JP3335634B2 - Ｐｎａ−ｄｎａ−ｐｎａキメラ高分子 - Google Patents
Ｐｎａ−ｄｎａ−ｐｎａキメラ高分子Info
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Description
関連出願のクロス・レフェレンス 本出願は、「ギャップ2'修飾オリゴヌクレオチド」
（“Gapped 2' Modified Oligonucleotides"）と称する
前出願である出願番号US92/11339（1992年12月23日提
出）の一部継続出願であり、この前出願US92/11339は、
「ギャップ2'修飾／オリゴヌクレオチド」（“Gapped
2' Modified/Oligonucleotides"）と称する前出願であ
る出願番号第814,961号（1991年12月24日提出）の一部
継続出願であり、両出願は、共に本出願に譲渡される。
さらに、本出願は、「ペプチド核酸の高次構造および結
合」（“Higher Order Structure and Binding of Pept
ide Nucleic Acids"）と称する出願番号第088,658号（1
993年７月２日提出）に関連し、共に本出願に一部分譲
渡される。この出願第088,658号は、「新しいペプチド
核酸」（“Novel peptide Nucleic Acids"）と称する出
願番号第054,363号（1993年４月26日提出）の一部継続
出願であり、第054,363号はPCT EP/91/01219（1992年
５月19日提出）の一部継続出願である。これらの出願の
それぞれの開示は、参照としてここに取り入れられる。 発明の分野 本発明は、PNA−DNA−PNA構造を持つキメラ分子の合
成および使用に関し、ここで、各々の“PNA"はペプチド
核酸であり、“DNA"はホスホジエステル、ホスホロチオ
エートまたはホスホロジチオエート2'−デオキシオリゴ
ヌクレオチドである。細胞、細胞抽出物またはRNアーゼ
Ｈを含む診断試験システム中では、RNA標的分子とハイ
ブリダイズ可能な塩基配列を持つ本発明のキメラ高分子
は、その標的RNA分子と結合でき、そのRNA標的分子のRN
アーゼＨによる鎖切断を容易にする。 発明の背景 大抵の疾病状態を含む哺乳類の健康状態のほとんど
が、タンパク質に影響されていることは、良く知られて
いる。その様なタンパク質は、直接作用するかまたはそ
れらの酵素機能を通してかのいずれかによって、動物お
よびヒトの多くの病気の主要な一因となっている。古典
的治療学は、一般的に、病気の原因または病気の強化機
能を和らげるために、その様なタンパク質との相互作用
に焦点が当てられてきた。しかしながら、最近では、メ
ッセンジャーRNA（mRNA）またはタンパク質の合成を指
示するその他の細胞内RNAとの相互作用によってそれら
のタンパク質の実際の生成を緩和する試みがなされてい
る。一般的に、望ましくないタンパク質形成を導く遺伝
子発現を干渉する、あるいは調整する事が、その様な治
療学的研究の目的である。 アンチセンス方法論は、これら細胞内核酸の正常かつ
重要な機能を崩壊するように、比較的短いオリゴヌクレ
オチドを一本鎖RNAまたは一本鎖DNAに相補的にハイブリ
ダイズさせることである。ハイブリダイゼーションは、
RNAまたはDNAとオリゴヌクレオチドの複素環式塩基との
ワトソン−クリック塩基対を介しての配列特異的水素結
合である。その様な塩基対は、互いに相補的であると言
われる。 Cohen、オリゴヌクレオチド：遺伝子発現のアンチセ
ンス阻害剤（Oligonucleotides:Antisense Inhibitors
of Gene Expression）、CRC Press,Inc.,Boca Ra
ton,F1（1989）に記載の通り、核酸機能の崩壊を提供す
るような自然発生的事件には、少なくとも二つの型があ
ると考えられる。第一の型は、ハイブリダイゼーション
停止である。これは、オリゴヌクレオチド阻害剤が標的
核酸に結合して、その結果、単純な立体障害によって、
重要なタンパク質、たいていはリボゾームの核酸との結
合を妨害するという終結反応（terminating event）を
意味する。メチルホスフェートオリゴヌクレオチド（例
えば、Millerら、Anti−Cancer Drug Design,1987,2,
117を参照の事）とα−アノマーオリゴヌクレオチド
は、ハイブリダイゼーション停止によって核酸機能を崩
壊させると考えられる最も広範囲にわたって研究されて
いる２つのアンチセンス剤である。 オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション停止の
能力を決定するために、相補的核酸と結合するオリゴヌ
クレオチドの相対能力を、特定のハイブリダイゼーショ
ン複合体の融解温度を測定することによって比較するこ
とができる。融解温度（Tm）は、二重らせんの特徴的物
理学的性質であり、これは、らせん形（ハイブリダイズ
している）対コイル形（ハイブリダイズしていない）が
50％の比率で存在する摂氏温度を意味している。Tmは、
UVスペクトルを用いてハイブリダイゼーションの形成お
よび崩壊（融解）を測定することによって測定される。
ハイブリダイゼーションの間に生ずる塩基のスタッキン
グは、UV吸収の減少（淡色化）を伴う。結果的に、UV吸
収の減少はより高いTmを示す。Tmがより高くなると、鎖
の結合強度はより大きくなる。非ワトソン−クリック塩
基対、すなわち塩基の誤対合は、Tmに強い不安定化影響
を持つ。 アンチセンスオリゴヌクレオチドが終結反応を起こす
第２の型には、細胞内RNアーゼによる標的RNAの酵素切
断が関与する。その様なRNアーゼＨによる切断機構は、
2'−デオキシリボフラノシルオリゴヌクレオチドが標的
RNAにハイブリダイズすることが必要である。その結果
生じたDNA−RNAデュープレックスは、RNアーゼＨ酵素を
活性化し；活性化された酵素はRNA鎖を切断する。RNA鎖
切断は、RNAの正常な機能を破壊する。ホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチドは、この型の終結反応により作
用する卓越したアンチセンス剤の一つである。DNAオリ
ゴヌクレオチドがRNアーゼＨの活性化に有効であるため
には、オリゴヌクレオチドは、RNアーゼＨを活性化する
ために十分な時間、細胞内で生き残るためには、ヌクレ
アーゼに対して適度に安定でなければならない。 Walderらは、最近の数報の発表で、RNアーゼＨとオリ
ゴヌクレオチドの相互作用についてさらに記載してい
る。そのうち特に興味深いものには、（１）Dagleら、N
ucleic Acids Research,1990,18,4751;（２）Dagle
ら、Antisense Research And Development,1991,1,1
1;（３）Ederら、J.Biol.Chm.,1991,266,6472;および
（４）Dagleら、Nucleic Acids Research,1991,19,18
05:がある。これらの報告の中で、Walderらは、修飾さ
れていないホスホジエステル−ヌクレオシド間結合と、
修飾されたホスホロチオエート−ヌクレオシド間結合の
両方を持つDNAオリゴヌクレオチドが、細胞内RNアーゼ
Ｈの基質になることに注目している。それらは基質であ
るので、それらはRNアーゼＨによる標的RNAの切断を活
性化する。しかしながら、さらに、著者らは、アフリカ
ツメガエルの胚では、ホスホジエステル結合およびホス
ホロチオエート結合の両方は、また、エキソヌクレアー
ゼ分解の対象でもあることに注目している。その様なヌ
クレアーゼ分解は、それがRNアーゼＨ活性化に有効なヌ
クレオチドを急速に涸渇させるために、好ましくない。
参考文献（１）、（２）および（４）に記載されている
ように、RNアーゼＨの活性化を提供しつつヌクレアーゼ
分解に対してそれらのオリゴヌクレオチドを安定化させ
るために、Walderらは、ホスホロアミダイト、アルキル
ホスホネートまたはホスホトリエステル結合の区画の間
に短い区画のホスホジエステル結合ヌクレオチドを配置
した2'−デオキシオリゴヌクレオチドを構築した。ホス
ホロアミダイトを含むオリゴヌクレオチドは、エキソヌ
クレアーゼに対して安定化されるが、参考文献（４）に
記載するように、著者らは、それぞれのホスホロアミダ
イト結合が、ホスホロアミダイトを含むオリゴヌクレオ
チドのTm測定値を1.6℃減少させることに注目してい
る。その様なTm値の減少は、オリゴヌクレオチドとその
標的鎖との間のハイブリダイゼーションにとって、望ま
しくない減少を示している。 他の著者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとそ
の標的鎖との間のハイブリダイゼーションのその様な損
失がもたらす影響について注釈している。Saison−Behm
oarasら、EMBO Journal,1991,10,1111、は、オリゴヌ
クレオチドはRNアーゼＨの基質になりうるが、mRNAへの
ハイブリダイゼーションが弱いため、RNアーゼＨによる
切断効率は低いことを見出だした。また、著者らは、オ
リゴヌクレオチドの3'末端にアクリジン置換が含まれる
と、オリゴヌクレオチドがエキソヌクレアーゼから保護
されることに注目した。 さらにまた、米国特許第5,149,797号（Pedersonら、1
992年９月22日発行）は、RNアーゼＨ機構によって作用
するオリゴヌクレオチドについて記載している。この特
許の請求の範囲のオリゴヌクレオチドは、メチルホスホ
ネート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデ
ートまたはホスホロアミデートに隣接するホスホロチオ
エートヌクレオチドから構成される内部セグメントから
なる。これらのオリゴヌクレオチドの成分、すなわち、
ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロモ
ルホリデート、ホスホロピペラジデートまたはホスホロ
アミデートはすべて、オリゴヌクレオチド結合として個
々に用いられた場合には、オリゴヌクレオチドとその標
的鎖との間のハイブリダイゼーションを減少させるの
で、Saison−Behmoarasらの説明は、この特許に記載さ
れているオリゴヌクレオチドにも等しく当てはまる。 アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびRNアーゼＨを
用いての標的RNA鎖の切断が有効であろう事は認識され
ているが、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性およ
びハイブリダイゼーションの忠実度もまた非常に重要で
ある。ハイブリダイゼーションの性質を維持または改良
し、かつヌクレアーゼ耐性を提供すると同時にRNアーゼ
Ｈを活性化することの出来る方法または物質は長い間必
要とされてきたが、これまで当該技術分野においては、
その様な方法および物質は示唆されていない。従って、
その様な方法および物質が切望される。 発明の目的 本発明の目的は、結合親和性の改善された状態で標的
鎖とハイブリダイズする、キメラ高分子を提供すること
である。 さらなる目的は、ヌクレアーゼ分解に対する安定性を
持つキメラ高分子を提供することである。 さらに、本発明の目的は、標的鎖を切断するためにRN
アーゼＨを活性化するキメラ高分子を提供することであ
る。 さらに、本発明の目的は、インビトロでの細胞の状態
および動物の健康状態、特に疾病状態をアッセイするた
めの、研究および診断の方法ならびに物質を提供するこ
とである。 他の目的は、標的RNAの活性を調節することを通して
病気を治療するための治療および研究方法ならびに物質
を提供することである。 発明の簡単な説明 本発明では、ペプチド核酸および2'−デオキシオリゴ
ヌクレオチドから形成される高分子が提供される。その
様な高分子は、次の構造:PNA−DNA−PNA［式中、PNA部
分はペプチド核酸配列であり、DNA部分はホスホジエス
テル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート
2'−デオキシオリゴヌクレオチド配列である］をもつ。
高分子のPNA部分は、ヌクレアーゼ耐性を増加させ、標
的RNAへの高分子の結合親和性を増加させると考えられ
る。2'−デデオキシオリゴヌクレオチド部分は、RNアー
ゼＨ応答およびRNA標的鎖の切断を誘発すると考えられ
る。 本発明の高分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチド
（即ちDNA）部分は、2'−デオキシ−エリスロ−ベント
フラノシル糖部分を持つヌクレオチド単位から形成され
るオリゴヌクレオチドセグメントである。それぞれのヌ
クレオチドは、ヌクレオチドの2'−デオキシ−エリスロ
−ペントフラノシル糖部分に結合したヌクレオベース
（nucleobase）を含む。ヌクレオチドは、ホスホジエス
テル結合、ホスホロチオエート結合および／またはホス
ホロジチオエート結合によって、互いにおよび／または
他の部分と結合している。本発明のある望ましい高分子
では、高分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチド部分の
ヌクレオチドのそれぞれが、ホスホロチオエート結合に
よって互いに結合している。他の望ましい実施態様で
は、2'−デオキシオリゴヌクレオチド部分のヌクレオチ
ドは、ホスホジエステル結合によって互いに結合してお
り、さらに望ましい実施態様では、ホスホジエステルお
よびホスホロチオエート結合の混合物が、2'−デオキシ
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位を互いに結合し
ている。 高分子のペプチド核酸部分は、核酸の相補鎖への高分
子の結合親和性を増加させる。さらに、細胞ヌクレアー
ゼによる分解に対する高分子のヌクレアーゼ安定性を提
供する。１つのまたはそれより多くのまたはそのすべて
がホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合
からなる高分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチド部分
を選択することにより、本発明の高分子にさらなるヌク
レアーゼ安定性が与えられる。 本発明の高分子のPNA部分は、Ｎ−（２−アミノエチ
ル）−グリシンからなるユニット、またはそのユニット
のグリシン部分の窒素原子に、カルボキシメチル部分ま
たはその類似体のようなリンカーを通してそれに結合す
るヌクレオベースをもつ上記のＮ−（２−アミノエチ
ル）−グリシンの類似体からなるユニットから構成され
る。ユニットは、グリシン部分のカルボキシル基とアミ
ノエチル部分のアミン基との間に形成されるアミド結合
を通して互いに連結されている。ヌクレオベースは、核
酸の４つの一般的なヌクレオベースの一つであることが
でき、また、それらは、その他の天然のまたは合成のヌ
クレオベースを含むこともできる。 本発明の望ましい高分子では、PNA−DNA−PNA構造
は、それぞれのＮ−（２−アミノエチル）グリシンPNA
ユニットとそれぞれの2'−デオキシ−エリスロ−ペント
フラノシル糖ホスフェートDNAユニットを互いに繋ぎ合
わせることによって形成される。この様に、本発明の高
分子のPNA部分のヌクレオベースは、Ｎ−（２−アミノ
エチル）グリシンPNAユニットからなる骨格上に連な
り、本発明の高分子のDNA部分のヌクレオベースは、2'
−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖ホスフェー
トユニットからなる骨格上に連なっている。本発明の高
分子のPNA部分のヌクレオベースおよびDNA部分のヌクレ
オベースは、共に、それらのそれぞれの骨格ユニットに
よって、例えば標的RNA鎖のような相補的核酸にハイブ
リダイズできる順序（配列）に接続される。 本発明の望ましい高分子では、PNAおよびDNA部分は互
いにアミド結合でつながっている。本発明のその様な望
ましい高分子では、構造： PNA−（アミド結合）−DNA−（アミド結合）−PNA: の高分子である。PNAとDNA部分をつなぐのに用いること
ができる他の結合には、アミン結合およびエステル結合
が含まれる。 本発明の高分子は、望ましくは、総数約９から約30の
ヌクレオベースを含有するサブユニットからなる。より
望ましくは、高分子は、約15から約25のヌクレオベース
を含有するサブユニットからなる。上記のように、RNア
ーゼＨ応答を誘発するための、この全体配列のうちの高
分子の長さは、３より大きく望ましくは５またはそれよ
り大きい連続する2'−デオキシ−エリスロ−ペントフラ
ノシル含有ヌクレオチドサブユニットのサブ配列であろ
う。 ペプチド核酸と2'−デオキシヌクレオチドサブユニッ
トの両者にとって望ましい本発明のヌクレオベースとし
ては、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミ
ン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニ
ン、６−メチルおよびその他のアルキルアデニン、２−
プロピルおよびその他のアルキルアデニン、５−ハロウ
ラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシル、
５−プロピニルシトシン、７−デアザアデニン、７−デ
アザグアニン、７−デアザ−７−メチル−アデニン、７
−デアザ−７−メチル−グアニン、７−デアザ−７−プ
ロピニル−アデニン、７−デアザ−７−プロピニル−グ
アニンおよびその他の７−デアザ−７−アルキルまたは
７−アリールプリン、N2−アルキル−グアニン、N2−ア
ルキル−２−アミノ−アデニン、プリン６−アザウラシ
ル、６−アザシトシンおよび６−アザチミン、５−ウラ
シル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハ
ロアデニン、８−アミノ−アデミン、８−チオールアデ
ニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシ
ルアデニンおよびその他の８−置換アデニンならびに８
−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグ
アニン、８−チオールアルキルグアニン、８−ヒドロキ
シルグアニンおよびその他の８−置換グアニン、その他
のアザおよびデアザ−ウラシル、その他のアザおよびデ
アザ−チミジン、その他のアザおよびデアザ−シトシ
ン、アザおよびデアザ−アデニン、アザおよびデアザ−
グアニンまたは５−トリフルオロメチルウラシルおよび
５−トリフルオロシトシンが挙げられる。 また、本発明は、望ましくないタンパク質の生成を特
徴とする病気をもつ生物を治療する方法を提供する。こ
れらの方法は、生物を、核酸の相補鎖に特異的にハイブ
リダイズする能力を持つヌクレオベースの配列を持つ高
分子と接触させることを含む。さらに、その方法は、ヌ
クレオベースの一部分がペプチド核酸サブユニット（PN
Aユニット）からなり、その残りのヌクレオベースは2'
−デオキシヌクレオチドサブユニット（DNAユニット）
からなることを含む。ペプチド核酸サブユニットおよび
デオキシヌクレオチドサブユニットは互いに結合して、
PNA−DNA−PNA（PNAはペプチド核酸であり、DNAは2'−
デオキシオリゴヌクレオチドである）の構造を持つ高分
子を形成する。 さらに、本発明では、核酸の相補鎖に特異的にハイブ
リダイズする能力を持つヌクレオベース配列をもつ薬学
上有効な量の高分子を含む組成物が提供される。さら
に、方法は、ヌクレオベースの一部分がペプチド核酸サ
ブユニット（PNAユニット）からなり、残りのヌクレオ
ベースは2'−デオキシヌクレオチドサブユニット（DNA
ユニット）からなる事を含む。ペプチド核酸サブユニッ
ト（PNA）およびデオキシヌクレオチドサブユニット（D
NA）は互いに結合されて、PNA−DNA−PNA構造の高分子
を形成する。さらに、組成物は、薬剤として許容しうる
希釈剤または担体を含む。 さらに、本発明では、上記のように、RNアーゼＨ酵素
および核酸を含む試験溶液をPNA−DNA−PNA高分子と接
触させることを含む、特定の核酸の配列をインビトロで
修飾する方法が提供される。 また、上記のように、生物をPNA−DNA−PNA高分子と
接触させることを含む、生物中でのハイブリダイゼーシ
ョンおよびRNアーゼＨ酵素の活性化を同時に増強する方
法が提供される。 図面の簡単な説明 図１は、本発明のある化合物の固相合成法を図解する
化学スキームである。 図２は、本発明のある化合物の固相合成法を図解する
化学スキームである。 図３は、本発明のある化合物の液相合成法を図解する
化学スキームである。 図４は、本発明のある化合物の液相合成法を図解する
化学スキームである。 図５は、本発明のある化合物の固相合成法を図解する
化学スキームである。 図６は、本発明のある化合物の液相合成法を図解する
化学スキームである。 本発明の詳細な説明 本発明の目的に従って、ヌクレアーゼ耐性を増加さ
せ、同時に、相補鎖への結合親和性を増加させ、また、
RNアーゼＨの基質でもある、新規の高分子が提供され
る。本発明の高分子は、複数のペプチド核酸サブユニッ
ト（PNAサブユニット）と複数の2'−デオキシヌクレオ
チドサブユニット（DNAサブユニット）から組み立てら
れている。それらを組み立てて、構造:PNA−DNA−PNAの
高分子とする。それぞれのペプチド核酸サブユニットお
よびそれぞれの2'−デオキシヌクレオチドサブユニット
は、標的RNA分子上、またはDNA分子およびタンパク質を
含むその他の標的分子上の同様のヌクレオベースと特異
的にハイブリダイズする能力を持つヌクレオベースを含
む。 本発明の高分子のペプチド核酸部分は、本発明の高分
子のヌクレアーゼ耐性を増加させる。さらに、これらの
同一のペプチド核酸部分は、核酸の相補鎖への、本発明
の高分子の結合親和性をも増加させる。本発明の高分子
の2'−デオキシヌクレオチド部分は、それぞれ、その糖
部分として2'−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル
基を含む。 上記のガイドラインに関連して、2'−デオキシヌクレ
オチドサブユニットの各々は、“天然”または“合成”
の部分であることができる。従って、本発明の文脈で
は、“オリゴヌクレオチド”という用語は、第一に、複
数の連結ししたヌクレオチドユニットから形成されるポ
リヌクレオチドをさす。ヌクレオチドユニットは、天然
のヌクレオシド間ホスホジエステル結合を通して互いに
連結される。ヌクレオチドユニットは、天然型の塩基お
よび2'−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖基か
ら形成される。従って、“オリゴヌクレオチド”という
用語は、実質上、天然型の種または天然型ヌクレオチド
ユニットから形成される合成種を含む。 オリゴヌクレオチドという用語は、天然型の構造なら
びに（天然塩基と同様に機能する修飾塩基部分を含む）
非天然型または“修飾された”構造を含むことを意味し
ている。高分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチド部分
のヌクレオチドは、天然のホスホジエステル結合に加え
て、その他の選ばれた合成結合で互いに連結されうる。
これらのその他の結合には、ホスホロチオエートおよび
ホスホロジチオエート糖間結合が含まれる。更に、適当
な結合として考えられるものは、ホスホロセレネートお
よびホスホロジセレネート結合である。塩基部分、すな
わち、2'−デオキシヌクレオチドのヌクレオベースは、
天然の塩基、すなわちアデニン、グアニン、シトシン、
ウラシルまたはチミジンを含みうる。あるいは、これら
は、天然のプリンおよびピリミジン塩基の代わりに用い
られるデアザまたはアザープリンおよびピリミジン;5ま
たは６位に置換基を持つピリミジン塩基;2、６または８
位に改変されたまたは置き換えられた置換基を持つプリ
ン塩基；を含みうる。それらは、また、本発明の精神に
一致するその他の修飾を含んでも良い。その様な2'−デ
オキシオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチ
ド（または天然系に沿って合成されたオリゴヌクレオチ
ド）と機能的に交換できるが、天然構造から一つまたは
それより多くの違いを持つものとして最もよく記載され
る。その様な2'−デオキシオリゴヌクレオチドは、高分
子中で有効に機能して標的RNA鎖のRNアーゼＨ切断を誘
発するかぎり、すべて、本発明に包含される。 本発明の一つの好ましい実施態様では、高分子のペプ
チド核酸部分によって確立される以上のヌクレアーゼ耐
性が、ホスホロチオエート−ヌクレオチド間結合を用い
ることによって得られる。Walderらの報告（上記）に反
して、種々の3'−エキソヌクレアーゼを含むウシ胎児血
清の様な系の中では、ヌクレオシド間結合をホスホジエ
ステル結合からホスホロチオエート結合に修飾すること
はヌクレアーゼ耐性を与えることが認められた。 最近、Brillら、J.Am.Chem.Soc.,1991,113,3972,は、
ホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドもまたヌクレ
アーゼ耐性を示すと報告している。これらの著者らは、
また、ホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドは、相
補的デオキシオリゴヌクレオチドと結合し、RNアーゼＨ
を刺激し、かつlacリプレッサーおよびcroリプレッサー
の結合を刺激することを報告している。この様な性質故
に、本発明の高分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチド
部分にホスホロジチオエート結合を用いても良い。ホス
ホロジチオエートの合成方法は、Beatonら、“オリゴヌ
クレオチドホスホロジチオエートの合成（Synthesis o
f oligonucleotides phosphorodithioates）”、第５
章、109頁、「オリゴヌクレオチドおよびその類似体（O
ligonucleotides and Analogs）、実用研究法（Ａ P
ractical Approach Series）」、Eckstein,F.編;The
Ptactical Approach Series,IRL Press、New Yor
k、1991、に記載されている。 ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート−ヌ
クレオチド間結合を用いることによって、本発明の高分
子にヌクレアーゼ耐性の増加が与えられる場合、その様
な結合は、それぞれのヌクレオチド間の部位に存在する
であろう。その他の実施態様では、すべてより少ないヌ
クレオチド間結合が、ホスホロチオエートまたはホスホ
ロジチオエート結合で修飾されるであろう。 本発明の高分子の結合親和性は、高分子のペプチド核
酸部分によって増加することが見いだされた。例えば、
10merのホモチミジンPNAをそれに相補的な10merのホモ
アデノシンDNAに結合させた場合のTmは73℃であるのに
対して、これに対応する10merのホノチミジンDNAを同様
に相補的である10merのホモアデノシンDNAに結合させた
場合のTmはわずか23℃である。 結合親和性はまた、本発明の2'−デオキシオリゴヌク
レオチドを構成するヌクレオチドサブユニットおよびペ
プチド核酸サブユニットの両方にある種の修飾塩基を用
いることによって増加させることもできる。その様な修
飾塩基は、５−プロピニルピリミジン、６−アザピリミ
ジン、およびＮ−２、Ｎ−６、および２−アミノプロピ
ルアデニンを含むＯ−６位の置換されたプリンを含むで
あろう。その他の修飾されたピリミジンおよびプリン塩
基もまた、核酸相補鎖への高分子の結合親和性を増加さ
せることが予測される。 その様な構造ユニットの製造に用いるための、適当な
ヌクレオベースには、アデニン、グアニン、シトシン、
ウラシル、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−
アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル
ならびにその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグア
ニンの２−プロピルならびにその他のアルキル誘導体、
５−ハロ−ウラシルおよびシトシン、６−アゾ−ウラシ
ル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウ
ラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、アミノ、チオ
ール、チオールアルキル、ヒドロキシルならびにその他
の８位置換のアデニンおよびグアニン、５−トリフルオ
ロメチルおよびその他の５位置換のウラシルおよびシト
シン、７−メチルグアニンおよびその他のヌクレオベー
スが含まれ、それらには、例えば米国特許第3,687,808
号、“The Concise Encyclopedia Of Polymer Sci
ence And Engineering",J.I.Kroschwitz編、John Wi
ley ＆ Sons,1990,858−859、およびEnglisch,U.およ
びGauss,D.H.,Angewandte Chemie、International Ed
ition 1991、30、613に開示されるものがある。 標的RNAのRNアーゼＨ酵素切断を誘発させるために、
本発明の高分子は、その中にDNA型セグメントであるセ
グメントまたはサブ配列を含んでいなくてはならない。
他の点から言うと、本発明の高分子の少なくとも一部分
は、2'−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖部分
を持つヌクレオチドサブユニットでなくてはならない。
３つより多くの連続して結合した2'−デオキシ−エリス
ロ−ペントフラノシル含有ヌクレオチドサブユニットを
持つサブ配列は、標的RNAと本発明の高分子のハイブリ
ダイゼーションによるRNアーゼＨ活性を誘発するために
必要であるらしいことが認められた。現在のところ、本
発明の高分子中には、５またはそれより多くの連続した
2'−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル含有ヌクレ
オチドサブユニットのサブ配列を持つことが望ましい。
少なくとも７つの連続する2'−デオキシ−エリスロ−ペ
ントフラノシル含有ヌクレオチドサブユニットが特に望
ましい。 本発明の高分子の全長は、長さ３から何百のサブユニ
ットであることができるが、標的特異性はもっと短い分
子で得る事ができるので、より実用的な最大の長さは、
長さ約30から約50のサブユニットであろう。より望まし
い最大の長さは、長さ約25サブユニットであろう。 標的によって、高分子の最小の長さは、３から約15の
総サブユニットといろいろであろう。実際には、アンチ
センスオリゴヌクレオチドを用いるに当たって、一般的
には、ハイブリダイゼーションにおける適当な親和性を
保証するためには、約15ヌクレオチドの最小の長さが必
要であることが分かった。しかし、上に記載したよう
に、ペプチド核酸サブユニットは、標的分子に対して、
ホスホロチオエート−オリゴヌクレオチドより良い親和
性を持つ正常なホスホジエステル−オリゴヌクレオチド
と比較してより大きいハイブリダイゼーション親和性を
持つので、本発明の高分子を用いる場合には、最小の長
さは通常アンチセンスオリゴヌクレオチドとのアンチセ
ンス結合に用いられるより小さいと予測することができ
る。これらの因子を考慮にいれると、高分子の望ましい
長さは、総数約３から約30のサブユニットであり、より
望ましい範囲は長さ約９から約25のサブユニットであろ
う。 本発明の高分子では、PNAユニットの間に一つあるい
はそれ以上の連続するDNAユニットが配置されるであろ
う。RNアーゼＨ応答を誘発させるためには、上記のよう
に、望ましくは、高分子のDNA部分は、少なくとも３つ
の2'−デオキシヌクレオチドユニットを持つであろう。
DNAユニットの数の上限を決定するために、高分子の全
長、用いるホスフェート結合、標的配列に対する望まし
い忠実度およびその他の因子を含む幾つかの因子が考慮
される。通常は、経済的考慮により、本発明の高分子で
は、標的分子に特異的に結合するために、また、所望す
るならば、RNアーゼＨ応答を引き出すために必要である
よりも多いヌクレオベースを持たないことが望ましい。
RNアーゼＨの機能を利用するためにはこの数は一般的に
約５ヌクレオチドである。さらに、ホスホロチオエート
およびホスホロジチオエート−リン酸結合はそれ自身ヌ
クレアーゼ耐性を示すので、これらの２つのリン酸結合
を用いると、ヌクレアーゼ耐性のために高分子のPNA部
分に頼らなくてはならないホスホジエステルサブユニッ
トと比較して、より長くのびるDNAサブユニットを用い
ることができる。これらの要素を考慮に入れると、本発
明の高分子を含む特に望ましい範囲は、長さ９から約28
のサブユニットであり、2'−デオキシヌクレオチドサブ
ユニットに続いて位置する約５から約８のその様なサブ
ユニットを持つ。 RNアーゼＨの作用機構は、DNA−RNAデュープレックス
を認識し、それに次いでこのデュープレックスのRNA鎖
を切断する。発明の背景の項に上記したように、この技
術分野でのその他の者は、DNA鎖にヌクレアーゼ安定性
を与えるために修飾したDNA鎖を用いてきた。これを行
うために、彼らは、ヌクレアーゼ安定性を増加させる
が、同時にハイブリダイゼーション特性を減少させるよ
うな修飾されたリン酸結合を用いてきた。 本発明者は、理論に拘束されることを望むものではな
いが、本発明の高分子においては、ペプチド核酸ユニッ
トを高分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチド部分の両
端に置くことによって、高分子にヌクレアーゼ安定性を
与えるであろうことを認識している。さらに、この事
は、相補鎖への結合および特異性を増加させるであろ
う。 再度、特定の理論に拘束されることを望むものではな
いが、本発明者は、RNA鎖の切断を認識い誘発させるた
めにRNアーゼＨが満たさなくてはならないある種の規準
を認識している。これらの第一は、RNA鎖は切断部位
で、リン酸結合を通して連結された負電荷を帯びたヌク
レオシドを持っていなければならない事である。さら
に、切断部位のヌクレオシドの糖は、β−ペントフラノ
シル糖でなければならず、また、2'エンドコンフォメー
ションでなくてはならない。この規準を満たすヌクレオ
シド（ヌクレオチド）は、2'−デオキシ−エリスロ−ペ
ントフラノシル β−ヌクレオシドのホスホジエステ
ル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホス
ホロセレネートおよびホスホロジセレネート−ヌクレオ
チドのみである。 上記の規準の観点から、2'エンドコンフォーメーショ
ン（例えば、シクロペンチルヌクレオシド）で存在する
ことが示されたある種のヌクレオシドでさえ、ペントフ
ランノシル糖を結合していないので、RNアーゼＨ活性を
誘発しないであろう。モデルは、オリゴヌクレオチド4'
−チオヌクレオシドはエンベロープコンフォメーション
で存在するが、2'エンドコンフォメーションで存在しな
いので、その様なヌクレオシド残基もまたRNアーゼＨ活
性を誘発しないであろうことを示している。さらに、α
−ヌクレオシドは、β−ペントフラノシル糖とは逆の立
体配座であるため、それらもまた、RNアーゼＨ活性を誘
発しないであろう。 非糖のテザー基を通して、または非リン酸結合を通し
てリン酸結合に連結されるヌクレオベースもまた、2'エ
ンドコンフォメーションでβ−ペントフラノシル糖を持
つと言う規準に合わない。従って、それらは、恐らく、
RNアーゼＨ活性を誘発しないであろう。 本発明の高分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチド部
分に取り込ませるために、ヌクレオシドは、ジメトキシ
トリチル基で5'位をブロックし、次いで、3'位をホスフ
ィチル化（phosphitylation）されるであろう。トリチ
ル化およびホスフィチル化の方法は、「オリゴヌクレオ
チドおよびその類似体、実用的研究法（Oligonucleotid
es and Analogs,A practical Approach）」、Eckst
ein,F.編、実用的研究法シリーズ（The Practical Ap
proach Series）、IRL Press,New Youk,1991、に報
告されている。オリゴヌクレオチド中への取り込みは、
ABI380BモデルシンセサイザーのようなDNAシンセサイザ
ーを用いて、ホスホジエステル、ホスホロチオエートま
たはホスホロジチオエート−リン酸結合を形成するため
に適当な化学を用いて、Echsteinの前掲引用書中に説明
されている合成のプロトコールにしたがって行われるで
あろう。 本発明の高分子の2'−デオキシヌクレオチドサブユニ
ットおよびペプチド核酸サブユニットは、共有結合で結
び付けられ、高分子のサブユニットを望ましいヌクレオ
ベース配列に固定する。望ましい長さに結び付けられた
共有結合連結（covalent interconnection）は、高分
子の２つの隣り合った領域のそれぞれの間で形成され
る。望ましくは、共有結合連結は、隣り合う領域を形成
する異なる型のサブユニット部分の両方に共有結合を形
成できる連結部分を選択することによって成し遂げられ
る。望ましくは、連結部分は、連結部分と異なる型の部
分の間に得られる原子鎖が同じ長さであるように選択さ
れる。本発明の一つの望ましい実施態様では、2'−デオ
キシヌクレオチドとペプチド核酸サブユニットを相互連
結する連結基として特に有用なものはアミド結合であ
る。その他の実施態様では、アミンおよびエステル結合
を用いることができる。 本発明の高分子のペプチド核酸サブユニット部分（PN
A部分）は、一般式（Ｉ）： ［式中： ｎは少なくとも２であり、 L1−Lnはそれぞれ、水素、ヒドロキシ、（C1−C4）ア
ルカノイル、天然型のヌクレオベース、非天然型のヌク
レオベース、芳香族部分、DNAインターカレーター、ヌ
クレオベース結合基、複素環式部分、およびレポーター
リガンドからなる群より独立的に選択され、L1−Lnの少
なくとも１つは、天然型ヌクレオベース、非天然型ヌク
レオベース、DNAインターカレーター、またはヌクレオ
ベース結合基であり； C1−Cnはそれぞれ、（CR6R7）ｙであり、ここでR6は
水素であり、R7は天然型のα−アミノ酸の側鎖からなる
群より選択されるか、またはR6およびR7は、水素、（C2
−C6）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリー
ル、ヒドロキシ、（C1−C6）アルコキシ、（C1−C6）ア
ルキルチオ、NR3R4およびSR5［ここで、R3およびR4は上
に定義した通りであり、R5は水素、（C1−C6）アルキ
ル、ヒドロキシ−、アルコキシ−もしくはアルキルチオ
−置換（C1−C6）アルキルである］からなる群より独立
的に選択されるか、またはR6およびR7が一緒になって脂
環式または複素環式系を作り上げ； D1−Dnはそれぞれ（CR6R7）ｚであり、R6およびR7は
上記の通りであり； ｙおよびｚはそれぞれ０または１から10までの整数で
あり、ｙ＋ｚの和は２より大きいが10以下であり； G1−Gn-1のそれぞれは、いずれの向きでもよい−NR3C
O−、−NR3CS−、−NR3SO−、または−NR3SO2−であ
り、R3は上記の通りであり； A1−AnおよびB1−Bnの組み合わせは、それぞれ： （ａ）Ａは式（II a）、（II b）または（II c）の基の
一つであり、 ＢはＮまたはR3N+である；または （ｂ）Ａは式（II d）の基であり、ＢはCHである； ［式中： Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NR3、CH2またはＣ（CH3）２であ
り； Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはNR4であり； ｐおよびｑはそれぞれ、０または１から５までの整数
であり、ｐ＋ｑの和は10以下であり； ｒおよびｓはそれぞれ、０または１から５までの整数
であり、ｒ＋ｓの和は10以下であり； R1およびR2のそれぞれは、水素、またはヒドロキシ−
もしくはアルコキシ−もしくはアルキルチオで置換され
ていてもよい（C1−C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコ
キシ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群
より独立的に選択され； G1−Gn-1はそれぞれ、いずれの向きでもよい−NR3CO
−、−NR3CS−、−NR3SO−または−NR3SO2−であり、こ
こでR3は上記の通りであり； Ｑは、−CO2H−、−CONR'R''、−SO3Hもしくは−SO2N
R'R''または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性化誘導体であ
り；そして Ｉは、−NHR'''R''''または−NR'''C（Ｏ）R''''であ
り、ここでR'、R''、R'''およびR''''は、水素、アルキ
ル、アミノ保護基、レポーターリガンド、インターカレ
ーター、キレーター、ペプチド、タンパク質、炭水化
物、脂質、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、
ヌクレオチドジホスフェート、ヌクレオチドトリホスフ
ェート、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドなら
びに可溶性および不溶性ポリマーからなる群より独立的
に選択される］である。 望ましいペプチド核酸は、一般式（III a）−（III
c）： ［式中： Ｌはそれぞれ、水素、フェニル、複素環式部分、天然
型のヌクレオベース、および非天然型のヌクレオベース
からなる基より独立的に選択され； R7'は、水素および天然型α−アミノ酸の側鎖からな
る群より独立的に選択され； ｎは、１から60の整数であり； ｋ、ｌ、およびｍはそれぞれ、独立的に０または１か
ら５の整数であり； ｐは、０または１であり； Rhは、OH、NH2または−NHLysNH2であり； Riは、ＨまたはCOCH3である： を持つ。 特に望ましいものは、式（III a）−（III c）を持つ
化合物であり、式中、Ｌはそれぞれ、ヌクレオベースで
あるチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、
グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）からなる群より独
立的に選択され、ｋおよびｍは、０または１であり、ｎ
は１から30、特に４から20の整数である。 本発明の高分子のペプチド核酸部分は、溶液中かまた
は固相上のどちらかで、一般的には、特許出願PCT/EP/0
1219（WO92/20702として1992年11月26に公開）または米
国特許出願08/088,658（1993年７月２日出願）、または
同等の方法にしたがって合成される。これらの特許出願
の内容は、参照としてここに取り入れられる。 用いられたシントン（synthon）は、モノマーのアミ
ノ酸またはその活性化誘導体であり、標準的な保護基に
よって保護されている。PNAもまた、関連するジ酸およ
びジアミンを用いることによって合成することができ
る。 本発明の新規のモノマーシントンは、一般式（IV）、
（Ｖ）、（VI）： ［式中、Ｌ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは上記の通りである
が、ただしその中の任意のアミノ基がアミノ保護基で保
護されていても良く;Eは、COOH、CSOH、SOOH、SO2OHま
たはその活性化誘導体であり；かつＦは、NHR3またはNP
gR3であり、ここでR3は上記の通りであり、かつPgはア
ミノ保護基である］ をもつアミノ酸、ジ酸およびジアミンからなる群より選
択される。 本発明の望ましいモノマーシントンは、式（VIII a）
−（VIII c）： ［式中、Ｌは、水素、フェニル、複素環式部分、天然型
ヌクレオベース、および非天然型ヌクレオベースからな
る基より選択され；かつR7'は、水素および天然型α−
アミノ酸側鎖よりなる群より選択される］ またはそのアミノ保護および／または酸末端活性化誘導
体をもつ。 本発明の化合物は、診断、治療に、ならびに研究用試
薬およびキットとして用いることができる。さらに、い
ったん試験システムで活性であると確認されれば、化学
療法薬を含む他の活性化合物の試験システムにおいて標
準として用いることができる。薬剤として許容しうる適
当な希釈剤または担体とともに混合した本発明の高分子
を有効量含有させることにより、薬剤組成物としても利
用できる。さらに、望ましくないタンパク質生成を特徴
とする疾患を持つ生物を治療するために用いることもで
きる。生物を、望ましくないタンパク質をコードする核
酸の鎖と特異的にハイブリダイズできる配列を持つ本発
明の高分子と接触させることができる。 その様な治療的処置は、単細胞原核生物および真核生
物から多細胞真核生物までの範囲のいろいろな生物で実
施することができる。その遺伝、代謝または細胞の制御
の基本部分としてDNA−RNA転写またはRNA−タンパク質
翻訳を用いるいずれの生物も、その様な治療的および／
または予防的処置が可能である。細菌、酵母、原生生
物、藻類、全植物および温血動物を含むすべての高等動
物のように外見上は異なった生物を、この治療法で処置
できる。さらに、多核真核生物の細胞の各々は、それら
の細胞活性に不可欠な部分としてDNA−RNA転写およびRN
A−タンパク質翻訳の両方を含むので、その様な治療お
よび／または診断もまた、その様な細胞集団で実施する
ことができる。さらに、真核生物細胞の多くのオルガネ
ラ、例えばミトコンドリアおよびクロロプラストもま
た、転写および翻訳の機構を含んでいる。このように、
単一の細胞、細胞集団またはオルガネラもまた、本発明
の治療的または診断的オリゴヌクレオチドで治療するこ
とのできる生物の定義の内に含まれうる。ここで用いる
ように、“治療”とは、疾病状態の根絶、例えば細菌、
原生動物類あるいはその他の伝染病の生物の殺傷、また
は遊走性あるいは有害な細胞の増殖または発現の制御の
両方を含むことを意味する。 例証の目的で、本発明の化合物を、ras−ルシフェラ
ーゼ−トランス活性化を用いるras−ルシフェラーゼ融
合システム中で用いた。「ras−オンコジンのアンチセ
ンス阻害（Antisense Inhibition of RAS Oncogen
e）」と称し、本出願と共に譲受された米国特許出願番
号07/715,196（1991年６月14日提出）に記載されている
（その全体の内容をここに参照として取り入れる）よう
に、ras−オンコジンは、原形質膜の内側表面に位置す
る関連タンパク質をコードする遺伝子ファミリーの構成
員である。ras−タンパク質は、アミノ酸レベルで高い
保存性を持ち、高い親和性および特異性でGTPに結合
し、かつGTPアーゼ活性を持つことが示されている。ras
遺伝子生成物の細胞性機能は未知であるが、それらの生
化学的性質は、GTP結合タンパク質またはＧタンパク質
として知られているシグナル伝達タンパク質の一種との
明らかな配列相同性と共に、ras遺伝子生成物は、原形
質膜を通る細胞外シグナルの伝達に関する基礎的な細胞
制御機能に重要な役割を演じていることを示唆する。 Ｈ−ras、Ｋ−rasおよびＮ−rasと名付けられた３種
のras遺伝子が、哺乳動物のゲノム中で同定された。哺
乳類のras遺伝子は、コード配列内の単一の点突然変異
によってトランスフォーメーションを誘導する性質を獲
得する。天然型ras−オンコジンの突然変異は、コドン1
2、13および61に位置することが見いだされている。Ｈ
−ras、Ｋ−rasおよびＮ−rasの配列は既知である。Cap
onら、Nature,302、1983,33−37;Kahnら、Anticancer R
es.,1987,7,639−652;HallおよびBrown、Nucleic Acid
s Res.,1985,13,5255−5268。ヒトの腫瘍中に認められ
る最も共通に検出される活性化rasの突然変異は、Ｈ−r
as遺伝子のコドン12中にあり、そこでは、GGCからGTCへ
の塩基の変化が、結果として、rasタンパク質産物のGTP
アーゼ制御ドメイン中にグリシンからバリンへの置換を
生ずる。Tabin,C.J.ら、Nature,1982,300,143−149;Red
dy,P.E.ら、Nature,1982,300,149−152;Taparowsky,E.
ら、Nature,1982,300,762−765。この単独のアミノ酸変
化は、ras−タンパク質機能の正常な制御を妨害し、そ
れ故、正常に制御されていた細胞タンパク質を連続的に
活性なタンパク質に変えると考えられる。正常なras−
タンパク質機能のその様な脱制御は、正常な増殖から悪
性増殖へのトランスフォーメーションの原因であると考
えられている。Moniaら、J.Bio.Chem.,1993,268,14514
−14522は、最近、トランス活性化レポーター遺伝子シ
ステムにより、キメラ“Gap"（非デオキシオリゴヌクレ
オチドに隣接される2'−デオキシオリゴヌクレオチドを
持つ構造）が、インビトロでHa−ras オンコジンに対
して活性であることを示している。上記のアッセイで活
性である本発明の化合物は、インビトロでの化学療法薬
スクリーニングテストの標準として用いることができ
る。 本発明の化合物は、固相合成または液相合成の両方に
より製造することができる。両方法は、実施例に示され
ている。実施例に示すように、実施例１は、本発明の高
分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチド部分の一般的な
合成法である。実施例２、３および４のスキームは、図
１に図解している。実施例２は、固相支持体樹脂への高
分子の右側PNA部分のカルボキシ末端の固定を図解して
記載している。実施例３は、高分子のこの右側PNA部分
の伸長、および3'−カルボキシヌクレオチドを通しての
最初の2'−デオキシヌクレオチドへのアミド結合の形成
について記載している。実施例４は、高分子の第２のPN
A（左側）部分へアミド結合をもたらすための、5'−ア
ミノヌクレオチドの付加を含む高分子の中央の2'−デオ
キシオリゴヌクレオチド部分の伸長を図解している。実
施例５および６のスキームは、図２に示されている。実
施例５は、左側PNA部分の完成を示している。実施例６
は、ブロック基の除去および樹脂からの除去を説明して
いる。実施例７のスキームは、図３に示されている。実
施例７は、5'−アミノ−3'−ヌクレオチドを5'−末端ヌ
クレオチドとして位置させるための液相DNA結合の形成
について説明している。実施例８および９のスキーム
は、それぞれ図４および５に示されている。実施例８
は、本発明の高分子のPNA部分の、DNA部分への液相結合
について説明している。この実施例では、実施例７のオ
リゴヌクレオチドを第１の“T"PNAサブユニットと結合
させ；これに対して、実施例９では、第１の“A"PNAサ
ブユニットを、高分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチ
ド部分に結合させる。実施例10、11および12のスキーム
は、図６に示されている。実施例10、11および12は、本
発明の高分子のDNA部分のPNA部分への液相結合について
説明している。 以下の実施例では、サブユニットがペプチド核酸（PN
A）グループかまたは2'−デオキシヌクレオチド（DNA）
グループのどちらであるかには関係なく、サブユニット
を、標準的な大文字による一文字表記、即ちＡ、Ｇ、Ｃ
またはＴ、を用いて表示する。その様な表記は、サブユ
ニット中に取り込まれたヌクレオベースを示している。
すなわち、“A"は、2'−デオキシアデノシンヌクレオチ
ド、並びにアデニン塩基を含むペプチド核酸サブユニッ
トの両方を表示するために用いられる。ペプチド核酸サ
ブユニットでは、アデニン塩基はカルボキシメチル連結
基を通してＮ−（２−アミノエチル）グリシン骨格と結
合する。標準的ヌクレオチド結合、即ち、ホスホジエス
テル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまた
はホスホロセレネートは、２つの隣合う表示文字の間の
ハイフォン（−）で示い、例えばＡ−Ｔは、チミジンヌ
クレオチドに連結したアデノシンヌクレオチドを示して
いる。ペプチド核酸結合を示すために、（ｐ）または
（pna）のどちらかが用いられ、例えば、Ａ（ｐ）−Ｔ
は、チミンペプチド核酸ユニットに連結したアデニンペ
プチド核酸ユニットを示す。 2'−デオキシヌクレオチドとペプチド核酸ユニットの
間の結合の変換は、括弧（ ）で示される。したがっ
て、“Ｔ−（3'−カルボキシ）−A"は、アデニン−ペプ
チド核酸サブユニットの２−アミノエチル部分のアミン
部分に結合したカルボキシ基をその3'位にもつチミジン
ヌクレオシドを示している。これに対して、“Ａ−（5'
−アミノ）−T"は、隣り合ったチミン−ペプチド核酸サ
ブユニットのグリシン部分のカルボキシ部分に結合した
アミンを5'位に持つチミジンヌクレオチドを示してい
る。末端基、例えば、カルボキシ、ヒドロキシル、Ｎ−
アセチルグリシンおよびその類似体は、適当なシンボル
表記法を用いて示される。 カルボベンゾキシブロッキング基は、肩文字Ｚ、例え
ばＺとして示される。フェノキシアセチル保護基は、肩
文字PAC、例えばPACとして示される。記載した標準的な
ポリスチレン−メリフィールド（Merrifield）樹脂の代
わりとして、ファルマシア（Pharmacia）から購入した
高架橋ポリスチレン、またはラップポリメレ（Rapp Po
lymere）から購入したテンタゲル（Tentagel）と呼ばれ
るポリエチレングリコール／ポリスチレングラフト共重
合体を用いてもよい。本発明の高分子を都合よく除去す
るためには、グリシンをエステル結合を通して樹脂に結
合させるべきである。 以下の実施例および方法は、本発明を説明するための
ものであって、制限するものではない。 実施例１ オリゴヌクレオチドの合成： 本発明の高分子のオリゴヌクレオチド部分は、ヨウ素
による酸化を用いた標準的ホスホロアミデートの化学を
用いて、自動DNAシンセサイザー（Applied Biosystems
model 380B）で合成される。ホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドのためには、標準酸化瓶を、ホスファ
イト結合を段階的にチエーションするために、0.2Mの3H
−1,2−ベンゾジチオール−３−オン 1,1−ジオキシド
／アセトニトリル溶液に置き換える。チエーションの待
ち段階は、68秒に増加させ、次いでキャッピング段階を
行った。別に指示しないかぎり、CPGカラムから切断
し、濃水酸化アンモニウム中55℃（18時間）で脱ブロッ
キングした後、オリゴヌクレオチドは、2.5倍容量のエ
タノールで、0.5M−NaCl溶液から２度沈殿させることに
よって精製する。分析用ゲル電気泳動は、20％アクリル
アミド、8M尿素、454mMトリス−ホウ酸緩衝液、pH7.0で
行った。ホスホジエステルおよびホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
からその物質の長さを判定する。 実施例２ 低充填のｔ−ブチルオキシカルボニルグリシルメリフィ
ールド樹脂 ヒドロキシメチルポリスチレン樹脂（1g、650μＭヒ
ドロキシ/g）は、固相のペプチド合成用容器に入れ、ジ
クロロメタン（DCM、２回 10ml）、N,N−ジメチルホル
ムアミド（DMF、２回 10ml）およびアセトニトリル
（２回 40ml）で順番に（それぞれの洗浄について１分
間振とうして）洗浄した。丸底フラスコに、Ｎ−ｔ−ブ
チロキシカルボニルグリシン（701mg、4mM）およびＯ−
（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１、１、３、３−
テトラメチルウロニウム テトラフルオロホウ酸塩（1.
156g、3.6mM）を加えた。無水アセトニトリル（40ml）
をバイアルに加え、次いでN,N−ジイソプロピルエチル
アミン（1.392ml、8mM）を加えた。フラスコは、すべて
の固体が溶解するまで振とうした。１分後、バイアルの
内容物をペプチド合成用容器に加え、125分間振とうし
た。次いで、反応溶液を流し、支持体をアセトニトリル
（１回 40ml）、ピリジン（２回 40ml）およびDMF
（２回 40ml）で洗浄した。DMF中の10％（v/v）無水酢
酸溶液（全40ml）を樹脂に加え、反応は40分間振とうし
て行った。反応溶液を流した後、無水酢酸キャップを上
記のように繰り返した。２回目のキャッピング反応の最
後に、樹脂を、DMF（２回 40ml）、ピリジン（１回 4
0ml）、およびDCM（３回 40ml）で洗浄した。次いで、
樹脂はアルゴンを吹き付けることによって乾燥させた。 グリシン誘導体化の程度は、ニンヒドリン定量アッセ
イによって測定した。上の樹脂（50mg）のアリコート
を、固相ペプチド合成容器中に置き、DCM（２回 3ml）
で洗浄した。次いで、樹脂は、トリフルオロ酢酸中の５
％（v/v）のｍ−クレゾール溶液（3ml）で３回、それぞ
れ２分ずつ振とうして、処理した。３回目の反応溶液を
流し去った後、樹脂は、DCM（３回 3ml）、ピリジン
（３回 3ml）およびDCM（３回 3ml）で洗浄した。次
いで、樹脂はアルゴンを吹き付けることによって乾燥さ
せた。 脱保護した乾燥させた樹脂のアリコート（5mg）を試
験管に入れた。この樹脂に、70％（v/v）水／ピリジン
（80μｌ）の溶液、カイザー試薬１（100μｌ、２％のH
2O/ピリジン中の200μＭ−KCN）、試薬２（40μｌ、ｎ
−BuOH中の５％（w/v）ニンヒドリン）、および試薬３
（50μｌ、ｎ−BuOH中の80％（w/v）フェノール）を加
えた。反応は100℃で10分間加熱して行い、冷却し、60
％（V/V）EtOH（7ml）で希釈した。次いで、570nmの吸
光度は、樹脂を含まない対照反応液、およびグリシンエ
チルエステルの定量を元にした標準曲線と比較した。1g
の樹脂当たり100μＭのグリシンの誘導体化レベルが得
られた。 実施例３ 5'−ヒドロキシ−Ｔ（3'−カルボキシ）−Ｔ（Ｐ）−CZ
（ｐ）−AZ（ｐ）−GZ（ｐ）−Gly− −Ｏ−樹脂 ｔ−ブチルオキシカルボニルグリシルメリフィールド
樹脂（200mg、10マイクロ当量、実施例１）は、固相ペ
プチド合成用容器に入れる。支持体は、50％DMF/DCM
（４回 5ml）で洗浄し、次いで、５％のｍ−クレゾー
ル／トリフルオロ酢酸（4ml）で２回、それぞれ２分間
ずつ振とうして処理する。支持体は、再び50％DMF/DCM
（４回 5ml）で、次いでピリジン（５回 5ml）で洗浄
する。バイアルに、N2−ベンジルオキシカルボニル−１
−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチルグリシ
ル）グアニン（80μＭ）およびＯ−（ベンゾトリアゾー
ル−１−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム−
テトラフルオロホウ酸塩（72μＭ）を加える。N,N−ジ
メチルホルムアミド（0.4ml）およびピリジン（0.4ml）
を、次いで、N,N−ジイソプロピルエチルアミン（160μ
Ｍ）をバイアルに加える。バイアルは、すべての固体が
溶解するまで、振とうする。１分後、バイアルの内容物
をペプチド合成用容器に加え、20分間振とうする。次い
で、反応溶液を流し、支持体をピリジン（４回 5ml）
で洗浄する。残った結合していないアミンは、N,N−ジ
メチルホルムアミド中のＮ−ベンジルオキシカルボニル
−N'−メチルイミダゾールトリフレートの10％溶液（0.
8ml）を加えることによってキャップする。５分間振と
う後、キャッピング溶液を流し、支持体を再びピリジン
（４回 5ml）で洗浄する。 上の段落に記載した通り、脱保護、カップリングおよ
びキャッピングは、さらに３種のPNAモノマー:N6−ベン
ジルオキシカルボニル−１−（ｔ−ブチルオキシカルボ
ニル−アミノエチルグリシル）アデニン、N4−ベンジル
オキシカルボニル−１−（ｔ−ブチルオキシカルボニル
−アミノエチルグリシル）シトシン、および１−（ｔ−
ブチルオキシカルボニル−アミノエチルグリシン）チミ
ン：について繰り返す。 次に、脱保護、カップリングおよびキャッピングはも
う一度繰り返すが、この場合に用いたモノマーは、5'−
（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−3'−カルボキシメチ
ルチミジンである。キャッピング反応後、樹脂をピリジ
ン（３回 3ml）およびDMF（３回 3ml）で洗浄する、
無水THF（3ml）をフラスコに加え、次いで45μｌの70％
（v/v）HF/ピリジンを加える。一晩振とう後、樹脂はTH
F（５回 3ml）、DMF（３回、3ml）、アセトニトリル
（５回 3ml）およびDCM（５回 3ml）で洗浄する。次
いで、アルゴンを吹き付けることにより樹脂を乾燥す
る。 実施例４ Ｔ（5'−アミノ）−GPAC−CPAC−APAC−Ｔ−Ｔ（3'−カ
ルボキシ）− −Ｔ（ｐ）−CZ（ｐ）−AZ（ｐ）−GZ（ｐ）−Gly−Ｏ
−樹脂 5'−ヒドロキシ−Ｔ（3'−カルボキシ）−GZ（ｐ）−
CZ（ｐ）−AZ（ｐ）−Ｔ（ｐ）−Gly−Ｏ−樹脂（10マ
イクロ当量、実施例３）をDNA合成カラムに入れる。標
準的なDNA合成（実施例１）を、環外アミン上にはフェ
ノキシアセチル保護基、リン上には２−シアノエチル
基、および5'−ヒドロキシル上には4,4'−ジメトキシト
リチル基を含むホスホルアミダイトを用いて行う。結合
させた5'−末端ホスホロアミダイトは、5'−（モノメト
キシトリチルアミノ）チミジン−3'−（N,N−ジイソプ
ロピルアミノ−２−シアノエチル）ホスホルアミダイト
である。モノメトキシトリチル基は、DCM中のジクロロ
酢酸を用いて標準的自動処理によって除去する。DCMで
洗浄後、樹脂は減圧下で乾燥させる。 実施例５ Ｎ−アセチルグリシル−Ｔ（ｐ）−Ｔ（ｐ）−CZ（ｐ）
−Ｔ（ｐ）−CZ（ｐ）−GZ（ｐ）−CZ（ｐ）−COOH ヒドロキシメチルポリスチレン樹脂（115mg、74マイ
クロ当量）を、固相ペプチド合成用容器に入れた。支持
体をDCM（３回3ml）、DMF（３回3ml）、ピリジン（３回
3ml）、さらに再びDMF（２回3ml）で洗浄した。バイア
ルにN4−ベンジルオキシカルボニル−１−（ｔ−ブチル
オキシカルボニル−アミノエチルグリシル）シトシン
（151mg、300μＭ）およびＯ−（ベンゾトリアゾール−
１−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム−テト
ラフルオロホウ酸塩（87mg、270μＭ）を加えた。N,N−
ジメチルホルムアミド（1.25ml）およびピリジン（1.25
ml）をバイアルに加え、次いで、N,N−ジイソプロピル
エチルアミン（105μｌ、600μＭ）を加えた。バイアル
は、すべての固体が溶解されるまで振とうした。１分
後、バイアルの内容物をペプチド合成容器に加え、30分
間振とうした。次いで、反応溶液を流し去り、支持体を
DMF（４回3ml）で洗浄した。Ｃモノマーのカップリング
は上記のように繰り返した。次いで、樹脂は、N,N−ジ
メチルホルムアミド中の10％Ｎ−ベンジルオキシカルボ
ニル−N'−メチル−イミダゾールトリフレート（2.25m
l）を加え、次いで５分間振とうすることによってキャ
ップした。最後に、樹脂は、ピリジン（４回3ml）で洗
浄し、次いで鎖伸長用に準備した。 支持体は、50％DMF/DCM（４回3ml）で洗浄し、次い
で、トリフルオロ酢酸中の５％ｍ−クレゾール（3ml）
で２回、それぞれ２分間振とうして、処理した。支持体
は、再び50％DMF/DCM（４回3ml）で、次いで、ピリジン
（５回3ml）で洗浄した。バイアルに、N2−ベンジルオ
キシカルボニル−１−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−
アミノエチルグリシル）グアニン（163mg、300μＭ）お
よびＯ−（ベンゾトリアゾ−１−リル）−1,1,3,3−テ
トラメチルウロニウム−テトラフルオロホウ酸塩（87m
g、270μＭ）を加えた。N,N−ジメチルホルムアミド
（1.25ml）およびピリジン（1.25ml）をバイアルに加
え、次いで、N,N−ジイソプロピルエチルアミン（105μ
ｌ、600μＭ）を加えた。バイアルは、すべての固体が
溶解するまで振とうした。１分後、バイアルの内容物を
ペプチド合成用容器に加え、20分間振とうした。次い
で、反応溶液を流し、支持体をピリジン（５回3ml）で
洗浄した。残った非結合のアミンは、N,N−ジメチルホ
ルムアミド中のＮ−ベンジルオキシカルボニル−N'−メ
チルイミダゾール−トリフレートの10％溶液（2.25ml）
を加えることによってキャップした。５分間振とうした
後、キャッピング溶液を流し、支持体を再びピリジン
（４回3ml）で洗浄した。 上の段落に記載したように、脱保護、カップリングお
よびキャッピングは、次のような順序で、PNAモノマー:
N4−ベンジルオキシカルボニル−１−（ｔ−ブチルオキ
シカルボニル−アミノエチルグリシル）シトシン、およ
び１−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチルグ
リシル）チミン、N4−ベンジルオキシカルボニル−１−
（ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノエチルグリシル）
シトシン、１−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノ
エチルグリシル）チミン、１−（ｔ−ブチルオキシカル
ボニルアミノエチルグリシル）−チミン，さらに次にＮ
−アセチルグリシン；で繰り返した。最後のカップリン
グ反応を行った後、樹脂をピリジン（５回3ml）およびD
CM（４回3ml）で洗浄した。次いで、樹脂は、アルゴン
を吹き付けることによって乾燥させた。 樹脂の一部分（29mg、10マイクロ当量）を固相ペプチ
ド合成用容器に入れ、テトラヒドロフラン（2.5ml）を
加え、次いで、飽和水性炭酸水素カリウム（0.25ml）お
よび硫酸水素テトラブチルアンモニウム（34mg、100μ
Ｍ）の水溶液を加えた。次いで、反応は、14時間、室温
で振とうして行った。水（1ml）を反応液に加え、その
結果、白色固体の沈殿物を得た。液体を濾過で除去し、
保存した。次いで、樹脂および白色固体に、第一回目の
洗浄で加えた水（1ml）をさらに加えて洗浄した。減圧
下で乾燥状態にまで濃縮すると、その結果、ピンクの油
の混じった白色固体が得られた。水（6ml）を加え、pH
を固体KHSO4で２に調整した。次いで、液体および懸濁
した黄色固体をエッペンドルフ（Eppendorf）チューブ
に移し、固体を遠沈した。溶媒を除去し、残った黄色固
体は、0.1％TFAを含む水中の30％アセトニトリルに再溶
解した。逆層クロマトグラフィーを行った結果、所望の
生成物（2.6mg,1μＭ）を得た：分子質量＝2498［電気
噴霧（electrospray）マススペクトロメトリ］。 実施例６ Ｎ−アセチルグリシル−Ｔ（ｐ）−Ｔ（ｐ）−Ｃ（ｐ）
−Ｔ（ｐ）−Ｃ（ｐ）−Ｇ（ｐ）−Ｃ（ｐ）−Ｔ（5'−
アミノ）−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ（3'−カルボキシ）−Ｔ
（ｐ）−Ｃ（ｐ）−Ａ（ｐ）−Ｇ（ｐ）−Gly−COOH Ｔ（5'−アミノ）−GPAC−CPAC−APAC−Ｔ−Ｔ（3'−
カルボキシ）−Ｔ（ｐ）−CZ（ｐ）−AZ（ｐ）−G
Z（ｐ）−Gly−Ｏ−樹脂（５マイクロ当量、実施例３）
を固相ペプチド合成用容器にいれる。樹脂は、DCM（３
回3ml）、DMF（３回3ml）、およびピリジン（３回3ml）
で洗浄する。バイアルにＮ−アセチルグリシル−Ｔ
（ｐ）−Ｔ（ｐ）−CZ（ｐ）−Ｔ（ｐ）−CZ（ｐ）−GZ
（ｐ）−CZ（ｐ）−COOH（10μＭ、実施例５の様に調製
される）およびＯ−（ベンソトリアゾール−１−イル）
−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム−テトラフルオロ
ホウ酸塩（９μＭ）を加える。N,N−ジメチルホルムア
ミド（0.3ml）およびピリジン（0.3ml）をバイアルに加
え、次いで、N,N−ジイソプロピルエチルアミン（20μ
Ｍ）を加える。バイアルは、すべての固体が溶解するま
で、振とうする。１分後、バイアルの内容物を、ペプチ
ド合成用容器に加え、４時間振とうする。次いで、反応
溶液を流し、支持体をピリジンで５回洗浄する。 テトラヒドロフラン（2ml）を樹脂に加え、次いで、
飽和水性炭酸水素カリウム溶液（0.2ml）および硫酸水
素テトラブチルアンモニウム（27mg、80μＭ）を加え
る。反応は、14時間、室温で振とうして行った。次い
で、溶液を流し、保持する。樹脂を50％テトラヒドロフ
ラン／水（３回1ml）および水（３回2ml）で洗浄する。
洗浄溶液を反応溶液に加え、減圧下で濃縮して、有機溶
媒を除去する−濃縮は最終容量が2mlになった時点で停
止する。無機物はゲル濾過によって除去する。粗物質を
15mMの酢酸水溶液（10ml）に溶解し、真空下での脱ガス
化および窒素の逆充填を交互に４回行う。BaSO4上のパ
ラジウム（５％,30mg）を加え、溶液を室温で２時間攪
拌する。触媒は濾過によって除去し、次いで、生成物は
逆層HPLCによって精製する。 実施例７ 5'−アミノ−デオキシチミジリル−（3'−5'）−3'−Ｏ
−ｔ−ブチルジフェニルシリル−デオキシチミジン（H2
N−Ｔ−Ｔ） 3'−ｔ−ブチルジフェニルシリルデオキシチミジン
（58mg、120μＭ）および5'−（ｐ−メトキシトリフェ
ニルメチルアミノ）−3'−［Ｏ−（２−シアノエチル）
−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミジル］デオ
キシチミジン（71mg、100μＭ）を別々の10ml丸底フラ
スコにいれ、それぞれ無水ピリジン（2ml）で一度、無
水アセトニトリル（1.5ml）で２度、共蒸発させた。次
いで、化合物はそれぞれ無水アセトニトリル（0.75ml）
中に溶解し、合わせた。反応は、無水アセトニトリル中
の0.4M 1H−テトラゾール溶液（1ml,400μＭテトラゾ
ール）を加えることによって開始した。50分間室温で撹
拌した後、反応は、酸化溶液（10mlの0.43％I2/90.54％
THF、0.41％ピリジンおよび9.05％水）中に注ぐことに
よって急冷した。 酸化反応は、さらに40分間攪拌し、ジクロロメタン
（50ml）および水（20ml）を含む分離用漏斗に注いだ。
残ったヨウ素は、有機層を0.3％ピロ亜硫酸ナトリウム
水溶液（95ml）で洗浄することによって除去した。次い
で、有機層は、減圧下で回転蒸発させることによって濃
縮して黄色油状物とした。黄色油状物は、減圧下、トル
エン（２×15ml）で共蒸発させ、残留ピリジンを除去し
た。 次いで、粗物質はジクロロメタン（6ml）に溶解し、
トリチル基は、３％トリクロロ酢酸／ジクロロメタン溶
液（3ml）を加えることによって除去した。15分間、室
温で攪拌した後、反応は、飽和水性冷（４℃）炭酸水素
ナトリウム（10ml）を含む分離用漏斗に注ぐことによっ
て急冷した。さらに、ジクロロメタン（20ml）を加え、
有機層を分離した。水層に残留した乳濁液は、さらにジ
クロロメタン（20ml）を加えることによって溶かした。
次いで、２つの有機層を合わせて、減圧下で乾燥するま
で濃縮した。所望の生成物は、得られた黄褐色の粗固体
から、20％（v/v）エタノール／クロロホルム、0.2％N,
N−ジイソプロピルエチルアミン（49mg、63μM,63％）
中で分離用シリカTLCによって、精製した。Rf［20％（v
/v）エタノール／クロロホルム、0.2％N,N−ジイソプロ
ピルエチルアミン］＝0.05;1H NMR（200MHz,MeOH−d
4） ｄ 7.65（m,4H）,7.4（m,8H）,6.45（m,1H）,5.9
5（m,1H）,4.6（m,1H）,4.1（m,2H）,3.9（m,1H）,3.6
（m,1H）,3.2（m,1H）,2.9（m,2H）,2.5−2.0（m,4H）,
1.89（s,6H）,1.1（s,9H）;31P NMR（MeOH−d4）ｄ
0.85;ESMS m/e 782。 実施例８ DMT−Ｏ−Ｔ（pna）−CONH−Ｔ−ＴのN,N−ジイソプロ
ピルエチルアンモニウム塩 H2N−TpT（25mg、30μＭ）を1:1のDMF/ピリジン（0.8
ml）に溶解した。分離用バイアルに１−（Ｏ−4,4'−ジ
メトキシトリチル−ヒドロキシエチルグリシル）チミン
（23.5mg、40μＭ）およびＯ−（ベンゾトリアゾール−
１−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム テト
ラフルオロホウ酸塩（11.6mg、36μＭ）を加えた。バイ
アルの内容物は、1:1のDMF/ピリジン（0.8ml）およびN,
N−ジイソプロピルエチルアミン（14μｌ、80μＭ）中
に溶解した。５分後、活性化したエステル溶液を、H2N
−TpT溶液に加えた。反応は、室温で80分間攪拌して行
い、エチルアルコール（0.5ml）を加えて急冷した。さ
らに150分後、反応混合液は、減圧下で濃縮し、乾燥さ
せた。得られた固体は、分離用シリカTLCを用いて、20
％（v/v）エタノール／クロロホルム、0.2％N,N−ジイ
ソプロピルエチルアミン（27mg、20μＭ、67％）で展開
することによって、精製した。Rf［20％（v/v）エタノ
ール／クロロホルム、0.2％N,N−ジイソプロピルエチル
アミン）＝0.18;1H NMR（200MHz,DMSO−d6） ｄ 11.
35（m,3H）,8.95（brs,0.3H）,8.72（brs,0.7H）,7.79
（m,2H）,7.61−7.19（m,22H）,6.91（m,4H）,6.36（m,
1H）,6.03（m,1H）,4.78（m,2H）,4.59（s,1H）,4.41
（m,3H）,4.20（s,1H）,3.93（m,2H）,3.65（s,2H）,3.
18（brs,3H）,2.97（m,2H）,3.74（s,6H）,3.42（m,4
H）,2.01（brs,4H）,1.77（m,7H）,1.62（s,2H）,1.03
（m,15H）;13C NMR（DMSO−d6）:167.9,164.6,163.8,1
58.2,150.5,144.9,143.0,136.1,135.7,132.9,130.2,12
9.8,128.1,127.8,126.8,123.4,118.6,113.4,110.7,110.
1,107.9,86.3,84.0,83.0,74.8,74.5,61.3,56.2,55.1,4
7.5,26.8,18.7,12.1:31P NMR（DMSO−d6） ｄ −0.
2,−1.05;ESMS m/e 1351. 実施例９ tBOC−AZ（pna）−CONH−Ｔ−ＴのN,N−ジイソプロピル
エチルアンモニウム塩 H2N−TpT（19mg、24μＭ）を1:1のDMF/ピリジン（0.6
5ml）に溶解した。別のバイアルに、N6−ベンジルオキ
シカルボニル−１−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−ア
ミノエチルグリシル）−アデニン（12.7mg、24μＭ）お
よびＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3
−テトラメチルウロニウム テトラフルオロホウ酸塩
（7.1mg、22μＭ）を加えた。バイアルの内容物は、1:1
のDMF/ピリジン（0.65ml）およびN,N−ジイソプロピル
エチルアミン（8.4μｌ、48μＭ）に溶解した。２分
後、活性化されたエステル溶液を、H2N−TpT溶液に加え
た。反応は、室温で105分間、攪拌して行い、エチルア
ルコール（0.5ml）を加えることによって急冷した。さ
らに120分後、反応混合物は、減圧下で濃縮し乾燥させ
た。得られた固体は、分離用シリカTLCを用い、20％（v
/v）エタノール／クロロホルム、0.2％N,N−ジイソプロ
ピルエチルアミン（6mg、５μＭ、21％）で展開するこ
とによって精製した。Rf［20％（v/v）エタノール／ク
ロロホルム、0.2％N,N−ジイソプロピルエチルアミン）
＝0.07;1H NMR（200MHz,DMSO−d6） ｄ 11.37（s,1
H）,11.22（s,1H）,10.64（brs,1H）,9.17（brs,0.3
H）,8.90（brs,0.7H）,8.59（m,2H）,8.30（m,1H）,7.8
0（M,1H）,7.58（S,3H）,7.38（m,12H）,7.16（m,1H）,
6.36（m,1H）,6.04（m,1H）,5.43（m,1H）,5.32（s,1
H）,5.23（s,2H）,5.1（s,1H）,4.42（m,3H）,4.19（m,
1H）,3.98（s,1H）,3.87（m,3H）,3.77（m,1H）,3.66
（m,1H）,3.02（m,2H）,22.68（m,1H）,2.03（m,4H）,
1.74（m,6H）,1.02（m,30H）;13P NMR（DMSO−d6）
ｄ −0.01,−0.8。 実施例10 １−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチルグリ
シル）チアミン、エチルエステル １−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチルグ
リシル）チミン（300mg、780μＭ）は、50％のDMF/ピリ
ジン（3.0ml）に溶解し、N,N−ジイソプロピルエチルア
ミン（0.25ml、1.44mM）を加えた。５分間撹拌した後、
Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3−テ
トラメチルウロニウム テトラフルオロホウ酸塩（350m
g、1.1mM）を加えて、薄オレンジ色の溶液を得た。反応
は30分間攪拌して行った。その後、無水エタノール（0.
75ml、4.26mM）を加えた。さらに90分間撹拌した後、反
応混合物を減圧下で濃縮して油状物を得た。油状物は、
酢酸エチル（30ml）中に溶解し、５℃に冷却した。精製
生成物は、白色固体として沈殿し、濾過によって集め
た。（289mg、701μＭ、90％）:1H NMR（200MHz,CDC
l3） ｄ 8.33（brs,1H）,7.02（s,0.3H）,6.97（s,0.
7H）,5.58（m,1H）,4.59（s,1.4H）,4.43（s,0.6H）,4.
1（s,2H）,3.54（m,2H）,3.33（m,2H）,1.92（s,3H）,
1.47（s,9H）。 実施例11 TBDPS−Ｔ−CONH−Ｔ（pna）−OEt １−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチルグ
リシル）チミン（30mg、72μＭ）のエチルエステルを1.
0mlのトリフルオロ酢酸中に溶解し、室温で30分間攪拌
した。これを真空下で濃縮し、次いで、5mlのトルエン
で２回、共蒸発させた。5'−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニル
シリル−3'−カルボキシメチルデオキシリボチミジン
（25mg、48μＭ）は、0.400mlの1:1のDMF/ピリジン溶液
中に溶解した。この溶液に、TBTU（21mg、65μＭ）およ
びN,N−ジイソプロピルエチルアミン（25μｌ、144μ
Ｍ）を加えた。反応液は、薄いオレンジ色になり、これ
を30分間攪拌した。TFA脱保護段階からのアミンを0.6ml
のDMF/ピリジンに溶解し、活性化カルボキシチミジン溶
液に加え、室温で１時間攪拌した。TLC分析（20％MeOH/
DCM）は、すべての活性化酸が消費されたことを示し
た。溶液を真空下で濃縮して油状物とした。油状物は、
2mmの分離用TLCプレート（20mm×20mm）上で、溶出溶媒
として20％のMeOH/DCMを用いて精製した。最も極性の低
いフラクションが、PNA−DNAキメラを含み、所望の生成
物を白色固体（25mg、36μＭ、50％）として得た。1 H NMR（200MHz,CDCl3） ｄ 9.8（brs,1H）,9.6（br
s,1H）,7.7（m,4H）,7.3（m,9H）,7.0（dd,1H）,6.2
（m,1H）,4.5−3.4（12H）,2.9（m,1H）,2.5−2.1（m,4
H）,1.5（s,3H）,1.3（d,6H）,1.1（s,9H）;13CNMR（CD
Cl3）:d 11.764,12.083,12.391,14.144,26.796,27.05
5,29.708,35.232,37.177,37.788,38.932,48.298,61.48
6,64.854,84.476,85.018,111.110,127.711,129.980,13
5.407,135.654,140.976,150.835,151.555,167.416,172.
192;ESMS m/e 817. 実施例12 Ｔ−CONH−Ｔ（pna）−OEt 上記のダイマー（30mg、0.058mM）は、1mlの乾燥THF
中に溶解することによって脱シリル化し、０℃に冷却し
た。これに、20mlの70％のHF/ピリジンを加え、10mlの1
Mフッ化テトラブチルアンモニウム溶液を加え、反応混
合液を一晩攪拌した。TLC（10％MeOH/DCM）は、反応が
完了したことを示した。溶液は、1mlの飽和NaHCO3を加
えて急冷し、ガス蒸発が終わるまで攪拌した。水層は、
さらに5mlの水を加えて希釈し、3mlの酢酸エチルで２回
抽出した。有機層は、集めて捨てた。水層は、乾燥する
まで蒸発させ、脱保護したダイマーおよびNaHCO3の混合
物を得た。混合物をメタノール中に懸濁し、20×20cm、
0.5mmの分離用TLCプレートを２枚用い、クロロホルム中
30％エタノールで溶離することによって精製した。プレ
ートは溶離を終えた後、乾燥させ、蛍光帯をかきとり、
抽出した。抽出物を濾過し、蒸発させると、少量のフッ
化テトラブチルアンモニウムの混濁した12mgの脱保護ダ
イマー（収率56％）を得た。1 H（CD4OD）:1.0−1.5（mm,10H）;1.5（m,2H）;1.9（s,
6H）;2.1−2.8（mm,6H）;3.2−4.0（mm,15H）;4.1−4.4
（m,4H）;4.7（s,1H）;6.1（m,1H）;7.3（s,1H）;8.0
（s,1H）。 実施例13 （5'−DMT）−AZ−Ｔ−（3'−カルボキシ）−Ｔ（pna）
（シアノエトキシ保護ホスホジエステル結合を含む） 実施例12の脱保護ダイマー（12mg、0.0207mM）を無水
ピリジンで２回、無水アセトニトリルで２回、共蒸発さ
せた。得られた白色固体を1:1のアセトニトリル:DMF3ml
中に溶解した。この溶液に、1mlの0.1M−アデノシンホ
スホルアミダイトおよび1mlの0.4M 1H−テトラゾール
溶液を加えた。これを、周囲温度で１時間攪拌し、次い
で、さらに1mlのアミダイトを加え、攪拌をさらに１時
間続けた。終了時に10mlの酸化溶液（90.54％THF、0.41
％ピリジンおよび9.05％水中の0.43％I2）を加え、反応
液を１時間攪拌した。反応液は25mlの1M−亜硫酸水素ナ
トリウム溶液を加えて急冷した。この溶液は、クロロホ
ルム２×20mlで抽出し、集めた抽出物を別の亜硫酸水素
溶液の一部分25mlで洗浄し、僅かに黄色の有機層を得
た。クロロホルム溶液は、硫酸マグネシウム上で乾燥さ
せ、濃縮して黄色油状物とした。混合物は、20×20cmの
分離用TLCプレート（２枚、0.5mmコーティング）を用
い、ジクロロメタン中の20％アセトンで溶離して精製し
た。トリマーのジアステレオマー混合物は、93％の収率
で25mgの油状物として単離した。1 H（CDCl3）:1.2（m,13H）;2.5−3.2（mm,5H）;3.4（m,
4H）;3.7（s,6H）;4.1（m,1H）;4.4（m,1H）;5.2（m,1
H）;6.5（m,1H）;6.8（m,4H）;7.3（m,10H）;7.5（m,3
H）;8.0（d,2H）;8.2（d,2H）;8.7（s,1H）;9.1（s,1
H）;31P（CDCl3）:8.247,8.116。 実施例14 NH4OH脱保護条件下でのPNAオリゴマーの安定性 第一の場合、遊離のアミノ末端を含むPNAオリゴマー
（Ｈ−TAT−TCC−GTC−ATC−GCT−CCT−CA−Lys−NH2）
（すべてPNA）を、70％の濃NH4OH中に溶解した。反応液
は23℃でインキュベートし、アリコートは以下に示す時
間点に逆層HPLCで試験した。第二の実験では、グリシル
でキャップしたアミノ末端を持つPNAオリゴマー（Ｈ−G
ly−TGT−ACG−TCA−CAA−CTA−Lys−NH2）（すべてPN
A）を、90％濃NH4OH中に溶解し、シールしたフラスコ
中、55℃に加熱した。 遊離のアミノ末端を含むPNAオリゴマーのNH4OH安定性
は、PNA/DNAキメラから塩基保護基を除去するには不十
分であった。グリシル基でアミノ末端をキャッピングす
ると、水性塩基に対するPNAの安定性が大きく増加し
た。グリシル−キャップPNAは、11時間点でほんの少し
分解され、23時間後15％が分解された。グリシン−キャ
ップPNAは、フェノキシアセチル保護基を除去するため
に用いる条件下では完全に安定であり、標準的DNA塩基
保護基（ベンゾイルおよびイソブチリルアミド）に用い
る条件にも比較的安定である。結果を表１に示す。 実施例15 アミンおよびエステル結合を通して結合した中央の2'−
デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチド領域に
隣接するペプチド核酸領域を持つ高分子 ペプチド核酸の第一領域は、上記の実施例２により調
製される。ペプチド核酸領域は、アミン基保護モノマー
を用いてＣ末端からＮ末端へ向かって調製される。第一
のペプチド領域が完成した後、末端アミンのブロック基
を除去し、得られたアミンは、Vasseurら、J.Am.Chem.S
oc.,1992,114,4006、の方法に従って調製した3'−Ｃ−
（ホルミル）−2',3'−ジデオキシ−5'−トリチルヌク
レオチドと反応させる。Ｃ−ホルミルヌクレオシドのア
ルデヒド部分とアミンとの縮合は、Vasseur、同上、の
条件により行われ、イミン結合中間体を得た。イミン結
合は、Vasseur、同上、の還元アルキル化条件下、HCHO/
NaBH3CN/AcOHで還元して、メチルアルキル化アミン結合
を通してペプチド核酸に結合させたヌクレオシドを得
た。次いで、中央になる2'−デオキシホスホロチオエー
トヌクレオチド領域は、実施例１のプロトコールに従っ
て、このヌクレオシドに続けて伸長した。第二のペプチ
ド領域のためのペプチド合成は、ヌクレオチドのジメト
キシトリチルブロッキング基を除去した後、DNA領域の
最後のヌクレオチドの5'ヒドロキシと、第二領域の最初
のペプチド核酸のカルボキシ末端とを反応させることに
よって開始する。カップリングは、ピリジン中のEDCを
通して行われ、ペプチドとヌクレオシドの間にエステル
結合が形成される。次いで、ペプチド合成が続けられ、
第二のペプチド核酸領域が完成する。 実施例16 中央の2'−デオキシホスホロセレネートオリゴヌクレオ
チド領域に隣接するペプチド核酸領域を持つ高分子 高分子の2'−デオキシヌクレオチド部分にホスホロセ
レネート結合を導入することを除いて、実施例15の合成
を繰り返し、酸化は、Stawinskiら、Tenth Internatio
nal Roundtable:Nucleosides,Nucleotides and Thei
r Biological Evaluation,September16−20、1992、A
bstracts of Papers,Abstract80に報告されている方
法にしたがって、3H−1,2−ベンゾチアセレノ−３−オ
ールを用いて行った。 実施例17 中央の2'−デオキシホスホロジチオエートオリゴヌクレ
オチド領域に隣接するペプチド核酸領域をもつ高分子 高分子の2'−デオキシヌクレオチド部分へホスホロジ
チオエート結合を導入することを除いて、実施例15の合
成を繰り返し、酸化は、Beatonら、「オリゴヌクレオチ
ドおよびその類似体」、第５章、「オリゴヌクレオチド
ホスホロジチオエートの合成」、109頁、Ａ Practical
Approach,Eckstein,F.編;The Practical Approach
Series,IRL Press,New York 1991、の方法を用い
て行う。 方法１ ras−ルシフェラーゼレポーター遺伝子の組み立て ras−ルシフェラーゼレポーター遺伝子はPCR法を用い
て組み立てた。オリゴヌクレオチドプライマーは、ヒト
のＨ−ras遺伝子の変異体（コドン12）および非変異体
（野生型）の両方のエキソン１の5'領域のPCRクローニ
ングのためのプライマーとして用いるために合成した。
ｃ−Ｈ−ras1活性化オンコジン（コドン12、GGC→GTC）
を含むプラスミドpT24−C3、およびｃ−Ｈ−ras プロ
トオンコジンを含むpbc−N1は、American Type Cultu
re Collection（Bethesda MD）から得た。1.9kbのホ
タルのルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドpT3/T7lu
cは、Clontech Laboratories（Palo Alto,CA）より得
た。オリゴヌクレオチドPCRプライマーは、鋳型として
変異体および非変異体のＨ−ras遺伝子を用いる標準的P
CR反応に用いた。これらのプライマーは、正常および変
異体のＨ−rasの（翻訳開始部位と比較して）配列−53
から＋65に相当し、Nhe IおよびHind IIIの制限エンド
ヌクレアーゼ部位に隣接する、145塩基対のDNA生成物を
生成する。PCR生成物は、標準法に従って、ゲル精製
し、沈殿し、洗浄して、水中に再懸濁した。 P.pyralis（ホタル）のルシフェラーゼ遺伝子のクロ
ーニング用PCRプライマーは、PCR生成物がアミノ末端メ
チオニン残基を除いて全長のルシフェラーゼタンパク質
をコードするように、かつアミノ末端メチオニン残基を
２つのアミノ酸、すなわちアミノ末端のリジン残基およ
び強くロイシン残基に置き換えるように設計した。ルシ
フェラーゼ遺伝子のクローニングに用いるオリゴヌクレ
オチドPCRプライマーは、ルシフェラーゼレポーター遺
伝子を含む商品として入手できるプラスミド（pT3/T7−
Luc）（Clontech）を鋳型として用いる標準PCR法に用い
た。これらのプライマーは、ルシフェラーゼ遺伝子に対
応し、唯一のHind IIIおよびBssH II制限エンドヌクレ
アーゼ部位を両端に持つ、おおよそ1.9kbの生成物を生
ずる。このフラグメントは、標準法に従って、ゲル精製
し、沈殿させ、洗浄し、さらに水中に再懸濁した。 ras−ルシフェラーゼ融合レポーター遺伝子の組み立
てを完成させるために、rasおよびルシフェラーゼのPCR
生成物を、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、制
限エンドヌクレアーゼNhe I、Hind IIIおよびBssH IIを
用いてステロイド誘導性マウス乳房腫瘍ウイルスプロモ
ーターMMTVを含む発現ベクター中に３部分連結反応によ
ってクローン化した。得られたクローンは、ホタルルシ
フェラーゼ遺伝子とフレームが合うように融合されたＨ
−ras5'配列（−53から＋65）が挿入されていた。得ら
れた発現ベクターは、ステロイド−誘導性MMTVプロモー
ターの制御下で発現するras−ルシフェラーゼ融合生成
物をコードする。これらのプラスミド構築物は、ホタル
のルシフェラーゼをコードする配列とフレームが合うよ
うに融合された活性化型（RA2）または正常型（RA4）Ｈ
−rasタンパク質のアミノ酸１−22をコードする配列を
含む。ras−ルシフェラーゼ融合mRNAの翻訳開始は、天
然のＨ−rasのAUGコドンに依存する。変異体および正常
型のＨ−rasルシフェラーゼ融合構築物の両方を、標準
法によるDNA配列分析によって確認した。 方法２ プラスミドDNAの細胞へのトランスフェクション トランスフェクションは、Greenberg,M.E.,Current
Protocols in Molecular Biology,（F.M.Ausubel,R.
Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.Seidman
およびK.Strahl編、John Wiley and Sons,NY,）に記
載の方法を次のように変更して行った。HeLa細胞は、60
mmの皿に５×105細胞／皿で塗布した。全量で10μｇま
たは12μｇのDNAをそれぞれの皿に加えた。この内、１
μｇは、構成的ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモータ
ーの制御下でラットのグルココルチコイド受容体を発現
するベクターであり、残りはras−ルシフェラーゼレポ
ータープラスミドである。リン酸カルシウム−DNA共沈
殿物は、16−20時間後に3mM−EGTAを含むトリス緩衝食
塩水［50mMトリス−塩酸（pH7.5）、150mM−NaCl］で洗
浄することによって除去した。次いで、10％ウシ胎児血
清を補充した新鮮な培養液を細胞に加えた。この時点
で、細胞を本発明の高分子で前処理し、その後デキサメ
タゾンによってレポーター遺伝子の発現を活性化した。 方法３ 細胞の処理 プラスミドのトランスフェクションに次いで、細胞
は、前もって37℃に暖めておいたリン酸緩衝食塩水で洗
浄し、５μg/mlのＮ−［１−（2,3−ジオレイルオキ
シ）プロピル］−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロ
リド（DOTMA）を含むOpti−MEMを、それぞれのプレート
に（1.0ml/穴で）加える。試験化合物は、それぞれのプ
レートに50μＭのストックから加え、４時間37℃でイン
キュベートする。培養液を除去し、10％のウシ胎児血清
を含むDMEMおよび指示濃度の適当な試験化合物で置き換
え、細胞をさらに２時間37℃でインキュベートし、その
後、最終濃度0.2μＭのデキサメタゾンで細胞を処理す
ることによってレポーター遺伝子の発現を活性化する。
細胞を収集し、デキサメタゾン刺激後15時間で、ルシフ
ェラーゼ活性についてアッセイする。 方法４ ルシフェラーゼアッセイ ルシフェラーゼは、Greenberg,M.E.,Current Protoc
ols in Molecular Biology,（F.M.Ausubel,R.Brent,
R.E.Kingston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.Seidmanおよび
K.Strahl編）、John Wiley and Sons,NY、に記載の
方法に従って、界面活性剤トリトンＸ−100で溶菌する
ことによって、細胞から抽出する。Dynatech ML1000ル
ミノメーターを用いて、ルシフェリン（Sigma）を625μ
Ｍになるように加えたときのピークの蛍光を測定した。
それぞれの抽出物について、ルシフェラーゼアッセイは
いろいろな時間に行い、異なる量の抽出物を用いて、デ
ータがアッセイの直線の範囲に集まることを確かめた。 方法５ 融解曲線 吸光度対温度曲線は、IBM PCコンピューターに接続
したGilford260分光光度計およびGilford Response I
I分光光度計を用いて260nmで測定する。緩衝液は、100m
M Na+、10mMホスフェートおよび0.1mM−EDTA、pH7を含
んでいた。試験化合物濃度は、85℃の吸光度、ならびに
PuglisiおよびTinoco,Mechods in Enzymol.,1989,18
0,304−325に記載の方法に従って計算した吸光係数から
測定して、それぞれの鎖あたり４μＭである。Tm値、デ
ュープレックス形成の自由エネルギーおよび会合定数
は、直線傾斜基本線を持つ二状態モデルにデータを合わ
せることから得られる。Petersheim,M.およびTurner,D.
H.,Biochemistry 1983,22,256−263。報告されるパラ
メーターは、少なくとも３回の実験の平均である。幾つ
かの試験化合物では、デュープレックス形成の自由エネ
ルギーもまた、Tm-1対log10（濃度）のプロットから得
られる。Borer,P.N.,Dengler,B.,Tinoco,I.,Jr.,および
Uhlenbeck,O.C.,J.Mol.Biol.,1974,86,843−853。 方法６ ゲルシフトアッセイ 構築したras標的転写産物である、変異コドン12を含
む47ヌクレオチドヘアピンは、Limaら、Biochemistry,1
991,31,12055−12061に記載の方法に従って、調製しマ
ッピングした。ハイブリダイゼーション反応は、100mM
ナトリウム、10mMリン酸塩、0.1mM−EDTA、100CPMのT7
−生成RNA（おおよそ10pM）、および1pMから10μＭの濃
度範囲の試験化合物を含む20μｌ中で調製される。反応
は、24時間37℃でインキュベートして行われる。ハイブ
リダイゼーションに次いで、負荷緩衝液を反応物に加
え、反応生成物は、45mMのトリス−ホウ酸および1mM−M
gCl2（TBM）を用いて調製した20％ポリアクリルアミド
ゲル上、未変性で解析する。電気泳動は10℃で行い、ゲ
ルはMolecular Dynamics Phosphorimagerを用いて定
量した。 方法７ RNアーゼＨ分析 RNアーゼＨ分析は、活性化された（コドン12、Ｇ→
Ｕ）Ｈ−ras mRNAの塩基＋23から＋47に対応する25塩
基のオリゴリボヌクレオチドの化学合成物を用いて行っ
た。5'−末端を標識したRNAは、濃度20nMで用い、10倍
モル過剰の試験化合物と共に、20mMトリス−Cl、pH7.
5、100mM−KCl、10mM−MgCl2、1mMジチオスレイトー
ル、10μｇ−tRNAおよび4U−RNsinを含む反応溶液中
で、最終容量10μｌでインキュベートする。反応成分
は、37℃で15分間、プレアニールし、次いで、ゆっくり
室温に冷却する。HeLa細胞核抽出物は、哺乳動物RNアー
ゼＨの源として用いられる。反応は、２μｇの核抽出物
（５μＬ）を加えることによって開始し、37℃で10分
間、反応を進行させる。反応は、フェノール／クロロホ
ルム抽出によって停止させ、RNA成分をエタノールで沈
殿させる。同量のCPMを、7M尿素を含む20％ポリアクリ
ルアミドゲルに負荷し、RNA切断生成物を電気泳動によ
って解析し、視覚化し、次いで、オートラジオグラフす
る。切断生成物の定量は、Molecular Dynamics Densi
tometerを用いて行う。 方法８ rasトランス活性化レポーター遺伝子システム 発現プラスミドpSV−oliは、構成的SV40プロモーター
制御下の活性化（コドン12、GGC→GTC）Ｈ−ras cDNA
挿入物を含み、Bruno Tocque博士（Rhone−Poulenc S
ante Vitry France）より頂いた。このプラスミド
は、鋳型として用いられ、PCRによって、ステロイド誘
導性マウス乳房腫瘍ウイルス（MMTV）プロモーターの制
御下のＨ−ras発現プラスミドを構築する。Ｈ−rasコー
ド配列を得るために、Ｈ−ras遺伝子の570bpのコード領
域をPCRによって増幅させる。PCRプライマーは、クロー
ニングを容易にするためにその5'−領域に唯一の制限エ
ンドヌクレアーゼ部位を持つようにデザインされる。Ｈ
−rasコドン12突然変異オンコジンのコード領域を含むP
CR生成物は、ゲル精製し、消化し、クローニングする前
にもう一度ゲル精製する。この構築物は、発現プラスミ
ドpMAMneo（Clontech Laboratories,CA）中に挿入物を
クローニングすることによって完成される。 ras−応答性レポーター遺伝子pRDO53は、ras発現を検
出するために用いられる。Owenら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.,U.S.A.,1990,87,3866−3870。 方法９ インビボでのras発現のノーザンブロット分析 ヒト泌尿器膀胱癌細胞株系T24は、American Type C
ulture Collection（Rockville MD）より得た。細胞
は,L−グルタミン（Gibco BRL,Gaithersburg MD）と
共に、10％熱不活性化ウシ胎児血清およびそれぞれ50U/
mlのペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した、
McCoy's 5A培地中で増殖させる。細胞は、100mmプレー
トに接種した。細胞は、集密度が70％達したときに、試
験化合物で処理される。プレートは、10mlの前もって暖
めておいたPBS、および2.5μｌ−DOTMAを含むOpti−MEM
還元血清培地5mlで洗浄する。次いで、試験化合物を所
望の濃度で加える。４時間処理した後、培地はMcCoy's
培地で置き換える。細胞は試験化合物処理後48時間で収
集し、RNAを標準CsCl沈殿法で分離する。Kingston,R.
E.、Current Protocols in Molecular Biology（F.
M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.A.Smit
h,J.G.SeidmanおよびK.Strahl編）、John Wiley and
Sons,NY。 ヒトの上皮癌細胞株HeLa229は、American Type Cul
ture Collection（Bethesda,MD）から得た。HeLa細胞
は、10％ウシ胎児血清および100U/mlペニシリンを補充
したDulbecco's Modified Eagle's培地（DMEM）中、
６穴プレート上に単層で維持される。試験化合物での処
理およびRNAの分離は、本質的に、上記のT24細胞の所に
記載した通りである。 ノーザンハイブリダイゼーション：それぞれ10μｇの
RNAは、1.2％アガロース／ホルムアミドゲルで電気泳動
し、標準法で、一晩、GeneBind45ナイロン膜（Pharmaci
a LKB,Piscataway,NJ）に移した。Kingston,R.E.、Cur
rent Protocols in Molecular Biology,（F.M.Ausu
bel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.S
eidmanおよびK.Strahl編）,John Wiley and Sons,N
Y.。RNAは、膜にUV架橋する。二本鎖の32P−標識プロー
ブは、the Prime ａ Gene labeling kit（Promeg
a,Madison WI）を用いて合成する。rasプローブは、コ
ドン12にGGCからGTCへの突然変異を持つ活性化（変異
体）Ｈ−ras mRNAのcDNAクローンのSal I−Nhe Iフラ
グメントである。対照プローブは、G3PDHである。ブロ
ットは、QuickHybハイブリダイゼーション溶液（Strata
gene,La Jolla,CA）で15分間68℃で前ハイブリダイズ
する。10mg/mlのサケ精液DNAを100μｌ混合した熱変性
放射性プローブ（2.5×106カウント/2mlハイブリダイゼ
ーション溶液）を加え、膜を１時間68℃でハイブリダイ
ズする。ブロットは、２×SSC/0.1％SDS中、室温で15分
間、２度、さらに0.1×SSC/0.1％SDS中、60℃で30分
間、一度洗浄する。ブロットは、オートラジオグラフ
し、シグナルの強度を、ImageQuant Phosphorlmager
（Molecular Dynamics,SunnyvaIe,CA）を用いて定量す
る。ノーザンブロットは、最初、rasプローブとハイブ
リダイズさせ、次いで、0.1×SSC/0.1％SDS中で15分間
沸騰させることによって取り除き、対照としてのG3PDH
プローブと再度ハイブリダイズさせて試料の負荷の適性
を照合する。 方法10 癌細胞増殖の阻害および化学療法剤試験の対照としての
利用 細胞は、本質的には、実施例９に記載の方法に従っ
て、培養し、試験化合物で処理される。細胞は、60mmプ
レート上に接種し、集密度が70％に達した時にDOTMA存
在下、試験化合物で処理する。時間経過実験：第１日、
細胞は、最終濃度100nMの単一用量の試験化合物で処理
する。増殖培地は、３日目に一度、取り替え、細胞は、
計数容器を用いて、５日間、毎日計数する。投与量応答
実験：さまざまな濃度（10,25,50,100または250nM）の
試験化合物を細胞に加え、細胞を収集し、３日後に計数
する。次いで、本発明の活性な化合物は、他の化学療法
剤のスクリーニングのための同様のスクリーンの標準と
して用いることができる。
（“Gapped 2' Modified Oligonucleotides"）と称する
前出願である出願番号US92/11339（1992年12月23日提
出）の一部継続出願であり、この前出願US92/11339は、
「ギャップ2'修飾／オリゴヌクレオチド」（“Gapped
2' Modified/Oligonucleotides"）と称する前出願であ
る出願番号第814,961号（1991年12月24日提出）の一部
継続出願であり、両出願は、共に本出願に譲渡される。
さらに、本出願は、「ペプチド核酸の高次構造および結
合」（“Higher Order Structure and Binding of Pept
ide Nucleic Acids"）と称する出願番号第088,658号（1
993年７月２日提出）に関連し、共に本出願に一部分譲
渡される。この出願第088,658号は、「新しいペプチド
核酸」（“Novel peptide Nucleic Acids"）と称する出
願番号第054,363号（1993年４月26日提出）の一部継続
出願であり、第054,363号はPCT EP/91/01219（1992年
５月19日提出）の一部継続出願である。これらの出願の
それぞれの開示は、参照としてここに取り入れられる。 発明の分野 本発明は、PNA−DNA−PNA構造を持つキメラ分子の合
成および使用に関し、ここで、各々の“PNA"はペプチド
核酸であり、“DNA"はホスホジエステル、ホスホロチオ
エートまたはホスホロジチオエート2'−デオキシオリゴ
ヌクレオチドである。細胞、細胞抽出物またはRNアーゼ
Ｈを含む診断試験システム中では、RNA標的分子とハイ
ブリダイズ可能な塩基配列を持つ本発明のキメラ高分子
は、その標的RNA分子と結合でき、そのRNA標的分子のRN
アーゼＨによる鎖切断を容易にする。 発明の背景 大抵の疾病状態を含む哺乳類の健康状態のほとんど
が、タンパク質に影響されていることは、良く知られて
いる。その様なタンパク質は、直接作用するかまたはそ
れらの酵素機能を通してかのいずれかによって、動物お
よびヒトの多くの病気の主要な一因となっている。古典
的治療学は、一般的に、病気の原因または病気の強化機
能を和らげるために、その様なタンパク質との相互作用
に焦点が当てられてきた。しかしながら、最近では、メ
ッセンジャーRNA（mRNA）またはタンパク質の合成を指
示するその他の細胞内RNAとの相互作用によってそれら
のタンパク質の実際の生成を緩和する試みがなされてい
る。一般的に、望ましくないタンパク質形成を導く遺伝
子発現を干渉する、あるいは調整する事が、その様な治
療学的研究の目的である。 アンチセンス方法論は、これら細胞内核酸の正常かつ
重要な機能を崩壊するように、比較的短いオリゴヌクレ
オチドを一本鎖RNAまたは一本鎖DNAに相補的にハイブリ
ダイズさせることである。ハイブリダイゼーションは、
RNAまたはDNAとオリゴヌクレオチドの複素環式塩基との
ワトソン−クリック塩基対を介しての配列特異的水素結
合である。その様な塩基対は、互いに相補的であると言
われる。 Cohen、オリゴヌクレオチド：遺伝子発現のアンチセ
ンス阻害剤（Oligonucleotides:Antisense Inhibitors
of Gene Expression）、CRC Press,Inc.,Boca Ra
ton,F1（1989）に記載の通り、核酸機能の崩壊を提供す
るような自然発生的事件には、少なくとも二つの型があ
ると考えられる。第一の型は、ハイブリダイゼーション
停止である。これは、オリゴヌクレオチド阻害剤が標的
核酸に結合して、その結果、単純な立体障害によって、
重要なタンパク質、たいていはリボゾームの核酸との結
合を妨害するという終結反応（terminating event）を
意味する。メチルホスフェートオリゴヌクレオチド（例
えば、Millerら、Anti−Cancer Drug Design,1987,2,
117を参照の事）とα−アノマーオリゴヌクレオチド
は、ハイブリダイゼーション停止によって核酸機能を崩
壊させると考えられる最も広範囲にわたって研究されて
いる２つのアンチセンス剤である。 オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション停止の
能力を決定するために、相補的核酸と結合するオリゴヌ
クレオチドの相対能力を、特定のハイブリダイゼーショ
ン複合体の融解温度を測定することによって比較するこ
とができる。融解温度（Tm）は、二重らせんの特徴的物
理学的性質であり、これは、らせん形（ハイブリダイズ
している）対コイル形（ハイブリダイズしていない）が
50％の比率で存在する摂氏温度を意味している。Tmは、
UVスペクトルを用いてハイブリダイゼーションの形成お
よび崩壊（融解）を測定することによって測定される。
ハイブリダイゼーションの間に生ずる塩基のスタッキン
グは、UV吸収の減少（淡色化）を伴う。結果的に、UV吸
収の減少はより高いTmを示す。Tmがより高くなると、鎖
の結合強度はより大きくなる。非ワトソン−クリック塩
基対、すなわち塩基の誤対合は、Tmに強い不安定化影響
を持つ。 アンチセンスオリゴヌクレオチドが終結反応を起こす
第２の型には、細胞内RNアーゼによる標的RNAの酵素切
断が関与する。その様なRNアーゼＨによる切断機構は、
2'−デオキシリボフラノシルオリゴヌクレオチドが標的
RNAにハイブリダイズすることが必要である。その結果
生じたDNA−RNAデュープレックスは、RNアーゼＨ酵素を
活性化し；活性化された酵素はRNA鎖を切断する。RNA鎖
切断は、RNAの正常な機能を破壊する。ホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチドは、この型の終結反応により作
用する卓越したアンチセンス剤の一つである。DNAオリ
ゴヌクレオチドがRNアーゼＨの活性化に有効であるため
には、オリゴヌクレオチドは、RNアーゼＨを活性化する
ために十分な時間、細胞内で生き残るためには、ヌクレ
アーゼに対して適度に安定でなければならない。 Walderらは、最近の数報の発表で、RNアーゼＨとオリ
ゴヌクレオチドの相互作用についてさらに記載してい
る。そのうち特に興味深いものには、（１）Dagleら、N
ucleic Acids Research,1990,18,4751;（２）Dagle
ら、Antisense Research And Development,1991,1,1
1;（３）Ederら、J.Biol.Chm.,1991,266,6472;および
（４）Dagleら、Nucleic Acids Research,1991,19,18
05:がある。これらの報告の中で、Walderらは、修飾さ
れていないホスホジエステル−ヌクレオシド間結合と、
修飾されたホスホロチオエート−ヌクレオシド間結合の
両方を持つDNAオリゴヌクレオチドが、細胞内RNアーゼ
Ｈの基質になることに注目している。それらは基質であ
るので、それらはRNアーゼＨによる標的RNAの切断を活
性化する。しかしながら、さらに、著者らは、アフリカ
ツメガエルの胚では、ホスホジエステル結合およびホス
ホロチオエート結合の両方は、また、エキソヌクレアー
ゼ分解の対象でもあることに注目している。その様なヌ
クレアーゼ分解は、それがRNアーゼＨ活性化に有効なヌ
クレオチドを急速に涸渇させるために、好ましくない。
参考文献（１）、（２）および（４）に記載されている
ように、RNアーゼＨの活性化を提供しつつヌクレアーゼ
分解に対してそれらのオリゴヌクレオチドを安定化させ
るために、Walderらは、ホスホロアミダイト、アルキル
ホスホネートまたはホスホトリエステル結合の区画の間
に短い区画のホスホジエステル結合ヌクレオチドを配置
した2'−デオキシオリゴヌクレオチドを構築した。ホス
ホロアミダイトを含むオリゴヌクレオチドは、エキソヌ
クレアーゼに対して安定化されるが、参考文献（４）に
記載するように、著者らは、それぞれのホスホロアミダ
イト結合が、ホスホロアミダイトを含むオリゴヌクレオ
チドのTm測定値を1.6℃減少させることに注目してい
る。その様なTm値の減少は、オリゴヌクレオチドとその
標的鎖との間のハイブリダイゼーションにとって、望ま
しくない減少を示している。 他の著者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとそ
の標的鎖との間のハイブリダイゼーションのその様な損
失がもたらす影響について注釈している。Saison−Behm
oarasら、EMBO Journal,1991,10,1111、は、オリゴヌ
クレオチドはRNアーゼＨの基質になりうるが、mRNAへの
ハイブリダイゼーションが弱いため、RNアーゼＨによる
切断効率は低いことを見出だした。また、著者らは、オ
リゴヌクレオチドの3'末端にアクリジン置換が含まれる
と、オリゴヌクレオチドがエキソヌクレアーゼから保護
されることに注目した。 さらにまた、米国特許第5,149,797号（Pedersonら、1
992年９月22日発行）は、RNアーゼＨ機構によって作用
するオリゴヌクレオチドについて記載している。この特
許の請求の範囲のオリゴヌクレオチドは、メチルホスホ
ネート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデ
ートまたはホスホロアミデートに隣接するホスホロチオ
エートヌクレオチドから構成される内部セグメントから
なる。これらのオリゴヌクレオチドの成分、すなわち、
ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロモ
ルホリデート、ホスホロピペラジデートまたはホスホロ
アミデートはすべて、オリゴヌクレオチド結合として個
々に用いられた場合には、オリゴヌクレオチドとその標
的鎖との間のハイブリダイゼーションを減少させるの
で、Saison−Behmoarasらの説明は、この特許に記載さ
れているオリゴヌクレオチドにも等しく当てはまる。 アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびRNアーゼＨを
用いての標的RNA鎖の切断が有効であろう事は認識され
ているが、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性およ
びハイブリダイゼーションの忠実度もまた非常に重要で
ある。ハイブリダイゼーションの性質を維持または改良
し、かつヌクレアーゼ耐性を提供すると同時にRNアーゼ
Ｈを活性化することの出来る方法または物質は長い間必
要とされてきたが、これまで当該技術分野においては、
その様な方法および物質は示唆されていない。従って、
その様な方法および物質が切望される。 発明の目的 本発明の目的は、結合親和性の改善された状態で標的
鎖とハイブリダイズする、キメラ高分子を提供すること
である。 さらなる目的は、ヌクレアーゼ分解に対する安定性を
持つキメラ高分子を提供することである。 さらに、本発明の目的は、標的鎖を切断するためにRN
アーゼＨを活性化するキメラ高分子を提供することであ
る。 さらに、本発明の目的は、インビトロでの細胞の状態
および動物の健康状態、特に疾病状態をアッセイするた
めの、研究および診断の方法ならびに物質を提供するこ
とである。 他の目的は、標的RNAの活性を調節することを通して
病気を治療するための治療および研究方法ならびに物質
を提供することである。 発明の簡単な説明 本発明では、ペプチド核酸および2'−デオキシオリゴ
ヌクレオチドから形成される高分子が提供される。その
様な高分子は、次の構造:PNA−DNA−PNA［式中、PNA部
分はペプチド核酸配列であり、DNA部分はホスホジエス
テル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート
2'−デオキシオリゴヌクレオチド配列である］をもつ。
高分子のPNA部分は、ヌクレアーゼ耐性を増加させ、標
的RNAへの高分子の結合親和性を増加させると考えられ
る。2'−デデオキシオリゴヌクレオチド部分は、RNアー
ゼＨ応答およびRNA標的鎖の切断を誘発すると考えられ
る。 本発明の高分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチド
（即ちDNA）部分は、2'−デオキシ−エリスロ−ベント
フラノシル糖部分を持つヌクレオチド単位から形成され
るオリゴヌクレオチドセグメントである。それぞれのヌ
クレオチドは、ヌクレオチドの2'−デオキシ−エリスロ
−ペントフラノシル糖部分に結合したヌクレオベース
（nucleobase）を含む。ヌクレオチドは、ホスホジエス
テル結合、ホスホロチオエート結合および／またはホス
ホロジチオエート結合によって、互いにおよび／または
他の部分と結合している。本発明のある望ましい高分子
では、高分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチド部分の
ヌクレオチドのそれぞれが、ホスホロチオエート結合に
よって互いに結合している。他の望ましい実施態様で
は、2'−デオキシオリゴヌクレオチド部分のヌクレオチ
ドは、ホスホジエステル結合によって互いに結合してお
り、さらに望ましい実施態様では、ホスホジエステルお
よびホスホロチオエート結合の混合物が、2'−デオキシ
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位を互いに結合し
ている。 高分子のペプチド核酸部分は、核酸の相補鎖への高分
子の結合親和性を増加させる。さらに、細胞ヌクレアー
ゼによる分解に対する高分子のヌクレアーゼ安定性を提
供する。１つのまたはそれより多くのまたはそのすべて
がホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合
からなる高分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチド部分
を選択することにより、本発明の高分子にさらなるヌク
レアーゼ安定性が与えられる。 本発明の高分子のPNA部分は、Ｎ−（２−アミノエチ
ル）−グリシンからなるユニット、またはそのユニット
のグリシン部分の窒素原子に、カルボキシメチル部分ま
たはその類似体のようなリンカーを通してそれに結合す
るヌクレオベースをもつ上記のＮ−（２−アミノエチ
ル）−グリシンの類似体からなるユニットから構成され
る。ユニットは、グリシン部分のカルボキシル基とアミ
ノエチル部分のアミン基との間に形成されるアミド結合
を通して互いに連結されている。ヌクレオベースは、核
酸の４つの一般的なヌクレオベースの一つであることが
でき、また、それらは、その他の天然のまたは合成のヌ
クレオベースを含むこともできる。 本発明の望ましい高分子では、PNA−DNA−PNA構造
は、それぞれのＮ−（２−アミノエチル）グリシンPNA
ユニットとそれぞれの2'−デオキシ−エリスロ−ペント
フラノシル糖ホスフェートDNAユニットを互いに繋ぎ合
わせることによって形成される。この様に、本発明の高
分子のPNA部分のヌクレオベースは、Ｎ−（２−アミノ
エチル）グリシンPNAユニットからなる骨格上に連な
り、本発明の高分子のDNA部分のヌクレオベースは、2'
−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖ホスフェー
トユニットからなる骨格上に連なっている。本発明の高
分子のPNA部分のヌクレオベースおよびDNA部分のヌクレ
オベースは、共に、それらのそれぞれの骨格ユニットに
よって、例えば標的RNA鎖のような相補的核酸にハイブ
リダイズできる順序（配列）に接続される。 本発明の望ましい高分子では、PNAおよびDNA部分は互
いにアミド結合でつながっている。本発明のその様な望
ましい高分子では、構造： PNA−（アミド結合）−DNA−（アミド結合）−PNA: の高分子である。PNAとDNA部分をつなぐのに用いること
ができる他の結合には、アミン結合およびエステル結合
が含まれる。 本発明の高分子は、望ましくは、総数約９から約30の
ヌクレオベースを含有するサブユニットからなる。より
望ましくは、高分子は、約15から約25のヌクレオベース
を含有するサブユニットからなる。上記のように、RNア
ーゼＨ応答を誘発するための、この全体配列のうちの高
分子の長さは、３より大きく望ましくは５またはそれよ
り大きい連続する2'−デオキシ−エリスロ−ペントフラ
ノシル含有ヌクレオチドサブユニットのサブ配列であろ
う。 ペプチド核酸と2'−デオキシヌクレオチドサブユニッ
トの両者にとって望ましい本発明のヌクレオベースとし
ては、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミ
ン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニ
ン、６−メチルおよびその他のアルキルアデニン、２−
プロピルおよびその他のアルキルアデニン、５−ハロウ
ラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシル、
５−プロピニルシトシン、７−デアザアデニン、７−デ
アザグアニン、７−デアザ−７−メチル−アデニン、７
−デアザ−７−メチル−グアニン、７−デアザ−７−プ
ロピニル−アデニン、７−デアザ−７−プロピニル−グ
アニンおよびその他の７−デアザ−７−アルキルまたは
７−アリールプリン、N2−アルキル−グアニン、N2−ア
ルキル−２−アミノ−アデニン、プリン６−アザウラシ
ル、６−アザシトシンおよび６−アザチミン、５−ウラ
シル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハ
ロアデニン、８−アミノ−アデミン、８−チオールアデ
ニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシ
ルアデニンおよびその他の８−置換アデニンならびに８
−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグ
アニン、８−チオールアルキルグアニン、８−ヒドロキ
シルグアニンおよびその他の８−置換グアニン、その他
のアザおよびデアザ−ウラシル、その他のアザおよびデ
アザ−チミジン、その他のアザおよびデアザ−シトシ
ン、アザおよびデアザ−アデニン、アザおよびデアザ−
グアニンまたは５−トリフルオロメチルウラシルおよび
５−トリフルオロシトシンが挙げられる。 また、本発明は、望ましくないタンパク質の生成を特
徴とする病気をもつ生物を治療する方法を提供する。こ
れらの方法は、生物を、核酸の相補鎖に特異的にハイブ
リダイズする能力を持つヌクレオベースの配列を持つ高
分子と接触させることを含む。さらに、その方法は、ヌ
クレオベースの一部分がペプチド核酸サブユニット（PN
Aユニット）からなり、その残りのヌクレオベースは2'
−デオキシヌクレオチドサブユニット（DNAユニット）
からなることを含む。ペプチド核酸サブユニットおよび
デオキシヌクレオチドサブユニットは互いに結合して、
PNA−DNA−PNA（PNAはペプチド核酸であり、DNAは2'−
デオキシオリゴヌクレオチドである）の構造を持つ高分
子を形成する。 さらに、本発明では、核酸の相補鎖に特異的にハイブ
リダイズする能力を持つヌクレオベース配列をもつ薬学
上有効な量の高分子を含む組成物が提供される。さら
に、方法は、ヌクレオベースの一部分がペプチド核酸サ
ブユニット（PNAユニット）からなり、残りのヌクレオ
ベースは2'−デオキシヌクレオチドサブユニット（DNA
ユニット）からなる事を含む。ペプチド核酸サブユニッ
ト（PNA）およびデオキシヌクレオチドサブユニット（D
NA）は互いに結合されて、PNA−DNA−PNA構造の高分子
を形成する。さらに、組成物は、薬剤として許容しうる
希釈剤または担体を含む。 さらに、本発明では、上記のように、RNアーゼＨ酵素
および核酸を含む試験溶液をPNA−DNA−PNA高分子と接
触させることを含む、特定の核酸の配列をインビトロで
修飾する方法が提供される。 また、上記のように、生物をPNA−DNA−PNA高分子と
接触させることを含む、生物中でのハイブリダイゼーシ
ョンおよびRNアーゼＨ酵素の活性化を同時に増強する方
法が提供される。 図面の簡単な説明 図１は、本発明のある化合物の固相合成法を図解する
化学スキームである。 図２は、本発明のある化合物の固相合成法を図解する
化学スキームである。 図３は、本発明のある化合物の液相合成法を図解する
化学スキームである。 図４は、本発明のある化合物の液相合成法を図解する
化学スキームである。 図５は、本発明のある化合物の固相合成法を図解する
化学スキームである。 図６は、本発明のある化合物の液相合成法を図解する
化学スキームである。 本発明の詳細な説明 本発明の目的に従って、ヌクレアーゼ耐性を増加さ
せ、同時に、相補鎖への結合親和性を増加させ、また、
RNアーゼＨの基質でもある、新規の高分子が提供され
る。本発明の高分子は、複数のペプチド核酸サブユニッ
ト（PNAサブユニット）と複数の2'−デオキシヌクレオ
チドサブユニット（DNAサブユニット）から組み立てら
れている。それらを組み立てて、構造:PNA−DNA−PNAの
高分子とする。それぞれのペプチド核酸サブユニットお
よびそれぞれの2'−デオキシヌクレオチドサブユニット
は、標的RNA分子上、またはDNA分子およびタンパク質を
含むその他の標的分子上の同様のヌクレオベースと特異
的にハイブリダイズする能力を持つヌクレオベースを含
む。 本発明の高分子のペプチド核酸部分は、本発明の高分
子のヌクレアーゼ耐性を増加させる。さらに、これらの
同一のペプチド核酸部分は、核酸の相補鎖への、本発明
の高分子の結合親和性をも増加させる。本発明の高分子
の2'−デオキシヌクレオチド部分は、それぞれ、その糖
部分として2'−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル
基を含む。 上記のガイドラインに関連して、2'−デオキシヌクレ
オチドサブユニットの各々は、“天然”または“合成”
の部分であることができる。従って、本発明の文脈で
は、“オリゴヌクレオチド”という用語は、第一に、複
数の連結ししたヌクレオチドユニットから形成されるポ
リヌクレオチドをさす。ヌクレオチドユニットは、天然
のヌクレオシド間ホスホジエステル結合を通して互いに
連結される。ヌクレオチドユニットは、天然型の塩基お
よび2'−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖基か
ら形成される。従って、“オリゴヌクレオチド”という
用語は、実質上、天然型の種または天然型ヌクレオチド
ユニットから形成される合成種を含む。 オリゴヌクレオチドという用語は、天然型の構造なら
びに（天然塩基と同様に機能する修飾塩基部分を含む）
非天然型または“修飾された”構造を含むことを意味し
ている。高分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチド部分
のヌクレオチドは、天然のホスホジエステル結合に加え
て、その他の選ばれた合成結合で互いに連結されうる。
これらのその他の結合には、ホスホロチオエートおよび
ホスホロジチオエート糖間結合が含まれる。更に、適当
な結合として考えられるものは、ホスホロセレネートお
よびホスホロジセレネート結合である。塩基部分、すな
わち、2'−デオキシヌクレオチドのヌクレオベースは、
天然の塩基、すなわちアデニン、グアニン、シトシン、
ウラシルまたはチミジンを含みうる。あるいは、これら
は、天然のプリンおよびピリミジン塩基の代わりに用い
られるデアザまたはアザープリンおよびピリミジン;5ま
たは６位に置換基を持つピリミジン塩基;2、６または８
位に改変されたまたは置き換えられた置換基を持つプリ
ン塩基；を含みうる。それらは、また、本発明の精神に
一致するその他の修飾を含んでも良い。その様な2'−デ
オキシオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチ
ド（または天然系に沿って合成されたオリゴヌクレオチ
ド）と機能的に交換できるが、天然構造から一つまたは
それより多くの違いを持つものとして最もよく記載され
る。その様な2'−デオキシオリゴヌクレオチドは、高分
子中で有効に機能して標的RNA鎖のRNアーゼＨ切断を誘
発するかぎり、すべて、本発明に包含される。 本発明の一つの好ましい実施態様では、高分子のペプ
チド核酸部分によって確立される以上のヌクレアーゼ耐
性が、ホスホロチオエート−ヌクレオチド間結合を用い
ることによって得られる。Walderらの報告（上記）に反
して、種々の3'−エキソヌクレアーゼを含むウシ胎児血
清の様な系の中では、ヌクレオシド間結合をホスホジエ
ステル結合からホスホロチオエート結合に修飾すること
はヌクレアーゼ耐性を与えることが認められた。 最近、Brillら、J.Am.Chem.Soc.,1991,113,3972,は、
ホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドもまたヌクレ
アーゼ耐性を示すと報告している。これらの著者らは、
また、ホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドは、相
補的デオキシオリゴヌクレオチドと結合し、RNアーゼＨ
を刺激し、かつlacリプレッサーおよびcroリプレッサー
の結合を刺激することを報告している。この様な性質故
に、本発明の高分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチド
部分にホスホロジチオエート結合を用いても良い。ホス
ホロジチオエートの合成方法は、Beatonら、“オリゴヌ
クレオチドホスホロジチオエートの合成（Synthesis o
f oligonucleotides phosphorodithioates）”、第５
章、109頁、「オリゴヌクレオチドおよびその類似体（O
ligonucleotides and Analogs）、実用研究法（Ａ P
ractical Approach Series）」、Eckstein,F.編;The
Ptactical Approach Series,IRL Press、New Yor
k、1991、に記載されている。 ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート−ヌ
クレオチド間結合を用いることによって、本発明の高分
子にヌクレアーゼ耐性の増加が与えられる場合、その様
な結合は、それぞれのヌクレオチド間の部位に存在する
であろう。その他の実施態様では、すべてより少ないヌ
クレオチド間結合が、ホスホロチオエートまたはホスホ
ロジチオエート結合で修飾されるであろう。 本発明の高分子の結合親和性は、高分子のペプチド核
酸部分によって増加することが見いだされた。例えば、
10merのホモチミジンPNAをそれに相補的な10merのホモ
アデノシンDNAに結合させた場合のTmは73℃であるのに
対して、これに対応する10merのホノチミジンDNAを同様
に相補的である10merのホモアデノシンDNAに結合させた
場合のTmはわずか23℃である。 結合親和性はまた、本発明の2'−デオキシオリゴヌク
レオチドを構成するヌクレオチドサブユニットおよびペ
プチド核酸サブユニットの両方にある種の修飾塩基を用
いることによって増加させることもできる。その様な修
飾塩基は、５−プロピニルピリミジン、６−アザピリミ
ジン、およびＮ−２、Ｎ−６、および２−アミノプロピ
ルアデニンを含むＯ−６位の置換されたプリンを含むで
あろう。その他の修飾されたピリミジンおよびプリン塩
基もまた、核酸相補鎖への高分子の結合親和性を増加さ
せることが予測される。 その様な構造ユニットの製造に用いるための、適当な
ヌクレオベースには、アデニン、グアニン、シトシン、
ウラシル、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−
アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル
ならびにその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグア
ニンの２−プロピルならびにその他のアルキル誘導体、
５−ハロ−ウラシルおよびシトシン、６−アゾ−ウラシ
ル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウ
ラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、アミノ、チオ
ール、チオールアルキル、ヒドロキシルならびにその他
の８位置換のアデニンおよびグアニン、５−トリフルオ
ロメチルおよびその他の５位置換のウラシルおよびシト
シン、７−メチルグアニンおよびその他のヌクレオベー
スが含まれ、それらには、例えば米国特許第3,687,808
号、“The Concise Encyclopedia Of Polymer Sci
ence And Engineering",J.I.Kroschwitz編、John Wi
ley ＆ Sons,1990,858−859、およびEnglisch,U.およ
びGauss,D.H.,Angewandte Chemie、International Ed
ition 1991、30、613に開示されるものがある。 標的RNAのRNアーゼＨ酵素切断を誘発させるために、
本発明の高分子は、その中にDNA型セグメントであるセ
グメントまたはサブ配列を含んでいなくてはならない。
他の点から言うと、本発明の高分子の少なくとも一部分
は、2'−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル糖部分
を持つヌクレオチドサブユニットでなくてはならない。
３つより多くの連続して結合した2'−デオキシ−エリス
ロ−ペントフラノシル含有ヌクレオチドサブユニットを
持つサブ配列は、標的RNAと本発明の高分子のハイブリ
ダイゼーションによるRNアーゼＨ活性を誘発するために
必要であるらしいことが認められた。現在のところ、本
発明の高分子中には、５またはそれより多くの連続した
2'−デオキシ−エリスロ−ペントフラノシル含有ヌクレ
オチドサブユニットのサブ配列を持つことが望ましい。
少なくとも７つの連続する2'−デオキシ−エリスロ−ペ
ントフラノシル含有ヌクレオチドサブユニットが特に望
ましい。 本発明の高分子の全長は、長さ３から何百のサブユニ
ットであることができるが、標的特異性はもっと短い分
子で得る事ができるので、より実用的な最大の長さは、
長さ約30から約50のサブユニットであろう。より望まし
い最大の長さは、長さ約25サブユニットであろう。 標的によって、高分子の最小の長さは、３から約15の
総サブユニットといろいろであろう。実際には、アンチ
センスオリゴヌクレオチドを用いるに当たって、一般的
には、ハイブリダイゼーションにおける適当な親和性を
保証するためには、約15ヌクレオチドの最小の長さが必
要であることが分かった。しかし、上に記載したよう
に、ペプチド核酸サブユニットは、標的分子に対して、
ホスホロチオエート−オリゴヌクレオチドより良い親和
性を持つ正常なホスホジエステル−オリゴヌクレオチド
と比較してより大きいハイブリダイゼーション親和性を
持つので、本発明の高分子を用いる場合には、最小の長
さは通常アンチセンスオリゴヌクレオチドとのアンチセ
ンス結合に用いられるより小さいと予測することができ
る。これらの因子を考慮にいれると、高分子の望ましい
長さは、総数約３から約30のサブユニットであり、より
望ましい範囲は長さ約９から約25のサブユニットであろ
う。 本発明の高分子では、PNAユニットの間に一つあるい
はそれ以上の連続するDNAユニットが配置されるであろ
う。RNアーゼＨ応答を誘発させるためには、上記のよう
に、望ましくは、高分子のDNA部分は、少なくとも３つ
の2'−デオキシヌクレオチドユニットを持つであろう。
DNAユニットの数の上限を決定するために、高分子の全
長、用いるホスフェート結合、標的配列に対する望まし
い忠実度およびその他の因子を含む幾つかの因子が考慮
される。通常は、経済的考慮により、本発明の高分子で
は、標的分子に特異的に結合するために、また、所望す
るならば、RNアーゼＨ応答を引き出すために必要である
よりも多いヌクレオベースを持たないことが望ましい。
RNアーゼＨの機能を利用するためにはこの数は一般的に
約５ヌクレオチドである。さらに、ホスホロチオエート
およびホスホロジチオエート−リン酸結合はそれ自身ヌ
クレアーゼ耐性を示すので、これらの２つのリン酸結合
を用いると、ヌクレアーゼ耐性のために高分子のPNA部
分に頼らなくてはならないホスホジエステルサブユニッ
トと比較して、より長くのびるDNAサブユニットを用い
ることができる。これらの要素を考慮に入れると、本発
明の高分子を含む特に望ましい範囲は、長さ９から約28
のサブユニットであり、2'−デオキシヌクレオチドサブ
ユニットに続いて位置する約５から約８のその様なサブ
ユニットを持つ。 RNアーゼＨの作用機構は、DNA−RNAデュープレックス
を認識し、それに次いでこのデュープレックスのRNA鎖
を切断する。発明の背景の項に上記したように、この技
術分野でのその他の者は、DNA鎖にヌクレアーゼ安定性
を与えるために修飾したDNA鎖を用いてきた。これを行
うために、彼らは、ヌクレアーゼ安定性を増加させる
が、同時にハイブリダイゼーション特性を減少させるよ
うな修飾されたリン酸結合を用いてきた。 本発明者は、理論に拘束されることを望むものではな
いが、本発明の高分子においては、ペプチド核酸ユニッ
トを高分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチド部分の両
端に置くことによって、高分子にヌクレアーゼ安定性を
与えるであろうことを認識している。さらに、この事
は、相補鎖への結合および特異性を増加させるであろ
う。 再度、特定の理論に拘束されることを望むものではな
いが、本発明者は、RNA鎖の切断を認識い誘発させるた
めにRNアーゼＨが満たさなくてはならないある種の規準
を認識している。これらの第一は、RNA鎖は切断部位
で、リン酸結合を通して連結された負電荷を帯びたヌク
レオシドを持っていなければならない事である。さら
に、切断部位のヌクレオシドの糖は、β−ペントフラノ
シル糖でなければならず、また、2'エンドコンフォメー
ションでなくてはならない。この規準を満たすヌクレオ
シド（ヌクレオチド）は、2'−デオキシ−エリスロ−ペ
ントフラノシル β−ヌクレオシドのホスホジエステ
ル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホス
ホロセレネートおよびホスホロジセレネート−ヌクレオ
チドのみである。 上記の規準の観点から、2'エンドコンフォーメーショ
ン（例えば、シクロペンチルヌクレオシド）で存在する
ことが示されたある種のヌクレオシドでさえ、ペントフ
ランノシル糖を結合していないので、RNアーゼＨ活性を
誘発しないであろう。モデルは、オリゴヌクレオチド4'
−チオヌクレオシドはエンベロープコンフォメーション
で存在するが、2'エンドコンフォメーションで存在しな
いので、その様なヌクレオシド残基もまたRNアーゼＨ活
性を誘発しないであろうことを示している。さらに、α
−ヌクレオシドは、β−ペントフラノシル糖とは逆の立
体配座であるため、それらもまた、RNアーゼＨ活性を誘
発しないであろう。 非糖のテザー基を通して、または非リン酸結合を通し
てリン酸結合に連結されるヌクレオベースもまた、2'エ
ンドコンフォメーションでβ−ペントフラノシル糖を持
つと言う規準に合わない。従って、それらは、恐らく、
RNアーゼＨ活性を誘発しないであろう。 本発明の高分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチド部
分に取り込ませるために、ヌクレオシドは、ジメトキシ
トリチル基で5'位をブロックし、次いで、3'位をホスフ
ィチル化（phosphitylation）されるであろう。トリチ
ル化およびホスフィチル化の方法は、「オリゴヌクレオ
チドおよびその類似体、実用的研究法（Oligonucleotid
es and Analogs,A practical Approach）」、Eckst
ein,F.編、実用的研究法シリーズ（The Practical Ap
proach Series）、IRL Press,New Youk,1991、に報
告されている。オリゴヌクレオチド中への取り込みは、
ABI380BモデルシンセサイザーのようなDNAシンセサイザ
ーを用いて、ホスホジエステル、ホスホロチオエートま
たはホスホロジチオエート−リン酸結合を形成するため
に適当な化学を用いて、Echsteinの前掲引用書中に説明
されている合成のプロトコールにしたがって行われるで
あろう。 本発明の高分子の2'−デオキシヌクレオチドサブユニ
ットおよびペプチド核酸サブユニットは、共有結合で結
び付けられ、高分子のサブユニットを望ましいヌクレオ
ベース配列に固定する。望ましい長さに結び付けられた
共有結合連結（covalent interconnection）は、高分
子の２つの隣り合った領域のそれぞれの間で形成され
る。望ましくは、共有結合連結は、隣り合う領域を形成
する異なる型のサブユニット部分の両方に共有結合を形
成できる連結部分を選択することによって成し遂げられ
る。望ましくは、連結部分は、連結部分と異なる型の部
分の間に得られる原子鎖が同じ長さであるように選択さ
れる。本発明の一つの望ましい実施態様では、2'−デオ
キシヌクレオチドとペプチド核酸サブユニットを相互連
結する連結基として特に有用なものはアミド結合であ
る。その他の実施態様では、アミンおよびエステル結合
を用いることができる。 本発明の高分子のペプチド核酸サブユニット部分（PN
A部分）は、一般式（Ｉ）： ［式中： ｎは少なくとも２であり、 L1−Lnはそれぞれ、水素、ヒドロキシ、（C1−C4）ア
ルカノイル、天然型のヌクレオベース、非天然型のヌク
レオベース、芳香族部分、DNAインターカレーター、ヌ
クレオベース結合基、複素環式部分、およびレポーター
リガンドからなる群より独立的に選択され、L1−Lnの少
なくとも１つは、天然型ヌクレオベース、非天然型ヌク
レオベース、DNAインターカレーター、またはヌクレオ
ベース結合基であり； C1−Cnはそれぞれ、（CR6R7）ｙであり、ここでR6は
水素であり、R7は天然型のα−アミノ酸の側鎖からなる
群より選択されるか、またはR6およびR7は、水素、（C2
−C6）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリー
ル、ヒドロキシ、（C1−C6）アルコキシ、（C1−C6）ア
ルキルチオ、NR3R4およびSR5［ここで、R3およびR4は上
に定義した通りであり、R5は水素、（C1−C6）アルキ
ル、ヒドロキシ−、アルコキシ−もしくはアルキルチオ
−置換（C1−C6）アルキルである］からなる群より独立
的に選択されるか、またはR6およびR7が一緒になって脂
環式または複素環式系を作り上げ； D1−Dnはそれぞれ（CR6R7）ｚであり、R6およびR7は
上記の通りであり； ｙおよびｚはそれぞれ０または１から10までの整数で
あり、ｙ＋ｚの和は２より大きいが10以下であり； G1−Gn-1のそれぞれは、いずれの向きでもよい−NR3C
O−、−NR3CS−、−NR3SO−、または−NR3SO2−であ
り、R3は上記の通りであり； A1−AnおよびB1−Bnの組み合わせは、それぞれ： （ａ）Ａは式（II a）、（II b）または（II c）の基の
一つであり、 ＢはＮまたはR3N+である；または （ｂ）Ａは式（II d）の基であり、ＢはCHである； ［式中： Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NR3、CH2またはＣ（CH3）２であ
り； Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはNR4であり； ｐおよびｑはそれぞれ、０または１から５までの整数
であり、ｐ＋ｑの和は10以下であり； ｒおよびｓはそれぞれ、０または１から５までの整数
であり、ｒ＋ｓの和は10以下であり； R1およびR2のそれぞれは、水素、またはヒドロキシ−
もしくはアルコキシ−もしくはアルキルチオで置換され
ていてもよい（C1−C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコ
キシ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群
より独立的に選択され； G1−Gn-1はそれぞれ、いずれの向きでもよい−NR3CO
−、−NR3CS−、−NR3SO−または−NR3SO2−であり、こ
こでR3は上記の通りであり； Ｑは、−CO2H−、−CONR'R''、−SO3Hもしくは−SO2N
R'R''または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性化誘導体であ
り；そして Ｉは、−NHR'''R''''または−NR'''C（Ｏ）R''''であ
り、ここでR'、R''、R'''およびR''''は、水素、アルキ
ル、アミノ保護基、レポーターリガンド、インターカレ
ーター、キレーター、ペプチド、タンパク質、炭水化
物、脂質、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、
ヌクレオチドジホスフェート、ヌクレオチドトリホスフ
ェート、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドなら
びに可溶性および不溶性ポリマーからなる群より独立的
に選択される］である。 望ましいペプチド核酸は、一般式（III a）−（III
c）： ［式中： Ｌはそれぞれ、水素、フェニル、複素環式部分、天然
型のヌクレオベース、および非天然型のヌクレオベース
からなる基より独立的に選択され； R7'は、水素および天然型α−アミノ酸の側鎖からな
る群より独立的に選択され； ｎは、１から60の整数であり； ｋ、ｌ、およびｍはそれぞれ、独立的に０または１か
ら５の整数であり； ｐは、０または１であり； Rhは、OH、NH2または−NHLysNH2であり； Riは、ＨまたはCOCH3である： を持つ。 特に望ましいものは、式（III a）−（III c）を持つ
化合物であり、式中、Ｌはそれぞれ、ヌクレオベースで
あるチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、
グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）からなる群より独
立的に選択され、ｋおよびｍは、０または１であり、ｎ
は１から30、特に４から20の整数である。 本発明の高分子のペプチド核酸部分は、溶液中かまた
は固相上のどちらかで、一般的には、特許出願PCT/EP/0
1219（WO92/20702として1992年11月26に公開）または米
国特許出願08/088,658（1993年７月２日出願）、または
同等の方法にしたがって合成される。これらの特許出願
の内容は、参照としてここに取り入れられる。 用いられたシントン（synthon）は、モノマーのアミ
ノ酸またはその活性化誘導体であり、標準的な保護基に
よって保護されている。PNAもまた、関連するジ酸およ
びジアミンを用いることによって合成することができ
る。 本発明の新規のモノマーシントンは、一般式（IV）、
（Ｖ）、（VI）： ［式中、Ｌ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは上記の通りである
が、ただしその中の任意のアミノ基がアミノ保護基で保
護されていても良く;Eは、COOH、CSOH、SOOH、SO2OHま
たはその活性化誘導体であり；かつＦは、NHR3またはNP
gR3であり、ここでR3は上記の通りであり、かつPgはア
ミノ保護基である］ をもつアミノ酸、ジ酸およびジアミンからなる群より選
択される。 本発明の望ましいモノマーシントンは、式（VIII a）
−（VIII c）： ［式中、Ｌは、水素、フェニル、複素環式部分、天然型
ヌクレオベース、および非天然型ヌクレオベースからな
る基より選択され；かつR7'は、水素および天然型α−
アミノ酸側鎖よりなる群より選択される］ またはそのアミノ保護および／または酸末端活性化誘導
体をもつ。 本発明の化合物は、診断、治療に、ならびに研究用試
薬およびキットとして用いることができる。さらに、い
ったん試験システムで活性であると確認されれば、化学
療法薬を含む他の活性化合物の試験システムにおいて標
準として用いることができる。薬剤として許容しうる適
当な希釈剤または担体とともに混合した本発明の高分子
を有効量含有させることにより、薬剤組成物としても利
用できる。さらに、望ましくないタンパク質生成を特徴
とする疾患を持つ生物を治療するために用いることもで
きる。生物を、望ましくないタンパク質をコードする核
酸の鎖と特異的にハイブリダイズできる配列を持つ本発
明の高分子と接触させることができる。 その様な治療的処置は、単細胞原核生物および真核生
物から多細胞真核生物までの範囲のいろいろな生物で実
施することができる。その遺伝、代謝または細胞の制御
の基本部分としてDNA−RNA転写またはRNA−タンパク質
翻訳を用いるいずれの生物も、その様な治療的および／
または予防的処置が可能である。細菌、酵母、原生生
物、藻類、全植物および温血動物を含むすべての高等動
物のように外見上は異なった生物を、この治療法で処置
できる。さらに、多核真核生物の細胞の各々は、それら
の細胞活性に不可欠な部分としてDNA−RNA転写およびRN
A−タンパク質翻訳の両方を含むので、その様な治療お
よび／または診断もまた、その様な細胞集団で実施する
ことができる。さらに、真核生物細胞の多くのオルガネ
ラ、例えばミトコンドリアおよびクロロプラストもま
た、転写および翻訳の機構を含んでいる。このように、
単一の細胞、細胞集団またはオルガネラもまた、本発明
の治療的または診断的オリゴヌクレオチドで治療するこ
とのできる生物の定義の内に含まれうる。ここで用いる
ように、“治療”とは、疾病状態の根絶、例えば細菌、
原生動物類あるいはその他の伝染病の生物の殺傷、また
は遊走性あるいは有害な細胞の増殖または発現の制御の
両方を含むことを意味する。 例証の目的で、本発明の化合物を、ras−ルシフェラ
ーゼ−トランス活性化を用いるras−ルシフェラーゼ融
合システム中で用いた。「ras−オンコジンのアンチセ
ンス阻害（Antisense Inhibition of RAS Oncogen
e）」と称し、本出願と共に譲受された米国特許出願番
号07/715,196（1991年６月14日提出）に記載されている
（その全体の内容をここに参照として取り入れる）よう
に、ras−オンコジンは、原形質膜の内側表面に位置す
る関連タンパク質をコードする遺伝子ファミリーの構成
員である。ras−タンパク質は、アミノ酸レベルで高い
保存性を持ち、高い親和性および特異性でGTPに結合
し、かつGTPアーゼ活性を持つことが示されている。ras
遺伝子生成物の細胞性機能は未知であるが、それらの生
化学的性質は、GTP結合タンパク質またはＧタンパク質
として知られているシグナル伝達タンパク質の一種との
明らかな配列相同性と共に、ras遺伝子生成物は、原形
質膜を通る細胞外シグナルの伝達に関する基礎的な細胞
制御機能に重要な役割を演じていることを示唆する。 Ｈ−ras、Ｋ−rasおよびＮ−rasと名付けられた３種
のras遺伝子が、哺乳動物のゲノム中で同定された。哺
乳類のras遺伝子は、コード配列内の単一の点突然変異
によってトランスフォーメーションを誘導する性質を獲
得する。天然型ras−オンコジンの突然変異は、コドン1
2、13および61に位置することが見いだされている。Ｈ
−ras、Ｋ−rasおよびＮ−rasの配列は既知である。Cap
onら、Nature,302、1983,33−37;Kahnら、Anticancer R
es.,1987,7,639−652;HallおよびBrown、Nucleic Acid
s Res.,1985,13,5255−5268。ヒトの腫瘍中に認められ
る最も共通に検出される活性化rasの突然変異は、Ｈ−r
as遺伝子のコドン12中にあり、そこでは、GGCからGTCへ
の塩基の変化が、結果として、rasタンパク質産物のGTP
アーゼ制御ドメイン中にグリシンからバリンへの置換を
生ずる。Tabin,C.J.ら、Nature,1982,300,143−149;Red
dy,P.E.ら、Nature,1982,300,149−152;Taparowsky,E.
ら、Nature,1982,300,762−765。この単独のアミノ酸変
化は、ras−タンパク質機能の正常な制御を妨害し、そ
れ故、正常に制御されていた細胞タンパク質を連続的に
活性なタンパク質に変えると考えられる。正常なras−
タンパク質機能のその様な脱制御は、正常な増殖から悪
性増殖へのトランスフォーメーションの原因であると考
えられている。Moniaら、J.Bio.Chem.,1993,268,14514
−14522は、最近、トランス活性化レポーター遺伝子シ
ステムにより、キメラ“Gap"（非デオキシオリゴヌクレ
オチドに隣接される2'−デオキシオリゴヌクレオチドを
持つ構造）が、インビトロでHa−ras オンコジンに対
して活性であることを示している。上記のアッセイで活
性である本発明の化合物は、インビトロでの化学療法薬
スクリーニングテストの標準として用いることができ
る。 本発明の化合物は、固相合成または液相合成の両方に
より製造することができる。両方法は、実施例に示され
ている。実施例に示すように、実施例１は、本発明の高
分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチド部分の一般的な
合成法である。実施例２、３および４のスキームは、図
１に図解している。実施例２は、固相支持体樹脂への高
分子の右側PNA部分のカルボキシ末端の固定を図解して
記載している。実施例３は、高分子のこの右側PNA部分
の伸長、および3'−カルボキシヌクレオチドを通しての
最初の2'−デオキシヌクレオチドへのアミド結合の形成
について記載している。実施例４は、高分子の第２のPN
A（左側）部分へアミド結合をもたらすための、5'−ア
ミノヌクレオチドの付加を含む高分子の中央の2'−デオ
キシオリゴヌクレオチド部分の伸長を図解している。実
施例５および６のスキームは、図２に示されている。実
施例５は、左側PNA部分の完成を示している。実施例６
は、ブロック基の除去および樹脂からの除去を説明して
いる。実施例７のスキームは、図３に示されている。実
施例７は、5'−アミノ−3'−ヌクレオチドを5'−末端ヌ
クレオチドとして位置させるための液相DNA結合の形成
について説明している。実施例８および９のスキーム
は、それぞれ図４および５に示されている。実施例８
は、本発明の高分子のPNA部分の、DNA部分への液相結合
について説明している。この実施例では、実施例７のオ
リゴヌクレオチドを第１の“T"PNAサブユニットと結合
させ；これに対して、実施例９では、第１の“A"PNAサ
ブユニットを、高分子の2'−デオキシオリゴヌクレオチ
ド部分に結合させる。実施例10、11および12のスキーム
は、図６に示されている。実施例10、11および12は、本
発明の高分子のDNA部分のPNA部分への液相結合について
説明している。 以下の実施例では、サブユニットがペプチド核酸（PN
A）グループかまたは2'−デオキシヌクレオチド（DNA）
グループのどちらであるかには関係なく、サブユニット
を、標準的な大文字による一文字表記、即ちＡ、Ｇ、Ｃ
またはＴ、を用いて表示する。その様な表記は、サブユ
ニット中に取り込まれたヌクレオベースを示している。
すなわち、“A"は、2'−デオキシアデノシンヌクレオチ
ド、並びにアデニン塩基を含むペプチド核酸サブユニッ
トの両方を表示するために用いられる。ペプチド核酸サ
ブユニットでは、アデニン塩基はカルボキシメチル連結
基を通してＮ−（２−アミノエチル）グリシン骨格と結
合する。標準的ヌクレオチド結合、即ち、ホスホジエス
テル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまた
はホスホロセレネートは、２つの隣合う表示文字の間の
ハイフォン（−）で示い、例えばＡ−Ｔは、チミジンヌ
クレオチドに連結したアデノシンヌクレオチドを示して
いる。ペプチド核酸結合を示すために、（ｐ）または
（pna）のどちらかが用いられ、例えば、Ａ（ｐ）−Ｔ
は、チミンペプチド核酸ユニットに連結したアデニンペ
プチド核酸ユニットを示す。 2'−デオキシヌクレオチドとペプチド核酸ユニットの
間の結合の変換は、括弧（ ）で示される。したがっ
て、“Ｔ−（3'−カルボキシ）−A"は、アデニン−ペプ
チド核酸サブユニットの２−アミノエチル部分のアミン
部分に結合したカルボキシ基をその3'位にもつチミジン
ヌクレオシドを示している。これに対して、“Ａ−（5'
−アミノ）−T"は、隣り合ったチミン−ペプチド核酸サ
ブユニットのグリシン部分のカルボキシ部分に結合した
アミンを5'位に持つチミジンヌクレオチドを示してい
る。末端基、例えば、カルボキシ、ヒドロキシル、Ｎ−
アセチルグリシンおよびその類似体は、適当なシンボル
表記法を用いて示される。 カルボベンゾキシブロッキング基は、肩文字Ｚ、例え
ばＺとして示される。フェノキシアセチル保護基は、肩
文字PAC、例えばPACとして示される。記載した標準的な
ポリスチレン−メリフィールド（Merrifield）樹脂の代
わりとして、ファルマシア（Pharmacia）から購入した
高架橋ポリスチレン、またはラップポリメレ（Rapp Po
lymere）から購入したテンタゲル（Tentagel）と呼ばれ
るポリエチレングリコール／ポリスチレングラフト共重
合体を用いてもよい。本発明の高分子を都合よく除去す
るためには、グリシンをエステル結合を通して樹脂に結
合させるべきである。 以下の実施例および方法は、本発明を説明するための
ものであって、制限するものではない。 実施例１ オリゴヌクレオチドの合成： 本発明の高分子のオリゴヌクレオチド部分は、ヨウ素
による酸化を用いた標準的ホスホロアミデートの化学を
用いて、自動DNAシンセサイザー（Applied Biosystems
model 380B）で合成される。ホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドのためには、標準酸化瓶を、ホスファ
イト結合を段階的にチエーションするために、0.2Mの3H
−1,2−ベンゾジチオール−３−オン 1,1−ジオキシド
／アセトニトリル溶液に置き換える。チエーションの待
ち段階は、68秒に増加させ、次いでキャッピング段階を
行った。別に指示しないかぎり、CPGカラムから切断
し、濃水酸化アンモニウム中55℃（18時間）で脱ブロッ
キングした後、オリゴヌクレオチドは、2.5倍容量のエ
タノールで、0.5M−NaCl溶液から２度沈殿させることに
よって精製する。分析用ゲル電気泳動は、20％アクリル
アミド、8M尿素、454mMトリス−ホウ酸緩衝液、pH7.0で
行った。ホスホジエステルおよびホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
からその物質の長さを判定する。 実施例２ 低充填のｔ−ブチルオキシカルボニルグリシルメリフィ
ールド樹脂 ヒドロキシメチルポリスチレン樹脂（1g、650μＭヒ
ドロキシ/g）は、固相のペプチド合成用容器に入れ、ジ
クロロメタン（DCM、２回 10ml）、N,N−ジメチルホル
ムアミド（DMF、２回 10ml）およびアセトニトリル
（２回 40ml）で順番に（それぞれの洗浄について１分
間振とうして）洗浄した。丸底フラスコに、Ｎ−ｔ−ブ
チロキシカルボニルグリシン（701mg、4mM）およびＯ−
（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１、１、３、３−
テトラメチルウロニウム テトラフルオロホウ酸塩（1.
156g、3.6mM）を加えた。無水アセトニトリル（40ml）
をバイアルに加え、次いでN,N−ジイソプロピルエチル
アミン（1.392ml、8mM）を加えた。フラスコは、すべて
の固体が溶解するまで振とうした。１分後、バイアルの
内容物をペプチド合成用容器に加え、125分間振とうし
た。次いで、反応溶液を流し、支持体をアセトニトリル
（１回 40ml）、ピリジン（２回 40ml）およびDMF
（２回 40ml）で洗浄した。DMF中の10％（v/v）無水酢
酸溶液（全40ml）を樹脂に加え、反応は40分間振とうし
て行った。反応溶液を流した後、無水酢酸キャップを上
記のように繰り返した。２回目のキャッピング反応の最
後に、樹脂を、DMF（２回 40ml）、ピリジン（１回 4
0ml）、およびDCM（３回 40ml）で洗浄した。次いで、
樹脂はアルゴンを吹き付けることによって乾燥させた。 グリシン誘導体化の程度は、ニンヒドリン定量アッセ
イによって測定した。上の樹脂（50mg）のアリコート
を、固相ペプチド合成容器中に置き、DCM（２回 3ml）
で洗浄した。次いで、樹脂は、トリフルオロ酢酸中の５
％（v/v）のｍ−クレゾール溶液（3ml）で３回、それぞ
れ２分ずつ振とうして、処理した。３回目の反応溶液を
流し去った後、樹脂は、DCM（３回 3ml）、ピリジン
（３回 3ml）およびDCM（３回 3ml）で洗浄した。次
いで、樹脂はアルゴンを吹き付けることによって乾燥さ
せた。 脱保護した乾燥させた樹脂のアリコート（5mg）を試
験管に入れた。この樹脂に、70％（v/v）水／ピリジン
（80μｌ）の溶液、カイザー試薬１（100μｌ、２％のH
2O/ピリジン中の200μＭ−KCN）、試薬２（40μｌ、ｎ
−BuOH中の５％（w/v）ニンヒドリン）、および試薬３
（50μｌ、ｎ−BuOH中の80％（w/v）フェノール）を加
えた。反応は100℃で10分間加熱して行い、冷却し、60
％（V/V）EtOH（7ml）で希釈した。次いで、570nmの吸
光度は、樹脂を含まない対照反応液、およびグリシンエ
チルエステルの定量を元にした標準曲線と比較した。1g
の樹脂当たり100μＭのグリシンの誘導体化レベルが得
られた。 実施例３ 5'−ヒドロキシ−Ｔ（3'−カルボキシ）−Ｔ（Ｐ）−CZ
（ｐ）−AZ（ｐ）−GZ（ｐ）−Gly− −Ｏ−樹脂 ｔ−ブチルオキシカルボニルグリシルメリフィールド
樹脂（200mg、10マイクロ当量、実施例１）は、固相ペ
プチド合成用容器に入れる。支持体は、50％DMF/DCM
（４回 5ml）で洗浄し、次いで、５％のｍ−クレゾー
ル／トリフルオロ酢酸（4ml）で２回、それぞれ２分間
ずつ振とうして処理する。支持体は、再び50％DMF/DCM
（４回 5ml）で、次いでピリジン（５回 5ml）で洗浄
する。バイアルに、N2−ベンジルオキシカルボニル−１
−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチルグリシ
ル）グアニン（80μＭ）およびＯ−（ベンゾトリアゾー
ル−１−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム−
テトラフルオロホウ酸塩（72μＭ）を加える。N,N−ジ
メチルホルムアミド（0.4ml）およびピリジン（0.4ml）
を、次いで、N,N−ジイソプロピルエチルアミン（160μ
Ｍ）をバイアルに加える。バイアルは、すべての固体が
溶解するまで、振とうする。１分後、バイアルの内容物
をペプチド合成用容器に加え、20分間振とうする。次い
で、反応溶液を流し、支持体をピリジン（４回 5ml）
で洗浄する。残った結合していないアミンは、N,N−ジ
メチルホルムアミド中のＮ−ベンジルオキシカルボニル
−N'−メチルイミダゾールトリフレートの10％溶液（0.
8ml）を加えることによってキャップする。５分間振と
う後、キャッピング溶液を流し、支持体を再びピリジン
（４回 5ml）で洗浄する。 上の段落に記載した通り、脱保護、カップリングおよ
びキャッピングは、さらに３種のPNAモノマー:N6−ベン
ジルオキシカルボニル−１−（ｔ−ブチルオキシカルボ
ニル−アミノエチルグリシル）アデニン、N4−ベンジル
オキシカルボニル−１−（ｔ−ブチルオキシカルボニル
−アミノエチルグリシル）シトシン、および１−（ｔ−
ブチルオキシカルボニル−アミノエチルグリシン）チミ
ン：について繰り返す。 次に、脱保護、カップリングおよびキャッピングはも
う一度繰り返すが、この場合に用いたモノマーは、5'−
（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−3'−カルボキシメチ
ルチミジンである。キャッピング反応後、樹脂をピリジ
ン（３回 3ml）およびDMF（３回 3ml）で洗浄する、
無水THF（3ml）をフラスコに加え、次いで45μｌの70％
（v/v）HF/ピリジンを加える。一晩振とう後、樹脂はTH
F（５回 3ml）、DMF（３回、3ml）、アセトニトリル
（５回 3ml）およびDCM（５回 3ml）で洗浄する。次
いで、アルゴンを吹き付けることにより樹脂を乾燥す
る。 実施例４ Ｔ（5'−アミノ）−GPAC−CPAC−APAC−Ｔ−Ｔ（3'−カ
ルボキシ）− −Ｔ（ｐ）−CZ（ｐ）−AZ（ｐ）−GZ（ｐ）−Gly−Ｏ
−樹脂 5'−ヒドロキシ−Ｔ（3'−カルボキシ）−GZ（ｐ）−
CZ（ｐ）−AZ（ｐ）−Ｔ（ｐ）−Gly−Ｏ−樹脂（10マ
イクロ当量、実施例３）をDNA合成カラムに入れる。標
準的なDNA合成（実施例１）を、環外アミン上にはフェ
ノキシアセチル保護基、リン上には２−シアノエチル
基、および5'−ヒドロキシル上には4,4'−ジメトキシト
リチル基を含むホスホルアミダイトを用いて行う。結合
させた5'−末端ホスホロアミダイトは、5'−（モノメト
キシトリチルアミノ）チミジン−3'−（N,N−ジイソプ
ロピルアミノ−２−シアノエチル）ホスホルアミダイト
である。モノメトキシトリチル基は、DCM中のジクロロ
酢酸を用いて標準的自動処理によって除去する。DCMで
洗浄後、樹脂は減圧下で乾燥させる。 実施例５ Ｎ−アセチルグリシル−Ｔ（ｐ）−Ｔ（ｐ）−CZ（ｐ）
−Ｔ（ｐ）−CZ（ｐ）−GZ（ｐ）−CZ（ｐ）−COOH ヒドロキシメチルポリスチレン樹脂（115mg、74マイ
クロ当量）を、固相ペプチド合成用容器に入れた。支持
体をDCM（３回3ml）、DMF（３回3ml）、ピリジン（３回
3ml）、さらに再びDMF（２回3ml）で洗浄した。バイア
ルにN4−ベンジルオキシカルボニル−１−（ｔ−ブチル
オキシカルボニル−アミノエチルグリシル）シトシン
（151mg、300μＭ）およびＯ−（ベンゾトリアゾール−
１−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム−テト
ラフルオロホウ酸塩（87mg、270μＭ）を加えた。N,N−
ジメチルホルムアミド（1.25ml）およびピリジン（1.25
ml）をバイアルに加え、次いで、N,N−ジイソプロピル
エチルアミン（105μｌ、600μＭ）を加えた。バイアル
は、すべての固体が溶解されるまで振とうした。１分
後、バイアルの内容物をペプチド合成容器に加え、30分
間振とうした。次いで、反応溶液を流し去り、支持体を
DMF（４回3ml）で洗浄した。Ｃモノマーのカップリング
は上記のように繰り返した。次いで、樹脂は、N,N−ジ
メチルホルムアミド中の10％Ｎ−ベンジルオキシカルボ
ニル−N'−メチル−イミダゾールトリフレート（2.25m
l）を加え、次いで５分間振とうすることによってキャ
ップした。最後に、樹脂は、ピリジン（４回3ml）で洗
浄し、次いで鎖伸長用に準備した。 支持体は、50％DMF/DCM（４回3ml）で洗浄し、次い
で、トリフルオロ酢酸中の５％ｍ−クレゾール（3ml）
で２回、それぞれ２分間振とうして、処理した。支持体
は、再び50％DMF/DCM（４回3ml）で、次いで、ピリジン
（５回3ml）で洗浄した。バイアルに、N2−ベンジルオ
キシカルボニル−１−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−
アミノエチルグリシル）グアニン（163mg、300μＭ）お
よびＯ−（ベンゾトリアゾ−１−リル）−1,1,3,3−テ
トラメチルウロニウム−テトラフルオロホウ酸塩（87m
g、270μＭ）を加えた。N,N−ジメチルホルムアミド
（1.25ml）およびピリジン（1.25ml）をバイアルに加
え、次いで、N,N−ジイソプロピルエチルアミン（105μ
ｌ、600μＭ）を加えた。バイアルは、すべての固体が
溶解するまで振とうした。１分後、バイアルの内容物を
ペプチド合成用容器に加え、20分間振とうした。次い
で、反応溶液を流し、支持体をピリジン（５回3ml）で
洗浄した。残った非結合のアミンは、N,N−ジメチルホ
ルムアミド中のＮ−ベンジルオキシカルボニル−N'−メ
チルイミダゾール−トリフレートの10％溶液（2.25ml）
を加えることによってキャップした。５分間振とうした
後、キャッピング溶液を流し、支持体を再びピリジン
（４回3ml）で洗浄した。 上の段落に記載したように、脱保護、カップリングお
よびキャッピングは、次のような順序で、PNAモノマー:
N4−ベンジルオキシカルボニル−１−（ｔ−ブチルオキ
シカルボニル−アミノエチルグリシル）シトシン、およ
び１−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチルグ
リシル）チミン、N4−ベンジルオキシカルボニル−１−
（ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノエチルグリシル）
シトシン、１−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノ
エチルグリシル）チミン、１−（ｔ−ブチルオキシカル
ボニルアミノエチルグリシル）−チミン，さらに次にＮ
−アセチルグリシン；で繰り返した。最後のカップリン
グ反応を行った後、樹脂をピリジン（５回3ml）およびD
CM（４回3ml）で洗浄した。次いで、樹脂は、アルゴン
を吹き付けることによって乾燥させた。 樹脂の一部分（29mg、10マイクロ当量）を固相ペプチ
ド合成用容器に入れ、テトラヒドロフラン（2.5ml）を
加え、次いで、飽和水性炭酸水素カリウム（0.25ml）お
よび硫酸水素テトラブチルアンモニウム（34mg、100μ
Ｍ）の水溶液を加えた。次いで、反応は、14時間、室温
で振とうして行った。水（1ml）を反応液に加え、その
結果、白色固体の沈殿物を得た。液体を濾過で除去し、
保存した。次いで、樹脂および白色固体に、第一回目の
洗浄で加えた水（1ml）をさらに加えて洗浄した。減圧
下で乾燥状態にまで濃縮すると、その結果、ピンクの油
の混じった白色固体が得られた。水（6ml）を加え、pH
を固体KHSO4で２に調整した。次いで、液体および懸濁
した黄色固体をエッペンドルフ（Eppendorf）チューブ
に移し、固体を遠沈した。溶媒を除去し、残った黄色固
体は、0.1％TFAを含む水中の30％アセトニトリルに再溶
解した。逆層クロマトグラフィーを行った結果、所望の
生成物（2.6mg,1μＭ）を得た：分子質量＝2498［電気
噴霧（electrospray）マススペクトロメトリ］。 実施例６ Ｎ−アセチルグリシル−Ｔ（ｐ）−Ｔ（ｐ）−Ｃ（ｐ）
−Ｔ（ｐ）−Ｃ（ｐ）−Ｇ（ｐ）−Ｃ（ｐ）−Ｔ（5'−
アミノ）−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ（3'−カルボキシ）−Ｔ
（ｐ）−Ｃ（ｐ）−Ａ（ｐ）−Ｇ（ｐ）−Gly−COOH Ｔ（5'−アミノ）−GPAC−CPAC−APAC−Ｔ−Ｔ（3'−
カルボキシ）−Ｔ（ｐ）−CZ（ｐ）−AZ（ｐ）−G
Z（ｐ）−Gly−Ｏ−樹脂（５マイクロ当量、実施例３）
を固相ペプチド合成用容器にいれる。樹脂は、DCM（３
回3ml）、DMF（３回3ml）、およびピリジン（３回3ml）
で洗浄する。バイアルにＮ−アセチルグリシル−Ｔ
（ｐ）−Ｔ（ｐ）−CZ（ｐ）−Ｔ（ｐ）−CZ（ｐ）−GZ
（ｐ）−CZ（ｐ）−COOH（10μＭ、実施例５の様に調製
される）およびＯ−（ベンソトリアゾール−１−イル）
−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム−テトラフルオロ
ホウ酸塩（９μＭ）を加える。N,N−ジメチルホルムア
ミド（0.3ml）およびピリジン（0.3ml）をバイアルに加
え、次いで、N,N−ジイソプロピルエチルアミン（20μ
Ｍ）を加える。バイアルは、すべての固体が溶解するま
で、振とうする。１分後、バイアルの内容物を、ペプチ
ド合成用容器に加え、４時間振とうする。次いで、反応
溶液を流し、支持体をピリジンで５回洗浄する。 テトラヒドロフラン（2ml）を樹脂に加え、次いで、
飽和水性炭酸水素カリウム溶液（0.2ml）および硫酸水
素テトラブチルアンモニウム（27mg、80μＭ）を加え
る。反応は、14時間、室温で振とうして行った。次い
で、溶液を流し、保持する。樹脂を50％テトラヒドロフ
ラン／水（３回1ml）および水（３回2ml）で洗浄する。
洗浄溶液を反応溶液に加え、減圧下で濃縮して、有機溶
媒を除去する−濃縮は最終容量が2mlになった時点で停
止する。無機物はゲル濾過によって除去する。粗物質を
15mMの酢酸水溶液（10ml）に溶解し、真空下での脱ガス
化および窒素の逆充填を交互に４回行う。BaSO4上のパ
ラジウム（５％,30mg）を加え、溶液を室温で２時間攪
拌する。触媒は濾過によって除去し、次いで、生成物は
逆層HPLCによって精製する。 実施例７ 5'−アミノ−デオキシチミジリル−（3'−5'）−3'−Ｏ
−ｔ−ブチルジフェニルシリル−デオキシチミジン（H2
N−Ｔ−Ｔ） 3'−ｔ−ブチルジフェニルシリルデオキシチミジン
（58mg、120μＭ）および5'−（ｐ−メトキシトリフェ
ニルメチルアミノ）−3'−［Ｏ−（２−シアノエチル）
−N,N−ジイソプロピルアミノホスホルアミジル］デオ
キシチミジン（71mg、100μＭ）を別々の10ml丸底フラ
スコにいれ、それぞれ無水ピリジン（2ml）で一度、無
水アセトニトリル（1.5ml）で２度、共蒸発させた。次
いで、化合物はそれぞれ無水アセトニトリル（0.75ml）
中に溶解し、合わせた。反応は、無水アセトニトリル中
の0.4M 1H−テトラゾール溶液（1ml,400μＭテトラゾ
ール）を加えることによって開始した。50分間室温で撹
拌した後、反応は、酸化溶液（10mlの0.43％I2/90.54％
THF、0.41％ピリジンおよび9.05％水）中に注ぐことに
よって急冷した。 酸化反応は、さらに40分間攪拌し、ジクロロメタン
（50ml）および水（20ml）を含む分離用漏斗に注いだ。
残ったヨウ素は、有機層を0.3％ピロ亜硫酸ナトリウム
水溶液（95ml）で洗浄することによって除去した。次い
で、有機層は、減圧下で回転蒸発させることによって濃
縮して黄色油状物とした。黄色油状物は、減圧下、トル
エン（２×15ml）で共蒸発させ、残留ピリジンを除去し
た。 次いで、粗物質はジクロロメタン（6ml）に溶解し、
トリチル基は、３％トリクロロ酢酸／ジクロロメタン溶
液（3ml）を加えることによって除去した。15分間、室
温で攪拌した後、反応は、飽和水性冷（４℃）炭酸水素
ナトリウム（10ml）を含む分離用漏斗に注ぐことによっ
て急冷した。さらに、ジクロロメタン（20ml）を加え、
有機層を分離した。水層に残留した乳濁液は、さらにジ
クロロメタン（20ml）を加えることによって溶かした。
次いで、２つの有機層を合わせて、減圧下で乾燥するま
で濃縮した。所望の生成物は、得られた黄褐色の粗固体
から、20％（v/v）エタノール／クロロホルム、0.2％N,
N−ジイソプロピルエチルアミン（49mg、63μM,63％）
中で分離用シリカTLCによって、精製した。Rf［20％（v
/v）エタノール／クロロホルム、0.2％N,N−ジイソプロ
ピルエチルアミン］＝0.05;1H NMR（200MHz,MeOH−d
4） ｄ 7.65（m,4H）,7.4（m,8H）,6.45（m,1H）,5.9
5（m,1H）,4.6（m,1H）,4.1（m,2H）,3.9（m,1H）,3.6
（m,1H）,3.2（m,1H）,2.9（m,2H）,2.5−2.0（m,4H）,
1.89（s,6H）,1.1（s,9H）;31P NMR（MeOH−d4）ｄ
0.85;ESMS m/e 782。 実施例８ DMT−Ｏ−Ｔ（pna）−CONH−Ｔ−ＴのN,N−ジイソプロ
ピルエチルアンモニウム塩 H2N−TpT（25mg、30μＭ）を1:1のDMF/ピリジン（0.8
ml）に溶解した。分離用バイアルに１−（Ｏ−4,4'−ジ
メトキシトリチル−ヒドロキシエチルグリシル）チミン
（23.5mg、40μＭ）およびＯ−（ベンゾトリアゾール−
１−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム テト
ラフルオロホウ酸塩（11.6mg、36μＭ）を加えた。バイ
アルの内容物は、1:1のDMF/ピリジン（0.8ml）およびN,
N−ジイソプロピルエチルアミン（14μｌ、80μＭ）中
に溶解した。５分後、活性化したエステル溶液を、H2N
−TpT溶液に加えた。反応は、室温で80分間攪拌して行
い、エチルアルコール（0.5ml）を加えて急冷した。さ
らに150分後、反応混合液は、減圧下で濃縮し、乾燥さ
せた。得られた固体は、分離用シリカTLCを用いて、20
％（v/v）エタノール／クロロホルム、0.2％N,N−ジイ
ソプロピルエチルアミン（27mg、20μＭ、67％）で展開
することによって、精製した。Rf［20％（v/v）エタノ
ール／クロロホルム、0.2％N,N−ジイソプロピルエチル
アミン）＝0.18;1H NMR（200MHz,DMSO−d6） ｄ 11.
35（m,3H）,8.95（brs,0.3H）,8.72（brs,0.7H）,7.79
（m,2H）,7.61−7.19（m,22H）,6.91（m,4H）,6.36（m,
1H）,6.03（m,1H）,4.78（m,2H）,4.59（s,1H）,4.41
（m,3H）,4.20（s,1H）,3.93（m,2H）,3.65（s,2H）,3.
18（brs,3H）,2.97（m,2H）,3.74（s,6H）,3.42（m,4
H）,2.01（brs,4H）,1.77（m,7H）,1.62（s,2H）,1.03
（m,15H）;13C NMR（DMSO−d6）:167.9,164.6,163.8,1
58.2,150.5,144.9,143.0,136.1,135.7,132.9,130.2,12
9.8,128.1,127.8,126.8,123.4,118.6,113.4,110.7,110.
1,107.9,86.3,84.0,83.0,74.8,74.5,61.3,56.2,55.1,4
7.5,26.8,18.7,12.1:31P NMR（DMSO−d6） ｄ −0.
2,−1.05;ESMS m/e 1351. 実施例９ tBOC−AZ（pna）−CONH−Ｔ−ＴのN,N−ジイソプロピル
エチルアンモニウム塩 H2N−TpT（19mg、24μＭ）を1:1のDMF/ピリジン（0.6
5ml）に溶解した。別のバイアルに、N6−ベンジルオキ
シカルボニル−１−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−ア
ミノエチルグリシル）−アデニン（12.7mg、24μＭ）お
よびＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3
−テトラメチルウロニウム テトラフルオロホウ酸塩
（7.1mg、22μＭ）を加えた。バイアルの内容物は、1:1
のDMF/ピリジン（0.65ml）およびN,N−ジイソプロピル
エチルアミン（8.4μｌ、48μＭ）に溶解した。２分
後、活性化されたエステル溶液を、H2N−TpT溶液に加え
た。反応は、室温で105分間、攪拌して行い、エチルア
ルコール（0.5ml）を加えることによって急冷した。さ
らに120分後、反応混合物は、減圧下で濃縮し乾燥させ
た。得られた固体は、分離用シリカTLCを用い、20％（v
/v）エタノール／クロロホルム、0.2％N,N−ジイソプロ
ピルエチルアミン（6mg、５μＭ、21％）で展開するこ
とによって精製した。Rf［20％（v/v）エタノール／ク
ロロホルム、0.2％N,N−ジイソプロピルエチルアミン）
＝0.07;1H NMR（200MHz,DMSO−d6） ｄ 11.37（s,1
H）,11.22（s,1H）,10.64（brs,1H）,9.17（brs,0.3
H）,8.90（brs,0.7H）,8.59（m,2H）,8.30（m,1H）,7.8
0（M,1H）,7.58（S,3H）,7.38（m,12H）,7.16（m,1H）,
6.36（m,1H）,6.04（m,1H）,5.43（m,1H）,5.32（s,1
H）,5.23（s,2H）,5.1（s,1H）,4.42（m,3H）,4.19（m,
1H）,3.98（s,1H）,3.87（m,3H）,3.77（m,1H）,3.66
（m,1H）,3.02（m,2H）,22.68（m,1H）,2.03（m,4H）,
1.74（m,6H）,1.02（m,30H）;13P NMR（DMSO−d6）
ｄ −0.01,−0.8。 実施例10 １−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチルグリ
シル）チアミン、エチルエステル １−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチルグ
リシル）チミン（300mg、780μＭ）は、50％のDMF/ピリ
ジン（3.0ml）に溶解し、N,N−ジイソプロピルエチルア
ミン（0.25ml、1.44mM）を加えた。５分間撹拌した後、
Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3−テ
トラメチルウロニウム テトラフルオロホウ酸塩（350m
g、1.1mM）を加えて、薄オレンジ色の溶液を得た。反応
は30分間攪拌して行った。その後、無水エタノール（0.
75ml、4.26mM）を加えた。さらに90分間撹拌した後、反
応混合物を減圧下で濃縮して油状物を得た。油状物は、
酢酸エチル（30ml）中に溶解し、５℃に冷却した。精製
生成物は、白色固体として沈殿し、濾過によって集め
た。（289mg、701μＭ、90％）:1H NMR（200MHz,CDC
l3） ｄ 8.33（brs,1H）,7.02（s,0.3H）,6.97（s,0.
7H）,5.58（m,1H）,4.59（s,1.4H）,4.43（s,0.6H）,4.
1（s,2H）,3.54（m,2H）,3.33（m,2H）,1.92（s,3H）,
1.47（s,9H）。 実施例11 TBDPS−Ｔ−CONH−Ｔ（pna）−OEt １−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチルグ
リシル）チミン（30mg、72μＭ）のエチルエステルを1.
0mlのトリフルオロ酢酸中に溶解し、室温で30分間攪拌
した。これを真空下で濃縮し、次いで、5mlのトルエン
で２回、共蒸発させた。5'−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニル
シリル−3'−カルボキシメチルデオキシリボチミジン
（25mg、48μＭ）は、0.400mlの1:1のDMF/ピリジン溶液
中に溶解した。この溶液に、TBTU（21mg、65μＭ）およ
びN,N−ジイソプロピルエチルアミン（25μｌ、144μ
Ｍ）を加えた。反応液は、薄いオレンジ色になり、これ
を30分間攪拌した。TFA脱保護段階からのアミンを0.6ml
のDMF/ピリジンに溶解し、活性化カルボキシチミジン溶
液に加え、室温で１時間攪拌した。TLC分析（20％MeOH/
DCM）は、すべての活性化酸が消費されたことを示し
た。溶液を真空下で濃縮して油状物とした。油状物は、
2mmの分離用TLCプレート（20mm×20mm）上で、溶出溶媒
として20％のMeOH/DCMを用いて精製した。最も極性の低
いフラクションが、PNA−DNAキメラを含み、所望の生成
物を白色固体（25mg、36μＭ、50％）として得た。1 H NMR（200MHz,CDCl3） ｄ 9.8（brs,1H）,9.6（br
s,1H）,7.7（m,4H）,7.3（m,9H）,7.0（dd,1H）,6.2
（m,1H）,4.5−3.4（12H）,2.9（m,1H）,2.5−2.1（m,4
H）,1.5（s,3H）,1.3（d,6H）,1.1（s,9H）;13CNMR（CD
Cl3）:d 11.764,12.083,12.391,14.144,26.796,27.05
5,29.708,35.232,37.177,37.788,38.932,48.298,61.48
6,64.854,84.476,85.018,111.110,127.711,129.980,13
5.407,135.654,140.976,150.835,151.555,167.416,172.
192;ESMS m/e 817. 実施例12 Ｔ−CONH−Ｔ（pna）−OEt 上記のダイマー（30mg、0.058mM）は、1mlの乾燥THF
中に溶解することによって脱シリル化し、０℃に冷却し
た。これに、20mlの70％のHF/ピリジンを加え、10mlの1
Mフッ化テトラブチルアンモニウム溶液を加え、反応混
合液を一晩攪拌した。TLC（10％MeOH/DCM）は、反応が
完了したことを示した。溶液は、1mlの飽和NaHCO3を加
えて急冷し、ガス蒸発が終わるまで攪拌した。水層は、
さらに5mlの水を加えて希釈し、3mlの酢酸エチルで２回
抽出した。有機層は、集めて捨てた。水層は、乾燥する
まで蒸発させ、脱保護したダイマーおよびNaHCO3の混合
物を得た。混合物をメタノール中に懸濁し、20×20cm、
0.5mmの分離用TLCプレートを２枚用い、クロロホルム中
30％エタノールで溶離することによって精製した。プレ
ートは溶離を終えた後、乾燥させ、蛍光帯をかきとり、
抽出した。抽出物を濾過し、蒸発させると、少量のフッ
化テトラブチルアンモニウムの混濁した12mgの脱保護ダ
イマー（収率56％）を得た。1 H（CD4OD）:1.0−1.5（mm,10H）;1.5（m,2H）;1.9（s,
6H）;2.1−2.8（mm,6H）;3.2−4.0（mm,15H）;4.1−4.4
（m,4H）;4.7（s,1H）;6.1（m,1H）;7.3（s,1H）;8.0
（s,1H）。 実施例13 （5'−DMT）−AZ−Ｔ−（3'−カルボキシ）−Ｔ（pna）
（シアノエトキシ保護ホスホジエステル結合を含む） 実施例12の脱保護ダイマー（12mg、0.0207mM）を無水
ピリジンで２回、無水アセトニトリルで２回、共蒸発さ
せた。得られた白色固体を1:1のアセトニトリル:DMF3ml
中に溶解した。この溶液に、1mlの0.1M−アデノシンホ
スホルアミダイトおよび1mlの0.4M 1H−テトラゾール
溶液を加えた。これを、周囲温度で１時間攪拌し、次い
で、さらに1mlのアミダイトを加え、攪拌をさらに１時
間続けた。終了時に10mlの酸化溶液（90.54％THF、0.41
％ピリジンおよび9.05％水中の0.43％I2）を加え、反応
液を１時間攪拌した。反応液は25mlの1M−亜硫酸水素ナ
トリウム溶液を加えて急冷した。この溶液は、クロロホ
ルム２×20mlで抽出し、集めた抽出物を別の亜硫酸水素
溶液の一部分25mlで洗浄し、僅かに黄色の有機層を得
た。クロロホルム溶液は、硫酸マグネシウム上で乾燥さ
せ、濃縮して黄色油状物とした。混合物は、20×20cmの
分離用TLCプレート（２枚、0.5mmコーティング）を用
い、ジクロロメタン中の20％アセトンで溶離して精製し
た。トリマーのジアステレオマー混合物は、93％の収率
で25mgの油状物として単離した。1 H（CDCl3）:1.2（m,13H）;2.5−3.2（mm,5H）;3.4（m,
4H）;3.7（s,6H）;4.1（m,1H）;4.4（m,1H）;5.2（m,1
H）;6.5（m,1H）;6.8（m,4H）;7.3（m,10H）;7.5（m,3
H）;8.0（d,2H）;8.2（d,2H）;8.7（s,1H）;9.1（s,1
H）;31P（CDCl3）:8.247,8.116。 実施例14 NH4OH脱保護条件下でのPNAオリゴマーの安定性 第一の場合、遊離のアミノ末端を含むPNAオリゴマー
（Ｈ−TAT−TCC−GTC−ATC−GCT−CCT−CA−Lys−NH2）
（すべてPNA）を、70％の濃NH4OH中に溶解した。反応液
は23℃でインキュベートし、アリコートは以下に示す時
間点に逆層HPLCで試験した。第二の実験では、グリシル
でキャップしたアミノ末端を持つPNAオリゴマー（Ｈ−G
ly−TGT−ACG−TCA−CAA−CTA−Lys−NH2）（すべてPN
A）を、90％濃NH4OH中に溶解し、シールしたフラスコ
中、55℃に加熱した。 遊離のアミノ末端を含むPNAオリゴマーのNH4OH安定性
は、PNA/DNAキメラから塩基保護基を除去するには不十
分であった。グリシル基でアミノ末端をキャッピングす
ると、水性塩基に対するPNAの安定性が大きく増加し
た。グリシル−キャップPNAは、11時間点でほんの少し
分解され、23時間後15％が分解された。グリシン−キャ
ップPNAは、フェノキシアセチル保護基を除去するため
に用いる条件下では完全に安定であり、標準的DNA塩基
保護基（ベンゾイルおよびイソブチリルアミド）に用い
る条件にも比較的安定である。結果を表１に示す。 実施例15 アミンおよびエステル結合を通して結合した中央の2'−
デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチド領域に
隣接するペプチド核酸領域を持つ高分子 ペプチド核酸の第一領域は、上記の実施例２により調
製される。ペプチド核酸領域は、アミン基保護モノマー
を用いてＣ末端からＮ末端へ向かって調製される。第一
のペプチド領域が完成した後、末端アミンのブロック基
を除去し、得られたアミンは、Vasseurら、J.Am.Chem.S
oc.,1992,114,4006、の方法に従って調製した3'−Ｃ−
（ホルミル）−2',3'−ジデオキシ−5'−トリチルヌク
レオチドと反応させる。Ｃ−ホルミルヌクレオシドのア
ルデヒド部分とアミンとの縮合は、Vasseur、同上、の
条件により行われ、イミン結合中間体を得た。イミン結
合は、Vasseur、同上、の還元アルキル化条件下、HCHO/
NaBH3CN/AcOHで還元して、メチルアルキル化アミン結合
を通してペプチド核酸に結合させたヌクレオシドを得
た。次いで、中央になる2'−デオキシホスホロチオエー
トヌクレオチド領域は、実施例１のプロトコールに従っ
て、このヌクレオシドに続けて伸長した。第二のペプチ
ド領域のためのペプチド合成は、ヌクレオチドのジメト
キシトリチルブロッキング基を除去した後、DNA領域の
最後のヌクレオチドの5'ヒドロキシと、第二領域の最初
のペプチド核酸のカルボキシ末端とを反応させることに
よって開始する。カップリングは、ピリジン中のEDCを
通して行われ、ペプチドとヌクレオシドの間にエステル
結合が形成される。次いで、ペプチド合成が続けられ、
第二のペプチド核酸領域が完成する。 実施例16 中央の2'−デオキシホスホロセレネートオリゴヌクレオ
チド領域に隣接するペプチド核酸領域を持つ高分子 高分子の2'−デオキシヌクレオチド部分にホスホロセ
レネート結合を導入することを除いて、実施例15の合成
を繰り返し、酸化は、Stawinskiら、Tenth Internatio
nal Roundtable:Nucleosides,Nucleotides and Thei
r Biological Evaluation,September16−20、1992、A
bstracts of Papers,Abstract80に報告されている方
法にしたがって、3H−1,2−ベンゾチアセレノ−３−オ
ールを用いて行った。 実施例17 中央の2'−デオキシホスホロジチオエートオリゴヌクレ
オチド領域に隣接するペプチド核酸領域をもつ高分子 高分子の2'−デオキシヌクレオチド部分へホスホロジ
チオエート結合を導入することを除いて、実施例15の合
成を繰り返し、酸化は、Beatonら、「オリゴヌクレオチ
ドおよびその類似体」、第５章、「オリゴヌクレオチド
ホスホロジチオエートの合成」、109頁、Ａ Practical
Approach,Eckstein,F.編;The Practical Approach
Series,IRL Press,New York 1991、の方法を用い
て行う。 方法１ ras−ルシフェラーゼレポーター遺伝子の組み立て ras−ルシフェラーゼレポーター遺伝子はPCR法を用い
て組み立てた。オリゴヌクレオチドプライマーは、ヒト
のＨ−ras遺伝子の変異体（コドン12）および非変異体
（野生型）の両方のエキソン１の5'領域のPCRクローニ
ングのためのプライマーとして用いるために合成した。
ｃ−Ｈ−ras1活性化オンコジン（コドン12、GGC→GTC）
を含むプラスミドpT24−C3、およびｃ−Ｈ−ras プロ
トオンコジンを含むpbc−N1は、American Type Cultu
re Collection（Bethesda MD）から得た。1.9kbのホ
タルのルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドpT3/T7lu
cは、Clontech Laboratories（Palo Alto,CA）より得
た。オリゴヌクレオチドPCRプライマーは、鋳型として
変異体および非変異体のＨ−ras遺伝子を用いる標準的P
CR反応に用いた。これらのプライマーは、正常および変
異体のＨ−rasの（翻訳開始部位と比較して）配列−53
から＋65に相当し、Nhe IおよびHind IIIの制限エンド
ヌクレアーゼ部位に隣接する、145塩基対のDNA生成物を
生成する。PCR生成物は、標準法に従って、ゲル精製
し、沈殿し、洗浄して、水中に再懸濁した。 P.pyralis（ホタル）のルシフェラーゼ遺伝子のクロ
ーニング用PCRプライマーは、PCR生成物がアミノ末端メ
チオニン残基を除いて全長のルシフェラーゼタンパク質
をコードするように、かつアミノ末端メチオニン残基を
２つのアミノ酸、すなわちアミノ末端のリジン残基およ
び強くロイシン残基に置き換えるように設計した。ルシ
フェラーゼ遺伝子のクローニングに用いるオリゴヌクレ
オチドPCRプライマーは、ルシフェラーゼレポーター遺
伝子を含む商品として入手できるプラスミド（pT3/T7−
Luc）（Clontech）を鋳型として用いる標準PCR法に用い
た。これらのプライマーは、ルシフェラーゼ遺伝子に対
応し、唯一のHind IIIおよびBssH II制限エンドヌクレ
アーゼ部位を両端に持つ、おおよそ1.9kbの生成物を生
ずる。このフラグメントは、標準法に従って、ゲル精製
し、沈殿させ、洗浄し、さらに水中に再懸濁した。 ras−ルシフェラーゼ融合レポーター遺伝子の組み立
てを完成させるために、rasおよびルシフェラーゼのPCR
生成物を、適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、制
限エンドヌクレアーゼNhe I、Hind IIIおよびBssH IIを
用いてステロイド誘導性マウス乳房腫瘍ウイルスプロモ
ーターMMTVを含む発現ベクター中に３部分連結反応によ
ってクローン化した。得られたクローンは、ホタルルシ
フェラーゼ遺伝子とフレームが合うように融合されたＨ
−ras5'配列（−53から＋65）が挿入されていた。得ら
れた発現ベクターは、ステロイド−誘導性MMTVプロモー
ターの制御下で発現するras−ルシフェラーゼ融合生成
物をコードする。これらのプラスミド構築物は、ホタル
のルシフェラーゼをコードする配列とフレームが合うよ
うに融合された活性化型（RA2）または正常型（RA4）Ｈ
−rasタンパク質のアミノ酸１−22をコードする配列を
含む。ras−ルシフェラーゼ融合mRNAの翻訳開始は、天
然のＨ−rasのAUGコドンに依存する。変異体および正常
型のＨ−rasルシフェラーゼ融合構築物の両方を、標準
法によるDNA配列分析によって確認した。 方法２ プラスミドDNAの細胞へのトランスフェクション トランスフェクションは、Greenberg,M.E.,Current
Protocols in Molecular Biology,（F.M.Ausubel,R.
Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.Seidman
およびK.Strahl編、John Wiley and Sons,NY,）に記
載の方法を次のように変更して行った。HeLa細胞は、60
mmの皿に５×105細胞／皿で塗布した。全量で10μｇま
たは12μｇのDNAをそれぞれの皿に加えた。この内、１
μｇは、構成的ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモータ
ーの制御下でラットのグルココルチコイド受容体を発現
するベクターであり、残りはras−ルシフェラーゼレポ
ータープラスミドである。リン酸カルシウム−DNA共沈
殿物は、16−20時間後に3mM−EGTAを含むトリス緩衝食
塩水［50mMトリス−塩酸（pH7.5）、150mM−NaCl］で洗
浄することによって除去した。次いで、10％ウシ胎児血
清を補充した新鮮な培養液を細胞に加えた。この時点
で、細胞を本発明の高分子で前処理し、その後デキサメ
タゾンによってレポーター遺伝子の発現を活性化した。 方法３ 細胞の処理 プラスミドのトランスフェクションに次いで、細胞
は、前もって37℃に暖めておいたリン酸緩衝食塩水で洗
浄し、５μg/mlのＮ−［１−（2,3−ジオレイルオキ
シ）プロピル］−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロ
リド（DOTMA）を含むOpti−MEMを、それぞれのプレート
に（1.0ml/穴で）加える。試験化合物は、それぞれのプ
レートに50μＭのストックから加え、４時間37℃でイン
キュベートする。培養液を除去し、10％のウシ胎児血清
を含むDMEMおよび指示濃度の適当な試験化合物で置き換
え、細胞をさらに２時間37℃でインキュベートし、その
後、最終濃度0.2μＭのデキサメタゾンで細胞を処理す
ることによってレポーター遺伝子の発現を活性化する。
細胞を収集し、デキサメタゾン刺激後15時間で、ルシフ
ェラーゼ活性についてアッセイする。 方法４ ルシフェラーゼアッセイ ルシフェラーゼは、Greenberg,M.E.,Current Protoc
ols in Molecular Biology,（F.M.Ausubel,R.Brent,
R.E.Kingston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.Seidmanおよび
K.Strahl編）、John Wiley and Sons,NY、に記載の
方法に従って、界面活性剤トリトンＸ−100で溶菌する
ことによって、細胞から抽出する。Dynatech ML1000ル
ミノメーターを用いて、ルシフェリン（Sigma）を625μ
Ｍになるように加えたときのピークの蛍光を測定した。
それぞれの抽出物について、ルシフェラーゼアッセイは
いろいろな時間に行い、異なる量の抽出物を用いて、デ
ータがアッセイの直線の範囲に集まることを確かめた。 方法５ 融解曲線 吸光度対温度曲線は、IBM PCコンピューターに接続
したGilford260分光光度計およびGilford Response I
I分光光度計を用いて260nmで測定する。緩衝液は、100m
M Na+、10mMホスフェートおよび0.1mM−EDTA、pH7を含
んでいた。試験化合物濃度は、85℃の吸光度、ならびに
PuglisiおよびTinoco,Mechods in Enzymol.,1989,18
0,304−325に記載の方法に従って計算した吸光係数から
測定して、それぞれの鎖あたり４μＭである。Tm値、デ
ュープレックス形成の自由エネルギーおよび会合定数
は、直線傾斜基本線を持つ二状態モデルにデータを合わ
せることから得られる。Petersheim,M.およびTurner,D.
H.,Biochemistry 1983,22,256−263。報告されるパラ
メーターは、少なくとも３回の実験の平均である。幾つ
かの試験化合物では、デュープレックス形成の自由エネ
ルギーもまた、Tm-1対log10（濃度）のプロットから得
られる。Borer,P.N.,Dengler,B.,Tinoco,I.,Jr.,および
Uhlenbeck,O.C.,J.Mol.Biol.,1974,86,843−853。 方法６ ゲルシフトアッセイ 構築したras標的転写産物である、変異コドン12を含
む47ヌクレオチドヘアピンは、Limaら、Biochemistry,1
991,31,12055−12061に記載の方法に従って、調製しマ
ッピングした。ハイブリダイゼーション反応は、100mM
ナトリウム、10mMリン酸塩、0.1mM−EDTA、100CPMのT7
−生成RNA（おおよそ10pM）、および1pMから10μＭの濃
度範囲の試験化合物を含む20μｌ中で調製される。反応
は、24時間37℃でインキュベートして行われる。ハイブ
リダイゼーションに次いで、負荷緩衝液を反応物に加
え、反応生成物は、45mMのトリス−ホウ酸および1mM−M
gCl2（TBM）を用いて調製した20％ポリアクリルアミド
ゲル上、未変性で解析する。電気泳動は10℃で行い、ゲ
ルはMolecular Dynamics Phosphorimagerを用いて定
量した。 方法７ RNアーゼＨ分析 RNアーゼＨ分析は、活性化された（コドン12、Ｇ→
Ｕ）Ｈ−ras mRNAの塩基＋23から＋47に対応する25塩
基のオリゴリボヌクレオチドの化学合成物を用いて行っ
た。5'−末端を標識したRNAは、濃度20nMで用い、10倍
モル過剰の試験化合物と共に、20mMトリス−Cl、pH7.
5、100mM−KCl、10mM−MgCl2、1mMジチオスレイトー
ル、10μｇ−tRNAおよび4U−RNsinを含む反応溶液中
で、最終容量10μｌでインキュベートする。反応成分
は、37℃で15分間、プレアニールし、次いで、ゆっくり
室温に冷却する。HeLa細胞核抽出物は、哺乳動物RNアー
ゼＨの源として用いられる。反応は、２μｇの核抽出物
（５μＬ）を加えることによって開始し、37℃で10分
間、反応を進行させる。反応は、フェノール／クロロホ
ルム抽出によって停止させ、RNA成分をエタノールで沈
殿させる。同量のCPMを、7M尿素を含む20％ポリアクリ
ルアミドゲルに負荷し、RNA切断生成物を電気泳動によ
って解析し、視覚化し、次いで、オートラジオグラフす
る。切断生成物の定量は、Molecular Dynamics Densi
tometerを用いて行う。 方法８ rasトランス活性化レポーター遺伝子システム 発現プラスミドpSV−oliは、構成的SV40プロモーター
制御下の活性化（コドン12、GGC→GTC）Ｈ−ras cDNA
挿入物を含み、Bruno Tocque博士（Rhone−Poulenc S
ante Vitry France）より頂いた。このプラスミド
は、鋳型として用いられ、PCRによって、ステロイド誘
導性マウス乳房腫瘍ウイルス（MMTV）プロモーターの制
御下のＨ−ras発現プラスミドを構築する。Ｈ−rasコー
ド配列を得るために、Ｈ−ras遺伝子の570bpのコード領
域をPCRによって増幅させる。PCRプライマーは、クロー
ニングを容易にするためにその5'−領域に唯一の制限エ
ンドヌクレアーゼ部位を持つようにデザインされる。Ｈ
−rasコドン12突然変異オンコジンのコード領域を含むP
CR生成物は、ゲル精製し、消化し、クローニングする前
にもう一度ゲル精製する。この構築物は、発現プラスミ
ドpMAMneo（Clontech Laboratories,CA）中に挿入物を
クローニングすることによって完成される。 ras−応答性レポーター遺伝子pRDO53は、ras発現を検
出するために用いられる。Owenら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.,U.S.A.,1990,87,3866−3870。 方法９ インビボでのras発現のノーザンブロット分析 ヒト泌尿器膀胱癌細胞株系T24は、American Type C
ulture Collection（Rockville MD）より得た。細胞
は,L−グルタミン（Gibco BRL,Gaithersburg MD）と
共に、10％熱不活性化ウシ胎児血清およびそれぞれ50U/
mlのペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した、
McCoy's 5A培地中で増殖させる。細胞は、100mmプレー
トに接種した。細胞は、集密度が70％達したときに、試
験化合物で処理される。プレートは、10mlの前もって暖
めておいたPBS、および2.5μｌ−DOTMAを含むOpti−MEM
還元血清培地5mlで洗浄する。次いで、試験化合物を所
望の濃度で加える。４時間処理した後、培地はMcCoy's
培地で置き換える。細胞は試験化合物処理後48時間で収
集し、RNAを標準CsCl沈殿法で分離する。Kingston,R.
E.、Current Protocols in Molecular Biology（F.
M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.A.Smit
h,J.G.SeidmanおよびK.Strahl編）、John Wiley and
Sons,NY。 ヒトの上皮癌細胞株HeLa229は、American Type Cul
ture Collection（Bethesda,MD）から得た。HeLa細胞
は、10％ウシ胎児血清および100U/mlペニシリンを補充
したDulbecco's Modified Eagle's培地（DMEM）中、
６穴プレート上に単層で維持される。試験化合物での処
理およびRNAの分離は、本質的に、上記のT24細胞の所に
記載した通りである。 ノーザンハイブリダイゼーション：それぞれ10μｇの
RNAは、1.2％アガロース／ホルムアミドゲルで電気泳動
し、標準法で、一晩、GeneBind45ナイロン膜（Pharmaci
a LKB,Piscataway,NJ）に移した。Kingston,R.E.、Cur
rent Protocols in Molecular Biology,（F.M.Ausu
bel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.S
eidmanおよびK.Strahl編）,John Wiley and Sons,N
Y.。RNAは、膜にUV架橋する。二本鎖の32P−標識プロー
ブは、the Prime ａ Gene labeling kit（Promeg
a,Madison WI）を用いて合成する。rasプローブは、コ
ドン12にGGCからGTCへの突然変異を持つ活性化（変異
体）Ｈ−ras mRNAのcDNAクローンのSal I−Nhe Iフラ
グメントである。対照プローブは、G3PDHである。ブロ
ットは、QuickHybハイブリダイゼーション溶液（Strata
gene,La Jolla,CA）で15分間68℃で前ハイブリダイズ
する。10mg/mlのサケ精液DNAを100μｌ混合した熱変性
放射性プローブ（2.5×106カウント/2mlハイブリダイゼ
ーション溶液）を加え、膜を１時間68℃でハイブリダイ
ズする。ブロットは、２×SSC/0.1％SDS中、室温で15分
間、２度、さらに0.1×SSC/0.1％SDS中、60℃で30分
間、一度洗浄する。ブロットは、オートラジオグラフ
し、シグナルの強度を、ImageQuant Phosphorlmager
（Molecular Dynamics,SunnyvaIe,CA）を用いて定量す
る。ノーザンブロットは、最初、rasプローブとハイブ
リダイズさせ、次いで、0.1×SSC/0.1％SDS中で15分間
沸騰させることによって取り除き、対照としてのG3PDH
プローブと再度ハイブリダイズさせて試料の負荷の適性
を照合する。 方法10 癌細胞増殖の阻害および化学療法剤試験の対照としての
利用 細胞は、本質的には、実施例９に記載の方法に従っ
て、培養し、試験化合物で処理される。細胞は、60mmプ
レート上に接種し、集密度が70％に達した時にDOTMA存
在下、試験化合物で処理する。時間経過実験：第１日、
細胞は、最終濃度100nMの単一用量の試験化合物で処理
する。増殖培地は、３日目に一度、取り替え、細胞は、
計数容器を用いて、５日間、毎日計数する。投与量応答
実験：さまざまな濃度（10,25,50,100または250nM）の
試験化合物を細胞に加え、細胞を収集し、３日後に計数
する。次いで、本発明の活性な化合物は、他の化学療法
剤のスクリーニングのための同様のスクリーンの標準と
して用いることができる。
配列番号１ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:10 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （iv）アンチセンス:yes （xi）配列:SEQ ID NO:1: 配列番号２ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:17 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （iv）アンチセンス:yes （xi）配列:SEQ ID NO:2: 配列番号３ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:20 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （iv）アンチセンス:yes （xi）配列:SEQ ID NO:3: 配列番号４ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ:15 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （iv）アンチセンス:yes （xi）配列:SEQ ID NO:4:
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 5/00 Ｃ０７Ｋ 5/00 7/06 7/06 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 21/00 - 21/04 A61K 31/7088 - 31/713 A61K 48/00 C12N 15/00 - 15/90 G01N 33/50 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ)
Claims (25)
- 【請求項１】構造： PNA−DNA−PNA ［式中： 前記DNAは、少なくとも１つの２′−デオキシオリゴヌ
クレオチドを含み； かつ前記PNAのそれぞれは、式（Ｉ）： 【化１】 ［式中： ｎは少なくとも２であり、 L1〜Lnはそれぞれ、水素、ヒドロキシ、（C1〜C4）アル
カノイル、天然型のヌクレオベース、非天然型のヌクレ
オベース、芳香族部分、DNAインターカレーター、ヌク
レオベース結合基、複素環式部分、およびレポーターリ
ガンドからなる群より独立的に選択され、L1〜Lnの少な
くとも１つは、天然型ヌクレオベース、非天然型ヌクレ
オベース、DNAインターカレーター、またはヌクレオベ
ース結合基であり； C1〜Cnはそれぞれ、（CR6R7）ｙであり、ここでR6は水
素であり、R7は天然型のα−アミノ酸の側鎖からなる群
より選択されるか、またはR6およびR7は、水素、（C2〜
C6）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリー
ル、ヒドロキシ、（C1〜C6）アルコキシ、（C1〜C6）ア
ルキルチオ、NR3R4およびSR5［ここで、R3およびR4はそ
れぞれ、水素、（C1〜C4）アルキル、ヒドロキシ−また
はアルコキシ−またはアルキルチオ−置換された（C1〜
C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ
およびアミノよりなる群から別個に選ばれ、R5は水素、
（C1〜C6）アルキル、ヒドロキシ−、アルコキシ−もし
くはアルキルチオ−置換（C1〜C6）アルキルである］か
らなる群より独立的に選択されるか、またはR6およびR7
が一緒になって脂環式または複素環式系を作り上げ； D1〜Dnはそれぞれ（CR6R7）ｚであり、R6およびR7は上
記の通りであり； ｙおよびｚはそれぞれ０または１から10までの整数であ
り、ｙ＋ｚの和は２より大きいが10以下であり； G1〜Gn-1のそれぞれは、いずれの向きでもよい−NR3CO
−、−NR3CS−、−NR3SO−、または−NR3SO2−であり、
R3は上記の通りであり； A1〜AnおよびB1〜Bnの組み合わせは、それぞれ： （ａ）Ａは式（II a）、（II b）または（II c）の基の
１つであり、 ＢはＮまたはR3N+である；または （ｂ）Ａは式（II d）の基であり、ＢはCHである； 【化２】 ［式中： Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NR3、CH2またはＣ（CH3）２であ
り； Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはNR4であり； ｐおよびｑはそれぞれ、０または１から５までの整数で
あり、ｐ＋ｑの和は10以下であり； ｒおよびｓはそれぞれ、０または１から５までの整数で
あり、ｒ＋ｓの和は10以下であり； R1およびR2のそれぞれは、水素、ヒドロキシもしくはア
ルコキシもしくはアルキルチオで置換されていてもよい
（C1〜C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキ
ルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群より独立的に
選択され； G1〜Gn-1はそれぞれ、いずれの向きでもよい−NR3CO
−、−NR3CS−、−NR3SO−または−NR3SO2−であり、こ
こでR3は上記の通りであり； Ｑは、−CO2H、−CONR′Ｒ″、−SO3Hもしくは−SO2N
R′Ｒ″または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性化誘導体で
あり；そして Ｉは、−NHRＲ′または−NRＣ（Ｏ）Ｒ′であ
り、ここでＲ′、Ｒ″、ＲおよびＲ′は、水素、ア
ルキル、アミノ保護基、レポーターリガンド、インター
カレーター、キレーター、ペプチド、タンパク質、炭水
化物、脂質、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチ
ド、ヌクレオチドジホスフェート、ヌクレオチドトリホ
スフェート、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド
ならびに可溶性および不溶性ポリマーからなる群より独
立的に選択される；ただし、少なくとも１つのＲ′は前
記DNAであり、少なくとも１つのＲ′は前記DNAであ
る］ を有する少なくとも１つのペプチド核酸サブユニットを
ふくむ］ の高分子。 - 【請求項２】前記PNA−DNA−PNAの高分子が、核酸鎖に
特異的にハイブリダイズする能力を有する、請求項１記
載の高分子。 - 【請求項３】前記核酸鎖が、RNA鎖である、請求項２記
載の高分子。 - 【請求項４】前記DNAが、互いに結合する一連の少なく
とも３つの２′−デオキシヌクレオチドを含み；かつ それぞれのPNAが、少なくとも２つのペプチド核酸サブ
ユニットを含む； 請求項１記載の高分子。 - 【請求項５】前記２′−デオキシヌクレオチドが、ホス
ホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチ
オエート−ヌクレオチドである、請求項１記載の高分
子。 - 【請求項６】前記DNAが、ホスホジエステル、ホスホロ
チオエートまたはホスホロジチオエート結合によって互
いに結合する一連の少なくとも３つの２′−デオキシヌ
クレオチドを含む、請求項１記載の高分子。 - 【請求項７】前記PNAのそれぞれが、式III a、III bま
たはIII c: 【化３】 ［式中： Ｌはそれぞれ、水素、フェニル、複素環式部分、天然型
のヌクレオベース、および非天然型のヌクレオベースか
らなる群より独立的に選択され； R7′はそれぞれ、水素および天然型α−アミノ酸の側鎖
からなる群より独立的に選択され； ｎは、１から60の整数であり； ｋ、ｌ、およびｍはそれぞれ、独立的に０または１から
５の整数であり； ｐは、０または１であり； Rhは、OH、NH2または−NHLysNH2であり； Riは、ＨまたはCOCH3である］ の化合物を含む、請求項１記載の高分子。 - 【請求項８】前記PNAのそれぞれが、式（III a）〜（II
I c）を有する化合物を含み、式中、各々のＬはヌクレ
オベースであるチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、シトシ
ン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）からな
る群より独立的に選択され、ｋおよびｍは０または１で
あり、ｎは１から30の整数である、請求項７記載の高分
子。 - 【請求項９】前記DNAが、互いに結合した一連の少なく
とも３つの前記２′−デオキシヌクレオチドを含み： PNAのそれぞれが少なくとも２つのペプチド核酸サブユ
ニットを含み；かつ 前記２′−デオキシヌクレオチドが、ホスホジエステ
ル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結
合を通して結合している； 請求項８記載の高分子。 - 【請求項１０】前記PNAのそれぞれが、アミド、アミン
またはエステル結合で前記DNAに共有結合している、請
求項１記載の高分子。 - 【請求項１１】構造： 【化４】 PNA−（アミド結合基）−DNA−（アミド結合基）−PNA ［式中： 前記DNAは、少なくとも１つの２′−デオキシヌクレオ
チドを含み； 前記PNAはそれぞれ、少なくとも１つのペプチド核酸サ
ブユニットを含み；かつ、 前記アミド結合基はそれぞれ、構造： −Ｃ（＝Ｏ）−NH− または −NH−Ｃ（＝Ｏ）− のアミド結合を含む］ の構造の高分子。 - 【請求項１２】インビトロで配列特異的核酸を修飾する
方法であって、RNアーゼＨおよび前記核酸を含む試験溶
液を請求項１記載の高分子と接触させることを含む方
法。 - 【請求項１３】インビトロで配列特異的核酸を修飾する
方法であって、RNアーゼＨおよび前記核酸を含む試験溶
液を請求項９記載の化合物と接触させることを含む方
法。 - 【請求項１４】構造： PNA−DNA または DNA−PNA ［式中： 前記DNAは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を
通して結合している複数のヌクレオシドを含み、少なく
とも１つの前記ヌクレオシドは２′−デオキシヌクレオ
チドであり；かつ 前記PNAは、式（Ｉ）： 【化５】 ［式中： ｎは少なくとも２であり、 L1〜Lnはそれぞれ、水素、ヒドロキシ、（C1〜C4）アル
カノイル、天然型のヌクレオベース、非天然型のヌクレ
オベース、芳香族部分、DNAインターカレーター、ヌク
レオベース結合基、複素環式部分、およびレポーターリ
ガンドからなる群より独立的に選択され、L1〜Lnの少な
くとも１つは、天然型ヌクレオベース、非天然型ヌクレ
オベース、DNAインターカレーター、またはヌクレオベ
ース結合基であり； C1〜Cnはそれぞれ、（CR6R7）ｙであり、ここでR6は水
素であり、R7は天然型のα−アミノ酸の側鎖からなる群
より選択されるか、またはR6およびR7は、水素、（C2〜
C6）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリー
ル、ヒドロキシ、（C1〜C6）アルコキシ、（C1〜C6）ア
ルキルチオ、NR3R4およびSR5［ここで、R3およびR4はそ
れぞれ、水素、（C1〜C4）アルキル、ヒドロキシ−また
はアルコキシ−またはアルキルチオ−置換された（C1〜
C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ
およびアミノよりなる群から別個に選ばれ、R5は水素、
（C1〜C6）アルキル、ヒドロキシ−、アルコキシ−もし
くはアルキルチオ−置換（C1〜C6）アルキルである］か
らなる群より独立的に選択されるか、またはR6およびR7
が一緒になって脂環式または複素環式系を作り上げ； D1〜Dnはそれぞれ（CR6R7）ｚであり、R6およびR7は上
記の通りであり； ｙおよびｚはそれぞれ０または１から10までの整数であ
り、ｙ＋ｚの和は２より大きいが10以下であり； G1〜Gn-1のそれぞれは、いずれの向きでもよい−NR3CO
−、−NR3CS−、−NR3SO−、または−NR3SO2−であり、
R3は上記の通りであり； A1〜AnおよびB1〜Bnの組み合わせは、それぞれ： （ａ）Ａは式（II a）、（II b）または（II c）の基で
あり、 ＢはＮまたはR3N+である；または （ｂ）Ａは式（II d）の基であり、ＢはCHである； 【化６】 ［式中： Ｘは、Ｏ、Ｓ、Se、NR3、CH2またはＣ（CH3）２であ
り； Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはNR4であり； ｐおよびｑはそれぞれ、０または１から５までの整数で
あり、ｐ＋ｑの和は10以下であり； ｒおよびｓはそれぞれ、０または１から５までの整数で
あり、ｒ＋ｓの和は10以下であり； R1およびR2のそれぞれは、水素、ヒドロキシもしくはア
ルコキシもしくはアルキルチオで置換されていてもよい
（C1〜C4）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキ
ルチオ、アミノおよびハロゲンからなる群より独立的に
選択され； G1〜Gn-1はそれぞれ、いずれの向きでもよい−NR3CO
−、−NR3CS−、−NR3SO−または−NR3SO2−であり、こ
こでR3は上記の通りであり； Ｑは、−CO2H、−CONR′Ｒ″、−SO3Hもしくは−SO2N
R′Ｒ″、または−CO2Hもしくは−SO3Hの活性化誘導体
であり；そして Ｉは、−NHRＲ′または−NRＣ（Ｏ）Ｒ′であ
り、ここでＲ′、Ｒ″、ＲおよびＲ′は、水素、ア
ルキル、アミノ保護基、レポーターリガンド、インター
カレーター、キレーター、ペプチド、タンパク質、炭水
化物、脂質、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチ
ド、ヌクレオチドジホスフェート、ヌクレオチドトリホ
スフェート、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド
ならびに可溶性および不溶性ポリマーからなる群より独
立的に選択される；ただし、少なくとも１つのＲ′は前
記DNAであり、少なくとも１つのＲ′は前記DNAであ
る］ を有する少なくとも１つのペプチド核酸サブユニットを
ふくむ］ の高分子。 - 【請求項１５】構造PNA−DNAを有する、請求項14記載の
高分子。 - 【請求項１６】構造DNA−PNAを有する、請求項14記載の
高分子。 - 【請求項１７】前記PNA−DNAまたはDNA−PNAの高分子
が、核酸鎖に特異的にハイブリダイズする能力を有す
る、請求項14記載の高分子。 - 【請求項１８】前記核酸鎖が、RNA鎖である、請求項17
記載の高分子。 - 【請求項１９】前記DNAが、互いに結合する一連の少な
くとも３つの２′−デオキシヌクレオチドを含み；かつ それぞれのPNAが、少なくとも２つのペプチド核酸サブ
ユニットを含む； 請求項14記載の高分子。 - 【請求項２０】前記２′−デオキシヌクレオチドが、ホ
スホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジ
チオエート２′−デオキシヌクレオチドである、請求項
14記載の高分子。 - 【請求項２１】前記DNAが、ホスホジエステル、ホスホ
ロチオエートまたはホスホロジチオエート結合によって
互いに結合する一連の少なくとも３つの２′−デオキシ
ヌクレオチドを含む、請求項14記載の高分子。 - 【請求項２２】前記PNAが、式III a、III bまたはIII
c: 【化７】 ［式中： Ｌはそれぞれ、水素、フェニル、複素環式部分、天然型
のヌクレオベース、および非天然型のヌクレオベースか
らなる群より独立的に選択され； R7′はそれぞれ、水素および天然型α−アミノ酸の側鎖
からなる群より独立的に選択され； ｎは、１から60の整数であり； ｋ、ｌ、およびｍはそれぞれ、独立的に、０または１か
ら５の整数であり； ｐは、０または１であり； Rhは、OH、NH2または−NHLysNH2であり；そして Riは、ＨまたはCOCH3である］ からなる群より選択される式を有する化合物を含む、請
求項14記載の高分子。 - 【請求項２３】前記PNAが、式（III a）、（III b）お
よび（III c）からなる群より選択される式を有する化
合物を含み、式中、各々のＬは、ヌクレオベースである
チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｓ）、グア
ニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）からなる群より独立的
に選択され、ｋおよびｍは０または１であり、ｎは１か
ら30の整数である、請求項22記載の高分子。 - 【請求項２４】前記DNAが、互いに結合した一連の少な
くとも３つの前記２′−デオキシヌクレオチドを含み； 前記PNAが、少なくとも２つのペプチド核酸サブユニッ
トを含み；かつ 前記２′−デオキシヌクレオチドが、ホスホジエステ
ル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結
合を通して結合している； 請求項23記載の高分子。 - 【請求項２５】前記PNAが、アミド、アミンまたはエス
テル結合で前記DNAに共有結合している、請求項14記載
の高分子。
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|---|---|---|---|
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