KR100190493B1 - Pna-dna-pna 잡종 거대분자들 - Google Patents

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Abstract

본 발명에 따르면 향상된 뉴클레아제 저항성, 상보적인 사슬에 친화성 증가, RNase H를 활성화하는 거대분자들이 제공되어진다. 상기 거대분자들은 PNA-DNA-PNA 구조를 가지며, 여기에서 상기 DNA 부분은 2'-데옥시-에리쓰로-펜토푸라노실 뉴클레오티드의 소단위들로 구성되어 있고 상기 PNA 부분들은 펩티드핵산의 소단위들로 구성되어 있다. 본 발명의 거대분자들은 진단과 다른 연구 목적에, 유기체에서 단백질 조절에, 그리고 치료에 적절한 다른 조건들의 진단, 발견 및 처치에 유용하다.

Description

[발명의 명칭]
PNA-DNA-PNA 잡종 거대분자들
(관련된 출원들에 대한 교차 참조)
본 출원은 '갭(gap)이 있는 2' 변형된 올리고뉴클레오티들'이라는 명칭으로 1991년 12월 24일 출원된 본 출원인의 선행출원번호 제 814,961 호의 계속출원인,'갭이 있는 2' 변형된 올리고뉴클레오티드들'이라는 명칭으로 1992년 12월 23일 출원된 본 출원인의 선행출원번호 제 US92/11339 호의 계속출원이며, 이들 두 출원들은 본 출원에 공동으로 양도되어졌다. 더욱 본 출원은 본 출원에 일부가 공통적으로 양도되어진, '펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid)들의 보다 높은 차수의 구조 및 결합'이라는 명칭으로 1993년 7윌 2일 출원된 출원번호 제 088,658 호에 관련된 것이다. 상기 출원은 1992년 5월 19일 출원된 PCT/EP91/01219 호의 계속 출원인, '신규한 펩티드 핵산들'이라는 명칭으로 1993년 4윌 26일 출원된 출원번호 제 054,363 호의 계속출원이다. 이들 출원들 각각의 상세한 설명들을 여기에 참고로 포함시켰다.
(발명의 분야)
본 발명은 PNA-DNA-PNA 구조를 갖는 잡종 분자(chimeric molecules)들의 합성과 사용에 관한 것으로, 여기에서 각 PNA는 펩티드 핵산이며, DNA는 포스포디 에스터, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 2'- 데옥시올리고 뉴클레오티드이다. 세포, 세포상 추출물 또는 RNase H 함유 진단시험시스템에서, RNA 목표분자에 혼성화할 수 있는 염기 서열을 갖는 본 발명의 잡종 거대분자는 목표 RNA 분자에 결합할 수 있고 RNA 목표분자의 RNase H 사슬 분열을 유도한다.
(발명의 배경)
대부분의 질병상태를 포함한 포유동물에서의 신체적 상태의 대부분이 단백질들에 의하여 영향을 받는다는 것은 잘 알려져 있다. 이들 단백질들은 직접적으로나 또는 그들의 효소적 기능들을 통하여 동물들 및 인간 내에서 않은 질병들에 주요한 부분으로 기여한다. 전통적인 요법들은 이들 질병유발기능들 또는 질병 잠재기능들을 경감시키기 위한 노력으로 상기한 단백질들과의 상호작용에 일반적으로 촛점을 맞추었었다. 그리나, 최근에 단백질 합성을 조종하는 전령RNA(mRNA) 또는 다른 세포내 RNA 들과의 상호작용에 의하여 상기한 단백질들의 실질적인 생산을 경감시키고자 하는 시도들이 행하여졌다. 바람직하지 못한 단백질 형성으로 유도되어지는 유전자 발현에 간섭하거나 또는 유전자발현을 조절하는 것이 상기한 치료요법적 접근법들의 목적이다.
항감작(antisense) 방법론은 상대적으로 짧은 올리고뉴클레오티드들의 단일-사슬의 RNA 또는 단일-사슬의 DNA에 이들 세포내의 핵산들의 정상적이고, 필수적인 기능들이 정지되어지도록 하는 상보성 혼성(complementary hybridization)이다.
혼성은 올리고뉴클레오티드들의 헤테로고리의 염기들의 와트슨-크릭 염기쌍들을 통한 RNA 또는 DNA에의 서열특이성 수소결합이다. 이러한 염기쌍들은 다른 하나에 대하여 상보성이라고 한다.
올리고뉴클레오티드: 유전자발현의 항감작 저해제들, 씨알씨 프레스 인코포레이티드, 보카 레이튼, 플로리다(1989)(Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Inc.,Boca Raton, F1(1989)에서 코헨(Cohen)에 의하여 논의되어진 바와 같은 핵산기능의 분열을 제공하는 자연적으로 일어나는 사건들은 적어도 두가지 형태가 될 것이다. 그 첫번째는 혼성 억제이다. 이는 사건의 종료를 의미하며, 여기에서 올리고뉴클레오티드 저해제가 목표 핵산에 결합하고 그에따라 단순한 입체장해(steric hindrance)에 의하여 필수 단백질들, 대부분 리보좀들의 핵산에의 결합을 억제하는 것을 나타낸다. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드(예를들어, 밀러와 그의 동료들의 항암제 설계 1987,2,117(Anti-Cancer Drug Design 1987,2,117)을 참조)들 및 알파-아노머(α-anomer) 올리고뉴클레오티드들이 혼성정지에 의하여 핵산기능을 억제시키는 것으로 여겨지는 가장 많이 연구되어진 두 항감작제 들이다.
올리고뉴클레오티드의 혼성억제외 정도를 결정함에 있어서, 상보성의 핵산들에 결합하는 올리고뉴클레오티드의 상대적인 능력은 특정의 혼성복합체의 용융접(Tm)의 결정에 의하여 비교되어질 수 있다. 이중나선(double helixes)들의 특정한 물리적 성질인 용융점은 코일(혼성되어지지 않은)에 대한 50%의 나선(혼성되어진)이 존재하는 곳에서의 섭씨단위의 온도를 나타낸다. Tm은 자외선 스팩트럼을 사용하여 혼성의 형성 및 파괴(용융)를 결정하므로써 측정되어진다. 혼성동안에 발생하는 염기적층(base stacking)은 자외선흡수(감색 성(hypochromicity))에서의 감소를 수반한다. 따라서 자외선흡수의 감소는 보다 높은 Tm을 나타낸다. Tm이 높을수록 사슬들의 결합의 강도는 커진다. 비-와트슨-크릭 염기쌍, 즉 염기불일치는 Tm에 대한 강한 불안정화효과를 갖는다.
항감작 올리고뉴클레오티드들에 대한 두번째 형태의 억제는 세포대 RNase H에 의한 목표RNA의 효소적 절단을 포함한다. 이러한 RNase H 절단들의 작용기구는 목표RNA에의 2'-데옥시리보푸라노실 올리고뉴클레오티드의 혼성을 필요로한다. 그 결과의 DNA-RNA 이중나선(duplex)은 RNase H 요소를 활성화하고; 상기 활성화된 효소는 상기 RNA사슬을 절단한다. 상기 RNA사슬의 절단은 상기 RNA의 정상적인 기능을 파괴한다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드들이 이러한 형태의 사건에 의하여 동작하는 하나의 저명한 항감작제외 예가 된다. DNA올리고뉴클레오티드가 RNAse H의 활성화에 유용하게 되기 위하여는, 상기 올리고뉴클레오티드는 RNase H의 활성화에 필요한 충분한 시간 동안 세포내에서 살아남도록 하기 위하여 뉴클레아제에 대하여 상당히 안정하여야만 한다.
왈더와 그의 동료들(Walder, et al.)의 최근, 다수의 간행물들은 RNase H 및 올리고뉴클레오티드들의 상호작용을 더욱 기술하고 있다. 그들 중 특히 흥미있는 것들로는 (1)대글과 그의 동료들의 핵산 연구 1990,18, 4751(Dagle, et al.,Nucleic Acids Research 1990,18,4751); (2)대글과 그의 동료들의 항감작 연구 및 개발 1991,1,11(Dagle, et al., Antisense Research And Development 1991,1,11) ; (3)에더와 그의 동료들의 바이올로지컬 케미스트리의 저널 1991,266,6472(Eder, et al., J. Biol. Chem.1991,266,6472) 및 (4) 대글과 그의 동료들의 핵산 연구 1991,19,1805(Dagle, et al., Nucleic Acids Research 1991,19,1805)등을 들 수 있다. 이들 논문들에서, 왈더와 그의 동료들은 변형되지 않은 포스포디에스테르인터뉴클레오시드 결합 및 변형되어진 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드결합의 두가지 모두를 갖는 DNA 올리고뉴클레오티드들이 세포상 RNase H에 대한 기질임을 주목하고 있다. 그들이 기질이기 때문에, 그들은 RNase H에 의하여 목표RNA의 절단을 활성화한다. 상기 저자는 제노푸스 엠브리오스(Xenopus embrios)내에서 포스포디에스테르결합들 및 포스포로티오에이트 결합들 두가지 모두가 또한 엑소뉴클레아제 분해에 적용되어진다는 것에 더욱 주목하고 있다. 이러한 뉴클레아제 분해가 RNase H 활성에 필요한 올리고뉴클레오티드를 빠르게 소모시키기 때문에 이러한 뉴클레아제 분해는 바람직하지 못하다. (1)대글과 그의 동료들의 핵산 연구 1990,18, 4751; (2)대글과 그의 동료들의 항감작 연구 및 개발 1991,1,11 및 (4) 대글과 그의 동료들의 핵산 연구 1991,19,1805 들에서 기술되어진 바와 같이, 여전히 RNase H 활성을 제공하면서도 뉴클레아제 분해에 그들 올리고뉴클레오티드들을 안정화시키기 위하여, 왈더와 그의 동료들은 포스포르아미테이트, 알킬포스포레이트 또는 포스포트리에스테르결합들의 부분들 사이에 위치하는 포스포디에스터가 결합된 뉴클레오티드들의 짧은 부분을 갖는 2'-데옥시올리고뉴클레오티드들을 조립하였다. 상기 포스포르아미테이트 함유 올리고뉴클레오티드들이 엑소뉴클레아제들에 대하여 안정하게 되어지는 한편 상기 (4)대글과 그의 동료들의 핵산 연구 1991,19,1805에서 저자들은 각 포스포르아미테이트 결합이 상기 포스포르아미테이트 함유 올리고뉴클레오티드 함유 올리고뉴클레오티드들의 Tm값의 측정에서 1.6℃의 손실을 낳는다는 것을 주목하고 있다. 상기한 Tm값에서의 상기한 감소는 상기 올리고뉴클레오티드와 그의 목표 사슬 사이의 혼성의 바람직하지 못한 감소를 나타낸다.
다른 저자들은 항감작 올리고뉴클레오티드와 그의 목표 사슬 사이의 상기한 혼성의 손실이 가질 수 있는 영향에 대하여 언급하고 있다. 세이슨-베모아라스와 그의 동료들의 엠보 저널 1991,10,1111에는 올리고뉴클레오티드가 RNaseH에 대한 기질이 될 수 있음에도 불구하고 상기 mRNA에의 약한 혼성 때문에 RNase H에 의한 절단 효율이 낮아짐을 말하고 있다. 상기 저자들은 또한 상기올리고뉴클레오티드의 3' 말단에서의 아크리딘 치환의 봉입(iuclusion)이 엑소뉴클레아제들로 부터 상기 올리고뉴클레오티드를 보호한다는 것에 주목하였다.
1992년 9월 22일, 페더슨과 그의 동료들에 허여되어진 미합중국 특허 제5,149,797 호는 RNase H 작용기구에 의하여 작동하는 올리고뉴클레오티드들을 더욱 기술하고 있다. 이 특허에서 특허청구하고 있는 바와 같은 올리고뉴클레오티드들은 메틸포스포데이트들, 포스포로모르폴리데이트들, 포스포로피피라지데이트들 또는 포스포르아미테이트들에 의하여 옆을 댄(flanked) 포스포로티오에이트 뉴클레오티드들로 조성한 내측 단편들로 이루어진다. 올리고뉴클레오티드 결합들로서 사용되어진 경우에, 이들 올리고뉴클레오티드들의 성분들 모두 즉, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트들, 포스포로모르폴리데이트들, 포스포로피페라지데이트들 또는 포스포르아미테이트들 각각이 상기 올리고뉴클레오티드와 그의 목표 사슬 사이의 혼성을 감소시키기 때문에, 세이슨-베모이라스와 그의 동료들의 상기한 언급은 본 발명에서 기술하고 있는 상기 올리고뉴클레오티드들에도 동등하게 적용되어질 수 있다.
항감작 올리고뉴클레오티드 및 RNase H를 사용하는 목표RNA 사슬의 절단이 유용할 수 있다는 것이 인식되어졌음에도 불구하고, 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 저항성 및 상기 혼성의 정확성은 역시 중요하다. 혼성특성을 유지하거나 개선하고 뉴클레아제 저항성을 제공하는 한편 동시적으로 RNase H를 활성화하는 방법들 및 물질들에 대한 오랜 욕구가 있었음에도 불구하고 이제까지 당해기술분야에서 이러한 방법들 및 물질들에 대하여 어떠한 제안도 없었다. 따라서,이러한 방법들 및 물질들에 대한 오랜 욕구가 여전히 남아있다.
(발명의 목적)
본 발명의 목적은 증가된 결합친화력으로 목표 사슬과 잡종 거대분자들을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 뉴클레아제 분해에 대하여 안정성을 갖는 잡종 거대분자들을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 목표 사슬 절단을 위한 RNase H를 활성화하는 잡종거대분자들을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 시험관 내에서 동물들의 신체적 상태, 특히 질병상태의 세포상 상태들을 분석하기 위한 연구 및 진단학적 방법 및 물질들을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 목표RNA의 활성의 조절을 통한 질병들의 처치를 위한 치료요법적 및 연구 방법들과 물질들을 제공하는 것이다.
(발명의 간단한 설명)
본 발명에 따르면 펩티드 핵산들 및 2'-데옥시올리고뉴클레오티들로 부터 형성된 거대분자들이 제공되어진다. 이러한 거대분자들은 PNA-DNA-PNA 구조를 가지며, 여기에서 상기 PNA 부분들은 펩티드핵산 서열들이며, 상기 DNA 부분은 포스포디에스터, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 2'-데옥시올리고 뉴클레오티드 서열이다. 상기 거대분자의 상기 PNA 부분들은 증가된 뉴클레아제 저항성 및 목표RNA들에 대한 거대분자의 증가된 결합친화력을 제공하는 것으로 여겨진다. 상기 2'-데옥시올리고뉴클레오티드 부분은 RNase H 응답 및 RNA 목표 사슬의 절단을 유도하는 것으로 여겨진다.
본 발명의 거대분자들의 2'-데옥시올리고뉴클레오티드 즉, DNA 부분들은 2'-데옥시-에리쓰리-펜토푸라노실 당 부분들을 갖는 뉴클레오티드 단위들로 부터 형성되어진 올리고뉴클레오티드 단편들이다. 각 뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드의 2'-데옥시-에리쓰로-펜토푸라노실 당 부분에 부착되어진 핵산염기(nucleobase)를 포함한다. 상기 뉴클레오티드들은 포스포디에스테르결합들, 포스포로티오에이트 결합들 및/또는 포스포로디티오에이트 결합들에 의하여 서로 및/또는 다른 부분들에 결합되어진다. 본 발명의 특정의 바람직한 거대분자들에서, 상기 거대분자의 2'-데옥시올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드들 각각은 포스포로티오에이트 결합들에 의하여 서로 결합되어진다. 다른 바람직한 구체예들에서, 상기 2'-데옥시올리고뉴클레오티드 부분의 상기 뉴클레오티드들은 포스포디에스테르결합들에 의하여 서로 결합되어지며, 또다른 구체예들에서, 포스포디에스테르및 포스포로티오에이트 결합들의 혼합물이 상기 2'-데옥시올리고뉴클레오티드의 상기뉴클레오티드 단위들을 서로 결합한다.
상기 거대분자들의 상기 펩티드핵산 부분들은 핵산의 상보성 사슬에 대한 상기 거대분자의 결합친화력을 증가시킨다. 더욱 이는 세포상의 뉴클레아제들에 의한 분해에 대한 상기 거대분자의 뉴클레아제 안정성을 제공한다. 하나 또는 그 이상 또는 모든 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 결합들을 포함하도록 하는 상기 거대분자의 상기 2'-데옥시올리고뉴클레오티드의 선택은 본 발명의 상기 거대분자들에 뉴클레아제 안정성을 더욱 제공한다.
본 발명의 상기 거대분자들의 상기 PNA 부분들은 상기 단위의 글리신 부분의 질소원자에 대한 카르복시메틸 부분 또는 그의 동족체와 같은 링커(linker)를 경유하여 그에 부착되어진 핵산염기를 갖는 N-(2-아미노에틸)-글리신 또는 그의 동족체를 포함하는 단위들로 이루어진다. 상기 단위들은 상기 글리신 부분의 상기카르복실기와 상기 아미노에틸 부분의 상기 아민기 사이에서 형성된 아미드 결합들을 통하여 서로 결합되어진다. 상기 핵산염기는 핵산들의 4개의 공통의 핵산염기들 중의 하나가 되거나 또는 이들은 다른 천연 또는 합성 핵산염기들을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 거대분자들에서, 상기 PNA-DNA-PNA 구조는 상기 각각의 N-(2-아미노에틸)글리신 PNA 단위들 및 상기 각각의 2'-데옥시-에리쓰로-펜토푸라노실 당 포스페이트 DNA 단위들을 서로 연결시킴에 의하여 형성되어진다.
따라서 본 발명의 상기 거대분자들의 PNA 부분의 핵산염기들은 N-(2-아미노에틸)글리신 PNA 단위들로 구성된 주쇄상으로 옮겨지고 그리고 본 발명의 상기 거대분자들의 DNA 부분의 핵산염기들은 2'-데옥시-에리쓰로-펜토푸라노실 당 포스페이트 단위들로 구성된 주쇄 상으로 옮겨진다. 본 발명의 거대분자들의 상기 PNA 부분들의 핵산염기 및 상기 DNA 부분의 핵산염기들이 함께 상보성 핵산, 예를 들면 목표되어진 RNA 사슬에 혼성되어질 수 있는 서열로 그들 각각의 주쇄 단위들에 의하여 연결되어진다.
본 발명의 바람직한 거대분자들에서, 상기 PNA 및 상기 DNA 부분들은 아미드 결합들로 서로 연결되어진다. 본 발명의 이러한 바람직한 거대분자에서, 상기 거대분자는
PNA-(아미드 결합)-DNA-(아미드 결합)-PNA
의 구조이다. 상기 PNA와 상기 DNA 부분들을 서로 연결하는데 사용되어질수 있는 다른 결합들에는 아민 결합들 및 에스테르 결합들들이 포함된다.
본 발명의 상기 거대분자들은 바람직하게 약 9에서 약 30까지의 전체 핵산염기 함유 소단위(subunit)들을 포함한다. 상기 거대분자들이 약 15에서 약 25까지의 핵산염기 함유 소단위들을 포함하는 것이 보다 바람직하다. 상기에서 특정한 바와 같이 RNase H 응답을 유도하기 위하여는, 여기에서 상기 거대분자의 전체 서열길이가 3 이상의 보조(sub)서열이 될 수 있으나, 바람직하게는 5 또는 그 이상의 연속적인 2'-데옥시-에리쓰로-펜토푸라노실 함유 뉴클레오티드 소단위들이 될수 있다.
상기 펩티드 핵산 및 상기 2'-데옥시뉴클레오티드 소단위들 두가지 모두에 대한 본 발명의 바람적한 핵산염기들에는 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실, 티민, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 다른 알킬 아데닌들, 2-프로필 및 다른 알킬 아데닌들, 5-할로 우라실, 5-할로 시토신, 5-포로피닐 우라실, 5-포로피닐시토신, 7-데아자아데 닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자-7-메틸-아데닌, 7-데아자-7-메틸-구아닌, 7-데아자-7-포로피닐-아데닌, 7-데아지-7-포로피닐-구아닌 및 다른 7-데아자-7-알킬 또는 7-아릴 퓨린들, N2-알킬-구아닌, N2-알킬-2-아미노-아데닌, 퓨린 6-아자 우라실, 6-아자 시토신 및 6-아자 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로 아데닌, 8-아미노-아데닌, 8-티올 아데닌, 8-티올알킬 아데닌들, 8-히도록실 아데닌 및 다른 8 치환되어진 아데닌들 및 8-할로 구아닌들, 8-아미노 구아닌, 8-티올 구아닌, 8-티올알킬 구아닌들, 8-히드록실 구아닌 및 다른 8 치환되어진 구아닌들, 다른 아자 및 데아자 우라실들, 다른 아자 및 데아자 티미딘들, 다른 아자 및 데아자 시토신, 아자 및 데아자 아데닌들, 아자 및 데아자 구아닌들 또는 5-트리풀루오로메틸 우라실 및 5-트리플루오로시토신들이 포함되어진다.
본 발명은 또한 단백질의 바람직하지 못한 생산에 의하여 특징지어지는 질병을 갖는 유기체를 처치하는 방법들을 제공한다. 이들 방법들은 핵산의 상보성 사슬과 특이적으로 혼성할 수 있는 핵산염기들의 서열을 갖는 거대분자를 유기체와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 핵산염기들의 부분을 갖는 것을 포함하는 상기 방법들은 펩티드 핵산 소단위들(PNA 단위들)을 포함하며, 또한 상기 핵산염기들의 나머지는 2'-데옥시뉴클레오티드 소단위들(DNA 단위들)을 포함한다. 상기 펩티드 핵산 소단위들과 상기 데옥시뉴클레오티드 소단위들은 함꼐 결합되어 PNA-DNA-PNA 구조의 거대분자를 형성하며,여기에서 상기 PNA들은 펩티드 핵산들이고, DNA는2'-데옥시올리고뉴클레오티드이다.
본 발명에 따라 핵산의 상보성 사슬에 특이적으로 혼성되어질 수 있는 핵산염기들의 서열을 갖는 거대분자의 약리학적으로 유효량을 포함하는 조성물이 더욱 제공되어진다. 상기 핵산염기들의 부분을 갖는 것을 더욱 포함하는 상기 조성물들은 펩티드 핵산 소단위들(PNA 단위들)을 포함하며, 또한 상기 핵산염기들의 나머지는 2'-데옥시뉴클레오티드 소단위들(DNA 단위들)을 포함한다. 상기 펩티드 핵산 소단위들(상기 PNA들) 및 상기 데옥시뉴클레오티드 소단위들(상기 DNA)들은 함께 결합되어 PNA-DNA-PNA 구조의 거대분자를 형성한다. 상기 조성물은 약리학적으로 수용가능한 회석제 또는 담체(carrier)를 더욱 포함한다.
본 발명에 따라 RNase H 요소를 함유하는 시험용액과 상기에서 한정한 바와같은, 상기 PNA-DNA-PNA거대분자를 갖는 핵산을 접촉시키는 것을 포함하는, 서열 특이성 핵산의 시험관내에서 변형시키는 방법들이 더욱 제공되어진다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명의 목적들에 따라, 일단 증가되어진 뉴클레아제 저항성, 상보성 사슬들에의 증가된 결합친화력을 가지며, RNase H에 대하여 기질이 되는 신규한 거대분자들이 제공되어진다. 본 발명의 거대분자들은 다수의 펩티드 핵산 소단위들(PNA 소단위들)과 다수의 2'-데옥시뉴클레오티드 소단위들(DNA 소단위들)로 부터 조립되어진다. 이들은 PNA-DNA-PNA 구조의 거대분자로 조립되어진다. 각 펩티드 핵산 소단위 및 각 2'-데옥시뉴클레오티드 소단위는 DNA 분자 및 단백질들을 포함하는 목표 RNA 분자들 또는 다른 목표 분자들상의 유사한 핵산염기들과 특이적으로 혼성할 수 있는 핵산염기를 포함한다.
본 발명의 거대분자들의 펩티드 핵산 부분들은 본 발명의 거대분자들에 증가된 뉴클레아제 저항성을 부여한다. 더우기, 이들 동일한 펩티드 핵산 부분들은 핵산의 상보성 사슬에 대한 본 발명의 거대분자들의 증가된 결합친화력을 부여한다. 본 발명의 거대분자들의 상기 2'-데옥시뉴클레오티드 부분 각각이 그들의 당 부분으로서 2'-데옥시 - 에리쓰로- 펜토푸라노실기를 포함한다.
상기한 지침들과 관련하여, 상기 2'-데옥시뉴클레오티드 소단위들 각각은 천연 또는 합성 부분이 될 수 있다. 따라서, 본 발명의 문맥에서, 첫번째의 경우에서 올리고뉴클레오티드라는 용어는 다수의 결합된 뉴클레오티드 단위들로 부터 형성된 폴리뉴클레오티드를 언급하는 것이다. 상기 뉴클레오티드 단위들은 원래의 인터뉴클레오시드, 포스포디에스테르 결합들을 통하여 서로 결합되어진다. 상기 뉴클레오티드 단위들은 천연적으로 발생하는 염기들 및 2'-데옥시-에리쓰로- 펜토푸라노실 당 기들로부터 형성되어진다. 따라서, 상기 용어 올리고뉴클레오티드는 천연적으로 발생하는 종들 또는 천연적으로 발생하는 뉴클레오티드 단위들로 부터 형성된 합성종들을 효과적으로 포함한다.
상기 용어 올리고뉴클레오티드는 천연의 염기들과 유사하게 기능하는 변형되어진 염기부분들을 포함하여 비-천연적으로 발생하는 또는 변형되어진 구조들과 마찬가지로 천연적으로 발생하는 구조들을 포함하는 것으로 고려된다. 상기 거대분자의 2'-데옥시올리고뉴클레오티드 부분의 상기 뉴클레오티드들은 상기 천연의 포스포디에스테르결합에 더해 다른 선택되어진 합성 결합들로 서로 결합되어질수 있다. 이들 다른 결합들은 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트 당간(inter-sugar) 결합들을 포함한다. 적절한 결합들로서 포스포로셀레네이트 및 포스포로디셀레네이트 결합들이 더욱 제안되어진다. 상기 염기부분 즉, 상기 2'-데옥시뉴클레오티드들의 핵산염기는 천연의 염기들 즉, 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실 또는 티민을 포함할 수 있다. 달리, 이들은 천연의 푸린 및 피리미딘 염기들; 5 또는 6 위치에 치환기들을 갖는 피리미딘 염기들; 2,6 또는 8 위치들에서 변경 또는 대체된 치환기들을 갖는 푸린 염기들을 대신하여 사용되어진 데아자 또는 아자푸린들 및 피리미딘들을 포함한다. 이들은 또한 본 발명의 정신을 유지하는 다른 변형예들을 포함할 수 있다. 이러한 2'-데옥시올리고뉴클레오티드들은 천연의 올리고뉴클레오티드들(또는 천연의 계통들을 따라 합성되어진 올리고뉴클레오티드들)과 기능적으로 교환되어질 수 있다는 것으로 잘 기술되어질 수 있으나, 이는 천연의 구조와는 하나 또는 그 이상의 차이점들을 갖는다. 이러한 2'-데옥시올리고뉴클레오티드들 모두는 이들이 거대분자대에서 목표 RNA 사슬의 상기 RNase H 절단을 유도하는데 효과적으로 기능하는 한 본 발명에 의하여 포함되어진다.
본 발명의 하나의 바람직한 구체예에서, 상기 거대분자의 펩티드 핵산 부분에 의하여 확인되어진 바를 넘어서는 뉴클레아제 저항성이 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 결합들의 활용에 의하여 달성되어진다. 앞서 언급한 왈더와 그의 동료들의 보고와는 반대로, 본 출원인은 3'-엑소뉴클레아제들의 변종을 포함하는 송아지 태 혈청(fetal calf serum)과 같은 시스템들에서, 포스포디에스테르결합으로 부텨 포스포로티오에이트 결합으로의 인터뉴클레오시드 결합의 변형이 뉴클레아제 저항을 제공한다는 것을 발견하였다.
브릴과 그의 동료들은 최근에 어메리칸 케미칼 소사이어티의 저널 1991,113,3972(Brill, et al., J. Am. Chem. Soc.1991,113,3972)에서 포스포로디티오에이트 올리고뉴클레오티드들이 또한 뉴클레아제 저항을 나타내고 있다고 보고하였다. 이들 저자들은 포스포로디티오에이트 올리고뉴클레오티드가 상보성 데옥시올리고 뉴클레오티드들과 결합하여 RNase H 를 자극하고 그리고 래크 억제체(lac repressor) 및 크로 억제체(cro repressor)를 자극한다는 것을 보고하였다. 이들 특성들의 관점에서, 포스포로디티오에이트 결합들이 또한 본 발명의 거대분자들의 2'-데옥시올리고뉴클레오티드 부분내에서 사용되어질 수 있다. 포스포로디티오에이트들의 합성은 비이튼과 그의 동료들(Beaton, et al.)에 의하여 제 5 장, 올리고뉴클레오티드들의 합성, 109페이지, 올리고뉴클레오티드들 및 유사체들, 실제적인 접근, 엑스타인, 에프, 에디션; 더 프랙티컬 어프로우치 시리이즈, 아이알씨 포레스, 뉴욕, 1991(Chapter 5, Synthesis of oligonucleotide phosphoodithioates, page 109, Oligonucleotides and Analogs, A Practical Approach, Eckstein, F., Ed. ; The Practical Approach Series, IRL Press, New York,1991)에 더욱 기술되어져 있다.
포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트들 인터뉴클레오티드 결합들의 사용에 의하여 본 발명의 거대분자에 증가되어진 뉴클레아제 저항성을 부여하는 경우에, 이러한 결합들은 각 인터뉴클레오티드 자리들내에 존재하게 된다. 다른 구체예들에서, 전체 보다 적은 인터뉴클레오티드 결합들이 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 결합들로 변형되어질 수 있다.
본 출원인은 본 발명의 거대분자들의 결합친화력이 상기 거대분자들의 펩티드핵산 부분들의 도움에 의하여 증가되어진다. 예로서, 상보성 1Omer 호모아데닌 DNA에 결합하는 10mer 호모티미딘 PNA의 Tm이 73℃인 반면에 상기 상기 동일한 상보성 10mer 호모아데노신 DNA에 대응하는 10mer 호모티미딘 DNA에 대한 Tm은 겨우 23℃이다.
결합친화력은 또한 본 발명의 2'-데옥시올리고뉴클레오티드들을 이루는 상기 뉴클레오티드 소단위들 및 상기 펩티드 핵산 소단위들에서의 특정의 변형되어진 염기들의 사용에 의하여도 증가되어질 수 있다. 이러한 변형되어진 염기들은 5-프로피닐피리미딘들 ,6-아자피리미딘들 및 2-아미노프로필아데닌을 포함하는 N-2, N-6 및 O-6 치환되어진 푸린들을 포함할 수 있다. 다른 변형되어진 피리미딘 및 푸린 염기들은 또한 거대분자들의 핵산의 상보성 사슬에의 결합친화력을 증가시키는 것으로 기대되어진다.
이러한 구조상 단위들을 준비하는데 사용하기 위하여, 적절한 핵산염기들에는 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실, 티미딘, 크산틴, 하이포크산틴, 아데닌과 구아닌의 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 다른 알킬 유도체들, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체들, 5-할로 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도 우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 아미노, 티올, 티올알킬, 히드록실 및 다른 8 치환되어진 아데닌들 및 구아닌들, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5 치환되어진 우라실들 및 시토신들, 7-메틸구아닌 및 다른 핵산염기들과 같은, 콘사이스엔사이클로페디아 오브 폴리머 사이언스 앤드 엔지니어링, 제이. 아이. 크로슈비츠, 에디션, 존 윌리 앤드 선즈, 1990의 858 내지 859에서 나타나 있으며, 잉글리쉬, 유. 앤드 가우스, 디. 에이취., 안게반테 케미, 인터내셔널 에디션 1991,30,613에서 나타난 것들인, 미합중국 특허 제 3,687,808 호에서 기술되어진 것들이 포함될 수 있다.
목표 RNA의 RNase H 효소 절단을 유도하기 위하여, 본 발명의 거대분자는 그 안에 DNA형 단편인 단편 또는 보조-서열을 반드시 포함하여야 한다. 달리말하면, 본 발명의 상기 거대분자들의 적어도 일부가 2'-데옥시-에리쓰로-펜토푸라노실 당 부분들을 갖는 뉴클레오티드 소단위들 이어야 한다. 본 출원인은 3개이상의 연속적인, 결합된 2'-데옥시-에리쓰로-펜토푸라노실-함유 뉴클레오티드 소단위들이 유사하게 본 발명의 거대분자의 목표 RNA와의 혼성에 대한 RNase H 활성을 유도하기 위하여 필요하다는 것을 발견하였다. 본 발명의 거대분자내에 5 또는 그 이상의 연속적인 2'-데옥시-에리쓰로-펜토푸라노실의 보조서열을 포함하는 뉴클레오티드 소단위들을 갖는 것이 현재 바람직하다. 적어도 7의 연속적인 2'-데옥시-에리쓰로-펜토푸라노실-함유 뉴클레오티드 소단위들의 사용이 특히 바람직하다.
본 발명의 거대분자들의 전체 길이가 3 내지 수백의 단위들의 길이가 될 수 있으나; 목표 특이성이 보다 짧은 분자로 달성되어질 수 있기 때문에, 보다 실질적인 최대 길이는 대략 30 내지 50의 소단위들의 길이가 될 수 있다. 보다 바람직한 최대 길이는 대략 25 소단위들의 길이가 될 수 있다.
목표에 따라, 상기 거대분자의 최소 길이는 3 대지 대략 15의 전체 소단위들까지 변화되어질 수 있다, 일반적으로 대략 15의 뉴클레오티드들의 최소 길이의 항감작 올리고뉴클레오티드들을 사용하는 것이 혼성에 대한 적절한 친화력을 보증하는데 필요하다는 것이 실제로 밝혀졌다. 앞서 언급한 바와 같은 방식으로, 상기 펩티드 핵산 소단위들이 통상의 포스포디에스테르올리고뉴클레오티드들과 비교하여 목표 분자들에 대한 보다 큰 혼성친화력을 가지며, 차례로 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드들 보다 더 큰 친화력을 가지기 때문에, 본 발명의 거대분자들의 사용에서, 실시에서 일반적으로 사용되는 것 보다 적은 최소 길이가 기대되어질 수 있다. 이들 인자들을 고려하면, 상기 거대분자들의 바람직한 길이는 대략 3 대지 대략 30까지의 전체 소단위들의 길이가 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 대략 9 대지 대략 25까지의 소단위들의 길이가 될 수 있다.
본 발명의 상기 거대분자들에서, PNA 단위들 사이에 하나 또는 그 이상의 연속되는 DNA 단위들이 존재할 수 있다. RNase H 응답을 유도하기 위하여, 앞서 언급한 바와 같이, 상기 거대분자들의 상기 DNA 부분이 적어도 3개의 2'-데옥시뉴클레오티드 단위들을 가질 수 있다. DNA 단위들의 상한을 결정함에 있어서, 거대분자의 전체 길이, 활용되어지는 포스페이트 결합, 목표 서열에의 원하는 정확성 및 다른 결합 인자들을 포함하는 여러 인자들이 고려되어질 수 있다. 대개, 경제적인 관점에서 목표분자에 특이적으로 결합하고, 필요하다면 RNase H 응답을 유도하는데 필요한 것 보다 더 많은 핵산염기 단위들을 본 발명의 상기 거대분자 내에 갖지 않는 것이 바람직하다. 상기 RNase H 작용기구를 활용하기 위하여는 이 숫자는 일반적으로 약 5의 뉴클레오티드들이 될 수 있다. 부가적으로, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트 포스페이트 결합들 자체가 뉴클레아제 저항성을 나타내기 때문에, 이들 포스페이트 결합들의 사용으로, 뉴클레아제 저항성을 위한 상기 거대분자의 PNA 부분들에 반드시 의존해야 하는 포스포디에스테르 소단위들에 비하여 보다 긴 DNA 소단위들의 연장이 활용될 수 있다. 이들 인자들을 고려하면, 본 발명의 거대분자들을 포함하여 실질적으로 바람직한 작동범위는 9 내지 28의 소단위들의 길이가 되며, 2'-데옥시뉴클레오티드 소단위들에 위치하여 연속되는 대략 5 대지 대략 8까지의 이들 소단위들을 갖는 것이다.
RNase H의 동작의 작용기구는 DNA-RNA 이중나선에 계속되는 상기 이중나선의 상기 RNA 사슬의 절단으로 인지되어진다. 상기 발명의 배경 부분에서 언급한 바와 같이, 당해 기술분야의 다른 사람들은 상기 DNA 사슬에 뉴클레아제 안정성을 부여하기 위하여 변형된 DNA 사슬들을 사용하였다. 이를 수행하기 위하여, 그들은 증가되어진 뉴클레아제 안정성을 부여하기는 하나 동시적으로 혼성특성을 떨어뜨리는 변형되어진 포스페이트 결합들을 사용하였다.
본 출원인은 본 발명의 거대분자들에서 이론에 의하여 근거하는 것을 원치 않음에도 불구하고, 본 출원인은 상기 거대분자의 2'-데옥시올리고뉴클레오티드 부분의 양 단부에의 펩티드 핵산 단위들의 위치에 의하여, 이것이 상기 거대분자에 증가되어진 뉴클레아제 안정성을 부여한다는 것을 인식하였다. 더욱, 이는 또한 상보성 사슬에의 증가된 결합 및 특이성을 부여할 수도 있다.
다시, 어떤 특정의 이론에 의하여 기초하는 것을 원치 않음에도 불구하고, 본출원인은 RNase H를 인식하고 그리고 RNA 사슬의 절단을 유도하는데 부합하는 특정의 기준들을 인식하게 되었다. 이들 중 첫번째는 절단 자리에의 상기 RNA 사슬이 음전하를 갖는 포스페이트 결합을 경유하여 연결되어진 그의 뉴클레오시트들을 반드시 갖는다는 것이다. 게다가, 상기 절단 자리에의 상기 뉴클레오시트들의 당은 반드시 β-펜토푸라노실 당 이어야 하며, 또한 2' 엔도 형(endo conformation)이어야 한다. 이러한 기준들에 부합하는 유일한 뉴클레오시드들(뉴클레오티드들)은 포스포디에스터, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 2'-데옥시-에리쓰로-펜토푸라노실 β-뉴클레오시드들의 포스포로셀레네이트 및 포스포로디셀레네이트 들이다.
상기한 기준들의 관점에서, 2' 엔도 형으로 존재하는 것으로 보여지는 특정한 뉴클레오시드들(예를 들면, 시콜로펜틸 뉴클레오시드들) 조차도 이들이 펜토푸라노실 당을 포함하지 않기 때문에 RNase H 활성을 유도하지는 못할 것이다. 이들이 2' 엔도 형으로 존재하고 있지 않기 때문에, 비록 상기한 뉴클레오시드들이 봉합형(envelope conformation)으로 존재함에도 불구하고, 올리고뉴클레오티드 4'-티오뉴클레오시드들이 역시 RNase H 활성을 유도하지는 못할 것이라는 것을 모델(modeling)이 보여준다. 게다가,α-뉴클레오시트들이 β-펜토푸라노실 당들에 대하여 반대의 원자서열이기 때문에, 이들 또한 RNase H 활성을 유도하지는 못할 것이다.
비-당 속박기(non-sugar tethering group)들을 경유하거나 또는 비-포스페이트 결합들을 경유하여 포스페이트 결합들에 부착되어진 핵산염기들은 또한 2' 엔도형의 β-펜토푸라노실 당을 갖는 상기 기준들에 부합하지 않는다. 따라서, 이들은 유사하게 RNase H 활성을 유도하지는 못할 것이다.
본 발명의 거대분자의 2'-데옥시올리고뉴클레오티드 부분내로의 함입을 위하여는, 뉴클레오시들은 올리고뉴클레오티드들 및 유사체들을 디메툭시트리틸기로 봉쇄되어져야 하며, 계속해서 어 프랙티컬 어포로우치, 엑스타인, 에프., 에디션; 더 프랙티컬 어프로우치 시리이즈, 아이알엘 프레스, 뉴욕, 1991에서 보고되어진 각 트리틸화 및 포스파이틸화(phosphitylation)절차 마다 3' 위치에서 포스파이틸화 되어져야 한다. 올리고뉴클레오티드들대로의 함입은 앞에서 인용한 것들 중에서 엑스타인에서 나타난 합성의 공정성적표(protocols)들 마다에서와 같이 포스포디에스터, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 포스페이트 결합들의 형성을 위한 적절한 화학을 사용하는 에이비아이 380 비(ABI 380 B) 모델 합성기와 같은 DNA 합성기를 활용하여 수행되어질 수 있다.
본 발명의 거대분자들의 상기 2'-데옥시뉴클레오티드 소단위들 및 상기 펩티드 핵산 소단위들은 공유결합들에 의하여 서로 결합되어져서 상기 거대분자의 소단위들을 원하는 핵산염기 서열로 고정시킨다. 원하는 길이의 공유성의 상호연결은 상기 거대분자의 두개의 인접한 영역들 각각의 사이에서 형성되어진다. 바람직하게 공유성의 상호연결은 인접한 영역들을 형성하는 소단위 부분들의 양쪽 모두의 서로 다른 형태들에의 공유결합으로 형성하는 결합부분의 선택에 의하여 달성되어진다. 바람직하게 상기 결합부분은 그 결과의 원자들의 사슬이 상기 결합부분과 부분들의 서로 다른 형태들 사이에서 동일한 길이가 되도록 하여 선택되어진다. 본 발명의 하나의 바람직한 구체예에서, 아미드 결합들이 2'-데옥시뉴클레오티드 및 펩티드 핵산 소단위들을 상호연결하는 결합으로서 특히 유용하다. 다른 구체예들에서, 아민 및 에스테르결합들이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 거대분자들의 펩티드 핵산 소단위 부분들(PNA 부분들)은 일반식(I)을 갖는다:
(I)
상기에서, n은 적어도 2이고,
L1-Ln각각은 각각 수소, 히드록시, (C1-C4)알카노일, 천연적으로 발생하는 핵산염기들, 비-천연적으로 발생하는 핵산염기들, 방향족 부분들, DNA 인터컬레이터(intercalator)들, 핵산염기-결합 기들, 헤테로고리 부분들 및 리포터 리간드들이고,L1-Ln중의 적어도 하나가 천연적으로 발생하는 핵산염기, 비-천연적으로 발생하는 핵산염기, DNA 인터컬레이터 또는 핵산-결합기들이며;
Cl-Cn각각이 (CR6R7)y이며, 여기에서 R6가 수소이고, R7이 천연적으로 발생하는 알파 아미노산들의 결가지들로 이루어진 그룹으로부터 선택되어지거나, 또는 R6및 R7이 각각 수소,(C2-C6)알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴, 히드록시, (C1-C6) 알콕시,(C1-C6)알킬티오, NB3B4및 SR5로 이루어진 그룹으로부터 선택되어지며, 여기에서, R3및 R4들이 상기에서 규정한 바와 같으며, 상기 R5가 수소,(C1-C6) 알킬, 히드록시-, 알콕시- 또는 알킬티오-로 치환되어진 (C1-C6)알킬이거나, 또는 R6및 R7들이 함께 완전한 알리사이클릭 시스템 또는 헤테로사이클릭 시스템으로 취하여지고,
D1-Dn각각이 (CR6R7)z 이며, 여기에서 R6및 R7들이 상기에서 규정한 바와 같으며;
y 및 z 각각이 0 또는 1 내지 10까지의 정수이고, 그 합계인 y + z 가 2 보다 크기는 하나, 10을 초과하지 않으며;
G1-Gn-1각각이 양 방향에서 -NR3CO-,-NR3CS-,-NR3SO- 또는 -NR3SO2- 이고, 여기에서, R3가 상기에서 규정한 바와 같으며;
A1-An및 B1-Bn각 쌍이 다음과 같이 선택되어질 수 있는 것으로:
(a) A 가 일반식 (IIa),(IIb) 또는 (IIc)의 기이고, B 가 N 또는 R3N+이거나;
또는
(b) A 가 일반식 (IId)의 기이고, B 가 CH; 이며,
상기식에서, X 가 O, S, Se, NR3, CH2또는 C(CH3)2이고;
Y 가 단일결합, O, S 또는 NR4이며;
p 및 q 각각이 0 또는 1 내지 5까지의 정수이고, 그 합계인 p + q 가 10을 초과하지 않고;
r 및 s 각각이 0 또는 1 내지 5까지의 정수이고, 그 합계인 r - s 가 10을 초과하지 않으며;
R1및 R2각각이 개별적으로 수소, 히드록시-, 알콕시- 또는 알킬티오-치환되어질 수 있는 (C1-C4)알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오, 아미노 및 할로겐으로 이루어진 그룹으로부터 선택되어질 수 있고;
G1-Gn-1각각이 양 방향에서 -NR3CO-,-NR3CS-,-NR3SO- 또는 -NR3SO2-이고, 여기에서, R3가 상기에서 규정한 바와 같으며;
Q 가 -CO2H,-CONR'R'',-SO3H 또는 -SO2NR'R'' 또는 -C○2H 또는 -SO3H의 활성화된 유도체이고; 그리고
I 가 -NHR'''R'''' 또는 -NR'''C(O)R'''' 이고, 여기에서, R', R'', R''' 및 R''''들이 개별적으로 수소, 알킬, 아미노 보호기들, 리포터 리간드들, 인터컬레이터들, 킬레이트제들, 펩티드들, 단백질들, 탄수화물들, 지질들, 스테로이드들, 뉴클레오시드들, 뉴클레오티드들, 뉴클레오티드 디포스페이트들, 뉴클레오티드 트리포스페이트들, 올리고뉴클레오티드들, 올리고뉴클레오시드들 및 가용성 또는 불용성의 고분자물질로 이루어진 그룹으로부터 선택되어질 수 있는 것이다.
바람직한 펩티드 핵산들은 일반식 (IIIa)-(IIIc)를 가진다:
상기식에서, 각 L 은 개별적으로 수소, 페닐, 헤테로고리 부분들, 천연적으로 발생하는 핵산염기들 및 비-천연적으로 발생하는 핵산염기들로 이루어진 그룹으로부터 선택되어지고;
각 R7'이 개별적으로 수소 및 천연적으로 발생하는 알파 아미노산들의 곁가지들로 이루어진 그룹으로부터 선택되어지며;
n 이 1 내지 60의 정수이고;
k,1 및 m 각각이 개별적으로 0 또는 1 내지 5까지의 정수이며;
p 가 0 또는 1이고;
Rh가 OH, NH2또는 -NHLysNH2이고; 그리고
Ri가 H 또는 COCH3이다.
특히 바람직한 화합물들은 각 L 이 개별적으로 핵산염기 티민(T), 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G) 및 우라실(U)들로 이루어진 그룹으로부터 선택되어지고, k 와 m 이 0 또는 1이며, n 이 1 대지 30의, 특히 4 내지 20의 정수인, 일반식 (IIIa)-(IIIc)를 갖는 화합물들이다.
본 발명의 상기 거대분자들의 상기 펩티드 핵산 부분들은 일반적으로 공개번호 WO 92/20702 호로 1992년 11월 26일 공개되어진 특허출원 PCT/EP/01219 호의 특허 또는 1993년 7월 2일 출원되어진, 미합중국 특허출원 제 08/088,658 호에서 기술되어진 절차들 또는 그와 등가의 절차들에 따라 용액상 또는 고체상에서 합성되어진다. 이들 특허출원들의 내용들을 여기에서 참고로 인용하였다.
사용되어진 신톤(syntos)들은 표준의 보호기들에 의하여 보호되어진, 단량체 아미노산들 또는 그들의 활성화되어진 유도체들이다. 상기 PNA 들은 또한 대응하는 이가산(diacid)들 및 디아민들의 사용에 의하여 합성되어질 수 있다.
본 발명에 따른 신규한 단량체 신톤들은 일반식 (IV) 또는 (V) 또는 (VI)를 갖는 아미노산들, 이가산들 및 디아민들로 이루어진 그룹으로부터 선택되어질 수 있다:
상기식에서, L, A, B, C 및 D 들이 그 안의 어떠한 아미노기들이 아미노보호기들에 의하여 보호되어질 수 있는 것을 제외하고는 상기에서 규정한 바와 같고; E 가 COOH, CSOH, SOOH, SO2OH 또는 그들의 활성화된 유도체들이며; F 가 NHR3또는 NPgR3이고, 여기에서 R3가 상기에서 규정한 바와 같고, 그리고 pg가 아미노보호기이다.
본 발명에 따른 바람직한 단량체 신톤들은 일반식 (VIIIa)-(VIIIc) 또는 그들의 아미노보호되어진 및/또는 산 말단 활성화된 유도체들을 갖는다:
상기식에서, L 이 수소, 페닐, 헤테로고리 부분들, 천연적으로 발생하는 핵산염기들 및 비-천연적으로 발생하는 핵산염기들이고; R7이 수소 및 천연적으로 발생하는 알파 아미노산의 곁가지들로 이루어진 그룹으로부터 선택되어진다.
본 발명의 화합물들은 진단들, 치료요법들 및 연구 시약들 및 키트(kit)들로서 활용되어질 수 있다. 시험시스템에서 일단 활성이 있는 것으로 확인되어진 것에 더해, 이들은 시험시스템들에서 화학요법제들을 포함하는 다른 활성의 화합물들에 대한 표준으로서 사용되어질 수 있다. 이들은 약제학적으로 수용가능한 희석제 또는 담체들과 혼합되어진 본 발명의 거대분자의 유효량을 포함함에 의하여 약제학적 조성물들에서 활용되어질 수 있다. 더욱 이들은 단백질의 바람직하지 못한 생산에 의하여 특정지어지는 질병을 갖는 유기체들을 처치하는데 사용되어질 수 있다. 상기 유기체는 바람직하지 못한 단백질에 대하여 부호화하는 핵산의 사슬과 특이적으로 혼성할 수 있는 서열을 갖는 본 발명의 거대분자와 접촉되어질 수 있다.
이러한 치료요법적 처치는 단세포상의 원핵 및 진핵 유기체들로 부터 다세포상의 진핵 유기체들 까지에 걸친 다양한 유기체들에서 실시되어질 수 있다. 그의 유전적, 대사성 또는 세포상 조절의 근본 부분으로서 DNA-RNA 전사 또는 RNA-단백질 해독을 활용하는 어떠한 유기체도 이러한 치료요법적 및/또는 예방학적 처치에 감수적이다. 박테리아, 효모, 원충류, 조류, 모든 식물 및 온혈동물들을 포함하는 모든 고등동물 등과 같은 표면적으로 다양한 유기체들이 이러한 치료에 의하여 처치되어질 수 있다. 더욱, 다세포상의 유핵의 상기 세포들 각각이 역시 그들의 세포상 활동에서의 중요한 부분으로서 DNA-RNA 전사 및 RNA-단백질 해독 두가지 모두를 포함하기 때문에, 이러한 치료요법적 및/또는 진단들이또한 상기한 세포상 집단들에 대하여 실시되어질 수 있다. 더우기, 예를 들면, 미토콘드리아 및 엽록체 등과 같은 유핵세포들의 많은 새포소기관들 또한 전사 및해독 작용기구들을 포함한다. 마찬가지로, 단세포들, 세포상 집단들 또는 기능질들도 역시 본 발명의 치료요법적 또는 진단학적 올리고뉴클레오티드들로 처리되어질 수 있는 유기체들의 범주내에 포함되어질 수 있다. 여기에서 사용되어진 것과 같이, 치료요법은 예를 들면 박테리아성, 원충류성 또는 다른 감염들과 같은 유기체를 살상하는 질병상태의 근절 또는 미주성의 또는 해로운 세포상 성장 또는 발현의 조절 두가지 모두를 포함하는 것을 의미한다.
설명을 위한 목적으로, 본 발명의 상기 화합물들은 라스-루시페라아제(las-luciferase) 상호활성화를 사용하는 라스-루시페라아제 혼성계에서 사용되어진다. 라스(RAS) 발암유전자(oncogene) 의 항감작 저해라는 명칭으로 l991년 6월 14일 출원되어지고 본 출원에 공통적으로 양도되어졌으며, 그 전체 내용이 여기에 참고로 포함되어진, 미합중국 특허출원 제 07/715,196 호에서 기술되어진 바와 같이, 상기 라스 발암유전자들은 상기 플라스마 막의 내측면에 편재되어진, 관련된 단백질들을 부호화하는 유전자 족의 구성원들이다, 라스 단백질은 아미노산 수준에서 높게 보존되어지고, 높은 친화력과 특이성으로 GTP에 결합하고 그리고 GTPase 활성을 소유하는 것으로 보여진다. 비록 라스 유전자 생산물들의 세포상 기능들이 알려져 있지는 않지만, GTP 결합 단백질들 또는 G 단백질들로서 알려진 일종의 신호-형질도입 단백질(signa1-transducing protein)들과의 명백한 서열상동과 함께 그들의 생화학적 특성들은 라스 유전자 생산물들이 플라스마 막들을 가로질러 세포외적 신호들의 생성에 관련된 기초적 세포상 조절성 기능들에서 주요한 역할을 한다는 것을 암시한다.
H-ras, K-ras 및 N-ras로 표시되는 세 라스 유전자들은 포유동물의 라스 유전자들은 그들의 부호화 서열들 내에 단일점 돌연변이에 의하여 형질전환-유도 특성을 획득한다. 천연적으로 발생하는 라스 발암유전자들내의 돌연변이들은 코돈 12,13 및 61에 편재화되어진다. H-ras, K-ras 및 N-ras의 서열들은 공지이다.
케이폰과 그의 동료들의 Nature 302, 1983, 33-37; 홀 및 브라운의 Nucleic Acids Res.1985,13,5255-5268 등을 참조하시오. 인간 종양들에서 발견되어지는 가장 일반적으로 검출되어진 활성의 라스 돌연변이는 H-ras 유전자의 코돈 12이며, 여기에서 GGC에서 GTC로의 염기변화는 상기 라스 단백질 생성물의 GTPase 조절 영역내에서의 글리신에서 발린으로의 치환의 결과를 가져온다. 태빈, 씨. 제이.와 그의 동료들의 Nature 1982,300,143-149; 레디, 피. 이. 와 그의 동료들의 Nature 1982,300,149-152; 타파로우스키,이.와 그의 동료들의 Nature 1982. 300,762-765를 참조하시오. 이러한 단일의 아미노산 변화는 라스 단백질기능의 정상의 조절을 페지시켜, 그에 의하여 정상적으로 조절되어진 세포 단백질을 계속적으로 활성인 단백질로 전환시키는 것으로 여겨진다. 정상의 라스 단백질 기능의 이러한 탈조절은 정상으로 부터 유해한 성장으로의 전형에 책임이 있는 것이다. 모니아와 그의 동료들은 J. Bio, Chem., 1993,268,14514-14522 에서 상호활성화 리포터 유전자 시스템을 경유하여 혼성의 갭(Gap)(비-데옥시올리고뉴클레오티드들로 옆을 댄 2'-데옥시올리고뉴클레오티드를 갖는 구조)가 상기 Ha-ras 발암유전자에 대하여 시험관내에서 활성인 것으로 최근에 나타났다. 상기 기술한 분석법들에서 활성인 본 발명의 화합물들은 시험관내에서의 화학요법제시험 스크린들에서 표준으로 사용되어질 수 있다.
본 발명의 화합물들은 고체상 합성 또는 용액상 합성의 두가지 모두를 경유하여 제조되어질 수 있다. 두 방법들은 실시예들에서 나타나 있다. 실시예들로 나타난 것으로, 실시예 1은 본 발명의 거대분자들의 2'-데옥시올리고뉴클레오티드 부분의 일반적인 합성 제조법이다. 실시예 2,3 및 4들의 계통이 제 1 도에 나타나 있다. 실시예 2는 상기 거대분자의 오른쪽면 PNA 부분의 카르복시 말단을 고체 담지 수지에 적재(loading)하는 것을 기술하고 나타내고 있다. 실시예 3은 거대분자의 이러한 오른쪽면 PNA 부분의 연장과 3'-카르복시 뉴클레오시드를 경유하여 첫번째의 2'-데옥시뉴클레오티드에의 아미드결합의 형성을 기술하고 있다.
실시예 4는 상기 거대분자의 두번째의 PNA(왼쪽면) 부분에의 아미드 결합에 영향을 주기 위한 5'-아미노 뉴클레오티드의 부가를 포함하는 상기 거대분자의 중앙의 2'-데옥시올리고뉴클레오티드 부분의 연장을 나타낸다. 실시예 5 및 6의 계통들을 제 2 도에 나타내었다. 실시예 5는 상기 왼쪽면 PNA 부분의 완성을 보여준다. 실시예 6은 봉합기들의 제거와 상기 수지로 부터의 제거를 나타낸다. 실시예 7의 계통을 제 3 도에 나타내었다. 실시예 7은 5'-말단 뉴클레오티드로서 5'-아미노-3'-뉴클레오티드의 위치화를 위한 용액상 DNA 결합들의 형성을 나타낸다. 실시예 8 및 9의 계통들을 제 4 도 및 제 5 도에 나타내었다. 실시예 8은 용액상의 본 발명의 거대분자의 PNA 부분의 상기 DNA 부분에의 용액상의 짝지음(coupling)을 나타내고있다. 이 실시예에서, 실시예 7의 상기 올리고뉴클레오티드가 첫번째의 T PNA 소단위에 짝지워지는 반면에, 실시예 9에서는 첫번째의 A PNA 소단위가 상기 거대분자의 2'-데옥시올리고뉴클레오티드 부분에 짝지워진다. 실시예 10,11 및 12 의 계통들이 제6 도에 나타나 있다. 실시예 10,11 및 12 들은 본 발명의 거대분자의 DNA 부분의 PNA 부분에의 용액상 짝지음을 나타내고 있다.
하기의 실시예들에서, 상기 소단위들이 그들이 펩티드 핵산(PNA)기들 또는 2'-데옥시뉴클레오티드(DNA)기들 인지의 여부에 관계없이 상기 소단위들은 표준의 대문자 한자의 표시들 즉, A, G, C 또는 T를 사용하여 표시한다. 이러한 표시는 상기 소단위들에 포함되어진 핵산염기를 나타낸다. 따라서, A는 아데닌 염기를 포함하는 펩티드 핵산 소단위와 마찬가지로 2'-데옥시아데노신 뉴클레오티들 두가지를 표시하는데 사용된다. 상기 펩티드 핵산 소단위에 대하여는 상기 아데닌 염기가 카르복시메틸 링커를 경유하여 N-(2-아미노에틸)글리신 주쇄에 부착되어진다. 표준 뉴클레오티드 결합, 즉 포스포디에스터, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 포스포로셀레네이트는 두개의 인접한 표시문자들 사이에 하이픈(-)을 사용하여 나타내어지며, 예를 들면 A-T 는 티미딘 뉴클레오티드에 결합되어진 아데노신 뉴클레오티드를 나타낸다. 펩티드 핵산 결합을 나타내기 위하여는 (p) 또는 (pna) 두가지가 활용되어지며, 예를 들어 A(p)-T 는 티민 펩티드 핵산 단위에 결합되어진 아데닌 펩티드 핵산 단위를 나타낸다.
2'-데옥시뉴클레오티드들과 펩티드핵산 단위들 사이의 전이연(transition linkage)들은 괄호들로 나타내어진다. 따라서 T-(3'-카르복시)-A 는 아데닌 펩티드 핵산 소단위의 2'-아미노에틸 부분의 아민 부분에 결합되어지는, 그의 3' 위치에 카르복시기를 갖는 티미딘 뉴클레오시드를 나타낸다. 반면에, A-(5'-아미노)-T 는 인접한 티민 팹티드 핵산 소단위의 글리신 부분의 카르복실 부분에 결합되어진, 그의 5' 위치에 아민을 갖는 티미딘 뉴클레오티드를 나타낸다. 예를들어 카르복시, 히드록실, N-아세틸글리신 등과 같은 말단기들은 적절한 상징적인 명명법을 사용하여 나타내어진다.
카르보밴족시 봉쇄기들은 예를 들어z와 같이 위첨자 z로 나타낸다. 페녹시아세틸 보호기는 예를 들어pac와 같이 위첨자 pac 로 나타낸다. 기술되어진 표준 폴리스티렌 메리필드 수지에 대한 변형예로서, Pharmacia에 의하여 판매되어지는 고도로 가교결합되어진 폴리스티렌 또는 Rapp Polymer 에 의하여 판매되어지는 텐타겔(tentagel)이 라 불리우는 폴리에틸렌글리콜/폴리스티렌 그라프트 공중합체가 사용되어질 수 있다. 본 발명의 거대분자들을 편리하게 제거하기 위하여는, 에스테르결합을 경유하여 글리신이 상기 수지에 부착되어져야 한다.
아래의 실시예들 및 절차들은 본 발명을 설명하는 것이고 동일하게 제한하고자 하는 것은 아니다.
(실시예 1)
올리고뉴클레오티드 합성:
본 발명의 거대분자들의 올리고뉴클레오티드 부분들을 표준 포스포르아미데이트를 사용하여 요오드에 의하여 산화시켜 자동화되어진 DNA 합성기(어플라이드 바이오시스템즈 모델 380비) 상에서 합성하였다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드들에 대하여는 포스파이트 결합들의 단계적 티아화(thiation)를 위하여 표준 산화병(standard oxidation bottle)을 아세토니트릴내의 3H-1,2-벤조디티올-3- 을 1,1-디옥사이드의 0.2몰 용액으로 치환하였다. 상기 티아화 대기 단계는 68초까지 증가되어졌으며, 계속해서 캡화(capping) 단계가 수행되어졌다. 달리 표시하지 않는 한, CPG 컬럼으로 부터의 절단과 진한 수산화암모늄내에서 55℃에서 (18시간) 탈봉쇄한 후에, 상기 올리고뉴클레오티드들은 2.5배 용적의 에탄올과 함께 0.5몰 염화나트륨 용액으로의 2회의 침전에 의하여 정제하였다. 20% 아크릴아미드, 8몰우레아, 454밀리몰 트리스보레이트 완충제, pH=7.0에서 분석적 겔 전기영동이 수행되어졌다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 부터 물질 길이에 대한 것으로서 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드들이 판정되어졌다.
(실시예 2)
저 하중 티-부틸옥시카르보닐글리실 메리필드 수지
히드록시메틸 폴리스티렌 수지(1그램,650마이크로몰 히드록실/그램)를 고체상 펩티드 합성 용기내에 위치시키고 연속적으로 디클로로메탄(DCM,2회 10밀리리터), N,N-디 메틸포름아미드(DMF,2회 10밀리리터) 및 아세토니트릴(2회 40밀리리터)로 세척(매 세척마다 1분간의 진탕) 하였다. 둥근바닥 플라스크에 N-t-부틸옥시 카르보닐글리신(701밀리그램, 4밀리몰) 및 O-(벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라 메틸우로니움 테트라플루오로보레이트(1.156그램,3.6밀리몰)을 가하였다, 무수아세토니트릴(40밀리리터)을 상기 바이알(vial)에 가하고 계속해서 N,N-디이소프로필에틸아민(1.392밀리리터,8밀리몰)을 가하였다. 모든 고체들이 용해되어질때까지 상기 플라스크를 진탕하였다. 1분 후에 상기 바이알의 모든 내용물들을 펩티드 합성용기에 가하고 125분간 진탕하였다. 그 다음에 상기 반응용액을 유출시키고 그리고 그 지지체를 아세토니트릴(1회 40밀리리터), 피리딘(2회 40밀리리터)및 N,N-디메틸포름아미드(2회 40밀리리터)로 세척하였다. N,N-디메틸포름아미드(40밀리리터의 전체 용적) 내의 10 용적% 아세트산 무수물의 용액을 상기 수지에 가하고 그리고 반응물을 40분간 진탕하였다. 반응용액을 유출시킨 후에 상기 아세트산 무수물 캡을 상기한 바와 같이 반복하였다. 두번째의 캡화 반응의 끝에서 상기 수지를 N,N-디메틸포름아미드(2회 40밀리리터), 피리딘(1회 40밀리리터) 및 디클로로메탄(3회 40밀리리터)로 세척하였다. 그 다음에 상기 수지를 아르곤으로 불어주어 건조시켰다.
글리신 유도화의 정도는 정량 닌히드린 분석법에 의하여 결정되어졌다. 상기수지의 분획(50밀리그램)을 고체상의 팹티드 합성기 용기 내에 위치시키고, 디클로로메탄(2회 3밀리리터)으로 세척하였다. 그 다음에 상기 수지는 매회 2분간 진탕하면서 트리플루오로아세트산(3밀리리터)내의 5 용적%의 m-크레졸 용액으로 3회 처리하였다. 상기 세번째의 반응용액을 유출시킨 후에, 상기 수지를 디클로로메탄(3회 3밀리리터), 피리딘(3회 3밀리리터) 및 디클로로메탄(3회 3밀리리터)로 세척하였다. 그 다음에 상기 수지를 아르곤으로 불어주어 건조시켰다.
탈봉쇄되어 건조되어진 수지의 분획(5밀리그램)을 시험관내에 위치시켰다. 상기 수지에 70 용적%의 물/피리딘의 용액(80마이크로리터), 카이저 시약 1호(100마이크로리터, 2% 물/피리딘 내의 200마이크로몰의 시안화칼륨), 시약 2호(40마이크로리터, 노말-부탄올내의 5 무게/용적%의 닌히드린) 및 시약 3호(50마이크로리터,80 무게/용적%의 페놀)을 가하였다. 상기 반응물을 100℃로 10분간 가열하였고, 냉각 및 60 용적%의 에탈올(7밀리리터)로 회석시켰다. 그 다음에 570나노미터에서의 흡수율을 수지를 포함하지 않은 대조반응물 및 글리신에틸에스터의 정량에 기초하는 표준곡선과 비교하였다. 수지 1그램 당 100마이크로몰의 글리신의 유도화가 수득되어졌다.
(실시예 3)
5'-히드록시-T(3'-카르복시)-T(p)-Cz(p)-Az(p)-Gz(p)-글리신-O-수지
t-부틸옥시 카르보닐글리실 메리필드 수지(200밀리그램, 10마이크로등가량, 실시예 1)을 고체상의 펩티드 합성 용기내에 위치시켰다. 상기 지지체를 50% N,N-디메틸포름아미드/디클로로메탄(4회 5밀리리터)로 세척하고 그 다음에 매회 2분간 진탕하면서 트리플루오로아세트산(4밀리리터)내의 5% 메타-크레졸로 2회 처리하였다. 상기 지지체는 다시 50%의 N,N-디메틸포름아미드/디클로로메탄(4회 5밀리리터)로 세척하고, 그 다음에 피리딘(5회 5밀리리터)로 세척하였다. 바이알에 N2-벤질옥시카르보닐-1-(t-부틸옥시카르보닐-아미노에틸글리콜)구아닌(80마이크로몰) 및 O-(벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트(72마이크로몰)를 가하였다. N,N-디메틸포름아미드(0.4밀리리터) 및 피리딘(0.4 밀리리터)들을 상기 바이알에 가하고 계속해서, N,N-디이소프로필에틸아민(160마이크로몰)을 가하였다. 모든 고체들이 용해될 때까지 상기 바이알을 진탕하였다.
1분 후에, 상기 바이알의 모든 내용물들을 펩티드 합성 용기에 가하고 20분간 진탕하였다. 그 다음에, 상기 반응용액을 유출시키고, 그리고 상기 지지체를 피리딘으로 세척하였다(4회 5밀리리터). 잔류하는 유리 아민을 N,N-디메틸포름아미드(0.8밀리리터)내의 N-벤질옥시카르보닐-N'-메틸이미다졸 트리플레이트의 10%용액을 가하여 캡화 하였다. 5분 동안 진탕한 후에, 상기 캡화 용액을 유출시키고 그리고 상기 지지체를 피리딘으로 다시 세척하였다(4회 5밀리리터).
상기한 문단에서 기술되어진 바와 같은 탈-보호, 짝지음 및 캡화들을 3개의 부가의 PNA 단량체 : N6-벤질옥시카르보닐-1-(t-부틸옥시카르보닐-아미노에틸글리콜) 아데 닌, N4-벤질옥시카르보닐-1-(t-부틸옥시카르보닐-아미노에틸글리콜)시토신 및 1-(t-부틸옥시카르보닐아미노에틸글리콜)티민들에 대하여도 반복되었다.
그 다음에, 탈-보호, 짝지음 및 캡화들을 1회 더 반복하였으나, 이 경우에서 사용되어진 단량체는 5'-(터트부틸디페닐실릴)-3'-카르복시메틸티미딘이다. 캡화 반응 후에, 상기 수지를 피리딘(3회 3밀리리터) 및 N,N-디메틸포름아미드(3회 3밀리리터)로 세척하였다. 무수 테트라하이드로푸란(THF,3밀리리터)을 상기 플라스크에 가하고, 계속해서 70 용적%의 하이드로푸란/피리딘 45마이크로리터로 세척하였다. 밤새도록 진탕한 후에, 상기 수지를 테트라하이드로푸란(5회 3밀리리터), N,N-디메틸포름아미드(3회,3밀리리터), 아세토니트릴(5회 3밀리리터) 및 디클로로메탄(5회,3밀리리터)로 세척하였다. 그 다음에 상기 수지를 아르곤으로 불어주어 건조시켰다.
(실시예 4)
T(5'-아미노)-GPAC-CPAC-APAC-TPAC-T(3'-카르복시)-T(p)-CZ(p)-AZ(p)-GZ(P)-글리신-O-수지
5'-히드록시-T(3'-카르복시)-GZ(p)-CZ(p)-AZ(p)-T(p)-글리신-O-수지(10 마이크로등가량, 실시예3)를 DNA 합성 컬럼내에 위치시켰다. 엑소사이클릭 아민들상에 페녹시아세틸 보호기들, 포스포리스 상에 2-시아노에틸기들 및 5'-히드록실상에 4,4'-디메톡시트리틸 기들을 포함하는 포스포르아미다이트들로 표준 DNA 합성(실시예 1)을 수행하였다. 상기 5'-말단 포스포르아미다이트에 짝지어진 것은 5'-(모노메톡시트리틸아미노)티미딘-3'-(N,N-디이소포로필아미노-2-시아노에틸)포스포르아미다이트이다. 상기 모노메톡시트리틸 기는 디클로로메탄내의 디클로로아세트산으로의 표준의 자동화된 처리에 의하여 제거되어졌다. 디클로로메탄으로 세척한 후에, 상기 수지를 감압하에서 건조시켰다.
(실시예 5)
N-아세틸글리실-T(p)-T(p)-Cz(p)-T(p)-CZ(p)-GZ(p)-CZ(p)-COOH
히드록시메틸폴리 스티렌수지(115밀리그램, 75마이크로등가량)을 고체상의 펩티드 합성 용기내에 위치시켰다. 상기 지지체를 디클로로메탄(3회,3밀리리터), N,N-디메틸포름아미드(3회,3밀리리터), 피리딘(3회,3밀리리터) 및 다시 N,N-디메틸포름아미드(2회,3밀리리터)로 세척하였다. 바이알에 N4-벤질옥시카르보닐-1-(t-부틸옥시카르보닐-아미노에틸글리실)시토신(151밀리그램, 300마이크로몰) 및 O-(벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트(87밀리그램, 270마이크로몰)를 가하였다. N,N-디메틸포름아미드(1.25밀리리터) 및 피리딘(1.25밀리리터)을 상기 바이알에 가하고 계속해서 N,N-디이소프로필에틸아민(105마이크로리터, 600마이크로몰)을 가하였다. 모든 고체들이 용해될 때까지 상기 바이알을 진탕하였다. 1분 후에, 상기 바이알의 내용물들을 펩티드 합성 용기에 가하고, 30분간 진탕하였다. 그 다음에 상기 반응용액을 유출시키고 그리고 상기 지지체를 N,N-디메틸포름아미드로 세척하였다(4회 3밀리리터). 상기 C 단량체의 짝지음을 상기한 바와 같이 반복하였다. 그 다음에 N,N-디메틸포름아미드(2.25밀리리터)내의 10% N-벤질옥시카르보닐-N'-메틸-이미다졸 트리플레이트를 가하고 계속해서 5분간 진탕하므로써 상기 수지를 캡화 하였다. 마지막으로 상기 수지를 피리딘으로 세척하고(4회 3밀리리터) 그리고 그 다음에 사슬연장(chain extension) 준비를 하였다.
상기 지지체를 50%의 N,N-디메틸포름아미드/디클로로메탄으로 세척하고(4회 3밀리리터), 그 다음에 매회 2분간 진탕하면서 트리플루오로아세트산(3밀리리터)내의 5% 메타-크레졸로 2회 처리하였다. 상기 지지체를 50% N,N-디메틸포름아미드/디클로로메탄으로 다시 세척하고(4회 3밀리리터), 그 다음에 피리딘으로 세척하였다(5회 3밀리리 터). 바이알에 N2-벤질옥시카르보닐-1-(t-부틸옥시카르보닐-아미노에틸글리실)구아닌(163밀리그램, 300마이크로몰) 및 O-(벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니옴 테트라플루오로보레이트(87밀리그램,270마이크로몰)을 가하였다. N,N-디메틸포름아미드(1.25밀리리터) 및 피리딘(1.25밀리리터)를 상기 바이알에 가하고, 계속해서 N,N-디 이소포로필에틸아민(105마이크로리터, 600마이크로몰)을 가하였다. 모든 고체들이 용해될 때까지 상기 바이알을 진탕하였다. 1분 후에, 상기 바이알의 내용물들을 펩티드 합성 용기에 가하고 20분간 진탕하였다. 그 다음에 상기 반응용액을 유출시키고 상기 지지체를 피리딘으로 세척하였다(5회,3밀리리터). 잔류하는 유리 아민을 N,N-디메틸포름아미드(2.25밀리리터)내의 N-벤질옥시카르보닐-N'-메틸이미다졸 트리플레이트의 10% 용액을 가하여 캡화 하였다. 5분 동안 진탕시킨 후에, 상기 캡화 용액을 유출시키고 그리고 상기 지지체를 피리딘으로 다시 세척하였다(4회, 3밀리리터). 상기 문단에서 기술되어진 바와 같은 탈-보호, 짝지음 및 캡화들을 하기의 순서대로 PNA 단량체들 : N4-벤질옥시카르보닐-1-(t-부틸옥시카르보닐-아미노에틸글리실)시토신 및 1-(t-부틸옥시카르보닐-아미노에틸글리실)티민, N4-벤질옥시카르보닐-1-(t-부틸옥시카르보닐-아미노에틸글리실)시토신, 1-(t-부틸옥시카르보닐-아미노에틸글리실)티민,1-(t-부틸옥시카르보닐아미노에틸글리실)-티민 및 계속해서 N-아세틸글리신 들에 대하여 반복하였다. 마지막 캡화 반응 후에, 상기 수지를 피리딘(5회,3밀리 리터) 및 디클로로메탄(4회, 3밀리리터)로 세척하였다. 그 다음에 상기 수지를 아르곤으로 불어주어 건조시켰다.
상기 수지의 일부(29밀리그램,10마이크로등가량)을 고체상 펩티드 합성 용기에 위치시키고, 테트라하이드로푸란(2.5밀리리터)을 가하고, 계속해서 포화 중탄산 칼륨(0.25밀리리터)및 테트라부틸암모늄 하이드로겐 설페이트(tertrabutylammonium hydrogen sulphate)(34밀리그램,100마이크로몰)의 수용액을가하였다. 그다음에 상기 반응을 실온에서 14시간 동안 진탕시켰다. 그 다음에 물(1밀리리터)을 상기반응에 가하여 백색고체의 침전이 생기도록 하였다. 상기 액체는 여과하여 보관하였다. 그 다음에, 상기 수지 및 백색고체를 별도의 물(1밀리리터)로 세척하고 이를 첫번째의 세척액에 가하였다. 감압하에서의 건조에 이르는 농축으로 핑크색 오일과 함께 섞여진 백색고체를 수득하였다. 물(6밀리리터)을 가하고, 그 pH를 고체 KHSO4로 2로 조절하였다. 그 다음에, 상기 액체와 부유하는 황색 고체를 에펜도르프 튜브들로 옮기고, 상기 고체를 스펀 다운(spun down)시켰다. 상기 용매를 제거하고, 잔류하는 황색 고체를 0.1%의 TFA를 포함하는 물 안의 30% 아세토니트릴에 재용해시켰다. 역상크로마토그래피는 원하는 생성물(2.6밀리그램,1마이크로몰)의 결과를 나타내었다: 분자성 질량 = 2498(전자분사 질량분석기)
(실시예 6)
N-아세틸글리실-T(p)-T(p)-C(p)-T(p)-C(p)-G(p)-C(p)-T(5'-아미노)-G-C-A-T-T(3'-카르복시)-T(p)-C(p)-A(p)-G(p)-글리신-COOH
T(5'-아미노)-GPAC-CPAC-APAC-T-T-(3'-카르복시)-T(p)-CZ(p)-AZ(p)-GZ(p)-
글리신-O-수지(5마이크로등가량, 실시예 3)을 고체상 펩티드 합성 용기내에 위치시켰다. 상기 수지를 디클로로메탄(3회,3밀리리터), N,N-디메틸포름아미드(3회,3밀리리터)및 피리딘(3회,3밀리리터)으로 세척하였다. 바이알에 N-아세틸글리실-T(p)-T(p)-CZ(p)-T(p)-CZ(p)-GZ(p)-CZ(p)-COOH(10마이크로몰, 실시예 5에서 제조한 바와 같은 것) 및 O-(벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니옴 테트라플루오로보레이트(9마이크로몰)를 가하였다. 상기 바이알에 N,N-디메틸포름아미드(0.3밀리리터)와 피리딘(0.3밀리리터)을 가하고, 계속해서 N,N-디이소프로필에틸아민(20마이크로몰)을 가하였다. 모든 고체들이 용해될 때까지 상기 바이알을 진탕시켰다. 1분 후에, 상기 바이알의 내용물들을 펩티드 합성 용기에 가하고 4시간 동안 진탕시켰다. 그 다음에 상기 반응용액을 유출시키고 그리고 상기 지지체를 피리딘으로 5회 세척하였다.
상기 수지에 테트라하이드로푸란(2밀리리터)을 가하고, 계속해서 포화 중탄산칼륨(0.2밀리리터) 및 테트라부틸암모늄 하이드로겐 설페이트(27밀리그램, 80마이크로몰)의 수용액을 가하였다. 상기 반응을 실온에서 14시간 동안 진탕시켰다.
그 다음에 상기 용액을 유출시키고 보관하였다. 상기 수지를 50% 테트라하이드로푸란/물(3회,1밀리리터)와 물(3회,2밀리리터)로 세척하였다. 상기세척용액들을 상기 반응용액에 가하고 그리고 유기물들을 제거하기 위하여 감압하에서 농축시키고, 농축을 최종용적이 2밀리리터 되는 곳에서 정지시켰다. 무기물들은 겔여과에 의하여 제거하였다. 상기 조물질(crude material)을 15밀리몰 아세트산 수용액(10밀리리터)에 용해시키고, 그리고 교대적으로 진공하에서의 탈기와 질소로의 재충진을 4회시켰다. 황산바륨 상에의 팔라듐(5%, 30밀리그램)을 가하고, 상기용액을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 여과에 의하여 상기 촉매를 제거하고 그리고 그 다음에 생성물을 역상 고성능액체크로마토그래피(reverse phase HPLC)에 의하여 정제하였다.
(실시예 7)
5'-아미노-데옥시티미딜릴-(3'-5')-3'-O-터트부틸디페닐실릴-데옥시티미딘(H2N-T-T)
3'-터트부틸디페닐실릴데옥시티미딘(58밀리그램, 120마이크로몰) 및 5'-(p-메톡시 트리페닐메틸아미노)-3'-[O-(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필아미노프스포르아미 딜]데옥시티미딘(71밀리그램,100마이크로몰)들을 분리하여 10밀리리터 둥근바닥 플라스크들에 넣고, 각각 무수 피리딘(2밀리리터)과 함께 1회, 그리고 무수 아세토니트릴(1.5밀리리터)과 2회 공-증발시켰다. 그 다음에 상기 화합물들을 각각 무수 아세토니트릴(0.75밀리리터)에 용해시켜 합하였다. 상기 반응을 무수 아세토니트릴내의 0.4몰 1H-테트라졸 용액(1밀리리터, 400마이크로몰 테트라졸)의 첨가에 의하여 개시시켰다. 실온에서 50분간 교반한 후에, 산화 용액(90.54%의 테트라하이드로푸란,0.41%의 피리딘 및 9.05%의 물 내의 0.43% 요오드 10밀리리터)내에 부어넣음으로써 상기 반응을 켄칭시켰다.
상기 산화반응물을 부가의 40분 동안 교반시키고 그리고 디클로로메탄(50밀리리터)과 물(20밀리리터)이 들어있는 분액깔대기내에 부어넣었다. 잔존 요오드는 상기 유기층을 물(95밀리리터)에의 0.3%의 소듐 메타바이설파이트의 용액으로 세척하여 제거하였다. 그 다음에 감압하에서 회전증발기에 의하여 상기 유기층을 황색 오일로 농축시켰다. 상기 황색 오일을 감압하에서 톨루엔과 함께 공-증발(2회,15밀리리터)시켜 잔존 피리딘을 제거하였다.
그 다음에 상기 조물질을 디클로로메탄(6밀리리터)에 용해시키고, 디클로로메탄(3밀리리터)내의 3% 트리클로로아세트산 용액의 첨가에 의하여 트리틸 기를 제거하였다. 실온에서 15분간 교반시킨 후에, 냉각된(4℃), 포화 중탄산나트륨 수용액(10밀리리터)이 들어있는 분액깔대기내로 부어넣음으로써 상기 반응을 급냉시켰다. 별도로 디클로로메탄(20밀리리터)을 가하고, 유기층을 분리하였다. 수성층내에 잔류하는 에멀젼을 그 이상의 디클로로메탄(20밀리리터)을 가하여 파괴시켰다. 그 다음에 상기 두 유기층을 합하고, 감압하에서 건조되도륵 농축시켰다.
20 용적%의 에탄올/클로로포름, 0.2% N,N-디이소프로필에틸아민(49밀리그램, 63마이크로몰,63%)에서 구동되는 정제 실리카 박막크로마토그래피에 의하여 그 결과의 거친, 갈색 고체로 부터 원하는 생성물을 정제하였다: Rf(20 용적% 에탄올/클로로포름, 0.2% N,N-디이소프로필에틸아민) = 0.05;1H NMR (200MHz,MeOH-d4) d 7.65 (m,4H),7.4 (m,8H),6.45(m,1H),5.95(m,1H),4.6(m,4H),4.1(m,2H),3.9(m,1H),3.6(m 1H),3.2 (m,1H),2.9 (m,2H),2.5-2.0(m,4H),1.89(s,6H),1.1(s,9H);31P NMR (MeOH-d4) d 0.85; ESMS m/e 782.
(실시예8)
DMT-O-T(pna)-CONH-T-T의 N,N-디이소프로필에틸암모늄염
H2N-TpT(25밀리그램,30마이크로몰)을 1:1의 N,N-디메틸포름아미드/피리딘(0.8밀리리터)에 용해시켰다. 별도의 바이알에 1-[O-4,4'-디메톡시트리틸-히드록시에틸글리실)티민 (23.5 밀리그램 , 40마이크로몰) 및 O-(벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니옴 테트라플루오로보레이트(11.6밀리그램, 36마이크로몰)을 가하였다. 상기 바이알의 내용물들을 1:1의 N,N-디메틸포름아미드/피리딘(0.8밀리리터)와 N,N-디이소프로필에틸아민(14마이크로리터, 80마이크로몰)에 용해시켰다. 5분 후에, 상기 활성화된 에스테르용액을 상기 H2N-TpT용액에 가하였다. 상기 반응물을 실온에서 80분간 교반시키고 그리고 에틸알코올(0.5밀리리터)의 첨가에 의하여 급냉시켰다. 별도의 150분 후에, 상기 반응혼합물을 감압하에서 건조되도록 농축시켰다. 그 결과의 고체를 20 용적% 에탄올/클로로포름,0.2% N,N-디이소프로필에틸아민(27밀리그램, 20마이크로몰,67%)에서 구동하는 정제 실리카 박막크로마토그래피에 의하여 정제하였다: Rf(20 용적% 에탄올/클로로포름,0.2% N,N-디이소프로필에틸아민) = 0.18 ;1H NMR (200MHz,DMSO-d6) d 11.35(m,3H), 8.95 (br s,0.3H), 8.72 (br s,0.7H), 7.79(m,2H),7.61-7.19 (m,22H), 6.91(m,4H), 6.36 (m,1H), 6.03 (m,1H), 4.78(m,2H), 4.59(s,1H), 4.41(m,3H), 4.20 (s,1H), 3.93(m,2H), 3.65 (s,2H), 3.18 (br s,3H), 2.97(m,2H), 3.74(s,6H), 3.42 (m,4H), 2.01 (br s,4H), 1.77 (m,7H), 1.62 (s,2H), 1.03(m,15H) ;13C NMR (DMSO-d6) :167.9,164.6,163.8,158.2,150.5,144.9,143.0,136.1,135.7,132.9,130.2,129.8,128.1,127.8,126.8,123.4,118.6,113.4,110.7,110.1,107.9,86.3,84.0,83.0,74.8,74.5,61.3,56.2, 55.1,47.5,26.8,18.7,12.1;31P NMR (DMSO-d6) d -0.2,-1.05;ESMS m/e 1351.
(실시예9)
tBoc-AZ(pna)-CONH-T-T의 N,N-디이소프로필에틸암모늄염
H2N-TpT(19밀리그램,24마이크로몰)을 1:1 N,N-디메틸포름아미드/피리딘(0.65밀리리터)에 용해시켰다. 별도의 바이알에 N6-벤질옥시카르보닐-1-(t-부틸옥시카르보닐-아미노에틸글리실)-아데닌(12.7밀리그램, 24마이크로몰) 및 O-(벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트(7.1밀리그램,22마이크로몰)들을 가하였다. 상기 바이알들의 내용물들을 1:1 N,N-디메틸포름아미드/피리딘(0.65밀리리터) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(8.4마이크로리터,48마이크로몰)에 용해시켰다. 2분 후에, 상기 활성화되어진 에스테르용액을 상기 H2N-TpT 용액에 가하였다. 상기 반응물을 실온에서 15분간 교반시키고, 그리고 에틸알코올(0.5밀리리터)의 첨가에 의하여 급냉시켰다. 별도의 120분 후에, 상기반응혼합물을 감압하에서 건조되도륵 농축시켰다. 그 결과의 고체를 20 용적%의 에탄올/클로로포름, 0.2% N,N-디이소프로필에틸아민(6밀리그램,5마이크로몰,21%)에서 구동되는 정제 실리카 박막크로마토그래피에 의하여 정제하였다: Rf(20 용적% 에탄올/클로로포름, 0.2% N,N-디이소프로필에틸아민) = 0.07;1H NMR (200MHz, DMSO-d6) d 11.37(s,1H),11.22(s,1H),10.64(br s, 1H),9.17(br s,0.3H),8.90(br
s,0.7H),8.59(m,2H),8.30(m,1H),7.80(m,1H),7.58 (s,3H),7.38(m,12H),7.16 (m,1H),6.36 (m,1H),6.04 (m,1H),5.43 (m,1H),5.32(s,1H),5.23(s.2H),5.1 (s,1H),4.42(m,3H),4.19 (m,1H),3.98(s,1H),3.87(m,3H),3.77(m,1H),3.66(m,1H),3.02(m,2H),2.68(m,1H),2.03(m,4H),1.74(m, 6H),1.02(m,30H);31P NMR (DMSO-d6) d -0.01,-0.8.
(실시예 10)
1-(t-부틸옥시카르보닐-아미노에틸글리실)티민, 에틸 에스터
1-(t-부틸옥시카르보닐-아미노에틸글리실)티민 (300밀리그램,780마이크로몰)을 50% N,N-디메틸포름아미드/피리딘(3.0밀리리터)에 용해시키고, 그리고 N,N-디이소프로필에틸아민(0.25밀리리터,1.44밀리몰)을 가하였다. 5분의 교반 후에,O-(벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니옴 테트라플루오로보레이트(350밀리그램, 1.1밀리몰)를 가하여 밝은 오렌지색 용액을 얻었다. 상기 반응물을 30분간 교반하고 그 후에 무수 에탄올(0.75밀리리터,4.26밀리몰)을 가하였다. 별도의 90분 후에, 상기 반응혼합물을 감압하에서 오일로 농축시켰다. 상기 오일을 에틸아세테이트(30밀리리터)에 용해시키고 5℃로 냉각시켰다. 순수한 생성물을 백색 고체로 침전시키고 이를 여과에 의하여 수집하였다(289밀리그램,701마이크로몰,90%);1H NMR(200MHz, CDCl3) d 8.33 (br s,1H),7.02(s,0.3H),6.97 (s,0.7H),5.58(m,1H),4.59(s,1.4H),4.43 (s,0.6H),4.1(s,2H),3.54 (m,2H), 3.33(m,2H),1.92 (s,3H),1.47 (s,9H).
(실시예 11)
TBDPS-T-CONH-T(pna)-OEt
1-(t-부틸옥시카르보닐-아미노에틸글리실)티민의 에틸 에스터(30밀리그램,72마이크로몰)를 1.0밀리리터의 트리플루오로아세트산에 용해시키고 실온에서 30분간 교반시켰다. 이를 진공중에서 농축시키고 그 다음에 5밀리리터의 톨루엔과 함께 2회 공-증발시켰다. 5'-O-터트부틸-디페닐실릴-3'-카르복시메틸데옥시리보티미딘(25밀리그램,48마이크로몰)을 0.400밀리리터의 1:1 N,N-디메틸포름아미드/피리딘 용액에 용해시켰다. 이 용액에 TBTU(21밀리그램, 65마이크로몰)와 N,N-디이소프로필에틸아민(25마이크로리터,144마이크로몰)을 가하였다. 상기 반응물은 엷은 오렌지색으로 되어졌으며 30분간 교반하였다. 상기 TFA 탈보호 단계로 부터의 아민을 0.6밀리리터의 N,N-디메틸포름아미드/피리딘에 용해시키고, 활성화되어진 카르복시티미딘 용액에 가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 박막크로마토그래피 분석(20% 메탄올/디클로로메탄)은 활성화되어진 산 모두가 소모되었음을 나타내었다. 상기 용액을 진공중에서 오일로 농축시켰다. 상기 오일을 용출액으로서 20% 메탄올/디클로로메탄으로 2밀리미터 정제 박막크로마토그래피판(20밀리미터 X 20밀리미터) 상에서 정제하였다. 가장 약한 극성의 분획이 백색고체로서 원하는 생성물을 제공하는 PNA-DNA 복합체를 포함하고 있다(25밀리그램, 36마이크로몰,50%) ;1H NMR (200 MHz, CDC13) d 9.8 (br s,1H),9.6 (br s,
1H),7.7(m,4H),7.3(m,9H),7.0 d,1H),6.2(m,1H),4.5-3.4 (12H),2.9(m,1H),2.5-2.1 (m,4H),1.5 (s,3H),1.3 (d,6H),1.1 (s,9H);13C NMR (CDC13) : d 11.764,12.083,12.391,14.144,26.796,27.055,29.708,35.232,37.177,37.788,38.932,48.298,61.486,64.854,84.476,85.018,111.110,127.711,129.980,135.407,135.654,140.976,150.835,151.555,167.416,172.192; ESMS m/e 817.
(실시예12)
T-CONH-T(pna)-OEt
상기 이량체(30밀리그램, 0.058밀리몰)을 1밀리리터의 건조 테트라하이드로푸란에 용해시키고,0℃로 냉각시켜서 탈실릴화 하였다. 여기에 20밀리리터의 70%하이드로푸란/피리딘을 가하고, 테트라부틸암모늄플루오라이드의 1몰 용액 10밀리리터를 가하고 그리고 상기 반응혼합물을 밤새동안 교반시켰다. 박막크로마토그래피(10% 메탄올/디클로로메탄)은 상기 반응이 종료된 것을 나타내고 있다. 상기 용액을 1밀리리터의 포화 NaHCO3으로 켄칭시키고 그리고 가스 분출이 종료될 때까지 교반하였다. 상기 수성층을 별도의 5밀리터의 물로 희석시키고, 3밀리리터의 에틸아세테이트로 2회 수득하였다. 상기 유기층을 합하고 그리고 폐기하였다. 상기 수성층을 건조되도록 증발시켜 탈보호되어진 이량체 및 NaHCO3의 혼합물을 수득하였다. 상기 혼합물을 메탄올에 현탁시키고 그리고 2개의 20 밀리미터 X 20 밀리미터, 0.5밀리미터의 정제 박막크로마토그래피 상에서 클로로포름내의 30% 에탄올로 용출시켜 정제하였다. 상기 판들의 용출이 종료된 후에, 이들을 건조시키고 형광띠를 긁어모아 추출하였다. 상기 추출물을 여과하고 증발시켜, 소량의 테트라부틸암모늄 플루오라이드로 오염되어진 탈보호화된 이량체 12밀리그램을 수득하였다(56% 수득율).1H (CD3OD): 1.0-1.5 (mm,10H),1.5(m,2H),1.9 (s,6H),2.1-2.8 (mm,6H),3.2-4.0(mm,15H),4.1-4.4(m,4H),4.7(s,1H),6.1(m,1H),7.3(s,1H),8.0(s,1H).
(실시예13)
(5'-DMT)-AZ-T-(3'-카르복시)-T(pna) (시아노에톡시 보호화되어진 포스포디에스테르결합을 포함)
실시예 12의 탈보호화된 이량체(12밀리그램,0.0207밀리몰)을 무수 피리딘으로 2회, 그리고 무수 아세토니트릴로 2회 공-증발시켰다. 그 결과의 백색 고체를 3밀리리터의 1:1 아세토니트릴: N,N-디메틸포름아미드로 용해시켰다. 이 용액에 아데노신 포스포르아미데이트의 0.1몰 용액 1밀리리터와 0.4몰 1H-테트라졸 용액 1밀리리터를 가하였다. 이를 주변온도에서 1시간 동안 교반시키고, 그다음에 별도의 1밀리리터의 아미다이트를 가하고 계속적으로 별도의 1시간 동안 교반하였다. 상기 시간의 끝에서,10밀리리터의 산화용액(90.54%의 테트라하이드로푸란, 0.41%의 피리딘 및 9.05%의 물 내의 0.43%의 요오드)을 가하고, 그리고 상기 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응을 소듐바이설파이트 용액의 1몰 용액 25밀리리터로 급냉시켰다. 이 용액을 클로로포름으로 2회 20밀리리터로 추출하고 그리고 상기 결합되어진 추출물들을 별도의 바이설파이트 용액 25밀리리터로 세척하여 약간 황색의 유기상을 얻었다. 상기 클로로포름 용액을 마그네슘 설페이트 상에서 건조시키고 그리고 농축시켜 황색 오일로 하였다. 상기 혼합물을 20센티미터 X 20센티미터 정제 박막크로마토그래피판(2개,0.5밀리미터 코팅)들을 사용하여 디클로로메탄내의 20% 아세톤으로 용출시켜 정제하였다. 상기 삼량체의 부분입체이성질의 혼합물을 오일로서 분리하였으며, 이는 25밀리그램의 무게로 93%의 수율에 달한다;1H (CDCl3):1.2 (m,13H),2.5-3.2 (mm,5H),3.4(m,4H),3.7(s,6H),4.1 (m,1H),4.4 (m,1H),5.2 (m,1H),6.5 (m,1H),6.8 (m,4H),7.3(m,10H),7.5(m,3H),8.0 (d,2H),8.2 (d,2H),8.7 (s,1H), 9.1(s,1H);31P(CDCl3): 8.247, 8.116.
(실시예 14)
NH4OH에 탈보호 조건들에 대한 PNA 올리고머들의 안정성
첫번째의 경우에서, 유리 아민 말단(H-TAT-TCC-GTC-ATC-GCT-CCT-CA-Lys-NH2)(모든 PNA)를 함유하는 PNA 올리고머를 70%의 진한 NH4OH에 용해시켰다. 상기 반응을 23℃에서 배양시키고 분획들을 아래에서 나타낸 시간들에서 액상고성능액체크로마토그래피로 검사하였다. 두번째의 실험에서 PNA 올리고머를 글리실-캡화되어진 아미노 말단(H-Gly-TGT-ACG-TCA-CAA-CTA-Lys-NH2)(모든 PNA)를 90%의 진한 NH4OH에 용해시키고 밀봉되어진 플라스크내에서 55℃에서 가열하였다.
유리 아미노 말단을 포함하는 상기 PNA 올리고머의 NH4OH 안정성이 불충분하여 상기 PNA/DNA 복합체들로 부터의 염기보호기들의 제거를 허용하였다. 상기 아미노 말단의 글리실기로의 캡화는 수용성 염기에 대한 PNA의 안정성을 크게 증대시켰다. 글리실-캡화되어진 PNA는 11시간 후에 단지 최소의 분해와 23시간 우에 15%의 분해만이 증명되었다. 상기 글리실 캡화되어진 PNA는 페녹시아세틸 보호기를 제거하는데 사용되어진 조건들에 대하여 완전히 안정하며, 표준DNA 염기 보호기들(벤조일 및 이소부티릴 아미드들)에 대하여 사용되어진 조건들에 상대적으로 안정하다. 그 결과들을 표 1에 나타내었다.
[표 1]
(실시예 15)
아민 및 에스테르결합들을 경유하여 중앙의 2'-데옥시 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 영역이 결합되어 옆을 댄 펩티드 핵산들을 갖는 거대분자
펩티드 핵산들의 첫번째의 영역을 상기 실시예2에서와 같이 제조하였다. 상기 펩티드 핵산들은 보호되어진 아민기들을 갖는 단량체들을 사용하여 C 말단으로부터 N 말단으로 향하도록 하여 제조하였다. 상기 첫번째의 펩티드 영역의 완료 후에, 상기 말단의 아민보호기를 제거하고 그리고 그 결과의 아민을 3'-C-(포르밀)-2',3'-디데옥시-5'-트리틸 뉴클레오티드와 반응시켜 바세우어와 그의 동료들(Vasseur, et, al.)의 J.Am. Chem. Soc 1992,114,4006의 절차에서와 같이 제조하였다. 상기 아민과 상기 C-포르밀 뉴클레오시드의 알데히드 부분과의 축합(바세우어의 상기와 같은 문헌의 조건들과 같은) 중간 아민 결합을 수득하는데 유효하였다. 상기 아민 결합은 바세우어의 상기와 같은 문헌의 환원성 알킬화 조건들 하에서 HCNO/NaBH3CN/AcOH 로 환원되어져 메틸 알킬화되어진 아민 결합을 경유하여 상기 펩티드 핵산에 연결되어져 상기 뉴클레오시트를 수득하였다.
그 다음에 내부 2'-데옥시 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 영역이 실시예 1의 공정성적표에서와 같이 이 뉴클레오시드로부터 연속되어졌다. 두번째의 펩티드영역의 펩티드 합성이 이 두번째 영역의 첫번째 펩티드 핵산의 카르복실 말단과 상기 뉴클레오티드에 대한 디메톡시트리틸 보호기의 제거에 이은 상기 DNA 영역의 마지막 뉴클레오티드의 5' 히드록시와의 반응에 의하여 시작되어졌다. 피리딘내의 EDC를 경유하여 짝지음이 이루어져 상기 펩티드와 상기 뉴클레오시드들의 사이에서 에스테르결합이 이루어지도록 하였다. 그 다음에 펩티드 합성을 계속 진행시켜 두번째의 펩티드 핵산 영역을 완성하도록 하였다.
(실시예 16)
중앙의 2'-데옥시 포스포로셀레네이트 올리고뉴클레오티드 영역으로 옆을 댄 펩티드 핵산 영역들을 갖는 거대분자
상기 거대분자의 2'-데옥시뉴클레오티드 부분내에 포스포로셀레네이트 결합들을 도입하기 위하여, 스타윈스키와 그의 동료들의 Tenth International Roundtable: Nucleosides, Nucletides and Their Biological Evaluation, September 16-20, 1992, Abstacts of Papers, Abstract 80.에 의하여 보고되어진 절차에서와 같이 3H-1,2-벤조티아셀레노-3-올로 산화가 이루어지도록 하는 것을 제외하고는 실시예 15의 합성을 반복하였다.
(실시예 17)
중앙의 2'-데옥시 포스포로디티오에이트 올리고뉴클레오티드 영역에 옆을 댄 펩티드 핵산 영역들을 갖는 거대분자
상기 거대분자의 2'-데옥시뉴클레오티드 부분 내에 포스포로디티오에이트 결합들을 도입하기 위하여, 비이톤과 그의 동료들의 Chapter 5, Synthesis of oligonucleotide phosphorodithioates, page 109, Oligonucleotides and Analogs, A Practical Approach, Ekstein, F.,Ed.: The Practical Approach Series, IRL Press, New York,1991의 절차들을 활용하여 산화가 이루어지도륵 하는 것을 제외하고는 실시예 15의 합성을 반복하였다.
(절차1)
ras-루시페라이제 리포터 유전자 조립체
PCR 기법을 사용하여 ras-루시페라아제 리포터 유전자들을 조립하였다. 돌연변이(코돈 12) 및 비-돌연,변이(야생형) 인간 H-ras 유전자들 두가지 모두의 액손1의 5'-영역들의 PCR 클로닝을 위한 프라이머(primer)로 사용하기 위하여 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 합성하였다. c-H-ras1 활성화되어진 발암유전자(코돈 12, GGC→GTC)를 포함하는 DT24-C3와 c-H-ras 발암유전자전구체(proto-oncogen)를 포함하는 pbc-N1 플라스미드들을 Americal Type Culture Collection(베데스다, 엠디)로부터 얻었다.
1.9b 반딧불이의 루시페라아제 유전자를 포함하는 플라스미드 pT3/T7 1uc 를 클론테크 라보레이토리즈(팔로 알토, 씨에이)로부터 얻었다. 주형으로서 돌연변이 및 비-돌연변이 H-ras 유전자들을 사용하는 표준 PCR 반응들에서 상기 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머들을 사용하였다. 이들 프라이머들은 NheI 및 HindIII 제한 엔도뉴클레아제 자리들에 의하여 옆을 댄, 정상 및 돌연변이 H-ras의 서열들 -53 대지 +65(해독개시자리에 대하여)에 대응하는 145 염기쌍들의 DNA 생성물을 생산하였다. 상기 PCR 생성물을 표준절차들을 사용하여 겔 정제하고, 침전시키고, 세척하고 그리고 물에 재현탁시켰다.
P.pyralis(반딧불이) 루시페라아제 유전자의 클로닝을 위한 PCR 프라이머들을 PCR 생성물이 아미노-말단 메티오닌 잔기를 제외하고 루시페라아제 단백질 전체길이를 부호화하도록 하여 실계하였으며, 이는 로이신 잔기에 이어서 2개의 아미노산들, 하나의 아미노-말단 라이신 잔기로 대체되어질 수 있다. 상기 루시페라이제 유전자의 클로닝에 사용되어진 상기 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머들이 주형으로서 상기 루시페라아제 리포터 유전자를 포함하는, 상용적으로 구입할 수 있는 플라스미드(pT3/T7-Luc)(클론데크)를 사용하는 표준 PCR 반응들에 사용하였다. 이들 프라이머들은 독특한 HindIII 및 BssHII 제한 엔도뉴클레아제 자리들에 의하여 옆을 댄, 상기 루시페라아제 유전자에 대응하는 대략 1.9kb의 생성물을 산출한다. 이 단편을 표준 절차들을 사용하여 겔 정제하고, 침전시키고, 세척하고 그리고 물에 재현탁시켰다.
상기 ras-루시페라아제 융합 리포터 유전자의 조합을 완료하기 위하여, 상기ras 및 루시페라아제 PCR 생성물들을 적절한 제한 엔도뉴클레아제들로 분해시키고, 그리고 제한 엔도뉴클레아제 NHeI, HindIII 및 BssHII를 사용하여 3-부분의 결찰에 의하여 스테로이드-유발가능한 마우스 유선 종양 바이러스 MMTV 프로모터를 포함하는 발현 벡터로 클론시켰다. 그 결과의 클론은 상기 반딧불이의 루시페라아제 유전자의 주쇄내에 H-ras 5' 서열들(-53 에서 +65)이 융합되어져 삽입되는 결과가 된다. 그 결과의 발현 벡티는 상기 스테로이드-유발가능한 MMTV 프로모터의 조절하에서 발현되어지는 ras-루시페라아제 융합 생성물을 부호화한다. 이들 플라스미드 조립체들은 반딧불이의 루시페라아제를 부호화하는 서열들내에 융합되어진, 활성화된(RA2) 또는 정상의(RA4) H-ras 단백질들의 아미노산들 1-22를 부호화하는 서열들을 포함한다. ras-루시페라아제 융합 mRNA의 해독개시는 정상의 H-ras AUG 코돈에 의존한다. 돌연변이 및 정상의 H-ras 루시페라아제 융합 조립체들 두가지 모두는 표준 절차들을 사용하는 DNA 서열 분석에 의하여 확인되었다.
(절차2)
세포들의 플라스미드 DNA로의 트랜스펙션
트랜스펙션(trsnsfection)은 Current Protocols in Molecular Biology, (F.M.Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K.Strahl, eds., John Willey and Sons, NY,)에서 그린버그(Greenburg, M.E.)에 의하여 기술되어진 바의 하기의 변형들에 따라 수행하였다. HeLa 세포들을 60밀리미터 플레이트들 상에 5 X 105세포/플레이트의 수준으로 깔아놓았다. 그 중의 1마이크로그램이 본질적인 라우스가계육종 바이러스(RSV;Rous sarcoma virus)의 조절하에서 쥐의 당성피질성 스테로이드 수용기를 발현라는 벡터이고, 나머지가 ras-루시페라아제 리포터 플라스미드인, 전체 10마이크로그램 또는 12마이크로그램의 DNA를 각 플레이트에 가하였다. 16-20시간 후에 3밀리몰 EGTA를 함유하는 트리스-완충 식염수[50밀리몰 트리스-Cl(pH 7.5), 150밀리몰 NaCl]로 세척하여 칼슘 포스페이트-DNA 공침전물들을 제거하였다. 그 다음에 송아지 태 혈청(fetal bovine serum)으로 보충되어진 신선한 매질을 상기 세포들에 가하였다.
이 시점에서, 덱사메타손에 의한 리포터 유전자 발현의 활성화에 앞서 세포들을 본 발명의 거대분자들로 사전-처치하였다.
(절차3)
세포들의 처치
플라스미드 트랜스펙션에 이어, 세포들을 37℃로 예열한, 포스페이트로 완충한 식염수로 세척하고 그리고 각 플레이트에 5마이크로그램/밀리리터의 N-[1-(2,3-디올레 일옥시)포로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)를 포함하는 옵티-멤(Opti-MEM)을 가하였다(플레이트 당 1.0밀리리터). 시험화합물들을 각 플레이트에 50마이크로몰 주(stock)로부터 가하고, 37℃에서 4시간 동안 배양시켰다.
매질을 제거하고 10% 송아지 태 혈청과 적절한 시험화합물을 표시되어진 농도로 포하하는 DMEM으로 대체하고, 그리고 세포들을 덱사메타손으로 처치하여 리포터유전자발현이 활성화되어져 최종의 0.2마이크로몰의 농도가 되기 전에 세포들을 37℃에서 별도의 2시간 동안 배양시켰다. 덱사메타손 자극 후에 15시간에서 세포들을 수확하고, 루시페라아제 활성에 대하여 분석하였다.
(절차4)
루시페라아제 분석
루시페라아제를 Current Protocols in Molecular Biology, (F.M.Ausubel, R. Brent, R,E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K.Strahl, eds.), John Willey and Sons, NY에서 그린버그(Greenburg,M.E.)에 의하여 기술되어진 바와 같이 세척액 트리톤 엑스-100으로의 붕괴에 의하여 세포들로부터 루시페라아제를 추출하였다. 다이나테크 엠엘1000 루미노미터를 사용하여 625마이크로몰까지의 루시페린(시그마)의 첨가에 대한 최대의 발광을 측정하였다. 매 추출에 대하여, 상기 분석이 선형의 범위이내가 되도록 자료들이 모아지는 것을 확신하도록 추출의 양을 달리하는 것을 사용하여 루시페라아제 분석을 여리번 중복해서 수행하였다.
(절차5)
용융 곡선
흡수율 대 온도 곡선들을 아이비엠 개인 컴퓨터 및 길포드 레스폰스 II 스펙트로포토미터에 연결되어진 길포트 260 스펙트로포토미터를 사용하여 측정하였다.
상기 완충제는 100밀리몰 Na+, 10밀리몰 포스페이트 및 0.1밀리몰 EDTA, pH 7을 포함한다. 85℃에서의 흡수율 및 푸글리시와 티노코의 Methods in Enzymol. 1989,180,304-325에 따라 계산되어진 소멸계수로부티 결정되어진 각 사슬에 대한 시험 화합물 농도는 4마이크로몰이다. Tm값들, 듀플렉스 형성의 자유에너지들 및 결합 상수들은 선형 경사의 기초선들에 대한 데이타의 단(fit)들로 부터 2상태의 모델들에 까지에서 얻어졌다. 피터샤임과 터너의 Biochemistry 1983,22,256-263을 참조하시오. 보고되어진 인자들은 적어도 3회의 실험들의 평균들이다.
일부 시험 화합물들에 대하여는, 듀플렉스 형성의 자유에너지들은 또한 Tm -1대 log10(농도)의 좌표로부터 얻어졌다. 보레르, 덴글리, 티노코 및 울렌베크의 J.Mol. Bio1.1974,86,843-853을 참조하시오.
(절차6)
겔 이동 분석
리마와 그의 동료들의 Biochemistry 1991,31,12055-12061에 기술되어진 바와 같이 상기 구조의 ras 목표 전사, 돌연변이된 코돈 12를 포함하는 47-뉴클레오티드 헤어핀을 준비하고, 도표화 하였다. 20마이크로리터내에 100밀리몰 나트륨, 10밀리몰 포스페이트, 0.1밀리몰 EDTA, 100 CPM의 T7-발생되어진 RNA(대략적으로 10피코몰) 및 1피코몰 내지 10마이크로몰의 농도의 범위의 시험화합물을 포함하여 혼성반응들을 준비하였다. 반응물들을 37℃에서 24시간 동안 배양시켰다.
혼성 후에, 적재 완충제를 상기 반응물들에 가하고, 반응 생성물들을 45밀리몰 트리스-보레이트 및 1밀리몰 MgC12(TBM)을 사용하여 제조한 20%의 원래의 폴리아크릴아미트 겔들 상에 재용해시켰다. 10℃에서 전기이동이 수행되어졌으며, 겔들은 분자 동적 포스포이메이저(Molecular Dynamics Phosphorimager)를 사용하여 정량하였다.
(절차7)
RNase H 분석
활성화되어진 H-ras mRNA의 염기들 +23 내지 -47(코돈 12, G→U)들에 대응하는 화학적으로 합성되어진 25-염기 올리고리보뉴클레오티드를 사용하여 RNaseH 분석을 수행하였다. 상기 5' 말단-표지되어진 RNA는 20나노몰의 농도에서 사용되어졌으며,10마이크로리터의 최종 용적으로 20밀리몰의 트리스-Cl, pH 7.5,100밀리몰의 염화칼륨, 10밀리몰의 염화마그네슘, 1밀리몰의 디티오테레이톨, 10마이크로그램의 tRNA 및 4 단위 RNasin을 포함하는 반응내에서 10배의 몰의 과량의 시험화합물과 함께 배양하였다. 상기 반응 성분들은 37℃에서 15분간 사전담금질되어졌으며, 그 마음에 실온으로 서서허 냉각되도륵 하였다. 유선의 RNaseH의 공급원으로서 HeLa 세포 핵 추출물들을 사용하였다. 반응들은 2마이크로그램의 핵 추출물(5마이크로리터)의 첨가에 의하여 개시되어졌으며, 반응들은 37℃에서 10분간 진행되도록 허용하였다. 페놀/클로로포름 추출에 의하여 반응들이 정지되었으며, RNA 성분들을 에탄올로 침전시켰다. 등가의 CPMs를 7몰의 우레아를 포함하는 20%의 폴리아크릴아미드겔 상에 적재시키고 RNA 절단 생성물들을 재용해시키고 자동방사선사진술(autoradiography)에 이은 전기이동에 의하여 가시화시켰다. 절단 생성물들의 정량을 분자 동력 밀도계(Molecular Dynamics Densitometer)를 사용하여 수행하였다.
(절차8)
ras 상호작용 리포터 유전자 시스템
본질적인 에스브이40(SV40) 프로모터의 조절 하에서 삽입되어진, 활성화되어진(코돈 12, GGC→GTC) H-ras cDNA를 포함하는 발현 플라스미드 pSV2-oli를 닥터 브루노 톡크(롱-프랑 상떼, 비트리, 프랑스)로 부터 기증받았다. 이 플라스미드를 스테로이드-유발가능한 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV)의 조절 하에서 PCR에 의하여 H-ras 발현 플라스미드를 조립하는데 주형으로서 사용하였다. H-ras 부호화 서열들을 수득하기 위하여, 상기 H-ras 유전자의 570bp 부호화 영역을 PCR에 의하여 증폭시켰다. 상기 PCR 프라이머들은 클로닝을 유용하게 하기 위하여 그들의 5-영역들에 독특한 제한 엔도뉴클레아제 자리들로 설계하였다.
클로닝에 앞서, 상기 H-ras 코돈 12 돌연변이 발암유전자의 부호화 영역을 포함하는 상기 PCR 생성물을 겔 정제하고, 분해시키고, 다시 한번 겔 정제 하였다.
이러한 조립은 상기 삽입물의 상기 발현 플라스미드 pMAMneo(클론테크 라보레이토리즈, 씨에이)내로의 클로닝에 의하여 완료되어졌다.
상기 ras-응답성 리포터 유전자 pRDO53은 ras 발현을 검출하기 위하여 사용되어졌다. 오웬과 그의 동료들의 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.1990,87,3866-3870을 참조하시오.
(절차9)
생체 내에서의 ras 발현의 노던 블로트 분석(nothern blot analysis)
인간의 방광암 세포 선 T24를 American Type Culture Collection(록빌, 엠디)로 부터 수득하였다. 세포들은 10%의 가열-비활성화되어진 송아지 태 혈청과 각각 50단위/밀리리터의 페니실린 및 스트렙토마이신을 보충한, 에-글루타민(기브코 비알엘, 게이터스버그 엠디)이 포함된 맥코이의 5A 매질 내에서 성장시켰다. 세포들을 100밀리미터 플레이트들 상에 접종시켰다. 이들이 70% 합류되어졌을 때, 이들을 시험화합물로 처치하였다. 플레이트들을 10밀리리터의 예비가열되어진 PBS 및 2.5마이크로리터의 DOTMA를 포함하는 5밀리리터의 Opti-MEM 환원되어진-혈청 매질로 세척하였다. 그 다음에 시험화합물을 원하는 농도로 가하였다. 처치의 4시간 후에, 상기 매질을 맥코이의 매질로 대체시켰다. 시험화합물 처치 후 48시간에서 세포들을 수확하고, 표준 CsCl 정제 방법을 사용하여 RNA를 단리시켰다. 킹스턴의 Current Protocols in Molecular Biology, (F.M.Ausubel, R. Brent, R,E. Kingston, D,D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K.Strahl, eds.), John Willey and Sons, NY,참조하시오.
인간의 유상피 암 세포 선 HeLa 229를 American Type Culture Collection(베데스다, 엠디)로 부터 수득하였다. HeLa 세포들은 6-웰(well)플레이트들 상에서 10% 송아지 태 혈청 및 100단위/밀리리터의 페니실린으로 보충되어진 둘베코의 변형된 이글 매질(DMEM;Dulbecco's Modified Eagle's medium)내에서 단일층들로 유지시켰다. 시험화합물로의 처치와 RNA의 분리는 근본적으로 상기에서 T24 세포들에 하여 기술되어진 바와 같다.
노던 혼성(northern hybridization): 각 RNA 10마이크로그램을 1.2% 아가로스/포름알데히드 겔 상에서 전기이동시키고, 표준 방법들을 사용하여 밤새 동안 진바인드 45 나일론 막(파마시아 엘케이비, 피스카타웨이, 엔제이)으로 옮겼다. 킹스톤의 Current Protocols in Molecular Biology, (F.M.Ausubel, R. Brent, R,E. Kingston, D,D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K.Strahl, eds.), John Willey and Sons, NY를 참조하시오. RNA는 상기 막에 자외선-가교결합되어진다. 프라임 어 진 라벨링 키트(프로메가, 메디슨 더블류아이)를 사용하여 이중-사슬로 된32P-표지되어진 소식자(probe)들을 합성하였다. 상기 ras 소식자는 코돈12에서 GGC→GTC 돌연변이를 갖는 활성화되어진 (돌연변이)H-ras mRNA의 cDNA 클론의 SalI-NheI 단편이다. 상기 조절 소식자는 G3PDH이다. 블로트(blot)들은 68℃에서 15분 동안 퀵(Qui)Hyb 혼성 용액(스트라타진, 라 졸라, 씨에이)으로 사전-혼성되어졌다. 100마이크로몰의 10밀리그램/밀리리터 연어 정자DNA와 혼합되어진, 가열-변성되어진 방사성 소식자(2.5 X 106카운트/2밀리리터)을 가하였고 그리고 상기 막을 68℃에서 1시간 동안 혼성시켰다. 상기 블로트들을 실온에서 15분 동안 2회 2 X SSC/0.1% SDS 로 그리고 60℃에서 30분 동안 1회 0.1 X SSC/0.1% SDS로 세척하였다. 블로트들을 방사능사진촬영 하였으며,신호의 강도는 이미지퀀트 포스포르이메이저(IMageQuant PhosphorImager)(몰레큘러 다이나믹스, 서니베일, 씨에이)를 사용하여 정량화하였다. 노던 블로트들은 우선 상기 ras 소식자와 혼성시켰고, 그 다음에 0.1 X SSC/0.1% SDS 내에서 15분간 가열하여 탈리시켰으며 조절 G3PDH 소식자로 재혼성시켜 정확한 시료 하중을 확인하였다.
(절차 10)
암세포들의 증식의 억제 및 화학요법제 시험에 대한 대조로서의 사용
세포들을 배양시키고 그리고 실질적으로 실시예 9에서 기술한 바의 시험화합물로 처리하였다. 세포들을 60밀리미터 플레이트들 상에 접종시키고 그리고 이들이 70% 합류되어졌을 때, DOTMA의 존재 중에서 시험화합물로 처치하였다. 시간 경과에 따른 실험: 첫째날에는 세포들을 시험화합물의 1회 분량으로 100나노몰의 최종 농도에서 처치하였다. 성장 매질읕 3일째에 1회 교체하였으며, 계수챔버(counting chamber)를 사용하여 5일 동안 매일 세포들을 계수하였다. 분량-응답 실험: 시험화합물의 여리 농도들(10,25,50,100 또는 250나노몰)을 상기 세포들에 가하고,3일 후에 세포들을 수확하고 계수하였다. 그 다음에 본 발명의 활성의 화합물들을 다른 화학요법제들의 검증을 위하여 이와 동일한 검증 방법에서 표준으로 사용하였다.
서열 리스트
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 : 아이시스 파마슈티칼스, 인코포레이티드
(ii) 발명의 밍칭 : PNA-DNA-PNA 잡종 거대분자들
(iii) 서열들의 수 : 4
(iv) 주소 :
(A) 수신인 : 우드콕 워시번 쿠르쯔 맥퀴위쯔 앤드 노리스
(B) 거리 : 원 리버티 플레이스 - 46 플로어
(C) 시 : 필라델피아
(D) 주 : 펜실바니아
(E) 국가 : 미합중국
(F) 집코트 : 19103
(v) 컴퓨터 해독가능한 형식
(A) 매체 형식 : 플로피디스크,1.44메가바이트 저장용량
(B) 컴퓨터 : 아이비엠 피씨 호환기종
(C) 오퍼레이팅 시스템 : 피씨-도스/엠에스-도스
(D) 소포트웨어 : 워트퍼펙트 5.1
(vi) 현재 출원 데이타
(A) 출원번호 : 미정
(B) 출원일 : 본 출원과 동일
(C) 분류 :
(vii) 선행출원 데이타
(A) 출원번호 : 08/158,352
(B) 출원일 : 1993년 11월 24일
(viii) 대리인/에이전트 정보
(A) 성명 : 존 더블류. 콜드웰
(B) 등륵번호 : 28,937
(C) 참조번호/서류번호 : ISIS-1746
(ix) 통신정보
(A) 전화 : 215-568-3100
(B) 팩스 : 215-568-3439
(2) 지열 확인 번호 1 에 대한 정보:
(i) 서열 특성들
(A) 길이 : 10
(B) 형식 : 핵산
(C) 사슬의 형 : 단일
(D) 형상 : 선형
(iv) 항감작 : 유
(xi) 서열 명세 : 서열 확인 번호 : 1 :
TGCATTTCAG 10
(2) 서열 확인 번호 2 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성들
(A) 길이 : 17
(B) 형식 : 핵산
(C) 사슬의 형 : 단일
(D) 형상 : 선형
(iv) 항감작 : 유
(xi) 서열 명세 : 서열 확인 번호 : 2 :
TTCTCGCTGC ATTTCAG 17
(2) 서열 확인 번호 3 에 대한 정보:
(i) 서열 특성들
(A) 길이 : 20
(B) 형식 : 핵산
(C) 사슬의 형 : 단일
(D) 형상 : 선형
(iv) 항감작 : 유
(xi) 서열 명세: 서열 확인 번호 : 3 :
TATTCCGTCA TCCGCTCCTCA 20
(2) 서열 확인 번호 4 에 대한 정보:
(i) 서열 특성들
(A) 길이 : 15
(B) 형식 : 핵산
(C) 사슬의 형 : 단일
(D) 형상 : 선형
(iv) 항감작 : 유
(xi) 서일 명세 : 서열 확인 번호 : 4 :
TGTACGTCAC AACTA 15
[도면들의 간단한 설명]
제 1 도는 본 발명의 특정의 화합물들의 고체상 합성을 나타내는 화학적 계통도이다.
제 2 도는 본 발명의 특정의 화합물들의 고체상 합성을 나타내는 화학적 계통도이다.
제 3 도는 본 발명의 특정의 화합물들의 용액상 합성을 나타내는 화학적 계통도이다.
제 4 도는 본 발명의 특정의 화합물들의 용액상 합성을 나타내는 화학적 계통도이다.
제 5 도는 본 발명의 특정의 화합물들의 고체상 합성을 나타내는 화학적 계통도이다.
제 6 도는 본 발명의 특정의 화합물들의 용액상 합성을 나타내는 화화적 계통도이다.

Claims (31)

  1. PNA-DNA-PNA의 구조이며;
    상기 DNA는 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오티드를 포함하고;
    상기 각각의 PNA는 하기 일반식(I)을 가지는 적어도 하나 이상의 펩티드핵산 소단위를 포함하며;
    상기 식(I)에서;
    n은 적어도 2이고, L1내지 Ln각각은 독립적으로 수소, 히드록시,(C1-C4)알카노일, 자연적으로 발생하는 핵산염기, 비-자연적으로 발생하는 핵산염기, 방향족 부분(moieties), DNA 인터컬레이터(intercalators),핵산염기-결합기, 헤테로고리 부분 및 리포터 리간드 (reporter ligands)로 이루어진 군으로부더 선택되고, L1내지 Ln중의 적어도 하나가 자연적으로 발생하는 핵산염기, 비-천연적으로 발생하는 핵산염기, DNA 인터컬레이터 또는 핵산-결합기이며;
    C1내지 Cn각각이 (CR6R7)y이며, 여기서 R6가 수소이고, R7이 자연적으로 발생하는 알파 아미노산들의 곁가지들로 이루어진 군으로부터 선택되어지거나, 또는 R6및 R7이 독립적으로 수소,(C2-C6)알킬, 아릴, 아랄킬,헤테로아릴, 히드록시,(C1-C6)알콕시,(C1-C6)알킬티오, NR3R4및 SR5로이루어진 군으로부터 선택되어지며, 여기서 R3및 R4상기에서 정의된 바와같으며, 상기 R5가 수소,(C1-C6)알킬, 히드록시-, 알콕시- 또는 알킬티오-로 치환되어진 (C1-C6)알킬이거나, 또는 R6및 R7이 함께 알리사이클릭 시스템 또는 헤테로사이클릭 시스템을 완성하고;
    D1내지 Dn각각이 (CR6R7)z 이며, 여기서 R6및 R7들이 상기에서 정의된 바와 같으며;
    y 및 z 각각이 0 또는 1 내지 10까지의 정수이고, 그 합계인 y + z 가 2보다 크기는 하나,10을 초과하지 않으며;
    G1내지 Gn-1각각이 양 방향에서 -NR3CO-,-NR3CS-,-NR3SO- 또는-NR3SO2- 이고, 여기서 R3가 상기에서 정의된 바와 같으며;
    A1내지 An및 B1내지 Bn의 각 쌍이 하기와 같이 선택되고:
    (a) A가 일반식 (IIa),(IIb) 또는 (IIc)의 기이고, B가 N 또는 R3N+이거나; 또는
    (b) A가 일반식 (IId)의 기이고, B가 CH 이며;
    상기식에서;
    X가 O, S, Se, NR3, CH2또는 C(CH3)2이고;
    Y가 단일결합,O, S 또는 NR4이며;
    p 및 q 각각이 0 또는 1 내지 5까지의 정수이고, 그 합계인 p + q 가 10을 초과하지 않고;
    r 및 s 각각이 0 또는 1 내지 5까지의 정수이고, 그 합계인 r + s 가 10을 초과하지 않으며;
    R1및 R2각각이 독립적으로 수소, 히드록시-, 알콕시- 또는 알킬티오-치환되어질 수 있는 (C1-C4)알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오, 아미노 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되어질 수 있고;
    G1내지 Gn-1각각이 양방향에서 -NR3CO-,-NR3CS-,-NR3SO- 또는 -NR3SO2- 이고, 여기서, R3가 상기에서 정의된 바와 같으며;
    Q가 -CO2H,-CONR'R'',-SO3H 또는 -SO2NR'R'' 또는 -CO2H 또는 -SO3H의 활성화된 유도체이고; 그리고
    I가 -NR'''R'''' 또는 -NR'''C(O)R'''' 이고;
    상기에서, 적어도 하나의 R'가 상기 DNA이고 적어도 하나의 R''''이 상기 DNA라면, R', R'', R''' 및 R''''들이 독립적으로 수소, 알킬, 아미노 보호기, 리포터 리간드, 인터컬레이터, 킬레이트화제, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 디포스페이트, 뉴클레오티드 트리포스페이트, 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및 가용성 또는 불용성의 고분자물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 거대분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PNA-DNA-PNA 거대분자가 핵산의 사슬과 특이적으로 혼성할 수 있는 것을 특징으로 하는 거대분자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 핵산의 사슬이 RNA 사슬인 것을 특징으로 하는 거대분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 DNA가 서열내에 서로 결합되어진 적어도 3개의 2'-데옥시뉴클레오티드들을 포함하며, 각 PNA가 적어도 두개의 펩티드 핵산 소단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 거대분자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 2'-데옥시뉴클레오티드가 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 뉴클레오티드인 것을 특징으로하는 거대분자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 DNA가 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 결합들에 의하여 서열내에 서로 결합되어진 적어도 3개의 2'-데옥시뉴클레오티드들을 포함하는 것을 특징으로 하는 거대분자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 PNA 각각이 하기의 일반식(IIIa),(IIIb) 또는 (IIIc)의 화합물을 포함하며;
    상기식에서;
    각각의 L은 독립적으로 수소, 페닐, 헤테로고리 부분들, 자연적으로 발생하는 핵산염기들 및 비-자연적으로 발생하는 핵산염기들로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 R7'이 독립적으로 수소 및 자연적으로 발생하는 알파 아미노산들의 곁가지들로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    n이 1 내지 60의 정수이고;
    k,1 및 m 각각이 독립적으로 0 또는 1 내지 5까지의 정수이며;
    p가 0 또는 1이고;
    Rh가 OH, NH2또는 -NHLysNH2그리고; 그리고
    Ri가 H 또는 COCH3인 것을 특징으로 하는 거대분자.
  8. 제8항에 있어서, 상기 PNA 각각이 일반식(IIIa) 내지 (IIIc)의 화합물을 포함하며, 상기에서 각각의 L은 독립적으로 핵산염기 티민(T), 아데닌(A),시토신(C), 구아닌(G) 및 우라실(U)로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, k및 m이 0 또는 1이며, n이 1 내지 30, 바람직하게는 4 내지 20까지의 정수인 것을 특징으로 하는 거대분자.
  9. 제9항에 있어서, 상기 DNA가 서열내에 서로 결합되어진 적어도 3개의 상기 2'-데옥시뉴클레오티드들을 포함하고;
    각각의 PNA가 적어도 2개의 펩티드 핵산 소단위들을 포함하고; 그리고 상기 2'-데옥시뉴클레오티드들이 포스포디 에스테르, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 결합들에 의하여 연결되는; 것을 특징으로 하는 거대분자.
  10. 제1항에 있어서, 상기 PNA 각각이 아미드, 아민 또는 에스테르결합으로 상기 DNA에 공유적으로 결합되는 것을 특정으로 하는 거대분자.
  11. PNA-(아미드 결합)-DNA-(아미드 결합)-PNA 의 구조를 가지며;
    상기 DNA가 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오티드를 포함하고;
    상기 PNA들 각각이 적어도 하나의 펩티드 핵산 소단위를 포함하고; 그리고
    상기 아미드 결합들 각각이 -C(=O)-NH- 또는 -NH-C(=O)- 의 구조의 아미드 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 거대분자,
  12. RNase H 및 핵산을 포함하는 시험용액과 제1항의 거대분자를 접촉시키는 것을 포함하는 서열-특이적 핵산의 시험관내에서의 변형 방법.
  13. RNase H 및 핵산을 포함하는 시험용액과 제10항의 화합물을 접촉시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 서열-특이적 핵산의 시험관내에서의 변형 방법.
  14. PNA-DNA 또는 DNA-PNA 의 구조이며;
    상기 DNA는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합에 의하여 결합된 다수의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드중 적어도 하나가 2'-디옥시뉴클레오티드이며;
    상기 PNA가 하기의 일반식(I)을 가지는 적어도 하나 이상의 펩티드핵산 소단위를 포함하며:
    상기식에서; n은 적어도 2이고,
    L1내지 Ln각각은 독립적으로 수소, 히드록시, (C1-C4)알카노일, 자연적으로 발생하는 핵산염기, 비-자연적으로 발생하는 핵산염기, 방향족 부분,DNA 인터컬레이터, 핵산염기-결합기, 헤테로고리 부분 및 리포터 리간드로 구성된 군으로부터 선택되고, L1내지 Ln중의 적어도 하나가 자연적으로 발생하는 핵산염기, 비-자연적으로 발생하는 핵산염기, DNA 인터컬레이터 또는 핵산-결합기이며;
    C1내지 Cn각각이 (CR6R7)y 이며, 상기에서 R6가 수소이고, R7이 자연적으로 발생하는 알파 아미노산들의 곁가지들로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R6및 R7이 독립적으로 수소,(C2-C6)알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴, 히드록시,(C1-C6)알콕시,(C1-C6)알킬티오, NR3R4및 SR5로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기에서, R3및 R4들이 상기에서 정의된 바와 같으며, 상기 R5가 수소,(C1-C6)알킬, 히드록시-, 알콕시- 또는 알킬티오-로 치환되어진 (C1-C6)알킬이거나, 또는 R6및 R7들이 함께 알리사이클릭 시스템 또는 헤테로사이클릭 시스템을 완성하고;
    D1내지 Dn각각이 (CR6R7)z이며, 상기에서 R6및 R7들이 상기에서 정의된 바와 같으며;
    y 및 z 각각이 0 또는 1 내지 10까지의 정수이고, 그 합계인 y + z 가 2 보다 크기는 하나, 10을 초과하지 않으며;
    G1내지 Gn-1각각이 양 방향에서 -NR3CO-,-NR3CS-,-NR3SO- 또는-NR3SO2- 이고, 상기에서, R3가 상기에서 정의된 바와 같으며;
    A1내지 An및 B1내지 Bn각 쌍이 다음과 같이 선택되어질 수 있고:
    (a) A 가 일반식 (IIa),(IIb) 또는 (IIc)의 기이고, B 가 N 또는 R3N+이거나;또는
    (b) A 가 일반식 (IId)의 기이고, B 가 CH이며;
    상기식에서; X 가 O, S, Se, NR3, CH2또는 C(CH3)2이고;
    Y가 단일결합,O, S 또는 NR4이며;
    p 및 q 각각이 0 또는 1 내지 5까지의 정수이고, 그 합계인 p + q 가 10을 초과하지 않고;
    r 및 s 각각이 0 또는 1 내지 5까지의 정수이고, 그 합계인 r + s 가 10을 초과하지 않으며;
    R1및 R2각각이 개별적으로 수소, 히드록시-, 알콕시- 또는 알킬티오-치환되어질 수 있는 (C1-C4)알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오, 아미노 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    G1내지 Gn-1각각이 양 방향에서 -NR3CO-,-NR3CS-,-NR3SO- 또는 NR3SO2- 이고, 상기에서, R3가 상기에서 정의된 바와 같으며;
    Q 가 -CO2H,-CONR'R'',-SO3H 또는 -SO2NR'R'' 또는 -CO2H 또는-SO3H의 활성화된 유도체이고; 그리고
    I 가 -NHR'''R'''' 또는 -NR'''C(O)R'''' 이고,
    상기에서; 적어도 하나의 R'이 상기 DNA이고 적어도 하나의 R''''이 상기 DNA이면, R', R'', R''' 및 R''''들이 독립적으로 수소, 알킬, 아미노보호기, 리포터 리간드, 인터컬레이터, 킬레이트화제, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 디포스페이드, 뉴클레오티드 트리포스페이트, 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및 가용성 또는 불용성의 고분자물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 거대분자.
  15. (정정) 제14항에 있어서, PNA-DNA 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 거대분자.
  16. (정정) 제14항에 있어서, DNA-PNA 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 거대분자.
  17. 제14항에 있어서, 상기 PNA-DNA 또는 DNA-PNA 거대분자가 핵산의 사슬과 특이적으로 혼성할 수 있는 것을 특징으로 하는 거대분자.
  18. 제17항에 있어서, 상기 핵산의 사슬이 RNA 사슬인 것을 특징으로 하는 거대분자.
  19. 제14항에 있어서, 상기 DNA 가 서열대에 서로 결합되어진 적어도 3개의 2'-데옥시뉴클레오티드들을 포함하며, 각각의 PNA가 적어도 두개의 펩티드 핵산 소단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 거대분자.
  20. 제14항에 있어서, 상기 2'-데옥시뉴클레오티드가 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 거대분자.
  21. 제14항에 있어서, 상기 DNA가 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 결합들에 의하여 서열내에 서로 결합된 적어도 3개의 2'-데옥시뉴클레오티드들을 포함하는 것을 특징으로 하는 거대분자.
  22. 제14항에 있어서, 상기 PNA가 하기의 (IIIa),(IIIb) 및 (IIIc)로 이루어진 군으로부터 선택된 일반식을 가지는 화합물을 포함하며:
    상기식에서; 각각의 L 은 독립적으로 수소, 페닐, 헤테로고리 부분, 자연적으로 발생하는 핵산염기 및 비-자연적으로 발생하는 핵산염기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 R7이 독립적으로 수소 및 자연적으로 발생하는 알파 아미노산들의 곁가지들로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    n 이 1 내지 60의 정수이고;
    k,1 및 m 각각이 독립적으로 0 또는 1 내지 5까지의 정수이며;
    p 가 0 또는 1이고;
    Rh가 OH, NH2또는 -NHLysNH2이고; 그리고
    R1가 H 또는 COCH3인 것을 특징으로 하는 거대분자.
  23. 제22항에 있어서, 상기 PNA가 (IIIa),(IIIb), 및 (IIIc)로 이루어진 군으로부터 선택된 일반식을 가지는 화합물을 포함하며, 상기에서 각각의 L 은 독립적으로 핵산염기 티민(T), 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G) 및 우라실(U)로 이루어진 군으로부터 선택되고, k 및 m이 0 또는 1이며, n이 1 내지 30, 바람직하게는 4 내지 20까지의 정수인 것을 특징으로 하는 거대분자.
  24. 제23항에 있어서, 상기 DNA가 서열내에 서로 결합되어진 적어도 3개의 상기 2'-데옥시뉴클레오티드들을 포함하고;
    각 PNA가 적어도 2개의 펩티드 핵산 소단위들을 포함하고; 그리고
    상기2'-데옥시뉴클레오티드들이 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 결합들에 의하여 연결되는 것을 특징으로 하는 거대분자.
  25. 제14항에 있어서, 상기 PNAs 각각이 아미드, 아민 또는 에스테르결합으로 상기 DNA에 공유적으로 결합되는 것을 특징으로 하는 거대분자.
  26. 핵산에 특이적으로 혼성될수 있는 핵산염기 서열을 포함하고 PNA-DNA 또는 DNA-PNA 구조를 가지는 거대분자와 상기 핵산을 접촉시키는 것으로 이루어지고,
    상기 DNA는 적어도 하나의 2'-데옥시뉴클레오티드를 포함하고;
    상기 PNA는 하기의 일반식(I)을 가지는 적어도 하나의 펩티드 핵산소단위를 포함하며:
    상기식에서; n은 적어도 2이고,
    L1-Ln각각은 독립적으로 수소, 히드록시,(C1-C4)알카노일, 자연적으로 발생하는 핵산염기, 비-자연적으로 발생하는 핵산염기, 방향족 부분, DNA인터컬레이터, 핵산염기-결합기, 헤테로고리 부분 및 리포터 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되고, L1내지 Ln중의 적어도 하나가 자연적으로 발생하는 핵산염기, 비-자연적으로 발생하는 핵산염기, DNA 인터컬레이터 또는 핵산-결합기이며;
    C1내지 Cn각각이 (CR6R7)y 이며, 상기에서R6 가 수소이고, R7이 자연적으로 발생하는 알파 아미노산들의 곁가지들로 이루어진 그룹으로부터 선택되어지거나, 또는 R6및 R7이 독립적으로 수소, (C2-C6)알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴, 히드록시, (C1-C6)알콕시, (C1-C6)알킬티오, NR3R4및 SR5로 이루어진 그룹으로부터 선택되어지며, 상기에서, R3및 R4들이 상기에서 정의된 바와 같으며, 상기 R5가 수소, (C1-C6)알킬, 히드록시-. 알콕시-또는 알킬티오-로 치환되어진 (C1-C6)알킬이거나, 또는 R6및 R7들이 함께
    알리사이클릭 시스템 또는 헤테로사이클릭 시스템을 완성하고;
    D1내지 Dn각각이 (CR6R7)z 이며, 상기에서 R6및 R7들이 상기에서 정의된 바와 같으며;
    y 및 z 각각이 0 또는 1 내지 10까지의 정수이고, 그 합계인 y + z 가 2 보다 크기는 하나,10을 초과하지 않으며;
    G1내지 Gn-1각각이 양 방향에서 -NR3CO-,-NR3CS-,-NR3SO- 또는 NR3SO2- 이고, 상기에서, R3가 상기에서 정의된 바와 같으며;
    A1내지 An및 Bl내지 Bn각 쌍이 하기와 같이 선택되고:
    (a) A 가 일반식 (IIa),(IIb) 또는 (IIc)의 기이고, B 가 N 또는 R3N+이거나; 또는
    (b) A 가 일반식 (IId)의 기이고, B 가 CH이며;
    상기식에서; X 가 O, S, Se, NR3, CH2또는 C(CH3)2이고;
    Y가 단일결합,O, S 또는 NR4이며;
    p 및 q 각각이 0 또는 1 내지 5까지의 정수이고, 그 합계인 p + q 가 10을 초과하지 않고;
    r 및 s 각각이 0 또는 1 내지 5까지의 정수이고, 그 합계인 r + s 가 10을 초과하지 않으며;
    R1및 R2각각이 독립적으로 수소, 히드록시-, 알콕시- 또는 알킬티오-치환되어질 수 있는 (C1-C4)알킬, 히드록시, 알콕시, 알킬티오, 아미노 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    G1내지 Gn-1각각이 양 방향에서 -NR3CO-,-NR3CS-,-NR3SO- 또는 NR3SO2-이고, 상기에서, R3가 상기에서 정의된 바와 같으며;
    Q가 -CO2H,-CONR'R'',-SO3H 또는 -SO2NR'R'' 또는 -CO2H 또는 -SO3H의 활성화된 유도체이고; 그리고
    I 가 -NHR'''R'''' 또는 -NR'''C(O)R'''' 이고,
    상기에서; 적어도 하나의 R'이 상기 DNA이고 적어도 하나의 R''''이 상기 DNA이면, R', R'', R''' 및 R''''들이 독립적으로 수소, 알킬, 아미노보호기, 리포터 리간드, 인터컬레이터, 킬레이트화제, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 스테로이드, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 디포스페이트, 뉴클레오티드 트리포스페이트, 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및 가용성 또는 불용성의 고분자물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성화 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 핵산의 사슬이 RNA 사슬인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 혼성화가 RNase H를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제26항에 있어서, 상기 DNA가 서열내에 서로 결합되어진 적어도 3개의 2'-데옥시뉴클레오티드들을 포함하며, 각 PNA가 적어도 두 개의 펩티드 핵산 소단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제26항에 있어서, 상기 2'-데옥시뉴클레오티드가 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제26항에 있어서, 상기 DNA가 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 결합들에 의하여 서열내에 서로 결합되어진 적어도 3개의 2'-데옥시뉴클레오티드들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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