걸린 DNA의 전체 통과시간을 구한다. 전체 DNA의 통과시간을 기준용액에서 구한 기준 통과 시간으로 나누어 농도를 측정하려고 하는 ‘DNA의 전체 길이’( = DNA 염기의 총 수 = DNA의 전체 통과시간 / 기준 통과 시간 )를 구한다. DNA의 전체 길이에 염기의 분자량( = 650 dalton × 1.66×10-15ng )을 곱하여 농도를 측정하려고 하는 DNA의 분자량을 구한다. 용액의 부피를 고려하면, DNA의 농도를 계산할 수 있다.
이러한 본 발명에 따른 DNA 농도 측정 장치는 나노기공 센서를 이용하여 측정하므로 DNA 농도 뿐만 아니라, DNA 분자 길이와 분자량까지 계산할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 DNA 농도 측정 장치는 나노기공 센서를 사용하므로 기존의 DNA 농도 측정 방법들에 비하여 분석속도가 빠르고 정확하다. 그리고, 형광 표지자를 붙이는 등의 별도의 준비 작업이 필요 없어 분석과정이 간단하다.
본 발명에 사용되는 나노 기공으로는 도 1에 도시된, 바이오 나노기공으로 α-헤몰리신 및 마이코박테리움 스메그마티스 포린 A(MspA) 채널, 그리고 고체 나노기공으로 산화규소(SiO2), 질화규소(SiN) 및 산화알루미늄(Al2O3) 나노기공 등이 가능하다. 그리고. 고체 나노기공에 바이오 나노기공을 결합한 복합(hybrid) 나노기공도 사용될 수 있다.
바이오 나노기공의 경우 단일가닥만 통과할 수 있으므로, 이중가닥 DNA를 단일가닥으로 분리하여 바이오 나노기공을 통과할 수 있도록 한다. 이를 위해 헬리카제 등의 DNA 분리효소가 바이오 나노기공 상단에 결합되도록 할 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 직렬 다중채널 나노기공 센서를 이용한 DNA 농도 측정 장치의 개략적인 구성도이다.
본 발명의 목적인 신뢰성이 높은 DNA 농도 측정 장치를 제공하기 위해, 나노기공 막(200)을 복수개 사용하여 직렬 다중채널 나노기공 센서를 이용한 DNA 농도 측정 장치를 구성할 수 있다.
나노기공을 하나만 사용하여 통과된 DNA 신호 폭을 측정하는 경우, 주위의 간섭, 시스템과 나노 기공의 잡음 등의 이유로 DNA 통과신호의 폭에 오차를 가질 수 있다.
이러한 오차를 줄이기 위해, 나노기공을 “병렬이 아닌” 직렬로 배열하는 센서를 발명 하였다. 증폭단에 연결된 V1(331), V2(332), V3(333), .... , VN(33N)을 순차적으로 제어할 경우 DNA 분자가 나노기공 1(201)에서, 나노기공 2(202), 나노기공 3(203), ...을 거쳐서, 나노기공 N(20N)까지 순차적으로 통과하고, 동일한 폭의 DNA 통과신호를 각각의 나노기공에서 발생시키게 된다.
도 4를 참조하면, DNA 농도 측정 장치의 전체적인 구성은, 농도를 측정하려고 하는 DNA 용액 투입구를 구비한 용기(100), 용기를 직렬로 연결된 별개의 공간으로 구분하는 복수개의 나노기공 막(201, 202, 203, ... , 20N), 별개의 공간마다 설치된 복수개의 전극(311, 312, 313, ... , 31N), 복수개의 전극에 각각 전압을 인가하여 DNA가 상기 나노기공 막을 통과하여 이동할 수 있도록 하는 전원부(331, 332, 333, ... , 33N), 복수개의 나노기공 막을 통하는 각각의 이온 전류를 측정하는 검출부(341, 342, 343, ... , 34N), 마이크로컨트롤러(400) 및 도 6에 도시된 검출부에서 측정된 결과로부터 DNA 농도를 구하는 연산부(500)를 포함한다.
복수개의 나노기공 막은 각각 하나씩의 나노기공을 구비하여, 용기의 DNA 용액 투입구 쪽의 DNA가 상기 복수개의 나노기공 막의 나노기공들을 통해서 투입구의 반대편까지 도달할 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 직렬 다중채널 나노기공 센서를 이용한 DNA 농도 측정 장치의 인가 전압과 측정 데이터를 나타낸 타이밍도이다.
도 5(a)는 마이크로프로세서를 이용하여 각 전극(311, 312, 313, ... , 31N)에 V1, V2, V3, ... , VN 전압을 인가하는 것을 나타낸 타이밍도 이다. 도 5(b)는 도 5(a)의 프로파일에 따라 전압을 인가하는 경우에 측정되는 DNA 통과신호를 나타낸다. V1에서 VN까지 전압을 순차적으로 인가하는 동안을 1 cycle이라 하면, 그 기간 동안 마이크로프로세서는 각각 트랜스 임피던스 증폭기(Transimpedance Amplifier; TIA)에서 발생되는 신호를 수집 저장한다. 그리고 DNA 분자가 마지막 나노기공 N(20N)을 통과한 이후에 모든 기공에서 발생된 신호들을 분석한다. 각각 나노기공에서 발생되는 DNA 통과 신호의 폭을 측정하여 평균을 낸다.
즉, 하나의 나노기공을 이용하는 경우 여러번 측정하더라도 오차는 계속 발생하지만, 복수의 나노기공이 직렬로 배치된 경우 동일한 시료가 여러 나노기공을 통과하면서 측정되므로 공통 오차를 제거할 수 있다.
도 4와 도 5를 이용하여 나노기공 센서를 사용한 DNA 농도 측정 방법을 개시한다.
먼저, DNA 분자 길이가 알려진 기준용액을 사용하여 단일 막의 나노기공을 통과하는 기준 통과 시간을 결정한다. 그리고, 각각 하나씩의 나노기공을 구비한 복수개의 나노기공 막에 의해 직렬로 연결된 별개의 공간으로 구분된 용기의 한쪽 끝에 있는 DNA 용액 투입구에 농도를 측정하려고 하는 DNA 용액을 투입한다. 그 후, 검출부가 DNA 용액 투입구 쪽에 있는 나노기공 막부터 순차적으로 측정대상 나노기공 막으로 선택하여, 기준 통과 시간 이상의 정해진 측정시간 동안 나노기공을 통과하는 이온 전류를 측정한다. 전원부는 측정대상 나노기공 막을 사이에 둔 전극 사이에 측정시간 내에 기준 통과 시간 이상의 정해진 전압인가시간 동안 전압을 인가한다. 측정시간 경과 후, 측정대상 나노기공 막으로 투입구 반대편에 있는 나노기공 막이 선택될 때까지, 측정과 전압인가를 반복한다. 연산부는 상기 검출부에서 측정한 결과를 이용하여, 상기 농도를 측정하려고 하는 DNA 용액의 DNA 농도를 구한다.
이렇게 직렬 다중채널 나노기공을 사용할 경우 하나의 나노기공을 사용했을 때보다 DNA 통과신호의 신뢰성을 높일 수 있는 장점이 있고, 이로 인하여 보다 정확하게 DNA 분자량 및 DNA 농도를 계산할 수 있다.
기준 통과 시간을 결정하는 방법을 개시한다. 우선 용기(100)의 DNA 용액 투입구에 알려진 길이의 DNA 분자가 들어있는 기준용액을 투입한다. 검출부(341, 342, 343, ... , 34N)에서 DNA 용액 투입구 쪽에 있는 나노기공 막의 나노기공을 통과하는 이온전류를 측정한다. DNA 용액 투입구 쪽의 나노기공 막을 사이에 둔 전극 사이에 전압(331, 332, 333, ... , 33N)을 인가한다. 연산부(500)가 검출부에서 측정한 결과에서 알려진 길이의 DNA 분자의 통과시간을 구한다. 연산부가 통과시간을 알려진 길이로 나누어 기준 통과 시간을 계산한다.
연산부(500)가 농도를 계산하는 방법을 개시한다. DNA 분자들을 나노기공에 통과시켜 얻은 측정 결과에서 농도를 측정하려고 하는 DNA분자들이 나노기공을 통과하는 데 걸린 DNA의 전체 통과시간을 구한다. 농도를 측정하려고 하는 DNA의 전체 통과시간을 기준용액에서 구한 기준 통과 시간으로 나누어 농도를 측정하려고 하는 DNA의 전체 길이를 구한다. DNA의 전체 길이에 염기의 분자량(= 650 dalton × 1.66×10-15ng)을 곱하여 농도를 측정하려고 하는 DNA의 분자량을 구한다. 용액의 부피를 고려하면, DNA의 농도를 계산할 수 있다.
실시예 1 : 직렬 다중채널 나노기공 센서의 제작
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 직렬 다중채널 나노기공 센서를 이용한 DNA 농도 측정 장치의 검출부를 자세히 나타낸 구성도이다.
직렬 다중채널 나노기공을 DNA 분자량 측정에 적용하기 위해서는 다중채널 증폭기(TIA)가 필요하다. 따라서 다중채널 측정 시스템이 필요하다. TIA(341, 342, ... , 34N)는 각각의 나노기공 센서와 연결되어 있다. 이득이 큰 증폭기가 사용될 경우 커맨드 전압들인 V1(331), V2(332), ... , VN(33N)이 나노기공에 인가된다. 따라서 V2 > V1인 경우 나노기공 1(201)에 있던 DNA 가 나노기공 2(202)로 이동하게 되고, V3 > V2인 경우 나노기공 2(202)에 있는 DNA가 나노기공 3(203)으로 이동하게 된다.
이때 커맨드 전압의 변화는 마이크로컨트롤러(400)에 의해서 발생하게 되고, 우리는 PC(500)를 통해 전압 프로파일을 결정할 수 있다. 각각 나노기공에서 발생하는 DNA 통과 신호들은 TIA 증폭기(341, 342, ... , 34N)를 통해 전압으로 증폭하게 된다. 그리고 멀티플렉서(350)를 통해 신호가 나오고 있는 나노기공에 엑세스 할 수 있다.
도 5를 참조하면, V1 만 전압이 인가되고 나머지 전압이 off될 경우 멀티플레서는 TIA1(341)과 연결된 1번 채널만 on을 시켜서 DNA 통과신호를 수집하게 된다. 이렇게 멀티플렉서 방식을 사용하므로 데이터변환기(ADC)의 개수를 줄여 전력 소모를 막을 수 있고, 또한 다른 나노기공에서 발생하는 간섭이나 잡음의 유입을 막을 수 있는 큰 장점이 있다
실험에 사용한 나노기공 센서는 고체 나노기공에 바이오 나노기공을 결합시킨 복합 나노기공이다.
고체 나노기공은 Si 기판에 SiN 박막을 두께 250 nm 화학 기상 증착법으로 성장시킨 것을 사용하였다. 상기 고체 나노기공은 지질이중층이 결합하기 쉽도록 직경이 10 nm 내지 50 nm 이 되도록 Si 기판에 PR 도포후 에칭에 의해 제작하였다.
바이오 나노기공을 결합시키기 위해 고체 나노기공에 지질 이중층을 결합시켰다. 그리고, 지질 이중층에 바이오 나노기공으로 α-헤몰리신을 결합시켰다.
실시예 2 : 나노기공 센서를 이용한 DNA 농도 측정
길이가 알려진 40-bp DNA를 도 6의 나노기공 센서를 사용한 DNA 농도 측정 장치를 이용하여 통과시간을 측정하였다. 40-bp DNA의 통과시간은 평균 100 μs 로 측정되었다.
통과시간을 DNA 길이로 나누어 주면, 염기당 기준시간은 100 μs / 40 bp = 2.5 μs / bp 가 된다. 즉, DNA 염기당 통과시간은 2.5 μs 가 된다.
DNA 농도를 모르는 미지 시료 1 μL 를 나노기공 센서를 사용한 DNA 농도 측정 장치를 이용하여 통과시간을 측정하였다. 측정된 전체 DNA 통과시간은 50 ms 로 측정되었다.
미지 시료의 염기수는 50 ms / 2.5 μs = 20,000 bp 이다. 즉, 미지시료 1 μL 에는 2만개의 염기가 존재한다. DNA 1개의 염기당 분자량은 650 달톤(dalton)이므로, 650 da × 20,000 bp = 13,000,000 da 이 된다. 무게로 환산하면, 13,000,000 × 1.66×10-15 ng = 2.158×10-9 ng/μL 이다.
이 미지 시료를 UV분광법을 이용하여 측정하였을 때, 오차범위에서 동일한 결과를 얻을 수 있었다.
이상에서 대표적인 실시 예를 통하여 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였으나, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 상술한 실시 예에 대하여 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 한도 내에서 다양한 변형이 가능함을 이해할 것이다. 그러므로 본 발명의 권리 범위는 설명된 실시 예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태에 의하여 정해져야 한다.
100 용기
130 DNA
200 나노기공 막
330 전원부
340 검출부
400 마이크로컨트롤러
500 연산부

Claims (8)

  1. 농도를 측정하려고 하는 DNA 용액 투입구를 구비한 용기;
    상기 용기를 직렬로 연결된 별개의 공간으로 구분하는 복수개의 나노기공 막:
    상기 별개의 공간마다 설치된 복수개의 전극;
    상기 복수개의 전극에 각각 전압을 인가하여 DNA가 상기 나노기공 막을 통과하여 이동할 수 있도록 하는 전원부;
    상기 복수개의 나노기공 막을 통하는 각각의 이온 전류를 측정하는 검출부; 및
    상기 검출부에서 측정된 결과로부터 DNA 농도를 구하는 연산부를 포함하며,
    상기 복수개의 나노기공 막은 각각 하나씩의 나노기공을 구비하여, 용기의 DNA 용액 투입구 쪽의 DNA가 상기 복수개의 나노기공 막의 나노기공들을 통해서 투입구의 반대편까지 도달할 수 있는 것을 특징으로 하는 나노기공 센서를 사용한 DNA 농도 측정 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 전원부는, 상기 복수개의 나노기공 막 중에서 DNA 용액 투입구 쪽에 있는 나노기공 막부터 순차적으로, 각 나노기공 막을 사이에 둔 전극 사이에 전압을 인가하고, 정해진 시간 후 그다음 나노기공 막을 사이에 둔 전극 사이에 전압을 인가하여, DNA를 용액 투입구 쪽에서 투입구의 반대편까지 이동시키는 것을 특징으로 하는 나노기공 센서를 사용한 DNA 농도 측정 장치.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 검출부는, 트랜스 임피던스 증폭기(TIA)와 멀티플렉서를 구비하는 것을 특징으로 하는 나노기공 센서를 사용한 DNA 농도 측정 장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 나노기공은 α-헤몰리신 채널, 마이코박테리움 스메그마티스 포린 A(MspA) 채널, 실리콘(Si) 나노기공, 질화 실리콘(SiN) 박막 나노기공, 그래핀 나노기공 및 이들을 결합한 복합 나노기공으로 구성된 군으로부터 선택되어지는 것을 특징으로 하는 나노기공 센서를 사용한 DNA 농도 측정 장치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 나노기공은 상단에 DNA 분리효소가 결합할 수 있는 구조를 가진 것을 특징으로 하는 나노기공 센서를 사용한 DNA 농도 측정 장치.
  6. (a) DNA 분자 길이가 알려진 기준용액을 사용하여 단일 막의 나노기공을 통과하는 기준 통과 시간을 결정하는 단계;
    (b) 각각 하나씩의 나노기공을 구비한 복수개의 나노기공 막에 의해 직렬로 연결된 별개의 공간으로 구분된 용기의 한쪽 끝에 있는 DNA 용액 투입구에 농도를 측정하려고 하는 DNA 용액이 투입되는 단계;
    (c) 검출부가 DNA 용액 투입구 쪽에 있는 나노기공 막부터 순차적으로 측정대상 나노기공 막으로 선택하여, 상기 기준 통과 시간 이상의 정해진 측정시간 동안 나노기공을 통과하는 이온 전류를 측정하는 단계;
    (d) 전원부가 상기 측정대상 나노기공 막을 사이에 둔 전극 사이에 상기 측정시간 내에 기준 통과 시간 이상의 정해진 전압인가시간 동안 전압을 인가하는 단계;
    (e) 상기 측정시간 경과 후, 측정대상 나노기공 막으로 투입구 반대편에 있는 나노기공 막이 선택될 때까지, 상기 (c) 및 (d) 단계를 반복하는 단계; 및
    (f) 연산부가 상기 검출부에서 측정한 결과를 이용하여, 상기 농도를 측정하려고 하는 DNA 용액의 DNA 농도를 구하는 단계를 포함하는 나노기공 센서를 사용한 DNA 농도 측정 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 (a) 단계는,
    (a-1) 상기 DNA 용액 투입구에 알려진 길이의 DNA 분자가 들어있는 기준용액이 투입되는 단계;
    (a-2) 상기 검출부가 DNA 용액 투입구 쪽에 있는 나노기공 막의 나노기공을 통과하는 이온전류를 측정하는 단계;
    (a-3) 상기 DNA 용액 투입구 쪽의 나노기공 막을 사이에 둔 전극 사이에 전압을 인가하는 단계;
    (a-4) 상기 연산부가 상기 검출부에서 측정한 결과에서 상기 알려진 길이의 DNA 분자의 통과시간을 구하는 단계; 및
    (a-5) 상기 연산부가 상기 통과시간을 상기 알려진 길이로 나누어 기준 통과 시간을 계산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노기공 센서를 사용한 DNA 농도 측정 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 (f)단계는,
    (f-1) 상기 연산부가 상기 DNA 용액의 측정 결과에서 상기 농도를 측정하려고 하는 DNA의 전체 통과시간을 구하는 단계;
    (f-2) 상기 연산부가 상기 농도를 측정하려고 하는 DNA의 전체 통과시간을 상기 기준 통과 시간으로 나누어 상기 농도를 측정하려고 하는 DNA의 전체 길이를 구하는 단계; 및
    (f-3) 상기 연산부가 상기 DNA의 전체 길이에 염기의 분자량을 곱하여 상기 농도를 측정하려고 하는 DNA의 분자량 및 농도를 계산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노기공 센서를 사용한 DNA 농도 측정 방법.
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