ES2445208T3 - Compuestos de 2,4-pirimidindiamina para uso en métodos para tratar o prevenir enfermedades autoinmunitarias - Google Patents

Compuestos de 2,4-pirimidindiamina para uso en métodos para tratar o prevenir enfermedades autoinmunitarias Download PDF

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Jeffrey Clough
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Catherine Sylvain
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Abstract

Un compuesto de formula (Ia) o una sal del mismo, en la que: R5 se selecciona del grupo que consiste en halógeno, halógeno, -ORd, -SRd, haloalquiloxi (C1-C3), perhaloalquiloxi (C1- C3), -NRcRc, haloalquilo (C1-C3), perhaloalquilo (C1-C3), -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, -N3, -S(O)Rd, -S(O)2Rd, - S(O)2ORd, -S(O)NRcRc; -S(O)2NRcRc, -OS(O)Rd, -OS(O)2Rd, -OS(O)2ORd, -OS(O)NRcRc, -OS(O)2NRcRc, -C(O)Rd, - C(O)ORd, -C(O)NRcRc, -C(NH)NRcRc, -OC(O)Rd, -SC(O)Rd, -OC(O)ORd, -SC(O)ORd, -OC(O) NRcRc, -SC(O)NRcRc, - OC(NH)NRcRc, -SC(NH)NRcRc, -[NHC(O)]nRd, -[NHC(O)]nORd, -[NHC(O)]nNRcRc y -[NHC(NH)]nNRcRc, arilo (C5-C10) opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos grupos R8 o diferentes, arilalquilo (C6-C16) opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos grupos R8 o diferentes, heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos grupos R8 o diferentes, y heteroarilalquilo de 6-16 miembros opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos grupos R8 o diferentes, alquilo (C1-C6) opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos grupos R8 o diferentes, alcanilo (C1-C4) opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos grupos R8 o diferentes, alquenilo (C2-C4) opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos grupos R8 o diferentes, y alquinilo (C2-C4) opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos grupos R8 o diferentes; cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, -ORd, -SRd, haloalquiloxi (C1-C3), perhaloalquiloxi (C1-C3), -NRcRc, haloalquilo (C1-C3), perhaloalquilo (C1-C3), -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, - NO2, -N3, -S(O)Rd, -S(O)2Rd, -S(O)2ORd, -S(O)NRcRc; -S(O)2NRcRc, -OS(O)Rd, -OS(O)2Rd, -OS(O)2ORd, -OS(O)NRcRc, - OS(O)2NRcRc, -C(O)Rd, -C(O)ORd, -C(O)NRcRc, -C(NH)NRcRc, -OC(O)Rd, -SC(O)Rd, -OC(O)ORd, -SC(O)ORd, - OC(O)NRcRc, -SC(O)NRcRc, -OC(NH)NRcRc, -SC(NH)NRcRc, -[NHC(O)]nRd, -[NHC(O)]nORd, -[NHC(O)]nNRcRc y - [NHC(NH)]nNRcRc, arilo (C5-C10) opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos grupos R8 o diferentes, arilalquilo (C6-C16) opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos grupos R8 o diferentes, heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos grupos R8 o diferentes, y heteroarilalquilo de 6-16 miembros opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos grupos R8 o diferentes.

Description

Compuestos de 2,4-pirimidindiamina para uso en metodos para tratar o prevenir enfermedades autoinmunitarias
1. REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reivindica el beneficio bajo 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud Serie n° 60/399.673, presentada el 29 de julio 5 2002; Serie n° 60/443.949, presentada el 31 de enero de 2003; y Serie n° 60/452.339, presentada el 6 de marzo de 2003.
2. CAMPO DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere generalmente a compuestos de 2,4-pirimidindiamina, a composiciones farmaceuticas que comprenden los compuestos, a intermedios y a metodos sinteticos para obtener los compuestos, y a los 10 compuestos y composiciones para uso en una variedad de contextos, tal como en el tratamiento o prevencion de enfermedades autoinmunitarias y/o los sintomas asociados con ellas.
3. ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La reticulacion de los receptores Fc, tales como el receptor de elevada afinidad por IgE (FcERI) y/o el receptor de elevada afinidad por IgG (FcyRI), activa una cascada de senalizacion en mastocitos, basofilos y otras celulas 15 inmunitarias que da como resultado la liberacion de mediadores quimicos responsables de numerosos sucesos adversos. Por ejemplo, tal reticulacion conduce a la liberacion de mediadores preformados de reacciones de hipersensibilidad anafilactica de tipo I (inmediata), tales como histamina, desde los sitios de almacenamiento en granulos via la desgranulacion. Tambien conduce a la sintesis y liberacion de otros mediadores, incluyendo leucotrienos, prostaglandinas y factores activadores de plaquetas (PAF), que desempenan papeles importantes en
20 reacciones inflamatorias. Mediadores adicionales que se sintetizan y se liberan con la reticulacion de receptores Fc incluyen citocinas y oxido nitrico.
La cascada o cascadas de senalizacion activadas por la reticulacion de receptores Fc tales como FceRI y/o FcyRI comprenden un conjunto de proteinas celulares. Entre los propagadores de senales intracelulares mas importantes estan las tirosina cinasas. Y, una tirosina cinasa importante implicada en las rutas de transduccion de senales asociadas
25 con la reticulacion de los receptores FcsRI y/o FcyRI, asi como otras cascadas de transduccion de senales, es Syk cinasa (vease Valent et al., 2002, Intl. J. Hematol. 75(4):257-362 para un repaso).
Puesto que los mediadores liberados como resultado de la reticulacion de los receptores FcsRI y FcyRI son responsables de, o desempenan papeles importantes en, la manifestacion de numerosos sucesos adversos, seria muy deseable la disponibilidad de compuestos capaces de inhibir la cascada o cascadas de senalizacion responsables de su
30 liberacion. Ademas, dado el papel critico que Syk cinasa desempena en esta(s) y en otra(s) cascada(s) de senalizacion de receptores, tambien seria muy deseable la disponibilidad de compuestos capaces de inhibir Syk cinasa.
El documento WO 01/600.816 describe inhibidores de cinasas.
1. SUMARIO DE LA INVENCION
Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina, como se discutira con mas detalle mas abajo, tienen una miriada de 35 actividades biologicas. Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina comprenden un "nucleo" de 2,4-pirimidindiamina que tiene la siguiente estructura y convencion numerica:
Los compuestos de la invencion tienen la formula (1a) como se define mas abajo, y estan sustituidos en los nitrogenos de C2 y C4 (N2 y N4) para formar aminas secundarias, y ademas estan opcionalmente sustituidos en una o mas de las 40 siguientes posiciones: la posicion C5 y/o la posicion C6.
La presente invencion proporciona compuestos de formula (1a) o una sal del mismo, en la que
R5 se selecciona del grupo que consiste en halogeno, -ORd, -SRd, haloalquiloxi (C1-C3), perhaloalquiloxi (C1-C3), -NRcRc, haloalquilo (C1-C3), perhaloalquilo (C1-C3), -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, -N3, -S(O)Rd, -S(O)2Rd, -S(O)2ORd, -S(O)NRcRc; -S(O)2NRcRc, -OS(O)Rd, -OS(O)2Rd, -OS(O)2ORd, -OS(O)NRcRc, -OS(O)2NRcRc, -C(O) Rd, -C(O)ORd, -C(O)NRcRc, -C(NH)NRcRc, -OC(O)Rd, -SC(O)Rd, -OC(O)ORd, -SC(O)ORd, -OC(O)NRcRc, -SC(O)NRcRc, -OC(NH)NRcRc, -SC(NH)NRcRc, -[NHC(O)]nRd, -[NHC(O)]nORd, -[NHC(O)]nNRcRc y -[NHC(NH)]nNRcRc, arilo (C5-C10) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, arilalquilo (C6-C16) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, y heteroarilalquilo de 6-16 miembros opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, alquilo (C1-C6) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, alcanilo (C1-C4) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, alquenilo (C2-C4) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, y alquinilo (C2-C4) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes;
cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, halogeno, -ORd, -SRd, haloalquiloxi (C1-C3), perhaloalquiloxi (C1-C3), -NRcRc, haloalquilo (C1-C3), perhaloalquilo (C1-C3), -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, -N3, -S(O)Rd, -S(O)2Rd, -S(O)2ORd, -S(O)NRcRc; -S(O)2NRcRc, -OS(O)Rd, -OS(O)2Rd, -OS(O)2ORd, -OS(O)NRcRc, -OS(O)2NRcRc, -C(O)Rd, -C(O)ORd, -C(O)NRcRc, -C(NH)NRcRc, -OC(O)Rd, -SC(O)Rd, -OC(O)ORd, -SC(O)ORd, -OC(O)NRcRc, -SC(O)NRcRc, -OC(NH)NRcRc, -SC(NH)NRcRc, -[NHC(O)]nRd, -[NHC(O)]nORd, -[NHC(O)]nNRcRc y -[NHC(NH)]nNRcRc, arilo (C5-C10) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, arilalquilo (C6-C16) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, y heteroarilalquilo de 6-16 miembros opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes
R8 se selecciona del grupo que consiste en Ra, Ra sustituido con uno o mas del mismo o diferente Ra o Rb, Rb, -ORa sustituidos con uno o mas del mismo o diferente Ra o Rb, -B(ORa)2, -B(NRcRc)2, -(CH2)m-Rb, -(CHRa)m-Rb, -O-(CH2)m-Rb, -S-(CH2)m-Rb, -O-CHRaRb, -O-CRa(Rb)2, -O-(CHRa)m-Rb, -O-(CH2)m-CH[(CH2)mRb]Rb, -S-(CHRa)m-Rb, -C(O)NH-(CH2)m-Rb, -C(O)NH-(CHRa)m-Rb, -O-(CH2)m-C(O)NH-(CH2)m-Rb, -S-(CH2)m-C(O)NH-(CH2)m-Rb, -O-(CHRa)m-C(O)NH-(CHRa)m-Rb, -S-(CHRa)m-C(O)NH-(CHRa)m-Rb, -NH-(CH2)m-Rb, -NH-(CHRa)m-Rb, -NH[(CH2)mRb], -N[(CH2)mRb]2, -NH-C(O)-NH(CH2)m-Rb, -NH-C(O)-(CH2)m-CHRbRb y -NH-(CH2)m-C(O)-NH-(CH2)m-Rb;
cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo (C1-C6), hidrogeno, cicloalquilo (C3-C8), ciclohexil, cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros;
cada Rb es un grupo adecuado seleccionado independientemente del grupo que consiste en -C(O)Rd, -C(O)ORd, =O, -ORd, haloalquiloxi (C1-C3), -OCF3, =S, -SRd, =NRd, =NORd, -NRcRc, halogeno, -CF3, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -S(O)Rd, -S(O)2Rd, -S(O)2ORd, -S(O)NRcRc, -S(O)2NRcRc, -OS(O)Rd, -OS(O)2Rd, -OS(O)2ORd, -OS(O)2NRcRc, -C(O)NRcRc, -C(NH)NRcRc, -C(NRa)NRcRc, -C(NOH)Ra, -C(NOH)NRcRc, -OC(O)Rd, -OC(O)ORd, -OC(O)NRcRc, -OC(NH)NRcRc, -OC(NRa)NRcRc, -[NHC(O)]nRd, -[NRaC(O)]nRd, -[NHC(O)]nORd, -[NRaC(O)]nORd, -[NHC(O)]nNRcRc, -[NRaC(O)]nNRcRc, -[NHC(NH)]nNRcRc y -[NRaC(NRa)]nNRcRc;
cada Rc es independientemente un grupo de proteccion o cada Ra, o, como alternativa, Rc se toma junto con el atomo de nitrogeno al que esta enlazado para formar un cicloheteroalquilo o heteroarilo de 5 a 8 miembros que puede incluir opcionalmente uno o mas de los mismos o diferentes heteroatomos adicionales, y que puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos o diferentes Ra o grupos Rb adecuados;
cada Rd es independientemente un Ra o un grupo de proteccion;
cada m es independientemente un numero entero de 1 a 3;y
cada n es independientemente un numero entero de 0 a 3.
R2 se selecciona del grupo que consiste en alquilo (C1-C6) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, cicloalquilo (C3-C8) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, cicloheteroalquilo de 3-8 miembros opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, arilo (C5-C15) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, y heteroarilo de 5-15 miembros opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes;
R4 es en la que:
cada Y1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, NR37, S, SO, SO2, SONR36 y NH;
R36 es hidrogeno o alquilo; y
R37 se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno o un progrupo seleccionado del grupo que consiste en -CH2PO(OR8)2, arilo, arilalquilo, heteroarilo, Ra, Rb, -CRaRb-O-C(O)R8, -CRaRb-O-PO(OR8)2, -CH2-O-PO(OR8)2, -C(O)-CRaRbN(CH3)2, -CRaRb-O-C(O)-CRaRb-N(CH3)2, -C(O)R8, y -C(O)-NR8-C(O)R8.
Cuando R5 es haloalquilo (C1-C3), en una realizacion puede ser -CF3, -CH2CF3, o -CF2CF3.
Cuando R5 es arilo (C5-C10) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, en una realizacion puede ser fenilo opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes.
Cuando R6 es haloalquilo (C1-C3), en una realizacion puede ser -CF3, -CH2CF3, o -CF2CF3.
Cuando R6 es arilo (C5-C10) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, en una realizacion puede ser fenilo opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes.
Cuando Ra es cicloheteroalquilo de 3-8 miembros, en una realizacion puede ser morfolinilo, piperazinilo, homopiperazinilo, o piperidinilo.
Cuando Ra es arilo (C5-C10), en una realizacion puede ser fenilo.
Cuando Ra es arilalquilo (C6-C16), en una realizacion puede ser bencilo.
Cuando R2 es arilo (C5-C15) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, en una realizacion puede ser fenilo opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes.
Cuando R2 es cicloalquilo (C3-C8) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, en una realizacion puede ser ciclohexilo opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes.
Cuando R37 es -C(O)R8, en una realizacion puede ser -C(O)CF3.
Tambien se describen profarmacos de los compuestos de formula (Ia). Tales profarmacos pueden ser activos en su forma de profarmaco, o pueden ser inactivos hasta que se convierten en condiciones fisiologicas u otras condiciones de uso en una forma de farmaco activo. En los profarmacos, uno o mas grupos funcionales de los compuestos de formula (Ia) estan incluidos en prorrestos que se escinden de la molecula en las condiciones de uso, tipicamente mediante hidrolisis, escision enzimatica o algun otro mecanismo de escision, para producir los grupos funcionales. Por ejemplo, se pueden incluir grupos amino primario o secundario en un prorresto de amida que se escinde en condiciones de uso para generar el grupo amino primario o secundario. De este modo, los profarmacos incluyen tipos especiales de grupos protectores, denominados "progrupos", que enmascaran uno o mas grupos funcionales de los compuestos de formula (Ia) que se escinden en las condiciones de uso para dar un compuesto farmaceutico de formula (Ia) activo. Los grupos funcionales en los compuestos de formula (Ia) que se pueden enmascarar con progrupos para la inclusion en un prorresto incluyen, pero no se limitan a, aminas (primarias y secundarias), hidroxilos, sulfanilos (tioles), carboxilos, carbonilos, fenoles, catecoles, dioles, alquinos, fosfatos, etc. En la tecnica se conocen miriadas de progrupos adecuados para enmascarar tales grupos funcionales para producir prorrestos que son escindibles en las condiciones deseadas de uso. Todos estos progrupos, solos o en combinaciones, pueden estar incluidas en los profarmacos. Ejemplos especificos de prorrestos que producen grupos amina primaria o secundaria que se pueden incluir en los profarmacos incluyen, pero no se limitan a, amidas, carbamatos, iminas, ureas, fosfenilos, fosforilos y sulfenilos. Los ejemplos especificos de prorrestos que producen grupos sulfanilo que se pueden incluir en los profarmacos incluyen, pero no se limitan a, tioeteres, por ejemplo derivados S-metilicos (monotio-, ditio-, oxitio-, aminotioacetales), sililtioeteres, tioesteres, tiocarbonatos, tiocarbamatos, disulfuros asimetricos, etc. Los ejemplos especificos de prorrestos que se escinden para producir grupos hidroxilo que se pueden incluir en los profarmacos incluyen, pero no se limitan a, sulfonatos, esteres y carbonatos. Ejemplos especificos de prorrestos que producen grupos carboxilo que se pueden incluir en los profarmacos incluyen, pero no se limitan a, esteres (incluyendo esteres de sililo, esteres y tioesteres de acido oxamico), amidas e hidrazidas.
Los profarmacos descritos aqui incluyen compuestos segun la formula estructural (Ia) en la que Rc y Rd estan sustituidos por un progrupo.
La sustitucion de los hidrogenos unidos a N2 y N4 en las 2,4-pirimidindiaminas de formula estructural (Ia) por sustituyentes afecta adversamente a la actividad de los compuestos. Sin embargo, como apreciaran los expertos, estos nitrogenos se pueden incluir en prorrestos que, en condiciones de uso, se escinden para producir 2,4-pirimidindiaminas segun la formula estructural (Ia). De este modo, los profarmacos incluyen compuestos segun la formula estructural (II): incluyendo sales, hidratos, solvatos y N-oxidos del mismo, en la que:
R2, R4, R5 y R6 son como se define previamente para la formula estructural (Ia); y
R2b y R4b son cada uno, independientemente entre si, un progrupo.
5 En otro aspecto, la presente invencion proporciona composiciones comprendiendo uno o mas compuestos de la invencion y un vehiculo, excipiente o diluyente apropiado. La naturaleza exacta del vehiculo, excipiente o diluyente dependera del uso deseado para la composicion, y puede oscilar desde adecuada o aceptable para usos veterinarios a adecuada o aceptable para uso humano.
Tambien se describen aqui intermedios utiles para sintetizar los compuestos de formula (Ia) y sus profarmacos. Los 10 intermedios incluyen 4-pirimidinaminas segun la formula estructural (III):
incluyendo sales, hidratos, solvatos y N-oxidos del mismo, en la que R4, R5 y R6 son como se define anteriormente para la formula estructural (Ia); LG es un grupo saliente tal como, por ejemplo, -S(O)2Me, -SMe o halo (par ejemp/a, F, Cl, Br, I); y R4c es hidrogeno o un progrupo.
15 Los intermedios incluyen 2-pirimidinaminas segun la formula estructural (IV):
incluyendo sales, hidratos, solvatos y N-oxidos de las mismas, en la que R2, R5 y R6 son como se define previamente para la formula estructural (Ia); LG es un grupo saliente, tal como, por ejemplo, -S(O)2Me, -SMe o halo (por ejemplo, P, Cl, Bar, I) y R2c es hidrogeno o un progrupo.
20 Los intermedios tambien incluyen 4-amino-o 4-hidroxi-2-pirimidinaminas segun la formula estructural (V):
incluyendo sales, hidratos, solvatos y N-oxidos de las mismas, en la que R2, R5 y R6 son como se define previamente para la formula estructural (Ia), R7 es un grupo amino o hidroxilo, y R2c es hidrogeno o un progrupo.
Los intermedios tambien incluyen citosinas N4-sustituidas segun la formula estructural (VI):
incluyendo sales, hidratos, solvatos y N-oxidos de las mismas, en la que R4, R5 y R6 son como se define previamente para la formula estructural (Ia), y R4c es hidrogeno o un progrupo.
Tambien se describen aqui metodos para sintetizar los compuestos de formula (Ia) y sus profarmacos. El metodo puede implicar hacer reaccionar una 4-pirimidinamina segun la formula estructural (III) con una amina de la formula HR2cN-R2, en la que R2 y R2c son como se define previamente para la formula estructural (IV), para producir una 2,4pirimidindiamina segun la formula estructural (Ia) o un profarmaco segun la formula estructural (II).
El metodo puede implicar hacer reaccionar una 2-pirimidinamina segun la formula estructural (IV) con una amina de la formula R4-NHR4c, en la que R4 y R4c son como se define previamente para la formula estructural (III), para producir una 2,4-pirimidindiamina segun la formula estructural (Ia) o un profarmaco segun la formula estructural (II).
El metodo puede implicar hacer reaccionar una 4-amino-2-pirimidinamina segun la formula estructural (V) (en la que R7 es un grupo amino) con una amina de la formula R4-NHR4c, en la que R4 y R4c son como se define para la formula estructural (III), para producir una 2,4-pirimidindiamina segun la formula estructural (Ia) o un profarmaco segun la formula estructural (II). Como alternativa, la 4-amino-2-pirimidinamina se puede hacer reaccionar con un compuesto de formula R4-LG, en la que R4 es como se define previamente para la formula estructural (Ia), y LG es un grupo saliente.
El metodo puede implicar halogenar una 4-hidroxi-2-pirimidinamina segun la formula estructural (V) (R7 es un grupo hidroxilo) para producir una 2-pirimidinamina segun la formula estructural (IV), y hacer reaccionar esta pirimidinamina con una amina apropiada, como se describe anteriormente.
El metodo puede implicar halogenar una citosina sustituida en N4 segun la formula estructural (VI) para producir una 4pirimidinamina segun la formula estructural (III), y hacer reaccionar esta pirimidinamina con una amina apropiada, como se describe anteriormente.
Los compuestos de formula (Ia) usados en la invencion son potentes inhibidores de la desgranulacion de inmunocitos, tales como mastocitos, basofilos, neutrofilos y/o eosinofilos. De este modo, tambien se describen aqui los compuestos de la invencion para uso en metodos para regular, y en particular inhibir, la desgranulacion de tales celulas. El metodo implica generalmente poner en contacto una celula que se desgranula con una cantidad de un compuesto de formula (Ia) o su profarmaco, o una sal aceptable, hidrato, solvato, N-oxido y/o composicion del mismo, eficaz para regular o inhibir la desgranulacion de la celula. El metodo se puede poner en practica en contextos in vitra o en contextos in viva como un enfoque terapeutico para el tratamiento o prevencion de enfermedades caracterizadas por, provocadas por o asociadas con la desgranulacion celular.
Aunque no se pretende estar atados por ninguna teoria de operacion, los datos bioquimicos confirman que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina ejercen su efecto inhibidor de la desgranulacion, al menos en parte, bloqueando o inhibiendo la cascada o cascadas de transduccion de senales iniciada por la reticulacion de los receptores Fc de elevada afinidad para IgE ("FcsRI") y/o IgG ("FcyRI"). De hecho, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina son potentes inhibidores de la desgranulacion mediada tanto por FcsRI como por FcyRI. Como consecuencia, los compuestos de formula (Ia) se pueden usar para inhibir estas cascadas de senalizacion de los receptores Fc en cualquier tipo de celula que exprese tales receptores FcsRI y/o FcyRI, incluyendo, pero sin limitarse a, macrofagos, mastocitos, basofilos, neutrofilos y/o eosinofilos.
Los metodos descritos aqui tambien permiten la regulacion de, y en particular la inhibicion de, procesos aguas abajo que resultan como consecuencia de activar tal cascada o cascadas de senalizacion del receptor de Fc. Tales procesos aguas abajo incluyen, pero no se limitan a, la desgranulacion mediada por FcsRI y/o mediada por FcyRI, la produccion de citocinas y/o la produccion y/o la liberacion de mediadores lipidicos tales como leucotrienos y prostaglandinas. El metodo implica generalmente poner en contacto una celula que expresa un receptor de Fc, tal como aquella de los tipos celulares discutidos anteriormente, con una cantidad de un compuesto de formula (Ia) o su profarmaco, o una sal aceptable, hidrato, disolvente, N-oxido y/o composicion del mismo, eficaz para regular o inhibir la cascada de senalizacion del receptor de Fc y/o un proceso aguas abajo efectuado mediante la activacion de esta cascada de senalizacion. El metodo se puede poner en practica en contextos in vitra o en contextos in viva como un enfoque terapeutico dirigido al tratamiento o prevencion de enfermedades caracterizadas por, provocadas por o asociadas con la cascada de senalizacion del receptor Fc, tales como enfermedades afectadas por la liberacion de mediadores quimicos especificos de los granulos con la desgranulacion, la liberacion y/o sintesis de citocinas, y/o la liberacion y/o sintesis de mediadores lipidicos tales como leucotrienos y prostaglandinas.
Tambien se describen aqui los compuestos de la invencion para uso en metodos para tratar y/o prevenir enfermedades caracterizadas por, provocadas por o asociadas con la liberacion de mediadores quimicos como consecuencia de activar cascadas de senalizacion del receptor de Fc, tales como las cascadas de senalizacion de FcsRI y/o FcyRI. Los metodos se pueden poner en practica en animales en los contextos veterinarios, o en seres humanos. Los metodos implican generalmente administrar a un sujeto animal o a un ser humano una cantidad de un compuesto de formula (Ia),
o su profarmaco, o una sal aceptable, hidrato, solvato, N-oxido y/o composicion del mismo, eficaz para tratar o prevenir la enfermedad. Como se explica previamente, la activacion de la cascada de senalizacion de los receptores FcsRI y FcyRI en ciertas celulas inmunitarias conduce a la liberacion y/o sintesis de una variedad de sustancias quimicas que son mediadores farmacologicos de una amplia variedad de enfermedades.
Cualquiera de las enfermedades se puede tratar o prevenir segun los metodos descritos aqui.
Por ejemplo, en mastocitos y basolilos, la activacion de la cascada de senalizacion de FcsRI o FcyRI conduce a la liberacion inmediata (es decir, en 1-3 min. de la activacion del receptor) de mediadores preformados de reacciones de hipersensibilidad atopica y/o de tipo I (par ejemp/a, histamina, proteasas tales como triptasa, etc.) via el proceso de desgranulacion. Tales reacciones de hipersensibilidad atopica o de tipo I incluyen, pero no se limitan a, reacciones anafilacticas al medio ambiente y a otros alergenos (par ejemp/a, polenes, venenos de insectos y/o animales, alimentos, farmacos, colorantes de contraste, etc.), reacciones anafilactoides, fiebre del heno, conjuntivitis alergica, rinitis alergica, asma alergica, dermatitis atopica, eccema, urticaria, trastornos de la mucosa, trastornos de los tejidos, y ciertos trastornos gastrointestinales.
La liberacion inmediata de los mediadores preformados via la desgranulacion es seguida de la liberacion y/o sintesis de una variedad de otros mediadores quimicos, incluyendo, entre otros, el factor activador de plaquetas (PAF), prostaglandinas y leucotrienos (par ejemp/a, LTC4), y la sintesis de nava y la liberacion de citocinas tales como TNFa, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, etc. El primero de estos dos procesos se produce aproximadamente 3-30 min. tras la activacion del receptor; el ultimo, aproximadamente 30 min-7 h tras la activacion del receptor. Se piensa que estos mediadores de "etapa tardia" son responsables en parte de los sintomas cronicos de las reacciones de hipersensibilidad atopica y de tipo I enumeradas anteriormente, y ademas son mediadores quimicos de la inflamacion y enfermedades inflamatorias (por ejemplo, osteoartritis, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria idiopatica del intestino, sindrome de intestino irritable, colon espastico, etc.), cicatrizacion de bajo grado (por ejemplo, esclerodermia, fibrosis incrementada, queloides, cicatrices post-quirurgicas, fibrosis pulmonar, espasmos vasculares, migrana, lesion por reperfusion y postinfarto del miocardio), y complejo o sindrome seco. Todas estas enfermedades se pueden tratar o prevenir segun los metodos descritos aqui.
Enfermedades adicionales que se pueden tratar o prevenir segun los metodos descritos aqui incluyen enfermedades asociadas con patologia de basofilos y/o mastocitos. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, enfermedades de la piel tales como esclerodermia, cardiopatias tales como postinfarto de miocardio, enfermedades pulmonares tales como cambios o remodelacion del musculo pulmonar y enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD) y enfermedades del intestino tales como sindrome inflamatorio del intestino (colon espastico).
Los compuestos de formula (Ia) son tambien potentes inhibidores de la tirosina cinasa Syk cinasa. De este modo, tambien se describen aqui metodos para regular, y en particular inhibir, la actividad de Syk cinasa. El metodo generalmente implica poner en contacto una Syk cinasa, o una celula que comprende una Syk cinasa, con una cantidad de un compuesto de formula (Ia) o su profarmaco, o una sal aceptable, hidrato, solvato, N-oxido y/o composicion del mismo, eficaz para regular o inhibir la actividad de Syk cinasa. La Syk cinasa puede ser una Syk cinasa aislada o recombinante. Como alternativa, la Syk cinasa puede ser una Syk cinasa endogena o recombinante expresada por una celula, por ejemplo un mastocito o un basofilo. El metodo se puede poner en practica en contextos in vitra o en contextos in viva como un enfoque terapeutico para el tratamiento o prevencion de enfermedades caracterizadas por, provocadas por o asociadas con la actividad de Syk cinasa.
Aunque no se pretende estar atados por ninguna teoria particular de operacion, se cree que los compuestos de formula (Ia) inhiben la desgranulacion celular y/o la liberacion de otros mediadores quimicos principalmente inhibiendo Syk cinasa que es activada a traves del homodimero de la cadena gamma de FcsRI (vease, par ejemp/a, FIG. 2). Este homodimero de la cadena gamma es compartido por otros receptores Fc, incluyendo FcyRI, FcyRIII y FcaRI. Para todos estos receptores, la transduccion de senal intracelular esta mediada por el homodimero de la cadena gamma comun. La union y la agregacion de esos receptores da como resultado el reclutamiento y activacion de tirosina cinasas tales como Syk cinasa. Como consecuencia de estas actividades de senalizacion comun, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina descritos aqui que se metabolizan en tales compuestos de 2,4-pirimidindiamina activos se pueden usar para regular, y en particular inhibir, las cascadas de senalizacion de receptores Fc que tienen este homodimero de la cadena gamma, tales como FcsRI, FcyRI, FcyRIII y FcaRI, asi como las respuestas celulares provocadas a traves de estos receptores.
Se sabe que Syk cinasa desempena un papel critico en otras cascadas de senalizacion. Por ejemplo, Syk cinasa es un efector de la senalizacion del receptor de celulas B (BCR) (Turner et al., 2000, Immunology Today 21:148-154), y es un componente esencial de la senalizacion de integrina beta(1), beta(2) y beta(3) en neutrofilos (Mocsai et al., 2002, Immunity 16:547-558). Puesto que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina descritos aqui son potentes inhibidores de Syk cinasa, se pueden usar para regular, y en particular inhibir, cualquier cascada de senalizacion en la que Syk desempene un papel, tal como, por ejemplo, las cascadas de senalizacion de los receptores Fc, de BCR y de integrinas, asi como las respuestas celulares provocadas mediante estas cascadas de senalizacion. La respuesta celular particular, regulada o inhibida, dependera, en parte, del tipo celular especifico y de la cascada de senalizacion del receptor, como es bien conocido en la tecnica. Los ejemplos no limitantes de respuestas celulares que pueden ser reguladas o inhibidas con los compuestos de 2,4-pirimidindiamina incluyen un estallido respiratorio, adhesion celular, desgranulacion celular, diseminacion celular, migracion celular, fagocitosis (par ejemp/a, en macrofagos), flujo de iones calcio (par ejemp/a, en mastocitos, basofilos, neutrofilos, eosinofilos y celulas B), agregacion plaquetaria, y maduracion celular (par ejemp/a, en celulas B).
De este modo, tambien se describen aqui los compuestos de la invencion para uso en metodos para regular, y en particular inhibir, cascadas de transduccion de senales en las que Syk desempena un papel. El metodo implica generalmente poner en contacto un receptor dependiente de Syk, o una celula que expresa un receptor dependiente de Syk, con una cantidad de un compuesto de formula (Ia) o su profarmaco, o una sal aceptable, hidrato, solvato, N-oxido y/o composicion del mismo, eficaz para regular o inhibir la cascada de transduccion de senales. Los metodos tambien se pueden usar para regular, y en particular inhibir, procesos aguas abajo o respuestas celulares provocadas por la activacion de la cascada de transduccion de senales dependiente de Syk particular. Los metodos se pueden poner en practica para regular cualquier cascada de transduccion de senales en la que no se sabe o se ha descubierto posteriormente que Syk desempena un papel. Los metodos se pueden poner en practica en contextos in vitra o en contextos in viva como un enfoque terapeutico para el tratamiento o prevencion de enfermedades caracterizadas por, provocadas por o asociadas con la activacion de la cascada de transduccion de senales dependiente de Syk. Los ejemplos no limitados de tales enfermedades incluyen las explicadas anteriormente.
Los datos celulares y de animales tambien confirman que los compuestos de formula (Ia) tambien se pueden usar para tratar o prevenir enfermedades autoinmunitarias y/o sintomas de tales enfermedades. De este modo, en otro aspecto, la presente invencion proporciona compuestos de formula (Ia) para uso en un metodo para tratar o prevenir una enfermedad autoinmunitaria y/o uno o mas sintomas asociados con ella en un mamifero. Los metodos implican generalmente administrar a un sujeto que sufre una enfermedad autoinmunitaria, o en riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmunitaria, una cantidad de un compuesto de formula (Ia) o composicion del mismo, eficaz para tratar
o prevenir la enfermedad autoinmunitaria y/o sus sintomas asociados. Las enfermedades autoinmunitarias que se pueden tratar o prevenir con los compuestos de formula (Ia) incluyen aquellas enfermedades que estan asociadas habitualmente con reacciones de hipersensibilidad no anafilactica (reacciones de hipersensibilidad de tipo II, tipo III y/o tipo IV), y/o aquellas enfermedades que estan mediadas, al menos en parte, por la activacion de la cascada de senalizacion de FcyR en monocitos. Tal enfermedad autoinmunitaria incluye, pero no se limita a, aquellas enfermedades autoinmunitarias que se denominan frecuentemente como trastornos autoinmunitarios de organo individual o de tipo celular individual, y aquella enfermedad autoinmunitaria que se denomina frecuentemente como trastorno autoinmunitario sistemico. Los ejemplos no limitantes de enfermedades denominadas frecuentemente como trastornos autoinmunitarios de organo individual o de tipo celular individual incluyen: tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolitica autoinmunitaria, gastritis atrofica autoinmunitaria de anemia perniciosa, encefalomielitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, enfermedad de Goodpasture, trombocitopenia autoinmunitaria, oftalmia simpatica, miastenia grave, enfermedad de Graves, cirrosis biliar primaria, hepatitis agresiva cronica, colitis ulcerosa y glomerulopatia membranosa. Los ejemplos no limitantes de enfermedades denominadas a menudo como trastorno autoinmunitario sistemico incluyen: lupus eritematoso sistemico, artritis reumatoide, sindrome de Sjogren, sindrome de Reiter, polimiositisdermatomiositis, esclerosis sistemica, panarteritis nudosa, esclerosis multiple y penfigoide ampolloso.
5. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La FIG. 1 proporciona un dibujo que ilustra la produccion de IgE inducida por alergenos, y la liberacion consiguiente de mediadores preformados y otros mediadores quimicos a partir de mastocitos;
la FIG. 2 proporciona un dibujo que ilustra la cascada de transduccion de senales de FcsRI que conduce a la desgranulacion de mastocitos y/o basofilos;
la FIG. 3 proporciona un dibujo que ilustra los puntos de accion putativos de compuestos que inhiben selectivamente aguas arriba la desgranulacion mediada por FcsRI, y compuestos que inhiben la desgranulacion tanto mediada por FcsRI como inducida por ionomicina;
la FIG. 4 proporciona graficas que ilustran los efectos de ciertos compuestos de 2,4-pirimidindiamina, DMSO (control) y ionomicina sobre el flujo de Ca2+ en celulas CHMC;
la FIG. 5 proporciona datos que muestran la inhibicion, sensible a la dosis, de la fosforilacion de Syk cinasa de un sustrato endogeno (LAT) y un sustrato peptidico en presencia de concentraciones crecientes de los compuestos R921218 (X), R921219 (Y) y R921304 (Z);
6. DESCRIPCION DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS 6.1 Definiciones
Como se usan aqui, los siguientes terminos estan destinados a tener los siguientes significados:
"Alquilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un radical hidrocarbonado monovalente ramificado, de cadena lineal o ciclico, saturado o insaturado, que tiene el numero senalado de atomos de carbono (es decir, C1-C6 significa uno a seis atomos de carbono), que deriva de la eliminacion de un atomo de hidrogeno de un solo atomo de carbono de un alcano, alqueno o alquino progenitor. Los grupos alquilo tipicos incluyen, pero no se limitan a, metilo; etilos tales como metilo; etilos tales como etanilo, etenilo, etinilo; propilos tales como propan-1-ilo, propan-2-ilo, ciclopropan-1-ilo, prop-1-en-1-ilo, prop-1-en-2-ilo, prop-2-en-1-ilo, cicloprop-1-en-1-ilo; cicloprop-2-en-1-ilo, prop-1-in-1ilo, prop-2-in-1-ilo, etc.; butilos tales como butan-1-ilo, butan-2-ilo, 2-metil-propan-1-ilo, 2-metil-propan-2-ilo, ciclobutan1-ilo, but-1-en-1-ilo, but-1-en-2-ilo, 2-metil-prop-1-en-1-ilo, but-2-en-1-ilo, but-2-en-2-ilo, buta-1,3-dien-1-ilo, buta-1,3dien-2-ilo, ciclobut-1-en-1-ilo, ciclobut-1-en-3-ilo, ciclobuta-1,3-dien-1-ilo, but-1-in-1-ilo, but-1-in-3-ilo, but-3-in-1-ilo, etc.; y similares. Cuando se pretenden niveles especificos de saturacion, se usa la nomenclatura "alcanilo", "alquenilo" y/o "alquinilo", como se define mas abajo. En realizaciones preferidas, los grupos alquilo son alquilo (C1-C6).
"Alcanilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un alquilo ramificado, de cadena lineal o ciclico, saturado, derivado de la eliminacion de un atomo de hidrogeno de un solo atomo de carbono de un alcano progenitor. Grupos alcanilo tipicos incluyen, pero no se limitan a, metanilo; etanilo; propanilos tales como propan-1-ilo, propan-2-ilo (isopropilo), ciclopropan-1-ilo, etc.; butanilos tales como butan-1-ilo, butan-2-ilo (sec-butilo), 2-metil-propan-1-ilo (isobutilo), 2-metil-propan-2-ilo (t-butilo), ciclobutan-1-ilo, etc.; y similares. En realizaciones preferidas, los grupos alcanilo son alcanilo (C1-C6).
"Alquenilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un alquilo ramificado, de cadena lineal o ciclico, insaturado, que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono, derivado de la eliminacion de un atomo de hidrogeno de un solo atomo de carbono de un alqueno progenitor. El grupo puede estar en conformacion cis o trans alrededor del doble o dobles enlaces. Grupos alquenilo tipicos incluyen, pero no se limitan a, etenilo; propenilos tales como prop-1-en1-ilo, prop-1-en-2-ilo, prop-2-en-1-ilo, prop-2-en-2-ilo, cicloprop-1-en-1-ilo, cicloprop-2-en-1-ilo; butenilos tales como but1-en-1-ilo, but-1-en-2-ilo, 2-metil-prop-1-en-1-ilo, but-2-en-1-ilo, but-2-en-2-ilo, buta-1,3-dien-1-ilo, buta-1,3-dien-2-ilo, ciclobut-1-en-1-ilo, ciclobut-1-en-3-ilo, ciclobuta-1,3-dien-1-ilo, etc.; y similares. En realizaciones preferidas, el grupo alquenilo es alquenilo (C2-C6).
"Alquinilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un alquilo ramificado, de cadena lineal o ciclico, insaturado, que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono, derivado de la eliminacion de un atomo de hidrogeno de un solo atomo de carbono de un alquino progenitor. Grupos alquinilo tipicos incluyen, pero no se limitan a, etinilo; propinilos tales como prop-1-in-1-ilo, prop-2-in-1-ilo, etc.; butinilos tales como but-1-in-1-ilo, but-1-in-3-ilo, but-3-in-1-ilo, etc.; y similares. En realizaciones preferidas, el grupo alquinilo es alquinilo (C2-C6).
"Alquildiilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo hidrocarbonado divalente ramificado, de cadena lineal o ciclico, saturado o insaturado, que tiene el numero senalado de atomos de carbono (es decir, C1-C6 significa de uno a seis atomos de carbono), derivado de la eliminacion de un atomo de hidrogeno de cada uno de dos atomos de carbono diferentes de un alcano, alqueno o alquino progenitor, o mediante la eliminacion de dos atomos de hidrogeno de un solo atomo de carbono de un alcano, alqueno o alquino progenitor. Los dos centros radicalicos monovalentes, o cada valencia del centro radical divalente, pueden formar enlaces con los mismos atomos o con atomos diferentes. Los grupos alquildiilo tipicos incluyen, pero no se limitan a, metandiilo; etildiilos tales como etan-1,1diilo, etan-1,2-diilo, eten-1,1-diilo, eten-1,2-diilo; propildiilos tales como propan-1,1-diilo, propan-1,2-diilo, propan-2,2diilo, propan-1,3-diilo, ciclopropan-1,1-diilo, ciclopropan-1,2-diilo, prop-1-en-1,1-diilo, prop-1-en-1,2-diilo, prop-2-en-1,2diilo, prop-1-en-1,3-diilo, cicloprop-1-en-1,2-diilo, cicloprop-2-en-1,2-diilo, cicloprop-2-en-1,1-diilo, prop-1-in-1,3-diilo, etc.; butildiilos tales como butan-1,1-diilo, butan-1,2-diilo, butan-1,3-diilo, butan-1,4-diilo, butan-2,2-diilo, 2-metil-propan1,1-diilo, 2-metil-propan-1,2-diilo, ciclobutan-1,1-diilo, ciclobutan-1,2-diilo, ciclobutan-1,3-diilo, but-1-en-1,1-diilo, but-1en-1,2-diilo, but-1-en-1,3-diilo, but-1-en-1,4-diilo, 2-metil-prop-1-en-1,1-diilo, 2-metaniliden-propan-1,1-diilo, buta-1,3dien-1,1-diilo, buta-1,3-dien-1,2-diilo, buta-1,3-dien-1,3-diilo, buta-1,3-dien-1,4-diilo, ciclobut-1-en-1,2-diilo, ciclobut-1-en1,3-diilo, ciclobut-2-en-1,2-diilo, ciclobuta-1,3-dien-1,2-diilo, ciclobuta-1,3-dien-1,3-diilo, but-1-in-1,3-diilo, but-1-in-1,4diilo, buta-1,3-diin-1,4-diilo, etc.; y similares. Cuando se pretenden niveles especificos de saturacion, se usa la nomenclatura alcanildiilo, alquenildiilo y/o alquinildiilo. Cuando se pretende especificamente que las dos valencias esten en el mismo atomo de carbono, se usa la nomenclatura "alquilideno". En algunas realizaciones, el grupo alquildiilo es alquildiilo (C1-C6). Tambien se prefieren grupos alcanildiilo aciclicos saturados en los que los centros radicalicos estan en los carbonos terminales, par ejemp/a metandiilo (metano); etan-1,2-diilo (etano); propan-1,3-diilo (propano); butan1,4-diilo (butano); y similares (tambien denominados como alquilenos, definidos mas abaja).
"Alquileno", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo alquildiilo saturado o insaturado, de cadena lineal, que tiene dos centros radicalicos monovalentes terminales derivados de la eliminacion de un atomo de hidrogeno de cada uno de los dos atomos de carbono terminales de un alcano, alqueno o alquino progenitor de cadena lineal. El localizador de un doble enlace o un triple enlace, si esta presente, en un alquileno particular, se indica entre corchetes. Los grupos alquileno tipicos incluyen, pero no se limitan a, metano; etilenos tales como etano, eteno, etino; propilenos tales como propano, prop[1]eno, propa[1,2]dieno, prop[1]ino, etc.; butilenos tales como butano, but[1]eno, but[2]eno, buta[1,3]dieno, but[1]ino, but[2]ino, buta[1,3]diino, etc.; y similares. Cuando se pretenden niveles especificos de saturacion, se usa la nomenclatura alcano, alqueno y/o alquino. En realizaciones preferidas, el grupo alquileno es alquileno (C1-C6) o (C1-C3). Tambien se prefieren grupos alcano saturados de cadena lineal, par ejemp/a metano, etano, propano, butano, y similares.
"Heteroalquilo", "heteroalcanilo", "heteroalquenilo", "heteroalquinilo", "heteroalquildiilo" y "heteroalquileno", por si mismos
o como parte de otro sustituyente, se refieren a grupos alquilo, alcanilo, alquenilo, alquinilo, alquildiilo y alquileno, respectivamente, en los que uno o mas de los atomos de carbono estan sustituidos cada uno independientemente con los mismos heteroatomos o grupos heteroatomicos, o diferentes. Los heteroatomos y/o grupos heteroatomicos tipicos que pueden sustituir a los atomos de carbono incluyen, pero no se limitan a, -O-, -S-, -S-O-, -NR'-, -PH-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)NR'-, -S(O)2NR'-, y similares, incluyendo sus combinaciones, en los que cada R' es independientemente hidrogeno
o alquilo (C1-C6).
"Cicloalquilo" y "Heterocicloalquilo", por si mismos o como parte de otro sustituyente, se refieren a versiones ciclicas de grupos "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Para grupos heteroalquilo, un heteroatomo puede ocupar la posicion que esta unida al resto de la molecula. Los grupos cicloalquilo tipicos incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo; ciclobutilos tales como ciclobutanilo y ciclobutenilo; ciclopentilos tales como ciclopentanilo y ciclopentenilo; ciclohexilos tales como ciclohexanilo y ciclohexenilo; y similares. Los grupos heterocicloalquilo tipicos incluyen, pero no se limitan a, tetrahidrofuranilo (par ejemp/a, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, etc.), piperidinilo (par ejemp/a, piperidin-1-ilo, piperidin-2-ilo, etc.), morfolinilo (par ejemp/a, morfolin-3-ilo, morfolin-4-ilo, etc.), piperazinilo (par ejemp/a, piperazin-1-ilo, piperazin-2-ilo, etc.), y similares.
"Puente heteroatomico aciclico" se refiere a un puente divalente en el que los atomos de la cadena principal son exclusivamente heteroatomos y/o grupos heteroatomicos. Los puentes heteroatomicos aciclicos tipicos incluyen, pero no se limitan a, -O-, -S-, -S-O-, -NR'-, -PH-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)NR'-, -S(O)2NR'-, y similares, incluyendo sus combinaciones, en los que cada R' es independientemente hidrogeno o alquilo (C1-C6).
"Sistema de anillo aromatico progenitor" se refiere a un sistema anular ciclico o policiclico insaturado que tiene un sistema de electrones 1 conjugados. Especificamente se incluyen en la definicion de "sistema de anillo aromatico progenitor" los sistemas de anillos condensados en los que uno o mas de los anillos son aromaticos y uno o mas de los anillos estan saturados o insaturados, tales como, por ejemplo, fluoreno, indano, indeno, fenaleno, tetrahidronaftaleno, etc. Los sistemas de anillos aromaticos progenitores tipicos incluyen, pero no se limitan a aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benceno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, hexaceno, hexafeno, hexaleno, indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, octaceno, octafeno, octaleno, ovaleno, penta-2,4-dieno, pentaceno, pentaleno, pentafeno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleyadeno, pireno, pirantreno, rubiceno, tetrahidronaftaleno, trifenileno, trinaftaleno, y similares, asi como los diversos hidroisomeros de los mismos.
"Arilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo hidrocarbonado aromatico monovalente que tiene el numero senalado de atomos de carbono (es decir, CS-C15 significa de 5 a 15 atomos de carbono), derivado de la eliminacion de un atomo de hidrogeno de un solo atomo de carbono de un sistema de anillo aromatico progenitor. Los grupos arilo tipicos incluyen, pero no se limitan a, grupos derivados de aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benceno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, hexaceno, hexafeno, hexaleno, as-indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, octaceno, octafeno, octaleno, ovaleno, penta-2,4-dieno, pentaceno, pentaleno, pentafeno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleyadeno, pireno, pirantreno, rubiceno, trifenileno, trinaftaleno, y similares, asi como sus diversos hidroisomeros. En realizaciones preferidas, el grupo arilo es arilo (CS-C15), siendo incluso mas preferido (CS-C10). Arilos particularmente preferidos son ciclopentadienilo, fenilo y naftilo.
"Arilarilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo hidrocarbonado monovalente derivado de la eliminacion de un atomo de hidrogeno de un solo atomo de carbono de un sistema anular en el que dos o mas sistemas de anillos aromaticos progenitores identicos o no identicos estan unidos directamente entre si mediante un enlace sencillo, en el que el numero de tales uniones anulares directas es uno menos el numero de sistemas de anillos aromaticos progenitores implicados. Grupos arilarilo tipicos incluyen, pero no se limitan a, bifenilo, trifenilo, fenil-naftilo, binaftilo, bifenil-naftilo, y similares. Cuando se especifica el numero de atomos de carbono en un grupo arilarilo, los numeros se refieren a los atomos de carbono que comprenden cada anillo aromatico progenitor. Por ejemplo, arilarilo (CS-C15) es un grupo arilarilo en el que cada anillo aromatico comprende de 5 a 15 carbonos, par ejemp/a bifenilo, trifenilo, binaftilo, fenilnaftilo, etc. Preferiblemente, cada sistema de anillo aromatico progenitor de un grupo arilarilo es independientemente un aromatico (CS-C15), mas preferiblemente un aromatico (CS-C10). Tambien se prefieren grupos arilarilo en los que todos los sistemas de anillos aromaticos progenitores son identicos, par ejemp/a bifenilo, trifenilo, binaftilo, trinaftilo, etc.
"Biarilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo arilarilo que tiene dos sistemas aromaticos progenitores identicos unidos directamente entre si mediante un enlace sencillo. Grupos biarilo tipicos incluyen, pero no se limitan a, bifenilo, binaftilo, biantracilo, y similares. Preferiblemente, los sistemas de anillos aromaticos son anillos aromaticos (CS-C15), mas preferiblemente anillos aromaticos (C5-C10). Un grupo biarilo particularmente preferido es bifenilo.
"Arilalquilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo alquilo aciclico en el que uno de los atomos de hidrogeno enlazado a un atomo de carbono, tipicamente un atomo de carbono terminal o sp3, se sustituye por un grupo arilo. Grupos arilalquilo tipicos incluyen, pero no se limitan a, bencilo, 2-feniletan-1-ilo, 2-fenileten-1-ilo, naftilmetilo, 2-naftiletan-1-ilo, 2-naftileten-1-ilo, naftobencilo, 2-naftofeniletan-1-ilo y similares. Cuando se pretenden restos alquilicos especificos, se usa la nomenclatura arilalcanilo, arilalquenilo y/o arilalquinilo. En realizaciones preferidas, el grupo arilalquilo es arilalquilo (C6-C21), par ejemp/a el resto alcanilo, alquenilo o alquinilo del grupo arilalquilo es (C1-C6) y el resto arilico es (C5-C15). En realizaciones particularmente preferidas, el grupo arilalquilo es (C6-C13), par ejemp/a el resto alcanilo, alquenilo o alquinilo del grupo arilalquilo es (C1-C3) y el resto arilico es (C5-C10).
"Sistema de anillo aromatico progenitor" se refiere a un sistema de anillo aromatico progenitor en el que uno o mas atomos de carbono se sustituyen cada uno independientemente por el mismo o diferentes heteroatomos o grupos heteroatomicos. Los heteroatomos o grupos heteroatomicos tipicos para sustituir a los atomos de carbono incluyen, pero no se limitan a, N, NH, P, O, S, S(O), S(O)2, Si, etc. Se incluyen especificamente en la definicion de "sistemas de anillos heteroaromaticos progenitores" sistemas de anillos condensados en los que uno o mas de los anillos son aromaticos, y uno o mas de los anillos estan saturados o insaturados, tales como, por ejemplo, benzodioxano, benzofurano, cromano, cromeno, indol, indolina, xanteno, etc. Tambien se incluyen en la definicion de "sistema de anillo heteroaromatico progenitor" aquellos anillos reconocidos que incluyen sustituyentes habituales, tales como, por ejemplo, benzopirona y 1-metil-1,2,3,4-tetrazol. Se excluyen especificamente de la definicion de "sistema de anillo heteroaromatico progenitor" anillos bencenicos condensados con polialquilenglicoles ciclicos tales como polietilenglicoles ciclicos. Los sistemas de anillos heteroaromaticos progenitores tipicos incluyen, pero no se limitan a, acridina, bencimidazol, bencisoxazol, benzodioxano, benzodioxol, benzofurano, benzopirona, benzotiadiazol, benzotiazol, benzotriazol, benzoxacina, benzoxazol, benzoxazolina, carbazol, 1-carbolina, cromano, cromeno, cinolina, furano, imidazol, indazol, indol, indolina, indolicina, isobenzofurano, isocromeno, isoindol, isoindolina, isoquinolina, isotiazol, isoxazol, naftiridina, oxadiazol, oxazol, perimidina, fenantridina, fenantrolina, fenazina, ftalacina, pteridina, purina, pirano, pirazina, pirazol, piridazina, piridina, pirimidina, pirrol, pirrolicina, quinazolina, quinolina, quinolicina, quinoxalina, tetrazol, tiadiazol, tiazol, tiofeno, triazol, xanteno, y similares.
"Heteroarilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo heteroaromatico monovalente que tiene el numero senalado de atomos anulares (par ejemp/a, "5-14 miembros" significa de 5 a 14 atomos anulares), derivado de la eliminacion de un atomo de hidrogeno de un solo atomo de un sistema de anillo heteroaromatico progenitor. Grupos heteroarilo tipicos incluyen, pero no se limitan a, grupos derivados de acridina, bencimidazol, bencisoxazol, benzodioxano, benzodiaxol, benzofurano, benzopirona, benzotiadiazol, benzotiazol, benzotriazol, benzoxacina, benzoxazol, benzoxazolina, carbazol, 1-carbolina, cromano, cromeno, cinolina, furano, imidazol, indazol, indol, indolina, indolicina, isobenzofurano, isocromeno, isoindol, isoindolina, isoquinolina, isotiazol, isoxazol, naftiridina, oxadiazol, oxazol, perimidina, fenantridina, fenantrolina, fenazina, ftalacina, pteridina, purina, pirano, pirazina, pirazol, piridazina, piridina, pirimidina, pirrol, pirrolicina, quinazolina, quinolina, quinolicina, quinoxalina, tetrazol, tiadiazol, tiazol, tiofeno, triazol, xanteno, y similares, asi como sus diversos hidroisomeros. En realizaciones preferidas, el grupo heteroarilo es un heteroarilo de 5-14 miembros, siendo particularmente preferido heteroarilo de 5-10 miembros.
"Heteroaril-heteroarilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo heteroaromatico monovalente derivado de la eliminacion de un atomo de hidrogeno de un solo atomo de un sistema anular en el que dos
o mas sistemas de anillos heteroaromaticos progenitores identicos o no identicos estan unidos directamente entre si mediante un enlace sencillo, en el que el numero de tales uniones anulares directas es uno menos el numero de sistemas de anillos heteroaromaticos progenitores implicados. Los grupos heteroaril-heteroarilo tipicos incluyen, pero no se limitan a, bipiridilo, tripiridilo, piridilpurinilo, bipurinilo, etc. Cuando se especifica el numero de atomos, los numeros se refieren al numero de atomos que comprenden cada uno de los sistemas de anillos heteroaromaticos progenitores. Por ejemplo, heteroaril-heteroarilo de 5-15 miembros es un grupo heteroaril-heteroarilo en el que cada sistema de anillo heteroaromatico progenitor comprende de 5 a 15 atomos, par ejemp/a bipiridilo, tripuridilo, etc. Preferiblemente, cada sistema de anillo heteroaromatico progenitor es independientemente un heteroaromatico de 5-15 miembros, mas preferiblemente un heteroaromatico de 5-10 miembros. Tambien se prefieren grupos heteroaril-heteroarilo en los que todos los sistemas de anillos heteroaromaticos progenitores son identicos.
"Biheteroarilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo heteroaril-heteroarilo que tiene dos sistemas de anillos heteroaromaticos progenitores identicos unidos directamente entre si mediante un enlace sencillo. Grupos biheteroarilo tipicos incluyen, pero no se limitan a, bipiridilo, bipurinilo, biquinolinilo, y similares. Preferiblemente, los sistemas de anillos heteroaromaticos son anillos heteroaromaticos de 5-15 miembros, mas preferiblemente anillos heteroaromaticos de 5-10 miembros.
"Heteroarilalquilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo alquilo aciclico en el que uno de los atomos de hidrogeno enlazado a un atomo de carbono, tipicamente un atomo de carbono terminal o sp, esta sustituido por un grupo heteroarilo. Cuando se pretenden restos alquilicos especificos, se usa la nomenclatura heteroarilalcanilo, heteroarilaquenilo y/o heteroarilalquinilo. En realizaciones preferidas, el grupo heteroarilalquilo es un heteroarilalquilo de 6-21 miembros, par ejemp/a el resto alcanilo, alquenilo o alquinilo del heteroarilalquilo es alquilo (C1-C6) y el resto heteroarilo es un heteroarilo de 5-15 miembros. En realizaciones particularmente preferidas, el heteroarilalquilo es un heteroarilalquilo de 6-13 miembros, par ejemp/a el resto alcanilo, alquenilo o alquinilo es alquilo (C1-C3) y el resto heteroarilo es un heteroarilo de 5-10 miembros.
"Halogeno" o "halo", por si mismos o como parte de otro sustituyente, excepto que se establezca de otro modo, se refiere a fluoro, cloro, bromo y yodo.
"Haloalquilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo alquilo en el que uno o mas de los atomos de hidrogeno se sustituye por halogeno. De este modo, el termino "haloalquilo" incluye monohaloalquilos, dihaloalquilos, trihaloalquilos, etc. hasta perhaloalquilos. Por ejemplo, la expresion "haloalquilo (C1-C2)" incluye fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, 1-fluoroetilo, 1,1-difluoroetilo, 1,2-difluoroetilo, 1,1,1-trifluoroetilo, perfluoroetilo, etc.
Los grupos definidos anteriormente pueden incluir prefijos y/o sufijos que se usan habitualmente en la tecnica para crear grupos sustituyentes adicionales bien reconocidos. Como ejemplos, "alquiloxi" o "alcoxi" se refiere a un grupo de la formula -OR", "alquilamina" se refiere a un grupo de la formula -NHR", y "dialquilamina" se refiere a un grupo de la formula -NR"R", en las que cada R" es independientemente un alquilo. Como otro ejemplo, "haloalcoxi" o "haloalquiloxi" se refiere a un grupo de la formula -OR"', en la que R"' es un haloalquilo.
"Grupo protector" se refiere a un grupo de atomos que, cuando se une a un grupo funcional reactivo en una molecula, enmascara, reduce o evita la reactividad del grupo funcional. Tipicamente, un grupo protector se puede eliminar selectivamente segun se desee durante el transcurso de una sintesis. Ejemplos de grupos protectores se pueden encontrar en Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry, 3a Ed., 1999, John Wiley & Sons, NY, y Harrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8, 1971-1996, John Wiley & Sons, NY. Grupos protectores de amino representativos incluyen, pero no se limitan a, formilo, acetilo, trifluoroacetilo, bencilo, benciloxicarbonilo ("CBZ"), terc-butoxicarbonilo ("Boc"), trimetilsililo ("TMS"), 2-trimetilsilil-etanosulfonilo ("TES"), tritilo y grupos tritilo sustituidos, aliloxicarbonilo, 9-fluorenil-metiloxicarbonilo ("FMOC"), nitroveratriloxicarbonilo ("NVOC"), y similares. Grupos protectores de hidroxilo representativos incluyen, pero no se limitan a, aquellos en los que el grupo hidroxilo esta acilado
o alquilado, tales como bencilo y esteres de tritilo, asi como eteres de alquilo, eteres de tetrahidropiranilo, eteres de trialquilsililo (par ejemp/a, grupos TMS o TIPPS) y eteres de alilo.
"Profarmaco" se refiere a un derivado de un compuesto de 2,4-pirimidindiamina activo (farmaco) que requiere una transformacion en las condiciones de uso, tal como dentro del cuerpo, para liberar el farmaco de 2,4-pirimidindiamina activo. Los profarmacos son frecuentemente, aunque no necesariamente, farmacologicamente inactivos hasta que se convierten en el farmaco activo. Los profarmacos se obtienen tipicamente enmascarando un grupo funcional en el farmaco de 2,4-pirimidindiamina, que se cree que se requiere en parte para la actividad, con un progrupo (definido mas abajo) para formar un prorresto que sufre una transformacion, tal como una escision, en las condiciones especificas de uso para liberar el grupo funcional, y por tanto el farmaco de 2,4-pirimidindiamina activo. La escision del prorresto puede transcurrir espontaneamente, tal como mediante una reaccion de hidrolisis, o puede estar catalizada o inducida por otro agente, tal como mediante una enzima, mediante luz, mediante acido o base, o mediante un cambio de o exposicion a un parametro fisico o medioambiental, tal como un cambio de temperatura. El agente puede ser endogeno a las condiciones de uso, tal como una enzima presente en las celulas a las que se administra el profarmaco, o las condiciones acidas del estomago, o se puede suministrar de forma exogena.
En la tecnica se conoce una amplia variedad de profarmacos, asi como los prorrestos resultantes, adecuados para enmascarar grupos funcionales en los compuestos de 2,4-pirimidindiamina activos para producir profarmacos. Por ejemplo, un grupo funcional hidroxilo se puede enmascarar como un prorresto de sulfonato, ester o carbonato, que se puede hidrolizar in viva para proporcionar el grupo hidroxilo. Un grupo funcional amino se puede enmascarar como un prorresto de amida, carbamato, imina, urea, fosfenilo, fosforilo o sulfenilo, que se puede hidrolizar in viva para proporcionar el grupo amino. Un grupo carboxilo se puede enmascarar como un prorresto de ester (incluyendo esteres y tioesteres de sililo), amida o hidrazida, que se puede hidrolizar in viva para proporcionar el grupo carboxilo. Otros ejemplos especificos de progrupos adecuados y sus prorrestos respectivos seran manifiestos para los expertos en la tecnica.
"Progrupo" se refiere a un tipo de grupo protector que, cuando se usa para enmascarar un grupo funcional en un farmaco de 2,4-pirimidindiamina activo para formar un prorresto, convierte el farmaco en un profarmaco. Los progrupos estan unidos tipicamente al grupo funcional del farmaco via enlaces que son escindibles en condiciones especificas de uso. De este modo, un profarmaco es aquella porcion de un prorresto que se escinde para liberar el grupo funcional en las condiciones especificas de uso. Como un ejemplo especifico, un prorresto de amida de la formula -NH-C(O)CH3 comprende el progrupo -C(O)CH3.
"Receptor Fc" se refiere a un miembro de la familia de moleculas de la superficie celular que se une a la porcion Fc (que contiene la region constante especifica) de una inmunoglobulina. Cada receptor Fc se une a inmunoglobulinas de un tipo especifico. Por ejemplo, el receptor Fca ("FcaR") se une a IgA, el FcsR se une a IgE, y el FcyR se une a IgG.
La familia de FcaR incluye el receptor polimerico de Ig implicado en el transporte epitelial de IgA/IgM, el receptor RcaRI especifico de la estirpe mieloide (tambien denominado CD89), el Fca/!R y al menos dos receptores de IgA alternativos (para un repaso reciente, vease Monteiro y van de Winkel, 2003, Annu. Rev. Immunol., publicacion electronica avanzada). El FcaRI es expresado en neutrofilos, eosinofilos, monocitos/macrofagos, celulas dendriticas y celulas de Kupfer. El FcaRI incluye una cadena alfa y el homodimero gamma de FcR que tiene un motivo de activacion (ITAM) en el dominio citoplasmico y fosforila Syk cinasa.
La familia de FcsR incluye dos tipos, denominados FcsRI y FcsRII (tambien conocido como CD23). FcsRI es un receptor de alta afinidad (se une a IgE con una afinidad de alrededor de 1010 M-1) encontrado en mastocitos, basofilos y eosinofilos que ancla IgE monomerico a la superficie celular. El FcsRI posee una cadena alfa, una cadena beta y el homodimero de la cadena gamma explicado anteriormente. El FcsRII es un receptor de baja afinidad, expresado en fagocitos mononucleares, linfocitos B, eosinofilos y plaquetas. El FcsRII comprende una cadena polipeptidica sencilla, y no incluye el homodimero de la cadena gamma.
La familia de FcyR incluye tres tipos, denominados FcyRI (tambien conocido como CD64), FcyRII (tambien conocido como CD32) y FcyRIII (tambien conocido como CD16). FcyRI es un receptor de alta afinidad (se une a IgG1 con una afinidad de 108 M-1) encontrado en mastocitos, basofilos, celulas mononucleares, neutrofilos, eosinofilos, celulas dendriticas y fagocitos, que ancla IgG monomerica a la superficie celular. El FcyRI incluye una cadena alfa y el dimero de la cadena gamma compartido por FcaRI y FcsRI.
El FcyRII es un receptor de baja afinidad expresado en neutrofilos, monocitos, eosinofilos, plaquetas y linfocitos B. El FcyRII incluye una cadena alfa, y no incluye el homodimero de la cadena gamma explicado anteriormente.
El FcyRIII es un receptor de baja afinidad (se une a IgG1 con una afinidad de 5 x 105 M-1) expresado en NK, eosinofilos, macrofagos, neutrofilos y mastocitos. Comprende una cadena alfa y el homodimero gamma compartido por FcaRI, FcsRI y FcyRI.
Los expertos reconoceran que la estructura de la subunidad y las propiedades de union de estos diversos receptores Fc, asi como los tipos celulares que los expresan, no estan completamente caracterizados. La explicacion anterior refleja simplemente el estado actual de la tecnica con relacion a estos receptores (vease, par ejemp/a, Immunobiology: The Immune System in Health & Disease, 5a Edicion, Janeway et al., Eds, 2001, ISBN 0-8153-3642-x, Figura 9.30 en la pagina 371), y no pretende ser limitante con respecto a la miriada de cascadas de senalizacion de receptores que se puede regular con los compuestos descritos aqui.
"Desgranulacion mediada por el receptor Fc" o "desgranulacion inducida por el receptor Fc" se refiere a la desgranulacion que transcurre via una cascada de transduccion de senales del receptor Fc iniciada por la reticulacion de un receptor Fc.
"Desgranulacion inducida por IgE" o "desgranulacion mediada por FcsRI" se refiere a la desgranulacion que transcurre via la cascada de transduccion de senales del receptor IgE iniciada por la reticulacion de IgE unido a FcsR1. La reticulacion se puede inducir mediante un alergeno especifico de IgE, o mediante otro agente de union multivalente, tal como un anticuerpo anti-IgE. Haciendo referencia a la FIG. 2, en mastocitos y/o basofilos, la cascada de senalizacion de FcsRI que conduce a la desgranulacion se puede dividir en dos etapas: aguas arriba y aguas abajo. La etapa aguas arriba incluye todos los procesos que ocurren antes de la movilizacion del ion calcio (ilustrado como "Ca2+" en la FIG. 2; vease tambien la FIG. 3). La etapa aguas abajo incluye la movilizacion del ion calcio y todos sus procesos aguas abajo. Los compuestos que inhiben la desgranulacion mediada por FcsRI pueden actuar en cualquier punto a lo largo de la cascada de transduccion de senales mediada por FcsRI. Los compuestos que inhiben selectivamente aguas arriba la desgranulacion mediada por FcsRI actuan para inhibir esa porcion de la cascada de senalizacion de FcsRI aguas arriba del punto en el que se induce la movilizacion del ion calcio. En ensayos basados en celulas, los compuestos que inhiben selectivamente la desgranulacion mediada por FcsRI aguas arriba inhiben la desgranulacion de celulas tales como mastocitos o basofilos que son activados o estimulados con un alergeno especifico de IgE o con un agente de union (tal como un anticuerpo anti-IgE), pero no inhiben apreciablemente la desgranulacion de celulas que son activadas o estimuladas con agentes desgranulantes que evitan la ruta de senalizacion de FcsRI, tales como, por ejemplo, los ionoforos de calcio ionomicina y A23187.
"Desgranulacion inducida por IgG" o "desgranulacion mediada por FcyRI" se refiere a la desgranulacion que transcurre via la cascada de transduccion de senales de FcyRI iniciada mediante la reticulacion de IgG unida a FcyRI. La reticulacion se puede inducir mediante un alergeno especifico de IgG o mediante otro agente de union multivalente, tal como un anticuerpo anti-IgG o un fragmento de anticuerpo. Al igual que la cascada de senalizacion de FcsRI, en mastocitos y basofilos la cascada de senalizacion de FcyRI tambien conduce a la desgranulacion, que se puede dividir en las mismas dos etapas: aguas arriba y aguas abajo. Similar a la desgranulacion mediada por FcsRI, los compuestos que inhiben selectivamente aguas arriba la desgranulacion mediada por FcyRI actuan aguas arriba del punto en el que se induce la movilizacion del ion calcio. En ensayos basados en celulas, los compuestos que inhiben selectivamente aguas arriba la desgranulacion mediada por FcyRI inhiben la desgranulacion de celulas tales como mastocitos o basofilos que son activados o estimulados por un alergeno especifico de IgG o con un agente de union (tal como un anticuerpo anti-IgG o fragmento), pero no inhiben apreciablemente la desgranulacion de celulas que son activadas o estimuladas con agentes desgranulantes que evitan la ruta de senalizacion de FcyRI, tales como, por ejemplo, los ionoforos de calcio ionomicina y A23187.
"Desgranulacion inducida por ionoforos" o "desgranulacion mediada por ionoforos" se refiere a la desgranulacion de una celula, tal como un mastocito o basofilo, que se produce con la exposicion a un ionoforo de calcio tal como, por ejemplo, ionomicina o A23187.
"Syk cinasa" se refiere a la tirosina cinasa proteinica del bazo no receptora (citoplasmica) de 72 kDa bien conocida, expresada en celulas B y en otras celulas hematopoyeticas. Syk cinasa incluye dos dominios de homologia tipo 2 con Src (SH2) de consenso en tandem, que se unen a motivos de activacion del inmunorreceptor basados en tirosina ("ITAM") fosforilados, un dominio "enlazador" y un dominio catalitico (para un repaso de la estructura y funcion de Syk cinasa, vease Sada et al., 2001, J. Biochem. (Tokyo) 130:177-186); vease tambien Turner et al., 2000, Immunology Today 21:148-154). La Syk cinasa se ha estudiado ampliamente como un efector de la senalizacion del receptor de celulas B (BCR) (Turner et al., 2000, mas arriba). La Syk cinasa tambien es critica para la fosforilacion de tirosina de multiples proteinas que regulan importantes rutas que parten de inmunorreceptores, tales como las cascadas de movilizacion de Ca2+ y de proteina cinasas activadas por mitogenos (MAPK) (vease, por ejemplo, la FIG. 2) y la desgranulacion. La Syk cinasa tambien desempena un papel critico en la senalizacion de integrina en neutrofilos (vease, par ejemp/a, Mocsai et al. 2002, Immunity 16:547-558).
Como se usa aqui, Syk cinasa incluye cinasas de cualquier especie animal, incluyendo, pero sin limitarse a, homosapiens, simio, bovina, porcina, roedor, etc., reconocida por pertenecer a la familia de Syk. Se incluyen especificamente isoformas, variantes de corte y empalme, variantes alelicas, mutantes, tanto de origen natural como hechas por el hombre. Las secuencias de aminoacidos de tales Syk cinasas son bien conocidas, y estan disponibles en GENBANK. Los ejemplos especificos de ARNm que codifican diferentes isoformas de Syk cinasa humana se pueden encontrar en el numero de acceso de GENBANK gi1213615521ref1NM 003177.21, gi14968991emb1Z29630.11HSSYKPTK[496899] y gi1150302581gb1BC011399.11BC011399[15030258].
Los expertos apreciaran que las tirosina cinasas que pertenecen a otras familias pueden tener sitios activos o bolsillos de union que son similares en estructura tridimensional a la de Syk. Como consecuencia de esta similitud estructural, se espera que tales cinasas, denominadas aqui como "imitadores de Syk", catalicen la fosforilacion de sustratos fosforilados por Syk. De este modo, se apreciara que tales imitadores de Syk, en cuyas cascadas de transduccion de senales tales imitadores de Syk desempenan un papel, y las respuestas biologicas provocadas por tales imitadores de Syk y las cascadas de senalizacion dependientes de los imitadores de Syk se pueden regular, y en particular inhibir, con los compuestos de 2,4-pirimidindiamina descritos aqui.
"Cascada de senalizacion dependiente de Syk" se refiere a una cascada de transduccion de senales en la que Syk cinasa desempena un papel. Los ejemplos no limitantes de tales cascadas de senalizacion dependientes de Syk incluyen las cascadas de senalizacion de FcaRI, FcsRI, FcyRI, FcyRIII, BCR e integrina.
"Enfermedad autoinmunitaria" se refiere a aquellas enfermedades que estan asociadas habitualmente a reacciones de hipersensibilidad no anafilactica (reacciones de hipersensibilidad de tipo II, tipo III y/o tipo IV) que generalmente resultan como consecuencia de la respuesta inmunitaria humoral y/o celular propia del sujeto a una o mas sustancias inmunogenas de origen endogeno y/o exogeno. Tales enfermedades autoinmunitarias se distinguen de las enfermedades asociadas con las reacciones de hipersensibilidad anafilactica (de tipo I o mediadas por IgE).
6.2 Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina
Los compuestos de la invencion son compuestos segun la formula estructural (Ia):
incluyendo sales, hidratos, solvatos y N-oxidos de los mismos, en la que R2, R4, R5 y R6 son como se define anteriormente. Mas abajo se describen realizaciones especificas adicionales de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion.
En una primera realizacion de los compuestos de formula estructural (Ia), R2, R4, R5 y R6 son como se define anteriormente para (Ia), con la condicion de que R2 no sea 3,4,5-trimetoxifenilo, 3,4,5-trialcoxifenilo (C1-C6) ni
en la que R21, R22 y R23 son como se define para R1, R2 y R3, respectivamente en la patente U.S. n° 6,235,746. En una realizacion especifica de esta primera realizacion, R21 es hidrogeno, halo, alquilo (C1-C6) de cadena lineal o ramificado, opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos o diferentes grupos R25, hidroxilo, alcoxi (C1-C6) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos o diferentes grupos fenilo o R25, tiol (-SH), alquiltio (C1-C6) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos o diferentes grupos fenilo o R25, amino (-NH2), -NHR26 o-NR26R26; R22 y R23 son cada uno, independientemente entre si, un alquilo (C1-C6) de cadena lineal o ramificado, opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos o diferentes grupos R25; R25 se selecciona del grupo que consiste en halo, hidroxilo, alcoxi (C1-C6), tiol, alquiltio (C1-C6), alquilamino (C1-C6) y dialquilamino (C1-C6); y cada R26 es independientemente un alquilo (C1-C6) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos o diferentes grupos fenilo o R25, o un -C(O)R27, en el que R27 es un alquilo (C1-C6) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos o diferentes grupos fenilo o
R25.
En otra realizacion especifica de esta primera realizacion, R21 es metoxi opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos o diferentes grupos halo, y/o R22 y R23 son cada uno, independientemente entre si, un metilo o etilo opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos o diferentes grupos halo.
En una segunda realizacion de los compuestos de formula estructural (Ia), R2, R4 y R5 son como se describe previamente para (Ia) y R6 es hidrogeno, con la condicion de que R2 no sea 3,4,5-trimetoxifenilo, 3,4,5-tri-alcoxifenilo (C1-C6) ni
en la que R21, R22 y R23 son como se define anteriormente en relacion con la primera realizacion.
En una tercera realizacion, los compuestos de formula estructural (Ia) excluyen los compuestos descritos en los Ejemplos 1-141 de la patente U.S. n° 6.235.746.
En una cuarta realizacion, los compuestos de formula estructural (Ia) excluyen compuestos definidos por la formula (1) o formula 1(a) de esta patente U.S. n° 6.235.746 (vease, por ejemplo, la descripcion en la Col. 1, linea 48 a Col. 7, linea 49 y Col. 8, lineas 9-36).
En una quinta realizacion, los compuestos de formula estructural (Ia) excluyen los compuestos definidos por las formulas (I) y (X) del documento WO 02/04429 o cualquier compuesto descrito en el documento WO 02/04429.
En una sexta realizacion de los compuestos de formula estructural (Ia), cuando la que R5 es ciano o -C(O)NHR, en el que R es hidrogeno o alquilo (C1-C6); y R6 es hidrogeno, entonces R2 es distinto de un grupo fenilo sustituido.
En una septima realizacion, los compuestos de formula estructural (Ia) excluyen compuestos definidos por las formulas
(I) y (IV) de la patente U.S. n° 4.983.608 o cualquier compuesto descrito en la patente U.S. n° 4.983.608.
Los expertos en la tecnica apreciaran que, en los compuestos de formula (Ia), R2 y R4 pueden ser iguales o diferentes, y pueden variar ampliamente. En R4 (y/o R2 cuando R2 es un anillo opcionalmente sustituido, tal como cicloalquilos, cicloheteroalquilos, arilos y heteroarilos opcionalmente sustituidos), el anillo puede estar unido al resto de la molecula a traves de cualquier carbono o heteroatomo disponible. Los sustituyentes opcionales pueden unirse a cualesquiera atomos de carbono y/o heteroatomos disponibles.
En una octava realizacion de los compuestos de formula estructural (Ia), R2 es un fenilo opcionalmente sustituido o un arilo (C5-C15) opcionalmente sustituido, sujeto a las condiciones de que (I) cuando R6 es hidrogeno, entonces R2 no es 3,4,5-trimetoxifenilo o 3,4,5-trialcoxi (C1-C6) fenilo; (2) cuando R2 es un fenilo 3,4,5-trisustituido, entonces los sustituyentes en las posiciones 3 y 4 no son simultaneamente metoxi o alcoxi (C1-C6); o (3) cuando R6 es hidrogeno entonces R5 es distinto de ciano. Como alternativa, R2 esta sujeto a las condiciones descritas en relacion con las realizaciones primera o segunda. El grupo arilo o fenilo opcionalmente sustituido puede estar unido al resto de la molecula a traves de cualquier atomo de carbono disponible. Ejemplos especificos de fenilos opcionalmente sustituidos incluyen fenilos que estan opcionalmente mono-, di- o trisustituidos con los mismos o diferentes grupos R8, en los que R8 es como se define previamente para la formula estructural (I), y sometidos a las condiciones anteriores. Cuando el fenilo esta monosustituido, el sustituyente R8 puede estar situado en la posicion arta, meta o para. Cuando esta situado en la posicion arta, meta o para, R8 se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en alquilo (C1-C10), alquilo ramificado (C1-C10), -ORa opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos o diferentes grupos Rb, -O-C(O)ORa, -O-(CH2)m-C(O)ORa, -C(O)ORa, -O-(CH2)m-NRcRc, -O-C(O)NRcRc, -O-(CH2)m-C(O)NRcRc, -O-C(NH)NRcRc, -O-(CH2)m C(NH)NRcRc y -NH-(CH2)m-NRcRc, en los que m, Ra y Rc son como se define previamente para la formula estructural (I). En una realizacion de estos compuestos, -NRcRc es un heteroarilo de 5-6 miembros que incluye opcionalmente uno o
mas de los mismos o diferentes heteroatomos adicionales. Ejemplos especificos de tales heteroarilos de 5-6 miembros incluyen, pero no se limitan a, oxadiazolilo, triazolilo, tiazolilo, oxazolilo, tetrazolilo e isoxazolilo.
En otra realizacion de estos compuestos, -NRcRc es un anillo cicloheteroalquilico de 5-6 miembros saturado que incluye opcionalmente uno o mas de los mismos o diferentes heteroatomos. Ejemplos especificos de tales cicloheteroalquilos incluyen, pero no se limitan a, pirrolidinilo, pirazolidinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo y morfolinilo.
En todavia otra realizacion de estos compuestos, cada Ra es independientemente un alquilo (C1-C6), y/o cada -NRcRc es NHRa, en el que Ra es un alquilo (C1-C6). En una realizacion especifica, R8 es -O-CH2-C(O)NHCH3. En otra realizacion especifica, R8 es -OH.
Cuando el fenilo esta disustituido o trisustituido, los sustituyentes R8 se pueden situar en cualquier combinacion de posiciones. Por ejemplo, los sustituyentes R8 se pueden situar en las posiciones 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 3,4, 3,5, 2,3,4, 2,3,5, 2,3,6, 2,4,5, 2,4,6, 2,5,6 o 3,4,5. En una realizacion de compuestos que incluyen un fenilo disustituido, los sustituyentes estan situados en una posicion distinta de 3,4. En otra realizacion, estan situados en 3,4. En una realizacion de compuestos que incluyen un fenilo trisustituido, los sustituyentes estan situados en una posicion distinta de 3,4,5, o, como alternativa, ninguno de dos de los sustituyentes esta situado en 3,4. En otra realizacion, los sustituyentes estan situados en 3,4,5.
Ejemplos especificos de sustituyentes R8 en tales fenilos di- y trisustituidos incluyen los diversos sustituyentes R8 descritos anteriormente en relacion con los fenilos sustituidos en arta, meta y para.
En otra realizacion especifica, los sustituyentes R8 utiles para sustituir tales fenilos di-y trisustituidos incluyen alquilo (C1-C6), alcoxi (C1-C6), metoxi, halo, cloro, perhaloalquilo (C1-C6), -CF3, perhaloalcoxi (C1-C6) y -OCF3. En una realizacion preferida, tales sustituyentes R8 estan situados en 3,4 o 3,5. Ejemplos especificos de anillos fenilicos disustituidos preferidos incluyen 3-cloro-4-metoxi-fenilo, 3-metoxi-4-clorofenilo, 3-cloro-4-trifluorometoxi-fenilo, 3trifluorometoxi-4-cloro-fenilo, 3,4-dicloro-fenilo, 3,4-dimetoxifenilo y 3,5-dimetoxifenilo.
En otra realizacion de compuestos que incluyen un fenilo trisustituido, el fenilo trisustituido tiene la formula:
en la que: R31 es metilo o alquilo (C1-C6); R32 es hidrogeno, metilo o alquilo (C1-C6); y R33 es un grupo halo.
En una novena realizacion de los compuestos de formula estructural (Ia), R2 es un heteroarilo opcionalmente sustituido. Grupos heteroarilo tipicos segun esta decimotercera realizacion comprenden de 5 a 15, y mas tipicamente de 5 a 11 atomos anulares, e incluyen uno, dos, tres o cuatro de los mismos o diferentes heteroatomos o grupos heteroatomicos seleccionados del grupo que consiste en N, NH, O, S, S(O) y S(O)2. El heteroarilo opcionalmente sustituido se puede unir a su atomo de nitrogeno en C2 a traves de cualquier atomo de carbono o heteroatomo disponible, pero tipicamente se une via un atomo de carbono. Los sustituyentes opcionales pueden ser iguales o diferentes, y pueden estar unidos a cualquier atomo de carbono o heteroatomo disponible. En una realizacion de estos compuestos, R5 es distinto de bromo, nitro, trifluorometilo, ciano o -C(O)NHR, en el que R es hidrogeno o alquilo (C1-C6). En todavia otra realizacion de compuestos que incluyen un grupo heteroarilo opcionalmente sustituido como el sustituyente R2, el heteroarilo no esta sustituido o esta sustituido con de uno a cuatro de los mismos grupos R8 o diferentes, en el que R8 es como se define previamente para la formula estructural (Ia). Los ejemplos especificos de tales heteroarilos opcionalmente sustituidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes grupos heteroarilo:
en las que: p es un numero entero de uno a tres; cada - - - representa independientemente un enlace sencillo o un doble enlace;
5 R35 es hidrogeno o R8, en el que R8 es como se define anteriormente para la formula estructural (I); X se selecciona del grupo que consiste en CH, N y N-O; cada Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S y NH; cada Y1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S, SO, SO2, SONR36, NH y NR37; cada Y2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en CH, CH2, O, S, N, NH y NR37;
10 R36 es hidrogeno o alquilo;
R37 se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno y un progrupo, preferiblemente hidrogeno o un progrupo seleccionado del grupo que consiste en arilo, arilalquilo, heteroarilo, Ra, Rb-CRaRb-O-C(O)R8, -CRaRb-O-PO(OR8)2, CH2-O-PO(OR8)2, -CH2-PO(OR8)2, -C(O)-CRaRb-N(CH3)2, -CRaRb-O-C(O)-CRaRb-N(CH3)2, -C(O)R8, -C(O)CF3 y -C(O)NR8-C(O)R8;
A se selecciona del grupo que consiste en O, NH y NR38;
R38 se selecciona del grupo que consiste en alquilo y arilo;
R9, R10, R11 y R12 se selecciona cada uno, independientemente entre si, del grupo que consiste en alquilo, alcoxi, halogeno, haloalcoxi, aminoalquilo e hidroxialquilo, o, como alternativa, R9 y R10 y/o R11 y R12 se toman juntos para formar un cetal;
cada Z se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxi, ariloxi, ester, carbamato y sulfonilo;
Q se selecciona del grupo que consiste en -OH, OR8, -NRcRc, -NHR39-C(O)R8, -NHR39-C(O)OR8, -NR39-CHR40-Rb, NR39-(CH2)m-Rb y -NR39-C(O)-CHR40-NRcRc;
R39 y R40 se seleccionan cada uno, independientemente entre si, del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo y NHR8; y
Ra, Rb y Rc son como se define previamente para la formula estructural (I). Sustituyentes Rb preferidos para Q se seleccionan de -C(O)OR8, -O-C(O)R8, -O-P(O)(OR8)2 y -P(O)(OR8)2.
En una realizacion de los heteroarilos representados anteriormente, asi como otros heteroarilos de 5-15 miembros segun esta realizacion de la invencion, cada R8 se selecciona independientemente del grupo que consiste en Rd, -NRcRc, -(CH2)m-NRcRc, -C(O)NRcRc, -(CH2)m-C(O)NRcRc, -C(O)ORd, -(CH2)m-C(O)ORd y -(CH2)m-ORd, en los que m, Rc y Rd son como se define previamente para la formula estructural (I).
En una realizacion especifica, Rd y/o Rc se seleccionan del grupo que consiste en Ra y cicloalquilo (C3-C8) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos o diferentes grupos hidroxilo, amino o carboxilo.
En otra realizacion de los heteroarilos representados anteriormente, cada R35 es un atomo de hidrogeno, una cadena carbonada de (C1-C6), incluyendo metilo, etilo, isopropilo, un grupo cicloalquilo, incluyendo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, un
en el que x = 1-8, -CH2CONHMe, -CH2CH2NHMe, -CH2CH2CONHMe, -CH2CH2CH2NHMe o -CH2CH2CH2OCH3.
Todavia en otra realizacion de los heteroarilos representados anteriormente, la conectividad del anillo aromatico esta en la posicion 5 o 6.
En una decima realizacion de los compuestos de formula estructural (Ia), R2 es un fenilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido, con la condicion de que: (1) cuando R6 y opcionalmente R5 es hidrogeno, entonces R2 es distinto de 3,4,5-trimetoxifenilo o 3,4,5-trialcoxifenilo (C1-C6); (3) cuando R4 es 3-metoxifenilo o 3-alcoxi (C1-C6)-fenilo, y R2 es un fenilo 3,4,5-trisustituido, los sustituyentes situados en las posiciones 3 y 4 no son ambos simultaneamente metoxi ni alcoxi (C1-C6); (4) cuando R2 es un fenilo sustituido y R6 es hidrogeno, entonces R5 es distinto de ciano o -C(O)NHR, en el que R es hidrogeno o alquilo (C1-C6); y/o (5) cuando R2 y R4 son cada uno independientemente un pirrol o un indol sustituido o no sustituido, entonces el pirrol o el indol se une al resto de la molecula via un atomo de carbono anular. Como alternativa, R2 esta sometido a las condiciones descritas en relacion con la realizacion primera o segunda.
En esta decima realizacion de la invencion, los sustituyentes R2 y R4 pueden ser iguales o diferentes. Los fenilo, arilo y/o heteroarilos opcionalmente sustituido especificos incluyen los ilustrados anteriormente en relacion con la octava y novena realizacion.
En una undecima realizacion de los compuestos de formulas estructurales (I) y (Ia), incluyendo sus realizaciones primera a decimocuarta descritas anteriormente, R6 es hidrogeno y R5 representa un grupo como se define para la formula (Ia) anterior, que es un grupo electronegativo. Como reconoceran los expertos, los grupos electronegativos son atomos o grupos de atomos que tienen una tendencia relativamente grande a atraer electrones hacia ellos. Ejemplos especificos de grupos electronegativos segun esta undecima realizacion incluyen, pero no se limitan a, -CN, -NC, -NO2, halo, bromo, cloro, fluoro, haloalquilo (C1-C3), perhaloalquilo (C1-C3), fluoroalquilo (C1-C3), perfluoroalquilo (C1-C3), -CF3, haloalcoxi (C1-C3), perhaloalcoxi (C1-C3), fluoroalcoxi (C1-C3), perfluoroalcoxi (C1-C3), -OCF3, -C(O)Ra,
C(O)ORa, -C(O)CF3 y -C(O)OCF3. En una realizacion especifica, el grupo electronegativo es un grupo electronegativo que contiene halogeno, tal como -OCF3, -CF3, bromo, cloro o fluoro. En otra realizacion especifica, R5 es fluoro.
En una duodecima realizacion, los compuestos de formula estructural (Ia) son compuestos segun la formula estructural (Ic):
y sales, hidratos, solvatos y N-oxidos de los mismos, en la que:
R4 es como se define para la formula (Ia) anterior;
R5 es F o -CF3; y
R8 es -O(CH2)m-Rb, en el que m y Rb son como se define previamente para la formula estructural (I). En una realizacion especifica, R8 es -O-CH2-C(O)NH-CH3 y/o R4 es un heteroarilo segun la realizacion decimotercera.
En una decimotercera realizacion, los compuestos de formula estructural (Ia) incluyen cualquier compuesto seleccionado de la TABLA 1 que inhibe una cascada de transduccion de senales de receptores Fc, una actividad de Syk cinasa, una cascada de transduccion de senales de receptores dependientes de Syk cinasa, o la desgranulacion celular como se mide en un ensayo in vitra, opcionalmente sujeto a la condicion de que el compuesto no sea un compuesto excluido por la realizacion descrita anteriormente. En una realizacion especifica, tales compuestos tienen una IC50 de alrededor de 20 !M o menos, segun se mide en un ensayo de desgranulacion in vitra, tal como uno de los ensayos de desgranulacion descritos en la seccion de Ejemplos.
En una decimocuarta realizacion, los compuestos de formula estructural (Ia) incluyen cualquier compuesto seleccionado de la TABLA 1 que inhibe la cascada de los receptores FcyR1 o Fc£R1 con una IC50 de alrededor de 20 !M o menos segun se mide en un ensayo in vitra, tal como uno de los ensayos in vitra proporcionados en la seccion de Ejemplos, opcionalmente sujeto a la condicion de que el compuesto no sea un compuesto excluido por las realizaciones descritas anteriormente.
En una decimoquinta realizacion, los compuestos de formula estructural (Ia) son aquellos en los que R2 se selecciona del grupo que consiste en
R4, R8, Ra, Rb, Rc, Rd son como se describe anteriormente, R5 es un atomo de fluor; R6 es un atomo de hidrogeno y cada R21 son independientemente un atomo de halogeno o un alquilo opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos o diferentes grupos halo, R22 y R23 son cada uno, independientemente entre si, un atomo de hidrogeno, metilo o etilo opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos o diferentes grupos halo, cada m es independientemente un numero entero de 1 a 3, y cada n es independientemente un numero entero de 0 a 3.
En una decimosexta realizacion, aplicable a las realizaciones primera a decimoquinta, R5 es un atomo de halogeno, tal como fluor, y R6 es un atomo de hidrogeno.
Tambien se describen especificamente combinaciones de las realizaciones primera a decimosexta anteriores.
Los expertos en la tecnica apreciaran que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina descritos aqui pueden incluir grupos funcionales que se pueden enmascarar con progrupos para crear profarmacos. Los profarmacos de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina definidos en las reivindicaciones anejas no son parte de la presente invencion. Tales progrupos son habitualmente, aunque no necesariamente, farmacologicamente inactivos hasta que se convierten en su forma farmaceutica activa. De hecho, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina activos de formula (Ia) descritos en la TABLA 1, mas abajo, pueden incluir prorrestos que son hidrolizables o de otro modo escindibles en las condiciones de uso. Por ejemplo, los grupos ester habitualmente sufren hidrolisis catalizada por acidos para producir el acido carboxilico progenitor cuando se exponen a las condiciones acidas del estomago, o la hidrolisis catalizada por bases cuando se exponen a las condiciones basicas del intestino o la sangre. De este modo, cuando se administran oralmente a un sujeto, las 2,4-pirimidindiaminas que incluyen restos de ester se pueden considerar profarmacos de su acido carboxilico correspondiente, independientemente de si la forma de ester es farmacologicamente activa. Haciendo referencia a la TABLA 1, numerosas 2,4-pirimidindiaminas que contienen ester de la invencion son activas en su forma de "profarmaco" de ester.
En los profarmacos descritos aqui, cualquier resto funcional disponible puede estar enmascarado con un progrupo para producir un profarmaco. Los grupos funcionales en los compuestos de 2,4-pirimidindiamina que se pueden enmascarar con progrupos para inclusion en un prorresto incluyen, pero no se limitan a, aminas (primarias y secundarias), hidroxilos, sulfanilos (tioles), carboxilos, etc. En la tecnica se conoce una miriada de progrupos adecuados para enmascarar tales grupos funcionales para producir prorrestos que son escindibles en las condiciones de uso deseadas. Todos estos progrupos, solos o en combinaciones, pueden estar incluidos en los profarmacos descritos aqui.
En una realizacion ilustrativa, los profarmacos descritos aqui son compuestos segun la formula estructural (Ia) en la que Rc y Rd pueden ser, ademas de sus alternativas definidas previamente, un progrupo.
La sustitucion de los hidrogenos unidos a N2 y N4 en las 2,4-pirimidindiaminas de formula estructural (Ia) por sustituyentes afecta adversamente a la actividad de los compuestos. Sin embargo, como apreciaran los expertos, estos nitrogenos se pueden incluir en prorrestos que, en condiciones de uso, se escinden para producir 2,4-pirimidindiaminas segun la formula estructural (Ia). De este modo, los profarmacos incluyen compuestos segun la formula estructural (II):
incluyendo sales, hidratos, solvatos y N-oxidos de los mismos, en la que:
R2, R4, R5 y R6 son como se define previamente para la formula estructural (Ia); y
R2b y R4b son cada uno, independientemente entre si, un progrupo. Ejemplos especificos de tales progrupos incluyen, pero no se limitan a, alquilo (C1-C6), -C(O)CH3, -C(O)NHR36 y -S(O)2R36, en los que R36 es alquilo (C1-C6), arilo (C5-C15) y cicloalquilo (C3-C8).
En los profarmacos de formula estructural (II), los diversos sustituyentes pueden ser como se describe para las diversas realizaciones primera a decimoquinta previamente descritas para los compuestos de formula estructural (Ia), o combinaciones de tales realizaciones.
Los expertos en la tecnica apreciaran que muchos de los compuestos de la invencion y sus profarmacos, asi como las diversas especies de compuestos descritas y/o ilustradas especificamente aqui, pueden mostrar el fenomeno de tautomeria, isomeria conformacional, isomeria geometrica y/o isomeria optica. Por ejemplo, los compuestos de la invencion y sus profarmacos pueden incluir uno o mas centros quirales y/o dobles enlaces, y, como consecuencia, pueden existir como estereoisomeros, tales como isomeros de dobles enlaces (es decir, isomeros geometricos), enantiomeros y diastereomeros y sus mezclas, tales como mezclas racemicas. Como otro ejemplo, los compuestos y profarmacos de la invencion pueden existir en varias formas tautomeras, incluyendo la forma enolica, la forma ceto y sus mezclas. Puesto que los diversos nombres, formulas y dibujos de los compuestos en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones solo pueden representar una de las posibles formas tautomeras, de isomero conformacional, de isomero optico o de isomero geometrico, se deberia entender que la invencion engloba cualquiera de las formas tautomera, de isomero conformacional, de isomero optico y/o de isomero geometrico de los compuestos o profarmacos que tienen una o mas de las utilidades descritas aqui, asi como mezclas de estas diversas formas isomeras diferentes. En casos de rotacion limitada alrededor de la estructura central de 2,4-pirimidindiamina, tambien son posibles atropisomeros, y tambien se incluyen especificamente en los compuestos de la invencion.
Ademas, los expertos apreciaran que cuando listas de sustituyentes alternativos incluyen miembros que, dado los requisitos de valencia u otras razones, no se pueden usar para sustituir un grupo particular, la lista esta destinada a ser leida en el contexto de que incluya aquellos miembros de la lista que sean adecuados para sustituir el grupo particular. Por ejemplo, los expertos apreciaran que aunque se pueden usar todas las alternativas enumeradas para Rb para sustituir un grupo alquilo, algunas alternativas, tales como =O, no se pueden usar para sustituir un grupo fenilo. Se entendera que solo se proponen combinaciones posibles de los pares de grupos sustituyentes.
Los compuestos de la invencion y/o sus profarmacos se pueden identificar mediante su estructura quimica o su nombre quimico. Cuando la estructura quimica y el nombre quimico entran en conflicto, la estructura quimica es determinante de la identidad del compuesto especifico.
Dependiendo de la naturaleza de los diversos sustituyentes, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion y sus profarmacos pueden estar en forma de sales. Tales sales incluyen sales adecuadas para usos farmaceuticos ("sales farmaceuticamente aceptables"), sales adecuadas para usos veterinarios, etc. Tales sales pueden derivar de acidos o bases, como es bien conocido en la tecnica.
En una realizacion, la sal es una sal farmaceuticamente aceptable. Generalmente, las sales farmaceuticamente aceptables son aquellas sales que retienen sustancialmente una o mas de las actividades farmacologicas deseadas del compuesto progenitor, y que son adecuadas para la administracion a seres humanos. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen sales de adicion de acidos formadas con acidos inorganicos o acidos organicos. Los acidos inorganicos adecuados para formar sales de adicion de acidos farmaceuticamente aceptables incluyen, a titulo de ejemplo y no de limitacion, acidos halohidricos (par ejemp/a, acido clorhidrico, acido bromhidrico, acido yodhidrico, etc.), acido sulfurico, acido nitrico, acido fosforico, y similares. Los acidos organicos adecuados para formar sales de adicion de acidos farmaceuticamente aceptables incluyen, a titulo de ejemplo y no de limitacion, acido acetico, acido trifluoroacetico, acido propionico, acido hexanoico, acido ciclopentanopropionico, acido glicolico, acido oxalico, acido piruvico, acido lactico, acido malonico, acido succinico, acido malico, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido citrico, acido palmitico, acido benzoico, acido 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, acido cinamico, acido mandelico, acidos alquilsulfonicos (par ejemp/a, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido 1,2-etanodisulfonico, acido 2hidroxietanosulfonico, etc.), acidos arilsulfonicos (par ejemp/a, acido bencenosulfonico, acido 4-clorobencenosulfonico, acido 2-naftalenosulfonico, acido 4-toluenosulfonico, acidos cicloalquilsulfonicos (par ejemp/a, acido canfosulfonico, etc.), acido 4-metilbiciclo[2.2.2]-oct-2-en-1-carboxilico, acido glucoheptonico, acido 3-fenilpropionico, acido trimetilacetico, acido butilacetico terciario, acido laurilsulfurico, acido gluconico, acido glutamico, acido hidroxinaftoico, acido salicilico, acido estearico, acido muconico, y similares.
Las sales farmaceuticamente aceptables tambien incluyen sales formadas cuando un proton acido presente en el compuesto progenitor se sustituye por un ion metalico (par ejemp/a, un ion de metal alcalino, un ion de metal alcalinoterreo o un ion de aluminio), un ion amonio o se coordina con una base organica (par ejemp/a, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, N-metilglucamina, morfolina, piperidina, dimetilamina, dietilamina, etc.).
Los compuestos y profarmacos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion, asi como sus sales, tambien pueden estar en forma de hidratos, solvatos y N-oxidos, como son bien conocidos en la tecnica.
6.3 Metodos de Sintesis
Los compuestos de la invencion y sus profarmacos se pueden sintetizar via una variedad de rutas sinteticas diferentes usando materiales de partida comercialmente disponibles y/o materiales de partida preparados por metodos sinteticos convencionales. Los metodos ejemplares adecuados que se pueden adaptar habitualmente para sintetizar los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion y sus profarmacos se encuentran en la patente U.S. n° 5.958.935. En la seccion de Ejemplos se proporcionan ejemplos especificos que describen la sintesis de numerosos compuestos de la invencion y sus profarmacos, asi como intermedios para ellos. Todos los compuestos de formula estructural (Ia) y
(II) se pueden preparar mediante adaptacion normal de estos metodos.
En los Esquemas (I)-(XI), a continuacion, se describe una variedad de rutas sinteticas ejemplares que se pueden usar para sintetizar los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion. En los Esquemas (I)-(XI), compuestos con numeros similares tienen estructuras similares. Estos metodos se pueden adaptar de forma normal para sintetizar los profarmacos segun la formula estructural (II).
En una realizacion ejemplar, los compuestos se pueden sintetizar a partir de uracilos o tiouracilos sustituidos o no sustituidos como se ilustra en el Esquema (I), a continuacion:
Esquema (I)
En el Esquema (I), R2, R4, R5, R6 son como se define previamente para la formula estructural (Ia), X es halogeno (par ejemp/a, F, Cl, Br o I) e Y e Y' se seleccionan cada uno, independientemente entre si, del grupo que consiste en O y S. Haciendo referencia al Esquema (I), el uracilo o tiouracilo 2 se dihalogena en las posiciones 2 y 4 usando un agente halogenante estandar POX3 (u otro agente halogenante estandar) en condiciones estandar para producir la 2,4bishalopirimidina 4. Dependiendo del sustituyente R5, en la pirimidina 4, el haluro en la posicion C4 es mas reactivo con nucleofilos que el haluro en la posicion C2. Esta reactividad diferencial se puede explotar para sintetizar 2,4pirimidindiaminas segun la formula estructural (Ia) haciendo reaccionar en primer lugar la 2,4-bishalopirimidina 4 con un equivalente de amina 10, produciendo la 4N-sustituida-2-halo-4-pirimidinamina 8, seguido de la amina 6 para producir una 2,4-pirimidindiamina segun la formula estructural (I). Las 2N,4N-bis(sustituidas)-2,4-pirimidindiaminas 12 y 14 se pueden obtener haciendo reaccionar la 2,4-bishalopiridina 4 con 6 o 10 en exceso, respectivamente.
En la mayoria de las situaciones, el haluro de C4 es mas reactivo con nucleofilos, como se ilustra en el Esquema. Sin embargo, como reconoceran los expertos, la identidad del sustituyente R5 puede alterar esta reactividad. Por ejemplo, cuando R5 es trifluorometilo, se obtiene una mezcla 50:50 de 4N-sustituida-4-pirimidinamina 8 y la 2N-sustituida-2pirimidinamina correspondiente. Independientemente de la identidad del sustituyente R5, la regioselectividad de la reaccion se puede controlar ajustando el disolvente y otras condiciones sinteticas (tales como la temperatura), como es bien conocido en la tecnica.
Las reacciones representadas en el Esquema (I) pueden transcurrir mas rapidamente cuando las mezclas de reaccion se calientan via microondas. Cuando se calienta de esta manera, se pueden usar las siguientes condiciones: calentamiento hasta 175°C en etanol durante 5-20 min. en un reactor Smith (Personal Chemistry) en un tubo cerrado hermeticamente (a una presion de 20 bares).
Los materiales de partida de uracilo o tiouracilo 2 se pueden adquirir de fuentes comerciales, o se pueden preparar usando tecnicas estandar de quimica organica. Los uracilos y tiouracilos comercialmente disponibles que se pueden usar como materiales de partida en el Esquema (I) incluyen, a titulo de ejemplo y no de limitacion, uracilo (Aldrich #13,078-8; Registro CAS 66-22-8); 2-tio-uracilo (Aldrich #11,558-4; Registro CAS 141-90-2); 2,4-ditiouracilo (Aldrich #15,846-1; Registro CAS 2001-93-6); 5-acetouracilo (Chem. Sources Int'12000; Registro CAS 6214-65-9); 5azidouracilo; 5-aminouracilo (Aldrich #85,528-6; Registro CAS 932-52-5); 5-bromouracilo (Aldrich #85,247-3; Registro CAS 51-20-7); 5-(trans-2-bromovinil)-uracilo (Aldrich #45,744-2; Registro CAS 69304-49-0); 5-(trans-2-clorovinil)-uracilo (Registro CAS 81751-48-2); 5-(trans-2-carboxivinil)-uracilo; acido uracil-5-carboxilico (hidrato del acido 2,4
dihidroxipirimidin-5-carboxilico; Aldrich #27,770-3; Registro CAS 23945-44-0); 5-clorouracilo (Aldrich #22,458-8; Registro CAS 1820-81-1); 5-cianouracilo (Chem. Sources Int'12000; Registro CAS 4425-56-3); 5-etiluracilo (Aldrich #23,044-8; Registro CAS 4212-49-1); 5-eteniluracilo (Registro CAS 37107-81-6); 5-fluorouracilo (Aldrich #85,847-1; Registro CAS 51-21-8); 5-yodouracilo (Aldrich #85,785-8; Registro CAS 696-07-1); 5-metiluracilo (timina; Aldrich #13,199-7; Registro CAS 65-71-4); 5-nitrouracilo (Aldrich #85,276-7; Registro CAS 611-08-5); acido uracil-5-sulfamico (Chem. Sources Int'12000; Registro CAS 5435-16-5); 5-(trifluorometil)-uracilo (Aldrich #22,327-1; Registro CAS 54-20-6); 5-(2,2,2trifluoroetil)-uracilo (Registro CAS 155143-31-6); 5-(pentafluoroetil)-uracilo (Registro CAS 60007-38-3); 6-aminouracilo (Aldrich #A5060-6; Registro CAS 873-83-6); acido uracil-6-carboxilico (acido orotico; Aldrich #0-840-2; Registro CAS 50887-69-9); 6-metiluracilo (Aldrich #D11,520-7; Registro CAS 626-48-2); acido uracil-5-amino-6-carboxilico (acido 5aminoorotico; Aldrich #19,121-3; Registro CAS #7164-43-4); 6-amino-5-nitrosouracilo (6-amino-2,4-dihidroxi-5nitrosopirimidina; Aldrich #27,689-8; Registro CAS 5442-24-0); acido uracil-5-fluoro-6-carboxilico (acido 5-fluoroorotico; Aldrich #42,513-3; Registro CAS 00000-00-0); y acido uracil-5-nitro-6-carboxilico (acido 5-nitroorotico; Aldrich #18,5280; Registro CAS 600779-49-9). Uracilos y/o tiouracilos sustituidos en 5, en 6 y 5,6-sustituidos adicionales estan disponibles en General Intermediates of Canada, Inc., Edmonton, Alberta, CA (www.generalintermediates.com) y/o Interchim, Francia (www.interchim.com), o se pueden preparar usando tecnicas estandar. Mas abaja se proporciona una miriada de referencias de libros de texto que ensenan metodos sinteticos adecuados.
Las aminas 6 y 10 se pueden adquirir de fuentes comerciales, o, como alternativa, se pueden sintetizar utilizando tecnicas estandar. Por ejemplo, las aminas adecuadas se pueden sintetizar a partir de nitroprecursores usando quimica estandar. En la seccion de Ejemplos se proporcionan reacciones ejemplares especificas. Vease tambien Vogel, 1989, Practical Organic Chemistry, Addison Wesley Longman, Ltd. y John Wiley & Sons, Inc.
Los expertos reconoceran que, en algunos casos, las aminas 6 y 10 y/o los sustituyentes R5 y/o R6 en el uracilo o tiouracilo 2 pueden incluir grupos funcionales que requieran proteccion durante la sintesis. La identidad exacta de cualquier o cualquiera de los grupos protectores usados dependera de la identidad del grupo funcional a proteger, y sera manifiesta para los expertos en la tecnica. Por ejemplo, en Greene yWuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a Edicion, John Wiley & Sons, Inc., New York (1999), y las referencias citadas alli (en lo sucesivo "Greene y Wuts"), se puede encontrar una guia para seleccionar grupos protectores adecuados, asi como estrategias sinteticas para su union y eliminacion.
En el Esquema (Ia), a continuacion, se ilustra una realizacion especifica del Esquema (I) que utiliza 5-fluorouracilo (Aldrich #32,937-1) como material de partida:
En el Esquema (Ia), R2, R4 son como se define previamente para el Esquema (I). Segun el Esquema (Ia), el 5fluorouracilo 3 se halogena con POCl3 para producir 2,4-dicloro-5-fluoropirimidina 5, que entonces se hace reaccionar
con amina 6 o 10 en exceso para producir N2,N4-bis-sustituida-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina 11 o 13, respectivamente. Como alternativa, la 2N,4N-disustituida-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina 9 asimetrica se puede obtener haciendo reaccionar 2,4-dicloro-5-fluoropirimidina 5 con un equivalente de amina 10 (para producir 2-choro-N4-sustituida-5-fluoro-4pirimidinamina 7) seguido de uno o mas equivalentes de amina 6.
En otra realizacion ejemplar, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion se pueden sintetizar a partir de citosinas sustituidas o no sustituidas como se ilustra en los Esquemas (IIa) y (IIb), a continuacion:
Esquema (IIb)
En los Esquemas (IIa) y (IIb), R2, R4, R5, R6 y X son como se define previamente para el Esquema (I), y PG representa un grupo protector. Haciendo referencia al Esquema (IIa), la amina exociclica en C4 de la citosina 20 se protege en primer lugar con un grupo protector PG adecuado, para producir la citosina N4-protegida 22. Para una guia especifica con respecto a grupos protectores utiles en este contexto, vease Vorbruggen y Ruh-Pohlenz, 2001, Handbook of
15 Nucleoside Synthesis, John Wiley & Sons, NY, p. 1-631 ("Vorbruggen"). La citosina protegida 22 se halogena en la posicion C2 usando un reactivo de halogenacion estandar en condiciones estandar para producir 2-cloro-4N-protegida4-pirimidinamina 24. La reaccion con la amina 6, seguido de la desproteccion de la amina exociclica en C4 y la reaccion con la amina 10 produce una 2,4-pirimidindiamina segun la formula estructural (Ia).
Como alternativa, haciendo referencia al Esquema (IIb), la citosina 20 se puede hacer reaccionar con la amina 10 o con la amina protegida 21 para producir la citosina N4-sustituida 23 o 27, respectivamente. Estas citosinas sustituidas se pueden halogenar entonces como se describe previamente, se pueden desproteger (en el caso de la citosina N4sustituida 27) y se pueden hacer reaccionar con la amina 6 para producir una 2,4-pirimidindiamina segun la formula estructural (Ia).
Las citosinas comercialmente disponibles que se pueden usar como materiales de partida en los Esquemas (IIa) y (IIb) incluyen, pero no se limitan a, citosina (Aldrich #14,201-8; Registro CAS 71-30-7); N4-acetilcitosina (Aldrich #37,791-0; Registro CAS 14631-20-0); 5-fluorocitosina (Aldrich #27,159-4; Registro CAS 2022-85-7); y 5-(trifluorometil)-citosina. Otras citosinas adecuadas, utiles como materiales de partida en los Esquemas (IIa), estan disponibles en General Intermediates of Canada, Inc., Edmonton, Alberta, CA (www.generalintermediates.com) y/o Interchim, Francia www.interchim.com, o se pueden preparar usando tecnicas estandar. Mas abaja se proporciona una miriada de referencias de libros de texto que ensenan metodos sinteticos adecuados.
Todavia en otra realizacion ejemplar, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion se pueden sintetizar a partir de 2-amino-4-pirimidinoles sustituidos o no sustituidos como se ilustra en el Esquema (III), a continuacion:
En el Esquema (III), R2, R4, R5, R6 y X son como se define previamente para el Esquema (I), y Z es un grupo saliente como se explica con mas detalle en relacion con el Esquema IV, mas abaja. Haciendo referencia al Esquema (III), se hace reaccionar 2-qmino-4-pirimidinol 30 con una amina 6 (o una amina opcionalmente protegida 21) para producir N2sustituido-4-pirimidinol 32, que entonces se halogena como se describe previamente para producir N2-sustituida-4-halo2-pirimidinamina 34. La desproteccion opcional (por ejemplo, si se uso la amina protegida 21 en la primera etapa), seguido de la reaccion con la amina 10, da una 2,4-pirimidindiamina segun la formula estructural (Ia). Como alternativa, el pirimidinol 30 se puede hacer reaccionar con un agente acilante 31.
Los 2-amino-4-pirimidinoles 30 comercialmente disponibles adecuados que se pueden usar como materiales de partida en el Esquema (III), incluyen, pero no se limitan a, hidrato de 2-amino-6-cloro-4-pirimidinol (Aldrich #A4702-8; Registro CAS 00000-00-0) y 2-amino-6-hidroxi-4-pirimidinol (Aldrich #A5040-1; Registro CAS 56-09-7). Otros 2-amino-4pirimidinoles 30 utiles como materiales de partida en el Esquema (III) estan disponibles en General Intermediates of Canada, Inc., Edmonton, Alberta, CA (www.generalintermediates.com) y/o Interchim, Francia (www.interchim.com), o se pueden preparar usando tecnicas estandar. Mas abaja se proporciona una miriada de referencias de libros de texto que ensenan metodos sinteticos adecuados.
Como alternativa, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion se pueden preparar a partir de 4-amino-2pirimidinoles sustituidos o no sustituidos como se ilustra en el Esquema (IV), mas abajo:
Esquema (IV)
En el Esquema (IV), R2, R4, R5, R6 son como se define previamente para el Esquema (I), y Z representa un grupo saliente. Haciendo referencia al Esquema (IV), el hidroxilo en C2 del 4-amino-2-pirimidiniol 40 es mas reactivo con 5 nucleofilos que el amino en C4, de forma que la reaccion con la amina 6 produce N2-sustituida-2,4-pirimidindiamina 42. La reaccion subsiguiente con el compuesto 44, que incluye un buen grupo saliente Z, o con la amina 10 produce una 2,4-pirimidindiamina segun la formula estructural (Ia). El compuesto 44 puede incluir virtualmente cualquier grupo saliente que se pueda sustituir por el amino en C4 de la N2-sustituida-2,4-pirimidindiamina 42. Los grupos salientes Z adecuados incluyen, pero no se limita a, halogenos, metanosulfoniloxi (mesiloxi, "OMs"), trifluorometanosulfoniloxi
10 ("OTf"), y p-toluenosulfoniloxi (tosiloxi; "OTs"), bencenosulfoniloxi ("besilato") y metanitrobencenosulfoniloxi ("nosilato"). Otros grupos salientes adecuados seran manifiestos para los expertos en la tecnica.
Los materiales de partida de 4-amino-2-pirimidinol sustituido se pueden obtener comercialmente, o se pueden sintetizar usando tecnicas estandar. Mas abaja se proporciona una miriada de referencia de libros de texto que ensenan metodos sinteticos adecuados.
15 Todavia en otra realizacion ejemplar, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion se pueden preparar a partir de 2-cloro-4-aminopiridinas o 2-amino-4-cloropiridinas como se ilustra en el Esquema (V), a continuacion:
Esquema (V)
En el Esquema (V), R2, R4, R5, R6 y X son como se define para el Esquema (I), y Z es como se define para el Esquema
20 (IV). Haciendo referencia al Esquema (V), la 2-amino-4-cloropirimidina 50 se hace reaccionar con la amina 10 para producir 4N-sustituida-2-pirimidinamina 52 que, tras la reaccion con el compuesto 31 o con la amina 6, produce una 2,4pirimidindiamina segun la formula estructural (I). Como alternativa, la 2-cloro-4-aminopirimidina 54 se puede hacer reaccionar con el compuesto 44 seguido de la amina 6 para producir un compuesto segun la formula estructural (Ia).
Hay comercialmente una variedad de pirimidinas 50 y 54, adecuadas para uso como materiales de partida en el
25 Esquema (V), incluyendo, a titulo de ejemplo y no de limitacion, 2-amino-4,6-dicloropirimidina (Aldrich #A4860-1; Registro CAS 56-05-3); 2-amino-4-cloro-6-metoxi-pirimidina (Aldrich #51,864-6; Registro CAS 5734-64-5); 2-amino-4cloro-6-metilpirimidina (Aldrich #12,288-2; Registro CAS 5600-21-5); y 2-amino-4-cloro-6-metiltiopirimidina (Aldrich #A4600-5; Registro CAS 1005-38-5). Materiales de partida de pirimidina adicionales estan disponibles en General Intermediates of Canada, Inc., Edmonton, Alberta, CA (www.generalintermediates.com) y/o Interchim, Francia
30 (www.interchim.com), o se pueden preparar usando tecnicas estandar. Mas abaja se proporciona una miriada de referencias de libros de texto que ensenan metodos sinteticos adecuados.
Como alternativa, las 4-cloro-2-pirimidinaminas 50 se pueden preparar como se ilustra en el Esquema (Va):
Esquema (Va)
En el Esquema (Va), R5 y R6 son como se define previamente para la formula estructural (Ia). En el Esquema (Va), el
5 dicarbonilo 53 se hace reaccionar con guanidina para producir 2-pirimidinamina 51. La reaccion con peracidos como acido m-cloroperbenzoico, acido trifluoroperacetico o complejo de urea-peroxido de hidrogeno produce el N-oxido 55, que entonces se halogena para dar 4-cloro-2-pirimidinamina 50. Las 4-halo-2-pirimidinaminas correspondientes se pueden obtener usando reactivos de halogenacion adecuados.
Todavia en otra realizacion ejemplar, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion se pueden preparar a 10 partir de uridinas sustituidas o no sustituidas como se ilustra en el Esquema (VI), a continuacion:
Esquema (VI)
En el Esquema (VI), R2, R4, R5, R6 y X son como se define previamente para el Esquema (I), y el superindice PG representa un grupo protector, como se explica en relacion con el Esquema (IIb). Segun el Esquema (VI), la uridina 60 tiene un centro reactivo en C4, de forma que la reaccion con la amina 10 o la amina protegida 21 produce citidina N4sustituida 62 o 64, respectivamente. La desproteccion catalizada por acidos de 62 o 64 N4-sustituida (cuando "PG"
5 representa un grupo protector labil a acidos) produce la citosina N4-sustituida 28, que se puede halogenar subsiguientemente en la posicion C2 y se puede hacer reaccionar con la amina 6 para producir una 2,4-pirimidindiamina segun la formula estructural (Ia).
Las citidinas tambien se pueden usar como materiales de partida de una manera analoga, como se ilustra en el Esquema (VII), a continuacion:
10 Esquema (VII)
En el Esquema (VII), R2, R4, R5, R6 y X son como se define previamente en el Esquema (I), y el superindice PG representa un grupo protector como se explica anteriormente. Haciendo referencia al Esquema (VII), al igual que la uridina 60, la citidina 70 tiene un centro reactivo en C4, de forma que la reaccion con la amina 10 o la amina protegida
15 21 produce la citidina N4-sustituida 62 o 64, respectivamente. Estas citidinas 62 y 64 se tratan entonces como se describe previamente para el Esquema (VI) para producir una 2,4-pirimidindiamina segun la formula estructural (Ia).
Aunque los Esquemas (VI) y (VII) se ejemplifican con ribosilnucleosidos, los expertos apreciaran que tambien funcionaran los 2'-desoxirribo- y 2',3'-didesoxirribonucleosidos correspondientes, asi como nucleosidos que incluyen azucares o analogos de azucares distintos de la ribosa.
20 En la tecnica se conocen numerosas uridinas y citidinas utiles como materiales de partida en los Esquemas (VI) y (VII), e incluyen, a titulo de ejemplo y no de limitacion, 5-trifluorometil-2'-desoxicitidina (Chem. Sources #ABCR F07669; Registro CAS 66,384-66-5); 5-bromouridina (Chem. Sources Int'12000; Registro CAS 957-75-5); 5-yodo-2'-desoxiuridina (Aldrich #1-775-6; Registro CAS 54-42-2); 5-fluorouridina (Aldrich #32,937-1; Registro CAS 316-46-1); 5-yodomidina (Aldrich #85,259-7; Registro CAS 1024-99-3); 5-(trifluorometil)uridina (Chem Sources Int'l 2000; Registro CAS 70-00-8),
25 5-trifluometil-2'-desoxiuridina (Chem. Sources Int'l 2000; Registro CAS 70-00-8). Las uridinas y citidinas adicionales que se pueden usar como materiales de partida en los Esquemas (VI) y (VII) estan disponibles en General Intermediates of Canada, Inc., Edmonton, Alberta, CA (www.generalintermediates.com) y/o Interchim, Francia (www.interchim.com), o se pueden preparar usando tecnicas estandar. Mas abaja se proporciona una miriada de referencias de libros de texto que ensenan metodos sinteticos adecuados.
Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion tambien se pueden sintetizar a partir de pirimidinas sustituidas, tales como pirimidinas clorosustituidas, como se ilustra en los Esquemas (VIII) y (IX), mas abajo:
Esquema (IX)
10 En los Esquemas (VIII) y (IX), R2, R4 y Ra son como se define previamente para la formula estructural (I), y "Ar" representa un grupo arilo. Haciendo referencia al Esquema (VIII), la reaccion de 2,4,6-tricloropirimidina 80 (Aldrich #T5,620-0; CAS#3764-01-0) con la amina 6 produce una mezcla de tres compuestos: pirimidin-mono-, di-y triaminas sustituidas 81, 82 y 83, que se pueden separar y aislar usando HPLC u otras tecnicas convencionales. Las mono- y diaminas 81 y 82 se pueden hacer reaccionar adicionalmente con las aminas 6 y/o 10 para producir N2,N4,N6
15 trisustituidas-2,4,6-pirimidintriaminas 84 y 85, respectivamente.
Las N2,N4-bis-sustituidas-2,4-pirimidindiaminas se pueden preparar de manera analoga al Esquema (VIII) empleando como materiales de partida 2,4-dicloro-5-metilpirimidina o 2,4-dicloro-pirimidina. En este caso, no se obtiene la pirimidinamina monosustituida que corresponde al compuesto 81. En su lugar, la reaccion transcurre para producir directamente la N2,N4-bis-sustituida-2,4-pirimidindiamina.
Haciendo referencia al Esquema (IX), se hace reaccionar 2,4,5,6-tetracloropirimidina 90 (Aldrich #24,671-9; CAS#178040-1) con amina 6 en exceso para producir una mezcla de tres compuestos: 91, 92, y 93, que se pueden separar y
5 aislar usando HPLC u otras tecnicas convencionales. Como se ilustra, la N2,N4-bis-sustituida-5,6-dicloro-2,4pirimidindiamina 92 se puede hacer reaccionar entonces en el haluro de C6 con, por ejemplo, un agente nucleofilo 94 para producir el compuesto 95. Como alternativa, el compuesto 92 se puede convertir en la N2,N4-bis-sustituida-5-cloro6-aril-2,4-pirimidindiamina 97 via una reaccion de Suzuki. La 2,4-pirimidindiamina 95 se puede convertir en la 2,4pirimidindiamina 99 mediante reaccion con Bn3SnH.
10 Como reconoceran los expertos, las 2,4-pirimidindiaminas segun la invencion, sintetizadas via los metodos ejemplares descritos anteriormente o por otros medios bien conocidos, tambien se pueden utilizar como materiales de partida y/o intermedios para sintetizar compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion adicionales. En el Esquema (X), a continuacion, se ilustra un ejemplo especifico:
Esquema (X)
En el Esquema (X), R4, R5, R6 y Ra son como se define previamente para la formula estructural (Ia). Cada Ra' es independientemente un Ra, y puede ser el mismo o diferente del Ra ilustrado. Haciendo referencia al Esquema (X), el acido carboxilico o el ester 100 se puede convertir en la amida 104 mediante reaccion con la amina 102. En la amina 102, Ra' puede ser igual o diferente de Ra del acido o ester 100. De forma similar, el ester de carbonato 106 se puede
20 convertir en carbamato 108.
En el Esquema (XI), a continuacion, se ilustra un segundo ejemplo especifico:
En el Esquema (XI), R4, R5, R6 y Rc son como se define previamente para la formula estructural (Ia). Haciendo referencia al Esquema (XI), la amida 110 o 116 se puede convertir en la amina 114 o 118, respectivamente, mediante
reduccion boranica con complejo 112 de borano-sulfuro de metilo. Otras reacciones adecuadas para sintetizar compuestos de 2,4-pirimidindiamina a partir de materiales de partida de 2,4-pirimidindiamina seran manifiestas para los expertos en la tecnica.
Aunque muchos de los esquemas sinteticos explicados anteriormente no ilustran el uso de grupos protectores, los expertos reconoceran que, en algunos casos, los sustituyentes R2, R4, R5 y/o R6 pueden incluir grupos funcionales que requieran proteccion. La identidad exacta del grupo protector usado dependera, entre otros, de la identidad del grupo funcional que se protege y de las condiciones de reaccion usadas en el esquema sintetico particular, y sera manifiesta para los expertos en la tecnica. Por ejemplo, en Greene y Wuts, mas arriba, se puede encontrar una guia para seleccionar grupos protectores y quimicas para su union y eliminacion adecuados para una aplicacion particular.
Los profarmacos segun la formula estructural (II) se pueden preparar mediante modificacion normal de los metodos descritos anteriormente. Como alternativa, tales profarmacos se pueden preparar haciendo reaccionar una 2,4pirimidindiamina adecuadamente protegida de formula estructural (Ia) con un progrupo adecuado. Las condiciones para llevar a cabo tales reacciones y para desproteger el producto para producir un profarmaco de formula (II) son bien conocidas.
En la tecnica se conoce una miriada de referencias que ensenan metodos utiles para sintetizar de forma general pirimidinas, asi como materiales de partida descritos en los Esquemas (I)-(IX). Para una guia especifica, refierase el lector a Brown, D. J., "The Pyrimidines", en The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volumen 16 (Weissberger, A., Ed.), 1962, Interscience Publishers, (una Division de John Wiley & Sons), Nueva York ("Brown I"); Brown, D.J., "The Pyrimidines", en The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volumen 16, Suplemento I (Weissberger, A. y Taylor, E. C., Ed.), 1970, Wiley-Interscience, (una Division de John Wiley & Sons), Nueva York ("Brown II"); Brown, D. J., "The Pyrimidines", en The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volumen 16, Suplemento II (Weissberger, A. y Taylor, E. C., Ed.), 1985, An Interscience Publication (John Wiley & Sons), Nueva York ("Brown III"); Brown, D. J., "The Pyrimidines" en The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volumen 52 (Weissberger, A. y Taylor, E. C., Ed.), 1994, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, p. 1-1509 ("Brown IV"); Kenner, G. W. y Todd, A., en Heterocyclic Compounds, Volumen 6, (Elderfield, R C., Ed.), 1957, John Wiley, Nueva York, Capitulo 7 (pirimidinas); Paquette, L. A., Principles of Modern Heterocyclic Chemistry, 1968, W. A. Benjamin, Inc., Nueva York, p. 1-401 (sintesis de uracilos p. 313, 315; sintesis de pirimidinas p. 313-316; sintesis de aminopirimidinas p. 315); Joule, J. A., Mills, K y Smith, G. F., Heterocyclic Chemistry, 3a edicion, 1995, Chapman and Hall, Londres, UK, p. 1-516; Vorbruggen, H. y Ruh-Pohlenz, C., Handbook of Nucleoside Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 2001, p. 1-631 (proteccion de pirimidinas mediante acilacion p. 9091; sililacion de pirimidinas p. 91-93); Joule, J. A., Mills, K. y Smith, G. F., Heterocyclic Chemistry, 4a edicion, 2000, Blackwell Science, Ltd, Oxford, UK, p. 1-589; y Comprehensive Organic Synthesis, Volumenes 1-9 (Trost, B. M. y Fleming, I., Ed.), 1991, Pergamon Press, Oxford, UK.
6.4 Inhibici6n de las Cascadas de Senalizaci6n de Receptores Fc
Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina activos de la invencion inhiben las cascadas de senalizacion de receptores Fc que conducen, entre otros, a la desgranulacion de las celulas. Como un ejemplo especifico, los compuestos inhiben las cascadas de senalizacion de FcsRI y/o FcyRI que conducen a la desgranulacion de celulas inmunitarias tales como neutrofilos, eosinofilos, mastocitos y/o basofilos. Tanto los mastocitos como los basofilos desempenan un papel central en trastornos inducidos por alergenos, incluyendo, por ejemplo, rinitis alergica y asma. Haciendo referencia a la FIG. 1, con la exposicion a alergenos, que pueden ser, entre otros, polen o parasitos, se sintetizan anticuerpos IgE especificos de alergenos mediante celulas B activadas por IL-4 (o IL-13) u otros mensajeros para cambiar a la sintesis de anticuerpos especificos de la clase IgE. Estos IgEs especificos de alergenos se unen al FcsRI de alta afinidad. Al unirse al antigeno, los IgE unidos a FcsRI se reticulan y se activa la ruta de transduccion de senales del receptor de IgEs, lo que conduce a la desgranulacion de las celulas y a la liberacion y/o sintesis consiguiente de un hospedante de mediadores quimicos, incluyendo histamina, proteasas (por ejemplo, triptasa y quimasa), mediadores lipidicos tales como leucotrienos (por ejemplo, LTCA4), factor activador de plaquetas (PAF) y prostaglandinas (PGD2) y una serie de citocinas, incluyendo TNF-a, IL-4, IL-13, IL-5, IL-6, IL-8, GMCSF, VEGF y TGF-1. La liberacion y/o sintesis de estos mediadores desde mastocitos y/o basofilos da cuenta de las respuestas de etapa temprana y tardia inducidas por alergenos, y estan directamente ligadas a sucesos aguas abajo que conducen a un estado inflamatorio sostenido.
Los sucesos moleculares en la ruta de transduccion de senales de FcsRI que conducen a la liberacion de mediadores preformados via la desgranulacion y liberacion y/o sintesis de otros mediadores quimicos son bien conocidos y se ilustran en la FIG. 2. Haciendo referencia a la FIG. 2, el FcsRI es un receptor heterotetramero compuesto de una subunidad alfa que se une a IgE, una subunidad beta, y dos subunidades gamma (homodimero gamma). La reticulacion de IgE unido a FcsRI mediante agentes de union multivalentes (incluyendo, por ejemplo, alergenos especificos de IgE o anticuerpos anti-IgE o fragmentos) induce la rapida asociacion y activacion de la cinasa Lyn relacionada con Src. Lyn fosforila motivos de activacion del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM) en las subunidades beta y gamma intracelulares, lo que conduce al reclutamiento de Lyn adicional hacia la subunidad beta y Syk cinasa hacia el homodimero gamma. Estas cinasas asociadas a receptores, que son activadas mediante fosforilacion intra- e intermolecular, fosforilan otros componentes de la ruta, tales como la Btk cinasa, LAT, y la fosfolipasa C-gamma (PLCgamma). La PLC-gamma activada inicia rutas que conducen a la activacion de la proteina cinasa C y a la movilizacion de Ca2+, acciones las cuales son necesarias para la desgranulacion. La reticulacion de FcsRI tambien activa las tres clases principales de proteina cinasas activadas por mitogenos (MAP), es decir, ERK1/2, JNK1/2, y p38. La activacion de estas rutas es importante en la regulacion transcripcional de mediadores proinflamatorios, tales como TNF-a e IL-6, asi como el mediador lipidico leucotrieno C4 (LTC4).
Aunque no se ilustra, se cree que la cascada de senalizacion de FcyRI comparte algunos elementos comunes con la cascada de senalizacion de FcsRI. De forma importante, al igual que FcsRI, el FcyRI incluye un homodimero gamma que es fosforilado y recluta Syk, y, al igual que FcsRI, la activacion de la cascada de senalizacion de FcyRI conduce, entre otros, a la desgranulacion. Otros receptores Fc que comparten el homodimero gamma, y que pueden ser regulados mediante los compuestos de 2,4-pirimidindiamina activos incluyen, pero no se limitan a, FcaRI y FcyRIII.
La capacidad de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion para inhibir las cascadas de senalizacion de los receptores Fc se puede determinar o confirmar de forma simple en ensayos in vitro. En la seccion de Ejemplos se proporcionan ensayos adecuados para confirmar la inhibicion de la desgranulacion mediada por FcsRI. En un ensayo tipico, las celulas capaces de sufrir la desgranulacion mediada por FcsRI, tales como mastocitos o basofilos, se hacen crecer en primer lugar en presencia de IL-4, Factor de Celulas Madre (SCF), IL-6 e IgB para incrementar la expresion del FcsRI, se exponen a un compuesto de ensayo de 2,4-pirimidindiamina de la invencion y se estimulan con anticuerpos anti-IgE (o, como alternativa, un alergeno especifico de IgE). Tras la incubacion, la cantidad de un mediador quimico u otro agente quimico liberado y/o sintetizado como consecuencia de la activacion de la cascada de senalizacion de FcsRI se puede cuantificar usando tecnicas estandar, y se puede comparar con la cantidad del mediador o agente liberado a partir de celulas de control (es decir, celulas que son estimuladas pero que no se exponen a compuesto de ensayo). La concentracion de compuesto de ensayo que produce una reduccion de 50% en la cantidad del mediador o agente, medida en comparacion con celulas de control, es la IC50 del compuesto de ensayo. El origen de los mastocitos o basofilos usados en el ensayo dependera, en parte, del uso deseado de los compuestos, y sera manifiesto para los expertos en la tecnica. Por ejemplo, si los compuestos se usaran para tratar o prevenir una enfermedad particular en seres humanos, una fuente conveniente de mastocitos o basofilos es un ser humano u otro animal que constituye un modelo clinico aceptado o conocido para la enfermedad particular. De esto modo, dependiendo de la aplicacion particular, los mastocitos o basofilos pueden derivar de una amplia variedad de fuentes animales, oscilando desde, por ejemplo, mamiferos inferiores tales como ratones y ratas, a perros, ovejas y otros mamiferos empleados habitualmente en pruebas clinicas, hasta mamiferos superiores tales como monos, chimpances y simios, hasta seres humanos. Los ejemplos especificos de celulas adecuadas para llevar a cabo los ensayos in vitra incluyen, pero no se limitan a, basofilos de roedores o de seres humanos, estirpes celulares de leucemia de basofilos de rata, mastocitos primarios de raton (tales como mastocitos de raton derivados de medula osea "BMMC") y mastocitos primarios de seres humanos aislados de sangre del cordon umbilical ("CHMC") u otros tejidos tales como pulmon. En la seccion de Ejemplos (vease, par ejemp/a, Demo et al., 1999, Cytometry 36(4):340-348 y la Solicitud Serie n° 10/053.355, presentada el 8 de noviembre de 2001, en tramite junto con la presente) se proporcionan o son bien conocidos metodos para aislar y cultivar estos tipos celulares. Por supuesto, tambien se pueden usar otros tipos de inmunocitos que se desgranulan con la activacion de la cascada de senalizacion de FcsRI, incluyendo, por ejemplo, eosinofilos.
Como reconoceran los expertos, el mediador o agente cuantificado no es critico. El unico requisito es que sea un mediador o agente liberado y/o sintetizado como consecuencia de la iniciacion o activacion de la cascada de senalizacion de receptores Fc. Por ejemplo, haciendo referencia a la FIG. 1, la activacion de la cascada de senalizacion de FcsRI en mastocitos y/o basofilos conduce a numerosos sucesos aguas abajo. Por ejemplo, la activacion de la cascada de senalizacion de FcsRI conduce a la liberacion inmediata (es decir, en 1-3 min. tras la activacion del receptor) de una variedad de mediadores quimicos preformados y agentes via la desgranulacion. De este modo, en una realizacion, el mediador o agente cuantificado puede ser especifico para granulos (es decir, presente en granulos pero no en el citoplasma celular de forma general). Ejemplos de mediadores o agentes especificos de granulos que se pueden cuantificar para determinar y/o confirmar la actividad de un compuesto de 2,4-pirimidindiamina de la invencion incluyen, pero no se limitan a, enzimas especificas de granulos tales como hexosaminidasa y triptasa, y componentes especificos de granulos tales como histamina y serotonina. Los ensayos para cuantificar tales factores son bien conocidos, y en muchos casos estan comercialmente disponibles. Por ejemplo, la liberacion de triptasa y/o hexosaminidasa se puede cuantificar incubando las celulas con sustratos escindibles que fluorescen al escindirse, y cuantificando la cantidad de fluorescencia producida, usando tecnicas convencionales. Tales sustratos fluorogenos escindibles estan comercialmente disponibles. Por ejemplo, para cuantificar la cantidad de triptasa liberada, se pueden usar los sustratos fluorogenos Z-Gly-Pro-Arg-AMC (Z=benciloxicarbonilo; AMC=7-amino-4-metilcumarina; BIOMOL Research Laboratories, Inc., Plymouth Meeting, PA 19462, numero de catalago P-142) y Z-Ala-Lys-Arg-AMC (Enzyme Systems Products, una division de ICN Biomedicals, Inc., Livermore, CA 94550, numero de catalago AMC-246). El sustrato fluorogeno 4-metilumbeliferil-N-acetil-1-D-glucosaminida (Sigma, St. Louis, MO, Catalogo #69585) se puede usar para cuantificar la cantidad de hexosaminidasa liberada. La liberacion de histamina se puede cuantificar usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) comercialmente disponible, tal como el ensayo ELISA #IM2015 de histamina de Inmunotech (Beckman-Coulter, Inc.). En la seccion de Ejemplos se proporcionan metodos especificos para cuantificar la liberacion de triptasa, hexosaminidasa e histamina. Cualquiera de estos ensayos se puede usar para determinar o confirmar la actividad de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion.
Haciendo referencia nuevamente a la FIG. 1, la desgranulacion es solamente una de varias respuestas iniciadas por la cascada de senalizacion de FcsRI. Ademas, la activacion de esta ruta de senalizacion conduce a la sintesis de novo y liberacion de citocinas y quimiocinas tales como IL-4, IL-5, IL-6, TNF-a, IL-13 y MIP1-a, y la liberacion de mediadores lipidicos tales como leucotrienos (por ejemplo, LTC4), factor activador de plaquetas (PAF) y prostaglandinas. En consecuencia, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion tambien se pueden evaluar para determinar la actividad cuantificando la cantidad de uno o mas de estos mediadores liberados y/o sintetizados por celulas activadas.
A diferencia de los componentes especificos de granulos explicados anteriormente, estos mediadores de "etapa tardia" no se liberan inmediatamente tras la activacion de la cascada de senalizacion de FcsRI. En consecuencia, cuando se cuantifican estos mediadores de etapa tardia, se deberia tener cuidado para asegurarse de que el cultivo celular activado se incuba durante un tiempo suficiente para dar como resultado la sintesis (si es necesario) y liberacion del mediador que se esta cuantificando. Generalmente, PAF y los mediadores lipidicos tales como leucotrieno C4 se liberan 3-30 min. tras la activacion de FcsRI. Las citocinas y otros mediadores de etapa tardia se liberan aprox. 4-8 h tras la activacion de FcsRI. Los tiempos de incubacion adecuados para un mediador especifico seran manifiestos para los expertos en la tecnica. En la seccion de Ejemplos se proporciona una guia especifica y ensayos.
La cantidad de un mediador particular de etapa tardia liberado se puede cuantificar usando cualquier tecnica estandar. En una realizacion, la cantidad o cantidades se pueden cuantificar usando ensayos ELISA. Los kits de ensayo ELISA adecuados para cuantificar la cantidad de TNFa, IL-4, IL-5, IL-6 y/o IL-13 liberados estan disponibles en, por ejemplo, Biosource International, Inc., Camarillo, CA 93012 (vease, por ejemplo, los numeros de catalogo KHC3011, KHC0042, KHC0052, KHC0061 y KHC0132). Los kits de ensayo ELISA adecuados para cuantificar la cantidad de leucotrieno C4 (LTC4) liberado de las celulas estan disponibles en Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI 48108 (vease, por ejemplo, numero de catalago 520211).
Tipicamente, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina activos de la invencion presentaran IC50 con respecto a la desgranulacion mediada por FcsRI y/o la liberacion o sintesis de mediadores de alrededor de 20 !M o menor, segun se mide en un ensayo in vitra, tal como uno de los ensayos in vitra descritos anteriormente o en la seccion de Ejemplos. Por supuesto, los expertos apreciaran que compuestos que presentan IC50 menores, por ejemplo del orden de 10 !M, 1 !M, 100 nM, 10 nM, 1 nM, o incluso menores, son particularmente utiles.
Los expertos tambien apreciaran que los diversos mediadores explicados anteriormente pueden inducir diferentes efectos adversos o mostrar diferentes potencias con respecto al mismo efecto adverso. Por ejemplo, el mediador lipidico LTC4 es un potente vasoconstrictor -es aproximadamente 1000 veces mas potente induciendo la vasoconstriccion que la histamina. Como otro ejemplo, ademas de mediar reacciones de hipersensibilidad atopica o de tipo I, las citocinas tambien pueden provocar remodelacion tisular y proliferacion celular. De este modo, aunque los compuestos que inhiben la liberacion y/o sintesis de uno cualquiera de los mediadores quimicos explicados previamente son utiles, los expertos apreciaran que los compuestos que inhiben la liberacion y/o la sintesis de una pluralidad de, o de incluso todos, los mediadores previamente descritos encuentran uso particular, ya que tales compuestos son utiles para mejorar
o evitar completamente una pluralidad de, o incluso todos, los efectos adversos inducidos por los mediadores particulares. Por ejemplo, los compuestos que inhiben la liberacion de los tres tipos de mediadores -especificos de granulos, lipidicos y de citocinas- son utiles para tratar o prevenir reacciones de hipersensibilidad de tipo I inmediata, asi como los sintomas cronicos asociados con ellas.
Los compuestos de la invencion capaces de inhibir la liberacion de mas de un tipo de mediador (par ejemp/a, especifico de granulos o de etapa tardia) se pueden identificar determinando la IC50 con respecto a un mediador representante de cada clase usando los diversos ensayos in vitra descritos anteriormente (u otros ensayos in vitra equivalentes). Los compuestos de la invencion que son capaces de inhibir la liberacion de mas de un tipo de mediador mostraran tipicamente una IC50 para cada tipo de mediador ensayado de menos de alrededor de 20 !M. Por ejemplo, un compuesto que muestra una IC50 de 1 !M con respecto a la liberacion de histamina (IC50histamina) y una IC50 de 1 nM con respecto a la sintesis y/o liberacion de LTC4 (IC50LTC4) inhibe la liberacion de mediadores tanto inmediatos (especificos
triptasa de 10 !M,
de granulos) como de etapa tardia. Como otro ejemplo especifico, un compuesto que muestra una IC50una IC50LTC4 de 1 !M y una IC50IL-4 de 1 !M inhibe la liberacion de mediadores inmediatos (especificos de granulos), lipidicos y de citocinas. Aunque los ejemplos especificos anteriores utilizan las IC50 de un mediador representante de cada clase, los expertos apreciaran que se pueden obtener las IC50 de una pluralidad, o incluso de todos, los mediadores que comprenden una o mas de las clases. La cantidad o cantidades e identidad o identidades de mediadores para los cuales se deberian de averiguar los datos de IC50 para un compuesto y aplicacion particulares seran manifiestas para los expertos en la tecnica.
Se pueden utilizar ensayos similares para confirmar la inhibicion de cascadas de transduccion de senales iniciadas por otros receptores Fc, tales como la senalizacion de FcaRI, FcyRI y/o FcyRIII, con modificacion habitual. Por ejemplo, la capacidad de los compuestos para inhibir la transduccion de senales de FcyRI se puede confirmar en ensayos similares a los descritos anteriormente, con la excepcion de que la cascada de senalizacion de FcyRI se activa, por ejemplo, incubando las celulas con IgG y un alergeno o anticuerpo especifico de IgG, en lugar de IgE y un alergeno o anticuerpo especifico de IgE. Los tipos celulares adecuados, agentes activantes y agentes para cuantificar y confirmar la inhibicion de otros receptores Fc, tales como receptores Fc que comprenden un homodimero gamma, seran manifiestos para los expertos en la tecnica.
Una clase particularmente util de compuestos incluye aquellos compuestos de 2,4-pirimidindiamina que inhiben la liberacion de mediadores inmediatos especificos de granulos y mediadores de etapa tardia con IC50s aproximadamente equivalentes. Por aproximadamente equivalente se quiere decir que las IC50s para cada tipo de mediador estan dentro de alrededor de un intervalo de 10 veces uno del otro. Otra clase particularmente util de compuestos incluye aquellos compuestos de 2,4-pirimidindiamina que inhiben la liberacion de mediadores inmediatos especificos de granulos, mediadores lipidicos y mediadores de citocinas con IC50s aproximadamente equivalentes. En una realizacion especifica, tales compuestos inhiben la liberacion de los siguientes mediadores con IC50s aproximadamente equivalentes: histamina, triptasa, hexosaminidasa, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNFa y LTC4. Tales compuestos son particularmente utiles para, entre otros, mejorar o evitar completamente las respuestas tanto de etapa temprana como de etapa tardia asociadas con reacciones de hipersensibilidad atopica o inmediata de tipo I.
Idealmente, la capacidad para inhibir la liberacion de todos los tipos deseados de mediadores residira en un unico compuesto. Sin embargo, tambien se pueden identificar mezclas de compuestos que logren el mismo resultado. Por ejemplo, se puede usar un primer compuesto que inhibe la liberacion de mediadores especificos de granulos en combinacion con un segundo compuesto que inhibe la liberacion y/o sintesis de mediadores de citocinas.
Ademas de las rutas de desgranulacion de FcsRI o FcyRI explicadas anteriormente, la desgranulacion de mastocitos y/o basofilos puede ser inducida por otros agentes. Por ejemplo, la ionomicina, un ionoforo del calcio que evita la maquinaria de transduccion de senales de FcsRI o FcyRI temprana de la celula, induce directamente un flujo de calcio que dispara la desgranulacion. Haciendo referencia nuevamente a la FIG. 2, PLCy activada inicia rutas que conducen, entre otros, a la movilizacion del ion calcio y la desgranulacion subsiguiente. Como se ilustra, esta movilizacion de Ca2+ es disparada tardiamente en la ruta de transduccion de senales de FcsRI. Como se menciono anteriormente, y como se ilustra en la FIG. 3, la ionomicina induce directamente la movilizacion de Ca2+ y un flujo de Ca2+ que conduce a la desgranulacion. Otros ionoforos que inducen la desgranulacion de esta manera incluyen A23187. La capacidad de los ionoforos inductores de la granulacion, tales como la ionomicina, para evitar las etapas tempranas de las cascadas de senalizacion de FcsRI y/o FcyRI se puede usar como una contraidentificacion para identificar compuestos activos de la invencion que ejercen especificamente su actividad inhibidora de la desgranulacion bloqueando o inhibiendo las cascadas de senalizacion de FcsRI o FcyRI tempranas, como se explica anteriormente. Los compuestos que inhiben especificamente tal desgranulacion temprana mediada por FcsRI o FcyRI inhiben no solo la desgranulacion y la subsiguiente liberacion rapida de histamina, triptasa y otros contenidos de granulos, sino tambien inhiben las rutas de activacion proinflamatorias que provocan la liberacion de TNFa, IL-4, IL-13 y los mediadores lipidicos tales como LTC4. De este modo, los compuestos que inhiben especificamente tal desgranulacion temprana mediada por FcsRI y/o FcyRI bloquean o inhiben no solo reacciones agudas de hipersensibilidad atopica o de tipo I, sino tambien las respuestas tardias que implican multiples mediadores inflamatorios.
Los compuestos de la invencion que inhiben especificamente la desgranulacion temprana mediada por FcsRI y/o FcyRI son aquellos compuestos que inhiben la desgranulacion mediada por FcsRI y/o FcyRI (por ejemplo, tienen una IC50 menor que alrededor de 20 !M con respecto a la liberacion de un mediador o componente especifico de granulos segun se mide en un ensayo in vitra con celulas estimuladas con un agente de union a IgE o IgG) pero que no inhiben apreciablemente la desgranulacion inducida por ionoforos. En una realizacion, se considera que los compuestos no inhiben apreciablemente la desgranulacion inducida por ionoforos si muestran una IC50 de la desgranulacion inducida por ionoforos mayor que alrededor de 20 !M, segun se mide en un ensayo in vitra. Por supuesto, los compuestos activos que muestran IC50s incluso mayores de la desgranulacion inducida por ionoforos, o que no inhiben en absoluto la desgranulacion inducida por ionoforos, son particularmente utiles. En otra realizacion, se considera que los compuestos no inhiben apreciablemente la desgranulacion inducida por ionoforos si muestran una diferencia mayor de 10 veces en sus IC50s de la desgranulacion mediada por FcsRI y/o FcyRI y la desgranulacion inducida por ionoforos, segun se mide en un ensayo in vitra. Los ensayos adecuados para determinar la IC50 de la desgranulacion inducida por ionoforos incluyen cualquiera de los ensayos de desgranulacion descritos previamente, con la modificacion de que las celulas son estimuladas o activadas con un ionoforo del calcio inductor de la desgranulacion, tal como ionomicina o A23187 (A.G. Scientific, San Diego, CA) en lugar de anticuerpos anti-IgE o un alergeno especifico de IgE. En la seccion de Ejemplos se proporcionan ensayos especificos para evaluar la capacidad de un compuesto de 2,4-pirimidindiamina particular de la invencion para inhibir la desgranulacion inducida por ionoforos.
Como reconoceran los expertos, los compuestos que muestran un grado elevado de selectividad por la desgranulacion mediada por FcsRI encuentran uso particular, puesto que tales compuestos se dirigen selectivamente hacia la cascada de FcsRI y no interfieren con otros mecanismos de la desgranulacion. De forma similar, los compuestos que muestran un grado elevado de selectividad por la desgranulacion mediada por FcyRI encuentran uso particular, puesto que tales compuestos seleccionan selectivamente la cascada de FcyRI y no interfieren con otros mecanismos de la desgranulacion. Los compuestos que muestran un grado elevado de selectividad son generalmente 10 veces o mas selectivos para la desgranulacion mediada por FcsRI o FcyRI con respecto a la desgranulacion inducida por ionoforos, tal como la desgranulacion inducida por ionomicina.
Los datos bioquimicos y otros datos confirman que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina descritos aqui son potentes inhibidores de la actividad de Syk cinasa. Por ejemplo, en experimentos con una Syk cinasa aislada, de veinticuatro compuestos de 2,4-pirimidindiamina ensayados, todos menos dos inhibieron la fosforilacion, catalizada por Syk cinasa, de un sustrato peptidico, con IC50s en el intervalo submicromolar. Los compuestos restantes inhibieron la fosforilacion en el intervalo micromolar. Ademas, de dieciseis compuestos ensayados en un ensayo in vitra con mastocitos, todos inhibieron la fosforilacion de sustratos de Syk cinasa (par ejemp/a, PLC-gammaI, LAT) y proteinas aguas abajo de Syk cinasa (par ejemp/a, JNK, p38, Erk1/2 y PKB, cuando se ensayaron), pero no proteinas aguas arriba de Syk cinasa en la cascada (par ejemp/a, Lyn). La fosforilacion de los sustratos de Lyn no se inhibio por los compuestos de 2,4pirimidindiamina ensayados. Ademas, para los siguientes compuestos, se observo una elevada correlacion entre su inhibicion de la actividad de Syk cinasa en ensayos bioquimicos (IC50 en el intervalo de 3 a 1850 nM) y su inhibicion de la desgranulacion mediada por FcsRI en mastocitos (IC50 en el intervalo de 30 a 1650 nM): R940347.
En consecuencia, la actividad de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion tambien se puede confirmar en ensayos bioquimicos o celulares de la actividad de Syk cinasa. Haciendo referencia nuevamente a la FIG.2, en la cascada de senalizacion de FcsRI en mastocitos y/o basofilos, Syk cinasa fosforila LAT y PLC-gammaI, lo que conduce, entre otros, a la desgranulacion. Cualquiera de estas actividades se puede usar para confirmar la actividad de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion. En una realizacion, la actividad se confirma poniendo en contacto una Syk cinasa aislada, o un fragmento activo de la misma, con un compuesto de 2,4 pirimidindiamina en presencia de un sustrato de Syk cinasa (par ejemp/a, un peptido sintetico o una proteina que se sabe que es fosforilada por Syk en una cascada de senalizacion) y evaluando si la Syk cinasa fosforilo el sustrato. Como alternativa, el ensayo se puede llevar a cabo con celulas que expresan una Syk cinasa. Las celulas pueden expresar endogenamente la Syk cinasa, o se pueden manipular mediante ingenieria genetica para que expresen una Syk cinasa recombinante. Las celulas pueden opcionalmente expresar tambien el sustrato de Syk cinasa. Las celulas adecuadas para llevar a cabo tales ensayos de confirmacion, asi como los metodos de manipulacion mediante ingenieria genetica de celulas adecuadas, seran manifiestos para los expertos en la tecnica. En la seccion de Ejemplos se proporcionan ejemplos especificos de ensayos bioquimicos y celulares adecuados para confirmar la actividad de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina.
Generalmente, los compuestos que son inhibidores de Syk cinasa mostraran una IC50 con respecto a una actividad de Syk cinasa, tal como la capacidad de Syk cinasa para fosforilar un sustrato sintetico o endogeno, en un ensayo in vitra o celular en el intervalo de alrededor de 20 !M o menos. Los expertos apreciaran que los compuestos que muestran IC50 menores, tales como en el intervalo de 10 !M, 1 !M, 100 nM, 10 nM, 1 nM, o incluso menores, son particularmente utiles.
6.4 Usos y Composiciones
Como se ha explicado previamente, los compuestos activos de la invencion inhiben las cascadas de senalizacion de los receptores Fc, especialmente aquellos receptores Fc que incluyen un homodimero gamma, tales como las cascadas de senalizacion de FcsRI y/o FcyRI, que conducen, entre otros, a la liberacion y/o sintesis de mediadores quimicos desde las celulas, ya sea via desgranulacion u otros procesos. Como tambien se ha explicado, los compuestos activos tambien son inhibidores potentes de Syk cinasa. Como una consecuencia de estas actividades, los compuestos activos de la invencion pueden ser para uso en una variedad de contextos in vitra, in viva y ex viva para regular o inhibir Syk cinasa, en cuyas cascadas de senalizacion la Syk cinasa desempena un papel, cascadas de senalizacion del receptor de Fc y las respuestas biologicas efectuadas por tales cascadas de senalizacion. Por ejemplo, en una realizacion, los compuestos pueden ser para uso en la inhibicion de Syk cinasa, ya sea in vitra o in viva, en virtualmente cualquier tipo celular que exprese Syk cinasa. Tambien pueden ser para uso en la regulacion de las cascadas de transduccion de senales, en las que Syk cinasa desempena un papel. Tales cascadas de transduccion de senales dependientes de Syk incluyen, pero no se limitan a, las cascadas de transduccion de senales de FcsRI, FcyRI, FcyRIII, BCR e integrina. Los compuestos pueden ser tambien para uso in vitra o in viva para regular, y en particular inhibir, respuestas celulares o biologicas efectuadas por tales cascadas de transduccion de senales dependientes de Syk. Tales respuestas celulares
o biologicas incluyen, pero no se limitan a, estallido respiratorio, adhesion celular, desgranulacion celular, diseminacion celular, migracion celular, agregacion celular, fagocitosis, sintesis y liberacion de citocinas, maduracion celular y flujo de Ca2+. De forma importante, los compuestos pueden ser para uso en la inhibicion de Syk in viva como un enfoque terapeutico para el tratamiento o prevencion de enfermedades mediadas, ya sea totalmente o en parte, por una actividad de Syk cinasa. Los ejemplos no limitantes de enfermedades mediadas por Syk cinasa que se pueden tratar o prevenir con los compuestos son aquellas explicadas con mas detalle a continuacion.
En otra realizacion, los compuestos activos pueden ser para uso en la regulacion o inhibicion de las cascadas de senalizacion del receptor de Fc y/o la desgranulacion mediada por FcsRI y/o FcyRI, como un enfoque terapeutico para el tratamiento o prevencion de enfermedades caracterizadas por, provocadas por y/o asociadas con la liberacion o sintesis de mediadores quimicos de tales cascadas de senalizacion del receptor de Fc o de tal desgranulacion. Tales tratamientos se pueden administrar a animales en contextos veterinarios, o a seres humanos. Las enfermedades que se caracterizan por, que estan provocadas por o que estan asociadas con tal liberacion, sintesis o desgranulacion de mediadores, y que por lo tanto se pueden tratar o prevenir con los compuestos activos, incluyen, a titulo de ejemplo y no de limitacion, reacciones alergicas o de hipersensibilidad anafilactica o atopicas, alergias (par ejemp/a, conjuntivitis alergica, rinitis alergica, asma atopica, dermatitis atopica y alergias a alimentos), cicatrizacion de bajo grado (par ejemp/a, de esclerodermia, fibrosis incrementada, queloides, cicatrices post-quirurgicas, fibrosis pulmonar, espasmos vasculares, migrana, lesion por reperfusion y post-infarto de miocardio), enfermedades asociadas con destruccion de tejido (par ejemp/a, COPD, cardiobronquitis y post-infarto de miocardio), enfermedades asociadas con inflamacion tisular (par ejemp/a, sindrome irritable del intestino, colon espastico y enfermedad inflamatoria del intestino), inflamacion y cicatrizacion.
Ademas de la miriada de enfermedades explicadas anteriormente, los datos empiricos celulares y de animales confirman que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina descritos aqui son tambien utiles para el tratamiento o prevencion de enfermedades autoinmunitarias, asi como los diversos sintomas asociados con tales enfermedades. Los tipos de enfermedades autoinmunitarias para las que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina pueden ser para uso en el tratamiento o prevencion incluyen generalmente aquellos trastornos que implican lesion tisular que se produce como resultado de una respuesta humoral y/o mediada por celulas frente a inmunogenos o antigenos de origen endogeno y/o exogeno. Tales enfermedades se denominan frecuentemente como enfermedades que implican reacciones de hipersensibilidad no anafilactica (es decir, tipo II, tipo III y/o tipo IV).
Como se ha explicado previamente, las reacciones de hipersensibilidad de tipo I generalmente resultan de la liberacion de sustancias farmacologicamente activas, tales como histamina, a partir de mastocitos y/o basofilos tras el contacto con un antigeno exogeno especifico. Como se ha mencionado anteriormente, tales reacciones de tipo I desempenan un papel en numerosas enfermedades, incluyendo asma alergica, rinitis alergica, etc.
Las reacciones de hipersensibilidad de tipo II (tambien denominadas como reacciones de hipersensibilidad citotoxica, citolitica dependiente del complemento o estimulante de celulas) se producen cuando las inmunoglobulinas reaccionan con componentes antigenicos de celulas o tejido, o con un antigeno o hapteno que se ha acoplado intimamente a las celulas o tejido. Las enfermedades que estan asociadas habitualmente con reacciones de hipersensibilidad de tipo II incluyen, pero no se limitan a, anemia hemolitica autoinmunitaria, eritroblastosis fetal y enfermedad de Goodpasture.
Las reacciones de hipersensibilidad de tipo III (tambien denominadas como reacciones de hipersensibilidad a complejos toxicos, a complejos solubles, o a complejos inmunitarios) resultan de la deposicion de complejos circulantes solubles de antigeno-inmunoglobulina en vasos o en tejidos, con reacciones inflamatorias agudas concomitantes en el sitio de la deposicion del complejo inmunitario. Los ejemplos no limitantes de enfermedades de reaccion de tipo III prototipicas incluyen la reaccion de Arthus, artritis reumatoide, enfermedad del suero, lupus eritematoso sistemico, ciertos tipos de glomerulonefritis, esclerosis multiple, y penfigoide ampolloso.
Las reacciones de hipersensibilidad de tipo IV (frecuentemente denominadas reacciones de hipersensibilidad celular, mediada por celulas, retrasada, o de tipo tuberculina) son provocadas por linfocitos T sensibilizados que resultan del contacto con un antigeno especifico. Los ejemplos no limitantes de enfermedades citadas que impliquen reacciones de tipo IV son dermatitis de contacto y rechazo de aloinjerto.
Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion pueden ser para uso en el tratamiento o prevencion de enfermedades autoinmunitarias asociadas con cualquiera de las reacciones de hipersensiblidad no anafilacticas. En particular, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion pueden ser para uso en el tratamiento o prevencion de aquellas enfermedades autoinmunitarias caracterizadas frecuentemente como trastornos autoinmunitarios de un solo organo o de un solo tipo celular, incluyendo, pero sin limitarse a: tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolitica autoinmunitaria, gastritis atrofica autoinmunitaria de anemia perniciosa, encefalomielitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, enfermedad de Goodpasture, trombocitopenia autoinmunitaria, oftalmia simpatica, miastenia grave, enfermedad de Graves, cirrosis biliar primaria, hepatitis agresiva cronica, colitis ulcerosa y glomerulopatia membranosa, asi como aquellas enfermedades autoinmunitarias caracterizadas frecuentemente por implicar un trastorno autoinmunitario sistemico, que incluyen, pero no se limitan a, lupus eritematoso sistemico (SLE), artritis reumatoide, sindrome de Sjogren, sindrome de Reiter, polimiositis-dermatomiositis, esclerosis sistemica, panarteritis nudosa, esclerosis multiple y penfigoide ampolloso.
Los expertos en la tecnica apreciaran que muchas de las enfermedades autoinmunitarias enumeradas anteriormente estan asociadas con sintomas graves, cuya mejora proporciona un beneficio terapeutico significativo incluso en casos en los que la enfermedad autoinmunitaria subyacente no se puede mejorar. Muchos de estos sintomas, asi como sus estados morbidos subyacentes, resultan como consecuencia de la activacion de la cascada de senalizacion de FcyR en monocitos. Puesto que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina descritos aqui son inhibidores potentes de tal senalizacion de FcyR en monocitos y otras celulas, pueden ser para uso en el tratamiento y/o prevencion de una miriada de sintomas adversos asociados con las enfermedades autoinmunitarias enumeradas anteriormente.
Como un ejemplo especifico, la artritis reumatoide (RA) tipicamente da como resultado hinchamiento, dolor, perdida de movimiento y dolor por palpacion de las articulaciones diana por todo el cuerpo. La RA se caracteriza por un sinovio cronicamente inflamado que esta densamente poblado con linfocitos. La membrana sinovial, que es tipicamente una gruesa capa celular, se hace enormemente celular y toma una forma similar a tejido linfoide, incluyendo celulas dendriticas, celulas T, B y NK, macrofagos y racimos de celulas plasmaticas. Este proceso, asi como una pletora de mecanismos inmunopatologicos que incluyen la formacion de complejos de antigeno-inmunoglobulina, eventualmente da como resultado la destruccion de la integridad de la articulacion, dando como resultado deformidad, perdida permanente de funcion y/o erosion osea en o cerca de la articulacion. Los compuestos de la invencion pueden ser para uso en el tratamiento o mejora de uno cualquiera, varios o todos de estos sintomas de RA. De este modo, en el contexto de RA, se proporciona beneficio terapeutico (discutido mas generalmente, mas abajo) cuando se logra una reduccion o mejora de cualquiera de los sintomas asociados habitualmente con RA, independientemente de si el tratamiento da como resultado un tratamiento concomitante de la RA subyacente y/o una reduccion en la cantidad de factor reumatoide circulante ("RF").
Como otro ejemplo especifico, el lupus eritematoso sistemico ("SLE") esta asociado tipicamente con sintomas tales como fiebre, dolor de la articulacion (artralgias), artritis, y serositis (pleuresia o pericarditis). En el contexto de SLE, se proporciona beneficio terapeutico cuando se logra una reduccion o mejora de cualquiera de los sintomas asociados normalmente con SLE, independientemente de si el tratamiento da como resultado un tratamiento concomitante de la SLE subyacente.
Como otro ejemplo especifico, la esclerosis multiple ("MS") deja lisiado al paciente perturbando la agudeza visual; estimulando la doble vision; perturbando las funciones motoras que afectan al andar y al uso de las manos; produciendo incontinencia del intestino y de la vejiga; espasticidad; y carencias sensoriales (tacto, dolor y sensibilidad a la temperatura). En el contexto de MS, el beneficio terapeutico se proporciona cuando se logra una mejora o una reduccion en la progresion de uno cualquiera o mas de los efectos incapacitantes asociados habitualmente con MS, independientemente de si el tratamiento da como resultado un tratamiento concomitante de la MS subyacente.
Cuando se usan en el tratamiento o prevencion de tales enfermedades, los compuestos activos pueden ser para la administracion individualmente, como mezclas de uno o mas compuestos activos, o en mezcla o combinacion con otros agentes utiles para tratar tales enfermedades y/o los sintomas asociados con tales enfermedades. Los compuestos activos tambien pueden ser para administracion en mezcla o en combinacion con agentes utiles para tratar otros trastornos o males, tales como esteroides, estabilizantes de membranas, inhibidores de 5LO, inhibidores de la sintesis y receptores de leucotrines, inhibidores de intercambio del isotipo IgE o de la sintesis de IgE, intercambio de isotipo IgG o sintesis de IgG, agonistas p, inhibidores de triptasa, aspirina, inhibidores de COX, metotrexat, farmacos anti-TNF, retuxina, inhibidores de PD4, inhibidores de p38, inhibidores de PDE4, y antihistaminas, por nombrar unos pocos. Los compuestos activos pueden ser para administracion per se en forma de profarmacos o como composiciones farmaceuticas, que comprenden un compuesto activo o profarmaco.
Las composiciones farmaceuticas que comprenden los compuestos activos de la invencion (o sus profarmacos) se pueden fabricar por medio de procesos convencionales de mezclamiento, disolucion, granulacion, levigacion obteniendo una gragea, emulsionamiento, encapsulamiento, atrapamiento o liofilizacion. Las composiciones se pueden formular de manera convencional usando uno o mas vehiculos, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiologicamente aceptables que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se puedan usar farmaceuticamente.
El compuesto activo o profarmaco se puede formular en la composicion farmaceutica per se, o en forma de un hidrato, solvato, N-oxido o sal farmaceuticamente aceptable, como se describe previamente. Tipicamente, tales sales son mas solubles en disoluciones acuosas que los acidos y bases libres correspondientes, pero tambien se pueden formar sales que tienen una solubilidad menor que los acidos y bases libres correspondientes.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden tomar una forma adecuada para virtualmente cualquier modo de administracion, incluyendo, por ejemplo, topica, ocular, oral, bucal, sistemica, nasal, inyeccion, transdermica, rectal, vaginal, etc., o una forma adecuada para la administracion mediante inhalacion o insuflamiento.
Para administracion topica, el (o los) compuesto(s) activo(s) o profarmaco(s) se puede(n) formular como disoluciones, geles, unguentos, cremas, suspensiones, etc., como es bien conocido en la tecnica.
Las formulaciones sistemicas incluyen aquellas disenadas para la administracion mediante inyeccion, par ejemp/a inyeccion subcutanea, intravenosa, intramuscular, intratecal o intraperitoneal, asi como aquellas disenadas para la administracion transdermica, transmucosal, oral o pulmonar.
Las preparaciones inyectables utiles incluyen suspensiones, disoluciones o emulsiones esteriles del compuesto o compuestos activos en vehiculos acuosos u oleosos. Las composiciones tambien pueden contener agentes de formulacion, tales como un agente de suspension, un agente estabilizante y/o un agente dispersante. Las formulaciones para inyeccion se pueden presentar en forma farmaceutica unitaria, par ejemp/a en ampollas o en recipientes de multiples dosis, y pueden contener conservantes anadidos.
Como alternativa, la formulacion inyectable se puede proporcionar en forma de polvo para la reconstitucion con un vehiculo adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, agua esteril libre de pirogenos, tampon, disolucion de dextrosa, etc., antes del uso. Para este fin, el compuesto o compuestos activos se pueden secar mediante cualquier tecnica conocida en la tecnica, tal como liofilizacion, y se pueden reconstituirantes del uso.
Para la administracion transmucosal, en la formulacion se usan penetrantes apropiados para la barrera a permear. Tales penetrantes son conocidos en la tecnica.
Para la administracion oral, las composiciones farmaceuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, tabletas, comprimidos o capsulas preparados por medios convencionales con excipientes farmaceuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidon de maiz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina, o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o silice); agentes disgregantes (por ejemplo, almidon de patata o glicolato de almidon sodico); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Los comprimidos se pueden revestir mediante metodos bien conocidos en la tecnica con, por ejemplo, azucares, peliculas o revestimientos entericos.
Las preparaciones liquidas para administracion oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, elixires, disoluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto seco para reconstitucion con agua u otro vehiculo adecuado antes del uso. Tales preparaciones liquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmaceuticamente aceptables tales como agentes de suspension (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arabiga); vehiculos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, esteres oleosos, alcohol etilico, cremophoreTM o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo, o acido sorbico). Las preparaciones tambien pueden contener tampones, sales, conservantes, saborizantes, colorantes y agentes edulcorantes, segun sea apropiado.
Las preparaciones para administracion oral se pueden formular de forma adecuada para dar una liberacion controlada del compuesto activo o profarmaco, como es bien conocido.
Para la administracion bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o tabletas formulados de manera convencional.
Para las rutas de administracion rectal y vaginal, el compuesto o compuestos activos se pueden formular como disoluciones (para enemas de retencion), supositorios o unguentos que contienen bases convencionales para supositorios, tales como manteca de cacao u otros gliceridos.
Para la administracion nasal o la administracion mediante inhalacion o insuflamiento, el (o los) compuesto(s) activo(s) o profarmaco(s) se puede(n) suministrar convenientemente en forma de una pulverizacion en aerosol a partir de envases a presion o un nebulizador con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, fluorocarbonos, dioxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol a presion, la dosis unitaria se puede determinar proporcionando una valvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular capsulas y cartuchos para uso en un inhalador o insuflador (por ejemplo, capsulas y cartuchos compuestos de gelatina) que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidon.
Un ejemplo especifico de una formulacion de suspension acuosa adecuada para la administracion nasal que usa dispositivos de pulverizacion nasal comercialmente disponibles incluye los siguientes ingredientes: compuesto activo o profarmaco (0,5-20 mg/ml); cloruro de benzalconio (0,1-0,2 mg/ml); Polisorbato 80 (TWEEN® 80; 0,5-5 mg/ml); carboximetilcelulosa sodica o celulosa microcristalina (1-15 mg/ml); feniletanol (1-4 mg/ml); y dextrosa (20-50 mg/ml). El pH de la suspension final se puede ajustar a un intervalo de alrededor de pH 5 a pH 7, siendo tipico un pH de alrededor de pH 5,5.
Otro ejemplo especifico de una suspension acuosa adecuada para la administracion de los compuestos via inhalacion contiene 1-20 mg/ml de Compuesto o profarmaco, 0,1-1% (v/v) de Polisorbato 80 (TWEEN® 80), 50 mM de citrato y/o 0,9% de cloruro de sodio.
Para la administracion ocular, el (o los) compuesto(s) activo(s) o profarmaco(s) se puede(n) formular como una disolucion, emulsion, suspension, etc., adecuada para la administracion al ojo. En la tecnica se conoce una variedad de vehiculos adecuados para administrar compuestos al ojo. Los ejemplos no limitantes especificos se describen en la patente U.S. n° 6.261.547; la patente U.S. n° 6.197.934; la patente U.S. n° 6.056.950; la patente U.S. n° 5.800.807; la patente U.S. n° 5.776.445; la patente U.S. n° 5.698.219; la patente U.S. n° 5.521.222; la patente U.S. n° 5.403.841; la patente U.S. n° 5.077.033; la patente U.S. n° 4.882.150; y la patente U.S. n° 4.738.851.
Para el suministro prolongado, el (o los) compuesto(s) activo(s) o profarmaco(s) se puede(n) formular como una preparacion de deposito para la administracion mediante implante o inyeccion intramuscular. El ingrediente activo se puede formular con materiales polimericos o hidrofobos adecuados (por ejemplo, como una emulsion en un aceite aceptable) o resinas de intercambio ionico, o como derivados apenas solubles, por ejemplo como una sal apenas soluble. Como alternativa, se pueden usar sistemas de suministro transdermico fabricados como un disco o parche adhesivo que libera lentamente el (o los) compuesto(s) activo(s) para absorcion percutanea. Para esto, se pueden usar potenciadores de la permeacion, para facilitar la penetracion transdermica del (o de los) compuesto(s) activo(s). Los parches transdermicos adecuados se describen, por ejemplo, en la patente U.S. n° 5.407.713; la patente U.S. n° 5.352.456; la patente U.S. n° 5.332.213; la patente U.S. n° 5.336.168; la patente U.S. n° 5.290.561; la patente U.S. n° 5.254.346; la patente U.S. n° 5.164.189; la patente U.S. n° 5.163.899; la patente U.S. n° 5.088.977; la patente U.S. n° 5.087.240; la patente U.S. n° 5.008.110; y la patente U.S. n° 4.921.475.
Como alternativa, se pueden emplear otros sistemas de suministro farmaceutico. Los liposomas y emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehiculos de suministro que se pueden usar para suministrar compuesto(s) activo(s) o profarmaco(s). Tambien se pueden emplear ciertos disolventes organicos, tales como dimetilsulfoxido (DMSO), aunque habitualmente al coste de una mayor toxicidad.
Si se desea, las composiciones farmaceuticas se pueden presentar en un envase o un dispositivo dispensador que puede contener una o mas formas farmaceuticas unitarias que contienen el (o los) compuesto(s) activo(s). El envase puede comprender, por ejemplo, una hoja de papel metalico o plastica, tal como un envase de blister. El envase o dispositivo dispensador puede estar acompanado por instrucciones para la administracion.
6.5 Dosis Eficaces
El (o los) compuesto(s) activo(s) de la invencion, o sus composiciones, generalmente se usaran en una cantidad eficaz para lograr el resultado pretendido, por ejemplo en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la enfermedad particular que se este tratando. El compuesto o compuestos pueden ser para administracion terapeuticamente para lograr beneficio terapeutico, o profilacticamente para lograr beneficio profilactico. Por beneficio terapeutico se quiere decir la erradicacion o mejora del trastorno subyacente que se esta tratando, y/o la erradicacion o mejora de uno o mas de los sintomas asociados con el trastorno subyacente, de forma que el paciente informa de una mejora de la sensacion o estado, a pesar de que el paciente todavia puede estar padeciendo el trastorno subyacente. Por ejemplo, la administracion de un compuesto a un paciente que sufre una alergia proporciona beneficio terapeutico no solo cuando se erradica o se mejora la respuesta alergica subyacente, sino tambien cuando el paciente informa de una disminucion de la gravedad o duracion de los sintomas asociados con la alergia tras la exposicion al alergeno. Como otro ejemplo, el beneficio terapeutico en el contexto de asma incluye una mejora de la respiracion tras el comienzo de un ataque asmatico, o una reduccion en la frecuencia o gravedad de los episodios asmaticos. El beneficio terapeutico tambien incluye generalmente detener o ralentizar la progresion de la enfermedad, independientemente de si se obtiene una mejora.
Para administracion profilactica, el compuesto puede ser para la administracion a un paciente con riesgo de desarrollar una de las enfermedades previamente descritas. Por ejemplo, si se desconoce si un paciente es alergico a un farmaco particular, el compuesto puede ser para la administracion antes de la administracion del farmaco, para evitar o mejorar una respuesta alergica frente al farmaco. Como alternativa, se puede aplicar la administracion profilactica, para evitar el comienzo de sintomas en un paciente diagnosticado con el trastorno subyacente. Por ejemplo, un compuesto puede ser para la administracion a una persona que sufre alergia, antes de la exposicion esperada al alergeno. Los compuestos tambien pueden ser para la administracion de forma profilactica a individuos sanos que estan expuestos repetidamente a agentes conocidos por una de las enfermedades descritas anteriormente, para evitar el comienzo del trastorno. Por ejemplo, un compuesto puede ser para la administracion a un individuo sano que esta expuesto repetidamente a un alergeno que se sabe que induce alergias, tal como latex, en un esfuerzo por prevenir que el individuo desarrolle una alergia. Como alternativa, un compuesto puede ser para la administracion a un paciente que sufre asma antes de tomar parte en actividades que disparan los ataques de asma, para reducir la gravedad de, o en general evitar, un episodio asmatico.
La cantidad de compuesto para administracion dependera de una variedad de factores, incluyendo, por ejemplo, la indicacion particular que se este tratando, el modo de administracion, si el beneficio deseado es profilactico o terapeutico, la gravedad de la indicacion que se esta tratando, y la edad y peso del paciente, la biodisponibilidad del compuesto activo particular, etc. La determinacion de una dosis eficaz esta dentro de las capacidades de los expertos en la tecnica.
Las dosis eficaces se pueden estimar inicialmente a partir de ensayos in vitra. Por ejemplo, se podria formular una dosis inicial para uso en animales para lograr una concentracion circulante en sangre o en suero del compuesto activo que sea o que este por encima de una IC50 del compuesto particular segun se mide en un ensayo in vitra, tal como los ensayos de CHMC o BMMC in vitra y otros ensayos in vitra descritos en la seccion de Ejemplos. El calculo de las dosis para lograr tales concentraciones sanguineas o sericas circulantes, teniendo en cuenta la biodisponibilidad del compuesto particular, esta dentro de las capacidades del experto. Para una guia, refierase el lector a Fingl y Woodbury, "Principios Generales" en: Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Capitulo 1, p. 1-46, ultima edicion, Pergamon Press, y las referencias citadas alli.
Las dosis iniciales tambien se pueden estimar a partir de datos in viva, tales como modelos animales. Los modelos animales utiles para ensayar la eficacia de los compuestos para tratar o prevenir las diversas enfermedades descritas anteriormente son bien conocidos en la tecnica. Los modelos animales adecuados de reacciones de hipersensibilidad o alergicas se describen en Foster, 1995, Allergy 50(21 Supl):6-9, discusion 34-38 y Tumas et al., 2001, J. Allergy Clin. Immunol. 107(6):1025-1033. Los modelos animales adecuados de rinitis alergica se describen en Szelenyi et al., 2000, Arzneimittelforschung 50(11): 1037-42; Kawaguchi et al., 1994, Clin. Exp. Allergy 24(3):238-244 y Sugimoto et al., 2000, Immunopharmacology 48(1):1-7. Los modelos animales adecuados de conjuntivitis alergica se describen en Carreras et al., 1993, Br. J. Ophthalmol. 77(8):509-514; Saiga et al, 1992, Ophthalmic Res. 24(1):45-50; y Kunert et al., 2001, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42(11):2483-2489. Los modelos animales adecuados de mastocitosis sistemica se describen en O'Keefe et al., 1987, J. Vest. Intern. Med. 1(2):75-80 y Bean Knudsen et al., 1989, Vet. Pathol. 26(1):90-92. Los modelos animales adecuados de sindrome hiper-IgE se describen en Claman et al., 1990, Clin. Immunol. Immunopathol. 56(1):46-53. Los modelos animales adecuados de linfoma de celulas B se describen en Hough et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13853-13858 y Hakim et al., 1996, J. Immunol. 157(12):5503-5511. Los modelos animales adecuados de trastornos atopicos tales como dermatitis atopica, eccema atopico y asma atopica se describen en Chan et al., 2001, J. Invest. Dermatol. 117(4):977-983 y Suto et al.,1999, Int Arch. Allergy Immunol. 120(Supl:1): 70-75. Los expertos normales pueden adaptar de forma habitual tal informacion para determinar las dosis adecuadas para la administracion a seres humanos. En la Seccion de Ejemplos se describen modelos animales adecuados adicionales.
Las cantidades de las dosis estaran tipicamente en el intervalo de alrededor de 0,0001 o 0,001 o 0,01 mg/kg/dia a alrededor de 100 mg/kg/dia, pero pueden ser mayores o menores, dependiendo, entre otros factores, de la actividad del compuesto, de su biodisponibilidad, del modo de administracion y otros diversos factores explicados anteriormente. La cantidad e intervalo de la dosificacion se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles plasmaticos del (o de los) compuesto(s) que sean suficientes para mantener el efecto terapeutico o profilactico. Por ejemplo, los compuestos se pueden administrar una vez por semana, varias veces por semana (por ejemplo, en dias alternos), una vez por dia o multiples veces por dia, dependiendo, entre otros, del modo de administracion, de la indicacion especifica tratada y de la valoracion del medico. En casos de administracion local o absorcion selectiva, tal como administracion topica local, la concentracion local eficaz de (de los) compuesto(s) activo(s) puede no estar relacionada con la concentracion plasmatica. Los expertos seran capaces de optimizar las dosis locales eficaces sin experimentacion excesiva.
Preferiblemente, el (los) compuesto(s) proporcionara(n) beneficio terapeutico o profilactico son provocar toxicidad sustancial. La toxicidad del (de los) compuesto(s) se puede determinar usando procedimientos farmaceuticos estandar. La relacion de la dosis entre el efecto toxico y el terapeutico (o profilactico) es el indice terapeutico. Se prefiere(n) compuesto(s) que muestre(n) indices terapeuticos elevados.
Habiendose descrito la invencion, se ofrecen los siguientes ejemplos a titulo ilustrativo y no limitativo.
7. EJEMPLOS 7.1 Sintesis de Materiales de Partida e Intermedios Otiles para Sintetizar los Compuestos de 2,4-Pirimidindiamina segun los Esquemas (I)-(V)
Se preparo como se describe a continuacion una variedad de materiales de partida y N4-monosustituida-2pirimidinaminas y N2-monosustituida-4-pirimidindiaminas [productos de reaccion de mono-sustitucion nucleofila aromatica (SNAR)] utiles para sintetizar los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion segun los Esquemas (I)(V). Las condiciones adecuadas para sintetizar los productos mono-SNAR se ejemplifican con la 2-cloro-N4-(3,4etilendioxifenil)-5-fluoro-4-pirimidinamina (R926087).
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
7.1
Sintesis de materiales de partida e intermedios utilespara sintetizar los compuestos de 2,4pirimidindiamina segun los Esquemas (I)-(V) Se preparo como se describe mas abajo una variedad de materiales de partida y N4monosustituidas-2-pirimidinaminas y N2-monosustituidas-4-pirimidindiaminas [productos dereaccion de monosustitucion nucleofila aromatica (SNAR)] utiles para sintetizar los compuestosde 2,4-pirimidindiamina de la invencion segun los Esquemas (I)-(V). Las condiciones adecuadaspara sintetizar los productos de la mono-SNAR se ejemplifican con 2-cloro-N4-(3,4etilendioxifenil)-5-fluoro-4-pirimidinamina (R926087)
7.1.1
2,4-dicloro-5-fluoropirimidina En un matraz de reaccion seco, equipado con una barra agitadora y un condensador de reflujo,se coloco 5-fluorouracilo (0,65 g, 5 mmoles) seguido de oxicloruro de fosforo (POCl3 ) (1,53 g, 10mmoles). La mezcla resultante se calento a 110°C durante 8 horas en una atmosfera denitrogeno. La reaccion se enfrio hasta la temperatura ambiente, se anadio pentacloruro de fosforo (PCl5 ) (3,12 g, 15 mmoles) y se calento hasta 110°C durante un periodo de 12 horas.Tras enfriar hasta la temperatura ambiente, la mezcla se vertio en agua con hielo, se saturo concloruro de sodio y se dejo durante 1 hora a 0°C para completar la descomposicion de POCl3 y PCl5 . El solido de 2,4-dicloro-5-fluoropirimidina se recogio mediante filtracion rapida, se secousando papel secante y se almaceno a baja temperatura. RMN 1 H (CDCl3 ):e 8,47 (s, 1H); RMN13 C (CDCl3 ): e 155,42, 151,87, 147,43 y 147,13; RMN 19 F (CDCl3 ): - 38149.
7.1.2
2,4-dicloro-5-nitropirimidina (Aldrich D6, 930-0) Una suspension de 5-nitrouracilo (10 g, 63 mmoles) en POCl3 (100 ml) se puso a reflujo durante5 h en presencia de N,N-dimetilanilina (10 ml), se enfrio hasta la temperatura ambiente y se vertio sobre hielo machacado, con agitacion vigorosa. La capa acuosa se extrajo con acetato deetilo. Las capas organicas combinadas se secaron sobre MgSO4 , y el disolvente se evaporo apresion reducida. El residuo se purifico mediante cromatografia sobre gel de silice (hexano/acetato de etilo; 1/1; v/v) para dar la 2,4-dicloro-5-nitropirimidina deseada. LCMS: tiempo de ret.: 23,26 min.; pureza: 95%; RMN 1 H (CDCl3 ): e 9,16 (1H, s).
7.1.3
2,4-dicloro-5-cianopirimidina De la misma manera que para la preparacion de 2,4-dicloro-5-nitropirimidina, la reaccion de 5cianouracilo con POCl3 y N,N-dimetilanilina dio 2,4-dicloro-5-cianopirimidina. LCMS: tiempo deret.: 13,75 min.; pureza: 95%.
7.1.4
2,4-dicloro-5-trifluorometilpirimidina De la misma manera que para la preparacion de 2,4-dicloro-5-nitropirimidina, la reaccion de 5cianouracilo con POCl3 y N,N-dimetilanilina dio 2,4-dicloro-5-cianopirimidina. RMN 1 H (CD3 OD): e 9,07; LCMS: tiempo de ret.: 16,98 min. (metodo rapido); pureza: 70%.
7.1.114
2-cloro-N4-[(2,2-dimetil-4H-5-pirido[1,4]oxazin-3-on)7-il]-5-fluoro-4-pirimidinamina (R940344) De la misma manera que para la preparacion de 2-cloro-5-fluoro-N4-(3-metiloxicarbonil-4metoxifenil)-4-pirimidinamina, se hicieron reaccionar 2,4-dicloro-5-fluoropirimidina y 7-amino-2,2dimetil-4H-5-pirido[1,4]oxazin-3-ona para dar 2-cloro-N4-[(2,2-dimetil-4H-5-pirido[1,4]oxazin-3on)-7-il]-5-fluoro-4-pirimidinamina R940344. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,32 (1H, s), 10,20 (1H, s),
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
8,45 (1H, d, 3,6 Hz), 8,33 (1H, d, 2,1 Hz), 7,84 (1H, d, 2,1 Hz), 1,54 (6H, s); pureza90,8% ; MS (m/e): 324 (MH+).
7.1.116
2-cloro-5-fluoro-N4-[2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin3(4H)-on-6-il]-4-pirimidinamina (R945298) De manera similar a la preparacion de 2-cloro-N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-4-pirimidinamina,se hicieron reaccionar 2,4-dicloro-5-fluoropirimidina y 6-amino-2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-3(4H)ona para dar 2-cloro-5-fluoro-N4-[2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-3(4H)-on-6-il]-4-pirimidinamina.RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 4,63 (s, 2H), 7,34 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,44 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,33 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 10,14 (s, 1H, NH), 11,19 (s, 1H, NH); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 152,35; LCMS: tiempo de ret.: 26,74 min.; pureza: 85,90%; MS (m/e): 296,13 (MH+ ).
7.2
Sintesis de aminas y precursores de aminas
7.2.1
5-Amino-2-(2-hidroxietilenoxi)piridina Una disolucion metanolica (50 ml) de 2-(2-hidroxietilenoxi)-5-nitropiridina (0,5 g) se hidrogeno enpresencia de Pd/C (10%; 0,05 g) usando un balon lleno de hidrogeno durante 2 h. Despues defiltrar a traves de una almohadilla de celite y lavar con metanol, la disolucion se concentro para dar la 5-amino-2-(2-hidroxietiloxi)piridina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,58 (d, 1H, J = 3 Hz), 7,05 (dd,1H, J = 2,7 y 8,1 Hz), 6,64 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 4,36 (m, 2H), 3,89 (m, 2H).
7.2.2
4-cloro-3-metoxianilina De la misma manera que para la preparacion de 5-amino-2-(2-hidroxietilenoxi)piridina, lahidrogenacion de 4-cloro-3-metoxinitrobenceno dio 4-cloro-3-metoxianilina. LCMS: pureza: 98%;MS: 199 (M+ acetonitrilo).
7.2.3
2-[5-Amino-2-oxo-1,3-benzoxazol-3(2H)-il]acetamida De la misma manera que para la preparacion de 5-amino-2-(2-hidroxietilenoxi)piridina, lahidrogenacion de 2-[1,3-benzoxazol-2-oxo-5-nitro-3(2H)-il)acetamida dio 2-[5-amino-2-oxo-1,3benzoxazol-3(2H)-il]acetamida. LCMS: pureza: 96%; MS: 208 (MH+ ).
7.2.4
7-nitro-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina La 7-nitro-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina se preparo mediante nitracion de 1,2,3,4tetrahidroisoquinolina segun la siguiente referencia: Grunewald, Gary L.; Dahanukar, Vilas H.;Caldwell, Timothy M.; Criscione, Kevin R.; Journal of Medicinal Chemistry (1997), 40(25), 39974005.
7.2.5
2-(t-Butoxicarbonil)-7-nitro-1,2,3,4tetrahidroisoquinolina Una mezcla de 7-nitro-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (0,55g, 3,1 mmoles), bicarbonato de di-tbutilo (0,70 g, 3,2 mmoles), trietilamina (1,0 ml, 7,7 mmoles) en diclorometano (8 ml) se agito a rt durante 8 h. La mezcla de reaccion se diluyo con agua (50 ml) y se agito durante 1 h. La faseorganica se separo y se lavo con salmuera. La concentracion de la fase organica dio 2-(tbutoxicarbonil)-7-nitro-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,03-7,95 (m, 2H), 7,28(d, 1H, J = 8,4 Hz), 4,66 (s, 2H), 3,68 (t, 2H, J = 6,0 Hz), 2,92 (t, 2H, J = 6,0 Hz),1,49 (s, 9H).
7.2.6
2,3-Dihidro-6-nitro-4-bencipiranona Se disolvio acido 3-(p-nitrofenil)-propionico en acido sulfurico concentrado y se trato con P2 O5 .La mezcla se agito durante 1 h a temperatura ambiente y se vertio sobre hielo. La filtracion dio
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
2,3-dihidro-6-nitro-4-bencipiranona como un solido blanco. RMN 1 H (DMSO): e 8,47 (d, J = 3,0Hz, 1H), 8,35 (dd, J = 3,0, 9,0 Hz, 1H), 7,29 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 4,70 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 2,90 (t, J= 7,2 Hz, 1H).
7.2.7
3,4-Dihidro-4-hidroxi-6-amino-2H-1-benzopirano Una mezcla de 2,3-dihidro-6-nitro-4-bencipiranona y Pd/C (10%) en MeOH se hidrogeno a 22°Cdurante 3 horas (40 psi). La mezcla se filtro y se concentro hasta sequedad para dar 3,4-dihidro4-hidroxi-6-amino-2H-1-benzopirano como un aceite marron. RMN 1 H (DMSO): e 6,40-6,56 (m, 3H), 5,05 (bs, 1H), 4,45 (bs, 1H), 3,94-4,09 (m, 2H), 1,76-1,98 (m, 2H).
7.2.9
3-(N-morfolinocarbonil)anilina A una disolucion a 0°C de cloruro de 3-nitrobenzoilo (0,50 g, 2,7 mmoles) y piridina (0,27 ml, 3,2mmoles) en diclorometano anhidro (15 ml) se anadio morfolina (0,28 ml, 3,2 mmoles). La mezclade reaccion se dejo calentar hasta rt y se agito durante 20 h. Los disolventes se eliminaron a vacio, y el residuo se suspendio en acetato de etilo y se lavo con HCl 1N. La capa organica selavo con una disolucion saturada de NaHCO3 y salmuera. La eliminacion de los disolventes avacio proporciono 1-(N-morfolinocarbonil)-3-nitrobenceno, que se uso sin purificacion adicional. Una mezcla de 1-(N-morfolinocarbonil)-3-nitrobenceno (0,64 g) y Pd al 10% sobre carbonactivado (60 mg) en metanol desgasificado (65 ml) se agito en un balon de H2 durante 2 h. Lamezcla de reaccion se filtro a traves de un auxiliar de la filtracion de Celite® y despues se concentro a presion reducida para dar 3-(N-morfolinocarbonil)anilina con rendimiento cuantitativo. 1 H NMR (CDCl3 ): e 7,19-7,14 (m, 1H), 6,75-6,69 (m, 3H), 3,58-3,71 (m, 10H).
7.2.10
3-(N-propilcarbonil)anilina De la misma manera que para la preparacion de 3-(N-morfolinocarbonil)anilina, se hicieronreaccionar cloruro de 3-nitrobenzoilo y n-propilamina para preparar 1-[(N-propilamino)carbonil]3-nitrobenceno, que sufrio hidrogenacion para dar 3-(N-propilcarbonil)anilina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,18 (t, 1H, J = 7,5 Hz), 7,13 (t, 1H, J = 1,8 Hz), 7,05-7,01 (m, 1H), 6,78 (ddd, 1H, J = 1,2, 2,4, y 7,5 Hz), 6,10 (bs, 1H), 3,58-3,53 (bs, 2H), 3,43-3,34 (m, 2H), 1,68-1,57 (m, 2H), 0,97 (t, 3H, J = 7,2 Hz).
7.2.11
3-[4-(Etoxicarbonil)-piperidinocarbonil]anilina De la misma manera que para la preparacion de 3-(N-morfolinocarbonil)anilina, se hicieronreaccionar cloruro de 3-nitrobenzoilo e isonipecotato de etilo para preparar 1-[4(etoxicarbonil)piperidinocarbonil]-3-nitrobenceno, que sufrio hidrogenacion para dar 3-[4(etoxicarbonil)piperidinocarbonil]anilina.
7.2.12
3-(N-metilcarbonil)anilina De la misma manera que para la preparacion de 3-(N-morfolinocarbonil)anilina, se hicieronreaccionar cloruro de 3-nitrobenzoilo e hidrocloruro de metilamina para preparar 1-[(Nmetilamino)carbonil]-3-nitrobenceno, que sufrio hidrogenacion para dar 3-(Nmetilcarbonil)anilina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,18 (t, 1H, J = 7,5 Hz), 7,13 (t, 1H, J = 1,8 Hz), 7,04
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
6,99 (m, 1H), 6,81-6,75 (m, 1H), 6,05 (bs, 1H), 3,84 (bs, 2H), 2,99 (d, 3H, J = 4,8 Hz).
7.2.13
7-Amino-1-tetralona De la misma manera que para la preparacion de 4-aminofenoxiacetato de etilo, se llevo a cabola hidrogenacion de 7-nitro-1-tetralona para preparar 7-amino-1-tetralona. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,32 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,05 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 6,82 (dd, 1H, J = 2,4 y 8,1 Hz), 2,85 (t, 2H, J = 6,6 Hz), 2,61 (t, 2H, J = 6,6 Hz), 2,14-2,04 (m, 2H).
7.2.14
7-Amino-2-(t-butoxicarbonil)-1,2,3,4tetrahidroisoquinolina De la misma manera que para la preparacion de 4-aminofenoxiacetato de etilo, se llevo a cabola hidrogenacion de 2-(t-butoxicarbonil)-7-nitro-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina para preparar 7amino-2-(t-butoxicarbonil)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 6,92 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 6,52 (dd, 1H, J = 2,4 y 8,4 Hz), 6,44 (bs, 1H), 4,47 (s, 2H), 3,63-3,48 (m, 2H), 2,71 (t, 2H, J= 5,1 Hz), 1,45 (s, 9H).
7.2.15
7-Amino-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina De la misma manera que para la preparacion de 4-aminofenoxiacetato de etilo, se llevo a cabola hidrogenacion de 7-nitro-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina para preparar 7-amino-1,2,3,4tetrahidroisoquinolina. RMN 1 H (DMSO-d ): e 9,35 (bs, 1H), 6,82 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 6,45 (dd,1H, J = 2,4 y 8,4 Hz), 6,30 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 5,05 (s, 2H), 4,05 (s, 2H), 3,24 (t, 2H, J = 6,6 Hz), 2,78 (t, 2H, J = 6,6 Hz).
7.2.16
2-(3-aminofenoxi)-N,2-dimetilpropanamida De la misma manera que para la preparacion de 4-aminofenoxiacetato de etilo, se llevo a cabola hidrogenacion de N,2-dimetil-2-(3-nitrofenoxi)propanamida para preparar 2-(3-aminofenoxi)N,2-dimetilpropanamida. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,03 (t, 1H, J = 7,8 Hz), 6,71 (bs, 1H), 6,39 (dd, 1H, J = 1,2 y 6,9 Hz), 6,29 (dd, 1H, J = 2,4 y 9,6 Hz), 6,25-6,22 (m, 1H), 2,86 (d, 3H, J = 4,2 Hz), 2,86 (d, 3H, J = 4,2 Hz), 1,50 (s, 6H).
7.2.17
2-(3-aminofenoxi)-2-metilpropanato de etilo De la misma manera que para la preparacion de 4-aminofenoxiacetato de etilo, se llevo a cabola hidrogenacion de 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)propanato de etilo para preparar 2-(3-aminofenoxi)2-metilpropanato de etilo. RMN 1 H (CDCl3 ): e 6,99 (t, 2H, J = 8,7 Hz), 6,32 (dt, 1H, J = 1,2 y 7,2 Hz), 6,24-6,18 (m, 2H), 4,23 (q, 2H, J = 7,2 Hz), 1,58 (s, 6H), 1,24 (t, 3H, J = 6,9 Hz).
7.2.18
N-metil-2-(5-amino-2-metilfenoxi)acetamida De la misma manera que para la preparacion de 4-aminofenoxiacetato de etilo, se llevo a cabola hidrogenacion de N-metil-2-(2-metil-5-nitrofenoxi)acetamida para preparar N-metil-2-(5-amino2-metilfenoxi)acetamida. RMN 1 H (CD3 OD): e 6,86 (d, 1H, J = 7,5 Hz), 6,32-6,25 (m, 2H), 4,43 (s, 2H), 2,82 (s, 3H), 2,14 (s, 3H).
7.2.19
6-Amino-2-(metoxicarbonil)-(1H)-indol El 6-amino-2-(metoxicarbonil)-(1H)-indol se preparo segun la siguiente referencias:1. Adams, Richard E.; Press, Jeffery B.; Deegan, Edward G.; Synthetic Communications (1991),12 (5), 675-681.
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
2. Boger, Dale L.; Yun, Weiya; Han, Nianhe; Johnson, Douglas S.; Biorganic & MedicinalChemistry (1995), 3(6), 611-621
7.2.20
Preparacion de 3-hidroxi-5(metoxicarbonilmetilenoxi)anilina y 3,5bis(metoxicarbonilmetilenoxi)-anilina N-(3,5-dihidroxifenil)carbamato de benciloA una mezcla de 5-aminobenceno-1,3-diol (0,60 g, 3,7 mmoles) e hidrogenocarbonato de sodio(1,4 g, 16 mmoles) en THF/agua (15 ml, 1:1 v/v) se anadio gota a gota cloroformiato de bencilo (1,6 ml, 11 mmoles). Despues de 3 h a rt, el THF se elimino a vacio y la capa acuosa que quedase extrajo con acetato de etilo. La purificacion mediante cromatografia en columna sobre gel desilice proporciono N-(3,5-dihidroxifenil)carbamato de bencilo. RMN 1 H (CD3 OD): e 7,42-7,25 (m, 5H), 6,46 (d, 2H, J = 2,4 Hz), 5,97-5,94 (m, 1H), 5,14 (s, 2H).N-[3-hidroxi-5-(metoxicarbonilmetilenoxi)fenil]carbamato de bencilo y N-[3,5bis(metoxicarbonilmetilenoxi)fenil]carbamato de bencilo.De la misma manera que para la preparacion de 4-nitrofenoxiacetato de etilo, se hicieronreaccionar N-(3,5-dihidroxifenil)carbamato de bencilo y bromoacetato de metilo para dar unamezcla de N-[3-hidroxi-5-(metoxicarbonilmetilenoxi)fenil]carbamato de bencilo. RMN 1 H (DMSOd ): e 9,62 (s, 1H), 9,44 (s, 1H), 7,42-7,31 (m, 5H), 6,63 (s, 1H), 6,50 (t, 1H, J = 2,4 Hz), 5,93 (t, 1H, J = 2,4 Hz), 5,10 (s, 2H), 4,63 (s, 2H), 3,67 (s, 3H), y N-[3,5bis(metoxicarbonilmetilenoxi)fenil]carbamato de bencilo, RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,38-7,32 (m, 5H),6,86 (s, 1H), 6,67 (d, 2H, J = 1,8 Hz), 6,19 (t, 1H, J = 2,4 Hz), 5,16 (s, 2H), 4,57 (s, 4H), 3,78 (s,6H), que se separaron mediante cromatografia en columna sobre gel de silice.3-Hidroxi-5-(metoxicarbonilmetilenoxi)anilinaDe la misma manera que para la preparacion de 4-aminofenoxiacetato de etilo, se llevo a cabola hidrogenacion de N-[3-hidroxi-5-(metoxicarbonilmetilenoxi)fenil]carbamato de bencilo parapreparar 3-hidroxi-5-(metoxicarbonilmetilenoxi)anilina. RMN 1 H (CD3 OD): e 5,87-5,80 (m, 2H), 5,78-5,72 (m, 1H), 4,56 (s, 2H), 3,76 (s, 3H). 3,5-Bis(metoxicarbonilmetilenoxi)anilinaDe la misma manera que para la preparacion de 4-aminofenoxiacetato de etilo, se llevo a cabola hidrogenacion de N-[3,5-bis(metoxicarbonilmetilenoxi)fenil]carbamato de bencilo para preparar 3,5-bis(metoxicarbonilmetilenoxi)anilina. RMN 1H (CD3 OD): e 5,92 (d, 2H, J = 2,4 Hz), 5,83 (t, 1H, J = 2,4 Hz), 4,58 (s, 4H), 3,78 (s, 6H).
7.2.22
Etil 6-Nitro-3-carboxi-4�-imidazo[5,1-c]-1,4- Se preparo segun J. of Heterocyclic Chemistry, 26, 205,7 x x
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
benzoxazina
7.2.23
Etil 6-Amino-3-carboxi-4 -imidazo[5,1-c]-1,4benzoxazina Etil 6-Nitro-3-carboxi-4 -imidazo[5,1-c]-1,4-benzoxazina se redujo mediante agitacion en MeOHa 40 p.s.i. de H2 con 20 por ciento en peso de Pd al 10%/C (Degussa) durante 1 h, despues sefiltro y el disolvente se evaporo. El compuesto se purifico directamente mediante cromatografiaen columna (EtOAc/hexano) para dar Etil 6-Amino-3-carboxi-4 -imidazo[5,1-c]-1,4-benzoxazina.1 H (DMSO-d6) 8,41 (s, 1H), 6,98 (m, 1H), 6,82 (m, 1H), 6,43 (m, 1H), 5,28 ((s. 2H), 4,23 (q, 2H,J=6,2 Hz), 1,27 (t, 2H, J=6,2 Hz) pureza 92% MS (m/e): 232 (MH+ ).
7.2.24
6-Amino-3,3-dimetil-1,4-benzoxazina Una mezcla de 15 g de 2-amino-4-nitrofenol y 40 g de Boc2 O en 300 ml de CHCl3 se puso a reflujo toda la noche, se filtro, y el filtrado se evaporo hasta casi sequedad. El residuo se triturocon hexanos, se recogio mediante filtracion por succion, y se seco para dar 2-N-Boc-amino-4nitrofenol. El 2-N-Boc-amino-4-nitrofenol se puso a reflujo en acetona con 15,6 ml de 1-cloro-2metilpropeno y 25 g de carbonato de potasio toda la noche. La mezcla de reaccion se vertio enhielo derretido, el solido se recogio mediante filtracion por succion y se lavo con agua. El solido se disolvio en EtOAc, y la parte organica se lavo con disolucion al 10% de NaOH, con agua,despues con salmuera, y se seco sobre MgSO4 . El organico se filtro para eliminar el agentesecante y se evaporo para dar 18 g de 1-(2-N-Boc-amino-4-nitrofenoxi)-2-metil-2-propeno. Seagitaron 7,8 g de 1-(2-N-Boc-amino-4-nitrofenoxi)-2-metil-2-propeno toda la noche en HClmetanolico en un matraz de fondo redondo con un tabique, y despues se calentaron a 80°C conun condensador de reflujo adyacente, durante 10 minutos. La reaccion se enfrio, y el metanol seelimino mediante evaporacion giratoria. El residuo se disolvio en 30 ml de HCl 4N, se transfirio auna nueva vasija para dejar atras cualquier solido no disuelto y se enfrio se enfrio hasta 0°C. Se anadieron gota a gota 1,83 g de NaNO2 en 5 ml de agua, y la disolucion se neutralizo conbicarbonato de sodio solido. Se anadio lentamente, gota a gota, una disolucion de 1,64 g deNaN3 en 17 ml de agua, y la reaccion se agito 30 minutos. El precipitado se recogio mediantefiltracion por succion, se lavo bien con agua y se seco en el embudo para dar 5,7 g de 1-(2azido-4-nitrofenoxi)-2-metil-2-propeno. Se pusieron a reflujo 7 g de 1-(2-azido-4-nitrofenoxi)-2metil-2-propeno en 300 ml de benceno toda la noche, se enfriaron y despues se evaporaron. Elproducto bruto se recristalizo en EtOAc/Hexanos para dar 3-metil-6-nitro-azirino[2,1-c]-1,4benzoxazina en dos cosechas con una masa combinada de 5,1. Se disolvio 1 g de 3-metil-6nitro-azirino[2,1-c]-1,4-benzoxazina en 500 ml de MeOH/5% de THF, se anadieron 200 mg de Pd al 10%/C (Degussa), y la mezcla resultante se agito a una atmosfera de 30 p.s.i. de H2 durante 8 horas. La mezcla de reaccion se filtro a traves de una almohadilla de celite, y el disolvente se evaporo. El residuo se disolvio en una cantidad mimina de DCM/THF/MeOH y secargo sobre una columna de SiO2 de 5 cm por 20 cm con 3% de MeOH/DCM, y el compuesto seeluyo isocraticamente con una pequena cantidad de presion positiva. Las fracciones apropiadasse combinaron y se evaporaron para dar 590 mg de 6-amino-3,3-dimetil-1,4-benzoxazina. 1H(DMSO-d6) 6,30 (d, 1H), 5,75 (d, 1H), 5,65 (dd, 1H), 3,58 (s, 2H), 1,08 (s, 6H) pureza 99% MS
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
(m/e): 179 (MH+).
7.2.25
4-aminofenoxiacetato de etilo 4-Nitrofenoxiacetato de etilo Un matraz de reaccion seco, equipado con un condensador de reflujo, una entrada de N2 y una barra magnetica agitadora, se cargo con 3-nitrofenol (76,45 g, 550 mmoles), K2 CO3 (76,45 g, 550 mmoles) y acetona seca (500 ml) en una atmosfera de N2 . A esto se anadio a temperaturaambiente bromoacetato de etilo (55,44 ml, 500 mmoles) a lo largo de un periodo de 15 min. Lamezcla de reaccion se puso a reflujo durante 16 h, se enfrio y se vertio sobre agua con hielo (4Kg). La disolucion acuosa resultante se extrajo con CH2 Cl2 (3 x 500 ml), se seco sobre Na2 SO4 anhidro, y el disolvente se elimino para obtener 103 g (92%) del 4-nitrofenoxiacetato de etilodeseado. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,20 (d, 2H, J = 8,2 Hz), 6,95 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 4,72 (s, 2H), 4,25(q, 2H), 1,23 (t, 3H); LCMS: tiempo de ret.: 27,07 min.; pureza: 100%; MS: 267 (M+ acetonitrilo).4-Aminofenoxiacetato de etilo. Una disolucion de 4-nitrofenoxiacetato de etilo (15 g) en EtOH (400 ml) se hidrogeno a 40 PSIdurante 40 minutos en presencia de Pd al 10%/C (1,5 g, 10% en peso). Despues de filtrar atraves de celite, el disolvente se elimino a presion reducida para obtener 4-aminofenoxiacetatode etilo. RMN 1 H (CDCl3 ): e 6,77 (d, 2H, 8,1 Hz), 6,60 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 4,50 (s, 2H), 4,24 (q,2H), 1,24 (t, 3H); LCMS: tiempo de ret.: 12,00 min.; pureza: 100%; MS (m/e): 196 (MH+ ).
7.2.26
4-Aminofenoxiacetato de terc-butilo 4-Nitrofenoxiacetato de terc-butilo.De la misma manera que para la preparacion de 4-nitrofenoxiacetato de etilo, se hicieronreaccionar 4-nitrofenol y bromoacetato de terc-butilo para preparar 4-nitrofenoxiacetato de tercbutilo. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,2 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 6,95 (d, 2H, J = 8,2 Hz), 4,60 (s, 2H), 1,42 (s,9H).4-aminofenoxiacetato de terc-butilo.De la misma manera que para la preparacion de 4-aminofenoxiacetato de etilo, se llevo a cabola hidrogenacion de 4-nitrofenoxiacetato de terc-butilo para preparar 4-aminofenoxiacetato deterc-butilo. RMN 1 H (CDCl3 ): e 6,74 (d, 2H, J = 9 Hz), 6,62 (d, 2H, J = 9 Hz), 4,42 (s, 2H), 1,42 (s,9H); LCMS: tiempo de ret.: 16,35 min.; pureza: 94%; MS (m/e): 224 (MH+ ).
7.2.27
3-Aminofenoxiacetato de etilo 3-Nitrofenoxiacetato de etilo De la misma manera que para la preparacion de 4-nitrofenoxiacetato de etilo, se hicieronreaccionar 3-nitrofenol y bromoacetato de etilo para preparar 3-nitrofenoxiacetato de etilo. RMN
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
1 H (CDCl3 ): e 7,88 (dt, 1H, J = 1,2 y 8,7 Hz), 7,71 (t, 1H, J = 2,4 Hz), 7,45 (t, 1H, J = 8,4 Hz), 7,27 (dt, 1H, J = 2,4 y 8,4 Hz), 4,70 (s, 2H), 4,29 (q, 2H, J = 6,9 Hz), 1,30 (t, 3H, J = 6,9 Hz); LCMS: tiempo de ret.: 27,28 min.; pureza: 96%. 3-Aminofenoxiacetato de etilo De la misma manera que para la preparacion de 4-aminofenoxiacetato de etilo, se llevo a cabola hidrogenacion de 3-nitrofenoxiacetato de etilo para preparar 3-aminofenoxiacetato de etilo.RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,05 (t, 1H, J = 7,2 Hz), 6,30 (m, 3H), 4,56 (s, 2H), 4,25 (q, 2H, J = 7,2 Hz), 1,29 (t, 3H, J = 6,9 Hz); LCMS: tiempo de ret.: 10,69 min.; pureza: 96%; MS (m/e): 196 (MH+ ).
7.2.28
2-(4-Aminofenoxi)propionato de (+)-etilo De la misma manera que para la preparacion de 4-aminofenoxiacetato de etilo, se llevo a cabola hidrogenacion de (+)-2-(4-nitrofenoxi)propionato de etilo para preparar (+)-2-(4aminofenoxi)propionato de etilo. RMN 1 H (CDCl3 ): e 6,70 (d, 2H), 6,58 (d, 2H), 4,60 (m, 1H), 4,20(q, 2H), 3,2 (bs, 2H), 1,45 (d, 3H), 1,22 (t, 3H).
7.2.29
3-Aminofenoxiacetamida de N-metilo N-Metil 3-NitrofenoxiacetamidaUna mezcla de 3-nitrofenoxiacetato de etilo (9,12 g, 40 mmoles), hidrocloruro de metilamina(26,8 g, 400 mmoles) y diisopropiletilamina (35,5 ml, 200 ml) en MeOH (100 ml) se agito en unvial de presion a 90°C durante 6 h. La reaccion se enfrio hasta la temperatura ambiente, sediluyo con agua (1 litro), el solido formado se filtro, se lavo con agua y se seco para obtener laN-metil-3-nitrofenoxiacetamida deseada (8 g, 95%). RMN 1 H CDCl3 ): e 7,91 (dd, 1H, J = 1,8 y 8,1 Hz), 7,78 (t, 1H, J = 2,4 Hz), 7,50 (t, 1H, J = 8,7 Hz), 7,29 (dd, 1H, J = 1,8 y 8,4 Hz), 6,50 (bs,2H), 4,57 (s, 2H), 2,95 y 2,93 (2s, 3H); LCMS: tiempo de ret.: 17,54 min.; pureza: 100%; MS(m/e): 211 (MH+). N-metil-3-aminofenoxiacetamida De la misma manera que para la preparacion de 4-aminofenoxiacetato de etilo, se llevo a cabola hidrogenacion de N-metil-3-nitrofenoxiacetamida (8 g, 39 mmoles) para dar la N-metil-3aminofenoxiacetamida deseada (6 g, 86%). RMN 1 H (CD3 OD): e 6,99 (t, 1H, J = 8,1 Hz), 6,376,25 (m, 3H), 4,41 (s, 2H), 2,80 (s, 3H); LCMS: tiempo de ret.: 19,80 min.; pureza: 100%.
7.2.30.
2-Metoxicarbonil-5-aminobenzofurano (R926610) 2-Metoxicarbonil-5-nitrobenzofurano (R926609) A una suspension de acido 5-nitro-2-benzofurancarboxilico (5 g, 24,15 mmoles) en CH2 Cl2 (250 ml) a 0°C se anadio DMF (0,100 ml) seguido de (COCl)2 (2M en CH2 Cl2 , 36,23 ml, 72,46 ml) a lolargo de un periodo de 10 min. La reaccion se agito a 0°C durante 1 h, y despues a temperaturaambiente durante 30 min. El disolvente de la reaccion se elimino a presion reducida, se seco a
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
alto vacio y se suspendio nuevamente en CH2 Cl2 (250 ml). La disolucion se enfrio hasta 0°C, seanadio piridina (4,8 ml, 48,03 mmoles) seguido de MeOH (10 ml,exceso) y se agito toda lanoche. El tratamiento de extraccion con CH2 Cl2 dio el 2-metoxicarbonil-5-nitrobenzofuranoesperado (R926609). RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,66 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 8,36 (dd, 1H, J = 2,4 y 9,6Hz), 7,71 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 7,65 (s, 1H), 4,01 (s, 3H); LCMS: tiempo de ret.: 26,94 min.2-Metoxicarbonil-5-aminobenzofurano (R926610) De la misma manera que para la preparacion de 4-aminofenoxiacetato de etilo, la hidrogenacion de 2-metoxicarbonil-5-nitrobenzofurano (2 g) en MeOH dio 2-metoxicarbonil-5aminobenzofurano. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,38 (bt, 2H), 6,90 (bd, 1H), 6,85 (bdd, 1H), 3,98 (s, 3H).
7.2.31
2-(2-Metil-5-nitrofenoxi)acetato de metilo De la misma manera que para la preparacion de 4-nitrofenoxiacetato de etilo, se hicieronreaccionar 2-metil-5-nitrofenol y bromoacetato de metilo para preparar 2-(2-metil-5nitrofenoxi)acetato de metilo. RMN 1 H (CD3 OD): e 7,80 (dd, 1H, J = 2,4 y 8,1 Hz), 7,65 (d, 1H, J= 2,4 Hz), 7,38 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 4,90 (s, 2H), 3,80 (s, 3H), 2,36 (s, 3H).
7.2.32
2-Metil-2-(3-nitrofenoxi)propanato de etilo Una mezcla de 3-nitrofenol (0,50 g, 3,6 mmoles), bromodimacetato de etilo de etilo (0,64 g, 3,3mmoles), K2 CO3 (1,3 g, 9,4 mmoles), yoduro de potasio (catalitico) en etanol absoluto (8 ml) secalento a 70°C durante 18 h. La mezcla de reaccion se enfrio, se vertio en una disolucion saturada de NaHCO3, y se extrajo con diclorometano. El producto, 2-metil-2-(3nitrofenoxi)propanato de etilo, se obtuvo despues de la purificacion mediante cromatografia encolumna sobre gel de silice. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,85 (dt, 1H, J = 1,2 y 8,1 Hz), 7,68 (t, 1H, J = 2,4 Hz), 7,40 (t, 1H, J = 8,4 Hz), 7,19-7,13 (m, 1H), 4,26 (q, 2H, J = 7,2 Hz), 1,64 (s, 6H), 1,26 (t,3H, J = 7,21),
7.2.33
N-Metil-2-(2-metil-5-nitrofenoxi)acetamida De la misma manera que para la preparacion de N-metil-3-nitrofenoxiacetamida, se hicieronreaccionar 2-metil-5-nitrofenoxiacetato de metilo e hidrocloruro de metilamina para preparar Nmetil-2-(2-metil-5-nitrofenoxi)acetamida. RMN 1 H (CD3 OD): e 7,82 (dd, 1H, J = 2,4 y 8,1 Hz), 7,69 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,40 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 4,66 (s, 2H), 2,83 (s, 3H), 2,40 (s, 3H).
7.2.34
N,2-Dimetil-2-(3-nitrofenoxi)propanamida De la misma manera que para la preparacion de 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)propanato de etilo, sehicieron reaccionar 3-nitrofenol y N,2-dimetil-2-bromopropanamida (preparada segun la siguiente referencia: Guziec, Frank S., Jr.; Torres, Felix F. Journal of Organic Chemistry (1993), 58(6), 1604-6) para preparar N,2-dimetil-2-(3-nitrofenoxi)propanamida. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,94 (dt, 1H, J = 1,2 y 8,1 Hz), 7,78 (t, 1H, J = 2,4 Hz), 7,45 (t, 1H, J = 8,4 Hz), 7,22 (ddd, 1H, J = 1,2, 2,4, y 8,1 Hz), 6,61 (bs, 1H), 2,89 (d, 3H, J = 5,1 Hz), 1,55 (s, 6H).
7.2.35
4-Amino-[(1H,1,2,3,4-tetrazolil)metilenoxi]benceno 4-Nitro-[(1H,1,2,3,4-tetrazol-5-il)metilenoxi]benceno
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
Una mezcla de 2-cianometoxi-4-nitrofenilo (5,8 g, 32,6 mmoles), azida sodica (6,3 g, 98,0 mmoles) y cloruro de amonio (8,5 g, 163,3 mmoles) se suspendio en DMF (100 ml) que contieneacido acetico (1 ml), y la mezcla se calento a 70°C. Despues de 17 h, la reaccion se enfrio hasta la temperatura ambiente, y se anadio acido clorhidrico acuoso 2 N (100 ml). El solido, queprecipito de la mezcla de reaccion, se recogio mediante filtracion, se lavo con agua (2 x 20 ml) ydespues con hexano (30 ml), dando el compuesto 4-nitro-[(1H,1,2,3,4-tetrazol-5il)metilenoxi]benceno (6,7 g, 99%) como un solido naranja: RMN 1 H (300 MHz, DMSO-d ) e 8,25 (d, = 9,2 Hz, 2H), 7,29 (d, = 9,1 Hz, 2H), 5,68 (s, 2H); ESI MS m 220 [C8 H7 N5 O3 - H] . 4-Amino-[(1H,1,2,3,4-tetrazolil)metilenoxi]benceno Una mezcla de 4-nitro-[(1,2,3,4-tetrazol-5-il)metilenoxi]benceno (6,7 g, 30,4 mmoles) y 5% enpeso de paladio sobre carbon (700 mg) suspendido en etanol/acido clorhidrico concentrado(14:1, 150 ml) se hidrogeno en una vasija cerrada hermeticamente, a 50 psi. La mezcla se agitohasta que no se observo mas captacion de hidrogeno, despues de lo cual la reaccion se filtro atraves de tierra de diatomeas con cloroformo, y el filtrado se concentro para dar producto bruto.La purificacion mediante cromatografia ultrarrapida (7:2,5:0,5 CHCl3 /CH3 OH/NH4 OH) dio 4amino-[(1H,1,2,3,4-tetrazolil)metilenoxi)]benceno como un solido marron: RMN 1 H (300 MHz, DMSO-d ) 6,76 (d, = 8,7 Hz, 2H), 6,52 (d, = 8,7 Hz, 2H), 5,07 (s, 2H); ESI MS m 190 [C8 H9 N5 O -H] .
7.2.36
4-Amino-[(1-metil-1,2,3,4-tetrazol-5-il)metilenoxi]benceno 4-Nitro-[(1-metil-1,2,3,4-tetrazol-5-il)metilenoxi]-benceno y 4-Nitro-[(2-metil-1,2,3,4-tetrazol-5il)metilenoxi]bencenoUna mezcla de 4-nitro-[(1H,1,2,3,4-tetrazolil)metilenoxi]benceno (10,00 g, 45,2 mmoles),carbonato de cesio (22,09 g, 67,8 mmoles) y yoduro de metilo (7,70 g, 54,3 mmoles) en DMF(200 ml) se agito a temperatura ambiente durante 24 h. La mezcla de reaccion se concentropara eliminar la mayoria de la DMF, y el residuo bruto se repartio entre cloroformo (100 ml) yagua (50 ml). La fase organica se separo, se lavo con salmuera, se seco (Na2 SO4 ) y se concentro para dar producto bruto como un solido naranja. La purificacion mediante cromatografia ultrarrapida (cloroformo) dio 4-nitro-[(1-metil-1,2,3,4-tetrazol-5-il)metilenoxi]benceno: RMN 1 H (300 MHz, DMSO-d ) e 8,26 (d, = 9,2 Hz, 2H), 7,31 (d, = 9,2 Hz, 2H), 5,72(s, 2H), 4,15 (s, 3H); y 4-nitro-(2-metil-1,2,3,4-tetrazol-5-il)metilenoxi]-benceno: RMN 1 H (300 MHz, DMSO-d ) e 8,24 (d, = 9,3 Hz, 2H), 7,29 (d, = 9,3 Hz, 2H), 5,58 (s, 2H), 4,41 (s, 3H).4-Amino-[(1-metil-1,2,3,4-tetrazol-5-il)metilenoxi]-bencenoUna mezcla de 4-nitro-[(1-metil-1,2,3,4-tetrazol-5-il)metilenoxi]-benceno (3,60 g, 15,3 mmoles) yPd al 5%/C (0,40 g) en 14:1 etanol/acido clorhidrico concentrado (75 ml) se agito a temperaturaambiente en una atmosfera de hidrogeno a 50 psi. Despues de 4 h, no se observo captacion
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
adicional de hidrogeno. La mezcla de reaccion se filtro a traves de tierra de diatomeas, Lossolidos se lavaron con una disolucion 6:3:1 de cloroformo/metanol/hidroxido de amonioconcentrado, y el filtrado se concentro para dar 4-amino-[(1-metil-1,2,3,4-tetrazol-5-il)metilenoxi]benceno bruto, que se purifico mediante cromatografia ultrarrapida (95:5 cloroformo/metanol):RMN 1 H (300 MHz, DMSO-d ) 7,48 (br s, 2H), 6,79 (d, = 6,9 Hz, 2H), 6,55 (d, = 6,9 Hz, 2H), 5,36 (s, 2H), 4,10 (s, 3H).
7.2.37
4-Amino-[(2-metil-1,2,3,4-tetrazol-5il)metilenoxi]benceno Una mezcla de 4-nitro-[(2-metil-1,2,3,4-tetrazol-5-il)metilenoxi]benceno (3,60 g, 15,3 mmoles) yPd al 5%/C (0,40 g) en 14:1 etanol/acido clorhidrico concentrado (75 ml) se agito a temperaturaambiente en una atmosfera de hidrogeno a 50 psi. Despues de 3 h no se observo captacionadicional de hidrogeno. La mezcla de reaccion se filtro a traves de tierra de diatomeas, lossolidos se lavaron con 6:3:1 de cloroformo/metanol/disolucion de hidroxido de amonio concentrado, y el filtrado se concentro para dar 4-amino-[(2-metil-1,2,3,4-tetrazol-5il)metilenoxi]benceno bruto, que se purifico mediante cromatografia ultrarrapida (95:5 cloroformo/metanol): RMN 1 H (300 MHz, DMSO-d ) e 6,80 (br s, 2H), 6,75 (d, = 9,0 Hz, 2H), 6,50 (d, = 9,0 Hz, 2H), 5,17 (s, 2H), 4,37 (s, 3H).
7.2.38
2-Etoxicarbonil-5-aminoindol (R926611) De la misma manera que para la preparacion de 4-aminofenoxiacetato de etilo, la hidrogenacion de 2-etoxicarbonil-5-nitroindol dio el 2-etoxicarbonil-5-aminoindol. LCMS: tiempo de ret.: 13,44min.; pureza: 93%; MS (m/e): 205 (MH+ ).
7.2.39
5-[(4-Aminofenoxi)metil]-3-fenil-1,2,4-oaxadiazol Preparacion de 5-[4-(nitrofenoxi)metil]-3-fenil-1,2,4-oxadiazolSe disolvieron 4-nitrofenol (0,36 g, 2,56 mmoles), 5-(clorometil)-3-fenil-1,2,4-oxadiazol (0,5 g,2,56 mmoles) y K2 CO3 anhidro (0,39 g, 2,82 mmoles) en acetona anhidra (20 ml), y se calento areflujo durante 12 h. La mezcla de reaccion se enfrio, y el disolvente se elimino a vacio. El solido bruto formado se recogio mediante filtracion, se lavo con agua y se seco a vacio para dar 5-[(4nitrofenoxi)metil]-3-fenil-1,2,4-oxadiazol (0,70 g, 92%). RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,25 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 8,08 (dd, 2H, J = 8,2 Hz), 7,52-7,49 (m, 3H), 7,13 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 5,45 (s, 2H). Preparacion de 5-[(4-aminofenoxi)metil]-3-fenil-1,2,4-oxadiazolEl 5-[(4-nitrofenoxi)metil]-3-fenil-1,2,4-oxadiazol (0,5 g, 1,68 mmoles) se disolvio en metanol:cloruro de metileno (1:1) (120 ml). Se anadio gota a gota disolucion acuosa de (15 ml)hidrosulfito de sodio (0,88 g, 5,05 mmoles) y K2 CO3 (0,70 g, 5,06 mmole) en nitrogeno durante 10 min. Se dejo agitar los contenidos a temperatura ambiente. Despues de consumir el materialde partida, la mezcla de reaccion se concentro, se diluyo con agua hasta que se formo la capahomogenea. La capa acuosa se extrajo varias veces con acetato de etilo y cloruro de metileno.Las capas organicas turbias se combinaron, se secaron con Na2 SO4 anhidro y se concentraron.La purificacion del concentrado solido mediante cromatografia en gel de silice proporciono 5-[(4
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aminofenoxi)metil]-3-fenil-1,2,4-oxadiazol (0,23g, 51%). RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,11 (m, 2H), 7,527,46 (m, 3H), 6,87 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 6,64 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 5,26 (s, 2H), 3,49 (br s, 2H).Preparacion de 5-[(4-Nitrofenoxi)metil]-3-metil-1,2,4-oxadiazol Una mezcla de acido 4-nitrofenoxiacetico (2,25 g, 11,4 mmoles), oxima de la acetamida,hidrocloruro de trietilamina (3,85 g, 27,62 mmoles), EDCI.HCl (4,37 g, 22,79 mmoles) ydiisopropiletilamina (7,42 g, 57,40 mmoles) en THF anhidro (250 ml) se puso a reflujo durante 18h. La mezcla de reaccion no homogenea de color marron se paralizo con agua, y se extrajo conEtOAc (3 x 300 ml). Las capas organicas combinadas se lavaron sucesivamente con NaHCO3 acuoso, con salmuera y se secaron sobre Na2 SO4 anhidro. La eliminacion del disolvente y la purificacion mediante purificacion cromatografica proporciono 5-[(4-nitrofenoxi)metil]-3-metil1,2,4-oxadiazol (1,62 g, 60%). RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,24 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 7,08 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 5,36 (s, 2H), 2,44 (s, 3H).Preparacion de 5-[(4-aminofenoxi)metil]-3-metil-1,2,4-oxadiazolDe la misma manera que para la preparacion de 5-[(4-aminofenoxi)metil]-3-fenil-1,2,4-oxadiazol, se hizo reaccionar 5-(4-nitrofenoximetil)-3-metil-1,2,4-oxadiazol con disolucion acuosa dehidrosulfito de sodio y K2 CO3 para preparar 5-[(4-aminofenox)imetil]-3-metil-1,2,4-oxadiazol. RMN 1 H (CDCl3 ): e 6,82 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 6,63 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 5,15 (s, 2H), 3,38 (br s,2H), 2,41 (s, 3H).
7.2.40
2-(4-Aminofenil)-2-metilpropionato de etilo 2-Metil-2-(4-nitrofenil)propionato de etilo Un matraz de reaccion seco cargado con 4-nitrofenilacetato de etilo (5,0 g, 23,89 mmoles),yodometano (8,48 g, 3,72 ml, 59,74 mmoles), 18-corona-6 (1,57 g, 5,93 mmoles) en THF seco(200 ml) se enfrio hasta -78°C en atmosfera de nitrogeno. Mientras se agita los contenidos, seanadio t-BuOK (5,90 g, 52,57 mmoles) en porciones. El precipitado violeta resultante se agito a-78°C durante 2 h, y se permito que los contenidos se calentasen hasta la temperaturaambiente. La reaccion se agito a temperatura ambiente durante 6 h. En este tiempo, nuevamente los contenido se enfriaron hasta -78°C, se anadio sucesivamente otra porcion deyodometano, t-BuOK, y 18-corona-6, y se agito a la misma temperatura durante 2 h. La reaccionse dejo calentar hasta la temperatura ambiente, y se agito toda la noche. La reaccion se paralizocon NH4 Cl satuado ac. (75 ml), la mezcla homogenea resultante se extrajo con eter (4 x 200 ml),se seco sobre Na2 SO4 anhidro, y se concentro. El concentrado se purifico mediantecromatografia en columna sobre gel de silice con 1% de EtOAc/hexanos para dar 2-metil-2-(4nitrofenil)propionato de etilo como un aceite amarillo palido (2,38, 42%). RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,17 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 7,49 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 4,12 (qt, 2H, J = 7,0 Hz), 1,60 (s, 6H), 1,17 (t, 3H, J
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
= 7,0 Hz).2-(4-aminofenil)-2-metilpropionato de etilo De la misma manera que para la preparacion de 4-aminofenoxiacetato de etilo, la hidrogenacion de 2-metil-2-(4-nitrofenil)propionato de etilo proporciono 2-(4-aminofenil)-2-metilpropionato de etilo. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,16 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 6,63 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 4,09 (qt, 2H, J = 7,0 Hz), 3,62 (br s, 2H), 1,52 (s, 6H), 1,17 (t, 3H, J = 7,0 Hz).
7.2.41
Anilinas sustituidas con restos de 1,3,4-oxadiazol N'1-(3-Clorobenzoil)-3-nitrobenceno-1-carbohidrazida A una disolucion de 3-clorobenzohidrazida (1 equivalente) y piridina (2 equivalentes) en CH2 Cl2 a 0°C se anadio a disolucion en CH2 Cl2 de cloruro de 3-nitrobenzoilo (1 equivalente), y se agitoa 0°C durante 1 h, y despues a temperatura ambiente toda la noche. La disolucion resultante seconcentro y se diluyo con agua, se basifico con NaHCO3 , el solido se filtro, se lavo con agua, seseco y se analizo para obtener N'1-(3-clorobenzoil)-3-nitrobenceno-1-carbohidrazida. RMN 1 H (DMSO-d6): e 10,99 (s, 1H), 10,79 (s, 1H), 8,73 (bs, 1H), 8,43 (bdd, 1H, J = 1,2 y 8,1 Hz), 8,33(bdd, 1J, J = 8,4 Hz), 7,95 (s, 1H), 7,87 (m, 2H), 7,67 (bdd, 1H, J = 1,2 y 8,1 Hz), 7,57 (t, 1H, J = 7,8 Hz); LCMS: pureza: 85%; MS (m/e): 320 (MH+ ). [2-(3-Clorofenil)-1,3,4-oxadiazol-5-il]-3-nitrobencenoUna suspension de N'1-(3-clorobenzoil)-3-nitrobenceno-1-carbohidrazida (0,321 g) en POCl3 (3ml) se agito a 90°C durante 24 h. La disolucion transparente resultante se paralizo con agua conhielo, el solido btenido se filtro, se lavo con agua, se seco y se analizo para dar [2-(3-clorofenil)1,3,4-oxadiazol-5-il]-3-nitrobenceno. RMN 1 H (DMSO-d6): e 8,86 (t, 1H, J = 1,8 Hz), 8,59 (dt, 1H,J = 1,8 y 8,4 Hz), 8,48 (m, 1H), 8,25 (t, 1H, J = 1,8 Hz), 8,16 (dt, 1H, J = 1,2 y 7,5 Hz), 7,93 (t,1H, J = 8,1 Hz), 7,75 (m, 1H), 7,66 (t, 1H, J = 7,5 Hz), LCMS: pureza: 86%; MS (m/e): 302(MH+).Reduccion de [2-(3-clorofenil)-1,3,4-oxadiazol-5-il]-3-nitrobenceno La hidrogenacion de [2-(3-clorofenil)-1,3,4-oxadiazol-5-il]-3-nitrobenceno (0,2 g) usando Pd al 10%/C (0,04 g) en MeOH (200 ml) a 15 PSI durante 1 h dio una mezcla de dos productos, asaber, 3-amino-[2-(3-clorofenil)-1,3,4-oxadiazol-5-il]benceno y 3-amino-(2-fenil-1,3,4-oxadiazol5-il)benceno, que se separaron mediante cromatografia en columna sobre gel de silice usandon-hexanos y despues n-hexanos: 5-10% de EtOAc como sistema disolvente. 3-Amino-[2-(3clorofenil)-1,3,4-oxadiazol-5-il]benceno: RMN 1 H (DMSO-d6): e 8,08 (m, 2H), 7,64 (m, 4H), 7,42(m, 1H), 7,10 (m, 1H); LCMS: pureza: 82%; MS (m/e): 272 (MH+ ). 3-Amino-(2-fenil-1,3,4oxadiazol-5-il)benceno: RMN 1 H (DMSO-d6): e 8,13 (m, 1H), 7,54 (m, 5H), 7,30 (m, 1H), 6,86
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
(dd, 1H, J = 1,5 y 8,1 Hz); LCMS: pureza: 93%; MS (m/e): 238 (MH+ ). N'1-(Etoxicarbonilmetilencabonil)-3-nitrobenceno-1-carbohidrazida De la misma manera que para la preparacion de N'1-(3-clorobenzoil)-3-nitrobenceno-1carbohidrazida, la reaccion de cloruro de 3-nitrobenzoilo con etoxicarbonilmetilencarbohidrazidadio N'1-(etoxicarbonilmetilencabonil)-3-nitrobenceno-1-carbohidrazida. RMN 1 H (CD3 OD): e 8,74 (m, 1H), 8,44 (dd, 1H, 1,8 y 8,1 Hz), 8,25 (bd, 1H, J = 8,4 Hz), 7,76 (t, 1H, J = 8,4 Hz), 4,22 (q,2H, J = 6,9 Hz), 3,44 (bs, 2H), 1,29 (t, 3H, J = 6,8 Hz); LCMS: pureza: 93%; MS (m/e): 296(MH+). [2-(Etoxicarbonilmetilen)-1,3,4-oxadiazol-5-il]-3-nitrobencenoDe la misma manera que para la preparacion de [2-(3-clorofenil)-1,3,4-oxadiazol-5-il]-3nitrobenceno, la reaccion de POCl3 con N'1-(etoxicarbonilmetilencabonil)-3-nitrobenceno-1carbohidrazida dio [2-(etoxicarbonilmetilen)-1,3,4-oxadiazol-5-il]-3-nitrobenceno. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,88 (t, 1H, J = 1,8 Hz), 8,42 (m, 2H), 7,74 (t, 1H, J = 7,5 Hz), 4,27 (q, 2H, J = 7,2 Hz),4,08 (s, 2H), 1,31 (t, 3H, J = 7,2 Hz); LCMS: pureza: 95%; MS (m/e): 278 (MH+ ).
7.2.42
Sintesis de (+)-5-Amino-(2,3-dihidro-2metoxicarbonil)benzofurano 2-Metoxicarbonil-5-nitrobenzofurano Una mezcla de 2-carboxi-5-nitrobenzofurano (2,0 g), MeOH (10 ml) y H2 SO4 concentrado (2,1ml) se calento en un tubo cerrado hermeticamente a 60°C durante 3 h. Al enfriar hasta latemperatura ambiente, se paralizo con agua con hielo y se basifico con cuidado con adicion deNaHCO3 . El solido obtenido se filtro, se lavo con agua, se seco y se analizo para dar 2metoxicarbonil-5-nitrobenzofurano. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,66 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 8,36 (dd, 1H, J = 2,4 y 9,6 Hz), 7,71 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 7,65 (s, 1H), 4,01 (s, 3H); LCMS: pureza: 97%; MS (m/e):222 (MH+). (+)-5-Amino-(2,3-dihidro-2-metoxicarbonil)benzofurano Una suspension de 2-metoxicarbonil-5-nitrobenzofurano (2,0 g), Pd al 10%/C (2,0 g), Na2 SO4 (2,0 g) en MeOH (500 ml) se hidrogeno a 55 PSI durante 3 dias. La disolucion resultante se filtroa traves de una almohadilla de celite, se concentro y se cromatografio usando n-hexanos ydespues 10%, 20% de EtOAc/n-hexanos para dar (+)-5-amino-(2,3-dihidro-2metoxicarbonil)benzofurano. RMN 1 H (CDCl3 ): e 6,69 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 6,56 (d, 1H, J = 1,2 Hz), 6,48 (dd, 1H, J = 1,8 y 7,5 Hz), 5,14 (dd, 1H, J = 6,6 y 7,2 Hz), 3,79 (s, 3H), 3,47 (dd, 1H, J= 10,5 y 10,8 Hz), 3,26 (dd, 1H, J = 7,2 y 6,6 Hz); LCMS: pureza: 100%; MS (m/e): 194 (MH+ ).
7.2.43
3-[1-Bis(etoxicarbonil)etoxi]anilina Preparacion de 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)malonato de dietilo
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
Se anadio 2-bromo-2-metilmalonato de dietilo (1,0 g, 3,95 mmoles) a una suspension agitada defluoruro de potasio (0,57 g, 9,8 mmoles) en DMF seca (5 ml). Despues de agitar durante 20 mina temperatura ambiente, se anadio 3-nitrofenol (0,55 g, 3,95 mmoles). La mezcla resultante seagito a 60°C durante 6 h, se enfrio hasta la temperatura ambiente, se diluyo con agua (30 ml) yse extrajo con acetato de etilo (3 X 200 ml). La capa organica se lavo con NaOH 1N ac. (2 X 75ml), se seco sobre Na2 SO4 anhidro, se filtro y se evaporo a vacio para dar 2-metil-2-(3nitrofenoxi)malonato de dietilo (0,89 g, 80%). RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,92 (dd, 1H, J = 2,3 y 8,2 Hz),7,82 (t, 1H, J = 2,3 Hz), 7,41 (t, 1H, J = 8,2 Hz), 7,30 (dd, 1H, J = 2,3 y 8,2 Hz), 4,28 (qt, 4H, J = 7,0 Hz), 1,81 (s, 3H), 1,26 (t, 6H, J = 7,0 Hz).Preparacion de 3-[1-Bis(etoxicarbonil)etoxi]anilina Se disolvio 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)malonato de dietilo (0,75 g, 2,40 mmoles) en tolueno:etanol(1:1, 100 ml), se transfirio a una botella de agitacion Parr que contiene Pd/C (0,15 g) y Na2 SO4anhidro (5,0 g) en presencia de atmosfera de nitrogeno. La mezcla resultante se trato conhidrogeno (30 PSI) hasta la desaparicion del 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)malonato de dietilo (2 h). Lamezcla se filtro a traves de celite, se cubrio con Na2 SO4 anhidro, seguido del lavado de laalmohadilla de celite con EtOAc. El filtrado se concentro y se seco a vacuo para dar 3-[1bis(etoxicarbonil)etoxi]anilina con rendimiento cuantitativo. RMN 1 H (CDCl3 ): e 6,98 (t, 1H, J = 8,2 Hz), 6,37-6,28 (m, 3H), 4,26 (qt, 4H, J = 7,0 Hz), 3,65 (br s, 2H), 1,72 (s, 3H), 1,24 (t, 6H, J = 7,0 Hz).
7.2.44
Preparacion de 4-(4-aminofenoximetil)-2metoxicarbonil-furano Preparacion de 4-(4-nitrofenoximetil)-2-metoxicarbonil-furanoSe puso a reflujo 3-nitrofenol (1,0 g, 7,19 mmoles), 5-(clorometil)-2-furoato de metilo (1,38 g,7,90 mmoles) y K2 CO3 anhidro (1,19 g, 8,60 mmoles) en acetona (30 ml) durante 8 h. La mezclade reaccion se enfrio y se diluyo con agua. El solido blanco resultante se filtro, se lavo con aguay se seco al aire toda la noche para dar 1,81 g (90%) del producto deseado. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,86 (dd, 1H, J = 2,3 y 8,2 Hz), 7,80 (t, 1H, J = 2,3 Hz), 7,45 (t, 1H, J = 8,2 Hz), 7,27 (dd, 1H, J = 2,3 y 8,2 Hz), 7,17 (d, 1H, J = 3,5 Hz), 6,58 (d, 1H, J = 3,5 Hz), 5,13 (s, 2H), 3,90 (s, 3H). Preparacion de 4-(4-aminofenoximetil)-2-metoxicarbonil-furanoDe la misma manera que para la reduccion de 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)malonato de dietilo, seredujo 4-(4-nitrofenoximetil)-2-metoxicarbonil-furano para proporcionar 4-(4-aminofenoximetil)-2metoxicarbonil-furano. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,15 (d, 1H, J = 3,5 Hz), 7,05 (t, 1H, J = 8,2 Hz), 6,50(d, 1H, J = 3,5 Hz), 6,37-6,27 (m, 3H), 5,01 (s, 2H), 3,89 (s, 3H).
7.2.45
Preparacion de 6-amino-1- Preparacion de 1-(metoxicarbonil)metil-6-nitroindazolina
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
(metoxicarbonil)metilindazolina
A una disolucion de 6-nitroindazolina (2,0 g, 12,25 mmoles) en DMF seca se anadio K2 CO3 anhidro (1,84 g, 13,31 mmoles) y 2-bromoacetato de metilo (2,04 g, 13,33 mmoles). La mezclaresultante se agito a temperatura ambiente durante 12 h. La mezcla de reaccion se paralizo conagua, y el solido resultante se recogio mediante filtracion, se lavo con agua en exceso, y se secoal aire. El solido amarillo recogido se purifico mediante cromatografia en columna sobre gel desilice usando un sistema de disolventes en gradiente para producir dos productos. Se recogio el producto deseado (1,12 g, 41%) con un valor de elevado en la TLC en 30% de EtOAc :hexanos.De la misma manera que para la reduccion de 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)malonato de dietilo, seredujo 1-(metoxicarbonil)metil-6-nitro-indazolina para dar 6-amino-1(metoxicarbonil)metilindazolina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,73 (d, 1H, J = 1,1 Hz), 7,35 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 6,49 (dd, 1H, J = 1,8 y 8,8 Hz), 6,39 (s, 1H), 5,34 (br s, 2H), 5,10 (s, 2H), 3,64 (s, 3H). Preparacion de 1-(metoxicarbonil)metil-5-nitroindazolinaDe la misma manera que para la preparacion de 1-(metoxicarbonil)metil-6-nitroindazolina, sepreparo 1-(metoxicarbonil)metil-5-nitroindazolina mediante alquilacion de 5-nitroindazolina con2-bromoacetato de metilo en presencia de K2 CO3 . El producto deseado (1,34 g, 46%) con valorde elevado en la TLC en 30% de EtOAc : hexanos se recogio mediante purificacion cromatografica en columna sobre gel de silice. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,75 (d, 1H, J = 1,8 Hz), 8,30(dd, 1H, J = 2,3 y 8,2 Hz), 8,26 (s, 1H), 7,40 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 5,22 (s, 2H), 3,78 (s, 3H). Preparacion de 5-amino-1-(metoxicarbonil)metilindazolina De la misma manera que para la reduccion de 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)malonato de dietilo, seredujo 1-(metoxicarbonil)metil-5-nitro-indazolina para proporcionar 5-amino-1(metoxicarbonil)metilindazolina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,84 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 7,15 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 6,95 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 6,88 (dd, 1H, J = 2,3 y 8,8 Hz), 5,09 (s, 2H), 3,73 (s, 3H). Preparacion de 1-(2-etoxicarboniletil)-6-nitroindazolina De la misma manera que para la preparacion de 1-(metoxicarbonil)metil-6-nitroindazolina, sepreparo 1-(etoxicarbonil)etil-6-nitroindazolina mediante alquilacion de 6-nitroindazolina con 3bromopropionato de etilo en presencia de K2 CO3 . El producto deseado (58%) con valro de elevado en la TLC en 30% de EtOAc : Hexanos se recogio mediante purificacion cromatograficaen columna sobre gel de silice. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,49 (s, 1H), 8,12 (s, 1H), 8,01 (dd, 1H, J = 1,7 y 8,8 Hz), 7,82 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 4,74 (t, 2H, J = 6,4 Hz), 4,09 (qt, 2H, J = 7,0 Hz), 3,03 (t,2H, J = 6,4 Hz), 1,18 (t, 3H, J = 7,0 Hz).
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
Preparacion de 6-amino-1-(2-etoxicarboniletil)indazolina De la misma manera que para la reduccion de 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)malonato de dietilo, se redujo 1-(2-etoxicarboniletil)-6-nitroindazolina para proporcionar 6-amino-1-(2etoxicarboniletil)indazolina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,81 (s, 1H), 7,46 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 6,60 (app s,1H), 6,55 (dd, 1H, J = 2,3 y 8,8 Hz), 4,51 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 4,11 (qt, 2H, J = 7,0 Hz), 3,52 (br s, 2H), 2,91 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 1,18 (t, 3H, J = 7,0 Hz). Preparacion de 1-(2-etoxicarboniletil)-5-nitroindazolina De la misma manera que para la preparacion de 1-(metoxicarbonil)metil-5-nitroindazolina, sepreparo 1-(etoxicarbonil)etil-5-nitroindazolina mediante alquilacion de 5-nitroindazolina con 3bromopropionato de etilo en presencia de K2 CO3 . El producto deseado (43%) con valor de Rfelevado en la TLC en 30% de EtOAc : Hexanos se recogio mediante purificacion cromatograficaen columna sobre gel de silice. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,70 (d, 1H, J = 1,7 Hz), 8,27 (dd, 1H, J = 2,3 y 8,8 Hz), 8,20 (d, 1H, J = 1,7 Hz), 7,59 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 4,70 (t, 2H, J = 6,4 Hz), 4,07 (qt, 2H,J = 7,0 Hz), 3,01 (t, 2H, J = 6,4 Hz), 1,16 (t, 3H, J = 7,0 Hz). Preparacion de 5-amino-1-(2-etoxicarboniletil)indazolina De la misma manera que para la reduccion de 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)malonato de dietilo, seredujo 1-(2-etoxicarboniletil)-5-nitroindazolina para proporcionar 5-amino-1-(2etoxicarboniletil)indazolina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,78 (s, 1H), 7,30 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 6,91 (d, 1H,J = 2,3 Hz), 6,87 (dd, 1H, J = 2,3 y 8,8 Hz), 4,59 (t, 2H, J = 6,4 Hz), 4,08 (qt, 2H, J = 7,0 Hz), 3,02 (br s, 2H), 2,92 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 1,16 (t, 3H, J = 7,0 Hz). Preparacion de 5-amino-2-metilindazolinaDe la misma manera que para la reduccion de 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)malonato de dietilo, seredujo 2-metil-5-nitroindazolina comercialmente disponible para proporcionar 5-amino-2metilindazolina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,61 (s, 1H), 7,53 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 6,81 (dd, 1H, J = 2,3 y 8,8 Hz), 6,75 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 4,13 (s, 3H), 3,85 (br s, 2H).
7.2.46
Preparacion de 3-metoxi-4-[(6-nitroindazol-1il)metil]benzoato de metilo De la misma manera que para la reduccion de 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)malonato de dietilo, seredujo 3-metoxi-4-[(6-nitroindazol-1-il)metil]benzoato de metilo para proporcionar 4-[(6aminoindazol-1-il)metil]benzoato de metilo. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,88 (s, 1H), 7,53 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 7,51 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 7,50 (d, 1H, J = 1,7 Hz), 6,67 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 6,56 (dd, 1H, J = 1,7 y 8,8 Hz), 6,45 (d, 1H, J = 1,2 Hz), 5,50 (s, 2H), 3,94 (s, 3H), 3,87 (s, 3H), 3,79 (br s, 2H).
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
Preparacion de 4-[(6-aminoindazol-2-il)metil]benzoato de metilo De la misma manera que para la reduccion de 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)malonato de dietilo, seredujo 3-metoxi-4-[(6-nitroindazol-2-il)metil]benzoato de metilo para proporcionar 4-[(6aminoindazol-2-il)metil]benzoato de metilo. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,78 (s, 1H), 7,56-7,53 (m, 2H), 7,43 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 6,98 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 6,81 (app s, 1H), 6,58 (dd, 1H, J = 1,8 y 8,8 Hz), 5,53 (s, 2H), 3,91 (s, 3H), 3,89 (s, 3H).
7.2.47
Preparacion de 6-amino-1-[2-metoxi-4-(atoluilsulfonamidocarboxi)-bencil]indazolina Preparacion de 6-nitro-1-[2-metoxi-4-(a-toluilsulfonamidocarboxi)-bencil]indazolina La hidrolisis del ester de 3-metoxi-4-[(6-nitroindazol-1-il)metil]benzoato de metilo en presenciade LiOH:H2 O produjo el acido correspondiente. El acido (1,65 g, 5,04 mmoles) asi formado seconvirtio en el cloruro de acido haciendolo reaccionar con SOCl2 (3,68 ml, 50,45 mmoles) a latemperatura de reflujo durante 5 h. La mezcla de reaccion se enfrio hasta la temperaturaambiente y se concentro a vacio. Al concentrado de cloruro de acido disuelto en CH2 Cl2 seco (75 ml), se anadieron sucesivamente a-toluilbencenosulfonamida (0,95 g, 5,54 mmoles) y 4(dimetilamino)-piridina (0,67 g, 5,54 mmoles) a temperatura ambiente, y se agito durante 12 h.La mezcla de reaccion se concentro, se disolvio en EtOAc (700 ml) y se trato sucesivamentecon HCl 2 N (2 X 100 ml), agua (150 ml) y salmuera (100 ml). El tratamiento habitual y la purificacion mediante cromatografia en columna sobre gel de silice proporciono el producto(1,57 g, 64%). RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 8,75 (s, 1H), 8,31 (s, 1H), 8,00 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 7,957,91 (m, 2H), 7,50 (d, 1H, J = 1,2 Hz), 7,46-7,27 (m, 4H), 6,92 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 5,76 (s, 2H),3,81 (s, 3H), 2,54 (s, 3H).Preparacion de 6-amino-1-[2-metoxi-4-(a-toluilsulfonamidocarboxi)-bencil]indazolina De la misma manera que para la reduccion de 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)malonato de dietilo, seredujo 6-nitro-1-[2-metoxi-4-(a-toluilsulfonamidocarboxi)bencil]indazolina para proporcionar 6amino-1-[2-metoxi-4-(a-toluilsulfonamidocarboxi)bencil]indazolina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,96 (dd, 1H, J = 1,2 y 8,2 Hz), 7,76 (s, 1H), 7,51 (d, 1H, J = 1,2 Hz), 7,49-7,44 (m, 1H), 7,37 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 7,34-7,32 (m, 1H), 7,30 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 6,51-6,47 (m, 2H), 6,35 (s, 1H), 5,35 (s, 2H),3,89 (s, 3H), 2,54 (s, 3H). Preparacion de 3-metoxi-4-[(5-nitroindazol-1-il)metil]benzoato de metiloDe la misma manera que para la preparacion de 3-metoxi-4-[(6-nitroindazol-1-il)metil]benzoatode metilo, se preparo 3-metoxi-4-[(5-nitroindazol-1-il)metil]benzoato de metilo mediante alquilacion de 5-nitroindazolina con (4-bromometil)-3-metoxibenzoato de metilo en presencia de K2 CO3 . El producto deseado (47%) con valor de elevado en la TLC en 30% de EtOAc : Hexanos como eluyente se recogio mediante purificacion cromatografica en columna sobre gel
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
de silice. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,73 (d, 1H, J = 1,8 Hz),8,26-8,22 (m, 2H), 7,56 (s, 1H), 7,54 (dd,1H, J = 1,8 y 8,2 Hz), 7,49 (d, 1H, J = 9,4 Hz), 6,98 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 5,66 (s, 2H), 3,91 (s, 3H),3,89 (s, 3H). bajo: 3-metoxi-4-[(5-nitroindazol-2-il)metil]benzoato de metilo. Preparacion de 5-nitro-1-[2-metoxi-4-(a-toluilsulfonamidocarboxi)-bencil]indazolina De la misma manera que para la preparacion de 6-nitro-1-[2-metoxi-4-(atoluilsulfonamidocarboxi)bencil]indazolina, se preparo 5-nitro-1-[2-metoxi-4-(atoluilsulfonamidocarboxi)bencil]indazolina a partir de 3-metoxi-4-[(5-nitroindazol-1il)metil]benzoato de metilo. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 8,81 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 8,39 (s, 1H), 8,21(dd, 1H, J = 1,8 y 8,8 Hz), 7,87 (dd, 2H, J = 3,6 y 8,8 Hz), 7,48 (d, 1H, J = 1,2 Hz), 7,39 (dd, 1H,J = 1,2 y 8,2 Hz), 7,33-7,15 (m, 3H), 6,85 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 5,65 (s, 2H), 3,76 (s, 3H), 2,49 (s,3H).Preparacion de 5-amino-1-[2-metoxi-4-( -toluil-sulfonamidocarboxi)bencil]indazolinaDe la misma manera que para la preparacion de 6-amino-1-[2-metoxi-4-(atoluilsulfonamidocarboxi)bencil]indazolina, se preparo 5-amino-1-[2-metoxi-4-(atoluilsulfonamidocarboxi)bencil]indazolina mediante reduccion de 5-nitro-1-[2-metoxi-4-(atoluilsulfonamidocarboxi)bencil]-indazolina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 7,87 (dd, 1H, J = 1,2 y 7,7 Hz), 7,73 (s, 1H), 7,50 (s, 1H), 7,35-7,14 (m, 5H), 6,78 (d, 1H, J = 1,8 Hz), 6,75 (s, 1H), 6,53 (d,1H, J = 8,2 Hz), 5,44 (s, 2H), 3,82 (s, 3H), 2,50 (s, 3H).
7.2.48
Preparacion de 8-amino-4 -imidazo[2,1-c][1,4]benzoxazina
7.3
Sintesis de 2,4-pirimidindiaminas Se sintetizo una variedad de 2,4-pirimidindiaminas de la invencion a partir de los materiales de partida e intermedios anteriores y otros reactivos comercialmente disponibles. Las condicionesadecuadas para sintetizar compuestos de N2,N4-bis-sustituida-2,4-pirimidindiamina (condiciones de reaccion "SNAr general"; Reaccion de Sustitucion Nucleofila Aromatica) seejemplifican con N2,N4-bis(4-etoxifenil)-2,4-pirimdindiamina (R926069) y N2,N4-bis(3hidroxifenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R921218). Las condiciones adecuadas para sintetizarN2,N4-disustituidas-2,4-pirimdindiaminas asimetricas se ejemplifican mediante N4-(3,4
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4-pirimidinadiamina (R926210).
7.3.908
N4-[(2,2-Dimetil-4H-5-pirido[1,4]oxazin-3-ona)-7-il]-5fluoro-N2-[3-(metilaminocarbonilmetilenoxi)fenil]-2,4pirimidindiamina (R940345) De la misma manera que para la preparacion de 5-fluoro-N2-[3(metilaminocarbonilmetilenoxi)fenil]-N4-(3-aminocarbonilfenil)-2,4-pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 2-cloro-N4-[(2,2-dimetil-4H-5-pirido[1,4]oxazin-3-ona)-7-il]-5-fluoro-4-pirimidinamina y3-(metilaminocarbonilmetilenoxi)anilina para dar N4-[(2,2-dimetil-4H-5-pirido[1,4]oxazin-3-ona)7-il]-5-fluoro-N2-[3-(metilaminocarbonilmetilenoxi)fenil]-2,4-pirimidindiamina R940345. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,23 (1H, s), 9,69 (1H, s), 9,54 (1H, s), 8,50 (1H, s), 8,25 (1H, d, 3,3 Hz), 8,06 (1H, m), 7,96 (1H, t, 2,5 Hz), 7,41-7,36 (2H, m), 7,24 (1H, t, 8,25 Hz), 6,34 (1H, d, 8,7 Hz), 4,47 (2H, s), 2,74 (3H, d, 3,3 Hz), 1,53 (6H, s); pureza: 98,4% ; MS (m/e): 468(MH+).
7.3.910
N4-[(2,2-Dimetil-4H-5-pirido[1,4]oxazin-3-ona)-6-il]-5fluoro-N2-[3-(metilaminocarbonilmetilenoxi)fenil]-2,4pirimidindiamina (R940347) De la misma manera que para la preparacion de 5-fluoro-N2-[3(metilaminocarbonilmetilenoxi)fenil]-N4-(3-aminocarbonilfenil)-2,4-pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 2-cloro-N4-[(2,2-dimetil-4H-5-pirido[1,4]oxazin-3-ona)-6-il]-5-fluoro-4-pirimidinamina y3-(metilaminocarbonilmetilenoxi)anilina para dar N4-[(2,2-dimetil-4H-5-pirido[1,4]oxazin-3-ona)6-il]-5-fluoro-N2-[3-(metilaminocarbonilmetilenoxi)fenil]-2,4-pirimidindiamina R940347. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,20 (1H, s), 9,46 (1H, s), 8,26 (1H, d, 3,6 Hz), 8,06 (1H, s), 7,71 (1H, m),7,49 (1H, d, 8,4 Hz), 7,45 (1H, s), 7,38 (1H, d, 9 Hz), 7,21 (1H, t, 8,1 Hz), 6,61 (1H, d,8,7 Hz), 4,47 (2H, s), 2,74 (3H, s), 1,52 (6H, s); pureza: 100% ; MS (m/e): 468 (MH+).
7.3.964
5-Fluoro-N2-(3-metilaminocarbonilmetilenoxifenil)N4-[2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona-7-il]-2,4pirimidindiamina (R945242) Se trato 2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona (500 mg) con acido nitrico (5 ml) y acido sulfurico(5 ml). La mezcla de reaccion se calento hasta 70°C durante 30 min, y despues se vertio enagua con hielo. La disolucion se neutralizo con bicarbonato de sodiohasta pH 6. La precipitacionamarilla se recogio mediante filtracion, se lavo con agua y se seco para dar una mezcla deproductos nitrados (regio-isomeros).La mezcla de compuesto nitrados se redujo en condiciones de hidrogenolisis usando Pd al 10%-C en metanol, a 40 psi durante 30 min. El catalizador se separo por filtracion. El filtrado seevaporo y se trato con 2,4-dicloro-5-fluoropirimidina (200 mg) en metanol (5 ml), agua (5 ml). Lamezcla de reaccion se calento a 70°C toda la noche, despues se evaporo. El residuo se hizoreaccionar con 3-metilaminocarbonilmetilenoxianilina (300 mg) en metanol (5 ml) y agua (1 ml) a100°C toda la noche. La mezcla de reaccion se diluyo con disolucion de HCl 1N (60 ml). Laprecipitacion marro se recogio mediante filtracion, se lavo con agua y se seco para dar 5-fluoroN2-(3-metilaminocarbonilmetilenoxifenil)-N4-[2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona-7-il]-2,4pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 2,62 (d, J = 4,8 Hz, 3H), 4,33 (s, 2H), 4,63 (s, 2H), 6,48(dd, J = 2,4 y 7,5 Hz, 1H), 7,11 (t, J = 8,1 Hz,1H), 7,27 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,36 (s, 1H), 7,86 (d, J= 2,1 Hz, 1H), 7,97 (m, 1H), 8,12 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 8,38 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 9,33 (s, 1H), 9,46 (s, 1H), 11,18 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 164,49; LCMS: tiempo de ret.: 13,16
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
min.; pureza: 79,30%; MS (m/e): 440,16 (MH+ ).
7.3.965
5-Fluoro-N2-(3-metilaminocarbonilmetilenoxifenil)N4-[2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-7-il]-2,4pirimidindiamina (R945263) 2H-Pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona (1 g, 6,66 mmoles) se puso a reflujo con complejo dehidruro de boro-sulfuro de metilo (2 ml) en THF (10 ml) durante 30 min para dar 2H-pirido[3,2-b]1,4-oxazina. De manera analoga a la preparacion de 5-fluoro-N2-(3metilaminocarbonilmetilenoxifenil)-N4-[2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona-7-il]-2,4pirimidindiamina, la 2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazina se nitro, se redujo y se hizo reaccionar con 2,4dicloro-5-fluoropirimidina (400 mg) y 3-metilaminocarbonilmetilenoxianilina (500 mg) para dar 5fluoro-N2-(3-metilaminocarbonilmetilenoxifenil)-N4-[2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-7-il]-2,4pirimidindiamina como un solido gris. RMN 1 H (CDCl3 ): e 2,91 (d, J = 4,8 Hz, 3H), 3,55 (t, J = 4,2 Hz, 2H), 4,24 (t, J = 4,5 Hz, 2H), 4,49 (s, 2H), 4,90 (br, 1H), 6,51 (dd, J = 2,7 y 8,1 Hz, 1H), 6,64(s,1H), 6,90 (dd, J = 2,1 y 8,1 Hz, 1H), 7,08 (s, 1H), 7,14 (br, 1H), 7,18 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 7,28(d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,51 (t, J = 2,1 Hz, 1H), 7,93 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 7,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H);LCMS: tiempo de ret.: 11,91 min.; pureza: 100%; MS (m/e): 426,12 (MH+ ).
7.3.966
5-Fluoro-N2-(3-metilaminocarbonilmetilenoxifenil)N4-[2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona-6-il]-2,4pirimidindiamina (R921304) 2H-Pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona (2,5 g) se disolvio en acido acetico (6 ml) y anhidridoacetico (30 ml). A la disolucion de la reaccion se anadio gota a gota acido nitrico fumante (3 ml),en un bano de hielo. La disolucion de la reaccion se agito en un bano de hielo toda la noche. Ladisolucion se vertio en hielo machacado. La precipitacion amarilla clara se recogio mediantefiltracion, se lavo con agua y se seco para dar una mezcla de productos nitrados (regiosiomeros). La mezcla se cristalizo en diclorometano para dar 6-nitro-2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona (1 g) como un solido amarillo claro. 6-Nitro-2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona (1 g) se redujo en condiciones de hidrogenolisis usando Pd al 10%-C en metanol (50 ml) y disolucion de HCl 1N (10 ml) a 50 psi durante 2 h. El catalizador se separo por filtracion y se lavo con metanol y Disolucion de HCl 1N. El filtrado se evaporo para dar 6-amino-2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona. De manera analoga a la preparacion de 5-fluoro-N2-(3-metilaminocarbonilmetilenoxifenil)-N4[2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona-7-il]-2,4-pirimidindiamina, se hizo reaccionar 6-amino-2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona con 2,4-dicloro-5-fluoropirimidina (500 mg) y 3metilaminocarbonilmetilenoxianilina (500 mg) para dar 5-fluoro-N2-(3metilaminocarbonilmetilenoxifenil)-N4-[2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona-6-il]-2,4pirimidindiamina como un solido beige. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 2,63 (d, J = 4,5 Hz, 3H), 4,35 (s,2H), 4,62 (s, 2H), 6,47 (dd, J = 1,8 y 8,1 Hz, 1H), 7,10 (t, J = 8,1 Hz,1H), 7,25 (d, J = 8,1 Hz, 1H),7,37 (m, 2H), 7,59 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,96 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 8,13 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,26 (s,1H), 9,29 (s, 1H), 11,13 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 163,20; LCMS: tiempo deret.: 25,22 min.; pureza: 97,55%; MS (m/e): 440,25 (MH+ ).
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
7.3.967
5-Fluoro-N2-(3-metilaminocarbonilmetilenoxifenil)N4-[2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-6-il]-2,4pirimidindiamina (R945299) 6-Nitro-2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona (500 mg) se puso a reflujo con complejo de hidruro de boro-sulfuro de metilo (1 ml) en THF (10 ml) durante 30 min para dar 6-nitro-2H-pirido[3,2-b]1,4-oxazina. De manera analoga a la preparacion de 5-fluoro-N2-(3metilaminocarbonilmetilenoxifenil)-N4-[2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona-7-il]-2,4pirimidindiamina, la 6-nitro-2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazina se redujo y se hizo reaccionar con 2,4dicloro-5-fluoropirimidina (500 mg) y 3-metilaminocarbonilmetilenoxianilina (500 mg) para dar 5fluoro-N2-(3-metilaminocarbonilmetilenoxifenil)-N4-[2H-pirido[3,2-b]-1,4-oxazin-6-il]-2,4pirimidindiamina como un solido gris. RMN 1 H (CD3 OD): e 2,81 (s, 3H), 3,48 (t, J = 4,5 Hz, 2H), 4,14 (t, J = 4,5 Hz, 2H), 4,44 (s, 2H), 6,60 (ddd, J = 1,5 y 2,7 y 7,5 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,14 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 7,17 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,42 (t, J = 2,1 Hz, 1H), 7,92 (d, J = 3,3 Hz, 1H); RMN 19 F (282 MHz, CD3 OD): e 168,20; LCMS: tiempo de ret.:25,49 min.; pureza: 97,56%; MS (m/e): 426,23 (MH+ ).
7.3.1100
Sintesis de intermedios, 2,4-pirimidindiaminas y2,4,6-pirimidinatriaminas segun los Esquemas VIII y IX Se sintetizo una variedad de intermedios y compuestos de 2,4-pirimidindiamina segun losEsquemas VIII y IX. El Esquema VIII se ejemplifica mediante la reaccion de 2,4,6tricloropirimidina con 3-hidroxianilina para formar una mezcla de tres compuestos, que sesepararon y se purificaron mediante cromatografia. El Esquema IX se ejemplifica mediante la reaccion de 2,4,5,6-tetracloridepirimidina con 3,4-etilendioxianilina para formar una mezcla detres compounds, que se separaron y se purificaron mediante cromatografia.
7.3.1101
Reaccion de 2,4,6-tricloropirimidina con 3hidroxianilina 4,6-Dicloro-N2-(3-hidroxifenil)-2pirimidinamina (R926407) N2,N4-Bis(3-hidroxifenil)6-cloro-2,4-pirimidindiamina (R926408) y N2,N4,N6Tris(3-hidroxifenil)-2,4,6-pirimidintriamina (R926409) Una mezcla de 2,4,6-tricloroanilina (0.183g, 1 mmol) y 3-hidroxianilina (0.327g, 3 mmoles) en 5ml de MeOH se calento a 100 oC en un vial cerrado durante 24h. La mezcla de reaccion sediluyo con H2O, se acidifico con HCl 2N y se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Con la eliminacion del disolvente, el residuo se purifico mediante cromatografia (asi como TLC preparativa) paradar tres productos, principalmente el mono-SNAr, 4,6-dicloro-N2-(3-hidroxifenil)-2-pirimidinamina(R926407),: RMN 1H (CDCl3): a 7,16 (t, 1H, J= 8,1 Hz), 6,78 (m,2H), 6,64 (dd, 1H, J= 1,2 y 8,1 Hz), 6,58 (s, 1H); LCMS: tiempo de ret.: 25,08 min.; pureza: 99%; MS (m/e): 256 (M+); productobis-SNAr, N2,N4-bis(3-hidroxifenil)-6-cloro-2,4-pirimidindiamina (R926408), RMN 1H (CD3OD): a7,21 (m, 1H), 7,14-7,03 (m, 5H), 6,50 (m, 1H), 6,44 (m, 1H), 6,16 (s, 1H); LCMS: tiempo deret.: 25,14 min.; pureza: 99%; MS (m/e): 329 (M+); y producto tris-SNAr, N2,N4,N6-tris(3hidroxifenil)-2,4,6-pirimidintriamina (R926409), RMN 1H (CD3OD): a 7,29 (m, 1H), 7,12-7,05 (m, 5H), 7,02 (m, 2H), 6,88 (dd, 2H, J= 1,2 y 8,1 Hz), 6,46 (dd, 1H,J=1,5 y 8,1 Hz),6,41 (dt, 1H); LCMS: tiempo de ret.:20,49 min.; pureza:94%; MS(m/e): 402 (MH+).
7.3.1102
N2,N4-Bis(4-metoxicarbonilmetilenoxifenil)-6-cloro2,4-pirimidindiamina(R926411) De manera similar a la reaccion de 2,4,6-tricloropirimidina con 3-hidroxianilina, la reaccion de 2,4,6-tricloropirimidina con 4-aminofenoxiacetato de metilo dio N2,N4-bis(4metoxicarbonilmetilenoxifenil)-6-cloro-2,4-pirimidindiamina. RMN 1H (CD3OD): a 7,65 (bs, 1H),7,40 (bd, 4H), 6,82 (bd, 4H), 6,00 (s, 1H), 6,62 (bs, 4H), 3,78 (bs, 6H); LCMS: tiempo de ret.:
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
29,87 min.; pureza: 98%; MS (m/e): 473 (MH+).
7.3.1103
Reaccion de 2,4,6-tricloropirimidina con 3,4etilendioxianilina 4,6-Dicloro-N2-(3,4-etilendioxifenil)2-pirimidinamina (R926515) N2,N4-Bis(3,4etilendioxifenil)-6-cloro-2,4-pirimidindiamina (R926245) N2,N4,N6-Tris(3,4-etilendioxifenil)-2,4,6pirimidintriamina (R926516) Una mezcla de 2,4,6-tricloroanilina (1 mmol) y 3,4-etilendioxianilina (3 mmol) en 5 ml de MeOHse calento a 100 oC en un vial cerrado durante 24h. La mezcla de reaccion se diluyo con H2O, se acidifico con HCl 2N y se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Con la eliminacion del disolvente, elresiduo se purifico mediante cromatografia (asi como TLC preparativa) para dar tres productos,principalmente el producto Mono-SNAr, 4,6-dicloro-N2-(3,4-etilendioxifenil)-2-pirimidinamina (R926515). RMN 1H (CD3OD): a 7,05 (s, 1H), 6,83 (m,2H), 6,45 (bs, 1H), 4,20 (bs, 4H); LCMS: tiempo de ret.: 29,75 min.; pureza: 96%; MS (m/e): 298 (M+); producto Bis-SNAr, N2,N4-bis(3,4etilendioxifenil)-6-cloro-2,4-pirimidindiamina (R926245): RMN 1H (CDCl3): a 7,23 (d, 1H, J= 3Hz), 6,90-6,70 (m, 6H), 6,02 (s, 1H),4,26 (bs, 4H), 4,23 (m, 4H); LCMS: tiempo de ret.: 31,34 min.; pureza: 95%; MS (m/e): 413 (MH+) y producto Tris-SNAr, N2,N4,N6-tris(3,4etilendioxifenil)-2,4,6-pirimidintriamina (R926516) RMN 1H (CD3OD): a 7,16 (d, 1H, J= 3Hz), 7,05 (bd, 1H), 6,99-6,90 (m, 3H), 6,80-6,70 (m, 4H), 6,03 (s, 1H), 4,22 (s, 4H), 4,20 (s, 8H); LCMS: tiempo de ret.: 27,72 min.; pureza: 61%; MS (m/e): 528 (M+).
7.3.1104
Reaccion de 2,4,6-tricloropirimidina con 4aminofenoxiacetato de etilo 4,6-dicloro-N2-(4etoxicarbonilmetil)-4,6-dicloro-2-pirimidinamina (R926549)2,6-dicloro-N4-(etoxicarbonilmetil)-4-pirimidinamina (R926550) Una mezcla de 2,4,6-tricloroanilina (1 mmoles) y 2-aminoacetato de etilo (3 mmoles) en 5 ml deMeOH se calento a 100°C en un vial cerrado hermeticamente, durante 24h. La mezcla dereaccion se diluyo con H2 O, se acidifico con HCl 2N y se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Aleliminar el disolvente, el residuo se purifico mediante cromatografia (asi como TLC preparativa)para dar tres productos, principalmente el producto de la mono-SNAr, 4,6-dicloro-N2-(4etoxicarbonilmetil)-4,6-dicloro-2-pirimidinamina (R926549). RMN 1 H (CDCl3 ): e 6,67 (s, 1H), 5,85(bs, 1H), 4,23 (q, 2H, J = 7,2 Hz), 4,19 (s, 2H), 1,29 (t, 3H, J = 7,2 Hz); LCMS: tiempo de ret.:26,18 min.; pureza: 100%; MS (m/e): 250 (MH+ ); y Mono-SNAr product, 2,6-dicloro-N4(etoxicarbonilmetil)-4-pirimidinamina (R926550):RMN 1 H (CDCl3 ): e 6,37 (bs, 1H), 4,28 (q, 2H, J= 6,9 Hz), 4,19 (bs, 2H), 1,31 (t, 3H, J = 7,2 Hz)
7.3.1105
6-Cloro-N2-(4-etoxicarbonilmetilenoxifenil)-N4(metoxicarbonilmetil)-2,4-pirimidindiamina (R926555) De manera similar a la preparacion de 4-[ester etilico de N-(L)-fenilalanina]-N2-(3-hidroxifenil)-5etoxicarbonil-2-pirimidinamina, la reaccion de 4-aminofenoxiacetato de etilo con 2-aminoacetatode metilo dio 6-cloro-N2-(4-etoxicarbonilmetilenoxifenil)-N4-(metoxicarbonilmetil)-2,4pirimidindiamina. RMN 1H (CD3OD): a 7,40 (d, 2H, J= 8,7 Hz), 6,86 (d, 2H, J= 9,3 Hz), 5,97 (s,1H), 4,64 (s, 2H), 4,26 (q, 2H, J= 7,2 Hz), 4,14 (q, 2H, J= 6,9 Hz), 4,05 9s, 2H), 1,25 (m, 6H);LCMS: tiempo de ret.: 26,.21 min.; pureza: 93%; MS (m/e): 409 (MH+).
7.3.1106
Reaccion de 3,4-etilendioxianilina con 2,4,5,6tetracloropirimidina. N4-(3,4-Etilendioxifenil)-2,5,6tricloro-4-pirimidinamina (R926466) N2,N4-Bis(3,4etilendioxifenil)-5,6-dicloro-2,4-pirimidindiamina (R926467) y N4,N6-Bis(3,4-etilendioxifenil)-2,5- Una mezcla de 3,4-etilendioxianilina (0.775 g, 5 mmoles) y 2,4,5,6-tetracloropirimidina (0.434 g,2 mmoles) en presencia de DIPEA (1,043 ml, 6 mmoles) en EtOAc (10 ml) se calento a 80 oCdurante 3 dias. La reaccion se diluyo con agua (50 ml), se acidifico (HCl 2N) y se extrajo conEtOAc (3 x 50 ml). El residuo obtenido tras la eliminacion se cromatografio usando 5-30% EtOAc/hexanos para obtener tres productos, a saber, N4-(3,4-Etilendioxifenil)-2,5,6-tricloro-4
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
dicloro-4,6-pirimidindiamina (R926468)
pirimidinamina (R926466): RMN 1H (CDCl3): a 7,18 (d, 1H, J= 2,7 Hz), 6,92 (dd, 1H, J= 2,1 and8,7 Hz), 6,87 (d, 1H, J= 9 Hz); LCMS: tiempo de ret.: 33,53 min.; pureza: 100%; MS (m/e): 292(MH+); N2,N4-Bis(3,4-etilendioxifenil)-5,6-dicloro-2,4-pirimidindiamina (R926467): RMN 1H (CDCl3): a 7,11 (d, 1H, J=2,4 Hz), 7,06 (d, 1H, J= 2,1 Hz), 7,04 (s, 1 HO, 6,94 (m, 2H), 6,84 (d,1H, J= 8,1 Hz), 6,76 (bd, 2H, J= 8,7 Hz), 4,27 (bs, 4H), 4,24 (bs, 1H); LCMS: tiempo de ret.:26,54 min.; pureza: 87%; MS (m/e): 364 (MH+); y N4,N6-Bis(3,4-etilendioxifenil)-2,5-dicloro-4,6pirimidindiamina (R926468): RMN 1H (CDCl3): a 7,07 (t, 1H, J= 2,4 Hz), 6,99 (s, 2H), 6,83 (dd,2H, J= 2,4 y 8,7 Hz), 6,75 (dd, 2H, J= 1,8 y 9 Hz), 4,19 (bs, 4H); LCMS: tiempo de ret.: 34,70min.; pureza: 99%; MS (m/e): 365 (MH+).
7.3.1107
Reaccion de 2,4,5,6-tetracloropirimidina con 4aminofenoxiacetato de etilo N4-(4Etoxicarbonilmetilenoxifenil)-2,5,6-tricloro-4pirimidinamina (R926568) N2,N4-Bis(4etoxicarbonilmetilenoxifenil)-5,6-dicloro-2,4pirimidindiamina (R926569) N2,N5-Bis(4etoxicarbonilmetilenoxifenil)-2,5-pirimidindiamina(R926570) De manera similar a la reaccion de 2,4,6-tricloropirimidina con 3,4-etilendioxianilina, la reaccionde 2,4,5,6-tetracloropirimidina con 4-aminofenoxiacetato de etilo dio una mezcla de productomono-SNAr, N4-(4-etoxicarbonilmetilenoxifenil)-2,5,6-tricloro-4-pirimidinamina (R926568): RMN1H NMR (CDCl3): a 7,46 (dd, 2H, J= 2,4 y 6,9 Hz), 7,3 (s, 1H), 6,95 (dd, 2H, J= 2,4 y 6,9 Hz), 4,63 (s, 2H), 4,28 (q, 2H, J= 7,2 Hz), 1,30 (t, 3H, J= 7,2 Hz); LCMS: tiempo de ret.: 30,62 min.;pureza: 99%; MS (m/e): 378 (MH+); producto Bis-SNAr, N2,N4-bis((4etoxicarbonilmetilenoxifenil)-5,6-dicloro-2,4-pirimidindiamina (R926569): RMN 1H (CDCl3): a7,42 (d, 2H, J= 9 Hz), 7,35 (d, 2H, J= 8,7 Hz), 6,90 (d, 2H, J= 9Hz), 6,83 (d, 2H, J= 8,7 Hz), 4,67(s, 2H), 4,60 (s, 2H), 4,28 (2q, 4H, J= 4,8 Hz), 1,31 (2t, 6H, J= 6,3 Hz); LCMS: tiempo de ret.: 33,09 min.; pureza: 85%; MS (m/e): 537 (MH+) y producto Bis-SNAr, N2,N5-bis((4etoxicarbonilmetilenoxifenil)-2,5-pirinidindiamina (R926570): RMN 1H (CDCl3): a 7,45 (d, 4H, J=8,7 Hz), 6,92 (d, 4H, J= 9Hz), 6,85 (s, 1H), 4,61 (s, 4H), 4,26 (q, 4H, J= 6,9 Hz), 1,30 (t, 6H, J=7,2 Hz); LCMS: tiempo de ret.: 31,66 min.; pureza: 97%; MS (m/e): 535 (MH+).
7.3.1108
Reaccion de 2,4,5,6-tetracloropirimidina con 4aminofenoxiacetato de terc-butilo, N4-(4-tercButoxioxicarbonilmetilenoxifenil)-2,5,6-tricloro-4pirimidinamina (R926575), N2,N4-Bis(4-tercbutoxioxicarbonilmetilenoxifenil)-5,6-dicloro-2,4pirimidindiamina (R926576) y N4,N6-Bis(4-tercbutoxioxicarbonilmetilenoxifenil)-2,5-dicloro-4,6pirimidindiamina (R926577) De manera similar a la reaccion de 2,4,6-tricloropirimidina con 3,4-etilendioxianilina, la reaccionde 2,4,5,6-tetracloropirimidina con 4-aminofenoxiacetato de terc-butilo dio una mezcla deproducto mono-SNAr, N4-(4-terc-butoxioxicarbonilmetilenoxifenil)-2,5,6-tricloro-4-pirimidinamina (R926575): RMN 1H (CDCl3): a 7,45 (dd, 2H, J= 2,4 y 7,2 Hz), 6,93 (dd, 2H, J= 2,4 and 7,2 Hz), 4,52 (s, 2H); LCMS: tiempo de ret.: 32,56 min.; pureza: 100%; MS (m/e): 402 (MH+); productoBis-SNAr, N2,N4-bis(4-terc-butoxioxicarbonilmetilenoxifenil)-5,6-dicloro-2,4-pirimidindiamina(R926576): RMN 1H (CDCl3): a 7,42 (d, 2H, J= 9 Hz), 7,35 (d, 2H, 9,3 Hz), 7,08 (s, 1H), 6,90 (d,2H, J= 9,3 Hz), 6,82 (d, 2H, J= 8,7 Hz), 4,53 (s, 2H), 4,49 (s, 2H), 1,50 (s, 9H), 1,49 (s, 9H);LCMS: tiempo de ret.: 36,04 min.; pureza: 92%; MS (m/e): 591 (MH+) y producto Bis-SNAr, N4,N6-bis(4-terc-butoxioxicarbonilmetilenoxifenil)-2,5-dicloro-4,6-pirimidindiamina (R926577):RMN 1H (CDCl3): a 7,43 (d, 4H, J= 8,7 Hz), 6,90 (dd, 4H, J= 9,3 Hz), 4,50 (s, 2H), 1,49 (s, 18H);LCMS: tiempo de ret.: 35,31 min.; pureza: 100%; MS (m/e): 591 (MH+).
7.3.1109
Reaccion de 2,4,5,6-tetracloropirimidina con 3hidroxianilina, N4-(3-Hidroxifenil)-2,5,6-tricloro-4- De manera similar a la reaccion de 2,4,6-tricloropirimidina con 3,4-etilendioxianilina, la reaccionde 2,4,5,6-tetracloropirimidina con 4-aminofenoxiacetato de terc-butilo dio una mezcla de
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
pirimidinamina (R926590), N2,N4- Bis(3-hidroxifenil)5,6-dicloro-2,4-pirimidindiamina (R926591) y N4,N6Bis(3-hidroxifenil)-2,5-dicloro-4,6-pirimidindiamina(R926592)
producto mono-SNAr, N4-(3-hidroxifenil)-2,5,6-tricloro-4-pirimidinamina (R926590): RMN 1H(CDCl3): a 7,38 (bs, 1H), 7,32 (t, 1H, J=2,4 Hz), 7,22 (s, 1H), 7,01 (dd, 1H, J= 1,2 y 8,1 Hz), 6,68(dd, 1H, J= 1,8 y 8,1 Hz); LCMS: tiempo de ret.: 26,09 min.; pureza: 99%; MS (m/e): 292 (MH+);producto Bis-SNAr, N2,N4-bis(3-hidroxifenil)-5,6-dicloro-2,4-pirimidindiamina (R926591): RMN 1H (CDCl3): a 7,45 (s, 1H), 7,30 (t, 1H, J= 2,4 Hz), 7,18 (t, 1H, J= 2,4 Hz), 7,07 (t, 1H, j= 6,6 Hz), 6,98 (t, 1H, J= 8,1 Hz), 6,75 (m, 2H), 6,54 (dd, 1H, J= 2,4 y 8,1 Hz); LCMS: tiempo de ret.: 26,54min.; pureza: 87%; MS (m/e): 364 (MH+); y producto Bis-SNAr, N4,N6-bis(3-hidroxifenil)-2,5dicloro-4,6-pirimidindiamina (R926592): RMN 1H (CDCl3): a 7,34 (t, 2H, j= 2,4 Hz), 7,21 (t, 2H, J= 7,5 Hz), 6,98 (m, 4H), 6,60 (m, 2H); LCMS: tiempo de ret.: 25,38 min.; pureza: 73%; MS (m/e): 364 (MH+).
Sintesis de anilinas
7.4.6
3-cloro-4-(metoxicarbonilmetilenoxi)nitrobenceno Un matraz de reaccion seco equipado con una barra de agitacion magnetica, condensador dereflujo y una entrada de N2 se cargo con un 2-cloro-4-nitrofenol comercialmente disponible (3,48g, 20 mmoles), K2 CO3 (3,03 g, 21,81 mmoles) y acetona seca (100 ml) en una atmosfera de N2 . Se anadio bromoacetato de metilo (1,72 ml, 18,18 mmoles) y se puso a reflujo durante 6 horas.Al enfriar, la mezcla de reaccion se diluyo con agua con hielo (1 litro), el solido obtenido se filtro,se lavo con agua (2 x 50 ml), y se seco para dar 3-cloro-4(metoxicarbonilmetilenoxi)nitrobenceno. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,33 (d, 1H, J = 3 Hz), 8,13 (dd, 1H,J = 2,7 y 9,3 Hz), 6,87 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 4,84 (s, 2H), 3,83 (s, 3H); LCMS: pureza: 87%; MS(m/e): 287 (M+ acetonitrilo).
7.4.7
3-cloro-4-(metoxicarbonilmetilenoxi)anilina A una disolucion de 3-cloro-4-(metoxicarbonilmetilenoxi)nitrobenceno (1,00 g) en MeOH (50 ml)se anadio 0,050 g de Pd al 10%/C, se desgasifico y se hidrogeno con un balon lleno dehidrogeno (aprox. 1 atmosfera) durante 2 horas. La mezcla de reaccion se filtro a traves de unaalmohadilla de celite, se concentro, y el residuo resultante se sometio entonces a ultrasonidoscon acetato de etilo y se filtro. El filtrado, al concentrarlo y secarlo a alto vacio, dio la 3-cloro-4(metoxicarbonilmetilenoxi)anilina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 6,79 (d, 1H, J = 9 Hz), 6,73 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 6,50 (dd, 1H, J = 2,7 y 9,3 Hz), 4,60 (s, 2H), 3,80 (s, 3H); LCMS: pureza: 87%; MS (m/e):216 (MH+).
7.4.8
3-cloro-4-(2-hidroxietilenoxi)nitrobenceno Un matraz de reaccion seco equipado con una barra de agitacion magnetica, una entrada de N2 y un tabique de caucho se cargo con 3-cloro-4-(metoxicarbonilmetilenoxi)nitrobenceno (1,23 g, 5mmoles) y CH2 Cl2 (50 ml) en una atmosfera de N2 . La disolucion de la reaccion se enfriohasta -78°C y se anadio hidruro de diisobutillitioaluminio (1,0 M en tolueno, 15 ml, 15 mmoles) a lo largo de un periodo de 15 minutos. La mezcla de reaccion se agito a -78°C durante 2 horas y atemperatura ambiente durante 1 hora, se paralizo con disolucion saturada de sal de Rochelle ynuevamente se agito durante 2 horas. La extraccion con CH2 Cl2 , secando sobre Na2 SO4 anhidro
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
y la evaporacion del disolvente dio 3-cloro-4-(2-hidroxietilenoxi)nitrobenceno. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,30 (d, 1H, J = 3 Hz). 8,15 (dd, 1H, J = 2,4 y 9 Hz), 7,02 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 4,25 (t, 2H, J = 4,8 Hz), 4,07 (m, 2H); LCMS: pureza: 92%.
7.4.9
3-cloro-4-(2-hidroxietilenoxi)anilina De la misma manera que para la preparacion de 3-cloro-4-(metoxicarbonilmetilenoxi)anilina, lahidrogenacion de 3-cloro-4(2-hidroxietilenoxi)nitrobenceno con balon lleno de hidrogeno (aprox. 1 atmosfera) en presencia de Pd al 10%/C como catalizador dio 3-cloro-4-[2hidroxietilenoxi)anilina. LCMS: MS (m/e): 187 (M+ )
7.4.10
2-(N-Metilaminocarbonil)-5-nitrobenzofurano Un matraz de reaccion seco equipado con una barra de agitacion magnetica, un tabique decaucho y una entrada de N2 se cargo con 2-carboxi-5-nitrobenzofurano (2,07 g, 10 mmoles),N,N-dimetilformamida (DMF) (0,100 ml) y CH2 Cl2 (50 ml) en una atmosfera de N2 . La mezcla dereaccion se enfrio hasta 0°C, y se le anadio cloruro de oxalilo [(COCl)2 ] (2,65 ml, 30 mmoles) alo largo de un periodo de 10 minutos. La mezcla resultante se agito durante 2 horas en elmomento en que la temperatura de 0°C se convirtio en la temperatura ambiente y tambien lareaccion se convirtio en una disolucion transparente. Se concentro y se seco a alto vacio paradar el cloruro de acido intermedio. El cloruro de acido se enfrio hasta 0°se le anadieron CH2 Cl2(50 ml), piridina (2,96 ml, 30 mmoles) seguido de sal de hidrocloruro de metilamina (1,34 g, 20mmoles). Al agitar durante 24 horas a temperatura ambiente, el disolvente se elimino a presion reducida y el residuo se suspendio en agua (200 ml). El solido formado se filtro, se lavo bien conagua y se seco para dar 2-(N-metilaminocarbonil)-5-nitrobenzofurano. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,63 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 8,33 (dd, 1H, J = 2,4 y 9,3 Hz), 7,60 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 7,59 (s, 1H), 3,07 (d,3H, J = 4,8 Hz); LCMS: pureza: 98%; MS (m/e): 221 (MH+ ).
7.4.11
(+)-5-Amino-[2-(N-metilaminocarbonil)-2,3dihidro]benzofurano Una suspension de 2-(N-metilaminocarbonil)-5-nitrobenzofurano (1,5 g), Pd al 10%/C (1,5 g),Na2 SO4 (1,5 g) en MeOH (200 ml) se hidrogeno a 55 PSI durante 3 dias. La disolucionresultante se filtro a traves de una almohadilla de celite, se concentro para dar (+)-5-amino-[2(N-metilaminocarbonil)-2,3-dihidro]benzofurano. RMN 1 H (CDCl3 ): e 6,65 (m, 2H), 6,53 (m, 1H),5,01 (dd, 1H, J = 6,0 y 6,6 Hz), 3,46 (dd, 1H, J = 9,9 y 10,2 Hz), 3,18 (dd, 1H, J = 6,0 y 4,2 Hz), 2,75 (d, 3H).
7.4.12
2-(N,N-Dimetilaminocarbonil)-5-nitrobenzofurano De la misma manera que para la preparacion de 2-(N-metilaminocarbonil)-5-nitrobenzofurano, lareaccion de 2-carboxi-5-nitrobenzofurano con cloruro de oxalilo seguido de la sal de dihidrocloruro de metilamina dio 2-(N,N-dimetilaminocarbonil)-5-nitrobenzofurano. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,61 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 8,31 (dd, 1H, J = 2,4 y 9,3 Hz), 7,63 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 7,409s, 1H), 3,35 (s, 3H), 3,17 (s, 3H); LCMS: pureza: 97%; MS (m/e): 235 (MH+ ).
7.4.13
(+)-5-Amino-[2-(N,N-dimetilaminocarbonil)-2,3dihidro]benzofurano De la misma manera que para la preparacion de (+)-5-amino-[2-(N-metilaminocarbonil)-2,3dihidro]benzofurano, la hidrogenacion de 2-(N,N-dimetilaminocarbonil)-5-nitrobenzofurano
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
produjo (+)-5-amino-[2-(N,N-dimetilaminocarbonil)-2,3-dihidro]benzofurano. RMN 1 H (DMSO-d6):e 6,44 (m, 2H), 6,27 (dd, 1H, J = 2,1 y 8,7 Hz), 5,42 (dd, 1H, J = 6,5 y 7,5 Hz), 4,54 (bd, J = 5,4 Hz), 3,23 (m, 2H), 2,83 (s, 3H), 2,82 (s, 3H); LCMS: pureza: 70%; MS (m/e): 207 (MH+ ).
7.4.14
2-[(1R,2S,5R)-Mentiloxicarbonil)-5-nitrobenzofurano De la misma manera que para la preparacion de 2-(N-metilaminocarbonil)-5-nitrobenzofurano, lareaccion de 2-carboxi-5-nitrobenzofurano con cloruro de oxalilo, seguido del tratamiento con(1R,2S,5R)-(-)-mentol dio 2-[(1R,2S,5R)-mentiloxicarbonil)-5-nitrobenzofurano. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,63 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 8,35 (dd, J = 2,4 y 8,7 Hz), 7,69 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 7,62 (s, 1H), 5,00(dt, 1H, J = 4,8 y 10,5 Hz), 2,14 (bd, 1H, J = 9,3 Hz), 1,95 (m, 1H), 1,76 (m, 2H), 1,56 (m, 3H),1,11 (m, 2H), 0,94 (d, 3H), 0,93 (d, 3H), 0,82 (d, 3H, J = 7,2 Hz); LCMS: pureza: 99,67%.
7.4.15
5-Amino-[2(R)-(1R,2S,5R)-mentiloxicarbonil-2,3dihidro]benzofurano De la misma manera que para la preparacion de (+)-5-amino-[2-(N-metilamino)carbonil]-2,3dihidrobenzofurano, la hidrogenacion de 2-[(1R,2S,5R)-mentiloxicarbonil)-5-nitrobenzofuranoprodujo una mezcla diatereomera de 5-amino-[2-(1R,2S,5R)-mentiloxicarbonil-2,3dihidro]benzofurano, a partir de la cual se aislo el 5-amino-[2(R)-(1R,2S,5R)-mentiloxicarbonil2,3-dihidro]benzofurano como un diastereomero cristalino usando el metodo de cristalizacion dedifusion en disolvente (CH2 Cl2 :n-n-hexanos). RMN 1 H (CDCl3 ): e 6,77 (bd, (1H), 6,73 (bs, 1H),6,68 (dd, 1H, J = 2,4 y 8,7 Hz), 5,11 (dd, 1H, J = 6,9 y 7,5 Hz), 4,76 (dt, 4,5 y 11,1 Hz), 3,49 (dd,1H, J = 9,9 y 10,5 Hz), 3,25 (dd, 1H, J = 7,2 y 7,8 Hz), 1,99 (bd, 1H), 1,86 (dpent, 1H, J = 3,0 y6,9 Hz), 1,70 (m, 1H), 1,66 (m, 1H), 1,46 (m, 2H), 1,02 (m, 1H). 0,90 (d, 3H, 7,2 Hz), 0,89 (d, 3H,J = 6,6 Hz), 0,75 (d, 3H, J = 6,9 Hz); MS (m/e): 318 (MH+ ). Metodo de difusion en disolvente: La molecula organica se disolvio en una cantidad mimina deCH2 Cl2 y el recipiente se coloco en un tarro que contiene anti-disolvente (n-hexanos), se coloco la tapa para evitar una perdida de disolvente y se les dejo equilibrar hasta que se observocristalizacion. Los cristales resultantes se aislaron mediante decantacion del disolvente.
7.4.16
3,5-dicloro-4-metoxianilina A una disolucion de 3,5-dicloro-4-metoxinitrobenceno comercialmente disponible (1,00 g, 4,5mmoles) en MeOH (100 ml) se anadio Pd al 10%/C (0,100 g), se desgasifico y se hidrogenousando un balon lleno de hidrogeno (aprox. 1 atmosfera) durante 2 horas. Con la filtracion atraves de celite y la concentracion dio 3,5-dicloro-4-metoxianilina, que se aislo como la sal dehidrocloruro de 3,5-dicloro-4-metoxianilina mediante acidificacion con una cantidad equivalentede HCl (4M, dioxano). Como alternativa, esta transformacion tambien se logro agitando 3,5dicloro-4-metoxinitrobenceno (1,00 g, 4,5 mmoles) con Na2 S2 O4 (3,91 g, 22,5 mmoles) y K2 CO3 (3,12 g, 22,5 mmoles) en MeOH:H2 O (50 ml, cada uno) a temperatura ambiente durante 24horas. La extraccion con acetato de etilo, seguido de la eliminacion del disolvente dio 3,5dicloro-4-metoxianilina. LCMS: pureza: 87%; MS (m/e): 233 (M+ acetonitrilo).
7.4.17
4-cloro-3-metoxianilina A una disolucion de 3,5-dicloro-4-metoxinitrobenceno comercialmente disponible (1,00 g, 4,5mmoles) en MeOH (100 ml) se anadio Pd al 10%/C (0,100 g), se desgasifico y se hidrogeno
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
usando un balon lleno de hidrogeno (aprox. 1 atmosfera) durante 2 horas. Con la filtracion atraves de celite y la concentracion dio 3,5-dicloro-4-metoxianilina, que se aislo como la sal dehidrocloruro de 3,5-dicloro-4-metoxianilina mediante acidificacion con una cantidad equivalentede HCl (4M, dioxano). Como alternativa, esta transformacion tambien se logro agitando 3,5dicloro-4-metoxinitrobenceno (1,00 g, 4,5 mmoles) con Na2 S2 O4 (3,91 g, 22,5 mmoles) y K2 CO3 (3,12 g, 22,5 mmoles) en MeOH:H2 O (50 ml, cada uno) a temperatura ambiente durante 24horas. La extraccion con acetato de etilo seguido de la eliminacion del disolvente dio 3,5-dicloro4-metoxianilina. LCMS: pureza: 87%; MS (m/e): 233 (M+ acetonitrilo).
7.4.18
4-cloro-3,5-dimetilanilina A una suspension de 4-cloro-3,5-dimetilnitrobenceno comercialmente disponible (0,185 g, 1mmol) en EtOH: H2 O (5 ml, each) a temperatura ambiente se anadio cloruro de amonio (0,265 g,5 mmoles) y polvo de hierro (0,280 g, 5 mmoles), se agito durante 5 minutos a temperaturaambiente seguido de 10 minutos a 60°C. Al enfriar hasta la temperatura ambiente, la mezcla dereaccion se filtro a traves de una almohadilla de celite, se lavo con etanol y el filtrado seconcentro. El residuo resultante se diluyo con agua, se saturo con cloruro de sodio y se extrajo con acetato de etilo. El disolvente organico se elimino a presion reducida para dar la 4-cloro-3,5dimetilanilina deseada. RMN 1 H (CDCl3 ): e 6,34 (s, 2H), 3,42 (bs, 2H), 2,20 (s, 6H); LCMS: pureza: 82%; MS: 156 (MH+ ).
7.4.19
3,4,5-Trimetilanilina De la misma manera que para la hidrogenacion de 3-(metoxicarbonilmetilenoxi)anilina, lahidrogenacion de 3,4,5-trimetilnitrobenceno comercialmente disponible dio 3,4,5-trimetilanilina.LCMS: pureza: 91%; MS (m/e): 136 (MH+ ).
Sintesis de anilinas y productos mono SNAr
7.4.91
2-Isopropoxi-5-nitropiridina Una disolucion de 2-bromo-5-nitropiridina (1,0 g, 4,9 mmoles), t-butoxido de potasio (6,9 ml, 6,9mmoles, disolucion 1N en THF), y alcohol isopropilico (75 ml) se calento a 75°C durante 2 dias.La mezcla de reaccion se concentro a vacio, y el residuo se suspendio en agua y se sometio aultrasonidos a temperatura ambiente durante varios minutos. El producto se recogio como unsolido bronceado mediante filtracion. RMN 1 H (CDCl3 ): e 9,06 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 8,31 (dd, J = 3,0 y 9,3 Hz, 1H), 6,73 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 5,43 (quintete, J = 5,7 Hz, 1H), y 1,37 (d, J = 6,3 Hz, 1H).
7.4.92
5-Amino-2-isopropoxipiridina De la misma manera que para la preparacion de 4-aminofenoxiacetato de etilo, se llevo a cabola hidrogenacion de 2-isopropoxi-5-nitropiridina para preparar 5-amino-2-isopropoxipiridina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,65 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 7,01 (dd, J = 3,0 y 8,7 Hz, 1H), 6,54 (d, J = 9,0 Hz, 1H),5,13 (quintete, J = 6,6 Hz, 1H), 3,20 (bs, 2H), y 1,32 (d, J = 6,6 Hz, 6H).
7.4.94
3-cloro-4-(N-morfolino)nitrobenceno Una mezcla de 2-cloro-4-fluoronitrobenceno (1,36 g, 7,72 mmoles) y morfolina (8,0 ml, 90
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
mmoles) se calento a 80°C durante 3 horas. La mezcla de reaccion se vertio en agua (150 ml) yel producto se recogio como un solido amarillo tras la filtracion. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,26 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 8,11 (dd, J = 3,0 ad 9,3 Hz, 1H), 7,05 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 3,91-3,87 (m, 4H), y 3,233,19 (m, 4H).
7.4.95
3-cloro-4-(N-morfolino)anilina A una disolucion de 3-cloro-4-(N-morfolino)nitrobenceno (1,0g, 4,1 mmoles) en etanol/agua (70ml, 2:1) se anadio polvo de hierro (1,4 g, 25 mmoles) seguido de NH4 Cl (0,46 g, 8,6 mmoles). Lamezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 10 minutos, y despues se calento a70°C durante 1,5 h. Tras enfriar hasta la temperatura ambiente, la mezcla de reaccion se filtro atraves de celite, y la torta del filtro se lavo con metanol. La concentracion del filtrado a vacio dioun solido blanco, que se disolvio en acetato de etilo y se lavo con NaHCO3 (aq) y salmuera. Lacapa organica se seco entonces (MgSO4 ), se filtro, y se concentro a vacio para dar el productocomo un solido blanco. RMN 1 H (CDCl3 ): e 6,98-6,91 (m, H), 6,82 (bs, 1H), 6,67-6,61 (m, 1H),3,90-3,82 (m, 4H), y 3,02-2,90 (m, 4H).
7.4.97
3-cloro-4-isopropoxinitrobenceno De la misma manera que para la preparacion de 2-isopropoxi-5-nitropiridina, se hizo reaccionar3-cloro-4-fluoronitrobenceno con isopropanol y t-butoxido de potasio para dar 3-cloro-4isopropoxinitrobenceno. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,26 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 8,11 (dd, J = 3,0 y 8,7 Hz,1H), 6,97 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 4,71 (quintete, J = 6,0 Hz, 1H), y 1,43 (d, J = 6,0 Hz, 6H).
7.4.98
3-cloro-4-isopropoxianilina De la misma manera que para la preparacion de 3-cloro-4-(N-morfolino)anilina, se redujo 3cloro-4-isopropoxinitrobenceno para dar 3-cloro-4-isopropoxianilina. RMN 1 H (DMSO-d ): e 6,80 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 6,59 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,43 (dd, J = 3,0, 8,7 Hz, 1H), 4,92 (bs, 2H), 4,24(quintete, J = 5,7 Hz, 1H), y 1,18 (d, J = 5,7 Hz, 6H).
7.4.100
5-Amino-2-(N,N-dimetilaminometil)benzofurano Se anadio complejo de borano-sulfuro de metilo (4,0 ml, 43 mmoles) a una suspension de 2[(N,N-dimetilamino)carbonil]-5-nitrobenzofurano (1,0 g, 43 mmoles) en THF anhidro (10 ml). Lamezcla de reaccion se calento a reflujo durante 3h. Al enfriar, el disolvente se elimino a vacio para dar un solido parecido a un gel. Se anadio gota a gota con cuidado metanol (50 ml) frio(0°C), y la mezcla resultante se calento a 80°C durante 30 min proporcionando una disolucionamarilla transparente. El disolvente se elimino a vacio, y el solido resultante se suspendio en metanol (50 ml), y se anadio HCl (1,5 ml, 4N en dioxano). Tras calentar a 80°C durante 30 min,el disolvente se elimino a presion reducida para dar un solido amorfo. El solido se disolvio enmetanol (20 ml), y se anadio amoniaco (2N en metanol) hasta que se puso basico. Se formo unprecipitado tras la dilucion con diclorometano (50 ml). La filtracion y la concentracion dieron 2(N,N-dimetilaminometil)-5-nitrobenzofurano bruto como un aceite amarillo (1,0 g), que se uso sinpurificacion adicional. A una suspension de 2-(N,N-dimetilaminometil)-5-nitrobenzofurano bruto(1,0 g) en metanol (desgasificado, 60 ml) se anadio Na2 S2 O4 (0,50 g) y Pd al 10%/C (100 mg).La mezcla de reaccion se agito en an atmosfera de H2 durante 10 h. Los solidos se eliminaron
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
mediante filtracion a traves de auxiliar de filtracion de Celite , y la torta del filtro se lavo variasveces con metanol. La concentracion dio un aceite amarillo oscuro. El producto, 5-amino-2-(N,Ndimetilaminometil)benzofurano, se obtuvo despues de la purificacion mediante cromatografia encolumna sobre gel de silice (fase movil: 0% a 5% metanol (que contiene 2N NH3 )/diclorometano). RMN 1 H (CD3 OD): e 7,24 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 6,91 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 6,76(dd, 1H, J = 2,4 y 8,7 Hz), 6,65 (s, 1H), 3,87 (s. 2H), 2,48 (s, 6H).
Bis-SNAr y reacciones subsiguientes
Sintesis de anilinas
7.4.139
2-cloro-6-metil-4-nitrofenol A una suspension de 6-metil-4-nitrofenol comercialmente disponible (5 g, 32,6 mmoles) en agua(300 ml) a temperatura ambiente se anadio N-clorosuccinimida (8,7 g, 32,6 mmoles) seguido deuna disolucion acuosa hidroxido de potasio 5N (13 ml, 65,2 mmoles). Despues de agitarla atemperatura ambiente durante 2 horas, la reaccion resultante se acidifico con HCl 2N (pH 2) yse extrajo con acetato de etilo (3 x 200 ml). La fase organica se separo, se lavo con salmuera,se seco (Na2 SO4 ), se concentro, y el residuo resultante se purifico mediante cromatografia ultrarrapida (EtOAc:n-hexanos 15 : 85; v/v) para dar 2-cloro-6-metil-4-nitrofenol (3,7 g, 60%).RMN 1 H (DMSO-d6): e 10,84 (1H, s), 8,20 (1H, d, J = 3,3 Hz), 8,13 (1H, dt, J = 2,7 Hz, J = 0,6 Hz), 2,39 (3H, s); LCMS: pureza: 96,69%.
7.4.140
4-Amino-2-cloro-6-metilfenol Se disolvio 2-cloro-6-metil-4-nitrofenol (2,5 g, 13,32 mmoles) en AcOH glacial (22 ml), y seanadio polvo de hierro (2,23 g, 40 mmoles). La mezcla se calento a 90°C con agitacionmecanica durante 2 horas, despues se enfrio hasta la temperatura ambiente y se diluyo conEtOAc (200 ml). La mezcla se filtro a traves de una almohadilla de Celite. El filtrado se lavo con salmuera, se seco (Na2 SO4 ) y se concentro a vacio. El residuo resultante se purifico mediante cromatografia sobre gel de silice con CH2 Cl2 para dar 4-amino-2-cloro-6-metilfenol (1,03 g,50%). RMN 1 H (DMSO-d6): e 8,02 (1H, d, J = 0,9 Hz), 6,47 (1H, d, J = 2,1 Hz), 6,38 (1H, d, J = 2,4 Hz), 4,74 (2H, s), 2,16 (3H, s).
7.4.141
3-cloro-4-metoxi-5-metilnitrobenceno A una disolucion de 2-cloro-6-metil-4-nitrofenol (1,2 g, 6,5 mmoles) en acetona (10 ml) se anadio carbonato de potasio (1,34 g, 9,75 mmoles) seguido de sulfato de dimetilo (1,33 ml, 7,8mmoles). La mezcla se agito a reflujo durante 2 horas. Se anadio hidroxido de amonio (1 ml), yla mezcla se calento a reflujo durante 30 minutos. La mezcla se enfrio hasta la temperaturaambiente, y el disolvente se elimino a vacio. El residuo se vertio en agua, se saturo con clorurode sodio, y el solido resultante se filtro para dar el 3-cloro-4-metoxi-5-metilnitrobenceno deseado(1,1 g, 84%). RMN 1 H (DMSO-d6): e 8,28 (1H, d, J = 2,7 Hz), 8,24 (1H, dt, J = 2,7 Hz, J = 0,75 Hz), 3,95 (3H, d, J = 0,9 Hz), 2,48 (3H, d, J = 0,9 Hz); LCMS: pureza: 98%.
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
7.4.142
3-cloro-4-metoxi-5-metilanilina Se disolvio 3-cloro-4-metoxi-5-metilnitrobenceno (1,1g, 5,4 mmoles) en AcOH glacial (9 ml), y se anadio polvo de hierro (0,917 g, 16,4 mmoles). La mezcla se calento a 90°C bajo una agitacion mecanica durante 2 horas, despues se enfrio hasta la temperatura ambiente y se diluyo conEtOAc (200 ml). La mezcla se filtro a traves de una almohadilla de Celite. El filtrado se lavo consalmuera, se seco (Na2 SO4 ) y se concentro a vacio. El residuo se purifico mediantecromatografia sobre gel de silice con CH2 Cl2 para dar 3-cloro-4-metoxi-5-metilanilina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 6,51 (1H, d, J = 2,7 Hz), 6,41 (1H, dd, J = 1,8 Hz, J = 0,9 Hz), 5,11 (2H, s), 3,68(3H, d, J = 0,9 Hz), 2,21 (3H, s); LCMS: pureza: 95%.
7.4.143
(+) 2-Etoxicarbonil-2-metil-6-nitro-3-oxo-4Hbenz[1,4]oxazina Una mezcla de fluoruro de potasio (KF) (1,8 g, 32,4 mmoles), DMF (10 ml), 2-bromo-2metilmalonato de dietilo (3,2 g, 12,9 mmoles), y 4-nitro-2-aminofenol (2 g, 12,9 mmoles) se agitodurante 16 horas, despues se vertio en agua, y se extrajo con EtOAc. El extracto se lavo consalmuera, se seco, y se concentro para dar (+) 2-etoxicarbonil-2-metil-6-nitro-3-oxo-4Hbenz[1,4]oxazina deseada, que se recristalizo en EtOH (2,2 g, 62%). RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,47 (1H, s), 7,99 (1H, dd, J = 9 Hz, J = 2,7 Hz), 7,85 (1H, d, J = 2,7 Hz), 7,36 (1H, d, J = 8,7 Hz), 4,23 (2H, q, J = 7 Hz), 1,85 (3H, s), 1,17 (3H, t, J = 7,2 Hz); LCMS: pureza: 98%; MS (m/e):281 (MH+).
7.4.144
(+) 6-Amino-2-etoxicarbonil-2-metil-3-oxo-4Hbenz[1,4]oxazina Una disolucion de (+) 2-etoxicarbonil-2-metil-6-nitro-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazina (0,5 g, 1,78mmoles) en metanol se hidrogeno a 30 PSI durante 1 hora en presencia de Pd al 10%/C (0,05 g,10% en peso). Despues de filtrar a traves de una almohadilla de Celite, el disolvente se eliminoa presion reducida para obtener (+) 6-amino-2-etoxicarbonil-2-metil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazina.RMN 1 H (DMSO-d6): e 10,73 (1H, s), 6,76 (1H, d, J = 12 Hz), 6,23-6,20 (2H, m), 5,0 (2H, s), 4,16(2H, q, J = 6,9 Hz), 1,69 (3H, s), 1,15 (3H, t, J = 6,9 Hz); LCMS: pureza: 99%; MS (m/e): 251(MH+).
7.4.145
3,5-Dimetil-4-metoxinitrobenceno A una disolucion de 2,6-dimetil-4-nitrofenol (1 g, 5,9 mmoles) en acetona (9 ml) se anadiocarbonato de potasio (1,22 g, 8,85 mmoles) seguido de sulfato de dimetilo (0,68 ml, 7,1mmoles). La mezcla se agito a reflujo durante 2 horas. Se anadio hidroxido de amonio (1 ml), yla mezcla se calento a reflujo durante 30 minutos adicionales. La mezcla se enfrio hasta latemperatura ambiente, y el disolvente se elimino a vacio. El residuo se vertio en agua, se saturocon cloruro de sodio y el solido resultante se filtro para dar el 3,5-dimetil-4-metoxinitrobenceno deseado. RMN 1 H (DMSO-d6): e 8,06 (2H, s), 3,84 (3H, s), 2,42 (6H, s); LCMS: pureza: 91%.
7.4.146
3,5-Dimetil-4-metoxianilina Una disolucion de 3,5-dimetil-4-metoxinitrobenceno (0,83 g, 4,5 mmoles) en metanol sehidrogeno a 30 PSI durante 1 hora en presencia de Pd al 10%/C (0,1 g, 10% en peso). Despues de filtrar a traves de una almohadilla de Celite, el disolvente se elimino a presion reducida paraobtener 3,5-dimetil-4-metoxianilina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 6,28 (2H, s), 4,69 (2H, anchos), 3,60
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
(3H, d, J = 0,9 Hz), 2,16 (6H, s); LCMS: pureza: 100%.
7.4.157
N4-(2,2-Dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-N2(3-cloro-4-metoxifenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina R940371 De la misma manera que para la preparacion de N2-(3-cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]-oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 2cloro-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina y 3-cloro-4metoxianilina para dar N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-N2-(3-cloro-4metoxifenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,20 (1H, s), 9,39 (1H, s),9,34 (1H, s), 8,22 (1H, d, J = 3,3 Hz), 7,90 (1H, s), 7,62-7,54 (2H, m), 7,47 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,08 (1H, d, J = 9 Hz), 3,87 (3H, s), 1,53 (6H, s); LCMS: pureza: 97,92%; MS (m/e): 445 (MH+ ).
7.4.158
N4-(2,2-Dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-N2(3,5-dimetoxifenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina R940372 De la misma manera que para la preparacion de N2-(3-cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]-oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 2cloro-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina y 3,5dimetoxianilina para dar N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-N2-(3,5-dimetoxifenil)-5fluoro-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,15 (1H, s), 9,34 (1H, s), 9,30 (1H, s), 8,23(1H, d, J = 3,3 Hz), 7,74 (1H, dd, J = 8,7 Hz, J = 3,9 Hz), 7,43 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,02 (2H, s),6,16 (1H, s), 3,75 (6H, s), 1,53 (6H, s); LCMS: pureza: 100%; MS (m/e): 441 (MH+ ).
7.4.159
N2-(3,4-diclorofenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiaminaR940373 De la misma manera que para la preparacion de N2-(3-cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]-oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 2cloro-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina y 3,4dicloroanilina para dar N2-(3,4-diclorofenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5fluoro-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,20 (1H, s), 9,68 (1H, s), 9,54 (1H, s), 8,27(1H, d, J = 3,6 Hz), 8,14 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,64 (1H, dd, J = 8,7 Hz, J = 2,1 Hz), 7,53-7,47 (3H, m), 1,53 (6H, s); LCMS: pureza: 100%; MS (m/e): 449 (M+ ).
7.4.160
N4-[(2,2-Dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5fluoro-N2-(indazolin-6-il)-2,4-pirimidindiamina R940380 De la misma manera que para la preparacion de N2-(3-cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 2cloro-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina y 6-aminoindazolpara dar N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(indazolin-6-il)-2,4pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,16 (1H, s), 9,48 (1H, s), 9,28 (1H, s), 8,27 (1H, d, J = 3,3 Hz), 8,17 (1H, s), 7,98 (1H, s), 7,84 (1H, m), 7,65 (1H, d, J = 9 Hz), 7,47 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,36 (1H, d, J = 8,7 Hz), 1,53 (6H, s); LCMS: pureza: 100%; MS (m/e): 421 (MH+ ).
7.4.161
N2-(3-terc-butilfenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiaminaR940381 De la misma manera que para la preparacion de N2-(3-cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 2cloro-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina y 3-terc� butilanilina para dar N2-(3-terc-butilfenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5fluoro-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,16 (1H, s), 9,27 (1H, s), 9,23 (1H, s), 8,22
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
(1H, d, J = 3,6 Hz), 7,74 (1H, m), 7,70 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,57 (1H, s), 7,44 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,205 (1H, t, J = 7,9 Hz), 7,01 (1H, d, J = 7,8 Hz), 1,53 (6H, s), 1,33 (9H, s); LCMS: pureza:100%; MS (m/e): 437 (MH+ ).
7.4.162
N4-[(2,2-Dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4-pirimidindiamina R940382 De la misma manera que para la preparacion de N2-(3-cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 2cloro-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina y 3-aminofenol para dar N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,16 (1H, s), 9,29 (1H, s), 9,25 (1H, s), 9,23 (1H, s),8,20 (1H, d, J = 3,6 Hz), 7,74 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,44 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,23 (1H, t, J = 1,25 Hz), 7,16 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,04 (1H, t, J = 7,9 Hz), 6,40 (1H, dd, J = 6,9 Hz, J = 1,2 Hz), 1,53(6H, s); LCMS: pureza: 100%; MS (m/e): 397 (MH+ ).
7.4.163
N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-N2(3-fluoro-4-metoxifenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina R940384 De la misma manera que para la preparacion de N2-(3-cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 2cloro-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina y 3-fluoro-4metoxianilina para dar N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-N2-(3-fluoro-4metoxifenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,20 (1H, s), 9,42 (1H, s),9,35 (1H, s), 8,21 (1H, d, J = 3,6 Hz), 7,75 (1H, dd, J = 14,4 Hz, J = 2,4 Hz), 7,56 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,46 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,37 (1H, d, J = 9,6 Hz), 7,08 (1H, t, J = 9,3 Hz), 3,85 (3H, s), 1,53(6H, s); LCMS: pureza: 97%; MS (m/e): 429 (MH+ ).
7.4.164
N2-(3-Clorofenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiaminaR940386 De la misma manera que para la preparacion de N2-(3-cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 2cloro-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina y 3-cloroanilina para dar N2-(3-clorofenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,10 (1H, s), 9,50 (1H, s), 9,43 (1H, s), 8,16 (1H, d, J = 3,3 Hz), 7,85 (1H, t, J = 1,95 Hz), 7,47 (2H, d, J =8,7 Hz), 7,38 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,18 (1H, t, J= 8,1 Hz), 6,89 (1H, ddd, J = 7,8 Hz, J = 2,1 Hz, J = 1,2 Hz), 1,43 (6H, s); LCMS: pureza: 100%;MS (m/e): 415 (MH+ ).
7.4.165
N2-(3,5-diclorofenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiaminaR940387 De la misma manera que para la preparacion de N2-(3-cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 2cloro-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina y 3,5dicloroanilina para dar N2-(3,5-diclorofenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5fluoro-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,10 (1H, s), 9,66 (1H, s), 9,49 (1H, s), 8,19(1H, m), 7,70 (2H, m), 7,39 (2H, m), 6,99 (1H, t. J = 1,95 Hz), 1,42 (6H, s); LCMS: pureza: 96%;MS (m/e): 450 (MH+ ).
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
7.4.166
N4-(2,2-Dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5fluoro-N2-(1-metilindazolin-6-il)-2,4-pirimidindiamina R940389 De la misma manera que para la preparacion de N2-(3-cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 2cloro-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina y 6-amino-1metilindazol para dar N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(1metilindazolin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,22 (1H, s), 9,60 (1H, s), 9,43(1H, s), 8,29 (1H, d, J = 3,6 Hz), 8,13 (1H, s), 7,95 (1H, s), 7,72 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,64 (1H, d, J= 9 Hz), 7,47 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,34 (1H, dd, J = 8,7 Hz, J = 1,8 Hz), 3,19 (3H, s), 1,53 (6H, s);LCMS: pureza: 100%; MS (m/e): 435 (MH+ ).
7.4.167
N2-(3-cloro-4-trifluorometoxifenil)-N4-(2,2-dimetil-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4pirimidindiamina R940390 De la misma manera que para la preparacion de N2-(3-cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 2cloro-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina y 3-cloro-4trifluorometoxianilina para dar N2-[3-cloro-4-trifluorometoxifenil]-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,24 (1H, s), 9,76(1H, s), 9,60 (1H, s), 8,28 (1H, d, J = 3,6 Hz), 8,14 (1H, d, J = 2,4 Hz), 7,70 (1H, dd, J = 9 Hz, J = 2,7 Hz), 7,54-7,43 (3H, m), 1,53 (6H, s); LCMS: pureza: 94,6%; MS (m/e): 499 (MH+ ).
7.4.168
N2-(3-cloro-4-metoxi-5-metilfenil)-N4-(2,2-dimetil-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4pirimidindiamina R940391 De la misma manera que para la preparacion de N2-(3-cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 2cloro-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina y 3-cloro-4metoxi-5-metilanilina para dar N2-(3-cloro-4-metoxi-5-metilfenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,20 (1H, s), 9,24(1H, s), 9,40 (1H, s), 8,23 (1H, dd, J = 3,3 Hz, J = 0,9 Hz), 7,76 (1H, d, J = 2,7 Hz), 7,61 (1H, d, J= 8,4 Hz), 7,47 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,42 (1H, d, J = 2,7 Hz), 3,76 (3H, d, J = 1,2 Hz), 2,27 (3H, s), 1,53 (6H, s); LCMS: pureza: 100%; MS (m/e): 459 (MH+ ).
7.4.169
N4-(2,2-Dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5fluoro-N2-(3-metoxicarbonilmetilenoxifenil)-2,4pirimidindiamina R940392 De la misma manera que para la preparacion de N2-(3-cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 2cloro-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina y 3(metoxicarbonilmetilenoxi)anilina para dar N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)5fluoro-N2-[3-metoxicarbonilmetilenoxifenil]-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,16 (1H, s), 9,36 (1H, s), 9,34 (1H, s), 8,23 (1H, d, J = 3,3 Hz), 7,69 (1H, d, J = 8,7 Hz), 7,47 (1H, d, J= 8,7 Hz), 7,42 (1H, s), 7,37 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,17 (1H, t, J = 8,1 Hz), 6,53 (1H, dd, J = 8,4 Hz, J = 2,4 Hz), 4,78 (2H, s), 3,79 (3H, s), 1,53 (6H, s); LCMS: pureza: 94,69%; MS (m/e): 469(MH+).
7.4.171
N2-(3-cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2-dimetil-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4- De la misma manera que para la preparacion de N2-(3-cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 2cloro-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina y 4-amino-2
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
pirimidindiamina R940394
cloro-6-metilfenol para dar N2-(3-cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,16 (1H, s), 9,27(1H, s), 9,15 (1H, s), 8,67 (1H, s), 8,19 (1H, d, J = 3,6 Hz), 7,64 (2H, m), 7,42 (1H, d, J = 8,4 Hz),7,29 (1H, d, J = 2,7 Hz), 2,22 (3H, s), 1,53 (6H, s); LCMS: pureza: 97,69%; MS (m/e): 444 (M+ ).
7.4.172
N2-(3,5-Dimetil-4-metoxifenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4pirimidindiamina R940395 De la misma manera que para la preparacion de N2-(3-cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 2cloro-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina y 3,5-dimetil-4metoxianilina para dar N2-(3,5-dimetil-4-metoxifenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 11,16 (1H, s), 9,23 (1H, s), 9,11 (1H,s), 8,19 (1H, d, J = 3,6 Hz), 7,69 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,44 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,33 (2H, s), 3,68(3H, s), 2,23 (6H, s), 1,53 (6H, s); LCMS: pureza: 99%; MS (m/e): 439 (MH+ ).
7.4.181
(+) 4-(N-terc-butoxicarbonil)amino-6-nitro-1benzopirano Una disolucion de (+) 4-amino-6-nitro-1-benzopirano en dioxano-agua se trato con bicarbonatode terc-butilo y bicarbonato de sodio. La mezcla se agito durante 2 horas a 0°C y se diluyo conhexano. La mezcla se filtro, y los solidos que quedan se lavaron con cuidado con hexano y sesecaron a presion reducida para dar (+) 4-(N-terc-butoxicarbonil)amino-6-nitro-1-benzopiranocomo un solido amarillo palido. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,23 (d, 1H, J = 2,7 Hz), 8,04 (dd, 1H, J = 2,7, 9,6 Hz), 6,88 (d, 1H, J = 9,6 Hz), 4,89 (bs, 1H), 4,81 (bs, 1H), 4,26-4,38 (m, 2H), 2,03-2,26 (m, 2H).
7.4.184
(+) 4-(N-terc-butoxicarbonil-N-metil)amino-6-nitro-1benzopirano Una disolucion de 4-amino-6-nitro-1-benzopirano en THF se trato con hidruro de sodio seguidode yoduro de metilo. La mezcla se agito durante 24 horas a 0°C. La mezcla se diluyo con agua yse extrajo con diclorometano. La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio y seconcentro a presion reducida para dar (+) 4-(N-terc-butoxicarbonil-N-metil)amino-6-nitro-1benzopirano como un solido amarillo palido. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,98 (dd, 1H, J = 3,4, 9,3 Hz),7,90 (bs, 1H), 6,82 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 5,65 (bs, 1H), 4,18-4,44 (m, 2H), 1,98-2,06 (m, 2H), 2,55(s, 3H).
7.4.188
(+) 4-(N-Acetil)amino-6-nitro-1-benzopirano Una disolucion de 4-hidroxi-6-nitro-1-benzopirano en acetonitrilo seco se trato con acido sulfurico concentrado. La mezcla se agito durante 1 hora a 22°C para dar (+) 4-(N-acetil)amino6-nitro-1-benzopirano comoun precipitado parduzco palido, que se separo por filtracion y seseco. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,13 (d, 1H, J = 2,8 Hz), 8,04 (dd, 1H, J = 2,8, 8,7 Hz), 6,88 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 5,87 (bs, 1H), 5,17-5,24 (m, 1H), 4,25-4,39 (m, 2H), 2,04-2,26 (m, 2H), 2,08 (s, 3H).
7.4.189
(+) 4-Amino-6-nitro-1-benzopirano Una disolucion de (+) 4-(N-acetil)amino-6-nitro-1-benzopirano en HCl concentrado se puso areflujo durante 16 horas. La mezcla de reaccion se concentro hasta sequedad a presionreducida y se basifico mediante adicion de carbonato de potasio. Se anadio agua, y la faseacuosa se extrajo con cloruro de metileno y se seco sobre sulfato de magnesio. La eliminacion
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
de los volatiles a presion reducida dio (+) 4-amino-6-nitro-1-benzopirano como un solidoamarillo, que se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,23 (d, 1H, J = 3,0 Hz), 7,96 (dd, 1H, J = 3,0, 9,0 Hz), 6,80 (d, 1H, J = 9,0 Hz), 4,04-4,41 (m, 3H), 1,782,14 (m, 2H).
7.4.190
Sal del acido (L)-(+)-tartarico de (S)-4-Amino-6-nitro1-benzopirano Una disolucion de (+)-4-amino-6-nitro-1-benzopirano en etanol-agua se trato con acido L-(+)tartarico y se calento para dar una disolucion transparente. La mezcla se mantuvo durante 3dias a 22°C, y el precipitado resultante se filtro y se lavo cuidadosamente con etanol para dar saldel acido (L)-(+)-tartarico de (S)-4-amino-6-nitrobenzo-1-pirano enantiomericamente pura. RMN1 H (DMSO-d6): e 8,44 (d, 1H, J = 2,7 Hz), 8,08 (dd, 1H, J = 2,7, 9,3 Hz), 7,01 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 4,32-4,39 (m, 3H), 3,97 (s, 2H), 1,90-2,26 (m, 2H).
7.4.191
Sal del acido (D)-(-)-tartarico de (R)-4-Amino-6-nitro1-benzopirano Una disolucion de (+)-4-amino-6-nitrobenzopirano en etanol-agua se trato con acido D-(-)tartarico y se calento para dar una disolucion transparente. La mezcla se mantuvo durante 3dias a 22°C, y el precipitado resultante se filtro y se lavo cuidadosamente con etanol para dar saldel acido (D)-(-)-tartarico de (R)-4-amino-6-nitro-1-benzopirano enantiomericamente pura. RMN1 H (DMSO-d6): e 8,44 (d, 1H, J = 2,7 Hz), 8,08 (dd, 1H, J = 2,7, 9,3 Hz), 7,01 (d, 1H, J = 9,3 Hz), 4,32-4,39 (m, 3H), 3,97 (s, 2H), 1,90-2,26 (m, 2H).
7.4.281
N2-[3-(N-Ciclobutilamino)carbonilmetilenoxifenil]-5fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4pirimidindiamina (R945389) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3-(N-ciclobutilaminocarbonilmetilenoxi)anilina (100 mg)y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2[3-(N-ciclobutilamino)carbonilmetilenoxifenil]-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 1,53-1,65 (m, 2H), 1,90-2,03 (m, 2H), 2,07-2,17 (m, 2H), 4,25 (q, J = 8,1 Hz, 1H), 4,32 (s, 2H), 4,61 (s, 2H), 6,46 (dd, J = 1,8 y 8,1 Hz, 1H), 7,10 (t, J= 8,1 Hz,1H), 7,23 (dd, J = 0,9 y 8,4 Hz, 1H), 7,38 (m, 2H), 7,60 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 8,13 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 8,22 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 9,23 (s, 1H), 9,26 (s, 1H), 11,12 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 163,26; LCMS: tiempo de ret.: 9,98 min.; pureza: 92,21%; MS (m/e): 480,25(MH+).
7.4.282
N2-[3-(N-Ciclopropilamino)carbonilmetilenoxifenil]-5fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4pirimidindiamina (R945390) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3-(N-ciclopropilaminocarbonilmetilenoxi)anilina (100 mg)y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2[3-(N-ciclopropilamino)carbonilmetilenoxifenil]-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 0,47 (m, 2H), 0,61 (m, 2H), 2,66 (m, J = 3,6 Hz, 1H), 4,32 (s, 2H), 4,62 (s, 2H), 6,44 (dd, J = 2,4 y 7,5 Hz, 1H), 7,09 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 7,22 (dd, J = 0,9 y 8,1 Hz, 1H), 7,37 (m, 2H), 7,59 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 8,13 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,22 (s, 1H), 9,26 (s, 1H), 11,12 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 163,27;
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
LCMS: tiempo de ret.: 8,89 min.; pureza: 83,29%; MS (m/e): 466,24 (MH+ ).
7.4.283
N2-[4-(4-Acetilpiperazino)fenil]-5-fluoro-N4-(2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945391) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-(4-acetilpiperazino)anilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoroN4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-[4-(4acetilpiperazino)fenil]-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina.RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 2,02 (s, 3H), 2,96 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 3,02 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 3,55 (br,4H), 4,62 (s, 2H), 6,84 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,36 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,48 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,57(d, J = 8,7 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,01 (s, 1H), 9,13 (s, 1H), 11,14 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 164,84; LCMS: tiempo de ret.: 7,29 min.; pureza: 88,46%; MS (m/e):479,27 (MH+).
7.4.284
5-Fluoro-N2-[4-(4-metoxicarbonilpiperazino)fenil]-N4(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4pirimidindiamina (R945392) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-(4-metoxicarbonilpiperazino)anilina (100 mg) y 2cloro-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar 5fluoro-N2-[4-(4-metoxicarbonilpiperazino)fenil]-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]-oxazin-6-il)-2,4pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 2,98 (t, J = 5,1 Hz, 4H), 3,48 (t, J = 5,1 Hz, 4H), 3,60 (s,3H), 4,62 (s, 2H), 6,83 (d, J = 9,3 Hz, 2H), 7,36 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,47 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,56(d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,01 (s, 1H), 9,13 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz,DMSO-d6 ): e -164,84; LCMS: tiempo de ret.: 8,61 min.; pureza: 83,00%; MS (m/e): 495,25(MH+).
7.4.290
N2-(3,4-diclorofenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945398) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3,4-dicloroanilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-(3,4-diclorofenil)-5-fluoroN4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 4,63 (s, 2H), 7,39-7,42 (m, 3H), 7,52 (dd, J = 2,4 y 8,7 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 8,18 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,46 (s, 1H), 9,59 (s, 1H), 11,17 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 162,48; LCMS: tiempo de ret.: 13,30 min.; pureza: 90,24%; MS (m/e): 421,07 (MH+ ).
7.4.291
N2-(3-cloro-4-metoxifenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945399) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3-cloro-4-metoxianilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-(3-cloro-4metoxifenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 3,76 (s, 3H), 4,62 (s, 2H), 7,00 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,47(m, 2H), 7,80 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 8,12 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 9,22 (s, 1H), 9,27 (s, 1H), 11,15 (s,1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e -163,98; LCMS: tiempo de ret.: 10,38 min.; pureza:91,61%; MS (m/e): 417,14 (MH+ ).
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
7.4.292
N2-(3,5-dicloro-4-metoxifenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945400) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3,5-dicloro-4-metoxianilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoroN4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-(3,5-dicloro-4metoxifenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 3,72 (s, 3H), 4,55 (s, 2H), 7,30 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,75(s, 2H), 8,14 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,48 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e - 162,65.
7.4.293
N2-(3,5-dimetoxifenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945401) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3,5-dimetoxianilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-(3,5-dimetoxifenil)-5fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 3,64 (s, 6H), 4,62 (s, 2H), 6,06 (t, J = 2,4 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 2,4 Hz, 2H), 7,32 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,60 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 8,13 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,18 (s, 1H), 9,24 (s, 1H), 11,11 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e -163,28; LCMS: tiempo de ret.: 10,41 min.; pureza: 97,00%; MS(m/e): 413,19 (MH+ ).
7.4.294
5-Fluoro-N2-(3-fluoro-4-metoxifenil)-N4-(2H-3-oxo4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945402) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3-fluoro-4-metoxianilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar 5-fluoro-N2-(3-fluoro-4metoxifenil)-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e3,75 (s, 3H), 4,62 (s, 2H), 6,99 (t, J = 9,3 Hz, 1H), 7,26 (dd, J = 2,4 y 9,0 Hz, 1H), 7,36 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,45 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,66 (dd, J = 2,7 y 14,4 Hz, 1H), 8,11 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 9,24(s, 1H), 9,32 (s, 1H), 11,15 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 163,98, -134,90; LCMS: tiempo de ret.: 9,84 min.; pureza: 93,66%; MS (m/e): 401,18 (MH+ ).
7.4.296
5-Fluoro-N2-(4-metoxifenil)-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945404) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-metoxianilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar 5-fluoro-N2-(4-metoxifenil)-N4(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 3,69 (s, 3H),4,63 (s, 2H), 6,79 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,53 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 9,05 (s, 1H), 9,18 (s, 1H), 11,13 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 175,00; LCMS: tiempo de ret.: 8,85 min.; pureza: 100%; MS (m/e): 383,25 (MH+).
7.4.297
N2-(3,4-Etilendioxifenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945405) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3,4-etilendioxianilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-(3,4-etilendioxifenil)-5fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 4,16 (q, J = 2,1 Hz, 4H), 4,62 (s, 2H), 6,67 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 6,98 (dd, J = 2,4 y 9,0 Hz, 1H), 7,27 (d,
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
J = 2,4 Hz, 1H), 7,34 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,53 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,05(s, 1H), 9,21 (s, 1H), 11,11 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 174,73; LCMS: tiempo deret.: 8,94 min.; pureza: 97,69%; MS (m/e): 411,26 (MH+ ).
7.4.298
5-Fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-N2(4-trifluorometoxifenil)-2,4-pirimidindiamina (R945406) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-trifluorometoxianilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar 5-fluoro-N4-(2H-3-oxo4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-N2-(4-trifluorometoxifenil)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 4,64 (s, 2H), 7,18 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,38 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,47 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,73 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 8,14 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 9,38 (s, 1H), 9,45 (s, 1H), 11,18 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 173,29, -68,81; LCMS: tiempo de ret.: 12,95 min.; pureza: 100%; MS (m/e):437,25 (MH+).
7.4.299
N2-(4-Etoxifenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945407) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-etoxianilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-(4-etoxifenil)-5-fluoro-N4-(2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 1,30 (t, J = 6,9 Hz,3H), 3,94 (q, J = 6,9 Hz, 2H), 4,63 (s, 2H), 6,77 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,36 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,48(d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,54 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,04 (s, 1H), 9,17 (s, 1H), 11,14 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e -175,00; LCMS: tiempo de ret.: 9,87 min.;pureza: 90,82%; MS (m/e): 397,28 (MH+ ).
7.4.300
N2-(4-Butoxifenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945408) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-butoxianilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-(4-butoxifenil)-5-fluoro-N4(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 0,93 (t, J = 7,5 Hz, 3H), 1,42 (hept, J = 7,5 Hz, 2H), 1,66 (p, J = 6,9 Hz, 2H), 3,89 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 4,62 (s,2H), 6,78 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,48 (d, J = 9,3 Hz, 2H), 7,54 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,04 (s, 1H), 9,17 (s, 1H), 11,14 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e -175,02; LCMS: tiempo de ret.: 12,12 min.; pureza: 95,36%; MS (m/e): 425,31(MH+).
7.4.301
5-Fluoro-N2-(4-fenoxifenil)-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945409) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-fenoxianilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar 5-fluoro-N2-(4-fenoxifenil)-N4(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 4,60 (s, 2H),6,91 (d, J = 9,0 Hz, 4H), 7,05 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,32 (m, 3H), 7,52 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,63 (d, J= 9,0 Hz, 2H), 8,10 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,27 (s, 2H), 11,14 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
d6 ): e - 174,19; LCMS: tiempo de ret.: 12,69 min.; pureza: 100%; MS (m/e): 445,27 (MH+ ).
7.4.302
N2-(4-Benciloxifenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945410) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-benciloxianilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-(4-benciloxifenil)-5-fluoroN4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 4,62 (s, 2H), 5,03 (s, 2H), 6,86 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,31-7,51 (m, 9H), 8,06 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 9,05 (s,1H), 9,15 (s, 1H), 11,13 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 170,56; LCMS: tiempo deret.: 12,02 min.; MS (m/e): 459,33 (MH+ ).
7.4.304
5-Fluoro-N2-(4-morfolinofenil)-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945412) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-morfolinoanilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar 5-fluoro-N2-(4-morfolinofenil)N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 3,00 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,71 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 4,62 (s, 2H), 6,81 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,46 (d, J = 9,3 Hz, 2H), 7,56 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,00 (s, 1H), 9,13(s, 1H), 11,13 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 175,15; LCMS: tiempo de ret.: 8,08min.; pureza: 92,97%; MS (m/e): 438,32 (MH+ ).
7.4.305
5-Fluoro-N2-(4-isopropoxifenil)-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945413) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-isopropoxianilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar 5-fluoro-N2-(4isopropoxifenil)-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSOd6 ): e 1,22 (d, J = 6,3 Hz, 6H), 4,48 (p, J = 6,0 Hz, 1H), 4,62 (s, 2H), 6,76 (d, J = 9,0 Hz, 2H),7,34 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,47 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,53 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,02 (s, 1H), 9,15 (s, 1H), 11,12 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 175,03; LCMS:tiempo de ret.: 10,52 min.; pureza: 100%; MS (m/e): 411,32 (MH+ ).
7.4.308
N4-(2,2-Dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirido[1,4]oxazin-6-il]5-fluoro-N2-[4-(4-metoxicarbonilpiperazino)fenil]-2,4pirimidindiamina (R945416) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-(4-metoxicarbonilpiperazino)anilina (100 mg) y 2cloro-N4-(2,2-dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina (50 mg) paradar N4-(2,2-dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirido[1,4]oxazin-6-il]-5-fluoro-N2-[4-(4metoxicarbonilpiperazino)fenil]-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 1,43 (s, 6H), 2,99 (t, J = 5,1 Hz, 4H), 3,49 (t, J = 5,1 Hz, 4H), 3,61 (s, 3H), 6,82 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,37 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,47 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,55 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,02 (s, 1H),9,14 (s, 1H), 11,08 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 164,38; LCMS: tiempo de ret.:10,24 min.; pureza: 100%; MS (m/e): 523,45 (MH+ ).
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
7.4.309
N2-[4-(N-Acetil-N-metilamino)fenil]-N4-(2,2-dimetil2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4pirimidindiamina (R945417) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-(N-acetil-N-metilamino)anilina (100 mg) y 2-cloro-N4(2,2-dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2[4-(N-acetil-N-metilamino)fenil]-N4-(2,2-dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 1,43 (s, 6H), 1,73 (s, 3H), 3,08 (s, 3H), 7,11 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,41 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,68 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 8,13 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,35 (s, 1H), 9,40 (s, 1H), 11,12 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 162,87; LCMS: tiempo de ret.: 10,03 min.; pureza: 100%; MS (m/e): 452,26 (MH+ ).
7.4.310
N2-[4-(N-Acetil-N-etilamino)fenil]-N4-(2,2-dimetil-2H3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4pirimidindiamina (R945418) De manera similar a la preparacion de 4-(4-metoxicarbonilpiperazino)nitrobenceno, se hicieronreaccionar N-etil-4-nitroanilina (1 g) y cloruro de acetilo (1 ml) para dar N-acetil-N-etil-4nitroanilina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 1,15 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,94 (s, 3H), 3,81 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 7,36 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 8,30 (d, J = 8,7 Hz, 2H). Se redujo N-acetil-N-etil-4-nitroanilina en condiciones de hidrogenolisis usando Pd al 10%-C en metanol a 40 psi durante 1 h. El catalizador se separo por filtracion. El filtrado se evaporo paradar 4-(N-acetil-N-etilamino)anilina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 1,09 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,82 (s, 3H), 3,68(q, J = 7,2 Hz, 2H), 6,79 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,95 (d, J = 8,1 Hz, 2H).De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-(N-acetil-N-etilamino)anilina (100 mg) y 2-cloro-N4(2,2-dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il]-5-fluoro-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2[4-(N-acetil-N-etilamino)fenil]-N4-(2,2-dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 0,97 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,43 (s, 6H), 1,68 (s, 3H), 3,56 (q, J = 6,9 Hz, 2H), 7,06 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,40 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,48 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 8,13 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 9,35 (s, 1H), 9,40 (s, 1H), 11,12 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e -162,90; LCMS: tiempo de ret.: 10,51 min.; pureza: 100%; MS (m/e): 466,25 (MH+ ).
7.4.311
N2-[4-(4-Acetilpiperazino)fenil]-N4-(2,2-dimetil-2H-3oxo-4H-5-pirido[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4pirimidindiamina (R945419) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-(4-acetilpiperazino)anilina (100 mg) y 2-cloro-N4-(2,2dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-[4-(4acetilpiperazino)fenil]-N4-(2,2-dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 1,43 (s, 6H), 2,03 (s, 3H), 2,96 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 3,03(t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,56 (m, 4H), 6,82 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,37 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,47 (d, J =8,7 Hz, 2H), 7,56 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,02 (s, 1H), 9,13 (s, 1H), 11,08 (s,1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e -164,40; LCMS: tiempo de ret.: 8,70 min.; pureza:97,70%; MS (m/e): 507,55 (MH+ ).
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
7.4.312
N2-[4-(N-Acetil-N-metilamino)fenil]-5-fluoro-N4-(2H3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945420) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-(N-acetil-N-metilamino)anilina (100 mg) y 2-cloro-5fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-[4-(N-acetilN-metilamino)fenil]-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 1,74 (s, 3H), 3,09 (s, 3H), 4,64 (s, 2H), 7,13 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,40 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 8,13 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 9,34 (s, 1H),9,39 (s, 1H), 11,16 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 171,37; LCMS: tiempo de ret.:9,14 min.; pureza: 91,43%; MS (m/e): 424,50 (MH+ ).
7.4.313
N2-[4-(N-Acetil-N-etilamino)fenil]-5-fluoro-N4-(2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945421) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-(N-acetil-N-etilamino)anilina (100 mg) y 2-cloro-5fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-[4-(N-acetilN-etilamino)fenil]-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 0,98 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,69 (s, 3H), 3,57 (q, J = 6,9 Hz, 2H), 4,63 (s, 2H), 7,08 (d,J = 8,7 Hz, 2H), 7,39 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 8,13(d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,34 (s, 1H), 9,40 (s, 1H), 11,16 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 171,36; LCMS: tiempo de ret.: 9,26 min.; pureza: 91,13%; MS (m/e): 438,27 (MH+ ).
7.4.314
N2-(3,4-dimetoxifenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945422) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3,4-dimetoxianilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-(3,4-dimetoxifenil)-5fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 3,64 (s, 3H), 3,68 (s, 3H), 4,63 (s, 2H), 6,79 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,20-7,23 (m, 2H), 7,33 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,59 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 8,08 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,03 (s, 1H), 9,16 (s, 1H), 11,13 (s, 1H);RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e -172,45; LCMS: tiempo de ret.: 8,35 min.; pureza: 94,21%; MS(m/e): 413,30 (MH+ ).
7.4.315
N4-(2,2-Dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)5-fluoro-N2-(4-morfolinofenil)-2,4-pirimidindiamina (R945423) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-morfolinoanilina (100 mg) y 2-cloro-N4-(2,2-dimetil-2H3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N4-(2,2-dimetil-2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(4-morfolinofenil)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 1,43 (s, 6H), 2,99 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,72 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 6,80 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,36 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,46 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,55 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,00 (s, 1H), 9,13 (s, 1H), 11,09 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 173,16; LCMS: tiempo de ret.: 9,59 min.; pureza: 100%; MS (m/e): 466,28 (MH+ ).
7.4.316
N2-[3-(N-Ciclobutilamino)carbonilmetilenoxifenil]-N4(2,2-dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5- De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3-(ciclobutilaminocarbonilmetilenoxi)anilina (100 mg) y2-cloro-N4-(2,2-dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina (50 mg)
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
fluoro-2,4-pirimidindiamina (R945424)
para dar N2-[3-(N-ciclobutilamino)carbonilmetilenoxifenil]-N4-(2,2-dimetil-2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 1,42 (s, 6H), 1,57-1,66 (m, 2H), 1,90-2,04 (m, 2H), 2,12 (m, 2H), 4,25 (q, J = 8,4 Hz, 1H), 4,33 (s, 2H), 6,46 (dd, J = 1,8y 8,1 Hz, 1H), 7,08 (t, J = 8,1 Hz,1H), 7,25 (dd, J = 8,4 Hz, 1H), 7,35 (m, 1H), 7,36 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,63 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 8,12 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 8,23 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 9,22 (s, 1H), 9,26(s, 1H), 11,06 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 171,41; LCMS: tiempo de ret.: 11,46min.; pureza: 97,65%; MS (m/e): 508,45 (MH+ ).
7.4.317
5-Fluoro-N2-[4-(4-metilpiperazino)fenil]-N4-(2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945426) Sse hicieron reaccionar 1-(4-nitrofenil)piperazina (1 g), yodometano (0,3 ml) e hidruro de sodio(500 mg) en THF (10 ml) toda la noche a temperatura ambiente. La disolucion se diluyo conagua. La precipitacion amarilla se recogio mediante filtracion, se lavo con agua para dar 4-(4metilpiperazino)nitrobenceno como un solido amarillo. RMN 1 H (CDCl3 ): e 2,45 (s, 3H), 2,69 (t, J= 5,1 Hz, 4H), 3,52 (t, J = 5,1 Hz, 4H), 6,83 (d, J = 9,3 Hz, 2H), 8,12 (d, J = 9,3 Hz, 2H).El 4-(4-Metilpiperazino)nitrobenceno se redujo en condiciones de hidrogenolisis usando Pd al10%-C en metanol a 40 psi durante 1 h. El catalizador se separo por filtracion. El filtrado seevaporo para dar 4-(4-metilpiperazino)anilina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 2,47 (s, 3H), 2,75 (t, J = 5,1 Hz, 4H), 3,16 (t, J = 5,1 Hz, 4H), 6,65 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 6,81 (d, J = 8,7 Hz, 2H). De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-(4-metilpiperazino)anilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoroN4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar 5-fluoro-N2-[4-(4metilpiperazino)fenil]-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 2,85 (s, 3H), 3,16 (m, 2H), 3,48 (m, 4H), 3,69 (m, 2H), 4,63 (s, 2H), 6,87 (d, J = 9,0Hz, 2H), 7,36 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,54 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,08 (s, 1H), 9,21 (s, 1H), 11,16 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 172,68; LCMS: tiempo de ret.: 5,67 min.; pureza: 100%; MS (m/e): 451 (MH+ ).
7.4.318
N4-(2,2-Dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)5-fluoro-N2-[4-(4-metilpiperazino)fenil]-2,4pirimidindiamina (R945427) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 4-(4-metilpiperazino)anilina (100 mg) y 2-cloro-N4-(2,2dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N4-(2,2dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-[4-(4-metilpiperazino)fenil]-2,4pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 1,43 (s, 6H), 2,71 (s, 3H), 3,16 (br, 8H), 6,84 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,37 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,54 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,05 (s, 1H), 9,18 (s, 1H), 11,10 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 172,96; LCMS: tiempo de ret.: 7,08 min.; pureza: 91,96%; MS (m/e): 479,25 (MH+ ).
7.4.319
N2-(3,5-Dimetilfenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5- De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3,5-dimetilanilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H-3
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945432)
oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-(3,5-dimetilfenil)-5-fluoroN4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 2,17 (s, 6H), 4,62 (s, 2H), 6,52 (s, 1H), 7,22 (s, 2H), 7,34 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,57 (d, J = 8,4 Hz, 1H),8,11 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,10 (s, 1H), 9,19 (s, 1H), 11,14 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e - 172,16; LCMS: tiempo de ret.: 11,34 min.; pureza: 90,04%; MS (m/e): 381,23 (MH+ ).
7.4.320
N2-(3,5-Dimetilfenil)-N4-(2,2-dimetil-2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina(R945433) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3,5-dimetilanilina (100 mg) y 2-cloro-N4-(2,2-dimetil-2H3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-(3,5-dimetilfenil)N4-(2,2-dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 1,42 (s, 6H), 2,16 (s, 6H), 6,51 (s, 1H), 7,23 (s, 2H), 7,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,59(d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,11 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,10 (s, 1H), 9,18 (s, 1H), 11,08 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 172,19; LCMS: tiempo de ret.: 13,05 min.; pureza: 95,71%; MS (m/e):409,30 (MH+).
7.4.321
5-Fluoro-N2-(3-isopropilfenil)-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945434) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3-isopropilanilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar 5-fluoro-N2-(3-isopropilfenil)N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 1,15 (d, J = 6,9 Hz, 6H), 2,74 (p, J = 6,9 Hz, 1H), 4,63 (s, 2H), 6,76 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,10 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,34 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,42 (s, 1H), 7,51 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,57 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,11(d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,15 (s, 1H), 9,21 (s, 1H), 11,15 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 172,02; LCMS: tiempo de ret.: 12,40 min.; pureza: 92,20%; MS (m/e): 395,28 (MH+ ).
7.4.322
N2-(3-cloro-4-metilfenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945439) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3-cloro-4-metilanilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-(3-cloro-4-metilfenil)5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e2,22 (s, 3H), 4,63 (s, 2H), 7,13 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,38 (m, 2H), 7,48 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,83 (d,J = 2,1 Hz, 1H), 8,13 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 9,31 (s, 1H), 9,33 (s, 1H), 11,13 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e -171,47; LCMS: tiempo de ret.: 12,66 min.; pureza: 94,85%; MS (m/e):401,13 (MH+).
7.4.323
5-Fluoro-N2-(3-metoxi-5-trifluorometilfenil)-N4-(2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945440) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3-metoxi-5-trifluorometilanilina (100 mg) y 2-cloro-5fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar 5-fluoro-N2-(3metoxi-5-trifluorometilfenil)-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 3,74 (s, 3H), 4,63 (s, 2H), 6,72 (s, 1H), 7,32 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,51 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,56 (s, 1H), 7,64 (s, 1H), 8,18 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 9,36 (s, 1H), 9,55 (s, 1H), 11,12 (s,
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e -170,42; LCMS: tiempo de ret.: 13,14 min.; pureza:86,65%; MS (m/e): 451,30 (MH+ ).
7.4.324
5-Fluoro-N2-(indol-6-il)-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945443) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 6-aminoindol (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar 5-fluoro-N2-(indol-6-il)-N4-(2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 4,62 (s, 2H), 6,30 (s,1H), 7,17 (m, 2H), 7,29 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,35 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 8,7 Hz, 1H),7,82 (s, 1H), 8,10 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,08 (s, 1H), 9,11 (s, 1H), 10,84 (s, 1H), 11,11 (s, 1H);RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e -172,73; LCMS: tiempo de ret.: 8,52 min.; pureza: 81,74%; MS(m/e): 392,30 (MH+ ).
7.4.325
N4-(2,2-dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)5-fluoro-N2-(indol-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945444) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 6-aminoindol (100 mg) y 2-cloro-N4-(2,2-dimetil-2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N4-(2,2-dimetil-2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(indol-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 1,42 (s, 6H), 6,30 (s, 1H), 7,18 (m, 2H), 7,29 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,35 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,77(d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,80 (s, 1H), 8,10 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,02 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 10,84 (s,1H), 11,04 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 172,86; LCMS: tiempo de ret.: 9,91 min.;pureza: 98,01%; MS (m/e): 420,18 (MH+ ).
7.4.326
N2-(3,5-diclorofenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945454) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3,5-dicloroanilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-(3,5-diclorofenil)-5-fluoroN4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 4,62 (s, 2H), 6,99 (t, J = 1,8 Hz, 1H), 7,38 (s, 2H), 7,70 (d, J = 2,1 Hz, 2H), 8,19 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,52(s, 1H), 9,66 (s, 1H), 11,17 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 170,19; LCMS: tiempo deret.: 14,05 min.; pureza: 85,53%; MS (m/e): 421,21 (MH+ ).
7.4.327
N2-(3-Bromofenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945455) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3-bromoanilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-(3-bromofenil)-5-fluoro-N4(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 4,63 (s, 2H),7,02 (ddd, J = 0,9 y 1,8 y 7,8 Hz, 1H), 7,13 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 7,39 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,47 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 7,52 (dd, J = 0,9 y 8,1 Hz, 1H), 7,99 (t, J = 1,8 Hz, 1H), 8,16 (d, J = 3,6 Hz, 1H),9,40 (s, 1H), 9,47 (s, 1H), 11,17 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e -170,91; LCMS:tiempo de ret.: 12,31 min.; pureza: 100%; MS (m/e): 431,20 (MH+ ).
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
7.4.328
N2-(3-terc-butilfenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945456) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3-terc-butilanilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-(3-terc-butilfenil)-5-fluoroN4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 1,23 (s, 9H), 4,62 (s, 2H), 6,91 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,11 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 7,34 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,48(s, 1H), 7,58 (s, 1H), 7,63 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 8,11 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,12 (s, 1H), 9,16 (s, 1H),11,12 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e -171,99; LCMS: tiempo de ret.: 13,16 min.;pureza: 93,03%; MS (m/e): 409,29 (MH+ ).
7.4.329
N2-(3,4-difluorofenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945458) De manera similar a la preparacion de N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-N2-(3-hidroxifenil)-2,4pirimidindiamina, se hicieron reaccionar 3,4-difluoroanilina (100 mg) y 2-cloro-5-fluoro-N4-(2H-3oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-4-pirimidinamina (50 mg) para dar N2-(3,4-difluorofenil)-5-fluoroN4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina. RMN 1 H (DMSO-d6 ): e 4,63 (s, 2H), 7,27 (m, 2H), 7,38 (s, 2H), 7,88 (ddd, J = 2,7 y 8,1 y 14,1 Hz, 1H), 8,15 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 9,46 (s, 1H), 9,48 (s, 1H), 11,17 (s, 1H); RMN 19 F (282 MHz, DMSO-d6 ): e 162,44, -148,50, -138,13; LCMS: tiempo de ret.: 11,63 min.; pureza: 84,89%; MS (m/e): 389,25 (MH+ ).
Sintesis de anilinas
7.4.330
(S)-2-Metil-6-nitro-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazina A una disolucion de 2-amino-4-nitrofenol (6,6 g) en DMF (100 ml) a 0°C se anadio 95% de NaH(1 g) solido, de una vez. La disolucion se agito at 0°C durante 20 minutos, despues atemperatura ambiente durante 1 hora. Se anadio (S)-(-)-2-cloropropionato de metilo (5 g) de unasola vez, y la reaccion se calento con un condensador de reflujo adjunto a 85°C toda la noche. La mezcla de reaccion se concentro, y el residuo se repartio entre EtOAc y agua. La fase acuosa se extrajo con EtOAc, y las capas organicas combinadas se lavaron tres veces con aguay despues una vez con salmuera, se secaron sobre MgSO4 , se filtraron y el volumen seminimizo enel evaporador giratorio hasta alrededor de 15 ml. El residuo se cromatografioEtOAc/hexanos 1:4 isocraticamente. Las fracciones puras se combinaron y se evaporaron, y elproducto bruto se recristalizo en EtOAc/hexanos para dar (S)-2-metil-6-nitro-3-oxo-4Hbenz[1,4]oxazina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 7,82 (dd, 1H), 7,76 (d, 1H), 7,12 (d, 1H), 4,90 (q, 1H),1,42 (d, 3H); LCMS: pureza: 100%; MS (m/e): 209 (MH+ ).
7.4.331
(S)-6-Amino-2-metil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazina A una disolucion de (S)-2-metil-6-nitro-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazina (2,5 g) en 250 ml deEtOH/EtOAc (1:1; v/v) se anadieron 500 mg de Pd al 10%/C (Degussa), y la reaccion sehidrogeno en el aparato Parr a 50 psi durante 1 hora. La reaccion se filtro a traves de un lechode celite, se evaporo y se seco a vacio para dar la 2,3 g de (S)-6-Amino-2-metil-3-oxo-4Hbenz[1,4]oxazina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 6,60 (d, 1H), 6,12 (m, 2H), 4,40 (q, 1H), 1,32 (d, 3H); LCMS: pureza: 100%; MS (m/e): 179 (MH+ ).
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
7.4.332
(R)-2-Metil-6-nitro-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazina De la misma manera que para la sintesis de (S)-2-metil-6-nitro-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazina, lareaccion de (R)-(+)-metil-2-cloropropionato con 2-amino-4-nitrofenol dio (R)-2-metil-6-nitro-3oxo-4H-benz[1,4]oxazina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 7,82 (dd, 1H), 7,76 (d, 1H), 7,12 (d, 1H), 4,90(q, 1H), 1,42 (d, 3H); LCMS: pureza: 100%; MS (m/e): 209 (MH+ ).
7.4.333
(R)-6-Amino-2-metil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazina De la misma manera que para la sintesis de (S)-6-amino-2-metil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazina, lahidrogenacion de (R)-2-metil-6-nitro-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazina dio (R)-6-amino-2-metil-3-oxo4H-benz[1,4]oxazina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 6,60 (d, 1H), 6,12 (m, 2H), 4,40 (q, 1H), 1,32 (d,3H); LCMS: pureza: 100%; MS (m/e): 179 (MH+ ).
7.4.334
7-Amino-4,4-dimetil-1,3-dioxo-2H,4H-isoquinolina El material se preparo segun el procedimiento esquematizado en l Med em, 2002, 45(16),3394-3405.
7.4.335
(+)-2-(2-Hidroxietil)-6-nitro-3-oxo-4Hbenz[1,4]oxazina A una disolucion de 2-amino-4-nitrofenol (16,5 g) en DMF (100 ml) a 0°C se anadio 95% de NaH (3 g) sdolido de una sola vez. La mezcla de reaccion se agito a 0°C durante 20 minutos,despues a temperatura ambiente durante 1 hora. Se anadio 2-bromobutirolactona (13,8 ml) a lamezcla de reaccion, y entonces se calento a 85°C durante toda la noche con un condensador dereflujo unido. La mezcla de reaccion se concentro hasta aproximadamente 25 ml, y se diluyo con25 ml de MeOH. Se anadieron 400 ml de agua DI, con agitacion, y el producto precipitado serecogio filtration y se seco en el embudo durante 4 h para dar (+)-2-(2-hidroxietil)-6-nitro-3-oxo4H-benz[1,4]oxazina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 7,82 (dd, 1H), 7,75 (d, 1H), 7,18 (d, 1H), 4,90 (m,1H), 4,70 (t, 1H), 3,8 (m, 2H), 1,96 (m, 2H); LCMS: pureza: 100%; MS (m/e): 239 (MH+ ).
7.4.336
(+)-6-Amino-2-(2-hidroxietil)-3-oxo-4Hbenz[1,4]oxazina Una disolucion de (+)-2-(2-hidroxietil)-6-nitro-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazina (1 g) en EtOH/EtOAc(100 ml; 1:1 v/v) se hidrogeno a 50 psi en presencia de 200 mg de Pd al 10%/C (Degussa) paradar (+)-6-amino-2-(2-hidroxietil)-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazina. RMN 1 H (DMSO-d6): e 6,60 (d, 1H), 6,12 (m,, 2H), 4,58 (t, 1H), 4,40 (m, 1H), 3,57 (m, 2H), 1,76 (m, 2H); LCMS: pureza: 98%; MS (m/e): 209 (MH+)
Preparacion de aminoindazolinas
7.4.363
1-(2-Etoxicarboniletil)-5-nitroindazolina y 2-(2etoxicarboniletil)-5-nitroindazolina De la misma manera que para la preparacion de 1-(metoxicarbonil)metil-5-nitroindazolina, la 1(2-etoxicarboniletil)-5-nitroindazolina se preparo mediante alquilacion de 5-nitroindazolina con 3bromopropionato de etilo en presencia de K2 CO3 . La 1-(2-etoxicarboniletil)-5-nitroindazolina (43%) con valor de Rf elevado en la TLC en 30% de EtOAcn-hexanos se recogio mediantepurificacion cromatografica en columna sobre gel de silice. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,70 (d, 1H, J = 1,7 Hz), 8,27 (dd, 1H, J = 2,3 y 8,8 Hz), 8,20 (d, 1H, J = 1,7 Hz), 7,59 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 4,70 (t,2H, J = 6,4 Hz), 4,07 (qt, 2H, J = 7,0 Hz), 3,01 (t, 2H, J = 6,4 Hz), 1,16 (t, 3H, J = 7,0 Hz). El subproducto de menor valor de Rf, 2-(2-etoxicarboniletil)-5-nitroindazolina, tambien se recogio
Numero de Seccion
Nombre del compuesto y numero de referencia Experimental
eluyendo la columna con 50% de EtOAcn-hexanos. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,71 (d. 1H. J = 2,0 Hz), 8,32 (s, 1H), 8,08 (app dd, 1H, J = 2,0 y 9,7 Hz), 7,73 (dd, 1H, J = 0,8 y 9,7 Hz), 4,77 (t, 2H, J = 6,4 Hz), 4,12 (qt, 2H, J = 7,0 Hz), 3,08 (t, 2H, J = 6,4 Hz), 1,22 (t, 3H, J = 7,0 Hz).
7.4.364
5-Amino-1-(2-etoxicarboniletil)indazolina De la misma manera que para la reaccion de 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)malonato de dietilo, la 1-(2etoxicarboniletil)-5-nitroindazolina se redujo para dar 5-amino-1-(2-etoxicarboniletil)indazolina.RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,78 (s, 1H), 7,30 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 6,91 (d, 1H, J = 2,3 Hz), 6,87 (dd, 1H, J = 2,3 y 8,8 Hz), 4,59 (t, 2H, J = 6,4 Hz), 4,08 (qt, 2H, J = 7,0 Hz), 3,02 (br s, 2H), 2,92 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 1,16 (t, 3H, J = 7,0 Hz).
7.4.365
5-Amino-2-(2-etoxicarboniletil)indazolina De la misma manera que para la reaccion de 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)malonato de dietilo, lareaccion de 2-(2-etoxicarboniletil)-5-nitroindazolina proporciono 5-amino-2-(2etoxicarboniletil)indazolina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,64 (s, 1H), 7,45 (dd, 1H, J = 0,9 y 9,1 Hz), 6,74(dd, 1H, J = 2,0 y 9,1 Hz), 6,67(d, 1H, J = 2,0 Hz), 4,57 (t, 2H, J = 6,7 Hz), 4,05 (qt, 2H, J = 7,0 Hz), 3,28 (br s, 2H), 2,93 (t, 2H, J = 6,7 Hz), 1,16 (t, 3H, J = 7,0 Hz).
7.4.366
1-metil-6-nitroindazolina y 2-metil-6-nitroindazolina De la misma manera que para la preparacion de 1-(metoxicarbonilmetil)-5-nitroindazolina, sealquilo 6-nitroindazol con yoduro de metilo en presencia de K2 CO3 . La mezcla de reaccion sediluyo con agua al terminar la reaccion. El solido formado se filtro, se seco y se cromatografiocon 15% de EtOAc:n-n-hexanos sobre gel de silice para dar un producto con valor elevado deRf, 1-metil-6-nitroindazolina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 8,32 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 8,01 (dd, 1H, J = 2,7 y 8,8 Hz), 7,83 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 4,18 (s, 3H). Tambien se recogio el subproducto de menorvalor de Rf, 2-metil-6-nitroindazolina, eluyendo la columna con 30% de EtOAc:n-hexanos. RMN1 H (CDCl3 ): e 8,69 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 8,03 (s, 1H), 7,90 (dd, 1H, J = 2,0 y 9,1 Hz), 7,75 (d, 1H, J= 9,1 Hz), 4,31 (s, 13H).
7.4.367
6-Amino-1-metilindazolina De la misma manera que para la reaccion de 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)malonato de dietilo, seredujo 1-metil-6-nitroindazolina para dar 6-amino-1-metilindazolina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,80 (s, 1H), 7,48 (dd, 1H, J = 0,6 y 8,2 Hz), 6,58 (dd, 1H, J = 1,8 y 8,2 Hz), 6,54 (d, 1H, J = 0,6 Hz), 3,94 (s, 3H), 3,5 (br s, 2H).
7.4.368
6-Amino-2-metilindazolina De la misma manera que para la reaccion de 2-metil-2-(3-nitrofenoxi)malonato de dietilo, seredujo 2-metil-6-nitroindazolina para dar 6-amino-2-metilindazolina. RMN 1 H (CDCl3 ): e 7,71 (s, 1H), 7,43 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 6,79 (app d, 1H, J = 1,7 Hz), 6,58 (dd, 1H, J = 1,7 y 8,8 Hz), 4,11(s, 3H), 3,31 (br s, 2H).
Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invenci6n inhiben la desgranulaci6n mediada por el receptor Fc RI
La capacidad de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion para inhibir la desgranulacion inducida por IgE se demostro en una variedad de ensayos celulares con mastocitos humanos cultivados (CHMC) y/o celulas derivadas de medula osea (BMMC) de raton. La inhibicion de la desgranulacion se midio a una densidad celular tanto baja como alta, cuantificando la liberacion de los factores triptasa, histamina y hexosaminidasa especificos de granulos. La inhibicion de la liberacion y/o sintesis de mediadores lipidicos se evaluo midiendo la liberacion de leucotrieno LTC4, y la inhibicion de la liberacion y/o sintesis de citocinas se monitorizo cuantificando TNF-a, IL-6 e IL-13. La triptasa y hexasaminidasa se cuantificaron usando sustratos fluorogenos como se describe en sus ejemplos respectivos. La histamina, TNFa, IL-6, IL-13 y LTC4 se cuantificaron usando los siguientes kits de ELISA comerciales: histamina (Immunotech #2015, Beckman Coulter), TNFa (Biosource #KHC3011), IL-6 (Biosource #KMC0061), IL-13 (Biosource #KHC0132) y LTC4 (Cayman Chemical #520211). Mas abajo se proporcionan los protocolos de los diversos ensayos.
Cultivo de mastocitos ybas6filos Humanos
Los mastocitos y basofilos humanos se cultivaron a partir de celulas progenitoras negativas para CD34 como se describe mas abajo (veanse tambien los metodos descritos en la Solicitud U.S. Serie n° 10/053.355, presentada el 8 de noviembre de 2001, en tramite junto con la presente.
Preparaci6n de medio completo STEMPRO-34
Para preparar medio completo ("CM") STEMPRO-34, se anadieron a un matraz de filtro 250 ml de medio libre de suero STEMPRO-34TM ("SFM"; GibcoBRL, numero de catalogo 10640). A esto se anadieron 13 ml de suplemento nutriente STEMPRO-34 ("NS"; GibcoBRL, numero de catalogo 10641) (preparado como se describe con mas detalle, mas abajo). El recipiente del NS se enjuago con aproximadamente 10 ml de SFM, y el enjuague se anadio al matraz de filtro. Tras la adicion de 5 ml de L-glutamina (200 mM; Mediatech, numero de catalogo MT 25-005-CI) y 5 ml de 100X penicilina/estreptomicina ("pen-estrep"; HyClone, numero de catalogo: SV30010), el volumen se llevo hasta 500 ml con SFM, y la disolucion se filtro.
El aspecto mas variable de la preparacion del CM es el metodo mediante el cual el NS se descongela y se mezcla antes de la adicion al SFM. El NS se deberia de descongelar en un bano de agua a 37°C y hacerlo girar en remolinos, sin generar vortices ni agitarlo, hasta que este completamente en disolucion. Mientras se le hace girar, observese si hay lipidos que no estan todavia en disolucion. Si hay lipidos y el NS no tiene un aspecto uniforme, devuelvase al bano de agua y repitase el proceso de giro en remolino hasta que tenga un aspecto uniforme. Algunas veces este componente pasa a la disolucion inmediatamente, algunas veces despues de un par de ciclos de giro en remolino, y algunas veces no lo hace en absoluto. Si, despues de un par de horas, el NS todavia no esta en disolucion, desechese y descongelese una unidad reciente. No se deberia de usar un NS que no parece uniforme despues de la descongelacion.
Expansi6n de las celulas CD34+
Una poblacion de partida de celulas positivas para CD34 (CD34+) de numero relativamente pequeno (1-5 x 106 celulas) se expandio hasta un numero relativamente grande de celulas progenitoras negativas a CD34 (alrededor de 2-4 x 109 celulas) usando los medios de cultivo y metodos descritos mas abajo. Las celulas CD34+ (procedentes de un unico donante) se obtuvieron de Allcells (Berkeley, CA). Debido a que hay un grado de variacion en la calidad y numero de celulas CD34+ que tipicamente proporciona Allcells, las celulas recientemente suministradas se transfirieron a un tubo conico de 15 ml y se llevaron hasta 10 ml en CM antes del uso.
En el dia 0, se llevo a cabo un recuento celular sobre las celulas viables (fase brillante), y las celulas se hicieron girar a 1200 rpm hasta un pelete. Las celulas se resuspendieron hasta una densidad de 275.000 celulas/ml con CM, que contiene 200 ng/ml de Factor de Celula Madre humano recombinante ("SCF"; Peprotech, numero de catalogo 300-07) y 20 ng/ml de ligando flt-3 humano (Peprotech, numero de catalogo 300-19) ("medio CM/SCF/flt-3"). En aproximadamente el dia 4 o 5, la densidad del cultivo se comprobo llevando a cabo un recuento celular, y el cultivo se diluyo hasta una densidad de 275.000 celulas/ml con medio CM/SCF/flt-3 reciente. En aproximadamente el dia 7, el cultivo se transfirio a un tubo esteril, y se llevo a cabo un recuento celular. Las celulas se hicieron girar a 1200 rpm y se resuspendieron hasta una densidad de 275.000 celulas/ml con medio CM/SCF/flt-3 reciente.
Este ciclo se repitio, comenzando a partir del dia 0, un total de 3-5 veces a lo largo del periodo de expansion.
Cuando el cultivo es grande y se mantiene en multiples matraces y se va a resuspender, los contenidos de todos los cultivos se combinan en un unico recipiente antes de llevar a cabo un recuento celular. Esto asegura que se logre un recuento celular exacto, y proporciona un grado de uniformidad de tratamiento para toda la poblacion. Cada matraz se comprueba separadamente en busca de contaminacion bajo el microscopio antes de la combinacion, para evitar la contaminacion de toda la poblacion.
Entre los dias 17-24, el cultivo puede comenzar a decaer (es decir, aproximadamente 5-10% del numero total de celulas muere) y no se expande tan rapidamente como antes. Las celulas se monitorizan entonces diariamente durante este tiempo, puesto que el fallo completo del cultivo puede tener lugar en un tiempo tan corto como 24 horas. Una vez ha
comenzado el decaimiento, las celulas se recuentan, se hacen girar a 850 rpm durante 15 minutos, y se resuspenden a una densidad de 350.000 celulas/ml en medio CM/SCF/flt-3, para inducir una o mas divisiones de la celula. Las celulas se monitorizan diariamente para evitar el fallo del cultivo.
Cuando en el cultivo de celulas progenitoras es evidente una muerte celular mayor de 15% y hay algo de desecho en el cultivo, las celulas progenitoras negativas para CD34 estan listas para ser diferenciadas.
Diferenciaci6n de celulas progenitoras negativas para CD34 en mastocitos de la mucosa
Se lleva a cabo una segunda fase para convertir las celulas progenitoras expandidas, negativas para CD34, en mastocitos de la mucosa diferenciados. Estos mastocitos humanos cultivados ("CHMC") de la mucosa derivan de celulas CD34+, aisladas de sangre del cordon umbilical y tratadas para formar una poblacion proliferada de celulas progenitoras negativas para CD34, como se describe anteriormente. Para producir las celulas progenitoras negativas para CD43, el ciclo de resuspension para el cultivo fue el mismo que el descrito anteriormente, excepto que el cultivo se sembro a una densidad de 425.000 celulas/ml y se anadio 15% de medio adicional en aproximadamente el cuarto o quinto dia sin llevar a cabo un recuento celular. Tambien, la composicion de citocinas del medio se modifico de forma que contuviese SCF (200 ng/ml) e IL-6 humana recombinante (200 ng/ml; Peprotech, numero de catalogo 200-06, reconstituida hasta 100 ug/ml en acido acetico 10 mM esteril) ("medio CM/SCF/IL-6").
Las Fases I y II juntas duran aproximadamente 5 semanas. Durante las semanas 1-3 es evidente que hay algo de muerte y desechos en el cultivo, y hay un periodo durante las semanas 2-5 durante el cual un pequeno porcentaje del cultivo ya no esta en suspension, sino que en su lugar esta adherido a la superficie de la vasija de cultivo.
Al igual que durante la Fase I, cuando el cultivo se va a resuspender en el septimo dia de cada ciclo, los contenidos de todos los matraces se combinan en un unico recipiente antes de llevar a cabo un recuento celular, para asegurar la uniformidad de toda la poblacion. Cada matraz se comprueba separadamente en busca de contaminacion bajo el microscopio antes de la combinacion, para evitar la contaminacion de toda la poblacion.
Cuando los matraces se combinan, aproximadamente el 75% del volumen se transfiere al recipiente comun, dejando atras alrededor de 10 ml, mas o menos, en el matraz. El matraz que contiene el volumen que queda se golpeo brusca y lateralmente para descargar las celulas adheridas. El golpeteo se repitio en un angulo perpendicular al primer golpeteo, para descargar completamente las celulas.
El matraz se recosto formando un angulo de 45 grados durante un par de minutos antes de que el volumen que queda se transfiriese a la vasija de recuento. Las celulas se hicieron girar a 950 rpm durante 15 minutos antes de sembrar a 35-50 ml por matraz (a una densidad de 425.000 celulas/ml).
Diferenciaci6n de celulas progenitoras negativas para CD34 en mastocitos de tipo tejido conjuntivo
Se preparo como antes una poblacion proliferada de celulas progenitoras negativas para CD34, y se trato para formar un fenotipo positivo para triptasa/quimasa (tejido conjuntivo). Los metodos se llevan a cabo como se describe anteriormente para mastocitos de la mucosa, pero con la sustitucion de IL-6 por IL-4 en el medio de cultivo. Las celulas obtenidas son tipicas de mastocitos de tejido conjuntivo.
Diferenciaci6n de celulas progenitoras negativas para CD34 en bas6filos
Se preparo como se describe en la Seccion 7.5.1.3, anterior, una poblacion proliferada de celulas progenitoras negativas para CD34, y se uso para formar una poblacion proliferada de basofilos. Las celulas negativas para CD34 se tratan como se describe para mastocitos de la mucosa, pero con la sustitucion de IL-6 por IL-3 (a 20-50 ng/ml) en el medio de cultivo.
Activaci6n de baja densidad celular de CHMC con IgE: ensayos de triptasa y LTC4
A placas con fondo en U de 96 pocillos duplicadas (Costar 3799) anadanse 65 ul de diluciones de compuesto o muestras de control que se han preparado en MT [137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 1,0 mM de MgCl2, 5,6 mM de glucosa, 20 mM de Hepes (pH 7,4), 0,1% de seroalbumina bovina (Sigma A4503)] que contiene 2% de MeOH y 1% de DMSO. Peleticense las celulas CHMC (980 rpm, 10 min.) y resuspendanse en MT precalentado. Anadanse 65 ul de celulas a cada placa de 96 pocillos. Dependiendo de la actividad de la desgranulacion para cada donante de CHMC particular, carguense 1000-1500 celulas/pocillo. Mezclense cuatro veces, seguido de una incubacion durante 1 h a 37°C. Durante la incubacion de 1 h, preparese una disolucion anti-IgE 6X [anticuerpo anti-IgE humana de conejo (1 mg/ml, Bethyl Laboratories A80-109A) diluido 1:167 en tampon MT]. Estimulense las celulas anadiendo 25 ul de disolucion anti-IgE 6X a las placas apropiadas. Anadanse 25 ul de MT a pocillos de control no estimulados. Mezclese dos veces tras la adicion del anti-IgE. Incubese a 37°C durante 30 minutos. Durante la incubacion de 30 minutos, diluyase la disolucion madre de sustrato de triptasa 20 mM [(Z-Ala-Lys-Arg-AMC.2TFA; Enzyme Systems Products, #AMC-246)] 1:2000 en tampon de ensayo de triptasa [0,1 M de Hepes (pH 7,5), 10% p/v de glicerol, 10 uM de heparina (Sigma H-4898), 0,01% de NaN3]. Haganse girar las placas a 1000 rpm durante 10 min. para peletizar las celulas. Transfieranse 25 ul del sobrenadante a una placa de fondo negro de 96 pocillos, y anadanse a cada pocillo 100 ul de disolucion de sustrato de triptasa recientemente diluida. Incubense las placas a temperatura ambiente durante 30 min. Lease la densidad optica de las placas a 355 nm/460 nm en un lector de placas espectrofotometrico.
El leucotrieno C4 (LTC4) tambien se cuantifica usando un kit de ELISA sobre muestras de sobrenadante apropiadamente diluidas (determinadas empiricamente para cada poblacion celular de donantes de forma que la medicion de las muestras cae dentro de la curva patron) siguiendo las instrucciones del proveedor.
Activaci6n de densidad celular elevada de CHMC con IgE: Ensayos de desgranulaci6n (triptasa, histamina), leucotrieno (LTC4) ycitocina (TNF alfa, IL-13)
Mastocitos humanos cultivados (CHMC) se sensibilizaron durante 5 dias con IL-4 (20 ng/ml), SCF (200 ng/ml), IL-6 (200 ng/ml), e IgE humana (CP 1035K de Cortx Biochem, 100-500 ng/ml, dependiendo de la generacion) en medio CM. Despues de sensibilizarlas, las celulas se contaron, se peletizaron (1000 rpm, 5-10 minutos), y se resuspendieron a 1-2 x 106 celulas/ml en tampon MT. Anadanse 100 ul de suspension celular a cada pocillo, y 100 ul de diluciones de compuesto. La concentracion final de vehiculo es 0,5% de DMSO. Incubese a 37°C (5% de CO2) durante 1 hora. Despues de 1 hora de tratamiento con compuesto, estimulense las celulas con 6X anti-IgE. Mezclense los pocillos con las celulas, y dejense incubar las placas a 37°C (5% de CO2) durante una hora. Despues de la incubacion durante 1 hora, peleticense las celulas (10 minutos, 1000 rpm) y recojanse 200 ul por pocillo del sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el pelete. Coloquese la placa del sobrenadante sobre hielo. Durante la etapa de 7 horas (vease a continuacion), realicese el ensayo de triptasa sobre el nadante que se ha diluido 1:500. Resuspendase el pelete celular en 240 ul de medio CM que contiene 0,5% de DMSO y una concentracion correspondiente de compuesto. Incubense las celulas CHMC durante 7 horas a 37°C (5% de CO2). Tras la incubacion, peleticense las celulas (1000 rpm, 10 minutos) y recojanse 225 ul por pocillo y coloquense en -80°C hasta que se este listo para llevar a cabo los ensayos de ELISA. Los ensayos de ELISA se realizan sobre muestras apropiadamente diluidas (determinadas empiricamente para cada poblacion celular de donantes, de forma que la medicion de la muestra cae dentro de la curva patron) segun las instrucciones del proveedor.
Activaci6n de densidad celular elevada de BMMC con IgE: Ensayos de desgranulaci6n (hexosaminidasa, histamina), leucotrieno (LTC4), ycitocina (TNF alfa, IL-6)
Preparaci6n de medio acondicionado con �EHI
El medio acondicionado con WEHI se obtuvo haciendo crecer celulas mielomonociticas murinas WEHI-3B (American Type Culture Collection, Rockville, MD) en medio Eagle modificado de Iscove (Mediatech, Hernandon, VA) suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (FBS; JRH Biosciences, Kansas City, MO), 50 !M de 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO) y 100 UI/ml de penicilina-estreptomicina (Mediatech) en un incubador con 5% de CO2/95% de aire, humidificado a 37°C. Se sembro una suspension celular inicial a 200.000 celulas/ml, y despues se dividio 1:4 cada 3-4 dias durante un periodo de dos semanas. Los sobrenadantes libres de celulas se cosecharon, se repartieron en alicuotas y se almacenaron a -80°C hasta que se necesitaron.
Preparaci6n de medio de BMMC
El medio de BMMC consiste en 20% de medio acondicionado con WEHI, 10% de FBS inactivado por calor (JHR Biosciences), 25 mM de HEPES, pH 7,4 (Sigma), 2 mM de L-glutamina (Mediatech), 0,1 mM de aminoacidos no esenciales (Mediatech), 1 mM de piruvato sodico (Mediatech), 50 !M de 2-mercaptoetanol (Sigma) y 100 UI/ml de penicilina-estreptomicina (Mediatech) en medio RPMI 1640 (Mediatech). Para preparar el medio de BMMC, todos los componentes se anaden a una unidad filtrante de 1 l esteril, y se filtran a traves de un filtro de 0,2 !m antes del uso.
Protocolo
Mastocitos derivados de medula osea (BMMC) se sensibilizaron toda la noche con SCF murino (20 ng/ml) y anticuerpo monoclonal anti-DNP (10 ng/ml, Clone SPE-7, Sigma # D-8406) en medio de BMMC a una densidad celular de 666 x 103 celulas/ml. Despues de la sensibilizacion, las celulas se contaron, se peletizaron (1000 rpm, 5-10 minutos), y se resuspendieron a 1-3 x 106 celulas/ml en tampon MT. Anadanse 100 ul de suspension celular a cada pocillo, y 100 ul de diluciones de compuesto. La concentracion final de vehiculo es 0,5% de DMSO. Incubese a 37°C (5% de CO2) durante 1 hora. Despues de 1 hora de tratamiento con compuesto, estimulense las celulas con 6X estimulo (60 ng/ml de DNP-BSA). Mezclense los pocillos con las celulas y dejense incubar las placas a 37°C (5% de CO2) durante una hora. Despues de una incubacion de 1 hora, peleticense las celulas (10 minutos, 1000 rpm) y recojanse 200 ul por pocillo del sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el pelete, y transfieranse a un tubo limpio o a una placa de 96 pocillos. Coloquese la placa con el sobrenadante sobre hielo. Durante la etapa de 4-5 horas (vease a continuacion), llevese a cabo el ensayo de hexosaminidasa. Resuspendase el pelete celular en 240 ul de medio acondicionado con WEHI que contiene 0,5% de DMSO y la concentracion correspondiente de compuesto. Incubense las celulas BMMC durante 4-5 horas a 37°C (5% de CO2). Tras la incubacion, peleticense las celulas (1000 rpm, 10 minutos) y recojanse 225 ul por pocillo y coloquense en -80°C hasta que se este listo para llevar a cabo los ensayos de ELISA. Los ensayos de ELISA se realizan sobre muestras apropiadamente diluidas (determinadas empiricamente para cada poblacion celular de donantes, de forma que la medicion de la muestra cae dentro de la curva patron) siguiendo las instrucciones del proveedor.
Ensayo de hexosaminidasa: en una placa de ensayo de 96 pocillos negra solida, anadanse 50 ul de sustrato de hexosaminidasa (4-metilumbeliferil-N-acetil-1-D-glucosaminida; 2 mM) a cada pocillo. Anadanse 50 ul de sobrenadante celular de BMMC (vease anteriormente) al sustrato de hexosaminidasa, coloquense a 37°C durante 30 minutos y lease la placa a 5, 10, 15 y 30 minutos en un espectrofotometro.
Activaci6n de bas6filos con IgE o �caro del polvo: Ensayo de liberaci6n de histamina
El ensayo de activacion de basofilos se llevo a cabo usando sangre periferica humana completa procedente de donantes alergicos a acaros del polvo, eliminandose la mayoria de los globulos rojos mediante sedimentacion con dextrano. La sangre periferica humana se mezclo 1:1 con dextrano T500 al 3%, y los globulos rojos (RBC) se dejaron sedimentar durante 20-25 min. La fraccion superior se diluyo con 3 volumenes de D-PBS, y las celulas se centrifugaron durante 10 min. a 1500 rpm, a temperatura ambiente (RT). El sobrenadante se aspiro, y las celulas se lavaron en un volumen igual de tampon MT. Finalmente, las celulas se resuspendieron en tampon MT que contiene 0,5% de DMSO en el volumen de sangre original. Se mezclaron 80 ul de celulas con 20 ul de compuesto en presencia de 0,5% de DMSO, por triplicado, en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos con fondo en V. Se ensayo un intervalo de dosis de 8 concentraciones de compuesto, dando como resultado una curva de respuesta a la dosis de 10 puntos, incluyendo una respuesta maxima (estimulada) y minima (no estimulada). Las celulas se incubaron con compuesto durante 1 hora a 37°C, 5% de CO2, despues de lo cual se anadieron 20 ul de 6X estimulo [1 ug/ml de anticuerpo anti-IgE (Bethyl Laboratories) o 667 au/ml de acaro del polvo (Antigen Laboratories)]. Las celulas se estimularon durante 30 minutos a 37°C, 5% de CO2. La placa se hizo girar durante 10 min. a 1500 rpm a temperatura ambiente, y se cosecharon 80 ul del sobrenadante para el analisis del contenido de histamina usando el kit de ELISA para histamina suministrado por Immunotech. El ELISA se llevo a cabo segun las instrucciones del proveedor.
Resultados
En la TABLA 1 se proporcionan los resultados de los ensayos de CHMC de baja densidad (Seccion 7.5.2), de los ensayos de BMMC de alta densidad (Seccion 7.5.4) y de los ensayos con basofilos (Seccion 7.5.5). En la TABLA 2 se proporcionan los resultados de los ensayos de CHMC de alta densidad (Seccion 7.5.3). En las TABLAS 1 y 2, todos los valores dados son las IC50 (en !M). Un valor de "9999" indica una IC50 10 !M, sin ninguna actividad medible a una concentracion de 10 !M. La mayoria de los compuestos ensayados tuvieron unas IC50 de menos de 10 !M, exhibiendo muchos de ellos unas IC50 en el intervalo submicromolar.
Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina inhiben la desgranulaci6n mediada por el receptor Fc RI
La capacidad de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion para inhibir la desgranulacion mediada por FcyRI se demostro con el compuesto R940347 en ensayos similares a los descritos en la Seccion 7.5, con la excepcion de que las celulas no se cebaron con IgE, y se activaron con fragmento Fab de anti-IgG humana de conejo (Bethyl Laboratories, numero de catalogo A80-105).
Todos los compuestos ensayados mostraron unas IC50 en el intervalo submicromolar.
TABLA 1
Compuestode ensayo
Baja densidad CHMCanti-IgEHexos CHMCIonomicinaHexos Basofilos anti-IgE Histamina Basofilos Ionomicina Histamina Basofilos �caro del polvoHistamina Densidad elevada
CHMCanti-IgETriptasa
CHMCIonomicina Triptasa CHMCanti-IgELTC4 BMMCanti-IgEhexos BMMCIonomicina Hexos BMMCanti-IgEhistamina BMMCanti-IgELTC4 BMMCanti-IgETNF-alfa BMMCanti-IgE IL-6
R940345
1,712
R940347
0,063 99
R945242
0,247 9999
R945263
1,642
R921304
0,085 9999
R945299
R945298
9999 9999
R940344
9999
TABLA 1B
Compuesto
CHMC anti-IgE Triptasa CHMC Ionomicina Triptasa BMMC anti-IgE Hexos. BMMC anti-IgE TNF-alfa BMMC anti-IgE IL-6
R940371
0,316
R940372
0,094
R940373
8888
R940380
0,042
R940381
8888
R940382
0,104
R940384
1,32
R940386
3,42
R940387
1,19
R940389
0,06
R940390
9999 9999
R940391
0,261
R940392
0,145
R940394
16,5353
R940395
9999
R945389
0,0748 9999
R945390
0,118 9999
R945391
0,094 9999
R945392
0,085 9999
R945398
7
R945399
0,163 9999
R945400
9999
R945401
8888 9999
R945402
0,112
R945404
0,103
R945405
0,131
R945406
8888
R945407
8888
R945408
9999
R945409
9999
R945410
9999
R945412
0,095
R945413
1,698
R945416
0,053
R945417
2,52082 9999
TABLA 1B
Compuesto
CHMC anti-IgE Triptasa CHMC Ionomicina Triptasa BMMC anti-IgE Hexos. BMMC anti-IgE TNF-alfa BMMC anti-IgE IL-6
R945418
8888 9999
R945419
0,125
R945420
0,436
R945421
0,371
R945422
0,092
R945423
0,145
R945424
0,188
R945426
0,256
R945427
0,279
R945432
0,049
R945433
0,276
R945434
8888
R945439
8888
R945440
8888
R945443
0,081 9999
R945444
0,043 9999
R945454
20,6 9999
R945455
8888 9999
R945456
8888
R945458
8888
Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invenci6n inhiben selectivamente la cascada del receptor de IgE aguas arriba
Para confirmar que muchos de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion ejercen su actividad inhibidora bloqueando o inhibiendo la cascada de transduccion de senales del receptor de IgE temprana, se ensayaron varios de los compuestos en ensayos celulares para determinar la desgranulacion inducida por ionomicina, como se describe mas abajo.
Activaci6n de densidad celular baja de CHMC con ionomicina: Ensayo de triptasa
Los ensayos para la desgranulacion de mastocitos inducida por ionomicina se llevaron a cabo como se describe para los ensayos de activacion de baja densidad de CHMC con IgE (Seccion 7.5.2, mas arriba), con la excepcion de que, durante la incubacion de 1 hora, se preparo una disolucion 6X de ionomicina [5 mM de ionomicina (Sigma I-0634) en MeOH (madre) diluida 1:416,7 en tampon MT (2 !M final)] y las celulas se estimularon anadiendo 25 !l de la disolucion 6X de ionomicina a las placas apropiadas.
Activaci6n de bas6filos con ionomicina: ensayo de liberaci6n de histamina
Los ensayos para la desgranulacion de basofilos inducida por ionomicina se llevaron a cabo como se describe para el ensayo de activacion de basofilos con IgE o con acaro del polvo (Seccion 7.5.5, mas arriba), con la excepcion de que, tras la incubacion con compuesto, las celulas se estimularon con 20 !l de ionomicina 2 !M.
Resultados
Los resultados de los ensayos de desgranulacion inducida por ionomicina, dados como valores de IC50 (en !M), se proporcionan en la TABLA 1, mas arriba. De los compuestos activos ensayados (es decir, aquellos que inhiben la desgranulacion inducida por IgE), la inmensa mayoria no inhibe la desgranulacion inducida por ionomicina, confirmando que estos compuestos activos inhiben selectivamente la cascada de transduccion de senales del receptor de IgE temprana (o aguas arriba).
Estos resultados se confirmaron para ciertos compuestos midiendo el flujo de ion calcio inducido por anticuerpos anti-IgE o inducido por ionomicina en celulas CHMC. En estos ensayos del flujo de Ca2+, 10 !M de R921218 y 10 !M de R902420 inhibieron el flujo de Ca2+ inducido por anticuerpos anti-IgE, pero no tuvieron efecto sobre el flujo de Ca2+ inducido por ionomicina (vease la FIG. 4).
El efecto inhibidor de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invenci6n es inmediato
Para ensayar la inmediatez de su efecto inhibidor, se anadieron simultaneamente ciertas 2,4-pirimidindiaminas de la invencion con un activador de anticuerpo anti-IgE en los ensayos celulares descritos anteriormente. Todos los compuestos ensayados bloquearon la desgranulacion inducida por IgE de celulas CHMC en el mismo grado que el observado cuando los compuestos se preincubaron con celulas CHMC durante 10 o 30 min. antes de la reticulacion del receptor.
Cinetica de la actividad farmacol6gica in vitro
Los compuestos R921218, R921302, R921219, R926240, R940277, R926742, R926495, R909243 y R926782 se ensayaron en experimentos de lavado. En los experimentos, celulas CHMC se activaron inmediatamente con anticuerpo anti-IgE en presencia de 1,25 !M de compuesto (tiempo cero), o el compuesto se lavo tras la activacion con anticuerpo anti-IgE a 30, 60 o 120 min. La actividad inhibidora de estos compuestos disminuyo enormemente 30 min. despues de la eliminacion del compuesto, indicando que se requiere una exposicion constante de los mastocitos a estos compuestos para una inhibicion maxima de la desgranulacion. Los otros compuestos ensayados produjeron resultados similares.
Toxicidad: celulas T y B
La capacidad de los compuestos de la invencion para ejercer su actividad inhibidora sin ser toxicos para las celulas del sistema inmunitario se demostro en ensayos celulares con celulas B y T. A continuacion se proporcionan los protocolos para los ensayos.
Toxicidad de Jurkat (celula T)
Diluyanse celulas Jurkat hasta 2 x 105 celulas/ml en medio RPMI completo (10% de suero fetal bovino inactivado por calor), e incubense a 37°C, 5% de CO2 durante 18 horas. Anadanse 65 ul de celulas a 7,7 x 105 celulas/ml a una placa de 96 pocillos con fondo en V (tratada con TC, Costar) que contiene 65 ul de 2X compuesto (la concentracion final del vehiculo es 0,5% de DMSO, 1,5% de MeOH). Mezclese, e incubense las placas durante 18-24 h a 37°C, 5% de CO2. La toxicidad se evaluo mediante analisis citometrico de flujo de la dispersion de la luz celular.
Toxicidad de BJAB (celula B)
La estirpe de celulas B BJAB se cultivo en fase logaritmica en RPMI 1640 + 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, 1x L-glutamina, 1x penicilina, 1x estreptavidina y 1x betamercaptoetanol a 37°C, 5% de CO2. En primer lugar, las BJAB se cosecharon, se hicieron girar y se resuspendieron en medio de cultivo hasta una concentracion de 7,7 x 105 celulas/ml. Se mezclaron 65 ul de celulas con 65 ul de compuesto, por duplicado y en presencia de 0,1% de DMSO, en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos con fondo en V. Las celulas se incubaron con compuesto a diversas diluciones a 37°C, 5% de CO2. La toxicidad se evaluo mediante analisis citometrico de flujo de la dispersion de la luz celular.
Toxicidad: ensayo de Cell Titer Glo
Siembrense 50 !l de celulas (1 x 106/ml) en cada pocillo que contiene 50 !l de compuesto. La concentracion final del vehiculo es 0,5% de DMSO, 1,5% de MeOH. Agitense las placas durante 1 minuto para mezclar las celulas y el compuesto. Incubense las placas a 37°C (5% de CO2) durante 18 horas. Al siguiente dia, cosechense 50 !l de celulas de cada pocillo, y anadanse a 50 !l de reactivo Cell Titer Glo (Invitrogen). Agitense las placas durante 1 minuto. Leanse en un luminometro.
Resultados
En la TABLA 2, mas arriba, se presentan los resultados de los ensayos de toxicidad de las celulas T y B, dados como valores de IC50 (en !M). Con unas pocas excepciones (vease la TABLA 1), todos los compuestos ensayados no fueron toxicos ni para las celulas B ni para las celulas T a las concentraciones inhibidoras efectivas. Los ensayos realizados con celulas B primarias produjeron resultados similares.
Los compuestos son eficaces en el tratamiento de asma
La eficacia del compuesto R921304 en el tratamiento de asma tambien se demostro en un modelo de raton de asma alergica.
Protocolo de estudio
Se sensibilizaron ratones frente a ovoalbumina (proteina de pollo) en presencia de un adyuvante (Alum) por via intraperitoneal en el dia 0 y en el dia 7. Una semana mas tarde, los ratones se sometieron a una exposicion intranasalmente con ovoalbumina en los Dias 14, 15 y 16 (modelo mas restrictivo) o en el Dia 14 (modelo menos restrictivo). Este regimen de sensibilizacion y exposicion conduce a hipersensibilidad de las vias respiratorias e inflamacion en los pulmones, que son dos caracteristicas dominantes del asma alergico humano. En el modelo de raton, las respuestas in vivo de las vias respiratorias se miden usando un pletismografo de cuerpo completo que determina la PENH (pausa aumentada, Buxco Electronics). La PENH es un valor adimensional que comprende el caudal inspiratorio pico (PIF), el caudal espiratorio pico (PEF), el tiempo de inspiracion, el tiempo de expiracion y el tiempo de relajacion, y se considera un parametro validado de la sensibilidad de las vias respiratorias. Las respuestas frente a la exposicion alergenica (OVA) se comparan con animales expuestos solamente a disolucion salina. Veinticuatro horas despues de la exposicion, los ratones se exponen a dosis crecientes de metacolina (agonista del receptor muscarinico), lo que da como resultado una contraccion del musculo liso. Los ratones expuestos a ovoalbumina demuestran una hipersensibilidad significativa de las vias respiratorias a metacolina, cuando se comparan con los ratones expuestos a la disolucion salina. Ademas, se observa un infiltrado celular en las vias respiratorias en animales expuestos a ovoalbumina, cuando se comparan con los ratones expuestos a la disolucion salina. Este infiltrado celular se caracteriza principalmente por eosinofilos, pero tambien esta presente un influjo mas pequeno de neutrofilos y celulas mononucleares.
El uso de este modelo para la evaluacion de inhibidores de pequenas moleculas de la desgranulacion de mastocitos se ha validado de varias formas. En primer lugar, usando ratones con deficiencia de mastocitos (W/Wv), se ha demostrado que las respuestas inducidas por ovoalbumina dependen de la presencia de mastocitos. En los ratones con deficiencia de mastocitos, la sensibilizacion y exposicion a ovoalbumina no da como resultado una hipersensibilidad de las vias respiratorias ni influjo de eosinofilos. En segundo lugar, el estabilizador de mastocitos, cromolina, fue capaz de bloquear la hipersensibilidad e inflamacion de las vias respiratorias inducida por ovoalbumina (datos no mostrados). El uso de este modelo para evaluar compuestos para el tratamiento de respuestas asmaticas que pueden estar mediadas por mecanismos distintos de la estabilizacion de mastocitos esta apoyado ademas por el efecto inhibidor de los esteroides dexametasona y budesonida sobre la broncoconstriccion inducida por metacolina.
Resultados
La eficacia de R921304 se evaluo mediante administracion intranasal en 10 dias consecutivos, desde el Dia 7 hasta el Dia 16, a una dosis de 20 mg/kg, con las ultimas 3 dosis administradas 30 minutos antes de la exposicion a disolucion salina o a ovoalbumina. R921304 fue capaz de inhibir la hipersensibilidad de las vias respiratorias inducida por ovoalbumina frente a metacolina, cuando se compara con los ratones tratados con el vehiculo.
Estos resultados demuestran claramente que R921219 y R921304 son eficaces inhibiendo las respuestas de las vias respiratorias en un modelo de raton de asma alergica.
Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina inhiben la fosforilaci6n de proteinas aguas abajo de Syk cinasa en mastocitos activados
El efecto inhibidor de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina sobre la fosforilacion de proteinas aguas abajo de Syk cinasa se ensayo con los compuestos R921304 en celulas BMMC activadas por el receptor de IgE.
Para el ensayo, se incubaron celulas BMMC en presencia de concentraciones variables de compuesto de ensayo (0,08 !M, 0,4 !M, 2 !M y 10 !M) durante 1 h a 37°C. Las celulas se estimularon entonces con anticuerpo anti-IgE como se describe previamente. Despues de 10 min., las celulas se lisaron, y las proteinas celulares se separaron mediante electroforesis (SDS PAGE).
Tras la electroforesis, la fosforilacion de las proteinas indicadas en FIGS. 7, 10 y 11A-D se evaluo mediante inmunotransferencia. Los anticuerpos se adquirieron de Cell Signaling Technology, Beverley, MA.
Haciendo referencia a las FIGS. 7, 10 y 11A-D, los compuestos indicados ensayados inhibieron la fosforilacion de proteinas aguas abajo de Syk, pero no aguas arriba de Syk, en la cascada de senalizacion del receptor de IgE, confirmando que los compuestos inhiben aguas arriba la desgranulacion inducida por IgE, y que los compuestos ejercen su actividad inhibidora inhibiendo Syk cinasa.
Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina inhiben Syk cinasa en ensayos bioquimicos
Se ensayaron varios compuestos de 2,4-pirimidindiamina para determinar la capacidad para inhibir la fosforilacion, catalizada por Syk cinasa, de un sustrato peptidico en un ensayo bioquimico de polarizacion fluorescente con Syk cinasa aislada. En este experimento, los Compuestos se diluyeron hasta 1% de DMSO en tampon de cinasa (20 mM de HEPES, pH 7,4, 5 mM de MgCl2, 2 mM de MnCl2, 1 mM de DTT, 0,1 mg/ml de gammaglobulina bovina acetilada). El compuesto en 1% de DMSO (0,2% de DMSO final) se mezclo con disolucion de ATP/sustrato a temperatura ambiente. Se anadio Syk cinasa (Upstate, Lake Placid NY) hasta un volumen final de reaccion de 20 ul, y la reaccion se incubo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las condiciones finales de la reaccion enzimatica fueron 20 mM de HEPES, pH 7,4, 5 mM de MgCl2, 2 mM de MnCl2, 1 mM de DTT, 0,1 mg/ml de gammaglobulina bovina acetilada, 0,125 ng de Syk, 4 uM de ATP, 2,5 uM de sustrato peptidico (biotina-EQEDEPEGDYEEVLE-CONH2, SynPep Corporation). Se anadio EDTA (10 mM final)/anticuerpo anti-fosfotirosina (1X final)/trazador fosfopeptidico fluorescente (0,5X final) en tampon de dilucion FP para detener la reaccion para un volumen total de 40 ul segun las instrucciones del fabricante (PanVera Corporation). La placa se incubo durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Las placas se leyeron en un lector de placas de polarizacion de la fluorescencia Polarion (Tecan). Los datos se convirtieron en cantidad de fosfopeptido presente usando una curva de calibracion generada mediante competicion con el competidor fosfopeptidico proporcionado en el Kit de Ensayo de Tirosina Cinasa, Green (PanVera Corporation).
En la TABLA 6, a continuacion, se muestran los resultados del ensayo:
Estos datos demuestran que todos los compuestos ensayados inhiben la fosforilacion por Syk cinasa, con IC50 en el intervalo submicromolar. Todos los compuestos ensayados inhiben la fosforilacion por Syk cinasa con IC50 en el intervalo micromolar.
Los compuestos son eficaces para el tratamiento de la autoinmunidad
La eficacia in viva de ciertos compuestos de 2,4-pirimidindiamina con respecto a enfermedades autoinmunitarias se evaluo en la reaccion de Arthus pasiva inversa, un modelo agudo de lesion tisular mediada por antigenos-anticuerpos, y en varios modelos de enfermedades de autoinmunidad e inflamacion. Estos modelos son similares por cuanto un anticuerpo contra un antigeno especifico media la enfermedad inflamatoria provocada por el complejo inmunitario (provocada por IC), y la destruccion subsiguiente de tejido. La deposicion de IC en sitios anatomicos especificos (sistema nervioso central (SNC) para encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE), y sinovio para artritis inducida por colageno (CIA)) conduce a la activacion de celulas que expresan FcyR y FcsR de superficie, principalmente mastocitos, macrofagos, y neutrofilos, lo que da como resultado la liberacion de citocinas, y la quimiotaxia de neutrofilos. La activacion de la respuesta inflamatoria es responsable de las respuestas efectoras aguas abajo, incluyendo edema, hemorragia, infiltracion de neutrofilos, y liberacion de mediadores proinflamatorios. Las consecuencias de estos sucesos provocados por IC son dificiles de identificar en trastornos autoinmunitarios; no obstante, muchos investigadores han demostrado que la inhibicion de la ruta de senalizacion de FcyR en estos modelos de animales ha dado como resultado una reduccion significativa del comienzo y gravedad de la enfermedad.
Los compuestos son eficaces en la reacci6n de Arthus en el rat6n
La eficacia in vivo del compuesto R940347 para inhibir la cascada inflamatoria provocada por IC se demostro en un modelo de raton de la Reaccion de Arthus Pasiva Inversa (reaccion de RPA).
Modelo
La lesion tisular inflamatoria aguda mediada por el complejo inmunitario (IC) esta implicada en una variedad de enfermedades autoinmunitarias humanas, incluyendo sindrome de vasculitis, sindrome de suero enfermo, lupus eritematoso sistemico (SLE), artritis reumatoide, sindrome de Goodpasture, y glomerulonefritis. El modelo experimental clasico para la lesion tisular mediada por IC es la reaccion de Arthus pasiva inversa. El modelo de reaccion de RPA es un metodo in vivo conveniente para estudiar inflamacion localizada, inducida por los IC, sin efectos sistemicos. La inyeccion intradermica de anticuerpos (Ab) especificos frente a albumina de huevo de pollo (anti-IgG de OVA de conejo), seguido de la inyeccion intravenosa (IV) de antigenos (Ag), especificamente albumina de huevo de pollo (ovoalbumina, OVA), provoca deposicion perivascular de los IC y una respuesta inflamatoria rapida caracterizada por edema, infiltracion de neutrofilos y hemorragia en los sitios de inyeccion. Los aspectos del modelo de raton de reaccion de RPA se parecen a la respuesta inflamatoria de pacientes con artritis reumatoide, SLE y glomerulonefritis.
Protocolo de estudio
En este sistema modelo, los compuestos de ensayo se administran en varios momentos de tiempo antes de la administracion de los Ab y los Ag. Se inyecta intradermicamente una disolucion de anti-IgG de OVA de conejo (50 !g en 25 !l/raton), e inmediatamente le sigue una inyeccion intravenosa de albumina de huevo de pollo (20 mg/kg de peso corporal) en una disolucion que contiene 1% de colorante de azul de Evans. El grado de edema y hemorragia se mide en la piel dorsal de ratones C57BL/6, usando el colorante de azul de Evans como un indicador del dano tisular local. Como control se usa IgG de conejo policlonal purificado.
El tiempo de pretratamiento, en el que los compuestos de ensayo se administran antes de la exposicion a Ab/Ag, depende de las propiedades farmacocineticas (PK) de cada compuesto individual. Cuatro horas despues de la induccion de la reaccion de Arthus, los ratones se eutanasiaron, y los tejidos se recogieron para evaluacion del edema. Este sistema modelo nos permite identificar rapidamente la actividad in vivo de muchos inhibidores.
Resultados
Todos los compuestos ensayados se administraron mediante la via oral.
R940347 inhibio el edema en un 89% cuando se administro a una dosis de 100 mg/kg, 2 horas antes de la exposicion.
En la Tabla 7 se resumen los resultados para los compuestos ensayados.
Tabla 7
� de inhibici6n frente al control con vehiculo Concentraci6n plasm�tica � SEM (ng�ml)
Nombre del compuesto
Dosis (mg�kg) Tiepo de Pretratamiento (h) Tamano del edema � SEM Exposici6n � tiempo de pretratamiento + 4 horas
R940347
100 0,5 36,7 � 22,4 1596 � 485
1
48,2 � 5,7 3014 � 590
2
88,9 � 9,1 1992 � 247
R940347
100 1 48 nd
Tabla 7
� de inhibici6n frente al control con vehiculo Concentraci6n plasm�tica � SEM (ng�ml)
Nombre del compuesto
Dosis (mg�kg) Tiepo de Pretratamiento (h) Tamano del edema � SEM Exposici6n � tiempo de pretratamiento + 4 horas
100
2 89 nd
nd = no determinado
Los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invenci6n inhiben la activaci6n de macr6fagos
Descripci6n
La capacidad de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion para inhibir la activacion de macrofagos diferenciados se demostro midiendo la liberacion de citocinas a partir de macrofagos estimulados. La liberacion de 5 factor alfa de necrosis tumoral (TNF) e interleucina 6 (IL-6) se cuantifico en respuesta a la estimulacion con IgG o LPS.
Purificaci6n y cultivo de macr6fagos humanos
Se purificaron monocitos CD14+ a partir de PBMC (Allcells # PB002) usando el kit de aislamiento de monocitos (Miltenyi biotec #130-045-501) segun las instrucciones del fabricante. La pureza se evaluo midiendo el porcentaje de celulas CD14+ mediante citometria de flujo. Tipicamente se logro una pureza 90%. Las celulas CD14+ purificadas se
10 colocaron entonces en placas (6x106 celulas/capsula de TC de 150 cm en 15 ml de medio) en Macrophage-SFM (Gibco #12065-074) con 100 ng/ml de M-CSF (Pepro Tech #300-25), y se dejaron diferenciar durante cinco dias. Al final de ese periodo, la morfologia celular y los marcadores de superficie celular (CD14, HLA-DR, B7.1, B7.2, CD64, CD32, y CD16) reflejaron la presencia de macrofago diferenciado maduro.
Estimulaci6n con LPS
15 Para la estimulacion con LPS, se anadieron 10 ul de una disolucion madre 10X a la mezcla de celulas preincubadacompuesto, hasta una concentracion final de 10 ng/ml. Las celulas se incubaron entonces durante 16 h a 37°C, y los sobrenadantes se analizaron como se describe anteriormente.
Se compararon concentraciones variadas de compuesto frente al disolvente solo para determinar la IC50 de cada compuesto para cada citocina. Las IC50 representativas para compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invencion se
20 muestran en la Tabla 11.
Tabla 11
Compuesto
Jurkat 1� Celula T 1� Celula B Monocitos/Macrofago
CD69 IC50 (en !M)
TNF IC50 (en !M) IL2 IC50 (en !M) GMSCF IC50 (en !M) IL4 IC50 (en !M) IFNg IC50 (en !M) CD69 IC50 (en !M) TNF IC50 (en !M) IL-6 IC50 (en !M)
R940344
7,735
R940345
5,395
R940347
0,581 0,0992 1,894 1,613 0,212 1,673 0,47 0,038 0,019
R945242
1,707
R945263
4,467
R921304
0,141 1,497 2,772 1,567 0,366 2,894 0,167
R945298
9,467
R945299
1,063
R950346
1,948
R950347
2,704
R950348
0,224
R950349
0,363
R950356
5,731
R950368
0,125
R950371
1,105
R950372
2,192
R950373
3,614
R950374
1,65
R950376
18,08
R950377
5,962
R950378
9999
R950379
0,878
R950380
8,688
R950381
0,805
R950382
1,547
R950383
1,026
R950385
2,58
R950386
11,354
Aunque la invencion anterior se ha descrito con cierto detalle para facilitar la comprension, sera manifiesto que se pueden realizar algunos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anejas. En consecuencia, las realizaciones descritas se han de considerar como ilustrativas y no restrictivas, y la invencion no se limitara a los detalles dados aqui, sino que se puede modificar dentro del alcance y equivalentes de las reivindicaciones anejas.

Claims (15)

  1. Reivindicaciones
    1. Un compuesto de formula (Ia)
    o una sal del mismo, en la que:
    R5 se selecciona del grupo que consiste en halogeno, halogeno, -ORd, -SRd, haloalquiloxi (C1-C3), perhaloalquiloxi (C1-C3), -NRcRc, haloalquilo (C1-C3), perhaloalquilo (C1-C3), -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, -N3, -S(O)Rd, -S(O)2Rd, S(O)2ORd, -S(O)NRcRc; -S(O)2NRcRc, -OS(O)Rd, -OS(O)2Rd, -OS(O)2ORd, -OS(O)NRcRc, -OS(O)2NRcRc, -C(O)Rd, C(O)ORd, -C(O)NRcRc, -C(NH)NRcRc, -OC(O)Rd, -SC(O)Rd, -OC(O)ORd, -SC(O)ORd, -OC(O) NRcRc, -SC(O)NRcRc, -OC(NH)NRcRc, -SC(NH)NRcRc, -[NHC(O)]nRd, -[NHC(O)]nORd, -[NHC(O)]nNRcRc y -[NHC(NH)]nNRcRc, arilo (C5-C10) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, arilalquilo (C6-C16) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, y heteroarilalquilo de 6-16 miembros opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, alquilo (C1-C6) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, alcanilo (C1-C4) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, alquenilo (C2-C4) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, y alquinilo (C2-C4) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes;
    cada R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, halogeno, -ORd, -SRd, haloalquiloxi (C1-C3), perhaloalquiloxi (C1-C3), -NRcRc, haloalquilo (C1-C3), perhaloalquilo (C1-C3), -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, -N3, -S(O)Rd, -S(O)2Rd, -S(O)2ORd, -S(O)NRcRc; -S(O)2NRcRc, -OS(O)Rd, -OS(O)2Rd, -OS(O)2ORd, -OS(O)NRcRc, -OS(O)2NRcRc, -C(O)Rd, -C(O)ORd, -C(O)NRcRc, -C(NH)NRcRc, -OC(O)Rd, -SC(O)Rd, -OC(O)ORd, -SC(O)ORd, -OC(O)NRcRc, -SC(O)NRcRc, -OC(NH)NRcRc, -SC(NH)NRcRc, -[NHC(O)]nRd, -[NHC(O)]nORd, -[NHC(O)]nNRcRc y [NHC(NH)]nNRcRc, arilo (C5-C10) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, arilalquilo (C6-C16) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, heteroarilo de 5-10 miembros opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, y heteroarilalquilo de 6-16 miembros opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes;
    R8 se selecciona del grupo que consiste en Ra Ra, sustituido con uno o mas del mismo o diferente Ra o Rb,
    Rb, -ORa sustituidos con uno o mas del mismo o diferente Ra o Rb, -B(ORa)2, -B(NRcRc)2, -(CH2)m-Rb, -(CHRa)m-Rb, -O(CH2)m-Rb, -S-(CH2)m-Rb, -O-CHRaRb, -O-CRa(Rb)2, -O-(CHRa)m-Rb, -O-(CH2)m-CH[(CH2)mRb]Rb, -S-(CHRa)m-Rb, C(O)NH-(CH2)m-Rb, -C(O)NH-(CHRa)m-Rb, -O-(CH2)m-C(O)NH-(CH2)m-Rb, -S-(CH2)m-C(O)NH-(CH2)m-Rb, -O-(CHRa)m C(O)NH-(CHRa)m-Rb, -S-(CHRa)m-C(O)NH-(CHRa)m-Rb, -NH-(CH2)m-Rb, -NH-(CHRa)m-Rb, -N[(CH2)mRb]2, -NH-C(O)-NH(CH2)m-Rb, -NH-C(O)-(CH2)m-CHRbRb y -NH-(CH2)m-C(O)-NH-(CH2)m-Rb;
    cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo (C1-C6), hidrogeno, cicloalquilo (C3-C8), ciclohexil cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros;
    cada Rb es un grupo adecuado seleccionado independientemente del grupo que consiste en -C(O)Rd, -C(O)ORd, =O, -ORd, haloalquiloxi (C1-C3), -OCF3, =S, -SRd, =NRd, =NORd, -NRcRc, halogeno, -CF3, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -S(O)Rd, -S(O)2Rd, -S(O)2ORd, -S(O)NRcRc, -S(O)2NRcRc, -OS(O)Rd, -OS(O)2Rd, -OS(O)2ORd, -OS(O)2NRcRc, C(O)NRcRc, -C(NH)NRcRc, -C(NRa)NRcRc, -C(NOH)Ra, -C(NOH)NRcRc, -OC(O)Rd, -OC(O)ORd, -OC(O)NRcRc, -OC(NH)NRcRc, -OC(NRa)NRcRc, -[NHC(O)]nRd, -[NR3C(O)]nRd, -[NHC(O)]nORd, -[NRaC(O)]nORd, -[NHC(O)]nNRcRc, [NRaC(O)]nNRcRc, -[NHC(NH)]nNRcRc y -[NRaC(NRa)]nNRcRc;
    cada Rc es independientemente un grupo de proteccion Ra, o, como alternativa, cada Rc se toma junto con el atomo de nitrogeno al que esta enlazado para formar un cicloheteroalquilo o heteroarilo de 5 a 8 miembros que puede incluir opcionalmente uno o mas de los mismos o diferentes heteroatomos adicionales, y que puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos o diferentes Ra o grupos Rb adecuados;
    cada Rd es independientemente un Ra o un grupo de proteccion;
    cada m es independientemente un numero entero de 1 a 3; y
    cada n es independientemente un numero entero de 0 a 3.
    R2 se selecciona del grupo que consiste en alquilo (C1-C6) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, cicloalquilo (C3-C8) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, cicloheteroalquilo de 3-8 miembros opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, arilo (C5-C15) opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes, y heteroarilo de 5-15 miembros opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos R8 o diferentes;
    R4 es
    en la que: cada Y1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, NR37, S, SO, SO2, SONR36 y NH; R36 es hidrogeno o alquilo; y R37 se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno o un progrupo seleccionado del grupo que consiste en -CH2
    PO(OR8)2, arilo, arilalquilo, heteroarilo, Ra, Rb, -CRaRb-O-C(O)R8, -CRaRb-O-PO(OR8)2, -CH2-O-PO(OR8)2, -C(O)-CRaRbN(CH3)2, -CRaRb-O-C(O)-CRaRb-N(CH3)2, -C(O)R8, y -C(O)-NR8-C(O)R8.
  2. 2.
    El compuesto segun la reivindicacion 1, en el que R8 se selecciona independientemente del grupo que consiste en Rd, -NRcRc, -(CH2)m-NRcRc, -C(O)NRcRc, -(CH2)m-C(O)NRcRc, -C(O)ORd, -(CH2)m-C(O)ORd y -(CH2)m-ORd.
  3. 3.
    El compuesto segun la reivindicacion 1 o 2, en el que cada Rc se toma junto con el atomo de nitrogeno al que esta enlazado para formar un cicloheteroalquilo o heteroarilo de 5 a 8 miembros que opcionalmente puede incluir uno o mas de los mismos heteroatomos adicionales o diferentes, y que puede estar opcionalmente sustituido con uno o mas de los mismos grupos Ra o Rb o diferentes adecuados.
  4. 4.
    El compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que R5 es fluoro y R6 es H.
  5. 5.
    El compuesto segun la reivindicacion 1 de formula
    en la que: Rx y Ry son independientemente H o metilo; y Rz es (a) piperazin-1-ilo sustituido en el N en la posicion 4 con metoxicarbonilo, metilcarbonilo, o metilo, o (b) morfolinilo.
  6. 6. El compuesto segun la reivindicacion 1 que es 5-Fluoro-N2-(4-morfolinofenil)-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina; N4-(2,2-Dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirido[1,4]oxazin-6-il]-5-fluoro-N2-[4-(4-metoxicarbonilpiperazino)fenil]-2,4
    pirimidindiamina; N2-[4-(4-Acetilpiperazino)fenil]-N4-(2,2-dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirido[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina; N4-(2,2-Dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(4-morfolinofenil)-2,4-pirimidindiamina; 5-Fluoro-N2-[4-(4-metilpiperazino)fenil]-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina; N4-(2,2-Dimetil-2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-[4-(4-metilpiperazino)fenil]-2,4-pirimidindiamina; o una sal farmaceuticamente aceptable de uno de los anteriores.
  7. 7.
    Una composicion que comprende un compuesto segun una de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehiculo, excipiente o diluyente farmaceuticamente aceptable.
  8. 8.
    Un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una composicion segun la reivindicacion 7, para uso en un metodo para tratar o prevenir una enfermedad autoinmunitaria y/o uno o mas sintomas asociados con ella en un mamifero, comprendiendo el metodo administrar al mamifero una cantidad eficaz de un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una composicion segun la reivindicacion 7.
  9. 9.
    El compuesto o composicion segun la reivindicacion 8, en el que el mamifero es un ser humano.
  10. 10.
    El compuesto o la composicion segun la reivindicacion 9, en el que la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en enfermedades autoinmunitarias que se denominan frecuentemente como trastornos autoinmunitarios de un solo organo o de un solo tipo de celulas, y enfermedades autoinmunitarias que se denominan frecuentemente por implicar un trastorno autoinmunitario sistemico.
  11. 11.
    El compuesto o la composicion segun la reivindicacion 9, en el que la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolitica autoinmunitaria, gastritis atrofica autoinmunitaria de anemia perniciosa, encefalomielitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, enfermedad de Goodpasture, trombocitopenia autoinmunitaria, oftalmia simpatica, miastenia grave, enfermedad de Graves, cirrosis biliar primaria, hepatitis agresiva cronica, colitis ulcerosa y glomerulopatia membranosa.
  12. 12.
    El compuesto o la composicion segun la reivindicacion 9, en el que la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en lupus eritematoso sistemico, artritis reumatoide, sindrome de Sjogren, sindrome de Reiter, polimiositis, dermatomiositis, esclerosis sistemica, panarteritis nudosa, esclerosis multiple y penfigoide ampolloso.
  13. 13.
    El compuesto o la composicion segun la reivindicacion 9, en el que la enfermedad autoinmunitaria es lupus eritematoso sistemico.
  14. 14.
    El compuesto o la composicion segun la reivindicacion 9, en el que la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide.
  15. 15.
    El compuesto o la composicion segun la reivindicacion 9, en el que la enfermedad autoinmunitaria es esclerosis multiple.
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