KR930010704B1 - 트리사이클로 화합물의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

트리사이클로 화합물의 제조방법
제1도는 본 발명에 따르는 분말형 FR-900506 물질의13C 핵자기공명 스펙트럼.
제2도는 본 발명에 따르는 분말형 FR-900506 물질의1H 핵자기공명 스펙트럼.
제3도는 본 발명에 따르는 결정형 FR-900506 물질의13C 핵자기공명 스펙트럼.
제4도는 본 발명에 따르는 결정형 FR-900506 물질의1H 핵자기공명 스펙트럼.
제5도는 본 발명에 따르는 FR-900525 물질의13C 핵자기공명 스펙트럼.
제6도는 본 발명에 따르는 FR-900525 물질의1H 핵자기공명 스펙트럼.
제7도는 본 발명에 따르는 FR-900523 물질의13C 핵자기공명 스펙트럼.
제8도는 본 발명에 따르는 FR-900523 물질의1H 핵자기공명 스펙트럼이다.
본 발명은 약리학적 활성을 갖는 신규 트리사이클로 화합물, 그의 제조방법 및 이들을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명은 면역 억제 활성, 항균 활성등과 같은 약리학적 활성을 갖는 신규 트리사이클로 화합물, 그의 제조방법 및 이들을 함유하는 약제학적 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명이 목적은 이식에 의한 거부반응, 골수이식에 의한 이식편대숙주질환(graft-versus-host disease), 자가면역질환, 감염성 질환 등의 예방 및 치료에 유용한 신규 트리사이클로 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 발효 방법 및 합성 방법에 의하여 트리사이클로 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 활성 성분으로서 트라사이클로 화합물을 함유하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 그 밖의 또 다른 목적은 이식에 의한 거부반응, 골수 이식에 의한 이식편대숙주질환, 자가면역질환, 감염성 질환 등의 예방 및 치료용 약제를 제조하기 위한 트리사이클로 화합물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명에 있어서, 본 발명은 신규의 특정 화합물인 FR-900506, FR-900523 및 FR-900525 물질을 최초로 새롭게 발견하여 이를 근거로하여 완성된 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명에 따라 FR-900506, FR-900523 및 FR-900525 물질은 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속에 속하는 신규한 종의 균주의 발효에 의해 얻어진 배양 육즙으로부터 순수 형태로 최초로 신규하게 분리되었다.
또한, FR-900506, FR-900523 및 FR-900525 물질의 화학 구조를 규명하기 위한 광범위하고 집중적인 연구의 결과로 본 발명자들은 그 들의 화학 구조를 결정하고 본 발명의 트리사이클로 화합물을 제조하는데 성공하였다.
본 발명의 신규 트리사이클로 화합물은 다음 일반식 및 그의 염으로 표시될 수 있다.
Figure kpo00001
상기 식에서, R1은 하이드록시 또는 보호된 하이드록시이고, R2는 수소, 하이드록시 또는 보호된 하이드록시며, R3는 메틸, 에틸, 프로필 또는 알릴이고, n은 1 또는 2의 정수이며, 선 및 점선 기호는 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단, R1및 R2가 각각 하이드록시이고, n이 정수 2 이며, 선 및 점선 기호가 단일결합을 나타내는 경우에, R3는 메틸, 프로필 또는 알릴이고, n이 정수 1인 경우에, R3는 프로필 또는 알릴이다.
목적 화합물(I)중에서, 다음 세 개의 특정 화합물이 발효에 의하여 제조되는 것으로 확인되었다.
(1) FR-900506 물질로 명명되는, R1및 R2가 각각 하이드록시이고, R3는 알릴이며, n은 2의 정수이고, 선 및 점선 기호는 단일 결합인 화합물(I) ; (2) FR-900523물질(별칭 : WS 7238 물질)로 명명되는, R1및 R2가 각각 하이드록시이고, R3는 메틸이며, n은 2의 정수이고, 선 및 점선 부호는 단일 결합인 화합물 (I) ; 및 (3) FR-900525 물질로 명명되는, R1및 R2가 각각 하이드록시이고, R3는 알릴이며, n은 1의 정수이고, 선 및 점선 부호는 단일 결합인 화합물(I).
본 발명의 트리사이클로 화합물(I)은 비대칭 탄소원자(들) 및 이중결합(들)으로 인해 광학 및 기하이성체와 같은 하나 이상의 컨포머(conformer)(들) 또는 입체 이성체쌍으로 존재할 수 있으며, 이들 이성체들도 또한 본 발명의 범위내에 포함된다.
본 발명에 따르면, 목적하는 트리사이클로 화합물(I)은 하기 방법에 의해 제조될 수 있다.
[ I ] 발효방법 :
스트랩토마이세스속에 속하는 균주→FR-900506물질, FR-900523물질 및 FR-900525 물질
[ II ] 합성방법 :
(1) 방법 1(하이드록시 보호기의 도입)
Figure kpo00002
Figure kpo00003
(2) 방법 2(하이드록시 보호기의 도입)
Figure kpo00004
Figure kpo00005
(3) 방법 3(이중결합의 형성)
Figure kpo00006
Figure kpo00007
(4) 방법 4(하이드록시 에틸렌기의 산화)
Figure kpo00008
Figure kpo00009
(5) 방법 5(알릴기의 환원)
Figure kpo00010
Figure kpo00011
상기 반응도식에서, R1,R2,R3,n 및 선 및 점선 부호는 각각 상기 정의한 바와 같으며, Ra 1와 Ra 2는 각각 보호된 하이드록시이고, Rb 2는 이탈기이다.
상기 정의 및 그의 바람직한 구체예를 이후 상세히 설명한다.
본 명세서에서 사용된 용어 ＂저급＂은 다른 지시가 없는 한 탄소수 1 내지 6을 의미한다.
＂보호된 하이드록시＂에서 적합한 하이드록시 보호기에는 다음의 기들의 포함될 수 있다 : 저급알킬티오메틸, (예 : 에틸티오메틸, 에틸티오메릴, 프로필티오메틴, 이소프로필티오메틸, 부틸티오메틸, 이소부틸티오메틸, 헥실티오메틸 등) 등과 같은 1-(저급 알킬티오)(저급) 알킬, 여기에서 바람직한 것은 C1-C4알킬티오메틸일 수 있고, 가장 바람직한 것은 메틸티오케틸일 수 있다 ;
트리(저급) 알킬실릴(예 : 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, 트리부틸실릴, t-부틸-디메틸실릴, 트리-t-부틸실릴 등), 저급알킬-디아릴실릴(예 : 메틸-디페니실릴, 에틸- 디페닐실릴, 프로필- 디페닐실릴, t-부틸-디페닐실릴 등) 등과 같은 삼치환된 실릴, 여기에서 바람직한 것은 트리(C1-C4) 알킬실린 및 C1-C4알킬- 디페닐실릴일 수 있고, 가장 바람직한 것은 t-부틸-디메릴실릴 및 t-부틸-디페닐실릴일 수 있다 ;
카복실산 및 설폰산으로부터 유도된, 지방족 아실 및 방향족기로 치환된 지방족 아실과 같은 아실 등.
지방족 아실에는 카복시와 같은 하나 이상의 적합한 치환체(들)를 가질 수 있는 저급알카노일(예 : 포로밀, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 아소부티릴, 발레릴, 이소발레릴, 피발로일, 헥사노일, 카복시아세틸, 카복시프로피오닐, 카복시부티릴, 카복시헥사노일 등), 저급알킬과 하나 이상의 적합한 치환체(들)를 가질 수 있는 사이클로(저급)알킬옥시(저급)알카노일(예 : 사이클로프로필옥시아세틸, 사이클로부틸 옥시프로피오닐, 사이클로헵틸옥시부티릴, 멘틸옥시아세틸, 멘틸옥시프로피오닐, 멘틸 옥시부티릴, 멘틸옥시헵타노일, 멘틸옥시헥사노일 등), 캄포설포닐 등이 포함될 수 있다.
방향족 아실에는 니트로와 같은 하나 이상의 적합한 치환체(들)를 가질 수 있는 아로일(예 : 벤조일, 톨루오일, 크실로일, 나프토일, 니트로페닐, 디니트로페닐, 니트로나프토일 등), 할로겐과 같은 하나 이상의 적합한 치환체(들)를 가질 수 있는 아렌설포닐(예 : 벤젠설포닐, 톨루엔설포니르 크실렌설포닐, 나프탈렌설포닐, 플루오로벤젠설포닐, 클로로벤젠설포닐, 브로모벤젠설포닐, 요오도벤젠설포닐 등) 등이 포함될 수 있다.
방향족기로 치환된 지방복 아실에는 저급알콕시 및 트리할로(저급)알킬과 같은 하나 이상의 적합한 치환체(들)를 가질 수 있는 아르(저급)알카노일(예 : 페닐아세틸, 페닐프로피오닐, 페닐부티릴, 2-트리플루오로메틸-2-메톡시-2-페닐아세틸, 2-에틸-2-트리플루오로메틸-2-페닐아세틸, 2-트리플루오로메틸-2-프로폭시-2-페닐아세틸 등) 등이 포함될 수 있다.
상기 정의된 것중에서 더욱 바람직한 아실기는 카복시를 가질 수 있는 C1-4알카노일, 사이클로알킬 부위에 두개의(C1-C4)알킬기를 가지는 사이클로(C5-C5) 알킬 옥시(C1-C4) 알키노일, 캄포설포닐, 하나 또는 두개의 니트로를 가질 수 있는 벤조일, 할로겐을 가지는 벤젠설포닐, C1-C4알콕시 및 트리할로(C1-C4) 알킬을 가지는 페닐(C1-C4) 알카노일 일 수 있고, 가장 바람직한것은 아세틸, 카복시프로피오닐, 멘틸옥시아세틸, 캄포설포닐, 벤조일, 니트로벤조일, 디니트로벤조일, 요오도베젠설포닐 및 2-트리플루오로메틸-2-메톡시-2-페닐아세틸일 수 있다.
적합한 ＂이탈기＂에는 하이드록시, 아실옥시(여기에서 아실 부위는 상기 예시된 것일 수 있다)등이 포함될 수 있다.
본 발명의 트리사이클로 화합물의 제조방법을 다음에 상세히 설명한다.
[ I ] 발효방법 : 본 발명의 FR-900506, FR-900523 및 FR-900525 물질은 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 9993(Streptomyces tsukubaensis No.9993) 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 야꾸시마엔시스 7238(Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis No.7238)rhk 같은 스트랩토마이세스속에 속하는 FR-900506, FR-900523 및/또는 FR-900525 물질(들)-생성 균주를 영양 배지중에서 발효시킴으로써 제조할 수 있다.
FR-900506, FR-900523 및 FR-900525물질의 제조에 사용된 미생물의 특성을 다음에 설명한다.
[A] 본 발명의 FR-900506 및 FR-900525물질은 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 9993과 같은 스트랩토마이세스 속에 속하는 FR-900506, 및 FR-900525물질(들)-생성 균주를 영양 배지중에서 발표시킴으로써 제조할 수 있다.
미생물
FR-900506 및/또는 FR-900525물질의 제조에 사용될 수 있는 미생물은 스트렙토마이세스 속에 속하는 FR-900506 및/또는 FR-900525물질(들)-생성 균주이며, 이들중 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 9993은 일본국 이바라끼껭 쯔꾸바군 도요사또쪼에서 수집된 토양 샘플에서 새로이 분리된 것이다.
새로이 분리된 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 9993의 동결건조 샘플은 과학기술성 산하 발효연구소(Fermentation Research Institute, Agency of industrial Science and Technology)(일본국 이바라끼껭 쯔꾸바군 야다베마찌 히가시 1-쪼메 1-3)에 기탁번호 FERM P-7886(기탁일 : 1984.10.5)으로 기탁되었으며[한국기탁번호 : KFCC-10192, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1986. 3. 7], 이 균주는 그 후에 부다페스트 조약에 따라 1985년 10월 19일, 동일한 기탁기관에서 신 기탁번호 FERM BP-927로 변경되었다.
신규 FR-900506, 및/또는 FR-900525 물질(들)의 제조는 본 명세서에 기술된 특정 미생물의 사용에만 한정되는 것은 아니며, 이는 단지 예시할 목적으로만 제시된 것이다. 본 발명에서는 또한 천연 변이주 뿐만 아니라 X-선 조사, 자외선 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘, 2-아미노퓨린 등에 의한 처리와 같은 통상의 방법에 의해 상기 언급된 미생물로부터 제조될 수 있는 인공 변이주를 포함해서 FR-900506 및/또는 FR-900525 물질을 생성할 수 있는 어떠한 변이라도 사용할 수 있다.
스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 9993(KFCC-10192)은 다음과 같은 형태학적, 배양적, 생물학적 및 생리학적 특성을 가진다.
[1]형태학적 특성 : 셔링(Shirling) 및 고트리브(Gottlieb)에 의해 기술된 방법(Shirling, E.B.and D.Gottlieb : Methobs for characterization of Streptomyces species. International Joumal of Systematic Bacteriology, 16, 313-340, 1966)이 본 분류학적 연구에 주로 사용되었다.
형태학적 특성은 오트밀 한천, 이스트-맥아 추출물 한천 및 무기염-전분 한천상에서 30℃에서 14일 동안 배양한 배양물에서 광 및 전자현미경으로 관찰하였다. 성숙 포자낭은 각 쇄 (Chain)에 10 내지 50개 또는 50개 이상의 포자를 갖는 렉티플렉시블즈(Rectiflexibiles)를 형성한다. 포자는 전자 현미경에 의해 0.5내지 0.7×0.7 내지 0.8㎛크기의 장방형 또는 원통형인 것으로 관찰되었다. 포자 표면은 매끄러웠다.
[2]배양특성 : 배양특성은 상기 언급한 셔링 및 고트리브, 및 왁스만(Waksman, S.A. : Theactinomycetes, Vol.2 : Classification, identification and description of genera and species. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961)에 의해 기술된 10종류의 배지상에서 관찰하였다.
배양은 30℃에서 14일간 동안 수행하였다. 이 연구에서 사용된 색상명은 표준 색상 가이드(Guide to color Standard : Nippon Shikisai Kenkyusho, Tokyo에서 출판된 매뉴얼)에 기초하였다. 콜로리는 오트밀-한천, 이스트-맥아 추출물 한천 및 무기염-전분 한천상에서 증식된 경우 회색 계열에 속하였다. 가용성 색소는 이스트-맥아 추출몰 한천에서 생성되었으아 다른 배지에서는 생성되지 않았다. 그 결과는 표 1과 같다.
[표 1]
균주 9993 및 스트랩토마이세스 미사키엔시스 IFO 12891의 배양특성
Figure kpo00012
세포벽 분석은 벡커등의 방법(Becker, B.,M.P .Lechevalier, R . E . Gordon and H . A . Lechevalier : Rapid differeentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates : Appl.Microbiol., 12,421-423,1964) 및 야마구찌의 방법(Yamaguchi,T.:Comparison of the cell wall composition of morphologically distinct actinomycetes : J.Bacteriol., 89,444-453,1965)에 의해 수행한다. 균주 9993의 전체 세포 가수분해물을 분석하여 LL-디아미노피멜산이 존재함이 확인하였다. 따라서, 이 균주의 세포벽은 타일 I인 것으로 판단된다.
[3] 생물학적 및 생리학적 특성 : 균주 9993의 생리학적 특성은 언급한 셔링 및 고브리브에 의해 기술된 방법에 따라 측정하였다. 결과는 표 2에 나타난다. 증식의 온도 범위 및 최적온도는 온도 구배 배양기(temperature gradient incubator : Toyo Kagaku Sangyo Co.,Ltd.에서 제조)를 사용하여 이스트-맥아 추출물 한천상에서 결정한다. 증식의 온도범위는 18 내지 35℃였으며, 최적 온도는 28℃이다. 밀크 펩톤화 및 젤라틴 액화는 양성이었다. 멜라노이드 색소 생성은 음성이었다.
[표 2]
균주 9993 및 스트렙토마이세스 미사키엔시스(Streptomyces misakiensis) IFO 12891의 생리학적 특성
Figure kpo00013
탄소 공급원의 이용은 프리담(Pridham) 및 고트리브의 방법(Pridham, T.G.and D.Gottlieb : The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination : J.Bacteriol., 56, 107-114,1948)에 따라 측정한다. 증식은 30℃에서 14일간 배양한 후 관찰하였다.
이 균주의 요약된 탄소 공급원 이용을 표 3에 나타내었다. 글리세린, 말토스 및 나트륨 석시네이트는 균주 9993에 의해 이용될 수 있었다. 또한, D-글루코스, 슈크로스, D-만노스 및 살리신이 이용된 것으로 관찰하였다.
[표 3]
균주 9993 및 스트렙토마이세스 미사키엔시스 IFO 12891의 탄소 공급원 이용
Figure kpo00014
균주 9993의 현미경적 관찰 및 세포벽 조성의 분석은 이 균주가 스트렙토마이스 왁스만 및 헨리치(Waksman and Henrici) 1943속에 나타낸다..
따라서, 이 균주를 간행물[International Journal of Systematic Bacteriology, 18,69 to 189,279 to 392(1968) 및 19,391 to 512(1969), 및 Bergy's Manual of Determinative Bacteriolgy 8th Edition(1974)]에 기재된 설명에 따라 다양한 스트렙토마이세스 균주종과 비교하였다.
비교 결과, 균주 9993은 스트렙토마이세스 아부라비엔시스 니시무라(Streptomyces aburaviensis Nichimura)등, 스트렙토마이세스 아벨라네우스 발다치 및 그레인(Streptomyces avellaneus Baldacci and Grein) 및 스트렙토마이세스 미사키엔시스 나까무라(Nakamura)와 닮은 것으로 판단된다. 따라서, 균주 9993의 배양 특성을 상응하는 스트렙토마이세스 아부라비엔시스 IFO 12830, 스트렙토마이세스 아벨라네우스 IFO 13451 및 스트렙토마이세스 미사키엔시스 IFO 12891과 비교하였다. 그 결과, 균주 9993은 스트렙토마이세스 미사키엔시스 IFO 12891과 가장 유사하였다. 따라서, 균주 9993을 상기 표 1, 2 및 3에서 보는 바와 같은 스트렙토마이세스 미사키엔시스 IFO 12891과 추가로 비교하여다. 추가의 비교 결과, 균주 9993은 스트렙토마이세스 미사키엔시스 IFO 12891과는 다음의 점에 있어서 상이하며, 따라서 균주 9993은 스트렙토마이세스의 신규한 균주종인 것으로 생각되며, 이 미생물이 쯔꾸바군에서 수집된 토양으로부터 분리되었기 때문에 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스(Streptomyces tsukubaensis) sp.nov.로 명명하였다.
스트렙토마이세스 미사키엔시스 IFO 12891과의 차이점
균주 9993의 오트밀 한천, 이스트-맥아 추출몰 한천, 글루코스-아스파라긴 한천 자페크 (Czapek) 한천 및 감자-댁스트로스 한천상에서 배양특성은 스트렙토마이세스 미사키엔시스 IFO 12891 과는 상이하다.
균주 9993의 전분 가수분해는 음성인데 반하여 스트렙토마이세스 미사키 엔시스 IFO 12891의 전분 가수 분해는 양성이다.
균주 9993의 젤라틴 액화는 양성인데 반하여, 스트렙토마이세스 미사키엔시스 IFO 12891의 젤라딘 액화는 음성이다.
탄소 공급원의 이용에 있어서, 균주 9993은 글리세린, 말토스 및 나트륨석시네이트를 이용할 수 있지만, 스트렙토마이세스 미사키엔시스 IFO 12891은 이들을 이용할 수 없다. 그리고, 균주 9993은 D-갈락토스 및 이눌린을 이용할 수 없는데 반하여, 스트렙토마이세스 미사키엔시스 IFO 12891은 이들을 이용할 수 있다.
FR-900506 및 FR-900525 물질의 제조
본 발명의 신규한 FR-900506 및 FR-900525 물질은 스트렙토마이세스 속에 속하는 FR-900506 및/또는 FR-900525 물질(들)-생성 균주(예:스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 No.9993,FERM BP-927)를 영양 배지에서 배양함으로써 제조할 수 있다.
일반적으로, FR-900506 및/또는 FR-900525물질(들)은 FR-900506 및/또는 FR-900525물질(들)-생성 균주를 동화성 탄소 및 질소 공급원을 함유하는 수성 배지중에서, 바람직하게는 호기적 조건하(예:진탄배양, 심부배양 등)에 배양하여 제조할 수 있다.
영양 배지중의 바람직한 탄소 공급원은 글루코스, 갈락토스, 글리세린, 덱스트린, 전분 등과 같은 탄수화물류이다. 이들외에 사용할 수 있는 다른 탄소 공급원은 말토스, 람노스, 라피노스, 아라비노스, 만노스, 살리신 , 나트륨 석시네이트 등이다.
바람직한 질소 공급원은 이스트 추출몰, 펩톤, 글루텐 밀(meal), 면실 밀, 대두 밀, 옥수수침지액(corn steep liquor), 건조 이스트, 소맥배아, 페더(feather)alf, 땅콩분말 등이며, 이들 암모늄염(예 : 질산암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등), 우레아, 아미노산 등과 같은 유기 또는 무기 질소 화합물이다.
탄소 및 질소 공급원은 배합하여 사용하는 것이 바람직하나, 미량의 증식인자 및 상당량의 광물질 영양물을 함유하는 덜 순수한 물질이 또한 사용하기에 적합하기 때문에 이들 공급원을 순수 형태로 사용할 필요는 없다. 필요하다면, 탄산나트륨 또는 탄산칼슘, 인산나트륨 또는 인산 칼륨, 염화나트륨 또는 염화칼륨, 요오드화나트륨 또는 요오드화칼륨, 마그네슘염, 구리염, 코발트염 등과 같은 무기염을 배지에 가할 수도 있다. 필요에 따라, 특히 배지가 기포를 심하게 생성할 때에는 액체 파라핀, 지방오일, 식물유, 광유 또는 실리콘과 같은 소포제를 첨가할 수도 있다.
FR-900506 및/또는 FR-900525 물질을 대량 제조하는 조건으로 심부 호기적 배양 조건이 바람직하다. 소량 제조를 위해서는, 플라스크 또는 병중에서의 진탕배양 또는 표면 배양이 사용된다. 또한, 증식을 대규모 탱크(tank)중에서 수행하는 경우에는 FR-900506 및/또는 FR-900525 물질의 제조과정 중에 증식의 지체를 막기 위하여 제조 탱크에서의 접종을 위해 증식형 미생물을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 우선 비교적 소량의 배양 배지를 미생물의 포자 또는 균사체로 접종하고, 접종 배지를 배양함으로써 미생물의 증식성 배양물을 제조한 후, 배양된 증식성 접종물을 대규모 랭크에 무균적으로 전이시키는 것이 바람직하다. 증식성 접종물이 생성된 배지는 FR-900506 및/또는 FR-900525 물질의 제조에 이용되는 배지와 실질적으로 동일하거나 상이하다.
배양 혼합물의 교반 및 통기는 여러 가지 방법으로 행해질 수 있다. 교반은 프로펠러 또는 유사한 기계적 교반 장치를 사용하거나, 발효기를 회전 또는 진탕시키거나, 다양한 펌핑장치를 사용하거나, 또는 배지에 멸균 공기를 통괴시킴으로써 제공될 수 있다. 통기는 발효 혼합물에 멸균 공기를 통과시켜 수행할 수 있다.
발효는 일반적으로 약 20 내지 40℃, 바람직하게는 25 내지 35℃에서 약 50 내지 150시간 동안 수행하며, 이러한 조건들은 발효 조건 및 규모에 따라서 변할 수 있다.
이렇게 생성된 FR-900506 및/또는 FR-900525물질(들)은 다른 공지된 생물학적 활성 물질의 회수에 일반적으로 사용되는 통상적인 방법에 의해 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 생성된 FR-900506 및/또는 FR-900525 물질은 배양된 균사체 및 여액중에서 발견되며, 따라서, FR-900506 및/또는 FR-900525 물질은 배양육즙을 여과하거나 원심분리하여 수득한 균사체 및 여액으로부터 감압하에서의 농축, 동결 건조, 통상의 용매에 의한 추출, pH 조절, 통상의 수지(예 : 음이온 또는 양이온 교환수지, 비이온성 흡착 수지 등)에 의한 처리, 통상의 흡착제(예 : 활성목탄, 규산 , 실리카겔, 셀룰로즈, 알루미나 등)에 의한 처리, 결정화, 재결정화 등과 같은 통상의 방법에 의해 분리 및 정제할 수 있다.
FR-900506 및/또는 FR-900525 물질의 물리적 및 화학적 특성
전술한 방법에 따라 생성된 FR-900506 및/또는 FR-900525 물질은 다음과 같은 물리적 및 화학적 특성을 갖는다.
FR-900506 물질
(1) 형태 및 색깔 : 백색 분말
(2) 원소 분석(%):
C ; 64.72, H ; 8.78, N ; 1.5
C ; 64.59, H ; 8.74, N ; 1.62
(3) 정색 반응 : 양성 : 황산세륨반응, 황산반응, 에르리히(Ehrlich) 반응, 드라겐도르프반응(Dragendorff) 및 요오드 증기반응
음성 : 염화 제2철반응, 닌히드린 반응 및 몰리쉬(Molish) 반응
(4) 용해도 : 가용 : 메탄올, 에탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디에틸에테르 및 벤젠
약간 용해 : 헥산, 석유에테르
불용 : 물
(5) 융점 : 85 내지 90℃
(6) 비선광도 :[α]D 23:-73°(c=0.8, CHCl3)
(7) 자외선 흡수 스펙트럼 : 말단 흡수
(8)적외선 흡수 스펙트럼
Figure kpo00015
:3680,3580,3520,2930,2870,2830,1745,1720,1700,1645,1450,1380,1350,1330,1310,1285,1170,1135,1090,1050,1030,1000,990,960(sh),918cm-1
(9)13C 핵자기 공명 스펙트럼:
Figure kpo00016
이 챠트는 제1도에 나타내었다.
(10)1H 핵자기 공명 스펙트럼 :
이 챠트는 제2도에 나타내었다.
(11) 박층 크로마토그래피:
Figure kpo00017
(12) 물질의 특성 : 중성물질
FR-900506 무질에 대해,13C 및1H 핵자기 공명 스펙트럼을 측정한 경우에, 이 물질은 다양한 화학적 쉬프트(shift)에서 시그날 쌍들을 나타내었다.
이렇게 특정화된 FR-900506 물질은 추가로 다음의 특성을 갖는는다.
(i) 25℃ 및 60℃에서13C 및 핵자기 공명 스펙트럼의 측정으로 여기에서 여러 시그날의 각 쌍의 세기가 변화되었음이 밝혀졌다.
(ii) 박층 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)의 측정으로 FR-900506 물질이 박층 크로마토그래피의 경우에는 단일반점으로 나타나며, HPLC의 경우에는 단일 피크로 각각 나타남이 밝혀졌다.
이러한 FR-900506 물질의 백색 분말은 아세토니트릴로부터 재질정화시켜 결정형태로 전활시킬 수 있으며, 이 결정은 다음의 물리적 및 화학적 특성을 가진다:
(1)형태 및 색상:
무색 프리즘상 결정
(2) 원소 분석(%):
C ; 64.3, H ; 8.92, N ; 1.77
C ; 64.20, H ; 8.86, N ; 1.72
(3) 융점 : 127 내지 129℃
(4) 비선광도 :
[α]D 23:-84.4°(c=1.02, CHCl3)
(5)13C 핵자기 공명 스펙트럼 :
Figure kpo00018
Figure kpo00019
이 챠트는 제3도에 나타내었다.
(6)1H 핵자기 공명 스펙트럼 :
이 챠트는 제4도에 나타내었다.
그 밖의 다른 물리적 및 화학적 특성, 즉 정색 반응, 용해도, 자외선 흡수 스펙트럼, 적외선 흡수 스펙트럼, 박층 크로마토그래피 및 FR-900506 물질의 무색 프리즘상 물질의 특성은 동일 조건하에서 동일물질의 백색 분말의 특성과 동일하였다.
상기 물리적 및 화학적 특성 및 X-선 회절분석에 의하여, FR-900506 물질은 다음의 화학구조를 갖는 것으로 결정내릴 수 있었다.
Figure kpo00020
17-알릴-1,14-디하이드록시-12-[2-(4-하이드록시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로-[22.3.1.04,9]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온
FR-900525 물질
(1) 형태 및 색상 :
백색분말
(2) 원소분석(%) :
C ; 65.17, H ; 8.53, N ; 1.76
(3) 정색반응 :
양성 : 황산세륨반응, 황산반응,에르리히(Ehrlich)반응, 드라겐도르프 반응 (Dragendorff) 및 요오드 증기반응
음성 : 염화 제2철반응,닌히드린 반응 및 몰리쉬(Molish)반응
(4)용해도 :
가용 : 메탄올, 에탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디에틸에테르 및 벤젠
약간 용해 : 헥산, 석유에테르
불용 : 물
(5) 융점 : 85 내지 90℃
(6)비선광도 :
[α]D 23=-88°(c=1.0,CHCl3)
(7) 자외선 흡수 스펙트럼 :
말단흡수
(8) 적외선 흡수 스펙트럼
Figure kpo00021
:3680,3580,3475,3340,2940,2880,2830,1755,1705,1635,1455,1382,1370,1330,1310,1273,1170,1135,1093,1050,1020,995,970,920,867cm-1
(9)13C 핵자기 공명 스펙트럼 :
Figure kpo00022
이 챠트는 제5도에 나타내었다.
(10)1H 핵자기 공명 수펙트럼 :
이 챠트는 제6도에 나타내었다.
(11) 박층 크로마토그래피 :
Figure kpo00023
(12) 물질의 특성 :
중성물질
FR-90052 물질에 대해,13C 및1H 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하면 이 물질은 여러 화학적 쉬프트에서 시그날의 쌍들을 나타내나, 박층 크로마토그래피 및 HPLC의 측정시에, FR-900525 물질을 박층 크로마토그래피에서는 단일반점을 나타내고 HPLC의 경우에도 단일 피크를 각각 나타낸다.
상기의 물리적 및 화학적 특성과 FR-900506 물질의 화학 구조의 결정의 성공으로부터, FR-900525 물질은 다음의 화학 구조를 갖는 것으로 판단된다.
Figure kpo00024
16-알릴-1,13-디하이드록시-11-[2-(4-하이드록시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-22,24-디메톡시-12,18,20,26-테트라메틸-10,27-디옥사-4-아자트리사이클로-[21.3.1.048]]-헵타코스-17-엔-2,3,9,15-데트라온
[B] 본발명의 FR-900523 물질은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페이스 야꾸시마엔시스 7238(Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis No. 7238)과 같은 스트렙토마이세스 속에 속하는 FR-900523 물질-생성 균주를 영양 배지중에서 발효시킴으로써 제조할 수 있다.
미생물
FR-900523 물질의 제조에 사용될 수 있는 미생물은 스트렙토마이세스 속에 속하는 FR-900523 물질-생성 균주이며, 이들 중에서 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페이스의 야꾸시마엔시스 7238은 일본국 가고시마껭 야꾸시마에서 수집된 토양 샘플로부터 새로이 분리되었다.
새로이 분리된 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠 서브스페시스 야꾸시마엔시스 7238은 과학 기술성 산화 발효연구소(No.1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki Prefecture, Japan)에 기탁번호 제 FERM P-8043으로 기탁되었으며(기탁일 : 1985.1.12)][한국기탁번호 : KFCC-10193, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일 : 1986.3.7], 이 균주는 그후에 부다페스트 조약에 의거 1985.10.19에 동일 기탁기관에서 신 기탁번호 FERM BP-928로 변경되었다.
신규 FR-900523 물질의 제조는 본 원에 기술된 특정 미생물의 사용에만 한정되는 것이 아니며, 이는 단지 예시 목적으로만 제시된 것이다. 본 발명에서는 또한 천연 변이주 및 X-선 조사, 자외선 조사, N-메틸-N′-니트로-N-니트로소구아니딘, 2-아미노퓨린에 의한 처리와 같은 통상의 방법에 의해 상기 언급된 미생물로부터 제조될 수 있는 인공 변이주를 포함해서 FR-900523 물질을 생성할 수 있는 어떠한 변이주라도 사용할 수 있다.
스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 야꾸시마엔시스 7238(KFCC-10193)은 다음과 같은 형태학적, 배양적, 생물학적 및 생리학적 특성을 갖는다.
[1] 형태학적 특성 :
셔링 (shirling) 및 고트리브(Gottlieb)에 의해 기술된 방법 (Shirling, E.B.and D.Gottlieb : Method for characterization of Streptomyces species, International Journal of Systematic Bacteriology, 16,313-340,1966)이 본 분류학적 연구에 주로 사용되었다.
형태학적 특성은 오트밀 한천, 이스트-맥아 추출물 한천 및 무기염-전분 한천상에서 30℃에서 14일 동안 배양한 배양물에서 광 및 전자 현미경으로 관찰하였다.
성숙 포자낭은 적당히 짧으며, 각 쇄슬에 약 20개의 포자를 갖는 레티나쿨리아퍼티(Rectinaculiaperti) 및 스피랄레스(Spirales)을 형성한다. 흡습성 포자체는 오트밀 한천 및 무기염-전분 한천상의 호기성 균사체중에서 발견된다. 포자상의 표면 불규칙성은 매우 짧고 두꺼운 돌기와 혹의 중간 정도이다.
[2] 배양특성 :
배양특성은 상기 언급한 셔링 및 코트리브, 및 왁스만(Waksman, S.A. : The actinomycetes, Vol.2 : Classification, identification and description of genera and species, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 19611에 의해 기술된 10종류의 배지상에서 관찰하였다.
배양은 30℃에서 14일 동안 수행하였다. 이 연구에서 사용된 색상명은 표준색상 가이드(Guide to Color Standard : Nippon Shikisai Kenkyusho, Tokyo에서 출판된 매뉴얼)에 기초하였다. 콜로니는 오트밀-한천, 이스트-맥아 추출물 한천 및 무기염-전분 한천상에서 증식된 경우 회색 계열에 속하였다. 가용성 색소는 시험한 배지에서는 생성더되지 않았다. 그 결과는 표 4와 같다.
[표 4]
균주 7238, 스트렙토마이세스 안티미오티쿠스 IFO 12839 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 글레보수스 IFO 13786 배양특성
Figure kpo00025
세포벽 분석은 벡커등의 방법(Becker, B., M.P.Lechevalier, R.E.Gordon and H.A.Lechevalier : Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates : Appl.Microbiol., 12, 421-423,1964) 및 야마구찌의 방법(Yamaguchi, T. : Comparison of the cell wall composition of morphologically distinct actinomycetes : J.Bacteriol. 89, 444-453,1965)에 의해 수행한다. 균주 7238의 전체 세포 가수분해물을 분석하여 LL-디아미노피멜산이 존재함을 확인하였다. 따라서, 이 균주의 세포벽은 타입 I인 것으로 판단된다.
[3] 생물학적 및 생리학적 특성 :
균주 7238의 생리학적 특성은 상기 언급한 셔링 및 고트리브에 의해 기술된 방법에 따라 측정하였다. 결과는 표 5에 나타낸다. 증식의 온도 범위 및 최적 온도는 온도구배 배양기(Toyo Kagaku Sangyo Co., Ltd.에서 제조)를 사용하여 이스트-맥아추출물 한천상에서 측정한다. 증식의 온도 범위는 18내지 36℃였으며, 최적온도는 28℃이다. 전분 가수분해 및 젤라틴 액화는 양성이었다. 멜라노이드 색소는 생성되지 않았다.
[표 5]
균주 7238, 스트렙토마이세스 안티마이코티쿠스(Streptomyces antimycoticus) IFO 12839 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 글레보수스(Streptomyces hygroscopicus subsp. glebosus) IFO 13786의 생리학적 특성
Figure kpo00026
탄소 공급원의 이용은 프리담(Pridham) 및 고트리브의 방법(Pridham, T.G. and D. Gottlieb : The utilization of carbon compounds by some Actinomycetalies as an aid for species determination : J. Bacteriol., 56, 107-114, 1948)에 따라 측정한다. 증식은 30℃에서 14일간 배양한후 관찰하였다.
이 균주의 요약된 탄소 공급원 이용을 표 6에 나타내었다. 균주 7238은 D-글루코스, 슈크로스, 락토스, 말토스, D-트레할로스, 이노시틀, 이눌린 및 살리신을 이용할 수 있다.
[표 6]
균주 7238 및 스트렙토마이세스 안티마이코티쿠스 IFO 12839 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 글레보수스 IFO 13786의 탄소 공급원 이용
Figure kpo00027
균주 7238의 현미경적 관찰 및 세포벽 조성의 분석은 이 균주가 스트렙토마이세스 왁스만 및 헨리치 1943속에 속함을 나타낸다.
따라서, 이 균주를 간행물[International Journal of Systematic Bacteriology, 18, 69 to 189, 279 to 392(1968) 및 19, 391 to 512(1969) 및 Bergy’s Manual of Determinative Bacteriology 8th Edition(1974)]에 기재된 설명에 따라 다양한 스트렙토마이세스 균주와 비교하였다.
비교 결과, 균주 7238은 스트렙토마이세스 안티마이코티쿠스 왁스만 1957 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 글레보수스 오모리(Ohmori) 등 1962와 유사한 것으로 판단된다. 따라서, 균주 7238의 배양 특성을 상기 표 4,5 및 6에서 보는 바와 같은 상응하는 스트렙토마이세스 안티마이코티쿠스 LFO 12839 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 글레보수스 IFO 13786과 추가로 비교하였다. 추가의 비교결과, 균주 7238은 다음의 점에 있어서 스트렙토마이세스 안티마이코티쿠스 IFO 12839 및 스트렙토마이세스 하이그로스코티쿠스 서브스페시스 글레보수스 IFO 13786과 상이하다.
(i) 스트렙토마이세스 안티마이코티쿠스 IFO 12839와의 차이점
균주 7238의 이스트-맥아 추출물 한천, 글루코스-아스파라긴 한천, 글리세린-아스파라긴 한천, 감자-덱스트로스 한천 및 티로신 한천상에서의 배양 특성은 스트렙토마이세스 안티마이코티쿠스 IFO 12839와는 상이하다.
탄소 공급원의 이용에 있어서, 균주 7238은 말토스를 이용할 수 있으나, 스트렙토마이세스 안티마이코티쿠스 IFO 12839는 이것을 이용할 수 없다. 또한, 균주 7238은 글리세린, D-프럭토스, 람노스, 라피노스, D-갈락토스, D-만노스, 만니톨 및 나트륨 석시네이트를 이용하지 못하나, 스트렙토마이세스 안티마이코티쿠스 IFO 12839는 이들을 이용할 수 있다.
(ii) 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 글레보수스 IFO 13786과의 차이점
균주 7238의 이스트-맥아추출물 한천, 감자-덱스트로스 한천 및 티로신 한천상에서의 배양 특성은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 글레보수스 IFO 13786과는 상이하다.
균주 7238은 밀크 펩톤화가 음성이나, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 글레보수스 IFO 13786은 양성이다. 균주 7238은 7% NaCl 존재하에서 증식할 수 있으나, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 글레보수스 IFO 13786은 동일 조건하에서 증식할 수 없다.
탄소 공급원의 이용에 있어서, 균주 7238은 락토스, 이눌린 및 살리신을 이용할 수 있으나, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 글레보수스 IFO 13786은 이들은 이용할 수 없다. 또한, 균주 7238은 글리세린, D-크실로스, D-프럭토스, 라피노스, D-갈락토스, D-만노스, 만니톨 및 나트륨 석시네이트를 이용할 수 없으나, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 글레보수스 IFO 13786은 이들을 이용할 수 있다.
그러나, 균주 7238은 오트밀 한천 및 무기염-전분 한천상에서 호기성 균사체중에 흡습성 포자체(hygroscopic spore mass)를 형성하며, 균주 7238의 추가의 형태학적 및 배양 특성은 스트렙토마이세스 하이그로스 코피쿠스 서브스페시스 글레보수스 IFO 13786과 유사하다. 따라서 균주 7238은 스트렙토 마이세스 하이그로스코피쿠스에 속하는 것으로 생각되며, 스트렙토마이세스 하이그로스코쿠스 서브스페시스 글레보수스 IFO 13786은이 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종중에서는 균주 7238과 가장 유사한 것이기는 하지만 균주 7238은 이 균주와는 상이하다. 이러한 사실로서 균주 7238은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스의 신규한 균주종인 것으로 판단되며, 이 미생물이 야꾸시마에서 수집된 토양으로부터 분리되었다는 점을 고려하여 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 야꾸시마엔시스 subsp. nov.(Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis subsp. nov.)로 명명 되었다.
FR-900523 물질의 제조
본 발명의 신규한 FR-900523 물질은 스트렙토마이세스속에 속하는 FR-900523 물질-생성균주(예 : 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 야꾸시마엔시스 7238, FERM BP-928)를 영양 배지중에서 배양함으로써 제조할 수 있다.
일반적으로 FR-900523 물질은 FR-900523 물질-생성균주를 동화성탄소 및 질소 공급원을 함유하는 수성 영양 배지중에서, 바람직하게는 호기적 조건하(예 : 진탄배양, 심부배양 등)에 배양하여 제조할 수 있다.
영양 배지중의 바람직한 탄소공급원은 글루코스, 슈크로스, 락토스, 글리세린, 전분, 덱스트린 등과 같은 탄수화물이다. 그밖의 다른 탄소공급원으로는 말토스, D-트레할로스, 이노시톨, 이눌린, 살리신 등이 포함할 수 있다.
바람직한 질소공급원은 이스트추출물, 펩톤, 글루텐 밀, 면실 밀, 대두 밀, 옥수수침지액, 건조이스트, 소맥배아, 페더 밀, 땅콩분말 등이며, 또한 암모늄염(예 : 질소암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄 등), 우레아, 아미조산 등과같은 유기 또는 무기질소 화합물이다.
탄소 및 질소공급원은 배합하여 사용하는 것이 바람직하나, 미량의 증식인자 및 상당량의 광물질 영양물을 함유하는 덜 순수한 물질이 또한 사용하기에 적합하기 때문에, 이들 공급원을 순수형태로 사용할 필요는 없다. 필요하다면, 탄산나트륨 또는 탄산칼슘, 인산나트륨 또는 인산칼륨, 염화나트륨 또는 염화칼륨, 요오드화나트륨 또는 요오드화칼륨, 마그네슘염, 구리염, 코발트염 등과같은 무기염을 배지에 가할 수도 있다. 필요에 따라, 특히 배지가 기포를 심하게 생성할때에는 액체파라핀, 지방오일, 식물류, 광유 또는 실리콘과 같은 소포제를 첨가할 수도 있다.
FR-900523 물질을 대량 제조하는 조건으로는 심부 호기적 배양조건이 바람직하다. 소량제조를 위해서는, 플라스크 또는 병중에서의 진탕배양 또는 표면배양이 사용된다. 또한, 증식을 대규모 탱크중에서 수행하는 경우에는, FR-900523 물질의 제조과정중에 증식의 지체를 막기 위하여 제조탱크에서의 접종에 증식형의 미생물을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 우선 비교적 소량의 배양 배지를 미생물의 포자 또는 균사체로 접종하고, 접종 배지를 배양함으로써 미생물의 증식성 접종물이 제조한 후, 배양된 증식성 접종물을 대규모 탱크에 무균적으로 전이시키는 것이 바람직하다. 증식성 접종물이 생성되는 배지는 FR-900523 물질의 생산에 이용되는 배지와 실질적으로 동일하거나 상이하다.
배양 혼합물의 교반 및 통기는 여러 가지 방법으로 행해질 수 있다. 교반은 프로펠러 또는 유사한 기계적 교반장치를 사용하거나, 발효기를 회전 또는 진탕시키거나, 다양한 펌핑장치를 사용하거나, 또는 배지에 멸균공기를 통과시킴으로서 제공될 수 있다. 통기는 발효 혼합물에 멸균공기를 통과시켜 수행할 수 있다.
발효는 일반적으로 약 20 내지 40℃, 바람직하게는 25 내지 35℃에서 약 50 내지 150시간 동안 수행하며, 이러한 조건들은 발효조건 및 규모에 따라서 변할 수 있다.
이렇게 생성된 FR-900523 물질은 그 밖의 다른 공지된 생물학적 활성물질의 회수에 일반적으로 사용되는 통상적인 방법에 의해 배지로부터 회수할 수 있다.
생성된 FR-900523 물질은 배양된 균사체 중에서 주로 발견되며, 따라서, FR-900523 물질은 배양육즙을 여과시키거나 원심분리하여 수득한 균사체로부터 감압하에서의 농축, 동결건조, 통상의 용매에 의한 추출, pH조절, 통상의 수지(예 :음이온 또는 양이온 교환수지, 비이온성 흡착수지)에 의한 처리, 통상의 흡착제(예 : 활성목탄, 규탄, 실리카겔, 셀룰로즈, 알루미나 등)에 의한 처리, 결정화, 재결정화 등과같은 통상의 방법에 의해 분리 및 정제할 수 있다.
특히, FR-900523 물질은, 발효에 의해 생성된 생성물을 함유하는 물질을 에텔아세테이트, n-헥산 등과 같은 적합한 용매중에 용해시키고, 이용액을 예를들어 칼럼중의 실리카겔상에서 에틸아세테이트 및 n-헥산 또는 그의 혼합물과 같은 적합한 유기용매를 사용하여 크로마토그래피시킴으로써 분리할 수 있다. 이렇게 하여 분리된 FR-900523 물질은 통상적인 방법, 예를들어 재결정, 재크로마토그래피, HPLC 등과같은 방법에 의해 추가로 정제할 수 있다.
FR-900523 물질의 물리적 및 화학적 특성
(1) 형태 및 색상
무색 침상결정
(2) 원소 분석(%) :
C ; 64.57%, H ; 8.84%, N ; 1.81%
(3) 정색 반응 :
양성 : 황산세륨반응, 황산반응, 에르리히(Ehrlich)반응, 드라겐도르프(Dragendorff) 반응 및 요오드 중기반응
음성 : 염화 제 2 철반응, 닌히드린 반응 및 몰리쉬(Molish)반응
(4) 용해도 :
가용 : 메탄올, 에탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디에틸에테르 및 벤젠
약간용해 : n-헥산 및 석유에테르
불용 : 물
(5) 융점 :
152 내지 154℃
(6) 비선광도 :
Figure kpo00028
: -73.0°(c=0.65, CHCl3)
(7) 자외선 흡수 스펙트럼 :
말단 흡수
(8) 적외선 흡수 스펙트럼
Figure kpo00029
:3670,3580,3510,2930,2875,2825,1745,1722,1700,1647,1450,1380,1350,1330,1307,1285,1170,1135,1090,1050,1030,1000,990,978,960,930,915,888,870,850cm-1
(9)13C 핵자기 공명 스펙트럼 :
Figure kpo00030
이 챠트는 제7도에 나타내었다.
(10)1H 핵자기 공명 스펙트럼 :
이 챠트는 제8도에 나타내었다.
(11) 박층 크로마토그래피 :
Figure kpo00031
(12) 물질의 특성 : 중성물질
FR-900523 물질에 대해,13C 및1H 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하면, 이 물질은 여러 화학적 쉬프트에서 시그날의 쌍들을 나타내지만, 박층 크로마토그래피 및 HPLC의 측정시에는, FR-900523 물질은 박층 크로마토그래피에서는 단일반점 및 HPLC에서 단일 피크를 각각 나타내었다.
상기의 물리적 및 화학적 특성과 FR-900506 물질의 화학구조 결정의 성공으로부터, FR-900523 물질은 다음의 화학구조를 갖는 것으로 결정 내릴 수 있다.
Figure kpo00032
1,14-디하이드록시-12-[2-(4-하이드록시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-23,25-디메톡시-13,19,17,21,27-펜타메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로-[22.3.1.04.9]-옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온
[Ⅱ합성방법]
(1) 방법 1 : (하이드록시-보호기의 도입)
화합물(Ib)는 하이드록시-보호기를 화합물(Ia)에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.
이 반응에 사용되는 하이드록시-보호기의 적합한 도입제는 디(저급)알킬설폭사이드, 예를들어 저급알킬메틸 설폭사이드(예 : 디메틸 설폭사이드, 에틸 메틸 설폭사이드, 프로필 메틸 설폭사이드, 이소프로필 메틸 설폭사이드, 부틸 메틸 설폭사이드, 이소부틸 메틸 설폭사이드, 헥실 메틸 설폭사이드 등), 트리(저급)알킬실릴할라이드(예 : 트리메틸실린 클로라이드, 트리에틸실린 브로마이드, 트리부틸실린 클로라이드, t-부틸-디메틸실린 클로라이드 등), 저급알킬-디아릴실릴 할라이드(예 : 메틸-디페닐실릴 클로라이드, 에틸-디페닐실릴 브로마이드,프로필-디톨릴실릴 클로라이드, t-부틸-디페닐실린 클로라이드 등)과 같은 삼치환된 실릴화합물, 및 카복실산, 설폰산 및 그의 반응성 유도체, 예를들어 산할라이드, 산무수물, 활성화 아마이드, 활성화 에스테르 등과같이 전술한 아실기를 도입할 수 있는 아실화제와 같은 통상적인 것일 수 있다.
이러한 반응성 유도체의 바람직한 예로는 산 클로라이드, 산 브로마이드, 치환된 인산(예 : 디알킬인산, 페닐인산, 디페닐인산, 디벤질인산, 할로겐화 인산 등), 디알킬아인산, 아황산, 티오황산, 황산, 알킬카보네이트(예 : 메틸 카보네이트, 에틸 카보네이트, 프로필 카보네이트 등), 지방족 카복실산(예 : 피발산, 펜탄산, 이소펜탄산, 2-에틸부티르산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산 등), 방향족 카복실산(예 : 벤조산 등) 등과같은 산과의 혼합산무수물, 대칭성 산무수물, 이마다졸, 4-치환 이미디졸, 디메틸피라졸, 트리아졸 및 테트라졸과 같은 이미노 작용기를 함유하는 헤테로사이클릭 화합물과의 활성화 산 아마이드, 활성화 에스테르(예 : p-니트로페닐 에스테르, 2,4-디니트로페닐 에스테르, 트리클로로페닐 에스테르, 펜타클로로페닐 에스테르, 메실페닐 에스테르, 페닐아조페닐 에스테르, 페닐 티오에스테르, p-니트로 페닐 티오에스테르, p-크레실 티오에스테르, 카복시메틸티오에스테르, 피리딜에스테르, 피페리디닐 에스테르, 8-퀴놀릴 티오에스테르, 또는 N,N-디메틸하이드록실아민, 1-하이드록시-2-(1H)-피리돈, N-하이드록시석신이미드, N-하이드록시프탈이미드, 1-하이드록시벤조트리아졸, 1-하이드록시-6-클롤로벤조트리아졸 등과 같은 N-하이드록시 화합물과의 에스테르)등이 포함될 수 있다.
이 반응에서, 디(저급)알킬 설폭사이드가 하이드록시-보호기의 도입제로 사용되는 경우에, 반응은 일반적으로 아세트산 무수물과 같은 저급알칸산 무수물의 존재하에서 수행한다.
또한, 삼치환된 실릴 화합물을 하이드록시-보호기의 도입제로 사용하는 경우에는, 반응은 이미다졸 등과 같은 통상적인 축합제의 존재하에서 수행하는 것이 바람직하다.
또한 그 밖에, 아실화제를 하이드록시-보호기의 도입제로 사용하는 경우에는, 반응은 알카리금속(예 : 리튬,나트륨,칼륨 등), 알카리토금속(예 : 칼슘 등), 알카리금속 수소화물(예 : 수소화나트륨 등), 알카리토금속 수소화물(예 : 수소화칼륨 등), 알카리금속 수산화물(예 : 수산화나트륨, 수산화 칼륨 등), 알카리금속탄산염(예 : 탄산나트륨, 탄산칼륨 등), 알카리금속 중탄산염(예 : 중탄산나트륨, 중탄산 칼륨 등), 알카리금속알콕사이드(예 : 나트륨메톡사이드, 나트륨에톡사이드, 칼륨 t-부톡사이드 등), 알카리금속알칸산(예 : 나트륨아세테이트 등), 트리알킬아민(예 : 트리에틸아민 등), 피리딘 화합물(예 : 피리딘,루티딘, 피콜린, 4-N,N-디메틸아미노피리딘 등), 퀴놀린 등과같은 유기 또는 무기염기의 존재하에 수행하는 것이 바람직하다.
상기 반응에서 아실화제를 유리형태 또는 그의 염 형태로 사용하는 경우에, 반응은 다음과 같은 통상적인 축합제의 존재하에서 수행하는 것이 바람직하다: 카보디이미드 화합물[예 : N,N′-디사이클로헥실카보디이미드, N-사이클로헥실-N′-(4-디에틸아미노사이클로헥실)카보디이미드, N,N′-디에틸카보디이미드, N,N′-디이소프로필카보디이미드, N-에틸-N′-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 등], 커텐이민 화합물[예 : N,N′-카보닐비스(2-메틸이미다졸), 펜타메틸렌케텐-N-사이클로헥실이민, 디페닐케텐-N-사이클로헥실이민 등], 올레핀 또는 아세틸렌 에테르 화합물(예 : 에톡시아세틸렌, β-사이클로비닐에틸에테르), N-하이드록시벤조트리아졸 유도체의 설폰산 에스테르[예 : 1-(4-클로로벤젠설포닐옥시)-6-클로로-1H-벤조트리아졸 등] 등.
반응은 일반적으로 물, 아세톤, 디클로로메탄, 알콜(예 : 메탄올, 에탄올 등), 테트라하이드로푸란, 피리딘, N,N-디메틸포름아미드 등 또는 그의 혼합물과 같은 반응에 나쁜 영향을 주지않는 통상적인 용매중에서 수행하며, 또한 염기 또는 하이드록시-보호기의 도입제가 액체인 경우에는 이것을 또한 용매로 사용할 수 있다.
반응 온도는 중요하지 않으며, 반응은 일반적으로 냉각 내지 가열하에서 수행된다.
이러한 방법은 반응동안에 화합물(Ia)의 R2에 대한 하이드록시 목적 화합물(Ib)에서의 상응하는 보호된 하이드록시기로 전환되는 경우를 포함한다.
또한, 이 방법은 그 범위내에 디(저급)알킬설폭사이드가 저급알칼산 무수물의 존대하에서 하이드록시-보호기의 도입제로 사용되는 경우에,
일반식
Figure kpo00033
의 부분구조를 가지는 화합물(Ia) (여기에서 R2는 하이드록시기이다)가 반응중에 때때로 산화되어 일반식
Figure kpo00034
의 부분 구조를 가지는 화합물(Ib) (여기에서 R2는 하이드록시기이다)를 생성시킬 수 있는 벙법을 포함한다.
(2) 방법 2 : (하이드록시-보호기의 도입)
화합물(Id)는 화합물(Ic)에 하이드록시-보호기를 도입시킴으로써 제조할 수 있다.
반응은 실질적으로 방법 1과 동일하게 수행될 수 있으며, 따라서, 반응조건(예를들어 염기, 축합제, 용매, 반응온도 등)은 방법 1의 것을 참조한다.
이 방법은 그 범위내에, 반응과정중에 화합물(Ic)의 R1에 대한 하이드록시기가 때때로 목적 화합물 (Id)중의 상응하는 보호된 하이드록시기로 전환될 수 있는 과정을 포함한다.
(3) 방법 3 : (이중결합의 형성)
화합물(If)는 화합물(Ie)를 염기화 반응시켜 제조할 수 있다. 이 반응에 사용되는 적합한 염기에는 방법 1에 예시된 것이 포함될 수 있다.
이 반응은 또한 R2가 하이드록시인 화합물(Ie)를 염기의 존재하에서 아실화제와 반응시킴으로써 수행할 수도 있다.
반응은 일반적으로 물, 아세톤, 디클로로메탄, 알콜(예 : 메탄올, 에탄올, 프로판올 등), 테트라하이드로푸란, 피리딘, N,N-디메틸포름아미드 등, 또는 그의 혼합물과 같이 반응에 나쁜 영향을 주지 않는 통상의 용매중에서 수행하며, 또한 염기가 액체인 경우에는 이것을 용매로 사용할 수도 있다.
반응 온도는 중요하지 않으며, 반응은 일반적으로 냉각 내지 가열하에 수행된다.
(4) 방법 4 : (하이드록시에틸렌기의 신화)
화합물(Ih)는 화합물(Ig)를 산화시켜 제조할 수 있다.
이 반응에 사용되는 산화제는 방법 1에 제시된 것과 같은 디(저급)알킬설폭사이드가 포함될 수 있다.
이 반응은 일반적으로 아세트산무수물과 같은 저급알칼산 무수술의 존재하에 아세톤, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 테트라하이드로푸란, 피리닌, N,N-디메틸포름아마이드 등 또는 그의 혼합물과 같이 반응에 나쁜 영향을 주지않는 통상의 용매중에서 수행하며, 저급알칼산 무수물이 액체인 경우에는 이를 또한 용매로 사용할 수 있다.
반응온도는 중요하지 않으며, 반응은 일반적으로 냉각 내지 가열하에서 수행된다.
이 방법은 그 범위내에, 반응과정중에 출발 화합물(Ig)의 R1에 대한 하이드록시기가 때때로 목적 화합물(Ih)중의 1-(저급알킬티오) (저급)알킬옥시기로 전환될 수도 있는 과정을 포함한다.
(5)방법 5 : (알릴기의 환원)
화합물(Ij)는 화합물(Ii)를 환원시킴으로써 수득할 수 있다.
이 방법에서 환원은 촉매적 환원 등과 같은, 알릴기를 프로필기로 환원시킬 수 있는 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다.
촉매적 환원에 사용되는 적합한 촉매에는 백금촉매(예 : 백금 플레이트, 스폰지상 백금, 백금블랙, 콜로이드상 백금, 산화백금, 백금망 등), 팔라듐 촉매(예 : 스폰지상 팔라듐, 팔라듐블랙, 산화팔라듐, 탄소상 팔라듐, 콜로이드상 팔라듐, 황산바륨상 팔라듐, 탄산바륨산 팔라듐 등), 니켈 촉매(예 : 화원니켈, 산화니켈, 라니니켈 등),코발트 촉매)예 : 환원 코발트, 라니코발트 등), 철 촉매(예 : 환원 철, 라니 철 등), 구리 촉매(예 : 환원 구리, 라니 구리, 울만(Ullman)구리 등)등과같은 통상적인 촉매가 포함된다.
환원반응은 일반적으로 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 피리딘, 에틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드, 디클로로메탄 또는 이들의 혼합물과 같이 반응에 나쁜 영향을 주지않는 통상적인 용매중에서 수행한다.
이 환원 반응의 반응온도는 중요하지 않으며, 반응은 일반적으로 냉각 내지 가온하에 수행된다.
상기에 설명된 합성방법 1 내지 5에 따라 수득된 목적 트리사이클로 화합물(I)은 통상적인 방법으로, 예를들어 추출, 침전, 분별 결정화, 재결정화, 크로마토그래피 등의 방법에 따라 분리 및 정제할 수 있다.
화합물(I) 및 (Ib) 내지 (Ij)의 적합한 염에는 약제학적으로 허용되는 염, 예를들어 알카리금속염(예 : 나트륨염, 칼륨염)등, 알카리토금속염(예 : 칼슘염, 마그네슘염 등), 암모늄염, 아민염(예 : 트리에틸아민염, N-벤질-N-메틸아민염 등) 및 그 밖의 다른 통상적인 유기염과 같은 염기성 염이 포함될 수 있다.
전술한 합성방법 1 내지 5에서의 반응 또는 그 반응혼합물의 후처리에 있어서, 출발물질 및 목적 화합물의 비대칭 탄소원자(들) 또는 이중결합(들)에 기인한 컨포머 및/또는 입체이성체(들)는 때때로 다른 컨포머 및/또는 입체이성체(들)로 전환될 수 있음을 주목해야 하며, 이러한 경우도 또한 본 발명의 범위내에 포함된다.
본발명의 트리사이클로 화합물(I)은 면역억제활성, 항균활성 등과같은 약리학적 활성을 가지며, 따라서 심장, 신장, 간, 골수, 피부등과 같은 기관 또는 조직의 이식에 대한 거부반응, 골수 이식에 의힌 이식편대 숙주질환, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 하시모드(Hashimoto) 갑상선염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 타잎 I 당뇨병, 포도막염 등과같은 자가면역질환 및 병원성 미생물에 의한 감염성질환 등의 치료 및 예방에 유용하다.
이러한 약리학적 활성을 입증하는 예로서, 트리사이클로 화합물의 몇가지 약리학적 실험 데이타를 다음에 예시한다.
실험 1
시험관내 림프구 혼합배양 반응(Mixed Lymphocyte Reaction : MLR)에서의 트리사이클로 화합물 ( I )의 억제
MLR 시험은 각 웰이 5×105C57BL/6 응답세포(responder cell) (H-2b), 10% 송아지 태자 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 0.2ml 5×105미토마이신 C 처리된(37℃에서 미토마이신 C 25㎍/ml로 30분 동안 처리하고 RPMI 1640 배지로 3회세척) BALB/C 자극(stimulator) 세포(H-2d), 2mM의 중산나트륨, 페니실린(50단위/ml) 및 스트렙토마이신(50㎍/ml)를 함유하는 마이크로타이터(microtiter) 플레이트중에서 수행한다. 세포를 37℃에서 이산화탄소 5% 및 공기 95%의 습한 대기중에서 68시간 동안 배양하고3H-티미딘(0.5μCi)으로 간헐적으로 처리한다음 4시간후에 세포를 수집한다.
본 발명의 목적 화합물을 에탄올에 용해시키고 RPMI 1640 배지로 추가로 희석한 후 배양물에 가하여 최종 농도가 0.1㎍/ml 이하로 되도록 만든다.
결과를 표7 내지 9에 나타내었다. 본 발명의 트리사이클로 화합물은 마우스 MLR을 억제하였다.
[표 7] : MLR에 대한 FR-900506 물질의 효과
Figure kpo00035
[표 8] : MLR에대한 FR-900523 물질의 효과
Figure kpo00036
[표 9] : MLR에 대한 FR-900525 물질의 효과
Figure kpo00037
트리사이클로 화합물( I )의 항균 활성
여러 진균류에 대한 트리사이클로 화합물( I )의 항균 활성은 사보라우드(Sabouraud) 한천중에서 한천계열 희석법에 의해 측정한다. 최소억제농도(MIC)는 30℃에서 24시간동안 배양한 후 ㎍/ml단위로 나타낸다.
본 발명의 트리사이클로 화합물은 하기 표10 및 11에 나타낸 바와같이, 예를들어 아스페르길루스 후미가투스(Aspergillus fumigatus) LFO 5840 및 후사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) IFO 5942와 같은 진균류에 대하여 항균 활성을 나타낸다.
[표 10] : 아스페르길루스 후미가투스 IFO 5840에 대한 트리사이클로 화합물( I )의 MIC값(ug/ml)
Figure kpo00038
[표 11]
Figure kpo00039
랫트에서 피부 동종 이식 생존(Skin Allograft Survival)에 대한 트리사이클로 화합물( I )의 효과
공여 랫트(Fischer)에서 얻은 벤탈(Vental) 동종 이식편을 수여랫트(WKA)의 흉곽 측부에 이식한다. 드레싱은 5일째 되는날 제거한다. 이식부위는 이식피부의 90% 이상이 괴사되는 것으로 정의되는 거부반응이 나타날때까지 매일 관찰한다.
FR-900506 물질을 올리브유에 용해시켜 이식일로부터 시작하여 14일간 연속적으로 근육내 주사한다.
표 12에서 보는 바와같이, 올리브유만을 14일간 연속적으로 근육 주사하여 처리한 랫트에서는 8일 이내에 모든 피부 동종 이식에 대해 거부 반응이 나타났으나, FR-900506 물질로 매일 처리한 것은 명백히 피부동종 이식 생존을 연장시켰다.
[표 12] : 피부 동종 이식 생존에 대한 FR-900506 물질의 효과
Figure kpo00040
실험 4
랫트에서 타잎 II콜라겐-유발 관절염에 대한 트리사이클로 화합물( I )의 효과
콜라겐을 0.01M 냉 아세트산에 2mg/ml의 농도로 용해시킨다. 용액을 동용적의 불완전 프로인트 보조제(incomplete Freund's adjuvant)중에 유화시킨다. 총 용적 0.5ml의 냉 에멀젼을 암컷 루이스(Lewis) 랫트의 등의 여러부위 및 꼬리의 한 두 부위에 파하 주사한다. FR-900506 물질은 올리브유에 용해시키고 경구 투여한다. 동량의 타잎 II 콜라겐으로 면역시킨 대조용 랫트에는 올리브유 만을 경구 투여한다. 관절염의 발생도를 관찰한다.
실험 결과는 표 13에 나타내었다. 염증의 다발성 관절염은 타잎 II 콜라겐 면역일로부터 14일간 올리브유를 투여한 모든 랫트에서 유발되었다.
FR-900506 물질로 14일동안 매일 치료하게 되면 3주간의 관찰 기간동안 관절염 유발이 완전히 억제된다.
[표 13] : 랫트에서 타잎 II 콜라겐-유발된 관절염에 대한 FR-900506 물질의 효과
Figure kpo00041
실험 5
SJL/J 마우스에서 실험적 알러지성 뇌척수염(Experimental Allergic Encephalomyelitis : EAE)에 대한 트리사이클로 화합물( I )의 효과
SJL/J 마우스로부터 척수 균질물을 제조한다. 취입에 의해 척수를 뽑아내고 대략 동용적의 물과 혼합한후 4℃에서 균질화시킨다. 동용적의 냉 균질물(10mg/ml)을 0.6mg/ml의 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37RA를 함유하는 완전 프로인트 보보제(CFA)로 유화시킨다.
0.2ml의 척수-CFA 에멀젼을 0 및 13일째에 SJL/J 마우스에 2회 주사하여 EAE를 유발시킨다. 이 시험에 사용된 모든 마우스에 대하여 매일 EAE의 임상적 증상을 평가하여 기록한다.
EAE의 중증도는 다음의 기준에 따라 기록한다:
등급 1-꼬리 강도의 저하 : 등급 2-비틀거리는 걸음걸이 : 등급 3-하나 이상의 갈비뼈의 약화 : 등급 4-하반신 불수 또는 반신불수.
FR-900506 물질을 올리브유에 용해시켜 0일째(최초면역일)부터 19일간 경구 투여한다. 표 14에서 보는 바와같이, FR-900506 물질은 EAE의 임상적 증상의 진전을 명백히 억제한다.
[표 14] : SJL/J 마우스에서 실험적 알러지성 뇌척수염에 대한 FR-900506 물질의 효과
Figure kpo00042
실험 6
마우스에서 국소적 이식편대숙주 반응(GvHR)에 대한 트리사이클로 화합물( I )의 효과
C 57 BL/6 공여자로부터 얻은 생존 비장세포(1×107세포)를 BDF1마우스의 오른쪽 뒷발바닥에 피하주사하여 국소적 GvHR을 유발시킨다. 마우스를 7일 후에 죽이고 오른쪽(주사한 발)과 왼쪽(주사하지 않은발)의 슬와부 림프절(PLN)의 무게를 단다. GvHR은 오른쪽과 왼쪽 PLN과의 무게 차이로서 나타낸다.
FR-900506 물질은 올리브유에 용해시키고 감작일로부터 5일간 경구 투여한다.
국소적 이식편대숙주 반응을 예방하는 FR-900506 물질의 ED50값은 19mg/kg이다.
실험 7
트리사이클로 화합물( I )의 급성 독성
ddY 마우스에 FR-900506, FR-900523 및 FR-900525 물질을 복강내 주사하여 급성 독성에 대한 시험을 수행하였으며, 그 결과 100mg/kg의 투여용량에서 각 경우에 사망한 예는 없었다.
본 발명의 약제학적 조성물은 활성 성분으로서 본 발명의 트리사이클로 화합물( I )을 외용, 내용 또는 비경구 투여에 적합한 유기 또는 무기담체 또는 부형제와 혼합물 상태로 함유하는 약제학적 제제의 형태, 예를들어 고체, 반도체 또는 액체형태로 사용될 수 있다. 활성 성분은 예를들어 정제, 펠렛, 캅셀제, 좌제, 용액제, 유제, 현탄제 및 사용하기에 적합한 그 밖의 다른 형태의 제제에 사용되는 일반적인 약제학적으로 허용되는 비독성 담체와 배합될 수 있다. 사용될 수 있는 담체로는 물, 글루코스, 락토스, 아라비아 고무, 젤라틴, 만니톨, 전분 페이스트, 마그네슘 트리실리케이트, 활석, 옥수수 전분, 케라틴, 콜로이드상 실리카, 감자전분, 우레아 및 고체, 반고체 또는 액체형태의 제제를 제조하는데 사용하기에 적합한 그 밖의 다른 담체가 있으며, 그 외에도 보조제, 안정제, 농후제 및 착색제 및 향로가 사용될 수도 있다. 활성 목적 화합물은 질병의 진행 정도 또는 상태에 따라 목적하는 효과를 제공하기에 충분한 양으로 약제학적 조성물중에 함유한다.
이 조성물을 인체에 적용하는 경우에, 비경구 또는 장내 투여하는 것이 바람직하다. 트리사이클로 화합물( I )의 치료학적으로 유효한 용량은 치료되는 각 환자의 연령 및 상태에 따라 달라지며, 활성성분 약 0.01 내지 1000mg, 바람직하게는 0.1 내지 500mg 및 더욱 바람직하게는 0.5 내지 100mg의 1일 용량이 질환을 치료하기 위해 일반적으로 제시되고, 일반적으로 약 0.5mg, 1mg, 5mg, 10mg, 50mg, 100mg, 250mg 및 500mg의 평균 1회 용량이 일반적으로 투여한다.
다음의 실시에는 본 발명을 설명할 목적으로 주어진 것이다.
[실시예 1]
스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 9993(KFCC-10192)의 분리
스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 9993은이하에 기술된 평판희석 기술에 의헤 분리된다.
일본의 이바라끼껭 쯔꾸바군 도요사또쪼에서 수집한 토양 약 1kg을 멸균 시험관에 넣고 5ml의 용적이 되도록 멸균수를 가한다. 그후 혼합물을 튜브 부져(tube duzzer)에 의해 10초 동안 혼합하고 10분간 정치시킨다. 상등액을 멸균수로 100배까지 연속 희석한다. 희석용액(0.1ml)를 페트리 접시내의, 티아민 하이드로클로라이드를 보강한 자페크(Czapk) 한천(사카로스 30g, 질산나트륨 3g, 인산이칼륨 1g, 황산마그네슘0.5g, 염화칼륨 0.5g, 황산 제 1 철0.01g, 티아민 하이드로클로라이드 0.1g, 한천 20g, 수돗물 1000ml ; pH 7.2)상에 산포 시킨다. 30℃에서 21일간 배양한후 플레이트상에 성장한 증식 콜로니를 사면 배지[이스트-맥아 추출물 한천(ISP-배지 2)]에 옮기고, 30℃에서 10일간 배양한다. 분리된 콜로니중에서스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 9993(KFCC-10192)이 발견된다.
[발 효]
글리세린(1%), 가용성전분(1%), 글루코스(0.5%), 면실 밀(0.5%), 건조 이스트(0.5%), 옥수수침지액(0.5%) 및 탄산칼슘(0.2%)를 함유하는 배양 배지(160ml)(pH 6.5로 조절됨)를 20개의 500ml 에렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 각각에 붓고 120℃에서 30초동안 멸균시킨다. 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 9993인 FERM BP-927의 사면 배양물 1루프를 각 배지에 접종하고 30℃에서 4일동안 회전 진탕기상에서 배양한다. 생성된 배양액을 120℃에서 20일동안 미리 멸균시킨 200ℓ 자(jar)-발효기중의 가용성전분(4.5%), 옥수수침지액(1%), 건조 이스트(1%), 탄산칼슘(0.1%) 및 아데카놀(Adekanol ; 소포제, 상표명, 제조원 : Asahi Denka Co.)(0.1%)을 함유하는 배지(150ℓ)에 접종한 후 150ℓ/분의 통기 및 250rpm의 교반하에 30℃에서 4일동안 배양한다.
[분리 및 정제]
이렇게 수득된 배양 육즙을 규조토(5kg)를 사용하여 여과한다. 균사체 케이크(cake)를 메탄올(50ℓ)로 추출하여 추출액 50ℓ를 수득한다. 균사체로 부터의 메탄올 추출물과 여액을 합하여 비이온성 흡착수지 다이아이온 HP-20(Diaion HP-20)(상품명 ; Mitsubishi Chemical Industries Ltd. 제조))(10ℓ)의 칼럼에 통과시킨다. 물(30ℓ) 및 수성메탄올(30ℓ)로 세척한 후 메탄올로 용출시킨다. 용출액을 감압하에 증발시켜 잔류하는 물(2ℓ)을 얻는다. 이 잔류물을 에틸아세테이트(2ℓ)로 추출한다. 에틸아세테이트 추출물을 감압하에 농축하여 오일상 잔류물을 수득한다. 오일상 잔류물을 2배의 중량의 산성 실리카겔(특제 실리카겔 12등급, Fuji Devison Co. 제조)과 혼합하고 혼합물을 에틸아세테이트중에서 슬러리화 한다. 용매를 증발시킨후, 생성된 건조 분말을 n-헥산으로 충진시킨 동일한 산성실리카겔 (800mℓ)상에서 칼럼 크로마토그래피 한다. 칼럼은 n-헥산(3ℓ), n-헥산과 에틸아세테이트의 혼합물(9 : 1v/v, 3ℓ 및 4 : 1v/v, 3ℓ ) 및 에틸아세테이트(3ℓ)로 전개시킨다. 목적 화합물을 함유하는 분획을 수집하고 감압하에 농축시켜 오일상 잔류물을 수득한다 오일상 잔류물을 n-헥산과 에틸아세테이트의 혼합물(1 : 1v/v, 30ml)에 용해시키고 동일 용매 시스템으로 충진시킨 실리카겔(Merck Co., Ltd. 제조, 230-400 메쉬) (500ml)상에서 칼럼 크로마토그래피한다.
용출은 n-헥산 및 에틸아세테이트(1 : 1v/v, 2ℓ 및 1 : 2v/v, 1.5ℓ)의 혼합물로 수행한다. 제 1 목적 화합물을 함유하는 분획을 수집하고 감압하에 농축하여 황색 오일을 얻는다. 오일상 잔류물을 2배의 중량의 산성 실리카겔과 혼합하고 이 혼합물을 에틸아세테이트중에 슬러리화 한다. 용매를 증발시킨 후, 생성된 건조 분말을 n-헥산에 의해 충진되고 전개되는 산성 실리카겔상에서 크로마토그래피한다. 목적 화합물을 함유하는 분획을 수집하고 감압하에 농축시켜 조 FR-900506 물질(1054mg)을 백색 분말의 형태로 수득한다.
이 조생성물 100mg을 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)시킨다. 용출은 담체로서 리크로소르브(Lichrosorb) SI 60(상품명, Merck Co., Ltd. 제품)을 사용한 칼럼(ψ×500mm)를 사용하여 수행한다.
이 크로마토그래피는 230nm에서 UV 검출기로 모니터하며, 이동상으로는 5ml/분의 유속으로 메틸렌클로라이드 및 디옥산의 혼합물(85 : 15v/v)을 사용하고, 활성 분획을 수집하여 증발시킨다. 고압 액체 크로마토그래피를 다시 반복수행하여 정제된 FR-900506 물질 14mg을 백색 분말로 수득한다.
또한, 용출을 에틸아세테이트(1.5ℓ)를 사용하여 계속적으로 수행하여, 제2의 목적 화합물을 함유하는 분획을 수집하고 감압하에서 농축시켜 조 FR-900525 물질(30mg)을 황색오일 형태로 수득한다.
[실시예 2]
[발효]
글리세린(1%), 옥수수전분(1%), 글루코스(0.5%), 면실 밀(1%), 옥수수침지액(0.5%), 건조 이스트(0.5%) 및 탄산칼슘(0.2%)를 함유하는 예비 배양배지(100ml)(ph 6.5)를 500ml의 에렌마디어 플라스크에 붓고 120℃에서 30분동안 멸균시킨다. 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 9993(KFCC-10192)의 사면 배양물 1루프를 배지에 접종하고 30℃에서 4일간 배양한다. 생성된 배양물을 120℃에서 30분동안 미리 멸균시킨 30ℓ 자-발효기 내의 동일한 예비 배양배지(20ℓ)에 옮긴다. 배양물을 30℃에서 2일간 배양하고, 이 예비배양물 16ℓ를 120℃에서 30분동안 미리 멸균시킨 2톤 탱크중의, 가용성전분(4.5%), 옥수수침지액(1%), 건조 이스트(1%), 탄산칼슘(0.1%) 및 아데카놀(소포제, 상품명, Asahi Denka Co. 제조)(0.1%)를 함유하는 발효 배지(1600ℓ)(ph 6.8)에 접종한 후, 30℃에서 4일간 배양한다.
[분리 및 정제]
이렇게하여 수득된 배양 육즙을 규조토(25kg)를 사용하여 여과한다. 균사체 케이크를 아세톤(500ℓ)으로 추출하여 추출몰 500ℓ를 얻는다. 균사체로부터 얻어진 아세톤 추출물 및 여액(1350ℓ)을 합하여 비이온성 흡착수지 다이아이온 HP-20(Diaion HP-20)(상품명, Mitsubishi Chemical Industries Ltd. 제조)(100ℓ)의 칼럼에 통과시킨다. 물(300ℓ) 및 50% 수성아세톤(300ℓ)으로 세척한 후, 용출을 75% 수성아세톤을 사용하여 수행한다. 용출액을 감압하에 증발시켜 잔류하는 물(300ℓ)을 얻는다. 이 잔류물을 에틸아세테이트(20ℓ)로 3회 추출한다. 에틸아세테이트 추출물을 감압하에 농축시켜 오일상 잔류물을 수득한다. 오일상 잔류물의 2배의 중량의 산성 실리카겔(특제 실리카겔 그레이드 12등급, Fuji Devison Co. 제품)과 혼합하고, 이 혼합물을 에틸아세테이트중에서 슬러리화 한다. 용매를 증발시킨후, 생성된 건조 분말을 n-헥산으로 충진시킨 동일한 산성 실리카겔(8ℓ)상에서 칼럼 크로마토그래피 한다. 이 칼럼을 n-헥산(30ℓ), n-헥산과 에틸아세테이트의 혼합물(4 : 1v/v, 30ℓ), 및 에틸아세테이트(30ℓ)로 전개시킨다. 목적 화합물을 함유하는 분획을 수집하고 감압하에 농축시켜 오일상 잔류물을 얻는다. 오일상 잔류물을 2배의 중량의 산성 실리카겔과 혼합하고, 이 혼합물을 에틸아세테이트중에서 슬러리화 한다. 용매를 증발시킨후, 생성된 건조 분말을 n-헥산으로 충진시킨 산성 실리카겔(3.5ℓ)상에서 재 크로마토그래피 한다. 칼럼을 n-헥산(10ℓ), n-헥산과 에틸아세테이트의 혼합물(4 : 1v/v, 10ℓ) 및 에틸아세테이트(10ℓ)로 전개시킨다. 목적 화합물을 함유하는 분획을 수집하고 감압에서 농축시켜 황색오일을 수득한다. 이 오일상 잔류물을 n-헥산 및 에틸아세테이트의 혼합물(1 : 1v/v, 300ml)에 용해시키고 동일 용매계로 충진시킨 실리카겔(Merck Co., Ltd. 제조, 230-400 메쉬)(2ℓ)상에서 칼럼 크로마토그래피 한다. 용출은 n-헥산과 에틸아세테이트의 혼합물(1 : 1v/v, 10ℓ 및 1 : 2v/v,6ℓ) 및 에틸아세테이트(6ℓ)를 사용하여 수행한다.
제 1 목적 화합물을 함유하는 분획을 수집하고 감압하에 농축하여 FR-900506 물질을 백색 분말 형태로 수득한다(34g). 이 백색 분말을 아세토니트릴에 용해시키고 농축시킨다. 이 농축물을 5℃에서 밤새 유지시켜 프리즘상 결정(22.7g)을 수득한다. 동일 용매로 재결정화시켜 정제된 FR-900506 물질(13.6g)을 무색 프리즘상 결정으로 수득한다.
또한, 제 2 목적 화합물을 함유하는 분획을 수집하고 감압하에 농축시켜 조 FR-900525 물질(314mg)을 황색 분말 형태로 수득한다.
[실시예 3]
[발효]
글리세린(1%), 옥수수전분(1%), 글루코스(0.5%), 면실 밀(1%),건조 이스트(0.5%), 옥수수침지액(0.5%), 및 탄산칼슘(0.2%)를 함유하는 배양배지(160ml)(pH 6.5로 조정된)를 10개의 500ml 에렌마이어 플라스크 각각에 도입시키고 120℃에서 30분동안 멸균시킨다. 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 9993(KFCC-10192)의 사면 배양물 1루프를 각 배지에 접종하고 30℃에서 4일동안 회전 진탕기상에서 배양한다. 생성된 배양물을 120℃에서 20분동안 미리 멸균시킨 200ℓ 자-발효기중의, 가용성 전분(5%), 땅콩분말(0.5%), 건조 이스트(0.5%), 글루텐 밀(0.5%), 탄산칼슘(0.1%) 및 아데카놀(소포제, 상품명, Asahi Denka Co. 제조)(0.1%)을 함유하는 배지(150ℓ)에 접종한 다음, 150ℓ/분의 통기 및 250rpm의 교반하에 30℃에서 4일동안 배양한다.
[분리 및 정제]
이렇게하여 수득된 배양 육즙을 규조토(5kg)를 사용하여 여과한다. 균사체 케이크를 아세톤(50ℓ)으로 추출하여 추출몰(50ℓ)을 수득한다. 균사체로 부터의 아세톤 추출물 및 여액(135ℓ)을 합하여 비이온성 흡착수지 다이아이온 HP-20(상품명 ; Mitsubishi Chemical Industries Ltd. 제조)(10ℓ)의 칼럼에 통과시킨다. 물(30ℓ) 및 50% 수성아세톤(30ℓ)으로 세척한 후, 75% 수성아세톤으로 용출시킨다. 용출액(30ℓ)을 감압하에 증발시켜 잔류하는 물(2ℓ)을 수득한다. 이 잔류물을 에틸아세테이트(2ℓ)로 3회 추출한다. 에틸아세테이트 추출물을 감압하에 농축시켜 오일상 잔류물을 수득한다. 오일상 잔류물을 2배의 중량의 산성실리카겔(특제 실리카겔 12등급, Fuji Devison Co. 제품)과 혼합하고, 이 혼합물을 에틸아세테이트중에 슬러리화한다. 용매를 증발시킨후, 생성된 건조 분말을 n-헥산으로 충진시킨 동일한 산성 실리카겔(800ml)상에서 칼럼 크로마토그래피 한다. 이 칼럼은 n-헥산(3ℓ), n-헥산과 에틸아세테이트의 혼합물(4 : 1v/v, 3ℓ) 및 에틸아세테이트(3ℓ)로 전개시킨다. 목적 화합물을 함유하는 분획을 수집하고 감압하에 농축시켜 오일상 잔류물을 수득한다. 오일상잔류물을 n-헥산 및 에틸아세테이트의 혼합물(1 : 1v/v, 30ml)에 용해시키고 동일 용매계로 충진시킨 실리카겔(Merck Co., Ltd. 제품, 230-400 메쉬) (500ml)상에서 칼럼 크로마토그래피한다. 용출은 n-헥산 및 에틸아세테이트의 혼합물(1 : 1v/v, 2ℓ 및 1 : 2v/v, 1.5ℓ) 및 에틸아세테이트(1.5ℓ)를 사용하여 수행한다.
제 1 목적 화합물을 함유하는 분획을 수집하고 감압하에 농축시켜 조 FR-900506 물질(3g)을 황색 분말형태로 얻는다.
또한, 제 2 목적 화합물을 함유하는 분획을 수집하고 감압하에 농축시켜 오일상 잔류물을 얻는다 이 오일상 잔류물을 실리카겔로 재 크로마토그래피하여 황색 오일을 얻는다. 이 오일상 잔류물을 2배의 중량의 산성 실리카겔과 혼합하고, 이 혼합물을 에틸아세테이트중에 슬러리화한다. 용매를 증발시킨후, 생성된 건조분말을 n-헥산에 의해 충진 및 전개되는 산성 실리카겔(100ml)상에서 크로마토그래피한다. 목적 화합물을 함유하는 분획을 수집하고 감압하에 농축하여 FR-900525 물질을 담황색 분말(380mg)형태로 수득한다. 이 분말은 n-헥산 및 에틸아세테이트의 혼합물(1 : 2v/v, 5ml)에 용해시키고 동일 용매계로 충진 및 세척된 산성 실리카겔(특제 실리카겔, 992 등급, Fuji Devison Co.제품)(100ml)상에서 칼럼 크로마토그래피한다. 용출은 에틸아세테이트를 사용하여 수행한다. 활성 분획을 수집하고 감압하에 증발시켜 정제된 FR-900525 물질(230mg)을 백색 분말의 형태로 수득한다.
[실시예 4]
스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 야꾸시마엔시스 7238(KFCC-10193)의 분리
스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 야꾸시마엔시스 7238(KFCC-10193)은 후술하는 바와같이 평판 희석 기술을 사용하여 분리한다.
일본국 가고시마껭 야꾸시마에서 수집한 약 1g의 토양을 멸균 시험관에 도입시키고 5ml의 용적이 되도록 멸균수를 가한다. 그후 혼합물을 튜브 부져에 의해 10초 동안 혼합하고 10분간 정치시킨다. 상등액을 멸균수로 100배 까지 연속 희석한다. 희석용액(0.1ml)을 페트리 접시내의, 티아민 하이드로클로라이드를 보강한 자페크 한천(사카로스 30g, 질산나트륨 3g, 인산이칼륨 1g, 황산마그네슘 0.5g, 염화칼륨 0.5g, 황산 제 1 철 0.01g, 티아민 하이드로클로라이드 0.1g, 한천 20g, 수돗물 1000ml ; pH 7.2)상에 산포시킨다. 30℃에서 21일간 배양한후 플레이트상에서 성장한 증식 콜로니를 사면 배지[이스트-맥아 추출물 한천(ISP-배지)]에 옮기고, 30℃에서 10일간 배양한다. 분리된 콜로니중에서, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 야꾸시마엔시스 7238(KFCC-10193)이 발견된다.
[발효]
글리세린(1%), 가용성전분(1%), 글루코스(0.5%), 면실 밀(0.5%), 건조 이스트(0.5%), 옥수수침지액(0.5%) 및 탄산칼슘(0.2%)를 함유하는 배양 배지(160ml)(pH6.5로 조성된)를 20개의 500ml 에렌마이어플라스크 각각에 도입시키고 120℃에서 30분 동안 멸균시킨다. 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 서브스페시스 야꾸시마엔시스 7238 FERM BP-928의 사면 배양물 1루프를 각 배지에 접종하고 30℃에서 4일동안 회전 진탕기상에서 배양한다. 생성된 배양물을 120℃에서 20분동안 미리 멸균시킨 200ℓ자-발효기중의 글루코스(4.5%), 옥수수침지액(1%), 건조 이스트(1%), 글루텐 밀(1%), 소맥배아(0.5%), 탄산칼슘(0.1%) 및 아데카놀(소포제, 상표명, Asahi Denka Co. 제품)(0.1%)을 함유하는 배지(150ℓ)에 접종하고 150ℓ/분의 통기 및 250rpm의 교반하에 30℃에서 4일동안 배양한다.
[분리 및 정제]
이렇게하여 수득한 배양 육즙을 규조토(5kg)를 사용하여 여과한다. 균사체 케이크를 아세톤(50ℓ)으로 추출하여 추출물 50ℓ를 수득한다. 균사체로 부터의 아세톤 추출물 및 여액(135ℓ)을 합하여 비이온성 흡착수지 다이아이온 HP-20(상품명 : Mitsubishi Chemical Industries Ltd. 제조)(10ℓ)의 칼럼에 통과시킨다. 물(30ℓ) 및 수성아세톤(30ℓ)으로 세척 한 후, 아세톤으로 용출시킨다. 용출액을 감압하에 증발시켜 잔류하는 물(2ℓ)을 수득한다. 이 잔류물을 에틸아세테이트(4ℓ)로 추출한다. 에틸아세테이트 추출물을 감압하에 농축하여 오일상 잔류물을 수득한다. 오일상 잔류물을 2배 중량의 산성 실리카겔(특제 실리카겔, 12등급, Fuji Devison Co. 제조)과 혼합하고, 이 혼합물을 에틸아세테이트중에 슬러리화한다. 용매를 증발시킨 후, 생성된 건조 분말을 n-헥산으로 충진시킨 동일한 산성 실리카겔(800ml)상에서 칼럼크로마토그래피 한다. 칼럼을 n-헥산(3ℓ), n-헥산과 에틸아세테이트의 혼합물(4 : 1 v/v, 3ℓ) 및 에틸아세테이트(3ℓ)로 전개시킨다. FR-900520 및 FR-900523 물질을 함유하는 분획을 수집하고 감압하에 농축시켜 오일상 잔류물을 수득한다. 오일상 잔류물을 n-헥산 및 에틸아세테이트의 혼합물(1 : 1v/v, 50ml)에 용해시키고 동일용매계의 의해 충진된 실리카겔(Merck Co., Ltd. 제품, 70-230 메쉬)(1000ml)상에서 칼럼크로마토그래피한다. 용출은 n-헥산과 에틸아세테이트의 혼합물(1 : 1 v/v, 3ℓ 및 1 : 2 v/v, 3ℓ) 및 에틸아세테이트 (3ℓ)를 사용하여 수행한다. 목적 화합물을 함유하는 분획을 수집하고 감압하에 농축시켜 황색 분말(4.5g)을 수득한다. 이 분말을 메탄올(200ml)에 용해시키고 물(10ml)과 혼합한다. 이 혼합물을 메탄올 및 물의 혼합물(4 : 1 v/v로 충진 및 전개되는 역상 실리카겔“YMC”(60-200 메쉬)(500ml)상에서 크로마토그래피한다.
FR-900525 물질을 함유하는 분획을 수집하고 감압하에 농축하여 FR-900525 물질의 조생성물(1.8g)을 담황색 분말 형태로 얻는다. 이 분말을 소량의 디에틸에테르에 용해시킨다. 이를 밤새 정치시킨 후, 침전된 결정을 여과하여 수집하고, 디에틸에테르로 세착한후 감악하게 건조시킨다. 디에틸에테르로 재결정화시켜 정제된 FR-900520 물질 600mg을 무색 판상 결정으로 수득한다.
동일한 용매제를 사용하여 역상 실리카겔 크로마토그래피를 수행하여, FR-900523 물질을 함유하는 후속 분확을 수집한 후 감압하에 농축시켜 FR-900523 물질의 조생성물(0.51g)을 담황색 분말형태로 수득한다. 이 조생성물을 아세토니트릴(3ml)에 용해시키고, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란 및 50mM 인산염 완충액(pH 2.0)의 혼합물(3 : 2 : 5, v/v)에 충진 및 전개되는 역상 실리카겔＂YMC＂(70ml)상에서 크로마토그래피한다. 목적 화합물을 함유하는 분획을 수집하고 에틸아세테이트로 추출한다. 이 추출물을 감압하에 농축시켜 황백색 분말(190mg)을 수득한다. 이 황백색 분말을 역상 실리카겔“YMC”상에서 재크로마토그래피하여 백색 분말(80mg)을 수득한다. 이 백색 분말을 소량의 디에틸에테르에 용해시키고 실온에서 밤새 정치시켜 결정 56mg을 수득한다. 디에틸에테르로 재결정화시켜 FR-900523 물질 34mg을 무색 침상결정 형태로 수득한다.
[실시예 5]
디클로로메탄(0.2ml)중의 FR-900506 물질(10.4mg)의 용액에 실온에서 피리딘(0.1ml) 및 아세트산 무수물(0.05ml)을 가하고, 혼합물을 5시간동안 교반한다. 반응 혼합물로부터 감압하에서 용매를 제거한다. 잔류물을 실리카겔 박층 크로마토그래피(전개 용매 : 디에틸에테르 및 디클로로메탄 1 : 2 v/v)하여 12-[2-(4-아세톡시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-17-알릴-1,14-디하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-데트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로-[22.3.1.04,6]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(6.0mg)을 수득한다.
IR υ (CHCl3) : 3520,1728,1750(sh),1640,1095cm-1
실시예 6
디클로로메탄(1ml)중의 FR-900506 물질(52.5mg)의 용액에 실온에서 피리딘(0.5ml) 및 아세트산 무수물(0.3ml)을 가하고, 혼합물을 실온에서 9시간동안 교반한다. 반응 혼합물로부터 감압하에서 용매를 제거한다. 잔류물을 실리카겔 박층 크로마토그래피(전개 용매 : 디에틸에테르 및 헥산, 3 : 1 v/v)하여 14-아세톡시- 12-[2-(4-아세톡시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-17-알릴-1-하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-데트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로-22.3.1.04.9]옥타코스-18-엔-2, 3, 10, 16-테트라온(48.0mg) 및 12-[2-(4-아세톡시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-1-메틸비닐]-17-알릴-1-하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로[22.3.1.04,9]옥타코사-14,18-디엔-2,3,10,16-테트라온(5.4mg)을 각각 수득한다.
전자 화합물
o IR υ (CHCl3) : 1730,1720(sh),1640cm-1
후자 화합물
o IR υ (CHCl3) : 1730,1690,1640,1627,cm-1
[실시예 7]
디클로메탄(0.2ml) 및 피리딘(0.1ml)중의 FR-900506 물질(9.7mg)의 용액에 실온에서 벤조일 클로라이드(50㎕)를 가하고, 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반한다. 반응 혼합물로부터 용매를 감압하에서 제거하여 조 오일을 수득한다. 이 조 오일을 실리카겔 박층 크로마토그래피(전개 용매 : 디에틸에테르 및 헥산, 2 : 1 v/v)해서 정제하여 17-알릴-12-[2-(4-벤조일옥시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-1,14-디하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로[22.3.1.04,9]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(8.0mg)을 수득한다.
o IR υ (CHCl3) : 3500,1735(sh),1710,1640,1600cm-1
[실시예 8]
피fl딘(1ml)중의 FR-900506 물질(30.5mg)의 용액에 p-니트로벤조일 클로라이드(약 100mg)를 가하고, 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반한다. 반응 혼합물을 에틸아세테이트로 희석하고, 포화 수성 중탄산나트륨, 물, 1N-염산, 물, 포화 수성중산나트륨, 물 및 수성 염화나트륨으로 연속해서 세척한 후 건조시킨다. 생성된 용액을 감압하에 농축시키고 잔류물을 실fl카겔상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 17-알릴-1,14-디하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-12-[2-[4-(p-니트로벤조일옥시)-3-메톡시사이클로헥실]-1-메틸비닐]-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로-[22.3.1.049]옥타코사-18-엔-2,3,10,16-테트라온(37.7mg)을 수득한다.
o IR υ(CHCl3) :1720,1640,1610,1530-1520cm-1
[실시예 9]
FR-900506 물질(30.6mg)을 피fl딘(0.5ml)중에서 3,5-디니트로벤조일 클로라이드(33mg)과 실시예 8과 유사한 방법에 따라 반응시켜 17-알릴-1,14-디하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-12-[2-[4-(3,5-디니트로벤조일옥시)-3-메톡시사이클로헥실]-1-메틸비닐]-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로-[22.3.1.04,9]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(36.0mg)을 수득한다.
o IR υ(CHCl3) :1730,,1640,1610,1530-1520cm-1
[실시예 10]
FR-900506 물질(48mg)을 피라딘(0.5ml)중에서 2-ℓ-멘틸옥시아세틸 클로라이드(0.08ml) 와 실시예 8과 유사한 방법에 따라 반응시켜 17-알릴-1,14-디하이드록시-23,25-디메톡시-12-[2-[4-(2-ℓ-멘틸옥시아세톡시)-3-메톡시사이클로헥실]-1-메틸비닐]-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로-[22.3.1.04,9]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(50.9mg)을 수득한다.
o IR υ(니트) : 3520,1760,1740(sh),1720(sh),1652cm-1
[실시예 11]
에틸아세테이트(10ml)중의(-)-2-트리플루오로메틸-2-메톡시-2-페닐아세트산(51mg)의 용액에 실온에서 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(47mg)을 가한다. 실온에서 1.5시간동안 교반한 후, FR-900506 물질(25.0mg) 및 4-(N.N-디메틸아미노)피리딘(11mg)을 가하고, 실온에서 3.5시간동안 교반한다. 생성된 용액을 농축시켜 잔류물을 얻고, 이 잔류물을 디에틸에테르중에 용해시킨 후, 염산, 수성 중탄나트륨 및 수성 염화나트륨으로 연속해서 세척한다. 유기층을 황산나트륨상에서 건조시키고 농축시켜 잔류물을 얻고, 이를 실리카겔상에서 크로마토그래피(전개 용매 : 디클로로메탄 및 디에틸에테르, 10 : 1 v/v)하여 17-알릴-12-[2-[4-[(-)-2-트리플루오로메틸-2-메톡시-페닐아세톡시]-3-메톡시사이클로헥실]-1-메틸비닐]-1,14-디하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로-[22.3.1.04,9]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(6.5mg) 및 17-알릴-14-[(-)-2-트리플루오로메틸-2-메톡시-2-페닐아세톡시-12-[2-[4-[(-)-2-트리플루오로메틸-2-메톡시-페닐아세톡시]-3-메톡시사이크로헥실]-1-메틸비닐]-1-하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로-[22.3.1.04,9]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(20.2mg)을 수득한다.
전자 화합물
o IR υ(니트) : 3510,1750,1730(sh),1710,1652,1500cm-1
후자 화합물
o IR υ(CHCl3) : 3500,3100-2300,1720,1750(sh),1635cm-1
o IR υ (니트) : 1750, 1720, 1652, 1500cm-1
[실시예 12]
피리딘(7ml)중의 FR-900506 물질(248mg)의 교반 용액에 석신산 무수물(145mg) 및 4-(N,N-디메틸아미노) 피리딘(7mg)을 가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 18시간동안 교반한다. 반응 혼합물을 감압하여 농축시키고 잔류물을 에틸에세테이트를 사용하여 실리카겔(20g)상에서 크로마토그래피하여 17-알릴-12-[2-[4-(3-카복시프로피오닐옥시)-3-메톡시사이클로헥실]-1-메틸비닐]-1,14-디하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로-[22.3.1.04.9]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(90mg)을 수득한다.
[실시예 13]
피리딘(3ml)중의 FR-900506 물질(100.7mg)의 용액에 p-요오드벤젠설포닐 클로라이드(500mg)을 가하고, 혼합물을 실온에서 36시간동안 교반한다. 이 용액을 에틸아세테이트로 희석하고 포화 수성 중탄산나트륨, 물, 및 수성 염화나트륨으로 세척한다. 유기층을 황산나트륨에서 건조시키고, 여과한 후 감압하에서 농축시킨다. 잔류물을 실리카겔(전개 용매 : 디에틸에테르 및 헥산, 3:1 v/v)상에서 크로마토그래피하여 17-알릴-1,14-디하이드록시-12-[2-[4-(p-요오드벤젠설포닐옥시)-3-메톡시사이크로헥실]-1-메틸비닐]-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로-[22.3.1.04,9]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(61mg) 및 17-알릴-1,14-디하이드록시-12-[2-[4-(p-요오드벤젠설포닐옥시)-3-메톡시사이클로헥실]-1-메틸비닐]-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로-[22.3.1.04,9]옥타코스-14, 18-엔-2,3,10,16-테트라온(12mg)을 각각 수득한다.
전자 화합물
o IR υ(CHCl3) : 3470,1730,1717,1692,1635,1568cm-1
후자 화합물
Figure kpo00043
[실시예 14]
FR-900506 물질(27mg)을 피리딘(0.6ml)중에서 d-캄포설포닐 클로라이드(97mg)와 실시예 13과 유사한 방법에 따라 반응시켜 17-알릴-12-[2-(4-d-캄포설포닐옥시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-1,14-디하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로[22.3.1.049]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(34mg)을 수득한다.
o IR υ (니트) : 3500,1747,1720(sh), 1710(sh),1655cm-1
[실시예 15]
디클로로메탄(3m1)중의 FR-900506 물질(89.7mg)의 교반 용액에 이미다졸(118mg) 및 t-부틸-디페닐실릴 클로라이드(52.2mg)을 가한다. 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반한 후, 반응 혼합물을 포화 수성 염화암모늄으로 희석하고 디에틸에테르로 3 회 추출한다. 추출물을 물 및 수성 염화 나트륨으로 세척하고, 황산나트륨상에서 건조 시킨후 감압하에 농축시킨다. 잔류물을 실리카켈 칼럼 크로마토그래피(전개 용매 : 에틸아세테이트 및 핵산, 1 : 3 v/v)에 의해 정제하여 17-알릴-12-[2-(4-t-부틸-디페닐실릴옥시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-1,14-디하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로[22.31.04,9]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(107mg)을 수득한다.
o IR υ (니트) : 3520,1742,1705,1650cm-1
[실시예 16]
FR-900506 물질(80mg)을 이미다졸(15mg)의 존재하에 N,N-디메틸포름아마이드(1ml)중에서 t-부틸-디메틸실릴 클로라이드(17mg)와 실시예 15와 유사한 방법에 따라 반응시켜 17-알릴-12-[2-(4-t-부틸-디메틸실릴옥시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-1,14-디하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥시-4-아자트리사이클로[22.3.1.04,9]옥시타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(85mg)을 수득한다.
o IR υ (CHCl3) : 1735,1720(sh),1700,1640cm-1
[실시예 17]
디메틸 설폭사이드(1.5ml)중의 FR-900506 물질(100mg)의 용액에 아세트산 무수물(1.5ml)를 가하고, 혼합물을 실온에서 14시간동안 교반한다. 반응 혼합물을 에틸아세테이트로 희석하고 포화 수성 중탄산나트륨, 물 및 수성 염화나트륨으로 세척한다. 유기층을 황산나트륨상에서 건조시키고, 여과한 후 감압하에 농축시킨다. 잔류물을 실리카겔 상에서 박층 크로마토그래피(전개 용매 : 디에틸에테르)하여 17-알릴-1,14-디하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-12-[2-(4-메틸티오메톡시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로[22.3.1.04,9]옥타코사-14,18-디엔-2,3,10,16-테트라온(51mg), 17-알릴-1하이드록시-12-[2-(4-하이드록시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로[22.3.1.04.9]옥타코사-14,15-디엔-2,3,4,16-테트라온(18mg) 및 17-알릴-1,14-디하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-12-[2-(4-메틸티오메톡시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로[22.3.1.04,9]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(10mg)을 각각 수득한다.
제 1 화합물
oIR υ(CHCl3) : 3470,1730,1635,1630,(sh),1580(sg)cm-1
제 2 화합물
oIR υ(CHCl3) : 1728,1640,1090cm-1
제 3 화합물
oIR υ(CHCl3) : 3480,1735,1710,1640cm-1
[실시예 18]
피리딘(1.5ml)중의 17-알릴-12-[2-(4-t-부틸-디메틸실릴옥시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-1,14-디하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로[22.3.1.04,9]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(39.9mg)의 용액에 아세트산 무수물(0.5ml)를 가하고, 혼합물을 실온에서 6시간동안 교반한다. 반응 혼합물로부터 용매를 감압하에 제거하여 조 오일을 얻고, 이를 실리카겔상에 박층 크로마토그래피(전개 용매 : 디에틸에테르 및 헥산, 1 : 1 v/v)에 의해 정제하여 14-아세톡시-17-알릴-12-[2-(4-t-부틸-디메틸실릴옥시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-1-하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로[22.3.1.04,9]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(26.5mg)을 수득한다.
o IR υ(CHCl3) : 1728,1715(sh),1635cm-1
[실시예 19]
17-알릴-12-[2-(4-t-부틸-디페닐실릴옥시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-1,14-디하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로[22.3.1.04,9]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(10.6mg)을 피리딘(0.2ml)중에서 아세트산 무수물(0.1mg)과 실시예 18과 유사한 방법에 따라 반응시켜 14-아세톡시-17-알릴-17-알릴-12-[2-(4-t-부틸-디페닐실릴옥시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-1,-하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로[22.3.1.04,9]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(10mg)을 수득한다.
○IR υ(CHCl3) : 3500,1730,1720(sh),1660(sh),1640,1620(sh),1100cm-1
[실시예 20]
테트라하이드로푸란(1.5ml)중의 14-아세톡시-17-알릴-12-[2-(4-t-부틸-디페닐실릴옥시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-1-하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로[22.3.1.04,9]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(43.8mg)의 용액에 실온에서 탄산칼륨(약 100mg)을 가하고 혼합물을 동일 온도에서 3시간동안 교반한다. 반응 혼합물을 디에틸에테르로 희석하고 생성된 용액을 포화 수성 염화암모늄, 물 및 수성 염화나트륨으로 연속해서 세척하고, 황산나트륨상에서 건조시킨다. 생성된 용액을 감압하에 농축하고 잔류물을 실리카겔상에서 박층 크로마토그래피(전개 용매 : 디에틸에테르 및 헥산, 3 : 2 v/v)에 의해 정제하여 17-알릴-12-[2-(4-t-부틸-디페닐실릴옥시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-1-하이드록시-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로[22.3.1.04,9]옥타코스-14,18-디엔-2,3,10,16-테트라온(30mg)을 수득한다.
○IR υ(CHCl3) : 1733,1720(sh),1685,1640(sh),1620cm-1
[실시예 21]
에틸아세테이트(2ml)중의 FR-900506 물질(50mg)의 용액을 대기압하에 실온에서 10% 탄소상 팔라듐(10mg)을 사용하여 20분동안 촉매적 환원시킨다. 반응 혼합물을 여과하고 여액을 증발건조시킨 후, 박층 크로마토그래피에 의해 정제한다. 클로로포름 및 아세톤의 혼합물(5 : 1, v/v)로 전개하여 1,14-디하이드록시-12-[2-(4-하이드록시-3-메톡시사이클로헥실)-1-메틸비닐]-23,25-디메톡시-13,19,21,27-테트라메틸-17-프로필-11,28-디옥사-4-아자트리사이클로[22.3.1.04,9]옥타코스-18-엔-2,3,10,16-테트라온(50.0mg)을 수득한다.
o IR υ(CHCl3) : 3480,1735(sh),1717,1700,1650(sh),1625cm-1

Claims (7)

  1. 일반식(I') 화합물을 생성하는 스트렙토마이세스속 균주를 영양배지에서 배양하고 일반식(I) 화합물 또는 그 의 염을 회수함을 특징으로 하는 일반식(I') 화합물 또는 그의 염의 제조방법.
    Figure kpo00044
    상기 식에서, R3 a는 메틸 및 알릴이고, n은 1 또는 2의 정수이며, 단, n이 정수 1인 경우에, R3 a는 알릴이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 일반식(I') 화합물이 다음 구조식을 가진 FR-900506 화합물임을 특징으로 하는 방법.
    Figure kpo00045
  3. 제 1 항에 있어서, 일반식(I') 화합물이 다음 구조식을 가진 FR-900525 화합물임을 특징으로 하는 방법.
    Figure kpo00046
  4. 제 1 항에 있어서, 일반식(I') 화합물이 다음 구조식을 가진 FR-900523 화합물임을 특징으로 하는 방법.
    Figure kpo00047
  5. 제 1 항에 있어서, 일반식(I')-생성 균주가 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스종임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 화합물(I')-생성 균주가 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스 9993(KFCC-10192)임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 화합물(I')-생성 균주가 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 세브스페시스 야꾸시마엔시스 7238(KFCC-10193)임을 특징으로 하는 방법.
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