ES2337782T3 - Metodos para tratar o prevenir enfermedades autoinmunitarias con compuestos de 2,4-pirimidindiamina. - Google Patents
Metodos para tratar o prevenir enfermedades autoinmunitarias con compuestos de 2,4-pirimidindiamina. Download PDFInfo
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Abstract
Un compuesto de 2,4-pirimidindiamina para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria distinta de colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino, y enfermedad inflamatoria del intestino idiopática, en el que el compuesto de 2,4-pirimidindiamina es: un compuesto de formula estructural (I): **(Ver fórmula)** o una sal, hidrato, solvato y/o un N-óxido del mismo, en la que: L1 y L2 son cada uno un enlace directo; R2 se selecciona del grupo que consiste en fenilo monosustituido en la posición 3 ó 5 con un grupo R8, fenilo di- o tri-sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R8, y un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define más abajo; R4 se selecciona del grupo que consiste en fenilo sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R8, y un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define más abajo; en la que, para R2 y R4, cada uno de dicho heteroarilo opcionalmente sustituido, independientemente entre sí, se selecciona del grupo que consiste en: **(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)** en las que: p es un número entero de uno a tres; cada - - - representa independientemente un enlace sencillo o un doble enlace; R35 es hidrógeno o R8; X se selecciona del grupo que consiste en CH, N y N-O; cada Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S y NH; cada Y1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S, SO, SO2, SONR36, NH y NR37; cada Y2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en CH, CH2, O, S, N, NH y NR37; R36 es hidrógeno o alquilo; R37 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y un progrupo seleccionado del grupo que consiste en arilo, arilalquilo, heteroarilo, Ra, Rb, -CRaRb-O-C(O)R8, -CRaRb-O-PO(OR8)2, -CH2-O-PO(OR8)2, -CH2-PO(OR8)2, -C(O)-CRaRb-N(CH3)2, -CRaRb-O-C(O)-CRaRb-N(CH3)2, -C(O)R8, -C(O)CF3 y -C(O)-NR8-C(O)R8; R38 se selecciona del grupo que consiste en alquilo y arilo; A se selecciona del grupo que consiste en O, NH y NR38; R9, R10, R11 y R12 se selecciona cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en alquilo, alcoxi, halógeno, haloalcoxi, aminoalquilo e hidroxialquilo, o, como alternativa, R9 y R10 y/o R11 y R12 se toman juntos para formar un cetal; cada Z se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxi, ariloxi, éster, y carbamato; Q se selecciona del grupo que consiste en -OH, -OR8, -NRcRc, -NR39-CHR40-Rb, -NR39-(CH2)m-Rb y -NR39-C(O)-CHR40-NRcRc; R39 y R40 se seleccionan cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo y NHR8; R5 se selecciona del grupo que consiste en -CN, -NC, fluoro, haloalquilo (C1-C3), perhaloalquilo (C1-C3), haloalcoxi (C1-C3), perhaloalcoxi (C1-C3), -C(O)Ra, -C(O)ORa, -C(O)CF3 y -C(O)OCF3; R6 es hidrógeno; R8 se selecciona del grupo que consiste en Re, Rb, Re sustituido con uno o más del mismo o diferente Ra o Rb, -ORa sustituido con uno o más del mismo o diferente Ra o Rb, -B(ORa)2, -B(NRcRc)2, -(CH2)m-Rb, -(CHRa)m-Rb, -O-(CH2)m-Rb, -S-(CH2)m-Rb, -O-CHRaRb, -O-CRa(Rb)2, -O-(CHRa)m-Rb, -O-(CH2)m-CH[(CH2)mRb]Rb, -S-(CHRa)m-Rb, -C(O)NH-(CH2)m-Rb, -C(O)NH-(CHRa)m-Rb, -O-(CH2)m-C(O)NH-(CH2)m-Rb, -S-(CH2)m-C(O)NH-(CH2)m-Rb, -O-(CHRa)m-C(O)NH-(CHRa)m-Rb, -S-(CHRa)m-C(O)NH-(CHRa)m-Rb, -NH-(CH2)m-Rb, -NH-(CHRa)m-Rb, -N[(CH2)mRb]2, -NH-C(O)-NH-(CH2)m-Rb, -NH-C(O)-(CH2)m-CHRbRb y -NH-(CH2)m-C(O)-NH-(CH2)m-Rb; cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C8), cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros; cada Rb es un grupo adecuado seleccionado independientemente del grupo que consiste en =O, -ORd, haloalquiloxi (C1-C3), =S, -SRd, =NRd, =NORd, -NRcRc, halógeno, -CF3, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -S(O)Rd, -S(O)2Rd, -S(O)2ORd, -S(O)NRcRc, -S(O)2NRcRc, -OS(O)Rd, -OS(O)2Rd, -OS(O)2ORd, -OS(O)2NRcRc, -C(O)Rd, -C(O)ORd, -C(O)NRcRc, -C(NH)NRcRc, -C(NRa)NRcRc, -C(NOH)Ra, -C(NOH)NRcRc, -OC(O)Rd, -OC(O)ORd, -OC(O)NRcRc, -OC(NH)NRcRc, -OC(NRa)NRcRc, -[NHC(O)]nRd, -[NR3C(O)]nRd, -[NHC(O)]nORd, -[NRaC(O)]nORd, -[NHC(O)]nNRcRc, -[NRaC(O)]nNRcRc, -[NHC(NH)]nNRcRc y -[NRaC(NRa)]n NRcRc; cada Rc es independientemente Ra, o, como alternativa, dos Rc se toman juntos con el átomo de nitrógeno al que están enlazados para formar un cicloheteroalquilo o heteroarilo de 5 a 8 miembros que puede incluir opcionalmente uno o más de los mismos o diferentes heteroátomos adicionales, y que puede estar opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes Ra o grupos Rb adecuados; cada Rd es independientemente un Ra; cada Re se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C8), cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros; cada m es independientemente un número entero de 1 a 3; y cada n es independientemente un número entero de 0 a 3; o el compuesto de 2,4-pirimidindiamina es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 7.4.214 a 7.4.244, 7.4.250 a 7.4.252, 7.4.256 a 7.4.258, 7.4.262 a 7.4.269, 7.4.272 a 7.4.276, 7.4.278 a 7.4.280, 7.4.283 a 7.4.289, 7.4.296, 7.4.298 a 7.4.302, 7.4.304, 7.4.305, 7.4.308 a 7.4.313, 7.4.315, 7.4.317, y 7.4.318; con las condiciones de que en la fórmula (I): (1)cuando R2 es un fenilo sustituido, entonces R5 es diferente de ciano o -C(O)NHR, en el que R es hidrógeno o alquilo (C1-C6); (2)cuando R2 y R4 son cada uno independientemente un indol sustituido o no sustituido, entonces R2 y R4 están unidos al resto de la molécula vía un átomo de carbono anular; y (3)el compuesto no sea **(Ver fórmula)**
Description
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Métodos para tratar o prevenir enfermedades
autoinmunitarias con compuestos de
2,4-pirimidindiamina.
La presente invención se refiere generalmente a
compuestos de 2,4-pirimidindiamina y a composiciones
farmacéuticas que comprenden los compuestos para uso en el
tratamiento o prevención de enfermedades autoinmunitarias y/o los
síntomas asociados con ellas.
La reticulación de los receptores Fc, tales como
el receptor de elevada afinidad por IgE (FcERI) y/o el receptor de
elevada afinidad por IgG (Fc\gammaRI), activa una cascada de
señalización en mastocitos, basófilos y otras células inmunitarias
que da como resultado la liberación de mediadores químicos
responsables de numerosos sucesos adversos. Por ejemplo, tal
reticulación conduce a la liberación de mediadores preformados de
reacciones de hipersensibilidad anafiláctica de tipo I (inmediata),
tales como histamina, desde los sitios de almacenamiento en
gránulos vía la desgranulación. También conduce a la síntesis
y liberación de otros mediadores, incluyendo leucotrienos,
prostaglandinas y factores activadores de plaquetas (PAF), que
desempeñan papeles importantes en reacciones inflamatorias.
Mediadores adicionales que se sintetizan y se liberan con la
reticulación de receptores Fc incluyen citocinas y óxido
nítrico.
La cascada o cascadas de señalización activadas
por la reticulación de receptores Fc tales como FceRI y/o
Fc\gammaRI comprenden un conjunto de proteínas celulares. Entre
los propagadores de señales intracelulares más importantes están
las tirosina cinasas. Y, una tirosina cinasa importante implicada en
las rutas de transducción de señales asociadas con la reticulación
de los receptores Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI, así como otras
cascadas de transducción de señales, es Syk cinasa (véase
Valent et al., 2002, Intl. J. Hematol.
75(4):257-362 para un repaso).
Puesto que los mediadores liberados como
resultado de la reticulación de los receptores Fc\varepsilonRI y
Fc\gammaRI son responsables de, o desempeñan papeles importantes
en, la manifestación de numerosos sucesos adversos, sería muy
deseable la disponibilidad de compuestos capaces de inhibir la
cascada o cascadas de señalización responsables de su liberación.
Además, dado el papel crítico que Syk cinasa desempeña en
esta(s) y en otra(s) cascada(s) de
señalización de receptores, también sería muy deseable la
disponibilidad de compuestos capaces de inhibir Syk cinasa.
El documento WO 01/600.816 describe inhibidores
de cinasas. El documento WO 01/64656 describe
2,4-di(hetero)arilamino-(oxi)-5-pirimidinas
como agentes antineoplásicos. El documento WO 00/39101 describe
derivados de pirimidina que son útiles como agentes contra el
cáncer. El documento US-A-5958935
describe 2-anilinopirimidinas sustituidas útiles
como inhibidores de proteína cinasas. El documento WO 01/47897
describe compuestos N-heterocíclicos que bloquean
la producción de citocinas vía inhibición de p38 cinasa. El
documento WO 00/58305 describe compuestos que son moduladores de la
actividad de receptores de quimiocinas. El documento WO 03/063794,
que se publicó el 7 de agosto de 2003, describe compuestos de
2,4-pirimidindiamina que inhiben las cascadas de
señalización de los receptores de IgE y/o IgG que conducen a la
liberación de mediadores químicos. El documento WO 03/078.404, que
se publicó el 25 de septiembre de 2003, describe derivados de
pirimidina útiles en trastornos en los que la inhibición de
zap-70 y/o Syk desempeña un papel, o provocados por
un mal funcionamiento de cascadas de señalización conectadas con
FAK. El documento WO 03/076.437, publicado el 18 de septiembre de
2003, describe 2-heteroarilpirimidinas inhibidoras
de CDK. El documento WO 03/002.544, publicado el 9 de enero de 2003,
describe inhibidores N-heterocíclicos de la
expresión de TNF-\alpha. El documento WO
03/026.664, publicado el 3 de abril de 2003, describe derivados de
2-fenilamino-4-(5-pirazolilamino)-pirimidina
como inhibidores de cinasas, en particular inhibidores de SRC
cinasas. El documento GB-A-2.373.186
describe combinaciones farmacéuticas de un antagonista de CCR3 y un
compuesto que es útil en el tratamiento de asma, enfermedad alérgica
o inflamación.
Los compuestos usados en la invención
generalmente comprenden un "núcleo" de
2,4-pirimidindiamina que tiene la siguiente
estructura y convención numérica:
Los compuestos usados en la invención están
sustituidos en el nitrógeno de C2 (N2), para formar una amina
secundaria, y además están sustituidos en la posición C5. Los
compuestos también están sustituidos en el nitrógeno de C4 (N4),
para formar una amina secundaria. El sustituyente en N2, así como
los sustituyentes opcionales en las otras posiciones, puede oscilar
ampliamente en carácter y propiedades fisicoquímicas. Por ejemplo,
el sustituyente o sustituyentes pueden ser un alquilo ramificado, de
cadena lineal o cíclico, un heteroalquilo ramificado, de cadena
lineal o cíclico, un arilo mono- o policíclico, un
heteroarilo mono- o policíclico, o combinaciones de
estos grupos. Estos grupos sustituyentes pueden estar sustituidos
adicionalmente, como se describirá con más detalle más abajo.
Los sustituyentes de N2 y/o N4 están unidos
directamente a sus átomos de nitrógeno respectivos.
Los sustituyentes en las posiciones N2, N4 y C5
pueden estar sustituidos adicionalmente con uno o más de los mismos
o diferentes grupos sustituyentes. La naturaleza de estos grupos
sustituyentes puede variar ampliamente. Los ejemplos no limitantes
de grupos sustituyentes adecuados incluyen alquilos ramificados, de
cadena lineal o cíclica, arilos mono- o policíclicos,
heteroalquilos ramificados, de cadena lineal o cíclicos,
heteroarilos mono- o policíclicos, halos, haloalquilos
ramificados, de cadena lineal o cíclicos, hidroxilos, oxos, tioxos,
alcoxis ramificados, de cadena lineal o cíclicos, haloalcoxis
ramificados, de cadena lineal o cíclicos, trimetoxis, ariloxis
mono- o policíclicos, heteroariloxis mono- o
policíclicos, éteres, alcoholes, sulfuros, tioéteres, sulfanilos
(tioles), iminas, azos, azidas, aminas (primarias, secundarias y
terciarias), nitrilos (cualquier isómero), cianatos (cualquier
isómero), tiocianatos (cualquier isómero), nitrosos, nitros, diazos,
sulfóxidos, sulfonilos, ácidos sulfónicos, sulfamidas,
sulfonamidas, ésteres sulfámicos, aldehídos, cetonas, ácidos
carboxílicos, ésteres, amidas, amidinas, formadinas, aminoácidos,
acetilenos, carbamatos, lactonas, lactamas, glucósidos,
gluconúridos, sulfonas, cetales, acetales, tiocetales, oximas,
ácidos oxámicos, ésteres oxámicos, etc., y combinaciones de estos
grupos. Los grupos sustituyentes que poseen funcionalidades
reactivas pueden estar protegidos o no protegidos, como es bien
conocido en la técnica.
La presente invención proporciona un compuesto
de 2,4-pirimidindiamina para uso en el tratamiento
de una enfermedad autoinmunitaria distinta de enfermedad de Crohn,
colitis ulcerosa, intestino inflamatorio, y enfermedad inflamatoria
idiopática del intestino, en el que el compuesto de
2,4-pirimidindiamina es:
un compuesto de fórmula estructural (I):
o una sal, hidrato, solvato y/o un
N-óxido del mismo, en la
que:
- \quad
- L^{1} y L^{2} son cada uno un enlace directo;
- \quad
- R^{2} se selecciona del grupo que consiste en fenilo monosustituido en la posición 3 ó 5 con un grupo R^{8}, fenilo di- o tri-sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R^{8}, y un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define más abajo;
- \quad
- R^{4} se selecciona del grupo que consiste en fenilo sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R^{8}, y un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define más abajo; en la que, para R^{2} y R^{4}, cada uno de dicho heteroarilo opcionalmente sustituido, independientemente entre sí, se selecciona del grupo que consiste en:
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en las
que:
- \quad
- p es un número entero de uno a tres;
- \quad
- cada - - - representa independientemente un enlace sencillo o un doble enlace;
- \quad
- R^{35} es hidrógeno o R^{8};
- \quad
- X se selecciona del grupo que consiste en CH, N y N-O;
- \quad
- cada Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S y NH;
- \quad
- cada Y^{1} se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S, SO, SO_{2}, SONR^{36}, NH y NR^{37};
- \quad
- cada Y^{2} se selecciona independientemente del grupo que consiste en CH, CH_{2}, O, S, N, NH y NR^{37};
- \quad
- R^{36} es hidrógeno o alquilo;
- \quad
- R^{37} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y un progrupo seleccionado del grupo que consiste en arilo, arilalquilo, heteroarilo, R^{a}, R^{b}, -CR^{a}R^{b}-O-C(O)R^{8}, -CR^{a}R^{b}-O-PO(OR^{8})_{2}, -CH_{2}-O-PO(OR^{8})_{2}, -CH_{2}-PO(OR^{8})_{2}, -C(O)-CR^{a}R^{b}-N(CH_{3})_{2}, -CR^{a}R^{b}-O-C(O)-CR^{a}R^{b}-N(CH_{3})_{2}, -C(O)R^{8}, -C(O)CF_{3} y -C(O)-NR^{8}-C(O)R^{8};
- \quad
- R^{38} se selecciona del grupo que consiste en alquilo y arilo;
- \quad
- A se selecciona del grupo que consiste en O, NH y NR^{38};
- \quad
- R^{9}, R^{10}, R^{11} y R^{12} se selecciona cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en alquilo, alcoxi, halógeno, haloalcoxi, aminoalquilo e hidroxialquilo, o, como alternativa, R^{9} y R^{10} y/o R^{11} y R^{12} se toman juntos para formar un cetal;
- \quad
- cada Z se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxi, ariloxi, éster, y carbamato;
- \quad
- Q se selecciona del grupo que consiste en -OH, -OR^{8}, -NR^{c}R^{c}, -NR^{39}-CHR^{40}-R^{b}, -NR^{39}-(CH_{2})_{m}-R^{b} y -NR^{39}-C(O)-CHR^{40}-NR^{c}R^{c};
- \quad
- R^{39} y R^{40} se seleccionan cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo y NHR^{8};
- \quad
- R^{5} se selecciona del grupo que consiste en -CN, -NC, fluoro, haloalquilo (C1-C3), perhaloalquilo (C1-C3), haloalcoxi (C1-C3), perhaloalcoxi (C1-C3), -C(O)R^{a}, -C(O)OR^{a}, -C(O)CF_{3} y -C(O)OCF_{3};
- \quad
- R^{6} es hidrógeno;
- \quad
- R^{8} se selecciona del grupo que consiste en R^{e}, R^{b}, R^{e} sustituido con uno o más del mismo o diferente R^{a} o R^{b}, -OR^{a} sustituido con uno o más del mismo o diferente R^{a} o R^{b}, -B(OR^{a})_{2}, -B(NR^{c}R^{c})_{2}, -(CH_{2})_{m}-R^{b}, -(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -S-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -O-CHR^{a}R^{b}, -O-CR^{a}(R^{b})_{2}, -O-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-CH[CH_{2})_{m}R^{b}]R^{b}, -S-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -S-(CH_{2})_{m}-C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -O-(CHR^{a})_{m}-C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -S-(CHR^{a})_{m}-C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -N[(CH_{2})_{m}R^{b}]_{2}, -NH-C(O)-NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -NH-C(O)-(CH_{2})_{m}-CHR^{b}R^{b} y -NH-(CH_{2})_{m}-C(O)-NH-(CH_{2})_{m}- R^{b};
- \quad
- cada R^{a} se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C8), cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros;
- \quad
- cada R^{b} es un grupo adecuado seleccionado independientemente del grupo que consiste en =O, -OR^{d}, haloalquiloxi (C1-C3), =S, -SR^{d}, =NR^{d}, =NOR^{d}, -NR^{c}R^{c}, halógeno, -CF_{3}, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO_{2}, =N_{2}, -N_{3}, -S(O)R^{d}, -S(O)_{2}R^{d}, -S(O)_{2}OR^{d}, -S(O)NR^{c}R^{c}, -S(O)_{2}NR^{c}R^{c}, -OS(O)R^{d}, -OS(O)_{2}R^{d}, -OS(O)_{2}OR^{d}, -OS(O)_{2}NR^{c}R^{c}, -C(O)R^{d}, -C(O)OR^{d}, -C(O)NR^{c}R^{c}, -C(NH)NR^{c}R^{c}, -C(NR^{a})NR^{c}R^{c}, -C(NOH)R^{a}, -C(NOH)NR^{c}R^{c}, -OC(O)R^{d}, -OC(O)OR^{d}, -OC(O)NR^{c}R^{c}, -OC(NH)NR^{c}R^{c}, -OC(NR^{a})NR^{c}R^{c}, -[NHC(O)]_{n}R^{d}, -[NR^{a}C(O)]_{n}R^{d}, -[NHC(O)]_{n} OR^{d}, -[NR^{a}C(O)]_{n}OR^{d}, -[NHC(O)]_{n}NR^{c}R^{c}, -[NR^{a}C(O)]_{n}NR^{c}R^{c}, -[NHC(NH)]_{n}NR^{c}R^{c} y -[NR^{a}C(NR^{a})]_{n}NR^{c} R^{c};
- \quad
- cada R^{c} es independientemente R^{a}, o, como alternativa, dos R^{c} se toman juntos con el átomo de nitrógeno al que están enlazados para formar un cicloheteroalquilo o heteroarilo de 5 a 8 miembros que puede incluir opcionalmente uno o más de los mismos o diferentes heteroátomos adicionales, y que puede estar opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes R^{a} o grupos R^{b} adecuados;
- \quad
- cada R^{d} es independientemente un R^{a};
- \quad
- cada R^{e} se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C8), cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros;
- \quad
- cada m es independientemente un número entero de 1 a 3; y
- \quad
- cada n es independientemente un número entero de 0 a 3; o
- \quad
- el compuesto de 2,4-pirimidindiamina es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 7.4.214 a 7.4.244, 7.4.250 a 7.4.252, 7.4.256 a 7.4.258, 7.4.262 a 7.4.269, 7.4.272 a 7.4.276, 7.4.278 a 7.4.280, 7.4.283 a 7.4.289, 7.4.296, 7.4.298 a 7.4.302, 7.4.304, 7.4.305, 7.4.308 a 7.4.313, 7.4.315, 7.4.317, y 7.4.318;
- \quad
- con las condiciones de que en la fórmula (I):
- (1)
- cuando R^{2} es un fenilo sustituido, entonces R^{5} es diferente de ciano o -C(O)NHR, en el que R es hidrógeno o alquilo (C1-C6);
- (2)
- cuando R^{2} y R^{4} son cada uno independientemente un indol sustituido o no sustituido, entonces R^{2} y R^{4} están unidos al resto de la molécula vía un átomo de carbono anular; y
- (3)
- el compuesto no sea
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- \quad
- Se describen profármacos de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina. Tales profármacos pueden ser activos en su forma de profármaco, o pueden ser inactivos hasta que se convierten en condiciones fisiológicas u otras condiciones de uso en una forma de fármaco activo. En los profármacos, uno o más grupos funcionales de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina están incluidos en prorrestos que se escinden de la molécula en las condiciones de uso, típicamente mediante hidrólisis, escisión enzimática o algún otro mecanismo de escisión, para producir los grupos funcionales. Por ejemplo, se pueden incluir grupos amino primario o secundario en un prorresto de amida que se escinde en condiciones de uso para generar el grupo amino primario o secundario. De este modo, los profármacos incluyen tipos especiales de grupos protectores, denominados "progrupos", que enmascaran uno o más grupos funcionales de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina que se escinden en las condiciones de uso para dar un compuesto farmacéutico de 2,4-pirimidindiamina activo. Los grupos funcionales en el compuesto de 2,4-pirimidindiamina que se pueden enmascarar con progrupos para la inclusión en un prorresto incluyen, pero no se limitan a, aminas (primarias y secundarias), hidroxilos, sulfanilos (tioles), carboxilos, carbonilos, fenoles, catecoles, dioles, alquinos, fosfatos, etc. En la técnica se conocen miríadas de progrupos adecuados para enmascarar tales grupos funcionales para producir prorrestos que son escindibles en las condiciones deseadas de uso. Todos estos progrupos, solos o en combinaciones, se pueden incluir en los profármacos de la invención. Ejemplos específicos de prorrestos que producen grupos amina primaria o secundaria que se pueden incluir en los profármacos incluyen, pero no se limitan a, amidas, carbamatos, iminas, ureas, fosfenilos, fosforilos y sulfenilos. Los ejemplos específicos de prorrestos que producen grupos sulfanilo que se pueden incluir en los profármacos incluyen, pero no se limitan a, tioéteres, por ejemplo derivados S-metílicos (monotio-, ditio-, oxitio-, aminotioacetales), sililtioéteres, tioésteres, tiocarbonatos, tiocarbamatos, disulfuros asimétricos, etc. Los ejemplos específicos de prorrestos que se escinden para producir grupos hidroxilo que se pueden incluir en los profármacos incluyen, pero no se limitan a, sulfonatos, ésteres y carbonatos. Ejemplos específicos de prorrestos que producen grupos carboxilo que se pueden incluir en los profármacos incluyen, pero no se limitan a, ésteres (incluyendo ésteres de sililo, ésteres y tioésteres de ácido oxámico), amidas e hidrazidas.
En un ejemplo, los profármacos son compuestos
según la fórmula estructural (I) en los que el grupo protector de
R^{c} y R^{d} es un progrupo.
La sustitución de los hidrógenos unidos a N2 y
N4 en las 2,4-pirimidindiaminas de fórmula
estructural (I) por sustituyentes afecta adversamente a la
actividad de los compuestos. Sin embargo, como apreciarán los
expertos, estos nitrógenos se pueden incluir en prorrestos que, en
condiciones de uso, se escinden para producir
2,4-pirimidindiaminas según la fórmula estructural
(I). De este modo, en otro ejemplo, los profármacos son compuestos
según la fórmula estructural (II):
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incluyendo sales, hidratos,
solvatos y N-óxidos del mismo, en la
que:
- \quad
- R^{2}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, L^{1} y L^{2} son como se define previamente para la fórmula estructural (I); y
- \quad
- R^{2b} y R^{4b} son cada uno, independientemente entre sí, un progrupo.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la presente invención
proporciona composiciones para uso según la invención, comprendiendo
la composición uno o más compuestos y un vehículo, excipiente o
diluyente apropiado. La naturaleza exacta del vehículo, excipiente
o diluyente dependerá del uso deseado para la composición, y puede
oscilar desde adecuada o aceptable para usos veterinarios a
adecuada o aceptable para uso humano.
Se describen intermedios útiles para sintetizar
los compuestos y profármacos de
2,4-pirimidindiamina. En un ejemplo, los
intermedios son 4-pirimidinaminas según la fórmula
estructural (III):
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incluyendo sales, hidratos,
solvatos y N-óxidos del mismo, en la que R^{4}, R^{5}, R^{6} y
L^{2} son como se define anteriormente para la fórmula
estructural (I); LG es un grupo saliente tal como, por ejemplo,
-S(O)_{2}Me, -SMe o halo (por ejemplo, F, Cl,
Br, I); y R^{40} es hidrógeno o un
progrupo.
\newpage
En otro ejemplo, los intermedios son
2-pirimidinaminas según la fórmula estructural
(IV):
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incluyendo sales, hidratos,
solvatos y N-óxidos de las mismas, en la que R^{2}, R^{5},
R^{6} y L^{1} son como se define previamente para la fórmula
estructural (I); LG es un grupo saliente, tal como, por ejemplo,
-S(O)_{2}Me, -SMe o halo (por ejemplo, P, Cl, Bar,
I) y R^{2c} es hidrógeno o un
progrupo.
Todavía en otro ejemplo, los intermedios son
4-amino- o
4-hidroxi-2-pirimidinaminas
según la fórmula estructural (V):
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incluyendo sales, hidratos,
solvatos y N-óxidos de las mismas, en la que R^{2}, R^{5},
R^{6} y L^{1} son como se define previamente para la fórmula
estructural (I), R^{7} es un grupo amino o hidroxilo, y R^{2c}
es hidrógeno o un
progrupo.
En otro ejemplo, los intermedios son citosinas
sustituidas en N4 según la fórmula estructural (VI):
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incluyendo sales, hidratos,
solvatos y N-óxidos de las mismas, en la que R^{4}, R^{5},
R^{5} y L^{2} son como se define previamente para la fórmula
estructural (I), y R^{4c} es hidrógeno o un
progrupo.
Se describen métodos para sintetizar los
compuestos y profármacos de 2,4-pirimidindiamina. En
un ejemplo, el método implica hacer reaccionar una
4-pirimidinamina según la fórmula estructural (III)
con una amina de la fórmula
HR^{26}N-L^{1}-R^{2}, en la
que L^{1}, R^{2} y R^{2c} son como se define previamente para
la fórmula estructural (IV), para producir una
2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural
(I) o un profármaco según la fórmula estructural
(II).
(II).
En otro ejemplo, el método implica hacer
reaccionar una 2-pirimidinamina según la fórmula
estructural (IV) con una amina de la fórmula
R^{4}-L^{2}-NHR^{40}, en la
que L^{4}, R^{4} y R^{4c} son como se define previamente para
la fórmula estructural (III), para producir una
2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural
(I) o un profármaco según la fórmula estructural (II).
\newpage
Todavía en otro ejemplo, el método implica hacer
reaccionar una
4-amino-2-pirimidinamina
según la fórmula estructural (V) (en la que R^{7} es un grupo
amino) con una amina de la fórmula
R^{4}-L^{2}-NHR^{4c}, en la
que L^{2}, R^{4} y R^{4c} son como se define para la fórmula
estructural (III), para producir una
2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural
(I) o un profármaco según la fórmula estructural (II). Como
alternativa, la
4-amino-2-pirimidinamina
se puede hacer reaccionar con un compuesto de fórmula
R^{4}-L^{2}-LG, en la que
R^{4} y L^{2} son como se define previamente para la fórmula
estructural (I), y LG es un grupo saliente.
Todavía en otro ejemplo, el método implica
halogenar una
4-hidroxi-2-pirimidinamina
según la fórmula estructural (V) (R^{7} es un grupo hidroxilo)
para producir una 2-pirimidinamina según la fórmula
estructural (IV), y hacer reaccionar esta pirimidinamina con una
amina apropiada, como se describe anteriormente.
Todavía en otro ejemplo, el método implica
halogenar una citosina sustituida en N4 según la fórmula estructural
(VI) para producir una 4-pirimidinamina según la
fórmula estructural (III), y hacer reaccionar esta pirimidinamina
con una amina apropiada, como se describe anteriormente.
Los compuestos de
2,4-pirimidindiamina usados en la invención son
potentes inhibidores de la desgranulación de inmunocitos, tales
como mastocitos, basófilos, neutrófilos y/o eosinófilos. De este
modo, se describen métodos para regular, y en particular inhibir,
la desgranulación de tales células. El método implica generalmente
poner en contacto una célula que se desgranula con una cantidad de
un compuesto o profármaco de 2,4-pirimidindiamina,
o una sal aceptable, hidrato, solvato, N-óxido y/o composición del
mismo, efectiva para regular o inhibir la desgranulación de la
célula. El método se puede poner en práctica en contextos in
vitro o en contextos in vivo como un enfoque terapéutico
para el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por,
provocadas por o asociadas con la desgranulación celular.
Aunque no se pretende estar atados por ninguna
teoría de operación, los datos bioquímicos confirman que los
compuestos de 2,4-pirimidindiamina ejercen su efecto
inhibidor de la desgranulación, al menos en parte, bloqueando o
inhibiendo la cascada o cascadas de transducción de señales iniciada
por la reticulación de los receptores Fc de elevada afinidad para
IgE ("Fc\varepsilonRI") y/o IgG ("Fc\gammaRI"). De
hecho, los compuestos de 2,4-pirimidindiamina son
potentes inhibidores de la desgranulación mediada tanto por
Fc\varepsilonRI como por Fc\gammaRI. Como consecuencia, los
compuestos de 2,4-pirimidina se pueden usar para
inhibir estas cascadas de señalización de los receptores Fc en
cualquier tipo de célula que exprese tales receptores
Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI, incluyendo, pero sin limitarse
a, macrófagos, mastocitos, basófilos, neutrófilos y/o
eosinófilos.
Los métodos también permiten la regulación de, y
en particular la inhibición de, procesos aguas abajo que resultan
como consecuencia de la activación de tal cascada o cascadas de
señalización de los receptores Fc. Tales procesos aguas abajo
incluyen, pero no se limitan a, la desgranulación mediada por
Fc\varepsilonRI y/o mediada por Fc\gammaRI, la producción de
citocinas y/o la producción y/o la liberación de mediadores
lipídicos tales como leucotrienos y prostaglandinas. El método
implica generalmente poner en contacto una célula que expresa un
receptor Fc, tal como uno de los tipos celulares explicados
anteriormente, con una cantidad de un compuesto o profármaco de
2,4-pirimidindiamina, o una sal aceptable, hidrato,
disolvente, N-óxido y/o composición del mismo, eficaz para regular
o inhibir la cascada de señalización del receptor Fc y/o un proceso
aguas abajo afectado por la activación de esta cascada de
señalización. El método se puede poner en práctica en contextos
in vitro o en contextos in vivo como un enfoque
terapéutico dirigido al tratamiento o prevención de enfermedades
caracterizadas por, provocadas por o asociadas con la cascada de
señalización del receptor Fc, tales como enfermedades afectadas por
la liberación de mediadores químicos específicos de los gránulos
con la desgranulación, la liberación y/o síntesis de citocinas, y/o
la liberación y/o síntesis de mediadores lipídicos tales como
leucotrienos y prostaglandinas.
La presente invención proporciona los compuestos
de 2,4-pirimidina definidos para uso en el
tratamiento y/o prevención de enfermedades caracterizadas por,
provocadas por o asociadas con la liberación de mediadores químicos
como consecuencia de la activación de cascadas de señalización de
los receptores Fc, tales como las cascadas de señalización de
Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI. Los métodos se pueden poner en
práctica en animales en los contextos veterinarios, o en seres
humanos. Los métodos generalmente implican administrar a un sujeto
animal o a un ser humano una cantidad de un compuesto o profármaco
de 2,4,-pirimidindiamina o una sal aceptable, hidrato, solvato,
N-óxido y/o una composición del mismo, eficaz para tratar o prevenir
la enfermedad. Como se explica previamente, la activación de la
cascada de señalización de los receptores Fc\varepsilonRI y
Fc\gammaRI en ciertas células inmunitarias conduce a la liberación
y/o síntesis de una variedad de sustancias químicas que son
mediadores farmacológicos de una amplia variedad de enfermedades.
Cualquiera de estas enfermedades se puede tratar o prevenir.
Por ejemplo, en mastocitos y basólilos, la
activación de la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI o
Fc\gammaRI conduce a la liberación inmediata (es decir, en
1-3 min. de la activación del receptor) de
mediadores preformados de reacciones de hipersensibilidad atópica
y/o de tipo I (por ejemplo, histamina, proteasas tales como
triptasa, etc.) vía el proceso de desgranulación. Tales
reacciones de hipersensibilidad atópica o de tipo I incluyen, pero
no se limitan a, reacciones anafilácticas al medio ambiente y a
otros alérgenos (por ejemplo, pólenes, venenos de insectos
y/o animales, alimentos, fármacos, colorantes de contraste, etc.),
reacciones anafilactoides, fiebre del heno, conjuntivitis alérgica,
rinitis alérgica, asma alérgica, dermatitis atópica, eccema,
urticaria, trastornos de la mucosa, trastornos de los tejidos, y
ciertos trastornos gastrointestinales.
\newpage
La liberación inmediata de los mediadores
preformados vía la desgranulación es seguida de la liberación y/o
síntesis de una variedad de otros mediadores químicos, incluyendo,
entre otros, el factor activador de plaquetas (PAF),
prostaglandinas y leucotrienos (por ejemplo, LTC4), y la
síntesis de novo y la liberación de citocinas tales como
TNF\alpha, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-13, etc. El primero de
estos dos procesos se produce aproximadamente 3-30
min. tras la activación del receptor; el último, aproximadamente 30
min-7 h tras la activación del receptor. Se piensa
que estos mediadores de "etapa tardía" son responsables en
parte de los síntomas crónicos de las reacciones de
hipersensibilidad atópica y de tipo I enumeradas anteriormente, y
además son mediadores químicos de la inflamación y enfermedades
inflamatorias (por ejemplo, osteoartritis, enfermedad inflamatoria
del intestino, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad
inflamatoria idiopática del intestino, síndrome de intestino
irritable, colon espástico, etc.), cicatrización de bajo grado (por
ejemplo, esclerodermia, fibrosis incrementada, queloides,
cicatrices post-quirúrgicas, fibrosis pulmonar,
espasmos vasculares, migraña, lesión por reperfusión y postinfarto
del miocardio), y complejo o síndrome seco. Todas estas enfermedades
se pueden tratar o prevenir.
Enfermedades adicionales que se pueden tratar o
prevenir incluyen enfermedades asociadas con patología de basófilos
y/o mastocitos. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no
se limitan a, enfermedades de la piel tales como esclerodermia,
cardiopatías tales como postinfarto de miocardio, enfermedades
pulmonares tales como cambios o remodelación del músculo pulmonar y
enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) y enfermedades del
intestino tales como síndrome inflamatorio del intestino (colon
espástico).
Los compuestos de
2,4-pirimidindiamina usados en la invención son
también potentes inhibidores de la tirosina cinasa Syk cinasa. Se
describen métodos para regular, y en particular inhibir, la
actividad de Syk cinasa. El método implica generalmente poner en
contacto una Syk cinasa, o una célula que comprende una Syk cinasa,
con una cantidad de un compuesto o profármaco de
2,4-pirimidindiamina de la invención, o una sal
aceptable, hidrato, solvato, N-óxido y/o composición del mismo,
eficaz para regular o inhibir la actividad de Syk cinasa. En un
ejemplo, la Syk cinasa es una Syk cinasa aislada o recombinante. En
otro ejemplo, la Syk cinasa es una Syk cinasa endógena o
recombinante expresada por una célula, por ejemplo un mastocito o un
basófilo. El método se puede poner en práctica en contextos in
vitro o en contextos in vivo como un enfoque terapéutico
para el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por,
provocadas por o asociadas con la actividad de Syk cinasa.
Aunque no se pretende estar atados por ninguna
teoría particular de operación, se cree que los compuestos de
2,4-pirimidindiamina inhiben la desgranulación
celular y/o la liberación de otros mediadores químicos
principalmente inhibiendo Syk cinasa que es activada a través del
homodímero de la cadena gamma de Fc\varepsilonRI (véase,
por ejemplo, Fig. 2). Este homodímero de la cadena gamma es
compartido por otros receptores Fc, incluyendo Fc\gammaRI,
Fc\gammaRIII y Fc\alphaRI. Para todos estos receptores, la
transducción de señal intracelular está mediada por el homodímero
de la cadena gamma común. La unión y la agregación de esos
receptores da como resultado el reclutamiento y activación de
tirosina cinasas tales como Syk cinasa. Como consecuencia de estas
actividades de señalización común, los compuestos de
2,4-pirimidindiamina descritos aquí que se
metabolizan en tales compuestos de
2,4-pirimidindiamina activos se pueden usar para
regular, y en particular inhibir, las cascadas de señalización de
receptores Fc que tienen este homodímero de la cadena gamma, tales
como Fc\varepsilonRI, Fc\gammaRI, Fc\gammaRIII y
Fc\alphaRI, así como las respuestas celulares provocadas a través
de estos receptores.
Se sabe que Syk cinasa desempeña un papel
crítico en otras cascadas de señalización. Por ejemplo, Syk cinasa
es un efector de la señalización del receptor de células B (BCR)
(Turner et al., 2000, Immunology Today
21:148-154), y es un componente esencial de la
señalización de integrina beta(1), beta(2) y
beta(3) en neutrófilos (Mocsai et al., 2002, Immunity
16:547-558). Puesto que los compuestos de
2,4-pirimidindiamina descritos aquí son potentes
inhibidores de Syk cinasa, se pueden usar para regular, y en
particular inhibir, cualquier cascada de señalización en la que Syk
desempeñe un papel, tal como, por ejemplo, las cascadas de
señalización de los receptores Fc, de BCR y de integrinas, así como
las respuestas celulares provocadas mediante estas cascadas de
señalización. La respuesta celular particular, regulada o inhibida,
dependerá, en parte, del tipo celular específico y de la cascada de
señalización del receptor, como es bien conocido en la técnica. Los
ejemplos no limitantes de respuestas celulares que pueden ser
reguladas o inhibidas con los compuestos de
2,4-pirimidindiamina incluyen un estallido
respiratorio, adhesión celular, desgranulación celular, diseminación
celular, migración celular, fagocitosis (por ejemplo, en
macrófagos), flujo de iones calcio (por ejemplo, en
mastocitos, basófilos, neutrófilos, eosinófilos y células B),
agregación plaquetaria, y maduración celular (por ejemplo, en
células B).
De este modo, en otro aspecto, se describen
métodos para regular, y en particular inhibir, cascadas de
transducción de señales en las que Syk desempeña un papel. El
método generalmente implica poner en contacto un receptor
dependiente de Syk, o una célula que expresa un receptor dependiente
de Syk, con una cantidad de un compuesto o profármaco de
2,4-pirimidindiamina, o una sal aceptable, hidrato,
solvato, N-óxido y/o composición del mismo, eficaz para regular o
inhibir la cascada de transducción de señales. Los métodos también
se pueden usar para regular, y en particular inhibir, procesos
aguas abajo o respuestas celulares provocadas por la activación de
la cascada de transducción de señales dependiente de Syk particular.
Los métodos se pueden poner en práctica para regular cualquier
cascada de transducción de señales en la que no se sabe o se ha
descubierto posteriormente que Syk desempeña un papel. Los métodos
se pueden poner en práctica en contextos in vitro o en
contextos in vivo como un enfoque terapéutico para el
tratamiento o prevención de enfermedades caracterizadas por,
provocadas por o asociadas con la activación de la cascada de
transducción de señales dependiente de Syk. Los ejemplos no
limitados de tales enfermedades incluyen las explicadas
anteriormente.
Los datos celulares y de animales también
confirman que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina
también se pueden usar para tratar o prevenir enfermedades
autoinmunitarias y/o síntomas de tales enfermedades. Los métodos
generalmente implican administrar a un sujeto que sufre una
enfermedad autoinmunitaria, o que tiene riesgo de desarrollar una
enfermedad autoinmunitaria, una cantidad de un compuesto o
profármaco de 2,4-pirimidindiamina, o una sal
aceptable, N-óxido, hidrato, solvato o composición del mismo, eficaz
para tratar o prevenir la enfermedad autoinmunitaria y/o sus
síntomas asociados. Las enfermedades autoinmunitarias que se pueden
tratar o prevenir con los compuestos de
2,4-pirimidindiamina incluyen aquellas enfermedades
que están asociadas habitualmente con reacciones de
hipersensibilidad no anafiláctica (reacciones de hipersensibilidad
de tipo II, tipo III y/o tipo IV), y/o aquellas enfermedades que
están mediadas, al menos en parte, por la activación de la cascada
de señalización de Fc\gammaR en monocitos. Tal enfermedad
autoinmunitaria incluye, pero no se limita a, aquellas enfermedades
autoinmunitarias que se denominan frecuentemente como trastornos
autoinmunitarios de órgano individual o de tipo celular individual,
y aquella enfermedad autoinmunitaria que se denomina frecuentemente
como trastorno autoinmunitario sistémico. Los ejemplos no limitantes
de enfermedades denominadas frecuentemente como trastornos
autoinmunitarios de órgano individual o de tipo celular individual
incluyen: tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica
autoinmunitaria, gastritis atrófica autoinmunitaria de anemia
perniciosa, encefalomielitis autoinmunitaria, orquitis
autoinmunitaria, enfermedad de Goodpasture, trombocitopenia
autoinmunitaria, oftalmia simpática, miastenia grave, enfermedad de
Graves, cirrosis biliar primaria, hepatitis agresiva crónica,
colitis ulcerosa y glomerulopatía membranosa. Los ejemplos no
limitantes de enfermedades denominadas a menudo como trastorno
autoinmunitario sistémico incluyen: lupus eritematoso sistémico,
artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, síndrome de Reiter,
polimiositis-dermatomiositis, esclerosis sistémica,
panarteritis nudosa, esclerosis múltiple y penfigoide
ampolloso.
ampolloso.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 proporciona un dibujo que ilustra la
producción de IgE inducida por alérgenos, y la liberación
consiguiente de mediadores preformados y otros mediadores químicos
a partir de mastocitos;
la Fig. 2 proporciona un dibujo que ilustra la
cascada de transducción de señales de Fc\varepsilonRI que conduce
a la desgranulación de mastocitos y/o basófilos;
la Fig. 3 proporciona un dibujo que ilustra los
puntos de acción putativos de compuestos que inhiben selectivamente
aguas arriba la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI, y
compuestos que inhiben la desgranulación tanto mediada por
Fc\varepsilonRI como inducida por ionomicina;
la Fig. 4 proporciona gráficas que ilustran los
efectos de ciertos compuestos de
2,4-pirimidindiamina, DMSO (control) y ionomicina
sobre el flujo de Ca^{2+} en células CHMC;
la Fig. 5 proporciona gráficas que ilustran la
inmediatez de la actividad inhibidora de los compuestos R921218 y
R926495;
la Fig. 6 proporciona una gráfica que ilustra el
efecto de lavado sobre la actividad inhibidora de los compuestos
R921218 y R921302;
la Fig. 7 proporciona datos que muestran que
concentraciones variables de los compuestos R921218 (A) y R921219
(B) inhiben la fosforilación de diversas proteínas aguas abajo de
Syk cinasa en la cascada de transducción de señales del receptor de
IgE en células BMMC activadas;
la Fig. 8 proporciona datos que muestran la
inhibición, sensible a la dosis, de la fosforilación de Syk cinasa
de un sustrato endógeno (LAT) y un sustrato peptídico en presencia
de concentraciones crecientes de los compuestos R921218 (X),
R921219 (Y) y R921304 (Z);
la Fig. 9 proporciona datos que muestran que la
inhibición de Syk cinasa por el compuesto R921219 es competitiva
con ATP;
la Fig. 10 proporciona datos que muestran que
concentraciones variables de los compuestos R921219 (A) y R218218
(B) inhiben la fosforilación de proteínas aguas abajo de Syk cinasa,
pero no LYN cinasa, en la cascada de transducción de señales de
Fc\varepsilonRI en células CHMC activadas; también se muestra la
inhibición de la fosforilación de proteínas aguas abajo de LYN
cinasa, pero no Syk cinasa, en presencia de un inhibidor de LYN
cinasa conocido (PP2);
las Figs. 11A-D proporcionan
datos que muestran la inhibición de la fosforilación de proteínas
aguas abajo de Syk cinasa en la cascada de transducción de señales
de Fc\varepsilonRI en células BMMC;
la Fig. 12 es una gráfica que ilustra la
eficacia del compuesto R921302 en un modelo de ratón de artritis
inducida por anticuerpos contra el colágeno ("CAIA");
\newpage
la Fig. 13 es una gráfica que ilustra la
eficacia del compuesto R921302 en el modelo de CAIA en comparación
con otros agentes y agentes de control;
la Fig. 14 es una gráfica que ilustra la
eficacia del compuesto R921302 en un modelo de rata de artritis
inducida por colágeno ("CIA");
la Fig. 15 es una gráfica que ilustra la
eficacia del compuesto R921302 en la inhibición de encefalomielitis
autoinmunitaria experimental ("EAE") en ratones, un modelo
clínico para esclerosis múltiple; y
la Fig. 16 es una gráfica que ilustra la
eficacia del compuesto R921302 sobre ratones SJL tratados en el día
de partida de la inmunización con 150 \mug de POLIPÉPTIDO
139-151/200 \mug de MTB (CFA).
\vskip1.000000\baselineskip
Como se usan aquí, los siguientes términos están
destinados a tener los siguientes significados:
- \quad
- "Alquilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un radical hidrocarbonado monovalente ramificado, de cadena lineal o cíclico, saturado o insaturado, que tiene el número señalado de átomos de carbono (es decir, C1-C6 significa uno a seis átomos de carbono), que deriva de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un alcano, alqueno o alquino progenitor. Los grupos alquilo típicos incluyen, pero no se limitan a, metilo; etilos tales como metilo; etilos tales como etanilo, etenilo, etinilo; propilos tales como propan-1-ilo, propan-2-ilo, ciclopropan-1-ilo, prop-1-en-1-ilo, prop-1-en-2-ilo, prop-2-en-1-ilo, cicloprop-1-en-1-ilo; cicloprop-2-en-1-ilo, prop-1-in-1-ilo, prop-2-in-1-ilo, etc.; butilos tales como butan-1-ilo, butan-2-ilo, 2-metil-propan-1-ilo, 2-metil-propan-2-ilo, ciclobutan-1-ilo, but-1-en-1-ilo, but-1-en-2-ilo, 2-metil-prop-1-en-1-ilo, but-2-en-1-ilo, but-2-en-2-ilo, buta-1,3-dien-1-ilo, buta-1,3-dien-2-ilo, ciclobut-1-en-1-ilo, ciclobut-1-en-3-ilo, ciclobuta-1,3-dien-1-ilo, but-1-in-1-ilo, but-1-in-3-ilo, but-3-in-1-ilo, etc.; y similares. Cuando se pretenden niveles específicos de saturación, se usa la nomenclatura "alcanilo", "alquenilo" y/o "alquinilo", como se define más abajo. En realizaciones preferidas, los grupos alquilo son alquilo (C1-C6).
- \quad
- "Alcanilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un alquilo ramificado, de cadena lineal o cíclico, saturado, derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un alcano progenitor. Grupos alcanilo típicos incluyen, pero no se limitan a, metanilo; etanilo; propanilos tales como propan-1-ilo, propan-2-ilo (isopropilo), ciclopropan-1-ilo, etc.; butanilos tales como butan-1-ilo, butan-2-ilo (sec-butilo), 2-metil-propan-1-ilo (isobutilo), 2-metil-propan-2-ilo (t-butilo), ciclobutan-1-ilo, etc.; y similares. En realizaciones preferidas, los grupos alcanilo son alcanilo (C1-C6).
- \quad
- "Alquenilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un alquilo ramificado, de cadena lineal o cíclico, insaturado, que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono, derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un alqueno progenitor. El grupo puede estar en conformación cis o trans alrededor del doble o dobles enlaces. Grupos alquenilo típicos incluyen, pero no se limitan a, etenilo; propenilos tales como prop-1-en-1-ilo, prop-1-en-2-ilo, prop-2-en-1-ilo, prop-2-en-2-ilo, cicloprop-1-en-1-ilo, cicloprop-2-en-1-ilo; butenilos tales como but-1-en-1-ilo, but-1-en-2-ilo, 2-metil-prop-1-en-1-ilo, but-2-en-1-ilo, but-2-en-2-ilo, buta-1,3-dien-1-ilo, buta-1,3-dien-2-ilo, ciclobut-1-en-1-ilo, ciclobut-1-en-3-ilo, ciclobuta-1,3-dien-1-ilo, etc.; y similares. En realizaciones preferidas, el grupo alquenilo es alquenilo (C2-C6).
- \quad
- "Alquinilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un alquilo ramificado, de cadena lineal o cíclico, insaturado, que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono, derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un alquino progenitor. Grupos alquinilo típicos incluyen, pero no se limitan a, etinilo; propinilos tales como prop-1-in-1-ilo, prop-2-in-1-ilo, etc.; butinilos tales como but-1-in-1-ilo, but-1-in-3-ilo, but-3-in-1-ilo, etc.; y similares. En realizaciones preferidas, el grupo alquinilo es alquinilo (C2-C6).
- \quad
- "Alquildiilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo hidrocarbonado divalente ramificado, de cadena lineal o cíclico, saturado o insaturado, que tiene el número señalado de átomos de carbono (es decir, C1-C6 significa de uno a seis átomos de carbono), derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de cada uno de dos átomos de carbono diferentes de un alcano, alqueno o alquino progenitor, o mediante la eliminación de dos átomos de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un alcano, alqueno o alquino progenitor. Los dos centros radicálicos monovalentes, o cada valencia del centro radical divalente, pueden formar enlaces con los mismos átomos o con átomos diferentes. Los grupos alquildiilo típicos incluyen, pero no se limitan a, metandiilo; etildiilos tales como etan-1,1-diilo, etan-1,2-diilo, eten-1,1-diilo, eten-1,2-diilo; propildiilos tales como propan-1,1-diilo, propan-1,2-diilo, propan-2,2-diilo, propan-1,3-diilo, ciclopropan-1,1-diilo, ciclopropan-1,2-diilo, prop-1-en-1,1-diilo, prop-1-en-1,2-diilo, prop-2-en-1,2-diilo, prop-1-en-1,3-diilo, cicloprop-1-en-1,2-diilo, cicloprop-2-en-1,2-diilo, cicloprop-2-en-1,1-diilo, prop-1-in-1,3-diilo, etc.; butildiilos tales como butan-1,1-diilo, butan-1,2-diilo, butan-1,3-diilo, butan-1,4-diilo, butan-2,2-diilo, 2-metil-propan-1,1-diilo, 2-metil-propan-1,2-diilo, ciclobutan-1,1-diilo, ciclobutan-1,2-diilo, ciclobutan-1,3-diilo, but-1-en-1,1-diilo, but-1-en-1,2-diilo, but-1-en-1,3-diilo, but-1-en-1,4-diilo, 2-metil-prop-1-en-1,1-diilo, 2-metaniliden-propan-1,1-diilo, buta-1,3-dien-1,1-diilo, buta-1,3-dien-1,2-diilo, buta-1,3-dien-1,3-diilo, buta-1,3-dien-1,4-diilo, ciclobut-1-en-1,2-diilo, ciclobut-1-en-1,3-diilo, ciclobut-2-en-1,2-diilo, ciclobuta-1,3-dien-1,2-diilo, ciclobuta-1,3-dien-1,3-diilo, but-1-in-1,3-diilo, but-1-in-1,4-diilo, buta-1,3-diin-1,4-diilo, etc.; y similares. Cuando se pretenden niveles específicos de saturación, se usa la nomenclatura alcanildiilo, alquenildiilo y/o alquinildiilo. Cuando se pretende específicamente que las dos valencias estén en el mismo átomo de carbono, se usa la nomenclatura "alquilideno". En algunas realizaciones, el grupo alquildiilo es alquildiilo (C1-C6). También se prefieren grupos alcanildiilo acíclicos saturados en los que los centros radicálicos están en los carbonos terminales, por ejemplo metandiilo (metano); etan-1,2-diilo (etano); propan-1,3-diilo (propano); butan-1,4-diilo (butano); y similares (también denominados como alquilenos, definidos más abajo).
- \quad
- "Alquileno", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo alquildiilo saturado o insaturado, de cadena lineal, que tiene dos centros radicálicos monovalentes terminales derivados de la eliminación de un átomo de hidrógeno de cada uno de los dos átomos de carbono terminales de un alcano, alqueno o alquino progenitor de cadena lineal. El localizador de un doble enlace o un triple enlace, si está presente, en un alquileno particular, se indica entre corchetes. Los grupos alquileno típicos incluyen, pero no se limitan a, metano; etilenos tales como etano, eteno, etino; propilenos tales como propano, prop[1]eno, propa[1,2]dieno, prop[1]ino, etc.; butilenos tales como butano, but[1]eno, but[2]eno, buta[1,3]dieno, but[1]ino, but[2]ino, buta[1,3]diino, etc.; y similares. Cuando se pretenden niveles específicos de saturación, se usa la nomenclatura alcano, alqueno y/o alquino. En realizaciones preferidas, el grupo alquileno es alquileno (C1-C6) o (C1-C3). También se prefieren grupos alcano saturados de cadena lineal, por ejemplo metano, etano, propano, butano, y similares.
- \quad
- "Heteroalquilo", "heteroalcanilo", "heteroalquenilo", "heteroalquinilo", "heteroalquildiilo" y "heteroalquileno", por sí mismos o como parte de otro sustituyente, se refieren a grupos alquilo, alcanilo, alquenilo, alquinilo, alquildiilo y alquileno, respectivamente, en los que uno o más de los átomos de carbono están sustituidos cada uno independientemente con los mismos heteroátomos o grupos heteroatómicos, o diferentes. Los heteroátomos y/o grupos heteroatómicos típicos que pueden sustituir a los átomos de carbono incluyen, pero no se limitan a, -O-, -S-, -S-O-, -NR'-, -PH-, -S(O)-, -S(O)_{2}-, -S(O)NR'-, -S(O)_{2}NR'-, y similares, incluyendo sus combinaciones, en los que cada R' es independientemente hidrógeno o alquilo (C1-C6).
- \quad
- "Cicloalquilo" y "Heterocicloalquilo", por sí mismos o como parte de otro sustituyente, se refieren a versiones cíclicas de grupos "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. Para grupos heteroalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición que está unida al resto de la molécula. Los grupos cicloalquilo típicos incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo; ciclobutilos tales como ciclobutanilo y ciclobutenilo; ciclopentilos tales como ciclopentanilo y ciclopentenilo; ciclohexilos tales como ciclohexanilo y ciclohexenilo; y similares. Los grupos heterocicloalquilo típicos incluyen, pero no se limitan a, tetrahidrofuranilo (por ejemplo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, etc.), piperidinilo (por ejemplo, piperidin-1-ilo, piperidin-2-ilo, etc.), morfolinilo (por ejemplo, morfolin-3-ilo, morfolin-4-ilo, etc.), piperazinilo (por ejemplo, piperazin-1-ilo, piperazin-2-ilo, etc.), y similares.
- \quad
- "Puente heteroatómico acíclico" se refiere a un puente divalente en el que los átomos de la cadena principal son exclusivamente heteroátomos y/o grupos heteroatómicos. Los puentes heteroatómicos acíclicos típicos incluyen, pero no se limitan a, -O-, -S-, -S-O-, -NR'-, -PH-, -S(O)-, -S(O)_{2}-, -S(O)NR'-, -S(O)_{2}NR'-, y similares, incluyendo sus combinaciones, en los que cada R' es independientemente hidrógeno o alquilo (C1- C6).
- \quad
- "Sistema de anillo aromático progenitor" se refiere a un sistema anular cíclico o policíclico insaturado que tiene un sistema de electrones \pi conjugados. Específicamente se incluyen en la definición de "sistema de anillo aromático progenitor" los sistemas de anillos condensados en los que uno o más de los anillos son aromáticos y uno o más de los anillos están saturados o insaturados, tales como, por ejemplo, fluoreno, indano, indeno, fenaleno, tetrahidronaftaleno, etc. Los sistemas de anillos aromáticos progenitores típicos incluyen, pero no se limitan a aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benceno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, hexaceno, hexafeno, hexaleno, indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, octaceno, octafeno, octaleno, ovaleno, penta-2,4-dieno, pentaceno, pentaleno, pentafeno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleyadeno, pireno, pirantreno, rubiceno, tetrahidronaftaleno, trifenileno, trinaftaleno, y similares, así como los diversos hidroisómeros de los mismos.
- \quad
- "Arilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo hidrocarbonado aromático monovalente que tiene el número señalado de átomos de carbono (es decir, CS-C15 significa de 5 a 15 átomos de carbono), derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un sistema de anillo aromático progenitor. Los grupos arilo típicos incluyen, pero no se limitan a, grupos derivados de aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benceno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, hexaceno, hexafeno, hexaleno, as-indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, octaceno, octafeno, octaleno, ovaleno, penta-2,4-dieno, pentaceno, pentaleno, pentafeno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleyadeno, pireno, pirantreno, rubiceno, trifenileno, trinaftaleno, y similares, así como sus diversos hidroisómeros. En realizaciones preferidas, el grupo arilo es arilo (CS-C15), siendo incluso más preferido (CS-C10). Arilos particularmente preferidos son ciclopentadienilo, fenilo y naftilo.
- \quad
- "Arilarilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo hidrocarbonado monovalente derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un sistema anular en el que dos o más sistemas de anillos aromáticos progenitores idénticos o no idénticos están unidos directamente entre sí mediante un enlace sencillo, en el que el número de tales uniones anulares directas es uno menos el número de sistemas de anillos aromáticos progenitores implicados. Grupos arilarilo típicos incluyen, pero no se limitan a, bifenilo, trifenilo, fenil-naftilo, binaftilo, bifenil-naftilo, y similares. Cuando se especifica el número de átomos de carbono en un grupo arilarilo, los números se refieren a los átomos de carbono que comprenden cada anillo aromático progenitor. Por ejemplo, arilarilo (CS-C15) es un grupo arilarilo en el que cada anillo aromático comprende de 5 a 15 carbonos, por ejemplo bifenilo, trifenilo, binaftilo, fenilnaftilo, etc. Preferiblemente, cada sistema de anillo aromático progenitor de un grupo arilarilo es independientemente un aromático (CS-C15), más preferiblemente un aromático (CS-C10). También se prefieren grupos arilarilo en los que todos los sistemas de anillos aromáticos progenitores son idénticos, por ejemplo bifenilo, trifenilo, binaftilo, trinaftilo, etc.
- \quad
- "Biarilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo arilarilo que tiene dos sistemas aromáticos progenitores idénticos unidos directamente entre sí mediante un enlace sencillo. Grupos biarilo típicos incluyen, pero no se limitan a, bifenilo, binaftilo, biantracilo, y similares. Preferiblemente, los sistemas de anillos aromáticos son anillos aromáticos (CS-C15), más preferiblemente anillos aromáticos (C5-C10). Un grupo biarilo particularmente preferido es bifenilo.
- \quad
- "Arilalquilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo alquilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno enlazado a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono terminal o sp^{3}, se sustituye por un grupo arilo. Grupos arilalquilo típicos incluyen, pero no se limitan a, bencilo, 2-feniletan-1-ilo, 2-fenileten-1-ilo, naftilmetilo, 2-naftiletan-1-ilo, 2-naftileten-1-ilo, naftobencilo, 2-naftofeniletan-1-ilo y similares. Cuando se pretenden restos alquílicos específicos, se usa la nomenclatura arilalcanilo, arilalquenilo y/o arilalquinilo. En realizaciones preferidas, el grupo arilalquilo es arilalquilo (C6-C21), por ejemplo el resto alcanilo, alquenilo o alquinilo del grupo arilalquilo es (C1-C6) y el resto arílico es (C5-C15). En realizaciones particularmente preferidas, el grupo arilalquilo es (C6-C13), por ejemplo el resto alcanilo, alquenilo o alquinilo del grupo arilalquilo es (C1-C3) y el resto arílico es (C5-C10).
- \quad
- "Sistema de anillo aromático progenitor" se refiere a un sistema de anillo aromático progenitor en el que uno o más átomos de carbono se sustituyen cada uno independientemente por el mismo o diferentes heteroátomos o grupos heteroatómicos. Los heteroátomos o grupos heteroatómicos típicos para sustituir a los átomos de carbono incluyen, pero no se limitan a, N, NH, P, O, S, S(O), S(O)_{2}, Si, etc. Se incluyen específicamente en la definición de "sistemas de anillos heteroaromáticos progenitores" sistemas de anillos condensados en los que uno o más de los anillos son aromáticos, y uno o más de los anillos están saturados o insaturados, tales como, por ejemplo, benzodioxano, benzofurano, cromano, cromeno, indol, indolina, xanteno, etc. También se incluyen en la definición de "sistema de anillo heteroaromático progenitor" aquellos anillos reconocidos que incluyen sustituyentes habituales, tales como, por ejemplo, benzopirona y 1-metil-1,2,3,4-tetrazol. Se excluyen específicamente de la definición de "sistema de anillo heteroaromático progenitor" anillos bencénicos condensados con polialquilenglicoles cíclicos tales como polietilenglicoles cíclicos. Los sistemas de anillos heteroaromáticos progenitores típicos incluyen, pero no se limitan a, acridina, bencimidazol, bencisoxazol, benzodioxano, benzodioxol, benzofurano, benzopirona, benzotiadiazol, benzotiazol, benzotriazol, benzoxacina, benzoxazol, benzoxazolina, carbazol, \beta-carbolina, cromano, cromeno, cinolina, furano, imidazol, indazol, indol, indolina, indolicina, isobenzofurano, isocromeno, isoindol, isoindolina, isoquinolina, isotiazol, isoxazol, naftiridina, oxadiazol, oxazol, perimidina, fenantridina, fenantrolina, fenazina, ftalacina, pteridina, purina, pirano, pirazina, pirazol, piridazina, piridina, pirimidina, pirrol, pirrolicina, quinazolina, quinolina, quinolicina, quinoxalina, tetrazol, tiadiazol, tiazol, tiofeno, triazol, xanteno, y similares.
- \quad
- "Heteroarilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo heteroaromático monovalente que tiene el número señalado de átomos anulares (por ejemplo, "5-14 miembros" significa de 5 a 14 átomos anulares), derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de un sistema de anillo heteroaromático progenitor. Grupos heteroarilo típicos incluyen, pero no se limitan a, grupos derivados de acridina, bencimidazol, bencisoxazol, benzodioxano, benzodiaxol, benzofurano, benzopirona, benzotiadiazol, benzotiazol, benzotriazol, benzoxacina, benzoxazol, benzoxazolina, carbazol, \beta-carbolina, cromano, cromeno, cinolina, furano, imidazol, indazol, indol, indolina, indolicina, isobenzofurano, isocromeno, isoindol, isoindolina, isoquinolina, isotiazol, isoxazol, naftiridina, oxadiazol, oxazol, perimidina, fenantridina, fenantrolina, fenazina, ftalacina, pteridina, purina, pirano, pirazina, pirazol, piridazina, piridina, pirimidina, pirrol, pirrolicina, quinazolina, quinolina, quinolicina, quinoxalina, tetrazol, tiadiazol, tiazol, tiofeno, triazol, xanteno, y similares, así como sus diversos hidroisómeros. En realizaciones preferidas, el grupo heteroarilo es un heteroarilo de 5-14 miembros, siendo particularmente preferido heteroarilo de 5-10 miembros.
- \quad
- "Heteroaril-heteroarilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo heteroaromático monovalente derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de un sistema anular en el que dos o más sistemas de anillos heteroaromáticos progenitores idénticos o no idénticos están unidos directamente entre sí mediante un enlace sencillo, en el que el número de tales uniones anulares directas es uno menos el número de sistemas de anillos heteroaromáticos progenitores implicados. Los grupos heteroaril-heteroarilo típicos incluyen, pero no se limitan a, bipiridilo, tripiridilo, piridilpurinilo, bipurinilo, etc. Cuando se especifica el número de átomos, los números se refieren al número de átomos que comprenden cada uno de los sistemas de anillos heteroaromáticos progenitores. Por ejemplo, heteroaril-heteroarilo de 5-15 miembros es un grupo heteroaril-heteroarilo en el que cada sistema de anillo heteroaromático progenitor comprende de 5 a 15 átomos, por ejemplo bipiridilo, tripuridilo, etc. Preferiblemente, cada sistema de anillo heteroaromático progenitor es independientemente un heteroaromático de 5-15 miembros, más preferiblemente un heteroaromático de 5-10 miembros. También se prefieren grupos heteroaril-heteroarilo en los que todos los sistemas de anillos heteroaromáticos progenitores son idénticos.
- \quad
- "Biheteroarilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo heteroaril-heteroarilo que tiene dos sistemas de anillos heteroaromáticos progenitores idénticos unidos directamente entre sí mediante un enlace sencillo. Grupos biheteroarilo típicos incluyen, pero no se limitan a, bipiridilo, bipurinilo, biquinolinilo, y similares. Preferiblemente, los sistemas de anillos heteroaromáticos son anillos heteroaromáticos de 5-15 miembros, más preferiblemente anillos heteroaromáticos de 5-10 miembros.
- \quad
- "Heteroarilalquilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo alquilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno enlazado a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono terminal o sp^{3}, está sustituido por un grupo heteroarilo. Cuando se pretenden restos alquílicos específicos, se usa la nomenclatura heteroarilalcanilo, heteroarilaquenilo y/o heteroarilalquinilo. En realizaciones preferidas, el grupo heteroarilalquilo es un heteroarilalquilo de 6-21 miembros, por ejemplo el resto alcanilo, alquenilo o alquinilo del heteroarilalquilo es alquilo (C1-C6) y el resto heteroarilo es un heteroarilo de 5-15 miembros. En realizaciones particularmente preferidas, el heteroarilalquilo es un heteroarilalquilo de 6-13 miembros, por ejemplo el resto alcanilo, alquenilo o alquinilo es alquilo (C1-C3) y el resto heteroarilo es un heteroarilo de 5-10 miembros.
- \quad
- "Halógeno" o "halo", por sí mismos o como parte de otro sustituyente, excepto que se establezca de otro modo, se refiere a fluoro, cloro, bromo y yodo.
- \quad
- "Haloalquilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo alquilo en el que uno o más de los átomos de hidrógeno se sustituye por halógeno. De este modo, el término "haloalquilo" incluye monohaloalquilos, dihaloalquilos, trihaloalquilos, etc. hasta perhaloalquilos. Por ejemplo, la expresión "haloalquilo (C1-C2)" incluye fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, 1-fluoroetilo, 1,1-difluoroetilo, 1,2-difluoroetilo, 1,1,1-trifluoroetilo, perfluoroetilo, etc.
Los grupos definidos anteriormente pueden
incluir prefijos y/o sufijos que se usan habitualmente en la técnica
para crear grupos sustituyentes adicionales bien reconocidos. Como
ejemplos, "alquiloxi" o "alcoxi" se refiere a un grupo de
la fórmula -OR'', "alquilamina" se refiere a un
grupo de la fórmula -NHR'', y "dialquilamina" se
refiere a un grupo de la fórmula -NR''R'', en las que
cada R'' es independientemente un alquilo. Como otro ejemplo,
"haloalcoxi" o "haloalquiloxi" se refiere a un grupo de la
fórmula -OR''', en la que R''' es un haloalquilo.
"Grupo protector" se refiere a un
grupo de átomos que, cuando se une a un grupo funcional reactivo en
una molécula, enmascara, reduce o evita la reactividad del grupo
funcional. Típicamente, un grupo protector se puede eliminar
selectivamente según se desee durante el transcurso de una síntesis.
Ejemplos de grupos protectores se pueden encontrar en Greene y
Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry, 3ª Ed., 1999, John
Wiley & Sons, NY, y Harrison et al., Compendium of
Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8,
1971-1996, John Wiley & Sons, NY. Grupos
protectores de amino representativos incluyen, pero no se limitan a,
formilo, acetilo, trifluoroacetilo, bencilo, benciloxicarbonilo
("CBZ"), terc-butoxicarbonilo ("Boc"),
trimetilsililo ("TMS"),
2-trimetilsilil-etanosulfonilo
("TES"), tritilo y grupos tritilo sustituidos,
aliloxicarbonilo,
9-fluorenil-metiloxicarbonilo
("FMOC"), nitroveratriloxicarbonilo ("NVOC"), y
similares. Grupos protectores de hidroxilo representativos incluyen,
pero no se limitan a, aquellos en los que el grupo hidroxilo está
acilado o alquilado, tales como bencilo y ésteres de tritilo, así
como éteres de alquilo, éteres de tetrahidropiranilo, éteres de
trialquilsililo (por ejemplo, grupos TMS o TIPPS) y éteres
de
alilo.
alilo.
"Profármaco" se refiere a un
derivado de un compuesto de 2,4-pirimidindiamina
activo (fármaco) que requiere una transformación en las condiciones
de uso, tal como dentro del cuerpo, para liberar el fármaco de
2,4-pirimidindiamina activo. Los profármacos son
frecuentemente, aunque no necesariamente, farmacológicamente
inactivos hasta que se convierten en el fármaco activo. Los
profármacos se obtienen típicamente enmascarando un grupo funcional
en el fármaco de 2,4-pirimidindiamina, que se cree
que se requiere en parte para la actividad, con un progrupo
(definido más abajo) para formar un prorresto que sufre una
transformación, tal como una escisión, en las condiciones
específicas de uso para liberar el grupo funcional, y por tanto el
fármaco de 2,4-pirimidindiamina activo. La escisión
del prorresto puede transcurrir espontáneamente, tal como mediante
una reacción de hidrólisis, o puede estar catalizada o inducida por
otro agente, tal como mediante una enzima, mediante luz, mediante
ácido o base, o mediante un cambio de o exposición a un parámetro
físico o medioambiental, tal como un cambio de temperatura. El
agente puede ser endógeno a las condiciones de uso, tal como una
enzima presente en las células a las que se administra el
profármaco, o las condiciones ácidas del estómago, o se puede
suministrar de forma exógena.
En la técnica se conoce una amplia variedad de
profármacos, así como los prorrestos resultantes, adecuados para
enmascarar grupos funcionales en los compuestos de
2,4-pirimidindiamina activos para producir
profármacos. Por ejemplo, un grupo funcional hidroxilo se puede
enmascarar como un prorresto de sulfonato, éster o carbonato, que
se puede hidrolizar in vivo para proporcionar el grupo
hidroxilo. Un grupo funcional amino se puede enmascarar como un
prorresto de amida, carbamato, imina, urea, fosfenilo, fosforilo o
sulfenilo, que se puede hidrolizar in vivo para proporcionar
el grupo amino. Un grupo carboxilo se puede enmascarar como un
prorresto de éster (incluyendo ésteres y tioésteres de sililo),
amida o hidrazida, que se puede hidrolizar in vivo para
proporcionar el grupo carboxilo. Otros ejemplos específicos de
progrupos adecuados y sus prorrestos respectivos serán manifiestos
para los expertos en la técnica.
"Progrupo" se refiere a un tipo de
grupo protector que, cuando se usa para enmascarar un grupo
funcional en un fármaco de 2,4-pirimidindiamina
activo para formar un prorresto, convierte el fármaco en un
profármaco. Los progrupos están unidos típicamente al grupo
funcional del fármaco vía enlaces que son escindibles en
condiciones específicas de uso. De este modo, un profármaco es
aquella porción de un prorresto que se escinde para liberar el
grupo funcional en las condiciones específicas de uso. Como un
ejemplo específico, un prorresto de amida de la fórmula
-NH-C(O)CH_{3} comprende
el progrupo -C(O)CH_{3}.
"Receptor Fc" se refiere a un
miembro de la familia de moléculas de la superficie celular que se
une a la porción Fc (que contiene la región constante específica)
de una inmunoglobulina. Cada receptor Fc se une a inmunoglobulinas
de un tipo específico. Por ejemplo, el receptor Fc\alpha
("Fc\alphaR") se une a IgA, el Fc\varepsilonR se une a
IgE, y el Fc\gammaR se une a IgG.
La familia de Fc\alphaR incluye el receptor
polimérico de Ig implicado en el transporte epitelial de IgA/IgM,
el receptor Rc\alphaRI específico de la estirpe mieloide (también
denominado CD89), el Fc\alpha/\muR y al menos dos receptores de
IgA alternativos (para un repaso reciente, véase Monteiro y van de
Winkel, 2003, Annu. Rev. Immunol., publicación electrónica
avanzada). El Fc\alphaRI es expresado en neutrófilos, eosinófilos,
monocitos/macrófagos, células dendríticas y células de Kupfer. El
Fc\alphaRI incluye una cadena alfa y el homodímero gamma de FcR
que tiene un motivo de activación (ITAM) en el dominio citoplásmico
y fosforila Syk cinasa.
La familia de Fc\varepsilonR incluye dos
tipos, denominados Fc\varepsilonRI y Fc\varepsilonRII (también
conocido como CD23). Fc\varepsilonRI es un receptor de alta
afinidad (se une a IgE con una afinidad de alrededor de 10^{10}
M^{-1}) encontrado en mastocitos, basófilos y eosinófilos que
ancla IgE monomérico a la superficie celular. El Fc\varepsilonRI
posee una cadena alfa, una cadena beta y el homodímero de la cadena
gamma explicado anteriormente. El Fc\varepsilonRII es un receptor
de baja afinidad, expresado en fagocitos mononucleares, linfocitos
B, eosinófilos y plaquetas. El Fc\varepsilonRII comprende una
cadena polipeptídica sencilla, y no incluye el homodímero de la
cadena gamma.
La familia de Fc\gammaR incluye tres tipos,
denominados Fc\gamma\muRI (también conocido como CD64),
Fc\gammaRII (también conocido como CD32) y Fc\gammaRIII (también
conocido como CD16). Fc\gammaRI es un receptor de alta afinidad
(se une a IgG1 con una afinidad de 10^{8} M^{-1}) encontrado en
mastocitos, basófilos, células mononucleares, neutrófilos,
eosinófilos, células dendríticas y fagocitos, que ancla IgG
monomérica a la superficie celular. El Fc\gammaRI incluye una
cadena alfa y el dímero de la cadena gamma compartido por
Fc\alphaRI y Fc\varepsilonRI.
El Fc\gammaRII es un receptor de baja afinidad
expresado en neutrófilos, monocitos, eosinófilos, plaquetas y
linfocitos B. El Fc\gammaRII incluye una cadena alfa, y no incluye
el homodímero de la cadena gamma explicado anteriormente.
El Fc\gammaRIII es un receptor de baja
afinidad (se une a IgG1 con una afinidad de 5 x 10^{5} M^{-1})
expresado en NK, eosinófilos, macrófagos, neutrófilos y mastocitos.
Comprende una cadena alfa y el homodímero gamma compartido por
Fc\alphaRI, Fc\varepsilonRI y Fc\gammaRI.
Los expertos reconocerán que la estructura de la
subunidad y las propiedades de unión de estos diversos receptores
Fc, así como los tipos celulares que los expresan, no están
completamente caracterizados. La explicación anterior refleja
simplemente el estado actual de la técnica con relación a estos
receptores (véase, por ejemplo, Immunobiology: The
Immune System in Health & Disease, 5ª Edición, Janeway et
al., Eds, 2001, ISBN
0-8153-3642-x,
Figura 9.30 en la página 371), y no pretende ser limitante con
respecto a la miríada de cascadas de señalización de receptores que
se puede regular con los compuestos descritos aquí.
"Desgranulación mediada por el receptor
Fc" o "desgranulación inducida por el receptor
Fc" se refiere a la desgranulación que transcurre vía
una cascada de transducción de señales del receptor Fc iniciada por
la reticulación de un receptor Fc.
"Desgranulación inducida por IgE" o
"desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI" se
refiere a la desgranulación que transcurre vía la cascada de
transducción de señales del receptor IgE iniciada por la
reticulación de IgE unido a Fc\varepsilonR1. La reticulación se
puede inducir mediante un alérgeno específico de IgE, o mediante
otro agente de unión multivalente, tal como un anticuerpo
anti-IgE. Haciendo referencia a la Fig. 2, en
mastocitos y/o basófilos, la cascada de señalización de
Fc\varepsilonRI que conduce a la desgranulación se puede dividir
en dos etapas: aguas arriba y aguas abajo. La etapa aguas arriba
incluye todos los procesos que ocurren antes de la movilización del
ion calcio (ilustrado como "Ca^{2+}" en la Fig. 2; véase
también la Fig. 3). La etapa aguas abajo incluye la movilización
del ion calcio y todos sus procesos aguas abajo. Los compuestos que
inhiben la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI pueden
actuar en cualquier punto a lo largo de la cascada de transducción
de señales mediada por Fc\varepsilonRI. Los compuestos que inhiben
selectivamente aguas arriba la desgranulación mediada por
Fc\varepsilonRI actúan para inhibir esa porción de la cascada de
señalización de Fc\varepsilonRI aguas arriba del punto en el que
se induce la movilización del ion calcio. En ensayos basados en
células, los compuestos que inhiben selectivamente la desgranulación
mediada por Fc\varepsilonRI aguas arriba inhiben la
desgranulación de células tales como mastocitos o basófilos que son
activados o estimulados con un alérgeno específico de IgE o con un
agente de unión (tal como un anticuerpo anti-IgE),
pero no inhiben apreciablemente la desgranulación de células que son
activadas o estimuladas con agentes desgranulantes que evitan la
ruta de señalización de Fc\varepsilonRI, tales como, por ejemplo,
los ionóforos de calcio ionomicina y A23187.
"Desgranulación inducida por IgG" o
"desgranulación mediada por Fc\gammaRI" se refiere a
la desgranulación que transcurre vía la cascada de
transducción de señales de Fc\gammaRI iniciada mediante la
reticulación de IgG unida a Fc\gammaRI. La reticulación se puede
inducir mediante un alérgeno específico de IgG o mediante otro
agente de unión multivalente, tal como un anticuerpo
anti-IgG o un fragmento de anticuerpo. Al igual que
la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI, en mastocitos y
basófilos la cascada de señalización de Fc\gammaRI también
conduce a la desgranulación, que se puede dividir en las mismas dos
etapas: aguas arriba y aguas abajo. Similar a la desgranulación
mediada por Fc\varepsilonRI, los compuestos que inhiben
selectivamente aguas arriba la desgranulación mediada por
Fc\gammaRI actúan aguas arriba del punto en el que se induce la
movilización del ion calcio. En ensayos basados en células, los
compuestos que inhiben selectivamente aguas arriba la
desgranulación mediada por Fc\gammaRI inhiben la desgranulación de
células tales como mastocitos o basófilos que son activados o
estimulados por un alérgeno específico de IgG o con un agente de
unión (tal como un anticuerpo anti-IgG o
fragmento), pero no inhiben apreciablemente la desgranulación de
células que son activadas o estimuladas con agentes desgranulantes
que evitan la ruta de señalización de Fc\gammaRI, tales como, por
ejemplo, los ionóforos de calcio ionomicina y A23187.
"Desgranulación inducida por
ionóforos" o "desgranulación mediada por
ionóforos" se refiere a la desgranulación de una célula, tal
como un mastocito o basófilo, que se produce con la exposición a un
ionóforo de calcio tal como, por ejemplo, ionomicina o A23187.
"Syk cinasa" se refiere a la
tirosina cinasa proteínica del bazo no receptora (citoplásmica) de
72 kDa bien conocida, expresada en células B y en otras células
hematopoyéticas. Syk cinasa incluye dos dominios de homología tipo
2 con Src (SH2) de consenso en tándem, que se unen a motivos de
activación del inmunorreceptor basados en tirosina ("ITAM")
fosforilados, un dominio "enlazador" y un dominio catalítico
(para un repaso de la estructura y función de Syk cinasa, véase
Sada et al., 2001, J. Biochem. (Tokyo)
130:177-186); véase también Turner et al.,
2000, Immunology Today 21:148-154). La Syk cinasa se
ha estudiado ampliamente como un efector de la señalización del
receptor de células B (BCR) (Turner et al., 2000, más
arriba). La Syk cinasa también es crítica para la fosforilación
de tirosina de múltiples proteínas que regulan importantes rutas que
parten de inmunorreceptores, tales como las cascadas de
movilización de Ca^{2+} y de proteína cinasas activadas por
mitógenos (MAPK) (véase, por ejemplo, la Fig. 2) y la
desgranulación. La Syk cinasa también desempeña un papel crítico en
la señalización de integrina en neutrófilos (véase, por
ejemplo, Mocsai et al. 2002, Immunity
16:547-558).
Como se usa aquí, Syk cinasa incluye cinasas de
cualquier especie animal, incluyendo, pero sin limitarse a, homo
sapiens, simio, bovina, porcina, roedor, etc., reconocida por
pertenecer a la familia de Syk. Se incluyen específicamente
isoformas, variantes de corte y empalme, variantes alélicas,
mutantes, tanto de origen natural como hechas por el hombre. Las
secuencias de aminoácidos de tales Syk cinasas son bien conocidas, y
están disponibles en GENBANK. Los ejemplos específicos de ARNm que
codifican diferentes isoformas de Syk cinasa humana se pueden
encontrar en el número de acceso de GENBANK
gi|21361552|ref|NM_003177.2|,
gi|496899|emb|Z29630.1|HSSYKPTK[496899] y
gi|15030258|gb|BC011399.1|BC011399[15030258], que se
incorporan aquí como referencia.
Los expertos apreciarán que las tirosina cinasas
que pertenecen a otras familias pueden tener sitios activos o
bolsillos de unión que son similares en estructura tridimensional a
la de Syk. Como consecuencia de esta similitud estructural, se
espera que tales cinasas, denominadas aquí como "imitadores de
Syk", catalicen la fosforilación de sustratos fosforilados
por Syk. De este modo, se apreciará que tales imitadores de Syk, en
cuyas cascadas de transducción de señales tales imitadores de Syk
desempeñan un papel, y las respuestas biológicas provocadas por
tales imitadores de Syk y las cascadas de señalización dependientes
de los imitadores de Syk se pueden regular, y en particular
inhibir, con los compuestos de 2,4-pirimidindiamina
descritos aquí.
"Cascada de señalización dependiente de
Syk" se refiere a una cascada de transducción de señales en
la que Syk cinasa desempeña un papel. Los ejemplos no limitantes de
tales cascadas de señalización dependientes de Syk incluyen las
cascadas de señalización de Fc\alphaRI, Fc\varepsilonRI,
Fc\gammaRI, Fc\gammaRIII, BCR e integrina.
"Enfermedad autoinmunitaria" se
refiere a aquellas enfermedades que están asociadas habitualmente a
reacciones de hipersensibilidad no anafiláctica (reacciones de
hipersensibilidad de tipo II, tipo III y/o tipo IV) que
generalmente resultan como consecuencia de la respuesta inmunitaria
humoral y/o celular propia del sujeto a una o más sustancias
inmunógenas de origen endógeno y/o exógeno. Tales enfermedades
autoinmunitarias se distinguen de las enfermedades asociadas con
las reacciones de hipersensibilidad anafiláctica (de tipo I o
mediadas por
IgE).
IgE).
Los compuestos usados en la invención son
generalmente compuestos de 2,4-pirimidindiamina
según la fórmula estructural (I):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
incluyendo sales, hidratos,
solvatos y N-óxidos del mismo, en la
que:
- \quad
- L^{1} y L^{2} son cada uno un enlace directo;
- \quad
- R^{2} se selecciona del grupo que consiste en fenilo mono sustituido en la posición 3 ó 5 con un grupo R^{8}, fenilo di- o tri-sustituido con uno o más de los mismos grupos R^{8} o diferentes, y un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define más abajo;
- \quad
- R^{4} se selecciona del grupo que consiste en fenilo sustituido con uno o más de los mismos grupos R^{8} o diferentes, y un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define más abajo;
en la que, para R^{2} y R^{4}, cada uno de
dicho heteroarilo opcionalmente sustituido, independientemente
entre sí, se selecciona del grupo que consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en las
que:
- \quad
- p es un número entero de uno a tres;
- \quad
- cada - - - representa independientemente un enlace sencillo o un doble enlace;
- \quad
- R^{35} es hidrógeno o R^{8};
- \quad
- X se selecciona del grupo que consiste en CH, N y N-O;
- \quad
- cada Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S y NH;
- \quad
- cada Y^{1} se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S, SO, SO_{2}, SONR^{36}, NH y NR^{37};
- \quad
- cada Y^{2} se selecciona independientemente del grupo que consiste en CH, CH_{2}, O, S, N, NH y NR^{37};
- \quad
- R^{36} es hidrógeno o alquilo;
- \quad
- R^{37} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y un progrupo seleccionado del grupo que consiste en arilo, arilalquilo, heteroarilo, R^{a}, R^{b}, -CR^{a}R^{b}-O-C(O)R^{8}, -CR^{a}R^{b}-O-PO(OR^{8})_{2}, -CH_{2}-O-PO(OR^{8})_{2}, -CH_{2}-PO(OR^{8})_{2}, -C(O)-CR^{a}R^{b}-N(CH_{3})_{2}, -CR^{a}R^{b}-O-C(O)-CR^{a}R^{b}-N(CH_{3})_{2}, -C(O)R^{8}, -C(O)CF_{3} y -C(O)-NR^{8}-C(O)R^{8};
- \quad
- R^{38} se selecciona del grupo que consiste en alquilo y arilo;
- \quad
- A se selecciona del grupo que consiste en O, NH y NR^{38};
- \quad
- R^{9}, R^{10}, R^{11} y R^{12} se seleccionan cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en alquilo, alcoxi, halógeno, haloalcoxi, aminoalquilo e hidroxialquilo, o, como alternativa, R^{9} y R^{10} y/o R^{11} y R^{12} se toman juntos para formar un cetal;
- \quad
- cada Z se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxi, ariloxi, éster, y carbamato;
- \quad
- Q se selecciona del grupo que consiste en -OH, -OR^{8}, -NR^{c}R^{c}, -NR^{39}-CHR^{40}-R^{b}, -NR^{39}-(CH_{2})_{m}-R^{b} y -NR^{39}-C(O)-CHR^{40}-NR^{c}R^{c};
- \quad
- R^{39} y R^{40} se seleccionan cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo y NHR^{8};
- \quad
- R^{5} se selecciona del grupo que consiste en -CN, -NC, fluoro, haloalquilo (C1-C3), perhaloalquilo (C1-C3), haloalcoxi (C1-C3), perhaloalcoxi (C1-C3), -C(O)R^{a}, -C(O)OR^{a}, -C(O)CF_{3} y -C(O)OCF_{3};
- \quad
- R^{6} es hidrógeno;
- \quad
- R^{8} se selecciona del grupo que consiste en R^{e}, R^{b}, R^{e} sustituido con uno o más del mismo o diferente R^{a} o R^{b}, -OR^{a} sustituido con uno o más del mismo o diferente R^{a} o R^{b}, -B(OR^{a})_{2}, -B(NR^{c}R^{c})_{2}, -(CH_{2})_{m}-R^{b}, -(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -S-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -O-CHR^{a}R^{b}, -O-CR^{a}(R^{b})_{2}, -O-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-CH[(CH_{2})_{m}-R^{b}]R^{b}, -S-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -S-(CH_{2})_{m}-C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -O-(CHR^{a})_{m}-C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -S-(CHR^{a})_{m}-C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -N[(CH_{2})_{m}R^{b}]2, -NH-C(O)-NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -NH-C(O)-(CH_{2})_{m}-CHR^{b}R^{b} y -NH-(CH_{2})_{m}-C(O)-NH-(CH_{2})_{m}-R^{b};
- \quad
- cada R^{a} se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C8), cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros;
- \quad
- cada R^{b} es un grupo adecuado seleccionado independientemente del grupo que consiste en =O, -OR^{d}, haloalquiloxi (C1-C3), =S, -SR^{d}, =NR^{d}, =NOR^{d}, -NR^{c}R^{c}, halógeno, -CF_{3}, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO_{2}, =N_{2}, -N_{3}, -S(O)R^{d}, -S(O)_{2}R^{d}, -S(O)_{2}OR^{d}, -S(O)NR^{c}R^{c}, -S(O)_{2}NR^{c}R^{c}, -OS(O)R^{d}, -OS(O)_{2}R^{d}, -OS(O)_{2}OR^{d}, -OS(O)_{2}NR^{c}R^{c}, -C(O)R^{d}, -C(O)OR^{d}, -C(O)NR^{c}R^{c}, -C(NH)NR^{c}R^{c}, -C(NR^{a})NR^{c}R^{c}, -C(NOH)R^{a}, -C(NOH)NR^{c}R^{c}, -OC(O)R^{d}, -OC(O)OR^{d}, -OC(O)NR^{c}R^{c}, -OC(NH)NR^{c}R^{c}, -OC(NR^{a})NR^{c}R^{c}, -[NHC(O)]_{n}R^{d}, -[NR^{a}C(O)]_{n}R^{d}, -[NHC(O)]_{n} OR^{d}, -[NR^{a}C(O)]_{n}OR^{d}, -[NHC(O)]_{n}NR^{c}R^{c}, -[NR^{a}C(O)]_{n}NR^{c}R^{c}, -[NHC(NH)]_{n}NR^{c}R^{c} y -[NR^{a}C(NR^{a})]_{n}NR^{c}R^{c};
- \quad
- cada R^{c} es independientemente R^{a}, o, como alternativa, dos R^{c} se toman juntos con el átomo de nitrógeno al que están enlazados para formar un cicloheteroalquilo o heteroarilo de 5 a 8 miembros que puede incluir opcionalmente uno o más de los mismos o diferentes heteroátomos adicionales y que puede estar opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes R^{a} o grupos R^{b} adecuados;
- \quad
- cada R^{d} es independientemente un R^{a};
- \quad
- cada R^{e} se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C8), cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros;
- \quad
- cada m es independientemente un número entero de 1 a 3; y
- \quad
- cada n es independientemente un número entero de 0 a 3; o
- \quad
- el compuesto de 2,4-pirimidindiamina es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 7.4.214 a 7.4.244, 7.4.250 a 7.4.252, 7.4.256 a 7.4.258, 7.4.262 a 7.4.269, 7.4.272 a 7.4.276, 7.4.278 a 7.4.280, 7.4.283 a 7.4.289, 7.4.296, 7.4.298 a 7.4.302, 7.4.304, 7.4.305, 7.4.308 a 7.4.313, 7.4.315, 7.4.317, y 7.4.318;
- \quad
- con las condiciones de que en la fórmula (I):
- (1)
- cuando R^{2} es un fenilo sustituido, entonces R^{5} es distinto de ciano o -C(O)NHR, en el que R es hidrógeno o alquilo (C1-C6);
- (2)
- cuando R^{2} y R^{4} son cada uno independientemente un indol sustituido o no sustituido, entonces el R^{2} y R^{4} están unidos al resto de la molécula vía un átomo de carbono anular; y
- (3)
- el compuesto no sea
L^{1} y L^{2} son cada uno un enlace directo
de forma que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina
usados en la invención son compuestos según la fórmula estructural
(Ia):
incluyendo sales, hidratos,
solvatos y N-óxidos de los mismos, en la que R^{2}, R^{4},
R^{5} y R^{6} son como se define anteriormente para la fórmula
estructural (I). Más abajo se describen realizaciones específicas
adicionales de los compuestos de
2,4-pirimidindiamina de la
invención.
En una primera realización de los compuestos de
fórmulas estructurales (I) y (Ia), R^{2}, R^{4}, R^{5},
R^{6}, L^{1} y L^{2} son como se define anteriormente para sus
estructuras (I) y (Ia) respectivas, con la condición de que R^{2}
no sea 3,4,5-trimetoxifenilo,
3,4,5-trialcoxifenilo (C1-C6) ni
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{21}, R^{22} y
R^{23} son como se define para R^{1}, R^{2} y R^{3},
respectivamente en la patente U.S. nº 6,235,746. En una realización
específica de esta primera realización, R^{21} es hidrógeno,
halo, alquilo (C1-C6) de cadena lineal o ramificado,
opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes
grupos R^{25}, hidroxilo, alcoxi (C1-C6)
opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes
grupos fenilo o R^{25}, tiol (-SH), alquiltio
(C1-C6) opcionalmente sustituido con uno o más de
los mismos o diferentes grupos fenilo o R^{25}, amino (-NH_{2}),
-NHR^{26} o-NR^{26}R^{26}; R^{22} y
R^{23} son cada uno, independientemente entre sí, un alquilo
(C1-C6) de cadena lineal o ramificado, opcionalmente
sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos
R^{25}; R^{25} se selecciona del grupo que consiste en halo,
hidroxilo, alcoxi (C1-C6), tiol, alquiltio
(C1-C6), alquilamino (C1-C6) y
dialquilamino (C1-C6); y cada R^{26} es
independientemente un alquilo (C1-C6) opcionalmente
sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos fenilo o
R^{25}, o un -C(O)R^{27}, en el que
R^{27} es un alquilo (C1-C6) opcionalmente
sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos fenilo o
R^{25}.
En otra realización específica de esta primera
realización, R^{21} es metoxi opcionalmente sustituido con uno o
más de los mismos o diferentes grupos halo, y/o R^{22} y R^{23}
son cada uno, independientemente entre sí, un metilo o etilo
opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes
grupos halo.
En una segunda realización de los compuestos de
fórmulas estructurales (I) y (Ia), R^{2}, R^{4}, R^{5} y
L^{2} son como se describe previamente para sus estructuras (I) y
(Ia) respectivas, L^{1} es un enlace directo y R^{6} es
hidrógeno, con la condición de que R^{2} no sea
3,4,5-trimetoxifenilo,
3,4,5-tri-alcoxifenilo
(C1-C6) ni
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{21}, R^{22} y
R^{23} son como se define anteriormente en relación con la primera
realización.
\vskip1.000000\baselineskip
En una tercera realización, los compuestos de
2,4-pirimidindiamina de fórmulas estructurales (I) y
(Ia) excluyen uno o más de los siguientes compuestos:
- \quad
- N2,N4-bis(3-metilfenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R092788);
- \quad
- N2,N4-bis(3-clorofenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R067962);
- \quad
- N2,N4-bis(2,5-dimetilfenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R067963);
- \quad
- N2,N4-bis(3,4-dimetilfenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R067964);
- \quad
- N2,N4-bis(2,4-dimetilfenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R070791);
- \quad
- N2,N4-bis(3-bromofenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R008958);
\newpage
- \quad
- N2,N4-bis(morfolino)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina; y
- \quad
- N2,N4-bis[(3-cloro-4-metoxifenil))-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina.
En una cuarta realización, los compuestos de
fórmulas estructurales (I) y (Ia) excluyen compuestos según la
siguiente fórmula estructural (Ib):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{24} es alquilo
(C1-C6); y R^{21}, R^{22} y R^{23} son como se
define anteriormente en relación con la primera
realización.
En una quinta realización, los compuestos de
fórmulas estructurales (I) y (Ia) excluyen los compuestos descritos
en los Ejemplos 1-141 de la patente U.S. nº
6.235.746.
En una sexta realización, los compuestos de
fórmulas estructurales (I) y (Ia) excluyen compuestos definidos por
la fórmula (1) o fórmula 1(a) de esta patente U.S. nº
6.235.746 (véase, por ejemplo, la descripción en la Col. 1, línea
48 a Col. 7, línea 49 y Col. 8, líneas 9-36).
En una séptima realización, los compuestos de
fórmulas estructurales (I) y (Ia) excluyen compuestos en los que
R^{5} es ciano cuando R^{2} es un fenilo sustituido; R4 es un
heteroarilo de 5-15 miembros, sustituido o no
sustituido; y R^{6} es hidrógeno.
En una octava realización, los compuestos de
fórmulas estructurales (I) y (Ia) excluyen los compuestos definidos
por las fórmulas (I) y (X) del documento WO 02/04429 o cualquier
compuesto descrito en el documento WO 02/04429.
En una novena realización de los compuestos de
fórmulas estructurales (I) y (Ia), cuando R^{5} es ciano y
R^{6} es hidrógeno, entonces R^{2} es distinto de un grupo
fenilo sustituido.
En una décima realización, los compuestos de
fórmulas estructurales (I) y (Ia) excluyen compuestos en los que
R^{2} y R^{4} son cada uno independientemente un anillo
pirrólico o indólico sustituido o no sustituido que está unido al
resto de la molécula vía su átomo de nitrógeno anular.
En una undécima realización, los compuestos de
fórmulas estructurales (I) y (Ia) excluyen compuestos definidos por
las fórmulas (I) y (IV) de la patente U.S. nº 4.983.608 o o
cualquier compuesto descrito en la patente U.S. nº 4.983.608.
Los expertos en la técnica apreciarán que, en
los compuestos de fórmulas (I) y (Ia), R^{2} y R^{4} pueden ser
iguales o diferentes, y pueden variar ampliamente. Cuando R^{2}
y/o R^{4} son anillos opcionalmente sustituidos, tal como arilos
o heteroarilos opcionalmente sustituidos, el anillo puede estar
unido al resto de la molécula a través de cualquier carbono o
heteroátomo disponible. Los sustituyentes opcionales se puede unir
a cualesquiera átomos de carbono y/o heteroátomos disponibles.
En una duodécima realización de los compuestos
de fórmulas estructurales (I) y (Ia), R^{2} y/o R^{4} es fenilo
sustituido sujeto a las condiciones de que (1) cuando R^{6} es
hidrógeno, entonces R^{2} no es
3,4,5-trimetoxifenilo o
3,4,5-trialcoxi
(C1-C6)-fenilo; (2) cuando R^{2}
es un fenilo 3,4,5-trisustituido, entonces los
sustituyentes en las posiciones 3 y 4 no son simultáneamente metoxi
o alcoxi (C1-C6); o (3) cuando R^{6} es hidrógeno
y R^{4} es heteroarilo de 5-15 miembros, entonces
R^{5} es distinto de ciano. Como alternativa, R^{2} está sujeto
a las condiciones descritas en relación con las realizaciones
primera o segunda. El grupo fenilo sustituido puede estar unido al
resto de la molécula a través de cualquier átomo de carbono
disponible. Ejemplos específicos de fenilos opcionalmente
sustituidos incluyen fenilos que están opcionalmente mono-,
di- o trisustituidos con los mismos o diferentes grupos
R^{8}, en los que R^{8} es como se define previamente para la
fórmula estructural (I), y sometidos a las condiciones anteriores.
Cuando el fenilo está monosustituido, el sustituyente R^{8} puede
estar situado en la posición orto, meta o para.
Cuando está situado en la posición orto, meta o
para, R^{8} se selecciona preferiblemente del grupo que
consiste en alquilo (C1-C10), alquilo ramificado
(C1-C10), -OR^{a} opcionalmente sustituido con
uno o más de los mismos o diferentes grupos R^{b},
-O-C(O)OR^{a},
-O-(CH_{2})_{m}-C(O)OR^{a},
-C(O)OR^{a},
-O-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c},
-O-C(O)NR^{c}R^{c},
-O-(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c},
-O-C(NH)NR^{c}R^{c},
-O-(CH_{2})_{m}-C(NH)NR^{c}R^{c}
y
-NH-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c},
en los que m, R^{a} y R^{c} son como se define
previamente para la fórmula estructural (I). En una realización de
estos compuestos, -NR^{c}R^{c} es un heteroarilo de
5-6 miembros que incluye opcionalmente uno o más de
los mismos o diferentes heteroátomos adicionales. Ejemplos
específicos de tales heteroarilos de 5-6 miembros
incluyen, pero no se limitan a, oxadiazolilo, triazolilo, tiazolilo,
oxazolilo, tetrazolilo e
isoxazolilo.
isoxazolilo.
En otra realización de estos compuestos,
-NR^{c}R^{c} es un anillo cicloheteroalquílico de
5-6 miembros saturado que incluye opcionalmente uno
o más de los mismos o diferentes heteroátomos. Ejemplos específicos
de tales cicloheteroalquilos incluyen, pero no se limitan a,
pirrolidinilo, pirazolidinilo, imidazolidinilo, piperidinilo,
piperazinilo y morfolinilo.
En todavía otra realización de estos compuestos,
cada R^{a} es independientemente un alquilo
(C1-C6), y/o cada -NR^{c}R^{c} es
NHR^{a}, en el que R^{a} es un alquilo (C1-C6).
En una realización específica, R^{8} es
-O-CH_{2}-C(O)NHCH_{3}.
En otra realización específica, R^{8} es -OH.
Cuando el fenilo está disustituido o
trisustituido, los sustituyentes R^{8} se pueden situar en
cualquier combinación de posiciones. Por ejemplo, los sustituyentes
R^{8} se pueden situar en las posiciones 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 3,4,
3,5, 2,3,4, 2,3,5, 2,3,6, 2,4,5, 2,4,6, 2,5,6 o 3,4,5. En una
realización de compuestos que incluyen un fenilo disustituido, los
sustituyentes están situados en una posición distinta de 3,4. En
otra realización, están situados en 3,4. En una realización de
compuestos que incluyen un fenilo trisustituido, los sustituyentes
están situados en una posición distinta de 3,4,5, o, como
alternativa, ninguno de dos de los sustituyentes está situado en
3,4. En otra realización, los sustituyentes están situados en
3,4,5.
Ejemplos específicos de sustituyentes R^{8} en
tales fenilos di- y trisustituidos incluyen los diversos
sustituyentes R^{8} descritos anteriormente en relación con los
fenilos sustituidos en orto, meta y para.
En otra realización específica, los
sustituyentes R^{8} útiles para sustituir tales fenilos
di- y trisustituidos incluyen alquilo
(C1-C6), alcoxi (C1-C6), metoxi,
halo, cloro, perhaloalquilo (C1-C6), -CF_{3},
perhaloalcoxi (C1-C6) y -OCF_{3}. En
una realización preferida, tales sustituyentes R^{8} están
situados en 3,4 o 3,5. Ejemplos específicos de anillos fenílicos
disustituidos preferidos incluyen
3-cloro-4-metoxi-fenilo,
3-metoxi-4-clorofenilo,
3-cloro-4-trifluorometoxi-fenilo,
3-trifluorometoxi-4-cloro-fenilo,
3,4-dicloro-fenilo,
3,4-dimetoxifenilo y
3,5-dimetoxifenilo, con la condición de que: cuando
R^{4} es
3-cloro-4-metoxifenilo
y R^{5} es halo o fluoro, y R^{6} es hidrógeno, entonces
R^{2} no sea
3-cloro-4-alcoxifenilo
(C1-C6) o
3-cloro-4-metoxifenilo;
y/o (2) R^{2} y/o R^{4} no sea
3,4,5-trialcoxifenilo (C1-C6) o
3,4,5-trimetoxife-
nilo.
nilo.
En otra realización de compuestos que incluyen
un fenilo trisustituido, el fenilo trisustituido tiene la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que: R^{31} es metilo o
alquilo (C1-C6); R^{32} es hidrógeno, metilo o
alquilo (C1-C6); y R^{33} es un grupo
halo.
En una decimotercera realización de los
compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia), R^{2} y/o R^{4}
es un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define en la
reivindicación 1. Grupos heteroarilo típicos según esta
decimotercera realización comprenden de 5 a 15, y más típicamente de
5 a 11 átomos anulares, e incluyen uno, dos, tres o cuatro de los
mismos o diferentes heteroátomos o grupos heteroatómicos
seleccionados del grupo que consiste en N, NH, O, S, S(O) y
S(O)_{2}. El heteroarilo opcionalmente sustituido se
puede unir a su átomo de nitrógeno en C2 o C4 respectivo o al
ligador L^{1} o L^{2} a través de cualquier átomo de carbono o
heteroátomo disponible, pero típicamente se une vía un átomo de
carbono. Los sustituyentes opcionales pueden ser iguales o
diferentes, y se pueden unir a cualquier átomo de carbono o
heteroátomo disponible. En una realización de estos compuestos,
R^{5} es distinto de bromo, trifluorometilo o ciano. En otra
realización de estos compuestos, cuando R^{2} y R^{4} son cada
uno un indol sustituido o no sustituido, entonces el anillo está
unido al resto de la molécula vía un átomo de carbono anular.
Todavía en otra realización de compuestos que incluyen un grupo
heteroarilo opcionalmente sustituido, el heteroarilo está no
sustituido o está sustituido con uno a cuatro de los mismos o
diferentes grupos R^{8}, en los que R^{8} es como se define
previamente para la fórmula estructural (I). Los siguientes son
grupos heteroarilo a partir de los cuales se pueden seleccionar
R^{2}
y R^{4}:
y R^{4}:
\vskip1.000000\baselineskip
en las
que:
- \quad
- p es un número entero de uno a tres;
- \quad
- cada \underbar{- - -} representa independientemente un enlace sencillo o un doble enlace;
- \quad
- R^{35} es hidrógeno o R^{8}, en el que R^{8} es como se define anteriormente para la fórmula estructural (I);
- \quad
- X se selecciona del grupo que consiste en CH, N y N-O;
- \quad
- cada Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S y NH;
- \quad
- cada Y^{1} se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S, SO, SO_{2}, SONR^{36}, NH y NR^{37};
- \quad
- cada Y^{2} se selecciona independientemente del grupo que consiste en CH, CH_{2}, O, S, N, NH y NR^{37};
- \quad
- R^{36} es hidrógeno o alquilo;
- \quad
- R^{37} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y un progrupo, preferiblemente hidrógeno o un progrupo seleccionado del grupo que consiste en arilo, arilalquilo, heteroarilo, R^{a}, R^{b}-CR^{a}R^{b}-O-C(O)R^{8}, -CR^{a}R^{b}-O-PO(OR^{8})_{2}, -CH_{2}-O-PO(OR^{8})_{2}, -CH_{1}-PO(OR^{8})_{2}, -C(O)-CR^{a}R^{b}-N(CH_{3})_{2}, -CR^{a}R^{b}-O-C(O)-CR^{a}R^{b}-N(CH_{3})_{2}, -C(O)R^{8}, -C(O)CF_{3} y -C(O)-NR^{8}-C(O)R^{8};
- \quad
- A se selecciona del grupo que consiste en O, NH y NR^{38};
- \quad
- R^{38} se selecciona del grupo que consiste en alquilo y arilo;
- \quad
- R^{9}, R^{10}, R^{11} y R^{12} se selecciona cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en alquilo, alcoxi, halógeno, haloalcoxi, aminoalquilo e hidroxialquilo, o, como alternativa, R^{9} y R^{10} y/o R^{11} y R^{12} se toman juntos para formar un cetal;
- \quad
- cada Z se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxi, ariloxi, éster y carbamato;
- \quad
- Q se selecciona del grupo que consiste en -OH, OR^{8}, -NR^{c}R^{c}, -NHR^{39}-C(O)R^{8}, -NHR^{39}-C(O)OR^{8}, -NR^{39}-CHR^{40}-R^{b}, -NR^{39}-(CH_{2})_{m}-R^{b} y -NR^{39}-C(O)-CHR^{40}-NR^{c}R^{c};
- \quad
- R^{39} y R^{40} se seleccionan cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo y NHR^{8}; y
- \quad
- R^{a}, R^{b} y R^{c} son como se define previamente para la fórmula estructural (I). Sustituyentes R^{b} preferidos para Q se seleccionan de -C(O)OR^{8}, -O-C(O)R^{8}, -O-P(O)(OR^{8})_{2} y -P(O)(OR^{8})_{2}.
\newpage
\global\parskip0.870000\baselineskip
En una realización de los heteroarilos
representados anteriormente, así como otros heteroarilos de
5-15 miembros según esta realización de la
invención, cada R^{8} se selecciona independientemente del grupo
que consiste en R^{d}, -NR^{c}R^{c},
-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c},
-C(O)NR^{c}R^{c},
-(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c},
-C(O)OR^{d},
-(CH_{2})_{m}-C(O)OR^{d}
y -(CH_{2})_{m}-OR^{d}, en
los que m, R^{c} y R^{d} son como se define previamente
para la fórmula estructural (I).
En una realización específica, R^{d} y/o
R^{c} se seleccionan del grupo que consiste en R^{a} y
cicloalquilo (C3-C8) opcionalmente sustituido con
uno o más de los mismos o diferentes grupos hidroxilo, amino o
carboxilo.
En otra realización de los heteroarilos
representados anteriormente, cada R^{35} es un átomo de hidrógeno,
una cadena carbonada de (C1-C6), incluyendo metilo,
etilo, isopropilo, un grupo cicloalquilo, incluyendo ciclopropilo,
ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo,
un
en el que x = 1-8,
-CH_{2}CONHMe, -CH_{2}CH_{2}NHMe, -CH_{2}CH_{2}CONHMe,
-CH_{2}CH_{2}CH_{2}NHMe o -CH_{2}CH_{2}
CH_{2}OCH_{3}.
CH_{2}OCH_{3}.
Todavía en otra realización de los heteroarilos
representados anteriormente, la conectividad del anillo aromático
está en la posición 5 ó 6. Se debería entender que R^{2} o R^{4}
pueden utilizar los grupos heteroarilo explicados en esta memoria
descriptiva.
En una decimocuarta realización de los
compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia), R^{2} y R^{4}
son cada uno, independientemente entre sí, un fenilo, arilo o
heteroarilo opcionalmente sustituido, con la condición de que: (1)
cuando L^{1} es un enlace directo y R^{6} y opcionalmente
R^{5} es hidrógeno, entonces R^{2} es distinto de
3,4,5-trimetoxifenilo o
3,4,5-trialcoxifenilo (C1-C6); (2)
cuando L^{1} y L^{2} son cada uno un enlace directo, R^{6} es
hidrógeno y R^{5} es halo, entonces R^{2} y R^{4} no son cada
uno simultáneamente 3,4,5-trimetoxifenilo o
3,4,5-trialcoxifenilo (C1-C6); (3)
cuando R^{4} es 3-metoxifenilo o
3-alcoxi
(C1-C6)-fenilo, y R^{2} es un
fenilo 3,4,5-trisustituido, los sustituyentes
situados en las posiciones 3 y 4 no son ambos simultáneamente metoxi
ni alcoxi (C1-C6); (4) cuando R^{2} es un fenilo
sustituido y R^{6} es hidrógeno, entonces R^{5} es distinto de
ciano o -C(O)NHR, en el que R es hidrógeno
o alquilo (C1-C6); y/o (5) cuando R^{2} y R^{4}
son cada uno independientemente un indol sustituido o no
sustituido, entonces el indol se une al resto de la molécula vía un
átomo de carbono anular. Como alternativa, R^{2} está sometido a
las condiciones descritas en relación con la realización primera o
segunda.
En esta decimocuarta realización de la
invención, los sustituyentes R^{2} y R^{4} pueden ser iguales o
diferentes. Los fenilo, arilo y/o heteroarilos opcionalmente
sustituido específicos incluyen los ilustrados anteriormente en
relación con la decimosegunda y decimotercera realización.
En una decimoquinta realización de los
compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia), que incluyen sus
realizaciones primera a decimocuarta descritas anteriormente,
R^{6} es hidrógeno y R^{5} es un grupo electronegativo. Como
reconocerán los expertos, los grupos electronegativos son átomos o
grupos de átomos que tienen una tendencia relativamente grande a
atraer electrones hacia ellos. Ejemplos específicos de grupos
electronegativos según esta decimocuarta realización incluyen, pero
no se limitan a, -CN, -NC, -NO_{2}, halo, bromo, cloro, fluoro,
haloalquilo (C1-C3), perhaloalquilo
(C1-C3), fluoroalquilo (C1-C3),
perfluoroalquilo (C1-C3), -CF_{3}, haloalcoxi
(C1-C3), perhaloalcoxi (C1-C3),
fluoroalcoxi (C1-C3), perfluoroalcoxi
(C1-C3), -OCF_{3}, -C(O)R^{a},
-C(O)OR^{a}, -C(O)CF_{3} y
-C(O)OCF_{3}. En una realización
específica, el grupo electronegativo es un grupo electronegativo
que contiene halógeno, tal como -OCF_{3}, -CF_{3},
bromo, cloro o fluoro. En otra realización específica, R^{5} es
fluoro, sujeto a la condición de que el compuesto no sea ningún
compuesto según la tercera realización.
En una decimosexta realización, los compuestos
de fórmulas estructurales (I) y (Ia) son compuestos según la
fórmula estructural (Ib):
y sales, hidratos, solvatos y
N-óxidos de los mismos, en la que R^{11} y R^{14} se seleccionan
cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en
hidroxi, alcoxi (C1-C6) y
-NR^{c}R^{c}; R^{12} y R^{13} son cada uno
hidrógeno, y R^{5}, R^{6} y R^{c} son como se define
anteriormente para la fórmula estructural
(I).
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
En una decimoséptima realización, los compuestos
de fórmulas estructurales (I) y (Ia) son compuestos según la
fórmula estructural (Ic):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y sales, hidratos, solvatos y
N-óxidos de los mismos, en la
que:
- \quad
- R^{4} se selecciona del grupo que consiste en heteroarilo de 5 a 10 miembros y 3-hidroxifenilo;
- \quad
- R^{5} es F o -CF_{3}; y
- \quad
- R^{8} es -O(CH_{2})_{m}-R^{b}, en el que m y R^{b} son como se define previamente para la fórmula estructural (I). En una realización específica, R^{8} es -O-CH_{2}-C(O)NH-CH_{3} y/o R^{4} es un heteroarilo según la realización decimo- tercera.
En una decimoctava realización, los compuestos
de fórmulas estructurales (I) y (Ia) incluyen cualquier compuesto
seleccionado de la Tabla 1 que inhibe una cascada de transducción de
señales de receptores Fc, una actividad de Syk cinasa, una cascada
de transducción de señales de receptores dependientes de Syk cinasa,
o la desgranulación celular como se mide en un ensayo in
vitro, opcionalmente sujeto a la condición de que el compuesto
no sea un compuesto excluido por la realización tercera descrita
anteriormente ni/u otras realizaciones. En una realización
específica, tales compuestos tienen una IC_{50} de alrededor de 20
\muM o menos, según se mide en un ensayo de desgranulación in
vitro, tal como uno de los ensayos de desgranulación descritos
en la sección de Ejemplos.
En una decimonona realización, los compuestos de
fórmulas estructurales (I) y (Ia) incluyen cualquier compuesto
seleccionado de la Tabla 1 que inhibe la cascada de los receptores
Fc\gammaR1 o Fc\gammaR1 con una IC_{50} de alrededor de 20
\muM o menos según se mide en un ensayo in vitro, tal como
uno de los ensayos in vitro proporcionados en la sección de
Ejemplos, opcionalmente sujeto a la condición de que el compuesto
no sea un compuesto excluido por la tercera realización descrita
anteriormente ni/u otras realizaciones.
En una vigésima realización, los compuestos de
fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que R^{2} se
selecciona del grupo que consiste en
R^{4}, R^{8}, R^{a}, R^{b}, R^{c},
R^{d} son como se describe anteriormente, R^{5} es un átomo de
flúor; R^{6} es un átomo de hidrógeno y cada R^{21} son
independientemente un átomo de halógeno o un alquilo opcionalmente
sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos halo,
R^{22} y R^{23} son cada uno, independientemente entre sí, un
átomo de hidrógeno, metilo o etilo opcionalmente sustituido con uno
o más de los mismos o diferentes grupos halo, cada m es
independientemente un número entero de 1 a 3, y cada n es
independientemente un número entero de 0 a 3.
En una vigésimo primera realización, los
compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que
R^{4} es
en la que R^{9} y R^{10} son
como se define anteriormente, e incluyen además, cada uno
independientemente un átomo de hidrógeno, y R^{2} es un grupo
fenilo, sustituido con uno o más de los mismos grupos R^{8},
o
en la que R^{35} es como se
define anteriormente. En un aspecto particular, cuando R^{2} es un
grupo fenilo, uno o más de R^{8} se selecciona de un halógeno y
de un grupo alcoxi. En un aspecto, el grupo fenilo está
di- o trisustituido con uno o más de los mismos grupos
R^{8}.
En una vigésimo segunda realización, los
compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que
R^{4} es
y R^{2} es un grupo fenilo,
sustituido con uno o más de los mismos grupos R^{8}. En un aspecto
particular, uno o más de R^{8} se selecciona de un halógeno y de
un grupo alcoxi. En un aspecto, el grupo fenilo está di-
o trisustituido con uno o más de los mismos grupos
R^{8}.
En una vigésimo tercera realización, los
compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que
R^{4} es un grupo fenilo sustituido con uno o más de los mismos
grupos R^{8}, en los que R^{2} es
en la que R^{35} es como se
define anteriormente. En realizaciones particulares, el grupo fenilo
R^{4} está di- o trisustituido con los mismos o
diferentes átomos de halógeno. En otra realización, R^{4} es un
grupo fenilo monosustituido con un átomo de halógeno. En un aspecto,
R^{35} es un grupo hidroxialquilo. En ciertos aspectos, el grupo
hidroxialquilo se puede funcionalizar adicionalmente en un grupo
éster, en carbamato,
etc.
En una vigésimo cuarta realización, los
compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que
R^{4} es
en la que R^{35} es como se
define anteriormente y R^{2} es un grupo fenilo sustituido con uno
o más de los mismos grupos R^{8}. En un aspecto particular,
R^{35} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo. En otro
aspecto, el grupo fenilo R^{2} está di- o trisustituido
con los mismos o diferentes grupos R^{8}, y en particular, átomos
de
halógeno.
En una vigésimo quinta realización, los
compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que
R^{4} es
en la que R^{35} es como se
define anteriormente, y R^{2}
es
en la que R^{9} y R^{10} son
como se define anteriormente e incluyen adicionalmente, cada uno
independientemente, un átomo de hidrógeno. En un aspecto, R^{35}
es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo, por ejemplo metilo, y
R^{9} y R^{10} son grupos alquilo, por ejemplo grupos
metilo.
En una vigésimo sexta realización, los
compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que
R^{4} es un grupo fenilo disustituido, sustituido con los mismos
o diferentes grupos R^{8}, y R^{2} es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{35} es como se
define anteriormente. En ciertos aspectos, el grupo fenilo está
sustituido con un átomo de halógeno y un grupo alcoxi, por ejemplo
un grupo metoxi. En ciertas realizaciones, R^{35} es un átomo de
hidrógeno, un grupo alquilo, por ejemplo un grupo metilo, o un grupo
hidroxialquilo. En ciertos aspectos, el grupo hidroxialquilo se
puede funcionalizar adicionalmente en un grupo éster, en un
carbamato,
etc.
En una vigésimo séptima realización, los
compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que
R^{4} es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en las que R^{8} y R^{c} son
como se define anteriormente, y R^{2} es un grupo fenilo que está
sustituido con uno o más de los mismos grupos R^{8}. En un
aspecto particular, R^{c} es un átomo de hidrógeno o un grupo
alquilo. En otro aspecto, el grupo fenilo R^{2} está
di- o trisustituido con los mismos o diferentes grupos
R^{8}, y en particular, átomos de halógeno,
o
\newpage
En una vigésimo octava realización, los
compuestos de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que
R^{4} es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Y^{1}, Y^{2} y cada
R^{35} independientemente, son como se define anteriormente, y
R^{2}
es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{35} es como se
define anteriormente. En un aspecto de la vigésimo octava
realización con respecto a R^{4}, Y^{1} es oxígeno, Y^{2} es
NH y uno o más de R^{35} o el resto R^{4} es un grupo alquilo,
y en particular un grupo metilo. En ciertos aspectos de la vigésimo
octava realización, dos R^{35} del resto R^{4} forman un resto
dialquílico geminal, en particular un resto dialquílico geminal
adyacente al NH, representado
como
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertos aspectos de la vigésimo octava
realización, con respecto a R^{2}, R^{35} es un átomo de
hidrógeno o un grupo alquilo, y en particular un grupo metilo.
En una vigésimo nona realización, los compuestos
de fórmulas estructurales (Ia) son aquellos en los que R^{4}
es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{9} y R^{10} son
como se define anteriormente, o un grupo fenilo sustituido. En un
aspecto, el grupo fenilo está di- o trisustituido con
uno o más de los mismos grupos R^{8}. En particular, el grupo
fenilo puede estar di- o trisustituido con uno o más
átomos de halógeno, que pueden ser iguales o diferentes. R^{2} en
la vigésimo nona realización
es
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en la que R^{35} es como se
define anteriormente. En un aspecto de la vigésimo nona realización,
R^{35} de R^{2} no es un grupo metilo. Todavía en otro aspecto
de la vigésimo nona realización, R^{2}
es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En una trigésima realización, aplicable a las
realizaciones primera a vigésimo nona, R^{5} es un átomo de
halógeno, tal como flúor, y R^{6} es un átomo de hidrógeno.
También se describen específicamente
combinaciones de las realizaciones primera a trigésima
anteriores.
Los expertos en la técnica apreciarán que los
compuestos de 2,4-pirimidindiamina descritos aquí
pueden incluir grupos funcionales que se pueden enmascarar con
progrupos para crear profármacos. Tales progrupos son habitualmente,
aunque no necesariamente, farmacológicamente inactivos hasta que se
convierten en su forma farmacéutica activa. De hecho, muchos de los
compuestos de 2,4-pirimidindiamina activos descritos
en la Tabla 1, más abajo, incluyen prorrestos que son
hidrolizables o de otro modo escindibles en condiciones de uso. Por
ejemplo, los grupos éster habitualmente sufren hidrólisis
catalizada por ácidos para producir el ácido carboxílico progenitor
cuando se exponen a las condiciones ácidas del estómago, o la
hidrólisis catalizada por bases cuando se exponen a las condiciones
básicas del intestino o la sangre. De este modo, cuando se
administran oralmente a un sujeto, las
2,4-pirimidindiaminas que incluyen restos de éster
se pueden considerar profármacos de su ácido carboxílico
correspondiente, independientemente de si la forma de éster es
farmacológicamente activa. Haciendo referencia a la Tabla 1,
numerosas 2,4-pirimidindiaminas que contienen éster
de la invención son activas en su forma de "profármaco"
de
éster.
éster.
En los profármacos, cualquier resto funcional
disponible se puede enmascarar con un progrupo para producir un
profármaco. Los grupos funcionales en los compuestos de
2,4-pirimidindiamina que se pueden enmascarar con
progrupos para inclusión en un prorresto incluyen, pero no se
limitan a, aminas (primarias y secundarias), hidroxilos, sulfanilos
(tioles), carboxilos, etc. En la técnica se conoce una miríada de
progrupos adecuados para enmascarar tales grupos funcionales para
producir prorrestos que son escindibles en las condiciones de uso
deseadas. Todos estos progrupos, solos o en combinaciones, se pueden
incluir en los profármacos.
En un ejemplo ilustrativo, los profármacos son
compuestos según la fórmula estructural (I) en la que R^{a} y
R^{d} pueden ser, además de sus alternativas previamente
definidas, un progrupo.
La sustitución de los hidrógenos unidos a N2 y
N4 en las 2,4-pirimidindiaminas de fórmula
estructural (I) por sustituyentes afecta adversamente a la
actividad de los compuestos. Sin embargo, como apreciarán los
expertos, estos nitrógenos se pueden incluir en prorrestos que, en
condiciones de uso, se escinden para producir
2,4-pirimidindiaminas según la fórmula estructural
(I). De este modo, en otra realización, los profármacos son
compuestos según la fórmula estructural (II):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
incluyendo sales, hidratos,
solvatos y N-óxidos de los mismos, en la
que:
- \quad
- R^{2}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, L^{1} y L^{2} son como se define previamente para la fórmula estructural (I); y
- \quad
- R^{2b} y R^{4b} son cada uno, independientemente entre sí, un progrupo. Ejemplos específicos de tales progrupos incluyen, pero no se limitan a, alquilo (C1-C6), -C(O)CH_{3}, -C(O)NHR^{36} y -S(O)_{2}R^{36}, en los que R^{36} es alquilo (C1-C6), arilo (C5-C15) y cicloalquilo (C3-C8).
\vskip1.000000\baselineskip
En los profármacos de fórmula estructural (II),
los diversos sustituyentes pueden ser como se describe para las
diversas realizaciones primera a vigésima previamente descritas para
los compuestos de fórmulas estructurales (I) y (Ia), o
combinaciones de tales realizaciones.
Los expertos en la técnica apreciarán que muchos
de los compuestos y profármacos, así como las diversas especies de
compuestos descritas y/o ilustradas específicamente aquí, pueden
mostrar el fenómeno de tautomería, isomería conformacional,
isomería geométrica y/o isomería óptica. Por ejemplo, los compuestos
y profármacos pueden incluir uno o más centros quirales y/o dobles
enlaces, y, como consecuencia, pueden existir como estereoisómeros,
tales como isómeros de dobles enlaces (es decir, isómeros
geométricos), enantiómeros y diastereómeros y sus mezclas, tales
como mezclas racémicas. Como otro ejemplo, los compuestos y
profármacos pueden existir en varias formas tautómeras, incluyendo
la forma enólica, la forma ceto y sus mezclas. Puesto que los
diversos nombres, fórmulas y dibujos de los compuestos en la
memoria descriptiva y en las reivindicaciones sólo pueden
representar una de las posibles formas tautómeras, de isómero
conformacional, de isómero óptico o de isómero geométrico, se
debería entender que la invención engloba cualquiera de las formas
tautómera, de isómero conformacional, de isómero óptico y/o de
isómero geométrico de los compuestos o profármacos que tienen una o
más de las utilidades descritas aquí, así como mezclas de estas
diversas formas isómeras diferentes. En casos de rotación limitada
alrededor de la estructura central de
2,4-pirimidindiamina, también son posibles
atropisómeros, y también se incluyen específicamente en los
compuestos de la invención.
Además, los expertos apreciarán que cuando
listas de sustituyentes alternativos incluyen miembros que, dado
los requisitos de valencia u otras razones, no se pueden usar para
sustituir un grupo particular, la lista está destinada a ser leída
en el contexto de que incluya aquellos miembros de la lista que sean
adecuados para sustituir el grupo particular. Por ejemplo, los
expertos apreciarán que aunque se pueden usar todas las
alternativas enumeradas para R^{b} para sustituir un grupo
alquilo, algunas alternativas, tales como =O, no se pueden usar
para sustituir un grupo fenilo. Se entenderá que sólo se proponen
combinaciones posibles de los pares de grupos sustituyentes.
Los compuestos y/o profármacos se pueden
identificar mediante su estructura química o su nombre químico.
Cuando la estructura química y el nombre químico entran en
conflicto, la estructura química es determinante de la identidad
del compuesto específico.
Dependiendo de la naturaleza de los diversos
sustituyentes, los compuestos y profármacos de
2,4-pirimidindiamina de la invención pueden estar
en forma de sales. Tales sales incluyen sales adecuadas para usos
farmacéuticos ("sales farmacéuticamente aceptables"), sales
adecuadas para usos veterinarios, etc. Tales sales pueden derivar
de ácidos o bases, como es bien conocido en la técnica.
En una realización, la sal es una sal
farmacéuticamente aceptable. Generalmente, las sales
farmacéuticamente aceptables son aquellas sales que retienen
sustancialmente una o más de las actividades farmacológicas deseadas
del compuesto progenitor, y que son adecuadas para la
administración a seres humanos. Las sales farmacéuticamente
aceptables incluyen sales de adición de ácidos formadas con ácidos
inorgánicos o ácidos orgánicos. Los ácidos inorgánicos adecuados
para formar sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables
incluyen, a título de ejemplo y no de limitación, ácidos
halohídricos (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido
bromhídrico, ácido yodhídrico, etc.), ácido sulfúrico, ácido
nítrico, ácido fosfórico, y similares. Los ácidos orgánicos
adecuados para formar sales de adición de ácidos farmacéuticamente
aceptables incluyen, a título de ejemplo y no de limitación, ácido
acético, ácido trifluoroacético, ácido propiónico, ácido hexanoico,
ácido ciclopentanopropiónico, ácido glicólico, ácido oxálico, ácido
pirúvico, ácido láctico, ácido malónico, ácido succínico, ácido
málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido
cítrico, ácido palmítico, ácido benzoico, ácido
3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, ácido
cinámico, ácido mandélico, ácidos alquilsulfónicos (por
ejemplo, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido
1,2-etanodisulfónico, ácido
2-hidroxietanosulfónico, etc.), ácidos
arilsulfónicos (por ejemplo, ácido bencenosulfónico, ácido
4-clorobencenosulfónico, ácido
2-naftalenosulfónico, ácido
4-toluenosulfónico, ácidos cicloalquilsulfónicos
(por ejemplo, ácido canfosulfónico, etc.), ácido
4-metilbiciclo[2.2.2]-oct-2-en-1-carboxílico,
ácido glucoheptónico, ácido 3-fenilpropiónico,
ácido trimetilacético, ácido butilacético terciario, ácido
laurilsulfúrico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido
hidroxinaftoico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido mucónico,
y
similares.
similares.
Las sales farmacéuticamente aceptables también
incluyen sales formadas cuando un protón ácido presente en el
compuesto progenitor se sustituye por un ion metálico (por
ejemplo, un ion de metal alcalino, un ion de metal
alcalino-térreo o un ion de aluminio), un ion amonio
o se coordina con una base orgánica (por ejemplo,
etanolamina, dietanolamina, trietanolamina,
N-metilglucamina, morfolina, piperidina,
dimetilamina, dietilamina,
etc.).
etc.).
Los compuestos y profármacos de
2,4-pirimidindiamina de la invención, así como sus
sales, también pueden estar en forma de hidratos, solvatos y
N-óxidos, como son bien conocidos en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos y profármacos se pueden
sintetizar vía una variedad de rutas sintéticas diferentes usando
materiales de partida comercialmente disponibles y/o materiales de
partida preparados por métodos sintéticos convencionales. Los
métodos ejemplares adecuados que se pueden usar habitualmente y/o
adaptar para sintetizar los compuestos y profármacos de
2,4-pirimidindiamina de la invención se encuentran
en la patente U.S. nº 5.958.935, cuya descripción se incorpora aquí
como referencia. En la sección de Ejemplos se proporcionan ejemplos
específicos que describen la síntesis de numerosos compuestos y
profármacos, así como intermedios para ellos. Todos los compuestos
de fórmulas estructurales (I), (Ia) y (II) se pueden preparar
mediante adaptación normal de estos
métodos.
métodos.
En los Esquemas (I)-(XI), a continuación, se
describe una variedad de rutas sintéticas ejemplares que se pueden
usar para sintetizar los compuestos de
2,4-pirimidindiamina de la invención. En los
Esquemas (I)-(XI), compuestos con números similares tienen
estructuras similares. Estos métodos se pueden adaptar de forma
normal para sintetizar los profármacos según la fórmula estructural
(II).
En una realización ejemplar, los compuestos se
pueden sintetizar a partir de uracilos o tiouracilos sustituidos o
no sustituidos como se ilustra en el Esquema (I), a
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
(I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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En el Esquema (I), R^{2}, R^{4}, R^{5},
R^{6}, L^{1} y L^{2} son como se define previamente para la
fórmula estructural (I), X es halógeno (por ejemplo, F, Cl,
Br o I) e Y e Y' se seleccionan cada uno, independientemente entre
sí, del grupo que consiste en O y S. Haciendo referencia al Esquema
(I), el uracilo o tiouracilo 2 se dihalogena en las posiciones 2 y
4 usando un agente halogenante estándar POX_{3} (u otro agente
halogenante estándar) en condiciones estándar para producir la
2,4-bishalopirimidina 4. Dependiendo del
sustituyente R^{5}, en la pirimidina 4, el haluro en la posición
C4 es más reactivo con nucleófilos que el haluro en la posición C2.
Esta reactividad diferencial se puede explotar para sintetizar
2,4-pirimidindiaminas según la fórmula estructural
(I) haciendo reaccionar en primer lugar la
2,4-bishalopirimidina 4 con un equivalente de amina
10, produciendo la
4N-sustituida-2-halo-4-pirimidinamina
8, seguido de la amina 6 para producir una
2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural
(I). Las
2N,4N-bis(sustituidas)-2,4-pirimidindiaminas
12 y 14 se pueden obtener haciendo reaccionar la
2,4-bishalopiridina 4 con 6 ó 10 en exceso,
respectivamente.
En la mayoría de las situaciones, el haluro de
C4 es más reactivo con nucleófilos, como se ilustra en el Esquema.
Sin embargo, como reconocerán los expertos, la identidad del
sustituyente R^{5} puede alterar esta reactividad. Por ejemplo,
cuando R^{5} es trifluorometilo, se obtiene una mezcla 50:50 de
4N-sustituida-4-pirimidinamina
8 y la
2N-sustituida-2-pirimidinamina
correspondiente. Independientemente de la identidad del sustituyente
R^{5}, la regioselectividad de la reacción se puede controlar
ajustando el disolvente y otras condiciones sintéticas (tales como
la temperatura), como es bien conocido en la técnica.
Las reacciones representadas en el Esquema (I)
pueden transcurrir más rápidamente cuando las mezclas de reacción
se calientan vía microondas. Cuando se calienta de esta manera, se
pueden usar las siguientes condiciones: calentamiento hasta 175ºC
en etanol durante 5-20 min. en un reactor Smith
(Personal Chemistry) en un tubo cerrado herméticamente (a una
presión de 20 bares).
Los materiales de partida de uracilo o
tiouracilo 2 se pueden adquirir de fuentes comerciales, o se pueden
preparar usando técnicas estándar de química orgánica. Los uracilos
y tiouracilos comercialmente disponibles que se pueden usar como
materiales de partida en el Esquema (I) incluyen, a título de
ejemplo y no de limitación, uracilo (Aldrich
#13,078-8; Registro CAS
66-22-8);
2-tio-uracilo (Aldrich
#11,558-4; Registro CAS
141-90-2);
2,4-ditiouracilo (Aldrich #15,846-1;
Registro CAS 2001-93-6);
5-acetouracilo (Chem. Sources Int'12000; Registro
CAS 6214-65-9);
5-azidouracilo; 5-aminouracilo
(Aldrich #85,528-6; Registro CAS
932-52-5);
5-bromouracilo (Aldrich #85,247-3;
Registro CAS 51-20-7);
5-(trans-2-bromovinil)-uracilo
(Aldrich #45,744-2; Registro CAS
69304-49-0);
5-(trans-2-clorovinil)-uracilo
(Registro CAS 81751-48-2);
5-(trans-2-carboxivinil)-uracilo;
ácido uracil-5-carboxílico (hidrato
del ácido
2,4-dihidroxipirimidin-5-carboxílico;
Aldrich #27,770-3; Registro CAS
23945-44-0);
5-clorouracilo (Aldrich #22,458-8;
Registro CAS 1820-81-1);
5-cianouracilo (Chem. Sources Int'12000; Registro
CAS 4425-56-3);
5-etiluracilo (Aldrich #23,044-8;
Registro CAS 4212-49-1);
5-eteniluracilo (Registro CAS
37107-81-6);
5-fluorouracilo (Aldrich #85,847-1;
Registro CAS 51-21-8);
5-yodouracilo (Aldrich #85,785-8;
Registro CAS 696-07-1);
5-metiluracilo (timina; Aldrich
#13,199-7; Registro CAS
65-71-4);
5-nitrouracilo (Aldrich #85,276-7;
Registro CAS 611-08-5); ácido
uracil-5-sulfámico (Chem. Sources
Int'12000; Registro CAS 5435-16-5);
5-(trifluorometil)-uracilo (Aldrich
#22,327-1; Registro CAS
54-20-6);
5-(2,2,2-trifluoroetil)-uracilo
(Registro CAS 155143-31-6);
5-(pentafluoroetil)-uracilo (Registro CAS
60007-38-3);
6-aminouracilo (Aldrich #A5060-6;
Registro CAS 873-83-6); ácido
uracil-6-carboxílico (ácido orótico;
Aldrich #0-840-2; Registro CAS
50887-69-9);
6-metiluracilo (Aldrich #D11,520-7;
Registro CAS 626-48-2); ácido
uracil-5-amino-6-carboxílico
(ácido 5-aminoorótico; Aldrich
#19,121-3; Registro CAS
#7164-43-4);
6-amino-5-nitrosouracilo
(6-amino-2,4-dihidroxi-5-nitrosopirimidina;
Aldrich #27,689-8; Registro CAS
5442-24-0); ácido
uracil-5-fluoro-6-carboxílico
(ácido 5-fluoroorótico; Aldrich
#42,513-3; Registro CAS
00000-00-0); y ácido
uracil-5-nitro-6-carboxílico
(ácido 5-nitroorótico; Aldrich
#18,528-0; Registro CAS
600779-49-9). Uracilos y/o
tiouracilos sustituidos en 5, en 6 y 5,6-sustituidos
adicionales están disponibles en General Intermediates of Canada,
Inc., Edmonton, Alberta, CA (www.generalintermediates.com)
y/o Interchim, Francia (www.interchim.com), o se pueden
preparar usando técnicas estándar. Más abajo se proporciona
una miríada de referencias de libros de texto que enseñan métodos
sintéticos adecuados.
Las aminas 6 y 10 se pueden adquirir de fuentes
comerciales, o, como alternativa, se pueden sintetizar utilizando
técnicas estándar. Por ejemplo, las aminas adecuadas se pueden
sintetizar a partir de nitroprecursores usando química estándar. En
la sección de Ejemplos se proporcionan reacciones ejemplares
específicas. Véase también Vogel, 1989, Practical Organic
Chemistry, Addison Wesley Longman, Ltd. y John Wiley & Sons,
Inc.
Los expertos reconocerán que, en algunos casos,
las aminas 6 y 10 y/o los sustituyentes R^{5} y/o R^{6} en el
uracilo o tiouracilo 2 pueden incluir grupos funcionales que
requieran protección durante la síntesis. La identidad exacta de
cualquier o cualquiera de los grupos protectores usados dependerá de
la identidad del grupo funcional a proteger, y será manifiesta para
los expertos en la técnica. Por ejemplo, en Greene y Wuts,
Protective Groups in Organic Synthesis, 3ª Edición, John Wiley &
Sons, Inc., New York (1999), y las referencias citadas allí (en lo
sucesivo "Greene y Wuts"), se puede encontrar una guía para
seleccionar grupos protectores adecuados, así como estrategias
sintéticas para su unión y eliminación.
\newpage
En el Esquema (Ia), a continuación, se ilustra
una realización específica del Esquema (I) que utiliza
5-fluorouracilo (Aldrich #32,937-1)
como material de partida:
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Esquema
(Ia)
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En el Esquema (Ia), R^{2}, R^{4}, L^{1} y
L^{2} son como se define previamente para el Esquema (I). Según
el Esquema (Ia), el 5-fluorouracilo 3 se halogena
con POCl_{3} para producir
2,4-dicloro-5-fluoropirimidina
5, que entonces se hace reaccionar con amina 6 ó 10 en exceso para
producir
N2,N4-bis-sustituida-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina
11 ó 13, respectivamente. Como alternativa, la
2N,4N-disustituida-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina
9 asimétrica se puede obtener haciendo reaccionar
2,4-dicloro-5-fluoropirimidina
5 con un equivalente de amina 10 (para producir
2-choro-N4-sustituida-5-fluoro-4-pirimidinamina
7) seguido de uno o más equivalentes de amina 6.
En otra realización ejemplar, los compuestos de
2,4-pirimidindiamina se pueden sintetizar a partir
de citosinas sustituidas o no sustituidas como se ilustra en los
Esquemas (IIa) y (IIb), a continuación:
\newpage
Esquema
(IIa)
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Esquema
(IIb)
En los Esquemas (IIa) y (IIb), R^{2}, R^{4},
R^{5}, R^{6},L^{1}, L^{2} y X son como se define
previamente para el Esquema (I), y PG representa un grupo protector.
Haciendo referencia al Esquema (IIa), la amina exocíclica en
C_{4} de la citosina 20 se protege en primer lugar con un grupo
protector PG adecuado, para producir la citosina
N4-protegida 22. Para una guía específica con
respecto a grupos protectores útiles en este contexto, véase
Vorbrüggen y Ruh-Pohlenz, 2001, Handbook of
Nucleoside Synthesis, John Wiley & Sons, NY, p.
1-631 ("Vorbrüggen"). La citosina protegida 22
se halogena en la posición C2 usando un reactivo de halogenación
estándar en condiciones estándar para producir
2-cloro-4N-protegida-4-pirimidinamina
24. La reacción con la amina 6, seguido de la desprotección de la
amina exocíclica en C4 y la reacción con la amina 10 produce una
2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural
(I).
Como alternativa, haciendo referencia al Esquema
(IIb), la citosina 20 se puede hacer reaccionar con la amina 10 o
con la amina protegida 21 para producir la citosina
N4-sustituida 23 ó 27, respectivamente. Estas
citosinas sustituidas se pueden halogenar entonces como se describe
previamente, se pueden desproteger (en el caso de la citosina
N4-sustituida 27) y se pueden hacer reaccionar con
la amina 6 para producir una 2,4-pirimidindiamina
según la fórmula estructural (I).
Las citosinas comercialmente disponibles que se
pueden usar como materiales de partida en los Esquemas (IIa) y
(IIb) incluyen, pero no se limitan a, citosina (Aldrich
#14,201-8; Registro CAS
71-30-7);
N^{4}-acetilcitosina (Aldrich
#37,791-0; Registro CAS
14631-20-0);
5-fluorocitosina (Aldrich #27,159-4;
Registro CAS 2022-85-7); y
5-(trifluorometil)-citosina. Otras citosinas
adecuadas, útiles como materiales de partida en los Esquemas (IIa),
están disponibles en General Intermediates of Canada, Inc.,
Edmonton, Alberta, CA (www.generalintermediates.com) y/o
Interchim, Francia www.interchim.com, o se pueden preparar
usando técnicas estándar. Más abajo se proporciona una
miríada de referencias de libros de texto que enseñan métodos
sintéticos adecuados.
Todavía en otra realización ejemplar, los
compuestos de 2,4-pirimidindiamina se pueden
sintetizar a partir de
2-amino-4-pirimidinoles
sustituidos o no sustituidos como se ilustra en el Esquema (III), a
continuación:
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Esquema
(III)
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En el Esquema (III), R^{2}, R^{4}, R^{5},
R^{6}, L^{1}, L^{2} y X son como se define previamente para
el Esquema (I), y Z es un grupo saliente como se explica con más
detalle en relación con el Esquema IV, más abajo. Haciendo
referencia al Esquema (III), se hace reaccionar
2-qmino-4-pirimidinol
30 con una amina 6 (o una amina opcionalmente protegida 21) para
producir
N2-sustituido-4-pirimidinol
32, que entonces se halogena como se describe previamente para
producir
N2-sustituida-4-halo-2-pirimidinamina
34. La desprotección opcional (por ejemplo, si se usó la amina
protegida 21 en la primera etapa), seguido de la reacción con la
amina 10, da una 2,4-pirimidindiamina según la
fórmula estructural (I). Como alternativa, el pirimidinol 30 se
puede hacer reaccionar con un agente acilante 31.
Los
2-amino-4-pirimidinoles
30 comercialmente disponibles adecuados que se pueden usar como
materiales de partida en el Esquema (III), incluyen, pero no se
limitan a, hidrato de
2-amino-6-cloro-4-pirimidinol
(Aldrich #A4702-8; Registro CAS
00000-00-0) y
2-amino-6-hidroxi-4-pirimidinol
(Aldrich #A5040-1; Registro CAS
56-09-7). Otros
2-amino-4-pirimidinoles
30 útiles como materiales de partida en el Esquema (III) están
disponibles en General Intermediates of Canada, Inc., Edmonton,
Alberta, CA (www.generalintermediates.com) y/o Interchim,
Francia (www.interchim.com), o se pueden preparar usando
técnicas estándar. Más abajo se proporciona una miríada de
referencias de libros de texto que enseñan métodos sintéticos
adecuados.
Como alternativa, los compuestos de
2,4-pirimidindiamina se pueden preparar a partir de
4-amino-2-pirimidinoles
sustituidos o no sustituidos como se ilustra en el Esquema (IV),
más abajo:
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Esquema
(IV)
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En el Esquema (IV), R^{2}, R^{4}, R^{5},
R^{6}, L^{1} y L^{2} son como se define previamente para el
Esquema (I), y Z representa un grupo saliente. Haciendo referencia
al Esquema (IV), el hidroxilo en C2 del
4-amino-2-pirimidiniol
40 es más reactivo con nucleófilos que el amino en C4, de forma que
la reacción con la amina 6 produce
N2-sustituida-2,4-pirimidindiamina
42. La reacción subsiguiente con el compuesto 44, que incluye un
buen grupo saliente Z, o con la amina 10 produce una
2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural
(I). El compuesto 44 puede incluir virtualmente cualquier grupo
saliente que se pueda sustituir por el amino en C4 de la
N2-sustituida-2,4-pirimidindiamina
42. Los grupos salientes Z adecuados incluyen, pero no se limita a,
halógenos, metanosulfoniloxi (mesiloxi, "OMs"),
trifluorometanosulfoniloxi ("OTf"), y
p-toluenosulfoniloxi (tosiloxi; "OTs"),
bencenosulfoniloxi ("besilato") y metanitrobencenosulfoniloxi
("nosilato"). Otros grupos salientes adecuados serán
manifiestos para los expertos en la técnica.
Los materiales de partida de
4-amino-2-pirimidinol
sustituido se pueden obtener comercialmente, o se pueden sintetizar
usando técnicas estándar. Más abajo se proporciona una
miríada de referencia de libros de texto que enseñan métodos
sintéticos adecuados.
Todavía en otra realización ejemplar, los
compuestos de 2,4-pirimidindiamina se pueden
preparar a partir de
2-cloro-4-aminopiridinas
o
2-amino-4-cloropiridinas
como se ilustra en el Esquema (V), a continuación:
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Esquema
(V)
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En el Esquema (V), R^{2}, R^{4}, R^{5},
R^{6}, L^{1}, L^{2} y X son como se define para el Esquema
(I), y Z es como se define para el Esquema (IV). Haciendo referencia
al Esquema (V), la
2-amino-4-cloropirimidina
50 se hace reaccionar con la amina 10 para producir
4N-sustituida-2-pirimidinamina
52 que, tras la reacción con el compuesto 31 o con la amina 6,
produce una 2,4-pirimidindiamina según la fórmula
estructural (I). Como alternativa, la
2-cloro-4-aminopirimidina
54 se puede hacer reaccionar con el compuesto 44 seguido de la amina
6 para producir un compuesto según la fórmula estructural (I).
Hay comercialmente una variedad de pirimidinas
50 y 54, adecuadas para uso como materiales de partida en el
Esquema (V), incluyendo, a título de ejemplo y no de limitación,
2-amino-4,6-dicloropirimidina
(Aldrich #A4860-1; Registro CAS
56-05-3);
2-amino-4-cloro-6-metoxi-pirimidina
(Aldrich #51,864-6; Registro CAS
5734-64-5);
2-amino-4-cloro-6-metilpirimidina
(Aldrich #12,288-2; Registro CAS
5600-21-5); y
2-amino-4-cloro-6-metiltiopirimidina
(Aldrich #A4600-5; Registro CAS
1005-38-5). Materiales de partida de
pirimidina adicionales están disponibles en General Intermediates
of Canada, Inc., Edmonton, Alberta, CA
(www.generalintermediates.com) y/o Interchim, Francia
(www.interchim.com), o se pueden preparar usando técnicas
estándar. Más abajo se proporciona una miríada de referencias
de libros de texto que enseñan métodos sintéticos adecuados.
Como alternativa, las
4-cloro-2-pirimidinaminas
50 se pueden preparar como se ilustra en el Esquema (Va):
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Esquema
(Va)
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En el Esquema (Va), R^{5} y R^{6} son como
se define previamente para la fórmula estructural (I). En el
Esquema (Va), el dicarbonilo 53 se hace reaccionar con guanidina
para producir 2-pirimidinamina 51. La reacción con
perácidos como ácido m-cloroperbenzoico, ácido
trifluoroperacético o complejo de urea-peróxido de
hidrógeno produce el N-óxido 55, que entonces se halogena para dar
4-cloro-2-pirimidinamina
50. Las
4-halo-2-pirimidinaminas
correspondientes se pueden obtener usando reactivos de halogenación
adecuados.
\newpage
Todavía en otra realización ejemplar, los
compuestos de 2,4-pirimidindiamina se pueden
preparar a partir de uridinas sustituidas o no sustituidas como se
ilustra en el Esquema (VI), a continuación:
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Esquema
(VI)
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En el Esquema (VI), R^{2}, R^{4}, R^{5},
R^{6}, L^{1}, L^{2} y X son como se define previamente para
el Esquema (I), y el superíndice PG representa un grupo protector,
como se explica en relación con el Esquema (IIb). Según el Esquema
(VI), la uridina 60 tiene un centro reactivo en C4, de forma que la
reacción con la amina 10 o la amina protegida 21 produce citidina
N4-sustituida 62 ó 64, respectivamente. La
desprotección catalizada por ácidos de 62 ó 64
N4-sustituida (cuando "PG" representa un grupo
protector lábil a ácidos) produce la citosina
N4-sustituida 28, que se puede halogenar
subsiguientemente en la posición C2 y se puede hacer reaccionar con
la amina 6 para producir una 2,4-pirimidindiamina
según la fórmula estructural (I).
\newpage
Las citidinas también se pueden usar como
materiales de partida de una manera análoga, como se ilustra en el
Esquema (VII), a continuación:
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Esquema
(VII)
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En el Esquema (VII), R^{2}, R^{4}, R^{5},
R^{6}, L^{1}, L^{2} y X son como se define previamente en el
Esquema (I), y el superíndice PG representa un grupo protector como
se explica anteriormente. Haciendo referencia al Esquema (VII), al
igual que la uridina 60, la citidina 70 tiene un centro reactivo en
C4, de forma que la reacción con la amina 10 o la amina protegida
21 produce la citidina N4-sustituida 62 ó 64,
respectivamente. Estas citidinas 62 y 64 se tratan entonces como se
describe previamente para el Esquema (VI) para producir una
2,4-pirimidindiamina según la fórmula estructural
(I).
Aunque los Esquemas (VI) y (VII) se ejemplifican
con ribosilnucleósidos, los expertos apreciarán que también
funcionarán los 2'-desoxirribo- y
2',3'-didesoxirribonucleósidos correspondientes, así
como nucleósidos que incluyen azúcares o análogos de azúcares
distintos de la ribosa.
En la técnica se conocen numerosas uridinas y
citidinas útiles como materiales de partida en los Esquemas (VI) y
(VII), e incluyen, a título de ejemplo y no de limitación,
5-trifluorometil-2'-desoxicitidina
(Chem. Sources #ABCR F07669; Registro CAS
66,384-66-5);
5-bromouridina (Chem. Sources Int'12000; Registro
CAS 957-75-5);
5-yodo-2'-desoxiuridina
(Aldrich #1-775-6; Registro CAS
54-42-2);
5-fluorouridina (Aldrich #32,937-1;
Registro CAS 316-46-1);
5-yodomidina (Aldrich #85,259-7;
Registro CAS 1024-99-3);
5-(trifluorometil)uridina (Chem Sources Int'l 2000; Registro
CAS 70-00-8),
5-trifluometil-2'-desoxiuridina
(Chem. Sources Int'l 2000; Registro CAS
70-00-8). Las uridinas y citidinas
adicionales que se pueden usar como materiales de partida en los
Esquemas (VI) y (VII) están disponibles en General Intermediates of
Canada, Inc., Edmonton, Alberta, CA
(www.generalintermediates.com) y/o Interchim, Francia
(www.interchim.com), o se pueden preparar usando técnicas
estándar. Más abajo se proporciona una miríada de
referencias de libros de texto que enseñan métodos sintéticos
adecuados.
Los compuestos de
2,4-pirimidindiamina también se pueden sintetizar a
partir de pirimidinas sustituidas, tales como pirimidinas
clorosustituidas, como se ilustra en los Esquemas (VIII) y (IX), más
abajo:
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Esquema
(VIII)
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
(IX)
En los Esquemas (VIII) y (IX), R^{2}, R^{4},
L^{1}, L^{2} y R^{a} son como se define previamente para la
fórmula estructural (I), y "Ar" representa un grupo arilo.
Haciendo referencia al Esquema (VIII), la reacción de
2,4,6-tricloropirimidina 80 (Aldrich
#T5,620-0;
CAS#3764-01-0) con la amina 6
produce una mezcla de tres compuestos:
pirimidin-mono-, di- y triaminas
sustituidas 81, 82 y 83, que se pueden separar y aislar usando HPLC
u otras técnicas convencionales. Las mono- y diaminas 81
y 82 se pueden hacer reaccionar adicionalmente con las aminas 6 y/o
10 para producir
N2,N4,N6-trisustituidas-2,4,6-pirimidintriaminas
84 y 85, respectivamente.
Las
N2,N4-bis-sustituidas-2,4-pirimidindiaminas
se pueden preparar de manera análoga al Esquema (VIII) empleando
como materiales de partida
2,4-dicloro-5-metilpirimidina
o 2,4-dicloro-pirimidina. En este
caso, no se obtiene la pirimidinamina monosustituida que
corresponde al compuesto 81. En su lugar, la reacción transcurre
para producir directamente la
N2,N4-bis-sustituida-2,4-pirimidindiamina.
Haciendo referencia al Esquema (IX), se hace
reaccionar 2,4,5,6-tetracloropirimidina 90 (Aldrich
#24,671-9;
CAS#1780-40-1) con amina 6 en exceso
para producir una mezcla de tres compuestos: 91, 92, y 93, que se
pueden separar y aislar usando HPLC u otras técnicas
convencionales. Como se ilustra, la
N2,N4-bis-sustituida-5,6-dicloro-2,4-pirimidindiamina
92 se puede hacer reaccionar entonces en el haluro de C6 con, por
ejemplo, un agente nucleófilo 94 para producir el compuesto 95.
Como alternativa, el compuesto 92 se puede convertir en la
N2,N4-bis-sustituida-5-cloro-6-aril-2,4-pirimidindiamina
97 vía una reacción de Suzuki. La
2,4-pirimidindiamina 95 se puede convertir en la
2,4-pirimidindiamina 99 mediante reacción con
Bn_{3}SnH.
Como reconocerán los expertos, las
2,4-pirimidindiaminas, sintetizadas vía los
métodos ejemplares descritos anteriormente o por otros medios bien
conocidos, también se pueden utilizar como materiales de partida y/o
intermedios para sintetizar compuestos de
2,4-pirimidindiamina adicionales. En el Esquema (X),
a continuación, se ilustra un ejemplo específico:
Esquema
(X)
En el Esquema (X), R^{4}, R^{5}, R^{6},
L^{2} y R^{a} son como se define previamente para la fórmula
estructural (I). Cada R^{a'} es independientemente un R^{a}, y
puede ser el mismo o diferente del R^{a} ilustrado. Haciendo
referencia al Esquema (X), el ácido carboxílico o el éster 100 se
puede convertir en la amida 104 mediante reacciones con la amina
102. En la amina 102, R^{a'} puede ser igual o diferente de
R^{a} del ácido o éster 100. De forma similar, el éster de
carbonato 106 se puede convertir en carbamato 108.
En el Esquema (XI), a continuación, se ilustra
un segundo ejemplo específico:
Esquema
(XI)
En el Esquema (XI), R^{4}, R^{5}, R^{6},
L^{2} y R^{c} son como se define previamente para la fórmula
estructural (I). Haciendo referencia al Esquema (XI), la amida 110 ó
116 se puede convertir en la amina 114 ó 118, respectivamente,
mediante reducción boránica con complejo 112 de
borano-sulfuro de metilo. Otras reacciones
adecuadas para sintetizar compuestos de
2,4-pirimidindiamina a partir de materiales de
partida de 2,4-pirimidindiamina serán manifiestas
para los expertos en la técnica.
Aunque muchos de los esquemas sintéticos
explicados anteriormente no ilustran el uso de grupos protectores,
los expertos reconocerán que, en algunos casos, los sustituyentes
R^{2}, R^{4}, R^{5}, R^{6}, L^{1} y/o L^{2} pueden
incluir grupos funcionales que requieran protección. La identidad
exacta del grupo protector usado dependerá, entre otros, de la
identidad del grupo funcional que se protege y de las condiciones de
reacción usadas en el esquema sintético particular, y será
manifiesta para los expertos en la técnica. Por ejemplo, en Greene
y Wuts, más arriba, se puede encontrar una guía para
seleccionar grupos protectores y químicas para su unión y
eliminación adecuados para una aplicación particular.
Los profármacos según la fórmula estructural
(II) se pueden preparar mediante modificación normal de los métodos
descritos anteriormente. Como alternativa, tales profármacos se
pueden preparar haciendo reaccionar una
2,4-pirimidindiamina adecuadamente protegida de
fórmula estructural (I) con un progrupo adecuado. Las condiciones
para llevar a cabo tales reacciones y para desproteger el producto
para producir un profármaco de fórmula (II) son bien conocidas.
En la técnica se conoce una miríada de
referencias que enseñan métodos útiles para sintetizar de forma
general pirimidinas, así como materiales de partida descritos en
los Esquemas (I)-(IX). Para una guía específica, refiérase el
lector a Brown, D. J., "The Pyrimidines", en The Chemistry of
Heterocyclic Compounds, Volumen 16 (Weissberger, A., Ed.), 1962,
Interscience Publishers, (una Division de John Wiley & Sons),
Nueva York ("Brown I"); Brown, D.1., "The Pyrimidines",
en The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volumen 16, Suplemento
I (Weissberger, A. y Taylor, E. C., Ed.), 1970,
Wiley-Interscience, (una Division de John Wiley
& Sons), Nueva York ("Brown II"); Brown, D. J., "The
Pyrimidines", en The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volumen
16, Suplemento II (Weissberger, A. y Taylor, E. C., Ed.), 1985, An
Interscience Publication (John Wiley & Sons), Nueva York
("Brown III"); Brown, D. J., "The Pyrimidines" en The
Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volumen 52 (Weissberger, A. y
Taylor, E. C., Ed.), 1994, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York,
p. 1-1509 ("Brown IV"); Kenner, G. W. y Todd,
A., en Heterocyclic Compounds, Volumen 6, (Elderfield, R C., Ed.),
1957, John Wiley, Nueva York, Capítulo 7 (pirimidinas); Paquette,
L. A., Principles of Modern Heterocyclic Chemistry, 1968, W. A.
Benjamin, Inc., Nueva York, p. 1-401 (síntesis de
uracilos p. 313, 315; síntesis de pirimidinas p.
313-316; síntesis de aminopirimidinas p. 315);
Joule, J. A., Mills, K y Smith, G. F., Heterocyclic Chemistry, 3ª
edición, 1995, Chapman and Hall, Londres, UK, p.
1-516; Vorbrüggen, H. y Ruh-Pohlenz,
C., Handbook of Nucleoside Synthesis, John Wiley & Sons, New
York, 2001, p. 1-631 (protección de pirimidinas
mediante acilación p. 90-91; sililación de
pirimidinas p. 91-93); Joule, J. A., Mills, K. y
Smith, G. F., Heterocyclic Chemistry, 4ª edición, 2000, Blackwell
Science, Ltd, Oxford, UK, p. 1-589; y Comprehensive
Organic Synthesis, Volúmenes 1-9 (Trost, B. M. y
Fleming, I., Ed.), 1991, Pergamon Press, Oxford,
UK.
UK.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de
2,4-pirimidindiamina activos de la invención inhiben
las cascadas de señalización de receptores Fc que conducen, entre
otros, a la desgranulación de las células. Como un ejemplo
específico, los compuestos inhiben las cascadas de señalización de
Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI que conducen a la desgranulación
de células inmunitarias tales como neutrófilos, eosinófilos,
mastocitos y/o basófilos. Tanto los mastocitos como los basófilos
desempeñan un papel central en trastornos inducidos por alérgenos,
incluyendo, por ejemplo, rinitis alérgica y asma. Haciendo
referencia a la Fig. 1, con la exposición a alérgenos, que pueden
ser, entre otros, polen o parásitos, se sintetizan anticuerpos IgE
específicos de alérgenos mediante células B activadas por
IL-4 (o IL-13) u otros mensajeros
para cambiar a la síntesis de anticuerpos específicos de la clase
IgE. Estos IgEs específicos de alérgenos se unen al
Fc\varepsilonRI de alta afinidad. Al unirse al antígeno, los IgE
unidos a Fc\varepsilonRI se reticulan y se activa la ruta de
transducción de señales del receptor de IgEs, lo que conduce a la
desgranulación de las células y a la liberación y/o síntesis
consiguiente de un hospedante de mediadores químicos, incluyendo
histamina, proteasas (por ejemplo, triptasa y quimasa), mediadores
lipídicos tales como leucotrienos (por ejemplo, LTCA4), factor
activador de plaquetas (PAF) y prostaglandinas (PGD2) y una serie
de citocinas, incluyendo TNF-\alpha,
IL-4, IL-13, IL-5,
IL-6, IL-8, GMCSF, VEGF y
TGF-\beta. La liberación y/o síntesis de estos
mediadores desde mastocitos y/o basófilos da cuenta de las
respuestas de etapa temprana y tardía inducidas por alérgenos, y
están directamente ligadas a sucesos aguas abajo que conducen a un
estado inflamatorio
sostenido.
sostenido.
Los sucesos moleculares en la ruta de
transducción de señales de Fc\varepsilonRI que conducen a la
liberación de mediadores preformados vía la desgranulación y
liberación y/o síntesis de otros mediadores químicos son bien
conocidos y se ilustran en la Fig. 2. Haciendo referencia a la Fig.
2, el Fc\varepsilonRI es un receptor heterotetrámero compuesto de
una subunidad alfa que se une a IgE, una subunidad beta, y dos
subunidades gamma (homodímero gamma). La reticulación de IgE unido
a Fc\varepsilonRI mediante agentes de unión multivalentes
(incluyendo, por ejemplo, alérgenos específicos de IgE o anticuerpos
anti-IgE o fragmentos) induce la rápida asociación
y activación de la cinasa Lyn relacionada con Src. Lyn fosforila
motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina
(ITAM) en las subunidades beta y gamma intracelulares, lo que
conduce al reclutamiento de Lyn adicional hacia la subunidad beta y
Syk cinasa hacia el homodímero gamma. Estas cinasas asociadas a
receptores, que son activadas mediante fosforilación
intra- e intermolecular, fosforilan otros componentes de
la ruta, tales como la Btk cinasa, LAT, y la fosfolipasa
C-gamma (PLC-gamma). La
PLC-gamma activada inicia rutas que conducen a la
activación de la proteína cinasa C y a la movilización de Ca^{2+},
acciones las cuales son necesarias para la desgranulación. La
reticulación de Fc\varepsilonRI también activa las tres clases
principales de proteína cinasas activadas por mitógenos (MAP), es
decir, ERK1/2, JNK1/2, y p38. La activación de estas rutas es
importante en la regulación transcripcional de mediadores
proinflamatorios, tales como TNF-\alpha e
IL-6, así como el mediador lipídico leucotrieno
C4
(LTC4).
(LTC4).
Aunque no se ilustra, se cree que la cascada de
señalización de Fc\gammaRI comparte algunos elementos comunes con
la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI. De forma
importante, al igual que Fc\varepsilonRI, el Fc\gammaRI incluye
un homodímero gamma que es fosforilado y recluta Syk, y, al igual
que Fc\varepsilonRI, la activación de la cascada de señalización
de Fc\gammaRI conduce, entre otros, a la desgranulación. Otros
receptores Fc que comparten el homodímero gamma, y que pueden ser
regulados mediante los compuestos de
2,4-pirimidindiamina activos incluyen, pero no se
limitan a, Fc\alphaRI y
Fc\gammaRIII.
Fc\gammaRIII.
La capacidad de los compuestos de
2,4-pirimidindiamina de la invención para inhibir
las cascadas de señalización de los receptores Fc se puede
determinar o confirmar de forma simple en ensayos in vitro.
En la sección de Ejemplos se proporcionan ensayos adecuados para
confirmar la inhibición de la desgranulación mediada por
Fc\varepsilonRI. En un ensayo típico, las células capaces de
sufrir la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI, tales como
mastocitos o basófilos, se hacen crecer en primer lugar en presencia
de IL-4, Factor de Células Madre (SCF),
IL-6 e IgB para incrementar la expresión del
Fc\varepsilonRI, se exponen a un compuesto de ensayo de
2,4-pirimidindiamina de la invención y se estimulan
con anticuerpos anti-IgE (o, como alternativa, un
alérgeno específico de IgE). Tras la incubación, la cantidad de un
mediador químico u otro agente químico liberado y/o sintetizado
como consecuencia de la activación de la cascada de señalización de
Fc\varepsilonRI se puede cuantificar usando técnicas estándar, y
se puede comparar con la cantidad del mediador o agente liberado a
partir de células de control (es decir, células que son
estimuladas pero que no se exponen a compuesto de ensayo). La
concentración de compuesto de ensayo que produce una reducción de
50% en la cantidad del mediador o agente, medida en comparación con
células de control, es la IC_{50} del ensayo. El origen de los
mastocitos o basófilos usados en el ensayo dependerá, en parte, del
uso deseado de los compuestos, y será manifiesto para los expertos
en la técnica. Por ejemplo, si los compuestos se usarán para tratar
o prevenir una enfermedad particular en seres humanos, una fuente
conveniente de mastocitos o basófilos es un ser humano u otro animal
que constituye un modelo clínico aceptado o conocido para la
enfermedad particular. De esto modo, dependiendo de la aplicación
particular, los mastocitos o basófilos pueden derivar de una amplia
variedad de fuentes animales, oscilando desde, por ejemplo,
mamíferos inferiores tales como ratones y ratas, a perros, ovejas y
otros mamíferos empleados habitualmente en pruebas clínicas, hasta
mamíferos superiores tales como monos, chimpancés y simios,
hasta seres humanos. Los ejemplos específicos de células adecuadas
para llevar a cabo los ensayos in vitro incluyen, pero no se
limitan a, basófilos de roedores o de seres humanos, estirpes
celulares de leucemia de basófilos de rata, mastocitos primarios de
ratón (tales como mastocitos de ratón derivados de médula ósea
"BMMC") y mastocitos primarios de seres humanos aislados de
sangre del cordón umbilical ("CHMC") u otros tejidos tales
como pulmón. En la sección de Ejemplos (véase, por
ejemplo, Demo et al., 1999, Cytometry
36(4):340-348 y la Solicitud Serie nº
10/053.355, presentada el 8 de noviembre de 2001, en trámite junto
con la presente) se proporcionan o son bien conocidos métodos para
aislar y cultivar estos tipos celulares. Por supuesto, también se
pueden usar otros tipos de inmunocitos que se desgranulan con la
activación de la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI,
incluyendo, por ejemplo,
eosinófilos.
eosinófilos.
Como reconocerán los expertos, el mediador o
agente cuantificado no es crítico. El único requisito es que sea un
mediador o agente liberado y/o sintetizado como consecuencia de la
iniciación o activación de la cascada de señalización de receptores
Fc. Por ejemplo, haciendo referencia a la Fig. 1, la activación de
la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI en mastocitos y/o
basófilos conduce a numerosos sucesos aguas abajo. Por ejemplo, la
activación de la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI
conduce a la liberación inmediata (es decir, en 1-3
min. tras la activación del receptor) de una variedad de mediadores
químicos preformados y agentes vía la desgranulación. De
este modo, en una realización, el mediador o agente cuantificado
puede ser específico para gránulos (es decir, presente en
gránulos pero no en el citoplasma celular de forma general).
Ejemplos de mediadores o agentes específicos de gránulos que se
pueden cuantificar para determinar y/o confirmar la actividad de un
compuesto de 2,4-pirimidindiamina de la invención
incluyen, pero no se limitan a, enzimas específicas de gránulos
tales como hexosaminidasa y triptasa, y componentes específicos de
gránulos tales como histamina y serotonina. Los ensayos para
cuantificar tales factores son bien conocidos, y en muchos casos
están comercialmente disponibles. Por ejemplo, la liberación de
triptasa y/o hexosaminidasa se puede cuantificar incubando las
células con sustratos escindibles que fluorescen al escindirse, y
cuantificando la cantidad de fluorescencia producida, usando
técnicas convencionales. Tales sustratos fluorógenos escindibles
están comercialmente disponibles. Por ejemplo, para cuantificar la
cantidad de triptasa liberada, se pueden usar los sustratos
fluorógenos
Z-Gly-Pro-Arg-AMC
(Z=benciloxicarbonilo;
AMC=7-amino-4-metilcumarina;
BIOMOL Research Laboratories, Inc., Plymouth Meeting, PA 19462,
número de catalágo P-142) y
Z-Ala-Lys-Arg-AMC
(Enzyme Systems Products, una división de ICN Biomedicals, Inc.,
Livermore, CA 94550, número de catalágo AMC-246).
El sustrato fluorógeno
4-metilumbeliferil-N-acetil-\beta-D-glucosaminida
(Sigma, St. Louis, MO, Catálogo #69585) se puede usar para
cuantificar la cantidad de hexosaminidasa liberada. La liberación de
histamina se puede cuantificar usando un ensayo inmunoabsorbente
ligado a enzimas (ELISA) comercialmente disponible, tal como el
ensayo ELISA #IM2015 de histamina de Inmunotech
(Beckman-Coulter, Inc.). En la sección de Ejemplos
se proporcionan métodos específicos para cuantificar la liberación
de triptasa, hexosaminidasa e histamina. Cualquiera de estos
ensayos se puede usar para determinar o confirmar la actividad de
los compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la
invención.
invención.
Haciendo referencia nuevamente a la Fig. 1, la
desgranulación es solamente una de varias respuestas iniciadas por
la cascada de señalización de Fc\varepsilonRI. Además, la
activación de esta ruta de señalización conduce a la síntesis de
novo y liberación de citocinas y quimiocinas tales como
IL-4, IL-5, IL-6,
TNF-\alpha, IL-13 y
MIP1-\alpha, y la liberación de mediadores
lipídicos tales como leucotrienos (por ejemplo, LTC4), factor
activador de plaquetas (PAF) y prostaglandinas. En consecuencia, los
compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención
también se pueden evaluar para determinar la actividad cuantificando
la cantidad de uno o más de estos mediadores liberados y/o
sintetizados por células
activadas.
activadas.
A diferencia de los componentes específicos de
gránulos explicados anteriormente, estos mediadores de "etapa
tardía" no se liberan inmediatamente tras la activación de la
cascada de señalización de Fc\varepsilonRI. En consecuencia,
cuando se cuantifican estos mediadores de etapa tardía, se debería
tener cuidado para asegurarse de que el cultivo celular activado se
incuba durante un tiempo suficiente para dar como resultado la
síntesis (si es necesario) y liberación del mediador que se está
cuantificando. Generalmente, PAF y los mediadores lipídicos tales
como leucotrieno C4 se liberan 3-30 min. tras la
activación de Fc\varepsilonRI. Las citocinas y otros mediadores
de etapa tardía se liberan aprox. 4-8 h tras la
activación de Fc\varepsilonRI. Los tiempos de incubación
adecuados para un mediador específico serán manifiestos para los
expertos en la técnica. En la sección de Ejemplos se proporciona
una guía específica y ensayos.
La cantidad de un mediador particular de etapa
tardía liberado se puede cuantificar usando cualquier técnica
estándar. En una realización, la cantidad o cantidades se pueden
cuantificar usando ensayos ELISA. Los kits de ensayo ELISA
adecuados para cuantificar la cantidad de TNF\alpha,
IL-4, IL-5, IL-6 y/o
IL-13 liberados están disponibles en, por ejemplo,
Biosource International, Inc., Camarillo, CA 93012 (véase, por
ejemplo, los números de catálogo KHC3011, KHC0042, KHC0052, KHC0061
y KHC0132). Los kits de ensayo ELISA adecuados para cuantificar la
cantidad de leucotrieno C4 (LTC4) liberado de las células están
disponibles en Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI 48108 (véase, por
ejemplo, número de catalágo 520211).
Típicamente, los compuestos de
2,4-pirimidindiamina activos de la invención
presentarán IC_{50} con respecto a la desgranulación mediada por
Fc\varepsilonRI y/o la liberación o síntesis de mediadores de
alrededor de 20 \muM o menor, según se mide en un ensayo in
vitro, tal como uno de los ensayos in vitro descritos
anteriormente o en la sección de Ejemplos. Por supuesto, los
expertos apreciarán que compuestos que presentan IC_{50} menores,
por ejemplo del orden de 10 \muM, 1 \muM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, o
incluso menores, son particularmente útiles.
Los expertos también apreciarán que los diversos
mediadores explicados anteriormente pueden inducir diferentes
efectos adversos o mostrar diferentes potencias con respecto al
mismo efecto adverso. Por ejemplo, el mediador lipídico LTC4 es un
potente vasoconstrictor - es aproximadamente
1000 veces más potente induciendo la vasoconstricción que la
histamina. Como otro ejemplo, además de mediar reacciones de
hipersensibilidad atópica o de tipo I, las citocinas también pueden
provocar remodelación tisular y proliferación celular. De este modo,
aunque los compuestos que inhiben la liberación y/o síntesis de uno
cualquiera de los mediadores químicos explicados previamente son
útiles, los expertos apreciarán que los compuestos que inhiben la
liberación y/o la síntesis de una pluralidad de, o de incluso
todos, los mediadores previamente descritos encuentran uso
particular, ya que tales compuestos son útiles para mejorar o
evitar completamente una pluralidad de, o incluso todos, los
efectos adversos inducidos por los mediadores particulares. Por
ejemplo, los compuestos que inhiben la liberación de los tres tipos
de mediadores -específicos de gránulos, lipídicos y de
citocinas- son útiles para tratar o prevenir reacciones
de hipersensibilidad de tipo I inmediata, así como los síntomas
crónicos asociados con ellas.
Los compuestos de la invención capaces de
inhibir la liberación de más de un tipo de mediador (por
ejemplo, específico de gránulos o de etapa tardía) se pueden
identificar determinando la IC_{50} con respecto a un mediador
representante de cada clase usando los diversos ensayos in
vitro descritos anteriormente (u otros ensayos in vitro
equivalentes). Los compuestos de la invención que son capaces de
inhibir la liberación de más de un tipo de mediador mostrarán
típicamente una IC_{50} para cada tipo de mediador ensayado de
menos de alrededor de 20 \muM. Por ejemplo, un compuesto que
muestra una IC_{50} de 1 \muM con respecto a la liberación de
histamina (IC_{50}^{histamina}) y una IC_{50} de 1 nM con
respecto a la síntesis y/o liberación de LTC4 (IC_{50}^{LTC4})
inhibe la liberación de mediadores tanto inmediatos (específicos de
gránulos) como de etapa tardía. Como otro ejemplo específico, un
compuesto que muestra una IC_{50}^{triptasa} de 10 \muM, una
IC_{50}^{LTC4} de 1 \muM y una
IC_{50}^{IL-4} de 1 \muM inhibe la liberación
de mediadores inmediatos (específicos de gránulos), lipídicos y de
citocinas. Aunque los ejemplos específicos anteriores utilizan las
IC_{50} de un mediador representante de cada clase, los expertos
apreciarán que se pueden obtener las IC_{50} de una pluralidad, o
incluso de todos, los mediadores que comprenden una o más de las
clases. La cantidad o cantidades e identidad o identidades de
mediadores para los cuales se deberían de averiguar los datos de
IC_{50} para un compuesto y aplicación particulares serán
manifiestas para los expertos en la técnica.
Se pueden utilizar ensayos similares para
confirmar la inhibición de cascadas de transducción de señales
iniciadas por otros receptores Fc, tales como la señalización de
Fc\alphaRI, Fc\gammaRI y/o Fc\gammaRIII, con modificación
habitual. Por ejemplo, la capacidad de los compuestos para inhibir
la transducción de señales de Fc\gammaRI se puede confirmar en
ensayos similares a los descritos anteriormente, con la excepción de
que la cascada de señalización de Fc\gammaRI se activa, por
ejemplo, incubando las células con IgG y un alérgeno o anticuerpo
específico de IgG, en lugar de IgE y un alérgeno o anticuerpo
específico de IgE. Los tipos celulares adecuados, agentes
activantes y agentes para cuantificar y confirmar la inhibición de
otros receptores Fc, tales como receptores Fc que comprenden un
homodímero gamma, serán manifiestos para los expertos en la
técnica.
Una clase particularmente útil de compuestos
incluye aquellos compuestos de 2,4-pirimidindiamina
que inhiben la liberación de mediadores inmediatos específicos de
gránulos y mediadores de etapa tardía con IC_{50}^{s}
aproximadamente equivalentes. Por aproximadamente equivalente se
quiere decir que las IC_{50}^{s} para cada tipo de mediador
están dentro de alrededor de un intervalo de 10 veces uno del otro.
Otra clase particularmente útil de compuestos incluye aquellos
compuestos de 2,4-pirimidindiamina que inhiben la
liberación de mediadores inmediatos específicos de gránulos,
mediadores lipídicos y mediadores de citocinas con IC_{50}^{s}
aproximadamente equivalentes. En una realización específica, tales
compuestos inhiben la liberación de los siguientes mediadores con
IC_{50}^{s} aproximadamente equivalentes: histamina, triptasa,
hexosaminidasa, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-13, TNF\alpha y LTC4.
Tales compuestos son particularmente útiles para, entre otros,
mejorar o evitar completamente las respuestas tanto de etapa
temprana como de etapa tardía asociadas con reacciones de
hipersensibilidad atópica o inmediata de tipo I.
Idealmente, la capacidad para inhibir la
liberación de todos los tipos deseados de mediadores residirá en un
único compuesto. Sin embargo, también se pueden identificar mezclas
de compuestos que logren el mismo resultado. Por ejemplo, se puede
usar un primer compuesto que inhibe la liberación de mediadores
específicos de gránulos en combinación con un segundo compuesto que
inhibe la liberación y/o síntesis de mediadores de citocinas.
Además de las rutas de desgranulación de
Fc\varepsilonRI o Fc\gammaRI explicadas anteriormente, la
desgranulación de mastocitos y/o basófilos puede ser inducida por
otros agentes. Por ejemplo, la ionomicina, un ionóforo del calcio
que evita la maquinaria de transducción de señales de
Fc\varepsilonRI o Fc\gammaRI temprana de la célula, induce
directamente un flujo de calcio que dispara la desgranulación.
Haciendo referencia nuevamente a la Fig. 2, PLC\gamma activada
inicia rutas que conducen, entre otros, a la movilización del ión
calcio y la desgranulación subsiguiente. Como se ilustra, esta
movilización de Ca^{2+} es disparada tardíamente en la ruta de
transducción de señales de Fc\varepsilonRI. Como se mencionó
anteriormente, y como se ilustra en la Fig. 3, la ionomicina induce
directamente la movilización de Ca^{2+} y un flujo de Ca^{2+}
que conduce a la desgranulación. Otros ionóforos que inducen la
desgranulación de esta manera incluyen A23187. La capacidad de los
ionóforos inductores de la granulación, tales como la ionomicina,
para evitar las etapas tempranas de las cascadas de señalización de
Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI se puede usar como una
contraidentificación para identificar compuestos activos de la
invención que ejercen específicamente su actividad inhibidora de la
desgranulación bloqueando o inhibiendo las cascadas de señalización
de Fc\varepsilonRI o Fc\gammaRI tempranas, como se explica
anteriormente. Los compuestos que inhiben específicamente tal
desgranulación temprana mediada por Fc\varepsilonRI o
Fc\gammaRI inhiben no sólo la desgranulación y la subsiguiente
liberación rápida de histamina, triptasa y otros contenidos de
gránulos, sino también inhiben las rutas de activación
proinflamatorias que provocan la liberación de TNF\alpha,
IL-4, IL-13 y los mediadores
lipídicos tales como LTC4. De este modo, los compuestos que inhiben
específicamente tal desgranulación temprana mediada por
Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI bloquean o inhiben no sólo
reacciones agudas de hipersensibilidad atópica o de tipo I, sino
también las respuestas tardías que implican múltiples mediadores
inflama-
torios.
torios.
Los compuestos de la invención que inhiben
específicamente la desgranulación temprana mediada por
Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI son aquellos compuestos que
inhiben la desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI y/o
Fc\gammaRI (por ejemplo, tienen una IC_{50} menor que alrededor
de 20 \muM con respecto a la liberación de un mediador o
componente específico de gránulos según se mide en un ensayo in
vitro con células estimuladas con un agente de unión a IgE o
IgG) pero que no inhiben apreciablemente la desgranulación inducida
por ionóforos. En una realización, se considera que los compuestos
no inhiben apreciablemente la desgranulación inducida por ionóforos
si muestran una IC_{50} de la desgranulación inducida por
ionóforos mayor que alrededor de 20 \muM, según se mide en un
ensayo in vitro. Por supuesto, los compuestos activos que
muestran IC_{50}^{s} incluso mayores de la desgranulación
inducida por ionóforos, o que no inhiben en absoluto la
desgranulación inducida por ionóforos, son particularmente útiles.
En otra realización, se considera que los compuestos no inhiben
apreciablemente la desgranulación inducida por ionóforos si muestran
una diferencia mayor de 10 veces en sus IC_{50}^{s} de la
desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI y la
desgranulación inducida por ionóforos, según se mide en un ensayo
in vitro. Los ensayos adecuados para determinar la IC_{50}
de la desgranulación inducida por ionóforos incluyen cualquiera de
los ensayos de desgranulación descritos previamente, con la
modificación de que las células son estimuladas o activadas con un
ionóforo del calcio inductor de la desgranulación, tal como
ionomicina o A23187 (A.G. Scientific, San Diego, CA) en lugar de
anticuerpos anti-IgE o un alérgeno específico de
IgE. En la sección de Ejemplos se proporcionan ensayos específicos
para evaluar la capacidad de un compuesto de
2,4-pirimidindiamina particular de la invención para
inhibir la desgranulación inducida por
ionóforos.
ionóforos.
Como reconocerán los expertos, los compuestos
que muestran un grado elevado de selectividad por la desgranulación
mediada por Fc\varepsilonRI encuentran uso particular, puesto que
tales compuestos se dirigen selectivamente hacia la cascada de
Fc\varepsilonRI y no interfieren con otros mecanismos de la
desgranulación. De forma similar, los compuestos que muestran un
grado elevado de selectividad por la desgranulación mediada por
Fc\gammaRI encuentran uso particular, puesto que tales compuestos
seleccionan selectivamente la cascada de Fc\gammaRI y no
interfieren con otros mecanismos de la desgranulación. Los
compuestos que muestran un grado elevado de selectividad son
generalmente 10 veces o más selectivos para la desgranulación
mediada por Fc\varepsilonRI o Fc\gammaRI con respecto a la
desgranulación inducida por ionóforos, tal como la desgranulación
inducida por ionomicina.
Los datos bioquímicos y otros datos confirman
que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina descritos
aquí son potentes inhibidores de la actividad de Syk cinasa. Por
ejemplo, en experimentos con una Syk cinasa aislada, de
veinticuatro compuestos de 2,4-pirimidindiamina
ensayados, todos menos dos inhibieron la fosforilación, catalizada
por Syk cinasa, de un sustrato peptídico, con IC50s en el intervalo
submicromolar. Los compuestos restantes inhibieron la fosforilación
en el intervalo micromolar. Además, de dieciséis compuestos
ensayados en un ensayo in vitro con mastocitos, todos
inhibieron la fosforilación de sustratos de Syk cinasa (por
ejemplo, PLC-gammaI, LAT) y proteínas aguas
abajo de Syk cinasa (por ejemplo, JNK, p38, Erk1/2 y PKB,
cuando se ensayaron), pero no proteínas aguas arriba de Syk cinasa
en la cascada (por ejemplo, Lyn). La fosforilación de los
sustratos de Lyn no se inhibió por los compuestos de
2,4-pirimidindiamina ensayados. Además, para los
siguientes compuestos, se observó una elevada correlación entre su
inhibición de la actividad de Syk cinasa en ensayos bioquímicos
(IC_{50} en el intervalo de 3 a 1850 nM) y su inhibición de la
desgranulación mediada por Fc\varepsilonRI en mastocitos
(IC_{50} en el intervalo de 30 a 1650 nM): R950373, R950368,
R921302, R945371, R945370, R945369, R945365, R921304, R945140,
R945071, R940358, R940353, R940352, R940351, R940350, R940347,
R921303, R940338, R940323, R940290, R940277, R940276, R940275,
R940269, R940255, R935393, R935372, R935366, R935310, R935309,
R935307, R935304, R935302, R935293, R935237, R935198, R935196,
R935194, R935193, R935191, R935190, R935138, R927050, R926968,
R926956, R926931, R926891, R926839, R926834, R926816, R926813,
R926791, R926782, R926780, R926757, R926753, R926745, R926715,
R926508, R926505, R926502, R926501, R926500, R921218, R921147,
R920410, R909268, R921219, R908712, R908702.
En consecuencia, la actividad de los compuestos
de 2,4-pirimidindiamina de la invención también se
puede confirmar en ensayos bioquímicos o celulares de la actividad
de Syk cinasa. Haciendo referencia nuevamente a la Fig.2, en la
cascada de señalización de Fc\varepsilonRI en mastocitos y/o
basófilos, Syk cinasa fosforila LAT y PLC-gammaI,
lo que conduce, entre otros, a la desgranulación. Cualquiera de
estas actividades se puede usar para confirmar la actividad de los
compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la invención.
En una realización, la actividad se confirma poniendo en contacto
una Syk cinasa aislada, o un fragmento activo de la misma, con un
compuesto de 2,4 pirimidindiamina en presencia de un sustrato de Syk
cinasa (por ejemplo, un péptido sintético o una proteína que
se sabe que es fosforilada por Syk en una cascada de señalización) y
evaluando si la Syk cinasa fosforiló el sustrato. Como alternativa,
el ensayo se puede llevar a cabo con células que expresan una Syk
cinasa. Las células pueden expresar endógenamente la Syk cinasa, o
se pueden manipular mediante ingeniería genética para que expresen
una Syk cinasa recombinante. Las células pueden opcionalmente
expresar también el sustrato de Syk cinasa. Las células adecuadas
para llevar a cabo tales ensayos de confirmación, así como los
métodos de manipulación mediante ingeniería genética de células
adecuadas, serán manifiestos para los expertos en la técnica. En la
sección de Ejemplos se proporcionan ejemplos específicos de ensayos
bioquímicos y celulares adecuados para confirmar la actividad de los
compuestos de 2,4-pirimidin-
diamina.
diamina.
Generalmente, los compuestos que son inhibidores
de Syk cinasa mostrarán una IC_{50} con respecto a una actividad
de Syk cinasa, tal como la capacidad de Syk cinasa para fosforilar
un sustrato sintético o endógeno, en un ensayo in vitro o
celular en el intervalo de alrededor de 20 \muM o menos. Los
expertos apreciarán que los compuestos que muestran IC_{50}
menores, tales como en el intervalo de 10 \muM, 1 \muM, 100 nM,
10 nM, 1 nM, o incluso menores, son particularmente útiles.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha explicado previamente, los compuestos
activos de la invención inhiben las cascadas de señalización de los
receptores Fc, especialmente aquellos receptores Fc que incluyen un
homodímero gamma, tales como las cascadas de señalización de
Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI, que conducen, entre otros, a la
liberación y/o síntesis de mediadores químicos desde las células,
ya sea vía desgranulación u otros procesos. Como también se
ha explicado, los compuestos activos también son inhibidores
potentes de Syk cinasa. Como consecuencia de estas actividades, los
compuestos activos de la invención se pueden usar en una variedad de
contextos in vitro, in vivo y ex vivo para
regular o inhibir Syk cinasa, cascadas de señalización en las que
Syk cinasa desempeña un papel, cascadas de señalización de
receptores Fc, y las respuestas biológicas provocadas por tales
cascadas de señalización. Por ejemplo, en una realización, los
compuestos se pueden usar para inhibir Syk cinasa, ya sea in
vitro o in vivo, en virtualmente cualquier tipo celular
que exprese Syk cinasa. También se pueden usar para regular
cascadas de transducción de señales en las que Syk cinasa desempeña
un papel. Tales cascadas de transducción de señales dependientes de
Syk incluyen, pero no se limitan a, las cascadas de transducción de
señales de Fc\varepsilonRI, Fc\gammaRI, Fc\gammaRIII, BCR e
integrina. Los compuestos también se pueden usar in vitro o
in vivo para regular, y en particular inhibir, respuestas
celulares o biológicas provocadas por tales cascadas de
transducción de señales dependientes de Syk. Tales respuestas
celulares o biológicas incluyen, pero no se limitan a, estallido
respiratorio, adhesión celular, desgranulación celular,
diseminación celular, migración celular, agregación celular,
fagocitosis, síntesis y liberación de citocinas, maduración celular
y flujo de Ca^{2+}. De forma importante, los compuestos se pueden
usar para inhibir in vivo Syk cinasa como un enfoque
terapéutico para el tratamiento o prevención de enfermedades
mediadas, ya sea totalmente o en parte, por una actividad de Syk
cinasa. Los ejemplos no limitantes de enfermedades mediadas por Syk
cinasa que se pueden tratar o prevenir con los compuestos son
aquellas explicadas con más detalle a continuación.
En otra realización, los compuestos activos se
pueden usar para regular o inhibir las cascadas de señalización de
los receptores Fc y/o la desgranulación mediada por
Fc\varepsilonRI y/o Fc\gammaRI como un enfoque terapéutico para
el tratamiento o prevención de enfermedades caracterizada por,
provocadas por y/o asociadas con la liberación o síntesis de
mediadores químicos de tales cascadas de señalización de receptores
Fc o de tal desgranulación. Tales tratamientos se pueden
administrar a animales en contextos veterinarios, o a seres
humanos. Las enfermedades que se caracterizan por, que están
provocadas por o que están asociadas con tal liberación, síntesis o
desgranulación de mediadores, y que por lo tanto se pueden tratar o
prevenir con los compuestos activos, incluyen, a título de ejemplo
y no de limitación, reacciones alérgicas o de hipersensibilidad
anafiláctica o atópicas, alergias (por ejemplo, conjuntivitis
alérgica, rinitis alérgica, asma atópica, dermatitis atópica y
alergias a alimentos), cicatrización de bajo grado (por
ejemplo, de esclerodermia, fibrosis incrementada, queloides,
cicatrices post-quirúrgicas, fibrosis pulmonar,
espasmos vasculares, migraña, lesión por reperfusión y
post-infarto de miocardio), enfermedades asociadas
con destrucción de tejido (por ejemplo, COPD,
cardiobronquitis y post-infarto de miocardio),
enfermedades asociadas con inflamación tisular (por ejemplo,
síndrome irritable del intestino, colon espástico y enfermedad
inflamatoria del intestino), inflamación y
cicatrización.
cicatrización.
Además de la miríada de enfermedades explicadas
anteriormente, los datos empíricos celulares y de animales
confirman que los compuestos de 2,4-pirimidindiamina
descritos aquí son también útiles para el tratamiento o prevención
de enfermedades autoinmunitarias, así como los diversos síntomas
asociados con tales enfermedades. Los tipos de enfermedades
autoinmunitarias que se pueden tratar o prevenir con los compuestos
de 2,4-pirimidindiamina generalmente incluyen
aquellos trastornos que implican lesión tisular que se produce como
resultado de una respuesta humoral y/o mediada por células a
inmunógenos o antígenos de origen endógeno y/o exógeno. Tales
enfermedades se denominan frecuentemente como enfermedades que
implican reacciones de hipersensibilidad no anafiláctica (es
decir, tipo II, tipo III y/o tipo IV).
Como se ha explicado previamente, las reacciones
de hipersensibilidad de tipo I generalmente resultan de la
liberación de sustancias farmacológicamente activas, tales como
histamina, a partir de mastocitos y/o basófilos tras el contacto
con un antígeno exógeno específico. Como se ha mencionado
anteriormente, tales reacciones de tipo I desempeñan un papel en
numerosas enfermedades, incluyendo asma alérgica, rinitis alérgica,
etc.
Las reacciones de hipersensibilidad de tipo II
(también denominadas como reacciones de hipersensibilidad
citotóxica, citolítica dependiente del complemento o estimulante de
células) se producen cuando las inmunoglobulinas reaccionan con
componentes antigénicos de células o tejido, o con un antígeno o
hapteno que se ha acoplado íntimamente a las células o tejido. Las
enfermedades que están asociadas habitualmente con reacciones de
hipersensibilidad de tipo II incluyen, pero no se limitan a, anemia
hemolítica autoinmunitaria, eritroblastosis fetal y enfermedad de
Goodpasture.
Las reacciones de hipersensibilidad de tipo III
(también denominadas como reacciones de hipersensibilidad a
complejos tóxicos, a complejos solubles, o a complejos inmunitarios)
resultan de la deposición de complejos circulantes solubles de
antígeno-inmunoglobulina en vasos o en tejidos, con
reacciones inflamatorias agudas concomitantes en el sitio de la
deposición del complejo inmunitario. Los ejemplos no limitantes de
enfermedades de reacción de tipo III prototípicas incluyen la
reacción de Arthus, artritis reumatoide, enfermedad del suero,
lupus eritematoso sistémico, ciertos tipos de glomerulonefritis,
esclerosis múltiple, y penfigoide ampolloso.
Las reacciones de hipersensibilidad de tipo IV
(frecuentemente denominadas reacciones de hipersensibilidad
celular, mediada por células, retrasada, o de tipo tuberculina) son
provocadas por linfocitos T sensibilizados que resultan del
contacto con un antígeno específico. Los ejemplos no limitantes de
enfermedades citadas que impliquen reacciones de tipo IV son
dermatitis de contacto y rechazo de aloinjerto.
Las enfermedades autoinmunitarias asociadas con
cualquiera de las reacciones anteriores de hipersensibilidad no
anafiláctica se pueden tratar o prevenir con los compuestos de
2,4-pirimidindiamina de la invención. En
particular, los métodos se pueden usar para tratar o prevenir
aquellas enfermedades autoinmunitarias caracterizadas
frecuentemente como trastornos autoinmunitarios de un solo órgano o
de un solo tipo de células, incluyendo, pero sin limitarse a:
tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica autoinmunitaria,
gastritis atrófica autoinmunitaria de anemia perniciosa,
encefalomielitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria,
enfermedad de Goodpasture, trombocitopenia autoinmunitaria,
oftalmia simpática, miastenia grave, enfermedad de Graves, cirrosis
biliar primaria, hepatitis agresiva crónica, colitis ulcerosa y
glomerulopatía membranosa, así como aquellas enfermedades
autoinmunitarias caracterizadas frecuentemente por implicar un
trastorno autoinmunitario sistémico, que incluyen, pero no se
limitan a, lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis reumatoide,
síndrome de Sjogren, síndrome de Reiter,
polimiositis-dermatomiositis, esclerosis sistémica,
panarteritis nudosa, esclerosis múltiple y penfigoide
ampolloso.
ampolloso.
Los expertos en la técnica apreciarán que muchas
de las enfermedades autoinmunitarias enumeradas anteriormente están
asociadas con síntomas graves, cuya mejora proporciona un beneficio
terapéutico significativo incluso en casos en los que la enfermedad
autoinmunitaria subyacente no se puede mejorar. Muchos de estos
síntomas, así como sus estados mórbidos subyacentes, resultan como
consecuencia de la activación de la cascada de señalización de
Fc\gammaR en monocitos. Puesto que los compuestos de
2,4-pirimidindiamina descritos aquí son potentes
inhibidores de tal señalización de Fc\gammaR en monocitos y en
otras células, los métodos encuentran uso en el tratamiento y/o
prevención de una miríada de síntomas adversos asociados con las
enfermedades autoinmunitarias enumeradas
anteriormente.
anteriormente.
Como un ejemplo específico, la artritis
reumatoide (RA) típicamente da como resultado hinchamiento, dolor,
pérdida de movimiento y dolor por palpación de las articulaciones
diana por todo el cuerpo. La RA se caracteriza por un sinovio
crónicamente inflamado que está densamente poblado con linfocitos.
La membrana sinovial, que es típicamente una gruesa capa celular,
se hace enormemente celular y toma una forma similar a tejido
linfoide, incluyendo células dendríticas, células T, B y NK,
macrófagos y racimos de células plasmáticas. Este proceso, así como
una plétora de mecanismos inmunopatológicos que incluyen la
formación de complejos de antígeno-inmunoglobulina,
eventualmente da como resultado la destrucción de la integridad de
la articulación, dando como resultado deformidad, pérdida
permanente de función y/o erosión ósea en o cerca de la
articulación. Los métodos se pueden usar para tratar o mejorar uno
cualquiera, varios o todos estos síntomas de RA. De este modo, en el
contexto de RA, se considera que los métodos proporcionan beneficio
terapéutico (explicado más generalmente, más abajo) cuando
se logra una reducción o mejora de cualquiera de los síntomas
asociados habitualmente con RA, independientemente de si el
tratamiento da como resultado un tratamiento concomitante de la RA
subyacente y/o una reducción en la cantidad de factor reumatoide
("RF") circulante.
Como otro ejemplo específico, el lupus
eritematoso sistémico ("SLE") está asociado típicamente con
síntomas tales como fiebre, dolor de la articulación (artralgias),
artritis, y serositis (pleuresía o pericarditis). En el contexto de
SLE, se considera que los métodos proporcionan beneficio terapéutico
cuando se logra una reducción o mejora de cualquiera de los
síntomas asociados habitualmente con SLE, independientemente de si
el tratamiento da como resultado un tratamiento concomitante del SLE
subyacente.
Como otro ejemplo específico, la esclerosis
múltiple ("MS") deja lisiado al paciente perturbando la agudeza
visual; estimulando la doble visión; perturbando las funciones
motoras que afectan al andar y al uso de las manos; produciendo
incontinencia del intestino y de la vejiga; espasticidad; y
carencias sensoriales (tacto, dolor y sensibilidad a la
temperatura). En el contexto de MS, se considera que los métodos
proporcionan beneficio terapéutico cuando se logra una mejora o una
reducción en la progresión de uno cualquiera o más de los efectos
lisiantes asociados habitualmente con MS, independientemente de si
el tratamiento da como resultado un tratamiento concomitante de la
MS
subyacente.
subyacente.
Cuando se usan para tratar o prevenir tales
enfermedades, los compuestos activos se pueden administrar de forma
individual, como mezclas de uno o más compuestos activos, o en
mezcla o combinación con otros agentes útiles para tratar tales
enfermedades y/o los síntomas asociados con tales enfermedades. Los
compuestos activos también se pueden administrar en mezcla o en
combinación con agentes útiles para tratar otros trastornos o
enfermedades, tales como esteroides, estabilizadores de la membrana,
inhibidores de SLO, inhibidores de la síntesis y de receptores de
leucotrienos, inhibidores del cambio del isotipo de IgE o de la
síntesis de IgE, del cambio del isotipo de IgG o de la síntesis de
IgG, \beta-agonistas, inhibidores de triptasa,
aspirina, inhibidores de COX, metotrexato, fármacos
anti-TNF, retoxina, inhibidores de PD4, inhibidores
de p38, inhibidores de PDE4, y antihistaminas, por nombrar unos
pocos. Los compuestos activos se pueden administrar per se
en forma de profármacos o como composiciones farmacéuticas que
comprenden un compuesto activo o profármaco.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
los compuestos activos de la invención (o sus profármacos) se
pueden fabricar por medio de procesos convencionales de
mezclamiento, disolución, granulación, levigación obteniendo una
gragea, emulsionamiento, encapsulamiento, atrapamiento o
liofilización. Las composiciones se pueden formular de manera
convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o
auxiliares fisiológicamente aceptables que facilitan el
procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se
puedan usar farmacéuticamente.
El compuesto activo o profármaco se puede
formular en la composición farmacéutica per se, o en forma de
un hidrato, solvato, N-óxido o sal farmacéuticamente aceptable,
como se describe previamente. Típicamente, tales sales son más
solubles en disoluciones acuosas que los ácidos y bases libres
correspondientes, pero también se pueden formar sales que tienen
una solubilidad menor que los ácidos y bases libres
correspondientes.
Las composiciones farmacéuticas pueden tomar una
forma adecuada para virtualmente cualquier modo de administración,
incluyendo, por ejemplo, tópica, ocular, oral, bucal, sistémica,
nasal, inyección, transdérmica, rectal, vaginal, etc., o una forma
adecuada para la administración mediante inhalación o
insuflamiento.
Para administración tópica, el (o los)
compuesto(s) activo(s) o profármaco(s) se
puede(n) formular como disoluciones, geles, ungüentos,
cremas, suspensiones, etc., como es bien conocido en la técnica.
Las formulaciones sistémicas incluyen aquellas
diseñadas para la administración mediante inyección, por
ejemplo inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular,
intratecal o intraperitoneal, así como aquellas diseñadas para la
administración transdérmica, transmucosal, oral o pulmonar.
Las preparaciones inyectables útiles incluyen
suspensiones, disoluciones o emulsiones estériles del compuesto o
compuestos activos en vehículos acuosos u oleosos. Las composiciones
también pueden contener agentes de formulación, tales como un
agente de suspensión, un agente estabilizante y/o un agente
dispersante. Las formulaciones para inyección se pueden presentar
en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo en ampollas o en
recipientes de múltiples dosis, y pueden contener conservantes
añadidos.
Como alternativa, la formulación inyectable se
puede proporcionar en forma de polvo para la reconstitución con un
vehículo adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, agua estéril
libre de pirógenos, tampón, disolución de dextrosa, etc., antes del
uso. Para este fin, el compuesto o compuestos activos se pueden
secar mediante cualquier técnica conocida en la técnica, tal como
liofilización, y se pueden reconstituir antes del uso.
Para la administración transmucosal, en la
formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera a
permear. Tales penetrantes son conocidos en la técnica.
Para la administración oral, las composiciones
farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, tabletas,
comprimidos o cápsulas preparados por medios convencionales con
excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes
aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado,
polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por
ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina, o hidrogenofosfato de
calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o
sílice); agentes disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o
glicolato de almidón sódico); o agentes humectantes (por ejemplo,
laurilsulfato de sodio). Los comprimidos se pueden revestir
mediante métodos bien conocidos en la técnica con, por ejemplo,
azúcares, películas o revestimientos entéricos. Los compuestos que
son particularmente adecuados para administración oral incluyen
compuestos R940350, R935372, R935193, R927050 y R935391.
Las preparaciones líquidas para administración
oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, elixires, disoluciones,
jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto seco
para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del
uso. Tales preparaciones líquidas se pueden preparar por medios
convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como
agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados
de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes
emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no
acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol
etílico, cremophore^{TM} o aceites vegetales fraccionados); y
conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de
metilo o propilo, o ácido sórbico). Las preparaciones también
pueden contener tampones, sales, conservantes, saborizantes,
colorantes y agentes edulcorantes, según sea
apropiado.
apropiado.
Las preparaciones para administración oral se
pueden formular de forma adecuada para dar una liberación controlada
del compuesto activo o profármaco, como es bien conocido.
Para la administración bucal, las composiciones
pueden tomar la forma de comprimidos o tabletas formulados de
manera convencional.
Para las rutas de administración rectal y
vaginal, el compuesto o compuestos activos se pueden formular como
disoluciones (para enemas de retención), supositorios o ungüentos
que contienen bases convencionales para supositorios, tales como
manteca de cacao u otros glicéridos.
Para la administración nasal o la administración
mediante inhalación o insuflamiento, el (o los) compuesto(s)
activo(s) o profármaco(s) se puede(n)
suministrar convenientemente en forma de una pulverización en
aerosol a partir de envases a presión o un nebulizador con el uso
de un propelente adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano,
triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, fluorocarbonos,
dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol a
presión, la dosis unitaria se puede determinar proporcionando una
válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular
cápsulas y cartuchos para uso en un inhalador o insuflador (por
ejemplo, cápsulas y cartuchos compuestos de gelatina) que contienen
una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal
como lactosa o almidón.
Un ejemplo específico de una formulación de
suspensión acuosa adecuada para la administración nasal que usa
dispositivos de pulverización nasal comercialmente disponibles
incluye los siguientes ingredientes: compuesto activo o profármaco
(0,5-20 mg/ml); cloruro de benzalconio
(0,1-0,2 mg/ml); Polisorbato 80 (TWEEN® 80;
0,5-5 mg/ml); carboximetilcelulosa sódica o
celulosa microcristalina (1-15 mg/ml); feniletanol
(1-4 mg/ml); y dextrosa (20-50
mg/ml). El pH de la suspensión final se puede ajustar a un intervalo
de alrededor de pH 5 a pH 7, siendo típico un pH de alrededor de pH
5,5.
Otro ejemplo específico de una suspensión acuosa
adecuada para la administración de los compuestos vía inhalación, y
en particular para tal administración del Compuesto R921218,
contiene 1-20 mg/ml de Compuesto o profármaco,
0,1-1% (v/v) de Polisorbato 80 (TWEEN® 80), 50 mM de
citrato y/o 0,9% de cloruro de sodio.
Para la administración ocular, el (o los)
compuesto(s) activo(s) o profármaco(s) se
puede(n) formular como una disolución, emulsión, suspensión,
etc., adecuada para la administración al ojo. En la técnica se
conoce una variedad de vehículos adecuados para administrar
compuestos al ojo. Los ejemplos no limitantes específicos se
describen en la patente U.S. nº 6.261.547; la patente U.S. nº
6.197.934; la patente U.S. nº 6.056.950; la patente U.S. nº
5.800.807; la patente U.S. nº 5.776.445; la patente U.S. nº
5.698.219; la patente U.S. nº 5.521.222; la patente U.S. nº
5.403.841; la patente U.S. nº 5.077.033; la patente U.S. nº
4.882.150; y la patente U.S. nº 4.738.851.
Para el suministro prolongado, el (o los)
compuesto(s) activo(s) o profármaco(s) se
puede(n) formular como una preparación de depósito para la
administración mediante implante o inyección intramuscular. El
ingrediente activo se puede formular con materiales poliméricos o
hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite
aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados apenas
solubles, por ejemplo como una sal apenas soluble. Como
alternativa, se pueden usar sistemas de suministro transdérmico
fabricados como un disco o parche adhesivo que libera lentamente el
(o los) compuesto(s) activo(s) para absorción
percutánea. Para esto, se pueden usar potenciadores de la
permeación, para facilitar la penetración transdérmica del (o de
los) compuesto(s) activo(s). Los parches transdérmicos
adecuados se describen, por ejemplo, en la patente U.S. nº
5.407.713; la patente U.S. nº 5.352.456; la patente U.S. nº
5.332.213; la patente U.S. nº 5.336.168; la patente U.S. nº
5.290.561; la patente U.S. nº 5.254.346; la patente U.S. nº
5.164.189; la patente U.S. nº 5.163.899; la patente U.S. nº
5.088.977; la patente U.S. nº 5.087.240; la patente U.S. nº
5.008.110; y la patente U.S. nº 4.921.475.
Como alternativa, se pueden emplear otros
sistemas de suministro farmacéutico. Los liposomas y emulsiones son
ejemplos bien conocidos de vehículos de suministro que se pueden
usar para suministrar compuesto(s) activo(s)
o profármaco(s). También se pueden emplear ciertos disolventes orgánicos, tales como dimetilsulfóxido (DMSO), aunque habitualmente al coste de una mayor toxicidad.
o profármaco(s). También se pueden emplear ciertos disolventes orgánicos, tales como dimetilsulfóxido (DMSO), aunque habitualmente al coste de una mayor toxicidad.
Si se desea, las composiciones farmacéuticas se
pueden presentar en un envase o un dispositivo dispensador que
puede contener una o más formas farmacéuticas unitarias que
contienen el (o los) compuesto(s) activo(s). El
envase puede comprender, por ejemplo, una hoja de papel metálico o
plástica, tal como un envase de blíster. El envase o dispositivo
dispensador puede estar acompañado por instrucciones para la
administración.
\vskip1.000000\baselineskip
El (o los) compuesto(s) activo(s)
o profármaco(s), o sus composiciones, generalmente se usarán
en una cantidad eficaz para lograr el resultado pretendido, por
ejemplo en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la enfermedad
particular que se esté tratando. El (o los) compuesto(s) se
puede(n) administrar terapéuticamente para lograr un
beneficio terapéutico, o profilácticamente para lograr un beneficio
profiláctico. Por beneficio terapéutico se quiere decir la
erradicación o mejora del trastorno subyacente que se está tratando,
y/o la erradicación o mejora de uno o más de los síntomas asociados
con el trastorno subyacente, de forma que el paciente informa de
una mejora de la sensación o estado, a pesar de que el paciente
todavía puede estar padeciendo el trastorno subyacente. Por
ejemplo, la administración de un compuesto a un paciente que sufre
una alergia proporciona beneficio terapéutico no sólo cuando se
erradica o se mejora la respuesta alérgica subyacente, sino también
cuando el paciente informa de una disminución de la gravedad o
duración de los síntomas asociados con la alergia tras la
exposición al alérgeno. Como otro ejemplo, el beneficio terapéutico
en el contexto de asma incluye una mejora de la respiración tras el
comienzo de un ataque asmático, o una reducción en la frecuencia o
gravedad de los episodios asmáticos. El beneficio terapéutico
también incluye generalmente detener o ralentizar la progresión de
la enfermedad, independientemente de si se obtiene una mejora.
Para la administración profiláctica, el
compuesto se puede administrar a un paciente con riesgo de
desarrollar una de las enfermedades descritas previamente. Por
ejemplo, si se desconoce si un paciente es alérgico a un fármaco
particular, el compuesto se puede administrar antes de la
administración del fármaco, para evitar o mejorar una respuesta
alérgica al fármaco. Como alternativa, se puede aplicar la
administración profiláctica, para evitar el comienzo de síntomas en
un paciente diagnosticado con el trastorno subyacente. Por ejemplo,
un compuesto se puede administrar a un sujeto que padece alergia
antes de la exposición esperada al alérgeno. Los compuestos también
se pueden administrar profilácticamente a individuos sanos que están
expuestos de forma repetida a agentes conocidos de una de las
enfermedades descritas anteriormente, para prevenir el comienzo del
trastorno. Por ejemplo, se puede administrar un compuesto a un
individuo sano que está expuesto repetidamente a un alérgeno que se
sabe que induce alergias, tal como látex, en un esfuerzo para
prevenir que el individuo desarrolle una alergia. Como alternativa,
se puede administrar un compuesto a un paciente que sufre asma antes
de llevar a cabo actividades que provocan ataques de asma, para
reducir la gravedad de, o evitar del todo, un episodio
asmático.
La cantidad de compuesto administrado dependerá
de una variedad de factores, incluyendo, por ejemplo, la indicación
particular tratada, el modo de administración, si el beneficio
deseado es profiláctico o terapéutico, la gravedad de la indicación
tratada, y la edad y peso del paciente, la biodisponibilidad del
compuesto activo particular, etc. La determinación de una dosis
eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la
técnica.
Las dosis eficaces se pueden estimar
inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, se
podría formular una dosis inicial para uso en animales para lograr
una concentración circulante en sangre o en suero del compuesto
activo que sea o que esté por encima de una IC_{50} del compuesto
particular según se mide en un ensayo in vitro, tal como los
ensayos de CHMC o BMMC in vitro y otros ensayos in
vitro descritos en la sección de Ejemplos. El cálculo de las
dosis para lograr tales concentraciones sanguíneas o séricas
circulantes, teniendo en cuenta la biodisponibilidad del compuesto
particular, está dentro de las capacidades del experto. Para una
guía, refiérase el lector a Fingl y Woodbury, "Principios
Generales" en: Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of
Therapeutics, Capítulo 1, p. 1-46, última edición,
Pergamon Press, y las referencias citadas allí.
Las dosis iniciales también se pueden estimar a
partir de datos in vivo, tales como modelos animales. Los
modelos animales útiles para ensayar la eficacia de los compuestos
para tratar o prevenir las diversas enfermedades descritas
anteriormente son bien conocidos en la técnica. Los modelos animales
adecuados de reacciones de hipersensibilidad o alérgicas se
describen en Foster, 1995, Allergy 50(21
Supl):6-9, discusión 34-38 y Tumas
et al., 2001, J. Allergy Clin. Immunol.
107(6):1025-1033. Los modelos animales
adecuados de rinitis alérgica se describen en Szelenyi et
al., 2000, Arzneimittelforschung 50(11):
1037-42; Kawaguchi et al., 1994, Clin. Exp.
Allergy 24(3):238-244 y Sugimoto et
al., 2000, Immunopharmacology 48(1):1-7.
Los modelos animales adecuados de conjuntivitis alérgica se
describen en Carreras et al., 1993, Br. J. Ophthalmol.
77(8):509-514; Saiga et al, 1992,
Ophthalmic Res. 24(1):45-50; y Kunert et
al., 2001, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.
42(11):2483-2489. Los modelos animales
adecuados de mastocitosis sistémica se describen en O'Keefe et
al., 1987, J. Vest. Intern. Med.
1(2):75-80 y Bean Knudsen et al.,
1989, Vet. Pathol. 26(1):90-92. Los modelos
animales adecuados de síndrome hiper-IgE se
describen en Claman et al., 1990, Clin. Immunol.
Immunopathol. 56(1):46-53. Los modelos
animales adecuados de linfoma de células B se describen en Hough
et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95:13853-13858 y Hakim et al., 1996, J.
Immunol. 157(12):5503-5511. Los modelos
animales adecuados de trastornos atópicos tales como dermatitis
atópica, eccema atópico y asma atópica se describen en Chan et
al., 2001, J. Invest. Dermatol.
117(4):977-983 y Suto et al.,1999, Int
Arch. Allergy Immunol. 120(Supl:1): 70-75.
Los expertos normales pueden adaptar de forma habitual tal
información para determinar las dosis adecuadas para la
administración a seres humanos. En la Sección de Ejemplos se
describen modelos animales adecuados adicionales.
Las cantidades de las dosis estarán típicamente
en el intervalo de alrededor de 0,0001 ó 0,001 ó 0,01 mg/kg/día a
alrededor de 100 mg/kg/día, pero pueden ser mayores o menores,
dependiendo, entre otros factores, de la actividad del compuesto,
de su biodisponibilidad, del modo de administración y otros diversos
factores explicados anteriormente. La cantidad e intervalo de la
dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar
niveles plasmáticos del (o de los) compuesto(s) que sean
suficientes para mantener el efecto terapéutico o profiláctico. Por
ejemplo, los compuestos se pueden administrar una vez por semana,
varias veces por semana (por ejemplo, en días alternos), una vez
por día o múltiples veces por día, dependiendo, entre otros, del
modo de administración, de la indicación específica tratada y de la
valoración del médico. En casos de administración local o absorción
selectiva, tal como administración tópica local, la concentración
local eficaz de (de los) compuesto(s) activo(s) puede
no estar relacionada con la concentración plasmática. Los expertos
serán capaces de optimizar las dosis locales eficaces sin
experimentación excesiva.
Preferiblemente, el (los) compuesto(s)
proporcionará(n) beneficio terapéutico o profiláctico son provocar
toxicidad sustancial. La toxicidad del (de los) compuesto(s)
se puede determinar usando procedimientos farmacéuticos estándar.
La relación de la dosis entre el efecto tóxico y el terapéutico (o
profiláctico) es el índice terapéutico. Se prefiere(n)
compuesto(s) que muestre(n) índices terapéuticos
elevados.
Habiéndose descrito la invención, se ofrecen los
siguientes ejemplos a título ilustrativo y no limitativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó como se describe a continuación una
variedad de materiales de partida y
N4-monosustituida-2-pirimidinaminas
y
N2-monosustituida-4-pirimidindiaminas
[productos de reacción de mono-sustitución
nucléofila aromática (SNAR)] útiles para sintetizar los compuestos
de 2,4-pirimidindiamina de la invención según los
Esquemas (I)-(V). Las condiciones adecuadas para sintetizar los
productos mono-SNAR se ejemplifican con la
2-cloro-N4-(3,4-etilendioxifenil)-5-fluoro-4-pirimidinamina
(R926087).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La capacidad de los compuestos de
2,4-pirimidindiamina de la invención para inhibir la
desgranulación inducida por IgE se demostró en una variedad de
ensayos celulares con mastocitos humanos cultivados (CHMC) y/o
células derivadas de médula ósea (BMMC) de ratón. La inhibición de
la desgranulación se midió a una densidad celular tanto baja como
alta, cuantificando la liberación de los factores triptasa,
histamina y hexosaminidasa específicos de gránulos. La inhibición
de la liberación y/o síntesis de mediadores lipídicos se evaluó
midiendo la liberación de leucotrieno LTC4, y la inhibición de la
liberación y/o síntesis de citocinas se monitorizó cuantificando
TNF-\alpha, IL-6 e
IL-13. La triptasa y hexasaminidasa se cuantificaron
usando sustratos fluorógenos como se describe en sus ejemplos
respectivos. La histamina, TNF\alpha, IL-6,
IL-13 y LTC4 se cuantificaron usando los siguientes
kits de ELISA comerciales: histamina (Immunotech #2015, Beckman
Coulter), TNF\alpha (Biosource #KHC3011), IL-6
(Biosource #KMC0061), IL-13 (Biosource #KHC0132) y
LTC4 (Cayman Chemical #520211). Más abajo se proporcionan los
protocolos de los diversos ensayos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los mastocitos y basófilos humanos se cultivaron
a partir de células progenitoras negativas para CD34 como se
describe más abajo (véanse también los métodos descritos en la
Solicitud U.S. Serie nº 10/053.355, presentada el 8 de noviembre de
2001, en trámite junto con la presente, cuya descripción se
incorpora aquí como referencia).
\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar medio completo ("CM")
STEMPRO-34, se añadieron a un matraz de filtro 250
ml de medio libre de suero STEMPRO-34^{TM}
("SFM"; GibcoBRL, número de catálogo 10640). A esto se
añadieron 13 ml de suplemento nutriente STEMPRO-34
("NS"; GibcoBRL, número de catálogo 10641) (preparado como se
describe con más detalle, más abajo). El recipiente del NS se
enjuagó con aproximadamente 10 ml de SFM, y el enjuague se añadió al
matraz de filtro. Tras la adición de 5 ml de
L-glutamina (200 mM; Mediatech, número de catálogo
MT 25-005-CI) y 5 ml de 100X
penicilina/estreptomicina ("pen-estrep";
HyClone, número de catálogo: SV30010), el volumen se llevó hasta
500 ml con SFM, y la disolución se filtró.
El aspecto más variable de la preparación del CM
es el método mediante el cual el NS se descongela y se mezcla antes
de la adición al SFM. El NS se debería de descongelar en un baño de
agua a 37ºC y hacerlo girar en remolinos, sin generar vórtices ni
agitarlo, hasta que esté completamente en disolución. Mientras se le
hace girar, obsérvese si hay lípidos que no están todavía en
disolución. Si hay lípidos y el NS no tiene un aspecto uniforme,
devuélvase al baño de agua y repítase el proceso de giro en
remolino hasta que tenga un aspecto uniforme. Algunas veces este
componente pasa a la disolución inmediatamente, algunas veces
después de un par de ciclos de giro en remolino, y algunas veces no
lo hace en absoluto. Si, después de un par de horas, el NS todavía
no está en disolución, deséchese y descongélese una unidad
reciente. No se debería de usar un NS que no parece uniforme
después de la desconge-
lación.
lación.
\vskip1.000000\baselineskip
Una población de partida de células positivas
para CD34 (CD34+) de número relativamente pequeño
(1-5 x 10^{6} células) se expandió hasta un
número relativamente grande de células progenitoras negativas a CD34
(alrededor de 2-4 x 10^{9} células) usando los
medios de cultivo y métodos descritos más abajo. Las células CD34+
(procedentes de un único donante) se obtuvieron de Allcells
(Berkeley, CA). Debido a que hay un grado de variación en la
calidad y número de células CD34+ que típicamente proporciona
Allcells, las células recientemente suministradas se transfirieron
a un tubo cónico de 15 ml y se llevaron hasta 10 ml en CM antes del
uso.
En el día 0, se llevó a cabo un recuento celular
sobre las células viables (fase brillante), y las células se
hicieron girar a 1200 rpm hasta un pelete. Las células se
resuspendieron hasta una densidad de 275.000 células/ml con CM, que
contiene 200 ng/ml de Factor de Célula Madre humano recombinante
("SCF"; Peprotech, número de catálogo 300-07)
y 20 ng/ml de ligando flt-3 humano (Peprotech,
número de catálogo 300-19) ("medio
CM/SCF/flt-3"). En aproximadamente el día 4 ó 5,
la densidad del cultivo se comprobó llevando a cabo un recuento
celular, y el cultivo se diluyó hasta una densidad de 275.000
células/ml con medio CM/SCF/flt-3 reciente. En
aproximadamente el día 7, el cultivo se transfirió a un tubo
estéril, y se llevó a cabo un recuento celular. Las células se
hicieron girar a 1200 rpm y se resuspendieron hasta una densidad de
275.000 células/ml con medio CM/SCF/flt-3
reciente.
reciente.
Este ciclo se repitió, comenzando a partir del
día 0, un total de 3-5 veces a lo largo del período
de expansión.
Cuando el cultivo es grande y se mantiene en
múltiples matraces y se va a resuspender, los contenidos de todos
los cultivos se combinan en un único recipiente antes de llevar a
cabo un recuento celular. Esto asegura que se logre un recuento
celular exacto, y proporciona un grado de uniformidad de tratamiento
para toda la población. Cada matraz se comprueba separadamente en
busca de contaminación bajo el microscopio antes de la combinación,
para evitar la contaminación de toda la población.
Entre los días 17-24, el cultivo
puede comenzar a decaer (es decir, aproximadamente
5-10% del número total de células muere) y no se
expande tan rápidamente como antes. Las células se monitorizan
entonces diariamente durante este tiempo, puesto que el fallo
completo del cultivo puede tener lugar en un tiempo tan corto como
24 horas. Una vez ha comenzado el decaimiento, las células se
recuentan, se hacen girar a 850 rpm durante 15 minutos, y se
resuspenden a una densidad de 350.000 células/ml en medio
CM/SCF/flt-3, para inducir una o más divisiones de
la célula. Las células se monitorizan diariamente para evitar el
fallo del cultivo.
Cuando en el cultivo de células progenitoras es
evidente una muerte celular mayor de 15% y hay algo de desecho en
el cultivo, las células progenitoras negativas para CD34 están
listas para ser diferenciadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se lleva a cabo una segunda fase para convertir
las células progenitoras expandidas, negativas para CD34, en
mastocitos de la mucosa diferenciados. Estos mastocitos humanos
cultivados ("CHMC") de la mucosa derivan de células CD34+,
aisladas de sangre del cordón umbilical y tratadas para formar una
población proliferada de células progenitoras negativas para CD34,
como se describe anteriormente. Para producir las células
progenitoras negativas para CD43, el ciclo de resuspensión para el
cultivo fue el mismo que el descrito anteriormente, excepto que el
cultivo se sembró a una densidad de 425.000 células/ml y se añadió
15% de medio adicional en aproximadamente el cuarto o quinto día
sin llevar a cabo un recuento celular. También, la composición de
citocinas del medio se modificó de forma que contuviese SCF (200
ng/ml) e IL-6 humana recombinante (200 ng/ml;
Peprotech, número de catálogo 200-06, reconstituida
hasta 100 ug/ml en ácido acético 10 mM estéril) ("medio
CM/SCF/IL-6").
Las Fases I y II juntas duran aproximadamente 5
semanas. Durante las semanas 1-3 es evidente que hay
algo de muerte y desechos en el cultivo, y hay un período durante
las semanas 2-5 durante el cual un pequeño
porcentaje del cultivo ya no está en suspensión, sino que en su
lugar está adherido a la superficie de la vasija de cultivo.
Al igual que durante la Fase I, cuando el
cultivo se va a resuspender en el séptimo día de cada ciclo, los
contenidos de todos los matraces se combinan en un único recipiente
antes de llevar a cabo un recuento celular, para asegurar la
uniformidad de toda la población. Cada matraz se comprueba
separadamente en busca de contaminación bajo el microscopio antes
de la combinación, para evitar la contaminación de toda la
población.
Cuando los matraces se combinan, aproximadamente
el 75% del volumen se transfiere al recipiente común, dejando atrás
alrededor de 10 ml, más o menos, en el matraz. El matraz que
contiene el volumen que queda se golpeó brusca y lateralmente para
descargar las células adheridas. El golpeteo se repitió en un ángulo
perpendicular al primer golpeteo, para descargar completamente las
células.
El matraz se recostó formando un ángulo de 45
grados durante un par de minutos antes de que el volumen que queda
se transfiriese a la vasija de recuento. Las células se hicieron
girar a 950 rpm durante 15 minutos antes de sembrar a
35-50 ml por matraz (a una densidad de 425.000
células/ml).
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó como antes una población proliferada
de células progenitoras negativas para CD34, y se trató para formar
un fenotipo positivo para triptasa/quimasa (tejido conjuntivo). Los
métodos se llevan a cabo como se describe anteriormente para
mastocitos de la mucosa, pero con la sustitución de
IL-6 por IL-4 en el medio de
cultivo. Las células obtenidas son típicas de mastocitos de tejido
conjuntivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó como se describe en la Sección
7.5.1.3, anterior, una población proliferada de células progenitoras
negativas para CD34, y se usó para formar una población proliferada
de basófilos. Las células negativas para CD34 se tratan como se
describe para mastocitos de la mucosa, pero con la sustitución de
IL-6 por IL-3 (a
20-50 ng/ml) en el medio de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
A placas con fondo en U de 96 pocillos
duplicadas (Costar 3799) añádanse 65 ul de diluciones de compuesto
o muestras de control que se han preparado en MT [137 mM de NaCl,
2,7 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl_{2}, 1,0 mM de MgCl_{2}, 5,6 mM
de glucosa, 20 mM de Hepes (pH 7,4), 0,1% de seroalbúmina bovina
(Sigma A4503)] que contiene 2% de MeOH y 1% de DMSO. Peletícense
las células CHMC (980 rpm, 10 min.) y resuspéndanse en MT
precalentado. Añádanse 65 ul de células a cada placa de 96
pocillos. Dependiendo de la actividad de la desgranulación para
cada donante de CHMC particular, cárguense 1000-1500
células/pocillo. Mézclense cuatro veces, seguido de una incubación
durante 1 h a 37ºC. Durante la incubación de 1 h, prepárese una
disolución anti-IgE 6X [anticuerpo
anti-IgE humana de conejo (1 mg/ml, Bethyl
Laboratories A80-109A) diluido 1:167 en tampón MT].
Estimúlense las células añadiendo 25 ul de disolución
anti-IgE 6X a las placas apropiadas. Añádanse 25 ul
de MT a pocillos de control no estimulados. Mézclese dos veces tras
la adición del anti-IgE. Incúbese a 37ºC durante 30
minutos. Durante la incubación de 30 minutos, dilúyase la
disolución madre de sustrato de triptasa 20 mM
[(Z-Ala-Lys-Arg-AMC2TFA;
Enzyme Systems Products, #AMC-246)] 1:2000 en
tampón de ensayo de triptasa [0,1 M de Hepes (pH 7,5), 10% p/v de
glicerol, 10 uM de heparina (Sigma H-4898), 0,01% de
NaN_{3}]. Háganse girar las placas a 1000 rpm durante 10 min.
para peletizar las células. Transfiéranse 25 ul del sobrenadante a
una placa de fondo negro de 96 pocillos, y añádanse a cada pocillo
100 ul de disolución de sustrato de triptasa recientemente diluida.
Incúbense las placas a temperatura ambiente durante 30 min. Léase
la densidad óptica de las placas a 355 nm/460 nm en un lector de
placas espectrofotométrico.
El leucotrieno C4 (LTC4) también se cuantifica
usando un kit de ELISA sobre muestras de sobrenadante apropiadamente
diluidas (determinadas empíricamente para cada población celular de
donantes de forma que la medición de las muestras cae dentro de la
curva patrón) siguiendo las instrucciones del proveedor.
\vskip1.000000\baselineskip
Mastocitos humanos cultivados (CHMC) se
sensibilizaron durante 5 días con IL-4 (20 ng/ml),
SCF (200 ng/ml), IL-6 (200 ng/ml), e IgE humana (CP
1035K de Cortx Biochem, 100-500 ng/ml, dependiendo
de la generación) en medio CM. Después de sensibilizarlas, las
células se contaron, se peletizaron (1000 rpm, 5-10
minutos), y se resuspendieron a 1-2 x 10^{6}
células/ml en tampón MT. Añádanse 100 ul de suspensión celular a
cada pocillo, y 100 ul de diluciones de compuesto. La concentración
final de vehículo es 0,5% de DMSO. Incúbese a 37ºC (5% de CO_{2})
durante 1 hora. Después de 1 hora de tratamiento con compuesto,
estimúlense las células con 6X anti-IgE. Mézclense
los pocillos con las células, y déjense incubar las placas a 37ºC
(5% de CO_{2}) durante una hora. Después de la incubación durante
1 hora, peletícense las células (10 minutos, 1000 rpm) y recójanse
200 ul por pocillo del sobrenadante, teniendo cuidado de no
perturbar el pelete. Colóquese la placa del sobrenadante sobre
hielo. Durante la etapa de 7 horas (véase a continuación), realícese
el ensayo de triptasa sobre el nadante que se ha diluido 1:500.
Resuspéndase el pelete celular en 240 ul de medio CM que contiene
0,5% de DMSO y una concentración correspondiente de compuesto.
Incúbense las células CHMC durante 7 horas a 37ºC (5% de CO_{2}).
Tras la incubación, peletícense las células (1000 rpm, 10 minutos) y
recójanse 225 ul por pocillo y colóquense en -80ºC hasta
que se esté listo para llevar a cabo los ensayos de ELISA. Los
ensayos de ELISA se realizan sobre muestras apropiadamente diluidas
(determinadas empíricamente para cada población celular de
donantes, de forma que la medición de la muestra cae dentro de la
curva patrón) según las instrucciones del proveedor.
\vskip1.000000\baselineskip
El medio acondicionado con WEHI se obtuvo
haciendo crecer células mielomonocíticas murinas
WEHI-3B (American Type Culture Collection,
Rockville, MD) en medio Eagle modificado de Iscove (Mediatech,
Hernandon, VA) suplementado con 10% de suero fetal bovino
inactivado por calor (FBS; JRH Biosciences, Kansas City, MO), 50
\muM de 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO) y
100 UI/ml de penicilina-estreptomicina (Mediatech)
en un incubador con 5% de CO_{2}/95% de aire, humidificado a
37ºC. Se sembró una suspensión celular inicial a 200.000 células/ml,
y después se dividió 1:4 cada 3-4 días durante un
período de dos semanas. Los sobrenadantes libres de células se
cosecharon, se repartieron en alícuotas y se almacenaron a
-80ºC hasta que se necesitaron.
\vskip1.000000\baselineskip
El medio de BMMC consiste en 20% de medio
acondicionado con WEHI, 10% de FBS inactivado por calor (JHR
Biosciences), 25 mM de HEPES, pH 7,4 (Sigma), 2 mM de
L-glutamina (Mediatech), 0,1 mM de aminoácidos no
esenciales (Mediatech), 1 mM de piruvato sódico (Mediatech), 50
\muM de 2-mercaptoetanol (Sigma) y 100 UI/ml de
penicilina-estreptomicina (Mediatech) en medio RPMI
1640 (Mediatech). Para preparar el medio de BMMC, todos los
componentes se añaden a una unidad filtrante de 1 l estéril, y se
filtran a través de un filtro de 0,2 \mum antes del
uso.
uso.
\vskip1.000000\baselineskip
Mastocitos derivados de médula ósea (BMMC) se
sensibilizaron toda la noche con SCF murino (20 ng/ml) y anticuerpo
monoclonal anti-DNP (10 ng/ml, Clone
SPE-7, Sigma # D-8406) en medio de
BMMC a una densidad celular de 666 x 10^{3} células/ml. Después
de la sensibilización, las células se contaron, se peletizaron (1000
rpm, 5-10 minutos), y se resuspendieron a
1-3 x 10^{6} células/ml en tampón MT. Añádanse 100
ul de suspensión celular a cada pocillo, y 100 ul de diluciones de
compuesto. La concentración final de vehículo es 0,5% de DMSO.
Incúbese a 37ºC (5% de CO_{2}) durante 1 hora. Después de 1 hora
de tratamiento con compuesto, estimúlense las células con 6X
estímulo (60 ng/ml de DNP-BSA). Mézclense los
pocillos con las células y déjense incubar las placas a 37ºC (5% de
CO_{2}) durante una hora. Después de una incubación de 1 hora,
peletícense las células (10 minutos, 1000 rpm) y recójanse 200 ul
por pocillo del sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el
pelete, y transfiéranse a un tubo limpio o a una placa de 96
pocillos. Colóquese la placa con el sobrenadante sobre hielo.
Durante la etapa de 4-5 horas (véase a
continuación), llévese a cabo el ensayo de hexosaminidasa.
Resuspéndase el pelete celular en 240 ul de medio acondicionado con
WEHI que contiene 0,5% de DMSO y la concentración correspondiente
de compuesto. Incúbense las células BMMC durante 4-5
horas a 37ºC (5% de CO_{2}). Tras la incubación, peletícense las
células (1000 rpm, 10 minutos) y recójanse 225 ul por pocillo y
colóquense en -80ºC hasta que se esté listo para llevar
a cabo los ensayos de ELISA. Los ensayos de ELISA se realizan sobre
muestras apropiadamente diluidas (determinadas empíricamente para
cada población celular de donantes, de forma que la medición de la
muestra cae dentro de la curva patrón) siguiendo las instrucciones
del proveedor.
Ensayo de hexosaminidasa: en una placa de ensayo
de 96 pocillos negra sólida, añádanse 50 ul de sustrato de
hexosaminidasa
(4-metilumbeliferil-N-acetil-\beta-D-glucosaminida;
2 mM) a cada pocillo. Añádanse 50 ul de sobrenadante celular de
BMMC (véase anteriormente) a los sustratos de hexosaminidasa,
colóquense a 37ºC durante 30 minutos y léase la placa a 5, 10, 15 y
30 minutos en un espectrofotómetro.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de activación de basófilos se llevó a
cabo usando sangre periférica humana completa procedente de
donantes alérgicos a ácaros del polvo, eliminándose la mayoría de
los glóbulos rojos mediante sedimentación con dextrano. La sangre
periférica humana se mezcló 1:1 con dextrano T500 al 3%, y los
glóbulos rojos (RBC) se dejaron sedimentar durante
20-25 min. La fracción superior se diluyó con 3
volúmenes de D-PBS, y las células se centrifugaron
durante 10 min. a 1500 rpm, a temperatura ambiente (RT). El
sobrenadante se aspiró, y las células se lavaron en un volumen
igual de tampón MT. Finalmente, las células se resuspendieron en
tampón MT que contiene 0,5% de DMSO en el volumen de sangre
original. Se mezclaron 80 ul de células con 20 ul de compuesto en
presencia de 0,5% de DMSO, por triplicado, en una placa de cultivo
de tejidos de 96 pocillos con fondo en V. Se ensayó un intervalo de
dosis de 8 concentraciones de compuesto, dando como resultado una
curva de respuesta a la dosis de 10 puntos, incluyendo una
respuesta máxima (estimulada) y mínima (no estimulada). Las células
se incubaron con compuesto durante 1 hora a 37ºC, 5% de CO_{2},
después de lo cual se añadieron 20 ul de 6X estímulo [1 ug/ml de
anticuerpo anti-IgE (Bethyl Laboratories) o 667
au/ml de ácaro del polvo (Antigen Laboratories)]. Las células se
estimularon durante 30 minutos a 37ºC, 5% de CO_{2}. La placa se
hizo girar durante 10 min. a 1500 rpm a temperatura ambiente, y se
cosecharon 80 ul del sobrenadante para el análisis del contenido de
histamina usando el kit de ELISA para histamina suministrado por
Immunotech. El ELISA se llevó a cabo según las instrucciones
del
proveedor.
proveedor.
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 1 se proporcionan los resultados de
los ensayos de CHMC de baja densidad (Sección 7.5.2), de los
ensayos de BMMC de alta densidad (Sección 7.5.4) y de los ensayos
con basófilos (Sección 7.5.5). En la Tabla 2 se proporcionan los
resultados de los ensayos de CHMC de alta densidad (Sección 7.5.3).
En las Tablas 1 y 2, todos los valores dados son las IC_{50} (en
\muM). Un valor de "9999" indica una IC_{50} > 10
\muM, sin ninguna actividad medible a una concentración de 10
\muM. La mayoría de los compuestos ensayados tuvieron unas
IC_{50} de menos de 10 \muM, exhibiendo muchos de ellos unas
IC_{50} en el intervalo submicromolar.
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de los compuestos de
2,4-pirimidindiamina de la invención para inhibir la
desgranulación mediada por Fc\gammaRI se demostró con los
compuestos R921218, R921302, R921303, R940347, R920410, R927050,
R940350, R935372, R920323, R926971 y R940352 en ensayos similares a
los descritos en la Sección 7.5, con la excepción de que las
células no se cebaron con IgE, y se activaron con fragmento Fab de
anti-IgG humana de conejo (Bethyl Laboratories,
número de catálogo A80-105).
Todos los compuestos ensayados mostraron unas
IC_{50} en el intervalo submicromolar.
Para confirmar que muchos de los compuestos de
2,4-pirimidindiamina de la invención ejercen su
actividad inhibidora bloqueando o inhibiendo la cascada de
transducción de señales del receptor de IgE temprana, se ensayaron
varios de los compuestos en ensayos celulares para determinar la
desgranulación inducida por ionomicina, como se describe más
abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensayos para la desgranulación de mastocitos
inducida por ionomicina se llevaron a cabo como se describe para
los ensayos de activación de baja densidad de CHMC con IgE (Sección
7.5.2, más arriba), con la excepción de que, durante la
incubación de 1 hora, se preparó una disolución 6X de ionomicina [5
mM de ionomicina (Sigma I-0634) en MeOH (madre)
diluida 1:416,7 en tampón MT (2 \muM final)] y las células se
estimularon añadiendo 25 \mul de la disolución 6X de ionomicina a
las placas apropiadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensayos para la desgranulación de basófilos
inducida por ionomicina se llevaron a cabo como se describe para el
ensayo de activación de basófilos con IgE o con ácaro del polvo
(Sección 7.5.5, más arriba), con la excepción de que, tras
la incubación con compuesto, las células se estimularon con 20
\mul de ionomicina 2 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de los ensayos de desgranulación
inducida por ionomicina, dados como valores de IC_{50} (en
\muM), se proporcionan en la Tabla 1, más arriba. De los
compuestos activos ensayados (es decir, aquellos que inhiben
la desgranulación inducida por IgE), la inmensa mayoría no inhibe la
desgranulación inducida por ionomicina, confirmando que estos
compuestos activos inhiben selectivamente la cascada de transducción
de señales del receptor de IgE temprana (o aguas arriba).
Estos resultados se confirmaron para ciertos
compuestos midiendo el flujo de ion calcio inducido por anticuerpos
anti-IgE o inducido por ionomicina en células CHMC.
En estos ensayos del flujo de Ca^{2+}, 10 \muM de R921218 y 10
\muM de R902420 inhibieron el flujo de Ca^{2+} inducido por
anticuerpos anti-IgE, pero no tuvieron efecto sobre
el flujo de Ca^{2+} inducido por ionomicina (véase la Fig. 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Para ensayar la inmediatez de su efecto
inhibidor, se añadieron simultáneamente ciertas
2,4-pirimidindiaminas de la invención con un
activador de anticuerpo anti-IgE en los ensayos
celulares descritos anteriormente. Todos los compuestos ensayados
bloquearon la desgranulación inducida por IgE de células CHMC en el
mismo grado que el observado cuando los compuestos se preincubaron
con células CHMC durante 10 ó 30 min. antes de la reticulación del
receptor.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos R921218, R921302, R921219,
R926240, R940277, R926742, R926495, R909243 y R926782 se ensayaron
en experimentos de lavado. En los experimentos, células CHMC se
activaron inmediatamente con anticuerpo anti-IgE en
presencia de 1,25 \muM de compuesto (tiempo cero), o el compuesto
se lavó tras la activación con anticuerpo anti-IgE
a 30, 60 ó 120 min. La actividad inhibidora de estos compuestos
disminuyó enormemente 30 min. después de la eliminación del
compuesto, indicando que se requiere una exposición constante de los
mastocitos a estos compuestos para una inhibición máxima de la
desgranulación. Los otros compuestos ensayados produjeron resultados
similares.
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de los compuestos de la invención
para ejercer su actividad inhibidora sin ser tóxicos para las
células del sistema inmunitario se demostró en ensayos celulares con
células B y T. A continuación se proporcionan los protocolos para
los ensayos.
\vskip1.000000\baselineskip
Dilúyanse células Jurkat hasta 2 x 10^{5}
células/ml en medio RPMI completo (10% de suero fetal bovino
inactivado por calor), e incúbense a 37ºC, 5% de CO_{2} durante
18 horas. Añádanse 65 ul de células a 7,7 x 10^{5} células/ml a
una placa de 96 pocillos con fondo en V (tratada con TC, Costar) que
contiene 65 ul de 2X compuesto (la concentración final del vehículo
es 0,5% de DMSO, 1,5% de MeOH). Mézclese, e incúbense las placas
durante 18-24 h a 37ºC, 5% de CO_{2}. La
toxicidad se evaluó mediante análisis citométrico de flujo de la
dispersión de la luz
celular.
celular.
\vskip1.000000\baselineskip
La estirpe de células B BJAB se cultivó en fase
logarítmica en RPMI 1640 + 10% de suero fetal bovino inactivado por
calor, 1x L-glutamina, 1x penicilina, 1x
estreptavidina y 1x betamercaptoetanol a 37ºC, 5% de CO_{2}. En
primer lugar, las BJAB se cosecharon, se hicieron girar y se
resuspendieron en medio de cultivo hasta una concentración de 7,7 x
10^{5} células/ml. Se mezclaron 65 ul de células con 65 ul de
compuesto, por duplicado y en presencia de 0,1% de DMSO, en una
placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos con fondo en V. Las
células se incubaron con compuesto a diversas diluciones a 37ºC, 5%
de CO_{2}. La toxicidad se evaluó mediante análisis citométrico
de flujo de la dispersión de la luz celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Siémbrense 50 \mul de células (1 x
10^{6}/ml) en cada pocillo que contiene 50 \mul de compuesto. La
concentración final del vehículo es 0,5% de DMSO, 1,5% de MeOH.
Agítense las placas durante 1 minuto para mezclar las células y el
compuesto. Incúbense las placas a 37ºC (5% de CO_{2}) durante 18
horas. Al siguiente día, coséchense 50 \mul de células de cada
pocillo, y añádanse a 50 \mul de reactivo Cell Titer Glo
(Invitrogen). Agítense las placas durante 1 minuto. Léanse en un
luminómetro.
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla 2, más arriba, se presentan
los resultados de los ensayos de toxicidad de las células T y B,
dados como valores de IC_{50} (en \muM). Con unas pocas
excepciones (véase la Tabla 1), todos los compuestos ensayados no
fueron tóxicos ni para las células B ni para las células T a las
concentraciones inhibidoras efectivas. Los ensayos realizados con
células B primarias produjeron resultados similares.
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de los compuestos de la invención
para ejercer su actividad inhibidora a dosis por debajo de aquellas
que muestran toxicidad en animales se demostró con los compuestos
R921218, R921219 y R921302.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudió R921218 en un amplio programa de
estudios de seguridad no clínica que concluyeron que este agente
era bien tolerado tanto en roedores como en no roedores. Para
resumir el resultado del ensayo de toxicología/seguridad no clínica
con R921218, este agente no produjo toxicidad limitante de la dosis
por la vía de administración intranasal en no roedores (conejos y
primates) o por la vía de administración oral en roedores (ratones y
ratas) durante estudios de toxicidad de dosis repetidas de 14 días
a dosis muchas veces por encima de la dosis anticipada que se
espera que produzca eficacia en el hombre. No hubo hallazgos
adversos en un conjunto de pruebas básicas de seguridad
farmacológica de la función cardiovascular, respiratoria y/o del
sistema nervioso central. No hubo signos de potencial mutagénico o
clastogénico en el ensayo de toxicología genética, ni tampoco hubo
efectos adversos tras la exposición a la piel y los ojos. Se
proporciona una breve discusión de los estudios claves de
toxicología.
toxicología.
Se llevó a cabo un estudio de toxicidad
intranasal de dosis repetidas de 14 días en macacos, a dosis de 2,1,
4,5 o 6,3 mg/kg/día. Los parámetros en vivo incluyeron:
observaciones clínicas, pesos corporales, consumo alimentario,
oftalmología, tensión arterial, electrocardiografía, hematología,
bioquímica analítica, análisis de orina, evaluación
inmunotoxicológica, necropsia macroscópica, pesos de los órganos,
evaluaciones toxicocinéticas, e histopatología (incluyendo la
cavidad nasal). No hubo hallazgos adversos atribuidos a R921218 en
ningún parámetro del estudio, y el NOAEL (nivel de efecto adverso
no observado) se consideró como 6,3 mg/kg/día.
Se llevó a cabo un estudio de toxicidad
intranasal de dosis repetidas de 14 días en conejos blancos de Nueva
Zelanda, a dosis de 1,7, 3,4 o 5,0 mg/kg/día. Los parámetros in
vivo incluyeron: observaciones clínicas, pesos corporales,
consumo alimentario, oftalmología, hematología, bioquímica
analítica, necropsia macroscópica, pesos de órganos, evaluaciones
toxicocinéticas, e histopatología (incluyendo la cavidad nasal). No
hubo hallazgos adversos atribuidos a R921218 en ningún parámetro
del estudio, y el NOAEL (nivel de efecto adverso no observado) se
consideró como 5,0 mg/kg/día.
\vskip1.000000\baselineskip
En estudios piloto de hallazgo de dosis, una
dosis oral de dosis única de 600 mg/kg se consideró un NOEL (nivel
de efecto no observado), mientras que no se toleraron múltiples
dosis (7 días) de 200 mg/kg/día y superiores.
En el ensayo in vitro de mutación inversa
con Salmonella-Escherichia
coli/microsomas de mamíferos (ensayo de Ames), se encontró que
R921219 es positivo al ensayo en la cepa probadora TA1537, con y sin
activación metabólica, confirmando los resultados de un estudio
anterior. Se encontró que R921219 no afecta adversamente a ninguna
de las otras 4 cepas probadoras. Se encontró que R921219 no posee
potencial clastogénico cuando se estudia en un ensayo de aberración
cromosómica in vitro.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo en roedores varios estudios
piloto no GLP de toxicidad. En el ratón, una dosis oral de 1000
mg/kg se toleró hasta 7 días. se llevó a cabo en el ratón un estudio
de toxicidad oral de 14 días, con dosis de 100, 300 y 1000 mg/kg.
No se toleró una dosis de 1000 mg/kg, mientras que una dosis de 300
mg/kg dio muestras de cambios histopatológicos en la vulva. Una
dosis de 100 mg/kg se consideró el NOAEL (nivel de efecto adverso
no observado) en el estudio. Se llevó a cabo un estudio de toxicidad
oral de 28 días en el ratón, a dosis de 100 mg/kg q.d., 100 mg/kg
b.i.d., 300 mg/kg q.d. y 300 mg/kg b.i.d. R921302 no se toleró a
300 mg/kg q.d. o b.i.d. La dosis más bajas (100 mg/kg q.d. o b.i.d.)
parecen bien toleradas (todavía no se conocen los resultados
clínicos ni histopatológicos). Parece que, en las ratas, las dosis
orales de 50, 150 y 300 mg/kg, dadas durante 32 días, son bien
toleradas (todavía no se conocen los resultados clínicos ni
histopatológicos).
En el ensayo in vitro de mutación inversa
con Salmonella-Escherichia coli/microsoma
mamífero (ensayo de Ames), se encontró que R921302 es positivo en
el ensayo en la cepa probadora TA98 con S9 y TA1537, con y sin
activación metabólica. Se encontró que R921302 no afecta
adversamente a ninguna de las otras 3 cepas probadoras. R921302 no
fue clastogénico cuando se evaluó en un ensayo de aberración
cromosómica in vitro.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayaron alrededor de 50 compuestos de
2,4-pirimidindiamina de la invención para determinar
la biodisponibilidad oral. Para el estudio, los compuestos se
disolvieron en diversos vehículos (por ejemplo, disolución de PEG
400, y suspensión de CMC) para la dosificación intravenosa y oral en
las ratas. Tras la administración del fármaco, se obtuvieron y se
extrajeron muestras de plasma. Las concentraciones en plasma de los
compuestos se determinaron mediante métodos de cromatografía de
líquidos de altas prestaciones/espectrometría de masas en tándem
(LC/MS/MS). Se llevaron a cabo análisis farmacocinéticos basándose
en los datos de concentración en plasma. Los parámetros
farmacocinéticos de interés incluyeron el aclaramiento (CL), volumen
de distribución en el estado estacionario (Vss), semivida terminal
(t_{^{1}/_{2}}), y biodisponibilidad oral (%F).
Estos estudios farmacocinéticos indican que
muchos de los compuestos de 2,4-pirimidindiamina
están oralmente disponibles, con %F de hasta aproximadamente 50%
(en el intervalo de 0-50%). Las semividas oscilaron
desde 0,5 hasta 3 h. En particular, los compuestos R940350,
R935372, R935193, R927050 y R935391 mostraron buenas
biodisponibilidades orales y semividas en ratas. De este modo, estos
estudios confirman que estos compuestos de
2,4-pirimidindiamina son adecuados para la
administración oral.
\vskip1.000000\baselineskip
La eficacia in vivo de los compuestos
R926109, R921218, R921219, R921302, R926495, R926508, R926742,
R926745 y R945150 frente a alergias se evaluó en el modelo de ratón
de anafilaxis cutánea pasiva (PCA). Este modelo proporciona una
medida directa de la desgranulación, inducida por IgE, de mastocitos
tisulares. En este modelo, los animales sensibilizados a IgE se
sometieron a una exposición alergénica, y el cambio en la
permeabilidad de la vasculatura dérmica que resulta de la
liberación de histamina desde mastocitos se mide mediante el cambio
en la cantidad de fuga del colorante al tejido circundante. La
inhibición de la liberación del mediador por los compuestos que
modulan la desgranulación de mastocitos se mide fácilmente
extrayendo el colorante del
tejido.
tejido.
\vskip1.000000\baselineskip
En el ensayo de PCA, los ratones se
sensibilizaron de forma pasiva mediante inyección intradérmica con
anticuerpos IgE anti-dinitrofenol (DNP) (Día
-1). A tiempos predeterminados, los animales se tratan
con el agente de ensayo (Día 0). El efecto modulador del agente
sobre la desgranulación de mastocitos cutáneos se mide tras la
inyección intravenosa de DNP conjugado con seroalbúmina humana
(HSA-DNP), junto con el colorante azul de Evans. La
reticulación resultante del receptor de IgE y el incremento
subsiguiente, inducido por la desgranulación de mastocitos, en la
permeabilidad vascular se determina midiendo la cantidad de
extravasación de colorante al tejido. El colorante se extrae del
tejido mediante formamida, y la absorbancia de este extracto se lee
a 620 nm. El efecto inhibidor del tratamiento farmacéutico se da
como el porcentaje de inhibición comparado con el tratamiento con
vehículo, esto es, el porcentaje de reducción en A_{620}.
Se han ensayado dos compuestos como controles
positivos: el antagonista de la histamina difenhidramina, y el
antagonista de la serotonina ciproheptadina. Ambos mediadores
(histamina y serotonina) son liberados con la desgranulación
mediada por IgE a partir del mastocito de ratón. Ambos compuestos de
referencia inhiben la respuesta de PCA; la ciproheptadina se usó de
forma normal en experimentos subsiguientes. La ciproheptadina
inhibió de forma reproducible la respuesta de la PCA en 61%
+/- 4% (8 mg/kg, i.p., tiempo de pretratamiento de 30
minutos, n=23 experimentos).
\vskip1.000000\baselineskip
Se observó una inhibición, dependiente de la
dosis, de la pérdida vascular mediada por Fc\varepsilonR con
dosis crecientes de R921218, R926109, R921219 y RR921302. Estos
compuestos se administraron en una formulación en disolución (67%
de PEG/33% de tampón de citrato) o una suspensión acuosa (1,5% de
Avicel). Estos resultados demuestran la fuerte correlación entre
los niveles plasmáticos del compuesto, la eficacia in vivo y
la potencia in vitro. El compuesto más potente, R921219, fue
activo con niveles de exposición circulantes de aproximadamente 10
\mug/ml (68% de inhibición a una dosis de 100 mg/kg) en
comparación con R921302, una molécula relativamente menos potente,
que redujo la extravasación plasmática en 42% a una dosis de 100
mg/kg. Además, la duración de la exposición al compuesto circulante
se reflejó en la duración de la actividad inhibidora. R921302, que
se determina que es el compuesto metabólicamente más estable en
estudios farmacocinéticos, inhibió la permeabilidad vascular
durante 1-2 horas antes de la señalización del
receptor inducida por antígenos, después de lo cual la eficacia
comenzó a disminuir. En la Tabla 3 y en la Tabla 4 se resumen estos
datos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se observó actividad in vivo similar con
los compuestos R926495, R926508, R926742, R926745 y R926150, que
fueron capaces de inhibir la respuesta de PCA tras la administración
por vía oral en una formulación a base de PEG (datos no
mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
La eficacia de los compuestos R921218, R921302,
R926495, R926508, R926742 y R921219 en el tratamiento de asma se
demostró en el modelo de oveja de asma alérgica. Las ovejas
desarrollan broncoconstricción en minutos de exposición a antígeno
inhalado (Ascaris suum), con una obstrucción máxima del
caudal de aire durante la respuesta alérgica temprana (EAR). La
liberación de mediadores mastocíticos preformados es probablemente
responsable de esta fase temprana de la obstrucción del caudal de
aire. Además de la EAR, el modelo de oveja nos permite evaluar el
efecto de los compuestos en la reacción asmática tardía (LAR) y en
la hipersensibilidad no específica de las vías respiratorias (AHR),
que se produce como resultado de la administración tópica o local de
alérgeno a la vía respiratoria. En las ovejas, la AHR se desarrolla
unas pocas horas después de la exposición al antígeno, y puede
durar hasta 2 semanas. Los resultados descritos más abajo demuestran
el potencial de los compuestos ensayados para inhibir una cascada
de sucesos que puede ser el resultado de la liberación de citocinas
desde el
mastocito.
mastocito.
\vskip1.000000\baselineskip
En el modelo de oveja de asma alérgica, a las
ovejas se les administran aerosoles del artículo de ensayo vía un
tubo endotraqueal, seguido de una exposición aerosólica con antígeno
extraído del áscari Ascaris suum, al que las ovejas son
alérgicas de forma natural. La exposición alergénica conduce a
bronconstricción directa (tanto EAR como LAR) y a una AHR no
específica persistente. Estas tres características son similares a
las observadas en asmáticos alérgicos humanos. La actividad del
agente de ensayo se determina mediante cambios en la resistencia
pulmonar (R_{L}), que se calcula a partir de medidas de presión
transpulmonar, caudal, y volumen respiratorio. Los datos de control
histórico obtenidos de las mismas ovejas tras el tratamiento salino
en comparación con una exposición alergénica, muestran que se
produce un incremento pronunciado de R_{L} durante la EAR, y
persiste durante aproximadamente 2-3 horas tras la
exposición alergénica. La LAR es un incremento menos pronunciado en
R_{L}, que comienza aproximadamente 5-6 tras la
exposición alergénica, y se resuelve en 8 horas tras la exposición.
Veinticuatro horas después de la exposición, se midió una respuesta
a la dosis frente a carbacol, para determinar la AHR, que se expresa
como la dosis de carbacol requerida para incrementar R_{L} en
400% con respecto al valor inicial. (Esta medida se denomina como la
concentración provocativa de carbacol que provoca un incremento de
400% en R_{L} con respecto al valor inicial (PC_{400}). Los
datos se comparan frente a los datos del control histórico para el
mismo individuo cuando se administra un aerosol de control de
disolución salina y se expone frente a Ascaris
suum.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los compuestos ensayados mostraron efectos
inhibidores en la LAR y la AHR, y asimismo varios de estos agentes
inhibieron la EAR. En la Tabla 5 se muestra la respuesta óptima para
cada compuesto en una serie de estudios para evaluar la actividad a
varios tiempos de pretratamiento y usando varias formulaciones
diferentes en disolución y suspensión. La eficacia de R921218 sobre
la EAR parece que depende de la formulación, observándose el mayor
efecto a 30 mg/oveja, administrados como un aerosol en disolución en
10% de etanol. R926495, R926742, R926508 y R921219, administrados
en cuatro ovejas diferentes a 45 mg/oveja en una suspensión acuosa
60 minutos antes de la exposición al alérgeno, demuestran que la
LAR y AHR están bloqueadas. Además de estos parámetros tardíos, la
EAR se redujo enormemente mediante tratamiento con R921219, R926508
o R926495. Se investigó la eficacia de RR921302 usando un vehículo
de 45% de PEG400/55% de tampón de citrato. En estas condiciones,
R921302, administrado a 30 mg/oveja 60 minutos antes de la
exposición, bloqueó la LAR y AHR, y la EAR no se vio
afectada.
afectada.
Estos datos demuestran claramente que estos
compuestos son capaces de bloquear las respuestas asmáticas en
ovejas alérgicas. Todos los compuestos inhibieron la AHR y LAR
significativamente cuando se comparan con el control histórico. La
EAR fue inhibida significativamente por R921219, R926508 y R926495
(54%, 21% y 33%, respectivamente). Por el contrario, R921218,
R921302 y R926742 no inhibieron la EAR cuando se administraron en
una suspensión acuosa.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
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La eficacia de los compuestos R921304 y R921219
en el tratamiento de asma también se demostró en un modelo de ratón
de asma alérgica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sensibilizaron ratones frente a ovoalbúmina
(proteína de pollo) en presencia de un adyuvante (Alum) por vía
intraperitoneal en el día 0 y en el día 7. Una semana más tarde, los
ratones se sometieron a una exposición intranasalmente con
ovoalbúmina en los Días 14, 15 y 16 (modelo más restrictivo) o en el
Día 14 (modelo menos restrictivo). Este régimen de sensibilización
y exposición conduce a hipersensibilidad de las vías respiratorias
e inflamación en los pulmones, que son dos características
dominantes del asma alérgico humano. En el modelo de ratón, las
respuestas in vivo de las vías respiratorias se miden usando
un pletismógrafo de cuerpo completo que determina la PENH (pausa
aumentada, Buxco Electronics). La PENH es un valor adimensional que
comprende el caudal inspiratorio pico (PIF), el caudal espiratorio
pico (PEF), el tiempo de inspiración, el tiempo de expiración y el
tiempo de relajación, y se considera un parámetro validado de la
sensibilidad de las vías respiratorias. Las respuestas frente a la
exposición alergénica (OVA) se comparan con animales expuestos
solamente a disolución salina. Veinticuatro horas después de la
exposición, los ratones se exponen a dosis crecientes de metacolina
(agonista del receptor muscarínico), lo que da como resultado una
contracción del músculo liso. Los ratones expuestos a ovoalbúmina
demuestran una hipersensibilidad significativa de las vías
respiratorias a metacolina, cuando se comparan con los ratones
expuestos a la disolución salina. Además, se observa un infiltrado
celular en las vías respiratorias en animales expuestos a
ovoalbúmina, cuando se comparan con los ratones expuestos a la
disolución salina. Este infiltrado celular se caracteriza
principalmente por eosinófilos, pero también está presente un
influjo más pequeño de neutrófilos y células
mononucleares.
mononucleares.
El uso de este modelo para la evaluación de
inhibidores de pequeñas moléculas de la desgranulación de mastocitos
se ha validado de varias formas. En primer lugar, usando ratones
con deficiencia de mastocitos (W/W^{v}), se ha demostrado que las
respuestas inducidas por ovoalbúmina dependen de la presencia de
mastocitos. En los ratones con deficiencia de mastocitos, la
sensibilización y exposición a ovoalbúmina no da como resultado una
hipersensibilidad de las vías respiratorias ni influjo de
eosinófilos. En segundo lugar, el estabilizador de mastocitos,
cromolina, fue capaz de bloquear la hipersensibilidad e inflamación
de las vías respiratorias inducida por ovoalbúmina (datos no
mostrados). El uso de este modelo para evaluar compuestos para el
tratamiento de respuestas asmáticas que pueden estar mediadas por
mecanismos distintos de la estabilización de mastocitos está
apoyado además por el efecto inhibidor de los esteroides
dexametasona y budesonida sobre la broncoconstricción inducida
por
metacolina.
metacolina.
La eficacia de R921304 se evaluó mediante
administración intranasal en 10 días consecutivos, desde el Día 7
hasta el Día 16, a una dosis de 20 mg/kg, con las últimas 3 dosis
administradas 30 minutos antes de la exposición a disolución salina
o a ovoalbúmina. R921304 fue capaz de inhibir la hipersensibilidad
de las vías respiratorias inducida por ovoalbúmina frente a
metacolina, cuando se compara con los ratones tratados con el
vehículo.
En un protocolo menos restrictivo, en el que los
ratones se expusieron a ovoalbúmina sólo una vez en el Día 14,
R921219, administrado subcutáneamente a 70 mg/kg en 67% de
PEG400/33% de tampón de citrato, 30 minutos antes de la exposición
a disolución salina o a ovoalbúmina, demuestra que R921219 bloquea
completamente la hipersensibilidad de las vías respiratorias
inducida por ovoalbúmina y el influjo celular.
Estos resultados demuestran claramente que
R921219 y R921304 son eficaces inhibiendo las respuestas de las
vías respiratorias en un modelo de ratón de asma alérgica.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto inhibidor de los compuestos de
2,4-pirimidindiamina sobre la fosforilación de
proteínas aguas abajo de Syk cinasa se ensayó con los compuestos
R921218, R218219 y R921304 en células BMMC activadas por el receptor
de IgE.
Para el ensayo, se incubaron células BMMC en
presencia de concentraciones variables de compuesto de ensayo (0,08
\muM, 0,4 \muM, 2 \muM y 10 \muM) durante 1 h a 37ºC. Las
células se estimularon entonces con anticuerpo
anti-IgE como se describe previamente. Después de 10
min., las células se lisaron, y las proteínas celulares se
separaron mediante electroforesis (SDS PAGE).
Tras la electroforesis, la fosforilación de las
proteínas indicadas en Figs. 7, 10 y 11A-D se evaluó
mediante inmunotransferencia. Los anticuerpos se adquirieron de
Cell Signaling Technology, Beverley, MA.
Haciendo referencia a las Figs. 7, 10 y
11A-D, los compuestos indicados ensayados inhibieron
la fosforilación de proteínas aguas abajo de Syk, pero no aguas
arriba de Syk, en la cascada de señalización del receptor de IgE,
confirmando que los compuestos inhiben aguas arriba la
desgranulación inducida por IgE, y que los compuestos ejercen su
actividad inhibidora inhibiendo Syk cinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayaron varios compuestos de
2,4-pirimidindiamina para determinar la capacidad
para inhibir la fosforilación, catalizada por Syk cinasa, de un
sustrato peptídico en un ensayo bioquímico de polarización
fluorescente con Syk cinasa aislada. En este experimento, los
Compuestos se diluyeron hasta 1% de DMSO en tampón de cinasa (20 mM
de HEPES, pH 7,4, 5 mM de MgCl_{2}, 2 mM de MnCl_{2}, 1 mM de
DTT, 0,1 mg/ml de gammaglobulina bovina acetilada). El compuesto en
1% de DMSO (0,2% de DMSO final) se mezcló con disolución de
ATP/sustrato a temperatura ambiente. Se añadió Syk cinasa (Upstate,
Lake Placid NY) hasta un volumen final de reacción de 20 ul, y la
reacción se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las
condiciones finales de la reacción enzimática fueron 20 mM de
HEPES, pH 7,4, 5 mM de MgCl_{2}, 2 mM de MnCl_{2}, 1 mM de DTT,
0,1 mg/ml de gammaglobulina bovina acetilada, 0,125 ng de Syk, 4 uM
de ATP, 2,5 uM de sustrato peptídico
(biotina-EQEDEPEGDYEEVLE-CONH2,
SynPep Corporation). Se añadió EDTA (10 mM final)/anticuerpo
anti-fosfotirosina (1X final)/trazador
fosfopeptídico fluorescente (0,5X final) en tampón de dilución FP
para detener la reacción para un volumen total de 40 ul según las
instrucciones del fabricante (PanVera Corporation). La placa se
incubó durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
Las placas se leyeron en un lector de placas de polarización de la
fluorescencia Polarion (Tecan). Los datos se convirtieron en
cantidad de fosfopéptido presente usando una curva de calibración
generada mediante competición con el competidor fosfopeptídico
proporcionado en el Kit de Ensayo de Tirosina Cinasa, Green
(PanVera Corporation).
\newpage
En la Tabla 6, a continuación, se muestran los
resultados del ensayo:
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\vskip1.000000\baselineskip
Estos datos demuestran que todos los compuestos
ensayados, excepto R945142 y R909236, inhiben la fosforilación por
Syk cinasa, con IC_{50} en el intervalo submicromolar. Todos los
compuestos ensayados inhiben la fosforilación por Syk cinasa con
IC_{50} en el intervalo micromolar.
La eficacia in vivo de ciertos compuestos
de 2,4-pirimidindiamina con respecto a enfermedades
autoinmunitarias se evaluó en la reacción de Arthus pasiva inversa,
un modelo agudo de lesión tisular mediada por
antígenos-anticuerpos, y en varios modelos de
enfermedades de autoinmunidad e inflamación. Estos modelos son
similares por cuanto un anticuerpo contra un antígeno específico
media la enfermedad inflamatoria provocada por el complejo
inmunitario (provocada por IC), y la destrucción subsiguiente de
tejido. La deposición de IC en sitios anatómicos específicos
(sistema nervioso central (SNC) para encefalomielitis
autoinmunitaria experimental (EAE), y sinovio para artritis
inducida por colágeno (CIA)) conduce a la activación de células que
expresan Fc\gammaR y Fc\varepsilonR de superficie,
principalmente mastocitos, macrófagos, y neutrófilos, lo que da como
resultado la liberación de citocinas, y la quimiotaxia de
neutrófilos. La activación de la respuesta inflamatoria es
responsable de las respuestas efectoras aguas abajo, incluyendo
edema, hemorragia, infiltración de neutrófilos, y liberación de
mediadores proinflamatorios. Las consecuencias de estos sucesos
provocados por IC son difíciles de identificar en trastornos
autoinmunitarios; no obstante, muchos investigadores han demostrado
que la inhibición de la ruta de señalización de Fc\gammaR en
estos modelos de animales ha dado como resultado una reducción
significativa del comienzo y gravedad de la enfermedad.
La eficacia in vivo de los compuestos
R921302, R926891, R940323, R940347, y R921303 para inhibir la
cascada inflamatoria provocada por IC se demostró en un modelo de
ratón de la Reacción de Arthus Pasiva Inversa (reacción de
RPA).
La lesión tisular inflamatoria aguda mediada por
el complejo inmunitario (IC) está implicada en una variedad de
enfermedades autoinmunitarias humanas, incluyendo síndrome de
vasculitis, síndrome de suero enfermo, lupus eritematoso sistémico
(SLE), artritis reumatoide, síndrome de Goodpasture, y
glomerulonefritis. El modelo experimental clásico para la lesión
tisular mediada por IC es la reacción de Arthus pasiva inversa. El
modelo de reacción de RPA es un método in vivo conveniente
para estudiar inflamación localizada, inducida por los IC, sin
efectos sistémicos. La inyección intradérmica de anticuerpos (Ab)
específicos frente a albúmina de huevo de pollo
(anti-IgG de OVA de conejo), seguido de la inyección
intravenosa (IV) de antígenos (Ag), específicamente albúmina de
huevo de pollo (ovoalbúmina, OVA), provoca deposición perivascular
de los IC y una respuesta inflamatoria rápida caracterizada por
edema, infiltración de neutrófilos y hemorragia en los sitios de
inyección. Los aspectos del modelo de ratón de reacción de RPA se
parecen a la respuesta inflamatoria de pacientes con artritis
reumatoide, SLE y glomerulone-
fritis.
fritis.
En este sistema modelo, los compuestos de ensayo
se administran en varios momentos de tiempo antes de la
administración de los Ab y los Ag. Se inyecta intradérmicamente una
disolución de anti-IgG de OVA de conejo (50 \mug
en 25 \mul/ratón), e inmediatamente le sigue una inyección
intravenosa de albúmina de huevo de pollo (20 mg/kg de peso
corporal) en una disolución que contiene 1% de colorante de azul de
Evans. El grado de edema y hemorragia se mide en la piel dorsal de
ratones C57BL/6, usando el colorante de azul de Evans como un
indicador del daño tisular local. Como control se usa IgG de conejo
policlonal purificado.
El tiempo de pretratamiento, en el que los
compuestos de ensayo se administran antes de la exposición a Ab/Ag,
depende de las propiedades farmacocinéticas (PK) de cada compuesto
individual. Cuatro horas después de la inducción de la reacción de
Arthus, los ratones se eutanasiaron, y los tejidos se recogieron
para evaluación del edema. Este sistema modelo nos permite
identificar rápidamente la actividad in vivo de muchos
inhibidores.
Todos los compuestos ensayados se administraron
mediante la vía oral.
R921302, cuando se administra en ratones C57B16
a una dosis de 50 mg/kg, 100 mg/kg, y 200 mg/kg 60 minutos antes de
la exposición a Ab/Ag, mostró inhibición de la formación de edema
dependiente de la dosis (49,9%, 93,2%, y 99,1%, respectivamente).
Además, R921302 mostró no sólo una inhibición profiláctica del
edema, sino también eficacia terapéutica, en la que el edema se
inhibió un 77,5% cuando el compuesto se administró 30 minutos
después de la exposición a una dosis de 100 mg/kg.
R940323 y R926891 mostraron la eficacia de
inhibición del edema en 32,4% y 54,9%, respectivamente, cuando se
administraron a 200 mg/kg, 60 minutos antes de la exposición. Estos
compuestos están mucho menos biodisponibles cuando se administran
oralmente, y los niveles de exposición sistémica fueron
aproximadamente 50 veces menores que el observado con R921302
(datos no mostrados). R940347 inhibió el edema en un 89% cuando se
administró a una dosis de 100 mg/kg, 2 horas antes de la
exposición.
El compuesto R921303 mostró una inhibición de
100%, 100% y 93,6%, de la formación del edema cuando se administra
a una dosis de 200 mg/kg y un tiempo de pretratamiento de 30, 60, y
120 minutos, respectivamente. El compuesto también demostró una
inhibición, dependiente de la dosis, de 65,4%, 81,2% y 100%, a dosis
de 50 mg/kg, 100 mg/kg y 200 mg/kg, respectivamente. En la Tabla 7
se resumen los resultados para los compuestos ensayados.
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\vskip1.000000\baselineskip
La eficacia in vivo del compuesto R921302
frente a enfermedades autoinmunitarias se demostró en un modelo de
ratón de artritis inducida por anticuerpos contra colágeno
(CAIA).
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La artritis inducida por colágeno (CIA) en
roedores se usa frecuentemente como uno de los modelos
experimentales para la lesión tisular mediada por IC. La
administración de colágeno tipo II en ratones o ratas da como
resultado una reacción inmunitaria que implica de forma
característica destrucción inflamatoria de cartílago y hueso de las
articulaciones distales, con hinchamiento concomitante de los
tejidos circundantes. CIA se usa habitualmente para evaluar
compuestos que pueden ser de uso potencial como fármacos para el
tratamiento de artritis reumatoide y otras afecciones inflamatorias
crónicas.
\newpage
En años recientes, ha surgido una nueva técnica
en el modelo de CIA, en la que se aplican anticuerpos
anti-colágeno tipo II para inducir una CIA mediada
por anticuerpos. Las ventajas del método son: tiempo corto para la
inducción de la enfermedad (que se desarrolla en
24-48 h después de una inyección intravenosa (IV) de
anticuerpos); la artritis es inducible tanto en razas de ratón
susceptibles a CIA como resistentes a CIA; y el procedimiento es
ideal para identificar rápidamente agentes terapéuticos
antiinflamatorios.
Se administró intravenosamente cóctel de
anticuerpos monoclonales inductor de artritis
Arthrogen-CIA® (Chemicon International Inc.) a
ratones Balb/c (2 mg/ratón) en el Día 0. Cuarenta y ocho horas
después, se inyectaron intraperitonealmente 100 \mul de LPS (25
\mug). En el Día 4, los dedos pueden parecer hinchados. En el Día
5, una o las dos patas (particularmente las patas traseras) empiezan
a estar rojas e hinchadas. En el Día 6, y después, las patas rojas
e hinchadas seguirán así durante al menos 1-2
semanas. Durante el estudio, los signos clínicos de la inflamación
se puntúan para evaluar la intensidad del edema en las patas. La
gravedad de la artritis se registra como la puntuación suma de
ambas patas traseras para cada animal (puntuación máxima posible de
8). El grado de inflamación con las patas implicadas se evalúa
midiendo el diámetro de las patas. Se monitorizan los cambios del
peso corporal.
Los animales se tratan en el momento de la
inducción de la artritis, comenzando en el Día 0. Los compuestos de
ensayo y los compuestos de control se administran una vez al día
(q.d.) o dos veces al día (b.i.d.), por vía oral (PO), dependiendo
de los protocolos farmacocinéticas PK previamente establecidos.
Al final del estudio (1-2
semanas tras la inducción de la artritis), los ratones se
eutanasiaron, y las patas se seccionaron transversalmente en la
tibia distal usando una guillotina, y se pesaron. La media \pm
error estándar de la media (SEM) para cada grupo se determina cada
día a partir de las puntuaciones clínicas de los animales
individuales, y los pesos de las patas traseras para cada grupo
experimental se calculan y se registran a la terminación del
estudio. Se obtiene una evaluación histopatológica de las patas.
\vskip1.000000\baselineskip
La administración de R921302 suprime
significativamente el desarrollo de artritis y la gravedad de la
enfermedad (p<0,005), como se muestra por los cambios en las
puntuaciones clínicas diarias medias de la artritis (Fig. 12). Las
puntuaciones artríticas diarias medias, desde el día 4 hasta el 14,
en el grupo de tratamiento, se redujeron entre 71 y 92%, en
comparación con las de grupo de control con vehículo. El grado de
inflamación de la pata, por medida del peso de la pata, se redujo
en animales tratados con R921302, en comparación con el grupo de
control con vehículo (Fig. 13). Al final del estudio, se evaluó el
grado de hinchamiento midiendo el peso de las patas, lo que se
indica mediante una reducción de 99,9% en el grupo tratado con
R921302, en comparación con el peso medio de las patas del grupo de
control con vehículo (p<0,002).
La evaluación histopatológica de las patas
cortadas reveló una destacada sinovitis, consistente con CIA. Se
observaron lesiones importantes en animales tratados con disolución
salina o vehículo, mientras que se encontraron lesiones de menor
gravedad en el grupo de tratamiento con R921302. Las articulaciones
se hicieron más gruesas, con proliferación notable del sinovio. Hay
un incremento de fibroblastos con una densa infiltración de
neutrófilos, linfocitos, monocitos, macrófagos y células
plasmáticas. Hay una proliferación vascular con congestión,
hemorragia y edema. La formación de paño estaba presente en el
espacio articular, y hubo destrucción de cartílago. En el grupo
tratado con el fármaco, las articulaciones eran casi normales, o
mostraron una inflamación limitada pero sin implicación de
cartílago.
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Las puntuaciones clínicas artríticas y el edema
de la pata se redujeron una media de 20% en animales tratados con
R050 dos veces al día a una dosis de 100 mg/kg, en comparación con
el control sin tratar (vehículo, p = 0,1). El edema de la pata se
inhibió en aproximadamente 26% en comparación con el control sin
tratar (vehículo), por medición del grosor de la pata trasera (p =
0,1). R050 no muestra artritis a una dosis de 30 mg/kg.
R070, una forma salina de R050, administrado a
dosis de 50 ó 100 mg/kg dos veces al día inhibió la enfermedad
clínica una media de 39,75% (p < 0,0002) o 35,28% (p < 0,0004)
de inhibición, respectivamente, en comparación con el control sin
tratar (vehículo). El grosor de la pata se redujo aproximadamente
50%.
R429, sal de R363, administrado dos veces al día
a 50 ó 100 mg/kg mostró una media de 23,81% (p < 0,05) o 20,82%
(p = 0,05) de inhibición de las puntuaciones clínicas artríticas,
respectivamente, en comparación con el control no tratado
(vehículo). De igual manera, el grosor de la pata se redujo.
R347 no afectó a las puntuaciones artríticas a
las dosis ensayadas (30 y 100 mg/kg dos veces al día).
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La eficacia in vivo del compuesto R921302
frente a enfermedades autoinmunitarias se demostró en un modelo de
rata de artritis inducida por colágeno (CIA).
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La artritis reumatoide (RA) se caracteriza por
inflamación crónica de la articulación, conduciendo eventualmente a
la destrucción irreversible de cartílago. Los IC que contienen IgG
son abundantes en el tejido sinovial de pacientes con RA. Aunque
todavía se debate qué papel desempeñan estos complejos en la
etiología y patología de la enfermedad, IC se comunica con las
células hematopoyéticas vía el Fc\gammaR.
CIA es un modelo animal ampliamente aceptado de
RA que da como resultado sinovitis inflamatoria crónica
caracterizada por formación de paño y degradación de la
articulación. En este modelo, la inmunización intradérmica con
colágeno tipo II natural, emulsionado con adyuvante incompleto de
Freund, da como resultado una poliartritis inflamatoria en 10 u 11
días y la destrucción subsiguiente de la articulación en 3 a 4
semanas.
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Se inmunizaron ratas LOU singénicas con colágeno
tipo II natural en el Día 0, y se evaluó la eficacia de R921302 en
un régimen de prevención y en un régimen de tratamiento. En el
protocolo de prevención, se administraron vehículo o diversas dosis
de R921302 vía sonda nasogástrica comenzando en el día de
inmunización (Día 0). En el protocolo de tratamiento, después de
que los signos clínicos de la artritis se desarrollaron en el Día
10, se inició el tratamiento con R921302 (300 mg/kg mediante sonda
nasogástrica, qd) y se continuó hasta el sacrificio en el Día 28.
En ambos protocolos, las puntuaciones clínicas se obtuvieron
diariamente, y los pesos corporales se midieron dos veces a la
semana. En el Día 28, se obtuvieron puntuaciones radiográficas, y
los niveles séricos de anticuerpo anti-colágeno II
se midieron mediante ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Alrededor de 10 días después de la inmunización,
las ratas desarrollaron CIA clínica, como se evidencia por un
incremento en sus puntuaciones artríticas (Fig. 14). La puntuación
artrítica media aumentó gradualmente en las ratas tratadas con
vehículo solo después del Día 10, y, hacia el Día 28, la puntuación
clínica media alcanzó 6,75 \pm 0,57. Las puntuaciones clínicas
medias en animales tratados desde el día de la inmunización (Día 0)
con la dosis elevada de R921302 (300 mg/kg/día) se redujeron
significativamente (p < 0,01) en los Días 10-28
en comparación con los controles con vehículo. En las ratas tratadas
con 300 mg/kg de R921302 al comienzo de la enfermedad, hubo una
puntuación de la artritis significativamente menor, comenzando en el
Día 16, y esta diferencia se observó hasta el final del estudio en
el Día 28. Las puntuaciones radiográficas enmascaradas (escala
0-6) obtenidas en el Día 28 de CIA fueron 4,8 \pm
0,056 en el grupo del vehículo, en comparación con 2,5 \pm
0,0,16, 2,4 \pm 0,006, y 0,13 \pm 0,000001 en animales tratados
una vez al día con 75, 150, y 300 mg/kg/día, respectivamente, en un
régimen de prevención, y 0,45 \pm 0,031 en animales tratados una
vez al día con 300 mg/kg/día al comienzo de la enfermedad. El
tratamiento con R921302 a 300 mg/kg/día, ya sea profilácticamente
(en inmunización) o después del comienzo de la enfermedad, impidió
el desarrollo de erosiones, y redujo el hinchamiento de tejidos
blandos. De forma similar, el tratamiento con R921302 dio como
resultado una reducción importante de anticuerpo
anti-colágeno II en el suero (datos no
mostrados).
mostrados).
\newpage
La eficacia in vivo del compuesto R921302
frente a enfermedades autoinmunitarias se demostró en un modelo de
ratón de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE).
\vskip1.000000\baselineskip
La EAE es un modelo útil para esclerosis
múltiple (MS), una enfermedad autoinmunitaria del SNC que es
provocada por infiltración de inmunocitos de la materia blanca del
SNC. La inflamación y la destrucción subsiguiente de mielina
provocan parálisis progresiva. Al igual que la enfermedad humana, la
EAE está asociada con activación periférica de células T
autorreactivas con proteínas mielínicas, tales como proteína básica
de mielina (MBP), proteína proteolipídica (PLP), o proteína
oligodendrocítica de mielina (MOG). Las células T específicas de
neuroantígenos activadas atraviesan la barrera hematoencefálica,
conduciendo a infiltración focal de células mononucleares y a
desmielinización. La EAE se puede inducir en razas de ratón
susceptibles mediante inmunización con proteínas específicas de
mielina en combinación con adyuvante. En el modelo de ratón SJL
usado en estos estudios, la parálisis de las extremidades
posteriores y de la cola es manifiesta hacia el Día 10 después de
la inmunización, el pico de gravedad de la enfermedad se observa
entre los Días 10 y 14, y se puede observar hacia el Día 35 un
ciclo de remisión espontánea parcial seguido de una recaída. Los
resultados descritos más abajo demuestran el potencial del agente
de ensayo (R921302) para suprimir la gravedad de la enfermedad y
evitar la recaída de los síntomas de la enfermedad que puede ser el
resultado de la liberación de citocinas mediada por Fc\gammaR a
partir de inmunoci-
tos.
tos.
\vskip1.000000\baselineskip
En el modelo murino de SJL de EAE, cada ratón se
sensibilizó con PLP/CFA (para inducir EAE se usaron 150 \mug de
PLP139-151 con 200 \mug de CFA en 0,05 ml de
homogenado en cuatro sitios del flanco posterior para un total de
0,2 ml de emulsión). En un protocolo de supresión, se administró
vehículo o diversas dosis de R921302 vía sonda nasogástrica
comenzando en el día de la inmunización (Día 0). En el protocolo de
tratamiento, al comienzo de la enfermedad, los animales se
separaron para lograr grupos con una puntuación clínica media
similar al comienzo, y se les administró vehículo o diversas
frecuencias de dosis de los artículos de ensayo vía sonda
nasogástrica. En ambos protocolos, las puntuaciones clínicas se
monitorizaron diariamente, y los pesos corporales se midieron dos
veces a la semana.
\vskip1.000000\baselineskip
Alrededor de 10 días después de la inmunización
con PLP, los ratones SJL desarrollaron EAE clínica, como es
evidente por un incremento en sus puntuaciones clínicas medias (Fig.
15). La puntuación paralítica aumentó gradualmente en los animales
tratados solamente con el vehículo desde el día de la inmunización
(Día 0), y hacia el Día 14 la puntuación media alcanzó un pico de
5,1 + 0,3. En el pico de la enfermedad (Día 14), la puntuación
clínica media en animales tratados con 100 mg/kg diarios o 100 mg/kg
dos veces al día se redujo significativamente (p < 0,05, 4,3 +
1,3 y 4,3 + 1,4, respectivamente). Hacia el Día 16, todos los
animales mostraron una remisión parcial de la gravedad clínica
media, lo que es una característica del modelo de SJL. Las
puntuaciones clínicas notablemente inferiores en animales tratados
dos veces al día con 100 mg/kg de R921302 siguieron siendo
significativas (p < 0,05) durante todo el experimento hasta que
los animales se sacrificaron en el Día 30. Estas menores
puntuaciones durante todo el período de tratamiento se reflejan en
el índice de enfermedad acumulativo (CDI) significativamente
inferior y en el incremento del índice de peso acumulativo (CWI),
como se observa en la Tabla 9. En el grupo tratado solamente con el
vehículo, 2/5 de los ratones recayeron. En el grupo de 100
mg/kg/día, 3/8 de los ratones recayeron. Ninguno de los ratones en
el grupo de 100 mg/kg dos veces al día recayó.
Los ratones SJL tratados con R921302 al comienzo
de la enfermedad (Día 11) a una dosis de 200 mg/kg dos veces al día
mostraron una disminución significativa (p = 0,003) del CDI (53,5
\pm 16,9 en animales tratados con R921302, en comparación con
72,9 \pm 8,9 en los animales tratados con el vehículo solo).
Además, hubo una importante disminución en el número de recaídas en
animales tratados con R921302 (2/12), en comparación con el número
de recaídas en animales tratados con vehículo (7/11). Los resultados
se resumen en la Tabla 10 y en la Fig. 16.
La capacidad de los compuestos de
2,4-pirimidindiamina de la invención para inhibir la
activación de células T se demostró usando una variedad de ensayos
que utilizan una estirpe celular de células T Jurkat y cultivos de
células T primarias. La inhibición de la activación de células T
Jurkat, en respuesta a la estimulación del receptor de células T
(TCR), se midió cuantificando el aumento del marcador de la
superficie celular CD69. La inhibición de la activación de células
T primarias se midió cuantificando la liberación de citocinas,
incluyendo factor alfa de necrosis tumoral (TNF), interleucina 2
(IL-2), interleucina 4 (IL-4),
gamma-interferón (IFNg), y factor estimulante de
colonias de granulocitos y macrófagos (GMSCF), en respuesta a la
coestimulación de TCR/CD28.
\vskip1.000000\baselineskip
Células T Jurkat humanas (clon N) se cultivaron
de forma normal en medio RPMI 1640 (Mediatech) suplementado con 10%
de suero fetal de ternera (FBS) (Hyclone), penicilina y
estreptamicina. El proceso de identificación tuvo lugar a lo largo
de tres días.
En el primer día de la identificación, las
células cultivadas se hicieron girar en una centrífuga (1000 rpm, 5
minutos) y se resuspendieron a 3,0 X 10^{5} células/ml en RPMI +
5% de FBS. En el segundo día de la identificación, las células se
hicieron girar a 1000 rpm durante 5 minutos y se resuspendieron en
RPMI + 5% de FBS a 1,3 X 10^{5} células/ml. Se añadieron 85
\mul de esta suspensión celular a los pocillos de placas de 96
pocillos con fondo en U (Corning). Se añadieron a cada pocillo 85
\mul de compuesto o RPMI diluido + 5% de FBS (como control)
solamente, y se incubó a 37ºC durante 1 hora. Las células se
estimularon entonces con anti-TCR (C305) a 500
ng/ml añadiendo una disolución 8X en 25 \mul a las células
colocadas en placas. Las células se incubaron entonces a 37ºC
durante 20 h.
En el tercer día de la identificación, las
placas se hicieron girar a 2500 RPM durante 1 minuto en una
centrífugadora Beckman GS-6R, y entonces se eliminó
el medio. Entonces se añadió a cada pocillo 50 \mul de disolución
de tinción (dilución 1:100 de anticuerpo
anti-CD69-APC (Becton Dickenson) en
PBS + 2% de FBS), seguido de la incubación de las placas 4 grados
durante 20 minutos en la oscuridad. Entonces se añadió a cada
pocillo 150 \mul de tampón de lavado (PBS + 2% de FBS), y las
placas se hicieron girar a 3000 RPM durante 1 minuto. El
sobrenadante se eliminó nuevamente, y el pelete se resuspendió
sometiéndolo suavemente a vórtex. Entonces se añadieron 75 \mul
de PBS + 2% de FBS + Cytofix (dilución 1:4), las placas se
sometieron suavemente a vórtex y se envolvieron con papel de
aluminio. Las células de las placas se leyeron usando un citómetro
de flujo acoplado a un sistema de manipulación de líquidos
automatizado.
Se compararon concentraciones variadas de
compuesto frente al disolvente sólo para determinar la inhibición
de la IC_{50} de la activación de células T de cada compuesto. Las
IC_{50} representativas para compuestos de
2,4-pirimidindiamina de la invención se muestran en
la Tabla 11.
\vskip1.000000\baselineskip
Células PBMC 2E8-4E8 o células T
proliferantes que se hicieron crecer en rIL-2 de
donantes humanos sanos se suspendieron en PBS, se hicieron girar
(1500 rpm, 8-10 minutos) y se resuspendieron en 100
ml de medio completo RPMI (1% de Pen-Estrep, 1% de
L-glutamina, 10 mM de HEPES). Las células se
colocaron en matraces T175 (37ºC, 5% de CO_{2}), y se dejó que
los monocitos se adhiriesen durante 2-3 horas.
Después de la unión monocítica, las células no adherentes se
cosecharon, se contaron mediante un hemocitómetro, se lavaron varias
veces con PBS, y entonces se resuspendieron en medio completo de
Yssel (medio IMDM modificado, con 1% de suero AB humano, 1% de
Pen-Estrep, 1% de L-glutamina, 10 mM
de HEPES) a 1,54E6 células/ml. Entonces se añadieron 90 ul de la
dilución celular a compuestos diluidos hasta 2X en medio de Yssel, y
se incubó durante 30 minutos a 37ºC (5% de CO_{2}). Después de
esta etapa de preincubación, la mezcla de compuesto/células se
transfirió a placas de estimulación, como se describe más
abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon placas de estimulación revistiendo
placas de 96 pocillos con 5 \mug/ml de \alphaCD3 (BD
PharMingen, número de catálogo 555336) + 10 \mug/ml de
\alphaCD28 (Beckman Coulter, número de catálogo IM1376) en PBS
(sin Ca^{2+}/Mg^{2+}) a 37ºC (5% CO_{2}) durante
3-5 horas. Después de la incubación con los
anticuerpos de estimulación, el cóctel se retiró, y las placas se
lavaron 3 veces con PBS antes de la adición de la mezcla de células
T primaras/compuesto.
La mezcla de compuesto/células se transfirió a
las placas de estimulación y se incubó durante 18 h a 37ºC (5% de
CO_{2}). Después de la estimulación celular, se transfirieron
\sim150 \mul de sobrenadante procedente de cada pocillo a
placas de filtro de 96 pocillos (placas de filtro Corning PVDF), se
hicieron girar (2000 rpm, 2-3 minutos) y se usó
inmediatamente para medidas de ELISA o LUMINEX, o se congeló a
-80ºC para un uso futuro.
Se llevaron a cabo ELISA de IL-2
usando el kit de ELISA de IL-2 humana Quantikine
(R&D Systems, número de catálogo D2050) como se describe por el
fabricante, y se midió la absorción en un espectofotómetro a 450 nm
de longitud de onda. Se restaron los valores del blanco, y las
absorbancias se convirtieron en pg/ml basándose en la curva
patrón.
Se llevó a cabo la multiplexación del ensayo de
Luminex para IL-2, GMSCF, IL-4 e
IFNg esencialmente como se describe por el fabricante (Upstate
Biotechnology). Esencialmente, se diluyeron 50 ul de muestra en 50
ul de diluyente de ensayo y 50 ul de tampón de incubación, después
se incubó con 100 ul de anticuerpo de detección diluido, durante 1
h a RT en la oscuridad. La placa de filtro se lavó 2x en tampón de
lavado, después se incubó con 100 ul del reactivo secundario
diluido (SAV-RPE), durante 30 min a RT en la
oscuridad. Finalmente, las placas se lavaron 3 veces y se realizó
la identificación de las perlas y se midió la RPE fluorescente
mediante el instrumento
Luminex.
Luminex.
Se compararon concentraciones variadas de
compuesto con el disolvente sólo para determinar la inhibición de
IC_{50} de la activación de las células T de cada compuesto. Las
IC_{50} representativas para los compuestos de
2,4-pirimidindiamina de la invención se muestran en
la Tabla 11.
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de los compuestos de
2,4-pirimidindiamina de la invención para inhibir la
activación de células B se demostró usando células B primarias en
un ensayo con marcador de superficie celular usando un clasificador
celular activado por fluorescencia (FACS). La inhibición de la
activación de células B primarias en respuesta a la estimulación
del receptor de células B (BCR) se midió cuantificando el aumento
del marcador de la superficie celular
CD69.
CD69.
\vskip1.000000\baselineskip
Células B humanas primarias se aislaron de capa
leucocitaria, la capa de glóbulos blancos que se forma entre los
glóbulos rojos y las plaquetas cuando se centrifuga la sangre
anticoagulada, o de sangre reciente usando perlas
CD19-Dynal® y un FACS. La capa leucocitaria se
obtuvo del Stanford Medical School Blood Centre, preparada en el
mismo día por el banco de sangre, almacenada y transportada en frío
(con hielo). La capa leucocitaria (aprox. 35 ml) se colocó en un
recipiente cónico estéril de 500 ml para centrífugadora y se enfrió
en hielo, y después se diluyó con PBS fría que contiene 0,2% de BSA
(Sigma: A7638) y citrato de sodio (0,1%, Sigma:
S-5570) (P-B-C)
hasta un volumen total de 200 ml, y se mezcló suavemente. Se recogió
sangre reciente de donantes en tubos al vacío de 10 ml que
contienen heparina (1 tubo al vacío recoge aproximadamente 8,5 ml de
sangre). La sangre se enfrió en hielo, se transfirió a tubos falcon
de 50 ml (20 ml/tubo) o un recipiente estéril cónico de 500 ml para
centrífugadora, y se diluyó con un volumen igual de
P-B-C.
Se colocaron en forma de capa 25 ml de sangre
diluida o capa leucocitaria sobre 15 ml de Ficoll frío, y se colocó
nuevamente en hielo. La sangre colocada sobre Ficoll se centrifugó
(Beckman GS-6R) durante 45 minutos a 2000 rpm, 4ºC,
para separar las células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
de los glóbulos rojos (RBC) y granulocitos. La capa acuosa superior
se aspiró entonces hasta 2,54 centímetros por encima de la capa de
PBMC. Las PBMC se transfirieron desde cada 2 tubos ficoll a un tubo
falcon limpio de 50 ml (= aprox. 10 ml/tubo). Las PBMC transferidas
se diluyeron 5x con PBS enfriada con hielo con 0,2% de BSA
(P-B), y se centrifugaron durante 20 min a 1400 rpm
y 4ºC. El sobrenadante (este puede estar turbio) se aspiró entonces,
y las PBMC se resuspendieron en 25 ml de P-B y las
células se contaron (usando una dilución 1:5) y se mantuvieron en
hielo.
Las células se seleccionaron entonces
positivamente usando anticuerpo anti-CD19 acoplado a
perlas magnéticas (Dynal®) según las instrucciones del fabricante.
La cantidad aproximada requerida de perlas
CD19-Dynal® (Dynaperlas revestidas con CD19
M-450 (pabB), Dynal®) se calculó estimando el número
de células B como 5% de las PBMC contadas, y añadiendo
aproximadamente 10 perlas por célula desde el lote madre de perlas
(4x10^{8} perlas/ml). Las perlas CD19-Dynal® se
lavaron 2x en P-B en un tubo de 5 ml usando el imán
Dynal®, y después se añadieron a las PBMC suspendidas. Esta mezcla
se hizo pasar entonces a través del imán Dynal® y se lavó varias
veces para separar las células unidas a las perlas.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la separación, las perlas y el anticuerpo
se eliminaron usando Dynal® CD19-DETACHaBEAD®
durante 45 min a 30ºC. El rendimiento es típicamente 2X10^{7}
células B por capa leucocitaria. Las células B se lavaron y se
resuspendieron como 1E6 células/ml en RPMI1640+10% de FBS+
Penicilina/Estreptavidina + 1 ng/ml de IFN\alpha8. Las células se
dejaron reposar toda la noche 37ºC y 5% de CO_{2}.
\newpage
Al siguiente día, las células se lavaron y se
resuspendieron en RPMI + 2,5% de FBS hasta 1X10^{6} células/ml.
Las células se repartieron entonces en partes alícuotas en una placa
de 96 pocillos con fondo en V (Corning), a 65 ul de células por
pocillo. Mediante robot, se añadieron 65 ul de un compuesto 2x a las
células con concentración final de DMSO a 0,2%, y se incubó durante
1 h a 37ºC. Las células se estimularon entonces con 20 ul de 7,5x
\alpha-IgM de Jackson Laboratories (final 5 ug/ml)
durante 24 h. En el día 3, las células se hicieron girar y se
tiñeron para CD69, y se analizaron mediante FACS en los hepatocitos
(mediante dispersión de luz).
Se compararon concentraciones variadas de
compuesto frente al disolvente sólo para determinar la inhibición
de IC_{50} de la activación de células B de cada compuesto. Las
IC_{50} representativas para los compuestos de
2,4-pirimidindiamina de la invención se muestran en
la Tabla 11.
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de los compuestos de
2,4-pirimidindiamina de la invención para inhibir la
activación de macrófagos diferenciados se demostró midiendo la
liberación de citocinas a partir de macrófagos estimulados. La
liberación de factor alfa de necrosis tumoral (TNF) e interleucina
6 (IL-6) se cuantificó en respuesta a la
estimulación con IgG o LPS.
\vskip1.000000\baselineskip
Se purificaron monocitos CD14+ a partir de PBMC
(Allcells # PB002) usando el kit de aislamiento de monocitos
(Miltenyi biotec #130-045-501) según
las instrucciones del fabricante. La pureza se evaluó midiendo el
porcentaje de células CD14+ mediante citometría de flujo.
Típicamente se logró una pureza > 90%. Las células CD14+
purificadas se colocaron entonces en placas (6x10^{6}
células/cápsula de TC de 150 cm en 15 ml de medio) en
Macrophage-SFM (Gibco #12065-074)
con 100 ng/ml de M-CSF (Pepro Tech
#300-25), y se dejaron diferenciar durante cinco
días. Al final de ese período, la morfología celular y los
marcadores de superficie celular (CD14, HLA-DR,
B7.1, B7.2, CD64, CD32, y CD16) reflejaron la presencia de macrófago
diferenciado
maduro.
maduro.
\vskip1.000000\baselineskip
Placas de 96 pocillos Immulon 4HBX (VWR
#62402-959) se revistieron con IgG humana reunida
(Jackson Immunoresearch
lab#009-000-003) a 10 ug/pocillo
toda la noche a 4ºC, o 1 h a 37ºC. También se revistió un control
negativo, que consiste en el fragmento F(ab')2, para evaluar
la estimulación de fondo. El anticuerpo no unido se eliminó por
lavado 2x con 200 ul de PBS. Se añadieron a cada pocillo 20 ul de
compuesto 5X, seguido de la adición de 15k células de macrófago
diferenciado en 80 ul que se había raspado y liberado de las placas.
Las células se incubaron durante 16 h en un incubador a 37ºC, y los
sobrenadantes se recogieron para el análisis con Luminex para
IL-6 y TNF\alpha, esencialmente como se describe
para las células T primarias, anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la estimulación con LPS, se añadieron 10 ul
de una disolución madre 10X a la mezcla de células
preincubada-compuesto, hasta una concentración
final de 10 ng/ml. Las células se incubaron entonces durante 16 h a
37ºC, y los sobrenadantes se analizaron como se describe
anteriormente.
Se compararon concentraciones variadas de
compuesto frente al disolvente sólo para determinar la IC_{50} de
cada compuesto para cada citocina. Las IC_{50} representativas
para compuestos de 2,4-pirimidindiamina de la
invención se muestran en la Tabla 11.
Aunque la invención anterior se ha descrito con
cierto detalle para facilitar la comprensión, será manifiesto que
se pueden realizar algunos cambios y modificaciones dentro del
alcance de las reivindicaciones anejas. En consecuencia, las
realizaciones descritas se han de considerar como ilustrativas y no
restrictivas, y la invención no se limitará a los detalles dados
aquí, sino que se puede modificar dentro del alcance y equivalentes
de las reivindicaciones anejas.
Todas las referencias bibliográficas y de
patentes citadas en toda esta Solicitud se incorporan como
referencia en la Solicitud para todos los fines.
Claims (45)
1. Un compuesto de
2,4-pirimidindiamina para uso en el tratamiento de
una enfermedad autoinmunitaria distinta de colitis ulcerosa,
enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino, y
enfermedad inflamatoria del intestino idiopática, en el que el
compuesto de 2,4-pirimidindiamina es:
- \quad
- un compuesto de formula estructural (I):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- o una sal, hidrato, solvato y/o un N-óxido del mismo, en la que:
- \quad
- L^{1} y L^{2} son cada uno un enlace directo;
- \quad
- R^{2} se selecciona del grupo que consiste en fenilo monosustituido en la posición 3 ó 5 con un grupo R^{8}, fenilo di- o tri-sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R^{8}, y un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define más abajo;
- \quad
- R^{4} se selecciona del grupo que consiste en fenilo sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R^{8}, y un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define más abajo;
- \quad
- en la que, para R^{2} y R^{4}, cada uno de dicho heteroarilo opcionalmente sustituido, independientemente entre sí, se selecciona del grupo que consiste en:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en las
que:
- \quad
- p es un número entero de uno a tres;
- \quad
- cada - - - representa independientemente un enlace sencillo o un doble enlace;
- \quad
- R^{35} es hidrógeno o R^{8};
- \quad
- X se selecciona del grupo que consiste en CH, N y N-O;
- \quad
- cada Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S y NH;
- \quad
- cada Y^{1} se selecciona independientemente del grupo que consiste en O, S, SO, SO_{2}, SONR^{36}, NH y NR^{37};
- \quad
- cada Y^{2} se selecciona independientemente del grupo que consiste en CH, CH_{2}, O, S, N, NH y NR^{37};
- \quad
- R^{36} es hidrógeno o alquilo;
- \quad
- R^{37} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y un progrupo seleccionado del grupo que consiste en arilo, arilalquilo, heteroarilo, R^{a}, R^{b}, -CR^{a}R^{b}-O-C(O)R^{8}, -CR^{a}R^{b}-O-PO(OR^{8})_{2}, -CH_{2}-O-PO(OR^{8})_{2}, -CH_{2}-PO(OR^{8})_{2}, -C(O)-CR^{a}R^{b}-N(CH_{3})_{2}, -CR^{a}R^{b}-O-C(O)-CR^{a}R^{b}-N(CH_{3})_{2}, -C(O)R^{8}, -C(O)CF_{3} y -C(O)-NR^{8}-C(O)R^{8};
- \quad
- R^{38} se selecciona del grupo que consiste en alquilo y arilo;
- \quad
- A se selecciona del grupo que consiste en O, NH y NR^{38};
- \quad
- R^{9}, R^{10}, R^{11} y R^{12} se selecciona cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en alquilo, alcoxi, halógeno, haloalcoxi, aminoalquilo e hidroxialquilo, o, como alternativa, R^{9} y R^{10} y/o R^{11} y R^{12} se toman juntos para formar un cetal;
- \quad
- cada Z se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxi, ariloxi, éster, y carbamato;
- \quad
- Q se selecciona del grupo que consiste en -OH, -OR^{8}, -NR^{c}R^{c}, -NR^{39}-CHR^{40}-R^{b}, -NR^{39}-(CH_{2})_{m}-R^{b} y -NR^{39}-C(O)-CHR^{40}-NR^{c}R^{c};
- \quad
- R^{39} y R^{40} se seleccionan cada uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo y NHR^{8};
- \quad
- R^{5} se selecciona del grupo que consiste en -CN, -NC, fluoro, haloalquilo (C1-C3), perhaloalquilo (C1-C3), haloalcoxi (C1-C3), perhaloalcoxi (C1-C3), -C(O)R^{a}, -C(O)OR^{a}, -C(O)CF_{3} y -C(O)OCF_{3};
- \quad
- R^{6} es hidrógeno;
- \quad
- R^{8} se selecciona del grupo que consiste en R^{e}, R^{b}, R^{e} sustituido con uno o más del mismo o diferente R^{a} o R^{b}, -OR^{a} sustituido con uno o más del mismo o diferente R^{a} o R^{b}, -B(OR^{a})_{2}, -B(NR^{c}R^{c})_{2}, -(CH_{2})_{m}-R^{b}, -(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -S-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -O-CHR^{a}R^{b}, -O-CR^{a}(R^{b})_{2}, -O-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-CH[(CH_{2})_{m}R^{b}]R^{b}, -S-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -O-(CH_{2})_{m}-C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -S-(CH_{2})_{m}-C(O)NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -O-(CHR^{a})_{m}-C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -S-(CHR^{a})_{m}-C(O)NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -NH-(CHR^{a})_{m}-R^{b}, -N[(CH_{2})_{m}R^{b}]_{2}, -NH-C(O)-NH-(CH_{2})_{m}-R^{b}, -NH-C(O)-(CH_{2})_{m}-CHR^{b}R^{b} y -NH-(CH_{2})_{m}-C(O)-NH-(CH_{2})_{m}-R^{b};
- \quad
- cada R^{a} se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C8), cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros;
- \quad
- cada R^{b} es un grupo adecuado seleccionado independientemente del grupo que consiste en =O, -OR^{d}, haloalquiloxi (C1-C3), =S, -SR^{d}, =NR^{d}, =NOR^{d}, -NR^{c}R^{c}, halógeno, -CF_{3}, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO_{2}, =N_{2}, -N_{3}, -S(O)R^{d}, -S(O)_{2}R^{d}, -S(O)_{2}OR^{d}, -S(O)NR^{c}R^{c}, -S(O)_{2}NR^{c}R^{c}, -OS(O)R^{d}, -OS(O)_{2}R^{d}, -OS(O)_{2}OR^{d}, -OS(O)_{2}NR^{c}R^{c}, -C(O)R^{d}, -C(O)OR^{d}, -C(O)NR^{c}R^{c}, -C(NH)NR^{c}R^{c}, -C(NR^{a})NR^{c}R^{c}, -C(NOH)R^{a}, -C(NOH)NR^{c}R^{c}, -OC(O)R^{d}, -OC(O)OR^{d}, -OC(O)NR^{c}R^{c}, -OC(NH)NR^{c}R^{c}, -OC(NR^{a})NR^{c}R^{c}, -[NHC(O)]_{n}R^{d}, -[NR^{3}C(O)]_{n}R^{d}, -[NHC(O)]_{n}OR^{d}, -[NR^{a}C(O)]_{n}OR^{d}, -[NHC(O)]_{n}NR^{c}R^{c}, -[NR^{a}C(O)]_{n}NR^{c}R^{c}, -[NHC(NH)]_{n}NR^{c}R^{c} y -[NR^{a}C(NR^{a})]_{n} NR^{c}R^{c};
- \quad
- cada R^{c} es independientemente R^{a}, o, como alternativa, dos R^{c} se toman juntos con el átomo de nitrógeno al que están enlazados para formar un cicloheteroalquilo o heteroarilo de 5 a 8 miembros que puede incluir opcionalmente uno o más de los mismos o diferentes heteroátomos adicionales, y que puede estar opcionalmente sustituido con uno o más de los mismos o diferentes R^{a} o grupos R^{b} adecuados;
- \quad
- cada R^{d} es independientemente un R^{a};
- \quad
- cada R^{e} se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C8), cicloalquilalquilo (C4-C11), arilo (C5-C10), arilalquilo (C6-C16), heteroalquilo de 2 a 6 miembros, cicloheteroalquilo de 3 a 8 miembros, cicloheteroalquilalquilo de 4 a 11 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros y heteroarilalquilo de 6 a 16 miembros;
- \quad
- cada m es independientemente un número entero de 1 a 3; y
- \quad
- cada n es independientemente un número entero de 0 a 3; o
- \quad
- el compuesto de 2,4-pirimidindiamina es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 7.4.214 a 7.4.244, 7.4.250 a 7.4.252, 7.4.256 a 7.4.258, 7.4.262 a 7.4.269, 7.4.272 a 7.4.276, 7.4.278 a 7.4.280, 7.4.283 a 7.4.289, 7.4.296, 7.4.298 a 7.4.302, 7.4.304, 7.4.305, 7.4.308 a 7.4.313, 7.4.315, 7.4.317, y 7.4.318;
- \quad
- con las condiciones de que en la fórmula (I):
- (1)
- cuando R^{2} es un fenilo sustituido, entonces R^{5} es diferente de ciano o -C(O)NHR, en el que R es hidrógeno o alquilo (C1-C6);
- (2)
- cuando R^{2} y R^{4} son cada uno independientemente un indol sustituido o no sustituido, entonces R^{2} y R^{4} están unidos al resto de la molécula vía un átomo de carbono anular; y
- (3)
- el compuesto no sea
\vskip1.000000\baselineskip
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el
que R^{2} se selecciona del grupo que consiste en heteroarilo de
5-10 miembros, benzodioxanilo, benzodioxolilo,
benzoxazinilo, benzoxazolilo, benzopiranilo, benzotriazolilo,
1,4-benzoxazinil-2-ona,
2H-1,4-benzoxazinil-3(4H)-ona,
2H-1,3-benzoxazinil-2,4(3H)-diona,
benzoxazolil-2-ona,
dihidrocumarinilo, 1,2-benzopironilo, benzofuranilo,
benzo[b]furanilo, indolilo, y pirrolilo, cada uno de
los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más de los
mismos o diferentes grupos R^{8}, en el que R^{8} es como se
define en la reivindicación 1.
3. El compuesto de la reivindicación 1, en el
que uno o ambos de R^{2} y R^{4}, independientemente entre sí,
es un heteroarilo opcionalmente sustituido.
4. El compuesto de la reivindicación 3, en el
que R^{2} y R^{4} sin iguales.
5. El compuesto de la reivindicación 3 ó 4, en
el que cada R^{35} se selecciona independientemente del grupo que
consiste en hidrógeno, R^{d}, -NR^{c}R^{c},
-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c},
-C(O)NR^{c}R^{c},
-(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c},
-C(O)OR^{d},
-(CH_{2})m-C(O)OR^{d} y
-(CH_{2})_{m}-OR^{d}, en
los que m, R^{c} y R^{d} son como se definen en la
reivindicación 1.
6. El compuesto de la reivindicación 5, en el
que cada m es uno.
7. El compuesto de la reivindicación 1, en el
que R^{2} es un heteroarilo opcionalmente sustituido que está
unido al resto de la molécula vía un átomo de carbono anular.
8. El compuesto de la reivindicación 1, en el
que R^{4} es un heteroarilo opcionalmente sustituido que está
unido al resto de la molécula vía un átomo de carbono anular.
9. El compuesto de la reivindicación 3, en el
que R^{4} es
en la que R^{9} y R^{10} son
como se definen en la reivindicación 1, e incluyen además, cada uno
independientemente, un átomo de hidrógeno, y R^{2} es un grupo
fenilo sustituido como se define en la reivindicación 1,
o
en la que R^{35} es como se
define en la reivindicación
1.
\vskip1.000000\baselineskip
10. El compuesto de la reivindicación 3, en el
que R^{4} es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Y^{1} y Y^{2} y cada
R^{35} son como se definen en la reivindicación 1, y R^{2}
es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{35} es como se
define en la reivindicación
1.
\vskip1.000000\baselineskip
11. El compuesto de la reivindicación 10, en el
que Y^{1} es oxígeno, Y^{2} es NH, y uno o más restos de
R^{35} es un grupo alquilo.
12. El compuesto de la reivindicación 11, en el
que dos R^{35} enlazados al mismo átomo de carbono son cada uno
metilo.
13. El compuesto de la reivindicación 12, en el
que R^{4} es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
14. El compuesto de la reivindicación 1, en el
que R^{5} se selecciona del grupo que consiste en fluoro,
fluoroalquilo (C1-C3), perfluoroalquilo
(C1-C3), fluoroalcoxi (C1-C3) y
perfluoroalcoxi (C1-C3).
15. El compuesto de la reivindicación 14, en el
que R^{5} se selecciona de fluoro, -CF_{3} y
-OCF_{3}.
16. El compuesto de la reivindicación 1, en el
que uno o ambos de R^{2} y R^{4} son, independientemente entre
sí, un fenilo sustituido con uno, dos o tres grupos R^{8}, en el
que R^{8} es como se define en la reivindicación 1.
17. El compuesto de la reivindicación 16, en el
que R^{2} y R^{4} son cada uno el mismo o diferente fenilo
sustituido.
18. El compuesto de la reivindicación 16 ó 17,
en el que el fenilo sustituido está
mono-sustituido.
19. El compuesto de la reivindicación 18, en el
que fenilo de R^{4} está sustituido en la posición ortho,
meta, o para.
20. El compuesto de la reivindicación 18, en el
que R^{8} se selecciona del grupo que consiste en alquilo
(C1-C10), alquilo (C1-C10)
ramificado, -OR^{d},
-O-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c},
-OC(O)NR^{c}R^{c},
-O-(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c},
-O-C(O)OR^{a},
-O-(CH_{2})_{m}-C(O)OR^{a}, -O-C(NH)NR^{c}R^{c}, -O-(CH_{2})_{m}-C(NH)NR^{c}R^{c},-NH-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c}, -NH-C(O)NR^{c}R^{c} y NH-
(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c}, en los que m, R^{a}, R^{c}, y R^{d} son como se definen en la reivindicación 1.
-O-(CH_{2})_{m}-C(O)OR^{a}, -O-C(NH)NR^{c}R^{c}, -O-(CH_{2})_{m}-C(NH)NR^{c}R^{c},-NH-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c}, -NH-C(O)NR^{c}R^{c} y NH-
(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c}, en los que m, R^{a}, R^{c}, y R^{d} son como se definen en la reivindicación 1.
21. El compuesto de la reivindicación 16 ó 17,
en el que el fenilo sustituido está disustituido.
22. El compuesto de la reivindicación 21, en el
que los sustituyentes k^{8} están situados en 2,3-; 2,4-; 2,5-;
2,6-; 3,4-; o 3,5-.
23. El compuesto de la reivindicación 21, en el
que R^{8} se selecciona independientemente del grupo que consiste
en alquilo (C1-C10), alquilo
(C1-C10) ramificado, -OR^{a} opcionalmente
sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R^{a}
o R^{b},
-O-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c},
-OC(O)NR^{c}R^{c},
-O-(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c},
-O-C(O)OR^{a},
-O-(CH_{2})_{m}-C(O)OR^{a},
O-C(NH)NR^{c}R^{c},
-O-(CH_{2})_{m}-C(NH)NR^{c}R^{c}-NH-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c},
-NH-C(O)NR^{c}R^{c} y
-NH-(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c},
en los que m, R^{a}, R^{b}, y R^{c} son como se definen en la
reivindicación 1.
24. El compuesto de la reivindicación 16 ó 17,
en el que el fenilo sustituido está trisustituido.
25. El compuesto de la reivindicación 24, en el
que los sustituyentes R^{8} están situados en 2, 3, 4; 2, 3, 5;
2, 3, 6, 2, 4, 5; 2, 4, 6; 2, 5, 6; o 3, 4, 5.
26. El compuesto de la reivindicación 25, en el
que cada R^{8} se selecciona independientemente del grupo que
consiste en alquilo (C1-C10), alquilo
(C1-C10) ramificado, -OR^{a} opcionalmente
sustituido con uno o más de los mismos o diferentes grupos R^{a}
o R^{b},
-O-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c},
-OC(O)NR^{c}R^{c},
-O-(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c},
-O-C(O)OR^{a},
-O-(CH_{2})_{m}-C(O)OR^{a},
O-C(NH)NR^{c}R^{c},
-O-(CH_{2})_{m}-C(NH)NR^{c}R^{c}-NH-(CH_{2})_{m}-NR^{c}R^{c},
-NH-C(O)NR^{c}R^{c} y
-NH-(CH_{2})_{m}-C(O)NR^{c}R^{c},
en los que m, R^{a}, R^{b}, y R^{c} son como se definen en la
reivindicación 1.
27. El compuesto de la reivindicación 24, en el
que el fenilo triasustituido tiene la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que: R^{31} es metilo o
alquilo (C1-C6); R^{32} es hidrógeno, metilo o
alquilo (C1-C6); y R^{33} es un grupo
halo.
28. El compuesto de la reivindicación 17, en el
que R^{2} y R^{4} sin iguales.
29. El compuesto de la reivindicación 1, en el
que el compuesto de 2,4-pirimidindiamina es un
compuesto según la fórmula estructural (Ib):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o una sal, hidrato, solvato y/o un
N-óxido del mismo, en la que R^{11} y R^{14} se seleccionan cada
uno, independientemente entre sí, del grupo que consiste en
hydroxi, alcoxi (C1-C6) y
-NR^{c}R^{c}; R^{12} y R^{13} son cada uno
hidrógeno; y R^{5}, R^{6} y R^{c} son como se definen en la
reivindicación
1.
30. El compuesto de la reivindicación 1, en el
que el compuesto de 2,4-pirimidindiamina es un
compuesto según la fórmula estructural (Ic):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o una sal, hidrato, solvato y/o un
N-óxido del mismo, en la
que:
- \quad
- R^{4} es fenilo opcionalmente sustituido con de 1 a 3 de los mismos o diferentes grupos R^{8}, o un heteroarilo opcionalmente sustituido como se define en la reivindicación 1;
- \quad
- R^{5} y R^{8} son como se definen en la reivindicación 1; y
- \quad
- R^{18} es -O(CH_{2})_{m}-R^{b}, en el que m y R^{b} son como se definen en la reivindicación 1.
\vskip1.000000\baselineskip
31. El compuesto de la reivindicación 30, en el
que R^{4} es un heteroarilo opcionalmente sustituido.
32. El compuesto de la reivindicación 30, en el
que R^{18} es
-O-CH_{2}-C(O)-NHCH_{3}.
33. El compuesto de la reivindicación 1, que se
selecciona del grupo que consiste en:
- \quad
- N2,N4-Bis(3-aminofenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R921302);
- \quad
- N4-(3-Cloro-4-metoxifenil)-5-fluoro-N2-[3-[(N-metilamino)carbonilmetilenoxilfenil]-2,4-pirimidindiamina (R926891);
- \quad
- N4-(2,2-Dimetil-4H-benzo[1,4]oxazin-3-on)-6-il]-5-fluoro-N2-[3-(metilaminocarbonilmetilenoxi)fenil]-2,4-pirimidindiamina (R940323);
- \quad
- N4-[(2,2-Dimetil-4H-5-pirido[1,4]oxazin-3-on)-6-il]-5-fluoro-N2-[3-(metilaminocarbonilmetilenoxi)fenil]-2,4-pirimidindiamina (R940347); y
- \quad
- N4-[(2,2-Difluoro-4H-benzo[1,4]oxazin-3-on)-6-il]-5-fluoro-N2-(3-(metilaminocarbonilmetilenoxi)fenil]-2,4-pirimidindiamina (R921303).
\vskip1.000000\baselineskip
34. El compuesto de la reivindicación 1, que se
selecciona del grupo que consiste en los compuestos 7.4.30 a
7.4.090, 7.4.101 a 7.4.138, 7.4.147 a 7.4.150, 7.4.152 a 7.4.180,
7.4.183, 7.4.186, 7.4.187, 7.4.194 a 7.4.211, 7.4.213, 7.4.245,
7.4.247 a 7.4.249, 7.4.253 a 7.4.255, 7.4.259 a 7.4.261, 7.4.270,
7.4.271, 7.4.277, 7.4.281, 7.4.282, 7.4.290 a 7.4.295, 7.4.297,
7.4.303, 7.4.306, 7.4.307, 7.4.314, 7.4.316, 7.4.319 a 7.4.329,
7.4.342 a 7.4.362, 7.4.372 a 7.4.382, y 7.4.384 a 7.4.445.
35. El compuesto de la reivindicación 1, que se
selecciona del grupo que consiste en:
- \quad
- (S)-5-Fluoro-N2-[3-(N-metilamino)carbonilmetilenoxifenil]-N4-(2-metil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R909317);
- \quad
- (R)-5-Fluoro-N2-[3-(N-metilamino)carbonilmetilenoxifenil]-N4-(2-metil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R909317);
- \quad
- N4-(2,2-Difluoro-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-N2-(3,5-dimetoxifenil)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R926970);
- \quad
- N2-(3-Cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2-difluoro-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R926971);
- \quad
- N2-(3,5-Dicloro-4-hidroxifenil)-N4-(2,2-difluoro-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R927048);
- \quad
- N2-(3,5-Dicloro-4-hidroxifenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R927051);
- \quad
- N2-(3-Cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R940358)
- \quad
- N2-(3-Cloro-4-metoxi-5-metilfenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R940361);
- \quad
- N4-(2,2-Dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(indazolin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R940363);
- \quad
- N4-(2,2-Dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(N1-metilindazolin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R940366);
- \quad
- N4-(2,2-Difluoro-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(1-metilindazolin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R940368); y
- \quad
- N2-(3,5-Dimetoxifenil)-5-fluoro-N4-(2H-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R945401).
\vskip1.000000\baselineskip
36. El compuesto de la reivindicación 1, que se
selecciona del grupo que consiste en:
- \quad
- N4-(3,3-Dimetil-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(N1-metilindazol-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R908592);
- \quad
- N4-(2,2-Dimetil-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-[1-(3-hidroxipropil)indazolin-5-il]-2,4-pirimidindiamina (R935432);
- \quad
- N4-(3-Cloro-4-metoxifenil)-5-fluoro-N2-[1-(3-hidroxipropil)indazolin-5-il]-2,4-pirimidindiamina (R935461);
- \quad
- N4-(2,2-Difluoro-3-oxo-4H-benz[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(indazolin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R940364);
- \quad
- N4-[(2,2-Dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-N2-(indazolin-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R940380);
- \quad
- N2-(3-Cloro-4-hidroxi-5-metilfenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R940394);
- \quad
- N2-(3,5-Dimetil-4-metoxifenil)-N4-(2,2-dimetil-3-oxo-4H-5-pirid[1,4]oxazin-6-il)-5-fluoro-2,4-pirimidindiamina (R940395); y
- \quad
- N4-(4-Amino-1-benzopiran-6-il)-5-fluoro-N2-(indazol-6-il)-2,4-pirimidindiamina (R950423).
\vskip1.000000\baselineskip
37. El compuesto de la reivindicación 1, que es
N4-[(2,2-difluoro-4H-benzo[1,4]oxazin-3-on)-6-il]-5-fluoro-N2-(3-(metilaminocarbonilmetilenoxi)fenil]-2,4-pirimidindiamina
(R921303).
38. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-37, que es para uso en la forma
de una composición farmacéutica que comprende el compuesto y un
vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
39. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-37, en el que la enfermedad
autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en
enfermedades autoinmunitarias que se denominan frecuentemente como
trastornos autoinmunitarios de un solo órgano o de un solo tipo de
células, y enfermedades autoinmunitarias que se denominan
frecuentemente por implicar un trastorno autoinmunitario
sistémico.
40. El compuesto de la reivindicación 39, en el
que la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que
consiste en tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica
autoinmunitaria, gastritis atrófica autoinmunitaria de anemia
perniciosa, encefalomielitis autoinmunitaria, orquitis
autoinmunitaria, enfermedad de Goodpasture, trombocitopenia
autoinmunitaria, oftalmia simpática, miastenia grave, enfermedad de
Graves, cirrosis biliar primaria, hepatitis agresiva crónica, y
glomerulopatía membranosa.
41. El compuesto de la reivindicación 39, en el
que la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que
consiste en lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide,
síndrome de Sjogren, síndrome de Reiter, polimiositis,
dermatomiositis, esclerosis sistémica, panarteritis nudosa,
esclerosis múltiple y penfigoide ampolloso.
42. El compuesto de la reivindicación 41, en el
que la enfermedad autoinmunitaria es lupus eritematoso
sistémico.
43. El compuesto de la reivindicación 41, en el
que la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide.
44. El compuesto de la reivindicación 41, en el
que la enfermedad autoinmunitaria es esclerosis múltiple.
45. El compuesto de la reivindicación 39, en el
que la enfermedad autoinmunitaria es glomerulonefritis asociada con
reacción de hipersensibilidad de tipo III.
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