JP2976966B2 - トリシクロ化合物の生産法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の構成】この発明は薬理活性を有するトリシクロ
化合物またはその塩、その製造法およびそれを含有する
医薬組成物に関する。さらに詳細には、この発明は免疫
抑制活性、抗菌活性等のような薬理活性を有する新規な
トリシクロ化合物またはその塩、その製造法、それを含
有する免疫抑制剤および抗菌剤に関する。すなわち、こ
の発明の一つの目的は、移植による拒絶反応、骨髄移植
による移植片対宿主病、自己免疫疾患、感染症等の治療
および予防に有用な新規トリシクロ化合物またはその医
薬として許容される塩を提供することである。この発明
のもう一つの目的は、醗酵法および合成法によるトリシ
クロ化合物またはその塩の製造法を提供することであ
る。この発明のさらにもう一つの目的は、有効成分とし
てトリシクロ化合物またはその医薬として許容される塩
を含有する免疫抑制剤および抗菌剤を提供することであ
る。この発明は4種の新規化合物であるFR−9005
06物質、FR−900520物質、FR−90052
3物質およびFR−900525物質が初めて見い出さ
れたことに基づくものである。さらに詳細には、FR−
900506物質、FR−900520物質、FR−9
00523物質およびFR−900525物質は、スト
レプトミセス(Streptomyces)属に属する
新菌種を醗酵することにより得られる培養ブロスから純
粋な形で初めて分離されたものである。そして、FR−
900506物質、FR−900520物質、FR−9
00523物質およびFR−900525物質の化学構
造を明らかにするため鋭意研究した結果、この発明の発
明者等はそれらの化学構造を決定し、それらの化合物の
誘導体の合成に成功した。この発明の新規なトリシクロ
化合物は下記一般式で示すことができる。 【化15】 (式中、R1 はヒドロキシ基または保護されたヒドロキ
シ基、R2 は水素、ヒドロキシ基または保護されたヒド
ロキシ基、R3 はメチル基、エチル基、プロピル基また
はアリル基、nは1または2の整数、実線と点線により
表わされる記号は単結合または二重結合を意味する) 【0002】目的化合物(I)のうち、下記4種の化合
物が醗酵により産生されることが見出された。 (1)R1 およびR2 がそれぞれヒドロキシ基、R3 がア
リル基、nが整数2、実線と点線により表わされる記号
が単結合を意味する化合物(I)(FR−900506
物質と命名) (2)R1 およびR2 がそれぞれヒドロキシ基、R3 がエ
チル基、nが整数2、実線と点線により表わされる記号
が単結合を意味する化合物(I)[(FR−90052
0物質と命名(別名:WS7238A物質)] (3)R1 およびR2 がそれぞれヒドロキシ基、R3 がメ
チル基、nが整数2、実線と点線により表わされる記号
が単結合を意味する化合物(I)[FR−900523
物質と命名(別名:WS7238B物質)] (4)R1 およびR2 がそれぞれヒドロキシ基、R3 がア
リル基、nが整数1、実線と点線により表わされる記号
が単結合を意味する化合物(I)(FR−900525
物質と命名) この発明のトリシクロ化合物(I)において、コンホー
マーあるいは不斉炭素原子および二重結合に起因する光
学異性体および幾何異性体のような1対以上の立体異性
体対が存在することがあり、そのようなコンホーマーあ
るいは異性体もこの発明の範囲内に包含される。この発
明の目的化合物であるトリシクロ化合物(I)またはそ
の塩は、下記に示す製造法により製造することができ
る。 【0003】[I]醗酵法 【化16】 【0004】[II]合成法 (1)製造法1(ヒドロキシ保護基の導入) 【化17】 【0005】(2)製造法2(ヒドロキシ保護基の導入) 【化18】【0006】(3)製造法3(二重結合の形成) 【化19】 【0007】(4)製造法4(ヒドロキシエチレン基の酸
化) 【化20】 【0008】(5)製造法5(アリル基の還元) 【化21】 (式中、R1 、R2 、R3 、nおよび実線と点線により
表わされる記号はそれぞれ前と同じ意味であり、R1 aお
よびR2 aはそれぞれ保護されたヒドロキシ基、R 2 bは脱
離基を意味する) 【0009】上記定義の具体例およびその好ましい実施
態様を以下詳細に説明する。この明細書において使用さ
れる「低級」なる語は、特に指示がなければ、炭素原子
1〜6個を意味する。「保護されたヒドロキシ基」にお
ける好適なヒドロキシ保護基としては、例えばメチルチ
オメチル、エチルチオメチル、プロピルチオメチル、イ
ソプロピルチオメチル、ブチルチオメチル、イソブチル
チオメチル、ヘキシルチオメチル等の低級アルキルチオ
メチル基のような1−(低級アルキルチオ)(低級)ア
ルキル基、さらに好ましいものとしてC1 〜C4 アルキ
ルチオメチル基、最も好ましいものとしてメチルチオメ
チル基;例えばトリメチルシリル、トリエチルシリル、
トリブチルシリル、第三級ブチル−ジメチルシリル、ト
リ第三級ブチルシリル等のトリ(低級)アルキルシリ
ル、例えばメチル−ジフェニルシリル、エチル−ジフェ
ニルシリル、プロピル−ジフェニルシリル、第三級ブチ
ル−ジフェニルシリル等の低級アルキル−ジアリールシ
リル等のようなトリ置換シリル基、さらに好ましいもの
としてトリ(C1 〜C4 )アルキルシリル基およびC1
〜C4 アルキル−ジフェニルシリル基、最も好ましいも
のとして第三級ブチル−ジメチルシリル基および第三級
ブチル−ジフェニルシリル基;カルボン酸およびスルホ
ン酸から誘導される脂肪族アシル基、芳香族アシル基お
よび芳香族基で置換された脂肪族アシル基のようなアシ
ル基;等が挙げられる。脂肪族アシル基としては、例え
ばホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソ
ブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキ
サノイル、カルボキシアセチル、カルボキシプロピオニ
ル、カルボキシブチリル、カルボキシヘキサノイル等
の、カルボキシのような適当な置換基を1個以上有して
いてもよい低級アルカノイル基、例えばシクロプロピル
オキシアセチル、シクロブチルオキシプロピオニル、シ
クロヘプチルオキシブチリル、メンチルオキシアセチ
ル、メンチルオキシプロピオニル、メンチルオキシブチ
リル、メンチルオキシペンタノイル、メンチルオキシヘ
キサノイル等の、低級アルキルのような適当な置換基を
1個以上有していてもよいシクロ(低級)アルコキシ
(低級)アルカノイル基、カンファースルホニル基等が
挙げられる。 【0010】芳香族アシル基としては、例えばベンゾイ
ル、トルオイル、キシロイル、ナフトイル、ニトロベン
ゾイル、ジニトロベンゾイル、ニトロナフトイル等の、
ニトロのような適当な置換基を1個以上有していてもよ
いアロイル基、例えばベンゼンスルホニル、トルエンス
ルホニル、キシレンスルホニル、ナフタレンスルホニ
ル、フルオロベンゼンスルホニル、クロロベンゼンスル
ホニル、ブロモベンゼンスルホニル、ヨードベンゼンス
ルホニル等の、ハロゲンのような適当な置換基を1個以
上有していてもよいアレーンスルホニル基等が挙げられ
る。芳香族基で置換された脂肪族アシル基としては、例
えばフェニルアセチル、フェニルプロピオニル、フェニ
ルブチリル、2−トリフルオロメチル−2−メトキシ−
2−フェニルアセチル、2−エチル−2−トリフルオロ
メチル−2−フェニルアセチル、2−トリフルオロメチ
ル−2−プロポキシ−2−フエニルアセチル等の、低級
アルコキシおよびトリハロ(低級)アルキルのような適
当な置換基を1個以上有していてもよいアル(低級)ア
ルカノイル基等が挙げられる。上記アシル基中、さらに
好ましいアシル基としては、カルボキシを有していても
よいC1 〜C4 アルカノイル基、シクロアルキル部分に
(C1 〜C4 )アルキルを2個有するシクロ(C5 〜C
6 )アルキルオキシ(C1 〜C4 )アルカノイル基、カ
ンファースルホニル基、ニトロを1個または2個有して
いてもよいベンゾイル基、ハロゲンを有するベンゼンス
ルホニル基、C1 〜C4 アルコキシとトリハロ(C1 〜
C4 )アルキルを有するフェニル(C1 〜C4 )アルカ
ノイル基が挙げられ、それらのうち、最も好ましいもの
としては、アセチル、カルボキシプロピオニル、メンチ
ルオキシアセチル、カンファースルホニル、ベンゾイ
ル、ニトロベンゾイル、ジニトロベンゾイル、ヨードベ
ンゼンスルホニルおよび2−トリフルオロメチル−2−
メトキシ−2−フェニルアセチルが挙げられる。好適な
「脱離基」としては、ヒドロキシ基、アシル部分が上記
で例示したようなものであるアシルオキシ基等が挙げら
れる。この発明のトリシクロ化合物(I)の製造法を以
下詳細に説明する。 【0011】[I]醗酵法 この発明のFR−900506物質、FR−90052
0物質、FR−900523物質およびFR−9005
25物質は、ストレプトミセス・ツクバエンシス(St
reptomyces tsukubaensis)N
o.9993およびストレプトミセス・ハイグロスコピ
カス・サブスプ・ヤクシマエンシス(Streptom
yces hygroscopicus Subsp.
yakushimaensis)No.7238のよ
うなストレプトミセス属に属する、FR−90050
6、FR−900520、FR−900523および/
またはFR−900525物質−生産菌株を培地中で醗
酵させることにより生産することができる。FR−90
0506物質、FR−900520物質、FR−900
523物質およびFR−900525物質の醗酵による
生産について以下に説明する。[A]この発明のFR−
900506物質、FR−900520物質およびFR
−900525物質は、ストレプトミセス・ツクバエン
シスNo.9993のようなストレプトミセス属に属す
る、FR−900506、FR−900520および/
またはFR−900525物質−生産菌株を培地中で醗
酵させることにより生産できる。 【0012】微生物 FR−900506物質、FR−900520物質およ
び/またはFR−900525物質の生産に使用される
菌は、ストレプトミセス属に属するFR−90050
6、FR−900520および/またはFR−9005
25物質−生産菌株であり、それらのうちストレプトミ
セス・ツクバエンシスNo.9993が茨城県筑波郡豊
里町で採取された土壌試料から新たに分離された。この
新たに分離されたストレプトミセス・ツクバエンシスN
o.9993の凍結乾燥標本は、工業技術院微生物工業
技術研究所(茨城県筑波郡矢田部町東1丁目1−3)に
1984年10月5日付で寄託番号微工研菌寄第788
6号として寄託され、次いで1985年10月19日付
で新しい寄託番号微工研条寄第927号として同寄託機
関のブダペスト条約ルートに切り換えられた。新規なF
R−900506物質、FR−900520物質および
/またはFR−900525物質の生産において、この
明細書に記載した菌は単に説明のためにのみ掲げたもの
であり、それに限定されるものではない。この発明には
また、自然突然変異菌ならびにX線照射、紫外線照射、
N−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、
2−アミノプリン等による慣用の処理によってつくられ
る人工突然変異菌をも含む、FR−900506物質、
FR−900520物質および/またはFR−9005
25物質を産生できるいかなる突然変異菌を使用する場
合も含まれる。ストレプトミセス・ツクバエンシスN
o.9993は下記のような形態学的性質、培養特性、
生物学的および生理学的特徴を有する。 【0013】[1]形態学的性質 主に、シャーリング(Shirling)およびゴット
リープ(Gottlieb)に記載の方法[シャーリン
グ・イー・ビーおよびディー・ゴットリープ:メソッズ
・フォー・キャラクテリゼーション・オブ・ストレプト
ミセス・スペシーズ(インターナショナル・ジャーナル
・オブ・システマチック・バクテリオロジー)(Met
hods for characterization
ofStreptomyces species.
InternationalJournal of S
ystematic Bacteriology)第1
6巻、第313〜340頁、1966年]を分類学的検
討に用いた。形態学的観察は、オートミール寒天、イー
スト・マルトエキストラクト寒天および無機塩・スター
チ寒天上、30℃で14日間生育させた培養物を用い、
光学および電子顕微鏡を用いて行った。成熟胞子体は各
胞子鎖に10〜50個または50個を超える数の胞子を
有する直鎖状または波状(Rectiflexibil
es)を形成した。電子顕微鏡での観察によればこの胞
子は楕円形の円筒状で、大きさは0.5〜0.7×0.
7〜0.8μmである。胞子表面は滑らかであった。 [2]培養特性 培養特性は上記シャーリングおよびゴットリープ、なら
びにワクスマン(Waksman)[ワクスマン・エス
・エー:ザ・アクチノマイセッツ、第2巻、クラシフィ
ケーション・アイデンティフィケーション・アンド・デ
スクリプション・オブ・ゼネラ・アンド・スペシーズ。
ザ・ウィリアムス・アンド・ウィルキンス・カンパニ
ー、バルチモア、1961年(Waksman,S.
A.:Theactinomycetes,Vol.2
: Classification, identi
fication and description
ofgenera and species. The
Williams and Wilkins C
o., Baltimore,1961)]に記載の1
0種類の培地で観察した。30℃で14日間培養した。
この研究で使用した色名は新色名帖(東京、日本色彩研
究所の手引書)に基づいた。オートミール寒天、イース
ト・マルトエキストラクト寒天および無機塩・スターチ
寒天上で成育させた場合、コロニーは灰色系に属してい
た。可溶性色素はイースト・マルトエキストラクト寒天
で生成したが、他の培地では生成しなかった。結果を表
1〜3に示す。 【0014】表1〜3.菌株No.9993およびスト
レプトミセス・ミサキエンシス IFO12891(Streptomyces mis
akiensisIFO12891)の培養特性 【表1】 【表2】【表3】 細胞壁組成分析を、ベッカー等の方法[ベッカー・ビー
・、エム・ピー・レシウ゛ァリエル、アール・イー・ゴ
ードンおよびエイチ・エー・レシウ゛ァリエル:ラピッ
ド・ディフェレンシエーション・ビトウ゛ィーン・ノカ
ルジアおよびストレプトミセス・バイ・ペーパークロマ
トグラフィー・オブ・ホール・セル・ヒドロリゼーツ:
アプライド・マイクロバイオロジー(Becker,
B., M.P.Lechevalier, R.E.
Gordon and H.A.Lechevalie
r:Rapid differentiation b
etween Nocardia and Strep
tomyces by paper chromato
graphy of whole cell hydr
olysates:Appl.Microbiol.)
第12巻、第421〜423頁、1964年]および山
口の方法[山口、ティー・:コンパリゾン・オブ・ザ・
セル・ウォール・コンポジション・オブ・モルホロジカ
リー・ディスティンクト・アクチノマイセッツ:ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー(Yamaguchi,
T.:Comparison of the cell
wall composition of morp
hologicallydistinct actin
omycetes:J.Bacteriol.)第89
巻、第444〜453頁、1965年]の方法によって
行った。菌株No.9993の全細胞加水分解物の分析
結果は、LL−ジアミノピメリン酸が存在することを示
した。従ってこの菌株の細胞壁はタイプIに属すると考
えられる。 【0015】[3]生物学的および生理学的性質 菌株No.9993の生理学的性質は、前記シャーリン
グおよびゴットリープに記載されている方法によって測
定した。その結果を表4に示す。生育温度範囲および生
育至適温度は、イースト・マルトエキストラクト寒天
上、温度勾配培養器(東洋化学産業株式会社製)を使用
して測定した。生育温度範囲は18〜35℃で、生育至
適温度は28℃であった。ミルクのペプトン化およびゼ
ラチン液化は陽性であった。メラニン色素の産出は陰性
であった。 表4.菌株No.9993およびストレプトミセス・ミ
サキエンシスIFO12891の生理学的性質 【表4】 炭素源の利用性をプリドハムおよびゴットリープの方法
[プリドハム・ティー・ジー・およびディー・ゴットリ
ープ:ザ・ユーティライゼーション・オブ・カーボン・
コンパウンズ・バイ・サム・アクチノマイセッテールズ
・アズ・アン・エイド・フォー・スペシーズ・デターミ
ネーション:ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(P
ridham,T.G.and D.Gottlie
b:Theutilization of carbo
n compounds bysome Actino
mycetales as an aid for s
pecies determination:J.Ba
cteriol.)第56巻、第107〜114頁、1
948年]によって試験した。30℃で14日間培養後
に、生育状況を観察した。この菌株の炭素源の利用性を
表5〜6にまとめて示す。グリセリン、マルトースおよ
びコハク酸ナトリウムは菌株No.9993により利用
された。さらにまた、D−グルコース、シュークロー
ス、D−マンノースおよびサリシンは多少利用する。 【0016】表5〜6.菌株No.9993およびスト
レプトミセス・ミサキエンシスIFO12891の炭素
源利用性 【表5】 【表6】 菌株No.9993の顕微鏡学的観察および細胞壁組成
分析の結果から、この菌株がワクスマン(Waksma
n)およびヘンリシ(Henrici)、1943年、
によるストレプトミセス属に属することが明らかとなっ
た。すなわち、この菌株を公表されている性状[インタ
ーナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・
バクテリオロジー(InternationalJou
rnal of Systematic Bacter
iology)第18巻、第69〜189頁、第279
〜392頁、1968年および第19巻、第391〜5
12頁、1969年、ならびにバージェイズ・マニュア
ル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー
(Bergey’s Manualof Determ
inative Bacteriology)第8版、
1974年]に照らして、ストレプトミセス属の種々の
種と比較した。比較の結果、菌株No.9993はスト
レプトミセス・アブラヴィエンシス・ニシムラ等(St
reptomyces aburaviensis N
ishimura et.al.)、ストレプトミセス
・アヴェラネウス・バルダッシおよびグレイン(Str
eptomyces avellaneus Bald
acci and Grein)およびストレプトミセ
ス・ミサキエンシス・ナカムラに類似していると考えら
れる。従って菌株No.9993の培養特性を、対応す
るストレプトミセス・アブラヴィエンシスIFO128
30、ストレプトミセス・アヴェラネウスIFO134
51およびストレプトミセス・ミサキエンシスIFO1
2891と比較した。その結果菌株No.9993はス
トレプトミセス・ミサキエンシスIFO12891に最
も類似していた。従って菌株No.9993をさらに上
記表1〜6に示したストレプトミセス・ミサキエンシス
IFO12891と詳細に比較した。この結果から、菌
株No.9993はストレプトミセス・ミサキエンシス
IFO12891と下記の点で区別することができ、従
って菌株No.9993はストレプトミセスの新種であ
ると考えられ、この微生物が茨城県筑波郡で採取した土
壌にちなんでストレプトミセス・ツクバエンシス・スプ
・ノブ(Streptomyces tsukubae
nsis sp.nov.)と命名された。 【0017】ストレプトミセス・ミサキエンシスIFO
12891との相違 菌株No.9993の培養特性は、ストレプトミセス・
ミサキエンシスIFO12891とは、オートミール寒
天、イースト・マルトエキストラクト寒天、グルコース
・アスパラギン寒天、スザペック寒天およびポテト・デ
キストロース寒天を用いて培養したとき異なる。菌株N
o.9993のスターチ加水分解は陰性であるが、スト
レプトミセス・ミサキエンシスIFO12891の場合
は陽性である。菌株No.9993のゼラチン液化は陽
性であるが、ストレプトミセス・ミサキエンシスIFO
12891の場合は陰性である。炭素源の利用性におい
ては、菌株No.9993はグリセリン、マルトースお
よびコハク酸ナトリウムを利用するが、ストレプトミセ
ス・ミサキエンシスIFO12891はこれらを利用し
ない。さらに、菌株No.9993はD−ガラクトース
およびイヌリンを利用しないが、ストレプトミセス・ミ
サキエンシスIFO12891はこれらを利用できる。 【0018】FR−900506物質、FR−9005
20物質およびFR−900525物質の産生 この発明の新規なFR−900506物質、FR−90
0520物質およびFR−900525物質は、例えば
ストレプトミセス・ツクバエンシスNo.9993、
(寄託番号:微工研条寄第927号)のようなストレプ
トミセス属に属するFR−900506、FR−900
520および/またはFR−900525物質生産菌株
を培地中で培養することにより産生できる。一般的に
は、FR−900506物質、FR−900520物質
および/またはFR−900525物質は、FR−90
0506、FR−900520および/またはFR−9
00525物質生産菌株を、同化しうる炭素源および窒
素源を含有する水性培地中で、好ましくは例えば振とう
培養、深部培養等の好気性条件下で培養することにより
産生できる。培地の好ましい炭素源としては、グルコー
ス、キシロース、ガラクトース、グリセリン、スター
チ、デキストリン等のような炭水化物が挙げられる。他
の炭素源としてはマルトース、ラムノース、ラフィノー
ス、アラビノース、マンノース、サリシン、コハク酸ナ
トリウム等が挙げられる。好ましい窒素源としてはイー
スト・エキストララクト、ペプトン、グルテンミール、
綿実粉、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、乾燥イ
ースト、小麦胚芽、羽毛粉、落花生粉等、ならびに例え
ば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸アンモニ
ウム等のアンモニウム塩、尿素、アミノ酸等のような無
機または有機窒素化合物が挙げられる。炭素源および窒
素源は好ましくはそれらの組合わせで使用されるが、微
量の生育因子および相当量の無機栄養素を含有していれ
ば純度の低い物質も使用でき、必ずしも純粋な形で使用
する必要はない。所望により培地に炭酸ナトリウムまた
は炭酸カルシウム、燐酸ナトリウムまたは燐酸カリウ
ム、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、沃化ナトリウ
ムまたは沃化カリウム、マグネシウム塩、銅塩、コバル
ト塩等の無機塩を添加してもよい。特に培養培地が著し
く発泡する場合には、必要により液状パラフィン、脂肪
油、植物油、鉱油またはシリコンのような消泡剤を添加
してもよい。FR−900506物質、FR−9005
20物質およびFR−900525物質を大量生産する
条件としては、深部好気培養が好ましい。少量生産には
フラスコまたはびん中で振とう培養または表面培養が行
われる。さらにまた、大型タンク内で生育を実施する場
合には、FR−900506物質、FR−900520
物質およびFR−900525物質の生産工程における
生育遅延を回避するために、微生物の前培養を用いて生
産タンク中に菌を接種するのが好ましい。すなわち、比
較的少量の培養培地に微生物の胞子または菌糸を接種
し、その接種培地を培養して微生物の前培養接種物をま
ず生産し、次いで培養した前培養接種物を無菌的に大型
タンクに移すのが望ましい。この前培養接種物を生産す
る培地は、FR−900506物質、FR−90052
0物質およびFR−900525物質の生産に使用され
る培地と実質的に同じであってもよく、また異なっても
よい。培養混合物の撹拌および通気は種々の方法で行う
ことができる。撹拌はプロペラまたはこれに準ずる撹拌
装置を用いるか、醗酵器を回転させるかまたは振とうす
るか、種々のポンプ装置を用いるか、または培地中に滅
菌空気を通すことによっても行うことができる。通気は
滅菌空気を醗酵混合物中を通過させることにより行って
もよい。醗酵は通常、約20℃〜40℃の温度範囲、好
ましくは25〜35℃で、約50〜150時間行われる
が、醗酵条件および醗酵規模によって適宜変化させれば
よい。 【0019】このようにして生産されたFR−9005
06物質、FR−900520物質およびFR−900
525物質は、他の既知の生物学的活性物質の回収に通
常使用される慣用の方法で培養培地から回収することが
できる。生産されたFR−900506物質、FR−9
00520物質およびFR−900525物質は、培養
菌糸中および濾液中に見出され、従ってFR−9005
06物質、FR−900520物質およびFR−900
525物質は、培養ブロスの濾過または遠心分離によっ
て得られる菌糸および濾液から、減圧濃縮、凍結乾燥、
常用の溶媒による抽出、pH調整、例えば陰イオン交換
樹脂または陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等の
常用の樹脂による処理、例えば活性炭、ケイ酸、シリカ
ゲル、セルロース、アルミナ等の常用の吸着剤による処
理、結晶化、再結晶化等の慣用の方法によって分離、精
製することができる。 【0020】FR−900506物質、FR−9005
20物質およびFR−900525物質の物理化学的性
質 上記醗酵法によって生産されたFR−900506物
質、FR−900520物質およびFR−900525
物質は下記の物理化学的性質を有する。 FR−900506物質 (1) 形状および色調: 白色粉末 (3) 呈色反応: 陽性:硫酸セリウム反応、硫酸反応、エールリッヒ反
応、ドラーゲンドルフ反応、沃素蒸気反応 陰性:塩化第二鉄反応、ニンヒドリン反応、モーリッシ
ュ反応 (4) 溶解性: 可溶:メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチ
ル、クロロホルム、ジエチルエーテル、ベンゼン 難溶:ヘキサン、石油エーテル 不溶:水 (5) 融点: 85〜90℃ (6) 比旋光度: [α]23 D:-73゜ (C=0.8,CHCl3) (7) 紫外線吸収スペクトル: 末端吸収 (8) 赤外線吸収スペクトル: νCHCl 3 max:3680, 3580, 3520, 2930, 2870, 2830, 1
745, 1720, 1700,1645, 1450, 1380, 1350, 1330, 131
0, 1285, 1170, 1135,1090, 1050, 1030, 1000, 990, 9
60 (sh), 918 cm-1 (9) 13C核磁気共鳴スペクトル: δ(ppm,CDCl3):{212.59 (s), 212.45 (s)}, {196.18
(s), 192.87 (s)},{169.07 (s), 168.90 (s)}, {164.90
(s), 166.01 (s)},{138.89 (s), 139.67 (s)}, {135.7
3 (d), 135.60 (d)},{132.52 (s), 131.99 (s)}, {130.
27 (d), 130.21 (d)},{122.87 (d), 123.01 (d)}, {11
6.57 (t), 116.56 (t)},{97.35 (s), 98.76 (s)}, 84.4
1 (d), {77.79 (d), 78.22 (d)},{75.54 (d), 76.97
(d)}, {73.93 (d), 73.09 (d)},{73.72 (d), 72.57
(d)}, {70.05 (d), 69.15 (d)}, 56.75 (d),{53.03
(d), 53.13 (d)}, {48.85 (t), 48.62 (t)},{40.33
(d), 40.85 (d)}, 39.40 (t), 31.58 (t), 30.79 (t),
{27.72 (t), 26.34 (t)}, 26.46 (d), 24.65 (t),{20.4
5 (q), 19.73 (q)}, {14.06 (q), 14.23 (q)},{9.69
(q), 9.98 (q)} 上記スペクトルのチャートを図1に示す。 (10) 1H核磁気共鳴スペクトル:上記スペクトルのチャ
ートを図2に示す。 (11)薄層クロマトグラフィー: 【表7】 (12)物質の性質: 中性物質 FR−900506物質に関して、13Cおよび 1H核磁
気共鳴スペクトルの測定の際、この物質は種々の化学シ
フトにおいてそれぞれ1対のシグナルを示す。このよう
な特徴を有するFR−900506物質は、さらに下記
の性質を有する。 (i)13C核磁気共鳴スペクトルを25℃および60℃
において測定したところ、それぞれ1対のシグナルの強
度比が変化する。 (ii)薄層クロマトグラフィーおよび高速液体クロマ
トグラフィーを測定したところ、FR−900506物
質はそれぞれ薄層クロマトグラフィーでは単一スポット
として、高速液体クロマトグラフィーでは単一ピークと
して現れる。 【0021】FR−900506物質のこの白色粉末は
アセトニトリルから再結晶すると結晶の形状に変化し、
この結晶は下記の物理化学的性質を有する。 (1) 形状および色調: 無色のプリズム状結晶 (3) 融点: 127〜129℃ (4) 比旋光度: [α]23 D :-84.4゜ (C=1.02,CHCl3) (5) 13C核磁気共鳴スペクトル: δ(ppm,CDCl3):{211.98 (s), 211.74 (s)}, {196.28
(s), 193.56 (s)},{168.97 (s), 168.81 (s)}, {164.85
(s), 165.97 (s)},{138.76 (s), 139.51 (s)}, {135.7
3 (d), 135.63 (d)},{132.38 (s), 131.90 (s)}, {130.
39 (d), 130.17 (d)},{122.82 (d), 122.96 (d)}, 116.
43 (t), {97.19 (s), 98.63 (s)},84.29 (d), {77.84
(d), 78.21 (d)}, {77.52 (d), 76.97 (d)},{69.89
(d), 69.00 (d)}, {56.63 (d), 54.87 (d)},{52.97
(d), 52.82 (d)}, {48.76 (t), 48.31 (t)},{40.21
(d), 40.54 (d)}, 31.62 (t), 30.72 (t), 24.56 (t),
{21.12 (t), 20.86 (t)}, {20.33 (q), 19.74 (q)},{1
6.17 (q), 16.10 (q)}, {15.88 (q), 15.75 (q)},{13.8
9 (q), 14.05 (q)}, {9.64 (q), 9.96 (q)} 上記スペクトルのチャートを図3に示す。 (6) 1H核磁気共鳴スペクトル:上記スペクトルのチャー
トを図4に示す。その他の物理化学的性質、すなわちF
R−900506物質の無色のプリズム状結晶の呈色反
応、溶解性、紫外線吸収スペクトル、赤外線吸収スペク
トル、薄層クロマトグラフィーおよび物性の性質は、白
色粉末のそれらと同じであった。上記物理化学的性質お
よびX線解析から、FR−900506物質は下記の化
学構造を有することがわかった。 【化22】 17−アリル−1,14−ジヒドロキシ−12−[2−
(4−ヒドロキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1
−メチルビニル]−23,25−ジメトキシ−13,1
9,21,27−テトラメチル−11,28−ジオキサ
−4−アザトリシクロ[22.3.1.04,9]オクタ
コス−18−エン−2,3,10,16−テトラオン 【0022】FR−900520物質 この化合物の物理化学的性質は後に述べる。 FR−900525物質 (1) 形状および色調: 白色粉末 (2) 元素分析値: C:65.17%,H:8.53%,N:1.76% (3) 呈色反応: 陽性:硫酸セリウム反応、硫酸反応、エールリッヒ反
応、ドラーゲンドルフ反応、沃素蒸気反応 陰性:塩化第二鉄反応、ニンヒドリン反応、モーリッシ
ュ反応 (4) 溶解性: 可溶:メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチ
ル、クロロホルム、ジエチルエーテル、ベンゼン 難溶:ヘキサン、石油エーテル 不溶:水 (5) 融点: 85〜89℃ (6) 比旋光度: [α]23 D :-88゜ (C=1.0,CHCl3) (7) 紫外線吸収スペクトル: 末端吸収 (8) 赤外線吸収スペクトル: νCHCl 3 max:3680, 3580, 3475, 3340, 2940, 2880, 2
830, 1755, 1705,1635, 1455, 1382, 1370, 1330, 131
0, 1273, 1170, 1135,1093, 1050, 1020, 995, 970, 92
0, 867 cm-1 (9) 13C核磁気共鳴スペクトル: δ(ppm,CDCl3):{212.61 (s), 211.87 (s)}, {188.57
(s), 191.12 (s)},{168.76 (s), 170.18 (s)}, {163.11
(s), 161.39 (s)},{140.28 (s), 139.37 (s)}, {135.6
2 (d), 135.70 (d)},{132.28 (s), 131.34 (s)}, {130.
09 (d), 130.00 (d)},{122.50 (d), 123.23 (d)}, 11
6.48 (t), {99.16 (s), 99.11 (s)},{84.42 (d), 84.48
(d)}, {78.60 (d), 79.86 (d)},{76.73 (d), 77.33
(d)}, {59.97 (d), 60.45 (d)},57.52 (q), {56.56
(q), 56.48 (q)}, {56.14 (q), 55.97 (q)},{53.45
(d), 53.26 (d)}, {49.15 (t), 49.73 (t)},{48.46
(t), 47.62 (t)}, {44.47 (t), 45.23 (t)},{41.40
(d), 40.40 (d)}, {35.19 (d), 35.11 (d)},{33.10
(d), 34.17 (d)}, {32.81 (t), 32.29 (t)},{31.53
(t), 31.33 (t)}, {30.80 (t), 30.66 (t)}, 28.60
(t),{26.03 (d), 26.98 (d)}, {25.43 (t), 24.40
(t)},{18.93 (q), 20.57 (q)}, {14.09 (q), 13.95
(q)},{9.85 (q), 10.00 (q)} 上記スペクトルのチャートを図5に示す。 (10) 1H核磁気共鳴スペクトル:上記スペクトルのチャ
ートを図6に示す。 (11)薄層クロマトグラフィー: 【表8】 (12)物質の性質: 中性物質 FR−900525物質に関して、13Cおよび 1H核磁
気共鳴スペクトルの測定の際、この物質は種々の化学シ
フトにおいてそれぞれ1対のシグナルを示したが、薄層
クロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー
を測定したところ、FR−900525物質はそれぞれ
薄層クロマトグラフィーで単一スポット、高速液体クロ
マトグラフィーでは単一ピークを示した。上記物理化学
的性質およびFR−900506物質の化学構造が決定
されたことにより、FR−900525物質は下記の化
学構造を有することが判明した。 【化23】 16−アリル−1,13−ジヒドロキシ−11−[2−
(4−ヒドロキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1
−メチルビニル]−22,24−ジメトキシ−12,1
8,20,26−テトラメチル−10,27−ジオキサ
−4−アザトリシクロ[21.3.1.04,8]ヘプタ
コス−17−エン−2,3,9,15−テトラオン [B]この発明のFR−900520物質およびFR−9
00523物質は、ストレプトミセス・ハイグロスコピ
カス・サブスプ・ヤクシマエンシスNo.7238のよ
うなストレプトミセス属に属するFR−900520お
よび/またはFR−900523物質−生産菌株を、培
地中で醗酵させることにより生産できる。 【0023】微生物 FR−900520物質および/またはFR−9005
23物質の生産に使用される菌は、ストレプトミセス属
に属するFR−900520および/またはFR−90
0523物質−生産菌株であり、それらのうちストレプ
トミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ・ヤクシマエ
ンシスNo.7238が鹿児島県屋久島で採取された土
壌試料から新たに分離された。この新たに分離されたス
トレプトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ・ヤク
シマエンシスNo.7238の凍結乾燥標本は、工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託番号微工研菌寄第80
43号として、1985年1月12日付で寄託され、次
いで1985年10月19日付で新しい寄託番号微工研
条寄第928号として同寄託機関のブダペスト条約ルー
トに切り換えられた。新規なFR−900520物質お
よびFR−900523物質の生産において、この明細
書に記載した菌は単に説明のためにのみ掲げたものであ
って、それに限定されるものではない。この発明にはま
た、自然突然変異菌ならびにX線照射、紫外線照射、N
−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、2
−アミノプリン処理等のような慣用の処理によってつく
られる人工突然変異菌をも含む、FR−900520物
質および/またはFR−900523物質を産生できる
いかなる突然変異菌を使用する場合も含まれる。ストレ
プトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ・ヤクシマ
エンシスNo.7238は下記のような形態学的性質、
培養特性、生物学的および生理学的特徴を有する。 [1]形態学的特徴 前述のシャーリングおよびゴットリープによって記載さ
れている方法を主としてこの分類学上の研究に用いた。
形態学的観察は、オートミール寒天、イースト・マルト
エキストラクト寒天および無機塩・スターチ寒天上、3
0℃で14日間生育させた培養物を用い、光学および電
子顕微鏡により行った。成熟胞子体は幾分短かく、それ
ぞれの鎖に約20個の胞子を有する鍵状(Retina
culiaperti)およびら旋状(Spirale
s)を形成していた。吸湿性の胞子塊がオートミール寒
天および無機塩・スターチ寒天上の気菌糸に見られた。
胞子表面の不揃いの凹凸は非常に短くて太い棘といぼと
の間の中間の形状であった。 【0024】[2]培養特性 培養特性は、上記シャーリングおよびゴットリープ、な
らびに前述のワクスマンに記載の10種類の培地上で観
察した。30℃で14日間培養した。この研究で使用し
た色名は前記新色名帖に基づいた。オートミール寒天、
イースト・マルトエキストラクト寒天および無機塩・ス
ターチ寒天上で生育させた場合、コロニーは灰色系に属
していた。可溶性色素は試験した培地中では産生されな
かった。結果を表9〜12に示す。 表9〜12.菌株No.7238、ストレプトミセス・
アンチマイコティクス(Streptomyces a
ntimicoticus)IFO12839およびス
トレプトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ・グレ
ボスス(Streptomyces hygrosco
picus subsp.glebosus)IFO1
3786の培養特性 【表9】【表10】 【表11】 【表12】 【0025】細胞壁分析を前述のベッカー等および山口
の方法によって行った。菌株No.7238の全細胞加
水分解物の分析結果は、LL−ジアミノピメリン酸の存
在を示していた。従ってこの菌株の細胞壁はタイプIに
属すると考えられる。 [3] 生物学的および生理学的性質 菌株No.7238の生理学的性質は、前記シャーリン
グおよびゴットリープ記載の方法に従って測定した。そ
の結果を表13に示す。生育温度範囲および生育至適温
度は、イースト・マルトエキストラクト寒天上、温度勾
配培養器(東洋化学産業株式会社製)を使用して測定し
た。生育温度範囲は18〜36℃で、至適温度は28℃
であった。スターチ加水分解およびゼラチン液化は陽性
であった。メラニン色素は産生されなかった。 表13.菌株No.7238、ストレプトミセス・アン
チマイコティクスIFO12839およびストレプトミ
セス・ハイグロスコピカス・サブスプ・グレボススIF
O13786の生理学的性質 【表13】 炭素源の利用性を前述のプリドハムおよびゴットリープ
の方法によって試験した。生育状態を30℃で14日間
培養した後観察した。この菌株の炭素源利用性を表14
〜15にまとめて示す。D−グルコース、シュークロー
ス、ラクトース、マルトース、D−トレハロース、イノ
シトール、イヌリンおよびサリシンが菌株No.723
8により利用された。 表14〜15.菌株No.7238、ストレプトミセス
・アンチマイコティクスIFO12839およびストレ
プトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ・グレボス
スIFO13786の炭素源利用性 【表14】 【表15】 菌株No.7238の顕微鏡学的観察および細胞壁組成
分析結果から、この菌株がワクスマンおよびヘンリシ、
1943年によるストレプトミセス属に属することが明
らかとなった。従って、この菌株を公表された性状[イ
ンターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティッ
ク・バクテリオロジー(International
Journal of Systematic Bac
teriology)第18巻、69〜189頁、27
9〜392頁、1968年および第19巻、391〜5
12頁、1969年ならびにバージェイズ・マニュアル
・オブ・デターミネーティブ・バクテリオロジー第8
版、1974年 (Bergey’s Manual
of Determinative Bacterio
logy 8thEdition,1974)]に照ら
して種々のストレプトミセス属に属する種と比較した。
比較の結果、菌株No.7238はストレプトミセス・
アンチマイコティクス・ワクスマン1957およびスト
レプトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ・グレボ
ススオオモリ等に類似していると考えられる。従って菌
株No.7238の培養特性を、さらに対応するストレ
プトミセス・アンチマイコティクスIFO12839お
よびストレプトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ
・グレボススIFO13786と、表9〜15に示した
ように比較した。この詳細比較の結果から、菌株No.
7238はストレプトミセス・アンチマイコティクスI
FO12839およびストレプトミセス・ハイグロスコ
ピカス・サブスプ・グレボススIFO13786とは下
記の点で区別することができた。 【0026】(i)ストレプトミセス・アンチマイコティ
クスIFO12839との相違 菌株No.7238の培養特性は、ストレプトミセス・
アンチマイコティクスIFO12839とは、イースト
・マルトエキストラクト寒天、グルコース・アスパラギ
ン寒天、グリセリンアスパラギン寒天、ポテト・デキス
トロース寒天およびチロシン寒天を用いて培養したとき
異なる。炭素源の利用性では、菌株No.7238はマ
ルトースを利用するが、ストレプトミセス・アンチマイ
コティクスIFO12839は利用しない。さらに、菌
株No.7238はグリセリン、D−フルクトース、ラ
ムノース、ラフィノース、D−ガラクトース、D−マン
ノース、マンニトールおよびコハク酸ナトリウムを利用
しないが、ストレプトミセス・アンチマイコティクスI
FO12839は利用する。 【0027】(ii)ストレプトミセス・ハイグロスコ
ピカス・サブスプ・グレボススIFO13786との相
違 菌株No.7238の培養特性は、ストレプトミセス・
ハイグロスコピカス・サブスプ・グレボススIFO13
786とは、イースト・マルトエキストラクト寒天、ポ
テト・デキストロース寒天およびチロシン寒天を用いて
培養したとき異なる。菌株No.7238のミルクペプ
トン化は陰性であるが、ストレプトミセス・ハイグロス
コピカス・サブスプ・グレボススIFO13786は陽
性である。菌株No.7238は7%NaClの存在下
に生育しうるが、ストレプトミセス・ハイグロスコピカ
ス・サブスプ・グレボススIFO13786は同条件下
には生育しない。炭素源の利用性では、菌株No.72
38はラクトース、イヌリンおよびサリシンを利用しう
るが、ストレプトミセス・ハイグロスコピカス・サブス
プ・グレボススIFO13786はそれらを利用しな
い。また、菌株No.7238はグリセリン、D−キシ
ロース、D−フルクトース、ラフィノース、D−ガラク
トース、D−マンノース、マンニトールおよびコハク酸
ナトリウムを利用しないが、ストレプトミセス・ハイグ
ロスコピカス・サブスプ・グレボススIFO13786
はそれらを利用する。しかしながら、菌株No.723
8はオートミール寒天および無機塩スターチ寒天で気菌
糸に吸湿性胞子塊を形成し、さらに菌株No.7238
の形態学的特徴および培養特性はストレプトミセス・ハ
イグロスコピカス・サブスプ・グレボススIFO137
86に類似している。従って菌株No.7238はスト
レプトミセス・ハイグロスコピカスに属し、この公知の
菌株がストレプトミセス・ハイグロスコピカスの亜種中
では菌株No.7238に最も類似しているけれども、
菌株No.7238はストレプトミセス・ハイグロスコ
ピカス・サブスプ・グレボススIFO13786とは異
なる。以上の事実から菌株No.7238は、ストレプ
トミセス・ハイグロスコピカスの新亜種であると考えら
れ、微生物が屋久島の土壌から分離されたことにちなん
で、ストレプトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ
・ヤクシマエンシス(Streptomyceshyg
roscopicus subsp.yakushim
aensis)と命名された。 【0028】FR−900520物質およびFR−90
0523物質の産生 この発明の新規なFR−900520物質および/また
はFR−900523物質は、例えばストレプトミセス
・ハイグロスコピカス・サブスプ・ヤクシマエンシスN
o.7238(寄託番号:微工研条寄第928号)のよ
うなストレプトミセス属に属するFR−900520お
よび/またはFR−900523物質生産菌株を培地で
培養することにより産生できる。一般的には、FR−9
00520物質および/またはFR−900523物質
は、FR−900520および/またはFR−9005
23物質生産菌株を同化しうる炭素源および窒素源を含
む水性栄養培地中、好ましくは例えば振とう培養、深部
培養等の好気性条件下に培養することによって産生でき
る。培地中の好ましい炭素源としては、グルコース、シ
ュークロース、ラクトース、グリセリン、スターチ、デ
キストリン等のような炭水化物が挙げられる。その他培
地中に含まれていてもよい炭素源としては、マルトー
ス、D−トレハロース、イノシトール、イヌリン、サリ
シン等が挙げられる。好ましい窒素源としてはイースト
・エキストラクト、ペプトン、グルテンミール、綿実
粉、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、乾燥イース
ト、小麦胚芽、羽毛粉、落花生粉等、ならびに例えば硝
酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸アンモニウム
等のアンモニウム塩、尿素、アミノ酸等のような無機ま
たは有機窒素化合物が挙げられる。炭素源および窒素源
は好ましくはそれらの組合わせで使用されるが、微量の
生育因子および相当量の無機栄養素を含有していれば純
度の低い物質も使用でき、必ずしも純粋な形で使用する
必要はない。所望により培地に炭酸ナトリウムまたは炭
酸カルシウム、燐酸ナトリウムまたは燐酸カリウム、塩
化ナトリウムまたは塩化カリウム、沃化ナトリウムまた
は沃化カリウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等
の無機塩を添加してもよい。特に培養培地が著しく発泡
する場合には、必要により液状パラフィン、脂肪油、植
物油、鉱油またはシリコンのような消泡剤を添加しても
よい。FR−900520物質およびFR−90052
3物質を大量生産する条件としては、深部好気培養が好
ましい。少量生産にはフラスコまたはびん中で振とう培
養または表面培養が行われる。さらにまた、大型タンク
内で生育を実施する場合には、FR−900520物質
およびFR−900523物質の生産工程における生育
遅延を回避するために、微生物の前培養を用いて生産タ
ンク中に菌を接種するのが好ましい。すなわち、比較的
少量の培養培地に微生物の胞子または菌糸を接種し、そ
の接種培地を培養して微生物の前培養接種物をまず生産
し、次いで培養した前培養接種物を無菌的に大型タンク
に移すのが望ましい。この前培養接種物を生産する培地
は、FR−900520物質およびFR−900523
物質の生産に使用される培地と実質的に同じであっても
よく、また異なってもよい。培養混合物の撹拌および通
気は種々の方法で行うことができる。撹拌はプロペラま
たはこれに準ずる撹拌装置を用いるか、醗酵器を回転さ
せるかまたは振とうするか、種々のポンプ装置を用いる
か、または培地中に滅菌空気を通すことによっても行う
ことができる。通気は滅菌空気を醗酵混合物中を通過さ
せることにより行ってもよい。醗酵は通常、約20℃〜
40℃の温度範囲、好ましくは25〜35℃で、約50
〜150時間行われるが、醗酵条件および醗酵規模によ
って適宜変化させればよい。このようにして生産された
FR−900520物質およびFR−900523物質
は、他の既知の生物学的活性物質の回収に通常使用され
る慣用の方法で培養培地から回収することができる。生
産されたFR−900520物質およびFR−9005
23物質は、培養菌糸中および濾液中に見出され、従っ
てFR−900520物質およびFR−900523物
質は、培養ブロスの濾過または遠心分離によって得られ
る菌糸および濾液から、減圧濃縮、凍結乾燥、常用の溶
媒による抽出、pH調整、例えば陰イオン交換樹脂また
は陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等の常用の樹
脂による処理、例えば活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セ
ルロース、アルミナ等の常用の吸着剤による処理、結晶
化、再結晶化等の慣用の方法によって分離、精製するこ
とができる。特に、FR−900520物質およびFR
−900523物質は、醗酵によって産生された両生成
物を含む物質を、酢酸エチル、n−ヘキサン等のような
適切な溶媒に溶解し、次いでその溶液をクロマトグラフ
ィー、例えば、シリカゲルを使用するカラムクロマトグ
ラフィーに付し、酢酸エチルおよびn−ヘキサン、また
はそれらの混合物のような適切な溶媒で溶出することに
より分離することができる。また、このようにして分離
されたFR−900520物質およびFR−90052
3物質はそれぞれ、例えば再結晶、再クロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー等の常法によってさら
に精製することができる。 【0029】FR−900520物質およびFR−90
0523物質の物理化学的性質 FR−900520物質 (1) 形状および色調: 無色の板状結晶 (2) 元素分析値: C: 64.81%, H : 8.82%, N : 1.55% (3) 呈色反応: 陽性:硫酸セリウム反応、硫酸反応、エールリッヒ反
応、ドラーゲンドルフ反応、沃素蒸気反応 陰性:塩化第二鉄反応、ニンヒドリン反応、モーリッシ
ュ反応 (4) 溶解性: 可溶:メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチ
ル、クロロホルム、ジエチルエーテル、ベンゼン 難溶:n−ヘキサン、石油エーテル 不溶:水 (5) 融点: 163〜165℃ (6) 比旋光度: [α]23 D : -84.1°(C = 1.0, CHCl3) (7) 紫外線吸収スペクトル: 末端吸収 (8) 赤外線吸収スペクトル: νCHCl 3 max : 3680, 3575, 3520, 2940, 2875, 2825,
1745, 1725, 1700,1647, 1610 (sh), 1452, 1380, 135
0, 1330, 1285, 1170,1135, 1090, 1030, 1005, 990,
980 (sh), 960 (sh), 913,908(sh) cm-1 (9) 13C核磁気共鳴スペクトル: δ(ppm, CDCl3): 213.04 (s), {196.21 (s), 193.23
(s)},{169.07 (s), 168.85 (s)}, {164.92 (s), 165.9
7 (s)},{138.67 (s), 139.53 (s)}, {132.46 (s), 131.
98 (s)},{130.20 (d), 130.08 (d)}, {123.42 (d), 12
3.59 (d)},{97.28 (s), 98.75 (s)}, 84.37 (d), {7
7.80 (d), 78.24 (d)},{75.53 (d), 76.98 (d)}, 73.9
2 (d), 73.69 (d),{73.11 (d), 72.72 (d)}, {70.11
(d), 69.21 (d)}, 57.02 (q),{56.60 (q), 57.43
(q)}, {56.23 (q), 55.98 (q)},{56.72 (d), 52.91
(d)}, {55.10 (d), 54.90 (d)},{48.90 (t), 48.57
(t)}, {40.19 (d), 40.63 (d)},{27.67 (t), 26.32
(t)}, {26.51 (d), 26.44 (d)}, 24.60 (t),{21.19
(t), 20.86 (t)}, {20.47 (q), 19.75 (q)},{16.21
(q), 15.97 (q)}, {15.83 (q), 15.94 (q)},{14.04
(q), 14.16 (q)}, 11.68 (q), {9.64 (q), 9.93 (q)} 上記スペクトルのチャートを図7に示す。 (10) 1H核磁気共鳴スペクトル:上記スペクトルのチャ
ートを図8に示す。 (11)薄層クロマトグラフィー: 【表16】 (12)物質の性質: 中性物質 FR−900520物質に関して、13Cおよび 1H核磁
気共鳴スペクトルの測定の際、この物質は種々の化学シ
フトにそれぞれ1対のシグナルを示すが、薄層クロマト
グラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーを測定し
たところ、FR−900520物質は薄層クロマトグラ
フィーで単一スポットを高速液体クロマトグラフィーで
単一ピークをそれぞれ示した。 【0030】上記物理化学的性質およびFR−9005
06物質の化学構造が決定されたことにより、FR−9
00520物質は下記の化学構造を有することが判明し
た。 【化24】 17−エチル−1,14−ジヒドロキシ−12−[2−
(4−ヒドロキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1
−メチルビニル]−23,25−ジメトキシ−13,1
9,21,27−テトラメチル−11,28−ジオキサ
−4−アザトリシクロ[22.3.1.04,9]オクタ
コス−18−エン−2,3,10,16−テトラオン FR−900523物質 (1) 形状および色調: 無色の針状結晶 (2) 元素分析値: C:64.57% , H:8.84% , N:1.81% (3) 呈色反応: 陽性:硫酸セリウム反応、硫酸反応、エールリッヒ反
応、ドラーゲンドルフ反応、沃素蒸気反応 陰性:酸化第二鉄反応、ニンヒドリン反応 (4) 溶解性: 可溶:メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチ
ル、クロロホルム、ジエチルエーテル、ベンゼン 難溶:n−ヘキサン、石油エーテル 不溶:水 (5) 融点: 152〜154℃ (6) 比旋光度: [α]23 D:-73.0° (C=0.65, CHCl3) (7) 紫外線吸収スペクトル: 末端吸収 (8) 赤外線吸収スペクトル: νCHCl 3 max:3670, 3580, 3510, 2930, 2875, 2825, 1
745, 1722, 1700,1647, 1450, 1380, 1350, 1330, 130
7, 1285, 1170, 1135,1090, 1050, 1030, 1000, 990, 9
78, 960, 930, 915, 888,870, 850 cm-1 (9) 13C核磁気共鳴スペクトル: δ(ppm, CDCl3):{213.82 (s), 213.32 (s)}, {196.31
(s), 193.34 (s)},{168.96 (s), 168.85 (s)}, {164.84
(s), 165.98 (s)},{137.80 (s), 138.41 (s)}, {132.8
9 (s), 131.96 (s)},{129.62 (d), 130.03 (d)}, {124.
51 (d), 124.84 (d)},{97.13 (s), 98.67 (s)}, 84.38
(d), {76.69 (d), 78.06 (d)},{75.45 (d), 76.91
(d)}, {73.89 (d), 73.70 (d)}, 73.70 (d),{73.09
(d), 72.84 (d)}, {70.40 (d), 69.24 (d)},{56.75
(d), 52.89 (d)}, {56.93 (q), 57.43 (q)},{56.61
(q), 56.56 (q)}, {56.24 (q), 55.94 (q)},{48.58
(t), 48.32 (t)}, {47.14 (d), 47.38 (d)},{40.23
(d), 40.65 (d)}, {27.85 (t), 26.32 (t)},{26.48
(d), 26.64 (d)}, 24.68 (t), {21.33 (t), 20.83
(t)},{20.63 (q), 19.77 (q)}, {16.24 (q), 16.34
(q)},{15.70 (q), 15.96 (q)}, {15.51 (q), 15.96
(q)},{14.31 (q), 14.18 (q)}, {9.64 (q), 10.04 (q)} 上記スペクトルのチャートを図9に示す。 (10) 1H核磁気共鳴スペクトル:上記スペクトルのチャ
ートを図10に示す。 (11)薄層クロマトグラフィー: 【表17】 (12)物質の性質: 中性物質 FR−900523物質に関して、13Cおよび 1H核磁
気共鳴スペクトルの測定の際に、この物質は種々の化学
シフトにそれぞれ1対のシグナルを示すが、薄層クロマ
トグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーの測定
の場合には、FR−900523物質はそれぞれ薄層ク
ロマトグラフィーで単一スポットを、高速液体クロマト
グラフィーで単一ピークを示した。 【0031】上記物理化学的性質およびFR−9005
06物質の化学構造が決定されたことにより、FR−9
00523物質は下記の化学構造を有することが判明し
た。 【化25】 1,14−ジヒドロキシ−12−[2−(4−ヒドロキ
シ−3−メトキシシクロヘキシル)−1−メチルビニ
ル]−23,25−ジメトキシ−13,17,19,2
1,27−ペンタメチル−11,28−ジオキサ−4−
アザトリシクロ[22.3.1.04,9]オクタコス−
18−エン−2,3,10,16−テトラオン 【0032】[II]合成法: (1)製造法1:(ヒドロキシ保護基の導入) 化合物(Ib)またはその塩は、化合物(Ia)または
その塩にヒドロキシ保護基を導入することによって製造
できる。この反応において使われるヒドロキシ保護基の
導入剤としては慣用のもの、例えばジメチルスルホキシ
ド、エチルメチルスルホキシド、プロピルメチルスルホ
キシド、イソプロピルメチルスルホキシド、ブチルメチ
ルスルホキシド、イソブチルメチルスルホキシド、ヘキ
シルメチルスルホキシド等の低級アルキルメチルスルホ
キシドのようなジ(低級)アルキルスルホキシド;例え
ば塩化トリメチルシリル、臭化トリエチルシリル、塩化
トリブチルシリル、塩化t−ブチルジメチルシリル等の
トリ(低級)アルキルシリルハロゲン化物、例えば塩化
メチル−ジフェニルシリル、臭化エチル−ジフェニルシ
リル、塩化プロピル−ジトリルシリル、塩化t−ブチル
−ジフェニルシリル等の低級アルキル−ジアリールシリ
ルハロゲン化物のような三置換シリル化合物;前記アシ
ル基を導入することのできるカルボン酸、スルホン酸お
よび、例えば酸ハロゲン化物、酸無水物、活性アミド、
活性エステルなどのこれらの反応性誘導体のようなアシ
ル化剤等を挙げることができる。このような反応性誘導
体の適切な例としては、酸塩化物、酸臭化物、例えばジ
アルキル燐酸、フェニル燐酸、ジフェニル燐酸、ジベン
ジル燐酸、ハロゲン化燐酸等の置換燐酸、ジアルキル亜
燐酸、亜硫酸、チオ硫酸、硫酸、例えば炭酸メチル、炭
酸エチル、炭酸プロピル等のアルキル炭酸エステル、例
えばピバリン酸、ペンタン酸、イソペンタン酸、2−エ
チルブチル酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸等の
脂肪族カルボン酸、例えば安息香酸等の芳香族カルボン
酸のような酸との混合酸無水物、対称型酸無水物、イミ
ダゾール、4−置換イミダゾール、ジメチルピラゾー
ル、トリアゾール、テトラゾールのようなイミノ基を含
有する複素環式化合物との活性酸アミド、例えばp−ニ
トロフェニルエステル、2,4−ジニトロフェニルエス
テル、トリクロロフェニルエステル、ペンタクロロフェ
ニルエステル、メシルフェニルエステル、フェニルアゾ
フェニルエステル、フェニルチオエステル、p−ニトロ
フェニルチオエステル、p−クレジルチオエステル、カ
ルボキシメチルチオエステル、ピリジルエステル、ピペ
リジルエステル、8−キノリルチオエステルまたはN,
N−ジメチルヒドロキシルアミン、1−ヒドロキシ−2
−(1H)−ピリドン、N−ヒドロキシスクシンイミ
ド、N−ヒドロキシフタルイミド、1−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール、1−ヒドロキシ−6−クロロベンゾト
リアゾールのようなN−ヒドロキシ化合物とのエステル
等の活性エステル等が挙げられる。この反応において、
ジ(低級)アルキルスルホキシドがヒドロキシ保護基の
導入剤として使用される場合、反応は、通常無水酢酸の
ような無水低級アルカン酸の存在下に行われる。さら
に、三置換シリル化合物がヒドロキシ保護基の導入剤と
して使用される場合、反応は、イミダゾール等のような
慣用の縮合剤の存在下に行うことが好ましい。 【0033】さらには、アシル化剤がヒドロキシ保護基
の導入剤として使用される場合、反応は、例えばリチウ
ム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、例えばカ
ルシウム等のアルカリ土金属、例えば水素化ナトリウム
等のアルカリ金属水素化物、例えば水素化カルシウム等
のアルカリ土金属水素化物、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、例えば炭酸
ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩、例
えば炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等のアルカ
リ金属炭酸水素塩、例えばナトリウムメトキシド、ナト
リウムエトキシド、カリウムt−ブトキシド等のアルカ
リ金属アルコキシド、例えば酢酸ナトリウム等のアルカ
リ金属アルカン酸、例えばトリエチルアミン等のトリア
ルキルアミン、例えばピリジン、ルチジン、ピコリン、
4−N,N−ジメチルアミノピリジン等のピリジン化合
物、キノリンのような有機または無機塩基の存在下に行
うのが好ましい。この反応において、アシル化剤が遊離
の酸またはその塩の形で使用する場合、反応は、例えば
N,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド、N−シク
ロヘキシル−N′−(4−ジエチルアミノシクロヘキシ
ル)カルボジイミド、N,N′−ジエチルカルボジイミ
ド、N,N′−ジイソプロピルカルボジイミド、N−エ
チル−N′−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジ
イミド等のカルボジイミド化合物、例えばN,N′−カ
ルボニルビス(2−メチルイミダゾール)、ペンタメチ
レンケテン−N−シクロヘキシルイミン、ジフェニルケ
テン−N−シクロヘキシルイミン等のケテンイミン化合
物、例えばエトキシアセチレン、β−シクロビニルエチ
ルエーテル等のオレフィンまたはアセチレン系エーテル
化合物、例えば1−(4−クロロベンゼンスルホニルオ
キシ)−6−クロロ−1H−ベンゾトリアゾール等のN
−ヒドロキシベンゾトリアゾール誘導体のスルホン酸エ
ステル等の慣用の縮合剤の存在下に行うことが好まし
い。反応は、通常、水、アセトン、ジクロロメタン、例
えばメタノール、エタノール等のアルコール、テトラヒ
ドロフラン、ピリジン、N,N−ジメチルホルムアミド
等またはこれらの混合溶媒のようなこの反応に悪影響を
与えない慣用の溶媒中で行われ、さらに、塩基またはヒ
ドロキシ保護基の導入剤が液体の場合は、これらも溶媒
として使用することができる。反応温度は特に限定され
ず、通常冷却下ないし加熱下で行われる。この反応にお
いて、化合物(Ia)のR2 で示されるヒドロキシ基が
保護されたヒドロキシ基に転換することもあり、このよ
うな場合もこの製造法に包含される。さらに、この反応
において、無水低級アルカン酸の存在下ジ(低級)アル
キルスルホキシドをヒドロキシ保護基導入剤として使用
する際、式: 【化26】 (式中、R2 はヒドロキシ基である)で示される部分構
造を有する化合物(Ia)が酸化され、式: 【化27】 (式中、R2 はヒドロキシである)で示される部分構造
を有する目的化合物(Ib)を得ることがあり、このよ
うな場合も、この製造法の範囲に包含される。 【0034】(2)製造法2:(ヒドロキシ保護基の導
入) 化合物(Id)またはその塩は、化合物(Ic)または
その塩にヒドロキシ保護基を導入することによって製造
できる。この反応は、製造法1と実質的に同様の方法で
行うことができ、従って、例えば塩基、縮合剤、溶媒、
反応温度等の反応条件は、製造法1を援用できる。この
反応において、化合物(Ic)のR1 におけるヒドロキ
シ基が目的化合物(Id)では対応する保護されたヒド
ロキシ基へ転換することがあり、このような場合も、こ
の製造法の範囲に包含される。 (3)製造法3:(二重結合の形成) 化合物(If)またはその塩は、化合物(Ie)または
その塩に塩基を反応させることによって製造できる。こ
の反応で使用される塩基としては、製造法1で例示した
塩基をそのまま挙げることができる。この反応は、ま
た、R2 がヒドロキシである化合物(Ie)またはその
塩に、塩基の存在下アシル化剤と反応させることによっ
ても製造できる。この反応は、水、アセトン、ジクロロ
メタン、例えばメタノール、エタノール、プロパノール
等のアルコール、テトラヒドロフラン、ピリジン、N,
N−ジメチルホルムアミド等またはその混合溶媒のよう
なこの反応に悪影響を与えない慣用の溶媒中で行われ、
さらに、塩基が液体である場合には、これらも溶媒とし
て使用することができる。反応温度は特に限定されず、
通常冷却下ないし加熱下で行われる。 【0035】(4)製造法4:(ヒドロキシエチレン基の
酸化) 化合物(Ih)またはその塩は、化合物(Ig)または
その塩を酸化することによって製造できる。この反応で
使用される酸化剤としては、製造法1で示したようなジ
(低級)アルキルスルホキシドを挙げることができる。
この反応は、通常無水酢酸のような無水低級アルカン酸
の存在下に、アセトン、ジクロロメタン、酢酸エチル、
テトラヒドロフラン、ピリジン、N,N−ジメチルホル
ムアミド等またはその混合溶媒のようなこの反応に悪影
響を与えない慣用の溶媒中で行われ、さらに、無水低級
アルカン酸が液体の場合には、これらも溶媒として使用
することができる。反応温度は特に限定されず、通常冷
却下ないし加熱下で行われる。この製造法は、反応の途
中で、原料化合物(Ig)のR1で示されるヒドロキシ
基が目的化合物(Ih)において1−(低級アルキルチ
オ)(低級)アルコキシ基へ転換することがあり、この
ような場合もこの製造法の範囲内に包含される。 (5)製造法5:(アリル基の還元) 化合物(Ij)またはその塩は、化合物(Ii)または
その塩を還元することによって製造できる。この製造法
における還元は、接触還元等のようなアリル基をプロピ
ル基に還元できる常法によって行うことができる。接触
還元で使用される触媒としては、例えば白金板、白金海
綿、白金黒、コロイド白金、酸化白金、白金線等の白金
触媒、例えばパラジウム海綿、パラジウム黒、酸化パラ
ジウム、パラジウム・炭素、コロイドパラジウム、パラ
ジウム・硫酸バリウム、パラジウム・炭酸バリウム等の
パラジウム触媒、例えば還元ニッケル、酸化ニッケル、
ラネーニッケル等のニッケル触媒、例えば還元コバル
ト、ラネーコバルト等のコバルト触媒、例えば還元鉄、
ラネー鉄等の鉄触媒、例えば還元銅、ラネー銅、ウルマ
ン銅等の銅触媒等のような慣用のものが挙げられる。こ
の還元は、通常、水、メタノール、エタノール、プロパ
ノール、ピリジン、酢酸エチル、N,N−ジメチルホル
ムアミド、ジクロロエタンまたはその混合溶媒のような
この反応に悪影響を与えない慣用の溶媒中で行われる。
この還元の反応温度は特に限定されず、通常冷却下ない
し加温下の範囲で行われる。上記に説明した製造法1〜
5によって得られるトリシクロ化合物(I)は、例えば
抽出、沈澱、分別結晶化、再結晶化、クロマトグラフィ
等の常法により単離、精製できる。化合物(I)および
(Ia)〜(Ij)における塩としては、無毒の、医薬
として許容される慣用の塩であり、例えばナトリウム
塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、例えばカルシウム
塩、マグネシウム塩等のアルカリ土金属塩、アンモニウ
ム塩、例えばトリエチルアミン塩、N−ベンジル−N−
メチルアミン塩等のアミン塩のような無機または有機塩
基との塩が挙げられる。前記の製造法1〜5の反応また
はその反応混合物の後処理中において、出発化合物およ
び目的化合物のコンホーマーおよび不斉炭素原子または
二重結合による立体異性体が、他のコンホ−マ−および
立体異性体に転換されることがあり、このような場合も
この発明の範囲に包含される。この発明のトリシクロ化
合物(I)は、免疫抑制作用、抗菌作用等のような薬理
作用を有し、従って、心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚等
の臓器あるいは組織の移植に対する拒絶反応、骨髄移植
によって起る移植片対宿主反応、慢性関節リウマチ、全
身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、
重症筋無力症、I型糖尿病、ブドウ膜炎等の自己免疫疾
患、病原菌によって起る感染症等の治療および予防に有
用である。このような薬理作用を有することを示すた
め、トリシクロ化合物(I)の薬理試験データを以下に
示す。 【0036】試験1 試験管内混合リンパ球反応(MLR)におけるトリシク
ロ化合物(I)の抑制効果 各ウェルにC57BL/6応答細胞(H−2b)5×1
05個と、マイトマイシンC処理(マイトマイシンC2
5μg/mlで37℃で30分間処理しRPM I164
0培地で3回洗浄する)したBALB/C刺激細胞(H
−2d)5×1 0 5個を0.2mlの10%牛胎仔血清
加RPMI1640培地[炭酸水素ナト リウム2m
M、ペニシリン(50単位/ml)およびストレプトマ
イシン(50μg/ml)を添加]に加えたマイクロタ
イタープレート中でMLR試験を行う。湿度100%、
二酸化炭素5%、空気95%に保った培養器内で、37
℃で、68時間、細胞を培養し、4時間 3H−チミジン
(0.5μCi)でパルスして、細胞を集める。この発
明の目的化合物をエタノールに溶解し、RPMI164
0培地に希釈し、培養物に添加し最終濃度を0.1μg
/ml以下になるようにする。結果を表18〜21に示
す。この発明のトリシクロ化合物は、マウスMLRを抑
制した。 【0037】表18:FR−900506物質のMLR
に対する効果 【表18】 【0038】表19:FR−900520物質のMLR
に対する効果 【表19】【0039】表20:FR−900523物質のMLR
に対する効果 【表20】 【0040】表21:FR−900525物質のMLR
に対する効果 【表21】 【0041】試験2 トリシクロ化合物(I)の抗菌活性 各種真菌に対するトリシクロ化合物(I)の抗菌活性
を、サブロー寒天中、寒天倍々希釈法によって測定し
た。30℃で24時間培養した後、最小発育阻止濃度
(MIC)をμg/mlで表わす。この発明のトリシク
ロ化合物は、真菌、例えばアスペルギルス・フミガーツ
スIF05840およびフサリウム・オキシスポルムI
F05942に対して、表22および23に記載するよ
うな抗菌活性を示した。 表22:トリシクロ化合物(I)のアスペルギルス・フ
ミガーツスIF05840に対するMIC値(μg/m
l) 【表22】表23:トリシクロ化合物(I)のフサリウム・オキシ
スペルムに対するMIC値(μg/ml) 【表23】 【0042】試験3 ラットにおける同種皮膚移植片生存に対するトリシクロ
化合物(I)の効果 ドナー(フィッシャー)ラットの腹部皮膚移植片を、レ
シピエント(WKA)ラットの外側胸部に移植する。5
日目に包帯を除去する。移植片上皮の90%以上が壊死
する拒絶反応があるまで、移植片を毎日検査する。FR
−900506物質をオリーブ油に溶解し、移植日より
毎日14日間連続筋肉内投与する。表24に示すよう
に、オリーブ油を14日間連続筋肉内投与したラットに
おいて、皮膚同種移植片は8日以内にすべて拒絶される
が、FR−900506物質で毎日処置したものは、皮
膚同種移植片生存が明らかに延長した。 表24:FR−900506物質の同種皮膚移植片生存
に対する効果 【表24】 【0043】試験4 ラットにおけるII型コラーゲン誘発関節炎に対するト
リシクロ化合物(I)の効果 コラーゲンを2mg/mlの濃度になるよう冷0.01
M酢酸に溶解する。溶液を等容量の不完全フロインドア
ジュバント中で乳化する。総量0.5mlのこの乳化物
を雌性ルイス系ラットの背中の数ケ所と尾の1、2ケ所
に皮内注射する。FR−900506物質をオリーブ油
に溶解し、経口投与する。同量のII型コラーゲンで免
疫した対照ラットには、オリーブ油のみを経口投与す
る。関節炎の発現率を観察する。試験結果を表25に示
す。II型コラーゲン免疫化と同じ日から14日間オリ
ーブ油で処理したラット全てに、関節炎が誘発された。
FR−900506物質を14日間毎日投与すると、3
週間の観察期間中、関節炎の誘発を完全に抑制した。 表25:ラットにおけるコラーゲン誘発関節炎に対する
FR−900506物質の効果 【表25】 【0044】試験5 SJL/J系マウスにおける実験的アレルギー性脳脊髄
炎(EAE)に対するトリシクロ化合物(I)の効果 SJL/J系マウスより脊髄ホモジネートを調整する。
脊髄を通気法で取り出し、約等容量の水と混合し、4℃
でホモジネートする。等容量のこの冷ホモジネート(1
0mg/ml)をマイコバクテリウム・ツベルクローシ
スH37RA0.6mg/mlを含有する完全フロイン
ドアジュバント(CFA)で乳化する。SJL/J系マ
ウスに、脊髄−CFAエマルジョン0.2mlを、0日
目と13日目の二回注入し、EAEを誘発させる。この
試験に使用した全マウスについて、EAEの臨床的徴候
を毎日評価、判定する。EAEの程度は、下記の判定基
準によった。グレード1:尾緊張低下、グレード2:ぎ
こちない歩行、グレード3:1本以上の四肢の脱力、グ
レード4:対麻痺または片麻痺。FR−900506物
質をオリーブ油に溶解し、0日目(初回免疫の日)より
19日間経口投与する。表26に示すように、FR−9
00506物質は、EAEの徴候の出現を明らかに阻止
した。 表26:SJL/J系マウスにおける実験的アレルギー
性脳脊髄炎に対するFR−900506物質の効果 【表26】 【0045】試験6 マウスにおける局所的移植片対宿主反応(GvHR)に
対するトリシクロ化合物(I)の効果 C57BL/6ドナーより得た生脾細胞(1×10
7 個)を、BDF1 系マウスの右後肢足蹠に皮下注射す
る。7日後にマウスを屠殺し、右(注射した足)および
左(注射していない足)両方の膝窩リンパ節(PLN)
の重量を測る。GvHRを左右PLNの重量差で表わ
す。FR−900506物質をオリーブ油に溶解し、感
作日より5日間経口投与する。FR−900506物質
の局所的移植片対宿主反応抑制のED50値は、19mg
/kgである。 【0046】試験7 トリシクロ化合物(I)の急性毒性 ddyマウスにおける腹腔内投与によるFR−9005
06、FR−900520、FR−900523、FR
−900525物質の急性毒性に関する試験を行い、い
ずれの場合にも投与量100mg/kgで死亡は観察さ
れなかった。この発明の医薬組成物は、外用、内服また
は非経口投与に適した有機または無機の担体もしくは賦
形剤と混合して、この発明のトリシクロ化合物(I)を
有効成分として含有する、例えば固体状、半固体状もし
くは液状の医薬製剤の形で使用することができる。有効
成分は、錠剤、ペレット剤、カプセル剤、坐剤、液剤、
エマルジョン、懸濁液およびその他の適切な形で使用で
き、例えば、通常の無毒で、医薬として許容される担体
と混合してもよい。使用し得る担体は、水、グルコー
ス、ラクトース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトー
ル、でん粉ペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、
コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、バレイシ
ョでん粉、尿素、および他の固体状、半固体状または液
状の製剤を製造するのに適した担体であり、さらに、賦
形剤、安定化剤、粘稠化剤、着色剤、香料を使用しても
よい。目的化合物は、疾患の経過または状態により、所
望の効果を発揮するのに十分な量が医薬製剤中に含有さ
れる。この医薬組成物をヒトに用いる場合は、非経口投
与あるいは内服で使用することが好ましい。トリシクロ
化合物(I)の治療有効量は、治療する患者個々の年齢
および疾病の程度により変化するが、通常、有効成分1日
約0.01〜1000mg、好ましくは0.1〜500
mg、さらに好ましくは0.5〜100mgが疾患の治
療に用いられ、一般に1回平均約0.5mg、1mg、
5mg、10mg、50mg、100mg、250m
g、500mgが投与される。以下、実施例に従って、
この発明を説明する。 【0047】実施例1 ストレプトミセス・ツクバエンシスNo.9993の分
離 以下に示す平板希釈法を用いてストレプトミセス・ツク
バエンシスNo.9993を分離した。茨城県筑波郡豊
里町で採取した約1グラムの土壌を無菌試験管に入れ、
滅菌水を加え、容量5mlとする。混合物をチューブブ
ザーで10秒間混合し、10分間放置する。上澄液を滅
菌水で順次100倍希釈する。希釈液(0.1ml)を
塩酸チアミン添加スザペック寒天(サッカロース30
g、硝酸ナトリウム3g、リン酸二カリウム1g、硫酸
マグネシウム0.5g、塩化カリウム0.5g、硫酸第
1鉄0.01g、塩酸チアミン0.1g、寒天20g、
水道水1000ml;pH7.2)を含有するペトリ皿
上に広げる。30℃で21日間インキュベートし、プレ
ート上に生育させたコロニーを斜面培地[酵母−麦芽エ
キス寒天(ISP培地2)]に移し、30℃で10日間
培養する。分離したコロニーの中にストレプトミセス・
ツクバエンシスNo.9993を見い出した。 醗酵 グリセリン(1%)、可溶性でん粉(1%)、グルコー
ス(0.5%)、綿実粉(0.5%)、乾燥酵母(0.
5%)、コーンスチープリカー(0.5%)、炭酸カル
シウム(0.2%)を含有する培地(160ml)(p
H6.5に調整)を、各々500mlのエルレンマイヤ
ーフラスコ20個に入れ、120℃で30分間滅菌す
る。ストレプトミセス・ツクバエンシスNo.9993
(寄託番号:微工研条寄第927号)の斜面培養物の1
白金耳を各培地に接種し、回転振盪機上、30℃で4日
間培養する。得られる培養物を、あらかじめ120℃で
20分間滅菌した200リットルのジャーファーメンタ
ーに入れた可溶性でん粉(4.5%)、コーンスチープ
リカー(1%)、乾燥酵母(1%)、炭酸カルシウム
(0.1%)、アデカノール(消泡剤、商品名、旭電化
製)(0.1%)を含有する培地(150リットル)
に接種し、30℃で、通気(150リットル/分) 、
撹拌 (250rpm)下に4日間培養する。 単離および精製 このようにして得られる培養ブロスをケイソウ土(5k
g)を用いて濾過する。菌糸体の塊をメタノール(50
リットル)で抽出し、抽出液50リットルを得る。菌糸
体より得られるメタノール抽出液と濾液とを合わせ、非
イオン性吸着樹脂「ダイアイオンHP−20」(商品
名、三菱化成社製)(10リットル)のカラムに通す。
水(30リットル)および水性メタノール(30リット
ル)で洗浄した後、メタノールで溶出する。溶出液を減
圧下に蒸発させ、残量を2リットルとする。これを酢酸
エチル(2リットル)で抽出する。酢酸エチル抽出液を
減圧濃縮し、油性残留物を得る。油性残留物を二倍重量
の酸性シリカゲル(特殊シリカゲル、グレード:12、
富士デビソン製)と混合し、この混合物を酢酸エチル中
でスラリー化する。溶媒を留去後、得られる乾燥粉末
を、n−ヘキサンで上記と同じ酸性シリカゲル(800
ml)を充填したカラムを用いるクロマトグラフィに付
す。カラムをn−ヘキサン(3リットル)、n−ヘキサ
ンと酢酸エチルの混合物(9:1v/v、3リットル;
4:1v/v、3リットル)および酢酸エチル(3リッ
トル)で展開する。目的化合物を含む画分を集め、減圧
濃縮して、油性残留物を得る。油性残留物をn−ヘキサ
ンと酢酸エチルとの混合物(1:1v/v、30ml)
に溶解し、同じ溶媒系でシリカゲル(230〜400メッ
シュ、メルク社製)(500ml)を充填したカラムを用
いるクロマトグラフィに付す。n−ヘキサンと酢酸エチ
ルとの混合物(1:1v/v、2リットル;1:2v/
v、1.5リットル)で溶出する。最初の目的化合物を
含む画分を集め、減圧濃縮し、黄色の油状物を得る。こ
の油性残留物を二倍重量の酸性シリカゲルと混合し、こ
の混合物を酢酸エチル中でスラリー化する。溶媒を留去
後、得られる乾燥粉末をn−ヘキサンで酸性シリカゲル
を充填したカラムにかけ、n−ヘキサンで展開する。目
的化合物を含む画分を集め、減圧濃縮し、粗FR−90
0506物質(1054mg)を白色の粉末として得
る。この粗生成物100mgを高速液体クロマトグラフ
ィに付す。リクロソルブ(Lichrosorb)SI
60(商品名、メルク社製)を担体とするカラム(8
φ×500mm)を用いて溶出する。このクロマトグラ
フィは、UV検出器で波長230nmにてモニターし、
移動相は塩化メチレン−ジオキサン混液(85:15v
/v)を流速5ml/分で用い、活性画分を集め、蒸発
濃縮する。この高速液体クロマトグラフィを繰り返し
て、精製FR−900506物質14mgを白色の粉末
として得る。さらに、酢酸エチル(1.5リットル)で
溶出を続けて行い、第二の目的化合物を含む画分を集
め、減圧濃縮して、粗FR−900525物質(30m
g)を黄色の油状物として得る。 【0048】実施例2 醗酵 グリセリン(1%)、コーンスターチ(1%)、グルコ
ース(0.5%)、綿実粉(1%)、コーンスチープリ
カー(0.5%)、乾燥酵母(0.5%)、炭酸カルシ
ウム(0.2%)を含有するpH6.5の前培養培地
(100ml)を500mlのエルレンマイヤーフラス
コに入れ、120℃で30分間滅菌する。ストレプトミ
セス・ツクバエンシスNo.9993の斜面培養物の1
白金耳を培地に接種し、30℃で4日間培養する。得ら
れる培養物を、あらかじめ120℃で30分間滅菌した
30リットルのジャーファーメンター中の前培養培地
(20リットル)に移す。培養物を30℃で2日間イン
キュベートして、前培養物16リットルを、あらかじめ
120℃で30分間滅菌した2トンタンクに入れた可溶
性でん粉(4.5%)、コーンスチープリカー(1
%)、乾燥酵母(1%)、炭酸カルシウム(0.1
%)、アデカノール(消泡剤、商品名、旭電化製)
(0.1%)を含有するpH6.8の醗酵培地(160
0リットル)に接種し、30℃で4日間培養する。 単離および精製 このようにして得られる培養ブロスを、ケイソウ土(2
5kg)を用いて濾過する。菌糸体の塊をアセトン(5
00リットル)で抽出し、抽出液500リットルを得
る。このアセトン抽出液と濾液(1350リットル)と
を合わせ、非イオン性吸着樹脂「ダイアイオンHP−2
0」(商品名、三菱化成社製)(100リットル)のカ
ラムに通す。水(300リットル)および50%水性ア
セトン(300リットル)で洗浄した後、75%水性ア
セトンで溶出する。溶出液を減圧下に蒸発させ、残量を
300リットルとする。これを酢酸エチル(20リット
ル)で3回抽出する。酢酸エチル抽出液を減圧濃縮し、
油性残留物を得る。この油性残留物を二倍重量の酸性シ
リカゲル(特殊シリカゲル、グレード12、富士デビソ
ン製)と混合し、この混合物を酢酸エチル中でスラリー
化する。溶媒を蒸発させ、得られる乾燥粉末を、n−ヘ
キサンで上記と同じ酸性シリカゲル(8リットル)を充
填したカラムクロマトグラフィに付す。カラムをn−ヘ
キサン(30リットル)、n−ヘキサン−酢酸エチル混
液(4:1v/v、30リットル)、酢酸エチル(30
リットル)で展開する。目的化合物を含む画分を集め、
減圧濃縮して油性残留物を得る。この油性残留物を二倍
重量の酸性シリカゲルと混合し、混合物を酢酸エチル中
でスラリー化する。溶媒の留去後、得られる粉末を、n
−ヘキサンで充填した酸性シリカゲル(3.5リット
ル)のカラムを用いるクロマトグラフィに再度付す。カ
ラムをn−ヘキサン(10リットル)、n−ヘキサン−
酢酸エチル混液(4:1v/v、10リットル)、酢酸
エチル(10リットル)で展開する。目的化合物を含む
画分を集め、減圧濃縮して、黄色の油状物を得る。この
油性残留物をn−ヘキサン−酢酸エチル混液(1:1v
/v、300ml)に溶解し、同じ溶媒系で充填したシ
リカゲル(230〜400メッシュ、メルク社製)(2
リットル)のカラムを用いるクロマトグラフィに付す。
n−ヘキサン−酢酸エチル混液 (1:1v/v、10
リットル;1:2v/v、6リットル)および酢酸エチ
ル(6リットル)で溶出する。最初の目的化合物を含む
画分を集め、減圧濃縮して、FR−900506物質を
白色粉末(34g)として得る。この白色粉末をアセト
ニトリルに溶解し、減圧濃縮する。濃縮液を5℃で一夜
放置してプリズム状結晶(22.7g)を得る。同じ溶
媒で再結晶して精製FR−900506物質(13.6
g)を無色プリズム状結晶として得る。さらに、第二の
目的化合物を含む画分を集め、減圧濃縮して、粗FR−
900525物質(314mg)を黄色の粉末として得
る。 【0049】実施例3 醗酵 グリセリン(1%)、コーンスターチ(1%)、グルコ
ース(0.5%)、綿実粉(1%)、乾燥酵母(0.5
%)、コーンスチープリカー(0.5%)、炭酸カルシ
ウム(0.2%)を含有する培地(160ml)(pH
6.5に調整)を各々500mlのエルレンマイヤーフ
ラスコ10個に入れ、120℃で30分間滅菌する。ス
トレプトミセス・ツクバエンシスNo.9993の斜面
培養物の1白金耳を各培地に接種し、回転振盪機上、3
0℃で4日間培養する。得られる培養物を、あらかじめ
120℃で20分間滅菌した200リットルのジャーフ
ァーメンターに入れた可溶性でん粉(5%)、ピーナツ
粉(0.5%)、乾燥酵母(0.5%)、グルテンミー
ル(0.5%)、炭酸カルシウム(0.1%)、アデカ
ノール(消泡剤、商品名、旭電化製)(0.1%)を含
有する培地(150リットル)に接種し、30℃で、通
気(150リットル/分)、撹拌(250rpm)下に
4日間培養する。 単離および精製 このようにして得られる培養ブロスをケイソウ土(5k
g)を用いて濾過する。菌糸体の塊をアセトン(50リ
ットル)で抽出し、抽出液50リットルを得る。菌糸体
より得られるアセトン抽出液と濾液(135リットル)
とを合わせ、非イオン性吸着樹脂「ダイアイオンHP−
20」(商品名、三菱化成社製)(10リットル)にカ
ラムを通す。水(30リットル)および50%水性アセ
トン(30リットル)で洗浄し、75%水性アセトンで
溶出する。溶出液(30リットル)を減圧下に蒸発濃縮
し、残量を2リットルし、酢酸エチル(2リットル)で
3回抽出する。酢酸エチル抽出液を減圧濃縮し、油性残
留物を得る。この油性残留物を二倍重量の酸性シリカゲ
ル(特殊シリカゲル、グレード12、富士デビソン製)
と混合し、混合物を酢酸エチル中でスラリー化する。溶
媒を留去し、得られる乾燥粉末を、n−ヘキサンで上記
と同じ酸性シリカゲル(800ml)を充填したカラム
を用いるクロマトグラフィに付す。カラムをn−ヘキサ
ン(3リットル)、n−ヘキサン−酢酸エチル混液
(4:1v/v、3リットル)、酢酸エチル(3リット
ル)で展開する。目的化合物を含む画分を集め、減圧濃
縮して、油性残留物を得る。この油性残留物をn−ヘキ
サン−酢酸エチル混液(1:1v/v、30ml)に溶
解し、同じ溶媒系で充填したシリカゲル(230〜40
0メッシュ、メルク社製)(500ml)のカラムを用
いるクロマトグラフィに付す。n−ヘキサン−酢酸エチ
ル混液(1:1v/v、2リットル;1:2v/v、
1.5リットル)および酢酸エチル(1.5リットル)
で溶出する。最初の目的化合物を含む画分を集め、減圧
濃縮して、粗FR−900506物質(3g)を黄色の
粉末として得る。さらに、第二の目的化合物を含む画分
を集め、減圧濃縮して、油性残留物を得る。この油性残
留物をシリカゲルクロマトグラフィに再度付し、黄色の
油状物を得る。この油性残留物を二倍重量の酸性シリカ
ゲルと混合し、混合物を酢酸エチル中でスラリー化す
る。溶媒を留去して、得られる乾燥粉末を、n−ヘキサ
ンで酸性シリカゲル(100ml)を充填したカラムを
用いるクロマトグラフィに付し、n−ヘキサンで展開す
る。目的化合物を含む画分を集め、減圧濃縮して、FR
−900525物質を淡黄色の粉末(380mg)とし
て得る。この粉末をn−ヘキサン−酢酸エチル混液
(1:2v/v、5ml)に溶解し、同じ溶媒系で充填
し洗浄した酸性シリカゲル(特殊シリカゲル、グレード
922、富士デビソン製)(100ml)のカラムを用
いるクロマトグラフィに付す。酢酸エチルで溶出する。
活性画分を集め、減圧下に蒸発させて、精製したFR−
900525物質(230mg)を白色粉末として得
る。 【0050】実施例4 ストレプトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ・ヤ
クシマエンシスNo.7238の分離 以下に示す平板希釈法によって、ストレプトミセス・ハ
イグロスコピカス・サブスプ・ヤクシマエンシスNo.
7238を分離する。鹿児島県屋久島で採取した土壌約
1グラムを無菌試験管に入れ、滅菌水を加えて容量を5
mlとする。混合物をチューブブザーで10秒間混合
し、10分間放置する。上澄液を滅菌水で順次100倍
希釈する。希釈液(0.1ml)を塩酸チアミン添加ス
ザペック寒天(サッカロース30g、硝酸ナトリウム3
g、リン酸二カリウム1g、硫酸マグネシウム0.5
g、塩化カリウム0.5g、硫酸第一鉄0.01g、塩
酸チアミン0.1g、寒天20g、水道水1000m
l;pH7.2)を含有するペトリ皿上に広げる。30
℃で21日間インキュベートし、プレート上に生育させ
たコロニーを斜面培地[酵母−麦芽エキス寒天(ISP
−培地2)]に移し、30℃で10日間培養する。分離
したコロニーの中に、ストレプトミセス・ハイグロスコ
ピカス・サブスプ・ヤクシマエンシスNo.7238を
見い出した。 醗酵 グリセリン(1%)、可溶性でん粉(1%)、グルコー
ス(0.5%)、綿実粉(0.5%)、乾燥酵母(0.
5%)、コーンスチープリカー(0.5%)、炭酸カル
シウム(0.2%)を含有する培地(160ml)(p
H6.5に調整)を、各々500mlのエルレンマイヤ
ーフラスコ20個に入れ、120℃で30分間滅菌す
る。ストレプトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ
・ヤクシマエンシスNo.7238(寄託番号:微工研
条寄第928号)の斜面培養物の1白金耳を各培地に接
種し、回転振盪機上、30℃で4日間培養する。得られ
る培養物を、グルコース(4.5%)、コーンスチープ
リカー(1%)、乾燥酵母(1%)、グルテンミール
(1%)、麦芽(0.5%)、炭酸カルシウム(0.1
%)、アデカノール(消泡剤、商品名、旭電化製)
(0.1%)を含有する、あらかじめ120℃で20分
間滅菌した200リットルのジャーファーメンター中の
培地(150リットル)に接種し、30℃、通気(15
0リットル/分)、撹拌(250rpm)下に4日間培
養する。 単離および精製 このようにして得られる培養ブロスを、ケイソウ土(5
kg)を用いて濾過する。菌糸体の塊をアセトン(50
リットル)で抽出し、抽出液50リットルを得る。菌糸
体より得られるアセトン抽出液と濾液(135リット
ル)とを合わせ、非イオン性吸着樹脂「ダイアイオンH
P−20」(商品名、三菱化成社製)(10リットル)
のカラムに通す。水(30リットル)および水性アセト
ン(30リットル)で洗浄した後、アセトンで溶出す
る。溶出液を減圧下に蒸発濃縮し残量を2リットルと
し、これを酢酸エチル(4リットル)で抽出する。酢酸
エチル抽出液を減圧濃縮し、油性残留物を得る。この油
性残留物を二倍重量の酸性シリカゲル(特殊シリカゲル
グレード12、富士デビソン製)と混合し、この混合物
を酢酸エチル中でスラリー化する。溶媒を留去した後、
得られる乾燥粉末をn−ヘキサンで充填した同じ酸性シ
リカゲル(800ml)のカラムを用いるクロマトグラ
フィに付す。カラムをn−ヘキサン(3リットル)、n
−ヘキサン−酢酸エチル混液(4:1v/v、3リット
ル)、酢酸エチル(3リットル)で展開する。FR−9
00520およびFR−900523物質を含む画分を
集め、減圧濃縮して油性残留物を得る。この油性残留物
をn−ヘキサン−酢酸エチル混液(1:1v/v、50
ml)に溶解し、同じ溶媒系で充填したシリカゲル(7
0〜230メッシュ、メルク社製)(1000ml)の
カラムを用いるクロマトグラフィに付す。n−ヘキサン
−酢酸エチル混液(1:1v/v、3リットル;1:2
v/v、3リットル)および酢酸エチル(3リットル)
で溶出する。目的化合物を含む画分を集め、減圧濃縮し
て、黄色の粉末(4.5g)を得る。この粉末をメタノ
ール(20ml)に溶解し、水(10ml)と混合す
る。混合物をメタノール−水混液(4:1v/v)で充
填し、これで展開する逆相シリカゲル「YMC」(60
〜200メッシュ)(500ml)(商品名、山村化学
研究所製)のカラムを用いるクロマトグラフィに付す。
FR−900520物質を含む画分を集め、減圧濃縮し
て、FR−900520物質の粗生成物(1.8g)を
淡黄色の粉末として得る。この粉末を少量のジエチルエ
ーテルに溶解する。一夜放置した後、沈澱する結晶を濾
取し、ジエチルエーテルで洗浄し、減圧乾燥する。ジエ
チルエーテルで再結晶して、精製FR−900520物
質600mgを無色の板状晶として得る。同じ溶媒系を
用いる逆相シリカゲルクロマトグラフィを続けて行い、
FR−900523物質を含む次の画分を集め、減圧濃
縮して、FR−900523物質の粗生成物(0.51
g)を淡黄色の粉末として得る。この粗生成物をアセト
ニトリル(3ml)に溶解し、アセトニトリル−テトラ
ヒドロフラン−50mMリン酸緩衝液混液(pH2.
0)(3:2:5v/v)で充填し、これで展開する逆
相シリカゲル「YMC」(70ml)を用いるクロマト
グラフィに付す。目的化合物を含む画分を酢酸エチルで
抽出する。この抽出液を減圧濃縮して、黄白色の粉末
(190mg)を得る。この黄白色の粉末を逆相シリカ
ゲル「YMC」上で再びクロマトグラフィに付し、白色
粉末(80mg)を得る。この白色粉末を少量のジエチ
ルエーテルに溶解し、室温で一夜放置して結晶56mg
を得る。ジエチルエーテルで再結晶して、FR−900
523物質の無色の針状晶34mgを得る。 【0051】実施例5 FR−900506物質(10.4mg)のジクロロメ
タン(0.2ml)中溶液にピリジン(0.1ml)お
よび無水酢酸(0.05ml)を室温で加え、混合物を
5時間撹拌する。溶媒を減圧下に除去する。残留物をシ
リカゲル薄層クロマトグラフィ(展開溶媒:ジエチルエ
ーテル−ジクロロメタン、1:2v/v)に付して、1
2−[2−(4−アセトキシ−3−メトキシシクロヘキ
シル)−1−メチルビニル]−17−アリル−1,14
−ジヒドロキシ−23,25−ジメトキシ−13,1
9,21,27−テトラメチル−11,28−ジオキサ
−4−アザトリシクロ[22.3.1.04,9]オクタ
コス−18−エン−2,3,10,16−テトラオン
(6.0mg)を得る。 IRν(CHCl3) : 3520, 1728, 1705 (sh), 1640, 1095 cm
-1 【0052】実施例6 FR−900506物質(52.5mg)のジクロロメ
タン(1ml)中溶液に、ピリジン(0.5ml)およ
び無水酢酸(0.3ml)を室温で加え、混合物を室温
で9時間撹拌する。溶媒を減圧下に除去する。残渣をシ
リカゲル薄層クロマトグラフィ(展開溶媒:ジエチルエ
ーテル−ヘキサン、3:1v/v)に付して、14−ア
セトキシ−12−[2−(4−アセトキシ−3−メトキ
シシクロヘキシル)−1−メチルビニル]−17−アリ
ル−1−ヒドロキシ−23,25−ジメトキシ−13,
19,21,27−テトラメチル−11,28−ジオキ
サ−4−アザトリシクロ[22.3.1.04,9]オク
タコス−18−エン−2,3,10,16−テトラオン
(48.0mg)および12−[2−(4−アセトキシ
−3−メトキシシクロヘキシル)−1−メチルビニル]
−17−アリル−1−ヒドロキシ−23,25−ジメト
キシ−13,19,21,27−テトラメチル−11,
28−ジオキサ−4−アザトリシクロ[22.3.1.
04,9]オクタコサ−14,18−ジエン−2,3,1
0,16−テトラオン(5.4mg)を得る。 前記化合物 IRν(CHCl3) : 1730, 1720 (sh), 1640 cm-1 後記化合物 IRν(CHCl3) : 1730, 1690, 1640, 1627 cm-1 【0053】実施例7 FR−900506物質(9.7mg)のジクロロメタ
ン(0.2ml)およびピリジン(0.1ml)中溶液
に、塩化ベンゾイル(50μl)を室温で加え、混合物
を室温で2時間撹拌する。溶媒を減圧下に除去し、粗油
状物を得る。この油状物をシリカゲル薄層クロマトグラ
フィ(展開溶媒:ジエチルエーテル−ヘキサン、2:1
v/v)で精製して、17−アリル−12−[2−(4
−ベンゾイルオキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−
1−メチルビニル]−1,14−ジヒドロキシ−23,
25−ジメトキシ−13,19,21,27−テトラメ
チル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシクロ[2
2.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−2,
3,10,16−テトラオン(8.0mg)を得る。 IR ν(CHCl3) : 3500, 1735 (sh), 1710, 1640, 1600 c
m-1 実施例8 FR−900506物質(30.5mg)のピリジン
(1ml)中溶液に、塩化p−ニトロベンゾイル(約1
00mg)を加え、混合物を室温で2時間撹拌する。反
応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウ
ム水溶液、水、1N塩酸、水、飽和炭酸水素ナトリウム
水溶液、水、塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、乾燥
する。得られる溶液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィで精製して、17−アリル−1,
14−ジヒドロキシ−23,25−ジメトキシ−13,
19,21,27−テトラメチル−12−[2−[4−
(p−ニトロベンゾイルオキシ)−3−メトキシシクロ
ヘキシル]−1−メチルビニル]−11,28−ジオキ
サ−4−アザトリシクロ[22.3.1.04,9]オク
タコス−18−エン−2,3,10,16−テトラオン
(37.7mg)を得る。 IR ν(CHCl3) : 1720, 1640, 1610, 1530-1520 cm-1 【0054】実施例9 実施例8の方法に準じて、FR−900506物質(3
0.6mg)と塩化3,5−ジニトロベンゾイル(33
mg)とをピリジン(0.5ml)中で反応させること
によって、17−アリル−1,14−ジヒドロキシ−2
3,25−ジメトキシ−13,19,21,27−テト
ラメチル−12−[2−[4−(3,5−ジニトロベン
ゾイルオキシ)−3−メトキシシクロヘキシル]−1−
メチルビニル]−11,28−ジオキサ−4−アザトリ
シクロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18−エ
ン−2,3,10,16−テトラオン(36.0mg)
を得る。 IR ν(CHCl3) : 1730, 1640, 1610, 1530-1520 cm-1 【0055】実施例10 実施例8の方法に準じて、ピリジン(0.5ml)中で
FR−900506物質(48mg)を塩化2−l−メ
ンチルオキシアセチル(0.08ml)と反応させるこ
とによって、17−アリル−1,14−ジヒドロキシ−
23,25−ジメトキシ−12−[2−[4−(2−l
−メンチルオキシアセトキシ)−3−メトキシシクロヘ
キシル]−1−メチルビニル]−13,19,21,2
7−テトラメチル−11,28−ジオキサ−4−アザト
リシクロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18−
エン−2,3,10,16−テトラオン(50.9m
g)を得る。 IR ν(ニート) : 3520, 1760, 1740 (sh), 1720 (sh),
1652 cm-1 【0056】実施例11 (−)−2−トリフルオロメチル−2−メトキシ−2−
フェニル酢酸(51mg)の酢酸エチル(10ml)中
溶液に、室温で、N,N′−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド(47mg)を加える。室温で1.5時間撹拌し
た後、FR−900506物質(25.0mg)および
4−(N,N−ジメチルアミノ)ピリジン(11mg)
を加え、室温で3.5時間撹拌する。得られる溶液を濃
縮して残渣を得、これをジエチルエーテルに取り、次い
で、塩酸、炭酸水素ナトリウム水溶液、塩化ナトリウム
水溶液で順次洗浄する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥
し、濃縮して残渣を得、これをシリカゲルクロマトグラ
フィ(展開溶媒:ジクロロメタン−ジエチルエーテル、
10:1v/v)に付して、17−アリル−12−[2
−[4−[(−)−2−トリフルオロメチル−2−メト
キシ−2−フェニルアセトキシ]−3−メトキシシクロ
ヘキシル]−1−メチルビニル]−1,14−ジヒドロ
キシ−23,25−ジメトキシ−13,19,21,2
7−テトラメチル−11,28−ジオキサ−4−アザト
リシクロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18−
エン−2,3,10,16−テトラオン(6.5mg)
および17−アリル−14−[(−)−2−トリフルオ
ロメチル−2−メトキシ−2−フェニルアセトキシ]−
12−[2−[4−[(−)−2−トリフルオロメチル
−2−メトキシ−2−フェニルアセトキシ]−3−メト
キシシクロヘキシル]−1−メチルビニル]−1−ヒド
ロキシ−23,25−ジメトキシ−13,19,21,
27−テトラメチル−11,28−ジオキサ−4−アザ
トリシクロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18
−エン−2,3,10,16−テトラオン(20.2m
g)を得る。 前記化合物 IR ν(ニート) : 3510, 1750, 1730 (sh), 1710, 1652,
1500 cm-1 後記化合物 IR ν(ニート) : 1750, 1720, 1652, 1500 cm-1 【0057】実施例12 FR−900506物質(248mg)のピリジン(7
ml)中溶液を撹拌しながら、これに無水コハク酸(1
45mg)および4−(N,N−ジメチルアミノ)ピリ
ジン(7mg)を加え、得られる混合物を室温で18時
間撹拌する。反応混合物を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチ
ルを用いるシリカゲル(20g)のクロマトグラフィに
付し、17−アリル−12−[2−[4−(3−カルボ
キシプロピオニルオキシ)−3−メトキシシクロヘキシ
ル]−1−メチルビニル]−1,14−ジヒドロキシ−
23,25−ジメトキシ−13,19,21,27−テ
トラメチル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシク
ロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−
2,3,10,16−テトラオン(90mg)を得る。 IR ν(CHCl3) : 3500, 3100-2300, 1720, 1705 (sh), 1
635 cm-1 【0058】実施例13 FR−900506物質(100.7mg)のピリジン
(3ml)中溶液に、塩化p−ヨードベンゼンスルホニ
ル(500mg)を加え、混合物を室温で36時間撹拌
する。溶液を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリ
ウム水溶液、水、塩化ナトリウム水溶液で洗浄する。有
機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧濃縮す
る。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ(展開溶媒:ジ
エチルエーテル−ヘキサン、3:1v/v)に付し、1
7−アリル−1,14−ジヒドロキシ−12−[2−
[4−(p−ヨードベンゼンスルホニルオキシ)−3−
メトキシシクロヘキシル]−1−メチルビニル]−2
3,25−ジメトキシ−13,19,21,27−テト
ラメチル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシクロ
[22.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−
2,3,10,16−テトラオン(61mg)および1
7−アリル−1−ヒドロキシ−12−[2−[4−(p
−ヨードベンゼンスルホニルオキシ)−3−メトキシシ
クロヘキシル]−1−メチルビニル]−23,25−ジ
メトキシ−13,19,21,27−テトラメチル−1
1,28−ジオキサ−4−アザトリシクロ[22.3.
1.04,9]オクタコサ−14,18−ジエン−2,
3,10,16−テトラオン(12mg)を得る。 前記化合物 IR ν(CHCl3) : 3470, 1730, 1717, 1692, 1635, 1568
cm-1 後記化合物1 H NMR δ ppm(CDCl3) : {6.15 (d,J=15Hz), 6.25 (d,J
=15Hz)}(1H),{6.70 (dd,J=15Hz,10Hz), 6.80 (dd,J=15H
z,10Hz)}(1H),7.60 (2H,m), 7.90 (2H,m) 【0059】実施例14 実施例13の方法に準じて、ピリジン(0.6ml)中
でFR−900506物質(27mg)を塩化d−カン
ファ−スルホニル(97mg)と反応させることによっ
て、17−アリル−12−[2−(4−d−カンファ−
スルホニルオキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1
−メチルビニル]−1,14−ジヒドロキシ−23,2
5−ジメトキシ−13,19,21,27−テトラメチ
ル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシクロ[2
2.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−2,
3,10,16−テトラオン(34mg)を得る。 IR ν(ニート) : 3500, 1747, 1720 (sh), 1710 (sh),
1655 cm-1 【0060】実施例15 FR−900506物質(89.7mg)のジクロロメ
タン(3ml)中溶液を撹拌しながら、これにイミダゾ
ール(118mg)および塩化t−ブチル−ジフェニル
シリル(52.2mg)を加える。混合物を室温で2時
間撹拌し、飽和塩化アンモニウム水溶液で希釈し、ジエ
チルエーテルで3回抽出する。抽出液を水および塩化ナ
トリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減
圧乾燥する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ
(展開溶媒:酢酸エチル−ヘキサン、1:3v/v)で
精製し、17−アリル−12−[2−(4−t−ブチル
−ジフェニルシリルオキシ−3−メトキシシクロヘキシ
ル)−1−メチルビニル]−1,14−ジヒドロキシ−
23,25−ジメトキシ−13,19,21,27−テ
トラメチル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシク
ロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−
2,3,10,16−テトラオン(107mg)を得
る。 IR ν(ニート) : 3520, 1742, 1705, 1650 cm-1 【0061】実施例16 実施例15の方法に準じて、イミダゾール(15mg)
の存在下に、N,N−ジメチルホルムアミド(1ml)
中で、FR−900506物質(80mg)を塩化t−
ブチル−ジメチルシリル(17mg)と反応させること
によって、17−アリル−12−[2−(4−t−ブチ
ル−ジメチルシリルオキシ−3−メトキシシクロヘキシ
ル)−1−メチルビニル]−1,14−ジヒドロキシ−
23,25−ジメトキシ−13,19,21,27−テ
トラメチル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシク
ロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−
2,3,10,16−テトラオン(85mg)を得る。 IR ν(CHCl3) : 1735, 1720 (sh), 1700, 1640 cm-1 【0062】実施例17 FR−900506物質(100mg)のジメチルスル
ホキシド(1.5ml)中溶液に、無水酢酸(1.5m
l)を加え、混合物を室温で14時間撹拌する。反応混
合物を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水
溶液、水、塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄する。有機
層を硫酸ナトリウムで乾燥、濾過し、減圧濃縮する。残
渣をシリカゲルの薄層クロマトグラフィ(展開溶媒:ジ
エチルエーテル)に付し、17−アリル−1,14−ジ
ヒドロキシ−23,25−ジメトキシ−13,19,2
1,27−テトラメチル−12−[2−(4−メチルチ
オメトキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1−メチ
ルビニル]−11,28−ジオキサ−4−アザトリシク
ロ[22.3.1.04,9]オクタコサ−14,18 −
ジエン−2,3,10,16−テトラオン(51m
g)、17−アリル−1−ヒドロキシ−12−[2−
(4−ヒドロキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1
−メチルビニル]−23,25−ジメトキシ−13,1
9,21,27−テトラメチル−11,28−ジオキサ
−4−アザトリシクロ[22.3.1.0 4,9]オクタコ
サ−14,18−ジエン−2,3,10,16−テトラ
オン(18mg)および17−アリル−1,14−ジヒ
ドロキシ−23,25−ジメトキシ−13,19,2
1,27−テトラメチル−12−[2−(4−メチルチ
オメトキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1−メチ
ルビニル]−11,28−ジオキサ−4−アザトリシク
ロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−
2, 3,10,16−テトラオン(10mg)を得
る。 一番目の化合物 IR ν(CHCl3) : 3470, 1730, 1635, 1630 (sh), 1580
(sh) cm-1 二番目の化合物 IR ν(CHCl3) : 1728, 1640, 1090 cm-1 三番目の化合物 IR ν(CHCl3) : 3480, 1735, 1710, 1640 cm-1 【0063】実施例18 17−アリル−12−[2−(4−t−ブチル−ジメチ
ルシリルオキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1−
メチルビニル]−1,14−ジヒドロキシ−23,25
−ジメトキシ−13,19,21,27−テトラメチル
−11,28−ジオキサ−4−アザトリシクロ[22.
3.1.04,9]オクタコス−18−エン−2,3,1
0,16−テトラオン(39.9mg)のピリジン
(1.5ml)中溶液に無水酢酸(0.5ml)を加
え、混合物を室温で6時間撹拌する。溶媒を減圧下に除
去して粗油状物を得、これをシリカゲル薄層クロマトグ
ラフィ(展開溶媒:ジエチルエーテル−ヘキサン、1:
1v/v)に付し、14−アセトキシ−17−アリル−
12−[2−(4−t−ブチル−ジメチルシリルオキシ
−3−メトキシシクロヘキシル)−1−メチルビニル]
−1−ヒドロキシ−23,25−ジメトキシ−13,1
9,21,27−テトラメチル−11,28−ジオキサ
−4−アザトリシクロ[22.3.1.04,9]オクタ
コス−18−エン−2,3,10,16−テトラオン
(26.5mg)を得る。 IR ν(CHCl3) : 1728, 1715 (sh), 1635 cm-1 【0064】実施例19 実施例18の方法に準じて、ピリジン(0.2ml)中
で17−アリル−12−[2−(4−t−ブチル−ジフ
ェニルシリルオキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−
1−メチルビニル]−1,14−ジヒドロキシ−23,
25−ジメトキシ−13,19,21,27−テトラメ
チル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシクロ[2
2.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−2,
3,10,16−テトラオン(10.6mg)を無水酢
酸(0.1mg)と反応させることによって、14−ア
セトキシ−17−アリル−12−[2−(4−t−ブチ
ル−ジフェニルシリルオキシ−3−メトキシシクロヘキ
シル)−1−メチルビニル]−1−ヒドロキシ−23,
25−ジメトキシ−13,19,21,27−テトラメ
チル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシクロ[2
2.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−2,
3,10,16−テトラオン(10mg)を得る。 IR ν(CHCl3) : 3500, 1730, 1720 (sh), 1660 (sh), 1
640, 1620 (sh),1100 cm-1 【0065】実施例20 14−アセトキシ−17−アリル−12−[2−(4−
t−ブチル−ジフェニルシリルオキシ−3−メトキシシ
クロヘキシル)−1−メチルビニル]−1−ヒドロキシ
−23,25−ジメトキシ−13,19,21,27−
テトラメチル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシ
クロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18−エン
−2,3,10,16−テトラオン(43.8mg)の
テトラヒドロフラン(1.5ml)中溶液に、炭酸カリ
ウム(約100mg)を室温で加え、混合物を同温で3
時間撹拌する。反応混合物をジエチルエーテルで希釈
し、得られる溶液を飽和塩化アンモニウム水溶液、水、
塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで
乾燥する。得られる溶液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲ
ル薄層クロマトグラフィ(展開溶媒:ジエチルエーテル
−ヘキサン、3:2v/v)で精製して、17−アリル
−12−[2−(4−t−ブチル−ジフェニルシリルオ
キシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1−メチルビニ
ル]−1−ヒドロキシ−23,25−ジメトキシ−1
3,19,21,27−テトラメチル−11,28−ジ
オキサ−4−アザトリシクロ[22.3.1.04,9]
オクタコサ−14,18−ジエン−2,3,10,16
−テトラオン(30mg)を得る。 IR ν(CHCl3) : 1733, 1720 (sh), 1685, 1640 (sh), 1
620 cm-1 【0066】実施例21 FR−900506物質(50mg)の酢酸エチル(2
ml)中溶液を、10%パラジウム−炭素(10mg)
を用いて、大気圧下、室温で、20分間接触還元する。
反応混合物を濾過し、濾液を蒸発乾固し、薄層クロマト
グラフィで精製する。クロロホルム−アセトン混液
(5:1v/v)で展開して、1,14−ジヒドロキシ
−12−[2−(4−ヒドロキシ−3−メトキシシクロ
ヘキシル)−1−メチルビニル]−23,25−ジメト
キシ−13,19,21,27−テトラメチル−17−
プロピル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシクロ
[22.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−
2,3,10,16−テトラオン(50.0mg)を得
る。 IR ν(CHCl3) : 3480, 1735 (sh), 1717, 1700, 1650
(sh), 1625 cm-1 【0067】実施例22 実施例1と同様の醗酵法により得られたFR−9005
06物質の粗白色粉末(1g)をアセトニトリル(5m
l)に溶かし、島津LC4A(商標、島津製作所社製)
の高速液体クロマトグラフィーに付す。YMC−S34
3(ODS)(商標、島久薬品株式会社製)を充填した
スチールカラム(内径25mm、長さ250mm)を用
い、12ml/分の流速で溶出する。移動相は28%ア
セトニトリル水溶液、10%n−ブタノール、0.07
5%燐酸、3.75mMドデシル硫酸ナトリウム(SD
S)の混液を用い、UVで210nmにて検出する。1
回につき100μlのサンプルを注入し、この高速液体
クロマトグラフィーを50回繰り返し、すべての量のサ
ンプルをクロマトグラフィーに付す。85分〜90分の
保持時間で溶出される画分を集め、等容量の酢酸エチル
(3.6l)で抽出する。酢酸エチル層を分取し、1%
炭酸水素ナトリウム(2l)で洗浄した後減圧で少量ま
で濃縮する。析出するSDSを濾去し、得られる粗粉末
を100mg/mlの濃度になるようにアセトニトリル
に溶かし、さらに高速液体クロマトグラフィーに付す。
移動相として12.5%アセトニトリル水溶液、9.7
5%n−ブタノール、0.075%燐酸、3.75mM
SDS を用いる。カラムは10ml/分の流速で溶
出する。131分〜143分の保持時間で溶出される画
分を集め、等容量の酢酸エチルで抽出する。抽出液を1
%炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、減圧下で少量ま
で濃縮する。濃縮の際析出するSDSを濾去する。得ら
れる粗粉末を少量の酢酸エチルに溶解し、シリカゲル
(Kiesel gel、230−400メッシュ)
(メルク社製)を用いたカラムクロマトグラフィーに付
す。カラムをn−ヘキサンと酢酸エチルの混液(30m
l)(1:1v/v)、次いでn−ヘキサンと酢酸エチ
ルの混液(60ml)(1:2v/v)で洗浄する。さ
らにカラムを酢酸エチルで溶出し、各画分を3mlづつ
集める。18−24の画分を合し、減圧下で濃縮する
と、FR−900520物質(24mg)を得る。
化合物またはその塩、その製造法およびそれを含有する
医薬組成物に関する。さらに詳細には、この発明は免疫
抑制活性、抗菌活性等のような薬理活性を有する新規な
トリシクロ化合物またはその塩、その製造法、それを含
有する免疫抑制剤および抗菌剤に関する。すなわち、こ
の発明の一つの目的は、移植による拒絶反応、骨髄移植
による移植片対宿主病、自己免疫疾患、感染症等の治療
および予防に有用な新規トリシクロ化合物またはその医
薬として許容される塩を提供することである。この発明
のもう一つの目的は、醗酵法および合成法によるトリシ
クロ化合物またはその塩の製造法を提供することであ
る。この発明のさらにもう一つの目的は、有効成分とし
てトリシクロ化合物またはその医薬として許容される塩
を含有する免疫抑制剤および抗菌剤を提供することであ
る。この発明は4種の新規化合物であるFR−9005
06物質、FR−900520物質、FR−90052
3物質およびFR−900525物質が初めて見い出さ
れたことに基づくものである。さらに詳細には、FR−
900506物質、FR−900520物質、FR−9
00523物質およびFR−900525物質は、スト
レプトミセス(Streptomyces)属に属する
新菌種を醗酵することにより得られる培養ブロスから純
粋な形で初めて分離されたものである。そして、FR−
900506物質、FR−900520物質、FR−9
00523物質およびFR−900525物質の化学構
造を明らかにするため鋭意研究した結果、この発明の発
明者等はそれらの化学構造を決定し、それらの化合物の
誘導体の合成に成功した。この発明の新規なトリシクロ
化合物は下記一般式で示すことができる。 【化15】 (式中、R1 はヒドロキシ基または保護されたヒドロキ
シ基、R2 は水素、ヒドロキシ基または保護されたヒド
ロキシ基、R3 はメチル基、エチル基、プロピル基また
はアリル基、nは1または2の整数、実線と点線により
表わされる記号は単結合または二重結合を意味する) 【0002】目的化合物(I)のうち、下記4種の化合
物が醗酵により産生されることが見出された。 (1)R1 およびR2 がそれぞれヒドロキシ基、R3 がア
リル基、nが整数2、実線と点線により表わされる記号
が単結合を意味する化合物(I)(FR−900506
物質と命名) (2)R1 およびR2 がそれぞれヒドロキシ基、R3 がエ
チル基、nが整数2、実線と点線により表わされる記号
が単結合を意味する化合物(I)[(FR−90052
0物質と命名(別名:WS7238A物質)] (3)R1 およびR2 がそれぞれヒドロキシ基、R3 がメ
チル基、nが整数2、実線と点線により表わされる記号
が単結合を意味する化合物(I)[FR−900523
物質と命名(別名:WS7238B物質)] (4)R1 およびR2 がそれぞれヒドロキシ基、R3 がア
リル基、nが整数1、実線と点線により表わされる記号
が単結合を意味する化合物(I)(FR−900525
物質と命名) この発明のトリシクロ化合物(I)において、コンホー
マーあるいは不斉炭素原子および二重結合に起因する光
学異性体および幾何異性体のような1対以上の立体異性
体対が存在することがあり、そのようなコンホーマーあ
るいは異性体もこの発明の範囲内に包含される。この発
明の目的化合物であるトリシクロ化合物(I)またはそ
の塩は、下記に示す製造法により製造することができ
る。 【0003】[I]醗酵法 【化16】 【0004】[II]合成法 (1)製造法1(ヒドロキシ保護基の導入) 【化17】 【0005】(2)製造法2(ヒドロキシ保護基の導入) 【化18】【0006】(3)製造法3(二重結合の形成) 【化19】 【0007】(4)製造法4(ヒドロキシエチレン基の酸
化) 【化20】 【0008】(5)製造法5(アリル基の還元) 【化21】 (式中、R1 、R2 、R3 、nおよび実線と点線により
表わされる記号はそれぞれ前と同じ意味であり、R1 aお
よびR2 aはそれぞれ保護されたヒドロキシ基、R 2 bは脱
離基を意味する) 【0009】上記定義の具体例およびその好ましい実施
態様を以下詳細に説明する。この明細書において使用さ
れる「低級」なる語は、特に指示がなければ、炭素原子
1〜6個を意味する。「保護されたヒドロキシ基」にお
ける好適なヒドロキシ保護基としては、例えばメチルチ
オメチル、エチルチオメチル、プロピルチオメチル、イ
ソプロピルチオメチル、ブチルチオメチル、イソブチル
チオメチル、ヘキシルチオメチル等の低級アルキルチオ
メチル基のような1−(低級アルキルチオ)(低級)ア
ルキル基、さらに好ましいものとしてC1 〜C4 アルキ
ルチオメチル基、最も好ましいものとしてメチルチオメ
チル基;例えばトリメチルシリル、トリエチルシリル、
トリブチルシリル、第三級ブチル−ジメチルシリル、ト
リ第三級ブチルシリル等のトリ(低級)アルキルシリ
ル、例えばメチル−ジフェニルシリル、エチル−ジフェ
ニルシリル、プロピル−ジフェニルシリル、第三級ブチ
ル−ジフェニルシリル等の低級アルキル−ジアリールシ
リル等のようなトリ置換シリル基、さらに好ましいもの
としてトリ(C1 〜C4 )アルキルシリル基およびC1
〜C4 アルキル−ジフェニルシリル基、最も好ましいも
のとして第三級ブチル−ジメチルシリル基および第三級
ブチル−ジフェニルシリル基;カルボン酸およびスルホ
ン酸から誘導される脂肪族アシル基、芳香族アシル基お
よび芳香族基で置換された脂肪族アシル基のようなアシ
ル基;等が挙げられる。脂肪族アシル基としては、例え
ばホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソ
ブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキ
サノイル、カルボキシアセチル、カルボキシプロピオニ
ル、カルボキシブチリル、カルボキシヘキサノイル等
の、カルボキシのような適当な置換基を1個以上有して
いてもよい低級アルカノイル基、例えばシクロプロピル
オキシアセチル、シクロブチルオキシプロピオニル、シ
クロヘプチルオキシブチリル、メンチルオキシアセチ
ル、メンチルオキシプロピオニル、メンチルオキシブチ
リル、メンチルオキシペンタノイル、メンチルオキシヘ
キサノイル等の、低級アルキルのような適当な置換基を
1個以上有していてもよいシクロ(低級)アルコキシ
(低級)アルカノイル基、カンファースルホニル基等が
挙げられる。 【0010】芳香族アシル基としては、例えばベンゾイ
ル、トルオイル、キシロイル、ナフトイル、ニトロベン
ゾイル、ジニトロベンゾイル、ニトロナフトイル等の、
ニトロのような適当な置換基を1個以上有していてもよ
いアロイル基、例えばベンゼンスルホニル、トルエンス
ルホニル、キシレンスルホニル、ナフタレンスルホニ
ル、フルオロベンゼンスルホニル、クロロベンゼンスル
ホニル、ブロモベンゼンスルホニル、ヨードベンゼンス
ルホニル等の、ハロゲンのような適当な置換基を1個以
上有していてもよいアレーンスルホニル基等が挙げられ
る。芳香族基で置換された脂肪族アシル基としては、例
えばフェニルアセチル、フェニルプロピオニル、フェニ
ルブチリル、2−トリフルオロメチル−2−メトキシ−
2−フェニルアセチル、2−エチル−2−トリフルオロ
メチル−2−フェニルアセチル、2−トリフルオロメチ
ル−2−プロポキシ−2−フエニルアセチル等の、低級
アルコキシおよびトリハロ(低級)アルキルのような適
当な置換基を1個以上有していてもよいアル(低級)ア
ルカノイル基等が挙げられる。上記アシル基中、さらに
好ましいアシル基としては、カルボキシを有していても
よいC1 〜C4 アルカノイル基、シクロアルキル部分に
(C1 〜C4 )アルキルを2個有するシクロ(C5 〜C
6 )アルキルオキシ(C1 〜C4 )アルカノイル基、カ
ンファースルホニル基、ニトロを1個または2個有して
いてもよいベンゾイル基、ハロゲンを有するベンゼンス
ルホニル基、C1 〜C4 アルコキシとトリハロ(C1 〜
C4 )アルキルを有するフェニル(C1 〜C4 )アルカ
ノイル基が挙げられ、それらのうち、最も好ましいもの
としては、アセチル、カルボキシプロピオニル、メンチ
ルオキシアセチル、カンファースルホニル、ベンゾイ
ル、ニトロベンゾイル、ジニトロベンゾイル、ヨードベ
ンゼンスルホニルおよび2−トリフルオロメチル−2−
メトキシ−2−フェニルアセチルが挙げられる。好適な
「脱離基」としては、ヒドロキシ基、アシル部分が上記
で例示したようなものであるアシルオキシ基等が挙げら
れる。この発明のトリシクロ化合物(I)の製造法を以
下詳細に説明する。 【0011】[I]醗酵法 この発明のFR−900506物質、FR−90052
0物質、FR−900523物質およびFR−9005
25物質は、ストレプトミセス・ツクバエンシス(St
reptomyces tsukubaensis)N
o.9993およびストレプトミセス・ハイグロスコピ
カス・サブスプ・ヤクシマエンシス(Streptom
yces hygroscopicus Subsp.
yakushimaensis)No.7238のよ
うなストレプトミセス属に属する、FR−90050
6、FR−900520、FR−900523および/
またはFR−900525物質−生産菌株を培地中で醗
酵させることにより生産することができる。FR−90
0506物質、FR−900520物質、FR−900
523物質およびFR−900525物質の醗酵による
生産について以下に説明する。[A]この発明のFR−
900506物質、FR−900520物質およびFR
−900525物質は、ストレプトミセス・ツクバエン
シスNo.9993のようなストレプトミセス属に属す
る、FR−900506、FR−900520および/
またはFR−900525物質−生産菌株を培地中で醗
酵させることにより生産できる。 【0012】微生物 FR−900506物質、FR−900520物質およ
び/またはFR−900525物質の生産に使用される
菌は、ストレプトミセス属に属するFR−90050
6、FR−900520および/またはFR−9005
25物質−生産菌株であり、それらのうちストレプトミ
セス・ツクバエンシスNo.9993が茨城県筑波郡豊
里町で採取された土壌試料から新たに分離された。この
新たに分離されたストレプトミセス・ツクバエンシスN
o.9993の凍結乾燥標本は、工業技術院微生物工業
技術研究所(茨城県筑波郡矢田部町東1丁目1−3)に
1984年10月5日付で寄託番号微工研菌寄第788
6号として寄託され、次いで1985年10月19日付
で新しい寄託番号微工研条寄第927号として同寄託機
関のブダペスト条約ルートに切り換えられた。新規なF
R−900506物質、FR−900520物質および
/またはFR−900525物質の生産において、この
明細書に記載した菌は単に説明のためにのみ掲げたもの
であり、それに限定されるものではない。この発明には
また、自然突然変異菌ならびにX線照射、紫外線照射、
N−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、
2−アミノプリン等による慣用の処理によってつくられ
る人工突然変異菌をも含む、FR−900506物質、
FR−900520物質および/またはFR−9005
25物質を産生できるいかなる突然変異菌を使用する場
合も含まれる。ストレプトミセス・ツクバエンシスN
o.9993は下記のような形態学的性質、培養特性、
生物学的および生理学的特徴を有する。 【0013】[1]形態学的性質 主に、シャーリング(Shirling)およびゴット
リープ(Gottlieb)に記載の方法[シャーリン
グ・イー・ビーおよびディー・ゴットリープ:メソッズ
・フォー・キャラクテリゼーション・オブ・ストレプト
ミセス・スペシーズ(インターナショナル・ジャーナル
・オブ・システマチック・バクテリオロジー)(Met
hods for characterization
ofStreptomyces species.
InternationalJournal of S
ystematic Bacteriology)第1
6巻、第313〜340頁、1966年]を分類学的検
討に用いた。形態学的観察は、オートミール寒天、イー
スト・マルトエキストラクト寒天および無機塩・スター
チ寒天上、30℃で14日間生育させた培養物を用い、
光学および電子顕微鏡を用いて行った。成熟胞子体は各
胞子鎖に10〜50個または50個を超える数の胞子を
有する直鎖状または波状(Rectiflexibil
es)を形成した。電子顕微鏡での観察によればこの胞
子は楕円形の円筒状で、大きさは0.5〜0.7×0.
7〜0.8μmである。胞子表面は滑らかであった。 [2]培養特性 培養特性は上記シャーリングおよびゴットリープ、なら
びにワクスマン(Waksman)[ワクスマン・エス
・エー:ザ・アクチノマイセッツ、第2巻、クラシフィ
ケーション・アイデンティフィケーション・アンド・デ
スクリプション・オブ・ゼネラ・アンド・スペシーズ。
ザ・ウィリアムス・アンド・ウィルキンス・カンパニ
ー、バルチモア、1961年(Waksman,S.
A.:Theactinomycetes,Vol.2
: Classification, identi
fication and description
ofgenera and species. The
Williams and Wilkins C
o., Baltimore,1961)]に記載の1
0種類の培地で観察した。30℃で14日間培養した。
この研究で使用した色名は新色名帖(東京、日本色彩研
究所の手引書)に基づいた。オートミール寒天、イース
ト・マルトエキストラクト寒天および無機塩・スターチ
寒天上で成育させた場合、コロニーは灰色系に属してい
た。可溶性色素はイースト・マルトエキストラクト寒天
で生成したが、他の培地では生成しなかった。結果を表
1〜3に示す。 【0014】表1〜3.菌株No.9993およびスト
レプトミセス・ミサキエンシス IFO12891(Streptomyces mis
akiensisIFO12891)の培養特性 【表1】 【表2】【表3】 細胞壁組成分析を、ベッカー等の方法[ベッカー・ビー
・、エム・ピー・レシウ゛ァリエル、アール・イー・ゴ
ードンおよびエイチ・エー・レシウ゛ァリエル:ラピッ
ド・ディフェレンシエーション・ビトウ゛ィーン・ノカ
ルジアおよびストレプトミセス・バイ・ペーパークロマ
トグラフィー・オブ・ホール・セル・ヒドロリゼーツ:
アプライド・マイクロバイオロジー(Becker,
B., M.P.Lechevalier, R.E.
Gordon and H.A.Lechevalie
r:Rapid differentiation b
etween Nocardia and Strep
tomyces by paper chromato
graphy of whole cell hydr
olysates:Appl.Microbiol.)
第12巻、第421〜423頁、1964年]および山
口の方法[山口、ティー・:コンパリゾン・オブ・ザ・
セル・ウォール・コンポジション・オブ・モルホロジカ
リー・ディスティンクト・アクチノマイセッツ:ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー(Yamaguchi,
T.:Comparison of the cell
wall composition of morp
hologicallydistinct actin
omycetes:J.Bacteriol.)第89
巻、第444〜453頁、1965年]の方法によって
行った。菌株No.9993の全細胞加水分解物の分析
結果は、LL−ジアミノピメリン酸が存在することを示
した。従ってこの菌株の細胞壁はタイプIに属すると考
えられる。 【0015】[3]生物学的および生理学的性質 菌株No.9993の生理学的性質は、前記シャーリン
グおよびゴットリープに記載されている方法によって測
定した。その結果を表4に示す。生育温度範囲および生
育至適温度は、イースト・マルトエキストラクト寒天
上、温度勾配培養器(東洋化学産業株式会社製)を使用
して測定した。生育温度範囲は18〜35℃で、生育至
適温度は28℃であった。ミルクのペプトン化およびゼ
ラチン液化は陽性であった。メラニン色素の産出は陰性
であった。 表4.菌株No.9993およびストレプトミセス・ミ
サキエンシスIFO12891の生理学的性質 【表4】 炭素源の利用性をプリドハムおよびゴットリープの方法
[プリドハム・ティー・ジー・およびディー・ゴットリ
ープ:ザ・ユーティライゼーション・オブ・カーボン・
コンパウンズ・バイ・サム・アクチノマイセッテールズ
・アズ・アン・エイド・フォー・スペシーズ・デターミ
ネーション:ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(P
ridham,T.G.and D.Gottlie
b:Theutilization of carbo
n compounds bysome Actino
mycetales as an aid for s
pecies determination:J.Ba
cteriol.)第56巻、第107〜114頁、1
948年]によって試験した。30℃で14日間培養後
に、生育状況を観察した。この菌株の炭素源の利用性を
表5〜6にまとめて示す。グリセリン、マルトースおよ
びコハク酸ナトリウムは菌株No.9993により利用
された。さらにまた、D−グルコース、シュークロー
ス、D−マンノースおよびサリシンは多少利用する。 【0016】表5〜6.菌株No.9993およびスト
レプトミセス・ミサキエンシスIFO12891の炭素
源利用性 【表5】 【表6】 菌株No.9993の顕微鏡学的観察および細胞壁組成
分析の結果から、この菌株がワクスマン(Waksma
n)およびヘンリシ(Henrici)、1943年、
によるストレプトミセス属に属することが明らかとなっ
た。すなわち、この菌株を公表されている性状[インタ
ーナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・
バクテリオロジー(InternationalJou
rnal of Systematic Bacter
iology)第18巻、第69〜189頁、第279
〜392頁、1968年および第19巻、第391〜5
12頁、1969年、ならびにバージェイズ・マニュア
ル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー
(Bergey’s Manualof Determ
inative Bacteriology)第8版、
1974年]に照らして、ストレプトミセス属の種々の
種と比較した。比較の結果、菌株No.9993はスト
レプトミセス・アブラヴィエンシス・ニシムラ等(St
reptomyces aburaviensis N
ishimura et.al.)、ストレプトミセス
・アヴェラネウス・バルダッシおよびグレイン(Str
eptomyces avellaneus Bald
acci and Grein)およびストレプトミセ
ス・ミサキエンシス・ナカムラに類似していると考えら
れる。従って菌株No.9993の培養特性を、対応す
るストレプトミセス・アブラヴィエンシスIFO128
30、ストレプトミセス・アヴェラネウスIFO134
51およびストレプトミセス・ミサキエンシスIFO1
2891と比較した。その結果菌株No.9993はス
トレプトミセス・ミサキエンシスIFO12891に最
も類似していた。従って菌株No.9993をさらに上
記表1〜6に示したストレプトミセス・ミサキエンシス
IFO12891と詳細に比較した。この結果から、菌
株No.9993はストレプトミセス・ミサキエンシス
IFO12891と下記の点で区別することができ、従
って菌株No.9993はストレプトミセスの新種であ
ると考えられ、この微生物が茨城県筑波郡で採取した土
壌にちなんでストレプトミセス・ツクバエンシス・スプ
・ノブ(Streptomyces tsukubae
nsis sp.nov.)と命名された。 【0017】ストレプトミセス・ミサキエンシスIFO
12891との相違 菌株No.9993の培養特性は、ストレプトミセス・
ミサキエンシスIFO12891とは、オートミール寒
天、イースト・マルトエキストラクト寒天、グルコース
・アスパラギン寒天、スザペック寒天およびポテト・デ
キストロース寒天を用いて培養したとき異なる。菌株N
o.9993のスターチ加水分解は陰性であるが、スト
レプトミセス・ミサキエンシスIFO12891の場合
は陽性である。菌株No.9993のゼラチン液化は陽
性であるが、ストレプトミセス・ミサキエンシスIFO
12891の場合は陰性である。炭素源の利用性におい
ては、菌株No.9993はグリセリン、マルトースお
よびコハク酸ナトリウムを利用するが、ストレプトミセ
ス・ミサキエンシスIFO12891はこれらを利用し
ない。さらに、菌株No.9993はD−ガラクトース
およびイヌリンを利用しないが、ストレプトミセス・ミ
サキエンシスIFO12891はこれらを利用できる。 【0018】FR−900506物質、FR−9005
20物質およびFR−900525物質の産生 この発明の新規なFR−900506物質、FR−90
0520物質およびFR−900525物質は、例えば
ストレプトミセス・ツクバエンシスNo.9993、
(寄託番号:微工研条寄第927号)のようなストレプ
トミセス属に属するFR−900506、FR−900
520および/またはFR−900525物質生産菌株
を培地中で培養することにより産生できる。一般的に
は、FR−900506物質、FR−900520物質
および/またはFR−900525物質は、FR−90
0506、FR−900520および/またはFR−9
00525物質生産菌株を、同化しうる炭素源および窒
素源を含有する水性培地中で、好ましくは例えば振とう
培養、深部培養等の好気性条件下で培養することにより
産生できる。培地の好ましい炭素源としては、グルコー
ス、キシロース、ガラクトース、グリセリン、スター
チ、デキストリン等のような炭水化物が挙げられる。他
の炭素源としてはマルトース、ラムノース、ラフィノー
ス、アラビノース、マンノース、サリシン、コハク酸ナ
トリウム等が挙げられる。好ましい窒素源としてはイー
スト・エキストララクト、ペプトン、グルテンミール、
綿実粉、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、乾燥イ
ースト、小麦胚芽、羽毛粉、落花生粉等、ならびに例え
ば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸アンモニ
ウム等のアンモニウム塩、尿素、アミノ酸等のような無
機または有機窒素化合物が挙げられる。炭素源および窒
素源は好ましくはそれらの組合わせで使用されるが、微
量の生育因子および相当量の無機栄養素を含有していれ
ば純度の低い物質も使用でき、必ずしも純粋な形で使用
する必要はない。所望により培地に炭酸ナトリウムまた
は炭酸カルシウム、燐酸ナトリウムまたは燐酸カリウ
ム、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、沃化ナトリウ
ムまたは沃化カリウム、マグネシウム塩、銅塩、コバル
ト塩等の無機塩を添加してもよい。特に培養培地が著し
く発泡する場合には、必要により液状パラフィン、脂肪
油、植物油、鉱油またはシリコンのような消泡剤を添加
してもよい。FR−900506物質、FR−9005
20物質およびFR−900525物質を大量生産する
条件としては、深部好気培養が好ましい。少量生産には
フラスコまたはびん中で振とう培養または表面培養が行
われる。さらにまた、大型タンク内で生育を実施する場
合には、FR−900506物質、FR−900520
物質およびFR−900525物質の生産工程における
生育遅延を回避するために、微生物の前培養を用いて生
産タンク中に菌を接種するのが好ましい。すなわち、比
較的少量の培養培地に微生物の胞子または菌糸を接種
し、その接種培地を培養して微生物の前培養接種物をま
ず生産し、次いで培養した前培養接種物を無菌的に大型
タンクに移すのが望ましい。この前培養接種物を生産す
る培地は、FR−900506物質、FR−90052
0物質およびFR−900525物質の生産に使用され
る培地と実質的に同じであってもよく、また異なっても
よい。培養混合物の撹拌および通気は種々の方法で行う
ことができる。撹拌はプロペラまたはこれに準ずる撹拌
装置を用いるか、醗酵器を回転させるかまたは振とうす
るか、種々のポンプ装置を用いるか、または培地中に滅
菌空気を通すことによっても行うことができる。通気は
滅菌空気を醗酵混合物中を通過させることにより行って
もよい。醗酵は通常、約20℃〜40℃の温度範囲、好
ましくは25〜35℃で、約50〜150時間行われる
が、醗酵条件および醗酵規模によって適宜変化させれば
よい。 【0019】このようにして生産されたFR−9005
06物質、FR−900520物質およびFR−900
525物質は、他の既知の生物学的活性物質の回収に通
常使用される慣用の方法で培養培地から回収することが
できる。生産されたFR−900506物質、FR−9
00520物質およびFR−900525物質は、培養
菌糸中および濾液中に見出され、従ってFR−9005
06物質、FR−900520物質およびFR−900
525物質は、培養ブロスの濾過または遠心分離によっ
て得られる菌糸および濾液から、減圧濃縮、凍結乾燥、
常用の溶媒による抽出、pH調整、例えば陰イオン交換
樹脂または陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等の
常用の樹脂による処理、例えば活性炭、ケイ酸、シリカ
ゲル、セルロース、アルミナ等の常用の吸着剤による処
理、結晶化、再結晶化等の慣用の方法によって分離、精
製することができる。 【0020】FR−900506物質、FR−9005
20物質およびFR−900525物質の物理化学的性
質 上記醗酵法によって生産されたFR−900506物
質、FR−900520物質およびFR−900525
物質は下記の物理化学的性質を有する。 FR−900506物質 (1) 形状および色調: 白色粉末 (3) 呈色反応: 陽性:硫酸セリウム反応、硫酸反応、エールリッヒ反
応、ドラーゲンドルフ反応、沃素蒸気反応 陰性:塩化第二鉄反応、ニンヒドリン反応、モーリッシ
ュ反応 (4) 溶解性: 可溶:メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチ
ル、クロロホルム、ジエチルエーテル、ベンゼン 難溶:ヘキサン、石油エーテル 不溶:水 (5) 融点: 85〜90℃ (6) 比旋光度: [α]23 D:-73゜ (C=0.8,CHCl3) (7) 紫外線吸収スペクトル: 末端吸収 (8) 赤外線吸収スペクトル: νCHCl 3 max:3680, 3580, 3520, 2930, 2870, 2830, 1
745, 1720, 1700,1645, 1450, 1380, 1350, 1330, 131
0, 1285, 1170, 1135,1090, 1050, 1030, 1000, 990, 9
60 (sh), 918 cm-1 (9) 13C核磁気共鳴スペクトル: δ(ppm,CDCl3):{212.59 (s), 212.45 (s)}, {196.18
(s), 192.87 (s)},{169.07 (s), 168.90 (s)}, {164.90
(s), 166.01 (s)},{138.89 (s), 139.67 (s)}, {135.7
3 (d), 135.60 (d)},{132.52 (s), 131.99 (s)}, {130.
27 (d), 130.21 (d)},{122.87 (d), 123.01 (d)}, {11
6.57 (t), 116.56 (t)},{97.35 (s), 98.76 (s)}, 84.4
1 (d), {77.79 (d), 78.22 (d)},{75.54 (d), 76.97
(d)}, {73.93 (d), 73.09 (d)},{73.72 (d), 72.57
(d)}, {70.05 (d), 69.15 (d)}, 56.75 (d),{53.03
(d), 53.13 (d)}, {48.85 (t), 48.62 (t)},{40.33
(d), 40.85 (d)}, 39.40 (t), 31.58 (t), 30.79 (t),
{27.72 (t), 26.34 (t)}, 26.46 (d), 24.65 (t),{20.4
5 (q), 19.73 (q)}, {14.06 (q), 14.23 (q)},{9.69
(q), 9.98 (q)} 上記スペクトルのチャートを図1に示す。 (10) 1H核磁気共鳴スペクトル:上記スペクトルのチャ
ートを図2に示す。 (11)薄層クロマトグラフィー: 【表7】 (12)物質の性質: 中性物質 FR−900506物質に関して、13Cおよび 1H核磁
気共鳴スペクトルの測定の際、この物質は種々の化学シ
フトにおいてそれぞれ1対のシグナルを示す。このよう
な特徴を有するFR−900506物質は、さらに下記
の性質を有する。 (i)13C核磁気共鳴スペクトルを25℃および60℃
において測定したところ、それぞれ1対のシグナルの強
度比が変化する。 (ii)薄層クロマトグラフィーおよび高速液体クロマ
トグラフィーを測定したところ、FR−900506物
質はそれぞれ薄層クロマトグラフィーでは単一スポット
として、高速液体クロマトグラフィーでは単一ピークと
して現れる。 【0021】FR−900506物質のこの白色粉末は
アセトニトリルから再結晶すると結晶の形状に変化し、
この結晶は下記の物理化学的性質を有する。 (1) 形状および色調: 無色のプリズム状結晶 (3) 融点: 127〜129℃ (4) 比旋光度: [α]23 D :-84.4゜ (C=1.02,CHCl3) (5) 13C核磁気共鳴スペクトル: δ(ppm,CDCl3):{211.98 (s), 211.74 (s)}, {196.28
(s), 193.56 (s)},{168.97 (s), 168.81 (s)}, {164.85
(s), 165.97 (s)},{138.76 (s), 139.51 (s)}, {135.7
3 (d), 135.63 (d)},{132.38 (s), 131.90 (s)}, {130.
39 (d), 130.17 (d)},{122.82 (d), 122.96 (d)}, 116.
43 (t), {97.19 (s), 98.63 (s)},84.29 (d), {77.84
(d), 78.21 (d)}, {77.52 (d), 76.97 (d)},{69.89
(d), 69.00 (d)}, {56.63 (d), 54.87 (d)},{52.97
(d), 52.82 (d)}, {48.76 (t), 48.31 (t)},{40.21
(d), 40.54 (d)}, 31.62 (t), 30.72 (t), 24.56 (t),
{21.12 (t), 20.86 (t)}, {20.33 (q), 19.74 (q)},{1
6.17 (q), 16.10 (q)}, {15.88 (q), 15.75 (q)},{13.8
9 (q), 14.05 (q)}, {9.64 (q), 9.96 (q)} 上記スペクトルのチャートを図3に示す。 (6) 1H核磁気共鳴スペクトル:上記スペクトルのチャー
トを図4に示す。その他の物理化学的性質、すなわちF
R−900506物質の無色のプリズム状結晶の呈色反
応、溶解性、紫外線吸収スペクトル、赤外線吸収スペク
トル、薄層クロマトグラフィーおよび物性の性質は、白
色粉末のそれらと同じであった。上記物理化学的性質お
よびX線解析から、FR−900506物質は下記の化
学構造を有することがわかった。 【化22】 17−アリル−1,14−ジヒドロキシ−12−[2−
(4−ヒドロキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1
−メチルビニル]−23,25−ジメトキシ−13,1
9,21,27−テトラメチル−11,28−ジオキサ
−4−アザトリシクロ[22.3.1.04,9]オクタ
コス−18−エン−2,3,10,16−テトラオン 【0022】FR−900520物質 この化合物の物理化学的性質は後に述べる。 FR−900525物質 (1) 形状および色調: 白色粉末 (2) 元素分析値: C:65.17%,H:8.53%,N:1.76% (3) 呈色反応: 陽性:硫酸セリウム反応、硫酸反応、エールリッヒ反
応、ドラーゲンドルフ反応、沃素蒸気反応 陰性:塩化第二鉄反応、ニンヒドリン反応、モーリッシ
ュ反応 (4) 溶解性: 可溶:メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチ
ル、クロロホルム、ジエチルエーテル、ベンゼン 難溶:ヘキサン、石油エーテル 不溶:水 (5) 融点: 85〜89℃ (6) 比旋光度: [α]23 D :-88゜ (C=1.0,CHCl3) (7) 紫外線吸収スペクトル: 末端吸収 (8) 赤外線吸収スペクトル: νCHCl 3 max:3680, 3580, 3475, 3340, 2940, 2880, 2
830, 1755, 1705,1635, 1455, 1382, 1370, 1330, 131
0, 1273, 1170, 1135,1093, 1050, 1020, 995, 970, 92
0, 867 cm-1 (9) 13C核磁気共鳴スペクトル: δ(ppm,CDCl3):{212.61 (s), 211.87 (s)}, {188.57
(s), 191.12 (s)},{168.76 (s), 170.18 (s)}, {163.11
(s), 161.39 (s)},{140.28 (s), 139.37 (s)}, {135.6
2 (d), 135.70 (d)},{132.28 (s), 131.34 (s)}, {130.
09 (d), 130.00 (d)},{122.50 (d), 123.23 (d)}, 11
6.48 (t), {99.16 (s), 99.11 (s)},{84.42 (d), 84.48
(d)}, {78.60 (d), 79.86 (d)},{76.73 (d), 77.33
(d)}, {59.97 (d), 60.45 (d)},57.52 (q), {56.56
(q), 56.48 (q)}, {56.14 (q), 55.97 (q)},{53.45
(d), 53.26 (d)}, {49.15 (t), 49.73 (t)},{48.46
(t), 47.62 (t)}, {44.47 (t), 45.23 (t)},{41.40
(d), 40.40 (d)}, {35.19 (d), 35.11 (d)},{33.10
(d), 34.17 (d)}, {32.81 (t), 32.29 (t)},{31.53
(t), 31.33 (t)}, {30.80 (t), 30.66 (t)}, 28.60
(t),{26.03 (d), 26.98 (d)}, {25.43 (t), 24.40
(t)},{18.93 (q), 20.57 (q)}, {14.09 (q), 13.95
(q)},{9.85 (q), 10.00 (q)} 上記スペクトルのチャートを図5に示す。 (10) 1H核磁気共鳴スペクトル:上記スペクトルのチャ
ートを図6に示す。 (11)薄層クロマトグラフィー: 【表8】 (12)物質の性質: 中性物質 FR−900525物質に関して、13Cおよび 1H核磁
気共鳴スペクトルの測定の際、この物質は種々の化学シ
フトにおいてそれぞれ1対のシグナルを示したが、薄層
クロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー
を測定したところ、FR−900525物質はそれぞれ
薄層クロマトグラフィーで単一スポット、高速液体クロ
マトグラフィーでは単一ピークを示した。上記物理化学
的性質およびFR−900506物質の化学構造が決定
されたことにより、FR−900525物質は下記の化
学構造を有することが判明した。 【化23】 16−アリル−1,13−ジヒドロキシ−11−[2−
(4−ヒドロキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1
−メチルビニル]−22,24−ジメトキシ−12,1
8,20,26−テトラメチル−10,27−ジオキサ
−4−アザトリシクロ[21.3.1.04,8]ヘプタ
コス−17−エン−2,3,9,15−テトラオン [B]この発明のFR−900520物質およびFR−9
00523物質は、ストレプトミセス・ハイグロスコピ
カス・サブスプ・ヤクシマエンシスNo.7238のよ
うなストレプトミセス属に属するFR−900520お
よび/またはFR−900523物質−生産菌株を、培
地中で醗酵させることにより生産できる。 【0023】微生物 FR−900520物質および/またはFR−9005
23物質の生産に使用される菌は、ストレプトミセス属
に属するFR−900520および/またはFR−90
0523物質−生産菌株であり、それらのうちストレプ
トミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ・ヤクシマエ
ンシスNo.7238が鹿児島県屋久島で採取された土
壌試料から新たに分離された。この新たに分離されたス
トレプトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ・ヤク
シマエンシスNo.7238の凍結乾燥標本は、工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託番号微工研菌寄第80
43号として、1985年1月12日付で寄託され、次
いで1985年10月19日付で新しい寄託番号微工研
条寄第928号として同寄託機関のブダペスト条約ルー
トに切り換えられた。新規なFR−900520物質お
よびFR−900523物質の生産において、この明細
書に記載した菌は単に説明のためにのみ掲げたものであ
って、それに限定されるものではない。この発明にはま
た、自然突然変異菌ならびにX線照射、紫外線照射、N
−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、2
−アミノプリン処理等のような慣用の処理によってつく
られる人工突然変異菌をも含む、FR−900520物
質および/またはFR−900523物質を産生できる
いかなる突然変異菌を使用する場合も含まれる。ストレ
プトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ・ヤクシマ
エンシスNo.7238は下記のような形態学的性質、
培養特性、生物学的および生理学的特徴を有する。 [1]形態学的特徴 前述のシャーリングおよびゴットリープによって記載さ
れている方法を主としてこの分類学上の研究に用いた。
形態学的観察は、オートミール寒天、イースト・マルト
エキストラクト寒天および無機塩・スターチ寒天上、3
0℃で14日間生育させた培養物を用い、光学および電
子顕微鏡により行った。成熟胞子体は幾分短かく、それ
ぞれの鎖に約20個の胞子を有する鍵状(Retina
culiaperti)およびら旋状(Spirale
s)を形成していた。吸湿性の胞子塊がオートミール寒
天および無機塩・スターチ寒天上の気菌糸に見られた。
胞子表面の不揃いの凹凸は非常に短くて太い棘といぼと
の間の中間の形状であった。 【0024】[2]培養特性 培養特性は、上記シャーリングおよびゴットリープ、な
らびに前述のワクスマンに記載の10種類の培地上で観
察した。30℃で14日間培養した。この研究で使用し
た色名は前記新色名帖に基づいた。オートミール寒天、
イースト・マルトエキストラクト寒天および無機塩・ス
ターチ寒天上で生育させた場合、コロニーは灰色系に属
していた。可溶性色素は試験した培地中では産生されな
かった。結果を表9〜12に示す。 表9〜12.菌株No.7238、ストレプトミセス・
アンチマイコティクス(Streptomyces a
ntimicoticus)IFO12839およびス
トレプトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ・グレ
ボスス(Streptomyces hygrosco
picus subsp.glebosus)IFO1
3786の培養特性 【表9】【表10】 【表11】 【表12】 【0025】細胞壁分析を前述のベッカー等および山口
の方法によって行った。菌株No.7238の全細胞加
水分解物の分析結果は、LL−ジアミノピメリン酸の存
在を示していた。従ってこの菌株の細胞壁はタイプIに
属すると考えられる。 [3] 生物学的および生理学的性質 菌株No.7238の生理学的性質は、前記シャーリン
グおよびゴットリープ記載の方法に従って測定した。そ
の結果を表13に示す。生育温度範囲および生育至適温
度は、イースト・マルトエキストラクト寒天上、温度勾
配培養器(東洋化学産業株式会社製)を使用して測定し
た。生育温度範囲は18〜36℃で、至適温度は28℃
であった。スターチ加水分解およびゼラチン液化は陽性
であった。メラニン色素は産生されなかった。 表13.菌株No.7238、ストレプトミセス・アン
チマイコティクスIFO12839およびストレプトミ
セス・ハイグロスコピカス・サブスプ・グレボススIF
O13786の生理学的性質 【表13】 炭素源の利用性を前述のプリドハムおよびゴットリープ
の方法によって試験した。生育状態を30℃で14日間
培養した後観察した。この菌株の炭素源利用性を表14
〜15にまとめて示す。D−グルコース、シュークロー
ス、ラクトース、マルトース、D−トレハロース、イノ
シトール、イヌリンおよびサリシンが菌株No.723
8により利用された。 表14〜15.菌株No.7238、ストレプトミセス
・アンチマイコティクスIFO12839およびストレ
プトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ・グレボス
スIFO13786の炭素源利用性 【表14】 【表15】 菌株No.7238の顕微鏡学的観察および細胞壁組成
分析結果から、この菌株がワクスマンおよびヘンリシ、
1943年によるストレプトミセス属に属することが明
らかとなった。従って、この菌株を公表された性状[イ
ンターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティッ
ク・バクテリオロジー(International
Journal of Systematic Bac
teriology)第18巻、69〜189頁、27
9〜392頁、1968年および第19巻、391〜5
12頁、1969年ならびにバージェイズ・マニュアル
・オブ・デターミネーティブ・バクテリオロジー第8
版、1974年 (Bergey’s Manual
of Determinative Bacterio
logy 8thEdition,1974)]に照ら
して種々のストレプトミセス属に属する種と比較した。
比較の結果、菌株No.7238はストレプトミセス・
アンチマイコティクス・ワクスマン1957およびスト
レプトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ・グレボ
ススオオモリ等に類似していると考えられる。従って菌
株No.7238の培養特性を、さらに対応するストレ
プトミセス・アンチマイコティクスIFO12839お
よびストレプトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ
・グレボススIFO13786と、表9〜15に示した
ように比較した。この詳細比較の結果から、菌株No.
7238はストレプトミセス・アンチマイコティクスI
FO12839およびストレプトミセス・ハイグロスコ
ピカス・サブスプ・グレボススIFO13786とは下
記の点で区別することができた。 【0026】(i)ストレプトミセス・アンチマイコティ
クスIFO12839との相違 菌株No.7238の培養特性は、ストレプトミセス・
アンチマイコティクスIFO12839とは、イースト
・マルトエキストラクト寒天、グルコース・アスパラギ
ン寒天、グリセリンアスパラギン寒天、ポテト・デキス
トロース寒天およびチロシン寒天を用いて培養したとき
異なる。炭素源の利用性では、菌株No.7238はマ
ルトースを利用するが、ストレプトミセス・アンチマイ
コティクスIFO12839は利用しない。さらに、菌
株No.7238はグリセリン、D−フルクトース、ラ
ムノース、ラフィノース、D−ガラクトース、D−マン
ノース、マンニトールおよびコハク酸ナトリウムを利用
しないが、ストレプトミセス・アンチマイコティクスI
FO12839は利用する。 【0027】(ii)ストレプトミセス・ハイグロスコ
ピカス・サブスプ・グレボススIFO13786との相
違 菌株No.7238の培養特性は、ストレプトミセス・
ハイグロスコピカス・サブスプ・グレボススIFO13
786とは、イースト・マルトエキストラクト寒天、ポ
テト・デキストロース寒天およびチロシン寒天を用いて
培養したとき異なる。菌株No.7238のミルクペプ
トン化は陰性であるが、ストレプトミセス・ハイグロス
コピカス・サブスプ・グレボススIFO13786は陽
性である。菌株No.7238は7%NaClの存在下
に生育しうるが、ストレプトミセス・ハイグロスコピカ
ス・サブスプ・グレボススIFO13786は同条件下
には生育しない。炭素源の利用性では、菌株No.72
38はラクトース、イヌリンおよびサリシンを利用しう
るが、ストレプトミセス・ハイグロスコピカス・サブス
プ・グレボススIFO13786はそれらを利用しな
い。また、菌株No.7238はグリセリン、D−キシ
ロース、D−フルクトース、ラフィノース、D−ガラク
トース、D−マンノース、マンニトールおよびコハク酸
ナトリウムを利用しないが、ストレプトミセス・ハイグ
ロスコピカス・サブスプ・グレボススIFO13786
はそれらを利用する。しかしながら、菌株No.723
8はオートミール寒天および無機塩スターチ寒天で気菌
糸に吸湿性胞子塊を形成し、さらに菌株No.7238
の形態学的特徴および培養特性はストレプトミセス・ハ
イグロスコピカス・サブスプ・グレボススIFO137
86に類似している。従って菌株No.7238はスト
レプトミセス・ハイグロスコピカスに属し、この公知の
菌株がストレプトミセス・ハイグロスコピカスの亜種中
では菌株No.7238に最も類似しているけれども、
菌株No.7238はストレプトミセス・ハイグロスコ
ピカス・サブスプ・グレボススIFO13786とは異
なる。以上の事実から菌株No.7238は、ストレプ
トミセス・ハイグロスコピカスの新亜種であると考えら
れ、微生物が屋久島の土壌から分離されたことにちなん
で、ストレプトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ
・ヤクシマエンシス(Streptomyceshyg
roscopicus subsp.yakushim
aensis)と命名された。 【0028】FR−900520物質およびFR−90
0523物質の産生 この発明の新規なFR−900520物質および/また
はFR−900523物質は、例えばストレプトミセス
・ハイグロスコピカス・サブスプ・ヤクシマエンシスN
o.7238(寄託番号:微工研条寄第928号)のよ
うなストレプトミセス属に属するFR−900520お
よび/またはFR−900523物質生産菌株を培地で
培養することにより産生できる。一般的には、FR−9
00520物質および/またはFR−900523物質
は、FR−900520および/またはFR−9005
23物質生産菌株を同化しうる炭素源および窒素源を含
む水性栄養培地中、好ましくは例えば振とう培養、深部
培養等の好気性条件下に培養することによって産生でき
る。培地中の好ましい炭素源としては、グルコース、シ
ュークロース、ラクトース、グリセリン、スターチ、デ
キストリン等のような炭水化物が挙げられる。その他培
地中に含まれていてもよい炭素源としては、マルトー
ス、D−トレハロース、イノシトール、イヌリン、サリ
シン等が挙げられる。好ましい窒素源としてはイースト
・エキストラクト、ペプトン、グルテンミール、綿実
粉、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、乾燥イース
ト、小麦胚芽、羽毛粉、落花生粉等、ならびに例えば硝
酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸アンモニウム
等のアンモニウム塩、尿素、アミノ酸等のような無機ま
たは有機窒素化合物が挙げられる。炭素源および窒素源
は好ましくはそれらの組合わせで使用されるが、微量の
生育因子および相当量の無機栄養素を含有していれば純
度の低い物質も使用でき、必ずしも純粋な形で使用する
必要はない。所望により培地に炭酸ナトリウムまたは炭
酸カルシウム、燐酸ナトリウムまたは燐酸カリウム、塩
化ナトリウムまたは塩化カリウム、沃化ナトリウムまた
は沃化カリウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等
の無機塩を添加してもよい。特に培養培地が著しく発泡
する場合には、必要により液状パラフィン、脂肪油、植
物油、鉱油またはシリコンのような消泡剤を添加しても
よい。FR−900520物質およびFR−90052
3物質を大量生産する条件としては、深部好気培養が好
ましい。少量生産にはフラスコまたはびん中で振とう培
養または表面培養が行われる。さらにまた、大型タンク
内で生育を実施する場合には、FR−900520物質
およびFR−900523物質の生産工程における生育
遅延を回避するために、微生物の前培養を用いて生産タ
ンク中に菌を接種するのが好ましい。すなわち、比較的
少量の培養培地に微生物の胞子または菌糸を接種し、そ
の接種培地を培養して微生物の前培養接種物をまず生産
し、次いで培養した前培養接種物を無菌的に大型タンク
に移すのが望ましい。この前培養接種物を生産する培地
は、FR−900520物質およびFR−900523
物質の生産に使用される培地と実質的に同じであっても
よく、また異なってもよい。培養混合物の撹拌および通
気は種々の方法で行うことができる。撹拌はプロペラま
たはこれに準ずる撹拌装置を用いるか、醗酵器を回転さ
せるかまたは振とうするか、種々のポンプ装置を用いる
か、または培地中に滅菌空気を通すことによっても行う
ことができる。通気は滅菌空気を醗酵混合物中を通過さ
せることにより行ってもよい。醗酵は通常、約20℃〜
40℃の温度範囲、好ましくは25〜35℃で、約50
〜150時間行われるが、醗酵条件および醗酵規模によ
って適宜変化させればよい。このようにして生産された
FR−900520物質およびFR−900523物質
は、他の既知の生物学的活性物質の回収に通常使用され
る慣用の方法で培養培地から回収することができる。生
産されたFR−900520物質およびFR−9005
23物質は、培養菌糸中および濾液中に見出され、従っ
てFR−900520物質およびFR−900523物
質は、培養ブロスの濾過または遠心分離によって得られ
る菌糸および濾液から、減圧濃縮、凍結乾燥、常用の溶
媒による抽出、pH調整、例えば陰イオン交換樹脂また
は陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等の常用の樹
脂による処理、例えば活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セ
ルロース、アルミナ等の常用の吸着剤による処理、結晶
化、再結晶化等の慣用の方法によって分離、精製するこ
とができる。特に、FR−900520物質およびFR
−900523物質は、醗酵によって産生された両生成
物を含む物質を、酢酸エチル、n−ヘキサン等のような
適切な溶媒に溶解し、次いでその溶液をクロマトグラフ
ィー、例えば、シリカゲルを使用するカラムクロマトグ
ラフィーに付し、酢酸エチルおよびn−ヘキサン、また
はそれらの混合物のような適切な溶媒で溶出することに
より分離することができる。また、このようにして分離
されたFR−900520物質およびFR−90052
3物質はそれぞれ、例えば再結晶、再クロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー等の常法によってさら
に精製することができる。 【0029】FR−900520物質およびFR−90
0523物質の物理化学的性質 FR−900520物質 (1) 形状および色調: 無色の板状結晶 (2) 元素分析値: C: 64.81%, H : 8.82%, N : 1.55% (3) 呈色反応: 陽性:硫酸セリウム反応、硫酸反応、エールリッヒ反
応、ドラーゲンドルフ反応、沃素蒸気反応 陰性:塩化第二鉄反応、ニンヒドリン反応、モーリッシ
ュ反応 (4) 溶解性: 可溶:メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチ
ル、クロロホルム、ジエチルエーテル、ベンゼン 難溶:n−ヘキサン、石油エーテル 不溶:水 (5) 融点: 163〜165℃ (6) 比旋光度: [α]23 D : -84.1°(C = 1.0, CHCl3) (7) 紫外線吸収スペクトル: 末端吸収 (8) 赤外線吸収スペクトル: νCHCl 3 max : 3680, 3575, 3520, 2940, 2875, 2825,
1745, 1725, 1700,1647, 1610 (sh), 1452, 1380, 135
0, 1330, 1285, 1170,1135, 1090, 1030, 1005, 990,
980 (sh), 960 (sh), 913,908(sh) cm-1 (9) 13C核磁気共鳴スペクトル: δ(ppm, CDCl3): 213.04 (s), {196.21 (s), 193.23
(s)},{169.07 (s), 168.85 (s)}, {164.92 (s), 165.9
7 (s)},{138.67 (s), 139.53 (s)}, {132.46 (s), 131.
98 (s)},{130.20 (d), 130.08 (d)}, {123.42 (d), 12
3.59 (d)},{97.28 (s), 98.75 (s)}, 84.37 (d), {7
7.80 (d), 78.24 (d)},{75.53 (d), 76.98 (d)}, 73.9
2 (d), 73.69 (d),{73.11 (d), 72.72 (d)}, {70.11
(d), 69.21 (d)}, 57.02 (q),{56.60 (q), 57.43
(q)}, {56.23 (q), 55.98 (q)},{56.72 (d), 52.91
(d)}, {55.10 (d), 54.90 (d)},{48.90 (t), 48.57
(t)}, {40.19 (d), 40.63 (d)},{27.67 (t), 26.32
(t)}, {26.51 (d), 26.44 (d)}, 24.60 (t),{21.19
(t), 20.86 (t)}, {20.47 (q), 19.75 (q)},{16.21
(q), 15.97 (q)}, {15.83 (q), 15.94 (q)},{14.04
(q), 14.16 (q)}, 11.68 (q), {9.64 (q), 9.93 (q)} 上記スペクトルのチャートを図7に示す。 (10) 1H核磁気共鳴スペクトル:上記スペクトルのチャ
ートを図8に示す。 (11)薄層クロマトグラフィー: 【表16】 (12)物質の性質: 中性物質 FR−900520物質に関して、13Cおよび 1H核磁
気共鳴スペクトルの測定の際、この物質は種々の化学シ
フトにそれぞれ1対のシグナルを示すが、薄層クロマト
グラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーを測定し
たところ、FR−900520物質は薄層クロマトグラ
フィーで単一スポットを高速液体クロマトグラフィーで
単一ピークをそれぞれ示した。 【0030】上記物理化学的性質およびFR−9005
06物質の化学構造が決定されたことにより、FR−9
00520物質は下記の化学構造を有することが判明し
た。 【化24】 17−エチル−1,14−ジヒドロキシ−12−[2−
(4−ヒドロキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1
−メチルビニル]−23,25−ジメトキシ−13,1
9,21,27−テトラメチル−11,28−ジオキサ
−4−アザトリシクロ[22.3.1.04,9]オクタ
コス−18−エン−2,3,10,16−テトラオン FR−900523物質 (1) 形状および色調: 無色の針状結晶 (2) 元素分析値: C:64.57% , H:8.84% , N:1.81% (3) 呈色反応: 陽性:硫酸セリウム反応、硫酸反応、エールリッヒ反
応、ドラーゲンドルフ反応、沃素蒸気反応 陰性:酸化第二鉄反応、ニンヒドリン反応 (4) 溶解性: 可溶:メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチ
ル、クロロホルム、ジエチルエーテル、ベンゼン 難溶:n−ヘキサン、石油エーテル 不溶:水 (5) 融点: 152〜154℃ (6) 比旋光度: [α]23 D:-73.0° (C=0.65, CHCl3) (7) 紫外線吸収スペクトル: 末端吸収 (8) 赤外線吸収スペクトル: νCHCl 3 max:3670, 3580, 3510, 2930, 2875, 2825, 1
745, 1722, 1700,1647, 1450, 1380, 1350, 1330, 130
7, 1285, 1170, 1135,1090, 1050, 1030, 1000, 990, 9
78, 960, 930, 915, 888,870, 850 cm-1 (9) 13C核磁気共鳴スペクトル: δ(ppm, CDCl3):{213.82 (s), 213.32 (s)}, {196.31
(s), 193.34 (s)},{168.96 (s), 168.85 (s)}, {164.84
(s), 165.98 (s)},{137.80 (s), 138.41 (s)}, {132.8
9 (s), 131.96 (s)},{129.62 (d), 130.03 (d)}, {124.
51 (d), 124.84 (d)},{97.13 (s), 98.67 (s)}, 84.38
(d), {76.69 (d), 78.06 (d)},{75.45 (d), 76.91
(d)}, {73.89 (d), 73.70 (d)}, 73.70 (d),{73.09
(d), 72.84 (d)}, {70.40 (d), 69.24 (d)},{56.75
(d), 52.89 (d)}, {56.93 (q), 57.43 (q)},{56.61
(q), 56.56 (q)}, {56.24 (q), 55.94 (q)},{48.58
(t), 48.32 (t)}, {47.14 (d), 47.38 (d)},{40.23
(d), 40.65 (d)}, {27.85 (t), 26.32 (t)},{26.48
(d), 26.64 (d)}, 24.68 (t), {21.33 (t), 20.83
(t)},{20.63 (q), 19.77 (q)}, {16.24 (q), 16.34
(q)},{15.70 (q), 15.96 (q)}, {15.51 (q), 15.96
(q)},{14.31 (q), 14.18 (q)}, {9.64 (q), 10.04 (q)} 上記スペクトルのチャートを図9に示す。 (10) 1H核磁気共鳴スペクトル:上記スペクトルのチャ
ートを図10に示す。 (11)薄層クロマトグラフィー: 【表17】 (12)物質の性質: 中性物質 FR−900523物質に関して、13Cおよび 1H核磁
気共鳴スペクトルの測定の際に、この物質は種々の化学
シフトにそれぞれ1対のシグナルを示すが、薄層クロマ
トグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーの測定
の場合には、FR−900523物質はそれぞれ薄層ク
ロマトグラフィーで単一スポットを、高速液体クロマト
グラフィーで単一ピークを示した。 【0031】上記物理化学的性質およびFR−9005
06物質の化学構造が決定されたことにより、FR−9
00523物質は下記の化学構造を有することが判明し
た。 【化25】 1,14−ジヒドロキシ−12−[2−(4−ヒドロキ
シ−3−メトキシシクロヘキシル)−1−メチルビニ
ル]−23,25−ジメトキシ−13,17,19,2
1,27−ペンタメチル−11,28−ジオキサ−4−
アザトリシクロ[22.3.1.04,9]オクタコス−
18−エン−2,3,10,16−テトラオン 【0032】[II]合成法: (1)製造法1:(ヒドロキシ保護基の導入) 化合物(Ib)またはその塩は、化合物(Ia)または
その塩にヒドロキシ保護基を導入することによって製造
できる。この反応において使われるヒドロキシ保護基の
導入剤としては慣用のもの、例えばジメチルスルホキシ
ド、エチルメチルスルホキシド、プロピルメチルスルホ
キシド、イソプロピルメチルスルホキシド、ブチルメチ
ルスルホキシド、イソブチルメチルスルホキシド、ヘキ
シルメチルスルホキシド等の低級アルキルメチルスルホ
キシドのようなジ(低級)アルキルスルホキシド;例え
ば塩化トリメチルシリル、臭化トリエチルシリル、塩化
トリブチルシリル、塩化t−ブチルジメチルシリル等の
トリ(低級)アルキルシリルハロゲン化物、例えば塩化
メチル−ジフェニルシリル、臭化エチル−ジフェニルシ
リル、塩化プロピル−ジトリルシリル、塩化t−ブチル
−ジフェニルシリル等の低級アルキル−ジアリールシリ
ルハロゲン化物のような三置換シリル化合物;前記アシ
ル基を導入することのできるカルボン酸、スルホン酸お
よび、例えば酸ハロゲン化物、酸無水物、活性アミド、
活性エステルなどのこれらの反応性誘導体のようなアシ
ル化剤等を挙げることができる。このような反応性誘導
体の適切な例としては、酸塩化物、酸臭化物、例えばジ
アルキル燐酸、フェニル燐酸、ジフェニル燐酸、ジベン
ジル燐酸、ハロゲン化燐酸等の置換燐酸、ジアルキル亜
燐酸、亜硫酸、チオ硫酸、硫酸、例えば炭酸メチル、炭
酸エチル、炭酸プロピル等のアルキル炭酸エステル、例
えばピバリン酸、ペンタン酸、イソペンタン酸、2−エ
チルブチル酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸等の
脂肪族カルボン酸、例えば安息香酸等の芳香族カルボン
酸のような酸との混合酸無水物、対称型酸無水物、イミ
ダゾール、4−置換イミダゾール、ジメチルピラゾー
ル、トリアゾール、テトラゾールのようなイミノ基を含
有する複素環式化合物との活性酸アミド、例えばp−ニ
トロフェニルエステル、2,4−ジニトロフェニルエス
テル、トリクロロフェニルエステル、ペンタクロロフェ
ニルエステル、メシルフェニルエステル、フェニルアゾ
フェニルエステル、フェニルチオエステル、p−ニトロ
フェニルチオエステル、p−クレジルチオエステル、カ
ルボキシメチルチオエステル、ピリジルエステル、ピペ
リジルエステル、8−キノリルチオエステルまたはN,
N−ジメチルヒドロキシルアミン、1−ヒドロキシ−2
−(1H)−ピリドン、N−ヒドロキシスクシンイミ
ド、N−ヒドロキシフタルイミド、1−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール、1−ヒドロキシ−6−クロロベンゾト
リアゾールのようなN−ヒドロキシ化合物とのエステル
等の活性エステル等が挙げられる。この反応において、
ジ(低級)アルキルスルホキシドがヒドロキシ保護基の
導入剤として使用される場合、反応は、通常無水酢酸の
ような無水低級アルカン酸の存在下に行われる。さら
に、三置換シリル化合物がヒドロキシ保護基の導入剤と
して使用される場合、反応は、イミダゾール等のような
慣用の縮合剤の存在下に行うことが好ましい。 【0033】さらには、アシル化剤がヒドロキシ保護基
の導入剤として使用される場合、反応は、例えばリチウ
ム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、例えばカ
ルシウム等のアルカリ土金属、例えば水素化ナトリウム
等のアルカリ金属水素化物、例えば水素化カルシウム等
のアルカリ土金属水素化物、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、例えば炭酸
ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩、例
えば炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等のアルカ
リ金属炭酸水素塩、例えばナトリウムメトキシド、ナト
リウムエトキシド、カリウムt−ブトキシド等のアルカ
リ金属アルコキシド、例えば酢酸ナトリウム等のアルカ
リ金属アルカン酸、例えばトリエチルアミン等のトリア
ルキルアミン、例えばピリジン、ルチジン、ピコリン、
4−N,N−ジメチルアミノピリジン等のピリジン化合
物、キノリンのような有機または無機塩基の存在下に行
うのが好ましい。この反応において、アシル化剤が遊離
の酸またはその塩の形で使用する場合、反応は、例えば
N,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド、N−シク
ロヘキシル−N′−(4−ジエチルアミノシクロヘキシ
ル)カルボジイミド、N,N′−ジエチルカルボジイミ
ド、N,N′−ジイソプロピルカルボジイミド、N−エ
チル−N′−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジ
イミド等のカルボジイミド化合物、例えばN,N′−カ
ルボニルビス(2−メチルイミダゾール)、ペンタメチ
レンケテン−N−シクロヘキシルイミン、ジフェニルケ
テン−N−シクロヘキシルイミン等のケテンイミン化合
物、例えばエトキシアセチレン、β−シクロビニルエチ
ルエーテル等のオレフィンまたはアセチレン系エーテル
化合物、例えば1−(4−クロロベンゼンスルホニルオ
キシ)−6−クロロ−1H−ベンゾトリアゾール等のN
−ヒドロキシベンゾトリアゾール誘導体のスルホン酸エ
ステル等の慣用の縮合剤の存在下に行うことが好まし
い。反応は、通常、水、アセトン、ジクロロメタン、例
えばメタノール、エタノール等のアルコール、テトラヒ
ドロフラン、ピリジン、N,N−ジメチルホルムアミド
等またはこれらの混合溶媒のようなこの反応に悪影響を
与えない慣用の溶媒中で行われ、さらに、塩基またはヒ
ドロキシ保護基の導入剤が液体の場合は、これらも溶媒
として使用することができる。反応温度は特に限定され
ず、通常冷却下ないし加熱下で行われる。この反応にお
いて、化合物(Ia)のR2 で示されるヒドロキシ基が
保護されたヒドロキシ基に転換することもあり、このよ
うな場合もこの製造法に包含される。さらに、この反応
において、無水低級アルカン酸の存在下ジ(低級)アル
キルスルホキシドをヒドロキシ保護基導入剤として使用
する際、式: 【化26】 (式中、R2 はヒドロキシ基である)で示される部分構
造を有する化合物(Ia)が酸化され、式: 【化27】 (式中、R2 はヒドロキシである)で示される部分構造
を有する目的化合物(Ib)を得ることがあり、このよ
うな場合も、この製造法の範囲に包含される。 【0034】(2)製造法2:(ヒドロキシ保護基の導
入) 化合物(Id)またはその塩は、化合物(Ic)または
その塩にヒドロキシ保護基を導入することによって製造
できる。この反応は、製造法1と実質的に同様の方法で
行うことができ、従って、例えば塩基、縮合剤、溶媒、
反応温度等の反応条件は、製造法1を援用できる。この
反応において、化合物(Ic)のR1 におけるヒドロキ
シ基が目的化合物(Id)では対応する保護されたヒド
ロキシ基へ転換することがあり、このような場合も、こ
の製造法の範囲に包含される。 (3)製造法3:(二重結合の形成) 化合物(If)またはその塩は、化合物(Ie)または
その塩に塩基を反応させることによって製造できる。こ
の反応で使用される塩基としては、製造法1で例示した
塩基をそのまま挙げることができる。この反応は、ま
た、R2 がヒドロキシである化合物(Ie)またはその
塩に、塩基の存在下アシル化剤と反応させることによっ
ても製造できる。この反応は、水、アセトン、ジクロロ
メタン、例えばメタノール、エタノール、プロパノール
等のアルコール、テトラヒドロフラン、ピリジン、N,
N−ジメチルホルムアミド等またはその混合溶媒のよう
なこの反応に悪影響を与えない慣用の溶媒中で行われ、
さらに、塩基が液体である場合には、これらも溶媒とし
て使用することができる。反応温度は特に限定されず、
通常冷却下ないし加熱下で行われる。 【0035】(4)製造法4:(ヒドロキシエチレン基の
酸化) 化合物(Ih)またはその塩は、化合物(Ig)または
その塩を酸化することによって製造できる。この反応で
使用される酸化剤としては、製造法1で示したようなジ
(低級)アルキルスルホキシドを挙げることができる。
この反応は、通常無水酢酸のような無水低級アルカン酸
の存在下に、アセトン、ジクロロメタン、酢酸エチル、
テトラヒドロフラン、ピリジン、N,N−ジメチルホル
ムアミド等またはその混合溶媒のようなこの反応に悪影
響を与えない慣用の溶媒中で行われ、さらに、無水低級
アルカン酸が液体の場合には、これらも溶媒として使用
することができる。反応温度は特に限定されず、通常冷
却下ないし加熱下で行われる。この製造法は、反応の途
中で、原料化合物(Ig)のR1で示されるヒドロキシ
基が目的化合物(Ih)において1−(低級アルキルチ
オ)(低級)アルコキシ基へ転換することがあり、この
ような場合もこの製造法の範囲内に包含される。 (5)製造法5:(アリル基の還元) 化合物(Ij)またはその塩は、化合物(Ii)または
その塩を還元することによって製造できる。この製造法
における還元は、接触還元等のようなアリル基をプロピ
ル基に還元できる常法によって行うことができる。接触
還元で使用される触媒としては、例えば白金板、白金海
綿、白金黒、コロイド白金、酸化白金、白金線等の白金
触媒、例えばパラジウム海綿、パラジウム黒、酸化パラ
ジウム、パラジウム・炭素、コロイドパラジウム、パラ
ジウム・硫酸バリウム、パラジウム・炭酸バリウム等の
パラジウム触媒、例えば還元ニッケル、酸化ニッケル、
ラネーニッケル等のニッケル触媒、例えば還元コバル
ト、ラネーコバルト等のコバルト触媒、例えば還元鉄、
ラネー鉄等の鉄触媒、例えば還元銅、ラネー銅、ウルマ
ン銅等の銅触媒等のような慣用のものが挙げられる。こ
の還元は、通常、水、メタノール、エタノール、プロパ
ノール、ピリジン、酢酸エチル、N,N−ジメチルホル
ムアミド、ジクロロエタンまたはその混合溶媒のような
この反応に悪影響を与えない慣用の溶媒中で行われる。
この還元の反応温度は特に限定されず、通常冷却下ない
し加温下の範囲で行われる。上記に説明した製造法1〜
5によって得られるトリシクロ化合物(I)は、例えば
抽出、沈澱、分別結晶化、再結晶化、クロマトグラフィ
等の常法により単離、精製できる。化合物(I)および
(Ia)〜(Ij)における塩としては、無毒の、医薬
として許容される慣用の塩であり、例えばナトリウム
塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、例えばカルシウム
塩、マグネシウム塩等のアルカリ土金属塩、アンモニウ
ム塩、例えばトリエチルアミン塩、N−ベンジル−N−
メチルアミン塩等のアミン塩のような無機または有機塩
基との塩が挙げられる。前記の製造法1〜5の反応また
はその反応混合物の後処理中において、出発化合物およ
び目的化合物のコンホーマーおよび不斉炭素原子または
二重結合による立体異性体が、他のコンホ−マ−および
立体異性体に転換されることがあり、このような場合も
この発明の範囲に包含される。この発明のトリシクロ化
合物(I)は、免疫抑制作用、抗菌作用等のような薬理
作用を有し、従って、心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚等
の臓器あるいは組織の移植に対する拒絶反応、骨髄移植
によって起る移植片対宿主反応、慢性関節リウマチ、全
身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、
重症筋無力症、I型糖尿病、ブドウ膜炎等の自己免疫疾
患、病原菌によって起る感染症等の治療および予防に有
用である。このような薬理作用を有することを示すた
め、トリシクロ化合物(I)の薬理試験データを以下に
示す。 【0036】試験1 試験管内混合リンパ球反応(MLR)におけるトリシク
ロ化合物(I)の抑制効果 各ウェルにC57BL/6応答細胞(H−2b)5×1
05個と、マイトマイシンC処理(マイトマイシンC2
5μg/mlで37℃で30分間処理しRPM I164
0培地で3回洗浄する)したBALB/C刺激細胞(H
−2d)5×1 0 5個を0.2mlの10%牛胎仔血清
加RPMI1640培地[炭酸水素ナト リウム2m
M、ペニシリン(50単位/ml)およびストレプトマ
イシン(50μg/ml)を添加]に加えたマイクロタ
イタープレート中でMLR試験を行う。湿度100%、
二酸化炭素5%、空気95%に保った培養器内で、37
℃で、68時間、細胞を培養し、4時間 3H−チミジン
(0.5μCi)でパルスして、細胞を集める。この発
明の目的化合物をエタノールに溶解し、RPMI164
0培地に希釈し、培養物に添加し最終濃度を0.1μg
/ml以下になるようにする。結果を表18〜21に示
す。この発明のトリシクロ化合物は、マウスMLRを抑
制した。 【0037】表18:FR−900506物質のMLR
に対する効果 【表18】 【0038】表19:FR−900520物質のMLR
に対する効果 【表19】【0039】表20:FR−900523物質のMLR
に対する効果 【表20】 【0040】表21:FR−900525物質のMLR
に対する効果 【表21】 【0041】試験2 トリシクロ化合物(I)の抗菌活性 各種真菌に対するトリシクロ化合物(I)の抗菌活性
を、サブロー寒天中、寒天倍々希釈法によって測定し
た。30℃で24時間培養した後、最小発育阻止濃度
(MIC)をμg/mlで表わす。この発明のトリシク
ロ化合物は、真菌、例えばアスペルギルス・フミガーツ
スIF05840およびフサリウム・オキシスポルムI
F05942に対して、表22および23に記載するよ
うな抗菌活性を示した。 表22:トリシクロ化合物(I)のアスペルギルス・フ
ミガーツスIF05840に対するMIC値(μg/m
l) 【表22】表23:トリシクロ化合物(I)のフサリウム・オキシ
スペルムに対するMIC値(μg/ml) 【表23】 【0042】試験3 ラットにおける同種皮膚移植片生存に対するトリシクロ
化合物(I)の効果 ドナー(フィッシャー)ラットの腹部皮膚移植片を、レ
シピエント(WKA)ラットの外側胸部に移植する。5
日目に包帯を除去する。移植片上皮の90%以上が壊死
する拒絶反応があるまで、移植片を毎日検査する。FR
−900506物質をオリーブ油に溶解し、移植日より
毎日14日間連続筋肉内投与する。表24に示すよう
に、オリーブ油を14日間連続筋肉内投与したラットに
おいて、皮膚同種移植片は8日以内にすべて拒絶される
が、FR−900506物質で毎日処置したものは、皮
膚同種移植片生存が明らかに延長した。 表24:FR−900506物質の同種皮膚移植片生存
に対する効果 【表24】 【0043】試験4 ラットにおけるII型コラーゲン誘発関節炎に対するト
リシクロ化合物(I)の効果 コラーゲンを2mg/mlの濃度になるよう冷0.01
M酢酸に溶解する。溶液を等容量の不完全フロインドア
ジュバント中で乳化する。総量0.5mlのこの乳化物
を雌性ルイス系ラットの背中の数ケ所と尾の1、2ケ所
に皮内注射する。FR−900506物質をオリーブ油
に溶解し、経口投与する。同量のII型コラーゲンで免
疫した対照ラットには、オリーブ油のみを経口投与す
る。関節炎の発現率を観察する。試験結果を表25に示
す。II型コラーゲン免疫化と同じ日から14日間オリ
ーブ油で処理したラット全てに、関節炎が誘発された。
FR−900506物質を14日間毎日投与すると、3
週間の観察期間中、関節炎の誘発を完全に抑制した。 表25:ラットにおけるコラーゲン誘発関節炎に対する
FR−900506物質の効果 【表25】 【0044】試験5 SJL/J系マウスにおける実験的アレルギー性脳脊髄
炎(EAE)に対するトリシクロ化合物(I)の効果 SJL/J系マウスより脊髄ホモジネートを調整する。
脊髄を通気法で取り出し、約等容量の水と混合し、4℃
でホモジネートする。等容量のこの冷ホモジネート(1
0mg/ml)をマイコバクテリウム・ツベルクローシ
スH37RA0.6mg/mlを含有する完全フロイン
ドアジュバント(CFA)で乳化する。SJL/J系マ
ウスに、脊髄−CFAエマルジョン0.2mlを、0日
目と13日目の二回注入し、EAEを誘発させる。この
試験に使用した全マウスについて、EAEの臨床的徴候
を毎日評価、判定する。EAEの程度は、下記の判定基
準によった。グレード1:尾緊張低下、グレード2:ぎ
こちない歩行、グレード3:1本以上の四肢の脱力、グ
レード4:対麻痺または片麻痺。FR−900506物
質をオリーブ油に溶解し、0日目(初回免疫の日)より
19日間経口投与する。表26に示すように、FR−9
00506物質は、EAEの徴候の出現を明らかに阻止
した。 表26:SJL/J系マウスにおける実験的アレルギー
性脳脊髄炎に対するFR−900506物質の効果 【表26】 【0045】試験6 マウスにおける局所的移植片対宿主反応(GvHR)に
対するトリシクロ化合物(I)の効果 C57BL/6ドナーより得た生脾細胞(1×10
7 個)を、BDF1 系マウスの右後肢足蹠に皮下注射す
る。7日後にマウスを屠殺し、右(注射した足)および
左(注射していない足)両方の膝窩リンパ節(PLN)
の重量を測る。GvHRを左右PLNの重量差で表わ
す。FR−900506物質をオリーブ油に溶解し、感
作日より5日間経口投与する。FR−900506物質
の局所的移植片対宿主反応抑制のED50値は、19mg
/kgである。 【0046】試験7 トリシクロ化合物(I)の急性毒性 ddyマウスにおける腹腔内投与によるFR−9005
06、FR−900520、FR−900523、FR
−900525物質の急性毒性に関する試験を行い、い
ずれの場合にも投与量100mg/kgで死亡は観察さ
れなかった。この発明の医薬組成物は、外用、内服また
は非経口投与に適した有機または無機の担体もしくは賦
形剤と混合して、この発明のトリシクロ化合物(I)を
有効成分として含有する、例えば固体状、半固体状もし
くは液状の医薬製剤の形で使用することができる。有効
成分は、錠剤、ペレット剤、カプセル剤、坐剤、液剤、
エマルジョン、懸濁液およびその他の適切な形で使用で
き、例えば、通常の無毒で、医薬として許容される担体
と混合してもよい。使用し得る担体は、水、グルコー
ス、ラクトース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトー
ル、でん粉ペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、
コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、バレイシ
ョでん粉、尿素、および他の固体状、半固体状または液
状の製剤を製造するのに適した担体であり、さらに、賦
形剤、安定化剤、粘稠化剤、着色剤、香料を使用しても
よい。目的化合物は、疾患の経過または状態により、所
望の効果を発揮するのに十分な量が医薬製剤中に含有さ
れる。この医薬組成物をヒトに用いる場合は、非経口投
与あるいは内服で使用することが好ましい。トリシクロ
化合物(I)の治療有効量は、治療する患者個々の年齢
および疾病の程度により変化するが、通常、有効成分1日
約0.01〜1000mg、好ましくは0.1〜500
mg、さらに好ましくは0.5〜100mgが疾患の治
療に用いられ、一般に1回平均約0.5mg、1mg、
5mg、10mg、50mg、100mg、250m
g、500mgが投与される。以下、実施例に従って、
この発明を説明する。 【0047】実施例1 ストレプトミセス・ツクバエンシスNo.9993の分
離 以下に示す平板希釈法を用いてストレプトミセス・ツク
バエンシスNo.9993を分離した。茨城県筑波郡豊
里町で採取した約1グラムの土壌を無菌試験管に入れ、
滅菌水を加え、容量5mlとする。混合物をチューブブ
ザーで10秒間混合し、10分間放置する。上澄液を滅
菌水で順次100倍希釈する。希釈液(0.1ml)を
塩酸チアミン添加スザペック寒天(サッカロース30
g、硝酸ナトリウム3g、リン酸二カリウム1g、硫酸
マグネシウム0.5g、塩化カリウム0.5g、硫酸第
1鉄0.01g、塩酸チアミン0.1g、寒天20g、
水道水1000ml;pH7.2)を含有するペトリ皿
上に広げる。30℃で21日間インキュベートし、プレ
ート上に生育させたコロニーを斜面培地[酵母−麦芽エ
キス寒天(ISP培地2)]に移し、30℃で10日間
培養する。分離したコロニーの中にストレプトミセス・
ツクバエンシスNo.9993を見い出した。 醗酵 グリセリン(1%)、可溶性でん粉(1%)、グルコー
ス(0.5%)、綿実粉(0.5%)、乾燥酵母(0.
5%)、コーンスチープリカー(0.5%)、炭酸カル
シウム(0.2%)を含有する培地(160ml)(p
H6.5に調整)を、各々500mlのエルレンマイヤ
ーフラスコ20個に入れ、120℃で30分間滅菌す
る。ストレプトミセス・ツクバエンシスNo.9993
(寄託番号:微工研条寄第927号)の斜面培養物の1
白金耳を各培地に接種し、回転振盪機上、30℃で4日
間培養する。得られる培養物を、あらかじめ120℃で
20分間滅菌した200リットルのジャーファーメンタ
ーに入れた可溶性でん粉(4.5%)、コーンスチープ
リカー(1%)、乾燥酵母(1%)、炭酸カルシウム
(0.1%)、アデカノール(消泡剤、商品名、旭電化
製)(0.1%)を含有する培地(150リットル)
に接種し、30℃で、通気(150リットル/分) 、
撹拌 (250rpm)下に4日間培養する。 単離および精製 このようにして得られる培養ブロスをケイソウ土(5k
g)を用いて濾過する。菌糸体の塊をメタノール(50
リットル)で抽出し、抽出液50リットルを得る。菌糸
体より得られるメタノール抽出液と濾液とを合わせ、非
イオン性吸着樹脂「ダイアイオンHP−20」(商品
名、三菱化成社製)(10リットル)のカラムに通す。
水(30リットル)および水性メタノール(30リット
ル)で洗浄した後、メタノールで溶出する。溶出液を減
圧下に蒸発させ、残量を2リットルとする。これを酢酸
エチル(2リットル)で抽出する。酢酸エチル抽出液を
減圧濃縮し、油性残留物を得る。油性残留物を二倍重量
の酸性シリカゲル(特殊シリカゲル、グレード:12、
富士デビソン製)と混合し、この混合物を酢酸エチル中
でスラリー化する。溶媒を留去後、得られる乾燥粉末
を、n−ヘキサンで上記と同じ酸性シリカゲル(800
ml)を充填したカラムを用いるクロマトグラフィに付
す。カラムをn−ヘキサン(3リットル)、n−ヘキサ
ンと酢酸エチルの混合物(9:1v/v、3リットル;
4:1v/v、3リットル)および酢酸エチル(3リッ
トル)で展開する。目的化合物を含む画分を集め、減圧
濃縮して、油性残留物を得る。油性残留物をn−ヘキサ
ンと酢酸エチルとの混合物(1:1v/v、30ml)
に溶解し、同じ溶媒系でシリカゲル(230〜400メッ
シュ、メルク社製)(500ml)を充填したカラムを用
いるクロマトグラフィに付す。n−ヘキサンと酢酸エチ
ルとの混合物(1:1v/v、2リットル;1:2v/
v、1.5リットル)で溶出する。最初の目的化合物を
含む画分を集め、減圧濃縮し、黄色の油状物を得る。こ
の油性残留物を二倍重量の酸性シリカゲルと混合し、こ
の混合物を酢酸エチル中でスラリー化する。溶媒を留去
後、得られる乾燥粉末をn−ヘキサンで酸性シリカゲル
を充填したカラムにかけ、n−ヘキサンで展開する。目
的化合物を含む画分を集め、減圧濃縮し、粗FR−90
0506物質(1054mg)を白色の粉末として得
る。この粗生成物100mgを高速液体クロマトグラフ
ィに付す。リクロソルブ(Lichrosorb)SI
60(商品名、メルク社製)を担体とするカラム(8
φ×500mm)を用いて溶出する。このクロマトグラ
フィは、UV検出器で波長230nmにてモニターし、
移動相は塩化メチレン−ジオキサン混液(85:15v
/v)を流速5ml/分で用い、活性画分を集め、蒸発
濃縮する。この高速液体クロマトグラフィを繰り返し
て、精製FR−900506物質14mgを白色の粉末
として得る。さらに、酢酸エチル(1.5リットル)で
溶出を続けて行い、第二の目的化合物を含む画分を集
め、減圧濃縮して、粗FR−900525物質(30m
g)を黄色の油状物として得る。 【0048】実施例2 醗酵 グリセリン(1%)、コーンスターチ(1%)、グルコ
ース(0.5%)、綿実粉(1%)、コーンスチープリ
カー(0.5%)、乾燥酵母(0.5%)、炭酸カルシ
ウム(0.2%)を含有するpH6.5の前培養培地
(100ml)を500mlのエルレンマイヤーフラス
コに入れ、120℃で30分間滅菌する。ストレプトミ
セス・ツクバエンシスNo.9993の斜面培養物の1
白金耳を培地に接種し、30℃で4日間培養する。得ら
れる培養物を、あらかじめ120℃で30分間滅菌した
30リットルのジャーファーメンター中の前培養培地
(20リットル)に移す。培養物を30℃で2日間イン
キュベートして、前培養物16リットルを、あらかじめ
120℃で30分間滅菌した2トンタンクに入れた可溶
性でん粉(4.5%)、コーンスチープリカー(1
%)、乾燥酵母(1%)、炭酸カルシウム(0.1
%)、アデカノール(消泡剤、商品名、旭電化製)
(0.1%)を含有するpH6.8の醗酵培地(160
0リットル)に接種し、30℃で4日間培養する。 単離および精製 このようにして得られる培養ブロスを、ケイソウ土(2
5kg)を用いて濾過する。菌糸体の塊をアセトン(5
00リットル)で抽出し、抽出液500リットルを得
る。このアセトン抽出液と濾液(1350リットル)と
を合わせ、非イオン性吸着樹脂「ダイアイオンHP−2
0」(商品名、三菱化成社製)(100リットル)のカ
ラムに通す。水(300リットル)および50%水性ア
セトン(300リットル)で洗浄した後、75%水性ア
セトンで溶出する。溶出液を減圧下に蒸発させ、残量を
300リットルとする。これを酢酸エチル(20リット
ル)で3回抽出する。酢酸エチル抽出液を減圧濃縮し、
油性残留物を得る。この油性残留物を二倍重量の酸性シ
リカゲル(特殊シリカゲル、グレード12、富士デビソ
ン製)と混合し、この混合物を酢酸エチル中でスラリー
化する。溶媒を蒸発させ、得られる乾燥粉末を、n−ヘ
キサンで上記と同じ酸性シリカゲル(8リットル)を充
填したカラムクロマトグラフィに付す。カラムをn−ヘ
キサン(30リットル)、n−ヘキサン−酢酸エチル混
液(4:1v/v、30リットル)、酢酸エチル(30
リットル)で展開する。目的化合物を含む画分を集め、
減圧濃縮して油性残留物を得る。この油性残留物を二倍
重量の酸性シリカゲルと混合し、混合物を酢酸エチル中
でスラリー化する。溶媒の留去後、得られる粉末を、n
−ヘキサンで充填した酸性シリカゲル(3.5リット
ル)のカラムを用いるクロマトグラフィに再度付す。カ
ラムをn−ヘキサン(10リットル)、n−ヘキサン−
酢酸エチル混液(4:1v/v、10リットル)、酢酸
エチル(10リットル)で展開する。目的化合物を含む
画分を集め、減圧濃縮して、黄色の油状物を得る。この
油性残留物をn−ヘキサン−酢酸エチル混液(1:1v
/v、300ml)に溶解し、同じ溶媒系で充填したシ
リカゲル(230〜400メッシュ、メルク社製)(2
リットル)のカラムを用いるクロマトグラフィに付す。
n−ヘキサン−酢酸エチル混液 (1:1v/v、10
リットル;1:2v/v、6リットル)および酢酸エチ
ル(6リットル)で溶出する。最初の目的化合物を含む
画分を集め、減圧濃縮して、FR−900506物質を
白色粉末(34g)として得る。この白色粉末をアセト
ニトリルに溶解し、減圧濃縮する。濃縮液を5℃で一夜
放置してプリズム状結晶(22.7g)を得る。同じ溶
媒で再結晶して精製FR−900506物質(13.6
g)を無色プリズム状結晶として得る。さらに、第二の
目的化合物を含む画分を集め、減圧濃縮して、粗FR−
900525物質(314mg)を黄色の粉末として得
る。 【0049】実施例3 醗酵 グリセリン(1%)、コーンスターチ(1%)、グルコ
ース(0.5%)、綿実粉(1%)、乾燥酵母(0.5
%)、コーンスチープリカー(0.5%)、炭酸カルシ
ウム(0.2%)を含有する培地(160ml)(pH
6.5に調整)を各々500mlのエルレンマイヤーフ
ラスコ10個に入れ、120℃で30分間滅菌する。ス
トレプトミセス・ツクバエンシスNo.9993の斜面
培養物の1白金耳を各培地に接種し、回転振盪機上、3
0℃で4日間培養する。得られる培養物を、あらかじめ
120℃で20分間滅菌した200リットルのジャーフ
ァーメンターに入れた可溶性でん粉(5%)、ピーナツ
粉(0.5%)、乾燥酵母(0.5%)、グルテンミー
ル(0.5%)、炭酸カルシウム(0.1%)、アデカ
ノール(消泡剤、商品名、旭電化製)(0.1%)を含
有する培地(150リットル)に接種し、30℃で、通
気(150リットル/分)、撹拌(250rpm)下に
4日間培養する。 単離および精製 このようにして得られる培養ブロスをケイソウ土(5k
g)を用いて濾過する。菌糸体の塊をアセトン(50リ
ットル)で抽出し、抽出液50リットルを得る。菌糸体
より得られるアセトン抽出液と濾液(135リットル)
とを合わせ、非イオン性吸着樹脂「ダイアイオンHP−
20」(商品名、三菱化成社製)(10リットル)にカ
ラムを通す。水(30リットル)および50%水性アセ
トン(30リットル)で洗浄し、75%水性アセトンで
溶出する。溶出液(30リットル)を減圧下に蒸発濃縮
し、残量を2リットルし、酢酸エチル(2リットル)で
3回抽出する。酢酸エチル抽出液を減圧濃縮し、油性残
留物を得る。この油性残留物を二倍重量の酸性シリカゲ
ル(特殊シリカゲル、グレード12、富士デビソン製)
と混合し、混合物を酢酸エチル中でスラリー化する。溶
媒を留去し、得られる乾燥粉末を、n−ヘキサンで上記
と同じ酸性シリカゲル(800ml)を充填したカラム
を用いるクロマトグラフィに付す。カラムをn−ヘキサ
ン(3リットル)、n−ヘキサン−酢酸エチル混液
(4:1v/v、3リットル)、酢酸エチル(3リット
ル)で展開する。目的化合物を含む画分を集め、減圧濃
縮して、油性残留物を得る。この油性残留物をn−ヘキ
サン−酢酸エチル混液(1:1v/v、30ml)に溶
解し、同じ溶媒系で充填したシリカゲル(230〜40
0メッシュ、メルク社製)(500ml)のカラムを用
いるクロマトグラフィに付す。n−ヘキサン−酢酸エチ
ル混液(1:1v/v、2リットル;1:2v/v、
1.5リットル)および酢酸エチル(1.5リットル)
で溶出する。最初の目的化合物を含む画分を集め、減圧
濃縮して、粗FR−900506物質(3g)を黄色の
粉末として得る。さらに、第二の目的化合物を含む画分
を集め、減圧濃縮して、油性残留物を得る。この油性残
留物をシリカゲルクロマトグラフィに再度付し、黄色の
油状物を得る。この油性残留物を二倍重量の酸性シリカ
ゲルと混合し、混合物を酢酸エチル中でスラリー化す
る。溶媒を留去して、得られる乾燥粉末を、n−ヘキサ
ンで酸性シリカゲル(100ml)を充填したカラムを
用いるクロマトグラフィに付し、n−ヘキサンで展開す
る。目的化合物を含む画分を集め、減圧濃縮して、FR
−900525物質を淡黄色の粉末(380mg)とし
て得る。この粉末をn−ヘキサン−酢酸エチル混液
(1:2v/v、5ml)に溶解し、同じ溶媒系で充填
し洗浄した酸性シリカゲル(特殊シリカゲル、グレード
922、富士デビソン製)(100ml)のカラムを用
いるクロマトグラフィに付す。酢酸エチルで溶出する。
活性画分を集め、減圧下に蒸発させて、精製したFR−
900525物質(230mg)を白色粉末として得
る。 【0050】実施例4 ストレプトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ・ヤ
クシマエンシスNo.7238の分離 以下に示す平板希釈法によって、ストレプトミセス・ハ
イグロスコピカス・サブスプ・ヤクシマエンシスNo.
7238を分離する。鹿児島県屋久島で採取した土壌約
1グラムを無菌試験管に入れ、滅菌水を加えて容量を5
mlとする。混合物をチューブブザーで10秒間混合
し、10分間放置する。上澄液を滅菌水で順次100倍
希釈する。希釈液(0.1ml)を塩酸チアミン添加ス
ザペック寒天(サッカロース30g、硝酸ナトリウム3
g、リン酸二カリウム1g、硫酸マグネシウム0.5
g、塩化カリウム0.5g、硫酸第一鉄0.01g、塩
酸チアミン0.1g、寒天20g、水道水1000m
l;pH7.2)を含有するペトリ皿上に広げる。30
℃で21日間インキュベートし、プレート上に生育させ
たコロニーを斜面培地[酵母−麦芽エキス寒天(ISP
−培地2)]に移し、30℃で10日間培養する。分離
したコロニーの中に、ストレプトミセス・ハイグロスコ
ピカス・サブスプ・ヤクシマエンシスNo.7238を
見い出した。 醗酵 グリセリン(1%)、可溶性でん粉(1%)、グルコー
ス(0.5%)、綿実粉(0.5%)、乾燥酵母(0.
5%)、コーンスチープリカー(0.5%)、炭酸カル
シウム(0.2%)を含有する培地(160ml)(p
H6.5に調整)を、各々500mlのエルレンマイヤ
ーフラスコ20個に入れ、120℃で30分間滅菌す
る。ストレプトミセス・ハイグロスコピカス・サブスプ
・ヤクシマエンシスNo.7238(寄託番号:微工研
条寄第928号)の斜面培養物の1白金耳を各培地に接
種し、回転振盪機上、30℃で4日間培養する。得られ
る培養物を、グルコース(4.5%)、コーンスチープ
リカー(1%)、乾燥酵母(1%)、グルテンミール
(1%)、麦芽(0.5%)、炭酸カルシウム(0.1
%)、アデカノール(消泡剤、商品名、旭電化製)
(0.1%)を含有する、あらかじめ120℃で20分
間滅菌した200リットルのジャーファーメンター中の
培地(150リットル)に接種し、30℃、通気(15
0リットル/分)、撹拌(250rpm)下に4日間培
養する。 単離および精製 このようにして得られる培養ブロスを、ケイソウ土(5
kg)を用いて濾過する。菌糸体の塊をアセトン(50
リットル)で抽出し、抽出液50リットルを得る。菌糸
体より得られるアセトン抽出液と濾液(135リット
ル)とを合わせ、非イオン性吸着樹脂「ダイアイオンH
P−20」(商品名、三菱化成社製)(10リットル)
のカラムに通す。水(30リットル)および水性アセト
ン(30リットル)で洗浄した後、アセトンで溶出す
る。溶出液を減圧下に蒸発濃縮し残量を2リットルと
し、これを酢酸エチル(4リットル)で抽出する。酢酸
エチル抽出液を減圧濃縮し、油性残留物を得る。この油
性残留物を二倍重量の酸性シリカゲル(特殊シリカゲル
グレード12、富士デビソン製)と混合し、この混合物
を酢酸エチル中でスラリー化する。溶媒を留去した後、
得られる乾燥粉末をn−ヘキサンで充填した同じ酸性シ
リカゲル(800ml)のカラムを用いるクロマトグラ
フィに付す。カラムをn−ヘキサン(3リットル)、n
−ヘキサン−酢酸エチル混液(4:1v/v、3リット
ル)、酢酸エチル(3リットル)で展開する。FR−9
00520およびFR−900523物質を含む画分を
集め、減圧濃縮して油性残留物を得る。この油性残留物
をn−ヘキサン−酢酸エチル混液(1:1v/v、50
ml)に溶解し、同じ溶媒系で充填したシリカゲル(7
0〜230メッシュ、メルク社製)(1000ml)の
カラムを用いるクロマトグラフィに付す。n−ヘキサン
−酢酸エチル混液(1:1v/v、3リットル;1:2
v/v、3リットル)および酢酸エチル(3リットル)
で溶出する。目的化合物を含む画分を集め、減圧濃縮し
て、黄色の粉末(4.5g)を得る。この粉末をメタノ
ール(20ml)に溶解し、水(10ml)と混合す
る。混合物をメタノール−水混液(4:1v/v)で充
填し、これで展開する逆相シリカゲル「YMC」(60
〜200メッシュ)(500ml)(商品名、山村化学
研究所製)のカラムを用いるクロマトグラフィに付す。
FR−900520物質を含む画分を集め、減圧濃縮し
て、FR−900520物質の粗生成物(1.8g)を
淡黄色の粉末として得る。この粉末を少量のジエチルエ
ーテルに溶解する。一夜放置した後、沈澱する結晶を濾
取し、ジエチルエーテルで洗浄し、減圧乾燥する。ジエ
チルエーテルで再結晶して、精製FR−900520物
質600mgを無色の板状晶として得る。同じ溶媒系を
用いる逆相シリカゲルクロマトグラフィを続けて行い、
FR−900523物質を含む次の画分を集め、減圧濃
縮して、FR−900523物質の粗生成物(0.51
g)を淡黄色の粉末として得る。この粗生成物をアセト
ニトリル(3ml)に溶解し、アセトニトリル−テトラ
ヒドロフラン−50mMリン酸緩衝液混液(pH2.
0)(3:2:5v/v)で充填し、これで展開する逆
相シリカゲル「YMC」(70ml)を用いるクロマト
グラフィに付す。目的化合物を含む画分を酢酸エチルで
抽出する。この抽出液を減圧濃縮して、黄白色の粉末
(190mg)を得る。この黄白色の粉末を逆相シリカ
ゲル「YMC」上で再びクロマトグラフィに付し、白色
粉末(80mg)を得る。この白色粉末を少量のジエチ
ルエーテルに溶解し、室温で一夜放置して結晶56mg
を得る。ジエチルエーテルで再結晶して、FR−900
523物質の無色の針状晶34mgを得る。 【0051】実施例5 FR−900506物質(10.4mg)のジクロロメ
タン(0.2ml)中溶液にピリジン(0.1ml)お
よび無水酢酸(0.05ml)を室温で加え、混合物を
5時間撹拌する。溶媒を減圧下に除去する。残留物をシ
リカゲル薄層クロマトグラフィ(展開溶媒:ジエチルエ
ーテル−ジクロロメタン、1:2v/v)に付して、1
2−[2−(4−アセトキシ−3−メトキシシクロヘキ
シル)−1−メチルビニル]−17−アリル−1,14
−ジヒドロキシ−23,25−ジメトキシ−13,1
9,21,27−テトラメチル−11,28−ジオキサ
−4−アザトリシクロ[22.3.1.04,9]オクタ
コス−18−エン−2,3,10,16−テトラオン
(6.0mg)を得る。 IRν(CHCl3) : 3520, 1728, 1705 (sh), 1640, 1095 cm
-1 【0052】実施例6 FR−900506物質(52.5mg)のジクロロメ
タン(1ml)中溶液に、ピリジン(0.5ml)およ
び無水酢酸(0.3ml)を室温で加え、混合物を室温
で9時間撹拌する。溶媒を減圧下に除去する。残渣をシ
リカゲル薄層クロマトグラフィ(展開溶媒:ジエチルエ
ーテル−ヘキサン、3:1v/v)に付して、14−ア
セトキシ−12−[2−(4−アセトキシ−3−メトキ
シシクロヘキシル)−1−メチルビニル]−17−アリ
ル−1−ヒドロキシ−23,25−ジメトキシ−13,
19,21,27−テトラメチル−11,28−ジオキ
サ−4−アザトリシクロ[22.3.1.04,9]オク
タコス−18−エン−2,3,10,16−テトラオン
(48.0mg)および12−[2−(4−アセトキシ
−3−メトキシシクロヘキシル)−1−メチルビニル]
−17−アリル−1−ヒドロキシ−23,25−ジメト
キシ−13,19,21,27−テトラメチル−11,
28−ジオキサ−4−アザトリシクロ[22.3.1.
04,9]オクタコサ−14,18−ジエン−2,3,1
0,16−テトラオン(5.4mg)を得る。 前記化合物 IRν(CHCl3) : 1730, 1720 (sh), 1640 cm-1 後記化合物 IRν(CHCl3) : 1730, 1690, 1640, 1627 cm-1 【0053】実施例7 FR−900506物質(9.7mg)のジクロロメタ
ン(0.2ml)およびピリジン(0.1ml)中溶液
に、塩化ベンゾイル(50μl)を室温で加え、混合物
を室温で2時間撹拌する。溶媒を減圧下に除去し、粗油
状物を得る。この油状物をシリカゲル薄層クロマトグラ
フィ(展開溶媒:ジエチルエーテル−ヘキサン、2:1
v/v)で精製して、17−アリル−12−[2−(4
−ベンゾイルオキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−
1−メチルビニル]−1,14−ジヒドロキシ−23,
25−ジメトキシ−13,19,21,27−テトラメ
チル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシクロ[2
2.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−2,
3,10,16−テトラオン(8.0mg)を得る。 IR ν(CHCl3) : 3500, 1735 (sh), 1710, 1640, 1600 c
m-1 実施例8 FR−900506物質(30.5mg)のピリジン
(1ml)中溶液に、塩化p−ニトロベンゾイル(約1
00mg)を加え、混合物を室温で2時間撹拌する。反
応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウ
ム水溶液、水、1N塩酸、水、飽和炭酸水素ナトリウム
水溶液、水、塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、乾燥
する。得られる溶液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィで精製して、17−アリル−1,
14−ジヒドロキシ−23,25−ジメトキシ−13,
19,21,27−テトラメチル−12−[2−[4−
(p−ニトロベンゾイルオキシ)−3−メトキシシクロ
ヘキシル]−1−メチルビニル]−11,28−ジオキ
サ−4−アザトリシクロ[22.3.1.04,9]オク
タコス−18−エン−2,3,10,16−テトラオン
(37.7mg)を得る。 IR ν(CHCl3) : 1720, 1640, 1610, 1530-1520 cm-1 【0054】実施例9 実施例8の方法に準じて、FR−900506物質(3
0.6mg)と塩化3,5−ジニトロベンゾイル(33
mg)とをピリジン(0.5ml)中で反応させること
によって、17−アリル−1,14−ジヒドロキシ−2
3,25−ジメトキシ−13,19,21,27−テト
ラメチル−12−[2−[4−(3,5−ジニトロベン
ゾイルオキシ)−3−メトキシシクロヘキシル]−1−
メチルビニル]−11,28−ジオキサ−4−アザトリ
シクロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18−エ
ン−2,3,10,16−テトラオン(36.0mg)
を得る。 IR ν(CHCl3) : 1730, 1640, 1610, 1530-1520 cm-1 【0055】実施例10 実施例8の方法に準じて、ピリジン(0.5ml)中で
FR−900506物質(48mg)を塩化2−l−メ
ンチルオキシアセチル(0.08ml)と反応させるこ
とによって、17−アリル−1,14−ジヒドロキシ−
23,25−ジメトキシ−12−[2−[4−(2−l
−メンチルオキシアセトキシ)−3−メトキシシクロヘ
キシル]−1−メチルビニル]−13,19,21,2
7−テトラメチル−11,28−ジオキサ−4−アザト
リシクロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18−
エン−2,3,10,16−テトラオン(50.9m
g)を得る。 IR ν(ニート) : 3520, 1760, 1740 (sh), 1720 (sh),
1652 cm-1 【0056】実施例11 (−)−2−トリフルオロメチル−2−メトキシ−2−
フェニル酢酸(51mg)の酢酸エチル(10ml)中
溶液に、室温で、N,N′−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド(47mg)を加える。室温で1.5時間撹拌し
た後、FR−900506物質(25.0mg)および
4−(N,N−ジメチルアミノ)ピリジン(11mg)
を加え、室温で3.5時間撹拌する。得られる溶液を濃
縮して残渣を得、これをジエチルエーテルに取り、次い
で、塩酸、炭酸水素ナトリウム水溶液、塩化ナトリウム
水溶液で順次洗浄する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥
し、濃縮して残渣を得、これをシリカゲルクロマトグラ
フィ(展開溶媒:ジクロロメタン−ジエチルエーテル、
10:1v/v)に付して、17−アリル−12−[2
−[4−[(−)−2−トリフルオロメチル−2−メト
キシ−2−フェニルアセトキシ]−3−メトキシシクロ
ヘキシル]−1−メチルビニル]−1,14−ジヒドロ
キシ−23,25−ジメトキシ−13,19,21,2
7−テトラメチル−11,28−ジオキサ−4−アザト
リシクロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18−
エン−2,3,10,16−テトラオン(6.5mg)
および17−アリル−14−[(−)−2−トリフルオ
ロメチル−2−メトキシ−2−フェニルアセトキシ]−
12−[2−[4−[(−)−2−トリフルオロメチル
−2−メトキシ−2−フェニルアセトキシ]−3−メト
キシシクロヘキシル]−1−メチルビニル]−1−ヒド
ロキシ−23,25−ジメトキシ−13,19,21,
27−テトラメチル−11,28−ジオキサ−4−アザ
トリシクロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18
−エン−2,3,10,16−テトラオン(20.2m
g)を得る。 前記化合物 IR ν(ニート) : 3510, 1750, 1730 (sh), 1710, 1652,
1500 cm-1 後記化合物 IR ν(ニート) : 1750, 1720, 1652, 1500 cm-1 【0057】実施例12 FR−900506物質(248mg)のピリジン(7
ml)中溶液を撹拌しながら、これに無水コハク酸(1
45mg)および4−(N,N−ジメチルアミノ)ピリ
ジン(7mg)を加え、得られる混合物を室温で18時
間撹拌する。反応混合物を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチ
ルを用いるシリカゲル(20g)のクロマトグラフィに
付し、17−アリル−12−[2−[4−(3−カルボ
キシプロピオニルオキシ)−3−メトキシシクロヘキシ
ル]−1−メチルビニル]−1,14−ジヒドロキシ−
23,25−ジメトキシ−13,19,21,27−テ
トラメチル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシク
ロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−
2,3,10,16−テトラオン(90mg)を得る。 IR ν(CHCl3) : 3500, 3100-2300, 1720, 1705 (sh), 1
635 cm-1 【0058】実施例13 FR−900506物質(100.7mg)のピリジン
(3ml)中溶液に、塩化p−ヨードベンゼンスルホニ
ル(500mg)を加え、混合物を室温で36時間撹拌
する。溶液を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリ
ウム水溶液、水、塩化ナトリウム水溶液で洗浄する。有
機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧濃縮す
る。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ(展開溶媒:ジ
エチルエーテル−ヘキサン、3:1v/v)に付し、1
7−アリル−1,14−ジヒドロキシ−12−[2−
[4−(p−ヨードベンゼンスルホニルオキシ)−3−
メトキシシクロヘキシル]−1−メチルビニル]−2
3,25−ジメトキシ−13,19,21,27−テト
ラメチル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシクロ
[22.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−
2,3,10,16−テトラオン(61mg)および1
7−アリル−1−ヒドロキシ−12−[2−[4−(p
−ヨードベンゼンスルホニルオキシ)−3−メトキシシ
クロヘキシル]−1−メチルビニル]−23,25−ジ
メトキシ−13,19,21,27−テトラメチル−1
1,28−ジオキサ−4−アザトリシクロ[22.3.
1.04,9]オクタコサ−14,18−ジエン−2,
3,10,16−テトラオン(12mg)を得る。 前記化合物 IR ν(CHCl3) : 3470, 1730, 1717, 1692, 1635, 1568
cm-1 後記化合物1 H NMR δ ppm(CDCl3) : {6.15 (d,J=15Hz), 6.25 (d,J
=15Hz)}(1H),{6.70 (dd,J=15Hz,10Hz), 6.80 (dd,J=15H
z,10Hz)}(1H),7.60 (2H,m), 7.90 (2H,m) 【0059】実施例14 実施例13の方法に準じて、ピリジン(0.6ml)中
でFR−900506物質(27mg)を塩化d−カン
ファ−スルホニル(97mg)と反応させることによっ
て、17−アリル−12−[2−(4−d−カンファ−
スルホニルオキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1
−メチルビニル]−1,14−ジヒドロキシ−23,2
5−ジメトキシ−13,19,21,27−テトラメチ
ル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシクロ[2
2.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−2,
3,10,16−テトラオン(34mg)を得る。 IR ν(ニート) : 3500, 1747, 1720 (sh), 1710 (sh),
1655 cm-1 【0060】実施例15 FR−900506物質(89.7mg)のジクロロメ
タン(3ml)中溶液を撹拌しながら、これにイミダゾ
ール(118mg)および塩化t−ブチル−ジフェニル
シリル(52.2mg)を加える。混合物を室温で2時
間撹拌し、飽和塩化アンモニウム水溶液で希釈し、ジエ
チルエーテルで3回抽出する。抽出液を水および塩化ナ
トリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減
圧乾燥する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ
(展開溶媒:酢酸エチル−ヘキサン、1:3v/v)で
精製し、17−アリル−12−[2−(4−t−ブチル
−ジフェニルシリルオキシ−3−メトキシシクロヘキシ
ル)−1−メチルビニル]−1,14−ジヒドロキシ−
23,25−ジメトキシ−13,19,21,27−テ
トラメチル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシク
ロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−
2,3,10,16−テトラオン(107mg)を得
る。 IR ν(ニート) : 3520, 1742, 1705, 1650 cm-1 【0061】実施例16 実施例15の方法に準じて、イミダゾール(15mg)
の存在下に、N,N−ジメチルホルムアミド(1ml)
中で、FR−900506物質(80mg)を塩化t−
ブチル−ジメチルシリル(17mg)と反応させること
によって、17−アリル−12−[2−(4−t−ブチ
ル−ジメチルシリルオキシ−3−メトキシシクロヘキシ
ル)−1−メチルビニル]−1,14−ジヒドロキシ−
23,25−ジメトキシ−13,19,21,27−テ
トラメチル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシク
ロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−
2,3,10,16−テトラオン(85mg)を得る。 IR ν(CHCl3) : 1735, 1720 (sh), 1700, 1640 cm-1 【0062】実施例17 FR−900506物質(100mg)のジメチルスル
ホキシド(1.5ml)中溶液に、無水酢酸(1.5m
l)を加え、混合物を室温で14時間撹拌する。反応混
合物を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水
溶液、水、塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄する。有機
層を硫酸ナトリウムで乾燥、濾過し、減圧濃縮する。残
渣をシリカゲルの薄層クロマトグラフィ(展開溶媒:ジ
エチルエーテル)に付し、17−アリル−1,14−ジ
ヒドロキシ−23,25−ジメトキシ−13,19,2
1,27−テトラメチル−12−[2−(4−メチルチ
オメトキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1−メチ
ルビニル]−11,28−ジオキサ−4−アザトリシク
ロ[22.3.1.04,9]オクタコサ−14,18 −
ジエン−2,3,10,16−テトラオン(51m
g)、17−アリル−1−ヒドロキシ−12−[2−
(4−ヒドロキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1
−メチルビニル]−23,25−ジメトキシ−13,1
9,21,27−テトラメチル−11,28−ジオキサ
−4−アザトリシクロ[22.3.1.0 4,9]オクタコ
サ−14,18−ジエン−2,3,10,16−テトラ
オン(18mg)および17−アリル−1,14−ジヒ
ドロキシ−23,25−ジメトキシ−13,19,2
1,27−テトラメチル−12−[2−(4−メチルチ
オメトキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1−メチ
ルビニル]−11,28−ジオキサ−4−アザトリシク
ロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−
2, 3,10,16−テトラオン(10mg)を得
る。 一番目の化合物 IR ν(CHCl3) : 3470, 1730, 1635, 1630 (sh), 1580
(sh) cm-1 二番目の化合物 IR ν(CHCl3) : 1728, 1640, 1090 cm-1 三番目の化合物 IR ν(CHCl3) : 3480, 1735, 1710, 1640 cm-1 【0063】実施例18 17−アリル−12−[2−(4−t−ブチル−ジメチ
ルシリルオキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1−
メチルビニル]−1,14−ジヒドロキシ−23,25
−ジメトキシ−13,19,21,27−テトラメチル
−11,28−ジオキサ−4−アザトリシクロ[22.
3.1.04,9]オクタコス−18−エン−2,3,1
0,16−テトラオン(39.9mg)のピリジン
(1.5ml)中溶液に無水酢酸(0.5ml)を加
え、混合物を室温で6時間撹拌する。溶媒を減圧下に除
去して粗油状物を得、これをシリカゲル薄層クロマトグ
ラフィ(展開溶媒:ジエチルエーテル−ヘキサン、1:
1v/v)に付し、14−アセトキシ−17−アリル−
12−[2−(4−t−ブチル−ジメチルシリルオキシ
−3−メトキシシクロヘキシル)−1−メチルビニル]
−1−ヒドロキシ−23,25−ジメトキシ−13,1
9,21,27−テトラメチル−11,28−ジオキサ
−4−アザトリシクロ[22.3.1.04,9]オクタ
コス−18−エン−2,3,10,16−テトラオン
(26.5mg)を得る。 IR ν(CHCl3) : 1728, 1715 (sh), 1635 cm-1 【0064】実施例19 実施例18の方法に準じて、ピリジン(0.2ml)中
で17−アリル−12−[2−(4−t−ブチル−ジフ
ェニルシリルオキシ−3−メトキシシクロヘキシル)−
1−メチルビニル]−1,14−ジヒドロキシ−23,
25−ジメトキシ−13,19,21,27−テトラメ
チル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシクロ[2
2.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−2,
3,10,16−テトラオン(10.6mg)を無水酢
酸(0.1mg)と反応させることによって、14−ア
セトキシ−17−アリル−12−[2−(4−t−ブチ
ル−ジフェニルシリルオキシ−3−メトキシシクロヘキ
シル)−1−メチルビニル]−1−ヒドロキシ−23,
25−ジメトキシ−13,19,21,27−テトラメ
チル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシクロ[2
2.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−2,
3,10,16−テトラオン(10mg)を得る。 IR ν(CHCl3) : 3500, 1730, 1720 (sh), 1660 (sh), 1
640, 1620 (sh),1100 cm-1 【0065】実施例20 14−アセトキシ−17−アリル−12−[2−(4−
t−ブチル−ジフェニルシリルオキシ−3−メトキシシ
クロヘキシル)−1−メチルビニル]−1−ヒドロキシ
−23,25−ジメトキシ−13,19,21,27−
テトラメチル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシ
クロ[22.3.1.04,9]オクタコス−18−エン
−2,3,10,16−テトラオン(43.8mg)の
テトラヒドロフラン(1.5ml)中溶液に、炭酸カリ
ウム(約100mg)を室温で加え、混合物を同温で3
時間撹拌する。反応混合物をジエチルエーテルで希釈
し、得られる溶液を飽和塩化アンモニウム水溶液、水、
塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで
乾燥する。得られる溶液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲ
ル薄層クロマトグラフィ(展開溶媒:ジエチルエーテル
−ヘキサン、3:2v/v)で精製して、17−アリル
−12−[2−(4−t−ブチル−ジフェニルシリルオ
キシ−3−メトキシシクロヘキシル)−1−メチルビニ
ル]−1−ヒドロキシ−23,25−ジメトキシ−1
3,19,21,27−テトラメチル−11,28−ジ
オキサ−4−アザトリシクロ[22.3.1.04,9]
オクタコサ−14,18−ジエン−2,3,10,16
−テトラオン(30mg)を得る。 IR ν(CHCl3) : 1733, 1720 (sh), 1685, 1640 (sh), 1
620 cm-1 【0066】実施例21 FR−900506物質(50mg)の酢酸エチル(2
ml)中溶液を、10%パラジウム−炭素(10mg)
を用いて、大気圧下、室温で、20分間接触還元する。
反応混合物を濾過し、濾液を蒸発乾固し、薄層クロマト
グラフィで精製する。クロロホルム−アセトン混液
(5:1v/v)で展開して、1,14−ジヒドロキシ
−12−[2−(4−ヒドロキシ−3−メトキシシクロ
ヘキシル)−1−メチルビニル]−23,25−ジメト
キシ−13,19,21,27−テトラメチル−17−
プロピル−11,28−ジオキサ−4−アザトリシクロ
[22.3.1.04,9]オクタコス−18−エン−
2,3,10,16−テトラオン(50.0mg)を得
る。 IR ν(CHCl3) : 3480, 1735 (sh), 1717, 1700, 1650
(sh), 1625 cm-1 【0067】実施例22 実施例1と同様の醗酵法により得られたFR−9005
06物質の粗白色粉末(1g)をアセトニトリル(5m
l)に溶かし、島津LC4A(商標、島津製作所社製)
の高速液体クロマトグラフィーに付す。YMC−S34
3(ODS)(商標、島久薬品株式会社製)を充填した
スチールカラム(内径25mm、長さ250mm)を用
い、12ml/分の流速で溶出する。移動相は28%ア
セトニトリル水溶液、10%n−ブタノール、0.07
5%燐酸、3.75mMドデシル硫酸ナトリウム(SD
S)の混液を用い、UVで210nmにて検出する。1
回につき100μlのサンプルを注入し、この高速液体
クロマトグラフィーを50回繰り返し、すべての量のサ
ンプルをクロマトグラフィーに付す。85分〜90分の
保持時間で溶出される画分を集め、等容量の酢酸エチル
(3.6l)で抽出する。酢酸エチル層を分取し、1%
炭酸水素ナトリウム(2l)で洗浄した後減圧で少量ま
で濃縮する。析出するSDSを濾去し、得られる粗粉末
を100mg/mlの濃度になるようにアセトニトリル
に溶かし、さらに高速液体クロマトグラフィーに付す。
移動相として12.5%アセトニトリル水溶液、9.7
5%n−ブタノール、0.075%燐酸、3.75mM
SDS を用いる。カラムは10ml/分の流速で溶
出する。131分〜143分の保持時間で溶出される画
分を集め、等容量の酢酸エチルで抽出する。抽出液を1
%炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、減圧下で少量ま
で濃縮する。濃縮の際析出するSDSを濾去する。得ら
れる粗粉末を少量の酢酸エチルに溶解し、シリカゲル
(Kiesel gel、230−400メッシュ)
(メルク社製)を用いたカラムクロマトグラフィーに付
す。カラムをn−ヘキサンと酢酸エチルの混液(30m
l)(1:1v/v)、次いでn−ヘキサンと酢酸エチ
ルの混液(60ml)(1:2v/v)で洗浄する。さ
らにカラムを酢酸エチルで溶出し、各画分を3mlづつ
集める。18−24の画分を合し、減圧下で濃縮する
と、FR−900520物質(24mg)を得る。
【図面の簡単な説明】
【図1】FR−900506物質の白色粉末の13C核磁
気共鳴スペクトルを表わす。 【図2】FR−900506物質の白色粉末の 1H核磁
気共鳴スペクトルを表わす。 【図3】FR−900506物質の無色のプリズム状結
晶の13C核磁気共鳴スペクトルを表わす。 【図4】FR−900506物質の無色のプリズム状結
晶の 1H核磁気共鳴スペクトルを表わす。 【図5】FR−900525物質の13C核磁気共鳴スペ
クトルを表わす。 【図6】FR−900525物質の 1H核磁気共鳴スペ
クトルを表わす。 【図7】FR−900520物質の13C核磁気共鳴スペ
クトルを表わす。 【図8】FR−900520物質の 1H核磁気共鳴スペ
クトルを表わす。 【図9】FR−900523物質の13C核磁気共鳴スペ
クトルを表わす。 【図10】FR−900523物質の 1H核磁気共鳴ス
ペクトルを表わす。
気共鳴スペクトルを表わす。 【図2】FR−900506物質の白色粉末の 1H核磁
気共鳴スペクトルを表わす。 【図3】FR−900506物質の無色のプリズム状結
晶の13C核磁気共鳴スペクトルを表わす。 【図4】FR−900506物質の無色のプリズム状結
晶の 1H核磁気共鳴スペクトルを表わす。 【図5】FR−900525物質の13C核磁気共鳴スペ
クトルを表わす。 【図6】FR−900525物質の 1H核磁気共鳴スペ
クトルを表わす。 【図7】FR−900520物質の13C核磁気共鳴スペ
クトルを表わす。 【図8】FR−900520物質の 1H核磁気共鳴スペ
クトルを表わす。 【図9】FR−900523物質の13C核磁気共鳴スペ
クトルを表わす。 【図10】FR−900523物質の 1H核磁気共鳴ス
ペクトルを表わす。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
C12N 1/20 C12N 1/20 A
(C12N 1/20
C12R 1:465)
(C12N 1/20
C12R 1:55)
(C12P 17/18
C12R 1:55)
(C12P 17/18
C12R 1:465)
微生物の受託番号 FERM BP−928
(58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名)
C12P 17/18
C12N 1/20
BIOSIS(DIALOG)
CA(STN)
REGISTRY(STN)
WPI(DIALOG)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.FR−900520物質−産生菌であるストレプト
ミセス・ツクバエンシスまたはストレプトミセス・ハイ
グロスコピカス・サブスプ・ヤクシマエンシスを培地に
培養し、得られる培養物からFR−900520物質を
分離採取することを特徴とするFR−900520物質
の製造法。 2.FR−900520物質−産生菌がストレプトミセ
ス・ツクバエンシスNo.9993である請求項1記載
のFR−900520物質の製造法。 3.FR−900520物質−産生菌がストレプトミセ
ス・ハイグロスコピカス・サブスプ・ヤクシマエンシス
No.7238である請求項1記載のFR−90052
0物質の製造法。
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