KR20130130827A

KR20130130827A - 이중-포어 디바이스

Info

Publication number: KR20130130827A
Application number: KR1020137023965A
Authority: KR
Inventors: 윌리암 던바; 김정숙
Original assignee: 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2011-07-20
Filing date: 2012-07-18
Publication date: 2013-12-02
Also published as: EP2734840A2; JP6364348B2; MX2013008539A; KR20160028518A; CN104774757A; CN104774757B; EP2988128A1; EP3318872A1; US8961763B2; KR101820834B1; MX342569B; EP2734840B1; CN103328973A; CA2823787C; EP2734840B3; EP2988128B1; AU2012284137A1; WO2013012881A3; JP2014529296A; ES2659343T3

Abstract

상부 챔버, 중간 챔버 및 하부 챔버를 포함하는 디바이스로서, 상기 상부 챔버가 제1 포어를 통해 상기 중간 챔버와 교류하고, 상기 중간 챔버가 제2 포어를 통해 상기 하부 챔버와 교류하고, 상기 제1 포어 및 상기 제2 포어는, 직경이 약 1nm 내지 약 100nm이고, 서로 약 10nm 내지 약 1000nm 이격되어 있고, 각각의 챔버는 전원 장치에 연결되는 전극을 포함하는, 디바이스를 제공한다. 또한, 특히 폴리뉴클레오타이드를 서열분석하는데 있어 상기 디바이스를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

이중-포어 디바이스 {DUAL-PORE DEVICE}

본 출원은, 법적으로 허용가능한 범위내에서, 2011년 7월 20일자 미국 가출원번호 61/572,843에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원과 본원에 인용된 모든 간행물들은 법적으로 허용가능한 최대의 범위로 원용에 의해 본 발명에 포함된다.

나노포어는, 지질막(생물학적 포어)에 단백질 채널로서 자연스럽게 형성되는 나노-크기의 개구이거나, 고상-상태 기질(고상-상태 포어)에서 개구를 뚫고 에칭하여 가공될 수 있다. 그러한 나노포어가 나노포어에 의해 분리된 두개의 챔버를 포함하는 나노 디바이스로 통합되는 경우, 민감도의 패치-클램프 증폭기가 트랜스-멤브레인 전압을 인가하고 포어를 통해 이온 전류를 측정하도록 사용될 수 있다.

나노포어는 저비용의 전체 게놈 DNA 서열분석에 대한 큰 가능성을 제시한다. 이에 대하여, 개별 DNA 분자는 일시적인 이동(shift)으로서 검출되는 각각의 포획 이벤트를 이용해 포획되어, 전기영동에 의해 상기 포어에 의해 구동될 수 있다. 그 후, DNA 분자의 서열은, DNA가 포어 채널를 통해 통과하기 때문에, 이동된 이온 전류 레코드 내의 패턴으로부터, 또는 나노포어 내거나 근처의 일부 다른 보조 센서로부터 추론될 수 있다.

원칙적으로, 나노포어 서열분석기는 샘플 증폭, 서열분석 작동시의 촉매 기능에 이용되는 효소와 시약의 사용, 및 서열분석 진행의 검출에 대한 광학, 합성 방법에 의한 종래의 서열분석에 의해 요구되는 일부 또는 전부에 대한 필요성을 감소시킬 수 있다.

나노포어 센서는 순수하게 전기를 이용하고, 혈액 또는 타액 샘플로부터 이용가능한 것보다 작은 농도/용량으로 DNA를 검출할 수 있다. 추가적으로, 나노포어는, 450 베이스로부터 10,000 베이스보다 큰 베이스까지, 서열분석된 DNA의 판독-길이를 극적으로 증가시킬 수 있다.

나노포어 서열분석에 대한 다음의 두 가지 원리의 장애가 존재한다: (1) 새로운 서열분석에 대해 핵산의 각 뉴클레오타이드의 식별을 정확히 판정하는데 충분한 감도의 결여(단일-뉴클레오타이드 감도의 결여), 및 (2) 감지하는 동안 나노포어를 통한 각 뉴클레오타이드 유닛의 전달 속도를 규제하는 능력. 많은 리서치 그룹들이 장애 (1)을 해결하기 위해 나노포어를 개선하고 향상시키려는 반면, 특정 나노포어 기술에만 이용되고, 순수 전기적 방법에 비교하여 고비용 및 복잡성을 일으키는 효소 또는 광학의 사용을 수반하지 않는 장애 (2)를 해결하기 위한 방법은 존재하지 않는다.

일구현예에서, 상부 챔버, 중간 챔버 및 하부 챔버를 포함하는 디바이스로서, 상기 상부 챔버가 제1 포어를 통해 중간 챔버와 교류하고, 중간 챔버가 제2 포어를 통해 하부 챔버와 교류하고, 제1 포어 및 제2 포어는 직경이 약 1nm 내지 약 100nm이고, 서로 약 10nm 내지 약 1000nm 이격되어 있고, 각각의 챔버는 전원 장치에 연결되는 전극을 포함하는, 디바이스를 제공한다.

일 측면에서, 상기 제1 및 제2 포어가 실질적으로 동축이다.

일 측면에서, 디바이스는 실리콘, 질화규소, 이산화규소, 그라핀, 탄소 나노튜브, Ti0₂, Hf0₂, Al₂0₃, 금속층, 유리, 생물학적 나노포어, 생물학적 포어 삽입구를 가지는 멤브레인, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 재료를 포함한다.

일 측면에서, 제1 포어 및 제2 포어는 깊이가 약 0.3nm 내지 약 100nm이다.

일 측면에서, 전원 장치는 상부 챔버와 중간 챔버 사이의 제1 전압, 및 중간 챔버와 하부 챔버 사이의 제2 전압을 제공하도록 구성되며, 제1 전압 및 제2 전압은 독립적으로 조정가능하다.

일 측면에서, 전원 장치는 제1 및 제2 전압의 각각을 생성하는 전압-클램프 시스템 또는 패치-클램프 시스템을 포함한다. 일 측면에서, 중간 챔버가 두 전압에 대하여 접지되도록 조정된다. 일 측면에서, 중간 챔버는 중간 챔버에 있는 전극 및 각각의 포어 사이의 컨덕턴스를 제공하는 매질(medium)을 포함한다.

일부 측면에서, 전원 장치, 예컨대 전압-클램프 시스템 또는 패치-클램프 시스템은 각각의 포어를 통해 이온 전류를 측정하도록 더 구성된다.

또다른 구현예는 상부 챔버, 중간 챔버 및 하부 챔버를 포함하는 디바이스로서, 상부 챔버는 제1 포어를 통해 중간 챔버와 교류하고, 중간 챔버는 제2 포어를 통해 하부 챔버와 교류하고, 제1 포어 및 제2 포어는 직경이 약 1nm 내지 약 100nm이고, 서로 약 10nm 내지 약 1000nm 이격되어 있는, 디바이스; 및 전압을 인가하는 전압-클램프 또는 패치-클램프 시스템에 연결하고, 각각의 포어를 통해 이온 전류를 측정하기 위한 각각의 챔버에 있는 전극으로서, 중간 챔버에 있는 전극이 두 개의 전압-클램프 또는 패치-클램프 시스템의 공통 접지에 접속되는, 전극을 제공한다.

또한, 일 구현예에서, (a) 임의의 상기 구현예의 디바이스의 상부 챔버, 중간 챔버, 또는 하부 챔버 중 하나에 대전된 폴리머를 포함하는 샘플을 적재하는 단계로서, 상기 디바이스는 상부 챔버와 중간 챔버 사이의 제1 전압, 및 중간 챔버와 하부 챔버 사이의 제2 전압을 제공하는 전압-클램프 또는 패치-클램프 시스템에 접속되는, 단계; (b) 상기 폴리머가 챔버 간에 이동하도록 초기 제1 전압 및 초기 제2 전압을 설정하여, 폴리머가 제1 포어 및 제2 포어 둘다를 가로지르도록 위치시키는 단계; 및 (c) 제1 전압 및 제2 전압이 둘다 중간 챔버로부터 대전된 폴리머를 끌어당기는 힘을 생성하도록 제1 전압 및 제2 전압을 조정하는 단계로서, 대전된 폴리머가 하나의 방향으로 제어된 방식으로 두 포어를 가로질러 이동하도록 두 전압이 크기가 상이한 제어 조건 하에 있도록 하는, 단계를 포함하는, 포어를 통해 대전된 폴리머의 이동을 제어하는 방법이 제공된다.

일 측면에서, 전달의 제어된 방식이 제1 전압 또는 제2 전압 또는 두 전압 다의 피드백 제어 또는 능동 제어에 의해, 제1 이온 전류 또는 제2 이온 전류 또는 두 이온 전류 측정의 피드백 기능으로서 하나의 전압 또는 두 전압 다를 이용하여, 확립된다. 제한되지 않는 실시예는 제2 정전압을 유지하고, 제1 전압의 능동 제어 또는 피드백 제어에 대한 피드백으로써 제2 이온 전류를 사용하여, 한 방향으로 대전된 폴리머의 제어 전달을 확립하는 것을 포함한다. 따라서, 일 측면에서, 제1 전압이 제2 포어를 가로지르는 측정된 이온 전류에 기초하여 조정된다.

일 측면에서, 샘플이 상부 챔버로 적재되고, 초기 제1 전압이 상부 챔버로부터 중간 챔버로 대전된 폴리머를 끌어당기도록 설정되고, 초기 제2 전압이 상기 폴리머를 중간 챔버로부터 하부 챔버로 끌어당기도록 설정된다.

또다른 측면에서, 샘플이 중간 챔버로 적재되고, 초기 제1 전압이 대전된 폴리머를 중간 챔버로부터 상부 챔버로 끌어당기도록 설정되고, 초기 제2 전압이 중간 챔버로부터 하부 챔버로 상기 대전된 폴리머를 끌어당기도록 설정된다.

일 측면에서, 대전된 폴리머는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드이다. 일 측면에서, 대전된 폴리머는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 이에 한정되지는 않으나, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 또는 DNA-RNA 중합체(hybrid)이다.

일 측면에서, 단계 (c)에서 조정된 제1 전압 및 제2 전압은 크기가 두 전압 사이의 차이의 약 10배 내지 약 10,000배 높다.

일 측면에서, 상기 방법은 단량체 유닛이 상기 포어를 통과하는 경우 포어 중 하나를 가로지르는 이온 전류를 측정함으로써 폴리머의 단량체 유닛을 식별하는 단계를 더 포함한다. 일 측면에서, 단량체 유닛은 뉴클레오타이드이다. 또다른 측면에서, 단량체 유닛은 뉴클레오타이드 쌍이다. 일부 측면에서, 단일 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 쌍은 하나의 분자에서 검출될 수 있다. 예를 들어, 이러한 분자는 보다 긴 그리고 그렇지 않다면 단일-가닥인 폴리뉴클레오티드 내에 이중 부분을 가지는데, 이 이중 부분은 왓슨-크릭 상호보완적 염기 페어링에 의해 부분적으로 또는 완전하게 형성된 것이다.

일 측면에서, 단량체는 DNA-결합 단백질, 또는 나노-입자와 같은 분자에 결합된다. DNA-결합 단백질의 비제한적인 예는 RecA 및 서열-특이적 DNA-결합 단백질, 예컨대, 파지 람다 억제 물질, NF-κB 및 p53을 포함한다. 나노-입자의 비제한적인 예는 양자 점 및 형광 표지를 포함한다.

일 측면에서, 폴리머가 고상 지지체, 예컨대 비드(bead)와 폴리머의 일 단부에 부착된다.

또다른 구현예는 (a) 임의의 상기 구현예의 디바이스의 상부 챔버에 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 샘플을 적재하는 단계로서, 상기 디바이스가 상부 챔버와 중간 챔버 사이의 제1 전압, 및 중간 챔버와 하부 챔버 사이의 제2 전압을 제공하기 위한 전압-클램프 또는 패치-클램프 시스템에 연결되고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 고상 지지체와 폴리뉴클레오타이드의 일 단부에 선택적으로 부착되는, 단계; (b) 폴리뉴클레오타이드가 상부 챔버로부터 중간 챔버로, 그리고 중간 챔버로부터 하부 챔버로 이동하도록 초기 제1 전압 및 초기 제2 전압을 설정하여, 폴리머가 제1 및 제2 포어를 가로지르도록 위치시키는 단계; (c) 제1 전압 및 제2 전압의 두 전압이 폴리뉴클레오타이드를 중간 챔버에서 떠나서 끌어당기는 힘을 생성하도록 제1 전압 및 제2 전압을 조정하는 단계로서, 폴리뉴클레오타이드가 한 방향으로 제어 방식으로 두 포어를 가로질러 이동하도록, 상기 두 전압이 크기가 상이한 제어 조건하에 있는, 단계; 및 (d) 뉴클레오타이드가 포어 중 하나의 포어를 통과하는 경우 상기 하나의 포어를 가로지르는 이온 전류를 측정함으로써, 하나의 포어를 통해 통과하는 폴리뉴클레오타이드의 각 뉴클레오타이드를 식별하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 서열분석을 판정하는 방법을 제공한다.

서열분석을 위한 개선된 이중-포어 디바이스를 제공한다.

이하 수반되는 도면은 도시되는 방법으로 제공된 구현예를 설명한다.
도 1a 내지 1c는 두 개의 포어(이중-포어) 디바이스를 도시하고 있다. (1a) 독립적인 전압 제어(V₁, V₂) 및 각 포어의 전류 측정(I₁, I₂)에 대한 이중-포어 칩과 이중-증폭기 전자공학 구성의 개략도이다. 챔버(A-C)는 공통 포어에 의한 것을 제외하고 용적 측정으로 분리된다. 실현 가능한 칩 파라미터가 인터-포어 간격은 10-500nm, 멤브레인 두께는 0.3-50nm, 및 포어 직경은 1-100nm이다. (1b) 전기작용으로, V₁ 및 V₂는, I₁ 및 I₂를 효과적으로 분리시키도록 모든 접근 저항을 최소화하는 디바이스를 구성함으로써, 원칙적으로 각 나노포어 저항에 걸쳐있다. (1c) 각 전압 힘의 방향을 보여주는 청색 화살표를 이용하여, 전압 경쟁이 제어에 사용될 것이다. 동일한 전압-힘 영향을 가진 포어를 가정하고, |V₁|=|V₂|+δV를 사용하면, 값(δV>0(<0))은 V₁(V₂) 방향으로 조절가능한 움직임을 위해 조정된다. 실제로, 각 포어에서의 전압-유도된 힘이 V₁=V₂와 동일하지 않을 것이라 하더라도, 캘리브레이션(calibration) 실험이, 두개의 포어 칩에 대해 동등한 끌어당기는 힘을 야기할 획득된 전압 바이어스를 식별할 수 있고, 그후 상기 바이어스 주위의 변이(variation)가 방향 제어에 사용될 수 있다.
도 2는 챔버 A, 챔버 B 및 챔버 C를 구비하는 두 개의 포어 하우징 디바이스의 외관도를 도시하고 있으며, 각 챔버는 유체 접근 및 샘플 적재를 위한 개구를 구비한다. 이중-포어 칩은 두 개의 개스킷(gasket) 사이에 위치되고, 하우징 디바이스의 각 부분의 각 개스킷 부분을 구비하며, 상기 두 부분은 칩 주변의 하우징을 개방하고 폐쇄하기 위해 힌지(hinge)(중간 탑) 주위를 회전한다.
일부 또는 모든 도면은 예시를 위한 개략도이다; 따라서, 그들은 도시된 요소의 실제 상대 크기 또는 위치를 나타낼 필요는 없다. 도면들은 특허청구범위 또는 청구항의 의미를 제한하는데 사용되는 것이 아니라는 이해하에서 하나 이상의 구현예를 설명하기 위해 제공된다.

본 출원에서, 명세서는 현재 영양소, 구성요소, 및 방법의 다양한 실시예를 제시한다. 기재된 다양한 실시예는 도시된 다양한 실시예를 제공하며, 대안의 종류의 상세한 설명으로서 해석되어서는 안된다. 오히려, 본 명세서에서 제공된 다양한 실시예의 상세한 설명은 반복되는 범위일 수 있음을 명심해야 한다. 본 명세서에 기재된 실시예는 단순히 예시이며, 본원의 범위를 제한하려는 것이 아니다.

또한, 공개에 있어서, 다양한 공고, 특허 및 공고된 특허 명세서가 인용을 구별하도록 언급된다. 이로써, 이러한 공고, 특허 및 공고된 특허 명세서의 공개는 본원이 보유하는 분야의 상태를 좀더 풍부하게 기재하기 위하여 본원 공개로 참조로 포함된다.

본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, "하나의(a, an)" 및 "상기(the)"의 단일 표현은 본 명세서에서 그렇지 아니하다고 명확히 기재하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다. 예를 들어, 용어 "전극"은 복수의 전극, 및 이들의 혼합을 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다"는 디바이스 및 방법이 인용된 구성요소 또는 단계를 포함하는 의미이나 다른 것을 배제하려는 의도는 아니다. 디바이스 및 방법을 정의할 때 사용되는 "필수적으로 이루어진"의 용어는 결합에서 임의의 필수적인 의미의 다른 구성요소 또는 단계를 배제한다는 의미일 것이다. "로 이루어진"의 용어는 다른 구성요소 또는 단계를 배제한다는 의미일 것이다. 이러한 과도적 용어 각각에 의해 정의되는 실시예는 본 발명의 범위 내에 있다.

범위를 포함하여 모든 수치 한정, 예컨대 간격, 크기, 온도, 시간, 전압 및 농도는 0.1의 증분만큼의 (+) 또는 (-)로 변화되는 대략의 값이다. 항상 명백히 이러한 것은 아니나, 모든 수치 한정이 용어 "약"에 의해 선행된다는 것을 이해해야할 것이다. 또한, 항상 명백히 이러한 것은 아니나, 본 명세서에 기재된 구성요소는 단순히 예시일 뿐이며 이러한 등가물은 이 분야에 알려져 있음을 이해해야할 것이다.

두 개의 포어 디바이스

본 발명의 일 구현예는 두 개의 포어 디바이스를 제공한다. 이 디바이스는 세 개의 챔버 및 챔버들 사이에 액체 교환을 가능하게 하는 두 개의 포어를 포함한다. 또한, 각각의 챔버는 전원 장치에 연결되는 전극을 포함하여 분리된 전압이 챔버들 사이의 각각의 포어를 가로질러 설정될 수 있다.

상부 챔버, 중간 챔버 및 하부 챔버를 포함하는 디바이스가 제공된, 본 발명의 일 구현에에 따르면, 상부 챔버는 제1 포어를 통해 중간 챔버와 교류하고, 중간 챔버는 제2 포어를 통해 하부 챔버와 교류하고, 제1 포어 및 제2 포어는 직경이 약 1nm 내지 약 100nm이고, 서로 약 10nm 내지 약 100nm 떨어져 있고, 각각의 챔버는 전원 장치에 연결하는 전극을 포함한다.

도 1(a)에 대하여, 디바이스는 상부 챔버(챔버 A), 중간 챔버(챔버 B), 및 하부 챔버(챔버 C)를 포함한다. 챔버들은 각각 분리된 포어(111 및 112)를 구비하는 두 분리된 층 또는 멤브레인(101 및 102)에 의해 분리된다. 또한, 각 챔버는 전원 장치에 연결되는 전극(121, 122 및 123)을 포함한다. 상부, 중간 및 하부 챔버의 주석은 용어와 관련이 있으며, 예를 들어, 상부 챔버가 접지에 대하여 중간 또는 하부 챔버 위에 위치한다는 것, 또는 그 반대의 경우를 나타내지는 않음이 명백하다.

각각의 포어(111 및 112)는 독립적으로 소분자, 대분자 또는 미생물이 통과할 수 있는 크기를 가진다. 일 측면에서, 각 포어의 직경은 적어도 약 1nm이다. 대안으로, 각 포어의 직경은 적어도 약 2nm, 3nm, 4nm, 5nm, 6nm, 7nm, 8nm, 9nm, 10nm, 11nm, 12nm, 13nm, 14nm, 15nm, 16nm, 17nm, 18nm, 19nm, 20nm, 25nm, 30nm, 35nm, 40nm, 45nm, 50nm, 60nm, 70nm, 80nm, 90nm 또는 100nm이다.

일 측면에서, 포어의 직경이 약 100nm 이하이다. 대안으로, 포어의 직경은 약 95nm, 90nm, 85nm, 80nm, 75nm, 70nm, 65nm, 60nm, 55nm, 50nm, 45nm, 40nm, 35nm, 30nm, 25nm, 20nm, 15nm 또는 10nm 이하이다.

일 측면에서, 포어는 약 1nm 내지 약 100nm, 또는 대안으로 약 2nm 내지 약 80nm, 또는 약 3nm 내지 약 70nm, 또는 약 4nm 내지 약 60nm, 또는 약 5nm 내지 약 50nm, 또는 약 10nm 내지 약 40nm, 또는 약 15nm 내지 약 30nm인 직경을 가진다.

일부 측면에서, 포어는 실질적으로 원형 형상을 가진다. 본 명세서에서 사용되는 "실질적으로 원형"은 원기둥의 형태로 적어도 약 80 또는 90%인 형상을 언급한다. 일부 구현예에서, 포어는 정사각형, 직사각형, 삼각형, 타원형 또는 육각형의 형상이다.

각각의 포어(111 및 112)는 독립적으로 깊이를 가진다. 일 측면에서, 각 포어는 적어도 약 0.3nm의 깊이를 가진다. 대안으로, 각 포어는 적어도 약 0.6nm, 1nm, 2nm, 3nm, 4nm, 5nm, 6nm, 7nm, 8nm, 9nm, 10nm, 11nm, 12nm, 13nm, 14nm, 15nm, 16nm, 17nm, 18nm, 19nm, 20nm, 25nm, 30nm, 35nm, 40nm, 45nm, 50nm, 60nm, 70nm, 80nm, 또는 90nm인 깊이를 가진다.

일 측면에서, 각 포어는 약 100nm 이하인 깊이를 가진다. 대안으로, 깊이는 약 95nm, 90nm, 85nm, 80nm, 75nm, 70nm, 65nm, 60nm, 55nm, 50nm, 45nm, 40nm, 35nm, 30nm, 25nm, 20nm, 15nm 또는 10nm 이하이다.

일 측면에서, 포어는 약 1nm 내지 약 100nm인 깊이를 가지며, 또는 대안으로, 약 2nm 내지 약 80nm, 또는 약 3nm 내지 약 70nm 또는 약 4nm 내지 약 60nm, 또는 약 5nm 내지 약 50nm, 또는 약 10nm 내지 약 40nm, 또는 약 15nm 내지 약 30nm인 깊이를 가진다.

일 측면에서, 포어는 약 10nm 내지 약 1000nm의 간격으로 이격된다. 일 측면에서, 간격은 적어도 약 10nm이고, 또는 대안으로 적어도 약 20nm , 30nm, 40nm, 50nm, 60nm, 70nm, 80nm, 90nm, 100nm, 150nm, 200nm, 250nm, 또는 300nm이다. 또다른 측면에서, 간격이 약 1000nm, 900nm, 800nm, 700nm, 600nm , 500nm, 400nm, 300nm, 250nm, 200nm, 150nm, 또는 100nm 이하이다. 또다른 측면에서, 간격이 약 20nm 내지 약 800nm, 약 30nm 내지 약 700nm, 약 40nm 내지 약 500nm, 또는 약 50nm 내지 약 300nm이다.

두 개의 포어가, 챔버 사이의 액체 교류를 가능하게 하고 규정된 크기와 그들 사이의 규정된 간격을 가지는 한, 임의의 위치에 배열될 수 있다. 일 측면에서, 포어는 그들 사이에 직접적으로 막힘이 없도록 위치된다. 여전히, 일 측면에서, 도 1a에 도시된 바와 같이, 포어는 실절적으로 동축이다.

일 측면에서, 디바이스는, 챔버에 있는 전극을 통해 하나 이상의 전원 장치에 연결된다. 일부 측면에서, 전원 장치는, 각 포어를 통해 독립적으로 전류를 측정할 수 있는, 각 포어를 통해 전압을 공급하기 위한 패치-클램프 또는 전압-클램프로 구성된다. 이 측면에서, 전원 장치는 두 전압 소스에 대한 공통 접지에 중간 챔버를 설정할 수 있다. 일 측면에서, 전원 장치는 상부 챔버(예컨대, 도 1a의 챔버 A)와 중간 챔버(예컨대, 도 1a의 챔버 B) 사이의 제1 전압, 및 중간 챔버와 하부 챔버(예컨대, 도 1a의 챔버 C) 사이의 제2 전압를 제공하도록 구성된다.

일부 측면에서, 제1 전압 및 제2 전압은 독립적으로 조정될 수 있다. 일 측면에서, 중간 챔버가 두 전압에 대하여 접지가 되도록 조정된다(도 1a-1c에 도시됨). 일 측면에서, 중간 챔버가 중간 챔버의 전극과 각 포어 사이의 컨덕턴스를 제공하기 위한 매질을 포함한다. 일 측면에서, 중간 챔버는 중간 챔버의 전극과 각 포어 사이의 저항을 제공하기 위한 매질을 포함한다. 나노포어 저항에 비하여, 그러한 저항을 충분히 작게 유지하는 것이, 포어에서의 두 전압 및 전류를 분리시키는데 유용하며, 전압의 독립적인 조정에 도움이 된다.

전압의 조정은 챔버에 있는 대전된 입자의 움직임을 제어하도록 이용될 수 있다. 예를 들어, 두 전압 모두 동일한 방향으로 설정되는 경우, 적절히 대전된 입자가 상부 챔버로부터 중간 챔버로, 그리고 하부 챔버로, 또는 다른 방향으로, 순차적으로 이동될 수 있다. 그렇지 않으면, 대전된 입자가 상부 또는 하부 챔버로부터 중간 챔버로 이동될 수 있고, 거기에 유지될 수 있다.

디바이스에서의 전압의 조정이 대분자, 예컨대 충분히 커서 동시에 두 포어 전부를 가로지를 수 있는 대전된 폴리머의 움직임을 제어하는데 특히 유용할 수 있다. 이 측면에서, 분자의 움직임 및 움직임 속도가, 이하 기재될 전압의 상대적 크기 및 방향에 의해 제어될 수 있다.

디바이스는 액상 샘플, 특히 생물학적 샘플을 유지하는데 적합한 물질, 및/또는 나노제조에 필요한 물질을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 그러한 물질은 유전체 물질, 예컨대 이에 한정되는 것은 아니나, 실리콘, 질화규소, 이산화규소, 그라핀, 탄소 나노튜브, Ti0₂, Hf0₂, Al₂0₃, 또는 기타 금속층, 또는 이들 물질들의 임의의 조합이다. 그라핀의 단일 시트는 0.3nm 이하의 두께의 막을 형성하며, 예를 들면, 포어-함유 막으로 사용될 수 있다.

미세유체(microfluidic)이며, 두 개의 포어 미세유체 칩 구현을 하우징하는 디바이스가 다양한 수단 및 방법에 의해 제조될 수 있다. 두개의 평행인 멤브레인으로 구성된 미세유체 칩에 있어서, 멤브레인의 각 면 상에 상이한 빔을 사용하는 것이 임의의 적합한 배열 기술과 협력하여 가능하다 할지라도, 두 멤브레인은 두 개의 동심의 포어를 형성하기 위해 단일 빔에 의해 동시에 뚫릴 수 있다. 개괄적으로, 하우징은 챔버 A-C의 밀봉된 분리를 보장한다. 일 측면에서, 하우징은, 각 전압이 각 포어를 통해 주로 인가되는 것을 보장하기 위해, 전압 전극(두 소스 및 하나의 접지) 및 나노포어 사이의 최소의 접근 저항을 제공할 것이다.

일 측면에서, 도 2는 디바이스의 또다른 구현예의 외부도를 도시하고 있다. 도 2에서, 디바이스는 스페이서에 의해 연결된 두 개의 평행한 멤브레인으로 구성된 미세유체 칩("이중-코어 칩"이라 함)을 포함한다. 각 멤브레인은 멤브레인의 중앙을 통해 단일 빔으로 뚫린 포어(도시되지 않음)를 포함한다. 또한, 바람직하게는, 디바이스가 칩을 위한 테플론(등록상표) 하우징을 가진다. 하우징은 챔버 A-C의 밀봉 분리를 보장하고, 각 전압이 각 포어를 통해 주로 인가되는 것을 보장하기 위해 전해질에 대한 최소의 접근 저항을 제공한다.

더욱 자세하게는, 포어-베어링 멤브레인은 5-100nm의 두께의 실리콘, 질화규소, 또는 이산화규소 창을 가지는 TEM(투과형 전자 현미경) 격자를 사용하여 제조될 수 있다. 스페이서는 인슐레이터(SU-8, 포토레지스트, PECVD 산화물, ALD 산화물, ALD 알루미나) 또는 증발 기체(Ag, Au, Pt) 재료를 사용하고, 그렇지 않으면 막 사이의 챔버 B의 수성 부분 내의 작은 부피를 차지하면서, 막을 분리하는데 사용될 수 있다. 홀더는 챔버 B의 가장 큰 부피 분획을 포함하는 수성 배스 내에 놓여진다. 챔버 A와 C는 막 밀봉 부분으로 이어지는 보다 큰 직경의 채널(낮은 접근 저항을 위한 것임)에 의해 접근할 수 있다.

초점을 맞춘 전자 또는 이온 빔이 멤브레인을 통한 포어를 뚫고 배열하는데 사용될 수 있다. 각 층에 정확한 빔 초점을 적용함으로써 포어는 더 작은 크기의 형태로 만들수도 있다(축소시킴). 임의의 단일 나노포어를 뚫는 방법은, 소정의 방법 및 멤브레인의 두께에 대해 가능한 구멍 깊이를 고려하여, 두 멤브레인에 한 쌍의 포어를 뚫어서 사용될 수 있다. 멤브레인 두께를 개선하기 위해, 규정된 깊이로 마이크로-포어를 미리 뚫고나서, 멤브레인의 나머지를 통해 나노포어를 뚫는 것도 가능하다.

또다른 측면에서, 하이브리드 포어를 형성하기 위해 생물학적 나노포어의 고상-상태 나노포어로의 삽입이 두 개의 포어 방법의 하나의 나노포어 또는 두 나노포어에 사용될 수 있다(문헌[Hall et al., Nat. Nanotech., 5(12):874-7, 2010]). 생물학적 포어가 이온 전류 측정의 감도를 증가시킬 수 있고, 오직 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드가, 예를 들어, 서열분석을 위해, 두 개의 포어 디바이스에서 포획되고 제어되는 경우에 유용하다.

두 개의 포어 디바이스를 이용하여 분자의 움직임 제어

디바이스의 포어에 존재하는 전압 때문에, 대전된 분자가 챔버들 사이의 포어를 통해 이동될 수 있다. 이동의 속도 및 방향이 전압의 크기 및 방향에 의해 제어될 수 있다. 또한, 두 전압의 각각이 독립적으로 조정될 수 있기 때문에, 대전된 분자의 움직임 및 속도가 각 챔버에서 정교하게 제어될 수 있다.

예를 들어, 디바이스가 양전하에 의해 대전된 두 분자를 제어 방식으로 혼합하도록 이용될 수 있다. 이를 위하여, 제1 분자가 상부 챔버에 초기에 적재되고, 제2 분자가 하부 챔버에 적재된다. 제1 포트의 제1 전압은 상부 챔버로부터 중간 챔버로 제1 분자의 움직임을 유도할 수 있다. 유사하게, 제1 전압의 반대 방향인 제2 전압은 하부 챔버로부터 중간 챔버로 제2 분자의 움직임을 유도할 수 있다. 반대 방향의 전압 때문에, 두 분자는 중간 챔버에 유지되어 서로 반응한다. 또한, 전압의 상대적 크기를 조정함으로써, 각 분자의 유입 속도가 제어 반응을 정교하게 조절하고 이끌 수 있다.

또다른 실시예는 대전된 폴리머, 예컨대 두 포어의 깊이와 두 포어 사이의 간격을 더한 결합된 거리보다 긴 길이를 가진 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 예를 들어, 1000bp dsDNA는 길이가 340nm 이하이며, 20nm 떨어져 있는 두 개의 10nm 길이의 포어에 걸쳐 있는 40nm보다 실질적으로 길 것이다. 제1 단계에서, 폴리뉴클레오티드는 상부 또는 하부 챔버 중 어느 하나 내로 로딩된다. 생리적 조건(~ pH 7.4) 하의 그것의 음 전하로 인해, 폴리뉴클레오티드는 전압이 인가되는 포어를 가로질러 이동할 수 있다. 따라서, 제2 단계에서, 두 개의 전압은 동일한 방향 및 동일하거나 유사한 정도로 포어에 인가되어 두 개의 포어를 순차적으로 가로지르는 폴리뉴클레오티드의 이동을 유발한다.

폴리뉴클레오티드가 제2 포어에 도달하는 시기 정도에, 하나 또는 두 개의 전압이 변할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 두 포어를 덮는 거리보다 길기 때문에, 폴리뉴클레오티드가 제2 포어에 도달하면, 그것은 또한 제1 포어에도 위치하게 된다. 따라서, 제1 포어에서의 전압의 방향의 신속한 변화는 폴리뉴클레오티드를 제2 포어에서 떨어트리는 힘을 생성할 것이다(도 1c에 도시).

이 시점에서, 만약 제1 포어에서 전압-유도된 힘이 제2 포어에서 전압-유도된 힘보다 작다면, 폴리뉴클레오티드는 제2 포어를 향해 두 포어를 가로질러 계속 이동할 것이지만, 그 속도는 낮을 것이다. 이와 관련하여, 폴리뉴클레오티드의 이동 속도 및 방향은 두 전압의 방향 및 정도에 의해 조절될 수 있음은 쉽게 이해된다. 이하에서 추가로 기술되는 바와 같이, 이러한 이동의 양호한 조절은 넓은 분야에 응용된다.

따라서, 일 측면에서, 포어를 통해 대전된 폴리머의 움직임을 제어하는 방법이 제공된다. 이 방법은 (a) 임의의 상기 구현예의 디바이스의 상부 챔버, 중간 챔버 또는 하부 챔버 중 하나의 대전된 폴리머를 포함하는 샘플을 적재하는 단계로서, 디바이스는 상부 챔버와 중간 챔버 사이의 제1 전압, 및 중간 챔버 및 하부 챔버 사이의 제2 전압을 제공하는 전원 장치에 연결되는, 단계; (b) 폴리머가 챔버들 사이에 움직이도록 초기의 제1 전압 및 초기의 제2 전압을 세팅하여, 제1 포어 및 제2 포어를 가로질러 폴리머를 위치시키는 단계; 및 (c) 제1 전압 및 제2 전압 둘다 중간 챔버로부터 대전된 폴리머를 당기는 힘을 생성하도록 제1 전압 및 제2 전압 조정하는 단계(전압-경쟁 모드)로서, 제어 상태 아래에서 두 전압의 크기가 상이하여 대전된 폴리머가 제어 방식 및 두 포어의 방향을 가로질러 이동하는, 단계를 수반한다.

단계(c)의 상기 전압-경쟁 모드를 확립하고자 하는 목적을 위해, 각 포어에서의 각 전압에 의해 가해지는 상대적인 힘이 사용되는 각 두개의 포어 디바이스에 대해 결정될 것이며, 이는 폴리뉴클레오타이드의 움직임(움직임은 이 가출원 명세서에서 후에 기술될 특징의 실시예를 이용하여 폴리뉴클레이타이드에서 위치 및 탐지가능 특징을 감지함으로써 측정될 수 있음)에 대한 상이한 전압 값의 영향을 주시함으로써 캘리브레이션 실험으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 힘이 각 공통 전압에서 동등한 경우에는, 그후 각 포어에서 동일한 전압 값을 (접지된 중간 챔버에 비하여 상부 및 하부 챔버의 공통 극성으로) 사용하는 것이 열교란(thermal agitation)(이하 기술될 브라운 운동의 존재 및 영향) 없이 제로 네트 움직임을 생성한다. 힘이 각 공통 전압에서 동등하지 않는 경우에는, 그후 동일하게 힘을 가하도록 달성하는 것은 공통 전압에서 더 약한 힘을 받는 포어에서 더 큰 전압의 사용 및 식별을 필요로 한다. 전압-경쟁 모드에 대한 캘리브레이션이, 각각의 두 개의 포어 디바이스에 대해 요구되며, 각 포어를 통한 특징이 힘에 영향을 주는 특정 대전된 폴리머 또는 분자에 대해 요구된다.

일 측면에서, 샘플이 상부 챔버로 적재되고, 초기 제1 전압이 상부 챔버로부터 중간 챔버로 대전된 폴리머를 끌어당기도록 설정되고, 초기 제2 전압이 중간 챔버로부터 하부 챔버로 폴리머를 끌어당기도록 설정된다. 유사하게, 샘플이 하부 챔버로 초기에 적재될 수 있다.

또다른 측면에서, 샘플이 중간 챔버로 적재되고, 초기 제1 전압이 중간 챔버로부터 상부 챔버로 대전된 폴리머를 끌어당기도록 설정되며, 초기 제2 전압이 중간 챔버로부터 하부 챔버로 대전된 폴리머를 끌어당기도록 설정된다.

일부 측면에서, 대전된 폴리머는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드이다. 특정 측면에서, 대전된 폴리머는 폴리뉴클레오타이드이다. 이에 한정되지 않는 실시예인 폴리뉴클레오타이드가 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 및 DNA-RNA 혼성체(hybrid)를 포함한다.

일 측면에서, 단계 (c)에서 조정된 제1 전압 및 제2 전압은, 두 전압 사이의 차이로서의 크기가 약 10배 내지 10,000배 높다. 예를 들어, 두 전압이 각각 90 mV 및 100 mV이다. 전압의 크기(-100 mV)는 그들 사이의 차이인 10 mV의 약 10배이다. 일부 측면에서, 전압의 크기가 그들 사이의 차이의 적어도 약 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 50배, 100배, 150배, 200배, 250배, 300배, 400배, 500배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 6000배, 7000배, 8000배 또는 9000배 높다. 일부 측면에서, 전압의 크기가 그들 사이의 차이의 약 10000배, 9000배, 8000배, 7000배, 6000배, 5000배, 4000배, 3000배, 2000배, 1000배, 500배, 400배, 300배, 200배, 또는 100배 이하로 높다.

일 측면에서, 단계 (c)에서 제1 전압 및 제2 전압에 대한 실시간 또는 온라인 조정이, 수백 메가헤르츠까지 매기는 클록에서, 전용 하드웨어 및 소프트웨어를 사용하여 능동 제어 또는 피드백 제어에 의해 수행된다. 제1 또는 제2 전압, 또는 둘다의 자동 제어는 제1 또는 제2 또는 둘다의 이온 전류 측정의 피드백에 기초한다.

두 개의 포어 디바이스를 이용한 분자의 분석

본 명세서의 두 개의 포어 디바이스는 포어에 인가되는 제어된 전압을 이용하여 디바이스 내에 유지되거나 움직에는 분자 또는 입자의 분석을 수행하는데 사용될 수 있다. 일 측면에서, 분석이 각 포어 또는 두 포어에서 수행된다. 각 전압-클램프 또는 패치-클램프 시스템이 각 포어를 통해 이온 전류를 측정하고, 이렇게 측정된 전류가 통과하는 대전된 입자 또는 분자의 존재, 또는 통과하는 대전된 입자 또는 분자와 연관된 특징을 검출하는데 사용된다.

위에서 기재된 것처럼, 폴리뉴클레오타이드는 동일한 방향을 가지는 두 전압에 의해 두 포어로 적재될 수 있다. 이 실시예에서, 일단 제1 포어에 인가된 전압의 방향이 반대가 되고, 신규 전압-유도된 힘의 크기가 제2 포어에 인가된 전압-유도된 힘보다 약간 낮게 되면, 폴리뉴클레오타이드는 동일한 방향으로 계속해서 움직일 것이나, 속도는 현저하게 낮을 것이다. 이 측면에서, 제2 포어 상에 전압을 공급하는 증폭기가 또한 제2 포어를 통해 통과하는 전류를 측정하고, 그후 이온 전류가 포어를 통해 통과하는 뉴클레오타이드의 식별을 결정하는데, 각각 상이한 뉴클레오타이드가 통과가 상이한 전류 특징(예컨대, 이온 전류 진폭의 이동(shift)에 기초함)을 일으키기 때문이다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드에서 각 뉴클레오타이드의 식별은 폴리뉴클레오타이드의 서열을 밝히게 된다.

일부 측면에서, 폴리뉴클레오타이드를 재-서열분석하기 위해 반복 제어 전달은 서열분석의 질을 더 향상시킨다. 각 전압이 각 방향으로의 제어 전달에 대해 더 크게 변경된다. 또한, 두 포어를 통한 두 전류가 개선된 정확도로 상관관계에 있을 수 있다는 것이 고려된다. 브라운 운동이 분자의 제어 전달에 영향을 끼치는 분자 움직임의 변동을 일으킬수 있다는 것이 고려된다. 그러나, 예를 들어, DNA 서열분석 동안, DNA의 반복 제어 전달 및 서열분석 측정의 평균으로, 이러한 효과가 축소되거나 회피될 수 있다. 또한, 대분자, 예컨대 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 제어 움직임에 대한 브라운 운동의 영향이, 특히 분자 내에서 장력을 생성하고, 대분자를 분리되도록 잡아당기는 힘을 경쟁시킬 때 상당할 수 있음이 고려된다.

이러한 방법은 종래발명에서 해결하지 못했던 문제에 대한 준비된 해결책을 제시한다.

예를 들어, 제어 전달 및 나오포어 서열분석에 요구되는 정교한 검지를 달성하는데 대한 두 가지 경쟁적인 장애가 있음이 알려져 있다. 하나는 포어에서 충분한 서열분석 감도를 제공하기 위해 비교적 고전압이 요구된다는 것이다. 반면에, 고전압은 포어를 통한 폴리뉴클레오타이드의 빠른 통과를 가능하게 하나, 각 뉴클레오타이드의 식별에 대한 충분한 시간이 가능하지는 않다.

특히, 나노포어 서열분석 플랫폼은 포어를 통한 폴리뉴클레오타이드의 통과율이 1 ms/nucleotide(nt) 이하로 제어될 것이 요구되나, 여전히 서열분석-감도 전류를 생성한다. 이는 전류 특성을 검출하기 위해 충분히 높은 신호-노이즈를 요구하나(고전압이 양호함), 측정을 보장하기 위한 포어를 통한 분자의 충분히 느린 움직임은 레코딩 대역폭 내이다(저전압이 양호함). 단일 포어 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드의 속도는 전압에 비례하고, 높은 전압일수록 감지에 유리하나, 폴리뉴클레오타이드의 속도를 감소시키기에는 불리하다: 폴리뉴클레오타이드 포획을 촉진하는 전압에서 비율이 1 ㎲/nt이거나 더 빠르다(1000배 더 빠름). 반면에, 더 낮은 전압은 감지 성능을 감소시키고, 또한 정확한 판독을 약화시키는 브라운 운동에 의해 야기되는 변동 비율의 상대적 기여를 증가시킨다.

본 명세서에 기재된 것 외에, 특정 나노포어 기술에만 사용되는 효소 또는 광학 또는 둘다를 수반하지 않는 장애들을 해결하기 위한 방법은 현재 존재하지 않는다.

몇몇 접근법이 저전압 하의 감지 능력의 결여와 연관된 문제점을 해결하도록 제시되어 왔다. 하나는 감도를 개선하기 위해 생물학적 나노포어를 제작하는 것이다. 또다른 것은, ssDNA의 뉴클레오타이드 사이의 간격보다 얇은 단일 시트로서의 그라핀 멤브레인을 사용하는 것이다. 또다른 것은, 나노포어에 인접하여 측정되는 보조 전류의 사용이다(예를 들어, 터널링(tunneling) 전류).

생물학적 나노포어는 제1 접근법에서 테스트되었다. a-헤몰라이신 나노포어가 연구에서 가장 통상적으로 사용되는 생물학적 포어이다. 연구는 a-헤몰라이신이 단일 중합체 및 그렇지 않으면 모든-핵염기 DNA 내의 무염기(1',2'-디데옥시) 잔기 내의 단일 뉴클레오티드 대체를 해결할 수 있다는 점을 보여주었다. 그러나, 단일 뉴클레오티드 감도는 야생형(WT) a-헤몰라이신을 가지는 이가 동의 DNA에서는 가능하지 않은데, 이런 DNA는 채널 내에서 10 뉴클레오티드 이하로 인해 영향받는 이온성 전류를 위한 것이다. a-헤몰라이신의 단백질 공학이 DNA 분석 및 염기서열 결정을 위한 그의 감도를 향상시키는데 사용되었다. 그러한 돌연변이 포어 하나가 네 개의 뉴클레오시드 5'-모노포스페이트 분자를 높은 정확도로 구별할 수 있는 공유 결합된 분자 어댑터를 가지는 a-헤몰라이신을 사용한다(문헌[Clarke et al., Nat. Nanotech, 4(4):265-70, 2009]). 그러나, 이 돌연변이 포어는 포어를 통과하는 온전한 이가 동의 ssDNA의 염기서열 결정을 위한 감도를 보이지 않는다.

또다른 예시적인 생물학적 포어는 MspA로서, 이는 깔대기 모양을 가지고 있으며, 채널의 바닥으로 향하는 이온성 전류의 감도에 초점이 맞춰져 있다. 또한, MspA 및 a-헤몰라이신을 통해 DNA의 비율 감소를 달성하는 것은 효소를 사용하여 이루어질 수 있다. 문헌[Manrao et al., Nature Biotechnology, 30:349-53, 2012]의 도 1에 도시된 바와 같이, DNA의 비율 감소는 MspA 나노포어 상에 놓여 있는 효소를 통해 달성된다. 그러나, 이는 비-결정론적인 감지 기간, 역추적에 의해 유발된 반복적인 판독 및 단일 중합체 영역을 감지해내지 못하게 되는 현상을 초래한다. 파이(phi)29 중합효소 매개된 DNA 자리 옮김의 메커니즘이 문헌[Cherf et al., Nat. Biotech., 30(4):344-8, 2012]에서 a-헤몰라이신에 대해 밝혀졌으며, 보다 민감한 MspA 나노포어에 대해 수행되었다(문헌[Manrao et al., Nature Biotechnology, 30:349-53, 2012]). 중합체화-촉매화된 자리 옮김의 순차적 비율은 2.5-40 nt/s인데, 이는 DNA 비율 감소 조건을 충족시키는 것이다. 그러나, 바이오포어 상의 효소가 자리 옮김 비율을 감소시키는 반면, 각각의 뉴클레오티드의 체류 시간에 대한 조절을 할 수 없었고, 이는 반복의 블라인드 트랙킹을 매우 어렵게 할 것이고, 단일 뉴클레오티드 판독 상의 장시간 멈춤으로부터 구별하는데 도전하게 할 것이다. 감도의 면에서, 문헌[Manrao et al., Nature Biotechnology, 30:349-53, 2012]의 도 3에 도시된 바와 같이, 반복적 DNA 템플레이트를 판독하는 것은 MspA 상의 파이29에 의해 달성될 수 있다. 도 (3a)는 반복되는 CAT 트리뉴클레오티드로 구성된 DNA 템플레이트에 대한 예시 추적을 보여주는데, 예외적으로 서열의 중간에 하나의 CAG 삼중선이 존재한다. *는 두 레벨 사이의 반복되는 전이로서 (인간 분석에 의해) 탐지되는 "토글(toggle)"을 나타낸다; 이는 효소에 기초한 조절 방법에 고유한 것이며 판독 오류를 일으킨다. 도 (3b)는 또한 공지된 DNA 서열에 나란한 레벨의 평균 전류를 사용한 (3a)의 이상화, 및 (3a)에 도시된 측정된 기간의 차이를 제거하는 것을 보여준다. 이상화는 단일 dG 치환에 의해 방해되는 세 개의 레벨의 반복되는 패턴을 보여준다. 네 개의 레벨이 단일 dG에 의해 치환에 가장 가까운 가장 큰 편차로 영향을 받는데, 이는 잔여 전류가 주로 4개 이하의 뉴클레오티드에 의해 영향을 받는다는 점을 시사한다. MspA를 통한 이온성 전류가 제한하는 구멍에 가장 가까운 4개 이하의 뉴클레오티드에 의해 영향을 받는다는 점은 서열을 확인하는데 있어 상당한 복잡성을 부가한다. 4⁴ = 256개의 조합 각각에 맵핑하는 분명한 전류 진폭의 라이브러리를 이상적으로 구축하는 반면, 업계에 제시된 바와 같이, 이러한 라이브러리를 달성하기는 어려울 것이다. 그 이유는 채널 전류 기록 내에서 단계 전이를 확인하는 것이 반-진폭 방법에 의한 2 이상의 신호 대 잡음 비(SNR)를 요구하기 때문이다(마르코프-기초 방법에 대해 SNR > 1.5). 기록 대역폭에서의 0.5 pA의 RMS 잡음에 의해, 증폭 이동은 요구되는 SNR을 갖기 위해 1 pA 이상이어야 하며, 이는 MspA에 의해 40 pH의 진폭 범위 내에서 40 이하의 탐지 가능한 레벨만을 초래한다(또는 SNR 1.5에서 53 이하의 레벨). 또한, 40 미만의 레벨이 관찰될 것인데, 이는 범위가 균일하게 사용되지 않고, 추가의 필터링이 잡음을 감소시켜 진폭 구별을 부가하는 동안 이미 존재하였던 보다 빠른 ssDNA 동작 전이를 보다 많이 소실시키기 때문이다.

현재, 이온 전류 감지가 핵산 서열분석에 대한 단일-뉴클레오타이드 감도를 제공할 수 있기 위한 나노포어는 존재하지 않는다. 여전히, 생물학적 포어 및 고상-상태 포어(그라핀)의 감도에 대한 개선이 활발히 계속 진행중인 연구 분야이다. 하나의 주제는 이온 전류 감지가 단일 중합체 영역(염기 반복)을 통한 진행의 직접 트랙킹을 허용하지 않는다는 것인데, 이는 포어를 통한 단일 중합체 ssDNA의 동작의 구별되는 뉴클레오티드 당 신호가 없기 때문이다. 트랙킹 반복은 필수적인데, 이는, 예를 들면, 특정 모노뉴클레오티드 반복(7, 9 nt)의 인간 미토콘드리아 DNA 내에서의 삭제 및 삽입은 여러 유형의 암과 연관되어 있다는 것이 밝혀졌기 때문이다(문헌[Sanchez-Cespedes, et al., Cancer Research, 61 (19):7015-7019, 2001]). 바이오포어 상의 효소가 자리 옮김 비율을 감소시킬 수 있지만, 각각의 뉴클레오티드의 체류 사간에 대한 조절이 불가능하다. 한편, 두 개의 포어 조절에 대해 일정한 전달 비율을 사용하면, 비-결정론적 멈춤이 제거되며, 반복 길이의 정확한 판단이 가능해진다. 반복 구획을 여러 번 재판독하는 것은 또한 판단 오류를 개선하고, 오차 범위를 확인할 수 있게 하며, 이는 효소에 의해 야기된 중합체화 화학을 뒤집을 필요 없이 이루어질 수 있다.

최근의 연구는, 단일 나노포어를 사용할 경우, 감소된 비율이 단순히 전압을 감소하는 것에 의해서는 달성될 수 없음을 보여줬다(문헌[Lu et al., Biophysical Journal, 101(1):70-9, 2011]). 대신에, 전압이 감소하면, 단일-가닥 DNA(ssDNA)의 비율이 보다 무작위가 되는데(역추적 포함), 이는 브라운 운동이 속도 오르내림에 대한 증가하는 기여자가 되기 때문이다. 연구는 또한, 이상화된 단일-뉴클레오티드-민감성 나노포어 센서를 사용하는 경우에도, 높은 전압 힘이, 그렇지 않으면 서열 결정 측정을 깨뜨릴 브라운 운동에 의해 유발된 속도 오르내림을 억제하기 위해 필요하다는 점을 보여준다.

본 명세서에서 제공된, 두 개의 포어 디바이스에 기초한 서열분석 방법은 현존하는 방법이 가지는 문제점을 해결한 준비가 되어 있으며, 현존하는 방법보다 추가의 장점을 제공한다. 고전압 또는 저전압에서 서열분석에 대한 충분한 감도를 가지는 하나 또는 두 개의 포어와 협력하여, 두 개의 포어 제어는 단일 나노포어 구현의 서열분석 속도 제어 문제점을 해결한다. 이러한 포어는 고상-상태 기질에 제공된 생물학적 포어, 고상-상태 기질을 가로질러 형성되는 멤브레인의 생물학적 포어, 또는 (예컨대, 그라핀, 실리콘, 또는 다른 기질의) 고상-상태 포어를 포함할 수 있다. 일 측면에서, MspA 같은 생물학적 포어 상의 파이29 같은 효소가 하나 또는 두 개의 포어에서, 서열 결정을 위한 큰 신호를 생성하기 위해 사용되는 높은 전압 및 효소를 각각의 포어의 맨 꼭대기에 잡아두고 중합체화-촉매화 DNA 동작을 가능하게 하기에 충분한, 하지만, 효소를 멈추게 하거나 분리시킬 정도로 크지는 않은 힘을 각각의 효소 상에 생성시키는 낮은 차동 전압과 함께 사용될 수 있다. 이러한 배열은 측정 신호를 현저히 증가시키고, 두 개의 포어가 동시에 하나의 스탠드의 DNA를 판독할 수 있게 하는 것에 의해 문헌[Cherf et al., Nat. Biotech., 30(4):344-8, 2012] 및 문헌[Manrao et al., Nature Biotechnology, 30:349-53, 2012]의 방법을 개선시킬 수 있다.

게다가, 본 명세서의 방법은 이온 전류 감지를 사용하는 포어에서 감도 검출을 보정하는 포어에서의 충분히 높은 전압을 생성할 수 있다. 고전압이 각 포어를 통한 항속을 충분히 보장하여 브라운 운동을 억제할 수 있다는 것은 타당하며, DNA 외곽 각 포어의 구성이 어느 하나의 방향으로 DNA의 움직임의 에너지론에 영향을 끼칠 것이다. 추가로, 상기 방법(도 1c)에서 이용된 전압 경쟁은, 분자가 포어에 충분한 시간을 들여서 분자의 분석을 가능하게 하도록 조절될 수 있다. 또한, 본 방법은 효소, 광학 또는 DNA의 부착에 대한 필요가 없다. 따라서, 상기 방법은 나노포어를 통한 높은 신호-노이즈 검출 전류를 제공하나, 단일 나노포어 구현에서 가능할 수 없는 분자 전달 속도, 능력을 규제할 수 있다.

상기 방법은 대전된 폴리머에서 단량체의 조성을 식별하는데 이용될 수 있다. 일 측면에서, 단량체 유닛은 폴리머가 단일 가닥 DNA 또는 RNA인 경우 뉴클레오타이드이다. 또다른 측면에서, 단량체 유닛은 폴리머가 이중 가닥인 경우 뉴클레오타이드 쌍일 수 있다.

일 측면에서, 상기 방법은. 특히 결합 분자가 대전된 경우, 폴리머, 예컨대 단량체로 결합된 분자로의 변경을 식별하는데 이용될 수 있다. 결합 분자는 대전되지는 않지만, 심지어 중성 분자가 그 크기를 이용하여 이온 전류를 변경할 수 있다.

또다른 측면에서, 상기 변경은 분자의 폴리머로의 결합을 포함한다. 예를 들어, DNA 분자에 있어서, 결합 분자는 DNA-결합 단백질, 예컨대, RecA, NF-κB 및p53일 수 있다. 또다른 측면에서, 변형은 특정 단량체 또는 조각에 결합하는 입자이다. 예를 들면, 유전형 또는 DNA 맵핑을 위한 특정 DNA 부위에 결합된 양자 점 또는 형광 표지가 장치에 의해 탐지될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 장치는 제한 없이 유전형 및 DNA 맵핑을 위한 저렴한 방법을 제공한다.

일 측면에서, 폴리머는, 폴리머의 일 단부에서 고상의 지지체, 예컨대 비드(bead)와 부착된다.

또한, 일 구현에에서, (a) 임의의 상기 구현예의 디바이스의 상부 챔버에 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 샘플을 적재하는 단계로서, 상기 디바이스는 상부 챔버와 중간 챔버 사이의 제1 전압, 및 중간 챔버와 하부 챔버 사이의 제2 전압을 제공하는 전원 장치에 연결되고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 고상 지지체와 상기 폴리뉴클레오타이드의 일 단부에 선택적으로 부착되는, 단게; (b) 초기 제1 전압 및 초기 제2 전압을 폴리뉴클레오타이드가 상부 챔버로부터 중간 챔버로, 그리고 중간 챔버로부터 하부 챔버로 이동하도록 설정하여, 폴리머가 제1 포어 및 제2 포어 둘다를 가로질러 위치하는 단계; (c) 제1 전압 및 제2 전압이 둘다 폴리뉴클레오타이드를 중간 챔버에서 떠나도록 끌어당기는 힘을 생성하도록 제1 전압 및 제2 전압을 조정하는 단계로서, 폴리뉴클레오타이드가 하나의 방향으로 제어 방식으로 두 포어를 가로질러 이동하도록, 상기 두 전압의 크기가 상이한 제어 조건 하인, 단계, 및 (d) 뉴클레오타이드가 포어를 통과하는 경우 포어를 가로지르는 이온 전류를 측정함으로써, 포어 중 하나를 통해 통과하는 폴리뉴클레오타이드의 각 뉴클레오타이드를 식별하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 서열분석을 결정하는 방법을 제공한다.

실시예

본 기술은 다음의 실시예를 참조하여 또한 규정된다. 맥락 및 방법에 대한 다양한 변경이 현재 발명의 범위에서 벗어나지 않는한 실시될 수 있음은 이 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

실시예 1. 포어에서 개별 dsDNA 분자의 포획 및 제어

이 실시예는 두 개의 포어 디바이스에서 각 포어로의 DNA의 포획이 각각의 독립된 이온 포어 전류에서 측정된 이동으로서 손쉽게 검출된다는 것을 보여준다.

이 실시예는 일 단부에 부착되는 비드가 있든지 없든지 dsDNA를 사용한 이중-포어 포획을 입증한다. 비드-한계(bead-tethered) ssDNA를 이용한 실험도 분석될 수 있다.

DNA의 포획 및 지연에서, 비드에 가장 근접한 포어 전압(챔버 A로부터 포획된 경우의 도 1a의 V₁)은, DNA 상의 경쟁 힘이 그것을 챔버 A 쪽으로 후퇴시킬 때까지 반전되거나 증가될 수 있다. 어느 한 포어의 이온 전류가 상기 실험 동안 DNA의 포획 및 방출을 손쉽게 검출 할 수 있다.

비드가 사용되는 경우, 상기 비드는, 비드가 어느 한 포어 또는 두 포어를 통과하는 것을 방지하는 적당한 크기를 가진다. 1 대 1의 비드-DNA 비율을 보장하는 방법이 이 분야에서 개선되어 왔다. 예를 들어, 비오틴화 DNA 이중(또는 ssDNA)에 결합된 1가 스트렙타아비딘-코팅된(streptavidin-coated) 양자점(QDs; QD655, Invitrogen)은 20-30nm 직경 범위인 비드를 제공할 수 있고, 금 입자 또는 라텍스를 사용하여 더 큰 비드(30-100nm)가 가능하다. 비드는 포획 속도와 관련있기 때문에, 실험을 고안하는데 있어서 유체역학 및 전하에서의 비드의 영향이 고려될 것이다.

비드 없이, dsDNA는 0.1 ms/kbp 이하로 포어를 통해 통과한다. 500bp 및 4kbp 길이의 DNA, 및 λ-파지(λ-phage) dsDNA 분자(48kbp 이하)가 사용될 수 있다. DNA 샘플이, 챔버 A로부터 챔버 B를 통해 통과하여 챔버 C로의 포획을 증진시키기 위해 각 포어에 대한 공통 전압 극성을 사용하여, 챔버 A로부터 두 포어로 전달될 수 있다(도 1a). dsDNA의 상당한 지속 길이(1 쿠운 길이(Kuhn length)는 100nm임)는 각 포어 내에 있는 DNA 부분이 완전히 연장되고 막대형이라는 것을 보장한다. 전압 및 이온 농도는 적절한 포획 속도를 식별하기 위해 달라질 수 있다. 각 포어에서 DNA의 존재를 나타내는 컨덕턴스 이동 값, 및 속도를 개선하거나 변경하기 위해, 각 챔버에서 상이한 완충 이온 농도도 사용될 수 있다.

직경이 10nm 이상의 나노포어의 사용으로 dsDNA와 나노포어 벽 사이의 상호작용(예컨대, 마찰 또는 교착)이 감소된다. 더 큰 포어에서는, dsDNA가 펼쳐진 구조 및 접힌 구조로 포획될 수 있다 할지라도, 더 높은 전압과 더 짧은(≤3kbp) dsDNA에서 일렬(펼쳐진) 구조일 것이다. 500nm 이하의 인터-포어 간격에서는, 1M의 KCl에서 적어도 200mV의 전압에 대하여, 이중-포어 포획, 그 다음의 제1 포어에서의 포획(챔버 A 및 B의 사이)의 확률이 매우 높다는 것이 고려된다.

전압 영향이 방사 간격 내에 열확산에 두드러져서, 고 확률의 포획을 유도하며, 적어도 4kbp 길이의 dsDNA(문헌[Gershow and Golovchenko, Nature Nanotechnology, 2:775-779, 2007])를 가지고 포어 크기(6-15nm 직경), 전압(120-500mV)의 범위에 대하여, 이 방사 간격은 적어도 900nm(인터-포어 간격보다 큼)로 추정되어 왔다. 이러한 발견은 신속한 dsDNA의 이중-포어 포획, 그 다음의 상기 dsDNA의 단일(제1) 포어 포획의 고 확률을 뒷받침한다.

두 개의 포어를 통한 DNA의 포획 및 제어는 능동형 제어 하드웨어 및 실시간 알고리즘으로부터 이익을 얻을 수 있다. 발명자들은 DNA 제어에 대한 능동형 제어 하드웨어/소프트웨어를 개발해 왔다. 예를 들어, 문헌[Gyarfas et al, Biophys. J., 100:1509-16, 2011], 문헌[Wilson et al., ACS Nano., 3(4):995-1003, 2009], 및 문헌[Benner et al., Nat. Nanotech., 2(11):718-24, 2007]을 참조하라. 유용한 소프트웨어는, 필드 프로그램형 게이트 어레이(field-programmable gate array, FPGA) 시스템(PCI-7831 R, 내셔널 인스트루먼트(National Instruments))으로 구현된, LabVIEW 소프트웨어(텍사스, 오스틴, 내셔널 인스트루먼트, 버전 8)이다. 참조된 FPGA는 동시에 4개까지의 증폭기를 제어할 수 있다. 또한, PC로 데이터를 디지털화하고 로그화하도록 사용되는 엑손 디지데이터 1440A 데이터 획득 시스템(Axon Digidata 1440A Data Acquisition System)은, 8개까지의 병렬 증폭기에 대한 전압 및 전류를 충분히 기록하도록, 16개의 입력 채널을 구비한다. 실시간 제어 및 측정을 위해 하드웨어/소프트웨어와 협력하는 다른 실시간 작동 시스템도, 증폭기를 제어하고, 데이터를 디지털화하고 로그화하도록 사용될 수 있다.

발명자들은 멀티-채널 디바이스 및 작은 공간의 하나 이상의 나노포어의 사용을 기능화하고 최적화하기 위해 "나노클램프"라는 저-노이즈 전압-클램프 증폭기를 또한 개발해 왔다(문헌[Kim et al., IEEE Trans. On Biom. Circ. And Syst. In press, May 2012], 문헌[Kim et al., Elec. Lette., 47(15):844-6, July, 2011], 및 문헌[Kim et al., Proceedings of the IEEE International SoC Design Conference (ISOCC), November, 2010] 참조). 임의의 다른 상업적 벤치-탑(bench-top) 전압-클램프 또는 패치-클램프 증폭기, 또는 집적 전압-클램프 또는 패치-클램프 증폭기가 두 개의 포어 제어 및 측정을 위해 사용될 수 있다.

다양한 고상-상태 포어 재료 및 직경에 대하여, 0.1-10kbp는 전위시키기 위해 1ms 이하를 취한다. FPGA-제어 증폭기에서, 1kbp DNA의 전체 통과 시간 1ms 보다 훨씬 빠른 0.020ms 내에 포획을 검출하고전압 제어 경쟁을 개시할 수 있다. 따라서, (비드 부착 없이) DNA 탈출 전에 제어 방법을 트리거할 확률이 높다. 제어의 입증으로서, 포어로부터 분자의 방출, 방향, 시간이 경쟁하는 전압 사이의 차이 및 크기의 기능으로서 입증될 수 있다(도 1c). 단일 포어 실험에서, 포어를 통한 긴 dsDNA(>1 kbp)의 속도의 상당한 변동이 실험상 관찰되며, 이러한 변동이 너무 상당하여 확산 브라운 운동에 기여한다. 문헌[Lu, et ai, Biophysical Journal, 101 (1):70-79, 2011]에서, 최종 속도(net velocity) 변동의 우세한 자원(예컨대, 총 통과 시간에 의해 분할된 DNA 길이)은, 인력의 전압 범위가 연장되는 포어의 부분에 더하여, 포어에서 아직 DNA의 부분에 영향을 미치지 않는 전압에 의해 유도된 점성항력(viscous drag) 때문인 것으로 모델이 되었다. 합리적인 실험 데이터가 모델에 일치되었다. 특히, dsDNA의 질량 중심이 포획시 포어와 동일 선형(colinear)이라면, 최종 속도는 더 빠르다. 그러나, 상기 질량 중심이 포어로부터 상쇄된다(offset)면, 최종 속도는 더 느리다. 전압 경쟁이 두 개의 포어 디바이스에 관여하는 경우, 전압 차가 상당히 높지 않다면, dsDNA 속도는 점성-저항-유도된 교란(viscous-drag-induced perturbation)에 의해 영향받지 않을 것이다. 이는 두 포어를 통한 dsDNA 포획과 경쟁 전압이 관여한 이후에, 포어 사이의 dsDNA가 완전히 연장되고 막대형이 되어서, 한 내부 포어 입구에 가까운 구조를 형성하는데 관여할 수 없기 때문이다. 반면에, 포어의 외부 면 상의 dsDNA 구조는 중간 채널로부터 각각의 국부 포어 전압에 의해 계속적으로 강제되고, 따라서 포어 입구 동역학(kinetics)이 틀렸음을 입증할 가능성이 적다. 그러한 구조는 제어된 전달 동력학에 영향을 줄 것이며, 캘리브레이션 실험이 이를 수량화하도록 사용될 수 있다.

랜덤의 횡방향 DNA 움직임에 의해 유도된 힘 불확실성이 최소일 것이다. 게다가, 전압 힘은 DNA 움직임의 반대 방향으로 전기삼투 흐름(electroosmotic flow, EOF)을 야기하고, DNA가 유도된 반대 이온 흐름이 존재하지 않는 경우보다 더 느리게 움직이도록 한다. 분자의 상이한 방사상 위치가 나노포어에서 상이한 EOF 필드를 일으킬 수 있기 때문에, 한가지 논점은 효과적인 전하 밀도 여부이며, 따라서 최종 구동 힘이 속도 변동을 유도하기 위해 DNA 방사상 위치에서 변동 동안 충분히 변한다. 1M KCl의 DNA의 효과적인 전하 밀도는 포어 벽과 DNA 사이의 1nm 이상의 간격에 대해 안정적이다.

게다가, SiN 나노포어는 본질적으로 DNA를 밀어내는 음 표면 전하를 가진다. 따라서, 분자가 방사상 위치 변동을 받는다 할지라도, 몇 나노미터보다 더 큰 직격을 가진 SiN 포어를 사용하여, 각 정전압 값이 두 포어의 각각에 일정한 효과적인 힘을 야기할 것이며, 따라서, 두 개의 포어 설정에서 두 경쟁 전압을 사용하는 경우 더 큰 힘의 방향으로 정속도가 가능할 것이다. 다른 재료 표면의 처리로 SiN과 비교할만한 효과를 제공할 수도 있다.

브라운 운동을 야기하는 랜덤의 횡방향 DNA 움직임에 의해 유도된 속도 불확실성이 경쟁 전압을 증가시킴으로서 감소될 수 있다. 감소되는지 여부를 판정하도록 실험이 이루어질 수 있다. 단일-나노포어 연구(문헌[Lu, et al., Biophysical Journal, 101(1):70-99, 2011])는 경쟁 힘의 증가가 브라운 운동에 의해 야기되는 불확실성을 감소시킬 수 있다는 것을 뒷받침한다. 이 연구는 빠른(나노초) 시간 범위에서 일어나는 브라운 운동에 의해 야기되는 속도 변동, 및 그러한 변동으로부터 야기되는 서열분석 오류를 분석하였다. 가설의 이상적인 단일-뉴클레오타이드 센서(>22 MHz인 대역폭에서 노이즈 없는 검출)을 가정하면, 브라운 운동은 75% 판독 오류를 일으킨다. 오류를 예측하는 관련 파라미터는 k_BT/F^*(0.34nm)이며, 이는 뉴클레오타이드 사이의 DNA 간격(0.34nm)을 전위시키는 열에너지의 비율이다. 이 비율에서, 힘(F=Vλ)은 전하 밀도 λ(dsDNA에 대해 0.2 e^-/bp)로 DNA를 구동하는 전압 V이다. 현재의 제어 방법에서는, 전압의 50배 증가가 오류를 더 개선하는 고 전압으로 5% 판독 오류를 일으킨다. 그러나, 단일 포어에서, 평균 속도(

)가 F^*d/(k_BT)이며(확산 상수 d임), 서열분석 대역폭에 대한 더욱 비현실적인 요구를 두어, DNA 속도는 F로 증가한다.

22MHz 대역폭을 유지하기 위해, 단일 나노포어에서 힘의 50배 증가는 동일한 평균 속도(

)를 유지하기 위해 용액 점도의 50배 증가와 병행되어야 할 것이다. 그러나, 사실상, 22MHz 대역폭은 이미 임의의 실험의 나노포어 플랫폼이 입증되었거나, 단일-뉴클레오타이드 서열분석에서 입증될 확률이 있는 것보다 훨씬 더 높다. 게다가, 점도의 증가는 단일 나노포어에서 오직 10배까지 DNA를 늦출 수 있다(문헌[Fologea, et al., Nano Lett., 5(9):1734-7, 2005]). 두 개의 포어 플랫폼을 사용하여, 각 전압이 충분히 높게 유지될 수 있고, 이는 브라운 운동에 의해 유발되는 변동을 억제시킬 수 있으나, 최종 DNA 속도를 판정하는 차동 전압이 제어율이 실제 서열분석 대역폭(명목상 1kHz) 내에 있음을 보장하도록 조정될 수 있다. 속도 변동을 유도하는 브라운 운동을 억제하는 대안의 방법은 피드백 제어를 사용하는 것이다. 일 측면에서, 10kHz 대역폭에서 제1 포어 전압의 작용에 대한 제1 포어 전류 피드백의 10kHz 대역폭에서, 브라운 운동이 이러한 kHz 폐-루프 대역폭에서 제1 포어 내에, 그리고 가까이에 유지되는 DNA의 검출가능한 특징을 제어하도록 보상될 수 있다. 이 능력은 두 공간적 차원에서의 브라운 운동을 억제하고 Hz 폐-루프 대역폭에서 분자에 부착된 비드의 광학 힘에 의해 동작하는 안티-브라운 동전기(anti-Brownian electrokinetic, ABEL) 트랩에 대한 일차원 아날로그이다(문헌[Wang and Moerner, ACS Nano, 5:5792-9, 2011]).

실시예 2. DNA 에 결합된 RecA 필라멘트의 검출 및 위치측정

이러한 실시예는 두 개의 포어 디바이스가 dsDNA에 대한 DNA-결합 단백질의 결합을 보여주도록 사용될 수 있음을 보여주며, 단백질은 특이 서열에 결합되거나 결합되지 않는다.

실시예 1에서 입증되는 바와 같이, DNA 샘플이 챔버 A로부터 포획될 수 있다. RecA 단백질은 손상된 DNA를 손상없는 DNA의 상호보완 영역과 짝을 지어주는 ATP-의존적인 DNA 가닥-교환 작용의 촉매 작용을 한다. 저조한 가수분해형 ATP 아날로그식 APT γS를 사용하여, 먼저 생리적 염에 결집된 경우, dsDNA에 결합된 RecA 필라멘트가 높은 염 농도(예컨대, 1M KCl)에서 매우 안정적이다. 천천히 가수분해되는 ATPγS의 대안으로서, 이러한 실시예는, 전혀 뒤집히지 않고, RecA가 DNA에 더 단단하게 결합하도록 하는, ADP-AlF4(알루미늄 테트라프루오라이드)를 사용할 수도 있다.

20-30nm 나노포어를 통한 λ-DNA에 결합되는 RecA 필라멘트의 검출이 입증되어 왔다(문헌[Kowalczyk et al., Nano Lett., 10(1):324-8, 2010]; 문헌[Smeets et al., Nano Lett, 9(9):3089-95, 2009]; 및 문헌[Hall et al. Nano Lett, 9(12):4441-5, 2009]). 그러나, 20bp 보다 작은 길이의 필라멘트(6 또는 더 작은 RecA 단백질)는, 전위율 및 측정 SNR 간의 결합 때문에, 단일 나노포어를 사용하여 해결될 수 없다.

이 실시에의 초기 실험은, 거의 피복되지 않은, 부분적으로 피복된, 그리고 완전히 피복되는 DNA를 생성하기 위해, RecA의 농도를 변화시키도록 노출되어 온 비드-결합 및 비결합 λ-DNA을 사용한다. 각 포어 전류의 실시간 모니터링이 제어된 전달의 게이지 진행에 사용될 수 있고, 필라멘트의 위치 매핑을 위해 상관될 것이다. 각 DNA의 반복되는 측정이 RecA 맵핑의 정확도를 개선할 것이다.

RecA가 DNA에 결합되는 경우, 추가된 전하 및 벌크, 및 높은 염 농도에서의 감도가 제안된 기구로 제어 전달 동안 검출 및 위치 매핑을 시도하는 이상적인 후보가 된다.

RecA-결합 DNA의 제어는 전위를 막도록 부착되는 비드 없이도 시도될 수 있다. 실시예 1의 dsDNA 실험에서와 같이, 능동 전압 제어가 DNA가 나노포어를 빠져나오기 전에 경쟁적인 전압 제어를 지체 없이 개시하도록 사용될 수 있다. DNA에 결합되는 대전된 종이 전기장에서 DNA의 운동에 영향을 미치기 때문에, 최종 전하 및 DNA의 강도를 변경함으로써, 실험을 조율하는 운동 제어가 dsDNA의 움직임을 제어하도록 하용되는 힘 균형 상에서 dsDNA에 결합된 RecA의 영향을 검사할 수 있다.

이 실시예는 낮은 RecA 농도에서 가장 짧은 관찰된 필라멘트 길이가 높은 SNR 및 충분히 늦고 제어된 속도에서 측정될 수 있어서, 고립되어 결합된 임의의 RecA 단백질이 존재한다면 검출될 수 있다는 것을 입증할 수 있다.

그러므로, 두 개의 포어 디바이스는 기본 연구에서 완전히 신규한 단일-분자 기구를 제공하며, RecA-DNA 필라멘트에 추가의 단백질 결합을 검출하는 능력을 검사할 수 있기 때문이며, 필라멘트 폭을 증가시켜서 실측 전류의 감소에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, RecA-DNA 필라멘트에 결합된 단백질은, 셀의 상태를 감지하고 다운스트림 규제 이벤트를 스위치 온하거나 스위치 오프하는 RecA를 사용하는, LexA 및 박테리오파지 람다 억제제를 포함한다.

캘리브레이션 실험이 DNA 상의 특이적 서열(위치)에 결합되는 단백질을 검출하는 것을 수반하여, 그후 전류의 단백질-유도된 이동이 포어를 통한 DNA의 속도 제어 성능의 평가를 가능하게 할 것이다. dsDNA 상의 특이적 사이트에 결합되는 실시예의 단백질은 Lac 억제제(21bp 세그먼트에 결합됨), 파지 람다 억제제(λ-DNA 상의 다수의 작동 사이트를 가짐), 및 다른 단백질을 포함한다.

실시예 3. 단일-가닥 DNA 내의 이중-가닥 세그먼트의 검출 및 위치측정

이 실시예는 다양한 길이의 이중-가닥을 가진 10kb까지의 ssDNA의 생산을 입증한다.

제1 단계에서, 10kbp dsDNA가 긴 범위 PCR에 의해 형성될 수 있다. 가닥의 일 단부가 비드 부착을 위해 비오틴화되고, 가닥은 화학적 변성에 의해 분리된다. 그후 두 개의 포어 실험에서 비드없는 10kb ssDNA가 측정된 가닥으로서 제공된다. 원하는 크기의 상호보완의 단일-가닥 세그먼트가 PCR에 의해 형성될 수 있고, 뒤이어 비드 포획 및 가닥 분리가 따른다.

다양한 길이이고 측정된 10kb ssDNA 내의 복수의 사이트에서의 ssDNA 세그먼트가, 100nt 세그먼트의 세트로 시작하여 사용될 수 있다. 문헌[Skinner et al., Nano Lett., 9(8):2953-60, Jan 2009]에서, 단일 고상-상태 포어를 통한 이온 전류가 ssDNA 호모폴리머, 및 푸린 및 피리미딘 호모폴리머로부터 dsDNA를 차별화하도록 사용되었다. 따라서, 두 개의 포어 디바이스를 사용하는 충분히 높은 전압에서 DNA에서의 이중 가닥 세그먼트로부터 단일 가닥 세그먼트를 차별화하는 확률이 높다. ssDNA를 dsDNA 세그먼트에 매핑시키는 것이 나노포어가 혼성-지원형(hybridization-assisted) 방법을 사용하여 서열분석하도록 하며(제안되는 이 방법이 높은 비용의 혼성-지원형 프로세스에 의존한다 할지라도), 긴 간격을 걸쳐 타겟 DNA 서열분석의 위치 및 식별을 밝히는데 사용될 수 있다. 또한, 단일 가닥 DNA 결합(SSB) 단백질의 사용을 분석할 수도 있다. 비드는, ssDNA에 결합하여 dsDNA보다 더 큰 임피던스를 형성함으로써, 이온 전류에서 ssDNA와 dsDNA 간의 차를 더 증폭시킬 것이기 때문이다.

실시예 4. 긴 ssDNA 의 포획 및 제어, 및 RecA 의 위치 측정

이 실시예는 ssDNA에 결합된 RecA 필라멘트의 검출 및 위치측정, 및 긴 ssDNA의 포획 및 제어를 입증한다. 게다가, 두 개의 포어 디바이스가 ssDNA 내의 퓨린 대 피리미딘 호모폴리머의 세그먼트를 검출할 수 있음을 보여준다.

20nm의 SiN 멤브레인에 있는 10nm의 포어를 통해 7kb의 ssDNA의 확률론적 풀기(Stochastic detangling)가 문헌[Stefan et al., Nano Lett., 10:1414-20, 2010]에 나타난 바와 같이 수행될 수 있다. 상기 문헌의 단일-나노포어 방법은 복잡한 ssDNA와 포어/멤브레인 표면 간의 기계적 접촉력에 의해 ssDNA를 푸는 반면, 각 포어에 가장 가까운 DNA 중추 상의 각 전압 힘의 작동에 의해, 이중-포어 경쟁 전압 설정이, ssDNA가 충분히 높은 경쟁 전압에서 포어 사이에서, 그리고 그 가까이에서 풀어지도록 전기영동으로 힘을 가할 수 있음이 고려된다.

두개의 포어 설정을 통해 ssDNA를 풀고 후속하여 속도를 정밀하게 제어하는 것이 긴 ssDNA 분자의 최종의 서열분석에 중요하다. 상당히 높은 전압(400mV 이하)에서, ss-DNA 내의 푸린 및 피리미딘 호모폴리머 세그먼트를 구별하는 것이 가능하며(문헌[Skinner et al., Nano Lett., 9(8):2953-60, Jan 2009]), 이는 진단 응용 및 가능한 암 연구에도 가치가 있다.

본 실시예는 또한 RecA, 또는 아마도 다른 단일 가닥 DNA 결합(SSB) 단백질의, ssDNA에 결합하고 보다 큰 임피던스를 생성하는 것에 의해 ssDNA 이온성 전류와 구별될 수 있는 탐지 가능한 "과속 방지턱"으로서의 용도를 조사한다. 이 ㄱ고과속 방지턱은 가능한 조절된 ssDNA 속도의 직접적 정량화를 가능하게 할 것이며, 이어서 요구되는 1ms/nt가 달성될 수 있다는 것을 보여줄 것이다. RecA가 특정 트리뉴클레오티드 서열 부위에 결합될 것이 요구되지는 않지만 우선적으로 TGG-반복 서열에 결합하고 또한 RecA 필라민트가 이미 형성된 곳에 결합하려는 경향이 있기 때문에, 보정 실험은 특정 공지 서열 위치에 결합하는 다른 ssDNA 결합 분자의 사용을 필요로 할 것이다. 각각의 포어를 통과할 때 탐지 가능한 공지된 결합 부위를 가지는 것이 경쟁하는 전압 값의 기능으로서의 분자의 속도를 결정하는데 필요하다. 비제한적 예는 하나 이상의 공지된 부위에 혼성화된 이중 가닥(또는 비드-포획된 이중 가닥)을 사용하는 것이다. 이로부터 전류 내의 이동이 각각의 포어를 통한 각각의 이중 가닥의 통로를 탐지하는데 사용된 후, 선택된 전압 값에 대한 가닥 통과 속도를 추정할 수 있다. 그 후, RecA 필라멘트가 형성되고 이러한 분자 상에서 검출될 수 있으며, RecA 필라멘트가 탐지될 수 있는 것에 상대적으로 기준 탐지 지점으로서 이중 부분을 유지하고, 그들의 위치를 추론할 수 있다.

dsDNA 내로 형광 표지를 혼입하는 것에 의해 단상형 유전자를 결정하는 방법 및 DNA 맵핑 방법(문헌[Xiao, et al., Us patent no. 7771944 B2, 2010]) 역시 두 개의 포어 장치를 사용할 수 있는데, 이는 비드 표지(예를 들면, 양자 점, 또는 임의의 형광 표지)가 보다 벌키하며, dsDNA 상에서의 결합 단백질이 하는 것과 마찬가지로 전류 내에서의 이동을 생성할 것이기 때문이다. 또한, 두 개의 포어 방법은 고 해상도 영상화 방법(즉, 전반사 형광 현미경 검사)를 사용하는 것보다 라벨 위치를 탐지하고 맵핑하는데 있어 간단하고 훨씬 저렴하다. 조절된 전달 동안 브라운 운동에 의해 야기되는 임의의 속도 오르내림이 보다 작은 부분을 탐지하는 것보다는 보다 큰 부분(단백질, 이중 부분, 비드 부착)을 탐지하는데 있어서 덜 유해하다는 것도 주목해야 한다.

본 발명이 상기 구현예들로서 설명되었지만, 상기 기재 및 실시예들은 본원 발명을 설명하기 위한 것이지 그를 제한하기 위한 것이 아님이 이해될 것이다. 본원 발명의 범위 내의 다른 구현예, 장점 및 변형이 본원 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

Claims

상부 챔버, 중간 챔버 및 하부 챔버를 포함하고,
상기 상부 챔버가 제1 포어를 통해 상기 중간 챔버와 교류하고, 상기 중간 챔버가 제2 포어를 통해 상기 하부 챔버와 교류하고,
상기 제1 포어 및 상기 제2 포어는, 직경이 약 1nm 내지 약 100nm이고, 서로 약 10nm 내지 약 1000nm 이격되어 있고,
각각의 챔버는 전원 장치에 연결되는 전극을 포함하는,
디바이스
제1항에 있어서,
상기 제1 포어 및 상기 제2 포어가 실질적으로 동축인, 디바이스.
제1항 또는 제2항에 있어서,
실리콘, 질화규소, 이산화규소, 그라핀, 탄소 나노튜브, Ti0₂, Hf0₂, Al₂0₃, 금속층, 유리, 생물학적 나노포어, 생물학적 포어 삽입구를 가지는 멤브레인, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 재료를 포함하는, 디바이스.
제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 포어 및 상기 제2 포어는 깊이가 약 0.3nm 내지 약 100nm인, 디바이스.
제1항 내지 제4항의 어느 한 항에 있어서,
상기 전원 장치는 상기 상부 챔버와 상기 중간 챔버 사이의 제1 전압, 및 상기 중간 챔버와 상기 하부 챔버 사이의 제2 전압을 제공하도록 구성되며, 상기 제1 전압 및 상기 제2 전압은 독립적으로 조정가능한, 디바이스.
제5항에 있어서,
상기 제1 전압은 상기 제2 포어를 가로지르는 측정된 이온 전류에 기초하여 조정되는, 디바이스.
제6항에 있어서,
상기 전원 장치는 각각의 상기 제1 전압 및 상기 제2 전압을 생성하는 전압-클램프 시스템 또는 패치-클램프 시스템을 포함하는, 디바이스.
제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 중간 챔버가 두 전압에 대하여 접지되도록 조정되는, 디바이스.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 중간 챔버는, 중간 챔버에 있는 전극 및 각 포어 사이의 컨덕턴스를 제공하는 매질(medium)을 포함하는, 디바이스.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전원 장치는 각 포어를 통하는 이온 전류를 측정하도록 더 구성되는, 디바이스.
상부 챔버, 중간 챔버, 하부 챔버, 및 각각의 챔버에 있는 전극을 포함하고,
상기 상부 챔버는 제1 포어를 통해 상기 중간 챔버와 교류하고, 상기 중간 챔버는 제2 포어를 통해 상기 하부 챔버와 교류하고, 상기 제1 포어 및 상기 제2 포어는, 직경이 약 1nm 내지 약 100nm이고, 서로 약 10nm 내지 약 1000nm 이격되어 있고,
상기 전극은, 전압을 인가하는 전압-클램프 또는 패치-클램프 시스템에 연결하고, 각각의 포어를 통하는 이온 전류를 측정하기 위한 것으로, 상기 중간 챔버에 있는 전극은 두 개의 전압-클램프 또는 패치-클램프 시스템의 공통 접지에 접속되는,
디바이스.
포어를 통한 대전된 폴리머의 이동을 제어하는 방법에 있어서,
(a) 제11항에 따른 디바이스의 상기 상부 챔버, 상기 중간 챔버, 또는 상기 하부 챔버 중 하나에 대전된 폴리머를 포함하는 샘플을 적재하는 단계로서, 상기 디바이스가 상기 상부 챔버와 상기 중간 챔버 사이의 제1 전압, 및 상기 중간 챔버와 상기 하부 챔버 사이의 제2 전압을 제공하는 전압-클램프 또는 패치-클램프 시스템에 접속되는, 샘플을 적재하는 단계;
(b) 상기 폴리머가 챔버 간에 이동하도록 초기 제1 전압 및 초기 제2 전압을 설정하여, 상기 폴리머가 상기 제1 포어 및 상기 제2 포어 둘다를 가로지르도록 위치시키는 단계; 및
(c) 상기 제1 전압 및 상기 제2 전압이 대전된 폴리머를 상기 중간 챔버에서 떠나서 끌어당기는 힘을 생성하도록 상기 제1 전압 및 상기 제2 전압을 조정하는 단계로서, 상기 대전된 폴리머가 한 방향으로 제어된 방식으로 두 포어를 가로질러 이동하도록 두 전압이 크기가 상이한 제어 조건 하에 있도록 하는, 조정하는 단계
를 포함하는, 대전된 폴리머의 이동을 제어하는 방법.
제12항에 있어서,
상기 샘플이 상기 상부 챔버로 적재되고, 상기 초기 제1 전압이 상기 상부 챔버로부터 상기 중간 챔버로 상기 대전된 폴리머를 끌어당기도록 설정되고, 상기 초기 제2 전압이 상기 중간 챔버로부터 상기 하부 챔버로 상기 폴리머를 끌어당기도록 설정되는, 대전된 폴리머의 이동을 제어하는 방법.
제12항에 있어서,
상기 샘플이 상기 중간 챔버로 적재되고, 상기 초기 제1 전압이 상기 중간 챔버로부터 상기 상부 챔버로 상기 대전된 폴리머를 끌어당기도록 설정되고, 상기 초기 제2 전압이 상기 중간 챔버로부터 상기 하부 챔버로 상기 대전된 폴리머를 끌어당기도록 설정되는, 대전된 폴리머의 이동을 제어하는 방법.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 대전된 폴리머는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드인, 대전된 폴리머의 이동을 제어하는 방법.
제15항에 있어서,
상기 대전된 폴리머는 폴리뉴클레오타이드인, 대전된 폴리머의 이동을 제어하는 방법.
제16항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 및 DNA-RNA 중합체(hybrid)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 대전된 폴리머의 이동을 제어하는 방법.
제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (c)에서 조정된 제1 전압 및 제2 전압의 크기가 두 전압 간의 차이의 크기보다 약 10배 내지 약 10,000배 높은, 대전된 폴리머의 이동을 제어하는 방법.
제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
단량체 유닛이 상기 포어 중 하나의 포어를 통과하는 경우, 상기 하나의 포어를 가로지르는 이온 전류를 측정함으로써 폴리머의 단량체 유닛을 식별하는 단계를 더 포함하는, 대전된 폴리머의 이동을 제어하는 방법.
제19항에 있어서,
상기 단량체 유닛은 뉴클레오타이드인, 대전된 폴리머의 이동을 제어하는 방법.
제19항에 있어서,
상기 단량체 유닛은 뉴클레오타이드 쌍인, 대전된 폴리머의 이동을 제어하는 방법.
제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단량체는 분자에 결합되는, 대전된 폴리머의 이동을 제어하는 방법.
제22항에 있어서,
상기 분자는 DNA-결합 단백질, 또는 나노-입자인, 대전된 폴리머의 이동을 제어하는 방법.
제23항에 있어서,
상기 DNA-결합 단백질은 서열-특이적 DNA-결합 단백질인, 대전된 폴리머의 이동을 제어하는 방법.
제12항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리머가 고상 지지체와 상기 폴리머의 일 단부에서 부착되는, 대전된 폴리머의 이동을 제어하는 방법.
폴리뉴클레오타이드의 서열분석을 판정하는 방법으로서,
(a) 제11항에 따른 디바이스의 상기 상부 챔버에 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 샘플을 적재하는 단계로서, 상기 디바이스가 상기 상부 챔버와 상기 중간 챔버 사이의 제1 전압, 및 상기 중간 챔버와 상기 하부 챔버 사이의 제2 전압을 제공하는 전압-클램프 또는 패치-클램프 시스템에 접속되고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 고상 지지체와 상기 폴리뉴클레오타이드의 일 단부에서 선택적으로 부착되는, 샘플을 적재하는 단계;
(b) 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 상부 챔버로부터 상기 중간 챔버로, 그리고 상기 중간 챔버로부터 상기 하부 챔버로 이동하도록 초기 제1 전압 및 초기 제2 전압을 설정하여, 폴리머가 상기 제1 및 제2 포어 둘다를 가로지르도록 위치시키는 단계;
(c) 상기 제1 전압 및 상기 제2 전압이 중간 챔버로부터 상기 폴리뉴클레오타이드를 끌어당기는 힘을 생성하도록 상기 제1 전압 및 상기 제2 전압을 조정하는 단계로서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 한 방향으로 제어 방식으로 두 포어를 가로질러 이동하도록, 두 전압이 크기가 상이한 제어 조건 하에 있도록 하는, 조정하는 단계; 및
(d) 상기 폴리뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오타이드가 상기 포어 중 하나의 포어를 통과하는 경우, 상기 하나의 포어를 가로지르는 이온 전류를 측정함으로써, 상기 하나의 포어를 통해 통과하는 폴리뉴클레오타이드의 각각의 뉴클레오타이드를 식별하는 단계
를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 서열분석을 판정하는 방법.