TWI678375B - 藉由抑制共濟蛋白（ｆｒａｔａｘｉｎ，ｆｘｎ）之天然反股轉錄本治療ｆｘｎ相關疾病 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於反義寡核苷酸，其特別藉由靶向共濟蛋白(Frataxin，FXN)之天然反義聚核苷酸來調節共濟蛋白(FXN)之表現及/或功能。本發明亦關於此等反義寡核苷酸之鑑別及其治療與FXN之表現相關之疾病及病症的用途。

Description

藉由抑制共濟蛋白(FRATAXIN，FXN)之天然反股轉錄本治療FXN相關疾病
本發明之實施例包含調節FXN及相關分子之表現及/或功能之寡核苷酸。
本申請案主張2011年6月9日申請之美國臨時專利申請案第61/494,928號之優先權，該臨時專利申請案以全文引用的方式併入本文中。
DNA-RNA及RNA-RNA雜交對核酸功能之許多態樣(包括DNA複製、轉錄及轉譯)而言為重要的。對偵測特定核酸或改變其表現之多種技術而言，雜交亦為重要的。反義核苷酸例如藉由與目標RNA雜交，藉此干擾RNA剪接、轉錄、轉譯及複製而破壞基因表現。反義DNA具有附加特徵，即DNA-RNA雜交體充當核糖核酸酶H消化之受質(一種存在於大多數細胞類型中之活性)。與寡去氧核苷酸(ODN)之情況一樣，反義分子可傳遞入細胞中，或其可自內源性基因表現為RNA分子。FDA近來核准一種反義藥物VITRAVENETM(用於治療細胞巨大病毒視網膜炎)，反映出反義具有治療效用。
提供本[發明內容]以呈現簡要指示本發明之性質及實質之本發明的概述。其在應瞭解其不應用於解釋或限制申請專利範圍之範疇或意義之情況下呈遞。
在一個實施例中，本發明提供藉由使用靶向天然反義轉 錄本之任何區域，從而導致上調相應有義基因之反義寡核苷酸來抑制天然反義轉錄本之作用的方法。本文亦涵蓋天然反義轉錄本可由視為在本發明之範疇內之siRNA、核糖核酸酶及小分子抑制。
一個實施例提供一種活體內或活體外調節患者細胞或組織中之FXN聚核苷酸之功能及/或表現的方法，其包含在活體內或活體外使該等細胞或組織與長度5至30個核苷酸之反義寡核苷酸接觸，其中該寡核苷酸與包含SEQ ID NO：2之核苷酸1至454內之5至30個連續核苷酸之聚核苷酸的反向互補序列具有至少50%序列一致性，藉此調節患者細胞或組織中之FXN聚核苷酸之功能及/或表現。
在一實施例中，寡核苷酸靶向FXN聚核苷酸之天然反義序列(例如SEQ ID NO：2中闡述之核苷酸)及其任何變異體、對偶基因、同源物、突變體、衍生物、片段及互補序列。反義寡核苷酸之實例係如SEQ ID NO：3至6所闡述。
另一實施例提供一種活體內或活體外調節患者細胞或組織中之FXN聚核苷酸之功能及/或表現的方法，其包含在活體內或活體外使該等細胞或組織與長度5至30個核苷酸之反義寡核苷酸接觸，其中該寡核苷酸與該FXN聚核苷酸之反義之反向互補序列具有至少50%序列一致性；藉此調節患者細胞或組織中之FXN聚核苷酸的功能及/或表現。
另一實施例提供一種活體內或活體外調節患者細胞或組織中之FXN聚核苷酸之功能及/或表現的方法，其包含在活體內或活體外使該等細胞或組織與長度5至30個核苷酸之 反義寡核苷酸接觸，其中該寡核苷酸與FXN反義聚核苷酸之反義寡核苷酸具有至少50%序列一致性；藉此調節患者細胞或組織中之FXN聚核苷酸的功能及/或表現。
在一實施例中，組合物包含一或多種與有義及/或反義FXN聚核苷酸結合之反義寡核苷酸。
在一實施例中，寡核苷酸包含一或多個經修飾或經取代之核苷酸。
在一實施例中，寡核苷酸包含一或多個經修飾之鍵。
在另一實施例中，經修飾之核苷酸包含含有硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2'-O-甲基、氟-或碳、亞甲基或其他鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)分子之經修飾之鹼基。較佳地，經修飾之核苷酸為鎖核酸分子，包括α-L-LNA。
在一實施例中，皮下、肌肉內、靜脈內或腹膜內向患者投與寡核苷酸。
在一實施例中，寡核苷酸係以醫藥組合物形式投與。治療方案包含向患者投與反義化合物至少1次；然而，此治療可經改進以包括歷時一段時期之多次劑量。治療可與一或多種其他類型之療法組合。
在一實施例中，寡核苷酸囊封於脂質體中或與載劑分子(例如膽固醇、TAT肽)連接。在各個及所有實施例中，方法及組合物包括向生物系統投與寡核苷酸。
下文描述其他態樣。
以下參考用於說明之例示性應用來描述本發明之若干態樣。應瞭解闡述眾多特定詳情、關係及方法以全面瞭解本發明。然而，一般技術者將容易認識到本發明可在無一或多個特定詳情之情況下或用其他方法加以實施。本發明不受行為或事件之次序限制，因為某些行為可能以不同次序及/或與其他動作或事件並行發生。此外，並非所有經說明之動作或事件皆為實施本發明之方法所需。
本文揭示之所有基因、基因名稱及基因產物皆意欲對應於來自本文揭示之組合物及方法所適用之任何物種的同源物。因此，術語包括(但不限於)來自人類及小鼠之基因及基因產物。應瞭解當揭示來自特定物種之基因或基因產物時，除非其所出現之上下文明確指明，否則此揭示內容僅意欲具有例示性，且不應解釋為限制。因此，舉例而言，對於在一些實施例中與哺乳動物核酸及胺基酸序列相關之本文揭示之基因，其意欲涵蓋來自其他動物(包括(但不限於)其他哺乳動物、魚類、兩棲動物、爬行動物及鳥類)之同源及/或直系同源基因及基因產物。在一個實施例中，基因或核酸序列為人類基因或核酸序列。
定義
本文所用之術語係僅出於描述特定實施例之目的且不意欲限制本發明。如本文所用，除非上下文另外明確指明，否則單數形式「一」及「該」亦意欲包括複數形式。此外，就術語「包括」、「具有」或其變化形式用於[實施方式]及/或申請專利範圍中而言，此等術語意欲以與術語 「包含」類似之方式具有包括性。
術語「約」意謂在如由一般技術者測定之特定值之可接受誤差範圍內，該誤差範圍將部分視如何量測或測定該值，亦即量測系統之限制而定。舉例而言，「約」可意謂根據此項技術中之慣例，在1或1以上之標準偏差內。或者，「約」可意謂既定值之至多20%、較佳至多10%、更佳至多5%、且仍然更佳至多1%之範圍。或者，特別就生物系統或方法而言，術語可意謂在某一值之一定數量級內，較佳在5倍內、且更佳在2倍內。當在本申請案及申請專利範圍中描述特定值時，除非另有陳述，否則術語「約」意味應假設在特定值之可接受誤差範圍內。
如本文所用，術語「mRNA」意謂靶向基因之目前已知mRNA轉錄本及可闡明之任何其他轉錄本。
就「反義寡核苷酸」或「反義化合物」而言，其意謂與另一RNA或DNA(目標RNA、DNA)結合之RNA或DNA分子。舉例而言，若其為RNA寡核苷酸，則其藉助於RNA-RNA相互作用與另一RNA目標結合且改變目標RNA之活性。反義寡核苷酸可上調或下調特定聚核苷酸之表現及/或功能。定義意欲包括就治療、診斷或其他觀點看來適用之任何外來RNA或DNA分子。此等分子包括例如反義RNA或DNA分子、干擾RNA(RNAi)、微RNA、誘餌RNA分子、siRNA、酶促RNA、治療性編輯RNA及促效劑及拮抗劑RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部引導序列(external guide sequence，EGS)寡核苷酸、選擇性剪接物 (alternate splicer)、引子、探針及與至少一部分目標核酸雜交之其他寡聚化合物。因而，此等化合物可以單股、雙股、部分單股、或環形寡聚化合物形式引入。
在本發明之情形下，術語「寡核苷酸」係指核糖核酸(RNA)或去氧核糖核酸(DNA)之寡聚物或聚合物或其模擬物。術語「寡核苷酸」亦包括天然及/或經修飾之單體或鍵(包括去氧核糖核苷、核苷、其經取代及α向差異構形式、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及其類似物)之線性或環形寡聚物。寡核苷酸能夠藉由規則樣式之單體對單體相互作用(諸如華特生-克里克(Watson-Crick)類型之鹼基配對、胡格斯丁(Hoögsteen)或反向胡格斯丁類型之鹼基配對、或其類似相互作用)來特異性結合目標聚核苷酸。
寡核苷酸可為「嵌合的」，亦即，由不同區域構成。在本發明之情形下，「嵌合」化合物為寡核苷酸，其含有兩個或兩個以上化學區域，例如DNA區域、RNA區域、PNA區域等。各化學區域由至少一個單體單元，亦即在寡核苷酸化合物之情況下之核苷酸構成。此等寡核苷酸通常包含至少一個其中寡核苷酸經修飾以展現一或多種所要性質之區域。寡核苷酸之所要性質包括(但不限於)例如對核酸酶降解增加之抗性、增加之細胞攝取及/或對目標核酸增加之結合親和力。因此，寡核苷酸之不同區域可具有不同性質。本發明之嵌合寡核苷酸可形成為兩種或兩種以上如上所述之寡核苷酸、經修飾之寡核苷酸、寡核苷及/或寡核 苷酸類似物的混合結構。
寡核苷酸可由「互相對準(register)」連接(亦即，當單體如天然DNA中一樣連續連接時)或經由間隔子連接之區域構成。間隔子意欲在區域之間構成共價「橋」且在較佳情況中具有不超過約100個碳原子之長度。間隔子可帶有不同功能性，例如具有正電荷或負電荷、帶有特殊核酸結合性質(嵌入劑、凹槽結合劑(groove binder)、毒素、螢光團等)、具有親脂性、誘導特殊二級結構，如例如會誘導α-螺旋之含有丙胺酸之肽。
如本文所用，「FXN」及「共濟蛋白」包括所有家族成員、突變體、對偶基因、片段、物質、編碼及非編碼序列、有義及反義聚核苷酸股等。
如本文所用，措詞『共濟蛋白』、FXN、FA、CyaY、FARR、FRDA、MGC57199、X25在文獻中視為相同且在本申請案中可互換使用。
如本文所用，術語「對...具有特異性之寡核苷酸」或「靶向...之寡核苷酸」係指具有(i)能夠與一部分靶向基因形成穩定複合物，或(ii)能夠與靶向基因之一部分mRNA轉錄本形成穩定雙螺旋的序列之寡核苷酸。複合物及雙螺旋之穩定性可藉由理論計算及/或活體外分析來確定。用於確定雜交複合物及雙螺旋之穩定性之例示性分析描述於以下實例中。術語「非特異性」用於對目標天然反義轉錄本或目標核酸為非特異性之模擬對照之情形下。寡核苷酸對照亦可稱為「非相關」。「非相關」寡核苷酸將具有錯義 序列(scrambled sequence)且長度將類似於比較寡核苷酸。實驗亦可在無對照寡核苷酸作為對FXN之非功能性效應之陰性對照下進行。此後述實驗稱為細胞基實驗中之非轉染或模擬轉染。
如本文所用，術語「目標核酸」涵蓋DNA、自此DNA轉錄之RNA(包含前mRNA(premRNA)及mRNA)、以及源於此RNA之cDNA、編碼序列、非編碼序列、有義或反義聚核苷酸。寡聚化合物與其目標核酸之特異性雜交會干擾核酸之正常功能。與目標核酸特異性雜交之化合物對該目標核酸功能之此調節通常稱為「反義(antisense)」。將會受到干擾之DNA功能包括例如複製及轉錄。將會受到干擾之RNA功能包括所有生命功能，諸如RNA向蛋白質轉譯位點之易位、蛋白質自RNA之轉譯、RNA之剪接以產生一或多種mRNA物質及RNA可參與或促進之催化活性。對目標核酸功能之此干擾之總體效應為調節經編碼之產物或寡核苷酸之表現。
RNA干擾「RNAi」由與「目標」核酸序列具有序列特異性同源性之雙股RNA(dsRNA)分子介導。在本發明之某些實施例中，介體為含5-25個核苷酸之「小干擾」RNA雙螺旋(siRNA)。siRNA係由稱為Dicer之RNA酶對dsRNA進行加工產生。siRNA雙螺旋產物經募集進入稱為RISC(RNA誘導之靜止複合物)之多蛋白siRNA複合物中。在不希望受任何特定理論束縛之情況下，咸信RISC接著經引導至目標核酸(適合為mRNA)，在此處，siRNA雙螺旋以 序列特異性方式進行相互作用來以催化方式介導裂解。可根據本發明使用之小干擾RNA可根據此項技術中熟知且將為一般技術者所熟悉之程序合成並使用。用於本發明方法中之小干擾RNA適合地包含約1個至約50個之間的核苷酸(nt)。在非限制性實施例之實例中，siRNA可包含約5至約40個nt、約5至約30個nt、約10至約30個nt、約15至約25個nt、或約20-25個核苷酸。
藉由使用自動比對核酸序列且指示具有一致性或同源性之區域之電腦程式來促進對適當寡核苷酸之選擇。此等程式用於例如藉由搜尋諸如GenBank之資料庫或藉由對PCR產物定序來比較所得核酸序列。來自一定範圍之物種之核酸序列的比較允許對顯示物種之間之適當一致性程度的核酸序列進行選擇。在尚未經定序之基因之情況下，進行南方墨點分析(Southern blot)以允許確定目標物種中之基因與其他物種中之基因之間的一致性程度。如此項技術中所熟知，藉由在不同嚴格性程度下進行南方墨點分析，有可能獲得一致性之近似度量。此等程序使得可選擇與欲經控制之個體中之目標核酸序列具有高互補程度且與其他物種中之相應核酸序列具有較低互補程度的核酸序列。熟習此項技術者將認識到在選擇用於本發明中之基因之適當區域方面有很大的自由。
就「酶促RNA」而言，其意謂具有酶促活性之RNA分子(Cech,(1988)J.American.Med.Assoc.260,3030-3035)。酶促核酸(核糖核酸酶)藉由與目標RNA結合來起作用。此 結合經由酶促核酸之目標結合部分發生，該目標結合部分保持密切鄰近於分子之起裂解目標RNA作用之酶促部分。因此，酶促核酸首先識別目標RNA且接著經由鹼基配對結合目標RNA，且一旦與正確位點結合，即以酶促方式起作用來切割目標RNA。
就「誘餌RNA」而言，其意謂模擬配位體之天然結合域之RNA分子。因此，誘餌RNA與天然結合目標競爭結合特定配位體。舉例而言，已顯示過度表現之HIV反式活化反應(trans-activation response；TAR)RNA可充當「誘餌」且高效結合HIV tat蛋白，藉此阻止其與HIV RNA中編碼之TAR序列結合。此意欲為一特定實例。此項技術中之相關人員應認識到此僅為一實例，且其他實施例容易使用此項技術中通常已知之技術產生。
如本文所用，術語「單體」通常指示經磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成大小在數個單體單元(例如約3-4個單體單元)至約數百個單體單元之範圍內之寡核苷酸的單體。磷酸二酯鍵之類似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、胺基磷酸酯及其類似物，如下更充分描述。
術語「核苷酸」涵蓋天然存在之核苷酸以及非天然存在之核苷酸。熟習此項技術者應清楚先前已視為「非天然存在」之各種核苷酸隨後已在自然界中發現。因此，「核苷酸」不僅包括已知之含有嘌呤及嘧啶雜環之分子，而且亦包括其雜環類似物及互變異構體。其他類型之核苷酸之說 明性實例為含有以下之分子：腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二胺基嘌呤、8-側氧基-N6-甲基腺嘌呤、7-去氮黃嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、N4,N4-橋亞乙基胞嘧啶(N4,N4-ethanocytosin)、N6,N6-橋亞乙基-2,6-二胺基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷，及Benner等人，美國專利第5,432,272號中描述之「非天然存在之」核苷酸。術語「核苷酸」意欲涵蓋每一及所有此等實例以及其類似物及互變異構體。尤其引起注意之核苷酸為含有腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶之核苷酸，其視為與人類中之治療及診斷應用相關之天然存在的核苷酸。核苷酸包括例如如Kornberg及Baker,DNA Replication，第2版(Freeman,San Francisco,1992)中所述之天然2'-去氧及2'-羥基糖以及其類似物。
關於核苷酸之「類似物」包括具有經修飾之鹼基部分及/或經修飾之糖部分(參見例如通常由Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York,1980；Freier及Altmann,(1997)Nucl.Acid.Res.,25(22),4429-4443；Toulmé,J.J.,(2001)Nature Biotechnology 19：17-18；Manoharan M.,(1999)Biochemica et Biophysica Acta 1489：117-139；Freier S.M.,(1997)Nucleic Acid Research,25：4429-4443；Uhlman,E.,(2000)Drug Discovery & Development,3：203-213；Herdewin P.,(2000)Antisense & Nucleic Acid Drug Dev.,10：297-310所述)的合成核苷酸；2'-O、3'-C連接之[3.2.0]雙環阿糖核苷。此等類似物包括經設計以增強結合性質，例如雙螺旋或三螺旋穩定性、特異性或其類似性質之合成核苷酸。
如本文所用，「雜交」意謂寡聚化合物之實質上互補股之配對。一種配對機制涉及寡聚化合物之股之互補核苷或核苷酸鹼基(核苷酸)之間的氫鍵結，其可為華特生-克里克、胡格斯丁或反向胡格斯丁氫鍵結。舉例而言，腺嘌呤及胸腺嘧啶為經由形成氫鍵而配對之互補核苷酸。雜交可在不同情況下發生。
當反義化合物與目標核酸之結合會干擾目標核酸之正常功能從而導致對功能及/或活性之調節，且存在足夠程度之互補性以避免該反義化合物與非目標核酸序列在特異性結合所要之條件下(亦即在活體內分析或治療性治療之情況下為在生理條件下，及在活體外分析之情況下為在進行分析之條件下)進行非特異性結合時，該反義化合物為「可特異性雜交的」。
如本文所用，片語「嚴格雜交條件」或「嚴格條件」係指本發明化合物將與其目標序列但與最小數目之其他序列雜交的條件。嚴格條件具有序列依賴性且在不同情況下將不同，且在本發明之情形下，寡聚化合物與目標序列雜交之「嚴格條件」係由寡聚化合物之性質及組成以及對其進行研究之分析決定。一般而言，嚴格雜交條件包含低濃度(<0.15 M)之具有無機陽離子(諸如Na+或K+)之鹽(亦即低 離子強度)、在寡聚化合物：目標序列複合物之Tm以下高於20℃-25℃之溫度、諸如甲醯胺、二甲基甲醯胺、二甲亞碸或清潔劑十二烷基硫酸鈉(SDS)之變性劑之存在。舉例而言，對於每1%甲醯胺，雜交率減小1.1%。高嚴格性雜交條件之一實例為0.1×氯化鈉-檸檬酸鈉緩衝液(SSC)/0.1%(w/v)SDS，在60℃下，持續30分鐘。
如本文所用之「互補」係指一或兩個寡聚股上之兩個核苷酸之間精確配對的能力。舉例而言，若在反義化合物之某一位置之核鹼基(nucleobase)能夠與在目標核酸(該目標核酸為DNA、RNA或寡核苷酸分子)之某一位置之核鹼基氫鍵結，則寡核苷酸與目標核酸之間之氫鍵結的位置視為互補位置。當各分子中有足夠數目之互補位置由可彼此氫鍵結之核苷酸佔據時，寡聚化合物與其他DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此互補。因此，「可特異性雜交」及「互補」為用於指示足夠數目之核苷酸足夠程度之精確配對或互補性以便在寡聚化合物與目標核酸之間發生穩定及特異性結合的術語。
在此項技術中應瞭解達成可特異性雜交無需寡聚化合物之序列100%互補於其目標核酸之序列。此外，寡核苷酸的一或多個區段可雜交以使介入或鄰近區段不涉及於雜交事件(例如環結構、錯配或髮夾結構)中。本發明之寡聚化合物包含與其靶向之目標核酸序列內之目標區域的至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約99%序列互補性。舉 例而言，反義化合物之20個核苷酸中有18個核苷酸互補於目標區域且因此將特異性雜交之反義化合物將表示90%互補性。在此實例中，其餘非互補核苷酸可叢集或經互補核苷酸穿插且無需彼此鄰接或與互補核苷酸鄰接。因而，長度為18個核苷酸且具有經與目標核酸完全互補之兩個區域側接之4(四)個非互補核苷酸的反義化合物將與目標核酸具有77.8%總體互補性且因此將屬於本發明之範疇。具有目標核酸之區域之反義化合物的互補性百分比可使用此項技術中已知之BLAST程式(基本局部比對搜尋工具)及PowerBLAST程式按常規方式確定。同源性百分比、序列一致性或互補性可藉由例如使用Smith及Waterman演算法(Adv.Appl.Math.,(1981)2,482-489)之Gap程式(威斯康星序列分析套裝(Wisconsin Sequence Analysis Package)，用於Unix之第8版，Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)，使用預設設置加以確定。
如本文所用，術語「熱熔點(Tm)」係指在確定的離子強度、pH值及核酸濃度下，50%之互補於目標序列之寡核苷酸與處於均衡狀態的目標序列雜交之溫度。通常，嚴格條件將為以下條件：鹽濃度為至少約0.01至1.0 M Na離子濃度(或其他鹽)，在pH 7.0至8.3下，且對於短寡核苷酸(例如10至50個核苷酸)，溫度為至少約30℃。嚴格條件亦可在添加諸如甲醯胺之去穩定劑下達成。
如本文所用，「調節」意謂基因表現增加(刺激)或減小(抑制)。
當用於聚核苷酸序列之情形下時，術語「變異體」可涵蓋與野生型基因相關之聚核苷酸序列。此定義亦可包括例如「對偶基因」、「剪接」、「物種」或「多形性」變異體。剪接變異體可與參照分子具有顯著一致性，但歸因於mRNA加工期間外顯子之替代性剪接，通常將具有較大或較小數目之聚核苷酸。相應多肽可具有其他功能域或不存在功能域。物種變異體為自一物種至另一物種變化之聚核苷酸序列。在本發明中，野生型基因產物之變異體具有特定效用。變異體可由核酸序列中之至少一個突變產生且可產生改變之mRNA或結構或功能可能或可能不改變之多肽。任何既定天然或重組基因可不具有對偶基因形式或具有1個或許多對偶基因形式。產生變異體之常見突變變化通常歸因於核苷酸之天然缺失、添加或取代。每一此等類型之變化可單獨或與其他變化組合在既定序列中發生一或多次。
所得多肽相對於彼此通常將具有顯著胺基酸一致性。多形性變異體為既定物種之個體之間的特定基因之聚核苷酸序列有變化。多形性變異體亦可涵蓋「單核苷酸多形現象」(SNP)或聚核苷酸序列有1個鹼基發生變化之單鹼基突變。SNP之存在可指示例如某一群體具有疾病狀態傾向，亦即對抗性之敏感性。
衍生聚核苷酸包括經受化學修飾(例如用烷基、醯基或胺基置換氫)之核酸。例如衍生寡核苷酸之衍生物可包含非天然存在之部分，諸如改變之糖部分或糖間鍵。此等中 之例示者為硫代磷酸酯及此項技術中已知之其他含硫物質。衍生核酸亦可含有標記，包括放射性核苷酸、酶、螢光劑、化學發光劑、顯色劑、受質、輔因子、抑制劑、磁性粒子及其類似物。
「衍生」多肽或肽為例如藉由糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、還原/烷基化、醯化、化學偶合、或適度福馬林(formalin)處理加以修飾之多肽或肽。衍生物亦可直接或間接經修飾以含有可偵測標記，包括(但不限於)放射性同位素、螢光標記及酶標記。
如本文所用，術語「動物」或「患者」意欲包括例如人類、綿羊、麌、鹿、長耳鹿(mule deer)、貂、哺乳動物、猴、馬、牛、豬、山羊、犬、貓、大鼠、小鼠、鳥類、雞、爬行動物、魚類、昆蟲及蜘蛛類動物。
「哺乳動物」涵蓋通常在醫療照護下之溫血哺乳動物(例如人類及馴化動物)。實例包括貓科動物、犬科動物、馬科動物、牛科動物及人類，以及僅人類。
「治療」涵蓋治療哺乳動物中之疾病狀態，且包括：(a)預防該疾病狀態在哺乳動物中發生，特定言之，當此哺乳動物易感染該疾病狀態但尚未診斷為患有其時；(b)抑制該疾病狀態，例如遏止其發展；及/或(c)減輕該疾病狀態，例如導致該疾病狀態之消退直至達到所要終點。治療亦包括改善疾病之症狀(例如減輕疼痛或不適)，其中此改善可能或可能不直接影響該疾病(例如病因、傳播、表現等)。
如本文所用，「癌症」係指哺乳動物中所見之所有類型 之癌症或贅瘤或惡性腫瘤，包括(但不限於)：白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌瘤及肉瘤。癌症以包含癌症之惡性細胞之「腫瘤」或組織形式顯現。腫瘤之實例包括肉瘤及癌瘤，諸如(但不限於)：纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤(mesothelioma)、尤因氏腫瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌(papillary carcinoma)、乳頭狀腺癌、囊腺癌(cystadenocarcinoma)、髓性癌(medullary carcinoma)、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨膜癌(choriocarcinoma)、精原細胞瘤(seminoma)、胚胎癌(embryonal carcinoma)、韋爾姆斯氏腫瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睾丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤(glioma)、星形細胞瘤(astrocytoma)、髓母細胞瘤(medulloblastoma)、顱咽管瘤(craniopharyngioma)、室管膜瘤(ependymoma)、松果腺瘤(pinealoma)、血管母細胞瘤(hemangioblastoma)、聽神經瘤、少枝膠質瘤(oligodendroglioma)、脊膜瘤、黑素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤。可藉由揭示之本發明組合物治療之其他癌症包括(但不限於)例如霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's Lymphoma)、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、乳癌、卵巢癌、肺癌、橫紋肌肉 瘤、原發性血小板增多症(primary thrombocytosis)、原發性巨球蛋白血症(primary macroglobulinemia)、小細胞肺腫瘤、原發性腦腫瘤、胃癌、結腸癌、惡性胰臟胰島素瘤(malignant pancreatic insulanoma)、惡性類癌、膀胱癌、胃癌、惡變前皮膚病變、睾丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、食道癌、生殖泌尿道癌、惡性高鈣血症(malignant hypercalcemia)、子宮頸癌、子宮內膜癌、腎上腺皮質癌及前列腺癌。
如本文所用，「神經疾病或病症」係指神經系統及/或視覺系統之任何疾病或病症。「神經疾病或病症」包括涉及中樞神經系統(腦、腦幹及小腦)、周邊神經系統(包括腦神經)及自主神經系統(其部分位於中樞神經系統與周邊神經系統兩者中)之疾病或病症。神經疾病或病症包括(但不限於)後天性癲癇狀失語症(acquired epileptiform aphasia)；急性播散性腦脊髓炎(acute disseminated encephalomyelitis)；腎上腺腦白質營養不良(adrenoleukodystrophy)；年齡相關之黃斑部變性(age-related macular degeneration)；胼胝體發育不全(agenesis of the corpus callosum)；認知障礙症(agnosia)；艾卡迪症候群(Aicardi syndrome)；亞歷山大病(Alexander disease)；阿爾珀斯病(Alpers' disease)；交替性偏癱(alternating hemiplegia)；阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)；血管性癡呆(Vascular dementia)；肌萎縮性側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)；無腦(anencephaly)；安琪曼症候群(Angelman syndrome)；血管瘤病(angiomatosis)； 缺氧症(anoxia)；失語症(aphasia)；精神性運動不能(apraxia)；蛛網膜囊腫(arachnoid cysts)；蛛網膜炎(arachnoiditis)；阿諾尼-加里畸形(Anronl-Chiari malformation)；動靜脈畸形(arteriovenous malformation)；亞斯伯格症候群(Asperger syndrome)；共濟失調毛細管擴張症(ataxia telegiectasia)；注意力不足過動症(attention deficit hyperactivity disorder)；自閉症(autism)；自主功能障礙(autonomic dysfunction)；背痛；巴登病(Batten disease)；白塞氏病(Behcet's disease)；貝爾氏麻痺(Bell's palsy)；良性原發性瞼痙攣(benign essential blepharospasm)；良性病灶(benign focal)；肌萎縮(amyotrophy)；良性顱內高壓；賓斯萬格氏病(Binswanger's disease)；瞼痙攣(blepharospasm)；布洛克-蘇茲貝格症候群(Bloch Sulzberger syndrome)；臂叢損傷(brachial plexus injury)；腦膿腫(brain abscess)；腦損傷；腦腫瘤(包括多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme))；脊椎腫瘤；布朗-塞卡爾症候群(Brown-Sequard syndrome)；卡納文病(Canavan disease)；腕隧道徵候群(carpal tunnel syndrome)；灼性神經痛(causalgia)；中樞性疼痛症候群；中央腦橋脊髓溶解(central pontine myelinolysis)；頭部病症；腦動脈瘤(cerebral aneurysm)；腦動脈硬化(cerebral arteriosclerosis)；腦萎縮(cerebral atrophy)；大腦性巨人症(cerebral gigantism)；大腦性麻痺(cerebral palsy)；夏科-馬里-圖斯病(Charcot-Marie-Tooth disease)；化學療法誘發之神經病及神經痛；加里畸形 (Chiari malformation)；舞蹈病(chorea)；慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)；慢性疼痛；慢性區域疼痛症候群；科芬-勞里症候群(Coffin Lowry syndrome)；昏迷(coma)，包括持續性增長狀態；先天性兩側面癱(congenital facial diplegia)；皮質基底核退化症(corticobasal degeneration)；顱動脈炎(cranial arteritis)；顱蓋骨折(craniosynostosis)；庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)；累積性損傷病症；庫欣氏症候群(Cushing's syndrome)；巨大細胞包涵體病(cytomegalic inclusion body disease)；細胞巨大病毒感染；舞蹈眼-舞蹈足症候群(dancing eyes-dancing feet syndrome)；丹尼沃克症候群(DandyWalker syndrome)；道森病(Dawson disease)；德莫斯特氏症候群(De Morsier's syndrome)；代哲因-科魯姆克麻痺(Dejerine-Klumke palsy)；癡呆；皮肌炎(dermatomyositis)；糖尿病性神經病變；彌漫性硬化症(diffuse sclerosis)；自主神經障礙(dysautonomia)；書寫困難(dysgraphia)；閱讀困難(dyslexia)；肌張力障礙(dystonias)；早期嬰兒癲癇腦病(early infantile epileptic encephalopathy)；空蝶鞍症候群(empty sella syndrome)；腦炎(encephalitis)；腦膨出(encephaloceles)；腦三叉血管瘤病(encephalotrigeminal angiomatosis)；癲癇症(epilepsy)；厄博氏麻痺(Erb's palsy)；原發性震顫(essential tremor)；法布瑞氏病(Fabry's disease)；華氏症候群(Fahr's syndrome)；暈厥(fainting)；家族性痙攣性麻 痺(familial spastic paralysis)；熱性發作(febrile seizures)；費雪症候群(Fisher syndrome)；弗里德棘希氏共濟失調(Friedreich's ataxia)；額顳葉型癡呆及其他「τ病變」(fronto-temporal dementia and other「tauopathies」)；高雪氏病(Gaucher's disease)；格斯特曼氏症候群(Gerstmann's syndrome)；巨細胞動脈炎(giant cell arteritis)；巨細胞性包涵體病(giant cell inclusion disease)；球狀細胞白血質障礙(globoid cell leukodystrophy)；古立安-白瑞症候群(Guillain-Barre syndrome)；HTLV-1相關之脊髓病(HTLV-1-associated myelopathy)；哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)；頭部損傷；頭痛；半面痙攣(hemifacial spasm)；遺傳性痙孿性截癱(hereditary spastic paraplegia)；多神經炎型遺傳性共濟失調(heredopathia atactic a polyneuritiformis)；耳部帶狀疱疹(herpes zoster oticus)；帶狀疱疹(herpes zoster)；平山症候群(Hirayama syndrome)；HIV相關之癡呆及神經病(亦為AIDS之神經學表現)；前腦無裂畸形(holoprosencephaly)；亨廷頓氏病(Huntington's disease)及其他聚麩醯胺酸重複疾病；腦內積水(hydranencephaly)；腦積水(hydrocephalus)；高皮質醇症(hypercortisolism)；低氧(hypoxia)；免疫介導之腦脊髓炎；包涵體肌炎；色素失調症(incontinentia pigmenti)；嬰兒植烷酸儲積病(infantile phytanic acid storage disease)；嬰兒雷夫蘇姆病(infantile refsum disease)；嬰兒痙攣症(infantile spasms)；發炎性肌病；顱內囊腫；顱內 高壓；喬伯特症候群(Joubert syndrome)；卡恩斯-塞爾症候群(Keams-Sayre syndrome)；肯尼迪病(Kennedy disease)金斯布恩症候群(Kinsboume syndrome)；克利佩爾-費爾症候群(Klippel Feil syndrome)；克拉培病(Krabbe disease)；庫格爾貝格-韋蘭德病(Kugelberg-Welander disease)；庫魯症(kuru)；拉弗拉病(Lafora disease)；蘭伯特-伊頓重肌無力症候群(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)；蘭道-科萊弗勒症候群(Landau-Kleffner syndrome)；側髓(瓦倫伯格)症候群(lateral 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syndrome)。弗里德棘希氏共濟失調(Freidrichs Ataxia)為欲用本發明之寡核苷酸治療之較佳疾病。
「增生性疾病或病症」包括(但不限於)涉及由骨髓、淋巴或紅血球譜系產生之造血來源之增生性/贅生性細胞或其前驅細胞的造血贅生性病症。此等包括(但不限於)紅血球母細胞白血病；急性前骨髓白血病(APML)；慢性骨髓性白血病(CML)；淋巴惡性疾病，包括(但不限於)急性淋巴母細胞白血病(ALL)(其包括B譜系ALL及T譜系ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、前淋巴細胞性白血病(PLL)；毛細胞白血病(HLL)及瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia，WM)。其他形式之惡性淋巴瘤包括(但不限於)非霍奇金淋巴瘤及其變異體，周邊T細胞淋巴瘤、成人T細胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)、大顆粒淋巴細胞性白血病(LGF)，霍奇金氏病及李特-斯頓伯格病(Reed-Sternberg disease)。
聚核苷酸及寡核苷酸組合物及分子
目標：在一個實施例中，目標包含共濟蛋白(FXN)之核酸序列，包括(不限於)與FXN相關之有義及/或反義非編碼及/或編碼序列。
FXN共濟蛋白為一種編碼屬於共濟蛋白家族之粒線體蛋白質之核基因。該蛋白質起調節粒線體鐵轉運及呼吸之作用。內含子三核苷酸重複GAA之擴增會產生弗里德棘希共濟失調。替代性剪接發生在此基因座處且已鑑別編碼不同同功異型物之兩個轉錄本變異體。
共濟蛋白之缺陷為弗里德棘希共濟失調(FRDA)之病因。FRDA為一種特徵在於神經退化及心肌病變之常染色體隱性進行性退化疾病，其為最常見之遺傳性共濟失調。該病症通常在青春期之前顯現且特徵通常在於肢體運動不協調、發音困難、眼球震顫、腱反射減弱或不存在、巴賓斯基跡象(babinski sign)、位置及振動感覺損害、脊柱側凸、弓形足(pes cavus)及趾上弓(hammer toe)。在大多數患者中，FRDA歸因於共濟蛋白基因之第一內含子中之GAA三聯體重複擴增，但在一些情況下，該疾病歸因於編碼區中之突變。
弗里德棘希氏共濟失調(FRDA)為最常見之常染色體隱性共濟失調，發病率為1：50 000。與常染色體顯性脊髓小腦共濟失調類似，該疾病之主要臨床徵象為協調喪失及步態不穩。然而，肥厚性心肌病變及胰島素抗性亦常見於FRDA中。
FRDA通常由共濟蛋白基因之第一內含子中之(GAA)n三聯體重複的兩個經擴增對偶基因之遺傳引起。認為擴增會部分抑制轉錄延伸或凝縮染色質結構並因此降低共濟蛋白蛋白質表現。FRDA之嚴重性與發病年齡兩者均直接與較小GAA擴增之規模相關。
認為共濟蛋白會支持鐵-硫叢集之生物發生(biogenesis)，因為其缺陷會特定影響鐵-硫叢集酶且因為與其相互作用的ISCU被認為為於其上構建鐵-硫叢集之主要骨架。活體外研究證明共濟蛋白與含有酶：粒線體烏頭酸酶(aconitase)及亞鐵螯合酶(ferrochelatase)(哺乳動物中之一種ISC蛋白質)之鐵-硫叢集相互作用，而在酵母及線蟲(Caenorhabditis elegans)中，其與丁二酸去氫酶相互作用。減弱共濟蛋白訊息物之基因表現會導致鐵-硫叢集蛋白質之成熟降低。對人類細胞之微陣列分析已顯示消除共濟蛋白會優先影響鐵-硫叢集相關轉錄本。
表1展示與人類共濟蛋白相關之粒線體蛋白質之一實例。
在一個實施例中，反義寡核苷酸用於預防或治療與異常共濟蛋白表現及/或功能相關之疾病或病症。此包括所有形式之共濟蛋白分子，包括突變體及表現或功能異常之正常或異常共濟蛋白分子。
廣泛範圍之疾病或病症可歸因於共濟蛋白之表現或功能異常，因為共濟蛋白與多種粒線體蛋白質及其他在生理上重要之分子，諸如在鐵-硫叢集生物發生及修復、鐵轉運及代謝、及抗氧化作用方面重要之分子締合。共濟蛋白亦與粒線體伴隨蛋白GRP75/壽命蛋白；粒線體伴隨蛋白HSP60相互作用。HSP60為GRP75之一種已知相互作用物且連同HSPlO一起形成粒線體伴侶蛋白(chaperonin)複合物。
共濟蛋白亦與包埋於線粒體內膜中之酶複合物丁二酸去氫酶相互作用，從而與基質而非膜間間隙相互作用。
共濟蛋白與已證明為真核Nfs lIISeD鐵-硫生物發生複合物之組分之ISD11直系同源物相互作用。因此，共濟蛋白之任何缺陷(例如表現、功能缺陷)皆將影響眾多細胞內過程。
反義之特異性及敏感性亦由熟習此項技術者利用以達成治療用途。反義寡核苷酸已在動物及人類中之疾病狀態之治療中用作治療部分。反義寡核苷酸已向人類安全且有效投與且眾多臨床試驗目前正在進行中。因此確定寡核苷酸可為可經組態以適用於治療細胞、組織及動物，尤其人類之治療方案的適用治療模態(therapeutic modality)。
在一實施例中，反義寡核苷酸用於預防或治療與FXN家族成員相關之疾病或病症。可用自使用反義化合物獲得之幹細胞再生之細胞/組織治療的例示性共濟蛋白(FXN)介導之疾病及病症包含：與FXN之異常功能及/或表現相關之疾病或病症、弗里德棘希氏共濟失調、雷氏症候群(Leigh's syndrome)、癌症、增生性疾病或病症、異常細胞增殖、神經疾病或病症、與粒線體功能受損相關之疾病或病症、由後天粒線體功能障礙引起之神經退化性疾病或病症、與氧化壓力相關之疾病或病症、發炎及自體免疫疾病或病症。
在一實施例中，向有需要之患者投與一或多種反義寡核苷酸對FXN進行調節以預防或治療與相較於正常對照FXN表現、功能、活性異常相關的任何疾病或病症。
在一實施例中，寡核苷酸對包括(不限於)非編碼區之FXN之聚核苷酸具有特異性。FXN目標包含FXN之變異體；FXN之突變體，包括SNP；FXN之非編碼序列；對偶基因、片段及其類似物。較佳地，寡核苷酸為反義RNA分子。
根據本發明之實施例，目標核酸分子不僅僅限於FXN聚核苷酸而且擴展至FXN之同功異型物、受體、同源物、非編碼區域及其類似物中之任一者。
在一實施例中，寡核苷酸靶向FXN目標之天然反義序列(編碼及非編碼區之天然反義)，包括(不限於)其變異體、對偶基因、同源物、突變體、衍生物、片段及互補序列。 較佳地，寡核苷酸為反義RNA或DNA分子。目標核酸分子本身見於「生物系統」中且本發明包括用本發明之寡核苷酸治療此等生物系統。術語「一或多種生物系統」廣泛包括用於監測目標蛋白質之表現之患者及/或其他活生物體以及細胞及/或細胞模型。本發明之寡核苷酸適用於活體內及活體外。
在一實施例中，本發明之寡聚化合物亦包括不同鹼基存在於化合物中之一或多個核苷酸位置的變異體。舉例而言，若最初核苷酸為腺嘌呤，則可產生在此位置含有胸苷、鳥苷、胞苷或其他天然或非天然核苷酸之變異體。此可在反義化合物之任何位置進行。接著使用本文所述之方法測試此等化合物以確定其抑制目標核酸表現之能力。
在一些實施例中，反義化合物與目標之間的同源性、序列一致性或互補性為約50%至約60%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為約60%至約70%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為約70%至約80%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為約80%至約90%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。
當反義化合物與目標核酸之結合會干擾目標核酸之正常功能以致活性損失，且存在足夠程度之互補性以避免該反義化合物與非目標核酸序列在特異性結合所要之條件下進行非特異性結合時，該反義化合物為可特異性雜交的。此 等條件包括亦即在活體內分析或治療性治療之情況下的生理條件及在活體外分析之情況下進行分析的條件。
當反義化合物(無論DNA、RNA、嵌合物、經取代之反義化合物等)與目標DNA或RNA分子之結合會干擾目標DNA或RNA之正常功能以致效用損失，且存在足夠程度之互補性以避免該反義化合物與非目標序列在特異性結合所要之條件下(亦即在活體內分析或治療性治療之情況下為在生理條件下，及在活體外分析之情況下為在進行分析之條件下)進行非特異性結合時，該反義化合物為可特異性雜交的。
在一實施例中，靶向FXN，包括(但不限於)使用例如PCR、雜交等鑑別及擴增之反義序列；一或多種如SEQ ID NO：2闡述之序列及其類似物可調節FXN之表現或功能。在一個實施例中，相較於對照，表現或功能經上調。在一實施例中，相較於對照，表現或功能經下調。
在一實施例中，寡核苷酸包含如SEQ ID NO：3至6闡述之核酸序列，包括使用例如PCR、雜交等鑑別及擴增之反義序列。此等寡核苷酸可包含一或多個經修飾之核苷酸、較短或較長片段、經修飾之鍵及其類似物。經修飾之鍵或核苷酸間鍵聯之實例包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或其類似物。在一實施例中，核苷酸包含磷衍生物。可與本發明之經修飾之寡核苷酸中的糖或糖類似部分連接之磷衍生物(或經修飾之磷酸酯基)可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、烷磷酸酯、硫代磷酸酯及其類似物。 製備以上指示之磷酸酯類似物及將其併入核苷酸、經修飾之核苷酸及寡核苷酸中本身亦為已知的且無需在此處加以描述。
反義之特異性及敏感性亦由熟習此項技術者利用以達成治療用途。反義寡核苷酸已在動物及人類中之疾病狀態之治療中用作治療部分。反義寡核苷酸已向人類安全且有效投與且眾多臨床試驗目前正在進行中。因此確定寡核苷酸可為可經組態以適用於治療細胞、組織及動物，尤其人類之治療方案的適用治療模態。
在本發明之實施例中，寡聚反義化合物，特定言之寡核苷酸與目標核酸分子結合且調節由目標基因編碼之分子之表現及/或功能。將會受到干擾之DNA功能包含例如複製及轉錄。將會受到干擾之RNA功能包含所有生命功能，諸如RNA向蛋白質轉譯位點之易位、蛋白質自RNA之轉譯、RNA之剪接以產生一或多種mRNA物質及RNA可參與或促進之催化活性。視所要功能而定，功能可經上調或抑制。
反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部引導序列(EGS)寡核苷酸、選擇性剪接物、引子、探針及與至少一部分目標核酸雜交之其他寡聚化合物。因而，此等化合物可呈單股、雙股、部分單股、或環形寡聚化合物形式引入。
在本發明之情形下，使反義化合物靶向特定核酸分子可為多步驟過程。該過程通常始於鑑別功能欲調節之目標核酸。此目標核酸可為例如表現與特定病症或疾病狀態相關 之細胞基因(或由基因轉錄之mRNA)、或來自感染物之核酸分子。在本發明中，目標核酸編碼共濟蛋白(FXN)。
靶向過程通常亦包括確定目標核酸內之用於發生反義相互作用以便產生所要效應(例如調節表現)的至少一個目標區域、區段或位點。在本發明之情形內，術語「區域」定義為目標核酸中具有至少一種可鑑別結構、功能或特徵的一部分。在目標核酸之區域內者為區段。「區段」定義為目標核酸內區域之較小部分或子部分。如本發明中使用之「位點」定義為目標核酸內之位置。
在一實施例中，反義寡核苷酸與共濟蛋白(FXN)之天然反義序列(SEQ ID NO：2)結合且調節FXN(SEQ ID NO：1)之表現及/或功能。反義序列之實例包括SEQ ID NO：3至6。
在一實施例中，反義寡核苷酸與共濟蛋白(FXN)聚核苷酸之一或多個區段結合且調節FXN之表現及/或功能。區段包含FXN有義或反義聚核苷酸之至少5個連續核苷酸。
在一實施例中，反義寡核苷酸對FXN之天然反義序列具有特異性，其中寡核苷酸與FXN之天然反義序列之結合會調節FXN之表現及/或功能。
在一實施例中，寡核苷酸化合物包含如SEQ ID NO：3至6闡述之序列、使用例如PCR、雜交等鑑別及擴增之反義序列。此等寡核苷酸可包含一或多個經修飾之核苷酸、較短或較長片段、經修飾之鍵及其類似物。經修飾之鍵或核苷酸間鍵聯之實例包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或其類似物。在一實施例中，核苷酸包含磷衍生物。可與本發明 之經修飾之寡核苷酸中的糖或糖類似部分連接之磷衍生物(或經修飾之磷酸酯基)可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、烷磷酸酯、硫代磷酸酯及其類似物。製備以上指示之磷酸酯類似物及將其併入核苷酸、經修飾之核苷酸及寡核苷酸中本身亦為已知的且無需在此處加以描述。
如此項技術中已知，因為轉譯起始密碼子通常為5'-AUG(在轉錄之mRNA分子中；在相應DNA分子中為5'-ATG)，所以轉譯起始密碼子亦稱為「AUG密碼子」、「起始密碼子」或「AUG起始密碼子」。少數基因具有之轉譯起始密碼子具有RNA序列5'-GUG、5'-UUG或5'-CUG；且5'-AUA、5'-ACG及5'-CUG已顯示在活體內起作用。因此，術語「轉譯起始密碼子」及「起始密碼子」可涵蓋許多密碼子序列，即使在各情況下之起始胺基酸通常為甲硫胺酸(在真核生物中)或甲醯甲硫胺酸(在原核生物中)。真核及原核基因可具有兩個或兩個以上替代性起始密碼子，其任一者可優先用於在特定細胞類型或組織中或在特定條件集合下起始轉譯。在本發明之情形下，「起始密碼子」及「轉譯起始密碼子」係指在活體內用於起始由編碼共濟蛋白(FXN)之基因所轉錄之mRNA的轉譯之密碼子，無論此等密碼子之序列如何。基因之轉譯終止密碼子(或「終止密碼子」)可具有以下三個序列之一：亦即5'-UAA、5'-UAG及5'-UGA(相應DNA序列分別為5'-TAA、5'-TAG及5'-TGA)。
術語「起始密碼子區域」及「轉譯起始密碼子區域」係指涵蓋自轉譯起始密碼子開始在任一方向(亦即5'或3')上之約25至約50個鄰接核苷酸之該種mRNA或基因的一部分。類似地，術語「終止密碼子區域」及「轉譯終止密碼子區域」係指涵蓋自轉譯終止密碼子開始在任一方向(亦即5'或3')上之約25至約50個鄰接核苷酸之該種mRNA或基因的一部分。因此，「起始密碼子區域」(或「轉譯起始密碼子區域」)及「終止密碼子區域」(或「轉譯終止密碼子區域」)為可用本發明之反義化合物有效靶向之所有區域。
此項技術中已知之指代轉譯起始密碼子與轉譯終止密碼子之間的區域之開放閱讀框架(ORF)或「編碼區」亦為可經有效靶向之區域。在本發明之情形內，靶向區域為涵蓋基因之開放閱讀框架(ORF)之轉譯起始或終止密碼子的基因內區域。
另一目標區域包括此項技術中已知之指代自轉譯起始密碼子開始在5'方向上之mRNA之一部分，且因此包括mRNA之5'帽蓋位點(cap site)與轉譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上之相應核苷酸)之5'未轉譯區域(5'UTR)。另一目標區域包括此項技術中已知之指代自轉譯終止密碼子開始在3'方向上之mRNA之一部分，且因此包括mRNA之轉譯終止密碼子與3'端之間的核苷酸(或基因上之相應核苷酸)之3'未轉譯區域(3'UTR)。mRNA之5'帽蓋位點包含經由5'-5'三磷酸酯鍵與mRNA之最5'端殘基接合之N7-甲基化鳥苷殘基。認為mRNA之5'帽蓋區域包括5'帽蓋結構自身以及鄰近於帽 蓋位點之前50個核苷酸。用於本發明之另一目標區域為5'帽蓋區域。
儘管一些真核mRNA轉錄本經直接轉譯，但許多含有一或多個稱為「內含子」之區域，其在轉譯之前自轉錄本切除。其餘(且因此經轉譯)區域稱為「外顯子」且一起剪接以形成連續mRNA序列。在一個實施例中，靶向剪接位點，亦即內含子-外顯子接合點或外顯子-內含子接合點尤其適用於疾病中牽涉異常剪接或疾病中牽涉特定剪接產物之過度產生的情況中。歸因於重排或缺失之異常融合接合點為目標位點之另一實施例。經由來自不同基因來源之2個(或2個以上)mRNA之剪接過程產生之mRNA轉錄本稱為「融合轉錄本」。可使用靶向例如DNA或前mRNA之反義化合物有效靶向內含子。
在一實施例中，反義寡核苷酸與目標聚核苷酸之編碼及/或非編碼區結合且調節目標分子之表現及/或功能。
在一實施例中，反義寡核苷酸與天然反義聚核苷酸結合且調節目標分子之表現及/或功能。
在一實施例中，反義寡核苷酸與有義聚核苷酸結合且調節目標分子之表現及/或功能。
替代性RNA轉錄本可自DNA之相同染色體組區域產生。此等替代性轉錄本通常稱為「變異體」。更詳言之，「前mRNA變異體」為自相同染色體組DNA產生之的轉錄本，不同於在其起始或終止位置中自相同染色體組DNA產生之其他轉錄本轉錄本且含有內含子與外顯子序列兩者。
在剪接期間切除一或多個外顯子或內含子區域或其部分之時，前mRNA變異體產生較小「mRNA變異體」。因此，mRNA變異體為經加工之前mRNA變異體且各獨特前mRNA變異體由於剪接而必定始終產生獨特mRNA變異體。此等mRNA變異體亦稱為「替代性剪接變異體」。若不發生前mRNA變異體之剪接，則前mRNA變異體與mRNA變異體相同。
變異體可經由使用替代性信號以起始或終止轉錄來產生。前mRNA及mRNA可具有1個以上起始密碼子或終止密碼子。源於前mRNA或mRNA之使用替代性起始密碼子之變異體稱為彼前mRNA或mRNA之「替代性起始變異體」。使用替代性終止密碼子之彼等轉錄本稱為彼前mRNA或mRNA之「替代性終止變異體」。一種特定類型之替代性終止變異體為「polyA變異體」，其中產生之多個轉錄本由藉由轉錄機構對1個「polyA終止信號」進行替代性選擇，藉此產生在獨特polyA位點處終止之轉錄本來產生。在本發明之情形內，本文所述之變異體類型亦為目標核酸之實施例。
目標核酸上與反義化合物雜交之位置定義為目標區域中由活性反義化合物靶向之長度至少5個核苷酸的部分。
儘管某些例示性目標區段之特定序列闡述於本文中，但熟習此項技術者應認知此等序列用於說明及描述在本發明範疇內之特定實施例。其他目標區段可輕易由一般技術者鑒於本揭示而鑑別。
包含選自說明性較佳目標區段內至少五個(5個)連續核苷酸段的長度5-100個核苷酸之目標區段亦視為適用於靶向。
目標區段可包括DNA或RNA序列，其包含一個說明性較佳目標區段之5'端之至少5個連續核苷酸(其餘核苷酸為相同DNA或RNA之連續段，緊接著目標區段之5'端之上游開始且延續至DNA或RNA含有約5至約100個核苷酸)。類似較佳目標區段由DNA或RNA序列表示，其包含一個說明性較佳目標區段之3'端之至少5個連續核苷酸(其餘核苷酸為相同DNA或RNA之連續段，緊接著目標區段之3'端之下游開始且延續至DNA或RNA含有約5至約100個核苷酸)。熟習技術者由本文說明之目標區段將無需過度實驗能夠鑑別其他較佳目標區段。
一旦一或多個目標區域、區段或位點已經鑑別，即選擇充分互補於目標(亦即充分良好雜交)且具有充分特異性之反義化合物以產生所要效應。
在本發明之實施例中，寡核苷酸與特定目標之反義股結合。寡核苷酸的長度為至少5個核苷酸且可經合成以使各寡核苷酸靶向重疊序列，因而合成寡核苷酸來涵蓋目標聚核苷酸之整個長度。目標亦包括編碼以及非編碼區域。
在一個實施例中，較佳用反義寡核苷酸靶向特定核酸。使反義化合物靶向特定核酸分子為多步驟過程。該過程通常以鑑別欲調節功能之核酸序列開始。例如，此序列可為表現與特定病症或疾病狀態相關之細胞基因(或由基因轉 錄之mRNA)，或非編碼聚核苷酸，諸如非編碼RNA(ncRNA)。
RNAs可分類成(1)信使RNA(mRNAs)，其轉譯成蛋白質，及(2)不編碼蛋白質之RNA(ncRNAs)。ncRNAs包含微RNAs、反義轉錄本及其他含有高密度終止密碼子及缺乏任何段「開放閱讀框架」之轉錄單元(TU)。許多ncRNA似乎自編碼蛋白質之基因座之3'非轉譯區域(3'UTRs)中的起始位點起始。ncRNAs通常稀少且至少半數已由FANTOM協會定序之ncRNAs似乎不聚腺苷酸化。大多數研究人員已出於明顯原因集中於經加工且排出至細胞質中之聚腺苷酸化mRNAs。近來，已顯示非聚腺苷酸化核RNAs之集合可能極大，且許多此等轉錄本係由所謂基因間區域產生。ncRNAs可調節基因表現之機制係藉由與目標轉錄本之鹼基配對。藉由鹼基配對作用之RNAs可分組成(1)順式編碼RNAs，其在相同遺傳位置但在其所作用之RNAs之相對股上編碼且因此顯示與其目標完全互補，及(2)反式編碼RNAs，其在不同於其所作用之RNAs之染色體位置編碼且通常不展現與其目標之完全鹼基配對潛力。
在不希望受理論束縛之情況下，本文所述之反義寡核苷酸對反義聚核苷酸之擾動可改變相應有義信使RNAs之表現。然而，此調節可能不一致(反義減弱(knockdown)導致信使RNA升高)或一致(反義減弱導致伴隨信使RNA降低)。在此等情況下，反義寡核苷酸可靶向反義轉錄本之重疊或非重疊部分，導致其減弱或螯合(sequestration)。編碼以及 非編碼反義可以相同方式靶向且任一種類能夠以一致或不一致方式調節相應有義轉錄本。用於鑑別對抗目標之新穎寡核苷酸之策略可基於藉由反義寡核苷酸或調節所欲目標之任何其他手段減弱反義RNA轉錄本。
策略1：在不一致調節之情況下，減弱反義轉錄本使得習知(有義)基因之表現升高。若習知基因編碼已知或推定之藥物目標，則減弱其反義對應物可以想像模擬受體促效劑或酶刺激劑之作用。
策略2：在一致調節之情況下，可相伴減弱反義與有義轉錄本兩者且藉此達成協同降低習知(有義)基因表現。例如，若使用反義寡核苷酸以達成減弱，則可使用此策略以施用一靶向有義轉錄本之反義寡核苷酸及另一靶向相應反義轉錄本之反義寡核苷酸，或同時靶向重疊有義及反義轉錄本之單一有力對稱反義寡核苷酸。
根據本發明，反義化合物包括反義寡核苷酸、核糖核酸酶、外部引導序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單股或雙股RNA干擾(RNAi)化合物(諸如siRNA化合物)、及其他與至少一部分目標核酸雜交且調節其功能之寡聚化合物。因而，其可為DNA、RNA、DNA樣、RNA樣或其混合物，或可為此等之一或多者之模擬物。此等化合物可為單股、雙股、環形或髮夾寡聚化合物且可含有結構元件，諸如內部或端部突起、錯配或環。反義化合物以線性形式按常規方式製備但可經連接或另外製備成環形及/或分支狀。反義化合物可包括構築體，諸如雜交形成完全或部分 雙股化合物之兩股或具有足夠自身互補性以允許雜交及形成完全或部分雙股化合物之單股。兩股可內部連接，從而留下自由3'或5'端；或可連接形成連續髮夾結構或環。髮夾結構可在5'或3'端上含有突出物，從而產生具有單股特性之延伸部分。雙股化合物視情況可在端上包括突出物。其他修飾可包括與一端、所選核苷酸位置、糖位置或1個核苷間鍵聯連接之結合基團。或者，兩股可經由非核酸部分或連接基團連接。當僅由一股形成時，dsRNA可採用在自身上對折以形成雙螺旋之自身互補性髮夾型分子的形式。因此，dsRNAs可為完全或部分雙股。基因表現可藉由在轉殖基因細胞株中穩定表現dsRNA髮夾來特定調節，然而，在一些實施例中，基因表現或功能經上調。當由兩股、或採用在自身上對折以形成雙螺旋之自身互補性髮夾型分子形式的單股形成時，兩股(或單股之雙螺旋形成區域)為以華特生-克里克方式進行鹼基配對之互補RNA股。
一旦引入系統中，本發明化合物可引發一或多種酶或結構蛋白之作用以實現目標核酸之裂解或其他修飾或可經由基於占位性(occupancy-based)之機制起作用。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可描述為「DNA樣」(亦即通常具有一或多個2'-去氧糖且通常具有T鹼基而非U鹼基)或「RNA樣」(亦即通常具有一或多個2'-羥基或2'-經修飾之糖且通常具有U鹼基而非T鹼基)。核酸螺旋可採用一種以上類型之結構，最常見為A形式及B形式。咸信，一般而言，具有B形式樣結構之寡核苷酸為「DNA樣」且具有A形式樣 結構之寡核苷酸為「RNA樣」。在一些(嵌合)實施例中，反義化合物可含有A形式區域與B形式區域兩者。
在一實施例中，所要寡核苷酸或反義化合物包含以下至少一者：反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、包含經修飾之鍵之反義寡核苷酸、干擾RNA(RNAi)、短干擾RNA(siRNA)；微型干擾RNA(miRNA)；小時序RNA(small,temporal RNA)(stRNA)；或短髮夾RNA(shRNA)；小RNA誘導之基因活化(RNAa)；小活化性RNA(saRNA)或其組合。
dsRNA亦可活化基因表現，一種已稱為「小RNA誘導之基因活化」或RNAa之機制。靶向基因啟動子之dsRNA誘導相關基因之強力轉錄活化。RNAa係使用稱為「小活化性RNA」(saRNA)之合成dsRNA在人類細胞中得以證明。當前未知在其他有機體中，RNAa是否保守。
已發現諸如小干擾RNA(siRNA)及微RNA(miRNA)之小雙股RNA(dsRNA)為稱為RNA干擾(RNAi)之進化保守機制的觸發物。RNAi總是經由重塑染色質以藉此抑制轉錄、降解互補mRNA、或減弱蛋白質轉譯來導致基因靜止。然而，在隨後實例章節中詳述之情況下，寡核苷酸顯示會增加共濟蛋白(FXN)聚核苷酸及其編碼產物的表現及/或功能。dsRNA亦可充當小活化性RNA(saRNA)。在不希望受理論束縛之情況下，藉由靶向基因啟動子中之序列，saRNA將誘導目標基因表現，這種現象稱為dsRNA誘導之轉錄活化(RNAa)。
在另一實施例中，本文中鑑別之「較佳目標區段」可用於對調節共濟蛋白(FXN)聚核苷酸之表現之其他化合物的篩檢中。「調節劑」為減少或增加編碼FXN之核酸分子之表現且包含互補於較佳目標區段之至少含5個核苷酸之部分的彼等化合物。篩檢方法包含以下步驟：使編碼FXN之有義或天然反義聚核苷酸之核酸分子的較佳目標區段與一或多種候選調節劑接觸，及選擇一或多種減少或增加編碼FXN聚核苷酸之核酸分子之表現的候選調節劑，例如SEQ ID NO：3至6。一旦顯示候選調節劑能夠調節(例如減少或增加)編碼FXN聚核苷酸之核酸分子之表現，調節劑即可接著用於FXN聚核苷酸之功能之其他探索研究中，或用作根據本發明之研究藥劑、診斷藥劑或治療藥劑。
靶向天然反義序列較佳調節目標基因之功能。舉例而言，FXN基因(例如寄存編號NM_181425)。在一實施例中，目標為FXN基因之反義聚核苷酸。在一實施例中，反義寡核苷酸靶向FXN聚核苷酸(例如寄存編號NM_181425)之有義及/或天然反義序列、其變異體、對偶基因、同功異型物、同源物、突變體、衍生物、片段及互補序列。較佳地，寡核苷酸為反義分子且目標包括反義及/或有義FXN聚核苷酸之編碼及非編碼區。
本發明之較佳目標區段亦可與本發明之其各別互補反義化合物組合以形成穩定化雙股(雙螺旋)寡核苷酸。
在此項技術中，此等雙股寡核苷酸部分已顯示會經由反義機制調節目標表現且調節轉譯以及RNA加工。此外，雙 股部分可經受化學修飾。舉例而言，此等雙股部分已顯示會藉由雙螺旋之反義與目標進行經典雜交，藉此觸發目標之酶促降解來抑制目標。
在一實施例中，反義寡核苷酸靶向共濟蛋白(FXN)聚核苷酸(例如寄存編號NM_181425)、其變異體、對偶基因、同功異型物、同源物、突變體、衍生物、片段及互補序列。較佳地，寡核苷酸為反義分子。
根據本發明之實施例，目標核酸分子不僅僅限於FXN而且擴展至FXN分子之同功異型物、受體、同源物及其類似物中之任一者。
在一實施例中，寡核苷酸靶向FXN聚核苷酸之天然反義序列(例如如SEQ ID NO：2闡述之聚核苷酸)及其任何變異體、對偶基因、同源物、突變體、衍生物、片段及互補序列。反義寡核苷酸之實例係如SEQ ID NO：3至6所闡述。
在一個實施例中，寡核苷酸互補於或結合FXN反義之核酸序列，包括(不限於)與FXN聚核苷酸相關之非編碼有義及/或反義序列，且調節FXN分子之表現及/或功能。
在一實施例中，寡核苷酸互補於或結合如SEQ ID NO：2闡述之FXN天然反義之核酸序列，且調節FXN分子之表現及/或功能。
在一實施例中，寡核苷酸包含SEQ ID NO：3至6之至少5個連續核苷酸之序列且調節FXN分子之表現及/或功能。
聚核苷酸目標包含FXN，包括其家族成員、FXN之變異體；FXN之突變體，包括SNP；FXN之非編碼序列；FXN 之對偶基因；物種變異體、片段及其類似物。較佳地，寡核苷酸為反義分子。
在一實施例中，靶向FXN聚核苷酸之寡核苷酸包含：反義RNA、干擾RNA(RNAi)、短干擾RNA(siRNA)；微型干擾RNA(miRNA)；小時序RNA(stRNA)；或短髮夾RNA(shRNA)；小RNA誘導之基因活化(RNAa)；或小活化性RNA(saRNA)。
在一實施例中，靶向共濟蛋白(FXN)天然反義轉錄本(例如SEQ ID NO：2)及/或FXN之其他天然反義轉錄本係藉由投與結合此等目標且調節此等目標之表現或功能之寡核苷酸來達成。在一個實施例中，相較於對照，表現或功能經上調。在另一實施例中，相較於對照，表現或功能經下調。
在一實施例中，反義化合物包含如SEQ ID NO：3至6闡述之序列。此等寡核苷酸可包含一或多個經修飾之核苷酸、較短或較長片段、經修飾之鍵及其類似物。
在一實施例中，SEQ ID NO：3至6包含一或多個LNA核苷酸。表2展示適用於本發明方法中之例示性反義寡核苷酸。
＊指示硫代磷酸酯鍵。+指示在指定之核糖核酸之核糖部 分上具有2'-O-4'-亞甲基鍵聯之LNA。為避免歧義，此LNA具有下式：
Figure TWI678375B_D0003
 其中B為特定指定鹼基。
可以此項技術中已知之若干方式調節所要目標核酸。舉例而言，反義寡核苷酸、siRNA等。酶促核酸分子(例如核糖核酸酶)為能夠催化多種反應之一或多者，包括能夠以核苷酸鹼基序列特異性方式重複裂解其他各別核酸分子之核酸分子。此等酶促核酸分子可用於例如靶向實際上任何RNA轉錄本。
反式裂解酶促核酸分子由於其序列特異性而有希望作為人類疾病之治療劑。酶促核酸分子可經設計以裂解在細胞RNA之背景內之特定RNA目標。該種裂解事件致使mRNA為非功能性的且取消自彼RNA表現蛋白質。以此方式，可選擇性抑制與疾病狀態相關之蛋白質之合成。
一般而言，具有RNA裂解活性之酶促核酸藉由首先與目標RNA結合而起作用。此結合經由酶促核酸之目標結合部分發生，該目標結合部分保持密切鄰近於分子之起裂解目標RNA作用之酶促部分。因此，酶促核酸首先識別目標 RNA且接著經由互補鹼基配對結合目標RNA，且一旦與正確位點結合，即以酶促方式起作用來切割目標RNA。該種目標RNA之關鍵裂解將破壞其引導合成編碼蛋白質的能力。在酶促核酸已結合並裂解其RNA目標之後，其自彼RNA釋放以搜尋另一目標且可重複結合並裂解新目標。
諸如活體外選擇(進化)策略(Orgel,(1979)Proc.R.Soc.London,B 205,435)之若干方法已用於開發能夠催化多種反應，諸如裂解及連接磷酸二酯鍵及醯胺鍵之新穎核酸催化劑。
開發催化活性最佳之核糖核酸酶將顯著有助於採用RNA裂解核糖核酸酶達成調節基因表現之目的的任何策略。錘頭狀核糖核酸酶例如在飽和(10 mM)濃度之Mg2+輔因子存在下以約1 min-1之催化速率(kcat)起作用。人工「RNA連接酶」核糖核酸酶已顯示會以約100 min-1之速率催化相應自身修飾反應。此外，已知具有由DNA構成之受質結合臂之某些經修飾之錘頭狀核糖核酸酶會以近似100 min-1之多個轉換速率催化RNA裂解。最後，用某些核苷酸類似物置換錘頭之催化核心內之特定殘基會產生顯示催化速率改良多達10倍之經修飾之核糖核酸酶。此等研究結果證明核糖核酸酶可以顯著大於大多數天然自身裂解核糖核酸酶在活體外顯示之催化速率的催化速率促進化學轉化。那麼有可能某些自身裂解核糖核酸酶之結構可經最佳化以產生最大催化活性，或可製備顯示顯著較快之RNA磷酸二酯裂解速率之完全新穎的RNA基元。
RNA催化劑對RNA受質之符合「錘頭」模型之分子間裂解首先顯示於1987年(Uhlenbeck,O.C.(1987)Nature,328：596-600)。回收RNA催化劑且使其與多個RNA分子反應，從而證明其確實起催化作用。
藉由在催化RNA中作適當鹼基變化以維持與目標序列之必要鹼基配對，基於「錘頭」基元設計出之催化RNA已用於裂解特定目標序列。此已允許使用催化RNA來裂解特定目標序列且指示根據「錘頭」模型設計出之催化RNA可能在活體內裂解特定受質RNA。
RNA干擾(RNAi)已成為調節哺乳動物及哺乳動物細胞中之基因表現之強力工具。此方法需要使用表現質體或病毒及經加工成siRNA之小髮夾RNA之編碼序列以自身RNA形式或以DNA形式傳遞小干擾RNA(siRNA)。此系統能夠高效轉運前siRNA至細胞質中，在細胞質中前siRNA具有活性且允許使用經調節且具組織特異性之啟動子以達成基因表現。
在一實施例中，寡核苷酸或反義化合物包含核糖核酸(RNA)及/或去氧核糖核酸(DNA)之寡聚物或聚合物、或其模擬物、嵌合體、類似物或同源物。此術語包括由天然存在之核苷酸、糖及共價核苷間(骨架)鍵構成之寡核苷酸以及具有非天然存在之以類似方式起作用之部分的寡核苷酸。此等經修飾或經取代之寡核苷酸常由於合乎需要之性質，諸如細胞攝取增強、對目標核酸之親和力增強及在核酸酶存在下之穩定性增加而超過天然形式被需要。
根據本發明，寡核苷酸或「反義化合物」包括反義寡核苷酸(例如其RNA、DNA、模擬物、嵌合體、類似物或同源物)、核糖核酸酶、外部引導序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單股或雙股RNA干擾(RNAi)化合物(諸如siRNA化合物)、saRNA、aRNA及與至少一部分目標核酸雜交且調節其功能之其他寡聚化合物。因而，其可為DNA、RNA、DNA樣、RNA樣或其混合物，或可為此等之一或多者之模擬物。此等化合物可為單股、雙股、環形或髮夾寡聚化合物且可含有結構元件，諸如內部或端部突起、錯配或環。反義化合物以線性形式按常規方式製備但可經連接或另外製備成環形及/或分支狀。反義化合物可包括構築體，諸如雜交形成完全或部分雙股化合物之兩股或具有足夠自身互補性以允許雜交及形成完全或部分雙股化合物之單股。兩股可內部連接，從而留下自由3'或5'端；或可連接形成連續髮夾結構或環。髮夾結構可在5'或3'端上含有突出物，從而產生具有單股特性之延伸部分。雙股化合物視情況可在端上包括突出物。其他修飾可包括與一端、所選核苷酸位置、糖位置或1個核苷間鍵聯連接之結合基團。或者，兩股可經由非核酸部分或連接基團連接。當僅由一股形成時，dsRNA可採用在自身上對折以形成雙螺旋之自身互補性髮夾型分子的形式。因此，dsRNAs可為完全或部分雙股。基因表現可藉由在轉殖基因細胞株中穩定表現dsRNA髮夾來特定調節。當由兩股、或採用在自身上對折以形成雙螺旋之自身互補性髮夾型分 子之形式的單股形成時，兩股(或單股之雙螺旋形成區域)為以華特生-克里克方式進行鹼基配對之互補RNA股。
一旦引入系統中，本發明化合物可引發一或多種酶或結構蛋白之作用以實現目標核酸之裂解或其他修飾或可經由基於占位性之機制起作用。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可描述為「DNA樣」(亦即通常具有一或多個2'-去氧糖且通常具有T鹼基而非U鹼基)或「RNA樣」(亦即通常具有一或多個2'-羥基或2'-經修飾之糖且通常具有U鹼基而非T鹼基)。核酸螺旋可採用1種以上類型之結構，最常見為A形式及B形式。咸信，一般而言，具有B形式樣結構之寡核苷酸為「DNA樣」且具有A形式樣結構之寡核苷酸為「RNA樣」。在一些(嵌合)實施例中，反義化合物可含有A形式區域與B形式區域兩者。
本發明之反義化合物可包含長度約5至約80個核苷酸(亦即約5至約80個連接之核苷)之反義部分。此係指反義化合物之反義股或部分之長度。換言之，本發明之單股反義化合物包含5至約80個核苷酸，且本發明之雙股反義化合物(諸如dsRNA)包含長度5至約80個核苷酸之有義及反義股或部分。一般技術者應瞭解此包括長度5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、 70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個核苷酸或其間任何範圍的反義部分。
在一個實施例中，本發明之反義化合物具有長度10至50個核苷酸之反義部分。一般技術者應瞭解此包括反義部分長度10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸或其間任何範圍的寡核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為15個核苷酸。
在一個實施例中，本發明之反義或寡核苷酸化合物具有長度為12或13至30個核苷酸之反義部分。一般技術者應瞭解此包括反義部分長度12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸或其間任何範圍的反義化合物。
在一實施例中，本發明之寡聚化合物亦包括不同鹼基存在於化合物中之一或多個核苷酸位置的變異體。舉例而言，若最初核苷酸為腺苷，則可產生在此位置含有胸苷、鳥苷或胞苷之變異體。此可在反義或dsRNA化合物之任何位置進行。接著使用本文所述之方法測試此等化合物以確定其抑制目標核酸表現之能力。
在一些實施例中，反義化合物與目標之間的同源性、序列一致性或互補性為約40%至約60%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為約60%至約70%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為約70%至約 80%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為約80%至約90%。在一些實施例中，同源性、序列一致性或互補性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。
在一實施例中，諸如SEQ ID NO：3至6中闡述之核酸分子之反義寡核苷酸包含一或多個取代或修飾。在一個實施例中，核苷酸經鎖核酸(LNA)取代。
在一實施例中，寡核苷酸靶向與FXN相關之編碼及/或非編碼序列之核酸分子有義及/或反義及如SEQ ID NO：1及2闡述之序列的一或多個區域。亦使寡核苷酸靶向SEQ ID NO：1及2之重疊區域。
本發明之某些較佳寡核苷酸為嵌合寡核苷酸。在本發明之情形下，「嵌合寡核苷酸」或「嵌合體」為含有兩個或兩個以上各自由至少一個核苷酸構成之化學性質不同區域的寡核苷酸。此等寡核苷酸通常含有經修飾之核苷酸之賦予一或多種有益性質(諸如核酸酶抗性增加、進入細胞之攝取增加、對目標之結合親和力增加)的至少一個區域及作為能夠裂解RNA：DNA或RNA：RNA雜交體之酶受質的區域。舉例而言，RNase H為一種會裂解RNA：DNA雙螺旋之RNA股的細胞核酸內切酶。因此，RNase H之活化會導致RNA目標之裂解，藉此極大增強反義調節基因表現之效率。因此，相較於硫代磷酸酯去氧寡核苷酸與相同目標區域之雜交，當使用嵌合寡核苷酸時，通常獲得用較短寡核苷酸所得到的類似結果。可藉由凝膠電泳及必要時此項技 術中已知之相關核酸雜交技術按常規方式偵測RNA目標之裂解。在一個實施例中，嵌合寡核苷酸包含至少一個經修飾以增加目標結合親和力之區域及通常充當RNAse H受質之區域。寡核苷酸對其目標(在此情況下，編碼ras之核酸)之親和力係藉由量測寡核苷酸/目標對之Tm按常規方式確定，Tm為寡核苷酸與目標解離之溫度；解離係以分光光度測定方式加以偵測。Tm愈高，寡核苷酸對目標之親和力愈大。
本發明之嵌合反義化合物可形成為兩個或兩個以上如上所述之寡核苷酸、經修飾之寡核苷酸、寡核苷及/或寡核苷酸模擬物之複合結構。此等化合物在此項技術中亦已被稱為雜交體或間隔體(gapmers)。教示製備此等雜交結構之代表性美國專利包含(但不限於)美國專利第5,013,830號；第5,149,797號；第5,220,007號；第5,256,775號；第5,366,878號；第5,403,711號；第5,491,133號；第5,565,350號；第5,623,065號；第5,652,355號；第5,652,356號；及第5,700,922號，各者以引用的方式併入本文中。
在一實施例中，經修飾之寡核苷酸之區域包含至少一個在糖之2'位置經修飾之核苷酸，最佳為2'-O烷基、2'-O-烷基-O-烷基或2'-氟-修飾之核苷酸。在另一實施例中，RNA修飾包括嘧啶之核糖上2'-氟、2'-胺基及2' O-甲基修飾、無鹼基殘基或RNA之3'端之倒轉鹼基。此等修飾按常規方式併入寡核苷酸中，且此等寡核苷酸已顯示比2'-去氧寡核苷酸對於既定目標具有較高Tm(亦即較高目標結合親和 力)。此增加之親和力之效應在於極大增強RNAi寡核苷酸抑制基因表現。RNAse H為一種裂解RNA：DNA雙螺旋之RNA股之細胞核酸內切酶；因此，此酶活化導致RNA目標之裂解，且因此可極大增強RNAi抑制之效率。RNA目標之裂解可按常規方式由凝膠電泳證明。在一實施例中，嵌合寡核苷酸亦經修飾以增強核酸酶抗性。細胞含有多種可降解核酸之核酸外切酶及核酸內切酶。許多核苷酸及核苷修飾已顯示使其所併入之寡核苷酸比天然寡去氧核苷酸對核酸酶消化具有更大抗性。核酸酶抗性係按常規方式量測，藉由寡核苷酸與細胞提取物或經分離之核酸酶溶液一起培育及通常藉由凝膠電泳量測完整寡核苷酸隨時間剩餘之程度。已經修飾以增強其核酸酶抗性之寡核苷酸完整存在的時間長於未經修飾之寡核苷酸。多種寡核苷酸修飾已經證明可增強或賦予核酸酶抗性。目前含有至少一個硫代磷酸酯修飾之寡核苷酸更佳。在一些情況下，增強目標結合親和力之寡核苷酸修飾亦獨立地能夠增強核酸酶抗性。
本發明所設想之一些較佳寡核苷酸之特定實例包括該等包含經修飾骨架，例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短鏈烷基或環烷基糖間鍵或短鏈雜原子或雜環糖間鍵聯者。最佳為具有硫代磷酸酯骨架之寡核苷酸，及具有雜原子骨架特別是CH2--NH--O--CH2、CH、--N(CH3)--O--CH2[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI骨架]、CH2--O--N(CH3)--CH2、CH2-N(CH3)--N(CH3)--CH2及O--N(CH3)--CH2--CH2骨架，其中天然磷酸二酯骨架表示為O--P--O-- CH者。De Mesmaeker等人(1995)Acc.Chem.Res.28：366-374揭示之醯胺骨架亦佳。具有嗎啉基骨架結構之寡核苷酸(Summerton及Weller，美國專利第5,034,506號)亦佳。在另一實施例中，諸如寡核苷酸之肽核酸(PNA)骨架、磷酸二酯骨架經聚醯胺骨架置換，其中核苷酸直接或間接與聚醯胺骨架之氮雜氮原子結合。寡核苷酸亦可包含一或多個經取代之糖部分。較佳寡核苷酸在2'位置包含以下之一：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3 OCH3、OCH3 O(CH2)n CH3、O(CH2)n NH2或O(CH2)n CH3，其中n為1至約10；C1至C10低碳烷基、烷氧基烷氧基、經取代之低碳烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O--、S--或N-烷基；O--、S--或N-烯基；SOCH3；SO2 CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；雜環烷基；雜環烷芳基；胺基烷胺基；聚烷胺基；經取代之矽烷基；RNA裂解基團；報導基團；嵌入劑；改良寡核苷酸之藥物動力學性質之基團；或改良寡核苷酸之藥效學性質之基團及其他具有類似性質之取代基。較佳修飾包括2'-甲氧基乙氧基[2'-O-CH2 CH2 OCH3，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)]。其他較佳修飾包括2'-甲氧基(2'-O--CH3)、2'-丙氧基(2'-OCH2 CH2CH3)及2'-氟(2'-F)。亦可在寡核苷酸上之其他位置，特定言之3'端核苷酸上之糖之3'位置及5'端核苷酸之5'位置進行類似修飾。寡核苷酸亦可具有糖模擬物，諸如替代戊呋喃糖基之環丁基。
寡核苷酸亦可或者或另外包括核鹼基(在此項技術中常 簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如本文所用，「未經修飾」或「天然」核苷酸包括腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。經修飾之核苷酸包括僅偶爾或短暫見於天然核酸中之核苷酸，例如次黃嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶、特定言之5-甲基胞嘧啶(亦稱為5-甲基-2'去氧胞嘧啶且在此項技術中常稱為5-Me-C)、5-羥甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC及龍膽二糖基(gentobiosyl)HMC、以及合成核苷酸，例如2-胺基腺嘌呤、2-(甲胺基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(胺基烷胺基)腺嘌呤或其他雜取代之烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、N6(6-胺己基)腺嘌呤及2,6-二胺基嘌呤。可包括此項技術中已知之「通用」鹼基，例如肌苷。5-Me-C取代已顯示會使核酸雙螺旋穩定性增加0.6-1.2℃且為目前較佳的鹼基取代。
本發明之寡核苷酸之另一修飾涉及使增強寡核苷酸之活性或細胞攝取之一或多個部分或結合物化學連接至寡核苷酸。此等部分包括(但不限於)脂質部分(諸如膽固醇部分、膽固醇基部分)、脂族鏈(例如十二烷二醇或十一基殘基)、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷(Adamantane)乙酸。包含親脂性部分之寡核苷酸及製備此等寡核苷酸之方法在此項技術，例如美國專利第5,138,045號、第5,218,105號及第5,459,255號中為已知的。
並非既定寡核苷酸中之所有位置皆必須經均一修飾，且 實際上一個以上之以上提及之修飾可併入單一寡核苷酸中或甚至寡核苷酸內單一核苷內。本發明亦包括作為如上文所定義之嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。
在另一實施例中，本發明之核酸分子與另一部分結合，該另一部分包括(但不限於)無鹼基核苷酸、聚醚、聚胺、聚醯胺、肽、碳水化合物、脂質或聚烴化合物。熟習此項技術者應認識到此等分子可在糖、鹼基或磷酸基上之若干位置與構成核酸分子之任何核苷酸的一或多者連接。
根據本發明使用之寡核苷酸可經由熟知固相合成技術方便且按常規方式製備。用於此合成之設備由包括Applied Biosystems之若干供應商銷售。亦可採用用於此合成之任何其他手段；寡核苷酸之實際合成完全在一般技術者之技能內。亦熟知使用類似技術來製備其他寡核苷酸，諸如硫代磷酸酯及烷基化衍生物。亦熟知使用類似技術及市售經修飾之胺基酸酯(amidites)及可控多孔性玻璃(controlled-pore glass；CPG)產品，諸如經生物素、螢光素、吖啶或補骨脂素(psoralen)修飾之胺基酸酯及/或CPG(可自Glen Research,Sterling VA獲得)來合成經螢光標記之寡核苷酸、經生物素標記之寡核苷酸或其他經修飾之寡核苷酸，諸如經膽固醇修飾之寡核苷酸。
根據本發明，使用修飾，諸如使用LNA單體以增強作用之效能、特異性及持續時間且拓寬包含當前化學組成(諸如MOE、ANA、FANA、PS等)之寡核苷酸的投藥途徑。此可藉由用LNA單體取代當前寡核苷酸中之一些單體達成。 經LNA修飾之寡核苷酸可具有與母體化合物類似之尺寸或可較大或較佳較小。較佳地，此等經LNA修飾之寡核苷酸含有小於約70%、更佳小於約60%、最佳小於約50%之LNA單體且其尺寸介於約5與25個核苷酸之間、更佳介於約12與20個核苷酸之間。
較佳經修飾之寡核苷酸骨架包含(但不限於)硫代磷酸酯、對掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯及其他烷基膦酸酯(包含3'膦酸伸烷酯及對掌性膦酸酯)、亞膦酸酯、胺基磷酸酯(包含3'-胺基胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷酸酯)、硫羰基胺基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯及具有正常3'-5'鍵之硼烷磷酸酯(boranophosphate)、此等硼烷磷酸酯之2'-5'連接之類似物及具有反極性之硼烷磷酸酯，其中鄰近核苷單元對係3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'連接。亦包括各種鹽、混合鹽及游離酸形式。
教示製備以上含磷鍵之代表性美國專利包含(但不限於)美國專利第3,687,808號；第4,469,863號；第4,476,301號；第5,023,243號；第5,177,196號；第5,188,897號；第5,264,423號；第5,276,019號；第5,278,302號；第5,286,717號；第5,321,131號；第5,399,676號；第5,405,939號；第5,453,496號；第5,455,233號；第5,466,677號；第5,476,925號；第5,519,126號；第5,536,821號；第5,541,306號；第5,550,111號；第5,563,253號；第5,571,799號；第5,587,361號及第5,625,050號，各專利以引用的方式併入本文中。
其中不包括磷原子之較佳經修飾之寡核苷酸骨架具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵聯、混合雜原子及烷基或環烷基核苷間鍵聯、或一或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵聯形成之骨架。此等寡核苷酸骨架包含具有以下之彼等寡核苷酸骨架：嗎啉基鍵(部分地由核苷之糖部分形成)；矽氧烷骨架；硫化物、亞碸及碸骨架；甲乙醯基(formacetyl)及硫代甲乙醯基(thioformacetyl)骨架；亞甲基甲乙醯基及亞甲基硫代甲乙醯基骨架；含烯骨架；胺基磺酸酯骨架；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基骨架；磺酸酯及磺醯胺骨架；醯胺骨架；及具有混合N、O、S及CH2組成部分之其他骨架。
教示製備以上寡核苷之代表性美國專利包含(但不限於)美國專利第5,034,506號；第5,166,315號；第5,185,444號；第5,214,134號；第5,216,141號；第5,235,033號；第5,264,562號；第5,264,564號；第5,405,938號；第5,434,257號；第5,466,677號；第5,470,967號；第5,489,677號；第5,541,307號；第5,561,225號；第5,596,086號；第5,602,240號；第5,610,289號；第5,602,240號；第5,608,046號；第5,610,289號；第5,618,704號；第5,623,070號；第5,663,312號；第5,633,360號；第5,677,437號；及第5,677,439號，各專利以引用的方式併入本文中。
在其他較佳寡核苷酸模擬物中，核苷酸單元之糖與核苷間鍵聯(亦即骨架)兩者均經新穎基團置換。保留鹼基單元以用於與適當核酸目標化合物雜交。一種此寡聚化合物， 即已顯示具有極佳雜交性質之寡核苷酸模擬物稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸之糖-骨架經含醯胺骨架，特定言之胺乙基甘胺酸骨架置換。核鹼基經保留且直接或間接與骨架醯胺部分之氮雜氮原子結合。教示製備PNA化合物之代表性美國專利包含(但不限於)美國專利第5,539,082號；第5,714,331號；及第5,719,262號，各專利以引用的方式併入本文中。PNA化合物之其他教示可見於Nielsen等人，(1991)Science 254,1497-1500中。
在本發明之一實施例中，寡核苷酸具有硫代磷酸酯骨架且寡核苷具有雜原子骨架，且特定言之CH2-NH-O-CH2-；稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI骨架之-CH2-N(CH3)-O-CH2-；-CH2-O-N(CH3)-CH2-；-CH2N(CH3)-N(CH3)CH2-及-O-N(CH3)-CH2-CH2-，其中天然磷酸二酯骨架表示為以上引用之美國專利第5,489,677號之-O-P-O-CH2-；及以上引用之美國專利第5,602,240號之醯胺骨架。具有以上引用之美國專利第5,034,506號之嗎啉基骨架結構之寡核苷酸亦佳。
經修飾之寡核苷酸亦可含有一或多個經取代之糖部分。較佳寡核苷酸在2'位置包含以下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O烷基-O-烷基，其中該烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代之C至CO烷基或C2至CO烯基及炔基。尤其較佳為O(CH2)n OmCH3、O(CH2)n,OCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2及O(CH2nON(CH2)nCH3)2，其中n及m可為 1至約10。其他較佳寡核苷酸在2'位置包含以下之一：C至CO、低碳烷基、經取代之低碳烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷胺基、聚烷胺基、經取代之矽烷基、RNA裂解基團、報導基團、嵌入劑、改良寡核苷酸之藥物動力學性質之基團、或改良寡核苷酸之藥效學性質之基團及具有類似性質之其他取代基。一較佳修飾包含2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)，亦即烷氧基烷氧基。另一較佳修飾包含2'-二甲胺基氧基乙氧基，亦即O(CH2)2ON(CH3)2基團，亦稱為2'-DMAOE，如以下本文實例中所述；及2'-二甲胺基乙氧基乙氧基(在此項技術中亦稱為2'-O-二甲胺基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，亦即2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2。
其他較佳修飾包含2'-甲氧基(2'-O CH3)、2'-胺基丙氧基(2'-O CH2CH2CH2NH2)及2'-氟(2'-F)。亦可在寡核苷酸上之其他位置，特定言之3'端核苷酸上或2'-5'連接之寡核苷酸中之糖之3'位置及5'端核苷酸之5'位置進行類似修飾。寡核苷酸亦可具有糖模擬物，諸如替代戊呋喃糖基糖之環丁基部分。教示製備此等經修飾之糖結構之代表性美國專利包含(但不限於)美國專利第4,981,957號；第5,118,800號；第5,319,080號；第5,359,044號；第5,393,878號；第5,446,137號；第5,466,786號；第5,514,785號；第5,519,134 號；第5,567,811號；第5,576,427號；第5,591,722號；第5,597,909號；第5,610,300號；第5,627,053號；第5,639,873號；第5,646,265號；第5,658,873號；第5,670,633號；及第5,700,920號，各專利以引用的方式併入本文中。
寡核苷酸亦可包含核鹼基(在此項技術中常簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如本文所用，「未經修飾」或「天然」核苷酸包含嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。經修飾之核苷酸包含其他合成及天然核苷酸，諸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-胺基腺嘌呤；腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物；腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫胸腺嘧啶及2-硫胞嘧啶；5-鹵尿嘧啶及5-鹵胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶及6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-鹵、8-胺基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基及其他8取代腺嘌呤及鳥嘌呤；5-鹵(特定言之5-溴)、5-三氟甲基及其他5-取代尿嘧啶及胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤(7-methylquanine)及7-甲基腺嘌呤；8-氮鳥嘌呤及8-氮腺嘌呤；7-去氮鳥嘌呤及7-去氮腺嘌呤及3-去氮鳥嘌呤及3-去氮腺嘌呤。
另外，核苷酸包含以下中揭示之核苷酸：美國專利第3,687,808號、『The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering』，第858-859頁，Kroschwitz,J.I. 編John Wiley & Sons,1990、Englisch等人，『Angewandle Chemie,International Edition』，1991,30，第613頁及Sanghvi,Y.S.，第15章，『Antisense Research and Applications』，第289-302頁，Crooke,S.T.及Lebleu,B.編，CRC Press,1993。某些此等核苷酸尤其適用於增加本發明之寡聚化合物之結合親和力。此等包含5-取代嘧啶、6-氮嘧啶及N-2、N-6及0-6取代嘌呤，包含2-胺丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已顯示會使核酸雙螺旋穩定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.及Lebleu,B.編，『Antisense Research and Applications』,CRC Press,Boca Raton,1993，第276-278頁)且為目前較佳的鹼基取代，當與2'-O甲氧基乙基糖修飾組合時甚至更特別較佳。
教示製備以上指示之經修飾之核苷酸以及其他經修飾之核苷酸之代表性美國專利包含(但不限於)美國專利第3,687,808號以及第4,845,205號；第5,130,302號；第5,134,066號；第5,175,273號；第5,367,066號；第5,432,272號；第5,457,187號；第5,459,255號；第5,484,908號；第5,502,177號；第5,525,711號第5,552,540號；第5,587,469號；第5,596,091號；第5,614,617號；第5,750,692號；及第5,681,941號，各專利以引用的方式併入本文中。
本發明之寡核苷酸之另一修飾涉及使增強寡核苷酸之活性，細胞分佈或細胞攝取之一或多個部分或結合物化學連接至寡核苷酸。
此等部分包含(但不限於)脂質部分(諸如膽固醇部分)、膽酸、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醇)、硫代膽固醇、脂族鏈(例如十二烷二醇或十一基殘基)、磷脂(例如二-十六基-外消旋-甘油或1,2-二-O-十六基-外消旋-甘油基-3-H-膦酸三乙基銨)、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚基(palmityl)部分、或十八烷基胺或己胺基-羰基-羥膽固醇(hexylamino-carbonyl-t oxycholesterol)部分。
教示製備此等寡核苷酸結合物之代表性美國專利包含(但不限於)美國專利第4,828,979號；第4,948,882號；第5,218,105號；第5,525,465號；第5,541,313號；第5,545,730號；第5,552,538號；第5,578,717號；第5,580,731號；第5,580,731號；第5,591,584號；第5,109,124號；第5,118,802號；第5,138,045號；第5,414,077號；第5,486,603號；第5,512,439號；第5,578,718號；第5,608,046號；第4,587,044號；第4,605,735號；第4,667,025號；第4,762,779號；第4,789,737號；第4,824,941號；第4,835,263號；第4,876,335號；第4,904,582號；第4,958,013號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,214,136號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,214,136號；第5,245,022號；第5,254,469號；第5,258,506號；第5,262,536號；第5,272,250號；第5,292,873號；第5,317,098號；第5,371,241號；第5,391,723號；第5,416,203號；第5,451,463號；第5,510,475號；第5,512,667號；第5,514,785號；第5,565,552號；第5,567,810號；第5,574,142號；第5,585,481號；第5,587,371號；第5,595,726 號；第5,597,696號；第5,599,923號；第5,599,928號及第5,688,941號，各專利以引用的方式併入本文中。
藥物發現：本發明化合物亦可應用於藥物發現及目標驗證之領域中。本發明包括使用本文鑑別出之化合物及較佳目標區段努力發現欲闡明存在於共濟蛋白(FXN)聚核苷酸與疾病狀態、表型或病狀之間的關係之藥物。此等方法包括偵測或調節FXN聚核苷酸，包含使樣品、組織、細胞或有機體與本發明化合物接觸，在處理之後某時量測FXN聚核苷酸之核酸或蛋白質含量及/或相關表型或化學終點，且視情況比較量測值與未處理樣品或經另一本發明化合物處理之樣品。此等方法亦可平行或與其他實驗組合進行以確定未知基因對於目標驗證方法之功能或確定特定基因產物作為用於治療或預防特定疾病、病狀或表型之目標的有效性。
評估基因表現之上調或抑制：
可藉由直接偵測核酸在細胞或有機體中之存在來評估外源性核酸向宿主細胞或有機體中的轉移。此偵測可藉由此項技術中熟知之若干方法達成。舉例而言，外源性核酸之存在可藉由南方墨點分析或藉由使用特異性擴增與核酸相關之核苷酸序列之引子的聚合酶鏈反應(PCR)技術加以偵測。亦可使用包括基因表現分析之習知方法量測外源性核酸之表現。舉例而言，外源性核酸產生之mRNA可使用北方墨點分析及反轉錄PCR(RT-PCR)偵測及定量。
外源性核酸表現之RNA亦可藉由量測酶活性或報導蛋白 活性加以偵測。舉例而言，反義調節活性可間接量測為目標核酸表現的減少或增加，其指示外源性核酸正在產生效應RNA。基於序列保守性，引子可經設計且用於擴增目標基因之編碼區。最初，各基因之最高度表現之編碼區可用於構築模式控制基因(model control gene)，但可使用任何編碼或非編碼區。各控制基因藉由在報導編碼區與其聚(A)信號之間插入各編碼區來裝配。此等質體將產生在基因之上游部分中具有報導基因且在3'非編碼區中具有潛在RNAi目標的mRNA。個別反義寡核苷酸之效用將藉由調節報導基因加以分析。適用於本發明方法中之報導基因包括乙醯羥基酸合成酶(AHAS)、鹼性磷酸酯酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡糖醛酸酶(GUS)、氯黴素乙醯轉移酶(chloramphenicol acetyltransferase；CAT)、綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白(RFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、藍螢光蛋白質(cyan fluorescent protein；CFP)、辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)(HRP)、螢光素酶(luciferase)(Luc)、胭脂鹼合成酶(nopaline synthase；NOS)、章魚鹼合成酶(octopine synthase；OCS)及其衍生物。可採用多種賦予對安比西林(ampicillin)、博來黴素(bleomycin)、氯黴素、健大黴素(gentamycin)、潮黴素(hygromycin)、康黴素(kanamycin)、林可黴素(lincomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)、草胺膦(phosphinothricin)、嘌呤黴素(puromycin)及四環素(tetracycline)之抗性之可選擇標記。用於確定報導基因之調節之方法係此項技術中為熟知，且包括(但不限於)螢光 分析法(例如螢光光譜分析法、螢光活化之細胞揀選法(FACS)、螢光顯微鏡術)、抗生素抗性測定法。
FXN蛋白及mRNA表現可使用熟習此項技術者已知及在本文別處描述之方法分析。舉例而言，諸如ELISA之免疫分析可用於量測蛋白質含量。FXN ELISA分析套組可例如自R&D Systems(Minneapolis,MN)購得。
在實施例中，使用本發明之反義寡核苷酸處理之樣品(例如活體內或活體外細胞或組織)中之FXN表現(例如mRNA或蛋白質)係藉由與對照樣品中之FXN表現進行比較來評估。舉例而言，蛋白質或核酸之表現可使用熟習此項技術者已知之方法與模擬處理或未處理樣品中之蛋白質或核酸之表現進行比較。或者，視所要資訊而定，可與經對照反義寡核苷酸(例如具有改變或不同序列之反義寡核苷酸)處理之樣品進行比較。在另一實施例中，可取經處理樣品與未經處理樣品之間之FXN蛋白或核酸之表現差異與經處理樣品與未經處理樣品之間之不同核酸(包括由研究人員視為適當的任何標準物，例如管家基因)之表現差異進行比較。
觀測到之差異可依需要表示，例如以比率或分數形式表示，以用於與對照組比較。在實施例中，相對於未處理樣品或經對照核酸處理之樣品，經本發明之反義寡核苷酸處理之樣品中的FXN mRNA或蛋白質之含量增加或減少約1.25倍至約10倍或10倍以上。在實施例中，FXN mRNA或蛋白質之含量增加或減少至少約1.25倍、至少約1.3倍、至 少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約5.5倍、至少約6倍、至少約6.5倍、至少約7倍、至少約7.5倍、至少約8倍、至少約8.5倍、至少約9倍、至少約9.5倍或至少約10倍或10倍以上。
套組、研究試劑、診斷劑及治療劑
本發明化合物可用於診斷、治療及預防，且可用作研究試劑及套組之組分。此外，熟悉此一般技術者經常使用能夠以強烈特異性抑制基因表現之反義寡核苷酸來闡明特定基因之功能或區分生物路徑之各個成員之功能。
對於在套組及診斷劑及各種生物系統中之使用，單獨或與其他化合物或治療劑組合之本發明化合物適用作差值分析及/或組合分析中之工具以闡明在細胞及組織內表現之基因之一部分或整個互補序列的表現樣式。
如本文所用，術語「生物系統」或「系統」定義為表現或使得有能力表現共濟蛋白(FXN)基因產物的任何有機體、細胞、細胞培養物或組織。此等包括(但不限於)人類、轉殖基因動物、細胞、細胞培養物、組織、異種移植物、移植物及其組合。
作為一個非限制性實例，用一或多種反義化合物處理之細胞或組織內的表現樣式與未經反義化合物處理之對照細胞或組織進行比較且分析產生之樣式以獲得基因表現量差值，因為其係關於例如所檢查基因之疾病相關性、信號傳 導路徑、細胞定位、表現量、尺寸、結構或功能。可在存在或不存在會影響表現樣式之其他化合物下對經刺激或未經刺激之細胞進行此等分析。
此項技術中已知之基因表現分析方法的實例包括DNA陣列或微陣列、基因表現之連續分析(serial analysis of gene expression；SAGE)、經消化之cDNA之限制酶擴增(restriction enzyme amplification of digested cDNAs；READS)、總基因表現分析(total gene expression analysis；TOGA)、蛋白質陣列及蛋白質組研究、表現之序列標籤(expressed sequence tag；EST)定序、差減RNA指紋(subtractive RNA fingerprinting；SuRF)、差減選殖、差異性呈現(differential display；DD)、比較染色體組雜交、螢光原位雜交(fluorescent in situ hybridization；FISH)技術及質譜方法。
本發明化合物適用於研究及診斷，因為此等化合物與編碼共濟蛋白(FXN)之核酸雜交。舉例而言，在如本文揭示之此等條件下以此效率作為有效FXN調節劑雜交之寡核苷酸分別為在有利於基因擴增或偵測的條件下的有效引子或探針。此等引子及探針適用於需要特異性偵測編碼FXN之核酸分子的方法中及用於擴增該等核酸分子以偵測FXN或用於FXN之其他研究中。本發明之反義寡核苷酸，特定言之引子及探針與編碼FXN之核酸的雜交可藉由此項技術中已知之手段加以偵測。此等手段可包括使酶與寡核苷酸結合、對寡核苷酸進行放射性標記或任何其他適合偵測手 段。亦可製備使用此等偵測手段用於偵測樣品中之FXN含量的套組。
反義之特異性及敏感性亦由熟習此項技術者利用以達成治療用途。反義化合物已在包括人類之動物中之疾病狀態的治療中用作治療部分。反義寡核苷酸藥物已向人類安全且有效投與且眾多臨床試驗目前正在進行中。因此確定反義化合物可為可經組態以適用於治療細胞、組織及動物，尤其人類之治療方案的適用治療模態。
對於治療劑，懷疑患有可藉由調節FXN聚核苷酸之表現加以治療之疾病或病症的動物，較佳人類係藉由投與本發明之反義化合物加以治療。舉例而言，在一非限制性實施例中，方法包含向需要治療之動物投與治療有效量之FXN調節劑的步驟。本發明之FXN調節劑有效調節FXN之活性或調節FXN蛋白之表現。在一個實施例中，相較於對照，FXN在動物中之活性或表現抑制約10%。較佳地，FXN在動物中之活性或表現抑制約30%。更佳地，FXN在動物中之活性或表現抑制50%或50%以上。因此，相較於對照，寡聚化合物調節共濟蛋白(FXN)mRNA之表現至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。
在一個實施例中，相較於對照，共濟蛋白(FXN)及/或其在動物中之活性或表現增加約10%。較佳地，FXN在動物中之活性或表現增加約30%。更佳地，FXN在動物中之活 性或表現增加50%或50%以上。因此，相較於對照，寡聚化合物調節FXN mRNA之表現至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。
舉例而言，可量測動物之血清、血液、脂肪組織、肝或任何其他體液、組織或器官中之共濟蛋白(FXN)表現之降低。較佳地，所分析之該等流體、組織或器官內含有之細胞含有編碼FXN肽之核酸分子及/或FXN蛋白自身。
本發明化合物可藉由添加有效量之化合物至適合醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑中而以醫藥組合物加以利用。使用本發明之化合物及方法在預防上亦可適用。
結合物
本發明之寡核苷酸之另一修飾涉及使增強寡核苷酸之活性，細胞分佈或細胞攝取之一或多個部分或結合物化學連接至寡核苷酸。此等部分或結合物可包括與諸如一級或二級羥基之官能基共價結合的結合基團。本發明之結合基團包括嵌入劑、報導分子、聚胺、聚醯胺、聚乙二醇、聚醚、增強寡聚物之藥效學性質之基團及增強寡聚物之藥物動力學性質之基團。典型結合基團包括膽固醇、脂質、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸酯、啡啶、蒽醌、吖啶、螢光素、若丹明(rhodamine)、香豆素(coumarin)及染料。在本發明之情形下，增強藥效學性質之基團包括改良攝取、增強對降解之抗性及/或增強與目標核酸之序列特異性雜交 的基團。在本發明之情形下，增強藥物動力學性質之基團包括改良本發明化合物之攝取、分佈、代謝或排泄的基團。代表性結合基團揭示於1992年10月23日申請之國際專利申請案第PCT/US92/09196號及美國專利第6,287,860號中，該等專利以引用的方式併入本文中。結合部分包括(但不限於)脂質部分(諸如膽固醇部分)、膽酸、硫醚(例如己基-5-三苯甲基硫醇)、硫代膽固醇、脂族鏈(例如十二烷二醇或十一基殘基)、磷脂(例如二-十六基-外消旋-甘油或1,2-二-O-十六基-外消旋-甘油基-3-H膦酸三乙基銨)、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚基部分、或十八烷基胺或己胺基-羰基-羥膽固醇部分。本發明之寡核苷酸亦可與活性原料藥結合，該等活性原料藥例如為阿司匹靈(aspirin)、華法林(warfarin)、苯基丁氮酮、布洛芬(ibuprofen)、舒洛芬(suprofen)、芬布芬(fenbufen)、酮洛芬(ketoprofen)、(S)-(+)-普拉洛芬(pranoprofen)、卡洛芬(carprofen)、丹磺醯基肌胺酸(dansylsarcosine)、2,3,5-三碘苯甲酸、氟芬那酸(flufenamic acid)、醛葉酸(folinic acid)、苯并噻二疊氮(benzothiadiazide)、氯噻嗪(chlorothiazide)、二氮呯(diazepine)、吲哚美辛(indomethicin)、巴比妥鹽(barbiturate)、頭孢菌素(cephalosporin)、磺胺藥、抗糖尿病藥、抗細菌劑或抗生素。
教示製備此等寡核苷酸結合物之代表性美國專利包括(但不限於)美國專利第4,828,979號；第4,948,882號；第5,218,105號；第5,525,465號；第5,541,313號；第5,545,730 號；第5,552,538號；第5,578,717號；第5,580,731號；第5,580,731號；第5,591,584號；第5,109,124號；第5,118,802號；第5,138,045號；第5,414,077號；第5,486,603號；第5,512,439號；第5,578,718號；第5,608,046號；第4,587,044號；第4,605,735號；第4,667,025號；第4,762,779號；第4,789,737號；第4,824,941號；第4,835,263號；第4,876,335號；第4,904,582號；第4,958,013號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,214,136號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,214,136號；第5,245,022號；第5,254,469號；第5,258,506號；第5,262,536號；第5,272,250號；第5,292,873號；第5,317,098號；第5,371,241號；第5,391,723號；第5,416,203號；第5,451,463號；第5,510,475號；第5,512,667號；第5,514,785號；第5,565,552號；第5,567,810號；第5,574,142號；第5,585,481號；第5,587,371號；第5,595,726號；第5,597,696號；第5,599,923號；第5,599,928號及第5,688,941號。
調配物
本發明化合物亦可與其他分子、分子結構或化合物之混合物，例如脂質體、受體靶向分子、經口調配物、經直腸調配物、局部調配物或其他調配物一起摻和、囊封、結合或另外締合以幫助攝取、分佈及/或吸收。教示製備此等有助於攝取、分佈及/或吸收之調配物之代表性美國專利包括(但不限於)美國專利第5,108,921號；第5,354,844號；第5,416,016號；第5,459,127號；第5,521,291號；第 5,543,165號；第5,547,932號；第5,583,020號；第5,591,721號；第4,426,330號；第4,534,899號；第5,013,556號；第5,108,921號；第5,213,804號；第5,227,170號；第5,264,221號；第5,356,633號；第5,395,619號；第5,416,016號；第5,417,978號；第5,462,854號；第5,469,854號；第5,512,295號；第5,527,528號；第5,534,259號；第5,543,152號；第5,556,948號；第5,580,575號；及第5,595,756號，各專利以引用的方式併入本文中。
儘管反義寡核苷酸無需在載體之情形下投與以調節目標表現及/或功能，但本發明之實施例係關於用於表現反義寡核苷酸之表現載體構築體，其包含啟動子、雜交啟動基因序列且具有強組成性啟動子活性或可在所要情況下經誘導之啟動子活性。
在一實施例中，發明實務涉及以適合核酸傳遞系統投與至少一種前述反義寡核苷酸。在一個實施例中，彼系統包括非病毒載體可操作地與聚核苷酸連接。此等非病毒載體之實例包括單獨寡核苷酸(例如SEQ ID NO：3至6之任何一或多者)或寡核苷酸與適合蛋白質、多醣或脂質調配物之組合。
另外適合之核酸傳遞系統包括病毒載體，序列通常來自腺病毒、腺病毒相關病毒(AAV)、輔助病毒依賴性腺病毒、反轉錄病毒或日本血球凝集蛋白病毒-脂質體(hemagglutinatin virus of Japan-liposome，HVJ)複合物中之至少一者。較佳地，病毒載體包含強真核啟動子，例如 細胞巨大病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子可操作地與聚核苷酸連接。
另外較佳之載體包括病毒載體、融合蛋白及化學結合物。反轉錄病毒載體包括莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia viruses)及基於HIV之病毒。一種較佳基於HIV之病毒載體包含至少兩個載體，其中gag及pol基因來自於HIV基因組且env基因來自於另一病毒。DNA病毒載體較佳。此等載體包括痘載體，諸如正痘或鳥類痘載體；疱疹病毒載體，諸如單純疱疹I病毒(herpes simplex I virus，HSV)載體；腺病毒載體及腺相關病毒載體。
本發明之反義化合物涵蓋任何醫藥學上可接受之鹽、酯或此等酯之鹽、或在向包括人類之動物投與時能夠(直接或間接)提供生物活性代謝物或其殘餘物之任何其他化合物。
術語「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明化合物之生理學上及醫藥學上可接受之鹽：亦即保留母體化合物之所要生物活性且不賦予不合需要之毒理學效應的鹽。對於寡核苷酸，醫藥學上可接受之鹽之較佳實例及其用途進一步描述於美國專利第6,287,860號中，該專利以引用的方式併入本文中。
本發明亦包括包括本發明之反義化合物之醫藥組合物及調配物。視需要局部治療或全身性治療及欲治療之區域而定，本發明之醫藥組合物可以許多方式投與。投藥可為局部投藥(包括眼用及向黏膜投藥，包括陰道及直腸傳遞)； 經肺投藥(例如藉由吸入或吹入散劑或氣霧劑，包括使用噴霧器；氣管內投藥；鼻內投藥；經表皮投藥及經皮投藥)；經口投藥或非經腸投藥。非經腸投藥包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注；或顱內，例如鞘內或室內投藥。
對於治療中樞神經系統中之組織，可藉由例如注射或輸注入腦脊髓液中來進行投藥。向腦脊髓液中投與反義RNA描述於例如美國專利申請公開案第2007/0117772號，「Methods for slowing familial ALS disease progression」中，該專利以全文引用的方式併入本文中。
當意欲本發明之反義寡核苷酸向中樞神經系統中之細胞投與時，可與一或多種能夠促進標的反義寡核苷酸跨越血腦障壁進行穿透之藥劑一起進行投藥。可例如在內嗅皮質(entorhinal cortex)或海馬(hippocampus)中進行注射。藉由向肌肉組織中之運動神經元投與腺病毒載體來傳遞神經營養因子描述於例如美國專利第6,632,427號，「Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons」中，該專利以引用的方式併入本文中。直接向腦，例如紋狀體(striatum)、丘腦(thalamus)、海馬或黑質(substantia nigra)中傳遞載體在此項技術中為已知的且描述於例如美國專利第6,756,523號，「Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain」中，該專利以引用的方式併入本文中。當藉由注射進行時，投藥可為快速的，或當藉由緩 慢輸注或投與緩慢釋放調配物時，投藥可歷時一段時期。
標的反義寡核苷酸亦可與會提供合乎需要之醫藥或藥效學性質之藥劑連接或結合。舉例而言，反義寡核苷酸可與此項技術中已知促進跨越血腦障壁進行穿透或轉運之任何物質，諸如轉鐵蛋白(transferrin)受體之抗體偶合，且藉由靜脈內注射進行投與。反義化合物可與例如使反義化合物更有效及/或增加反義化合物跨越血腦障壁進行轉運之病毒載體連接。滲透血腦障壁破壞亦可藉由例如輸注糖，包括(但不限於)內消旋赤藻糖醇(meso erythritol)、木糖醇(xylitol)、D(+)半乳糖、D(+)乳糖、D(+)木糖、半乳糖醇(dulcitol)、肌醇(myo-inositol)、L(-)果糖、D(-)甘露糖醇、D(+)葡萄糖、D(+)阿拉伯糖(D(+)arabinose)、D(-)阿拉伯糖、纖維二糖、D(+)麥芽糖、D(+)棉子糖(D(+)raffinose)、L(+)鼠李糖(L(+)rhamnose)、D(+)蜜二糖(D(+)melibiose)、D(-)核糖、核糖醇(adonitol)、D(+)阿拉伯糖醇、L(-)阿拉伯糖醇、D(+)海藻糖(D(+)fucose)、L(-)海藻糖、D(-)來蘇糖(D(-)lyxose)、L(+)來蘇糖及L(-)來蘇糖；或胺基酸，包括(但不限於)麩醯胺酸、離胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、纈胺酸及牛磺酸來達成。增強血腦障壁穿透之方法及材料描述於例如美國專利第4,866,042號，「Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier」、第6,294,520號，「Material for passage through the blood-brain barrier」及第6,936,589號，「Parenteral delivery systems」中，該等專利皆以全文引用之方式併入本文中。
標的反義化合物可與其他分子、分子結構或化合物之混合物，例如脂質體、受體靶向分子、經口調配物、經直腸調配物、局部調配物或其他調配物一起摻和、囊封、結合或另外締合以幫助攝取、分佈及/或吸收。舉例而言，調配物中可包括陽離子脂質以促進寡核苷酸攝取。一種顯示會促進攝取之此組合物為LIPOFECTIN(可自GIBCO-BRL,Bethesda,MD獲得)。
咸信具有至少一個2'-O-甲氧基乙基修飾之寡核苷酸特別適用於經口投藥。用於局部投藥之醫藥組合物及調配物可包括經皮貼片、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及散劑。習知醫藥載劑、水性基質、粉末基質或油性基質、增稠劑及其類似物可為必需的或合乎需要的。經塗敷之保險套(condom)、手套及其類似物亦可為適用的。
宜以單位劑型提供之本發明之醫藥調配物可根據醫藥工業中熟知之習知技術製備。此等技術包括使活性成分與醫藥載劑或賦形劑締合之步驟。一般而言，藉由使活性成分與液體載劑或細粉狀固體載劑或兩者均一且密切締合，且接著必要時使產物成形來製備調配物。
本發明之組合物可調配成任何許多可能之劑型，諸如 (但不限於)錠劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑、液體糖漿、軟凝膠劑、栓劑及灌腸劑。本發明之組合物亦可調配成於水性、非水性或混合介質中之懸浮液。水性懸浮液可另外含有會增加懸浮液黏度之物質，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇及/或葡聚糖。懸浮液亦可含有穩定劑。
本發明之醫藥組合物包括(但不限於)溶液、乳液、泡沫及含脂質體調配物。本發明之醫藥組合物及調配物可包含一或多種滲透增強劑、載劑、賦形劑或其他活性成分或非活性成分。
乳液通常為一種液體分散於另一液體中之呈直徑通常超過0.1 μm之小滴形式的異質系統。除分散相及可呈於水相、油相中之溶液或自身呈分離相(separate phase)存在的活性藥物之外，乳液亦可含有其他組分。微乳液作為本發明之一個實施例而包括。乳液及其使用在此項技術中為熟知的且進一步描述於美國專利第6,287,860號中。
本發明之調配物包括脂質體調配物。如本發明中所用，術語「脂質體」意謂由以球狀雙層排列之兩親媒性脂質構成的微脂粒。脂質體為單層或多層微脂粒，其具有由親脂性物質形成之膜及含有欲傳遞之組合物之水性內部。陽離子脂質體為咸信與帶負電荷之DNA分子相互作用形成穩定複合物之帶正電荷的脂質體。咸信對pH值敏感或帶負電荷之脂質體會圈閉(entrap)DNA而非與其複合。陽離子脂質體與非陽離子脂質體兩者均已用於向細胞傳遞DNA。
脂質體亦包括「空間穩定」脂質體，如本文所用之該術 語係指包含一或多種特殊化脂質之脂質體。當併入脂質體中時，此等特殊化脂質會產生相對於缺乏此等特殊化脂質之脂質體，循環壽命增加之脂質體。空間穩定脂質體之實例為以下脂質體：脂質體之形成微脂粒之脂質部分的一部分包含一或多種醣脂或經一或多種親水性聚合物，諸如聚乙二醇(PEG)部分衍生化。脂質體及其使用進一步描述於美國專利第6,287,860號中。
本發明之醫藥調配物及組合物亦可包括界面活性劑。界面活性劑在藥品、調配物及乳液中之使用在此項技術中為熟知的。界面活性劑及其使用進一步描述於美國專利第6,287,860號中，該專利以引用的方式併入本文中。
在一個實施例中，本發明採用各種滲透增強劑來高效傳遞核酸，特定言之寡核苷酸。除幫助非親脂性藥物跨越細胞膜進行擴散之外，滲透增強劑亦增強親脂性藥物之滲透性。滲透增強劑可分類為屬於以下五大類之一：亦即界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑及非螯合非界面活性劑。滲透增強劑及其使用進一步描述於美國專利第6,287,860號中，該專利以引用的方式併入本文中。
熟習此項技術者應認識到調配物係根據其預定用途，亦即投藥途徑按常規方式加以設計。
用於局部投藥之較佳調配物包括本發明之寡核苷酸與局部傳遞劑，諸如脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑及界面活性劑進行摻和的調配物。較佳脂質及脂質體包括中性脂質及脂質體(例如二油醯基-磷脂醯基 DOPE乙醇胺、二肉豆蔻醯基磷脂醯基膽鹼DMPC、二硬脂醯基磷脂醯基膽鹼)、帶負電荷脂質及脂質體(例如二肉豆蔻醯基磷脂醯基甘油DMPG)及陽離子脂質及脂質體(例如二油醯基四甲基胺丙基DOTAP及二油醯基-磷脂醯基乙醇胺DOTMA)。
對於局部或其他投藥，本發明之寡核苷酸可囊封在脂質體內或可與脂質體，特定言之與陽離子脂質體形成複合物。或者，寡核苷酸可與脂質，特定言之與陽離子脂質複合。較佳脂肪酸及酯、其醫藥學上可接受之鹽及其使用進一步描述於美國專利第6,287,860號中。
用於經口投藥之組合物及調配物包括散劑或顆粒劑、微顆粒、奈米顆粒、於水或非水性介質中之懸浮液或溶液、膠囊劑、凝膠膠囊劑、藥囊、錠劑或小錠劑。增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑可合乎需要。較佳經口調配物為本發明之寡核苷酸連同一或多種滲透增強劑、界面活性劑及螯合劑投與的調配物。較佳界面活性劑包括脂肪酸及/或其酯或鹽、膽汁酸及/或其鹽。較佳膽汁酸/鹽及脂肪酸及其使用進一步描述於美國專利第6,287,860號中，該專利以引用的方式併入本文中。滲透增強劑之組合，例如脂肪酸/鹽與膽汁酸/鹽之組合亦佳。一種特別較佳之組合為月桂酸、癸酸及UDCA之鈉鹽。其他滲透增強劑包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-十六基醚。本發明之寡核苷酸可以顆粒形式(包括噴霧乾燥粒子)或經複合形成微粒或奈米粒子來經口傳遞。寡核苷酸 複合劑及其使用進一步描述於美國專利第6,287,860號中，該專利以引用的方式併入本文中。
用於非經腸、鞘內或室內投藥之組合物及調配物可包括亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適合添加劑，諸如(但不限於)滲透增強劑、載體化合物及其他醫藥學上可接受之載劑或賦形劑之滅菌水溶液。
本發明之某些實施例提供含有一或多種寡聚化合物及一或多種藉由非反義機制起作用之其他化學治療劑的醫藥組合物。此等化學治療劑實例包括(但不限於)癌症化學治療藥物，諸如道諾黴素(daunorubicin)、柔紅黴素(daunomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、黃膽素(idarubicin)、依索比星(esorubicin)、博來黴素(bleomycin)、馬磷醯胺(mafosfamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、雙氯乙基-亞硝脲(bischloroethyl-nitrosurea)、硫酸布他卡因(busulfan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、放線菌素D(actinomycin D)、光神黴素(mithramycin)、潑尼松(prednisone)、羥孕酮(hydroxyprogesterone)、睪固酮(testosterone)、他莫昔芬(tamoxifen)、達卡巴嗪(dacarbazine)、丙卡巴肼(procarbazine)、六甲基三聚氰胺(hexamethylmelamine)、五甲基三聚氰胺、米托蒽醌(mitoxantrone)、安吖啶(amsacrine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、甲基環己基亞硝脲、氮芥(nitrogen mustard)、美法侖(melphalan)、環磷醯胺、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氮胞苷、羥基 脲、去氧柯福黴素(deoxycoformycin)、4-羥基過氧化環磷醯胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟去氧尿苷(5-FUdR)、甲胺喋呤(MTX)、秋水仙鹼(colchicine)、紫杉醇(taxol)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(VP-16)、三甲曲沙(trimetrexate)、伊立替康(irinotecan)、拓朴替康(topotecan)、吉西他濱(gemcitabine)、替尼泊甙(teniposide)、順鉑(cisplatin)及己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)。當與本發明化合物一起使用時，此等化學治療劑可個別(例如5-FU及寡核苷酸)、依序(例如5-FU及寡核苷酸持續一段時間使用，隨後使用MTX及寡核苷酸)或與一或多種其他此等化學治療劑(例如5-FU、MTX及寡核苷酸，或5-FU、放射線療法及寡核苷酸)組合使用。本發明組合物中亦可組合消炎藥，包括(但不限於)非類固醇消炎藥及皮質類固醇；及抗病毒藥物，包括(但不限於)病毒唑(ribivirin)、阿糖腺苷(vidarabine)、阿昔洛韋(acyclovir)及更昔洛韋(ganciclovir)。反義化合物與其他非反義藥物之組合亦在本發明範疇內。兩種或兩種以上組合之化合物可一起或依序使用。
在另一相關實施例中，本發明組合物可含有一或多種靶向第一核酸之反義化合物，特定言之寡核苷酸；及一或多種靶向第二核酸目標之其他反義化合物。舉例而言，第一目標可為共濟蛋白(FXN)之特定反義序列，且第二目標可為來自另一核苷酸序列之區域。或者，本發明組合物可含有兩種或兩種以上靶向同一共濟蛋白(FXN)核酸目標之不 同區域的反義化合物。反義化合物之眾多實例在本文中加以說明且其他實例可選自此項技術中已知之適合化合物中。兩種或兩種以上組合之化合物可一起或依序使用。
給藥：
咸信治療組合物之調配及其隨後投藥(給藥)在此項技術中之相關人員的技能內。給藥視欲治療之疾病狀態之嚴重性及反應性而定，其中治療過程持續數天至數月，或直至治癒或減弱疾病狀態。最佳給藥時程可由藥物在患者體內之累積之量測結果加以計算。一般技術者可容易確定最佳劑量、給藥方法及重複率。最佳劑量可視個別寡核苷酸之相對效能而變化，且可通常基於在活體外及活體內動物模型中認為有效之EC50加以估計。一般而言，劑量為每公斤體重0.01 μg至100 g，且可每日、每週、每月或每年給與一次或一次以上，或甚至每2至20年給與一次。一般技術者可容易基於量測藥物在體液或組織中之滯留時間及濃度來估計用於給藥的重複率。在成功治療之後，可能需要使患者經受維持療法以防止疾病狀態復發，其中以在每公斤體重0.01 μg至100 g之範圍內之維持劑量，每日一次或一次以上至每20年一次投與寡核苷酸。
在實施例中，用以下藥物劑量治療患者：每公斤體重至少約1 mg、至少約2 mg、至少約3 mg、至少約4 mg、至少約5 mg、至少約6 mg、至少約7 mg、至少約8 mg、至少約9 mg、至少約10 mg、至少約15 mg、至少約20 mg、至少約25 mg、至少約30 mg、至少約35 mg、至少約40 mg、至 少約45 mg、至少約50 mg、至少約60 mg、至少約70 mg、至少約80 mg、至少約90 mg或至少約100 mg。反義寡核苷酸之某些注射劑量描述於例如美國專利第7,563,884號，「Antisense modulation of PTP1B expression」中，該專利以全文引用的方式併入本文中。
儘管以上已描述本發明之各種實施例，但應瞭解其已僅藉由實例而非限制方式加以呈現。可根據本文之揭示內容在不脫離本發明之精神或範疇之情況下對揭示之實施例作眾多變化。因此，本發明之寬度及範疇不應由任何上述實施例限制。
本文提及之所有文獻皆以引用的方式併入本文中。本申請案中引用之所有公開案及專利文獻皆出於所有目的以引用的方式併入本文中，該引用的程度就如同各個別公開案或專利文獻經如此個別表示一般。就在本文件中引用各種參考文獻而言，申請人不承認任何特定參考文獻為其發明之「先前技術」。本發明組合物及方法之實施例在以下實例中加以說明。
實例
以下非限制性實例用於說明本發明之所選實施例。應瞭解比例變化及所示組分之要素之替代物將為熟習此項技術者顯而易知且在本發明之實施例之範疇內。
實例1：設計對共濟蛋白(FXN)之反義核酸分子及/或FXN聚核苷酸之有義股具有特異性的反義寡核苷酸
如上所指示，術語「對...具有特異性之寡核苷酸」或 「靶向...之寡核苷酸」係指具有(i)能夠與一部分靶向基因形成穩定複合物，或(ii)能夠與靶向基因之一部分mRNA轉錄本形成穩定雙螺旋的序列之寡核苷酸。
藉由使用電腦程式(例如IDT AntiSense Design,IDT OligoAnalyzer)來促進對適當寡核苷酸之選擇，該電腦程式自動鑑別各既定序列中將以所要熔融溫度(通常50-60℃)與目標聚核苷酸序列形成雜交體且將不形成自身二聚體或其他複合物二級結構之含19-25個核苷酸之子序列。
藉由使用自動比對核酸序列且指示具有一致性或同源性之區域之電腦程式來進一步促進對適當寡核苷酸之選擇。此等程式用於例如藉由搜尋諸如GenBank之資料庫或藉由對PCR產物定序來比較所得核酸序列。比較來自既定基因組之一定範圍之基因及基因間區域的核酸序列使得可選擇對相關基因顯示適當特異性程度的核酸序列。此等程序使得可選擇展現與目標核酸序列具有高互補程度且與既定基因組中之其他核酸序列具有較低互補程度的寡核苷酸。熟習此項技術者將認識到在選擇用於本發明中之基因之適當區域方面有很大的自由。
當反義化合物與目標核酸之結合會干擾目標核酸之正常功能以致對功能及/或活性進行調節，且存在足夠程度之互補性以避免該反義化合物與非目標核酸序列在特異性結合所要之條件下(亦即在活體內分析或治療性治療之情況下為在生理條件下，及在活體外分析之情況下為在進行分析之條件下)進行非特異性結合時，該反義化合物為「可 特異性雜交的」。
本文所述之寡核苷酸之雜交性質可藉由如此項技術中已知之一或多種活體外分析確定。舉例而言，本文所述之寡核苷酸之性質可藉由使用熔融曲線分析測定目標天然反義與潛在藥物分子之間的結合強度獲得。
目標天然反義與潛在藥物分子(分子)之間的結合強度可使用任何確立之量測分子間相互作用強度之方法，例如熔融曲線分析來估計。
熔融曲線分析測定天然反義/分子複合物自雙股構形快速轉變為單股構形之溫度。此溫度廣泛接受為兩個分子之間相互作用強度的可靠量度。
熔融曲線分析可使用實際天然反義RNA分子之cDNA複本或對應於分子之結合位點之合成DNA或RNA核苷酸進行。含有所有為進行此分析所必需之試劑之多個套組可用(例如Applied Biosystems Inc.MeltDoctor套組)。此等套組包括含有一種雙股DNA(dsDNA)結合染料(諸如ABI HRM染料、SYBR Green、SYTO等)之適合緩衝溶液。dsDNA染料之性質為其幾乎不發射游離形式之螢光，但當與dsDNA結合時具有高度螢光性。
為了進行分析，cDNA或相應寡核苷酸以由特定製造商方案確定之濃度與分子混合。加熱混合物至95℃以解離所有預先形成之dsDNA複合物，接著緩慢冷卻至室溫或由套組製造商確定之其他較低溫度以允許DNA分子黏接。接著緩慢加熱新形成之複合物至95℃，同時連續收集關於由反 應產生之螢光量的資料。螢光強度與反應中存在之dsDNA量成反比。可使用與套組相容之即時PCR儀器(例如ABI之StepOne Plus即時PCR系統或lightTyper儀器，Roche Diagnostics,Lewes,UK)收集資料。
藉由使用適當軟體(例如lightTyper(Roche)或SDS Dissociation Curve,ABI)相對於溫度(x軸)繪製螢光相對於溫度之負導數(在y軸上-d(螢光)/dT)來構築熔融峰。分析資料以鑑別自dsDNA複合物快速轉變為單股分子之溫度。此溫度稱為Tm且與兩個分子之間相互作用強度成正比。通常，Tm將超過40℃。
實例2：調節FXN聚核苷酸 用反義寡核苷酸處理HepG2細胞
實例2中使用之所有反義寡核苷酸皆如實例1中所述設計。委託製造商(IDT Inc.,Coralville,IA)製造所設計之硫代磷酸酯鍵寡核苷酸且提供表2中所示之所設計之硫代磷酸酯類似物。核苷酸之間的星號符號指示存在硫代磷酸酯鍵。為實例2中之實驗所需之寡核苷酸可使用任何適當目前先進技術方法合成，例如由IDT使用之方法：在固體支撐物，諸如5微米控制多孔性玻璃珠(CPG)上，使用胺基磷酸酯單體(所有活性基團經保護基(例如糖上之三苯甲基、A及C上之苯甲醯基及G上之N-2-異丁醯基)保護之正常核苷酸)。保護基阻止在寡核苷酸合成期間之非所要反應。在合成過程結束時移除保護基。初始核苷酸經由3'碳與固體支撐物連接且合成在3'至5'方向上進行。以四步向增長 之寡核苷酸鏈中添加新鹼基：1)使用三氯乙酸自固定核苷酸之5'氧移除保護基；2)使用四唑將固定核苷酸與按順序下一核苷酸偶合在一起；反應經由四唑基胺基磷酸酯中間物進行；3)洗除未反應之游離核苷酸及反應副產物且封端未反應之固定寡核苷酸以防止其參與下一輪合成；封端係藉由使用乙酸酐及N-甲基咪唑使游離5'羥基乙醯化達成；4)為穩定核苷酸之間的鍵，使用碘及水(若欲產生磷酸二酯鍵)或比尤凱格(Beaucage)試劑(3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物)(若需要硫代磷酸酯鍵)使磷氧化。藉由交替兩種氧化劑，可構築嵌合骨架。對序列中之每個核苷酸重複上述四步循環。當合成完全序列時，寡核苷酸自固體支撐物裂開且使用氫氧化銨在高溫下脫除保護基。藉由脫鹽來洗除保護基且凍乾剩餘寡核苷酸。
為進行實例2中設計之實驗，ATCC之HepG2細胞(目錄號HB-8065)在生長培養基(MEM/EBSS(Hyclone目錄號SH30024，或Mediatech目錄號MT-10-010-CV)+10% FBS(Mediatech目錄號MT35-011-CV)+青黴素/鏈黴素(streptomycin)(Mediatech目錄號MT30-002-CI))中在37℃及5% CO2生長。在實驗前1天，細胞以0.5×104個/ml之密度再接種於6孔盤中且在37℃及5% CO2培育隔夜。在實驗當天，6孔盤中之培養基換成新鮮生長培養基。
由製造商以凍乾形式運送之寡核苷酸於去離子無RNAse/DNAse水中稀釋至濃度20 μM。2 μl此溶液與400 μl Opti-MEM培養基(Gibco目錄號31985-070)及4 μl Lipofectamine 2000(Invitrogen目錄號11668019)在室溫一起培育20分鐘，接著向6孔盤之一個孔中逐滴施加HepG2細胞。包括2 μl水替代寡核苷酸溶液的類似混合物用於模擬轉染對照。在37℃及5% CO2培育3-18小時之後，培養基換成新鮮生長培養基。在添加反義寡核苷酸之後48小時，移除培養基且使用Promega之SV總RNA分離系統(目錄號Z3105)或來自Qiagen之RNeasy總RNA分離套組(目錄號74181)遵循製造商說明書自細胞提取RNA。600 ng提取RNA加入使用Thermo Scientific之Verso cDNA套組(目錄號AB1453B)或高容量cDNA反轉錄套組(目錄號4368813)如製造商方案中所述進行之反轉錄反應中。使用此反轉錄反應之cDNA，藉由使用ABI Taqman基因表現混合物(目錄號4369510)及ABI設計之引子/探針進行即時PCR來監測基因表現(根據Applied Biosystems Inc.,Foster City CA之Applied Biosystems Taqman基因表現分析：Hs00175940_m1(FXN))。使用以下PCR循環：50℃ 2分鐘，95℃ 10分鐘，40個循環(95℃ 15秒，60℃ 1分鐘)，使用StepOne Plus即時PCR機(Applied Biosystems)。基於經處理樣品與模擬轉染樣品之間18S校正dCt值之差異計算用反義寡核苷酸處理之後基因表現的倍數變化。
結果：即時PCR結果顯示在用針對FXN反義AI951739所設計之兩種反義寡聚物處理之後48小時，HepG2細胞中之FXN mRNA含量顯著增加(圖1)。
實例3：藉由用靶向FXN特異性天然反義轉錄本之反義寡 核苷酸處理來上調不同細胞株中之FXN mRNA
在實例3中，在一組各種細胞株中，在20 nM之最終濃度下篩檢靶向FXN特異性天然反義轉錄本之具有不同化學組成的反義寡核苷酸。所用細胞來源於不同類型及器官。以下資料證實經由調節FXN特異性天然反義轉錄本之功能使FXN mRNA上調不限於單一寡核苷酸、細胞類型或組織且證明本發明之寡核苷酸會上調生物系統中之FXN之表現。
材料及方法
人類GM03816A纖維母細胞細胞株：人類GM03816A纖維母細胞細胞株獲自在共濟蛋白(FXN)基因(具有約330及380個重複之對偶基因)中攜帶同種接合子GAA擴增之36歲女性病人。此等細胞在達爾伯克氏改良必需培養基(Dulbecco's Modified Essential Medium)(Cellgrow目錄號10-013-CV)+10% FBS(Cellgrow，目錄號35-011-CV)+1%青黴素/鏈黴素(Cellgrow，目錄號30-002-Cl)中在37℃及5%CO2生長。使用以下方法之一用反義寡核苷酸處理細胞。對於次日方法，在實驗之前1天，將細胞於生長培養基中以約2×105個/孔之密度再接種於6孔盤中且在37℃及5% CO2培育隔夜。次日，6孔盤中之培養基換成新鮮生長培養基(1.5毫升/孔)且細胞用反義寡核苷酸進行給藥。所有反義寡核苷酸皆由IDT Inc.(Coralville,IA)製造。所有寡核苷酸之序列皆列於表2中。寡核苷酸之儲備溶液於無DNAse/RNAse之無菌水中稀釋成20 μM之濃度。為對1個孔給藥，2 μl此溶液與400 μl Opti-MEM培養基(Gibco目錄號 31985-070)及4 μl脂染胺2000(Invitrogen目錄號11668019)一起在室溫培育20分鐘且向具有細胞之6孔盤之一個孔中逐滴施加。包括2 μl水替代寡核苷酸溶液之類似混合物用於模擬轉染對照。在37℃及5% CO2培育約18小時之後，培養基換成新鮮生長培養基。在添加反義寡核苷酸之後48小時，移除培養基且使用Promega之SV總RNA分離系統(目錄號Z3105)遵循製造商說明書自細胞提取RNA。600奈克經純化之總RNA加入使用Invitrogen之SuperScript VILO cDNA合成套組(目錄號11754-250)如製造商方案中所述進行之反轉錄反應中。來自此反轉錄反應之cDNA用於藉由使用ABI Taqman基因表現混合物(目錄號4369510)及由ABI設計之引子/探針進行即時PCR來監測基因表現(針對人類FXN之分析Hs00175940_m1)。使用所有3個分析獲得之結果極類似。使用以下PCR循環：50℃ 2分鐘，95℃ 10分鐘，40個循環(95℃ 15秒，60℃ 1分鐘)，使用StepOne Plus即時PCR系統(Applied Biosystems)。18S之分析由ABI製造(目錄號4319413E)。基於經處理樣品與模擬轉染樣品之間18S校正dCt值之差異計算用反義寡核苷酸處理之後基因表現的倍數變化。對於替代性同一天方法，所有程序皆類似地進行，但細胞在第一天在其分配至6孔盤中之後即刻用反義寡核苷酸進行給藥。
人類GM15850D淋巴細胞：人類GM15850D淋巴母細胞細胞株。人類GM03816A纖維母細胞細胞株獲自在共濟蛋白(FXN)基因(具有約650及1030個重複之對偶基因)中攜帶 同種接合子GAA擴增之13歲男性病人。此等細胞在含2 ml L-麩醯胺酸之RPMI 1640(ATCC目錄號30-2001)+5%非熱不活化FBS(Cellgrow，目錄號35-010 CV)+1%青黴素/鏈黴素(Cellgrow，目錄號30-002-Cl)中在37℃及5% CO2生長。使用以下方法用反義寡核苷酸處理細胞。細胞於生長培養基中以約3×105個/孔之密度接種於6孔盤中且在37℃及5% CO2培育隔夜並即刻用反義寡核苷酸給藥；在給藥之後，各孔僅含有1.5 ml。寡核苷酸之儲備溶液於無DNAse/RNAse之無菌水中稀釋成20 μM之濃度。為對1個孔給藥，2 μl此溶液與400 μl Opti-MEM培養基(Gibco目錄號31985-070)及4 μl脂染胺2000(Invitrogen目錄號11668019)一起在室溫培育20分鐘且向具有細胞之6孔盤之一個孔中逐滴施加。包括2 μl水替代寡核苷酸溶液之類似混合物用於模擬轉染對照。所有反義寡核苷酸皆由IDT Inc.(Coralville,IA)製造。所有寡核苷酸之序列皆列於表2中。次日，添加1.5 ml新鮮培養基至6孔盤之各孔中。在給藥之後48小時，用相同反義寡核苷酸處理之細胞於15 ml錐形管中匯合在一起；模擬轉染細胞於15 ml錐形管中匯合在一起。在彼時，細胞在120 g下離心6分鐘且丟棄培養基。溶解細胞集結粒以遵循製造商說明書使用Promega之SV總RNA分離系統(目錄號Z3105)提取細胞RNA。600奈克經純化之總RNA加入使用Invitrogen之SuperScript VILO cDNA合成套組(目錄號11754-250)如製造商方案中所述進行之反轉錄反應中。此反轉錄反應之cDNA用於藉由使用ABI Taqman基因表現混 合物(目錄號4369510)及由ABI設計之引子/探針進行即時PCR來監測基因表現(針對人類FXN之分析Hs00175940_m1)。使用所有3個分析獲得之結果極類似。使用以下PCR循環：50℃ 2分鐘，95℃ 10分鐘，40個循環(95℃ 15秒，60℃ 1分鐘)，使用StepOne Plus即時PCR系統(Applied Biosystems)。18S之分析由ABI製造(目錄號4319413E)。基於經處理樣品與模擬轉染樣品之間18S校正dCt值之差異計算用反義寡核苷酸處理之後基因表現的倍數變化。對於替代性同一天方法，所有程序皆類似地進行，但細胞在第一天在其分配至6孔盤中之後即刻用反義寡核苷酸進行給藥。
CHP-212細胞株：ATCC之CHP-212人類神經母細胞瘤細胞(目錄號CRL-2273)在生長培養基(MEM與F12(分別為ATCC目錄號30-2003及Mediatech目錄號10-080-CV)之1：混合物+10% FBS(Mediatech目錄號MT35-011-CV)+青黴素/鏈黴素(Mediatech目錄號MT30-002-CI))中在37℃及5% CO2生長。使用以下方法之一用反義寡核苷酸處理細胞。對於次日方法，在實驗之前1天，將細胞於生長培養基中以約2×105個/孔之密度再接種於6孔盤中且在37℃及5% CO2培育隔夜。次日，6孔盤中之培養基換成新鮮生長培養基(1.5毫升/孔)且細胞用反義寡核苷酸進行給藥。所有反義寡核苷酸皆由IDT Inc.(Coralville,IA)製造。所有寡核苷酸之序列皆列於表2中。寡核苷酸之儲備溶液於無DNAse/RNAse之無菌水中稀釋成20 μM之濃度。為對1個孔給藥，2 μl此溶 液與400 μl Opti-MEM培養基(Gibco目錄號31985-070)及4 μl脂染胺2000(Invitrogen目錄號11668019)一起在室溫培育20分鐘且向具有細胞之6孔盤之一個孔中逐滴施加。包括2 μl水替代寡核苷酸溶液之類似混合物用於模擬轉染對照。在37℃及5% CO2培育約18小時之後，培養基換成新鮮生長培養基。在添加反義寡核苷酸之後48小時，移除培養基且使用Promega之SV總RNA分離系統(目錄號Z3105)遵循製造商說明書自細胞提取RNA。600奈克經純化之總RNA加入使用Invitrogen之SuperScript VILO cDNA合成套組(目錄號11754-250)如製造商方案中所述進行之反轉錄反應中。此反轉錄反應之cDNA用於藉由使用ABI Taqman基因表現混合物(目錄號4369510)及由ABI設計之引子/探針進行即時PCR來監測基因表現(針對人類FXN之分析Hs00175940_m1)。使用所有3個分析獲得之結果極類似。使用以下PCR循環：50℃ 2分鐘，95℃ 10分鐘，40個循環(95℃ 15秒，60℃ 1分鐘)，使用StepOne Plus即時PCR系統(Applied Biosystems)。18S之分析由ABI製造(目錄號4319413E)。基於經處理樣品與模擬轉染樣品之間18S校正dCt值之差異計算用反義寡核苷酸處理之後基因表現的倍數變化。對於替代性同一天方法，所有程序皆類似地進行，但細胞在第一天在其分配至6孔盤中之後即刻用反義寡核苷酸進行給藥。
HepG2細胞株：ATCC之HepG2人類肝細胞癌細胞(目錄號HB-8065)在生長培養基(MEM/EBSS(Hyclone目錄號 SH30024，或Mediatech目錄號MT-10-010-CV)+10% FBS(Mediatech目錄號MT35-011-CV)+1%青黴素/鏈黴素(Mediatech目錄號MT30-002-CI))中在37℃及5% CO2生長。使用以下方法之一用反義寡核苷酸處理細胞。對於次日方法，在實驗之前1天，細胞於生長培養基中以約2×105個/孔之密度再接種於6孔盤中且在37℃及5% CO2培育隔夜。次日，6孔盤中之培養基換成新鮮生長培養基(1.5毫升/孔)且細胞用反義寡核苷酸進行給藥。所有反義寡核苷酸皆由IDT Inc.(Coralville,IA)製造。所有寡核苷酸之序列皆列於表2中。寡核苷酸之儲備溶液於無DNAse/RNAse之無菌水中稀釋成20 μM之濃度。為對1個孔給藥，2 μl此溶液與400 μl Opti-MEM培養基(Gibco目錄號31985-070)及4 μl脂染胺2000(Invitrogen目錄號11668019)一起在室溫培育20分鐘且向具有細胞之6孔盤之一個孔中逐滴施加。包括2 μl水替代寡核苷酸溶液之類似混合物用於模擬轉染對照。在37℃及5% CO2培育約18小時之後，培養基換成新鮮生長培養基。在添加反義寡核苷酸之後48小時，移除培養基且使用Promega之SV總RNA分離系統(目錄號Z3105)遵循製造商說明書自細胞提取RNA。600奈克經純化之總RNA加入使用Invitrogen之SuperScript VILO cDNA合成套組(目錄號11754-250)如製造商方案中所述進行之反轉錄反應中。來自此反轉錄反應之cDNA用於藉由使用ABI Taqman基因表現混合物(目錄號4369510)及由ABI設計之引子/探針進行即時PCR來監測基因表現(針對人類FXN之分析Hs00175940_m1)。 使用所有3個分析獲得之結果極類似。使用以下PCR循環：50℃ 2分鐘，95℃ 10分鐘，40個循環(95℃ 15秒，60℃ 1分鐘)，使用StepOne Plus即時PCR系統(Applied Biosystems)。18S之分析由ABI製造(目錄號4319413E)。基於經處理樣品與模擬轉染樣品之間18S校正dCt值之差異計算用反義寡核苷酸處理之後基因表現的倍數變化。對於替代性同一天方法，所有程序皆類似地進行，但細胞在第一天在其分配至6孔盤中之後即刻用反義寡核苷酸進行給藥。
結果：相較於模擬轉染對照，在用20 nM反義寡核苷酸處理之後，不同細胞株中之FXN mRNA含量展示於表3中。如自資料所見，當以20 nM施加時，一些寡核苷酸在上調FXN mRNA含量方面具有高度活性且在人類(初級細胞株)中，在源於不同細胞類型/器官之細胞株HepG2肝癌細胞株(肝)、GM15850D患者淋巴母細胞細胞株(血液)、CHP-212神經母細胞瘤細胞株(腦)、GM03816A患者纖維母細胞細胞株中一致顯示上調。針對天然反義序列設計之一些寡核苷酸不影響或僅輕微影響所有或一些測試細胞株中之FXN mRNA含量。此等差異與指示寡核苷酸之結合可能取決於寡核苷酸之目標序列之二級及三級結構的文獻資料一致。
表3展示用靶向FXN特異性天然反義轉錄本之反義寡核苷酸處理之細胞中的FXN mRNA的相對表現。以下縮寫在不同細胞類型及器官(肝、血液、纖維母細胞、腦)中可 用。對於關於此處呈現之細胞之更多資訊，參見實例1及2之報導。
儘管本發明已關於一或多個實施例加以說明及描述，但熟習此項技術者在閱讀及理解本說明書及附圖後將想到等效變化及修改。此外，儘管本發明之特定特徵可能已僅關於若干實施例之一加以揭示，但當可能為任何既定或特定應用所需及對任何既定或特定應用有利時，此特徵可與其他實施例之一或多個其他特徵組合。
本發明之摘要將允許讀者快速探明技術揭示內容之性質。應瞭解其不應用於解釋或限制以下申請專利範圍之範疇或意義。
圖1：藉由用靶向FXN特異性天然反義轉錄本之反義寡 核苷酸對HepG2細胞給藥達成之FXN mRNA上調。HepG2肝癌細胞株用靶向FXN特異性天然反義轉錄本之不同反義寡核苷酸(CUR-0732、CUR-0733、CUR-0734及CUR-0735)在20 nM下給藥。在給藥48小時之後，藉由逆轉錄(RT)即時聚合酶鏈反應(PCR)定量FXN mRNA。基於經給藥細胞(添加CUR寡核苷酸至細胞)與模擬細胞(添加非特異性寡核苷酸至細胞)之間的經18S校正之不同值計算歸因於寡核苷酸處理FXN mRNA之相對表現變化。表示為CUR-0732、CUR-0733、CUR-0734及CUR-0735之柱條分別對應於用SEQ ID NO：3至6處理之樣品。
圖2：藉由用靶向FXN特異性天然反義轉錄本之反義寡核苷酸對CHP-212細胞給藥達成之FXN mRNA上調。CHP-212神經母細胞瘤細胞株用靶向FXN特異性天然反義轉錄本之不同反義寡核苷酸(CUR-0732、CUR-0733、CUR-0734及CUR-0735)在20 nM下給藥。在給藥48小時之後，藉由逆轉錄(RT)即時聚合酶鏈反應(PCR)定量FXN mRNA。基於經給藥細胞(添加CUR寡核苷酸至細胞)與模擬細胞(添加非特異性寡核苷酸至細胞)之間的經18S校正之不同值計算歸因於寡核苷酸處理FXN mRNA之相對表現變化。表示為CUR-0732、CUR-0733、CUR-0734及CUR-0735之柱條分別對應於用SEQ ID NO：3至6處理之樣品。
圖3：藉由用靶向FXN特異性天然反義轉錄本之反義寡核苷酸對GM03816患者纖維母細胞細胞株給藥達成之FXN mRNA上調。GM03816患者纖維母細胞細胞株用靶向FXN 特異性天然反義轉錄本之不同反義寡核苷酸(CUR-0732、CUR-0733、CUR-0734及CUR-0735)在20 nM下給藥。在給藥48小時之後，藉由逆轉錄(RT)即時聚合酶鏈反應(PCR)定量FXN mRNA。基於經給藥細胞(添加CUR寡核苷酸至細胞)與模擬細胞(添加非特異性寡核苷酸至細胞)之間的經β-肌動蛋白校正之不同值計算歸因於寡核苷酸處理FXN mRNA之相對表現變化。表示為CUR-0732、CUR-0733、CUR-0734及CUR-0735之柱條分別對應於用SEQ ID NO：3至6處理之樣品。
圖4：藉由用靶向FXN特異性天然反義轉錄本之反義寡核苷酸對GM15850患者淋巴母細胞細胞株給藥達成之FXN mRNA上調。GM15850患者淋巴母細胞細胞株用靶向FXN特異性天然反義轉錄本之不同反義寡核苷酸(CUR-0732、CUR-0733、CUR-0734及CUR-0735)在20 nM下給藥。在給藥48小時之後，藉由逆轉錄(RT)即時聚合酶鏈反應(PCR)定量FXN mRNA。基於經給藥細胞(添加CUR寡核苷酸至細胞)與模擬細胞(添加非特異性寡核苷酸至細胞)之間的經18S校正之不同值計算歸因於寡核苷酸處理FXN mRNA之相對表現變化。表示為CUR-0732、CUR-0733、CUR-0734及CUR-0735之柱條分別對應於用SEQ ID NO：3至6處理之樣品。
圖5：藉由用靶向FXN特異性天然反義轉錄本之反義寡核苷酸對GM15850患者淋巴母細胞細胞株給藥達成之FXN mRNA上調。GM15850患者淋巴母細胞細胞株用靶向FXN 特異性天然反義轉錄本之不同反義寡核苷酸(CUR-0732、CUR-0734)在20 nM下給藥。在給藥48小時之後，藉由逆轉錄(RT)即時聚合酶鏈反應(PCR)定量FXN mRNA。基於經給藥細胞(添加CUR寡核苷酸之細胞)與模擬細胞(添加非特異性寡核苷酸之細胞)之間的經β-肌動蛋白校正之不同值計算歸因於寡核苷酸處理FXN mRNA之相對表現變化。表示為CUR-0732及CUR-0734之柱條分別對應於用SEQ ID NO：3及5處理之樣品。18S及β肌動蛋白為即時PCR之標準對照。
序列表描述-SEQ ID NO：1：智人共濟蛋白(FXN)，編碼粒線體蛋白質之核基因，轉錄本變異體2，mRNA(NCBI寄存編號：NM_181425)；SEQ ID NO：2：天然FXN反義序列(AI951739)；SEQ ID NO：3至6：反義寡核苷酸。
<110>
<120> 藉由抑制共濟蛋白(FRATAXIN，FXN)之天然反股轉錄本治療FXN相關疾病
<130> FXN
<140> 101120802
<141> 2012-06-08
<150> 61/494,928
<151> 2011-06-09
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7176
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
Figure TWI678375B_D0005
Figure TWI678375B_D0006
Figure TWI678375B_D0007
Figure TWI678375B_D0008
<210> 2
<211> 454
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
Figure TWI678375B_D0009
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義寡核苷酸
<400> 3
Figure TWI678375B_D0010
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義寡核苷酸
<400> 4
Figure TWI678375B_D0011
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義寡核苷酸
<400> 5
Figure TWI678375B_D0012
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反義寡核苷酸
<400> 6
Figure TWI678375B_D0013

Claims (41)

  1. 一種活體外上調細胞或細胞模型中之共濟蛋白(FXN)聚核苷酸之功能及/或表現的方法，其包括：使該系統與至少一種10至30個核苷酸長度之反義寡核苷酸接觸，其中該至少一種寡核苷酸與選自SEQ ID NO：2之共濟蛋白(FXN)聚核苷酸之天然反義聚核苷酸之反向互補序列具有至少90%序列一致性；藉此上調該共濟蛋白(FXN)聚核苷酸之功能及/或表現。
  2. 一種活體外上調細胞或細胞模型中之共濟蛋白(FXN)聚核苷酸之功能及/或表現的方法，其包括：使該系統與至少一種10至30個核苷酸長度之反義寡核苷酸接觸，其靶向且與該共濟蛋白(FXN)聚核苷酸之天然反義聚核苷酸之互補區域特異性雜交，該FXN聚核苷酸之天然反義聚核苷酸選自SEQ ID NO：2；藉此上調該共濟蛋白(FXN)聚核苷酸之功能及/或表現。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該共濟蛋白(FXN)之功能及/或表現比對照組增加。
  4. 如請求項1或2之方法，其中該至少一種反義寡核苷酸靶向共濟蛋白(FXN)聚核苷酸之編碼及/或非編碼核酸序列之天然反義聚核苷酸。
  5. 如請求項1或2之方法，其中該至少一種反義寡核苷酸靶向具有與共濟蛋白(FXN)聚核苷酸重疊及/或非重疊序列之天然反義聚核苷酸。
  6. 如請求項1或2之方法，其中該至少一種反義寡核苷酸包含一或多個選自以下之修飾：至少一個經修飾之糖部分、至少一個經修飾之核苷間鍵聯、至少一個經修飾之核苷酸及其組合。
  7. 如請求項6之方法，其中該一或多個修飾包含至少一個選自以下之經修飾之糖部分：2'-O-甲氧基乙基修飾之糖部分、2'-甲氧基修飾之糖部分、2'-O-烷基修飾之糖部分、雙環糖部分及其組合。
  8. 如請求項6之方法，其中該一或多個修飾包含至少一個選自以下之經修飾之核苷間鍵聯：硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、胺基磷酸酯(phosphoramidate)、胺基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、胺基乙酸酯(acetamidate)、羧甲基酯及其組合。
  9. 如請求項6之方法，其中該一或多個修飾包含至少一個選自以下之經修飾之核苷酸：肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、阿糖核酸(FANA)及其組合。
  10. 一種活體外上調哺乳動物細胞或組織中之共濟蛋白(FXN)基因之功能及/或表現的方法，其包括：使該等細胞或組織與至少一種長度19至30個核苷酸之短干擾RNA(siRNA)寡核苷酸接觸，該至少一種siRNA寡核苷酸對共濟蛋白(FXN)聚核苷酸之天然反義聚核苷酸的非重疊區域具有特異性，該FXN聚核苷酸之天然反義聚核苷酸選自SEQ ID NO：2。
  11. 一種至少一種長度10至30個核苷酸之反義寡核苷酸之用途，其係用於製造用於上調哺乳動物細胞或組織中之共濟蛋白(FXN)聚核苷酸之功能及/或表現的藥劑，其中該至少一種寡核苷酸靶向且與選自SEQ ID NO：2之天然反義聚核苷酸之互補區域特異性雜交，並上調共濟蛋白(FXN)聚核苷酸之表現。
  12. 如請求項11之用途，其中該至少一種寡核苷酸與包含SEQ ID NO：2之天然反義轉錄本核苷酸1至454內之10至30個連續核苷酸之聚核苷酸的反向互補序列具有至少90%序列一致性。
  13. 如請求項11或12之用途，其中該至少一種寡核苷酸包含至少一種如SEQ ID NO：3至6所示之寡核苷酸序列。
  14. 如請求項11或12之用途，其中該共濟蛋白(FXN)之功能及/或表現比對照組增加。
  15. 如請求項11或12之用途，其中該至少一種反義寡核苷酸靶向共濟蛋白(FXN)聚核苷酸之編碼及/或非編碼核酸序列之天然反義聚核苷酸。
  16. 如請求項11或12之用途，其中該至少一種反義寡核苷酸靶向具有與共濟蛋白(FXN)聚核苷酸重疊及/或非重疊序列之天然反義聚核苷酸。
  17. 如請求項11或12之用途，其中該至少一種反義寡核苷酸包含一或多個選自以下之修飾：至少一個經修飾之糖部分、至少一個經修飾之核苷間鍵聯、至少一個經修飾之核苷酸及其組合。
  18. 如請求項17之用途，其中該一或多個修飾包含至少一個選自以下之經修飾之糖部分：2'-O-甲氧基乙基修飾之糖部分、2'-甲氧基修飾之糖部分、2'-O-烷基修飾之糖部分、雙環糖部分及其組合。
  19. 如請求項17之用途，其中該一或多個修飾包含至少一個選自以下之經修飾之核苷間鍵聯：硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、胺基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
  20. 如請求項17之用途，其中該一或多個修飾包含至少一個選自以下之經修飾之核苷酸：肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、阿糖核酸(FANA)及其組合。
  21. 一種至少一種長度19至30個核苷酸之短干擾RNA(siRNA)寡核苷酸之用途，其係用於製造用於上調哺乳動物細胞或組織中之共濟蛋白(FXN)基因之功能及/或表現的藥劑，其中該至少一種siRNA寡核苷酸對共濟蛋白(FXN)聚核苷酸之天然反義聚核苷酸具有特異性，該FXN聚核苷酸之天然反義聚核苷酸選自SEQ ID NO：2，且其中該至少一種siRNA寡核苷酸靶向且與該共濟蛋白(FXN)聚核苷酸之天然反義聚核苷酸之互補、非重疊區域特異性雜交。
  22. 一種包含至少一個修飾之合成性經修飾之10至30個核苷酸長度之寡核苷酸，其中該至少一個修飾係選自：至少一個經修飾之糖部分；至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯；至少一個經修飾之核苷酸及其組合；其中該寡核苷酸為反義化合物，其靶向且與選自SEQ ID NO：2之共濟蛋白(FXN)聚核苷酸之天然反義聚核苷酸的互補區域特異性雜交，且相較於正常對照組，其在活體內或活體外上調共濟蛋白(FXN)基因之功能及/或表現。
  23. 如請求項22之寡核苷酸，其中該至少一個修飾包含選自由以下組成之群之核苷酸間鍵聯：硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、胺基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
  24. 如請求項22之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。
  25. 如請求項22之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯之骨架。
  26. 如請求項22之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸，該經修飾之核苷酸選自：肽核酸、鎖核酸(LNA)及其組合。
  27. 如請求項22之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含複數個修飾，其中該等修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸：硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、胺基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
  28. 如請求項22之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含複數個修飾，其中該等修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸：肽核酸、鎖核酸(LNA)及其組合。
  29. 如請求項22之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含至少一個選自以下之經修飾之糖部分：2'-O-甲氧基乙基修飾之糖部分、2'-甲氧基修飾之糖部分、2'-O-烷基修飾之糖部分、雙環糖部分及其組合。
  30. 如請求項22之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含複數個修飾，其中該等修飾包含選自以下之經修飾之糖部分：2'-O-甲氧基乙基修飾之糖部分、2'-甲氧基修飾之糖部分、2'-O-烷基修飾之糖部分、雙環糖部分及其組合。
  31. 如請求項22之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含如SEQ ID NO：3至6所示之序列。
  32. 一種醫藥組合物，其包含一或多種如請求項22至31中任一項之寡核苷酸及醫藥學上可接受之賦形劑。
  33. 如請求項32之組合物，其中該等寡核苷酸相較於如SEQ ID NO：3至6所示之任一核苷酸序列具有至少約40%序列一致性。
  34. 如請求項32之組合物，其中該等寡核苷酸包含如SEQ ID NO：3至6所示之核苷酸序列。
  35. 如請求項34之組合物，其中如SEQ ID NO：3至6所示之該等寡核苷酸包含一或多個修飾或取代。
  36. 如請求項34之組合物，其中該一或多個修飾係選自：硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、鎖核酸(LNA)分子及其組合。
  37. 一種至少一種如請求項22至31中任一項之寡核苷酸的用途，其係用於製造用於預防或治療與至少一種共濟蛋白(FXN)聚核苷酸及/或其至少一種編碼產物相關之疾病的藥劑。
  38. 如請求項37之用途，其中與該至少一種共濟蛋白(FXN)聚核苷酸相關之疾病係選自：與FXN之異常功能及/或表現相關之疾病或病症、弗里德棘希氏共濟失調(Freidreich's ataxia)、雷氏症候群(Leigh's syndrome)、癌症、增生性疾病或病症、異常細胞增殖、神經疾病或病症、與粒線體功能受損相關之疾病或病症、由後天粒線體功能障礙引起之神經退化性疾病或病症、與氧化壓力相關之疾病或病症、發炎及自體免疫疾病或病症。
  39. 如請求項37或38之用途，其中該至少一種寡核苷酸係選自如SEQ ID NO：3至6所示之任一核苷酸序列。
  40. 如請求項37或38之用途，其中該FXN聚核苷酸包含SEQ ID NO：1。
  41. 一種鑑別及選擇至少一種寡核苷酸用於活體內投藥之方法，該寡核苷酸對選自SEQ ID NO：2之FXN基因之天然反義轉錄本所選目標聚核苷酸具有選擇性，其包括：鑑別至少一種包含至少部分互補於該所選目標聚核苷酸之反義聚核苷酸的至少10個連續核苷酸之寡核苷酸；量測該反義寡核苷酸與該目標聚核苷酸或該所選目標聚核苷酸之反義聚核苷酸在嚴格雜交條件下的雜交體(hybridization)之熱熔點；及基於所獲得之資訊選擇至少一種寡核苷酸用於活體內投藥。
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