DK169550B1 - Tricycloforbindelser, fremgangsmåde til fremstilling deraf, anvendelse deraf, præparater indeholdende disse samt Streptomyces tsukubaensis mikroorganismekultur til brug ved fremgangsmåden - Google Patents

Tricycloforbindelser, fremgangsmåde til fremstilling deraf, anvendelse deraf, præparater indeholdende disse samt Streptomyces tsukubaensis mikroorganismekultur til brug ved fremgangsmåden Download PDF

Info

Publication number
DK169550B1
DK169550B1 DK556285A DK556285A DK169550B1 DK 169550 B1 DK169550 B1 DK 169550B1 DK 556285 A DK556285 A DK 556285A DK 556285 A DK556285 A DK 556285A DK 169550 B1 DK169550 B1 DK 169550B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
hydroxy
allyl
streptomyces
compound according
reaction
Prior art date
Application number
DK556285A
Other languages
English (en)
Other versions
DK556285A (da
DK556285D0 (da
Inventor
Masakuni Okuhara
Hirokazu Tanaka
Tohru Kino
Hiroshi Hatanaka
Toshio Goto
Original Assignee
Fujisawa Pharmaceutical Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB848430455A external-priority patent/GB8430455D0/en
Priority claimed from GB858502869A external-priority patent/GB8502869D0/en
Priority claimed from GB858508420A external-priority patent/GB8508420D0/en
Application filed by Fujisawa Pharmaceutical Co filed Critical Fujisawa Pharmaceutical Co
Publication of DK556285D0 publication Critical patent/DK556285D0/da
Publication of DK556285A publication Critical patent/DK556285A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK169550B1 publication Critical patent/DK169550B1/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D498/18—Bridged systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • C12R2001/55—Streptomyces hygroscopicus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces
    • Y10S435/898—Streptomyces hygroscopicus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Description

i DK 169550 B1
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte tricycloforbindelser med farmakologisk aktivitet, en fremgangsmåde til fremstilling deraf, et farmaceutisk præparat, der indeholder forbindelserne samt en Steptomyces tsukubaensis mikroorganismekultur til brug ved fremgangs-5 måden.
Den foreliggende opfindelse angår endvidere en hidtil ukendt anvendelse af ascomycin (FR 900520) og fremgangsmåde til fremstilling af FR 900520.
Mere specifikt angår opfindelsen hidtil ukendte tricycloforbindelser, 10 som har farmakologisk aktivitet såsom immunosuppressiv aktivitet og antimikrobiel aktivitet, en fremgangsmåde til fremstilling deraf, et farmaceutisk præparat indeholdende forbindelserne samt anvendelse af forbindelserne.
Ét formål med den foreliggende opfindelse er følgelig at tilveje-15 bringe hidtil ukendte' tricycloforbindelser, som er nyttige til behandling og forebyggelse af rejektion ved transplantation, "graft-versus-host"-sygdomme ved knoglemarvs transplantation, autoimmune sygdomme, infektionssygdomme og lignende.
Et andet formål med opfindelsen er at tilvejebringe en fremgangsmåde 20 til fremstilling af tricycloforbindelser ved fermenteringsprocesser.
Et yderligere formål med opfindelsen er at tilvejebringe et farmaceutisk præparat, som er ejendommeligt ved, at det indeholder en tri-cycloforbindelse ifølge opfindelsen som aktiv bestanddel sammen med en farmaceutisk acceptabel, i det væsentlige ikke-toxisk bærer eller 25 excipiens.
Et sidste formål med opfindelsen er at tilvejebringe en biologisk ren kultur af mikroorganismen Streptomyces tsukubaensis nr. 9993 (FERM BP-927) til brug ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.
Endnu et formål med opfindelsen er at tilvejebringe en anvendelse af 30 tricycloforbindelser til fremstilling af et lægemiddel til behandling og forebyggelse af rejektion ved transplantation, "graft-versus- 2
LM\ IOZJOOKJ D I
host"-sygdomme ved knoglemarvs transplantation, autoimmune sygdomme, infektionssygdomme og lignende.
Fra US 3.244.592 kendes forbindelsen ascomycin, der har vist sig at være identisk med FR-900520. Forbindelsen er beskrevet som havende 5 antifungicid virkning. I patentskriftet beskrives tillige en fremgangsmåde til fremstilling af ascomycin ved hjælp af mikroorganismestammen Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus.
Med hensyn til den foreliggende opfindelse skal det bemærkes, at den udspringer fra og er baseret på erkendelsen af visse hidtil ukendte 10 specifikke forbindelser, stofferne FR-900506, FR-900523 og FR-900525. Nærmere betegnet blev stofferne FR-900506, FR-900520, FR-900523 og FR-900525 først isoleret i ren form fra dyrkningsvæsker, der frembragtes ved fermentering af hidtil ukendte arter, der hører til slægten Streptomyces.
15 Som et resultat af omfattende undersøgelser til belysning af de kemiske strukturer af stofferne FR-900506, FR-900523 og FR-900525 er det lykkedes at bestemme deres kemiske struktur og at fremstille tri-cycloforbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse.
De hidtil ukendte tricycloforbindelser ifølge opfindelsen har neden-20 stående almene formel I
CH, “rUyv9 'Wri o [2 ^'V c* 1 °VoH f^CH3
0Η3νΛ V
I LJ CH3 OCH- OCH, hvor DK 169550 B1 3 rA betegner hydroxy, eller 1-(lavere alkylthio)-(lavere)alkyloxy, tri(lavere)alkylsilyloxy, (lavere)alkyl-diaryisilyloxy, alipha-tisk acyloxy, aromatisk acyloxy eller aliphatisk acyloxy substitueret med en aromatisk gruppe, som er afledt fra carboxyl-5 eller sulfonsyrer, R2 betegner hydrogen eller hydroxy eller er som defineret under rA r3 betegner methyl, ethyl, propyl eller allyl, n er et helt tal på 1 eller 2, og en fuldt optrukket og en stiplet linje betegner en enkeltbin- 10 ding eller en dobbeltbinding, under forudsætning af, at når R^· og R2 begge betegner hydroxy, n er 2, og en fuldt optrukket og en stiplet linie betegner en enkeltbinding, da betegner R^ methyl, propyl eller allyl, og salte deraf.
15 Det har vist sig, at følgende fire specifikke forbindelser dannes ved fermentering: 1) Den forbindelse med den almene formel I, hvor R1 og R2 hver betegner hydroxy, R^ betegner allyl, n er et helt tal på 2, og en fuldt optrukket og en stiplet linje betegner en enkelt- 20 binding, hvilken forbindelse betegnes FR-900506, 2) den forbindelse med den almene formel 1', hvor og R2 hver betegner hydroxy, R^ betegner ethyl, n er et helt tal på 2, og en fuldt optrukket og en stiplet linje betegner en enkeltbinding, hvilken forbindelse betegnes FR-900520 (en anden 25 betegnelse er WS 7238A), 3) den forbindelse med den almene formel X, hvor R^ og R2 hver betegner hydroxy, R^ betegner methyl, n er et helt tal på 2, og en fuldt optrukket og en stiplet linje betegner en enkeltbinding, hvilken forbindelse betegnes FR-900523 (en anden 30 betegnelse er WS 7238B), og 4) den forbindelse med den almene formel I, hvor R^- og R2 hver betegner hydroxy, R^ betegner allyl, n er et helt tal på 1, og UK IbSbbU b l 4 en fuldt optrukket og en stiplet linje betegner en enkeltbinding, hvilken forbindelse betegnes FR-900525.
Med hensyn til tricycloforbindelserne med den almene formel I ifølge opfindelsen er det klart, at der kan være én eller flere conformere 5 eller stereoisomere par såsom optiske og geometriske isomerer på grund af ét eller flere asymmetriske carbonatomer og én eller flere dobbeltbindinger, og at sådanne isomerer også ligger inden for rammerne af den foreliggende opfindelse.
Tre af de omhandlede tricycloforbindelser med den almene formel I og 10 den kendte forbindelse FR-900520 kan fremstilles ved følgende fermenteringsprocesser :
Arter hørende til føl-900506 slægten Streptomyces Fermentering^ JfR-900520 j FR-900523 og 15 (JR-900525
Opfindelsen angår således en særlig fremgangsmåde til fremstilling af fremstilles forbindelser med den almene formel II
H°v_ 3 Jl ch3 æ Λ3 11 ay·0 -OH < ch3
Chy^<0 V
L 1 j ch3 20 OCH3 och3 hvor R^ betegner ethyl eller allyl, n er et helt tal på 1 eller 2, når RJ betegner allyl, og n er 2, når, R^ betegner ethyl, 5 DK 169550 B1 * hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at mikroorganismestammen Streptomyces tsukubaensis nr. 9993 (FERM BP-927) eller en af denne stamme afledt mutant, der har væsentligt samme egenskaber, dyrkes i et næringsmedium, hvorefter stofferne FR-900506, FR-900520 og/eller 5 FR-900525 isoleres ved konventionelle metoder.
Endvidere kan en del af forbindelserne med formlen I fremstilles ved følgende syntetiske processer:
Proces 1 (indføring af en hydroxybeskyttelsesgruppe) A - CK3"~
Wrr ) [2 i r3
°[°OH
“SY'S, V
il/1“3 10 OCH^ Indføring af en hydroxy beskyttelsesgruppe Ψ
a T J
ch,o^nA\ 3 il CH3 CH3 \Α^Ν/0 ^V° v-*3 lr et V X, I^OH ^ CH3
V
U/ CH3 OCH3 OCH3 6 DK TbybbU b l 2) Proces 2 (indføring af en hydroxybeskyttelsesgruppe)
R“ v/V
ch3o-X>v ^ ch3-1L
(gu—, I I .
SV r*! - J^Q salt deraf I OH f ^H3 a3yS y.
Il / CH3 och3 och3 5 Indføring af en hydroxy beskyttelsesgruppe •v r1Y^i CH3 Id CK3 eller et (CH_5—, I 1 n salt deraf .CL/ <λ* οΛτ;°οη y
Ii^y ^ OCH3 och3 3) Proces 3 (dannelse af en dobbeltbinding) 7 DK 169550 B1 CH3oAA CH3 (W»i } I2 Ie b(f r3 eller et I o salt deraf 0 I oh
CH3V^0 V
CH3 0CH3 0CH3 5 Base Ψ ΤΊ if CH3°^>S,^|l ^3 eller et salt deraf ΐν Λ3 cf>° /^CH3 U0H \ ch3vX<o y.
I 1 / CH3 och3 och3 4) Proces 4 (oxidation af hydroxyethylengruppen) υκ ibyssu b i δ r1Y^i ch3 CH 3_ (CH-)—, I T !g 0HA’ auret J j] I salt deraf ° [.OH <C ^CH3
a2yS<o V
Il / ch3 och3 och3 5 Oxidation af hydroxy- ethylengruppen Ψ κ'γχ X X Ih
CH3°^^>1 CH
J I i 3 eller et ^3 salt deraf (CH)—, I Γ cy r*3 ° f°OH ^^CH3
ch3nAo K
\XJ^ CH3 OCH3 OCH3 5) Proces 5 (reduktion af allylgruppen) 9 DK 169550 B1 r1Y^i ch3 ch3AJyy° T2,n/ *2X π if CH~CH=CH, I {} 2 2 eller et ° I °OH salt deraf C^3Vv V.
II / CH3 OCHj OCH3 5 Reduktion ry\ CH,0'Avn^ns.
3 I CH3
(CHJ-, J L I
C5! / K2 1
i S I
<^]*0 0H IJ
γη \ eller et
CH3V^° K
I I / cjj^ salt deraf och3 och3 i hvilke formler 10 R^-, R^, R^, n og en fuldt optrukket og en stiplet linje hver har de ovenfor angivne betydninger,
Rj og R| hver betegner beskyttet hydroxy, og R·^ betegner en fraspaltelig enhed.
De ovenfor anførte definitioner og de foretrukne .udførelsesformer er 15 forklaret nærmere nedenfor.
I nærværende beskrivelse og krav betegner udtrykket "lavere" 1-6 carbonatomer, medmindre andet er angivet.
DK 169550 ΒΊ ίο
Udtrykket 1-(lavere alkylthio)-lavere alkyloxy kan betyde lavere alkylthiomethyloxy (fx methylthiomethyloxy, ethylthiomethyloxy, · propylthiomethyloxy, isopropyl thiomethyloxy, butyl thiomethyloxy, isobutylthiomethyloxy, hexylthiomethyloxy, etc.), idet den foretrukne 5 betydning kan være alkylthiomethyloxy, og den mest foretrukne kan være methylthiomethyloxy;
Udtrykket tri(lavere alkyl)silyloxy kan betyde trimethylsilyloxy, triethylsilyloxy, tributylsilyloxy, tert.butyl-dimethylsilyloxy, tri-tert.butylsilyloxy, etc., og lavere alkyl-diarylsilyloxy kan betyde 10 me thyl-diphenyls i ly loxy, ethyl-diphenylsilyloxy, propyl-diphenylsily- loxy, tert.butyl-diphenylsilyloxy, etc., idet den foretrukne betydning kan være tri(C^ ^-alkyl)silyloxy og ^-alkyl-diphenylsilyloxy, og den mest foretrukne kan være tert.butyl-dimethylsilyloxy og tert.-buty1-diphenyls ily1oxy; 15 Udtrykket acyloxy kan betyde aliphatisk acyloxy, aromatisk acyloxy og aliphatisk acyloxy substitueret med en aromatisk gruppe, som er afledt fra carboxyl- og sulfonsyrer.
Aliphatisk acyloxy kan betyde lavere alkanoyloxy, som eventuelt er hensigtsmæssigt substitueret med én eller flere substituenter såsom 20 carboxy (fx formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, isovaleryl, pivaloyl, hexanoyl, carboxyacetyl, carboxypropionyl, carboxybutyryl, carboxyhexanoyl, etc.), cyclo-lavere alkyloxy-lavere alkanoyloxy, som eventuelt er hensigtsmæssigt substitueret med én eller flere substituenter såsom lavere alkyl (fx cyclopropyloxyace-25 tyl, cyclobutyloxypropionyl, cycloheptyloxybutyryl, menthyloxyacetyl, menthyloxypropionyl, menthyloxybutyryl, menthyloxyheptanoyl, menthy-loxyhexanoyl, etc.), camphersulfonyloxy.
Aromatisk acyloxy kan betyde aroyloxy, som eventuelt er hensigtsmæssigt substitueret med én eller flere substituenter såsom nitro (fx 30 benzoyl, toluoyl, xyloyl, naphthoyl, nitrophenyl, dinitrophenyl, nitronaphthoyl, etc.), arensulfonyloxy, som eventuelt er hensigtsmæssigt substitueret med én eller flere substituenter såsom halogen (fx benzensulfonyl, toluensulfonyl, xylensulfonyl, naphthalensulfo- DK 169550 B1 11 nyl, fluorbenzensulfonyl, chlorbenzensulfonyl, brombenzensulfonyl, iodbenzensulfonyl, etc.).
Aliphatisk acyloxy substitueret med en aromatisk gruppe kan betyde ar-lavere alkanoyloxy, som eventuelt er hensigtsmæssigt substitueret 5 med én eller flere substituenter såsom' lavere alkoxy og trihalogen-lavere alkyl (fx phenylacetyl, phenylpropionyl, phenylbutyryl, 2-trifluormethyl-2-methoxy-2-phenylacetyl, 2-ethyl-2-trifluorme thyl- 2 -phenylacetyl, 2-trifluormethyl-2-propoxy-2-phenylacetyl, etc.).
Den således definerede særlig foretrukne acyloxygruppe kan være 10 alkanoyloxy, som eventuelt er substitueret med carboxy, cyclo-C^ g-alkyloxy-C^ ^-alkanoyl substitueret med to alkylgrupper på cycloalkyldelen, camphersulfonyloxy, benzoyloxy, som eventuelt er substitueret med én eller to nitrogrupper, benzensulfonyloxy substitueret med halogen, phenyl-C^ ^-alkanoyloxy substitueret med ^-15 alkoxy og trihalogen-C^ ^-alkyl, idet de mest foretrukne betydninger er acetyloxy, carboxypropionyloxy, menthyloxyacetyloxy, camphersulfonyloxy, benzoyloxy, nitrobenzoyloxy, dinitrobenzoyloxy, iodbenzensul-fonyloxy og 2-trifluormethyl-2-methoxy-2-phenylacetyloxy.
En egnet "fraspaltelig enhed" kan betyde hydroxy og acyloxy, hvor 20 acyloxydelen kan være en sådan som eksemplificeret ovenfor.
Fremgangsmåderne til fremstilling af tricycloforbindelserne med den almene formel I ifølge opfindelsen samt fremgangsmåde til fremstilling af FR-900520 forklares nærmere nedenfor.
I) Fermenteringsprocesser 25 Stofferne FR-900506, FR-900523 og FR-900525 ifølge opfindelsen og FR-900520 kan fremstilles ved i et næringsmedium at fermentere stammer, som danner stofferne FR-900506, FR-900520, FR-900523 og/eller FR-900525, og som hører til slægten Streptomyces såsom Streptomyces tsukubaensis nr. 9993 og Streptomyces hygroscopicus subsp. yaku-30 shimaensis nr. 7238.
DK 169550 Bl 12 Nærmere oplysninger om de mikroorganismer, der anvendes til fremstilling af stofferne FR-900506, FR-900520, FR-900523 og FR-900525, er anført nedenfor.
A) Stofferne FR-900506 og FR-900525 ifølge opfindelsen og FR-900520 5 kan fremstilles ved i et næringsmedium at fermentere en stamme, som danner stofferne FR-900506, FR-900520 og/eller FR-900525, og som hører til slægten Streptomyces såsom Streptomyces tsukubaensis nr.
9993.
Mikroorganismen 10 Den mikroorganisme, som kan anvendes til fremstilling af stofferne FR-900506, FR-900520 og/eller FR-900525, er en stamme, som danner stofferne FR-900506, FR-900520 og/eller FR-900525, og som tilhører slægten Streptomyces, hvoriblandt Streptomyces tsukubaensis nr. 9993 for nylig er blevet isoleret fra en jordprøve indsamlet i Toyosato-15 cho, Tsukuba-gun, Ibaraki Prefecture, Japan.
En lyofiliseret prøve af den for nylig isolerede Streptomyces tsuku-ba ensis nr. 9993 er deponeret i Fermentation Research Institute,
Agency of Industrial Science and Technology (No. 1-3, Higashi 1-cho-me, Yatabemachi Tsukuba-gun, Ibaraki Prefecture, Japan) under depone-20 ringsnummeret FERM P-7886 (deponeret den 5. oktober 1984) og er derefter den 19. oktober 1985 konverteret til deponering i henhold til Budapest-traktaten hos samme deponeringsmyndighed under det nye deponeringsnummer FERM BP-927.
Det er klart, at fremstillingen af de hidtil ukendte stoffer 25 FR-900506 og/eller FR-900525 ikke er begrænset til anvendelsen af den bestemte organisme, der er beskrevet her, og som kun er anført som eksempel. Den foreliggende opfindelse omfatter også anvendelse af en hvilken som helst mutant, som er i stand til at danne stofferne FR-900506, FR-900520 og/eller FR-900525, herunder både naturlige 30 mutanter og kunstige mutanter, som kan fremstilles ud fra den beskrevne organisme ved konventionelle metoder såsom bestråling med røntgenstråler, ultraviolet bestråling, behandling med N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, 2-aminopurin og lignende.
DK 169550 B1 13
Streptomyces tsukubaensis nr. 9993 har følgende morfologiske, kulturmæssige, biologiske og fysiologiske egenskaber: 1) Morfologiske egenskaber
De metoder, der er beskrevet af Shirling og Gottlieb (E.B. Shirling 5 og D. Gottlieb, "Methods for characterization of Streptomyces species", International Journal of Systematic Bacteriology 16, 1966, s. 313-340), blev i hovedsagen anvendt til denne taxonomiske under-søg-else.
Morfologiske iagttagelser blev foretaget med lys- og elektronmikro-10 skoper på kulturer, der var dyrket ved 30°C i 14 dage på havremelsagar, gær/maltekstraktagar og uorganiske salte/stivelsesagar. De modne sporophorer dannede Rectiflexibiles med 10-50 eller over 50 sporer i hver kæde. Sporerne var aflange eller cylindriske, 0,5-0,7 x 0,7-0,8 μια i størrelse, bestemt ved elektronmikroskopisk observa-15 tion. Sporeoverfladerne var glatte.
2) Kulturkendetegn
Kulturkendetegn blev observeret på ti slags medier som beskrevet af Shirling og Gottlieb nævnt ovenfor samt af Waksman (S.A. Waksman, The Actinomycetes, bind 2, "Classification, identification and descrip-20 tion of genera and species", The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961).
Inkubationen blev udført ved 30eC i 14 dage. De ved denne undersøgelse anvendte farvenavne er baseret på Guide to Color Standard (manual udgivet af Nippon Shikisai Kenkyusho, Tokyo). Kolonierne tilhørte den 25 grå farveserie, når de blev dyrket på havremelsagar, gær/maltekstraktagar og uorganiske salte/stivelsesagar. Der dannedes opløseligt pigment i gær/maltekstraktagar, men ikke i andre medier. Resultaterne er anført i tabel 1.
14 DK IbSbbU b l TABEL 1
Kulturkendetegn for stamme nr. 9993 og Streptomyces misakiensis IF0 12891
Kulturkendetegn 5 Medium Nr. 9993 . IFO 12891
Havremelsagar V Moderat Moderat L Grå Gråhvid U Svagt lyserød Farveløs 10 0 Intet Intet Gær /maltekstrakt- V Moderat Moderat agar L Lysegrå Gråhvid U Mat rødorange Lysebrun 0 Mat rødorange Intet 15 Uorganiske salte/ V Moderat Moderat stivelsesagar L Svagt gulorange Gråhvid til lysegrå U Mørkorange Svagt gulbrun 0 Intet Intet 20 Glucose- V Dårlig Moderat asparagin-agar L Hvid Gråhvid U Svagt brun Svagt gulbrun 0 Intet Svagt brun
Glycerol- V Moderat Moderat 25 asparagin-agar L Svagt lyserød Gråhvid til hvid U Svagt lyserød Svagt gulbrun 0 Intet Svagt brun DK 169550 B1 15 TABEL 1 fortsat
Medium Nr. 9993 IFO 12891
Czapek-agar V Dårlig Rigelig 5 L Intet Gråhvid U Svagt lyserød Mørkorange til mørkebrun 0 Intet Intet Næringsagar V Dårlig Dårlig 10 L Hvid, dårlig Hvid U Farveløs Farveløs 0 Intet Intet
Kartoffel/dextrose- V Dårlig Moderat agar L Intet Gulgrå 15 U Svagt lyserød Brun 0 Intet Intet
Tyrosin-agar V Moderat Moderat L Hvid Gråhvid til lysegrå 20 U Mat rødorange Mørkorange til sort 0 Intet Intet
Pepton/gæreks- V Dårlig Dårlig trakt/jern-agar L Intet Intet 25 U - Farveløs Farveløs 0 Intet Intet
Forkortelser: V . - vækst 30 L = farve på luftmasse U = farve på undersiden 0 = opløseligt pigment DK 169550 Bl 16
Cellevæganalyse blev foretaget i henhold til de af Becker et al. samt Yamaguchi beskrevne metoder (B. Becker, M.P. Lechevalier, R.E. Gordon og H.A. Lechevalier, "Rapid differentiation between Nocardia and · Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates", 5 Appl. Microbiol. 12, 1964, s. 421-423, og T. Yamaguchi, "Comparison of the cell wall composition of morphologically distinct Actinomyce-tes", J. Bacteriol. 89, 1965, s. 444-453). Analyse af helcelle-hy-drolysater af stamme nr. 9993 viste tilstedeværelsen af LL-diamino-pimelinsyre. Følgelig antages cellevæggen på denne stamme at være af 10 type I.
3) Biologiske og fysiologiske egenskaber
De fysiologiske egenskaber hos stamme nr. 9993 blev bestemt i henhold til de af Shirling og Gottlieb beskrevne metoder, som er nævnt ovenfor. Resultaterne er vist i tabel 2. Temperaturområde og optimal tem-15 peratur for vækst blev bestemt på gær/maltekstrakt-agar under anvendelse af en temperaturgradient-inkubator (fremstillet af Toyo Ka-gaku Sangyo Co., Ltd.). Temperaturområdet for vækst var 18-35eC med en optimal temperatur på 28eC. Mælkepeptonisering og gelatine- væskedannelse var positive. Melanoidpigment-dannelse var negativ.
20 TABEL 2
Fysiologiske egenskaber hos stamme nr. 9993 og Streptomyces misakiensis IFO 12891 Fysiologiske egenskaber Nr. 9993 IFO 12891
25 Temperaturområde for vækst 18-35°C 12-35°C
Optimal temperatur 28°C 28°C
Nitratreduktion Negativ Negativ
Stivelseshydrolyse Negativ Positiv Mælkekoagulation Negativ Negativ 30 Mælkepeptonisering Positiv Svagt positiv
Melanindannelse Negativ Negativ
Gelatine-væskedannelse Positiv Negativ H2S-dannelse Negativ Negativ
NaCl-tolerans (%) <3% 3%<,<5% 35 _ DK 169550 B1 17
Udnyttelsen af carbonkilder blev undersøgt i henhold til de af Prid-ham og Gottlieb beskrevne metoder (T.G. Pridham og D. Gottlieb, "The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination", J. Bacteriol. 56, 1948, s. 107-114). Væksten 5 blev iagttaget efter 14 dages inkubation ved 30°C.
Carbonkilde-udnyttelsen hos denne stamme er vist summarisk i tabel 3. Glycerol, maltose og natriumsuccinat kunne udnyttes af stamme nr.
9993. Endvidere iagttoges også tvivlsom udnyttelse af D-glucose, saccharose, D-mannose og salicin.
10 TABEL 3
Carbonkilde-udnyttelse hos stamme nr. 9993 og Streptomyces misakiensis IFO 12891 Carbonkilder Nr. 9993 IFO 12891 15 D-Glucose ±
Saccharose ±
Glycerol + D-Xylose D-Fructose 20 Lactose
Maltose +
Rhamnose
Raffinose D-Galactose - + 25 L-Arabinose D-Mannose ± D-Trehalose Inositol D-Mannitol 30 Inulin - +
Cellulose
Salicin +
Chitin - ±
UK I0J700U D I
18 TABEL 3 fortsat
Carbonkilder Nr. 9993 IFO 12891
Natriumcitrat 5 Natriumsuccinat +
Natriumacetat
Symboler: + - udnyttelse 10 ± = tvivlsom udnyttelse - ingen udnyttelse
Mikroskopundersøgelser og analyse af cellevægssammensstningen hos stamme nr. 9993 viser, at denne stamme tilhører slægten Streptomyces Waksman og Henrici 1943.
15 Følgelig blev der foretaget en sammenligning af denne stamme med forskellige Streptomyces-arter i lyset af de offentliggjorte beskrivelser (International Journal of Systematic Bacteriology 18, 1968, s. 69-189 og 279-392, og 19, 1969, s. 391-512, samt Bergey's Manual of Deter minative Bacteriology, 8. udgave 1974).
20 Som et resultat af sammenligningen anses stamme nr. 9993 for at ligne Streptomyces aburaviensis Nishimura et al., Streptomyces avellaneus Baldacci og Grein og Streptomyces misakiensis Nakamura. Kulturkendetegnene for stamme nr. 9993 blev derfor sammenlignet med de tilsvarende stammer Streptomyces aburaviensis IFO 12830, Streptomyces 25 avellaneus IFO 13451 og Streptomyces misakiensis IFO 12891. Som et resultat heraf lignede stamme nr. 9993 Streptomyces misakiensis IFO 12891 mest. Stamme nr. 9993 blev derfor yderligere sammenlignet med Streptomyces misakiensis IFO 12891 som vist i tabel 1, 2 og 3 ovenfor. Ud fra yderligere sammenligninger kunne stamme nr. 9993 skelnes 30 fra Streptomyces misakiensis IFO 12891 på følgende punkter, hvorfor stamme nr. 9993 anses for at være en hidtil ukendt Streptomyces-art, som har fået betegnelsen Streptomyces tsukubaensis sp. nov., idet der henvises til den jord, der blev indsamlet i Tsukuba-gun, hvorfra organismen er isoleret.
DK 169550 B1 19
Forskel fra Streptomyces misakiensis IFO 12891
Kulturkendetegn for stamme nr. 9993 er forskellige fra Streptomyces misakiensis IFO 12891 på havremelsagar, gær/maltekstrakt-agar, gluco-se/asparagin-agar, Czapek-agar og kartoffel/dextrose-agar.
5 Stivelseshydrolyse forårsaget af stamme nr. 9993 er negativ, men er positiv for Streptomyces misakiensis IFO 12891.
Gelatine-væskedannelse forårsaget af stamme nr. 9993 er positiv, men er negativ for Streptomyces misakiensis IFO 12891.
Med hensyn til carbonkilde-udnyttelse kan stamme nr. 9993 udnytte 10 glycerol, maltose og natriumsuccinat, men Streptomyces misakiensis IFO 12891 kan ikke udnytte dem. Desuden kan stamme nr. 9993 ikke udnytte D-galactose og inulin, hvorimod Streptomyces misakiensis IFO 12891 kan udnytte dem.
Fremstilling af stofferne FR-900506, FR-900520 og FR-900525 15 De hidtil ukendte stoffer FR-900506 og FR-900525, samt FR-900520 kan fremstilles ved at dyrke en stamme, der danner FR-900506, FR-900520 og/eller FR-900525, og som tilhører slægten Streptomyces (fx Streptomyces tsukubaensis nr. 9993, FERM BP-927), i et næringsmedium.
Generelt kan stofferne FR-900506, FR-900520 og/eller FR-900525 frem-20 stilles ved at dyrke den stamme, der danner FR-900506, FR-900520 og/eller FR-900525, i et vandigt næringsmedium indeholdende kilder til assimilerbart carbon og nitrogen, fortrinsvis under aerobe betingelser (fx rystekultur, submers kultur, etc.).
De foretrukne carborikilder i næringsmediet er carborihydrater såsom 25 glucose, xylose, galactose, glycerol, stivelse, dextrin og lignende.
Andre kilder, som kan .inkorporeres, er maltose, rhamnose, raffinose, arabinose, mannose, salicin, natriumsuccinat og lignende.
De foretrukne nitrogenkilder er gærekstrakt, pepton, glutenmel, bomuldsfrømel, sojabønnemel, majsstøbevand, tørgær, hvedespirer, fjermel
LUV I O^OOU D I
20 ("feather meal"), jordnøddepulver, etc., samt uorganiske og organiske nitrogenforbindelser såsom ammoniumsalte (fx ammoniumnitrat, ammoniumsulfat, ammoniumphosphat, etc.), urinstof, aminosyrer og lignende.
Carbon- og nitrogenkilderne behøver ikke, selv om de med fordel an-5 vendes i kombination, at blive anvendt i deres rene form, da mindre rene materialer, der indeholder spor af vækstfaktorer og betydelige mængder mineralske næringsstoffer, også er egnede til anvendelse.
Hvis det ønskes, kan der til mediet sættes mineralsalte såsom natrium- eller calciumcarbonat, natrium- eller kaliumphosphat, natrium-10 eller kaliumchlorid, natrium- eller kaliumiodid, magnesiumsalte, kobbersalte, cobaltsalt og lignende. Hvis det er nødvendigt, især hvis dyrkningsmediet skummer meget, kan der tilsættes et antiskummid-del såsom flydende paraffin, en fed olie, vegetabilsk olie, mineralolie eller silicone.
15 Submerse aerobe dyrkningsbetingelser foretrækkes som betingelser for fremstillingen af stofferne FR-900506, FR-900520 og FR-900525 i store mængder. Til produktion i små mængder anvendes en ryste- eller overfladekultur i en kolbe eller flaske. Når dyrkningen udføres i store tanke, foretrækkes det endvidere at anvende den vegetative form af 20 organismen til inokulering i produktions tankene for at undgå forsinket vækst under produktionen af stofferne FR-900506, FR-900520 og FR-900525. Det er således ønskeligt først at fremstille et vegetativt inokulum af organismen ved inokulation af en relativt lille mængde dyrkningsmedium med sporer eller mycelier af organismen og dyrke 25 dette inokulerede medium og derefter overføre det dyrkede vegetative inokulum aseptisk til store tanke. Det medium, i hvilket det vegetative inokulum fremstilles, er i det væsentlige det samme som eller er forskelligt fra det medium, der anvendes til fremstilling af stoffer-né FR-900506, FR-900520 og FR-900525.
30 Agitation og beluftning af dyrkningsblandingen kan foretages på flere forskellige måder. Agitation kan foretages med en omrører eller et lignende mekanisk agitationsudstyr, ved at dreje eller ryste fermenteringsbeholderen, med forskelligt pumpeudstyr eller ved at lede steril luft gennem mediet. Beluftning kan udføres ved at lede steril 35 luft gennem fermenteringsblandingen.
DK 169550 B1 21
Fermenteringen udføres sædvanligvis ved en temperatur på ca. 20-40°C, fortrinsvis 25-35eC, i ca. 50-150 timer, hvilket kan varieres afhængigt af fermenteringsbetingelserne og -målestokken.
De således fremstillede stoffer FR-900506, FR-900520 og/eller FR-5 900525 kan isoleres fra dyrkningsmediet ved konventionelle metoder, der sædvanligvis anvendes til isolering af andre kendte biologisk aktive stoffer. De fremstillede stoffer FR-900506, FR-900520 og FR-900525 kan isoleres og oprenses fra myceliet og det filtrat, der fås ved filtrering eller centrifugering af dyrkningsvæsken, ved en sæd-10 vanlig metode såsom koncentration under reduceret tryk, lyofilise- ring, ekstraktion med et sædvanligt opløsningsmiddel, pH-indstilling, behandling med en sædvanlig harpiks (fx anion- eller kationbytter-harpiks, ikke-ionisk adsorptionsharpiks, etc.), behandling med en sædvanlig adsorbent (fx aktivkul, kiselsyre, silicagel, cellulose, 15 aluminiumoxid, etc), krystallisation, omkrystallisation og lignende.
Fysiologiske og kemiske egenskaber hos stofferne FR-900506, FR-900520 og FR-900525
De ved ovenstående fremgangsmåder fremstillede stoffer FR-900506, FR-900520 og FR-900525 har følgende fysiske og kemiske egenskaber: 20 FR-900506 1) Form og farve:
Hvidt pulver 2) Elementaranalyse
Beregnet: C 64,72 H 8,78 N 1,59 25 Fundet: C 64,59 H 8,74 N 1,62.
3) Farvereaktion:
Positiv: ceriumsulfatreaktion, svovlsyrereaktion, Ehrlich-reak- tion, Dragendorff-reaktion og ioddampreaktion.
Negativ: ferrichloridreaktion, ninhydrinreaktion og Molish-reak- 30 tion.
22
UK ΙΟϋΟΟυ D I
4) Opløselighed:
Opløseligt: methanol, ethanol, acetone, ethylacetat, chloro form, diethylether og benzen.
Tungt 5 opløseligt: hexan, petroleumsether.
Uopløseligt: vand 5) Smeltepunkt: 85-90°C.
6) Specifik rotation: 10 [a]jp = -73° (c - 0,8 i CHCI3).
7) Ultraviolet absorptionsspektrum:
Endeabsorption 8) Infrarødt absorptionsspektrum (CHCI3): >/ = 3680, 3580, 3520, 2930, 2870, 2830, 1745, 1720, 1700, 1645, 1450, 15 1380, 1350, 1330, 1310, 1285, 1170, 1135, 1090, 1050, 1030, 1000, 990, 960 (skulder) og 918 cm" 13 9) G-NMR-spektrum (CDCI3): S (ppm) - 212,59 (s) + 212,45 (s), 196,18 (s) + 192,87 (s), 169,07 (s) + 168,90 (s), 164,90 (s) + 166,01 (s), 138,89 (s) + 139,67 (s), 20 135,73 (d) + 135,60 (d), 132,52 (s) + 131,99 (s), 130,27 (d) + 130,21 (d), 122,87 (d) + 123,01 (d), 116,57 (t) + 116,56 (t), 97,35 (s) + 98,76 (s), 84,41 (d), 77,79 (d) + 78,22 (d), 75,54 (d) + 76,97 (d), 73,93 (d) + 73,09 (d), 73,72 (d) + 72,57 (d), 70,05 (d) + 69,15 (d), 56,75 (d), 53,03 (d) + 53,13 (d), 48,85 25 (t) + 48,62 (t), 40,33 (d) + 40,85 (d), 39,40 (t), 31,58 (t), 30,79 (t), 27,72 (t) + 26,34 (t), 26,46 (d), 24,65 (t), 20,45 (q) + 19,73 (q), 14,06 (q) + 14,23 (q), 9,69 (q) + 9,98 (q), hvilket spektrum er vist i fig. 1.
10) ^H-NMR-spektrum: 30 er vist i fig. 2.
DK 169550 B1 23 11) Tyndtlagschromatografi:
Stationær fase Elueringsopløs- Rf-værdier ningsmiddel 5 Silicagelplade Chloroform/methanol 0,58 (10:1, vol/vol)
Ethylacetat 0,52 12) Stoffets egenskab: 10 Neutralt stof.
Med hensyn til stoffet FR-900506 skal det bemærkes, at hvad angår 13 i målinger af C- og •LH-NMR-spektre, udviste stoffet signalpar ved forskellige kemiske shift-værdier.
Det således karakteriserede stof FR-900506 har følgende yderligere 15 egenskaber: 13 i) Målinger af C-NMR-spektre ved 25eC og 60eC viste, at intensiteten af hvert par af de forskellige signaler deri blev forandret.
ii) Målinger af tyndtlagschromatografi og højtryksvæskechromato- 20 grafi viste, at stoffet FR-900506 forekommer som henholdsvis en enkelt plet ved tyndtlagschromatograf! og en enkelt top ved høj tryksvæskechromatograf i.
Dette hvide pulver af stoffet FR-900506 kunne omdannes til krystalform ved omkrystallisation af acetonitril, hvilke krystaller har 25 følgende fysiske og kemiske egenskaber: 1) Form og farve:
Farveløse prismer.
DK 169550 Bl 24 2) Elementaranalys e:
Beregnet: C 64,30 H 8,92 N 1,77
Fundet: C 64,20 H 8,86 N 1,72.
3) Smeltepunkt: 5 127-129°C.
4) Specifik rotation: [a]jp - -84,4° (c - 1,02 i CHC13).
5) ^C-NMR-spektrum (CDCI3): S (ppm) - 211,98 (s) + 211,74 (s), 196,28 (s) + 193,56 (s), 168,97 (s) + 10 168,81 (s), 164,85 (s) + 165,97 (s), 138,76 (s) + 139,51 (s), 135,73 (d) + 135,63 (d), 132,38 (s) + 131,90 (s), 130,39 (d) + 130,17 (d), 122,82 (d) + 122,96 (d), 116,43 (t), 97,19 (s) + 98,63 (s), 84,29 (d), 77,84 (d) + 78,21 (d), 77,52 (d) + 76,97 (d), 69,89 (d) + 69,00 (d), 56,63 (d) + 54,87 (d), 52,97 (d) + 15 52,82 (d), 48,76 (t) + 48,31 (t), 40,21 (d) + 40,54 (d), 31,62 (t), 30,72 (t), 24,56 (t), 21,12 (t) + 20,86 (t), 20,33 (q) + 19,74 (q), 16,17 (q) + 16,10 (q), 15,88 (q) + 15,75 (q), 13,89 (q) + 14,05 (q), 9,64 (q) + 9,96 (q), hvilket spektrum er vist i fig. 3.
20 6) ^H-NMR-spektrum er vist i fig. 4.
Andre fysiske og kemiske egenskaber, dvs. farvereaktion, opløselighed, UV-spektrum, IR-spektrum, tyndtlagschromatografi og egenskab hos de farveløse prismer af stoffet FR-900506, var de samme som egen-25 skaberne hos det hvide pulver af stoffet under identiske betingelser.
Ud fra ovenstående fysiske og kemiske egenskaber og røntgendiffraktionsanalyse kunne det bestemmes, at stoffet FR-900506 har følgende kemiske struktur: DK 169550 B1 25 ~χχ ch3 . jcvVv
Al/011 OH ^ 4N 9]U0 ia^CH2-CH=CH2
o II
7 JL^OH 2θΓ 3
CH3 jl*Q28 2y^CH
26^V24^v-^22 3 25] 24 J23 22 OCH3 och3 17-Allyl-l,14-dihydroxy-12-[2-(4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl)- 1-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28- 4 9 dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]octacos-18-en-2,3,10,16-tetra-on 5 Stoffet FR-900520
De fysiske og kemiske egenskaber er beskrevet nedenfor.
Stoffet FR-900525 1) Form og farve:
Hvidt pulver 10 2) Elementåranalyse
Fundet: C 65,17 H 8,53 N 1,76 3) Farvereaktion:
Positiv:, ceriumsulfatreaktion, svovlsyrereaktion, Ehrlich-reaktion, Dragendorff-reaktion og ioddampreaktion.
15 Negativ: ferrichloridreaktion, ninhydrinreaktion og Molish- reaktion.
DK 169550 Bl 26 4) Opløselighed:
Opløseligt: methanol, ethanol, acetone, ethylacetat, chloro form, diethylether og benzen.
Tungt 5 opløseligt: hexan, petroleumsether.
Uopløseligt: vand 5) Smeltepunkt: 85-89°C.
6) Specifik rotation: 10 [a]§3 - -88° (c = 1,0 i CHCI3).
7) Ultraviolet absorptionsspektrum:
Endeabsorption 8) Infrarødt absorptionsspektrum: (CHCI3): 1/^^ = 3680, 3580, 3475, 3340, 2940, 2880, 2830, 1755, 1705, 1635, 15 1455, 1382, 1370, 1330, 1310, 1273, 1170, 1135, 1093, 1050, 1020, 995, 970, 920 og 867 cm·1.
9) ^3C-NMR-spektrum: (CDCI3): 8 (ppm) = 212,61 (s) + 211,87 (s), 188,57 (s) + 191,12 (s), 168,76 (s) + 170,18 (s), 163,11 (s) + 161,39 (s), 140,28 (s) + 139,37 (s), 20 135,62 (d) + 135,70 (d), 132,28 (s) + 131,34 (s), 130,09 (d) + 130,00 (d), 122,50 (d) + 123,23 (d), 116,48 (t), 99,16 (s) + 99,11 (s), 84,42 (d) + 84,48 (d), 78,60 (d) +79,86 (d), 76,73 (d) + 77,33 (d), 59,97 (d) + 60,45 (d), 57,52 (q), 56,56 (q) + 56,48 (q), 56,14 (q) + 55,97 (q), 53,45 (d) + 53,26 (d), 49,15 25 (t) + 49,73 (t), 48,46 (t) + 47,62 (t), 44,47 (t) + 45,23 (t), 41.40 (d) + 40,40 (d), 35,19 (d) + 35,11 (d), 33,10 (d) + 34,17 (d), 32,81 (t) + 32,29 (t), 31,53 (t) + 31,33 (t), 30,80 (t) + 30,66 (t), 28,60 (t), 26,03 (d) + 26,98 (d), 25,43 (t) + 24.40 (t), 18,93 (q) + 20,57 (q), 14",09 (q) + 13,95 (q), 9,85 30 (q) + 10,00 (q), hvilket spektrum er vist i fig. 5.
DK 169550 Bl 27 10) ^H-NMR-spektrum: er vist i fig. 6.
11) Tyndtlagschromatografi:
Stationær fase Elueringsopløs- Rf-værdier 5 ningsmiddel
Silicagelplade Ethylacetat 0,34 12) Stoffets egenskab: 10 Neutralt stof.
Med hensyn til stoffet FR-900525 skal det bemærkes, at hvad angår målinger af ^C- og ^H-NMR-spektre, udviste stoffet signalpar ved forskellige kemiske shift-værdier, medens stoffet FR-900525 ved måling deraf ved tyndtlagschromatografi og højtryksvæskechromatografi 15 viste henholdsvis en enkelt plet ved tyndtlagschromatografi og en enkelt top ved hø j tryksvæskechromatograf i.
Ud fra ovenstående fysiske og kemiske egenskaber og den med held udførte bestemmelse af stoffet FR-900506's kemiske struktur kunne det bestemmes, at stoffet FR-900525 har følgende kemiske struktur: CH30"''^S^'Xj| CH^ 6 T r p
_[ ]I /010 OH
5 i7rp£CH2-CH«CH2 o 0 - iaX ch, Ί^ΟΗ 19Γ . 3 CH3^1^i>0 27 2^ch 24T j22 och3 och3 DK 169550 61 28 16-Allyl-l,13-dihydroxy-11-[2-(4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl)- 1-methylvinyl]-22,24-dimethoxy-12,18,20,26-tetramethyl-10,27- 4 8 dioxa-4-azatricyclo[2l.3.1.0 ’ ]heptacos-17~en-2,3,9,15-tétra- on 5 B) Stoffet FR-900523 ifølge opfindelsen samt FR-900520 kan fremstilles ved fermentering af en stamme, der producerer stofferne FR-900520 og/eller FR-900523, og som tilhører arten Streptomyces såsom Strep tomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis nr. 7238, i et næringsmedium.
10 Mikroorganismen
Den mikroorganisme, som kan anvendes til fremstilling af stofferne FR-900520 og/eller FR-900523, er en stamme, der producerer stofferne FR-900520 og/eller FR-900523, og som tilhører arten Streptomyces, hvoriblandt Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis nr. 7238 15 for nylig er blevet isoleret fra en jordprøve indsamlet i Yakushima, Kagoshima Prefecture, Japan.
En lyofiliseret prøve af den for nylig isolerede Streptomyces hygro scopicus subsp. yakushimaensis nr. 7238 er deponeret i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (No.
20 1-3, Higashi 1-chome, Yatabemachi, Tsukuba-gun, Ibaraki Prefecture,
Japan) tinder deponeringsnummeret FERM P-8043 (deponeringsdato 12. januar 1985) og er derefter den 19. oktober 1985 blevet konverteret til deponering i henhold til Budapest-traktaten hos samme deponeringsmyndighed under det nye deponeringsnummer FERM BP-928.
25 Det er klart, at fremstillingen af FR-900520 og FR-900523 ikke er begrænset til anvendelsen af den bestemte organisme, der er beskrevet heri, og som kun er anført som eksempel. Opfindelsen angår også anvendelsen af alle mutanter, som er i stand til at producere stofferne FR-900520 og/eller FR-900523, herunder både naturlige mutanter 30 og kunstige mutanter, som kan fremstilles ud fra den beskrevne organisme ved konventionelle metoder såsom røntgenbestråling, ultraviolet bestråling, behandling med N-methyl-N'- nitro-N-nitrosoguanidin, 2-aminopurin og lignende.
DK 169550 B1 29
Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis nr. 7238 har følgende morfologiske, kulturmæssige, biologiske og fysiologiske egenskaber .
1) Morfologiske egenskaber: 5 Til denne taxonomiske undersøgelse blev der hovedsagelig benyttet de metoder, der er beskrevet af Shirling og Gottlieb (E.B. Shirling og D. Gottlieb, "Methods for characterization of Streptomyces species", International Journal of Systematic Bacteriology 16, 1966, s. 313-340).
10 Morfologiske iagttagelser blev foretaget med lys- og elektronmikroskoper på kulturer, der var dyrket ved 30°C i 14 dage på havremels-agar, gær/maltekstrakt-agar og uorganiske salte/stivelses-agar. De modne sporoforer var moderat korte og dannede Retinaculiaperti og spiraler med ca. 20 sporer i hver kæde. Der sås hygroskopisk spore-15 masse i luft-myceliet på havremelsagar og uorganiske salte/stivelses-agar. Overfladeuregelmæssigheder på sporerne var en mellemting mellem meget korte, tykke pigge og vorter.
2) Kulturkendetegn:
Kulturkendetegn blev observeret på ti typer medier som beskrevet af 20 Shirling og Gottlieb (loc.cit.) og af Waksman (S.A. Waksman, The
Actinomycetes, bind 2, "Classification, identification and description of genera and species", The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961).
Inkubation blev udført ved 30?C i 14 dage. De ved denne undersøgelse 25 anvendte farvenavne er baseret på Guide to Color Standard (manual udgivet af Nippon Shikisai Kenkyusho, Tokyo). Kolonier hørte til den grå farveserie, når de blev dyrket på havremelsagar, gær/maltekstrakt-agar og uorganiske salte/stivelses-agar. Der blev ikke dannet opløseligt pigment i de undersøgte medier. Resultaterne er 30 vist i tabel 4.
DK 169550 Bl 30 TABEL 4
Kulturkendetegn for stamme nr. 7238,
Streptomyces antimycoticus IFO 12839 og Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786 5 Kulturkendetegn
Medium Nr. 7238 IFO 12839 IFO 13786
Havremelsagar V Dårlig Dårlig Dårlig L Grålig gulbrun Grålig gul- Grålig gul- 10 brun brun U Svagt gul Svagt gul Svagt gul 0 Intet Intet Intet Gær/maltekstrakt- V Moderat Rigelig Moderat agar L Gråhvid Grå Grå 15 U Svagt gulbrun Svagt gul- Mørkorange brun 0 Intet Intet Intet
Uorganiske salte/ V Moderat Moderat Moderat stivelsesagar L Grå til sort Grå Lysegrå 20 U Mørk gul- Gulgrå Svagt gulorange orange 0 Intet Intet Intet
Glucose- V Moderat Moderat Moderat asparagin-agar L Gråhvid Grå Hvid 25 U Svagt gul- Svagt gul- Svagt gulorange orange orange O Intet Intet Intet
Glycerol- V Moderat Moderat Moderat asparagin-agar L Hvid Grå Lysegrå 30 U Gulgrå Gulgrå Grålig gul brun 0 Intet Intet Intet DK 169550 B1 31 TABEL 4 fortsat
Medium Nr. 7238 IFO 12839 IFO 13786
Czapek-agar V Moderat Moderat Moderat 5 L Gråhvid Gråhvid Hvid U Svagt gul- Svagt gul- Svagt gulbrun brun brun 0 Intet Intet Intet Næringsagar V Moderat Moderat Moderat 10 L Gråhvid Gråhvid Ingen U Svagt gul Svagt gul Svagt gul 0 Intet Intet Intet
Kartoffel/dextrose- V Moderat Moderat Moderat agar L Hvid, dårlig Svagt rød- Svagt lyse 15 brun rød til hvid U Svagt gul- Svagt gul- Svagt gulorange orange brun 0 Intet Intet Intet 20 Tyrosin-agar V Moderat Moderat Moderat L Hvid Gråhvid Grå til sort U Svagt gulbrun Brun Svagt gul brun 25 0 Intet Brun Intet
Pepton/gæreks- V Moderat Moderat Moderat trakt/jern-agar L Ingen Gråhvid Ingen U Svagt gul Svagt gul Farveløs 0 Intet Intet Intet 30 _________
Forkortelser: V = vækst L = farve på luftmasse U = farve på undersiden 0 = opløseligt pigment 32 DK 16955U Bl
Cellevæganalysen blev foretaget i henhold til de af Becker et al. samt Yamaguchi beskrevne metoder (B. Becker, M.P. Lechevalier, R.E.
Gordon og H.A. Lechevalier, "Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates", 5 Appl. Microbiol. 12, 1964, s. 421-423, og T. Yamaguchi, "Comparison of the cell wall composition of morphologically distinct Actinomyce-tes", J. Bacteriol. 89, 1965, s. 444-453). Analyse af helcelle-hy-r drolysater af stamme nr. 7238 viste tilstedeværelsen af LL-diamino-pimelinsyre. Følgelig antages cellevæggen hos denne stamme at være af 10 type I.
3) Biologiske og fysiologiske egenskaber
De fysiologiske egenskaber hos stamme nr. 7238 blev bestemt i henhold til de af Shirling og Gottlieb beskrevne metoder, som er nævnt ovenfor. Resultaterne er vist i tabel 5. Temperaturområde og optimal tem-15 peratur for vækst blev bestemt på gær/maltekstrakt-agar under anvendelse af en temperaturgradient-inkubator (fremstillet af Toyo Ka-gaku Sangyo Co., Ltd.). Temperaturområdet for vækst var 18-36°C med en optimal temperatur på 28°C. Stivelseshydrolyse og gelatine- væskedannelse var positive. Der dannedes intet melanoidpigment.
DK 169550 B1 33 TABEL 5
Fysiologiske egenskaber hos stamme nr. 7238 Streptomyces antimycoticus IFO 12839 og Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786 5 Fysiologiske egenskaber Nr. 7238 IFO 12839 IFO 13786
Temperaturområde for vakst 18-36°C 18-38eC 16-35°C
Optimal temperatur 28°C 28eC 27°G
Nitratreduktion Negativ Negativ Negativ 10 Stivelseshydrolyse Positiv Positiv Positiv Mælkekoagulation Negativ Negativ Negativ Mælkepeptonisering Negativ Negativ Positiv
Melanindannelse Negativ Negativ Negativ
Gelatine-væskedannelse Positiv Positiv Positiv 15 H2S-dannelse Negativ Negativ Negativ
Urease-aktivitet Negativ Negativ Negativ
NaCl-tolerans (%) 7%, 10% 7%, 10% 5%, 7%
Udnyttelsen af carbonkilder blev undersøgt i henhold til de af Prid-20 ham og Gottlieb beskrevne metoder (T.G. Pridham og D. Gottlieb, "The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination", J. Bacteriol. 56, 1948, s. 107-114). Væksten blev iagttaget efter 14 dages inkubation ved 30“C.
Carbonkilde-udnyttelsen hos denne stamme er vist summarisk i tabel 6.
25 D-Glucose, saccharose, lactose, maltose, D-trehalose, inositol, inu-lin og salicin kunne udnyttes af stamme nr. 7238.
34
UK I0300U D I
TABEL 6
Carbonkilde-udnyttelse hos stamme nr. 7238,
Streptomyces antimycoticus 1F0 12839 og Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786 5 Carbonkilder Nr. 7238 IFO 12839 IFO 13786 D-Glucose + + +
Saccharose + + +
Glycerol - + ΠΙΟ D-Xylose - ± + D-Fructose + +
Lactose + +
Maltose + - +
Rhamnose - + - 15 Raffinose -++ D-Galactose + + L-Arabinose ± ± D-Mannose - + + D-Trehalose + ± + 20 Inositol + + + D-Mannitol - + +
Inulin + + -
Cellulose ±
Salicin + + - 25 Chitin ± - -
Natriumcitrat - - ±
Natriumsuccinat + +
Natriumacetat - 30 Symboler: + = udnyttelse ± = tvivlsom udnyttelse = ingen udnyttelse
Mikroskopundersøgelser og analyse af cellevægssammensætningen i 35 stamme nr. 7238 viser, at denne stamme tilhører slægten Streptomyces Waksman og Henrici 1943.
DK 169550 B1 35 Følgelig blev der foretaget en sammenligning af denne stamme med forskellige Streptomyces-arter i lyset af de offentliggjorte beskrivelser (International Journal of Systematic Bacteriology 18, 1968, s. 69-189 og 279-392, og 19, 1969, s. 391-512, samt Bergey's Manual of 5 Deter minative Bacteriology, 8. udgave 1974).
Som et resultat af sammenligningen anses stamme nr. 7238 for at ligne Streptomyces antimycoticus Waksman 1957 og Streptomyces hygroscopicus subsp. glébosus Ohmori et al. 1962. Kulturkendetegnene for stamme nr. 7238 blev derfor yderligere sammenlignet med de tilsvarende stammer 10 Streptomyces antimycoticus IFO 12839 og Streptomyces hygroscopicus subsp. glébosus IFO 13786 som vist i tabel 4, 5 og 6 ovenfor. Ud fra yderligere sammenligninger kunne stamme nr. 7238 skelnes fra Streptomyces antimycoticus IFO 12839 og Streptomyces hygroscopicus subsp. glébosus IFO 13786 på følgende punkter.
15 i) Forskel fra Streptomyces antimycoticus IFO 12839
Kulturkendetegnene for stamme nr. 7238 er forskellige fra Streptomyces antimycoticus IFO 12839 på gær/maltekstrakt-agar, glucose/as-paragin-agar, glycerol/asparagin-agar, kartoffel/dextrose-agar og tyrosin-agar.
20 Med hensyn til carbonkildeudnyttelse kan stamme nr. 7238 udnytte maltose, hvorimod Streptomyces antimycoticus IFO 12839 ikke kan.
Desuden kan stamme nr. 7238 ikke udnytte glycerol, D-fructose, rham-nose, raffinose, D-galactose, D-mannose, mannitol og natriumsuccinat, medens Streptomyces antimycoticus IFO 12839 kan udnytte dem.
25 ii) Forskel fra Streptomyces hygroscopicus subsp. glébosus IFO 13786
Kulturkendetegnene for stamme nr. 7238 er forskellige fra Streptomyces hygroscopicus subsp. glébosus IFO 13786 på gær/maltekstrakt-agar, kartoffel/dextrose-agar og tyrosin-agar.
30 Mælkepeptonisering er negativ for stamme nr. 7238, men er positiv for Streptomyces hygroscopicus subsp. glébosus IFO 13786. Stamme nr. 7238 36
UIV. I O57 O OU 13 I
kan vokse i nærværelse af 7% NaCl, hvorimod Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786 ikke kan vokse under samme betingelse.
Med hensyn til carbonkildeudnyttelse kan stamme nr. 7238 udnytte lactose, inulin og salicin, hvorimod Streptomyces hygroscopicus 5 subsp. glebosus IFO 13786 ikke kan udnytte dem. Stamme nr. 7238 kan ikke udnytte glycerol, D-xylose, D-fructose, raffinose, D-galactose, D- mannose, mannitol og natriumsuccinat, men Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786 kan udnytte dem.
Stamme nr. 7238 danner imidlertid hygroskopisk sporemasse i luft-10 myceliet på havremelsagar og uorganiske salte/stivelses-agar, og endvidere er de morfologiske og kulturmæssige kendetegn for stamme nr.
7238 meget lig kendetegnene for Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786. Derfor anses stamme nr. 7238 for at tilhøre Streptomyces hygroscopicus, men stamme nr. 7238 er forskellig fra 15 Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus IFO 13786, selv om denne kendte stamme er den, der ligner stamme nr. 7238 mest af Streptomyces hygroscopicus-underarterne. Ud fra ovennævnte fakta anses stamme nr. 7238 for at være en ny art af Streptomyces hygroscopicus og har fået betegnelsen Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis 20 subsp. nov. under henvisning til den jord, der blev indsamlet i Yakushima, og fra hvilken organismen er isoleret.
Fremstilling af stofferne FR-900520 og FR-900523 FR-900520 og det hidtil ukendte stof FR-900523 kan fremstilles ved at dyrke en stamme, der producerer stofferne FR-900520 og FR-900523, og 25 som tilhører arten Streptomyces (fx Streptomyces hygro scopicus subsp. yakushimaensis nr. 7238, FERM BP-928), i et næringsmedium.
Generelt kan stofferne FR-900520 og/eller FR-900523 fremstilles ved at dyrke den stamme, der producerer stofferne FR-900520 og/eller FR-900523, i et vandigt næringsmedium, der indeholder kilder til assimi-30 lerbart carbon og nitrogen, fortrinsvis under aerobe betingelser (fx rystekultur, submers kultur, etc.).
DK 169550 B1 37
De foretrukne carbonkilder i næringsmediet er carbonhydrater såsom glucose, saccharose, lactose, glycerol, stivelse, dextrin og lignende. Andre kilder, som kan inkorporeres, er maltose, D-trehalose, inositol, inulin, salicin og lignende.
5 De foretrukne nitrogenkilder er gærekstrakt, pepton, glutenmel, bomuldsfrømel, sojabønnemel, majsstøbevand, tørgær, hvedekim, fjermel ("feather meal"), jordnøddepulver, etc., samt uorganiske og organiske nitrogenforbindelser såsom ammoniumsalte (fx ammoniumnitrat, ammoniumsulfat, ammoniumphosphat, etc.), urinstof, aminosyrer og lignende.
10 Carbon- og nitrogenkilderne behøver ikke, selv om de med fordel anvendes i kombination, at blive anvendt i deres rene form, da mindre rene materialer, der indeholder spor af vækstfaktorer og betydelige mængder mineralske næringsstoffer, også er egnede til anvendelse.
Hvis det ønskes, kan der til mediet sættes mineralsalte såsom natri-15 um- eller calciumcarbonat, natrium- eller kaliumphosphat, natriumeller kaliumchlorid, natrium- eller kaliumiodid, magnesiumsalte, kobbersalte, cobaltsalt og lignende. Hvis det er nødvendigt, især hvis dyrkningsmediet skummer meget, kan der tilsættes et antiskummid-del såsom flydende paraffin, en fed olie, vegetabilsk olie, mineral-20 olie eller silicone.
Submerse aerobe dyrkningsbetingelser foretrækkes som betingelser for fremstillingen af stofferne FR-900520 og FR-900523 i store mængder.
Til produktion i små mængder anvendes en ryste- eller overfladekultur i en kolbe eller flaske. Når dyrkningen udføres i store tanke, fore-25 trækkes det endvidere at anvende den vegetative form af organismen til inokulering i produktionstankene for at undgå forsinket vækst under produktionen af stofferne FR-900520 og FR-900523. Det er således ønskeligt først at fremstille et vegetativt inokulum af organismen ved inokulation af en relativt lille mængde dyrkningsmedium med 30 sporer eller mycelier af organismen og dyrke dette inokulerede medium og derefter overføre det dyrkede vegetative inokulum aseptisk til store tanke. Det medium, i hvilket det vegetative inokulum fremstilles, er i det væsentlige det samime som eller er forskelligt fra det medium, der anvendes til fremstilling af stofferne FR-900520 og 35 FR-900523.
DK 169550 Bl 38
Agitation og beluftning af dyrkningsblandingen kan foretages på flere forskellige måder. Agitation kan foretages med en omrører eller et lignende mekanisk agitationsudstyr, ved at dreje eller ryste fermenteringsbeholderen, med forskelligt pumpeudstyr eller ved at lede 5 steril luft gennem mediet. Beluftning kan udføres ved at lede steril luft gennem fermenteringsblandingen.
Fermenteringen udføres sædvanligvis ved en temperatur på ca. 20-40eC, fortrinsvis 25-35°C, i ca. 50-150 timer, hvilket kan varieres afhængigt at fermenteringsbetingelserne og -målestokken.
10 De således fremstillede stoffer FR-900520 og/eller FR-900523 kan isoleres fra dyrkningsmediet ved konventionelle metoder, der sædvanligvis anvendes til isolering af andre kendte biologisk aktive stoffer. De fremstillede stoffer FR-900520 og FR-900523 findes hovedsagelig i det dyrkede mycelium, og følgelig kan stofferae FR-900520 15 og FR-900523 isoleres og oprenses fra myceliet, som fås efter filtrering eller centrifugering af dyrkningsvæsken, ved en sædvanlig metode såsom koncentration under reduceret tryk, lyofilisering, ekstraktion med et sædvanligt opløsningsmiddel, pH-indstilling, behandling med en sædvanlig harpiks (fx anion- eller katioribytter-20 harpiks, ikke-ionisk adsorptionsharpiks, etc.), behandling med en sædvanlig adsorbent (fx aktivkul, kiselsyre, silicagel, cellulose, aluminiumoxid, etc.), krystallisation, omkrystallisation og lignende.
Stofferne FR-900520 og FR-900523 kan især fraskilles ved at opløse de materialer, der indeholder begge produkter fremstillet ved fermente-25 ring, i et hensigtsmæssigt opløsningsmiddel såsom ethylacetat, n-h.exan og lignende, hvorefter denne opløsning underkastes chroma-tografi, fx på silicagel i en søjle med et hensigtsmæssigt organisk opløsningsmiddel såsom ethylacetat og n-hexan eller en blanding deraf. Hvert af de således fraskilte stoffer FR-900520 og FR-900523 30 kan oprenses yderligere ved en konventionel'metode, fx omkrystallisation, re-chromatografi, højtryksvæskechromatografi og lignende.
DK 169550 B1 39
Fysiske og kemiske egenskaber af stofferne FR-900520 og FR-900523
Stoffet FR-900520 1) Form og farve:
Farveløse plader 5 2) Elementaranalyse: C 64,81 H 8,82 N 1,55 3) Farvereaktion:
Positiv: ceriumsulfatreaktion, svovlsyrereaktion, Ehrlich- reaktion, Dragendorff-reaktion og ioddampreaktion.
10 Negativ: ferrichloridreaktion, nirihydrinreaktion og Molish- reaktion.
4) Opløselighed:
Opløseligt: methanol, ethanol, acetone, ethylacetat, chloro form, diethylether og benzen.
15 Tungt opløseligt: hexan, petroleumsether.
Uopløseligt: vand.
5) Smeltepunkt: 163-165°C.
20 6) Specifik rotation: [a]p3 - -84,1° (c - 1,0 i CHC13).
7) Ultraviolet absorptionsspektrum:
Endeabsorption 8) Infrarødt absorptionsspektrum: (CHCI3): vmav - 25 3680, 3575, 3520, 2940, 2875, 2825, 1745, 1725, 1700, 1647., 1610 (skulder), 1452, 1380, 1350, 1330, 1285, 1170, 1135, 1090, 1030, 1005, 990, 980 (skulder), 960 (skulder), 913 og 908 (skulder) cm*l.
DK 169550 ΒΊ 40 9) ^C-NMR-spektrum (CDCI3): δ (ppm) = 213,04 (s), 196,21 (s) + 193,23 (s), 169,07 (s) + 168,85 (s), 164,92 (s) + 165,97 (s), 138,67 (s) + 139,53 (s), 132,46 (s) + 131,98 (s), 130,20 (d) + 130,08 (d), 123,42 (d) + 123,59 (d), 5 97,28 (s) + 98,75 (s), 84,37 (d), 77,80 (d) + 78,24 (d), 75,53 (d) + 76,98 (d), 73,92 (d), 73,69 (d), 73,11 (d) + 72,72 (d), 70,11 (d) + 69,21 (d), 57,02 (q), 56,60 (q) + 57,43 (q), 56,23 (q) + 55,98 (q), 56,72 (d) + 52,91 (d), 55,10 (d) + 54,90 (d), 48,90 (t) + 48,57 (t), 40,19 (d) + 40,63 (d), 27,67 (t) + 10 26,32 (t), 26,51 (d) + 26,44 (d), 24,60 (t), 21,19 (t) + 20,86 (t), 20,47 (q) + 19,75 (q), 16,21 (q) + 15,97 (q), 15,83 (q) + 15,94 (q), 14,04 (q) + 14,16 (q), 11,68 (q), 9,64 (q) + 9,93 (q), hvilket spektrum er vist i fig. 7.
15 10) ^H-NMR-spektrum: er vist i fig. 8.
11) Tyndtlagschromatografi:
Stationær fase Elueringsopløs- Rf-værdier ningsmiddel 20 _
Silicagelplade Chloroform/methanol 0,38 (20:1, vol/vol)
Ethylacetat 0,51 25 12) Stoffets egenskab:
Neutralt stof.
Med hensyn til stoffet FR-900520 skal det bemærkes, at hvad angår 13 1 målinger af C- og •LH-NMR-spektre, udviser stoffet signalpar ved forskellige kemiske shift-værdier, og at det ved måling ved tyndt- 30 lagschromatografi og høj tryksvæskechromatografi viste henholdsvis en enkelt plet ved tyndtlagschromatografi og en enkelt top ved høj tryksvæskechromatograf i .
DK 169550 B1 41
Ud fra ovenstående fysiske og kemiske egenskaber og den vellykkede bestemmelse af stoffet FR-900506's kemiske struktur kunne det bestemmes, at stoffet FR-900520 har følgende kemiske struktur: CH3°AA. ^
Cl /° °h ^ y^]f i[ ®2ch3 I^OH \ 3 CH3Y^O k kJL ch3 och3 och3 17-Ethyl-1,14-dihydroxy-12-[2-(4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl)- 5 1-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11, 28 - 4 9 dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]octacos-18-en-2,3,10,16-tetra-on.
Stoffet FR-900523 1) Form og farve: 10 Farveløse nåle.
2) Elementaranalyse: C 64,57 H 8,84 N 1,81 1
Farvereaktion:
Positiv: ceriumsulfatreaktion, svovlsyrereaktion, Ehrlich- 15 reaktion, Dragendorff-reaktion og ioddampreaktion.
Negativ: ferrichloridreaktion og ninhydrinreaktion.
42 4) Opløselighed:
Opløseligt: methanol, ethanol, acetone, ethylacetat, chloroform, diethylether og benzen.
Tungt 5 opløseligt: n-hexan og petroleumsether.
Uopløseligt: vand.
5) Smeltepunkt: 152-154°C.
6) Specifik rotation: 10 [a]p1 = -73,0° (c - 0,65 i CHCl3).
7) Ultraviolet absorptionsspektrum:
Endeabsorption.
8) Infrarødt absorptionsspektrum (CHCI3): 1/ y - 3670, 3580, 3510, 2930, 2875, 2825, 1745, 1722, 1700, 1647, 15 1450, 1380, 1350, 1330, 1307, 1285, 1170, 1135, 1090, 1050, 1030, 1000, 990, 978, 960, 930, 915, 888, 870 og 850 cm-1.
9) ^1C-NMR-spektrum (CDCI3): δ (ppm) - 213,82 (s) + 213,32 (s), 196,31 (s) + 193,34 (s), 168,96 (s) + 168,85 (s), 164,84 (s) + 165,98 (s), 137,80 (s) + 138,41 (s), 20 132,89 (s) + 131,96 (s), 129,62 (d) + 130,03 (d), 124,51 (d) + 124,84 (d), 97,13 (s) + 98,67 (s), 84,38 (d), 76,69 (d) + 78,06 (d), 75,45 (d) + 76,91 (d), 73,89 (d) + 73,70 (d), 73,70 (d), 73,09 (d) + 72,84 (d), 70,40 (d) + 69,24 (d), 56,75 (d) + 52,89 (d), 56,93 (q) + 57,43 (q), 56,61 (q) + 56,56 (q), 56,24 25 (q) + 55,94 (q), 48,58 (t) + 48,32 (t), 47,14 (d) + 47,38 (d), 40,23 (d) + 40,65 (d), 27,85 (t) + 26,32 (t), 26,48 (d) + 26,64 (d), 24,68 (t), 21,33 (t) + 20,83 (t), 20,63 (q) + 19,77 (q), 16,24 (q) + 16,34 (q), 15,70 (q) + 15,96 (q), 15,51 (q) + 15,96 (q), 14,31 (q) + 14,18 (q), 9,64 (q) + 10,04 (q), 30 hvilket spektrum er vist i fig. 9.
10) ^H-NMR-spektrum er vist i fig. 10.
DK 169550 B1 43 11) Tyndtlagschromatografi:
Stationær fase Elueringsopløs- Rf-værdier ningsmiddel 5 Silicagelplade Chloroform/methanol 0,38 (20:1, vol/vol)
Ethylacetat 0,51 12) Stoffets egenskab: 10 Neutralt stof.
Med hensyn til stoffet FR-900523 skal det bemærkes, at hvad angår målinger af ^C- og ^H-NMR-spektre, udviser stoffet signalpar ved forskellige kemiske shift-værdier, og at det ved måling ved tyndtlagschromatografi og højtryksvæskechromatografi viste henholdsvis en 15 enkelt plet ved tyndtlagschromatografi og en enkelt top ved høj tryksvæskechromatograf i .
Ud fra ovenstående fysiske og kemiske egenskaber og den vellykkede bestemmelse af stoffet FR-900506's kemiske struktur kunne det bestemmes, at stoffet FR-900523 har følgende kemiske struktur:
"XX
fflrLL-y0
Cy9«, °*|3 L^oh \ 3
CH3 K
3 TY Acbj 0CH3 OCH3 44 1,14-Dihydroxy-12-[2-(4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methyl- vinyl] -23,25-dimethoxy-13,19,17,21,27-pentamethyl-ll,28-dioxa- 4 9 4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon II) Syntetiske processer 5 Proces 1 (indføring af hydroxybeskyttelsesgruppe)
Forbindelsen med den almene formel Ib kan fremstilles ved indføring af en hydroxybeskyttelsesgruppe i forbindelsen med den almene formel la.
Egnede midler, der ved denne reaktion kan anvendes til indføring af 10 hydroxybeskyttelsesgruppen, kan være konventionelle midler såsom di(lavere alkyl)sulfoxid, fx lavere alkylmethylsulfoxid (fx dimethyl-sulfoxid, ethylmethylsulfoxid, propylmethylsulfoxid, isopropylmethyl-sulfoxid, butyImethylsulfoxid, isobutylmethylsulfoxid, hexylmetyl-sulfoxid, etc.), en trisubstitueret silylforbindelse såsom tri(lavere 15 alkyl)silylhalogenid (fx trimethylsilylchlorid, triethylsilylbromid, tributylsilylchlorid, tert.butyldimethylsilylchlorid, etc.), lavere alkyl-diarylsilylhalogenid (fx methyl-diphenylsilylchlorid, ethyl-diphenyls ilylbromid, propyl - di toly Is ilylchlor id, ter t. butyl - diphenyl -silylchlorid, etc.) samt et acyleringsmiddel, som er i stand til at 20 indføre den ovenfor nævnte acylgruppe, såsom carboxylsyre, sulfonsyre og reaktive derivater deraf, fx et syrehalogenid, et syrearihydrid, et aktiveret amid, en aktiveret ester og lignende. Foretrukne eksempler på sådanne reaktive derivater kan omfatte syrechlorid, syrebromid, et blandet syreanhydrid med en syre såsom substitueret phosphorsyre (fx 25 dialkylphosphorsyre, phenylphosphorsyre, diphenylphosphorsyre, diben-zylphosphorsyre, halogeneret phosphorsyre, etc.), dialkylphosphor-syre, svovlsyrling, thiosvovlsyre, svovlsyre, alkylcarbonat (fx methylcarbonat, ethylcarbonat, propylcarbonat, etc.), aliphatisk carboxylsyre (fx pivalinsyre, pentansyre, isopentansyre, 2-ethylsmør-30 syre, trichloreddike-trifluoreddikesyre, etc.), aromatisk carboxylsyre (fx benzoesyre, etc.), et symmetrisk syreanhydrid, et aktiveret syreamid med en heterocyclisk forbindelse indeholdende en iminofunk-tion såsom imidazol, 4-substitueret imidazol, dimethylpyrazol, tria-zol og tetrazol, en aktiveret ester (fx p-nitrophenylester, 2,4- DK 169550 B1 45 dinitrophenylester, trichlorphenylester, pentachlorphenylester, mesylphenylester, phenylazophenylester, phenylthioester, p-nitro-phenylthioester, p-cresylthioester, carboxymethylthioester, pyridyl-ester, piperidinylester, 8-quinolylthioester eller en ester med en 5 N-hydroxyforbindelse såsom Ν,Ν-dimethylhydroxylamin, l-hydroxy-2- (1H)-pyridon, N-hydroxysuccinimid, N-hydroxyphthalimid, 1-hydroxyben-zotriazol, 1-hydroxy-6-chlorbenzotriazol, etc.) og lignende.
I de tilfælde, hvor der anvendes et di(lavere alkyl)sulfoxid som middel til indføring af hydroxybeskyttelsesgruppen, udføres omsætningen 10 sædvanligvis i nærværelse af et lavere alkansyreahhydrid såsom eddi-kesyreanhydrid.
Såfremt der anvendes en trisubstitueret silylforbindelse som middel til indføring af hydroxybeskyttelsesgruppen, udføres omsætningen endvidere fortrinsvis i nærværelse af et konventionelt kondensations-15 middel såsom imidazol og lignende.
Såfremt der anvendes et acyleringsmiddel som middel til indføring af hydroxybeskyttelsesgruppen, udføres omsætningen ydermere fortrinsvis i nærværelse af en organisk eller uorganisk base såsom et alkalimetal (fx lithium, natrium, kalium, etc.), et jordalkalimetal (fx calcium, 20 etc.), et alkalimetalhydrid (fx natriumhydrid, etc.), et jordalkali-metalhydrid (fx calciumhydrid, etc.), et alkalimetalhydroxid (fx natriumhydroxid, kaliumhydroxid, etc.), et alkalimetalcarbonat (fx natriumcarbonat, kaliumcarbonat, etc.), et alkalimetalhydrogencarbo-nat (fx natriumhydrogencarbonat, kaliumhydrogencarbonat, etc.), et 25 alkalimetalalkoxid (fx natriummethoxid, natriumethoxid, kalium-tert. -butoxid, etc.), en alkalimetal-alkansyre (fx natriumacetat, etc.), en trialkylamin (fx triethylamin, etc.), en pyridinforbindelse (fx pyridin, lutidin, picolin, 4-N,N-dimethylaminopyridin, etc.), quino-lin og lignende.
30 Hvis acyleringsmidlet anvendes i fri form eller i form af et salt ved denne omsætning, udføres omsætningen fortrinsvis i nærværelse af et konventionelt kondensationsmiddel såsom en carbodiimidforbindelse (fx N,N' -dicyclohexylcarbodiimid, N-cyclohexyl-N' -(4-diethylaminocyclo-hexyl)carbodiimid, N,N'-diethylcarbodiimid, N,N'-diisopropylcarbodi- 46 imid, N-ethyl-N' - (3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, etc.)» en keten-iminforbindelse (fx N,N'-carbonyl-bis(2-methylimidazol), pentamethyl-enketen-N-cyclohexylimin, dipheny Ike t en - N - cy c 1 ohexy 1 imin, etc.)» en olefinisk eller acetylenisk etherforbindelse (fx ethoxyacetylen, 5 /3-cyclovinylethylether), en sulfonsyreester af et N-hydroxybenzotria-zolderivat (fx 1- (4-chlorbenzensulfonyloxy) -6-chlor-lH-benzotriazol, etc.) og lignende.
Omsætningen udføres sædvanligvis i et konventionelt opløsningsmiddel, som ikke påvirker reaktionen i ugunstig retning, såsom vand, acetone, 10 dichlormethan, alkohol (fx methanol, ethanol, etc.), tetrahydrofuran, pyridin, N,N-dimethylformamid, etc., eller en blanding deraf, og hvis basen eller midlet til indføring af hydroxybeskyttelsesgruppen er flydende, kan den eller det også anvendes som opløsningsmiddel.
Reaktions temperaturen er ikke kritisk, og omsætningen udføres sæd-15 vanligvis under temperaturbetingelser varierende fra afkøling til opvarmning.
Denne proces omfatter det tilfælde, hvor hydroxygruppen R2 i forbindelsen med den almene formel la undertiden under omsætningen kan omdannes til den tilsvarende beskyttede hydroxygruppe i forbindelsen 20 med den almene formel Ib.
Denne proces omfatter også det tilfælde, at når der anvendes et di(lavere alkyl)sulfoxid som middel til indføring af hydroxybeskyttelsesgruppen i nærværelse af et lavere alkansyreanhydrid, da kan forbindelsen med den almene formel la med en delstruktur med den 25 almene formel hvor R2 betegner hydroxy, undertiden oxideres i løbet af omsætningen, hvilket giver forbindelsen med den almene formel Ib med en delstruktur med den almene formel ir DK 169550 B1 47 hvor r2 betegner hydroxy.
Proces 2 (indføring af en hydroxybeskyttelsesgruppe)
Forbindelsen med den almene formel Id kan fremstilles ved indføring af en hydroxybeskyttelsesgruppe i forbindelsen med den almene formel 5 Ic.
Omsætningen kan udføres ved i det væsentlige samme fremgangsmåde som beskrevet under proces 1, og der henvises derfor til de under proces 1 beskrevne reaktionsbetingelser (fx base, kondensationsmiddel, opløsningsmiddel, reaktionstemperatur, etc.).
10 Denne proces omfatter det tilfælde, hvor hydroxygruppen R1 i den almene formel Ic i løbet af reaktionen ofte kan omdannes til den tilsvarende beskyttede hydroxygruppe i forbindelsen med den almene formel Id.
Proces 3 (dannelse af en dobbeltbinding) 15 Forbindelsen med den almene formel If kan fremstilles ved at omsætte forbindelsen med den almene formel le med en base.
En egnet base til anvendelse ved denne omsætning kan omfatte en base som eksemplificeret under proces 1.
Omsætningen kan også udføres ved at omsætte en forbindelse med den 20 almene formel le, hvor R^ betegner hydroxy, med et acyleringsmiddel i nærværelse af en base.
Omsætningen udføres sædvanligvis i et konventionelt opløsningsmiddel, som ikke påvirker reaktionen i ugunstig retning, såsom vand, acetone, dichlormethan, alkohol (fx methanol, ethanol, propanol, etc.), tetra-25 hydrofuran, pyridin, Ν,Ν-dimethylformamid, étc., eller en blanding deraf, og hvis basen endvidere er flydende, kan den også anvendes som opløsningsmiddel.
DK 169550 B1 48
Reaktions temperaturen er ikke kritisk, og omsætningen udføres sædvanligvis under temperaturbetingelser varierende fra afkøling til opvarmning.
Proces 4 (oxidation af hydroxyethylengruppen) 5 Forbindelsen med den almene formel Ih kan fremstilles ved at oxidere en forbindelse med den almene formel Ig.
Det ved denne omsætning anvendte oxidationsmiddel kan omfatte et di (lavere alkyl)sulfoxid såsom de, der er nævnt under proces 1.
Omsætningen udføres sædvanligvis i nærværelse af et lavere alkan-10 syreanhydrid såsom eddikesyreanhydrid i et konventionelt opløsningsmiddel, som ikke påvirker reaktionen i ugunstig retning, såsom acetone, dichlormethan, ethylacetat, tetrahydrofuran, pyridin, N,N-di-methylformamid, etc., eller en blanding deraf, og hvis det lavere al-kansyrearihydrid endvidere er flydende, kan det også anvendes som 15 opløsningsmiddel.
Reaktionstemperaturen er ikke kritisk, og omsætningen udføres sædvanligvis under temperaturbetingelser varierende fra afkøling til opvarmning .
Denne proces omfatter det tilfælde, hvor hydroxygruppen R^ i udgangs-20 forbindelsen med den almene formel Ig i løbet af omsætningen undertiden kan omdannes til en 1-(lavere alkylthio)-lavere alkyloxygruppe i forbindelsen med den almene formel Ih.
Proces 5 (reduktion af en allylgruppe)
Forbindelsen med den almene formel Ij kan fås ved reduktion af en 25 forbindelse med den almene formel li.
Reduktionen i denne proces kan udføres ved en konventionel metode, som er i stand til at reducere en allylgruppe til en propylgruppe, såsom katalytisk reduktion eller lignende.
DK 169550 B1 49
Egnede katalysatorer, som anvendes ved den katalytiske reduktion, er konventionelle katalysatorer såsom platinkatalysatorer (fx platinplade, platinsvamp, platinsort, kolloidt platin, platinoxid, platintråd, etc.), palladiumkatalysatorer (fx palladiumsvamp, palladium-5 sort, palladiumoxid, palladium/kul, kolloidt palladium, palladium/-bariumsulfat, palladium/bariumcarbonat, etc.), nikkelkatalysatorer (fx reduceret nikkel, nikkeloxid, Raney-nikkel, etc.), cobaltkataly-satorer (fx reduceret cobalt, Raney-cobalt, etc.), jernkatalysatorer (fx reduceret jern, Raney-jem, etc.), kobberkatalysatorer (fx redu-10 ceret kobber, Raney- kobber, Ullman-kobber, etc.) og lignende.
Reduktionen udføres sædvanligvis i et konventionelt opløsningsmiddel, som ikke påvirker reaktionen i ugunstig retning, såsom vand, methanol, ethanol, propanol, pyridin, ethylacetat, N,N-dimethylformamid, dichlormethan eller en blanding deraf.
15 Reaktionstemperaturen ved reduktionen er ikke kritisk, og omsætningen udføres sædvanligvis under temperaturbetingelser varierende fra afkøling til opvarmning.
De omhandlede tricycloforbindelser med den almene formel I, der fås ved ovenstående syntese-processer 1-5, kan isoleres og oprenses på 20 konventionel måde, fx ved ekstraktion, udfældning, fraktioneret krystallisation, omkrystallisation, chromatografi og lignende.
Egnede salte af forbindelserne med de almene formler I og Ib-Ij kan omfatte farmaceutisk acceptable salte såsom basissalte, fx alkalimetalsalte (fx natriumsalt, kaliumsalt, etc.), jordalkalimetalsalte 25 (fx calciumsalt, magnesiumsalt, etc.), ammoniumsalt, aminsalte (fx triethylaminsalt, N-ben2yl-N-methylaminsalt, etc.) og andre konventionelle organiske salte.
Det skal bemærkes, at ved ovenstående omsætninger i syntese-processerne 1-5 eller ved efterbehandlingen af den dertil anvendte reak-30 tionsblanding, kan conformeren og/eller én eller flere stereoiso-merer på grund af ét eller flere asymmetriske carbonatomer eller én eller flere dobbeltbindinger i udgangs- og slutforbindelserne under- DK 169550 B1 50 tiden omdannes til den anden conformer og/eller den eller de andre stereoisornerer.
Tricycloforbindelserne med den almene formel I ifølge opfindelsen har farmakologisk aktivitet såsom immunosuppressiv aktivitet, antimikro-5 biel aktivitet og lignende og er derfor nyttige til behandling og forebyggelse af rejektion ved transplantation af organer eller væv såsom hjerter, nyrer, levere, rygmarv, hud, etc., "graft-versus-host"-sygdomme ved rygmarvs transplantation, autoimmune sygdomme såsom rheumatoid arthritis, systemisk lupus erythematosus, Hashimotos 10 thyroiditis, dissemineret sclerose, myasthenia gravis, type I diabetes , uveitis, etc., infektionssygdomme, der er forårsaget af patogene mikroorganismer, og lignende.
Det har overraskende vist sig, at forbindelsen FR-900525 er nyttig til behandling og forebyggelse af rejetion ved "graft-versus-host" 15 sygdomme ved knoglemarvstransplantation.
Som eksempler til påvisning af sådanne farmakologiske aktiviteter er der i det følgende angivet nogle farmakologiske testdata for tricycloforbindelserne .
Test 1 20 Suppression forårsaget af tricycloforbindelserne I ved in vitro blandet lymfocyt-reaktion (MLR) MLR-Testen blev udført på mikrotiterplader, hvor hver brønd indeholdt 5 x 105 C57BL/6-responder-celler (H-2^), 5 x 105 mitomycin C- behandlede (25 μg/ml mitomycin C ved 37“C i 30 minutter og vasket 3 gange 25 med RPMI 1640-medium) BALB/C-stimulatorceller (H-2^) i 0,2 ml RPMI 1640-medium beriget med 10% føtalt kalveserum, 2 mM natriumhydrogen-carbonat, 50 eriheder/ml penicillin og 50 ^g/ml streptomycin. Cellerne blev inkuberet ved 37“C i en fugtig atmosfære med 5% carbondioxid og 3
95% luft i 68 timer og radioaktivt mærket med 0,5 /iCi H-thymidin 4 30 timer før isolering af cellerne. Den omhandlede forbindelse ifølge opfindelsen blev opløst i ethanol og yderligere fortyndet i RPMI
DK 169550 B1 51 1640-medium og sat til kulturerne, hvilket gav slutkoncentrationer på 0,1 jug/ml eller derunder.
Resultaterne er vist i tabel 7-11. Tricycloforbindelserne ifølge opfindelsen og FR-900520 undertrykte muse-MLR.
5 TABEL 7
Virkning af stoffet FR-900506 på MLR FR-900506-kon- Radioaktivitet Suppression IC^ centration (ng/ml) (gnms. CPM±SE) (%) (ng/ml) 10 2,5 54 ± 4 99,5 1,25 168 ± 23 98,3 0,625 614 ± 57 93,8 0,313 3880 ± 222 60,9 0,26 0,156 5490 ± 431 44,7 15 0,078 7189 ± 365 27,6 0 9935 ± 428 TABEL 8
Virkning af stoffet FR-900520 på MLR 20 FR-900520-kon- Radioaktivitet Suppression IC^ centration (ng/ml) (gnms. CPM1SE) (%) (ng/ml) 100 175 ±16 99,2 10 515 ±55 97,8 25 1 2744 ± 527 88,1 0,38 0,500 9434 ± 1546 59,2 0,25 14987 ± 1786 35,1 0 23106 ± 1652 0 DK 169550 B1 52 TABEL 9
Virkning af stoffet FR-900523 på MLR
FR-900523-kon- Radioaktivitet Suppression IC^ centration (ng/ml) (grans. CPM+SE) (%) (ng/ml) 5 _ 100 25 ± 12 99,9 10 156 ±37 99,3 1 5600 ± 399 75,8 0,5 0,500 11624 ± 395 49,7 10 0,250 17721 ± 1083 23,3 0 23106 ± 1052 0 TABEL 10
Virkning af stoffet FR-900525 på MLR 15 FR-900525-kon- Radioaktivitet Suppression IC^-q centration (ng/ml) (grans. CPM±SE) (%) (ng/ml) 100 469 ± 56 97,0 10 372 ±32 97,6 20 5 828 ± 369 94,7 1,55 2,5 3564 ± 512 77,4 1,2 10103 ± 421 35,8 0 15741 ± 411 DK 169550 B1 53 TABEL 11
Virkning af tricycloforbindelser I og stoffet FR-900520 på MLR.
Eks. R1 R2 R3 n IC5o nr. * 1.2.3 HO- HO- -CH2CH=CH2 2 0.26 4,22 HO- HO- -CH2CH3 2 0,38 4 HO- Ha -ch3 ^ 2 05 1.2.3 HO- Ha -CH2CH=CH2 1 1,55 5 CH3COO- Ha -CH2CH=CH2 2 0,28 6 CH3coa CH3coa -ch2ch=ch2 y^ M * 6 ch3coo- h -ch2ch=ch2 Y^ 2 1,55 13 p-IC6H4S03- Ha -ch2ch=ch2 2 94 12 H00CH2CH2C02- Ha -ch2ch=ch2 γ\ M » 4 HO- Ha -ch2ch2ch3 Y^ 2 0,76 DK 169550 B1 54
Test 2
Antimikrobiel aktivitet af tricycloforbindelser
Den antimikrobielle aktivitet af tricycloforbindelser mod forskellige fungi blev bestemt ved en agar-seriefortyndingsmetode i en Sabouraud-5 agar. Minimale inhiberende.koncentrationer (MIC) blev udtrykt som /xg/ml efter inkubation ved 30®C i 24 timer.
Tricycloforbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse udviste antimikrobiel aktivitet mod fungi, fx Aspergillus fumigatus IFO 5840 og Fusarium oxysporum IFO 5942, hvilket er vist i nedenstående tabel 10 12 og 13.
TABEL 12 MIC-Værdier (/jg/ml) af tricycloforbindelserne I mod Aspergillus fumigatus IFO 5840 Stof MIC (/ig/ml) 15 FR-900506 0,025 FR-900520 0,1 FR-900523 0,3 FR-900525 0,5 20 _ TABEL 13 MIC-Værdier (μζ/ml af tricycloforbindelserne I mod Fusarium oxysporum Stof MIC (/tg/ml) 25 _ FR-900506 0,05 FR-900525 1
Test 3 30 Virkning af tricycloforbindelserne I på hudallotransplantat-over-levelse hos rotter DK 169550 B1 55
Ventrale allotransplantater fra donorrotter (Fischer) blev transplanteret på det laterale thorax-område på modtagerrotter (WKA). Forbindingerne blev fjernet på dag 5. Transplantaterne blev undersøgt daglig indtil afstødning, hvilket blev defineret som mere end 90% 5 nekrose af transplantatets epitel.
Stoffet FR-900506 blev opløst i olivenolie og administreret intramu-skulært i 14 på hinanden følgende dage, idet man begyndte på transplantationsdagen .
Det fremgår af tabel 14, at alle hudallotransplantater blev afstødt 10 inden for 8 dage hos rotter, der var behandlet med olivenolie intra-muskulært i 14 på hinanden følgende dage, medens daglig behandling med stoffet FR-900506 klart forlængede hudallotransplantaternes overlevelsestid, TABEL 14 15 Virkning af stoffet FR-900506 på hudallo transp lantat - overlevelse Dosis Antal dyr Hudallotransplantat (mg/kg) overlevelsesdag 20 Kontrol - 11 7,7,7,7,7,7,8,8,8,8,8 (olivenolie)
Stoffet 1 8 19,19,19,20,21,21,22,22 FR-900506 3,2 6 22,23,23,26,27,35 10 5 56,61,82,85,89 25 _
Test U
Virkning af tricycloforbindelserne I på type II collagen-induceret arthritis hos rotter
Collagen blev opløst i 0,01 M kold eddikesyre i en koncentration på 30 2 mg/ml. Opløsningen blev emulgeret i et lige så stort volumen DK 169550 B1 56
Freund's ukomplette adjuvans. Et samlet volumen på 0,5 ml af den kolde emulsion blev injiceret intradermalt forskellige steder på ryggen og på ét eller to steder på halen af Lewis-hunrotter. Stoffet FR-900506 blev opløst i olivenolie og administreret oralt. Kontrol-5 rotter, der var immuniseret med den samme mængde type Il-collagen, modtog orale administrationer af olivenolie alene. Forekomst af arthritis blev observeret.
Testresultaterne er vist i tabel 15. Inflammatorisk polyarthritis blev induceret i alle de rotter, der var behandlet med olivenolie i 10 14 dage begyndende på samme dag som immuniseringen med type Il-colla gen.
Daglig behandling med stoffet FR-900506 i 14 dage gav fuldstændig suppression af arthritis-induktion i en observationsperiode på 3 uger.
15 TABEL 15
Virkning af stoffet FR-900506 på type II collagen-induceret arthritis hos rotter Dosis Forekomst af (mg/kg/dag) arthritis 20 _
Kontrol (olivenolie) - 5/5
Stoffet FR-900506 3,2 0/5 25 Test 5
Virkning af tricycloforbindelseme I på eksperimentelt fremkaldt allergisk encephalomyelitis (EAE) hos SJL/J-mus
Der blev fremstillet rygmarvshomogenater fra SJL/J-mus. Rygmarven blev fjernet ved insufflation, blandet med et omtrent lige så stort 30 volumen vand og homogeniseret ved 4°C. Et lige så stort volumen af dette kolde homogenat (10 mg/ml) blev emulgeret med Freund's komplette adjuvans (CFA) indeholdende 0,6 mg/ml Mycobacterium tuber culosis H37RA.
DK 169550 B1 57 EAE blev induceret ved to injektioner af 0,2 ml rygmarvs/CFA-emulsion på SJL/J-mus på dag 0 og dag 13. Alle de ved denne test anvendte mus blev bedømt daglig for kliniske tegn på EAE.
Alvoren af EAE blev bedømt i henhold til følgende kriterier: grad 1: 5 formindsket haletonus - grad 2: klodset gang - grad 3: svaghed i ét eller flere lemmer - grad 4: paraplegi eller hemiplegi.
Stoffet FR-900506 blev opløst i olivenolie og administreret oralt i 19 dage begyndende på dag 0 (dagen for den første immunisering). Det fremgår af tabel 16, at stoffet FR-900506 klart forhindrede udvikling 10 af kliniske tegn på EAE.
TABEL 16
Virkning af stoffet FR-900506 på eksperimentelt fremkaldt encephalomyelitis hos SJL/J-mus
Dosis Antal dyr med 15 (mg/kg) sygdom på dag 24
Kontrol (olivenolie) - 10/10
Stoffet FR-900506 32 0/5 20 Test 6
Virkning af tricycloforbindelseme I på lokal "graft-versus-host"-reaktion (GvHR) hos mus.
Levedygtige miltceller (1 x 10^ celler) fra C57BL/6-donorer blev injiceret subcutant i højre bagpote på BDF^-mus for at inducere lokal 25 GvHR. Musene blev aflivet 7 dage senere, og både de højre (injiceret pote) og de venstre (ikke-injiceret pote) popliteale lymfeknuder (PLN) blev vejet. GvHR blev udtrykt som vægtforskellen mellem højre og venstre PLN.
Stoffet FR-900506 blev opløst i olivenolie og administreret oralt i 5 30 dage begyndende på samme dag som sensibilisering.
DK 169550 B1 58 ED^q-Værdien af stoffet FR-900506 til forhindring af lokal "graft-versus-host"-reaktion var 19 mg/kg.
Test 7
Akut toxicitet af trieycloforbindelser 5 Der blev udført en test for akut toxicitet af stofferne FR-900506, FR-900520, FR-900523 og FR-900525 i ddY-mus ved intraperitoneal injektion, og der kunne ikke iagttages dødsfald ved en dosis på 100 mg/kg i noget tilfælde.
Det farmaceutiske præparat ifølge opfindelsen kan anvendes i form af 10 et farmaceutisk præparat, fx i fast, halvfast eller flydende form, der indeholder tricycloforbindelserne I ifølge den foreliggende opfindelse som aktiv bestanddel i blanding med en organisk eller uorganisk bærer eller excipiens, der er egnet til extern, enteral eller parenteral anvendelse. Den aktive bestanddel kan fx være blan-15 det med sædvanlige ikke-toxiske, farmaceutisk acceptable bærere for tabletter, pellets, kapsler, suppositorier, opløsninger, emulsioner, suspensioner og en hvilken som helst anden form, der er egnet til anvendelse. De bærere, som kan anvendes, er vand, glucose, lactose, acacia-gummi, gelatine, mannitol, stivelsespasta, magnesiumtrisili-20 cat, talkum, majsstivelse, keratin, kolloidt siliciumdioxid, kartoffelstivelse, urinstof og andre bærere, der er egnede til anvendelse ved fremstilling af præparater i fast, halvfast eller flydende form, og desuden kan der anvendes hjælpestoffer, stabilisatorer, fortyk-ningsmidler, farvestoffer og parfumer. Den aktive forbindelse inkor-25 poreres i det farmaceutiske præparat i en mængde, der er tilstrækkelig til at fremkalde den ønskede virkning på sygdommens forløb eller patientens tilstand.
Til administration af dette præparat til mennesker foretrækkes det at administrere det parenteralt eller enteralt. Selv om dosen af den 30 terapeutisk virksomme mængde af tricycloforbindelserne I varierer med og også afhænger af alderen og tilstanden af hver enkelt patient, der skal behandles, gives der generelt en daglig dosis på ca. 0,01-1000 DK 169550 Bl 59 mg,' fortrinsvis 0,1-500 mg og især 0,5-100 mg, af den aktive bestanddel til behandling af sygdomme, og der administreres generelt en gennemsnitlig enkeltdosis på ca. 0,5 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg og 500 mg, 5 Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler.
EKSEMPEL 1
Isolering af Streptoayces tsukubaensis nr. 9993
Streptomyces tsukubaensis nr. 9993 blev isoleret under anvendelse af fortyndingspladeteknikker som beskrevet i det følgende.
10 Ca. 1 g jord, som var indsamlet i Toyosato-cho, Tsukuba Gun, Ibaraki Prefecture, Japan, blev sat til et sterilt reagensglas, og volumenet blev bragt op på 5 ml med sterilt vand. Blandingen blev derefter grundigt blandet i 10 sekunder med en rørformet vibrator, og blandingen fortsattes i 10 minutter. Supernatanten blev successivt for-15 tyndet 100 gange med sterilt vand. Den fortyndede opløsning (0,1 ml) blev udpladet på Czapek-agar beriget med thiamin-hydrochlorid (30 g saccharose, 3 g natriumnitrat, 1 g dikaliumphosphat, 0,5 g magnesiumsulfat, 0,5 g kaliumchlorid, 0,01 g ferrosulfat, 0,1 g thiamin-hydrochlorid, 20 g agar, 1000 ml ledningsvand; pH-værdi 7,2) i en 20 Petri-skål. De voksende kolonier, der udviklede sig på pladerne efter 21 dages inkubation ved 30°C, blev overført til skråagar [gær/maltekstrakt-agar (ISP-medium 2)] og blev dyrket i 10 dage ved 30eC.
Blandt de isolerede kolonier kunne der findes Streptomyces tsukuba ensis nr. 9993.
25 Fermentering
Et dyrkningsmedium på 160 ml indeholdende 1% glycerol, 1% opløselig stivelse, 0,5% glucose, 0,5% bomuldsfrømel, 0,5% tørgær, 0,5% majs-støbevand og 0,2% calciumcarbonat (indstillet på pH 6,5) blev hældt i hver af 20 500 ml's Erlenmeyer-kolber og steriliseret ved 120°C i 30 30 minutter. En podeøjefuld skråagarkultur af Streptomyces tsukubaensis DK 169550 B1 60 nr. 9993, FERM BP-927, blev inokuleret i hvert af medierne og dyrket ved 30°C i 4 dage på et roterende rysteapparat. Den resulterende kultur blev inokuleret i et medium på 150 1 indeholdende 4,5% opløselig stivelse, 1% maj sstøbevand, 1% tørgær, 0,1% calciumcarbonat og 5 0,1% Adekanol™ (antiskummiddel fremstillet af Asahi Denka Co.) i en 200 liters krukke-fermentor, som i forvejen var blevet steriliseret ved 120°C i 20 minutter, og kulturen blev dyrket ved 30°C i 4 dage under beluftning med 150 1/minut og omrystning ved 250 omdr./minut.
Isolering og oprensning 10 Den således vundne dyrkningsvæske blev filtreret ved hjælp af 5 kg diatoméjord. Myceliekagen blev ekstraheret med 50 1 methanol, hvilket gav 50 1 ekstrakt. Methanolekstrakten fra myceliet og filtratet blev kombineret og ledt gennem en 10 liters søjle af en ikke-ionisk adsorptionsharpiks (Diaion1" HP-20, fremstillet af Mitsubishi Chemical 15 Industries Ltd.). Efter vask med 30 1 vand og 30 1 vandigt methanol blev der udført eluering med methanol. Eluatet blev inddampet vinder reduceret tryk, hvilket gav 2 1 restvand. Denne remanens blev ekstraheret med 2 1 ethylacetat. Ethylacetatekstrakten blev koncentreret under reduceret tryk til en olieagtig remanens. Den olieagtige rema-20 nens blev blandet med en to gange så stor vægtmængde sur silicagel (speciel silicagel, kvalitet 12, fremstillet af Fuji Devison Co.), og denne blanding blev opslæmmet i ethylacetat. Efter afdampning af opløsningsmidlet blev det resulterende tørre pulver underkastet søjlechromatografi på 800 ml af den samme sure silicagel, som var 25 pakket med n-hexan. Søjlen blev elueret med 3 1 n-hexan, en blanding af n-hexan og ethylacetat (9:1 vol/vol, 3 1 og 4:1 vol/vol, 3 1) og 3 1 ethylacetat. Fraktionerne indeholdende den ønskede forbindelse blev opsamlet og koncentreret under reduceret tryk til en olieagtig remanens. Den olieagtige remanens blev opløst i en blanding af n-he-30 xan og ethylacetat (1:1 vol/vol, 30 ml) og underkastet søjlechromatografi på 500 ml silicagel (fremstillet af Merck & Co., Ltd., 0,063-0,037 mm) pakket med samme opløsningsmiddelsystem.
Der blev udført eluering med en blanding af n-hexan og ethylacetat (1:1 vol/vol, 2 1 og 1:2 vol/vol, 1,5 1). Fraktioner indeholdende den 35 første omhandlede forbindelse blev opsamlet og koncentreret under DK 169550 B1 61 reduceret tryk til en gullig olie. Den olieagtige remanens blev blandet med to gange sin vægt af sur silicagel, og denne blanding blev opslæmmet i ethylacetat. Efter afdampning af opløsningsmidlet blev det resulterende tørre pulver chromatograferet på sur silicagel, 5 der var pakket og elueret med n-hexan. Fraktioner indeholdende den ønskede forbindelse blev opsamlet og koncentreret under reduceret tryk, hvilket gav 1054 mg råt FR-900506-stof i form af et hvidt pulver.
100 mg af dette råprodukt blev underkastet højtryksvæskechromato-10 grafi. Der blev udført eluering under anvendelse af en søjle (dia meter 8 x 500 mm) med Lichrosorb™ SI 60 (fremstillet af Merck & Co.) som bærer. Denne chromatografi blev overvåget med en UV-detektor ved 230 nm, og den mobile fase var en blanding af methylenchlorid og di-oxan (85:15 vol/vol) med en strømningshastighed på 5 ml/minut. De 15 aktive fraktioner blev opsamlet og inddampet. Højtryksvæskechromato-grafien blev gentaget, og dette gav 14 mg af det oprensede FR-900506-stof i form af et hvidt pulver.
Yderligere eluering blev kontinuerligt udført med 1,5 1 ethylacetat, og fraktioner indeholdende den anden ønskede forbindelse blev opsam-20 let og koncentreret under reduceret tryk, hvilket gav 30 mg råt FR-900525-stof i form af en gullig olie.
EKSEMPEL 2 Fermentering 100 ml af et forkulturmedium indeholdende 1% glycerol, 1% majsstivel-25 se, 0,5% glucose, 1% bomuldsfrømel, 0,5% majsstøbevand, 0,5% tørgær og 0,2% calciumcarbonat ved pH 6,5 blev hældt i en 500 ml's Erlen-meyer-kolbe og steriliseret ved 120eC i 30 minutter. En podeøjefuld skråagarkultur af Streptomyces tsukubaensis nr. 9993 blev inokuleret i mediet og dyrket ved 30®C i 4 dage. Den resulterende kultur blev 30 overført til 20 1 af samme forkulturmedium i en 30 liters krukke-fer-mentor, som i forvejen var blevet steriliseret ved 120®C i 30 minutter. Efter at kulturen var inkuberet ved 30°C i 2 dage, blev 16 1 af DK 169550 B1 62 forkulturen inokuleret i et 1600 liters fermenteringsmedium indeholdende 4,5% opløselig stivelse, 1% majsstøbevand, 1% tørgær, 0,1% calciumcarbonat og 0,1% Adekanol111 (antiskummiddel, fremstillet af Asahi Denka Co.) ved pH 6,8 i en 2 tons tank, som i forvejen var 5 blevet steriliseret ved 120°C i 30 minutter, og forkulturen blev dyrket ved 30°C i 4 dage.
Isolering og oprensning
Den således vundne dyrkningsvæske blev filtreret ved hjælp af 25 kg diatoméjord. Myceliekagen blev ekstraheret med 500 1 acetone, hvilket 10 gav 500 1 ekstrakt. Acetoneekstrakten fra myceliet og filtratet (1350 1) blev kombineret og ledt gennem en 100 liters søjle af en ikke-ionisk adsorptionsharpiks (Diaion* HP-20, fremstillet af Mitsubishi Chemical Industries Ltd.). Efter vask med 300 1 vand og 300 1 50%'s vandigt acetone blev der udført eluering med 75%'s vandigt 15 acetone. Eluatet blev inddampet under reduceret tryk, hvilket gav 300 1 restvand. Denne remanens blev ekstraheret med 3 x 20 1 ethyla-cetat. Ethylacet at ekstrakten blev koncentreret under reduceret tryk til en olieagtig remanens. Den olieagtige remanens blev blandet med en to gange så stor vægtmængde sur silicagel (speciel silicagel, 20 kvalitet 12, fremstillet af Fuji Devison Co.), og denne blanding blev opslæmmet i ethylacetat. Efter afdampning af opløsningsmidlet blev det resulterende tørre pulver underkastet søjlechromatografi på 8 1 af den samme sure silicagel, som var pakket med n-hexan. Søjlen blev elueret med 30 1 n-hexan, en blanding af n-hexan og ethylacetat (4:1 25 vol/vol, 30 1) og 30 1 ethylacetat. Fraktionerne indeholdende den ønskede forbindelse blev opsamlet og koncentreret under reduceret tryk til en olieagtig remanens. Den olieagtige remanens blev blandet med to gange sin vægt sur silicagel, og denne blanding blev opslæmmet i ethylacetat. Efter afdampning af opløsningsmidlet blev det resul-30 terende tørre pulver igen chromatograferet på 3,5 1 sur silicagel, der var pakket med n-hexan. Søjlen blev elueret med 10 1 n-hexan, en blanding af n-hexan og ethylacetat (4:1 vol/vol, 10 1) og 10 1 ethylacetat. Fraktioner indeholdende den ønskede forbindelse blev opsamlet og koncentreret under reduceret tryk, hvilket gav en gullig olie.
35 Den olieagtige remanens blev opløst i en blanding af n-hexan og ethylacetat (1:1 vol/vol, 300 ml) og underkastet søjlechromatografi DK 169550 B1 63 på 2 1 silicagel (fremstillet af Merck Co., Ltd., 0,063-0,037 mm) pakket med det samme opløsningsmiddelsystem. Der blev udført eluering med en blanding af n-hexan og ethylacetat (1:1 vol/vol, 10 1 og 1:2 vol/vol, 6 1) og 6 1 ethylacetat.
5 Fraktioner indeholdende den første ønskede forbindelse blev opsamlet og koncentreret under reduceret tryk, hvilket gav 34 g af stoffet FR-900506 i form af et hvidt pulver. Dette hvide pulver blev opløst i acetonitril og koncentreret under reduceret tryk. Dette koncentrat blev holdt ved 5°C natten over, og man fik 22,7 g prismer. Omkry-10 stallisation af samme opløsningsmiddel gav 13,6 oprenset FR-900506-stof i form af farveløse prismer.
Yderligere fraktioner indeholdende den anden ønskede forbindelse blev opsamlet og koncentreret under reduceret tryk, hvilket gav 314 mg råt FR-900525-stof i form af et gulligt pulver.
15 EKSEMPEL 3 Fermentering
Et dyrkningsmedium på 160 ml indeholdende 1% glycerol, 1% majsstivelse, 0,5% glucose, 1% bomuldsfrømel, 0,5% tørgær, 0,5% majsstøbevand og 0,2% calciumcarbonat (indstillet på pH 6,5) blev hældt i hver 20 af 10 500 ml's Erlenmeyer-kolber og steriliseret ved 120eC i 30 minutter. En podeøjefuld skråagarkultur af Streptomyces tsukubaensis nr. 9993 blev inokuleret i hvert af medierne og dyrket ved 30°C i 4 dage på et roterende rysteapparat. Den resulterende kultur blev inokuleret i et medium på 150 1 indeholdende 5% opløselig stivelse, 25 0,5% jordnøddepulver, 0,5% tørgær, 0,5% glutenmel, 0,1% calciumcarbo nat og 0,1% Adekanol™ (antiskummiddel fremstillet af Asahi Denka Co.) i en 200 liters krukke-fermentor, som i forvejen var blevet steriliseret ved 120°C i 20 minutter, og kulturen blev dyrket ved 30BC i 4 dage under beluftning med 150 1/minut og omrystning med 250 30 omdr. /minut.
DK 169550 B1 64
Isolering og oprensning
Den således vundne dyrkningsvæske blev filtreret ved hjælp af 5 kg diatoméjord. Myceliekagen blev ekstraheret med 50 1 acetone, hvilket gav 50 1 ekstrakt. Acetoneekstrakten fra myceliet og filtratet 5 (135 1) blev kombineret og ledt gennem en 10 liters søjle af en ikke- ionisk adsorptionsharpiks (Diaionw HP-20, fremstillet af Mitsubishi Chemical Industries Ltd.). Efter vask med 30 1 vand og 30 1 50%'s vandigt acetone blev der udført eluering med 75%'s vandigt acetone. Eluatet (30 1) blev inddampet under reduceret tryk, hvilket gav 2 1 10 restvand. Denne remanens blev ekstraheret med 3x21 ethylacetat. Ethylacetatekstrakten blev koncentreret under reduceret tryk til en olieagtig remanens. Den olieagtige remanens blev blandet med en to gange så stor vægtmængde sur silicagel (speciel silicagel, kvalitet 12, fremstillet af Fuji Devison Co.), og denne blanding blev opslæm-15 met i ethylacetat. Efter afdampning af opløsningsmidlet blev det resulterende tørre pulver underkastet søjlechromatografi på 800 ml af den samme sure silicagel, som var pakket med n-hexan. Søjlen blev elueret med 3 1 n-hexan, en blanding af n-hexan og ethylacetat (4:1 vol/vol, 3 1) og 3 1 ethylacetat. Fraktionerne indeholdende den 20 ønskede forbindelse blev opsamlet og koncentreret under reduceret tryk til en olieagtig remanens. Den olieagtige remanens blev opløst i en blanding af n-hexan og ethylacetat (1:1 vol/vol, 30 ml) og underkastet søjlechromatografi på 500 ml silicagel (fremstillet af Merck Co., Ltd., 0,063-0,037 mm) pakket med samme opløsningsmiddelsystem.
25 Der blev udført eluering med en blanding af n-hexan og ethylacetat (1:1 vol/vol, 2 1 og 1:2 vol/vol, 1,5 1) og 1,5 1 ethylacetat.
Fraktioner indeholdende den første ønskede forbindelse blev opsamlet og koncentreret under reduceret tryk til en gullig olie, hvilket gav 3-g råt FR-900506-stof i fonn af et gulligt pulver.
30 Yderligere fraktioner indeholdende den anden ønskede forbindelse blev opsamlet og koncentreret under reduceret tryk til en olieagtig remanens. Denne olieagtige remanens blev igen chromatograferet på silicagel, hvilket gav en gullig olie. Den olieagtige remanens blev blandet med to gange sin vægt sur silicagel, og denne blanding blev opslæmmet 35 i ethylacetat. Efter afdampning af opløsningsmidlet blev det resul- DK 169550 B1 65 terende tørre pulver chromatograferet på 100 ml sur silicagel pakket og elueret med n-hexan. Fraktioner indeholdende den ønskede forbindelse blev opsamlet og koncentreret under reduceret tryk, hvilket gav 380 mg FR-900525-stof i form af et svagt gulligt pulver. Dette pulver 5 blev opløst i en blanding af n-h'exan og ethylacetat (1:2 vol/vol, 5 ml) og udsat for 100 ml sur silicagel (speciel silicagel, kvalitet 922, fremstillet af Fuji Devison Co.) pakket og vasket med samme opløsningsmiddelsystem. Der blev udført eluering med ethylacetat. De aktive fraktioner blev opsamlet og inddampet under reduceret tryk, 10 hvilket gav 230 mg oprenset FR-900525-stof i form af et hvidt pulver.
EKSEMPEL 4
Isolering af Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis nr.
7238
Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis nr. 7238 blev iso-15 leret under anvendelse af fortyndingspladeteknikker som beskrevet i det følgende.
Ca. 1 g jord, som var indsamlet i Yakushima, Kagoshima Prefecture,
Japan, blev sat til et sterilt reagensglas, og volumenet blev bragt op på 5 ml med sterilt vand. Blandingen blev derefter grundigt blan-20 det i 10 sekunder med en rørformet vibrator, og blandingen fortsattes i 10 minutter. Supernatanten blev successivt fortyndet 100 gange med sterilt vand. Den fortyndede opløsning (0,1 ml) blev udpladet på Cza-pek-agar tilsat thiamin-hydrochlorid (30 g saccharose, 3 g natriumnitrat, 1 g dikaliumphosphat, 0,5 g magnesiumsulfat, 0,5 g kalium-25 chlorid, 0,01 g ferrosulfat, 0,1 g thiamin-hydrochlorid, 20 g agar, 1000 ml ledningsvand; pH-værdi 7,2) i en Petri-skål. De voksende kolonier, der udviklede sig på pladerne efter 21 dages inkubation ved 30°C, blev overført til skråagar [gær/maltekstrakt-agar (ISP-medium 2)] og blev dyrket i 10 dage ved 30eC. Blandt de .isolerede kolonier 30 kunne der findes Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis nr. 7238.
DK 169550 B1 66
Fermentering
Et dyrkningsmedium på 160 ml indeholdende 1% glycerol, 1% opløselig stivelse, 0,5% glucose, 0,5% bomuldsfrømel, 0,5% tørgær, 0,5% majs-støbevand og 0,2% calciumcarbonat (indstillet på pH 6,5) blev hældt i 5 hver af 20 500 ml's Erlenmeyer-kolber og steriliseret ved 120°C i 30 minutter. En podeøjefuld skråagarkultur af Streptomyces hygroscopi cus subsp. yakushimaensis nr. 7238, FERM BP-928, blev inokuleret i hvert af medierne og dyrket ved 30°C i 4 dage på et roterende rysteapparat. Den resulterende kultur blev inokuleret i et medium på 150 1 10 indeholdende 4,5% glucose, 1% majsstøbevand, 1% tørgær, 1% glutenmel, 0,5% hvedekim, 0,1% calciumcarbonat og 0,1% Adekanol™ (antiskummiddel fremstillet af Asahi Denka Co.) i en 200 liters krukke-fermentor, som i forvejen var blevet steriliseret ved 120°C i 20 minutter, og kulturen blev dyrket ved 30®C i 4 dage under beluftning med 150 1/minut 15 og omrystning ved 250 omdr./minut.
Isolering og oprensning
Den således vundne dyrkningsvæske blev filtreret ved hjælp af 5 kg diatoméjord. Myceliekagen blev ekstraheret med 50 1 acetone, hvilket gav 50 1 ekstrakt. Acetoneekstrakten fra myceliet og filtratet 20 (135 1) blev kombineret og ledt gennem en 10 liters søjle af en ikke- ionisk adsorptionsharpiks (Diaion™ HP-20, fremstillet af Mitsubishi Chemical Industries Ltd.). Efter vask med 30 1 vand og 30 1 vandigt acetone blev der udført eluering med acetone. Eluatet blev inddampet under reduceret tryk, hvilket gav 2 1 restvand. Denne remanens blev 25 ekstraheret med 4 1 ethylacetat. Ethylacetatekstrakten blev koncentreret under reduceret tryk til en olieagtig remanens. Den olieagtige remanens blev blandet med en to gange så stor vægtmængde sur silica-gel (speciel silicagel, kvalitet 12, fremstillet af Fuji Devison Co.), og denne blanding blev opslæmmet i ethylacetat. Efter afdamp-30 ning af opløsningsmidlet blev det resulterende tørre pulver underkastet søjlechromatografi på 800 ml af den samme sure silicagel, som var pakket med n-hexan. Søjlen blev elueret med 3 1 n-hexan, en blanding af n-hexan og ethylacetat (4:1 vol/vol, 3 1) og 3 1 ethylacetat. Fraktionerne indeholdende stofferne FR-900520 og FR-900523 35 blev opsamlet og koncentreret under reduceret tryk til en olieagtig DK 169550 B1 67 remanens. Den olieagtige remanens blev opløst i en blanding af n-hexan og ethylacetat (1:1 vol/vol, 50 ml) og underkastet søjlech-romatografi på 1000 ml silicagel (fremstillet af Merck Co., Ltd., 0,210-0,063 mm) pakket med samme opløsningsmiddelsystem. Der blev 5 udført eluering med en blanding af n-hexan og ethylacetat (1:1 vol/-vol, 3 1 og 1:2 vol/vol, 3 1) og 3 1 ethylacetat. Fraktioner indeholdende de ønskede forbindelser blev opsamlet og koncentreret under reduceret tryk, hvilket gav 4,5 g af et gulligt pulver. Dette pulver blev opløst i 20 ml methanol og blandet med 10 ml vand. Blandingen 10 blev chromatograferet på 500 ml reversfase-silicagel YMCW (0,250- 0,074 mm, fremstillet af Yamamura Chemical Institute), der var pakket og elueret med en blanding af methanol og vand (4:1 vol/vol).
Fraktioner indeholdende stoffet FR-900520 blev opsamlet og koncentreret under reduceret tryk, hvilket gav 1,8 g råprodukt af FR-900520-15 stof i form af et bleggult pulver. Dette pulver blev opløst i en lille mængde diethylether. Efter henstand natten over blev de udfældede krystaller opsamlet ved filtrering, vasket med diethylether og derefter tørret under reduceret tryk. Omkrystallisation af diethylether gav 600 mg oprenset FR-900520-stof i form af farveløse plader.
20 Der blev udført chromatografi på reversfase-silicagel med samme opløsningsmiddelsystem, og de resulterende fraktioner indeholdende stoffet FR-900523 blev opsamlet og koncentreret under reduceret tryk, hvilket gav 0,51 g råprodukt af FR-900523-stof i form af et bleggult pulver. Dette råprodukt blev opløst i 3 ml acetonitril og udsat for 25 70 ml reversfase-silicagel "IMC1", der var pakket og elueret med en blanding af acetonitril, tetrahydrofuran og 50 mM phosphatpuffer-opløsning (pH 2,0) (3:2:5 vol/vol). Fraktioner indeholdende den ønskede forbindelse blev opsamlet og ekstraheret med ethylacetat.
Denne ekstrakt blev koncentreret under reduceret tryk, hvilket gav 30 190 mg af et gulligt-hvidt pulver. Det gulligt-hvide pulver blev igen chromatograferet på reversfase-silicagel YMC™, hvilket gav 80 mg af et hvidt pulver. Dette hvide pulver blev opløst i en lille mængde, diethylether og lodes henstå natten over ved stuetemperatur, hvilket gav 56 mg krystaller. Omkrystallisation af diethylether gav 34 mg FR-35 900523-stof i form af farveløse nåle.
EKSEMPEL 5 68 DK 169550 B1
Til en opløsning af 10,4 mg FR-900506-stof i 0,2 ml dichlormethan sattes 0,1 ml pyridin og 0,05 ml eddikesyreanhydrid ved stuetemperatur, og blandingen blev omrørt i 5 timer. Opløsningsmidlet blev 5 fjernet fra reaktionsblandingen under reduceret tryk. Remanensen blev underkastet tyndtlagschromatografi på silicagel (elueringsopløsnings-middel: diethylether og dichlormethan, 1:2 vol/vol), hvilket gav 6,0 mg 12-[2-(4-acetoxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-17-allyl- 1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-ll,28-dioxa- 4 9 10 4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon.
IR-Spektrum (CHCI3): v = 3520, 1728, 1705 (skulder), 1640 og max 1095 cm"1.
EKSEMPEL 6
Til en opløsning af 52,5 mg FR-900506-stof i 1 ml dichlormethan 15 sattes 0,5 ml pyridin og 0,3 ml eddikesyreanhydrid ved stuetemperatur, og blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 9 timer. Opløsningsmidlet blev fjernet fra reaktionsblandingen under reduceret tryk. Remanensen blev underkastet tyndtlagschromatografi på silicagel (elueringsopløsningsmiddel: diethylether og hexan, 3:1 vol/vol), 20 hvilket gav henholdsvis 48,0 mg 14-acetoxy-12-[2-(4-acetoxy-3-meth- oxycyclohexyl) -1 -me thy lvinyl ] -17 - allyl -1 -hydroxy- 23,25- dimethoxy- 4 9 13,19,21,27-tetramethyl-ll,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]-oc-tacos-18-en-2,3,10,16-tetraon og 5,4 mg 12-[2-(4-acetoxy-3-methoxy-cyclohexyl)-1-methylvinyl]-17-allyl-1 -hydroxy-23,25-dimethoxy-25 13,19,21,27-tetramethyl-ll,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0^’^]oc- tacosa-14,18-dien-2,3,10,16-tetraon.
Førstnævnte forbindelse: IR-Spektrum (CHCI3): v = 1730, 1720 (skulder) og 1640 cm-^. Sidstnævnte forbindelse: DK 169550 B1 69 IR-Spektrum (CHCI3): 1/ = 1730, 1690, 1640 og 1627 cm'1.
EKSEMPEL 7
Til en opløsning af 9,7 mg FR-900506-stof i 0,2 ml dichlormethan og 0,1 ml pyridin sattes 50 μΐ benzoylchlorid ved stuetemperatur, og 5 blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 2 timer. Opløsningsmidlet blev fjernet fra reaktionsblandingen under reduceret tryk, hvilket gav en rå olie. Denne olie blev oprenset ved tyndslagtschromatografi på silicagel (elueringsopløsningsmiddel: diethylether og hexan, 2:1 vol/vol), hvilket gav 8,0 mg 17-allyl-12- [2-(4-benzoyloxy-3-methoxy-10 cyclohexyl)-1-methylvinyl]-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy- 4 9 13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ] oc-tacos-18-en- 2,3,10,16-tetraon.
IR-Spektrum (CHCI3): 1/ = 3500, 1735 (skulder), 1710, 1640 og
måX
1600 cm'1.
15 EKSEMPEL 8
Til en opløsning af 30,5 mg FR-900506-stof i 1 ml pyridin sattes ca.
100 mg p-nitrobenzoylchlorid, og blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 2 timer. Reaktionsblandingen blev fortyndet med ethyl-acetat og vasket successivt med mættet vandigt natriumhydrogencarbo-20 nat, vand, IN saltsyre, vand, mættet vandigt natriumhydrogencarbonat, vand og vandigt natriumchlorid og blev derefter tørret. Den resulterende opløsning blev koncentreret under reduceret tryk, og remanensen blev oprenset ved søjlechromatografi på silicagel, hvilket gav 37,7 mg 17-allyl-l,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetra- 25 methyl-12- [2- [4- (p-nitrobenzoyloxy) -3-methoxycyclohexyl] -1-methylvi- 4 9 nyl]-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]octacos-18-en- 2,3,10,16-tetraon.
IR-Spektrum (CHCI3): y = 1720, 1640, 1610 og 1530-1520 cm'1.
EKSEMPEL 9 70 DK 169550 B1
Der blev vundet 36,0 mg 17-allyl-l,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,- 19.21.27- tetramethyl-12-[2-[4-(3,5-dinitrobenzoyloxy)-3-methoxycyclo- 4 9 hexyl]-1-methylvinyl]-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]octacos-5 18-en-2,3,10,16-tetraon ved at omsætte 30,6 mg FR-900506-stof med 33 mg 3,5-dinitrobenzoylchlorid i 0,5 ml pyridin på samme måde som beskrevet i eksempel 8.
IR-Spektrum (CHCl3): ^^ = 1730. 1640, 1610> 1530-1520 cm'1.
EKSEMPEL 10 10 Der blev vundet 50,9 mg 17-allyl-l,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-12- [2-[4-(2-1-menthyloxyacetoxy)-3-methoxycyclohexyl]-1-methylvinyl]- 4 9 13.19.21.27- tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]oc-tacos-18-en-2,3,10,16-tetraon ved at omsætte 48 mg FR-900506-stof med 0,08 ml 2-1-menthyloxyacetylchlorid i 0,5 ml pyridin på samme 15 måde som beskrevet i eksempel 8.
IR-Spektrum (rent): vmav - 3520, 1760, 1740 (skulder), 1720 (skulder) og 1652 cm'l.
EKSEMPEL 11
Til en opløsning af 51 mg (-)-2-trifluormethyl-2-methoxy-2-phenyl-20 eddikesyre i 10 ml ethylacetat sattes ved stuetemperatur 47 mg N,N'-dicyclohexylcarbodiimid. Efter 1,5 times omrøring ved stuetemperatur blev der tilsat 25,0 mg FR-900506-stof og 11 mg 4- (N, N-dime thy lami-no)pyridin efterfulgt af omrøring ved stuetemperatur i 3,5 time. Den resulterende opløsning blev koncentreret til en remanens, som blev . 25 taget op i diethylether og derefter successivt vasket med saltsyre, vandigt natriumhydrogencarbonat og vandigt natriumchlorid. Den organiske fase blev tørret over natriumsulfat og koncentreret til en remanens, som blev chromatograferet på silicagel (elueringsopløs-ningsmiddel: dichlormethan og diethylether, 10:1 vol/vol), hvilket DK 169550 B1 71 gav. 6,5 mg 17-allyl-12-[2-[4-[(-)-2-trifluormethyl-2-methoxy-2-phe- nylacetoxy]-3-methoxycyclohexyl]-1-methylvinyl]-1,14-dihydroxy-23,25- dimethoxy- 13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo- [22.3.1.0^’^]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon og 20,2 mg 17-allyl-14- 5 [(-)-2-trifluormethyl-2-methoxy-.2-phenylacetoxy]-12-£2-[4-[(-)-2- trifluormethyl-2-methoxy-2-phenylacetoxyJ - 3-methoxycyclohexyl] -1 - methylvinyl]-1-hydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28- 4 9 dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon. Førstnævnte forbindelse: 10 IR-Spektrum (rent): f/max = 3510, 1750, 1730 (skulder), 1710, 1652 og 1500 cm~^.
Sidstnævnte forbindelse: IR-Spektrum (rent): ^max 1750, 1720, 1652 og 1500 cm"^-.
EKSEMPEL 12 15 Til en omrørt opløsning af 248 mg FR-900506-stof i 7 ml pyridin sattes 145 mg ravsyreanhydrid og 7 mg 4-(N,N-dimethylamino)pyridin, og den resulterende blanding blev omrørt ved stuetemperatur i 18 timer. Reaktionsblandingen blev koncentreret under reduceret tryk, og remanensen blev underkastet chromatografi på 20 g silicagel med 20 ethylacetat, hvilket gav 90 mg 17-allyl-12-[2-[4-(3-carboxypropiony-loxy) -3-methoxycyclohexyl] -1-methylvinyl] -1,14-dihydroxy-23,25-dime- thoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo- 4 9 [22.3.1.0 ’ ]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon.
IR-Spektrum (CHC13): v =3500, 3100-2300, 1720, 1705 (skulder) og
TUflX
25 1635 cm"1.
EKSEMPEL 13 72 DK 169550 B1
Til en opløsning af 100,7 mg FR-900506-stof i 3 ml pyridin sattes 500 mg p-iodbenzensulfonylchlorid, og blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 36 timer. Opløsningen blev fortyndet med ethylacetat 5 og vasket med mættet vandigt natriumhydrogencarbonat, vand og vandigt natriumchlorid. Den organiske fase blev tørret over natriumsulfat, filtreret og koncentreret under reduceret tryk. Remanensen blev chromatograferet på silicagel (elueringsopløsningsmiddel: diethyl- ether og hexan, 3:1 vol/vol), hvilket gav henholdsvis 61 mg 17-allyl- 10 1,14-dihydroxy-12-[2-[4-(p-iodbenzensulfony1oxy)-3-methoxycyclohex- yl]-1-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-ll,28-di- 4 9 oxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon og 12 mg 17-allyl-l-hydroxy-12-[2-[4-(p-iodbenzensulfonyloxy) -3-methoxy-cyclohexyl ] -1 -methylvinyl ] - 23,25 - dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-15 ll,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0^’^]octacosa-14,18-dien-2,3,10,16- tetraon.
Førstnævnte forbindelse: IR-Spektrum (CHCl3): v - 3470, 1730, 1717, 1692, 1635 og 1568 cm" 1.
20 Sidstnævnte forbindelse: ^-H-NMR-Spektrum (CDC13): δ (ppm) = 6,15 (d, J=15Hz) + 6,25 (d, J=15Hz) i alt IH, 6,70 (dd, J-15 og 10Hz) +6,80 (dd, J=15 og 10Hz) i alt IH, 7,60 (2H, m), 7,90 (2H, m).
EKSEMPEL 14 25 34 mg 17-allyl-12-[2-(4-d-camphersulfonyloxy)-3-methoxycyclohexyl)- 1-methylvinyl]-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetrame- 4 9 thyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon blev vundet ved at omsætte 27 mg FR-900506-stof med 97 mg d-camphersulfonylchlorid i 0,6 ml pyridin på samme måde som beskrevet i 30 eksempel 13.
DK 169550 B1 73 IR-Spektrum (rent): ι/^χ - 3500, 1747, 1720 (skulder), 1710 (skulder) og 1655 cm’^.
EKSEMPEL 15
Til en omrørt opløsning af 89,7 mg FR-900506-stof i 3 ml dichlor- 5 methan sattes 118 mg imidazol og 52,2 mg tert.butyldiphenylsilyl- chlorid. Efter 2 timers omrøring af blandingen ved stuetemperatur blev reaktionsblandingen fortyndet med mættet vandigt ammoniumchlorid og ekstraheret tre gange med diethylether. Ekstrakten blev vasket med vand og vandigt natriumchlorid, tørret over natriumsulfat og derefter 10 koncentreret under reduceret tryk. Remanensen blev oprenset ved søjlechromatografi på silicagel (elueringsopløsningsmiddel: ethylace- tat og hexan, 1:3 vol/vol), hvilket gav 107 mg 17-allyl-12-[2-(4- tert.butyldiphenylsilyloxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-1,14- dihydroxy- 23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4- 4 9 15 azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon.
IR-Spektrum (rent): y = 3520, 1742, 1705 og 1650 cm"*-.
EKSEMPEL 16 85 mg 17-allyl-12«[2-(4-tert.butyldimethylsilyloxy-3-methoxycyclohex-yl)-1-methylvinyl]-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetra-20 methyl-11,28- dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0^’^]octacos-18-en-2,3,10,16- tetraon blev vundet ved at omsætte 80 mg FR-900506-stof med 17 mg tert.butyldimethylsilylchlorid i nærværelse af 15 mg imidazol i 1 ml N,N-dimethylformamid på samme måde som beskrevet i eksempel 15.
IR-Spektrum (CHCI3): = 1735, 1720 (skulder), 1700 og 1640'cm"·1-.
25 EKSEMPEL 17
Til en opløsning af 100 mg FR-900506-stof i 1,5 ml dimethylsulfoxid sattes 1,5 ml eddikesyreanhydrid, og blandingen blev omrørt ved DK 169550 B1 74 stuetemperatur i 14 timer. Reaktionsblandingen blev fortyndet med ethylacetat og vasket med mættet vandigt natriumhydrogencarbonat, vand og vandigt natriumchlorid. Den organiske fase blev tørret over natriumsulfat, filtreret og koncentreret under reduceret tryk. Rema- 5 nensen blev underkastet tyndtlagschromatografi på silicagel (eluer- ingsopløsningsmiddel: diethylether), hvilket gav henholdsvis 51 mg 17-allyl-l, 14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21., 27-tetramethyl-12- [ 2- (4-methylthiomethoxy- 3 -methoxycyclohexyl) -1 -methylvinyl] -11,28.- 4 9 dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]octacosa-14,18-dien-2,3,10,16-tetra- 10 on, 18 mg 17-allyl-l-hydroxy-12-[2-(4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl)-1- methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-ll,28-dioxa-4- 4 9 azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]octacosa-14,18-dien-2,3,10,16-tetraon og 10 mg 17-allyl-l,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl- 12-[2-(4-methylthiomethoxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-11,28- 4 9 15 dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon.
Første forbindelse: IR-Spektrum (CHCI3): v = 3470, 1730, 1635, 1630 (skulder) og 1580
BSX
(skulder) cm'
Anden forbindelse: 20 IR-Spektrum (CHCI3): v = 1728, 1640 og 1090 cm'1.
Tredje forbindelse: IR-Spektrum (CHCI3): v - 3480, 1735, 1710 og 1640 cm'1.
EKSEMPEL 18
Til en opløsning af 39,9 mg 17-allyl-12-[2-(4-tert.butyl-dimethylsi- 25 lyloxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-1,14-dihydroxy-23,25-dime- 4 9 thoxy-13,19,21,27-tetramethyl-ll,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]-octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon i 1,5 ml pyridin sattes 0,5 ml eddi-kesyreanhydrid, og blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 6 timer. Opløsningsmidlet blev fjernet fra reaktionsblandingen under re- DK 169550 B1 75 duceret tryk, hvilket gav en rå olie, som blev oprenset ved tyndt- lagschromatografi på silicagel (elueringsopløsningsmiddel: diethylet- her og hexan, 1:1 vol/vol), hvilket gav 26,5 mg 14-acetoxy-17-allyl- 12-[2-(4-tert.butyldimethylsilyloxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvi- 5 nyl]-l-hydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa- 4 9 4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon.
IR-Spektrum (CHCI3): y = 1728, 1715 (skulder) og 1635 cm'^.
EKSEMPEL 19 10 mg 14-acetoxy-17-allyl-12-[2-^-tert.butyldiphenylsilyloxy-S- lO methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-l-hydroxy-23,25-dimethoxy- 4 9 13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]oc- tacos-18-en-2,3,10,16-tetraon blev vundet ved at omsætte 10,6 mg 17-allyl-12-[2-(4-tert.butyldiphenylsilyloxy-3-methoxycyclohexyl)-1- methylvinyl]-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl- 4 9 15 ll,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon med 0,1 mg eddikesyreanhydrid i 0,2 ml pyridin på samme måde som beskrevet i eksempel 18.
IR-Spektrum (CHClo): v = 3500, 1730, 1720 (skulder), 1660 (skul-J max der), 1640, 1620 (skulder) og 1100 cnfl. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 EKSEMPEL 20 2
Til en opløsning af 43,8 mg 14-acetoxy-17-allyl-12-[2-(4-tert.bu 3 tyldiphenylsilyloxy- 3 -methoxycyclohexyl) -1 -methylvinyl ] -1 -hydroxy- 4 23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo-4 9 5 [22.3.1.0 ’ ]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon i 1,5 ml tetrahydrofuran 6 sattes ca. 100 mg kaliumcarbonat ved stuetemperatur, og blandingen 7 blev omrørt ved samme temperatur i 3 timer. Reaktionsblandingen blev 8 fortyndet med diethylether, og den resulterende opløsning blev vasket 9 successivt med mættet vandigt ammoniumchlorid, vand og vandigt na- 10 triumehlorid og tørret over natriumsulfat. Den resulterende opløsning 11 blev koncentreret under reduceret tryk, og remanensen blev oprenset DK 169550 B1 76 ved tyndtlagschromatografi på silicagel (elueringsopløsningsmiddel: diethylether og hexan, 3:2 vol/vol), hvilket gav 30 mg 17-allyl-12- [ 2 - (4 - tert. butyldiphenylsilyloxy- 3 -me thoxycyclohexyl) -1 -methylvi - nyl]-1 -hydroxy-23, 25 -dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa- 4 9 5 4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]octacosa-14,18-dien-2,3,10,16-tetraon.
1R-Spektrum (CHCI3): i/^ay - 1733, 1720 (skulder), 1685, 1640 (skulder) og 1620 cm"^-.
EKSEMPEL 21
En opløsning af 50 mg FR-900506-stof i 2 ml ethylacetat blev under-10 kastet katalytisk reduktion under anvendelse af 10 mg 10%'s palladi-um/kul under atmosfærisk tryk og ved stuetemperatur i 20 minutter. Reaktionsblandingen blev filtreret, og filtratet blev inddampet til tørhed og oprenset ved tyndtlagschromatografi. Eluering med en blanding af chloroform og acetone (5:1 vol/vol) gav 50,0 mg 1,14-dihy-15 droxy-12- [2- (4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl) -1-methylvinyl] -23,25- dimethoxy-13,19,21,27-tetramethyl-17-propyl-11,28-dioxa-4-azatri-4 9 cyclo[22,3.1.0 ’ ]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon.
IR-Spektrum (CHCI3): 1/ - 3480, 1735 (skulder), 1717, 1700, 1650 (skulder) og 1625 crn"^·. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 EKSEMPEL 22 2 1 g af et hvidt pulver af råt FR-900506-stof, der var vundet ved en 3 fermenteringsproces i lighed med det i eksempel 1 beskrevne, blev 4 opløst i 5 ml acetonitril og underkastet høj tryksvæskechromatografi 5 (HPLC) under anvendelse af Shimazu™ LC4A (fremstillet af Shimazu 6
Seisaku-sho). En stålsøjle (25 mm indre diameter, længde 250 mm) 7 pakket med yMCw-S343 (ODS, fremstillet af Shimakyu Co., Ltd.) blev 8 anvendt med en strømningshastighed på 12 ml/minut. Den mobile fase 9 var en vandig blanding af 28% acetonitril, 10% n-butanol, 0.075% 10 phosphorsyre og 3,75 mM natriumdodecylsulfat (SDS), og detektering 11 blev udført under anvendelse af en Hitachi UV-recorder ved 210 nm.
DK 169550 B1 77
100 μΐ af prøven blev injiceret hver gang, og HPLC blev gentaget 50 gange, så at hele prøven kunne udsættes for søjlen. Hvert eluat med en retentionstid på 85-90 minutter blev opsamlet og ekstraheret med et lige så stort volumen ethylacetat (3,6 1). Ethylacetatfasen blev 5 fraskilt og vasket med 2 1 1%'s vandigt natriumhydrogencarbonat og koncentreret i vakuum til et lille volumen. SDS, der var krystalliseret efter koncentration, blev fjernet ved filtrering. Det vundne rå pulver blev opløst i acetonitril i en koncentration på 100 mg/ml og igen underkastet HPLC. Den mobile fase var en vandig blanding af 10 12,5% acetonitril, 9,75% n-butanol, 0,075% phosphorsyre og 3,75 mM
SDS. Søjlen blev elueret med en strømningshastighed på 10 ml/minut. Eluateme med en retentionstid på 131-143 minutter blev opsamlet og ekstraheret med et lige så stort volumen ethylacetat. Opløsningsmiddelfasen blev fraskilt og vasket med 1%'s vandigt natriumhydrogen-15 carbonat og koncentreret i vakuum til et lille volumen. SDS, der var krystalliseret efter koncentration, blev fjernet ved filtrering.
Det således vundne rå pulver blev opløst i en lille mængde ethylacetat og underkastet søjlechromatografi på 10 ml silicagel (Kieselgel, 0,063- 0,037 mm, fremstillet af Merck Co., Ltd.). Søjlen blev vasket 20 med 30 ml af en blanding af n-hexan og ethylacetat (1:1 vol/vol) og 60 ml af en blanding af n-hexan og ethylacetat (1:2 vol/vol).
Eluering blev udført med ethylacetat, og der blev fraktioneret (hver fraktion: 3 ml). Fraktionerne 18-24 blev indsamlet og koncentreret til tørhed i vakuum, hvilket gav 24 mg FR-900520-stof.

Claims (15)

1. Tricycloforbindelser med den almene formel I "'XX 3 9*3 CH (σι_)—, J n ΕΛη3 1 oV° JL ° Γ^ΟΗ ^ CH3 V liy ch3 . och, och, hvor -i d
2. Forbindelser ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de har nedenstående almene formel DK 169550 B1 0γ° *!X> “f .OB f''1'11] α3γ<0 V =r3 och3 ock, hvor R^· er som defineret i krav 1, R2 er som defineret under R* i krav 1, og 5 R^ betegner methyl, propyl eller allyl.
3. Forbindelse ifølge krav 2, kendetegnet ved, at R^ betegner allyl.
4. Forbindelse ifølge krav 3, kendetegnet ved, at R*- betegner hydroxy, lavere alkyl-10 thiomethoxy, tri(lavere alkyl)silyloxy, lavere alkyl-diphenylsily-loxy, lavere alkanoyloxy, som eventuelt er substitueret med carboxy eller cyclo-lavere alkoxy-lavere alkanoyloxy, som eventuelt bærer to lavere alkylgrupper på cycloalkyldelen, camphersulfonyloxy, aroyloxy, som kan have én eller to nitrogrupper, arensulfonyloxy, som eventuelt 15 er substitueret med halogen, eller ar-lavere alkanoyloxy, som eventuelt er substitueret med lavere alkoxy og trihalogen-lavere alkyl, og R2 betegner hydroxy eller lavere alkanoyloxy.
5. Forbindelse ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den er 17-allyl-l,14-dihydroxy-12-'[2- 20 (4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl) -1-me thyl vinyl] -23,25-dimethoxy- 4 9 13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]oc-tacos-18-en-2,3,10,16-tetraon. DK 169550 B1 80
5 R^ betegner hydroxy, l-(lavere alkylthio)-(lavere)alkyloxy, tri(-lavere)alkylsilyloxy, (lavere)alkyl-diarylsilyloxy, aliphatisk acyloxy, aromatisk acyloxy eller aliphatisk acyloxy substitueret med en aromatisk gruppe, som er afledt fra carboxyl- eller sulfonsyrer,
6. Forbindelse ifølge krav 4, kendetegnet ved, at rA betegner lavere alkanoyloxy, og R^ betegner hydroxy eller lavere alkanoyloxy.
7. Forbindelse ifølge krav 6, 5 kendetegnet ved, at den er 12-[2-(4-acetoxy-3-methoxycyc- lohexyl) -1-methylvinyl] -17-allyl-l, 14-dihydroxy-23,25-dimethoxy- 4 9 13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]oc- tacos-18-en-2,3,10,16-tetraon eller 14-acetoxy-12-[2-(4-acetoxy-3- methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-17-allyl-l-hydroxy-23,25-dimethoxy- 4 9 10 13,19,21,27-tetramethyl-ll,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0 ’ ]oc-tacos-18-en-2,3,10,16-tetraon.
8. Forbindelse ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den er l,14-dihydroxy-12-[2-(4-hy-droxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-2 3,25-dimethoxy-15 13,19,17,21,27-pentamethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0^’oc- tacos-18-en-2,3,10,16-tetraon.
9. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R^ betegner hydroxy, lavere alkyl-thiomethoxy, lavere alkanoyloxy eller arensulfonyloxy, som eventuelt 20 er substitueret med halogen, R^ betegner hydrogen eller hydroxy, n er et helt tal 2, og en fuldt optrukket og en stiplet linje betegner en dobbeltbinding.
10 FR-900520 og/eller FR-900525 isoleres ved konventionelle metoder.
10. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er 16-allyl-l,13-dihydroxy-ll-[2- 25 (4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl) -1-methylvinyl] -22,24-dimethoxy- 4 8 12·, 18,20,26-tetramethyl-10,27-dioxa-4-azatricyclo[21.3.1.0 ' Jhepta-cos-17-en-2,3,9,15-tetraon.
10 R2 betegner hydrogen eller er som defineret under R*· betegner methyl, ethyl, propyl eller allyl, n er et helt tal på 1 eller 2, og en fuldt optrukket og en stiplet linje betegner en enkeltbinding eller en dobbeltbinding, 15 under forudsætning af, at når R^ og R2 begge betegner hydroxy, n er 2, og en fuldt optrukket linie og en stiplet linie betegner en enkel tbinding, da betegner R^ methyl, propyl eller allyl, og salte deraf.
11. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelser med den almene formel II DK 169550 B1 81 (GJ-)—η· /I cy “Λ3 7 o 11 ° £ OH y^CH3 “·τΧ>- OCH3 och3 hvor betegner ethyl eller allyl, n er et helt tal på 1 eller 2, når betegner allyl, og 5 n er 2, når R^ betegner ethyl, kendetegnet ved, at mikroorganismestammen Streptomyces tsukubaensis nr. 9993 (FERM BP-927) eller en af denne stamme afledt mutant, der har væsentligt samme egenskaber, dyrkes i et næringsmedium, hvorefter stofferne FR-900506,
12. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en tricycloforbindelse ifølge krav 1 som aktiv bestanddel sammen med en farmaceutisk acceptabel, i det væsentlige ikke-toxisk bærer eller excipiens.
13. Anvendelse af tricycloforbindelser med den almene formel I' DK 169550 B1 82 r1T^i 3 (I CH3 CH3AJv^v/° (QL)—. J T T cy ir'3 " “jyS V 0CH3 OCH3 til fremstilling af et lægemiddel til behandling eller forebyggelse 5 af rejektion ved transplantation, autoimmune sygdomme og "graft-versus-host"-sygdomme ved knoglemarvstransplantation.
14. Anvendelse af tricycloforbindelser ifølge krav 1 til fremstilling af et lægemiddel til behandling eller forebyggelse af infektionssygdomme .
15. Biologisk ren kultur af mikroorganismen Streptomyces tsukubaensis nr. 9993 (FERM BP-927) til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 11.
DK556285A 1984-12-03 1985-11-29 Tricycloforbindelser, fremgangsmåde til fremstilling deraf, anvendelse deraf, præparater indeholdende disse samt Streptomyces tsukubaensis mikroorganismekultur til brug ved fremgangsmåden DK169550B1 (da)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB8430455 1984-12-03
GB848430455A GB8430455D0 (en) 1984-12-03 1984-12-03 Fr-900506 substance
GB858502869A GB8502869D0 (en) 1985-02-05 1985-02-05 Ws 7238 substances
GB8502869 1985-02-05
GB858508420A GB8508420D0 (en) 1985-04-01 1985-04-01 Fr-900506 & fr-900525 substances
GB8508420 1985-04-01

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK556285D0 DK556285D0 (da) 1985-11-29
DK556285A DK556285A (da) 1986-06-04
DK169550B1 true DK169550B1 (da) 1994-11-28

Family

ID=27262535

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK556285A DK169550B1 (da) 1984-12-03 1985-11-29 Tricycloforbindelser, fremgangsmåde til fremstilling deraf, anvendelse deraf, præparater indeholdende disse samt Streptomyces tsukubaensis mikroorganismekultur til brug ved fremgangsmåden

Country Status (24)

Country Link
US (15) US4894366A (da)
EP (1) EP0184162B1 (da)
JP (6) JPH0372483A (da)
KR (5) KR930010704B1 (da)
CN (1) CN1013687B (da)
AT (1) ATE104984T1 (da)
AU (1) AU592067B2 (da)
CA (1) CA1338491C (da)
CY (1) CY1912A (da)
DE (2) DE19575026I2 (da)
DK (1) DK169550B1 (da)
ES (1) ES8705038A1 (da)
FI (2) FI87803C (da)
GR (1) GR852904B (da)
HK (1) HK18596A (da)
HU (1) HU195250B (da)
IE (1) IE62865B1 (da)
IL (2) IL77222A (da)
LU (1) LU90317I2 (da)
MX (1) MX9202943A (da)
NL (1) NL960023I2 (da)
NO (1) NO168372C (da)
NZ (1) NZ214407A (da)
PT (1) PT81589B (da)

Families Citing this family (311)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4894366A (en) * 1984-12-03 1990-01-16 Fujisawa Pharmaceutical Company, Ltd. Tricyclo compounds, a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same
US5254562A (en) * 1984-12-03 1993-10-19 Fujisawa Pharmaceutical Company, Ltd. Tricyclo compounds, a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same
US5266692A (en) * 1984-12-03 1993-11-30 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Tricyclo compounds, a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same
GB8608080D0 (en) * 1986-04-02 1986-05-08 Fujisawa Pharmaceutical Co Solid dispersion composition
DE3886265T2 (de) * 1987-06-05 1994-04-28 Fujisawa Pharmaceutical Co Anti-FR-900506-Stoffe-Antikörper und höchstempfindliches Enzym-Immunoassay-Verfahren.
DE3737523A1 (de) * 1987-11-05 1989-05-18 Bayer Ag Verwendung von substituierten hydroxypiperidinen als antivirale mittel
PH26083A (en) * 1987-11-09 1992-02-06 Sandoz Ltd 11, 28-dioxa-4-azatricyclo [22.3.1.04.9) octacos-18-ene derivatives and pharmaceutical compositions containing them and method of use thereof
DE3844904C2 (de) * 1987-11-09 1997-01-30 Sandoz Ag Neue Verwendung von 11,28-Dioxa-4-azatricyclo-[22.3.1.0·4·,·9·]octacos-18-en-Derivaten
US5366971A (en) * 1987-11-09 1994-11-22 Sandoz Ltd. Use of 11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.04,9 ]octacos-18-ene derivatives and pharmaceutical compositions containing them
AT400808B (de) * 1987-11-09 1996-03-25 Sandoz Ag Verwendung von tricyclischen verbindungen zur herstellung von topischen arzneimitteln
DE3838035C2 (de) * 1987-11-09 1994-03-24 Sandoz Ag Neue Verwendung von 11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.O·4··,··9·]octacos-18-en-Derivaten
GB8728820D0 (en) * 1987-12-09 1988-01-27 Fisons Plc Compounds
WO1989005304A1 (en) * 1987-12-09 1989-06-15 Fisons Plc Macrocyclic compounds
AT407957B (de) * 1987-12-17 2001-07-25 Novartis Erfind Verwalt Gmbh Neue verwendung von 11,28-dioxa-4-azatricyclo- (22.3.1.04,9)octacos-18-en-derivaten und sie enthaltende pharmazeutische zubereitungen
EP0323865A1 (en) * 1988-01-07 1989-07-12 Merck & Co. Inc. Novel immunosuppressant agent
US5290772A (en) * 1988-06-29 1994-03-01 Merck & Co., Inc. Immunosuppressant agent
US4981792A (en) * 1988-06-29 1991-01-01 Merck & Co., Inc. Immunosuppressant compound
DE68921934T2 (de) * 1988-06-29 1995-10-19 Merck & Co Inc Immunsuppressives Agens.
ATE131536T1 (de) * 1988-08-01 1995-12-15 Fujisawa Pharmaceutical Co Fr-901154- und fr-901155-derivate, verfahren zu ihrer herstellung
US5202258A (en) * 1988-08-05 1993-04-13 Merck & Co., Inc. Immunosuppressant-producing culture
EP0356399A3 (en) * 1988-08-26 1991-03-20 Sandoz Ag Substituted 4-azatricyclo (22.3.1.04.9) octacos-18-ene derivatives, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
EP0358508A3 (en) * 1988-09-08 1991-03-20 Merck & Co. Inc. Novel immunosuppressant compound
EP0364031B1 (en) * 1988-10-12 1992-12-23 Merck & Co. Inc. Hydroxide mediated fk-506 rearrangement process
CA1316916C (en) * 1988-10-12 1993-04-27 David Askin Hydroxide mediated fk-506 rearrangement product
US4980466A (en) * 1988-10-12 1990-12-25 Merck & Co., Inc. Hydroxide mediated FK-506 rearrangement product
FR2639637A1 (fr) * 1988-11-29 1990-06-01 Sandoz Sa Derives cycliques et leurs metabolites, leur preparation et leur utilisation comme medicaments
EP0378317A3 (en) * 1989-01-13 1990-11-28 Merck & Co. Inc. Microbial transformation product of l-679,934
EP0378320A3 (en) * 1989-01-13 1990-11-28 Merck & Co. Inc. Microbial transformation product
US5268370A (en) * 1989-01-13 1993-12-07 Merck & Co., Inc. Microbial transformation product of L-679,934
US4975372A (en) * 1989-01-13 1990-12-04 Merck & Co., Inc. Microbial transformation product of L-683,590
US5272068A (en) * 1989-03-15 1993-12-21 Merck & Co., Inc. Process for producing immunosuppressant agent L-683942 by fermentation
EP0388153B1 (en) * 1989-03-15 1994-12-28 Merck & Co. Inc. Immunosuppressant agent
EP0388152B1 (en) * 1989-03-15 1994-10-12 Merck & Co. Inc. Process for producing an immunosuppressant agent (demethimmunomycin) using a mutant strain of a microorganism
US5155228A (en) * 1989-03-23 1992-10-13 Merck & Co., Inc. FK-506 C10-C18 process intermediates
US4940797A (en) * 1989-03-23 1990-07-10 Merck & Co., Inc. Process for synthesis of FK-506 C10-C18 intermediates
US5068323A (en) * 1989-04-21 1991-11-26 Merck & Co., Inc. Thermally re-arranged FK-506 derivatives having immunosuppressant activity
CA2014841A1 (en) * 1989-04-21 1990-10-21 Byron H. Arison Macrolides having immunosuppressive activity
US5057608A (en) * 1989-04-21 1991-10-15 Merck & Co., Inc. Immunoregulants, immunosuppressants, process to make ring expanded macrolide related to FK-506/FK-520
US5270187A (en) * 1989-05-05 1993-12-14 Merck & Co., Inc. Microbial transformation product
US4987139A (en) * 1989-05-05 1991-01-22 Merck & Co., Inc. FK-520 microbial transformation product
JPH0368583A (ja) * 1989-05-05 1991-03-25 Merck & Co Inc 新規微生物変換物質
IE64214B1 (en) * 1989-06-06 1995-07-26 Fujisawa Pharmaceutical Co Macrolides for the treatment of reversible obstructive airways diseases
US5138052A (en) * 1989-06-13 1992-08-11 Merck & Co., Inc. L-683,590 microbial transformation product
CA2018710A1 (en) * 1989-06-13 1990-12-13 Shieh-Shung T. Chen L-683,590 microbial transformation product
KR920700212A (ko) * 1989-06-14 1992-02-19 쟝 크라머·한스 루돌프 하우스 헤테로원자-함유 트리사이클릭 화합물
US5164525A (en) * 1989-06-30 1992-11-17 Merck & Co., Inc. Synthetic process for fk-506 type macrolide intermediates
US5235066A (en) * 1989-06-30 1993-08-10 Merck & Co., Inc. FK-506 type macrolide intermediate
EP0413532A3 (en) * 1989-08-18 1991-05-15 Fisons Plc Macrocyclic compounds
WO1991002736A1 (en) * 1989-08-18 1991-03-07 Fisons Plc Macrocyclic compounds
US5011943A (en) * 1989-08-28 1991-04-30 Merck Frosst Canada, Inc. FK-506 C10 -C24 process intermediates
GR1001225B (el) * 1989-09-14 1993-06-30 Fisons Plc Νέαι μακροκυκλικαί ενώσεις και νέα μέ?οδος χρήσεως τους.
US5215995A (en) * 1989-10-16 1993-06-01 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Hair revitalizing agent
ATE126803T1 (de) * 1989-11-09 1995-09-15 Sandoz Ag Heteroatome enthaltende tricyclische verbindungen.
IE904050A1 (en) * 1989-11-13 1991-05-22 Merck & Co Inc Aminomacrolides and derivatives having immunosuppressive¹activity
US5208228A (en) * 1989-11-13 1993-05-04 Merck & Co., Inc. Aminomacrolides and derivatives having immunosuppressive activity
GB8925797D0 (en) * 1989-11-15 1990-01-04 Fisons Plc Compositions
EP0444829A3 (en) * 1990-02-27 1992-06-03 Fisons Plc Immunosuppressive compounds
US5260301A (en) * 1990-03-01 1993-11-09 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Pharmaceutical solution containing FK-506
US5064835A (en) * 1990-03-01 1991-11-12 Merck & Co., Inc. Hydroxymacrolide derivatives having immunosuppressive activity
WO1991013899A1 (en) * 1990-03-12 1991-09-19 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Tricyclo compounds
EP0594600A1 (en) * 1990-03-13 1994-05-04 FISONS plc Immunosuppressive macrocyclic compounds
US5296489A (en) * 1990-03-13 1994-03-22 Fisons Immunosuppressive macrocyclic compounds
EP0455427A1 (en) * 1990-04-30 1991-11-06 Merck & Co. Inc. Deoxymacrolide derivatives having immunosuppressive activity
WO1991017754A1 (en) * 1990-05-11 1991-11-28 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Methods for treating and preventing inflammation of mucosa and blood vessels using fk 506 and related compounds
JPH05507915A (ja) * 1990-06-11 1993-11-11 藤沢薬品工業株式会社 特発性血小板減少性紫斑病およびバセドウ病治療薬製造のためのｆｋ５０６等のマクロライド化合物の用途
US5643901A (en) * 1990-06-11 1997-07-01 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Medicament for treating idiopathic thrombocytopenic purpura
US5342935A (en) * 1990-06-25 1994-08-30 Merck & Co., Inc. Antagonists of immunosuppressive macrolides
US5190950A (en) * 1990-06-25 1993-03-02 Merck & Co., Inc. Antagonists of immunosuppressive macrolides
CA2044846A1 (en) * 1990-06-25 1991-12-26 Thomas R. Beattie Antagonists of immunosuppressive macrolides
US5210030A (en) * 1990-06-25 1993-05-11 Merck & Co., Inc. Process for selectively acylating immunomycin
GB9014136D0 (en) * 1990-06-25 1990-08-15 Fujisawa Pharmaceutical Co Tricyclo compounds,a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same
MY110418A (en) * 1990-07-02 1998-05-30 Novartis Ag Heteroatoms-containing tricyclic compounds.
GB9014681D0 (en) * 1990-07-02 1990-08-22 Fujisawa Pharmaceutical Co Tricyclo compounds,a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same
EP0466365A3 (en) * 1990-07-03 1992-04-15 Merck & Co. Inc. Novel immunosuppressant fermentation products of a microorganism
GB2245891A (en) * 1990-07-09 1992-01-15 Fujisawa Pharmaceutical Co Tricyclo compounds
GB2246350A (en) * 1990-07-23 1992-01-29 Fujisawa Pharmaceutical Co Tricyclo compounds
US5089517A (en) * 1990-08-03 1992-02-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Neuroprotection by indolactam v and derivatives thereof
WO1992003441A1 (en) * 1990-08-18 1992-03-05 Fisons Plc Macrocyclic compounds
GB2247620A (en) * 1990-09-07 1992-03-11 Fujisawa Pharmaceutical Co The use of macrolide compounds for cytomegalovirus infection
CA2051872A1 (en) * 1990-09-24 1992-03-25 Kevin M. Byrne Directed biosynthesis process for prolyl-immunomycin
GB2248184A (en) * 1990-09-28 1992-04-01 Fujisawa Pharmaceutical Co New use of macrolide compounds for active oxygen-mediated diseases
US5143918A (en) * 1990-10-11 1992-09-01 Merck & Co., Inc. Halomacrolides and derivatives having immunosuppressive activity
US5233036A (en) * 1990-10-16 1993-08-03 American Home Products Corporation Rapamycin alkoxyesters
US5348966A (en) * 1990-10-24 1994-09-20 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Method for treating pyoderma and Sezary's syndrome using FK 506 and related compounds
CA2054128A1 (en) * 1990-10-29 1992-04-30 Kevin M. Byrne Process for the production of analogues of immunomycin
PH31204A (en) * 1990-11-02 1998-05-05 Fujisawa Pharmaceutical Co Pharmaceutical composition.
IE65341B1 (en) * 1990-11-08 1995-10-18 Fujisawa Pharmaceutical Co Suspensions containing tricyclic compounds
GB2249787A (en) * 1990-11-19 1992-05-20 Fujisawa Pharmaceutical Co Lactone compounds
GB9027471D0 (en) * 1990-12-19 1991-02-06 Fujisawa Pharmaceutical Co Novel compound
US5116756A (en) * 1991-01-28 1992-05-26 Merck & Co., Inc. Process for producing FK-506
US5194378A (en) * 1991-01-28 1993-03-16 Merck & Co., Inc. Process for producing fk-506
WO1992013862A1 (en) * 1991-02-05 1992-08-20 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Lactone compounds
US5147877A (en) * 1991-04-18 1992-09-15 Merck & Co. Inc. Semi-synthetic immunosuppressive macrolides
DK0581959T3 (da) * 1991-04-26 2001-01-29 Fujisawa Pharmaceutical Co Anvendelse af makrolidforbindelser til øjensygdomme
US5250678A (en) 1991-05-13 1993-10-05 Merck & Co., Inc. O-aryl, O-alkyl, O-alkenyl and O-alkynylmacrolides having immunosuppressive activity
US5262533A (en) * 1991-05-13 1993-11-16 Merck & Co., Inc. Amino O-aryl macrolides having immunosuppressive activity
US5162334A (en) * 1991-05-13 1992-11-10 Merck & Co., Inc. Amino O-alkyl, O-alkenyl and O-alkynlmacrolides having immunosuppressive activity
US5565560A (en) * 1991-05-13 1996-10-15 Merck & Co., Inc. O-Aryl,O-alkyl,O-alkenyl and O-alkynylmacrolides having immunosuppressive activity
CA2071066A1 (en) * 1991-06-19 1992-12-20 Ali Shafiee Fk-900520 enzymatic and/or microbial methylation products
US5225403A (en) * 1991-06-25 1993-07-06 Merck & Co., Inc. C-21 hydroxylated FK-506 antagonist
US5273979A (en) * 1991-08-01 1993-12-28 Merck & Co., Inc. C-31 desmethyl FR-900520 cyclic hemiketal immunosuppressant agent
US5198358A (en) * 1991-08-28 1993-03-30 Merck & Co., Inc. Microorganism for producing C-31 desmethyl FR-900520 cyclic hemiketal immunosuppressant agent
US5149701A (en) * 1991-08-01 1992-09-22 Merck & Co., Inc. C-31 methylated FR-900520 cyclic hemiketal immunosuppressant agents
US5189042A (en) * 1991-08-22 1993-02-23 Merck & Co. Inc. Fluoromacrolides having immunosuppressive activity
US5708002A (en) * 1991-09-05 1998-01-13 Abbott Laboratories Macrocyclic immunomodulators
KR100351222B1 (ko) * 1991-09-05 2002-09-05 아보트 러보러터리즈 매크로사이클릭 면역 조절제 및 이의 제조방법
US5247076A (en) * 1991-09-09 1993-09-21 Merck & Co., Inc. Imidazolidyl macrolides having immunosuppressive activity
ZA926812B (en) 1991-09-09 1993-04-28 Merck & Co Inc O-heteroaryl,o-alkylheteroaryl,o-alkenylheteroaryl and o-alkynylheteroaryl macrolides having immunosupressive activity
US5252732A (en) * 1991-09-09 1993-10-12 Merck & Co., Inc. D-heteroaryl, O-alkylheteroaryl, O-alkenylheteroaryl and O-alkynylheteroarylmacrolides having immunosuppressive activity
US5208241A (en) * 1991-09-09 1993-05-04 Merck & Co., Inc. N-heteroaryl, n-alkylheteroaryl, n-alkenylheteroaryl and n-alkynylheteroarylmacrolides having immunosuppressive activity
US5164495A (en) * 1991-09-18 1992-11-17 Abbott Laboratories Method for preparing a dicarboxylic acid half-acid ester of FK506
US5221625A (en) * 1992-01-10 1993-06-22 Merck & Co., Inc. Cyclcic FR-900520 microbial biotransformation agent
AU665052B2 (en) * 1992-01-28 1995-12-14 Abraham Karpas The use of a compound for the manufacture of a medicament for the treatment of HIV infection
JP3140228B2 (ja) * 1992-02-17 2001-03-05 ファイザー製薬株式会社 新規な大環状ラクトンおよびその生産菌
JP2563080B2 (ja) * 1992-03-02 1996-12-11 フアイザー・インコーポレイテツド マクロライドの糖誘導体
CA2132457C (en) * 1992-03-02 1998-06-16 Kevin Koch Fluorosugar derivatives of macrolides
WO1993018048A1 (en) * 1992-03-02 1993-09-16 Pfizer, Inc. 2-aminosugar derivatives of macrolides
US5506233A (en) * 1992-03-02 1996-04-09 Pfizer Inc. Desosamino derivatives of macrolides as immunosuppressants and antifungal agents
EP0562853B1 (en) 1992-03-27 1996-06-05 American Home Products Corporation 29-Demethoxyrapamycin for inducing immunosuppression
CA2091194A1 (en) * 1992-04-08 1993-10-09 Richard D. Connell 2-oxo-ethyl derivatives as immunosuppressants
HUT66531A (en) * 1992-05-07 1994-12-28 Sandoz Ag Heteroatoms-containing tricyclic compounds, pharmaceutical prepns contg. them and process for producing them
WO1993025533A1 (en) * 1992-06-05 1993-12-23 Abbott Laboratories Methods and reagents for the determination of immunosuppressive agents
US5284877A (en) * 1992-06-12 1994-02-08 Merck & Co., Inc. Alkyl and alkenyl macrolides having immunosuppressive activity
US5284840A (en) * 1992-06-12 1994-02-08 Merck & Co., Inc. Alkylidene macrolides having immunosuppressive activity
US5264355A (en) * 1992-07-02 1993-11-23 Merck & Co., Inc. Methlating enzyme from streptomyces MA6858
ZA935112B (en) * 1992-07-17 1994-02-08 Smithkline Beecham Corp Rapamycin derivatives
US5324644A (en) * 1992-07-28 1994-06-28 Merck & Co., Inc. Process for producing immunosuppressant agent
DK0672756T3 (da) * 1992-08-12 2002-03-25 Fujisawa Pharmaceutical Co Monoklonalt antistof, som genkender FK506-bindende protein, fremgangsmåde til måling af niveauet af FK506-bindende protein og kit dertil
US5365948A (en) * 1992-08-21 1994-11-22 J & W Mcmichael Software Inc. Method for use in treating a patient with FK 506 to prevent an adverse immune response
US5283183A (en) * 1992-09-28 1994-02-01 Merck & Co., Inc. Cyclic FR-900520 microbial biotransformation agent
US5268282A (en) * 1992-09-28 1993-12-07 Merck & Co., Inc. Cyclic FR-900520 microbial biotransformation agent
US5290689A (en) * 1992-09-28 1994-03-01 Merck & Co., Inc. New cyclic FR-900520 microbial biotransformation agent
US5268281A (en) * 1992-09-28 1993-12-07 Merck & Co., Inc. Cyclic FR-900520 microbial biotransformation agent
US5318895A (en) * 1992-10-05 1994-06-07 Merck & Co., Inc. Aspergillus niger mutants
GB9227055D0 (en) * 1992-12-29 1993-02-24 Fujisawa Pharmaceutical Co New use
DE4300478C2 (de) * 1993-01-11 1998-05-20 Eos Electro Optical Syst Verfahren und Vorrichtung zum Herstellen eines dreidimensionalen Objekts
JPH08507788A (ja) * 1993-03-17 1996-08-20 アボツト・ラボラトリーズ 置換脂環式アミン含有大環状免疫調節剤
AT408520B (de) * 1993-05-27 2001-12-27 Novartis Erfind Verwalt Gmbh Galenische formulierungen
CH686761A5 (de) 1993-05-27 1996-06-28 Sandoz Ag Galenische Formulierungen.
MY110603A (en) * 1993-05-27 1998-08-29 Novartis Ag Tetrahydropyran derivatives
GB2279006A (en) * 1993-06-03 1994-12-21 Fujisawa Pharmaceutical Co Treatment of amyotrophic lateral sclerosis
JPH06345646A (ja) * 1993-06-08 1994-12-20 Fujisawa Pharmaceut Co Ltd ローション剤
US5352783A (en) * 1993-06-09 1994-10-04 Merck & Co., Inc. Microbial transformation product having immunosuppressive activity
US5359060A (en) * 1993-07-06 1994-10-25 Pfizer, Inc. Phosponated derivatives of macrolides
JPH09501162A (ja) * 1993-07-30 1997-02-04 アボツト・ラボラトリーズ 免疫調節活性を有する活性化マクロラクタム
GB2281294A (en) * 1993-08-23 1995-03-01 Fujisawa Pharmaceutical Co Process for producing half esters of the macrolide FK506
US5616588A (en) 1993-09-30 1997-04-01 American Home Products Corporation Rapamycin formulation for IV injection
UA41884C2 (uk) * 1993-11-05 2001-10-15 Амерікан Хоум Продактс Корпорейшн Спосіб відокремлення рапаміцину від кислотних, основних та неполярних нейтральних домішок, присутніх в концентраті екстрактів ферментаційного бульйону або маточних розчинів
US5898029A (en) * 1994-04-12 1999-04-27 The John Hopkins University Direct influences on nerve growth of agents that interact with immunophilins in combination with neurotrophic factors
US5880280A (en) * 1994-06-15 1999-03-09 Merck & Co., Inc. Aryl, alkyl, alkenyl and alkynylmacrolides having immunosuppressive activity
US5693648A (en) * 1994-09-30 1997-12-02 Merck & Co., Inc. O-aryl, O-alkyl, O-alkenyl and O-alkynyl-macrolides having immunosuppressive activity
CN1089233C (zh) 1994-10-26 2002-08-21 诺瓦蒂斯有限公司 药物组合物
AR004480A1 (es) * 1995-04-06 1998-12-16 Amico Derin C D Compuestos de ascomicina que poseen actividad antiinflamatoria, pro cedimiento para prepararlos, uso de dichos compuestos para preparar agentesfarmaceuticos y composiciones farmaceuticas que los incluyen
US5616595A (en) * 1995-06-07 1997-04-01 Abbott Laboratories Process for recovering water insoluble compounds from a fermentation broth
US6361760B1 (en) 1995-09-19 2002-03-26 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Aerosol compositions
DK0956034T3 (da) 1996-07-30 2002-12-16 Novartis Ag Farmaceutiske præparater til behandling af transplantatafstødning, autoimmune eller inflammatoriske tilstande omfattende cyclosporin A og 40-O-(2-hydroxyethyl)-rapamycin
KR100244164B1 (ko) * 1997-07-15 2000-03-02 김용옥 수용성 고분자-타크로리무스 접합체 화합물 및 그의 제조 방법
US6562620B2 (en) * 1997-09-19 2003-05-13 Mcgill University Medium to promote islet cell survival
US6015815A (en) 1997-09-26 2000-01-18 Abbott Laboratories Tetrazole-containing rapamycin analogs with shortened half-lives
US7399480B2 (en) 1997-09-26 2008-07-15 Abbott Laboratories Methods of administering tetrazole-containing rapamycin analogs with other therapeutic substances using medical devices
US20030129215A1 (en) 1998-09-24 2003-07-10 T-Ram, Inc. Medical devices containing rapamycin analogs
US6890546B2 (en) 1998-09-24 2005-05-10 Abbott Laboratories Medical devices containing rapamycin analogs
US7357942B2 (en) 1997-09-26 2008-04-15 Abbott Laboratories Compositions, systems, and kits for administering zotarolimus and paclitaxel to blood vessel lumens
US8257725B2 (en) 1997-09-26 2012-09-04 Abbott Laboratories Delivery of highly lipophilic agents via medical devices
US8057816B2 (en) 1997-09-26 2011-11-15 Abbott Laboratories Compositions and methods of administering paclitaxel with other drugs using medical devices
US8394398B2 (en) 1997-09-26 2013-03-12 Abbott Laboratories Methods of administering rapamycin analogs with anti-inflammatories using medical devices
US8257726B2 (en) 1997-09-26 2012-09-04 Abbott Laboratories Compositions, systems, kits, and methods of administering rapamycin analogs with paclitaxel using medical devices
WO1999042104A1 (en) * 1998-02-23 1999-08-26 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Use of macrolide compounds for treating glaucoma
AUPP223198A0 (en) * 1998-03-06 1998-04-02 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. New use
EP2198858B1 (en) 1998-03-26 2011-06-29 Astellas Pharma Inc. Sustained release preparation of a macrolide compound like tacrolimus
CA2337377A1 (en) 1998-07-17 2000-01-27 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Compounds, compositions, and methods for stimulating neuronal growth and elongation
US7960405B2 (en) 1998-09-24 2011-06-14 Abbott Laboratories Compounds and methods for treatment and prevention of diseases
US8257724B2 (en) 1998-09-24 2012-09-04 Abbott Laboratories Delivery of highly lipophilic agents via medical devices
US7455853B2 (en) 1998-09-24 2008-11-25 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Medical devices containing rapamycin analogs
US6503737B1 (en) 1998-10-02 2003-01-07 Kosan Biosciences, Inc. Isolated nucleic acids relating to the fkbA gene within the FK-520 polyketide synthase gene cluster
DE19853487A1 (de) 1998-11-19 2000-05-25 Fumapharm Ag Muri Verwendung von Dialkylfumaraten
GB9826656D0 (en) 1998-12-03 1999-01-27 Novartis Ag Organic compounds
CA2368463A1 (en) * 1999-03-31 2000-10-05 Abbott Laboratories Phosphate containing macrocyclic immunomodulators
US6121257A (en) * 1999-03-31 2000-09-19 Abbott Laboratories Sulfamate containing macrocyclic immunomodulators
US20040176358A1 (en) * 1999-04-30 2004-09-09 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
US7572788B2 (en) * 1999-04-30 2009-08-11 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
US7063857B1 (en) 1999-04-30 2006-06-20 Sucampo Ag Use of macrolide compounds for the treatment of dry eye
US20060025388A1 (en) * 1999-04-30 2006-02-02 Glick Gary D Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
US20030119029A1 (en) * 1999-04-30 2003-06-26 Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel benzodiazepine compounds and targets thereof
EP2062583B1 (en) * 1999-04-30 2012-12-26 The Regents of the University of Michigan Therapeutic applications of pro-apoptotic benzodiazepines
US20050113460A1 (en) * 1999-04-30 2005-05-26 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
GB9917158D0 (en) * 1999-07-21 1999-09-22 Fujisawa Pharmaceutical Co New use
US20030018044A1 (en) * 2000-02-18 2003-01-23 Peyman Gholam A. Treatment of ocular disease
US7018405B2 (en) 2000-12-22 2006-03-28 Avantec Vascular Corporation Intravascular delivery of methylprednisolone
US6471980B2 (en) 2000-12-22 2002-10-29 Avantec Vascular Corporation Intravascular delivery of mycophenolic acid
AR033151A1 (es) * 2001-04-12 2003-12-03 Sucampo Pharmaceuticals Inc Agente para el tratamiento oftalmico topico de las enfermedades inflamatorias oculares
US6656460B2 (en) 2001-11-01 2003-12-02 Yissum Research Development Method and composition for dry eye treatment
US7452692B2 (en) * 2002-02-13 2008-11-18 Teva Gyógyszergyár Zártkörüen Müködö Részvénytársaság Method for extracting a macrolide from biomatter
ZA200406350B (en) 2002-02-13 2006-11-29 Teva Gyogyszergyar Reszveny Tarsasag Method for extracting a macrolide from biomatter
SI1478327T1 (sl) * 2002-02-22 2015-08-31 Meda Ab Metoda za zmanjšanje in zdravljenje imunosupresije, inducirane z UV-B
AU2002321821A1 (en) * 2002-06-28 2004-01-19 Biocon Limited Solid state fermentation and fed batch for the production of an immunosuppressant
CA2497640C (en) 2002-09-06 2012-02-07 Abbott Laboratories Medical device having hydration inhibitor
WO2004060346A2 (en) 2002-12-30 2004-07-22 Angiotech International Ag Drug delivery from rapid gelling polymer composition
WO2004069845A1 (en) * 2003-02-10 2004-08-19 Biocon Limited Solid state fermentation and fed batch for the production of an immunosuppressant
KR20050114262A (ko) * 2003-03-31 2005-12-05 테바 기오기스제르갸르 레스즈베니타르사사그 마크로라이드의 결정화 및 정제
US20060169199A1 (en) * 2003-03-31 2006-08-03 Vilmos Keri Crystallization and purification of macrolides
US20060177500A1 (en) * 2003-07-09 2006-08-10 Hee-Jong Shin Solid dispersion of tacrolimus
PT1558622E (pt) * 2003-07-24 2007-12-04 Teva Gyogyszergyar Zartkoeruee Processo de purificação de macrolidos
JPWO2005011796A1 (ja) * 2003-08-05 2006-09-14 株式会社カネカ 生体留置用ステント
CA2537041C (en) 2003-08-29 2012-04-03 Lifecycle Pharma A/S Modified release compositions comprising tacrolimus
DK1663217T3 (da) 2003-08-29 2010-11-08 Lifecycle Pharma As Faste dispersioner indeholdende tacrolimus
TW200517114A (en) 2003-10-15 2005-06-01 Combinatorx Inc Methods and reagents for the treatment of immunoinflammatory disorders
ES2317066T3 (es) * 2003-10-17 2009-04-16 Ranbaxy Laboratories Limited Produccion de tacrolimus (fk-506)utilizando nuevas especies de streptomyces.
CN1905870A (zh) 2003-11-21 2007-01-31 康宾纳特克斯公司 用于治疗炎性病症的方法和试剂
CA2548297C (en) * 2003-12-05 2011-06-14 Biocon Limited Process for the purification of macrolides
KR100485877B1 (ko) * 2003-12-30 2005-04-28 종근당바이오 주식회사 타크롤리무스를 생산하는 미생물 및 이를 이용한타크롤리무스의 대량 생산방법
US20050176080A1 (en) * 2004-02-10 2005-08-11 Vani Bodepudi Hapten, immunogens and derivatives of ascomycin useful for preparation of antibodies and immunoassays
CA2559747C (en) 2004-03-19 2013-12-31 Abbott Laboratories Multiple drug delivery from a balloon and a prosthesis
US8431145B2 (en) 2004-03-19 2013-04-30 Abbott Laboratories Multiple drug delivery from a balloon and a prosthesis
CA2562805C (en) 2004-04-12 2014-03-11 Biocon Limited Process for the production of macrolides using a novel strain, streptomyces sp. bicc 7522
US20050272723A1 (en) * 2004-04-27 2005-12-08 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for treating diseases and conditions associated with mitochondrial function
US20090275099A1 (en) * 2004-04-27 2009-11-05 Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for treating diseases and conditions associated with mitochondrial function
JP2006014722A (ja) * 2004-06-02 2006-01-19 Keio Gijuku 遺伝子マーカー及びその利用
WO2006115509A2 (en) 2004-06-24 2006-11-02 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Small molecule immunopotentiators and assays for their detection
CA2571899A1 (en) * 2004-07-01 2006-08-03 Yale University Targeted and high density drug loaded polymeric materials
US20060014677A1 (en) * 2004-07-19 2006-01-19 Isotechnika International Inc. Method for maximizing efficacy and predicting and minimizing toxicity of calcineurin inhibitor compounds
US20060052369A1 (en) * 2004-09-07 2006-03-09 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
JP2008512125A (ja) * 2004-09-10 2008-04-24 アイバックス ファーマシューティカルズ スポレツノスト エス ルチェニム オメゼニム マクロリド化合物を単離する方法
BRPI0515695A (pt) * 2004-09-10 2008-03-04 Ivax Pharmaceuticals Sro processo para isolamento de tacrolimus cristalino
GT200500282A (es) * 2004-10-12 2006-05-04 Heteroatomos conteniendo compuestos triciclicos.
ITMI20042098A1 (it) * 2004-11-03 2005-02-03 Antibioticos Spa Processo per la purificazione di tacrolimus
TWI315310B (en) 2004-12-01 2009-10-01 Teva Gyogyszergyar Zartkoruen Mukodo Reszvenytarsasag Methods of preparing pimecrolimus
KR20070116581A (ko) * 2004-12-15 2007-12-10 엘란 파마 인터내셔널 리미티드 나노입자형 타크롤리무스 제제
CA2586692A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Teva Gyogyszergyar Zartkoruen Mukodo Reszvenytarsasag Method of purifying macrolides
AU2006203946B2 (en) * 2005-01-03 2009-07-23 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
WO2006083486A1 (en) * 2005-01-05 2006-08-10 TEVA GYÓGYSZERGYÁR ZÁRTKöR..EN M..k..D.. RÉSZVÉNYTÁRSASÁG Amorphous tacrolimus and preparation thereof
US20090162868A1 (en) * 2005-01-13 2009-06-25 Yusuke Tanigawara Gene Markers and Utilization of the Same
EP1877004A4 (en) 2005-03-23 2012-01-25 Abbott Lab COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE ADMINISTRATION OF RAPAMYCIN ANALOGUES WITH MEDICAL DEVICES FOR LONG-TERM EFFECT
EP2327429B1 (en) 2005-03-23 2014-09-17 Abbott Laboratories Delivery of highly lipophilic agents via medical devices
EP1893218A4 (en) 2005-06-01 2011-01-12 Univ Michigan NON-SOLVATED BENZODIAZEPINE PREPARATIONS AND METHODS
CN1876822B (zh) * 2005-06-06 2010-05-12 上海市农药研究所 他克莫司的产生菌株及生产方法
WO2007013017A1 (en) * 2005-07-29 2007-02-01 Ranbaxy Laboratories Limited A process for purification of macrolides
ITMI20051549A1 (it) * 2005-08-05 2007-02-06 Antibioticos Spa Purificazione del tacrolimus su supporti dimorigine vegetale
WO2007029082A2 (en) * 2005-09-05 2007-03-15 Ranbaxy Laboratories Limited An improved fermentation process for preparing ascomycin
US20080318289A1 (en) * 2005-10-05 2008-12-25 Parveen Kumar Fermentation Processes for the Preparation of Tacrolimus
US20070105844A1 (en) * 2005-10-26 2007-05-10 Regents Of The University Of Michigan Therapeutic compositions and methods
AU2006308655B2 (en) 2005-11-01 2010-09-23 The Regents Of The University Of Michigan Novel 1,4-benzodiazepine-2,5-diones with therapeutic properties
EP2218442A1 (en) 2005-11-09 2010-08-18 CombinatoRx, Inc. Methods, compositions, and kits for the treatment of ophthalmic disorders
US7622477B2 (en) 2006-02-28 2009-11-24 Cordis Corporation Isomers and 42-epimers of rapamycin alkyl ether analogs, methods of making and using the same
US7678901B2 (en) 2006-02-28 2010-03-16 Wyeth Rapamycin analogs containing an antioxidant moiety
JP4700022B2 (ja) * 2006-03-15 2011-06-15 アイバックス ファーマシューティカルズ スポレツノスト エス ルチェニム オメゼニム タクロリマスの精製方法
US8022188B2 (en) * 2006-04-24 2011-09-20 Abbott Laboratories Immunosuppressant binding antibodies and methods of obtaining and using same
US7759338B2 (en) * 2006-04-27 2010-07-20 The Regents Of The University Of Michigan Soluble 1,4 benzodiazepine compounds and stable salts thereof
JP5264716B2 (ja) 2006-06-09 2013-08-14 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 化合物およびその標的に関連する組成物および方法
CA2660804A1 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Astellas Pharma Inc. Reverse targeting lipid vesicle
US20080161324A1 (en) * 2006-09-14 2008-07-03 Johansen Lisa M Compositions and methods for treatment of viral diseases
CA2668134A1 (en) * 2006-11-06 2008-05-15 Teva Gyogyszergyar Zartkoerueen Muekoedoe Reszvenytarsasag Ascomycin and pimecrolimus having reduced levels of des-methylascomycin and 32-deoxy-32-epichloro-desmethylascomycin respectively, and methods for preparation thereof
JP2010515753A (ja) * 2007-01-10 2010-05-13 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 肺内送達用免疫抑制剤組成物の送達の増強
US10265407B2 (en) 2007-02-15 2019-04-23 Yale University Modular nanodevices for smart adaptable vaccines
WO2008109347A2 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Yale University Methods for ex vivo administration of drugs to grafts using polymeric nanoparticles
CA2783589A1 (en) 2007-03-09 2008-09-18 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel compounds and targets thereof
DK2167033T3 (da) 2007-05-30 2017-08-14 Veloxis Pharmaceuticals As En gang dagligt oral doseringsform omfattende tacrolismus
KR100891313B1 (ko) * 2007-08-17 2009-03-31 (주) 제노텍 담체로 작용하는 흡착성 수지의 제공에 의한 트리사이클로화합물의 생산 및 추출 방법
CN101855203B (zh) 2007-09-14 2014-03-19 密执安州立大学董事会 F1f0-atp合成酶抑制剂以及相关的方法
MX2010004857A (es) 2007-11-06 2010-07-28 Univ Michigan Compuestos de benzodiazepinona utiles en el tratamiento de afecciones de la piel.
US8921642B2 (en) * 2008-01-11 2014-12-30 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Conditional-stop dimerizable caspase transgenic animals
KR101003042B1 (ko) 2008-03-17 2010-12-21 종근당바이오 주식회사 고순도 타크로리무스의 정제 방법
MX2010011068A (es) * 2008-04-08 2010-11-04 Amyris Biotechnologies Inc Expresion de secuencias heterologas.
US8173621B2 (en) 2008-06-11 2012-05-08 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside cyclicphosphates
WO2010021681A2 (en) * 2008-08-18 2010-02-25 Combinatorx (Singapore) Pte. Ltd. Compositions and methods for treatment of viral diseases
JP5567573B2 (ja) 2008-09-11 2014-08-06 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン アリールグアニジンｆ１ｆ０−ａｔｐアーゼ阻害剤およびそれと関連する方法
KR100910165B1 (ko) * 2008-09-18 2009-07-30 (주) 제노텍 은 이온 용액 추출을 이용한 불포화 알킬기를 가진 락톤 화합물 정제방법
CN102176913B (zh) * 2008-10-08 2014-08-13 高田制药株式会社 外用的他克莫司制剂
WO2010075554A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Pharmasset, Inc. Synthesis of purine nucleosides
PA8855701A1 (es) 2008-12-23 2010-07-27 Análogos de nucleósidos
EA019341B1 (ru) 2008-12-23 2014-02-28 Джилид Фармассет, Ллс. Фосфорамидаты нуклеозидов
US8604023B2 (en) 2009-04-17 2013-12-10 The Regents Of The University Of Michigan 1,4-benzodiazepinone compounds and their use in treating cancer
CN101712686B (zh) * 2009-06-22 2012-08-29 鲁南制药集团股份有限公司 一种发酵液中他克莫司的分离纯化方法
EP2272963A1 (en) * 2009-07-09 2011-01-12 LEK Pharmaceuticals d.d. Process for Preparation of Tacrolimus
WO2011035124A1 (en) 2009-09-18 2011-03-24 The Regents Of The University Of Michigan Benzodiazepinone compounds and methods of treatment using same
WO2011062765A2 (en) 2009-11-17 2011-05-26 The Regents Of The University Of Michigan 1,4-benzodiazepine-2,5-diones and related compounds with therapeutic properties
JP5856064B2 (ja) 2009-11-17 2016-02-09 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 治療特性を有する１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオンおよび関連化合物
US20110130711A1 (en) * 2009-11-19 2011-06-02 Follica, Inc. Hair growth treatment
US8951595B2 (en) 2009-12-11 2015-02-10 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Coatings with tunable molecular architecture for drug-coated balloon
US8480620B2 (en) 2009-12-11 2013-07-09 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Coatings with tunable solubility profile for drug-coated balloon
DK2575769T3 (da) 2010-02-17 2016-09-26 Veloxis Pharmaceuticals As Stabiliseret tacrolismussammensætning
BR112012024884A2 (pt) 2010-03-31 2016-10-18 Gilead Pharmasset Llc síntese estereosseletiva de ativos contendo fósforo
US20110318277A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 APT Pharmaceuticals, Inc. University of Maryland, Baltimore Tacrolimus compositions for aerosol administration
KR101261131B1 (ko) 2010-08-24 2013-05-06 이화여자대학교 산학협력단 신규 타크롤리무스 유도체, 상기 유도체를 포함하는 신경 보호용 조성물, 상기 유도체를 포함하는 면역 억제용 조성물, 상기 유도체의 생산 방법 및 상기 유도체의 생산 균주
MA34586B1 (fr) 2010-08-25 2013-10-02 Medis Lab Particules cristallines de tacrolimus micronise a surface modifiee et compositions pharmaceutiques associees
US10117411B2 (en) 2010-10-06 2018-11-06 Dow Agrosciences Llc Maize cytoplasmic male sterility (CMS) C-type restorer RF4 gene, molecular markers and their use
EP3556774B1 (en) 2011-03-11 2024-01-03 Beth Israel Deaconess Medical Center Inc. Anti-cd40 antibodies and uses thereof
EP2841098A4 (en) 2012-04-23 2016-03-02 Allertein Therapeutics Llc NANOPARTICLES FOR THE TREATMENT OF ALLERGIES
NZ631337A (en) 2013-03-14 2017-01-27 Alkermes Pharma Ireland Ltd Prodrugs of fumarates and their use in treating various diseases
US8669281B1 (en) 2013-03-14 2014-03-11 Alkermes Pharma Ireland Limited Prodrugs of fumarates and their use in treating various diseases
CN105188741A (zh) 2013-04-03 2015-12-23 阿勒丁医疗公司 新型纳米颗粒组合物
WO2015073691A1 (en) 2013-11-14 2015-05-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for treating cancer by activation of bmp signaling
CN104650112B (zh) * 2013-11-18 2018-07-31 山东新时代药业有限公司 他克莫司8-丙基类似物的制备方法
UY35927A (es) 2013-12-31 2015-07-31 Dow Agrosciences Llc ?gen restaurador rf3 de tipo s de la esterilidad masculina citoplasmática del maíz (cms), marcadores moleculares y sus usos?.
WO2015106283A1 (en) 2014-01-13 2015-07-16 Amplyx Pharmaceuticals, Inc. Antifungal compounds
CA2935167C (en) 2014-01-16 2022-02-22 Musc Foundation For Research Development Targeted nanocarriers for the administration of immunosuppressive agents
CA2940845C (en) 2014-02-24 2019-09-24 Alkermes Pharma Ireland Limited Sulfonamide and sulfinamide prodrugs of fumarates and their use in treating various diseases
KR101694879B1 (ko) * 2014-08-01 2017-01-12 주식회사 인트론바이오테크놀로지 면역억제활성 없이 신경재생활성이 유지되는 fk506 유도체 및 그의 용도
US10143682B2 (en) 2014-10-28 2018-12-04 Koushi Yamaguchi Medicine for improving state of pregnancy, and use thereof
US20180243224A1 (en) 2015-08-19 2018-08-30 Vivus, Inc. Pharmaceutical formulations
EP3906943A1 (en) 2015-09-04 2021-11-10 Primatope Therapeutics Inc. Humanized anti-cd40 antibodies and uses thereof
CN106074367A (zh) * 2016-07-20 2016-11-09 中山大学中山眼科中心 含fk506类化合物/fkbp蛋白二聚体的药物组合物及其制备方法
CN108384819B (zh) * 2017-02-03 2021-06-25 上海医药工业研究院 一种用于发酵他克莫司的培养基以及发酵方法
RU2686779C1 (ru) * 2018-07-26 2019-04-30 Общество с ограниченной ответственностью "Изварино Фарма" Штамм streptomyces tsukubensis - продуцент такролимуса и способ получения такролимуса
US20210228551A1 (en) 2018-08-10 2021-07-29 Koushi Yamaguchi Therapeutic agent for humoral immunity-related diseases in maternofetal relationship
WO2020076738A2 (en) * 2018-10-12 2020-04-16 Bellicum Pharmaceuticals, Inc Protein-binding compounds
WO2020117134A1 (en) 2018-12-04 2020-06-11 İlko İlaç Sanayi̇ Ve Ti̇caret A.Ş. Stable tacrolimus ointment formulation for topical treatment of skin conditions
KR102135527B1 (ko) * 2018-12-18 2020-07-20 이문수 발가락 습기 제거 양말
WO2020129348A1 (ja) 2018-12-18 2020-06-25 晃史 山口 不妊・不育症または妊娠状態を改善するための薬剤
GR1009790B (el) 2019-03-20 2020-08-03 Φαρματεν Α.Β.Ε.Ε. Σκευασμα παρατεταμενης αποδεσμευσης που περιλαμβανει τακρολιμους
CN117177749A (zh) 2021-03-03 2023-12-05 萨那生物科技公司 与心肌细胞疗法一起使用的免疫抑制疗法以及相关的方法和组合物

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3244592A (en) * 1962-06-09 1966-04-05 Arai Tadashi Ascomycin and process for its production
JPS54110000A (en) * 1978-02-17 1979-08-29 Kaken Pharmaceut Co Ltd Novel streptovaricin c derivative
US4309504A (en) * 1980-01-28 1982-01-05 Eli Lilly And Company Process for preparing narasin
US4654334A (en) * 1980-10-08 1987-03-31 International Minerals & Chemical Corp. Manganese-containing antibiotic agents
US4415669A (en) * 1981-12-07 1983-11-15 Merck & Co., Inc. Substance and process for its production
US4390546A (en) * 1981-12-07 1983-06-28 Merck & Co., Inc. Antiparasitic macrolide from a strain of Streptomyces hygroscopicus
US4510317A (en) * 1983-07-28 1985-04-09 Hoffmann-La Roche Inc. Antibiotic X-14934A
US4894366A (en) 1984-12-03 1990-01-16 Fujisawa Pharmaceutical Company, Ltd. Tricyclo compounds, a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same
GB8430455D0 (en) * 1984-12-03 1985-01-09 Fujisawa Pharmaceutical Co Fr-900506 substance
US5254562A (en) * 1984-12-03 1993-10-19 Fujisawa Pharmaceutical Company, Ltd. Tricyclo compounds, a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same
US5266692A (en) * 1984-12-03 1993-11-30 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Tricyclo compounds, a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same
PH26083A (en) * 1987-11-09 1992-02-06 Sandoz Ltd 11, 28-dioxa-4-azatricyclo [22.3.1.04.9) octacos-18-ene derivatives and pharmaceutical compositions containing them and method of use thereof
US5956352A (en) * 1992-04-24 1999-09-21 Digital Equipment Corporation Adjustable filter for error detecting and correcting system

Also Published As

Publication number Publication date
CA1338491C (en) 1996-07-30
JPH1112281A (ja) 1999-01-19
AU592067B2 (en) 1990-01-04
US5110811A (en) 1992-05-05
FI854731A0 (fi) 1985-11-29
KR930010706B1 (ko) 1993-11-08
CN1013687B (zh) 1991-08-28
AU5059685A (en) 1986-06-12
NL960023I1 (nl) 1996-12-02
US6482845B1 (en) 2002-11-19
EP0184162A2 (en) 1986-06-11
US5624842A (en) 1997-04-29
NO168372B (no) 1991-11-04
US5565559A (en) 1996-10-15
NZ214407A (en) 1989-11-28
KR930010705B1 (ko) 1993-11-08
IE62865B1 (en) 1995-03-08
US5830717A (en) 1998-11-03
ES8705038A1 (es) 1987-04-16
DE3587806D1 (de) 1994-06-01
US4929611A (en) 1990-05-29
GR852904B (da) 1986-04-01
US4956352A (en) 1990-09-11
US6201005B1 (en) 2001-03-13
ATE104984T1 (de) 1994-05-15
EP0184162B1 (en) 1994-04-27
DK556285A (da) 1986-06-04
CY1912A (en) 1985-11-30
JPH0372484A (ja) 1991-03-27
DE3587806T2 (de) 1994-08-25
JP2976966B2 (ja) 1999-11-10
MX9202943A (es) 1992-06-30
IE852971L (en) 1986-06-03
CN85109492A (zh) 1986-06-10
JPH0346445B2 (da) 1991-07-16
FI864527A (fi) 1986-11-07
US4894366A (en) 1990-01-16
NO168372C (no) 1992-02-12
JPH0372483A (ja) 1991-03-27
US20030229115A1 (en) 2003-12-11
FI87803B (fi) 1992-11-13
KR930010704B1 (ko) 1993-11-08
HU195250B (en) 1988-04-28
JP3211891B2 (ja) 2001-09-25
JP2746134B2 (ja) 1998-04-28
DK556285D0 (da) 1985-11-29
PT81589B (pt) 1987-10-20
ES549478A0 (es) 1987-04-16
HUT41842A (en) 1987-05-28
PT81589A (en) 1986-01-01
KR930010707B1 (ko) 1993-11-08
EP0184162A3 (en) 1989-02-08
IL92345A (en) 1991-06-10
JPH0720970B2 (ja) 1995-03-08
HK18596A (en) 1996-02-09
US6028097A (en) 2000-02-22
DE19575026I2 (de) 2002-03-28
JPH1067783A (ja) 1998-03-10
NL960023I2 (nl) 1997-06-02
FI85977B (fi) 1992-03-13
FI87803C (fi) 1993-02-25
FI85977C (fi) 1992-06-25
KR860004918A (ko) 1986-07-16
US20030170831A1 (en) 2003-09-11
FI854731A (fi) 1986-06-04
LU90317I2 (fr) 1999-01-11
JPH07224066A (ja) 1995-08-22
FI864527A0 (fi) 1986-11-07
JPH11343294A (ja) 1999-12-14
NO854833L (no) 1986-06-04
US5496727A (en) 1996-03-05
JP2828091B2 (ja) 1998-11-25
KR930010708B1 (ko) 1993-11-08
IL77222A (en) 1991-06-10
US20050124646A1 (en) 2005-06-09
US20040029908A1 (en) 2004-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK169550B1 (da) Tricycloforbindelser, fremgangsmåde til fremstilling deraf, anvendelse deraf, præparater indeholdende disse samt Streptomyces tsukubaensis mikroorganismekultur til brug ved fremgangsmåden
EP0349061B1 (en) Immunosuppressant agent
EP0627009B1 (en) Macrocyclic lactones and a productive strain thereof
JPS61148181A (ja) Ｆｒ―９００５０６物質およびその製造法
US5254562A (en) Tricyclo compounds, a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same
US5266692A (en) Tricyclo compounds, a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same
US5359060A (en) Phosponated derivatives of macrolides
NO176523B (no) Fremgangsmåte for fremstilling av tricykloforbindelsen FR-900523

Legal Events

Date Code Title Description
B1 Patent granted (law 1993)
CTFF Application for supplementary protection certificate (spc) filed

Free format text: CA 1995 00015, 950927

CTFG Supplementary protection certificate (spc) issued

Free format text: CA 1995 00015, 950927, EXPIRES: 20090607

PUP Patent expired