DE3844904C2

DE3844904C2 - Neue Verwendung von 11,28-Dioxa-4-azatricyclo-[22.3.1.0·4·,·9·]octacos-18-en-Derivaten

Info

Publication number: DE3844904C2
Application number: DE3844904A
Authority: DE
Inventors: Maximilian Dr Grassberger; Josef Gottfried Dr Meingassner; Anton Dr Stuetz; Peter Dr Stuetz
Original assignee: Sandoz AG; Sandoz Patent GmbH
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 1987-11-09
Filing date: 1988-11-09
Publication date: 1997-01-30
Anticipated expiration: 2008-11-10

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Verwendung von Verbindungen der Formel

worin
R₁ für eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe,
R₂ für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe
R₃ für Methyl, Ethyl, Propyl oder Allyl,
n für 1 oder 2 und das Symbol einer Linie und einer gestrichelten Linie für eine Einfach- oder Doppelbindung stehen,
in freier Form oder in Salzform,
zur topischen Behandlung von allergischen Dermatiten aus der Gruppe der atopischen Dermatitis, der Kontakt-Dermatitis und ekzematösen Dermatiten, und der seborrhoeischen Dermatitis.

Die Verbindungen der Formel I, deren Herstellung sowie ihre immunosuppressive und antimikrobielle Wirkung sind z. B. in Fujisawa EP 184 162 beschrieben.

Es wurde nun gefunden, daß die Verbindungen der Formel I weitere interessante pharmakologische Eigenschaften besitzen und daher für eine weitere Verwendung als Heilmittel geeignet sind.

Es ist bekannt und in der Literatur wiederholt berichtet, daß Cyclosporin A (Sandimmun®), ein hochwirksames immosuppressives Mittel, bei topischer Applikation gegen Psoriasis praktisch keine Wirkung zeigt (z. B. Lancet [1987] 806; J. Invest. Dermatol. 90, [1988] 251). Bei Kontaktallergien von Tieren ist Cyclosporin A nur bei Mäusen und Meerschweinchen nach topischer Applikation von mindestens 0,1%igen Bereitungen wirksam, nicht aber am Schwein, bei dem Cyclosporin in Bereitungen bis zu 5% ohne Wirkung ist.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Verbindungen der Formel I ausgezeichnete topische Aktivität besitzen. So üben sie bei Schweinen bei topischer Anwendung eine ausgezeichnete Wirkung gegen eine DNFB-Kontaktallergie aus. In Mäusen mit einer Oxazolon-Allergie ergibt sich im Vergleich mit Cyclosporin A eine mindestens 25fache Überlegenheit. Zusätzlich zeigen die Verbindungen der Formel I bei topischer Applikation auch in Tiermodellen von Dermatitis durch Irritantien einen ent zündungshemmenden Effekt. Dies deutet auf eine allgemeine antiinflammatorische Wirkung bei epikutaner Anwendung hin. In Einklang damit stehen Ergebnisse von in vitro Untersuchungen: Die Hemmung der TPA-induzierten PGE₂-Freisetzung aus Makrophagen, sowie die Hemmung des FMLP- bzw. Calciumionophor A23187-stimulierten "oxidative burst" von humanen neutrophilen polymorphkernigen Leukozyten. Weiters zeigen die Verbindungen der Formel I überraschend auch eine Hemmung der Proliferation von Humankeratinozyten in Zellkulturen.

Die Verbindungen der Formel I in freier Form oder in pharmakologisch verträglicher Salzform sind daher für die Therapie von allergischen Dermatiten bei topischer Applikation geeignet.

Diese Wirkung ist aus folgenden Tests ersichtlich:

1. Prüfung der Wirksamkeit nach topischer Applikation an Modellen der allergisch bedingten Kontaktdermatitis (DTH-Reaktion): 1.1. Oxazolon-Allergie/Maus

Zur Sensibilisierung werden Mäusen 10 µl einer Oxazolonlösung (2%ig) auf die venterale Bauchhaut aufgetragen. 8 Tage danach erfolgt eine Zweitexposition mit 10 µl einer 2%igen Oxazolonlösung, die auf die periphere Innenfläche der rechten Ohrmuschel aufgetragen werden. 20 Minuten und 2 Stunden nach dem Auslösen der Challenge-Reaktion durch die Zweitexposition wird die Testlösung auf die Stelle der Zweitexposition aufgebracht. Die Beurteilung der Entzündungshemmung durch die Testsubstanz erfolgt im Vergleich zu einer unbehandelten Gruppe, die nur mit dem Lösungsmittel der Testsubstanz behandelt wird. 24 Stunden nach der Zweitexposition werden die Tiere getötet und die abgesetzten Ohrmuscheln gewogen. Die Differenz aus beiden Ohrmuschel-Gewichten wird zur Auswertung verwendet, indem die einzelnen Differenzen der Testgruppen und der Lösungsmittel kontrolle statistisch (einfache Varianzanalyse mit nachfolgendem Dunnet-Test bei Normalverteilung, andernfalls mit dem Kruskal-Wallis′ H-Test und Wilcoxon-Mann-Whitney′s U-Test) verglichen werden. Die Wirkung der Testsubstanz wird aufgrund der Mittelwerte in % angegeben.

In der Tabelle 1 sind die Versuchergebnisse in diesem Modell für Verbindungen der Formel I und Cyclosporin A angegeben. Als Lösungsmittel im Test wird Ethanol verwendet.

Tabelle 1

1.2 DNFB-Allergie-Schwein

Die Verwendung von Dinitrofluorbenzol (DNFB) oder Dinitrochlor benzol (DNCB) zur Induktion einer Kontaktallergie ist ein klassisches experimentelles Verfahren, das auch beim Menschen angewendet wird (P.S. Friedmann, C. Moss in Maibach, Lowe, edit., Models in Dermatology, Vol. 2, 275-281, Karger-Basel). Wegen der Ähnlichkeit von Schweine- und Humanhaut wurde ein entsprechendes Modell zur topischen Prüfung von Substanzen auch am Schwein aufgebaut. Am 1. und 3. Versuchstag werden jeweils 100 µl einer 10%igen DNFB-Bereitung auf die Innenfläche des rechten bzw. linken Oberschenkel aufgebracht. Am 14. Versuchstag werden jedem Schwein rechts und links am Rücken kreisförmige Stellen mit einem Durchmesser von 5 cm (8 pro Schwein) markiert und darauf jeweils 150 µl einer 0,5%igen DNFB-Bereitung aufgetragen. Die Prüfung der Testsubstanzen erfolgt entweder in Form galenischer Bereitungen oder als Lösungen. Die Substanzträger werden als Placebo- Kontrollen in jedem Versuch mitgeführt.

Die Behandlung erfolgt durch viermaliges schonungsvolles Auftragen der Testbereitungen (erstmals 30 Minuten, dann 6. 24 und 32 Stunden nach der Auslösung der Challenge-Reaktion). Vor jeder Behandlung werden die Testareale nach Rötung, Schwellung und Konsistenz beurteilt. Die Färbung der Testfelder wird anschließend mit einem Reflektometer quantitativ bestimmt, wobei die Teststellen wiederholt vermessen werden. Aus den Meßdaten Helligkeit (L*) und Sättigung (C*) wird der "Erythemindex" für jede Messung nach folgender Formel errechnet: 100 - L* × C*. Der mittlere Erythemindex dient der Wirksamkeitsbestimmung nach der Formel

Δ: Differenz zum Ausgangswert.

Die klinische Befundung der Teststellen ergibt deutliche Unterschiede zwischen den Stellen, die mit Placebo bzw. Wirkstoff behandelt werden. Während placebobehandelte Stellen diffus kirschrote, beetartig erhabene, indurierte Areale bildeten, sind mit Verbindung A in 5%iger Bereitung (Lösung in 15% Dimethyl acetamid, 42.5% Ethanol und 42.5% Propylenglykol) behandelte Teststellen kaum von der umgebenden normalen Haut zu unter scheiden. Sie weisen nur eine leichte fleckenförmige Rötung auf.

Die unterschiedliche Färbung kann mit dem Refraktometer deutlich gezeigt werden. Dexamethason in gleicher Konzentration und Bereitung zeigte in diesem Modell nur eine schwache Wirkung, für Cyclosporin A kann keine Wirkung nachgewiesen werden.

2. Prüfung der Wirksamkeit nach topischer Applikation am Modell der irritansbedingten Dermatitis von Mäusen 2.1. TPA-induzierte Dermatitis

Die Irritation der Haut von Versuchstieren mit 12-O-Tsetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) ist eine Methode, Testsubstanzen nach lokaler Anwendung auf ihre antiin flammatorische Wirkung zu testen (siehe Maibach, Lowe, edit., Models in Dermatology Vol. 3, 86-92, Karger-Basel [1987]. NMRI-Mäusen werden 10 µl einer TPA-Lösung auf die innere und äußere Seite der rechten Ohrmuschel aufgetragen (2×10 µl/Maus = 2×0.5 µg TPA/Maus). Die Behandlung erfolgt 30 Minuten nach der Irritation, indem 2×10 µl der Testlösung wie beschrieben auf die irritierte Ohrmuschelfläche aufgebracht werden. Die Auswertung der Testgruppe erfolgt im Vergleich mit einer Gruppe, deren rechte Ohrmuscheln nur mit der Irritationslösung und dem Lösungsmittel der Substanz behandelt wurden. 6 Stunden nach dem Auftragen des Irritans werden die Tiere getötet, die Ohrmuscheln abgesetzt und gewogen. Die Differenz aus beiden Ohrmuschel- Gewichten wird zur Auswertung verwendet, indem die einzelnen Differenzwerte der Testgruppen mit den einzelnen Differenzen der Kontrollgruppe statistisch (wie bei 1.1.) verglichen werden. Die Wirkung der Testsubstanzen wird aufgrund der Mittelwerte in % angegeben.

Die Ergebnisse im Vergleich zu Indomethacin sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Als Lösungsmittel wurde eine Mischung aus Dimethylacetamid, Aceton und Ethanol (2/4/4) verwendet.

Tabelle 2

2.2 Crotonöl-induzierte Dermatitis

Crotonöl wird wie TPA häufig zur Induktion einer irritans- Dermatitis verwendet, an der Testsubstanzen auf ihre antiinflammatorische Wirkung getestet werden (siehe Maibach, Lowe edit., Models in Dermatology, Vol. 3, 86-92, Karger-Basel [1987]. NMRI-Mäusen werden 15 µl 0.23% Crotonöl (in einem Gemisch aus Dimethylacetamid, Aceton und Ethanol = 2/4/4) auf die Innenfläche der rechten Ohrmuschel aufgetragen. Die Behandlung erfolgt gleichzeitig mit der Irritation, indem die Substanz in der Irritanslösung gelöst wird. Die Auswertung der Testgruppe erfolgt im Vergleich mit einer Gruppe, deren rechte Ohrmuschel nur mit der Irritanslösung behandelt wurde. 6 Stunden nach dem Auftragen des Irritans werden die Tiere getötet, die Ohrmuscheln abgesetzt und gewogen. Die Differenz aus beiden Ohrmuschel-Gewichten wird zur Auswertung verwendet, indem die einzelnen Differenzwerte der Testgruppen mit den einzelnen Differenzen der Kontrollgruppe statistisch (wie bei 1.1) verglichen werden. Die Wirkung der Testsubstanzen wird aufgrund der Mittelwerte in % angegeben.

Die Ergebnisse mit Verbindung A im Vergleich zu Indomethacin sind in Tabelle 3 wiedergegeben:

Tabelle 3

3. Inhibierung des "oxidative burst" in humanen neutrophilen polymorphkernigen Leukozyten (Inhibierung der FMLP- bzw. A23187-stimulierten Chemilumineszenz)

Polymorphkernige Leukozyten (PMNL) werden wie beschrieben aus peripheren Blut des Menschen präpariert (Schaude, M., W. Mlineritsch, B. Mandak, Mycoses 31(5), 259-267 [1988]). Die Herstellung der Testsubstanzstammlösungen (500 mg/l) erfolgt am Versuchstag in 5% DMSO/RPMI 1640. Für die Bestimmung der Chemilumineszenz mittels Biolumat LB 9505 wird der Lumines zenz-Indikator 7-Dimethylaminonaphthalin-1,2-dicarbonsäure hydrazid (DMNH) verwendet. Bei der Bestimmung der Chemilu mineszenz von PMNL Zellen besteht das Reaktionsgemisch aus 200 µl PMNL-Suspension (5×10⁶ Zellen/ml). 100 µl der jeweiligen Test substanz-Verdünnung oder dem Lösungsmittel als Kontrolle und 25 µl der DMNH-Lösung (2,5×10^-6 M). Die CL-Reaktion wird entweder durch Zugabe des Peptids N-Formyl-L-Methionyl-L-Leucyl-L-Phenyl alanin (FMPL), 4×10^-6 M) oder durch den Calziumionophor A 23187 (4×10^-6 M) gestartet. Der Verlauf der CL-Reaktion bei 370 wird über einen Zeitraum von 20 Minuten in Intervallen von 20 Sekunden gemessen. 3 Parameter werden zur Beurteilung der Ergebnisse herangezogen: Peakintensität des abgestrahlten Lichtes, Zeit bis zum Peak und die Fläche unter der Reaktionsverlaufskurve. Als minimale Hemmkonzentration wird jene niedrigste Wirkstoffkon zentration bezeichnet, bei der eine deutliche Hemmung aller 3 Parameter beobachtet werden kann (Tabelle 4):

Tabelle 4

4. Inhibierung der Makrophagen-Aktivierung (Inhibierung der TPA-induzierten Freisetzung von PG-E₂)

Peritoneale Exsudatzellen von NMRI-Mäusen, die 3 Tage vorher mit 1,5 ml Thioglykolat i.p. vorbehandelt wurden, werden in peritonealen lavage gezüchtet, mit defizientem PBS gewaschen und in DMEM-Medium, das mit 10% FCS supplimentiert ist, resus pendiert. 1×10⁶ Zellen werden in jede der Vertiefungen einer 24-Kulturenplatte gegeben, und die Zellen werden 4 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ zur Adhärenz belassen. Dann werden die Zellen zweimal mit defizientem PBS gewaschen. Die erhaltene, < 95% reine Makrophagenpopulation wird mit TPA (20 µl/1 Stunde) in DMEM- Medium ohne FCS stimuliert. Die konditionierten Medien werden zentrifugiert und der PGE₂-Freisetzung durch die Testsubstanzen wird als prozentuelle Inhibition im Vergleich zu den Kontrollen berechnet.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt:

Tabelle 5

5. Inhibition der Proliferation von Human-Keratinozyten

Kulturen von Human-Keratinozyten werden durch Trypsinierung von humanen Vorhäuten Neugeborener erhalten oder als EpiPack von Clonetics Corp. (San Diego) bezogen. Die Keratinozytenkulturen werden in einem supplementierten Keratinozytenmedium (KGM) in Kulturflaschen gezüchtet. Die Passagen 3-5 von 80-90% konfluenten Keratinozyten werden in KGM in einer Konzentration von 1×10⁵ Zellen/ml resuspendiert, und entweder je 0,1 ml dieser Zellsus pension werden in eine 96-Näpfchen-Mikrotiterplatte oder je 1 ml dieser Zellsuspension in eine 24-Näpfchenplatte in Gegenwart der Testsubstanz gegeben. Die Zellen werden 48 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ gezüchtet. Während der letzten 16 Stunden wird 3H-Thymidin inkorporiert (Mikrotiterplatte, 1 µCi/Näpfchen), die Zellen werden hinsichtlich Morphologie kontrolliert, dreimal mit eiskalter defizienter PBS und zweimal mit Trichloressigsäure gewaschen, in 100 µl 0,1 N NaOH, die 1% SDS enthält, solu bilisiert und die Radioaktivität gemessen. Alternativ werden Zellen der 24-Näpfchen Kulturplatte trypsinisiert (Trypsin/EDTA), auf Viabilität kontrolliert durch Trypanblauexklusion, und dreifache Aliquote werden in einem Zell-Counter gemessen.

Ergebnis: Verbindung A zeigt im Konzentrationsbereich von 0,5 bis 5 µM dosisabhängig eine Reduktion der Proliferation (Tabelle 6):

Tabelle 6

Die Substanzbezeichnungen haben folgende Bedeutung:

A: FK 506 = 17-Allyl-1,14-dihydroxy-12-[2-(4-hydroxy-3-methoxy cyclohexyl)-1-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetrame thyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0^4,9]-octacos-18-en- 2,3,10,16-tetraon (Seite 32 in EP 184 162) (R¹, R² OH; R³ = Allyl; n = 2; Einfachbindung).
B: Dihydro-FK 506 = 1,14-Dihydroxy-12-[2-(4-hydroxy-3-methoxy cyclohexyl)-1-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetra methyl-17-propyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0^4,9]octa cos-18-en-2,3,10,16-tetraon (Seite 98 als Beispiel 21 in EP 184 162)
(R¹, R² = OH; R³ = n-Propyl; n = 2; Einfachbindung).
C: dehydratiertes FK 506 = 17-Allyl-1-hydroxy-12-[2-(4-hy droxy-3-methoxycyclohexyl)-1-methylvinyl]-23-25-dimethoxy- 13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0^4,9] octacos-14,18-dien-2,3,10,16-tetraon (Seite 95 als Teil von Beispiel 17 in EP 184 162)
(R¹ = OH; R² = H; R³ = Allyl; n = 2; Doppelbindung).
D: Diacetyl-FK 506 = 14-Acetoxy-12-[2-(4-acetoxy-3-methoxycyclo hexyl)-1-methylvinyl]-17-allyl-1-hydroxy-23,25-dimethoxy- 13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0^4,9]- octacos-18-en-2,3,10,16-tetraon (Seite 89 als Teil von Beispiel 6 in EP 184 162)
(R¹, R² = Acetoxy; R³ = Allyl; n = 2; Einfachbindung).
E: Monoacetyl-FK 506 = 12-[2-(4-Acetoxy-3-methoxycyclohexyl)- 1-methylvinyl]-17-allyl-1,14-dihydroxy-23,25-dimethoxy- 13,19,21,27-tetramethyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0^4,9]- octacos.18-en-2,3,10,16-tetraon (Seite 88 als Beispiel 5 in EP 184 162)
(R¹ = Acetoxy; R² = Hydroxy; R³ = Allyl; n = 2; Einfachbindung).

Die Verbindung A (FK 506) ist ein aus der Natur isoliertes Produkt. Sie besitzt eine bestimmte sterische Konfiguration. Obwohl sie in EP 184 162 mit ausführlichen Charakterisierungs daten offenbart ist, gibt jedoch die für FK 506 auf Seite 32 in EP 184 162 angegebene Formel keine Information über die stereo chemische Konfiguration an. Weiter ist in EP 184 162 überhaupt keine Information über die genaue Konfiguration von irgendwelcher spezifisch offenbarter Verbindung enthalten. Da mehrere Asyme triezentren vorhanden sind, umfaßt daher die Formel auf Seite 32 viele potentielle Verbindungen, allerdings entspricht nur eine dem FK 506. Die genaue Konfiguration von FK 506 wurde später veröffentlicht, z. B. in H. Tanaka et al., J. Am. Chem. Soc. 109 (1987) 5031-5033, T. Kino et al., J. Antibiotics 40 (1987) 1249-1255 und T. Taga et al., Acta Cryst. C43 (1987) 751-753, und entspricht folgender Formel:

Daraus geht hervor, daß die Verbindungen B, C, D und E ebenfalls eine der obigen Formel Ia entsprechende Konfiguration besitzen, da in EP 184 162 ihre Herstellung ausgehend von FK 506 durchgeführt wird, unter Verwendung von Reaktionsschritten, die die Konfiguration nicht verändern.

Eine Ausführung der Erfindung ist die Verwendung von Verbindungen der Formel I in freier Form oder in Form von pharmazeutisch verträglichen Salzen zur topischen Behandlung von allergischen Dermatiten aus der Gruppe, der atopischen Dermatitis, der Kontakt-Dermatitis und ekzematösen Dermatiten, und der seborrhoeischen Dermatitis.

Bevorzugt sind die Verbindungen der Formel I, in denen R¹, R² und n die oben für Formel I angegebene Bedeutung besitzen, R³ Propyl oder Allyl bedeuten und das Symbol einer Linie und gestrichelten Linie für eine Einfachbindung steht; besonders bevorzugt ist die Verbindung A.

Für obige Verwendung hängt die zu verabreichende Dosis von der verwendeten Verbindung, der Verabreichungsart sowie der Behandlungsart ab. Man erhält bei größeren Säugetieren zufriedenstellende Ergebnisse bei mehrmals täglicher lokaler Verabreichung einer 1-3%igen Wirkstoffkonzentration, z. B. 2 bis 5 mal täglich. Beispiele von geeigneten galenischen Formen sind Lotionen, Gele oder Cremen.

Claims

1. Verwendung von Verbindungen der Formel worin
R₁ für eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe,
R² für Wasserstoff oder eine gegebenenfalls geschützte Hydroxygruppe,
R³ für Methyl, Ethyl, Propyl oder Allyl,
n für 1 oder 2 und
das Symbol einer Linie und gestrichelten Linie für eine Einfach- oder Doppelbindung stehen,
in freier Form oder in Salzform,
zur topischen Behandlung von allergischen Dermatiten aus der Gruppe der atopischen Dermatitis, der Kontakt-Dermatitis und ekzematösen Dermatiten, und der seborrhoeischen Dermatitis.

2. Verwendung von 17-Allyl-1,14-dihydroxy-12-[2-(4-hydroxy-3-methoxy cyclohexyl)-1-methylvinyl]-23,25-dimethoxy-13,19,21,27-tetra methyl-11,28-dioxa-4-azatricyclo[22.3.1.0^4,9]-octacos-18-en- 2,3,10,16-tetraon nach dem Anspruch 1.

3. Verwendung der Verbindung der Formel Ia nach dem Anspruch 1.

4. Verwendung der Verbindungen nach den Ansprüchen 1-3 in Form von Lotionen, Gelen oder Cremen.