DK165455B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af dipeptidderivater og farmaceutisk acceptable salte heraf - Google Patents

Description

DK 165455 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte dipeptidderivater med den i krav 1 angivne formel I med antihypertensiv virkning og deres farmaceutisk acceptable salte.

5

Fra dansk patentskrift nr. 149 594 kendes dipeptidderivater med et svovlatom i molekylets skelet. Forbindelserne er inhibitorer for det angiotensinkonverterende enzym og har derfor også antihypertensiv virkning.

10

Fra US patentskrift nr. 4 105 776 kendes prolinderivater og dermed beslægtede forbindelser med et svovlatom i molekylets skelet. Disse forbindelser har også antihypertensiv virkning.

15

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser har ikke noget svovlatom i molekylets skelet. Dette menes at være grunden til, at de er langt stærkere blodtryksnedsættende. De kan derfor anvendes i 20 mindre mængder end de hidtil kendte forbindelser og har færre uønskede bivirkninger, mens det ikke er ualmindeligt, at patienter, der behandles med de kendte forbindelser er udsat for bivirkninger i form af svimmelhed, opkastninger, hovedpine, arrhythmi og lignende.

25

En af de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser, l-[N-[l-(ethoxycarbonyl)-3-phenylpro-pyl]-L-alanyl]-L-prolin, enalapril, er markedsført i Danmark, jvf. lægemiddelkataloget 1989, side 137-138. Denne 30 forbindelse er grundigt undersøgt og beskrevet i litteraturen, se f.eks. Merck index, 10. udgave, 1983, A5.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser har den almene formel I, eller er farmaceu-35 tisk acceptable salte deraf 2

DK 165455B

0 R1 R3 R4 R5 O

1 I I I I 1 6

R-C-C-NH-C-C-N-C-C-R I

I I I I

Η Η O H

5 hvori R er hydroxy, lavere alkoxy, aryl-(lavere alkoxy), aryl-(lavere alkylamino) eller hydroxylamino, i R er hydrogen, ligekædet eller forgrenet lavere alkyl, 10 carboxy-(lavere alkyl), (lavere alkylthio)-(lavere al kyl), aryl-(lavere alkyl), indolyl-(lavere alkyl), amino-(lavere alkyl), arylthio-(lavere alkyl), halogenaryl-(lavere alkyl) eller aryloxy-(lavere alkyl), 3 15 R er lavere alkyl, hydroxy-(lavere alkyl), phenyl-(lavere alkyl), imidazolyl-(lavere alkyl), amino-(lavere alkyl) eller halogen-(lavere alkyl), 4 R er hydrogen eller lavere alkyl, 20 5 R er lavere alkyl, phenyl-(lavere alkyl), indolyl-(lavere alkyl) eller guanidino-(lavere alkyl), eller 4 5 R og R sammen danner en alkylenbro med 2-4 carbonatom-25 er, en alkylenbro med 2-3 carbonatomer og et svovlatom, en alkylenbro med 3-4 carbonatomer og en dobbeltbinding eller en sådan alkylenbro substitueret med hydroxy eller lavere alkoxy, og g 30 R er hydroxy, lavere alkoxy eller amino.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man 35 3

DK 165455 B

a) omsætter en keton med formlen 0 R1

1 I

R - c - C « 0 II

5 hvori R* og R har de ovenfor angivne betydninger, og hvori reaktive grupper i R^ eventuelt er beskyttede, med et dipeptid med formlen: 10

R3 R4 R5 O

I I I 6

H0N -C-C-N-C-C-R III

2 I « I

Η 0 H

15 3 4 5 6 hvori R , R , R og R har de ovenfor angivne betydnin- 3 5 ger, og hvori reaktive grupper i R og R eventuelt er beskyttede, i nærværelse af et reduktionsmiddel, efterfulgt om nødvendigt af fjernelse af eventuelle beskyttel-20 sesgrupper, og om ønsket fremstilling af et salt deraf på i og for sig kendt måde og, om ønsket, isolering af den biologisk mere aktive isomere ved kromatografi eller fraktioneret krystallisation, eller 25 b) omsætter en keton med formlen O R1

I

R - C - C = 0 II

30 hvori R og R* er som defineret i det foregående, idet R dog er forskellig fra hydroxy, og hvori reaktive grupper i R·*" eventuelt er beskyttede, med en aminosyre eller beskyttet aminosyre med formlen: 35 4

DK 165455B

R3

H2NCH - COOH IV

3 5 hvori R er som defineret i det foregående, i nærværelse af et reduktionsmiddel til dannelse af et mellemprodukt med formlen: 0 R1 R3

10 «II

R - C - CH - NHCHC00H V

» efterfulgt af kobling af mellemproduktet med en aminosyre eller et beskyttet aminosyrederivat med formlen: 15 R4 R5 I > 6

HN - C - COR VI

H

20 1 3 4 5 6 hvori R, R , R , R , R og R er som defineret i det fo- g regående, idet R er forskellig fra hydroxy, og hvori re- 5 aktive grupper i R eventuelt er beskyttede, til opnåelse af en forbindelse med formlen I, hvori R og R^ ikke er

OC

hydroxy, efterfulgt om nødvendigt af fjernelse af eventuelle beskyttelsesgrupper og om ønsket overføring af R

g og/eller R i hydroxylgrupper ved hydrolyse eller hydrogenering af det tilsvarende forstadium, og om ønsket fremstilling af et salt deraf på i og for sig kendt måde, 30 og om ønsket isolering af den biologisk mere aktive isomere ved kromatografi eller fraktioneret krystallisation, eller 35 5

DK 165455 B

c) omsætter en amin med formlen: 0 R1

1 I

R - C - C - NH_ VIX

5 I 2

H

hvori R og R1 er som defineret i det foregående, og hvori reaktive grupper i R^ kan være beskyttet, med en keton med formlen: R3 0 R4 R5 I I I I 6

0 = C- C- N- C- COR VIII

15 H

hvori R3, R4, R^ og R^ er som defineret i det foregående, 3 5 og hvori reaktive grupper i R og R eventuelt er beskyttede, efterfulgt om nødvendigt af fjernelse af eventuelle beskyttelsesgrupper, eller om ønsket udførelse af reaktionen trinvis ved at kondensere forbindelsen VII, hvor R ikke er hydroxy, med en ketonsyre med formlen: R3

25 I

O = C - COOH IX

3 hvori R er som defineret i det foregående, og reaktive 3 grupper i R eventuelt er beskyttede, til opnåelse af:

Ov 0 R1 R3

1 I I

RC - C - NHCHCOOH X

35 2

H

DK 165455 B

6 1 3 hvori R, R og R er som defineret i det foregående, og kondenserer forbindelsen X med et aminosyrederivat med formlen: 5 R4 R5 I I 6

HN - C - COR° VI

H

^ hvori R4, R^ og R^ er som defineret i det foregående, 6 5

idet R ikke er hydroxy, og hvori reaktive grupper i R

eventuelt er beskyttede, efterfulgt om nødvendigt af fjernelse af eventuelle beskyttelsesgrupper, til opnåelse af en forbindelse, hvori R og R^ ikke er hydroxy, og om 15 ønsket overføring af R og/eller R^ i hydroxy ved hydrolyse eller hydrogenering af det passende forstadie og yderligere, om ønsket, fremstilling af et salt deraf på konventionel måde og, hvis det er ønsket, isolering af den biologisk mere aktive isomere ved kromatografi eller fraktioneret krystallisation, eller d) omsætter et dipeptid med formlen: R1 R4 R5 0 25 I I I « 6

H0N -CH-C-N-C-C-R III

2 « I

0 H

35 4 5 6 hvori R , R , R og R er som defineret i det foregående, ^ og hvori reaktive grupper i R1 og R^ eventuelt er beskyttede, med en forbindelse med formlen: 7

DK 165455 B

R1

X - C - COR XI

H

5 hvori R og R1 er som defineret i det foregående, og hvori reaktive grupper i R1 eventuelt er beskyttede, og hvor X er chlor, brom, iod eller en sulfonyloxygruppe, efterfulgt om nødvendigt af fjernelse af eventuelle beskyttel-sesgrupper, eller om ønsket omsætning af forbindelsen XI, hvori R ikke er OH, med et aminosyrederivat med formlen: R3

15 H2NCH - COOH IV

3 hvori R er som defineret i det foregående, og reaktive grupper eventuelt er beskyttede, til dannelse af et mellemprodukt med formlen: 20 R1 R3

I I

RCO - C - NHCH - COOH X

H

25 og derpå omsætning af mellemproduktet med et aminosyrederivat med formlen: R4 R5

30 I I

HN - C - COR6 VI

H

35

DK 165455 B

8 4 5 6 hvori R , R og R er som defineret i det foregående, 6 5 idet R ikke er OH, og hvori reaktive grupper i R eventuelt er beskyttede, efterfulgt om nødvendigt af fjernelse af eventuelle beskyttelsesgrupper, til dannelse af en 5 forbindelse I, og om ønsket fremstilling af et salt deraf på konventionel måde, og om ønsket isolering af den biologisk mere aktive isomere ved kromatografi eller fraktioneret krystallisation, eller 10 e) omsætter et aminosyrederivat med formlen: 0 R1 i

R - C - C - NH- VII

I 2

15 H

hvori R og R1 er som defineret i det foregående, og hvori i reaktive grupper x R eventuelt kan være beskyttede,· med et α-substitueret acylaminosyrederivat med formlen: 20 R3 0 R4 R5 ! i I I 6

X-CH-C-N-C- C0R° XII

H

25 3 4 5 6 hvori X, R , R , R og R er som defineret i det foregå- 3 ende, og hvori aktive grupper i R kan være beskyttede, efterfulgt af fjernelse af eventuelle beskyttelsesgrupper, om nødvendigt, til dannelse af det ønskede produkt, O u eller om nødvendigt omsætning af en aminosyreester VII, hvor R ikke er hydroxyl, med en α-substitueret syre med formlen: 35 9

DK 165455B

R3

X - CH - COOH XIII

3 5 hvor R kan indeholde hensigtsmæssig beskyttelse for en reaktiv gruppe, til opnåelse af en mellemproduktester med formlen: R1 R3 10 1 1

10 RCO - C - NHCH - COOH X

H

og derpå omsætning af dette mellemprodukt med en aminosy-*•5 re med formlen: R4 R5 1 I 6

HN - C - COR VI

20 H

6 5 hvori R ikke er hydroxyl, og R kan indeholde hensigtsmæssige beskyttelsesgrupper for en reaktiv gruppe, efterfulgt af fjernelse af beskyttelsesgrupperne, om nødven-25 digt, til opnåelse af en forbindelse med formlen I, og om ønsket overføring af R og/eller R^ i hydroxy ved hydrolyse eller hydrogenering af det passende forstadie, og endvidere, om ønsket, fremstilling af et salt deraf på i og for sig kendt måde, og yderligere, om ønsket, isole- w V/ ring af den biologisk mere aktive isomere ved kromatografi eller fraktioneret krystallisation.

35

DK 165455 B

10

De lavere alkylgrupper eller lavere alkenylgrupper omfatter, undtagen hvor andet er anført, en vilkårlig af de forskellige lige eller forgrenede carbonhydridgrupper med 1-6 carbonatomer, f.eks. methyl, ethyl, propyl, isopro-5 pyl, butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, isopentyl, hexyl eller vinyl, allyl eller butenyl. Ar-alkyl-grupperne har 1-4 carbonatomer i alkyldelen og omfatter for eksempel benzyl og p-methoxybenzyl. Halogen står for chlor, brom, iod eller fluor. Aryl betegner, hvor ikke andet er an-10 givet, phenyl eller naphthyl.

13 5

Eksempler på grupper R , R og R er “ U-r OT- er-

» I

Η H

H0-CH2-, HS-CH2, H2N-(CH2)4-, CH3-S-(CH2)2-, H2N-(CH2)3-20 og

NH

H2N-C-NH-(CH2)3-.

4 5 R og R danner, når de er knyttet sammen via carbon- og 25 nitrogenatomerne, hvortil de er knyttet, en ring med 4-6 led, som kan indeholde et svovlatom eller en dobbeltbinding. Foretrukne ringe har formlerne: 30 ^-ί ^-

v eller V

COOH C00H

hvor Y er CH0, S eller CHOCH«.

35 2 0

DK 165455 B

11

Foretrukne er de forbindelser med formlen I, hvori: R er hydroxy, lavere alkoxy eller aryl-(lavere alkoxy) er hydroxy eller amino; 3 5 R er lavere alkyl eller amino-(lavere alkyl), 4 5 R og R er knyttet sammen under dannelse af de foretrukne ringe som defineret i det foregående, hvor Y er CH2, S eller CH-OCH3; R^ har den tidligere angivne betydning.

10 Særligt foretrukne forbindelser er de foretrukne forbindelser med formlen I, hvori endvidere R^· er alkyl med 1-8 carbonatomer, substitueret lavere 15 alkyl, hvori alkylgruppen har 1-4 carbonatomer, og substituenten er amino, arylthio, aryloxy eller aralkyl eller indolylalkyl, hvori alkyldelen har 1-3 carbonatomer, såsom phenethyl eller indolyl-ethyl eller substitueret ar-lavere-alkyl (phenyl- 20 lavere-alkyl eller naphtyl-lavere-alkyl).

Mest foretrukne er forbindelser med formlen I, hvori R er hydroxy eller lavere alkoxy; 25 R^ er hydroxy; 3 R er methyl eller amino-(lavere alkyl); 4 5 R og R er knyttet sammen via carbon- og nitrogenatomet til dannelse af prolin, 4-thiaprolin eller 4-meth-oxyprolin; 30 R er alkyl med 1-8 carbonatomer, substitueret lavere alkyl, hvori alkylgruppen har 1-4 carbonatomer, og substituenten er amino, arylthio eller aryloxy, aralkyl eller indolylalkyl, hvori alkyldelen har 35 1-3 carbonatomer, såsom phenethyl eller indolyl- ethyl eller substitueret aralkyl (phenyl-lavere-alkyl eller naphthyl-lavere-alkyl).

DK 165455 B

12

De foretrukne, særligt foretrukne og mest foretrukne forbindelser omfatter også de farmaceutisk acceptable salte deraf.

5 Produkterne med formlen I og de foretrukne undergrupper kan fremstilles ved en eller flere fremgangsmåder, der er skitseret ved hjælp af følgende ligninger. Som det vil være indlysende for fagmanden på området og som vist i eksemplerne, kan reaktive grupper, der ikke indgår i kon-10 densationerne, såsom amino-, carboxy, mercapto og lign ende, være beskyttet ved standardmetoder i peptidkemien før koblingsreaktionerne, og beskyttelsesgrupperne fjernes bagefter til opnåelse af de ønskede produkter.

15 Metode I, Vej I

0 R1 R30 R4R50

1 I I I I I I f. NaBHoCN

R-C-C=0 + H0NCHC-N-C-C-R ---> I

2 I

20 H II III

Ketosyre (eller ester, amid eller hydroxamsyre) II kondenseres med dipeptid III i vandig opløsning, optimalt nær neutralitetspunktet, eller i et hensigtsmæssigt orga-nisk opløsningsmiddel (f.eks. CH^CN) i nærværelse af na-triumcyanoborhydrid til opnåelse af forbindelsen I. Alternativt reduceres mellemproduktet, der er en Schiff’sk base, en amin eller aminol, katalytisk til opnåelse af produktet I, f.eks. ved hjælp af hydrogen i nærværelse af 30 10 %'s palladium-på-kul eller i nærværelse af Raney-nik- kel. Forholdet mellem de diastereoisomere produkter, der dannes, kan ændres ved valg af katalysator.

g

Hvis R og R er carboxybeskyttelsesgrupper, såsom alkoxy 35 eller benzyloxy, kan de overføres ved velkendte metoder,

DK 165455B

13 såsom hydrolyse eller hydrogenering, til forbindelse I, hvor R og/eller er hydroxy. Dette gælder i alle de følgende metoder, hvor den nævnte situation forekommer.

5 Alternativt kan forbindelsen II kondenseres med en aminosyre IV

R3 0 R1 R3

I NaBH-CN I I I

H«NCH-COOH + II ---> R-C-CHNHCHCOOH

10

IV V

under samme betingelser til opnåelse af aminosyren V. Påfølgende kobling af aminosyrederivatet VI ved kendte metoder giver forbindelsen I.

15

De kendte metoder omfatter beskyttelse af reaktive grupper under koblingsreaktionen, f.eks. ved hjælp af N-formyl-, N-t-butoxycarbonyl- og N-carbobenzyloxy-grupper, efterfulgt af fjernelse deraf til opnåelse af de ønskede 20 forbindelser I. Endvidere kan gruppen R indeholde estergrupper, der kan fjernes, såsom benzyl, ethyl eller t-bu-tyl. Kondensationsmidler til denne syntesevej er typisk sådanne, som er nyttige i peptidkemien, såsom dicyclo-hexylcarbodiimid (DCC) eller diphenylphosphorylazid 25 (DPPA), eller forbindelser V kan aktiveres via mellempro duktet i form af aktive estere, såsom de, der er afledt fra 1-hydroxybenzotriazol.

4 5

R R

|| , DCC eller DPPA

30 V + HN - C - CO - R -- I

H (DCC = Dicyclohexylcarbodiimid) (DPPA = Diphenylphosphorylazid)

VI

35

DK 165455 B

14

Vgj-2 OR1 R2 O R3 R4

Il I I I I 6

R - C - C - NH„ + 0 = C- C- N- C- CO - R -> I

5 I 5 I

Η H

VII VIII

Aminosyre (eller ester, amid eller hydroxamsyre) VII kondenseres med keton VIII under betingelser som beskrevet for Vej 1 til opnåelse af forbindelser I.

Alternativt kan syntesen udføres trinvis ved at kondensere VII med ketosyre IX.

15 R2 0 R1 R2

I III

VII + 0 = C - COOH -> RC - C - NHCH - COOH

H

IX X

20 til opnåelse af aminosyren X. Ved kendte metoder som angivet i det foregående under Vej 1, kan X kondenseres med aminosyrederivat VI til opnåelse af I.

4 ς 1 3 A ς

R κ 0 R RO RRO

25 II 6 · I I ' I I ' 6

X + HN-C-CO-R -> R-C-C-NHCHC-N-C-C-R

35

I I

2

VI I

3 30 I det specielle tilfælde, hvor R1 bærer en a-aminosubsti- 4 tuent, kan carbonyl- og aminogrupperne hensigtsmæssigt være beskyttet som en å-lactam-funktion.

5

H HH

15

DK 165455B

Metode 2 - Vej 1 q Λ ς i ΈΓ 0 R R° R*

l'll 6 I

H«N -ch-c-n-c- COR° + X - C - COR

5 2 I I

Η H

III XI

OR1 R3 0 R4 R5 10 «I I I I I 6

-> R-C-C-NH -CH-C-N-C- COR

I I

Η H

X5 Dipeptidet III alkyleres med den passende <r-halogensyre (ester eller amid) eller e-sulfonyloxysyre (ester eller amid) IX under basiske betingelser i vand eller et organisk opløsningsmiddel.

20 X er chlor, brom, iod eller alkylsulfonyloxy eller aryl-sulfonyloxy.

Alternativt kan syntesen udføres trinvis 25 R3 R1 R1 R3

II II

HoN-CH-C00H + X-C-COR -> RCO-C-NH-CH-COOH

2 I I

Η H

IV XI X

30 r4r5 or1 r3 o r4 r5 ll6 1 I I i I I 6

+ HN-C-COR -> R-C-C-NH -CH-C-N-C- COR

I I I

Η Η H

35 VI I

X = Cl, Br, I, alkylsulfonyloxy eller arylsulfonyloxy.

DK 165455 B

16

Aminosyren IV alkyleres med o-halogensyren (esteren eller amidet) eller a-sulfonyloxysyren (esteren eller amidet) XI under basiske betingelser til opnåelse af en forbindelse X. Denne kondenseres ved standardmetoder som an-5 givet under Vej 1 med aminosyren (esteren eller amidet) VI til opnåelse af forbindelsen I.

£

Reduktiv spaltning af benzylesteren I (hvor R er benzo-yloxy, og R er alkoxy) vil give forbindelser med formlen 10 I, hvori R er alkoxy, og R^ er hydroxy, og hvor R^ er alkoxy, og R er benzyloxy, vil der opnås forbindelser med

C

formlen I, hvori R er hydroxy, og R er alkoxy.

Ve j 2 15 R1 R3 0 R4 R5 I I I I 6 R - C - C - NH0 + X-CH-C-N-C - COR --—>

I I 2 I

20 ° H H

VII XII

R1 R3 0 R4 R5 0 I I a i i α

25 R-C-C-NH-CH-C-N-C- CR

I I I

OH H

X = Cl, Br, I, alkylsulfonyloxy eller arylsulfonyloxy.

30

Aminosyren eller derivatet VII alkyleres med den passende substituerede α-halogenacetyl- eller a-sulfonyloxyacetyl-aminosyre XII under basiske betingelser i vand eller et andet opløsningsmiddel til opnåelse af forbindelser med 35 formlen I.

17

DK 165455B

Alternativt kan syntesen udføres trinvis ved at kondensere en aminosyreester VII med en substitueret e-halogen-eddikesyre eller a-sulfonyloxyeddikesyre XIII til opnåelse af mellemproduktet X. Ved kendte metoder beskrevet 5 under Vej 1 kan X kobles med en aminosyre VI eller et derivat til opnåelse af forbindelsen I.

R1 R3 R1 R3

I I I I

RC0-C-NHo + X-CH-COOH -> RCO-C-NH-CH-COOH

10 I 2 I

Η H

VII XIII X

r4r5 i, I I 6 15 X + HN-C-C0R° ->

H

VI

i 3 4. ς 20 0 R R R R 0 || ί i I 1 6

R-C-C-NH-C-C-N-C- CR

I I I I

Η Η O H

25

Om ønsket kan beskyttelsesgrupper fjernes på i og for sig kendt måde.

De udgangsmaterialer, der kræves til ovennævnte proces-30 ser, er kendt i litteraturen, eller de kan fremstilles ved kendte metoder ud fra kendte udgangsmaterialer.

35

DK 165455 B

18 I produkter med en almen formel I kan de carbonatomer, 13 5 hvortil R , R og R er knyttet, være asymmetriske. Forbindelserne forekommer følgelig i diastereoisomere former eller blandinger deraf. De i det foregående beskrevne 5 synteser kan anvendes på racemater, enantiomere eller diastereomere udgangsmaterialer.

Når fremgangsmåderne giver diastereomere produkter, kan de diastereomere opspaltes ved konventionelle kromatogra-10 fiske metoder eller ved fraktioneret krystallisation. I almindelighed foretrækkes aminosyredelstrukturerne, dvs.

0 R1 R3 R4R50 1 I I II« R-C-C-NH- , -NH-CHCO- og -N-C-C-

15 I I

Η H

af formlen I på S-konfigurationen.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede 20 forbindelser danner farmaceutisk acceptable salte med forskellige uorganiske og organiske syrer og baser, som også er omfattet af opfindelsen. Sådanne salte omfatter ammoniumsalte, alkalimetalsalte, som natrium- og kaliumsalte (som foretrækkes), j ordalkalimetalsalte, som 25 calcium- og magnesiumsalte, salte med organiske baser, f.eks. dicyclohexylaminsalte, N-methyl-D-glucaminsalte, salte med aminosyrer, som arginin, lysin og lignende.

Også salte med organiske og uorganiske syrer kan fremstilles, f.eks. salte af HC1, HBr, H2S04, H^PO^, methan-30 sulfonsyre, toluensulfonsyre, maleinsyre, fumarsyre, kamfersulfonsyre. Andre salte er også nyttige, f.eks. til isolering eller rensning af produktet.

Saltene kan dannes på konventionel måde, såsom ved at om-35 sætte den frie syre eller frie base af produktet med et

DK 165455 B

19 eller flere ækvivalenter af den passende base eller syre i et opløsningsmiddel eller et medium, hvori saltet er uopløseligt, eller i et opløsningsmiddel, såsom vand, som derpå fjernes i vakuum eller ved frysetørring eller ved 5 udbytning af kationeme fra det eksisterende salt med en anden kation på en hensigtsmæssig ionbytterharpiks.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser inhiberer det angiotensinkonverterende enzym 10 og blokerer således konvertering af decapeptid angiotensin I til angiotensin II. Angiotensin II er et kraftigt pressorstof. Således kan blodtrykssænkning være resultatet af inhibering af dets biosyntese, specielt i dyr og mennesker, hvis hypertension er forbundet med angiotensin 15 II. Endvidere nedbryder konverterende enzym vasodepressor stof fet bradykinin. Derfor kan inhibitorer for angiotensinkonverterende enzym nedsætte blodtrykket, også ved potentiering af bradykinin. Skønt den relative betydning af disse og andre mulige mekanismer ikke er fuldt klar-20 lagt, er inhibitorerne af angiotensinkonverterende enzym effektive antihypertensive midler i en række dyreforsøg, og de er for eksempel nyttige hos mange mennesker med renovasculær, sygelig og væsentlig hypertension. Se f.eks. D.W. Cushman et al.. Biochemistry 16, 5484 (1977).

25

Bedømmelsen af de konverterende enzyminhibitorer er udført ved in vitro enzyminhiberingsforsøg. For eksempel er metoden af Y. Piquilloud, A. Reinharz og M. Roth, Bio-chem. Biophys. Acta, 206, 136 (1970) en nyttig metode, i 30 hvilken hydrolysen af carbobenzyloxyphenylalanylhistidi-nylleucin måles. In vivo bedømmelser udføres for eksempel i normotensive rotter behandlet med angiotensin I ved den teknik, der er beskrevet af J.R. Weeks og J.A. Jones,

Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 104, 646 (1960) eller i en 35 høj renin rottemodel, såsom den, der er beskrevet af S. Koletsky et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 125, 96 (1967).

DK 165455B

20

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser er således nyttige som antihypertensiva ved behandling af hypertensive dyr, herunder mennesker, og de kan anvendes til opnåelse af en reduktion af blodtrykket 5 ved at formulere dem i præparater som tabletter, kapsler eller elixirer, til oral administrering, eller i sterile opløsninger eller suspensioner til parenteral administrering. De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser kan administreres til patienter (dyr og 10 mennesker) med behov for en sådan behandling i et dosisområde på 5 - 500 mg pr. patient, almindeligvis indgivet flere gange, så der indgives en total daglig dosis på 5 - 2.000 mg pr. dag. Dosis vil variere afhængigt af sygdommens alvor, patientens vægt og andre faktorer, som er 15 kendte for fagmanden på området.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser kan også indgives i kombination med andre lægemidler, såsom diuretica eller antihypertensiva. Disse 20 er typisk kombinationer, hvis individuelle daglige doser ligger på 1/5 af den minimalt anbefalede kliniske dosis af den maksimalt anbefalede mængde for entiteterne, når de gives alene. For at illustrere disse kombinationer kan et af de i den foreliggende opfindelse omhandlede anti-25 hypertensiva, der er effektivt klinisk i området 15 - 200 mg pr. dag, effektivt kombineres med mængder på 3 - 200 mg pr. dag af følgende antihypertensiva og diuretica i de angivne dosisområder pr. dag: 30 hydrochlorthiazid.................. 15 - 200 mg chlorthiazid....... 125 - 2000 mg ethacrynsyre....................... 15 - 200 mg amilorid........................... 5 - 20 mg furosemid.......................... 5- 80 mg 35 propanolol ......................... 20 - 480 mg timolol............................ 5 - 50 mg methyldopa......................... 65 - 2000 mg 21

DK 165455 B

Desuden er tripræparat-kombinationer af hydrochlorthiazid (15-200 mg) plus amilorid (5-20 mg) plus konverterende enzyminhibitor fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen (3-200 mg) eller hydrochlorthiazid (15-200 mg) 5 plus timolol (5-50 mg) plus den konverterende enzyminhibitor som omhandlet (3-200 mg) effektive kombinationer til kontrol af blodtrykket i hypertensive patienter. De i det foregående angivne dosisområder kan indstilles på enhedsbasis efter behov for at muliggøre opdelte daglige 10 doser. Dosis vil også være afhængig af sygdommens alvor, patientens vægt og andre faktorer, som er velkendte for fagmanden på området.

15 Dokumentation for den antihypertensive virkning af forbindelserne med formlen I (enalapril)

Formålet med undersøgelsen 20 (A) at sammenligne den antihypertensive virkning af enalapril og captopril (fremstilles og forhandles af Bristol-Myers Squibb) under samtidig administrering af hydrochlorthiazid (HCTZ), og 25 (B) at undersøge den antihypertensive virkning af enalapril under samtidig administrering af HCTZ plus ALDOMET® eller timololmaleat, og af captopril under samtidig administrering af HCTZ plus ALDOMET® eller timololmaleat.

30

Enalapril og captopril er ACE-hæmmere. ACE har en hyper-tensiv virkning, idet det fraspalter angiotensin fra an-giotensinogen.

35

DK 165455B

22

Forsøgsforløb

Undersøgelsen blev foretaget som et sammenlignende dob-belt-blindforsøg med randomiseret opdeling i grupper. Der 5 deltog ikke-hospitalsindlagte patienter af begge køn i alderen 21-65 år, der under den indledende 4 ugers periode til fastlæggelse af basislinje-værdier udviste et su-pint diastolisk blodtryk (SDBP) på 100-120 nun Hg (SDBP-målinger ved basislinje uge 2 og 4 afveg ikke mere 10 mm 10 Hg). Patienterne blev under denne periode indgivet 50 mg qd hydrochlorthiazid (HCTZ).

4 uger: Fastlæggelse af basislinje-værdier for blodtryk 6 uger: Første behandling 15 6 uger: Anden behandling Første behandlingsperiode (uge 1-6)

De udvalgte patienter opdeltes i to overgrupper: 20 I. Med SDBP basislinje på 100-110 mm Hg og II. Med SDBP basislinje på 111-120 mm Hg.

Patienterne i disse to grupper blev herefter tilfældigt 25 fordelt på to behandlingsgrupper: 1. Blev indgivet HCTZ + enalapril + placebo for captopril 2. Blev indgivet HCTZ + captopril + placebo for enalapril 30 Hos patienter med SDBP >90 mmHg forøgedes under første behandlingsperiode doseringen af ACE-hæmmer hver 2. uge.

Hos patienter med SDBP <90 mmHg (tilfredsstillende respons) blev vedligeholdt på denne dosis, så længe det 35 tilfredsstillende respons varede. Aktiv medikering var som følger: 23

DK 165455B

Behandlingsuger 1-2 3-4 5-6 5 -

Gruppe 50 mg HCTZ qd 50 mg HCTZ qd 50 mg HCTZ qd 1 + + + 5 mg enalapril 10 mg enalapril 20 mg enalapril b.i.d. b.i.d. b.i.d.

10

Gruppe 50 mg HCTZ qd 50 mg HCTZ qd 50 mg HCTZ qd 2 + + + 25 mg captopril 50 mg captopril 100 mg captopril t.i.d. t.i.d. t.i.d.

15

Anden behandlingsperiode (uge 7-12) I slutningen af behandlingsuge 6 fik patienter i både gruppe 1 og 2 med SDBP >90 mm Hg enten timololmaleat eller ALDOMET® sat til deres behandlingsprogram. Under behandlingsugerne 7-12 behandledes patienter med utilfredsstillende respons således: 25

Behandlingsuger

Behandling 7-8 9-10 11-12 30

Timololmaleat 20 mg qd 40 mg qd 60 mg qd ALDOMET® 250 mg b.i.d. 250 mg b.i.d. 1.000 mg b.i.d.

35

DK 165455 B

24

Kliniske og laboratorie målinger

Fra basislinje til og med follow-up periode måles stående og rygliggende blodtryk og puls hver 2. uge.

5

Laboratorie tests blev foretaget efter 2 og 4 uger fra basislinje og i uge 6, 12 og 16 af behandlingsperioderne.

Effektiviteten af såvel ACE-hæmmer-terapi og triple-10 terapi blev bedømt på to måder: 1. Man sammenligner proportionerne af patienter med "godt" (SDBP-nedsættelse fra basislinje på 10 mm Hg eller derover, men ikke under 90 mm Hg) eller 15 "særdeles godt" (SDBP på 90 mm Hg eller derunder) respons.

2. Middel blodtryk (supint og stående systolisk og dia-stolisk) blev beregnet for hver behandlingsgruppe ved 20 basislinje-måling og ved hver 2 ugers behandlings måling.

Resultater 25 175 patienter fuldførte basislinje-perioden og blev ran- domiseret i behandlingsgrupper.

85 i gruppe 1 - enalapril b.i.d.

90 2 - captopril t.i.d.

30

Patienterne var diagnostiseret som havende moderat eller svær hypertension. 95 havde en eller flere sekundære diagnoser, der var ingen signifikante forskelle mellem grupperne m.h.t. sekundære diagnoser. Ligeledes var der 35 ingen signifikante forskelle m.h.t. alder, køn, race, varighed af hypertension samt antal i gruppe I (SDBP 100-110 mmHg) og gruppe II (SDBP >110 mm Hg).

25

DK 165455B

Tabel 1 viser resultaterne af analysen af ændringer i middel blodtryk i forhold til basislinje-værdi. I ugerne 2, 4, 6, 12 og 16 var middel SDBP for både patienter på HCTZ + enalpril og på HCTZ + captopril signifikant redu-5 ceret (p<0,01) i forhold til basislinje-middelværdi. Der var ingen signifikant forskel mellem grupperne. Middel supint systolisk blodtryk var ligeledes signifikant reduceret (p<0,01) fra basislinje-middel i ugerne 2, 4, 6, 12, og 16.

10 I uge 2 var der en signifikant forskel mellem grupperne (p*0,048), hvor behandling med HCTZ + enalpril resulterede i større nedsættelse af blodtryk end behandling med HCTZ + captopril.

15 20 25 30 35 26

DK 165455B

TABEL 1 HCTZ + Enalapril versus HCTZ + Cap topril Ændring i middel supint blodtryk (i mm Hg) i forhold til basislinje 5

Diastolisk Systolisk

Middel Middel

Basis- ændring Basis- ændring linje fra linje fra 10 Antal middel- basis- middel- basis-

Uge Gruppe patienter værdi linje værdi linje 2 Enalapril 83 105,6 -13,9** 159,1 -19,1**

Captopril 88 105,9 -11,9** 155,8 -13,3**(a) 4 Enalapril 80 105,7 -15,9** 159,4 -19,8**

Captopril 86 105,8 -15,0** 155,7 -16,6** 15 6 Enalapril 79 105,2 -16,3** 158,5 -21,6**

Captopril 82 105,6 -16,5** 155,5 -20,1** 12 Enalapril 37 103,9 -19,4** 151,7 -22,9**

Captopril 32 104,4 -19,4** 154,7 -20,0** 20 16 Enalapril 30 103,7 -18,8** 151,8 -22,8**

Captopril 19 104,0 -20,2** 154,8 -22,2** ** Statistisk signifikant reduktion fra basislinje, p<0,01.

(a) Signifikant forskel mellem gruppe, p = 0,048.

25 30 35 27

DK 165455B

Tabel 2 viser ændringer i middel blodtryk fra uge 6 til ugerne 12 og 16 for patienter, der ikke opnåede et tilfredsstillende respons på behandling med HCTZ + ACE-hæm-mer. Grupper, der fik enten timololmaleat eller ALDOMET© 5 udviste yderligere reduktioner i både systolisk og dia-stolisk blodtryk målt såvel i rygleje som i siddende stilling. På nogle få punkter var disse forskelle statistisk signifikante. Der var ingen signifikante forskelle mellem grupperne. Ændringer i blodtryk målt i stående 10 stilling (ikke vist) var lig dem vist for supint blodtryk.

TABEL 2 HCTZ + Enalapril + timolol eller ALDOMET® versus 15 HCTZ + Captopril + timolol eller ALDOMET® Ændring i middel supint blodtryk (i mm Hg) i forhold til middelværdi for uge 6 2q Diastolisk Systolisk

Middel- Middel Middel- Middel værdi ændring værdi ændring

Antal for fra for fra

Uge Gruppe patienter uge 6 uge 6 uge 6 uge 6 12 Enal/Tim 8 96,4 -7,1 147,2 -14,3* 25 Capto/Tim 12 95,2 -9,3** 141,5 -11,1

Enal/MD 14 97,0 -8,1* 152,1 -11,6*

Capto/MD 15 95,5 -4,8* 143,3 -5,7 16 Enal/Tim 4 96,5 -2,8 152,5 -8,3

Capto/Tim 7 94,7 -3,6 142,6 -3,7

Enal/MD 7 97,0 -3,9* 154,1 -7,7 3Q Capto/MD 6 94,7 -3,0 142,7 -2,2 *, ** Statistisk signifikant reduktion fra uge 6 basislinje, p er henholdsvis <0,05 og <0,001.

35

DK 165455B

28 I -tabel 3 er vist de vigtigste resultater af analysen af typerne af blodtryksrespons (som defineret ovenfor). I løbet af ugerne 2, 4 og 6 forøgedes antallet af patienter der opnåede et godt eller særdeles godt respons. Det kan 5 ikke afgøres, om denne forøgelse var på grund af højere doser af ACE-inhibitorer eller længere varighed af behandling. Data i tabel 3 for ugerne 12 og 16 viser virkningen af tilføjelse af enten timololmaleat eller ALDOMET® til doseringsprogrammet. Tilføjelsen af timolol-10 maleat (20 - 60 mg/dag) eller ALDOMET® (500 - 2000 mg/dag) til begge dobbelt-behandlingsprogrammer er effektivt for de patienter, der ikke reagerer tilfredsstillende på dobbeltterapi.

15 TABEL 3 HCTZ + Enalapril + timolol eller ALDOMET® versus HCTZ + Captopril + timolol eller ALDOMET®

Andel patienter med godt eller særdeles godt respons angivet i hen-20 hold til behandlingsgruppe

Antal Antal patienter patienter Godt +

Antal med godt med særdeles særdeles godt Uge Gruppe patienter respons godt respons % 25 2 Enalapril 83 21 37 70

Captopril 88 14 37 58 4 Enalapril 80 18 42 75

Captopril 86 21 39 70 6 Enalapril 79 10 52 78 3Q Captopril 82 20 49 84 12 Enal/Tim 8 3 3 75

Capto/Tim 13 4 9 100

Enal/MD 15 5 9 93

Capto/MD 17 3 9 71 16 Enal/Tim 5 2 2 80 35 Capto/Tim 10 2 6 80

Enal/MD 13 3 7 77

Capto/MD 14 3 7 71

DK 165455 B

29

Bivirkninger

Ingen patienter på enalapril havde alvorlige bivirkninger, hvorimod seks patienter på captopril havde alvor-5 lige bivirkninger.

De viste kombinationer formuleres typisk til farmaceutiske præparater som angivet i det følgende: 10

Cirka 10-500 mg af en forbindelse af blanding af forbindelser med formel I eller et fysiologisk acceptabelt salt forbindes med fysiologisk acceptabelt hjælpemiddel, bærer, excipiens, bindemiddel, konserveringsmiddel, sta-15 bilisator, smagsstof osv. i en enhedsdosisform efter behov i sædvanlig farmaceutisk praksis. Mængden af aktivt stof i disse præparater er således, at der opnås en hensigtsmæssig dosis i det angivne område.

20 Eksempler på hjælpemidler, som kan inkorporeres i tabletter, kapsler og lignende, er følgende: Et bindemiddel, såsom gummi tragacanth, acacia, majsstivelse eller gelatine; et excipiens, såsom mikrokrystallinsk cellulose; et sønderdelingsmiddel, såsom majsstivelse, forgelatineret 25 stivelse, algininsyre og lignende; et smøremiddel, såsom magnesiumstearat; et sødemiddel, såsom saccharose, lactose eller saccharin; et smagsmiddel, såsom pebermynte, olie af vintergrønt eller kirsebær. Når dosisenhedsformen er en kapsel, kan den foruden af materialer af ovennævnte 30 ^ΥΡβ indeholde en væskeformig bærer, såsom en fedtolie. Forskellige andre materialer kan være til stede som overtræk eller for på anden måde at modificere den fysiske form for dosisenhed. For eksempel kan tabletterne være overtrukne med shellak, sukker eller begge dele. En sirup 35 eller elixir kan indeholde den aktive forbindelse, saccharose som et sødemiddel, methyl- og propylparabener som konserveringsmidler, et farvestof eller et smagsstof, så- 30

DK 165455B

som kirsebær- eller orangesmag.

Sterile præparater til injektion kan formuleres efter konventionel farmaceutisk praksis ved at opløse eller 5 suspendere det aktive stof i et hjælpemiddel, såsom vand til injektion, en naturligt forekommende vegetabilsk olie, som sesamolie, kokosnøddeolie, jordnøddeolie eller bomuldsfrøolie, eller et syntetisk fedt-hjælpemiddel, som ethyloleat eller lignende. Puffere, konserveringsmidler, 10 antioxidanter og lignende kan inkorporeres efter behov.

De efterfølgende eksempler forklarer fremgangsmåden ifølge opfindelsen nærmere. De foretrukne diastereomere af de ved eksemplerne fremstillede forbindelser isoleres ved 15 søjlekromatografi eller fraktioneret krystallisation.

20 25 30 35

NzlirS§£l22£Yl2-phenYlethYlX;L-alanYl-L-Erolin

DK 165455 B

EKSEMPEL 1 31

En blanding af phenylpyrødruesyre (753 mg) og L-alanyl-L-prolin (171 mg) i methanol-vand indstilles til pH 6,8 og be-5 handles med natriumcyanoborhydrid (173 mg) ved stuetemperatur, indtil reaktionen er fuldstændig. Produktet absorberes på stærk kationbytterharpiks og elueres med 2 pct.'s pyridin i vand til opnåelse af 294 mg råt diastereomert produkt, N-(l-carboxy-2-phenylethyl)-L-alanyl-L-prolin. En portion renses 10 ved gelfiltrering (LH-20) til spektrografisk analyse. NMR-spektret viser en bred singlet ved 7,2, kompleks absorption fra 3,0 til 4,6, en multiplet ved 2,1 og et par dubletter ved 1,5 ppm.

15 EKSEMPEL 2

Nzilr2§£boxyethyli-L-alanyl-L-prolin

En opløsning af L-alanyl-L-prolin (372 mg) og pyrø.druesyre (881 mg) i vand indstilles til pH 7 og behandles med 377 mg 20 natriumcyanoborhydrid ved stuetemperatur, indtil omsætningen er komplet. Produktet absorberes på stærkt sur ionbytterhar-piks og elueres derpå med 2 pct.'s pyridin i vand. Frysetørring giver 472 mg N-(1-carboxyethyl)-L-alanyl-L-prolin. NMR- og massespektrogram er i overensstemmelse med strukturen. NMR-25 spektret viser multipletter centreret ved 4,5, 3,7 og 2,2 ppm, og et par dubletter ved 1,6 ppm.

EKSEMPEL 3 30

NzlllSSEboSYZ^-cyclghexylethyli-L^alanyl-L-prolin 3-cyclohexyl-2-oxopropionsyre (cyclohexylpyrodruesyre) (0,98 g) og L-alanyl-L-prolin (0,22 g) blev behandlet med natriumcyanoborhydrid (0,22 g) som beskrevet i det foregående. Der 35 blev opnået et let farvet fast stof, N-(l-carboxy-2-cyclohexyl)”

DK 165455 B

32 L-alanyl-L-prolin, 0,31 g. Efter rensning ved kromatografi viste massespektret spidser ved 340 (molekylarion), 322, 277, 249 og 226. NMR-spektret viste kompleks absorption i området 4,8 til 3,6, og spidser ved 2,2, 1,7 og 1,2 ppm.

5 EKSEMPEL 4 6-methyl-2-oxoheptansyre (0,90 g) og L-alanyl-L-prolin (0,21 g) blev behandlet med natriumcyanoborhydrid (0,21 g) som beskrevet i det foregående. Der blev opnået et hvidt fnugget 10 fast stof, N-(l-carboxy-5-methylhexyl)-L-alanyl-L-prolin (0,24 g). Efter rensning ved kromatografi viste massespektret en spids ved 472 (disilylderivat). NMR-spektret viste absorption centret ved 4,5 3,65, 2,0, 1,6, 1,3 og 0,85 ppm.

EKSEMPEL 5 15 N-^l-carboxy-3-methylbutyl)_-L2alanyl-L-grolin 4-methyl-2-oxopentansyre (1,29 g) og L-alanyl-L-prolin (0,32 g) blev behandlet med natriumcyanoborhydrid (0,32 g) som beskrevet i det foregående. Der blev opnået et fnugget hvidt fast stof, N-(l-carboxy-3-methylbutyl)-L-alanyl-L-prolin, (0,40 g).

20 En portion blev renset ved kromatografi. Massespektret viste en spids ved 429 (molekylarion af disilylderivat minus methyl 444-15). NMR-spektret viste resonanser centret ved 4,4, 3,6, 2,1, 1,6 og 0,95 ppm.

EKSEMPEL 6 25 N-^l-carboxypropYl)-L-alanyl-L-prolin 2-oxosmørsyre (1,02 g) og L-alanyl-L-prolin (0,37 g) blev behandlet med natriumcyanoborhydrid (0,38 g) som beskrevet i det foregående. Der blev opnået rå N-(1-carboxypropyl)-L-alanyl-L-prolin (0,42 g). En del blev kromatograferet til spektral-30 analyse. Massespektret viste fremtrædende spidser ved 254 33

DK 16b4bb B

(M-18) og 210 (M-62) . NMR-spektret udviste kompleks absorption fra 4,5 til 3,4, en multiplet centret ved 2,0 og methyl-resonanser centret ved 1,55 og 0,95 ppm.

EKSEMPEL 7

NiilicarboxY-g-methYlgropyl^L-alanyl-L-prolin 5 En blanding af 3-methyl-2-oxosmørsyre-natriumsalt (1,46 g) og L-alanyl-L-prolin (0,40 g) blev behandlet med natriumcy-anoborhydrid (0,41 g) som beskrevet i det foregående. Der blev opnået rå N-(l-carboxy-2-methylpropyl)-L-alanyl-L-prolin (0,45 g) ved eluering fra ionbytterharpiks. Produktet 10 smeltede ved 131 - 142°C. NMR-spektret viser kompleks absorption i området 4,6 til 3,3, en bred multiplet centret ved 2,2 og dubletter ved 1,65 og 1,1 ppm.

EKSEMPEL 8

Nzll^.3-dicarbpxyprogyl)_i:hi:§l§SYlzi;ZEE2iiS

15 2-oxoglutarsyre (1,46 g) og L-alanyl-L-prolin (0,37 g) blev behandlet med natriumcyanoborhydrid (0,38 g) som beskrevet i det foregående. Rå N-(1,3-dicarboxypropyl)-L-alanyl-L-prolin (0,47 g) blev opnået, smp.: 140 - 160°C. Massespektret af silyleret materiale viste en ion ved 517 m/e ækvivalent 20 til den molekylære ion for det trisilylerede derivat minus methyl (532-15). NMR-spektret var i overensstemmelse med strukturen. Methylresonanser var centreret ved 1,4 ppm.

EKSEMPEL 9 N-jlx4-dicarbqxybutyl2-L-alanyl-L-prolin 25 2-oxoadipinsyre (1,74 g) og L-alanyl-L-prolin (0,41 g) blev behandlet med natriumcyanoborhydrid (0,42 g) som beskrevet i det foregående. Der blev opnået rå N-(1,4-dicarboxybutyl)-L-alanyl-L-prolin (0,35 g), smp.: 106 - 132°C. Den højeste spids i massespektret var 312 svarende til molekylarionen

DK 165455B

34 minus vand. Methylresonanserne i NMR-spektret viser et par dubletter centreret ved 1,55 ppm.

EKSEMPEL· 10 5 En opløsning af L-alanyl-L-isoleucin (150 mg) og 4-methyl-2-oxopentansyrenatriumsalt (564 mg) i vand blev indstillet til pH 7 og behandlet med 140 mg natriumcyanoborhydrid ved stuetemperatur i flere dage. Reaktionen blev afskrækket med stærkt sur ionbytterharpiks, sat til en kolonne af samme harpiks, 10 og elueret med 2 pct.'s pyridin i vand. Frysetørring gav 200 mg (84,9 pct.) hvidt fnugget fast stof, N-(1-carboxy- 3-methylbutyl)-L-alanyl-L-isoleucin. Massespektret viste spidser ved 460 for det disilylerede derivat og 445 for di-silylmolekylarionen minus methyl (460-15). NMR-spektret viste 15 en bred dublet centreret ved 0,95 ppm, kompleks absorption i området 1,2 - 1,8 ppm og en bred svag singlet ved 3,7 ppm.

EKSEMPEL 11

En opløsning af L-alanyl-L-phenylalanin (150 mg) og 4-methyl-20 2-oxopentansyrenatriumsalt (483 mg) i vand blev indstillet til pH 7 og behandlet med 120 mg natriumcyanoborhydrid ved stuetemperatur i flere dage. Reaktionen blev afskrækket med "Dowex" 50 (H+), sat til en kolonne med samme harpiks og elueret med 2 pct.'s pyridin i vand. Frysetørring gav 197 mg (88,7 25 pct.) hvidt fnugget fast stof, N-(l-carboxy-3-methylbutyl)-L-alanyl-L-phenylalanin. Massespektrum viste spidser ved 551 for trisilylderivatet minus methyl (566-15), 479 for disilyl-derivatet minus methyl (494-15) og 449 for trisilylderivatet minus -COOTMS (566-117). NMR-spektret viste brede dubletter 30 ved 0,95 og 1,5 ppm, kompleks svag absorption i området 2,8 - 3,4 ppm og en singlet ved 7,1 ppm. Integrationen var i overensstemmelse med den struktur, der giver det rette forhold mellem aromatiske og alifatiske protoner.

Nz£§rboxYmethYl-L-alanYl;L-grolin EKSEMPEL 12 35 I en lille kolbe udstyret med en pH-elektrode kombineres 1,05 g L-alanyl-L-prolin og 1,2 ml 4 M NaOH. Der tilsættes 0,53 g 5 chloreddikesyre i 1,2 ml 2 M NaOH. pH indstilles til 8-9, der opvarmes til 85°C, og pH holdes ved 8-9 i 15 minutter ved tilsætning af NaOH efter behov. Der tilsættes yderligere 0,53 g chloreddikesyre og NaOH efter behov i 15 minutter. Der tilsættes en tredje portion på 0,53 g chloreddikesyre, pH holdes 10 på 8-9 i 15 minutter, og reaktionsblandingen holdes yderligere 15 minutter ved 85°C og afkøles. Reaktionsblandingen passeres gennem en søjle af "Dowex" 50 (H+), der vaskes med vand og elueres med 2 pct.'s pyridin i vand. De fraktioner, der har en positiv ninhydrin-reaktion, kombineres og koncentreres 15 til et lille volumen i vakuum og frysetørres.

Dette materiale opløses i nogle få milliliter vand og sættes til en søjle med "Dowex" 50 (Na+). Der elueres med 0,5 M citronsyre indstillet til pH 3,3 med NaOH. Det ønskede produkt kommer først ud (ninhydrin-test), godt opløst fra uomsat 20 alanylprolin. Produktfraktionen koncentreres i vakuum til en vægt på cirka 300 g.

Opløsningen sættes til en kolonne med "Dowex" 50 (H+). Der vaskes med vand, derpå elueres produktet med 2 pct.'s pyridin i vand. Produktfraktionen koncentreres i vakuum til et lille 25 volumen og frysetørres. Der opnås 417 mg N-carboxymethyl-L-alanyl-L-prolin.

NMR-spektrum (D20, MeOH indre standard): 1,58 ppm (d, J = 6) med lidt følgende ved 1,53 (d, J = 6) (totalt 3H), 1,77 - 2,68 (bredt m, 4H), 3,63 (s) over 3,28 - 3,92 (m) (totalt 4H), 30 4,05-4,72 (bredt m, 2H) overlappet af vandspids ved 4,68.

NiilicarboxYethYll-L-alanyl-L-grolin EKSEMPEL 13 36

DK 165455B

45 g benzylpyrovat og 4,5 g L-alanin opløses i en blanding af 115 ml vand og 250 ml p-dioxan. pH indstilles til 5,5 med NaOH. 5 Der tilsættes 9,4 g natriumcyanoborhydrid og omrøres ved stuetemperatur i 6 dage. pH indstilles til 1 med koncentreret HC1.

Denne opløsning sættes til en søjle med "Dowex" 50 (H+) fremstillet i 50 pct.'s dioxan-vand. Der vaskes med 50 pct.'s 10 dioxan-vand, efterfulgt af vand. Produktet elueres med 2 pct.'s pyridin i vand, produktfraktionerne kombineres og koncentreres til tørhed i vakuum. Den faste rest tritureres med vand, der filtreres og vaskes med vand. Der tørres til opnåelse af 6,8 g N-(1-carbobenzoxyethyl)-L-alanin som en 15 blanding af diastereoisomere. En anden portion på 1,0 g kan opnås fra det faste stof i moderluden.

208 mg af ovennævnte forbindelse og 217 mg L-prolin-benzylester-hydrochlorid opløses i tør dimethylformamid.. Der afkøles til 0°C og tilsættes 0,193 ml diphenylphosphorylazid opløst i 20 dimethylformamid. Derpå tilsættes der dråbevis i løbet af 10 minutter en opløsning af 0,24 ml triethylamin i dimethylformamid, idet temperaturen holdes ved 0°C. Der omrøres 3 timer ved 0°C og derpå natten over ved stuetemperatur.

Blandingen fortyndes med ethylacetat, der vaskes med vand og 25 5 pct.'s natriumbicarbonat. Der koncentreres i vakuum til et lille volumen og kromatograferes på en præparativ silica-tyndtlagskromatografiplade, idet der udvikles med ethylacetat. Det brede bånd ved = 0,5 - 0,6 skrabes af, der elueres med ethylacetat, og opløsningsmidlet afstrippes til opnåelse af 30 212 mg af en blanding af diastereoisomere af N-(l-carbobenzoxy- ethyl)-L-alanyl-L-prolin-benzylester.

37

DK 1654bbK

135 mg af ovennævnte forbindelse opløses i en blanding af methanol og vand. Der tilsættes 50 mg 10 pct.'s Pd på C-katalysator og hydrogeneres ved 276 kPa ^'s tryk og stuetemperatur. Der filtreres, koncentreres i vakuum og frysetørres 5 til opnåelse af 95 mg af en blanding af de diastereoisomere af N-(1-carboxyethyl)-L-alanyl-L-prolin. NMR-spektret er sammenligneligt med det i eksempel 2 anførte, og massespektret for det silylerede derivat viser samme fragmentmønster.

EKSEMPEL 14 N-(1-carboxyethyl)-alanyl-L-prolin 0,75 g N-(l-carbobenzoxyethyl)-alanin opløses i pyridin, og der tilsættes 7,5 ml 1 M triethylamin i pyridin. Der afkøles og tilsættes 1,09 g L-prolin-benzylester-hydrochlorid og 0,678 g dicyclohexylcarbodiimid. Blandingen henstår 20 15 timer ved 0°C. Dernæst filtreres blandingen, og der koncentreres i vakuum. Resten opløses i ethylacetat, og opløsningen vaskes med mættet I^COg, efterfulgt af saltvand. Den organiske fase tørres, koncentreres i vakuum, hvorpå resten kromato-graferes på silicagel med ethylacetat-hexan til isolering af 20 den diastereoisomere blanding af N-(l-carbobenzoxyethyl)-alanyl-L-prolin.

Der hydrogeneres på sædvanlig måde med 10 pct.'s Pd/C i vandig ethanol og opnås efter oparbejdning og frysetørring N-(l-carboxyethy1)-alanyl-L-prolin som et hvidt fast stof.

25 NMR-spektrum (D20): 1,65 ppm (d, 6H) 1,9 - 2,6 (m, 4H) 3,5 - 4,2 (m, 3H) 4,3 - 4,8 (m, 2H).

EKSEMPEL 15 30 N-il-carbomethoxyethyl2^alanyl-L-grolin

En opløsning af 1,4 g methyl-L-alaninat,HCl og 3,1 g a-brom-propionsyre i dioxan-vandblanding neutraliseres til pH 9 med

DK 165455B

38 natriumhydroxid. Der opvarmes til 70°C, og temperaturen holdes i 30 minutter, idet pH holdes ved 8-9 ved tilsætning af natriumhydroxid efter behov. Der afkøles, blandingen sættes til en søjle af "Dowex" 50 (H+) ionbytterharpiks, der vaskes 5 med vand og elueres med 2 pct.'s pyridin i’vand. Produktfraktionerne kombineres, og der frysetørres. Dette rå produkt renses ved kromatografi på en ionbyttersøjle med ’’Dowex" 50 (Na+) i 0,5 M natriumcitratpuffer pH 3,3. Produktfraktionerne samles, koncentreres til et lille volumen i vakuum, og kroma-10 tografien på "Dowex” 50 (H+) gentages. Produktfraktionerne frysetørres til opnåelse af ren N-(1-carbomethoxyethyl)-alanin.

Dette mellemprodukt kobles med L-prolin-t-butylester under anvendelse af diphenylphosphorylazid som beskrevet i eksempel 13, hvorefter t-butylesteren fjernes ved opløsning deraf i tri-15 fluoreddikesyre ved stuetemperatur i 3 timer, afdestillering af JL.

TFA og rensning på en søjle af "Dowex” 50 (H )-2 pct.'s pyridin som beskrevet, til opnåelse af N-(l-carbometnoxyethyl)-alanyl-prolin som en blanding af diastereoisomere.

EKSEMPEL 16 2 0 N-^ lzmethoxycarbonyl-3-methyl thiopropyl^-alanyl^L-prolin

En opløsning af pyruvoyl-L-prolin (185 mg), L-methioninmethyl-ester (600 mg) og natriumcyanoborhydrid (200 mg) i 20 ml methanol indstilles til neutralitet med fortyndet methanolisk natriumhydroxid. Efter henstand ved stuetemperatur i 3 dage 25 absorberes produktet på stærkt sur ionbytterharpiks, og det elueres med 2 pct.'s pyridin i vand til opnåelse af 80 mg produkt. NMR-spektret viser OCH3 ved 3,95S, S-Ch3 ved 2,2i og CH-CH3 ved 1,55 og 1,7 £ Massespektrogrammet af silyleret materiale viser den forventede molekylarion ved 404 m/e, 30 EKSEMPEL 17 N-JilJlS) 7 c arboxy- 3 -methy lthiopr opy 1) -alany 1-L-pr olin

En opløsning af N-(1(S)-methoxycarbonyl-3-methylthiopropyl)-DL-alanyl-L-prolin (127,5 mg, 0,384 mM) i 2 ml vand behandles 39 UK 1004-000 under nitrogen med 7,82 ml 0,100 N natriumhydroxid (0,782 mM) og omrøres i 2,5 timer ved stuetemperatur. Produktet absorberes fra reaktionsblandingen på 30 ml "Dowex” 50 (H+) og elueres med 4 pct.'s vandig pyridin til opnåelse af 73,5 mg, 5 som yderligere renses over en LH-20 søjle til opnåelse af 55,7 mg produkt. NMR-spektret i D20 viser S-CH^ ved 2,1, CH-CHj ved 1,5 og 1,6<£ og ingen methylester. Massespektrogrammet af silyleret materiale viser den forventede molekylarion ved 462 m/e.

10 EKSEMPEL 18

NiIli^§thoxycarbonyl;2-X3-indolyl]_-ethylX-alanyl-L-prglin På tilsvarende måde som i eksempel 16 kondenseres tryptophan-methylester med pyruvoyl-L-prolin i nærværelse af natriumcyano-borhydrid til opnåelse af N-[l-methoxycarbonyl-2-(3-indolyl)~ 15 ethyl]-alanyl-L-prolin.

NMR-spektret i CDCl^ viser aromatiske protoner ved 6,9 til 7,7; protoner nabostillede til den aromatiske kerne og nabostillede til nitrogenet ved 2,8 til 3,9; alifatiske methylenprotoner ved 1,4 til 2,7 og alaninmethyl ved 1,0 til 1,4. Massespek-20 trogramet af silyleret materiale viser en ion ved 516 m/e i overensstemmelse med disilyleret materiale, der har mistet en CH3-gruppe.

EKSEMPEL 19

NlIliSiicarboxy-2-£3-inaolyl2;ethy^-DL-aianyl-L3grolin 25 På tilsvarende måde som i eksempel 17 hydrolyseres ovennævnte produkt til opnåelse af den forventede disyre. NMR-spektret i D20-d5Pyr viser 5 aromatiske protoner ved 6,8 til 7,7; 7 protoner nabostillet til den aromatiske kerne og nabostillet til nitrogenet ved 2,8 til 7,4 og 7 alifatiske protoner ved 30 1,0 til 2,2 ίi overensstemmelse med den forventede struktur.

Massespektrogrammet af silyleret materiale viser en spids ved 431 m/e udlagt som en protoneret monosilyleret ion, der har mistet en CH^-gruppe.

EKSEMPEL 20

DK 165455 B

40 N-_(l-carboxy-3-phenyIpropy1)-L-alanyl-L-4-thiazolidin-carbpxylsyre

tBoc-alanin (1,8 g) og L-thiazolidin-4-carboxylsyre-benzylester-_ hydrochlorid (2,6 g) kombineres i methylenchlorid. Ved 0 - 5°C

O

behandles med triethylamin (1,4 ml), dernæst med DCC (2,3 g) i methylenchlorid, hvorpå blandingen henstår natten over.

Efter filtrering og vask af filtratet med vand og natriumbi-carbonatopløsning afstrippes opløsningsmidlet, og der kromato-graferes på Silica G-60 (E. Merck) i ethylacetat-hexan. Opløsningsmidlet strippes fra de kombinerede produktfraktioner i vakuum. Benzylesteren hydrolyseres i acetonitril-vand ved pH 13,5 (NaOH) i 1 time ved stuetemperatur. Der neutraliseres til pH 8 med HC1, vaskes med ether, det vandige lag koncentreres i vakuum og frysetørres, t-butyloxycarbonyl-beskyttelsesgruppen fjernes i 4 M hydrogenchlorid i ethylace-tat, produktet fældes med ether, der filtreres og tørres til opnåelse af L-alanyl-L-thiazolidin-4-carboxylsyre. 0,385 g af dette produkt kondenseres med 1,88 g 2-oxo-4-phenylsmørsyre 2Q i vand under anvendelse af 0,354 g natriumcyanoborhydrid ved den i eksempel 2 beskrevne metode til opnåelse af 0,53 g af blandingen af diastereoisomere af N-(l-carboxy-3-phenyl-propyl)-L-alanyl-L-4-thiazolidin-carboxylsyre. NMR-spektret (D2O + NaOD) indeholder en splittet dublet ved 1,2 ppm (3H), 25 en singlet ved 7,1 (5H), bred absorption i området 1,6 til 2,0 (2H) og bred multi-absorption i området 2,2 til 4,1 og en stor vandspids ved 4,6 ppm. Massespektret af silyleret materiale viser molekylarionen af det disilylerede derivat ved m/e = 556.

30 EKSEMPEL 21

NzlllSå^oxy-S-phenylpropyl^-L^alanyl-L-pipecolinsyre

Ved at substituere L-pipecolinsyre-methylester-hydrochlorid 35 (1,8 g) med thiazolidin-carboxylsyreesteren fra eksempel 20 kan titelforbindelsen fremstilles ved den i nævnte eksempel beskrevne metode.

DK 165455B

41 NMR-spektret (CD^OD) viser en bred multiplet ved 1,3 - 1,9 ppm (9H), en singlet ved 7,22 (5H) og en række multipletter i området 2,0 - 4,8 ppm. Massespektret af det silylerede materiale udviser en spids ved m/e = 580 for den disilylerede mole-5 kylarion.

EKSEMPEL 22

Nzili£aEfe22II^IBi3§SYi2E2EYilliii:§i§SYJ:Zi;zNzmethylalanin

Ved at erstatte thiazolidincarboxylsyreesteren i eksempel 20 med L-N-methylalanin-methylester-hydrochloridet (1,5 g) kan 10 titelforbindelsen fremstilles ved den i nævnte eksempel beskrevne metode.

EKSEMPEL 23 N- (l-carboxy^l-methylethy1)-L-alanyl-L-prolin 7,7 g 2-bromisosmørsyre-benzylester, 2,4 g L-alanyl-L-prolin-15 t-butylester og 7,0 g sølvoxid kombineres i 40 ml benzen.

Der koges under tilbagesvaling i 24 timer, hvorpå der tilsættes yderligere 7,7 g af bromesteren og 7,0 g sølvoxid, hvorpå der koges under tilbagesvaling i yderligere 24 timer. Der afkøles, filtreres, opløsningsmidlet afstrippes, diesteren af 20 produktet isoleres ved sædvanlige kromatografiske procedurer.

t-butylestergruppen i trifluoreddikesyre og benzylgruppen fjernes ved katalytisk hydrogenolyse på konventionel måde til opnåelse af den frie syre.

EKSEMPEL 24 2 5 N-j 1-carboxy-3-pheny lgropy l]_-L-alanyl-L-prolin

En blanding af 4-phenyl-2-oxosmørsyre (1,49 g) og L-alanyl-L-prolin (0,31 g) i vand indstilles til pH 7,5 med base og behandles med natriumcyanoborhydrid (0,32 g) natten over. Produktet absorberes på stærkt sur ionbytterharpiks og elueres med 2 %'s 30 pyridin i vand til opnåelse af 0,36 g råt diastereomert produkt, N-(l-carboxy-3-phenyl-propyl)-L-alanyl-L-prolin. En del renses ved gelfiltrering (LH-20) til spektrografisk analy-

DK 165455B

42 se. NMR-spektret i DMSO viser aromatisk hydrogen ved 7,20, en bred singlet ved 4,30, brede multipletter ved 3,0 - 3,9, 2,67 og 1,94 og en dublet ved 1,23 og 1,15. Massespektret viser en molekylårion ved 492 m/e for det di-trimethylsilyle-5 rede produkt.

EKSEMPEL 25

Nliilcarboxy-3-ghenylgrogyl2-L-alanyl-L-prolin

XAD-2 polystyrenharpiks (Rohm & Haas Co.) formales og sigtes. 200-400 mesh fraktionen udtages, og 440 ml fyldes på en kroma-10 tografisk søjle. Der tilvejebringes ligevægt med 0,1 M

NHjOH i forholdet 95:5 (vol./vol.) vand-methanol. Til søjlen sættes 350 mg N-(l-carboxy-3-phenyl-propyl)-L-alanyl-L-prolin, fremstillet og renset som beskrevet i eksempel 24, opløst i 10 ml af samme opløsningsmiddel. Der elueres med dette opløsnings-15 middel. Den første isomere kommer ud fra søjlen i volumenområdet 375 - 400 ml elueringsmiddel. Den anden isomere kommer i området 440 - 480 ml med mellemproduktfraktionerne indeholdende en blanding af de isomere. Den fraktion, der indeholder den første isomere, frysetørres til opnåelse af 130 mg hvidt fast 20 stof. Omkrystallisering fra 1 ml vand indstillet til pH 3 giver 94 mg hvide nåle, smp.: 148 - 151°C (dek.). Dette er den mere aktive isomere, og den har S,S,S-konfiguration som bestemt ved røntgenanalyse.

[a]D = -67,0° (0,1 M HC1) efter tørring i vakuum over P2°5* 25 NMR (DMSO) viser en enkelt dublet for methylprotonerne ved 1,22 ppm. Fraktionen indeholdende den anden isomere frysetørres til opnåelse af 122 mg hvidt fast stof. 103 g omkrystalliseres fra 2,5 ml vand indstillet til pH 3, hvorved der opnås 64 g fjerlignende hvide krystaller, smp.: 140 - 145°C (dek.), 30 ta]D = -101,6° (0,1 M HCl) efter tørring. NMR (DMSO) viser methyldubletten ved 1,17 ppm.

EKSEMPEL 26 N-(1-(S)-ethoxycarbpny1-3-phenylpropy1^-L-alanyl-L-prolin

L/IY I OWUU D

43

Ethyl-2-oxo-4-phenylbutyrat (1,03 g) og L-alanyl-L-prolin (0,19 g) opløses i 1:1 ethanol/vand-opløsningsmlddel. En opløsning af natriumcyanoborhydrid (0,19 g) i ethanol/vand tilsættes dråbevis ved stuetemperatur i løbet af 2 timer. Når 5 reaktionen er fuldstændig, absorberes produktet i stærkt sur ionbytterharpiks og elueres med 2 pct.'s pyridin i vand.

De produktrige fraktioner frysetørres til opnåelse af 0,25 g rå N-(l-ethoxycarbonyl-3-phenylpropyl)-L-alanyl-L-prolin. Massespektret viser en molekylarion ved 448 m/e for det mono-10 silylerede produkt. Kromatgorafi giver den ønskede isomere.

EKSEMPEL 27 På samme måde som beskrevet i eksempel 26 kondenseres 2-oxo- 4-phenylbutyramid og L-alanyl-L-prolin i nærværelse af na-15 triumcyanoborhydrid til opnåelse af N-(l-amino-carbonyl-3-phenylpropyl)-L-alanyl-L-prolin.

EKSEMPEL 28

Nyilygg^bggyr3ipbenylpropyl)-L-alanyl-L-tryptophan På samme måde som beskrevet i eksempel 24 kondenseres 2-oxo-20 4-phenylsmørsyre og L-alanyl-L-tryptophan i nærværelse af natriumcyanoborhydrid til opnåelse af N-(l-carboxy-3-phenyl-propy1)-L-alanyl-L-tryptophan.

EKSEMPEL 29

NlllzCSSboxy-S-phenylgropyl^-L-alanyl-L-^-hydrgxyorglin 25 På samme måde som beskrevet i eksempel 24 kondenseres 2-oxo- 4-phenylsmørsyre og L-alanyl-L-4-hydroxyprolin i nærværelse af natriumcyanoborhydrid til opnåelse af N-(l-carboxy-3-phenyl-propyl)-L-alanyl-L-4-hydroxyprolin.

DK 165455B

44 NMR-spektret i deuteromethanol udviser en dublet centreret ved 1,53 ppm (3H), en singlet ved 7,13 (5H) og en række multipletter i området 2,0 - 4,7 ppm. Massespektret af silyleret materiale viser molekylarionen af det trisilylerede produkt 5 ved m/e = 580.

EKSEMPEL 30

Nzllzcarbgxy-3-phenylpropylj_-L-serinyl-L-grolin På samme måde som beskrevet i eksempel 24 kondenseres 2-oxo- 4-phenyIsmørsyre og L-serinyl-L-prolin i nærværelse af natri-10 umcyanoborhydrid til opnåelse af N-(l-carboxy-3-phenylpropyl)-L-serinyl-L-prolin.

Massespektrum viser en molekylarion ved 580 m/e for det trisily lerede produkt. NMR-spektret i D2O er i overensstemmelse med strukturen.

15 EKSEMPEL 31 N-jl-carboxy-3-phenylpropyl)-L-phenylalanyl-L-prolin På samme måde som beskrevet i eksempel 24 kondenseres 2-oxo-4-phenylsmØrsyre og L-phenylalanyl-L-prolin i nærværelse af natriumcyanoborhydrid til opnåelse af N-(l-carboxy-3-phenyl-20 propyl)-L-phenylalanyl-L-prolin.

Massespektret viser en ion ved 406 m/e for molekylarionen minus vand (424-18). NMR-spektret i D2O var i overensstemmelse med strukturen.

EKSEMPEL 32 25 N-Jnl-carboxY23-phenylpropyl/-L-cygteinyl-L-prolin På samme måde som beskrevet i eksempel 24 kondenseres 2-oxo-4-phenylsmørsyre og L-S-benzylcysteinyl-L-prolin i nærværelse

DK 165455 B

45 af natriumcyanoborhydrid. Produktet behandles med natrium i flydende ammoniak til opnåelse af N-(l-carboxy-3-phenylpro-pyl)-L-cysteinyl-L-prolin.

EKSEMPEL 33 5 N-Jl-carboxy-3-ghenylnropyl)^L-histidinyl-L-leucin På samme måde som beskrevet i eksempel 24 kondenseres 2-oxo-4-phenylsmørsyre og L-histidinyl-L-leucin i nærværelse af natriumcyanoborhydrid til opnåelse af N-(l-carboxy-3-phenyl-propy1)-L-histidinyl-L-leucin.

10 EKSEMPEL 34 i?ziizS§£^25Yl^lEi}§SYiE£2EZilliilEii§nylalanyl-L-arginin På samme måde som beskrevet i eksempel 24 kondenseres 2-oxo-4-phenylsmørsyre og L-phenylalanyl-L-arginin i nærværelse af natriumcyanoborhydrid til opnåelse af N-(l-carboxy-3-phenyl-15 propyl)-L-phenylalanyl-L-arginin.

EKSEMPEL 35

Nlllzcarboxy-S-phenylpropyl^-L-phenylalanyl-L-tryEtoohan På samme måde som beskrevet i eksempel 24 kondenseres 2-oxo-4-phenylsmørsyre og L-phenylalanyl-L-tryptophan i nærværelse 20 af natriumcyanoborhydrid til opnåelse af N-(l-carboxy-3-phenyl-propyl)-L-phenylalanyl-L-tryptophan.

EKSEMPEL 36

NiIlz2§E^22Y“lzi3zindolyl].2rggylj_-L-alanyl;L-prolin På samme måde som beskrevet i eksempel 24 kondenseres 4—(3— 25 indolyl)-2-oxosmørsyre og L-alanyl-L-prolin i nærværelse af natriumcyanoborhydrid til opnåelse af N-[l-carboxy-3-(3-indo-lyl)propyl]-L-alanyl-L-prolin.

EKSEMPEL 37 46

DK 165455B

N-(l-carboxy-3-phenylpropyl)-L-alanyl-S^j-dehydrogrolin

En blanding af 3,4-dehydroprolin (2,3 g), t-Boc-L-alanin-N-hydroxysuccinimidester (7,2 g) og natriumcarbonat (2,5 g) 5 i en dioxan/vand-blanding omrøres ved 0°C natten over. Der neutraliseres til pH 8 med HC1. Der koncentreres til et lille volumen i vakuum og frysetørres. t-Boc-beskyttelsesgruppen fjernes med trifluoreddikesyre på sædvanlig måde, og produktet kromatograferes på "Dowex" 50 (H+), idet der elueres med 2 10 pct.'s pyridin i vand som beskrevet i eksempel 2. Dipeptidet isoleres ved frysetørring. Dette produkt kobles med 2-keto-4-phenylsmørsyre på samme måde som beskrevet i eksempel 24 til opnåelse af produktet som en blanding af diastereoisomere. Massespektret viser en molekylarion ved 490 m/e for det di-15 silylerede produkt.

Den diastereomere blanding (140 mg) som fremstillet i det foregående opspaltes i sine komponenter ved kromatografi på "XAD-2"-harpiks som beskrevet i eksempel 25. Hovedkomponenten (70 mg) elueres først fra søjlen, aD -143° (c = 1,3, methanol). Mas-20 sespektret for hver komponent viser en molekylarion ved 490 m/e for de ditrimethylsilylerede produxter.

EKSEMPEL 38 N-(l-carboxy-3-ghenylpropyl)-L-alanyl-2-methyl-thiazolidin-4- 25 Denne forbindelse fremstilles på den i eksempel 37 beskrevne måde, idet man erstatter de 2,3 g 3,4-dehydroprolin med 2,9 g 2-methylthiazolidin-4-carboxylsyre.

EKSEMPEL 39 N-^l-carboxy-3-ghenylOropyli3L-alanyl-2;methylalanin 30 Denne forbindelse fremstilles på den.i eksempel 37 beskrevne 47 måde, idet man erstatter de 2,3 g 3,4-dehydroprolin med 1,8 g 2-methylalanin.

EKSEMPEL 40 T^rfyldte_kagsler_indeholdende_50_mg__aktiy_bestanddel_2r>1_kagsel 5 Pr. kapsel N-(l-carboxy-2-phenylethyl)-L-alanyl-L-prolin 50 mg Lactose 149 mg

Magnesiumstearat 1 mg

Kapsel (størrelse nr. 1) 200 mg 10 N-(l-carboxy-2-phenylethyl)-L-alanyl-L-prolinet findeles til et pulver nr. 60, og derpå passeres lactose og magnesium-stearat gennem en nr. 60 sigtedug ned på pulveret, og de kombinerede bestanddele blandes i 10 minutter og fyldes derpå i en nr. 1 tør gelatinekapsel.

15 EKSEMPEL 41

iJzilr§thgxycarbonyl;3-ghenylprogyl]."Lzåi§2Y2:ZiiZEE2iiD

En opløsning af L-alanyl-L-prolin (7,7 g) og ethyl-2-oxo-4-phenylbutyrat (42,6 g) i 140 ml ethanol omrøres med 64 g pulverformige molekylsigter ved stuetemperatur i 0,5 timer.

20 En opløsning af natriumcyanoborhydrid (2,6 g) i 40 ml ethanol tilsættes derpå langsomt i løbet af 6 timer. Efter frafiltre-ring af sigterne koncentreres reaktionsblandingen under vakuum til et lille volumen. Resten fordeles mellem CHCl^ og vand. pH indstilles til 8,5, og CHCl-j-laget fraskilles og 25 smides væk. Det vandige lag syrnes til pH 2,7, og produktet ekstraheres over i chloroform. Chloroforraekstrakten tørres over Na2SC>4 og koncentreres under vakuum til opnåelse af 10,4 g blandede diastereomere. HPLC indikerer, at hovedpro-. duktet er det ønskede N-(1-(S)-ethoxycarbonyl-3-phenylpropyl)-30 L-alanyl-L-prolin.

EKSEMPEL 42 48

DK 165455B

N-^l-_(S)_-ethgxYcarbonYl-3-gheriYlprogYl)_-L-alanYl-L-grolin-

En opløsning af N-(l-ethoxycarbonyl-3-phenylpropyl-L-prolin), 5 blandede isomere (13,8 g) i 69 ml acetonitril behandles med 4,25 g maleinsyre og 69 ml acetonitril. Efter omrøring i 1 time ved stuetemperatur filtreres det faste stof, det vaskes med acetonitril og lufttørres til opnåelse af 8,4 g maleat-salt, smp.: 141 - 145°C, ifølge HPLC cirka 96 % rent. Det 10 rå maleatsalt omkrystalliseres fra acetonitril til opnåelse af 7,1 g N-(1-(S)-ethoxycarbony1-3-phenylpropyl)-L-alanyl-L-prolin-maleatsalt, smp.: 148 - 150°C, ifølge HPLC cirka 99 % rent.

EKSEMPEL 43 15 A. N- (l-ethoxycarbony;l--3-phenylpropyl) -L-alanyl-L-prolin

En blanding af 0,814 g L-alanyl-L-prolin, 0,206 g ethyl-2-oxo-4-phenylbutyrat og 1,6 g molekylsigter i 10 ml ethanol hydrogeneres ved stuetemperatur under et tryk på 276 kPa med 0,1 g 10 pct.’s Pd på carbon som katalysator. Efter endt hydrogen-20 optagelse absorberes det rå produkt, der er opnået ved filtrering og koncentrering, på ionbytterharpiks, ("Dowex" 50, H ), og det elueres med 2 pct.'s pyridin i vand til opnåelse af 0,224 g N-(l-ethoxycarbonyl-3-phenylpropyl)-L-alanyl-L-prolin. HPLC indikerer et isomerforhold på 55:45.

25 B. N-.[l- _(S) -ethoxycarbonyl-3-phehylpropyl] -L-alanyl-L-prolin- male insyresa.lt

En blanding af 3 g L-alanyl-L-prolin, 5 g ethyl-2-oxo-4-phenyl-butanoat, 13 g 3A molekylsigter og 3,6 g Raney-nikkel i 85 ml ethanol hydrogeneres ved 25°C og 276 kPa hydrogen, indtil endt 30 hydrogenoptagelse. De faste stoffer frafiltreres, vaskes med 80 ml ethanol, og filtraterne kombineres. Forsøg ved højtryksvæskekromatografi viser et forhold på 87:13 mellem diastereo-

DK 165455 B

49 isomere til fordel for det ønskede produkt. Ethanol fjernes under vakuum til opnåelse af en olie, som opløses i 60 ml vand og 20 ml ethylacetat. pH for den omrørte tofaseblanding indstilles til 8,6 med 50 pct.'s NaOH. Lagene adskilles, og den 5 vandige fase ekstraheres med yderligere 2 x 20 ml ethylacetat. Vandfasen indstilles til pH 4,25 med saltsyre, 12 g NaCl opløses i vandet, og produktet ekstraheres med 5 x 12 ml ethylacetat. Ekstrakterne kombineres og tørres med Na2SO^. Det ønskede produkt, N-[l-(S)-ethoxycarbonyl-3~phenylpropyl)-L-10 alanyl-L-prolin, krystalliseres som sit maleatsalt ved tilsætning af 1,86 g maleinsyre. Efter omrøring i 4 timer filtreres saltet, det vaskes med ethylacetat og tørres til opnåelse af 5,2 g rent produkt, smp.: 150 - 151°C.

EKSEMPEL 44 15 N-^l-benzylgxycarbonyl-3-gh§nylgro2yl]_-L-alanyl-L;2rolin

En opløsning af L-alanyl-L-prolin (167 mg) og benzyl-2-oxo-4-phenylbutyrat (1,20 g) i 5 ml ethanol omrøres ved stuetemperatur med 3 g pulverformige molekylsigter, type 4A. Natrium-cyanoborhydrid (75 mg) tilsættes derpå i portioner i løbet af 20 3 timer. Produktet renses ved absorption på stærk kation- bytterharpiks og elueres med 2 pct.'s pyridin i vand. Efter passage gennem en gelfiltreringssøjle (LH-20) opnås 220 mg N-(1-benzyloxycarbony 1-3-phenylpropy 1) -L-alanyl-L-prolin som en blanding af isomere. Tyndtlagskromatografi på silicagel 25 elueret med 1 EtOAc, 1 n-butanol, 1 ^0, 1 HOAc viser én hovedplet, Rf = 0,71. Isomere adskilles under anvendelse af HPLC med omvendt fase til opnåelse af N-(1(S)-benzyloxycarbony 1- 3-phenylpropy1)-L-alany1-L-prolin.

På lignende måde giver N-acetylaminoethyl-2~oxo-4-phenyl-30 butyrat og L-alanyl-L-prolin, når de reduceres med natrium- cyanoborhydrid N-[1-(2-acetamino)-ethoxycarbony1-3-pheny1-propyl]-L-alanyl-L-prolin.

Tilsvarende giver dimethylaminoethyl-2-oxo-4-phenylbutyrat og L-alanyl-L-prolin N-[1-(2-dimethylamino)-ethoxycarbonyl-3- phenylpropyl]-L-alanyl-L-prolin.

50

DK 165455B

Tilsvarende giver benzyl-2-oxo-5-methylhexanoat og L-alanyl-L-5 prolin N-(l-benzyloxycarbonyl-4-methylpentyl)-L-alanyl-L-prolin.

EKSEMPEL 45 N-(1-butoxycarbony1-3-phenylpropy1)-L-alanyl-L-prolin

En opløsning af N-benzyloxycarbonyl-L-alanyl-L-prolin 3° 10 butylester (452 mg) i 5 ml benzen hydrogeneres over 150 mg 10 pct.'s Pd på carbon til fjernelse af den nitrogenbeskyttende gruppe. Efter filtrering og afdampning af opløsningsmidlet opløses L-alanyl^L-prolin 3° butylesteren i 8 ml tetrahydrofuran, og den behandles med 1/41 g butyl-2-oxo-15 4-phenylbutyrat og 3 g pulverformige molekylsigter. Natrium-cyanoborhydrid (150 mg) tilsættes portionsvis i løbet af flere timer/ og blandingen omrøres ved stuetemperatur natten over. Efter filtrering og koncentrering under vakuum behandles resten med 25 ml trifluoreddikesyre ved stuetemperatur i 2 20 timer. Efter fjernelse af syren renses produktet ved absorption på ionbytterharpiks og gelfiltrering (LH-20). Koncentrering og tørring af produktrige fraktioner giver 182 mg N- (1-butoxycarbony1-3-phenylpropyl)-L-alanyl-L-prolin som en blanding af isomere. Tyndtlagskromatografi (silicagel, 25 1 EtOAc, 1 butanol, 1 E^O, 1 HOAc) viser to pletter, - = 0,67 og 0,72. Massespektret viser spidser ved 548 (disily-leret molekylarion) og 476 (monosilyleret molekylarion).

Isomere opspaltes under anvendelse af HPLC med omvendt fase til opnåelse af N-(1(S)-butoxycarbony1-3-phenylpropyl)-L-30 alanyl-L-prolin.

EKSEMPEL 46

Mliil^ihoxycarbonYl-S-ghenYlprogyl^-L-alanyl-L-prglinethylester 51

UK lbb^DOB

En opløsning af 0,63 g N-(l-carboxy-3-phenylpropyl)-L-alanyl-L-prolin i 9,7 ml ethanol mættes med gasformig HC1 ved 0°C.

Efter henstand natten over ved stuetemperatur fjernes HC1 og ethanol under vakuum til opnåelse af en let gul olie, som 5 renses ved gelfiltrering (LH-20 søjle). Udbyttet af N-(l-ethoxycarbonyl-3-phenylpropy1)-L-alanyl-L-prolinethylester er 0,39 g, én plet ved tyndtlagskromatografi. NMR-spektret indikerer to ethylgrupper per aromatisk ring. Massespektret viser en molekylarion ved 404 m/e.

10 EKSEMPEL 47 N-(l-carboxy-37phenylpropyl)-L-alanyl-I>4a-methoxyprolin

Methyl-L-4a-methoxyprolinat-hydrochlorid fremstilles ud fra L-hydroxyprolin ved den metode, der er beskrevet af E. Adams et al., J. Biol. Chem., 208, 573 (1954), forestring med methanolisk 15 hydrogenchlorid efter standardmetode. Der kobles med Boc-L-alanin i methylenchlorid med dicyclohexylcarbodiimid som tidligere beskevet, mellemproduktet Boc-L-Ala-L-methoxy-Pro-OMe renses ved kromatografi på silica-gel under eluering med ethylacetat:hexan 1:1. Esteren hydrolyseres med natrium-20 hydroxid i acetonitril/vand, pH indstilles til 7,5, der frysetørres, og beskyttelsesgrupperne fjernes fra aminen med 4 M saltsyre i ethylacetat på sædvanlig måde. 0,54 g af denne L-alanyl-L-4a-methoxyprolin kondenseres med 2,0 g 2-oxo-4-phenylsmørsyre i 6 ml vand, idet der anvendes 0,43 g natrium-25 cyanoborhydrid på den i eksempel 24 beskrevne måde. Der isoleres som beskrevet i nævnte eksempel til opnåelse af 0,92 g af en blanding af diastereoisomere af N-(l-carboxy-3-phenyl-propyl)-L-alanyl-L-4a-methoxyprolin. NMR-spektret i D20 viser en splittet dublet centreret ved 1,58 ppm (3H), singlet 30 ved 3,37 (3H) og 7,35 ppm (5H), kompleks absorption i området 1,9; - 3,5 og en bred multiplet ved 4,0 - 4,6 ppm. Massespektrum viser fremtrædende spidser ved m/e = 360 (M-18) og 256 (M-122).

EKSEMPEL 48 52

DK 165455B

l?liIl£§22Zi25Y2§£]?2iiYll3-Ehen£lgroEYl2“L-alanYl-L-4a”methoxY- B£2ii£ L-alanyl-L-4a-methoxyprolin, fremstillet som angivet i eksem-5 pel 47 i det foregående, bobles med benzyl-2-oxo-4-phenyl-butyrat i ethanol under anvendelse af natriumcyanoborhydrid ved den metode, der er beskrevet i eksempel 44, til opnåelse af blandingen af diastereoisomere af N-(1-benzyloxycarbonyl- 3-phenylpropyl)-L-alanyl-L-prolin. Isomere adskilles under 10 anvendelse af HPLC med omvendt fase til opnåelse af N- (1 (S) — benzyloxycarbonyl-3-phenylpropyl)-L-alanyl-L-prolin.

EKSEMPEL 49 N-(l-benzylaminocarbonyl-3-phenylpropYl)-L-alanyl-L-prolin

Benzylamidet af 2-oxo-4-phenyl-smørsyre fremstilles ved at 15 opløse 3,0 g af denne syre, 2,4 ml benzylamin og 4,7 ml diphenylphosphorylazid i 60 ml kold dimethylformamid og dråbevis tilsætte 2,6 ml triethylamin i dimethylf ormamid, idet temperaturen holdes ved cirka -10°C i 2,5 timer.

Blandingen henstår natten over ved stuetemperatur, dimethyl-20 formamidet fjernes i vakuum, og resten fordeles mellem vand og ethylacetat. Indholdet af det organiske lag kromatograferes på silicagel, idet der elueres med ethylacetatihexan 1:4. Opløsningsmidlet afdampes fra produktfraktionerne til opnåelse af 2,2 g krystallinsk N-benzyl-2-oxo-4-phenylbutyramid.

25 1,26 g af denne forbindelse kobles med 0,19 g L-Ala-L-Pro under anvendelse af 0,125 g natriumcyanoborhydrid i ethanol på den i eksempel 44 beskrevne måde. Det rå produkt renses ved gelfiltrering (LH-20) til opnåelse af blandingen af diastereoisomere af N-(l-benzylaminocarbonyl-3-phenylpropyl)-30 L-alanyl-L-prolin. NMR-spektret (CDClg) viser en dublet ved 1,1 ppm (3H), et tæt par af singletter ved 7,3 (10H) og kompleks absorption ved 1,6 - 2,3 (6H), 2,3 - 2,9 (2H), 2,9 - 3,8 (4H) og 4,0 - 4,6 (3H). Massespektret af silyleret materiale viser fremtrædende spidser ved m/e = 509 (monosilylderivat) og EKSEMPEL 50 53

DK 16b4bb B

581 (disilylderivat).

N- (l-carboxy-3-phenyipropyl) -L-a 1 anyl-L-N-methylphenylaj._anin

Ved at erstatte N-methyl-L-phenylalanin-methylester med thia-5 zolidincarboxylsyreesteren i eksempel 20 fremstilles L-ala-nyl-N-methyl-L-phenylalanin. 0,85 g af denne forbindelse kondenseres med 3,02 g 2-oxo-4-phenylsmørsyre under anvendelse af 0,64 g natriumcyanoborhydrid i vand som beskrevet. Blandingen syrnes til pH 1,5 og ekstraheres over i ether.

10 Etheren afstrippes, resten opløses i 70 pct.'s methanol-vand, -i.

og der kromatograferes på "Dowex" 50 (H ) i noget opløsningsmiddel, idet der elueres med en opløsning af 3 pct.'s pyridin • i samme opløsningsmiddelblanding. Produktfraktionerne kombineres, koncentreres, frysetørres og renses på LH-20 i meth-15 anol til opnåelse af 0,54 g af blandingen af isomere af N- (l-carboxy-3-phenylpropyl)-L-alanyl-L-N-methylphenylalanin. NMR-spektret (D20, NaOD) udviser en dublet centreret ved 1,18 ppm (3H), to overlappende singletter ved 7,3 (IOH), en singlet ved 2,95 (3H) og brede multi-absorptioner i områderne 1,4 20 til 2,1 og 2,3 til 4,4. Massespektret for silyleret materiale viser den molekylåre ion af disilyleret materiale ved m/e = 556.

EKSEMPEL 51

Nrliz§thgxycarbonyl-3-phenylpropylX-L-alanyl-L-2rolinamid 25 L-alanyl-L-prolinamid fremstilles ved at koble t-Boc-L-alanin med L-prolinamid ved konventionelle metoder under anvendelse af dicyclohexylcarbodiimid i 4:1 methylenchlorid:DMF. Mellemproduktet t-Boc-L-Ala-L-Pro-NH2 renses ved kromatografi på LH-20 i methanol, efterfulgt af fjernelse af den t-Boc-be-30 skyttende gruppe i 4 M HCl i ethylacetat. 0,5 g af dette L-Ala-L-Pro-N^.HCl kobles i 10 ml absolut ethanol neutraliseret med et askvi valent triethylamin med 2,4 g ethyl-2-oxo-4-

DK 165455 B

54 phenylbutyrat under anvendelse af molekylsigter og 0,30 g natriumcyanoborhydrid som beskrevet i eksempel 41. I det foreliggende eksempel findes produktet i chloroformekstrakten ved pH 8,5; der koncentreres i vakuum, opløses i 50 pct. ethanol-5 vand, kromatograferes på "Dowex" 50 (H+) i 50 pct.'s ethanol-vand, og der elueres med 2 pct.'s pyridin i dette opløsningsmiddel. Produktfraktionerne kombineres og renses yderligere ved kromatografi på LH-20 i methanol. Opløsningsmidlet af-strippes i vakuum til opnåelse af 0,40 g N-(l-ethoxycarbonyl-3-10 phenylpropyl)-L-alanyl-L-prolinamid som en blanding af dia-stereoisomere. NMR-spektret (CDC^) udviser en triplet, der overlapper en dublet ved 1,1 - 1,5 ppm (6H), en serie på fem multipletter i området 1,5 - 4,7 ppm (15H) og en singlet ved 7,17 ppm (5H). Massespektret af silyleret materiale viser 15 fremtrædende spidser ved m/e = 477 (monosilyIderivater) og 519 (disilylderivat).

EKSEMPEL 52 N-(l-carboxy-3-phenYlpropyl)-L-alanyl-L-prolinamid L-alanyl-L-prolinamid, fremstillet som i eksempel 51, kobles 20 med 2-oxo-4-phenyIsmørsyre under anvendelse af natriumcyanoborhydrid i 50 pct.’s ethanol-vand ved den i eksempel 2 beskrevne metode. Efter eluering fra ionbytterharpiksen koncentreres der i vakuum til et lille volumen, der skylles med vand og frysetørres til opnåelse af N-(l-carboxy-3-phenyl-25 propyl)-L-alanyl-L-prolinamid som en blanding af diastereo-isomere.

EKSEMPEL 53 i?liii§il^Y^£2SY§SiS22§£^2SYlz32Ehenylpropyl.)_-L-alanyl-L-prolin

Til en kold opløsning af 0,19 g N-(l-ethoxycarbonyl-3-phenyl-30 propyl)-L-alanyl-L-prolin-maleatsalt, fremstillet som i eksempel 42, i 1 ml ethanol sættes 0,85 g kaliumhydroxid i 0,57 ml ethanol. Derpå tilsættes dråbevis en suspension af 0,07 g hydroxylamin-hydrochlorid i 0,9 ml ethanol indeholdende 0,060 g kaliumhydroxid. Reaktionsbeholderen holdes i isbad i 2 timer 55

UK Ί 00490 D

og derpå ved stuetemperatur natten over. Den overliggende væske afdekanteres, fortyndes med 10 ml vand, indstilles til pH 2,5 med saltsyre og vaskes med chloroform. Det vandige lag neutraliseres og frysetørres og renses ved kromatografi på 5 XAD-2 harpiks i en gradueret 0,1 M ammoniumhydroxid-methanol-blanding til opnåelse af N-(1(S)-hydroxyaminocarbonyl-3-phenyl-propyl)-L-alanyl-L-prolin. Massespektret af det silylerede materiale viser en ion ved m/e = 579 for det trisylilerede derivat, og NMR er i overensstemmelse med strukturen.

10 EKSEMPEL 54

Nlillcarboxy-3-methylbutyl].-L~alanyl-L-try2toghan

En opløsning af natriumsaltet af 4-methyl-2-oxopentansyre (414 mg) og L-alanyl-L-tryptophan (150 mg) i vand indstilles til pH 7 med base og behandles med natriumcyanoborhydrid 15 (103 mg) ved stuetemperatur i flere dage. Produktet absor beres på en stærkt sur ionbytterharpiks og elueres med 2 pct.'s pyridin i vand. De produktrige fraktioner frysetørres, hvilket giver 189 mg fnugget hvidt fast stof. Massespektret viser en molekylarion ved 389 m/e og spidser ved 187 20 m/e og 158 m/e for følgende fragmenter: CH3 H CH-CH3 ?H2 ?H3

I]_l| I og H02C-CH-NH-CH

-CH-CH- co2h NMR-spektret i D20 er i overensstemmelse med strukturen.

EKSEMPEL 55

Nrill2§£boxy-3-methylbutyl]_;L;histidyl-L-leucin På den i eksempel 54 beskrevne måde kondenseres 4-methyl-2-25 oxopentansyre og L-histidyl-L-leucin i nærværelse af natrium-cyanoborhydrid til opnåelse af N-(l-carboxy-3-methylbutyl)-L-histidyl-L-leucin. 1 dette tilfælde elueres produktet fra

DK 165455 B

56 ionbytterharpiksen med 10 pct.'s ammoniak. Massespektret viser en molekylarion ved 408 m/e for de disilylerede produkter minus 18. NMR-spektret er i overensstemmelse med strukturen.

EKSEMPEL 56 5 N-^l-carboxy-S^methylbutyll-L-Dhenylalanyl-L^arginin På samme måde som beskrevet i eksempel 54 kondenseres 4-methyl- 2-oxo-pentansyre og L-phenylalanyl-L-arginin i nærværelse af natriumcyanoborhydrid til opnåelse af N-(l-carboxy-3-methyl-butyl)-L-phenylalanyl-L-arginin. Produktet elueres fra ion-10 bytterharpiksen med 10 pct.'s ammoniak. NMR-spektret var i overensstemmelse med strukturen.

EKSEMPEL 57 A. N-_( 1-carboxy-^-ghenylpropy 1 i~L-ly sy l“L-prolin_ Oiydrochlo- ridsalt)_ 15 På den i eksempel 56 beskrevne måde kondenseres 2-oxo-4-phenyl-smørsyre og £-t-BOC-L-lysyl-L-prolin i nærværelse af natriumcyanoborhydrid. Den £-t-BOC-beskyttende gruppe spaltes i alt væsentligt, når produktet absorberes på stærkt sur ionby tterharpiks. Det rå N-(l-carboxy-3-phenylpropyl)-L-lysyl-L-20 prolin elueres fra harpiksen med 10 pct.'s ammoniak, frysetørres og renses ved gelfiltreringskromatografi (LH-20).

En minimal spids for t-BOC-protoner i NMR-spektret forsvinder, når produktet behandles med ethylacetat, 4 N i gasformig hy-drogenchlorid. NMR-spektret for det resulterende hydrochlorid 25 af produktet er i overensstemmelse med strukturen. Massespektret viser en molekylarion ved 693 m/e for det tetrasily-lerede produkt. Kromatografi under XAD-2 harpiks under anvendelse af 3,5 pct.'s acetonitril i 0,1 molar ammoniumhydroxid giver Ν-α-(1(S)-carboxy-3-phenylpropyl)-L-lysyl-L-prolin.

30 B. N-g^^l^jSX-carboxy-S-ghenylpropylX-L-lysyl-L-prolin På den i eksempel 54 beskrevne måde kondenseres 2-oxo-4-phenyl-

DK 165455B

57 smørsyre og N-£-t-Boc-L-lysyl-L-prolin i nærværelse af natrium-cyanoborhydrid. Produktet absorberes på stærkt sur ionbytter-harpiks og elueres med 2 pct.'s pyridin i vand. Produktrige fraktioner strippes til et glas og behandles med 4 N HC1 i 5 ethylacetat til fjernelse af den t-Boc-beskyttende gruppe.

Det resulterende hydrochloridsalt overføres til den frie base ved at absorbere på en stærkt sur ionbytterharpiks og eluere med 2 pct.'s pyridin i vand. Frysetørring af produktrige fraktioner giver N-a-(l-carboxy-3-phenylpropyl)-L-lysyl-L-prolin 10 som et hvidt fnugget fast stof. NMR-spektret er i overensstemmelse med strukturen. Massespektret viser en molekylar-ion ved 549 for det disilylerede produkt. Kromatografi giver den ønskede isomere.

EKSEMPEL 58 15 N- (l-carboxy-3-phenylpropyl)-L-2-fluoralanyl-L-prolin

Til en opløsning af L-3-fluoralanin (420 mg) i 4 ml acetonevand (1:1) sættes triethylamin (590 mg) og 2-t-butoxycarbonyl-oximino-2-phenylacetonitril (1,060 g). Blandingen omrøres 2,5 timer. Kold 5 pct.'s vandig kaliumbicarbonatopløsning tilsættes, og blandingen ekstraneres med ethylacetat. Den 20 vandige fase syrnes med kold 1 N saltsyre og ekstraheres med ethylacetat. Sidstnævnte ekstrakt vaskes med mættet vandig natriumchlorid, tørres over natriumsulfat og koncentreres til tørhed til opnåelse af L-t-Boc-3-fluoralanin (800 mg), smp.: 91 - 93°C.

25 Til en omrørt opløsning af sidstnævnte stof (800 mg) og prolin-benzylester (1,5 g) i methylenchlorid (8 ml) ved 0°C sættes dicyclohexylcarbodiimid (845 mg) i methylenchlorid (6 ml), og blandingen holdes ved 0°C i 2 timer og ved 20°C i 18 timer. Blandingen filtreres, bundfaldet vaskes med methylenchlorid, 30 og de kombinerede portioner af filtrat og vaskevæsken ekstraheres med kold 1 N saltsyre, kold 5 pct.'s vandig kaliumbi-carbonat, mættet vandig natriumchlorid, tørres over natriumsulfat og koncentreres til tørhed. Tør søjlekromatografi på silicagel H under eluering med 6 pct.'s acetone i chloroform 35 giver det rene beskyttende dipeptid.

DK 165455 B

58

Gruppen t-boc fjernes ved behandling med 4 N hydrogenchlorid i ethylacetat (8 ml) ved 0°C i 1 time. Ether 20 ml) tilsættes, og det udfældede L-3-fluoralanyl-L-prolin-benzylester-hydro-chlorid (450 mg), smp.: 158 - 161°C, samles ved filtrering.

5 Hydrogenering i 6 ml vand og 2 ml ethanol over 60 mg 10 pct.'s palladium-på-kul ved 1 atmosfæres tryk og 20°C i 90 minutter efterfulgt af filtrering og koncentrering til tørhed giver L-3-fluoralanyl-L-prolin-hydrochlorid (330 mg). Massespektret viser en molekylarion ved 348 m/e for ditrimethylsilylerede 10 produkter.

Til en blanding af 4-phenyl-2-oxosmørsyre (375 mg) og L-fluor-alanyl-L-prolin-hydrochlorid (100 mg) i 3 ml vand (pH indstilles til 7 med natriumhydroxid) sættes natriumcyanoborhydrid (80 mg). Blandingen omrøres 20 timer og oparbejdes som be-15 skrevet i eksempel 24. Massespektret for det LH-20 rensede produkt viser en molekylarion ved 510 m/e for de trimethyl-silylerede produkter; tic - silicagel-plade, enkelt plet Rf = 0,7 - system 1:1:1:1 ethylacetat:eddikesyre:n-butanol:vand.

De diastereomere adskilles på XAD-2 harpiks som beskrevet i 20 eksempel 25.

N-(l-ethoxycarbonyl-3-phenylpropyl)-L-3-fluoralanyl-L-prolin fremstilles som beskrevet i eksempel 26.

EKSEMPEL 59

Niilzethoxycarbgnyl-S^phenylpropyl^-L-alanyl-L-Sil-dehydrgprolin 25 Ved den i eksempel 26 beskrevne procedure overføres L-alanyl-L-3,4-dehydroprolin, fremstillet som i eksempel 37, i N-(l-ethoxycarbonyl-3-phenylpropyl)-L-alanyl-L-3,4-dehydroprolin som en diastereomer blanding med to komponenter, tlc-silicagel-plade R^ = 0,82 (størstedelen) og R^ = 0,79 (mindre), to ud-30 viklingssystemer 4:1:1 - n-butanol:vand:eddikesyre. Massespektrogrammet viser en molekylarion ved 518 m/e for de ditrimethylsily lerede produkter.

DK 165455 B

EKSEMPEL 60 59 N- [1 (S)-methoxycarbonyl-2-ilH-imidazpl-4-yl) -ethyl^-DL-alanYl--L-grolin På lignende måde som i eksempel 16 kondenseres L-histidin-5 methylester med pyruvoyl-L-prolin i nærværelse af natriumcyano-borhydrid til opnåelse af N-[l-methoxycarbonyl-2-(lH-imidazol-4-yl)ethyl]-DL-alanyl-L-prolin. NMR-spektret i D2O viser imidazol-protonerne ved 8,6 og 7,3; protonerne nabostillet til imida-zolen og methylesterprotonerne ved 3,7 og alanylmethyl ved 1,1 10 til 1,38.

EKSEMPEL 61 På tilsvarende måde som i eksempel 18 hydrolyseres produktet fra eksempel 58 til opnåelse af den forventede disyre. NMR-15 spektret i D20 viser imidazolprotonerne ved 7,2 og 8,5; og alaninmethyl ved 1,25 i.

EKSEMPEL 62 N-j_l (_S2-ethoxycarbonyl-5-aminogentyl22D£L-a lany 1-L-grolin

En opløsning af £-benzyloxycarbonyl-L-lysin-ethylester-hydro-20 chlorid (2,94 g) i vand (10 ml) gøres basisk med 15 ml mættet vandig kaliumbicarbonat og ekstraheres med CH2C12. Ekstrakten tørres over MgSO^ og koncentreres til tørhed. Resten, £-benzyl-oxycarbonyl-L-lysin-ethylester, opløses i THF (20 ml) og pyruvoylprolin (555 mg), og molekylarsigter nr. 4A (1,0 g) 25 tilsættes på pulverform. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 4 timer. Natriumcyanoborhydrid (630 mg) i 1 ml CHgOH tilsættes i løbet af 2 timer, og blandingen omrøres natten over. Den filtreres derpå, koncentreres til tørhed, og resten fordeles mellem vand (10 ml) og CH2C12 (15 ml).

30 Den vandige fase absorberes på stærkt sur ionbytterharpiks og elueres med 4 pct.'s pyridin i vand til opnåelse af

DK 165455 B

60 470 mg N-(l(S)-ethoxycarbonyl-5-benzyloxycarbonylaminopentyl)-D,L-alany1-L-prolin. Den beskyttende gruppe fjernes ved hydrogenering i ethanol :.vand 1:1 over 10 pct.'s Pd/C-katalysator ved 40 psi. Blandingen filtreres, og filtratet bringes til 5 tørhed. Resten kromatograferes i methanol på en LH-20 søjle til opnåelse af det ønskede N-(l(S)-ethoxycarbonyl-5-aminopen-tyl)-D,L-alany1-L-prolin. NMR-spektret (D20) og massespektret efter trimetylsilylering bekræfter strukturen.

EKSEMPEL 63 10 N-Q(S)-carboxy-S-aminopentyl)-L-alanyl-L-prolin N-(1(S) -ethoxycarbonyl-5-benzyloxycarbonylaminopentyl) -D ,L-alany1-L-prolin, som fremstillet i eksempel 62, behandles med 0,1 M NaOH ved stuetemperatur natten over. Efter absorption af produktet på en stærkt sur ionbytterharpiks elueres det med 15 4 pct.'s pyridin i vand til opnåelse af N-(1(S)-carboxy-5- benzyloxycarbonylaminopentyl)-D,L-alany1-L-prolin, enkelt plet ved tic (Rf = 0,4 - butanol:vand:pyridin:eddikesyre 10:4:3:1). På tilsvarende måde som i eksempel 62 fjernes den beskyttende gruppe ved hydrogenering til opnåelse af N-(1(S)-20 carboxy-5-aminopentyl)-D,L-alanyl-L-prolin. Massespektret for det trimetylsilylerede produkt er i overensstemmelse med strukturen, idet det har en massespids ved 531 m/e. Kromatografi giver den ønskede isomere.

EKSEMPEL 64 25 N-jtl-carboxy-G-aminohexyl^L^alanyl-L-prolin

Benzyl-2-oxo-7-phthalimidoheptanoat (fremstillet ved alkyle-ring af benzyl-l,3-dithian-2-carboxylat med 5-phthalimido-pentylbromid og efterfølgende oxidativ overføring til ketonen med N-bromsuccinimid) kondenseres med L-alany1-L-prolin i 30 nærværelse af overskud af NaBHgCN. Kondensationsproduktet, N-(l-benzyloxycarbonyl-6-phthalimidohexyl)-L-alany1-L-prolin (390 mg) i 25 ml 50 pct.'s vandig ethanol hydrogeneres ved 276 kPa over 10 pct.'s palladium-på-kul. Fjernelse af opløsningsmiddel og katalysator giver N-(l-carboxy-6-phthalimidohexyl)-35 L-alany 1-L-prolin (320 mg) med de forventede spektrale og kro-

DK 165455 B

61 matografiske egenskaber. En portion af ovennævnte mellemprodukt (152 mg) i 2 ml ethanol koges under tilbagesvaling med hydrazin (32 mg) i 1,5 timer. Phthalhydrazidet fjernes ved filtrering, ethanolet fjernes under vakuum, og resten absor-5 beres på stærkt sur ionbytterharpiks. Eluering med 2 pct.’s vandig pyridin og frysetørring giver det ønskede N-(1-carboxy- 6-aminohexyl)-L-alanyl-L-prolin (58 mg). Spektraldata stemmer overens med strukturen. Massespektret viser en spids ved 311 for molekylårionen minus vand (329 - 18).

1° EKSEMPEL 65

Ved at udføre hydrazinolyse som beskrevet i eksempel 64 på N- (1-benzyloxycarbonyl-6-phthalimidohexyl) -L-alanyl-L-pro-lin opnås en blanding, hvorfra N-(l-benzyloxycarbonyl-6-amino-15 hexyl)-L-alanyl-L-prolin kan isoleres.

EKSEMPEL 66 NHl^carboxy-^-ghenoxyethyl^-L-alanyl-L-grolin

En opslemning af phenoxypyrudruesyre (1,8 g) (fremstillet ved kondensation af ethylphenoxyacetat med diethyloxalat, 20 efterfulgt af syrekatalyseret hydrolyse og decarboxylering) og L-alanyl-L-prolin (0,37 g) i 10 ml vand indstilles til pH 7 med fortyndet NaOH. Blandingen behandles med NaBH3CN (0,18 g) og omrøres ved stuetemperatur i 5 dage. Anden og tredje dag tilsættes yderligere ketosyren (0,9 g) og natriumcyanoborhy-25 drid (0,18 g). Produktet absorberes på stærkt sur ionbytterharpiks og elueres med 2 pct.'s pyridin i vand til opnåelse af 0,5 g N-(l-carboxy-2-phenoxyethyl)-L-alanyl-L-prolin efter frysetørring. NMR-spektret er i overensstemmelse med strukturen. Massespektret viser en spids ved 479 for den silyle-30 rede molekylarion minus methyl (494 - 15).

EKSEMPEL 67 62

DK 165455B

Nzilz§thoxYcarbon^l-2-2henoxYethYl)_-L;a.lanYl-L-2rglin

Ved at omsætte ethylphenoxypyruvat (fremstillet ud fra syren ved surt katalyseret forestring) og L-alanyl-L-prolin med 5 NaCNBHg i ethanolopløsning og isolering af produktet som beskrevet i eksempel 66 opnås N-(l-ethoxycarbonyl-2-phenoxyethyl)-L-alanyl-L-prolin.

EKSEMPEL 68

NliIl2åEboxy;2-ghenylthioethyl),-L-alanyl-L-prolin 10 En blanding af phenylthiopyrudruesyre (1,96 g) (fremstillet ved kondensation af ethylphenylthioacetat med diethyloxalat, efterfulgt af syrekatalyseret hydrolyse og decarboxylering) og L-alanyl-L-prolin (0,37 g) i 10 ml HjO indstilles til pH 7,0 med fortyndet NaOH og behandles med NaBHgCN (0,18 g) i 2 ml 15 ^0. Efter omrøring natten over ved stuetemperatur absorberes produktet på stærkt sur ionbytterharpiks og elueres med 2 pct.'s pyridin i vand til opnåelse af 0,36 g N-(l-carboxy-2-phenylthioethyl)-L-alanyl-L-prolin. NMR- og masse-spektrum indikerer den ønskede struktur. En massespids ved 348 indi-20 kerer molekylarionen (366) - vand (18).

EKSEMPEL 69

Nillz§thgxycarbgnyl^2-Dhenylthioethyll-L-alanyl-L-prolin

Ethylphenylthiopyruvat (fremstillet ud fra syren ved forestring) og L-alanyl-L-prolin omsættes med NaBH^CN i ethanolopløsning 25 som beskrevet i eksempel 68, og det isolerede produkt giver, som beskrevet deri, N-(l-ethoxycarbonyl-2-phenylthioethyl)-L-alanyl-L-prolin.

EKSEMPEL 70

NziIz§ife2SZS§£fe2SZil5-g-chlgrghenylprgpyl]_-L-alanyl-L-grglin 30 En opløsning af ethyl-4-p-chlorphenyl-2-oxobutyrat (fremstillet

DK 165455 B

63 ud fra syren ved forestring med ethanol i under tilbagesvaling kogende CCl^) og L-alanyl-L-prolin i ethanol behandles med overskud af NaBH^CN og omrøres ved stuetemperatur, indtil omsætningen er fuldstændig. Ethanolen fjernes under vakuum, 5 og produktet absorberes på stærkt sur ionbytterharpiks.

Eluering med 2 pct.'s pyridin i vand giver N-(1-ethoxycarbo-nyl-3-p-chlorphenylpropyl)-L-alanyl-L-prolin.

EKSEMPEL 71 N-[l-carbethoxy-2- (3-indolyllethy^-L-alanyl-L-prolin 10 På samme måde som beskrevet i eksempel 26 kondenseres ethyl-esteren af indol-3-pyrudruesyre med L-alanyl-L-prolin i 1:1 ethanol:vand-opløsning ved hjælp af natriumcyanoborhydrid. Isolering på "Dowex" 50 som beskrevet giver blandingen af isomere af N-[l-carbethoxy-2-(3-indoly 1) ethyl]-L-alanyl-L-prolin.

15 EKSEMPEL 72 N-ilicarbethoxy-2-p;aminomethylphenylethyl].-L-alanyl-L-grolin

Ethyl-2-oxo-3-p-cyanophenylpropanoat (fremstillet ved kobling af p-cyanobenzylbromid med ethyl-l,3-dithian-2-carboxylat og efterfølgende oxidativ hydrolyse på den måde, der er beskrevet 20 af Eliel og Hartmann, J. Org. Chem., 37.' (1972)), konden seres med L-alanyl-L-prolin, og produktet renses ved den metode, der er beskrevet i eksempel 1. Den resulterende blanding af isomere af N- (-carbethoxy-2-p-cyanophenylethyl) -L-alanyl-L-prolin hydrogeneres i ethanolopløsning indeholdende hydrogen-25 chlorid og palladium-på-kul som katalysator. Opløsningsmidlet og overskud af HC1 afdestilleres i vakuum, der skylles med ethanol og koncentreres til tørhed til opnåelse af hydrochlo-riderne af blandingen af diastereoisomere af den ønskede forbindelse.

DK 165455B

EKSEMPEL 73 64 N-jl-carboxy-g-p-aminQin^hvlighenYlethYlX-L-alanyl-L-grolin

En prøve af NH (l-carbethoxy-2-p-cyanopheny lethyl)-L-alanyl-L-prolin, fremstillet i eksempel 72, behandles med et ækvivalent 5 natriumhydroxid i en blanding af methanol og vand som opløsningsmiddel ved stuetemperatur natten over. Opløsningsmidlerne afdestilleres i vakuum til opnåelse af natriumsaltene af blandingen af isomere af N- (l-carboxy-2-cyanophenylethyl) -L-alanyl-L-prolin. Denne blanding hydrogeneres i ethanolisk 10 hydrogenchloridopløsning og oparbejdes som beskrevet i eksempel 72 til opnåelse af hydrochloriderne af blandingen af dia-stereoisomere af den ønskede forbindelse.

EKSEMPEL 74 N-_(l-carbethoxy-2 jS)_-amino-3-phenylpropyl)-pfL-alanyl-L-prolin 15 Til en blanding af N-phthaloyl-L-2-amino-3-phenylpropionalde-hyd (Peterson et al., J. Am. Chem. Soc., 79. I3**9 (1957)) (2,18 g) og kaliummetabisulfit (0,87 g) i vand:methanol 1:1 sættes natriumcyanid (0,55 g) under kraftig omrøring. Der omrøres i 90 minutter, fortyndes med ethylacetat og filtreres. 20 Det organiske lag vaskes med vand og tørres over magnesiumsulfat. Opløsningsmidlet fjernes i vakuum til opnåelse af N-phthaloyl-3-amino-4-phenyl-2-hydroxybutyronitril, tic i ethylacetat rhexan 1:1, Rf = 0,5.

Dette materiale opløses i vandfri ethanol, som er mættet med 25 ammoniak, og henstår i 6 dage ved stuetemperatur. Opløsningsmidlet fjernes, resten optages i dioxan:konc. saltsyre (1:1), der opvarmes til 70°C, og temperaturen holdes i 20 timer. Opløsningen inddampes til tørhed, resten opslemmes i varmt vand, der filtreres og renses på en stærkt sur kationbytter-30 harpiks på sædvanlig måde til opnåelse af (2R,S;3D)-2-amino-4-pheny1-3-phthaloylaminosmørsyre. Syren opløses i vandfri ethanol, der tilføres vandfri hydrogenchlorid til mætning,

DK 165455B

65 og blandingen holdes 16 timer ved stuetemperatur. Opløsningsmidlet fjernes i vakuum til opnåelse af ethylester-hydrochlo-ridet af aminosyren.

Dette ethyl-2-amino-4-phenyl-3-phthalylaminobutanoat kondense-5 res med pyruvoyl-L-prolin ved hjælp af natriumcyanoborhydrid på den i eksempel 16 beskrevne måde til opnåelse af N-(l-carb-ethoxy-3-phenyl-2-phthaloylaminopropyl)-D,L-alanyl-L-prolin som en blanding af isomere. Dette materiale koges under tilbagesvaling i ethanol med et ækvivalent hydrazin i 1,5 10 timer, der afkøles, og phthalhydrazidet frafiltreres, og det ønskede produkt isoleres fra den resulterende blanding ved kromatografiske metoder til opnåelse af N-(1-carbethoxy- 2-(S)-amino-3-phenyIpropyl)-D,L-alany1-L-prolin.

EKSEMPEL 75 15 1 ^carboxy-2-|S2-aminc23;;2henYl propyl ^-D^L-alariYl-L-prol in 2-amino~4-phenyl-3- (S)-3-phthaloylaminosmørsyre, fremstillet i eksempel 74, kondenseres med pyruvoyl-L-prolin ved hjælp af natriumcyanoborhydrid på den i eksempel 16 beskrevne måde til opnåelse af N-(i-carboxy-3-phenyl-2-phthaloylarnino-D,L-: 20 alanyl-L-prolin som en blanding af isomere. Dette materiale koges under tilbagesvaling i ethanol med et ækvivalent hydrazin i 1,5 timer, der afkøles, phthalhydrazidet frafiltreres, og det ønskede produkt isoleres ved kromatografiske metoder til opnåelse af titelforbindelsen.

25 EKSEMPEL 76 ίΐίΙζ5§£&22ϊΙ£ΐί-phenylpropYl2~DiL-alanYl-L-prglin

En opløsning af N-phthaloyl-3-amino-4-phenyl-2-hydroxybutyro-nitril (fremstillet i eksempel 74) i ethanol mættet med vandig 30 ammoniak henstår i 3 dage ved stuetemperatur. Opløsningsmidlet fjernes i vakuum, og resten koges under tilbagesvaling i 6 timer i koncentreret saltsyre. Der inddampes til tørhed, og resten renses på en søjle af "Dowex" 50 (H+) ionbytterharpiks,

DK 165455B

66 idet der i sekvens elueres med methanol:vand 10:1, vand:py-ridin 50:1 og endelig 0,5 M ammoniumhydroxidopløsning. Den ønskede 2,3-diamino~4-phenyl-propionsyre isoleres fra sidste elueringsmiddel ved koncentration til tørhed. Der fremstilles 5 en opløsning af kobberkomplekset af denne aminosyre, og 3- aminogruppen benzoxyleres in s i tu med benzoylchlorid under basiske betingelser, altsammen ved den metode, der er beskrevet af R. Roeske et al., J. Am. Chem. Soc., 78' 5883 (1956). Kobberkomplekset spaltes med hydrogensulfid, og der oparbejdes 10 som beskrevet deri til opnåelse af 2-amino-3- (S)-benzoylamino- 4-phenylsmørsyre. Dette mellemprodukt kondenseres med pyru-voyl-2-prolin ved hjælp af natriumcyanoborhydrid på den måde, der er beskrevet i eksempel 16, til opnåelse af det ønskede N-(l-carboxy-2-(S)-benzoylamino-3-phenylpropyl)-D,L-alanyl-L-15 prolin som en blanding af isomere, som kan opspaltes ved kromatografiske metoder, om ønsket.

EKSEMPEL 77

Nzilrcarbethoxy-g-^Si-benzoYlamino-S-ghenYlprogylX-D^L-alanyl- L-prolin 20 2-amino-3-benzoylamino-4-phenylsmørsyre (fremstillet i.eksempel 76) behandles med en mættet opløsning af hydrogenchlorid i absolut ethanol i 4 timer, hvorpå opløsningsmidlet afstrippes i vakuum til opnåelse af ethyl-2-amino-3-benzoylamino-4-phenyl-butyrat-hydrochlorid. Dette mellemprodukt kondenseres med 25 pyruvoyl-L-prolin ved hjælp af natriumcyanoborhydrid på den i eksempel 16 beskrevne måde, og titelforbindelsen isoleres som deri beskrevet.

EKSEMPEL 78 N-j2-amino-l-carboxy-4-methylpentyl] -D ,L-alanyl-L-prolin 30 En opløsning af 0,731 g trans-3-amino-4-(2-methylpropyl)-2- azetidinon (fremstillet ved chlorsulfonylisocyanataddition til 4-methyl-l-penten; den opnåede β-lactam beskyttes som t-

DK 165455B

*67 butyldimethylsilylderivatet og behandles derpå med lithium-diisopropylamid efterfulgt af tosylazid og chlortrimetylsilan. Sur oparbejdning og silicagel-kromatografi giver trans-3-azido-4-(2-methylpropyl)-2-azetidinon, som hydrogeneres (10 pct.'s 5 Pd/C-ethanol) til aminoderivatet og 4,58 g benzylpyruvat i 20 ml absolut ethanol indeholdende 10 g molekylsigter nr.

4A på pulverform behandles dråbevis med en opløsning af natriumcyanoborhydrid (0,65 g) i 8 ml absolut ethanol, indtil reaktionen er fuldstændig. Reaktionsblandingen filtre-10 res, og filtratet koncentreres. Resten opløses i 50 ml vand og syrnes med 1 N HC1 til pH - 3. Blandingen genjusteres til pH = 9,5 med 10 pct.'s natriumcarbonatopløsning. Den vandige opløsning mættes med natriumchlorid og ekstraheres med ethyl-acetat (5 x 40 ml). De kombinerede organiske lag tørres 15 (natriumsulfat) og koncentreres til opnåelse af en olie (4,94 g). Kromatografi på silicagel (ethylacetat) giver 1,11 g produkt. NMR- og massespektrogram er i overensstemmelse med strukturen N-[trans-4-(2-methylpropyl)-2-oxo-3-azeti-dinyl]-D,L-alanin-benzylester. Debenzylering udføres ved 20 katalytisk hydrogenering (10 pct.'s Pd/C, 2;1 ethanol:vand).

En koldopløsning (0°C) af syren (428 mg) og L-prolin-t-butyl-ester (377 mg) i 5 mg dimethylformamid behandles med en opløsning af diphenylphosphorylazid (605 mg) i 5 ml dimethylformamid og derpå med en opløsning af triethylamin (223 mg i 15 25 ml dimethylformamid) i løbet af 20 minutter. Efter 3 timers forløb fjernes isbadet, og reaktionsblandingen omrøres ved omgivelsernes temperatur natten over. Ethylacetat (100 ml) tilsættes, og den resulterende opløsning vaskes med vand (2 x 40 ml), 5 pct.'s natriumcarbonatopløsning (3 x 30 ml) og vand 30 (1 x 50 ml) før tørring med natriumsulfat. Koncentrering giver en olie, 0,78 g, hvis NMR- og massespektrum er i overensstemmelse med strukturen N-[trans-4-(2-methylpropyl)-2-oxo-3-azetidinyl]-D,L-alanyl-L-prolin-t-butylester. Det rå produkt opløses i 25 ml trifluoreddikesyre (ved 0°C). Reaktionsblan-35 dingen omrøres ved 0°C i 20 minutter og derpå ved stuetemperatur i 2,5 timer. Reaktionsblandingen koncentreres til tørhed, og resten behandles med 1 N NaOH (30 ml) i 4,5 timer ved

DK 165455B

68 stuetemperatur. Den basiske blanding sættes langsomt til en stærkt sur ionbytterharpiks, og produktet udvindes med 2 pct.'s pyridin i vand. Frysetørring giver 0,30 g N-[2-amino- 1- carboxy-4-methy 1-pentyl]-D, L-alanyl-L-prolin, der består af 5 fire diastereoisomere (SfS,S,S? S,S,R,S; R,R,R,S; R,R,S,S), som kan adskilles ved kromatografi. NMR- og massespektrogram er i overensstemmelse med strukturen. NMR-spektret viser multipletter centreret ved 4,5, 3,85, 2,3, 1,79 og 1,16 ppm. Massespektret viser en spids ved 458 (disilyleret molekylarion -15).

10 EKSEMPEL 79 N-(2-amino-l-ethoxycarbonyl-4-methylpentyl)-D,L-alanyl-L-prolin

Et mellemprodukt i eksempel 78, N-[trans-4- (2-methylpropyl)- 2- oxo-3-azetidinyl]-D,L-alanin (125 mg) kondenseres med 15 L-prolinbenzylester-hydrochlorid (167 mg) i nærværelse af diphenylphosphorylazid (191 mg) og triethylamin (140 mg) i dimethylformamidopløsning til opnåelse af 217 mg N-[trans-4-(2-methylpropyl)-2-oxo-3-azetidionyl]-D,L-alanyl-L-prolin-benzylester. Benzyl-beskyttelsesgruppen fjernes ved hydrogeno-20 lyse, og β-lactamen åbnes ved vandfri natriumethoxid i ethanol til opnåelse af N-(2-amino-l-ethoxycarbonyl-4-methylpentyl)-D,L-alanyl-L-prolin.

EKSEMPEL 80 N-J2-benzamido-l-carbpxy-4-methylpentyl)-p fL-alanyl-L-prolin 25 En opløsning af N-(2-amino-l-carboxy-4-methylpentyl)-D,L- alanyl-L-prolin (fremstillet som beskrevet i eksempel 78) i vandig alkali behandles med benzoylchlorid til opnåelse af N-(2-benzamido-l-carboxy-4-methylpentyl) -D, L-alanyl-L-prolin.

EKSEMPEL 81 69

DK 165455B

Nli2rb§nzamido-l-ethoxycarbonyl;;4-meth;s/lpentyl)_-DAL-alanYl“L- grolin

En opløsning af N-(2-amino~l-ethoxycarbonyl-4-methylpentyl)-5 D,L-alanyl-L-prolin (fremstillet som beskrevet i eksempel 79) i organisk opløsningsmiddel behandles med benzoylchlorid til opnåelse af N- (2-benzamido-1-ethoxyc arbony1-4-methy1-pentyl)-D,L-alany1-L-prolin.

EKSEMPEL 82 10 N-a- [l-ethoxycarbony1-3-phenylpropyl]-L-arginy1-L-prolin På den i eksempel 37 beskrevne måde kondenseres N-a-t-Boc-N-fo-nitro-L-arginin-N-hydroxy-succinimidester med L-prolin i dioxan-vand, Ν-α-t-Boc-beskyttelsesgruppen fjernes med trifluor-eddikesyre, og dipeptidet isoleres som beskrevet. Der kobles 15 med ethyl-2-oxo-4-phenylbutyrat som beskrevet i eksempel 26 og der isoleres som beskrevet til opnåelse af materialet med to-nitrogen i argininen, som stadig er beskyttet ved nitrogruppen. Denne beskyttelsesgruppe fjernes ved katalytisk hydrogenering i ethanol-vand-eddikesyre over palladium-på-kul 20 som katalysator ved stuetemperatur og 276 kPa hydrogentryk.

Katalysatoren frafiltreres, og opløsningsmidlerne afdestilleres i vakuum til opnåelse af en blanding af de isomere af N-«-(l-ethoxycarbonyl-3-phenylpropyl)-L-arginyl-L-prolin.

EKSEMPEL 83 25 N-a-^l-carboxy-S-ghenylgrogyl^D^L-homglysyl-L-prolin N-tø-benzyloxy-carbonyl-N-a-3°-butoxycarbonyl-D,L-homolysin (fremstillet fra homolysin via kobberkomplekset) kondenseres med L-prolin-3°-butylester ved hjælp af diphenylphosphorylazid. 3°-butylgrupperne fjernes med trifluoreddikesyre, og pro-30 duktet, Ν-ω-benzyloxycarbony1-D,L-homolysyl-L-prolin, omsættes med 2-oxo-4-phenyIsmørsyre og NaBH^CN. Konensations-

DK 165455 B

70 produktet debenzyleres ved katalytisk hydrogenering til opnåelse af N-a-(l-carboxy-3-phenylpropyl)-D,L-homolysyl-L-prolin.

EKSEMPEL 84 5 N-a-_( l~ethoxy carbonyl-3-phenylpropyl) -D, L-homolysyl-L-prolin

Det i eksempel 83 beskrevne mellemprodukt, Ν-ω-benzyloxycarbo-nyl-D,L-homolysyl-L-prolin, omsættes med ethyl-2-oxo-4-phenyl-butyrat og NaBH-jCN. Kondensationsproduktet hydrogeneres over palladium-på-kul til opnåelse af N-a- (l-ethoxycarbonyl-3-10 phenylpropyl)-D,L-homolysyl-L-prolin.

EKSEMPEL 85 N-a- (l-carboxy-3-phenylpropyl)_-g-amino-D^L-alanYl-L-grolin

Under basiske betingelser omsættes DL-α,β-diaminopropionsyre med benzyloxycarbonylchlorid til opnåelse af D,L-a,3-bis(benzyl-15 oxycarbonylamino)propionsyre (smp.: 123,5 - 124°C) efter syr ning. Phosphorpentachlorid sættes til en chloroformopløsning indeholdende di-Cbz-produktet til opnåelse af D,L-4-(benzyl-oxycarbonylaminomethyl)-oxazolidin-2,5-dion efter oparbejdning. En opløsning af L-prolin-t-butylester i methylenchlorid sæt-20 tes til N-carboxyanhydridet i tetrahydrofuran ved -60°C.

Efter opbevaring natten over i fryser strippes blandingen til tørhed, hvilket giver det rå produkt. Trifluoreddikesyre spalter effektivt t-butylesteren på 2 timer ved stuetemperatur, hvilket resulterer i en hovedblanding af L-prolin og β-ben-25 zyloxycarbonylamino-D,L-alanyl-L-prolin. Gelfiltreringskromatografi (LH-20) resulterer i rent dipeptid. 2-oxo-4-phenyIsmørsyre og benzyloxycarbonylamino-D,L-alanyl-L-prolin kondenseres i nærværelse af natriumcyanoborhydrid. Fjernelse af den beskyttende gruppe fra det resulterende produkt giver 30 N-(1-carboxy-3-phenylpropyl)^-amino-D,L-alanyl-L-prolin. NMR (D2O) er i overensstemmelse med strukturen.

EKSEMPEL 86 71

DK 165455B

NiSillzSthoxycarbgnYl-S-ghenYlErgEYlliÉiamino-D^L-alanYl-L-grolin

En opløsning af β-benzyloxycarbonylamino-D,L-alanyl-L-prolin (fremstillet som beskrevet i eksempel 85) og ethyl-2-oxo-4-5 phenylbutyrat kondenseres i ethanolisk opløsning med NaBH^CN. Beskyttelsesgruppen fjernes fra produktet ved katalytisk hydrogenering til opnåelse af N-a-(l-ethoxycarbonyl-3-phenylpro-py1)-B-amino-D,L-alanyl-L-prolin.

EKSEMPEL 87

NziIliSllSSEfestoxY-3-ghenylgrgpylX-D^L-g-aminomethYlghenyl-

ålSDYilklBSSiiS

Ethyl-2-oxo-3-p-cyanophenylpropionatf fremstillet som i eksempel 72, hydrolyseres ved omrøring i 5 pct.'s natriumhydroxid ved stuetemperatur natten over, reaktionsblandingen vaskes 15 med ether, det vandige lag syrnes til pH 2 med koncentreret HC1, produktet ekstraheres over i en blanding af ether og ethylacetat, og opløsningsmidlet fjernes til opnåelse af 2-oxo-3-p-cyanophenylpropionsyre. Syren kobles reduktivt med ethylesteren af L-homophenylalanin i nærværelse af natrium-20 cyanoborhydrid på den i eksempel 13 beskrevne måde, og der renses som beskrevet i dette eksempel til opnåelse af blandingen af diastereoisomere af N-(1-(S)-carbethoxy-3-phenyl-propyl)-D,L-p-cyanophenylalanin. Denne forbindelse kondenseres med benzyl-L-prolinat-hydrochlorid i dimethylforamid 25 ved anvendelse af diphenylphosphorylazid-reagens på den i eksempel 13 beskrevne måde til opnåelse af blandingen af diastereoisomere af N-(l-(S)-carbethoxy-3-phenylpropyl)-D,L-p-cyano-phenylalanyl-L-prolin-benzylester. Dette mellemprodukt hydrogeneres i ethanol indeholdende hydrogenchlorid over palladium-30 på-kul som katalysator som beskrevet i eksempel 72, og der oparbejdes som skitseret der til opnåelse af det ønskede produkt som en blanding af diastereoisomere.

EKSEMPEL 88

DK 165455 B

72 N-ct-j l^J Sj>-carbgxy-3-BhenYlpropyl) -D fL-p-aminomethylphenylala-nyl^L-prglin N-(1-(S)-carbethoxy-3-phenylpropy1)-D,L-cyanopheny1alany1-L-5 prolin-benzylester, fremstillet i eksempel 87, hydrolyseres ved behandling med to ækvivalenter natriumhydroxid i en blanding af methanol og vand ved stuetemperatur natten over. Opløsningsmidlet strippes fra reaktionsblandingen i vakuum, og resten hydrogeneres i ethanolisk hydrogenchlorid som i 10 eksempel 72 og oparbejdes som beskrevet der til opnåelse af blandingen af diastereoisomere af den ønskede forbindelse.

EKSEMPEL 89 N-a^jl-ethpxycarbgnyl^g-phenYlprgpyl)-N-£~acetyl-L-lysyl-L-prolin 15 På den i eksempel 26 beskrevne måde kobles ethyl-2-oxo-4- phenylbutyrat med N-£-aeetyl-L-lysyl-L-prolin i ethano1-vand-opløsning i nærværelse af natriumcyanoborhydrid. Der isoleres på "Dowex" 50 som beskrevet, og de produktrige fraktioner frysetørres til opnåelse af blandingen af isomere af N-(l-20 ethoxycarbonyl-3-phenylpropyl) -N-£-acety1-L-lysyl-L-prolin.

EKSEMPEL 90 N-a-(1-ethoxycarbonyly3-phenylpropyl)-L-histidyl-L-prolin På den i eksempel 26 beskrevne måde kobles ethyl-2-oxo-4-phenylbutyrat med L-histidyl-L-prolin i nærværelse af natrium-25 cyanoborhydrid. Der renses som beskrevet til opnåelse af blandingen af diastereoisomere af N-a-(1-ethoxycarbony1-3-pheny1-propyl)-L-histidyl-L-prolin.

EKSEMPEL 91 73

DK 165455B

A. N-a-(l-ethoxycarbonyl-3-a-naphthylpropyl)-L-lYSYl-L-grolin

Ethyl-4-a-naphthyl-2-oxobutyrat (fremstillet ved alkylering af ethyl-1,3-dithian-2-carboxylat med 2-a-naphthylethylbromid og 5 påfølgende overføring til ketonen med N-bromsuccinimid i vandig acetone) kondenseres med £-3°-butoxycarbonyl-L-lysyl-L-prolin i ethanol i nærværelse af NaBH^CN og molekylsigter. Produktet absorberes på stærkt sur ionbytterharpiks og elueres med 2 pct.'s pyridin i vand. Fjernelse af t-Boc-gruppen 10 fuldendes ved behandling med 4,0 N HC1 i ethylacetat til opnåelse af N-a-(l-ethoxy~carbonyl-3-a-naphthylpropyl)-L-lysyl-L-prolin.

B. N-a-(l-carbethoxy-3-a-naohthylprgpyl^-L-lysyl-L-prglin

En opslemning af 4-a-naphthyl-2-oxosmørsyre (fremstillet 15 ud fra esteren ved hydrolyse) i vand indstilles til pH 7 med fortyndet NaOH og frysetørres. Resten behandles med £-3°-butoxycarbonyl-L-lysyl-L-prolin som beskrevet i eksempel 91A til opnåelse af N-a-(l-carboxy-3-a-naphthylpropyl)-L-lysyl-L-prolin.

20 EKSEMPEL 92

NzSziIll§il£åE^22YzllBlSl2i2£Eh§BYiE£2EYllz;L-lYsyl-L-grolin En opløsning af C-3°-butoxycarbonyl-L-lysyl-L-prolin (0,36 g) og 4-p-chlorphenyl-2-oxosmørsyre (1,1 g) i 5 ml vand indstilles til pH 7 med fortyndet NaOH og behandles med 0,07 g 25 NaBH^CN i 1 ml vand i løbet af flere timer. Efter omrøring natten over ved stuetemperatur absorberes produktet på stærkt sur ionbytterharpiks og elueres med 2 pct.'s pyridin i vand til opnåelse af 0,058 g produkt. NMR indikerer, at t-Boc-beskyttelsesgruppen ikke er fjernet fuldstændigt. Produktet 30 behandles med 4,5 N HC1 i ethylacetat, efterfulgt af ionbyt-ningisolation til opnåelse af 0,048 g N-a-(l-carboxy-3-p-chlorphenylpropyl)-L-lysyl-L-prolin. NMR- og massespektret er i overensstemmelse med strukturen. En spids findes ved 584 for den silylerede molekylårion. Kromatografi giver den øn- EKSEMPEL 93 74

DK 165455 B

skede isomere.

N-a-(l-ethoxYcarbgnyl-3-g-chlorphenYl)-17lysyl-L-prolin

Ved at kondensere ethyl-4-p-chlorphenyl-2-oxo-butyrat og £-3°-5 butoxycarbonyl-L-lysyl-L-prolin i ethanolisk opløsning med overskud af NaBHgCN og isolering af produktet som beskrevet i eksempel 92 opnås N-a-(l-ethoxycarbonyl-3-p-chlorphenylpropyl)-L-lysyl-L-prolin.

EKSEMPEL 94 10 N-g-^l-carboxy-S-jiS^I-dichlgrphenylX-propylJ.-L-lysyl-L-prolin

En opløsning af 4-(3,4-dichlorphenyl)-2-oxo-smørsyre (fremstillet ud fra dichlordihydrocinnamatester ved kondensation med ethyloxalat og påfølgende syrekatalyseret hydrolyse og delvis decarboxylering) i vand behandles som beskrevet i eksempel 92 15 til opnåelse af N-a-[l-carboxy-3-(3,4-dichlorphenyl)-propyl]-L-lysyl-L-prolin.

EKSEMPEL 95 N-a- [1 (s)_-carbgxy-3- (3-indolyl)propyl] -L-lysyl-L-prolin 2-ΟΧΟ-4-(3-indolyl)smørsyre fremstilles ud fra homotryptophan 20 ved den metode, der er beskrevet af Weygand et al., Ann. 658, 128 (1962). Denne forbindelse kondenseres med S-t-Boc-L-lysyl-L-prolin i nærværelse af natriumcyanoborhydrid som beskrevet i eksempel 54 til opnåelse af den rå blanding af dia-stereoisomere af N-a-(l-carboxy-3-(3-indolyl)propyl]-N-£-t-25 Boc-L-lysyl-L-prolin. Beskyttelsesgruppen i lysinsidekæden fjernes ved behandling med 4 N hydrogenchlorid i ethylacetat, og der renses på en stærkt sur ionbytterharpiks som beskrevet i nævnte eksempel til opnåelse af det ønskede produkt. Kromatografi giver den ønskede isomere.

EKSEMPEL 96 75

DK 165455B

NrSzl6r§i!}i22ziz£å£fe22Yii§2YilriiliY§Ylli;rEE2iiD Benzyl-2-oxo-7-phthalimidoheptanoat og £-3°-butoxycarbonyl-L-lysyl-L-prolin kondenseres med overskud af NaBH^CN i ethano-5 lisk opløsning til opnåelse af N-a-(l-benzyloxycarbonyl-6-phthalimidohexyl) -N- f-3°-butoxycarbonyl-L-lysyl-L-prolin. Fjernelse af benzylgruppen ved hydrogenering over Pd, fjernelse af t-boc-gruppen med 4,5 N HC1 i ethylacetat og fjernelse af phthalimidgruppen ved behandling med hydrazin giver N-a-10 (6-amino-l-carboxyhexyl)-L-lysyl-L-prolin.

EKSEMPEL 97 N-a-J6-amino-l-benzyloxycarbonYlhexyl)-L-lysyl-L-prolin N-a- (l-benzyloxycarbonyl-6-phthalimidohexyl) -N- £-3°-butoxy-carbonyl-L-lysyl-L-prolin (fremstillet som beskrevet i eksempel 15 96) behandles med 4,0 N HC1 i ethylacetat og derpå med et æk vivalent hydrazin under tilbagesvaling i kogende ethanol, hvilket giver en blanding, hvorfra N-a-(6-amino-l-benzyloxycarbo-nylhexyl)-L-lysyl-L-prolin kan isoleres.

EKSEMPEL 98 20 N-a- (5-amino-l (S) -carboxypentyl).-L-lysyl-L-prolin

Benzyl-2-oxo-6-phthalimidohexanoat behandles som beskrevet i eksempel 96 til opnåelse af N-a-(5-amino-l-carboxylpentyl)-L-lysyl-L-prolin. Kromatografi giver den ønskede isomere.

EKSEMPEL 99 2 5 N-a-j-5-amino-l-benzyloxycarbonylpentyl^-L-lysvl-L-prolin

Benzyl-2-oxo-6-phthalimidohexanoat behandles som beskrevet i eksempel 96, bortset fra at debenzylering med hydrogen over palladium undlades. Fra produktblandingen kan det ønskede N-a-(5-amino-l-benzyloxycarbonylpentyl)-L-lysyl-L-prolin 30 isoleres.

"76

DK 165455 B

EKSEMPEL 100 A. Nraril~carboxY-2-]3henoxYethYl) ^L-lysyl-L-prolin

Phenoxypyrudruesyre (0,9 g) opløses i vand, pH indstilles til 7 med fortyndet NaOH, og opløsningen frysetørres. Resten op-5 løses i 10 ml ethanol og behandles med £-3°-butoxycarbonyl-L-lysyl-L-prolin (0,36 g) og pulverformig molekylsigter nr. 4A (3,0 g) . Natriumcyanoborhydrid (0,18 g i 3,5 ml ethanol) tilsættes portionsvis, og der omrøres ved stuetemperatur, indtil omsætningen er fuldstændig. Produktet isoleres ved ab-10 sorption på stærkt sur ionbytterharpiks og eluering med 2 pct.'s pyridin i vand efterfulgt af frysetørring til opnåelse af 0,25 g afbeskyttet produkt, N-α- (l-carboxy-2-phenoxyethyl)-L-lysyl-L-pyrolin. NMR- og masse-spektrum er i overensstemmelse med strukturen.

15 B. N-a-jl-ethpxycarbonyl-2-phenoxyethyl)_-L-lYsyl-L-prolin

Ethylphenoxypyruvat behandlet med £-3°butoxycarbonyl-l-Ly-syl-L-prolin som beskrevet i eksempel 100A giver N-a-(l-eth-oxycarbonyl)-2-phenoxyethyl)-L-lysyl-L-prolin.

EKSEMPEL 101 20 A. N-a-iliSl-carboxy-g-phenylthioethyli-L-lysyl-L^prolin

Phenylthiopyrodruesyre behandles med £-3°-butoxycarbonyl-L-lysyl-L-prolin som beskrevet i eksempel 100 til opnåelse af N-a-(l-carboxy-2-phenylthioethyl)-L-lysyl-L-prolin. Massespektret viser en silyleret molekylarion ved 567 m/e. Kro-25 matografi giver den ønskede isomere.

B. N^a-^l-ethoxycarbonyl^g-phenylthioethylX-L-lysyl-L^prolin

Ethylphenylthiopyruvat behandles med i-3°-butoxycarbonyl-L-lysyl-L-prolin som beskrevet i eksempel 100A til opnåelse af N-Pi- (l-ethoxycarbonyl-2-phenylthioethyl) -L-lysyl-L-prolin.

EKSEMPEL 102 77

DK 165455B

i?lSllil2SE^25Yl21§llSiBiii2z3i2h§2Yi2£!2EYiii:5z£liYSYili:lE£2iiS Ethyl-2-amino-4-phenyl-3-phthalimidobutanoat kondenseres med 2-oxo-6-phthalimidohexansyre (fremstillet ved alkylering 5 af benzyl-1,3-dithian-2-carboxylat med phthalimidobutylbromid efterfulgt af oxidation og hydrolyse) i nærværelse af natrium-cyanoborhydrid ved den procedure, der er beskrevet i eksempel 13. Det resulterende mellemprodukt kobles med L-prolin-benzyl-ester-hydrochlorid ved hjælp af diphenylphosphorylazid som 10 beskrevet i nævnte eksempel til opnåelse af en blanding af isomere af N-a-(l-carbethoxy-2(S)-phthalimido-3-phenylpropyl)-N-£-phthaloyl-D,L~lysyl-L~prolin-benzylester, der renses ved søjlekromatografi. Dernæst behandles med to ækvivalenter • natriumhydroxid i ethanol-vand-opløsning i 4 timer ved 15 stuetemperatur, neutraliseres til pH 4 med kone. saltsyre, ethanolen afdestilleres i vakuum, produktet ekstraheres over i ethylacetat, og opløsningsmidlet fjernes i vakuum.

Denne rest koges under tilbagesvaling i ethanol indeholdende to ækvivalenter hydrazin i 1,5 timer, og der isoleres som 20 beskrevet i eksempel 74 til opnåelse af den ønskede forbindelse.

EKSEMPEL 103 N-a- (l-carboxy-2-(S)-benzoylamino-3-phenylpropyl)-D,L-lysyl-L-prolin 25 Ethyl-2-amino-3-benzoylamino-4-phenylbutanoat (fremstillet i eksempel 77) kondenseres med 2-oxo-6-phthalimidohexansyre i nærværelse af natriumcyanoborhydrid ved den i eksempel 13 beskrevne metode. Den resulterende forbindelse N-a-(l-carbethoxy-2- (S) -benzoylamino-3-phenylpropyl) -N- E.-phthaloyl-D,L-30 lysin kobles med L-prolin-benzylester-hydrochlorid ved hjælp af diphenylphosphorylazid som beskrevet i det samme eksempel til opnåelse af en blanding af isomere af N-a-(1-carbethoxy- 2- (S) -benzoylamino-3-phenylpropyl) -N-£.-phthaloyl-D,L-lysyl-L-

DK 165455 B

78 prolin-benzylester, som renses ved kromatografi. Der behandles med to ækvivalenter natriumhydroxid i ethanol-vand-opløsning i 4 timer ved stuetemperatur og oparbejdes som beskrevet i eksempel 102 til opnåelse af N-a-(l-carboxy-2-(S)-benzoylamino-3-5 phenylpropy 1) -N- 8-phthaloy 1-D, L-lysyl-L-prolin. Denne for bindelse koges under tilbagesvaling i ethanol i 1,5 timer i nærværelse af et ækvivalent hydrazin, og der isoleres som beskrevet i eksempel 74 til opnåelse af den ønskede forbindelse som en blanding af isomere.

10 EKSEMPEL 104 N-a-(2-amino-l-carboxy-4-methylpentYl)-D,L-lysyl-L-prolin

En ethanolisk opløsning af trans-3-amino-4-(2-methylpropyl)- 2-azetidinon (som fremstillet i eksempel 78) kobles reduktivt med benzyl-2-oxo-6-phthalimidohexanoat under anvendelse 15 af NaBHgCH og molekylsigter. Produktet, N-a-[4-(2-methyl-propyl)-2-oxo-3-azetidinyl]-N-£-phthaloyl-D,L-lysin-benzyl-ester, debenzyleres ved hydrogenering over palladium. Den frie syre og prolin-benzylesteren kobles med diphenylphos-phorylazid, og produktet debenzyleres derefter som i det 20 foregående til opnåelse af N-a-[4-(2-methylpropyl)-2-oxo-3-azetidinyl] -N- £-phthaloyl-D, L-lysyl-L-prolin. Phthaloylgrup-pen fjernes ved stuetemperatur i ethanolisk opløsning med et mol ækvivalent hydrazin til opnåelse af N-a-[4-(2-methylpropyl)- 2-oxo-3-azetidinyl]-D,L-lysyl-L-prolin. Hydrolyse med fortyn-25 det natriumhydroxid giver, ved åbning af S-lactamringen, N-a-(2-amino-l-carboxy-4-methylpentyl)-D,L-lysyl-L-prolin.

EKSEMPEL 105

NraziS-benzamido^l-carboxy-l-methylpentylX-D^L-lysyl-L-prolin N-a- [4- (2-methylpropyl) -2-oxo-3-azetidinyl] -N-£-3°-butoxycarb-30 onyl-D,L-lysin-benzylester fremstilles ud fra trans-3-amino-4-(2-methylpropyl)-2-azetidinon (eksempel 78) og benzyl-£-3°-but-oxy-carbonylamino-2-oxohexanoat. Benzylgruppen fjernes ved hydrogenering, og produktet kobles med L-prolin-benzylester.

DK 165455 B

79

Produktet, N-a-[4-(2-methylpropyl-2-oxo-3-azetidinyl]-N-£~3°-butoxycarbony 1-D, L-lysy 1-L-prolin-benzylester, debenzyleret med hydrogen, og β-lactamen hydrolyseres med fortyndet base til opnåelse af N-a-(2-amino-l-carboxy-4-methylpentyl)-N-1-5 3°-butoxycarbonyl-D,L-lysyl-L-prolin. Efter benzoylering med benzoylchlorid i organisk opløsningsmiddel fjernes t-Boc-beskyttelsesgruppen med trifluoreddikesyre til opnåelse af N-a-(2-benzamido~l-carboxy-4~methylpentyl)-D,L-lysyl-L-prolin.

10 EKSEMPEL 106 N-a-j1(S)-c arboxy-3"P^chlorphenylpropyl)-L-lysy1-L-4-methoxy-prolin

Methyl-L-4a-methoxyprolinat-hydrochlorid kobles med N-a-t-Boc-N-£.-Cbz-L-lysin under anvendelse af dicylohexylcarbodi-15 imid og triethylaminmethylenchlorid som beskrevet i eksempel 20. Der renses ved kromatografi, esteren hydrolyseres, og t-Boc-beskyttelsesgruppen fjernes som beskrevet i nævnte eksempel. Denne £-Cbz-L-lysyl-L-4a-methoxyprolin kobles reduktivt med 2-oxo-4-p-chlorphenylsmørsyre (fremstillet ud fra 20 p-chlorhydrokanelsyre-ethylester ved basekatalyseret kondensation med diethyloxalat efterfulgt af decarboxylering i vandfri hydrogenchlorid i eddikesyre) i nærværelse af natrium-cyanoborhydrid og oparbejdning som beskrevet i eksempel 24 til opnåelse af blandingen af isomere af N-a-(l-carboxy-3-p-25 chlorphenylpropyl)-N-£-Cbz-L-lysyl-L-4a-methoxyprolin.

Benzyloxycarbonyl-beskyttelsesgruppen fjernes ved katalytisk hydrogenering over palladium-på-kul som katalysator på sædvanlig måde. Kromatografi giver den ønskede isomere.

EKSEMPEL 107 30 N-a-jl-carboxy-3-g-chlorphenyl2ropyl2-L-lysyl-L-4-thiazolidin-N-a-t-Boc-N-å-Cbz-L-lysin kobles med L-thiazolidin-4-carboxyl-

DK 165455B

80 syre-benzylester-hydrochlorid, der renses ved kromatografi, esteren hydrolyseres, og den t-Boc-beskyttende gruppe fjernes, hvilket altsammen er beskrevet i eksempel 20. Denne forbindelse kobles reduktivt med 2-oxo-4-p-chlorphenyIsmørsyre 5 som beskrevet i eksemplet til opnåelse af blandingen af isomere af N-a-(l-carboxy-3-p-chlorphenylpropyl)-N-£-Cbz-L-lysyl-L-4-thiazolidin-carboxylsyre. Benzyloxycarbonyl-beskyttelses-gruppen fjernes ved behandling med hydrogenbromid i eddikesyre ved stuetemperatur efter standardmetoden i peptidkemien, 10 opløsningsmidlet afstrippes i vakuum, der skylles med vand, og endelig frysetørres der til opnåelse af det ønskede produkt.

EKSEMPEL 108 N-a-^l-carboxy-S-p-chlorphenylpropyll-L-lysyl-D^L-trans-S- ^si^Yithiazglidin^i-carboxylsyre 15 Trans-5-methylthiazolidin-4-carboxylsyre—ethylester-hydrochlo-rid (fremstillet ud fra α-bromcrotonsyre og thioacetamid, sur hydrolyse til β-methylcystein og påfølgende omsætning med formaldehyd, metoden der er anvendt af R.F. Nutt et al., Abstracts of the 6th American Peptide Symposium, Washington, D.C.

20 (1979), 1-16, p.· 95) kobles med 7,4 g Ν-α-t-Boc-N-t-Cbz-L- lys in, under anvendelse af 2,8 ml triethylamin og 4,5 g dicyc-lohexylcarbodiimid i methylenchlorid som beskrevet i eksempel 20. Dette mellemprodukt kobles reduktivt med 2-oxo-4-p-chlorphenylsmørsyre under anvendelse af natriumcyanobor- 25 hydrid efterfulgt af fjernelse af benzyloxycarbonyl-beskyttel-sesgruppen som beskrevet i eksempel 107 til opnåelse af N-a-(l-carboxy-3-p-chlorphenylpropyl) -L-lysyl-D ,L-trans-5-methyl-thiazolidin-4-carboxylsyre som en blanding af isomere.

EKSEMPEL 109 30 N-a-(l-carboxy-3-p-chlorphenylpropvl)-L-lysyl-L-3,4-' ^ehYdroprolin L-3,4-dehydroprolin-ethylester-hydrochlorid kondenseres med

DK 165455 B

si Ν-α-t-Boc-N- fc-Cbz-L-lysin, t-Boc-beskyttelsesgruppen fjernes med 4 M HC1 i ethylacetat, hvorpå mellemproduktet reduktivt kobles med 2-oxo-4-p-chlorphenylsmørsyre, beskyttelsesgruppen fjernes med HBr i eddikesyre, og der oparbejdes, altsammen som 5 beskrevet i eksempel 107, til opnåelse af blandingen af isomere af N-a- (l-carboxy-3-p-chlorphenylpropyl)-L-lysyl-L-3,4-dehy-droprolin.

EKSEMPEL 110

NzlliSSSfeoxYZ^-methylpentYll-L-alanyl-L-prglin 10 En opløsning af 5-methyl-2-oxohexansyre (1,44 g) og L-alanyl-L-prolin (0,37 g,) i 5 ml vand indstilles til pH 7 og behandles med NaBH3CN (0,31 g). Efter omrøring ved stuetemperatur i fem dage absorberes reaktionsproduktet på stærkt sur ionbyt-terharpiks, og der elueres med 2 pct.'s pyridin i vand til op-15 nåelse af 0,6 g frysetørret fast stof. En portion (0,2 g) renses ved kromatografi på en LH 20 søjle til opnåelse af 0,18 g N-(l-carboxy-4-methylpentyl)-L-alanyl-L-prolin. NMR- og massespektret er i overensstemmelse med den angivne struktur.

De diastereoisomere kan isoleres ved kromatografi.

20 EKSEMPEL 111 N- (1- (S) -ethoxYcarbonYl-4-methylpentyl) -L-alanyl-;L-prolin

Ethyl-5-methyl-2-oxohexanoat (3,44 g) og L-alanyl-L-prolin (0,74 g) omrøres i 15 ml ethanol med 6 g pulverformige molekyl-sigter 4A. Natriumcyanoborhydrid (0,23 g) i ethanol tilsæt-25 tes dråbevis i løbet af flere timer. Ethanolen fjernes derpå under vakuum, produktet absorberes på stærkt sur ionbytterhar-piks og elueres med 2 pct.1 s pyridin i vand til opnåelse af 1,08 g N-(1-ethoxycarbony1-4-methylpentyl)-L-alanyl-L-prolin.

En portion renses ved LH-20 kromatografi til spektralanalyse.

30 NMR er i overensstemmelse med strukturen. Massespektret viser en spids ved 414 (silyleret molekylarion -15). Kromatografi giver den ønskede isomere.

EKSEMPEL 112 82

DK 165455 B

NrlilcarbgxY-S-p-ghengxYEhenyJjDrgEYl^L-alanYl-L-prglin

En blanding af 2-oxo-4-p-phenoxyphenylsmØrsyre (fremstillet ved omsætning mellem p-phenoxyphenyl-Grignard-reagens og ethyl-5 enoxid, overføring af den resulterende alkohol i bromidet og kondensation med ethyl-1,3-dithian-2-carboxylat; oxidativ spaltning af dithianen efterfulgt af basisk hydrolyse giver ketosyren) og L-alanyl-L-prolin i vand indstilles til pH 7 med fortyndet base og behandles med overskud af NaBHgCN.

10 Produktet/ N-(l-carboxy-3-p-phenoxyphenylpropyl)-L-alanyl-L-prolin, isoleres ved kromatografi.

EKSEMPEL 113 N-(1-ethoxycarbony1-3-p-phenoxyphenylprgpy1)-I^alanyl-L-prolin

Ethyl-2-oxo-4-p-phenoxyphenylsmørsyre (fremstillet som beskrevei 15 i eksempel 112, bortset fra at den afsluttende alkaliske hydrolyse undlades) kondenseres med L-alanyl-L-prolin i nærværelse af NaBHgCN, hvilket giver N-(1-ethoxycarbonyl-3-p-phenoxy-phenylpropyl)-L-alanyl-L-prolin.

EKSEMPEL 114 20 N-(l7carboxy-3-ghenylpropyl)-L-alanyl-pf l-3,3-dimethylprolin 3,3-dimethyl-D/L-prolin fremstilles ud fra 3-methyl-2-butenal ved den metode, der er beskrevet af Cox, J. Chem. Soc., 1964, 5024, og dette produkt overføres i methylester-hydrochloridet med methanolisk hydrogenchlorid. Dernæst kobles der med t-25 Boc-L-alanin og kondenseres med 2-oxo-4-phenylsmørsyre ved de i eksempel 47 beskrevne metoder til opnåelse af en blanding af isomere af det ønskede produkt.

EKSEMPEL 115 A. N-(l-carboxY-3-phenylpropyl^-L-g-benzyl-cysteinYl-L-prolin 83

Kondensation af L-N~t-Boc-S~benzylcystein med L-prolin-t-butyl-ester i nærværelse af dicyclohexyl-carbodiimid på sædvanlig måde giver det blokerede dipeptid, L-(N-t-Boc-S-benzylcysteinyD-L-prolin-t-butylester . Denne behandles med 4N HC1 i ethylace-5 tat ved 0°C til opnåelse af L-(S-benzylcysteinyl)-L-prolin. Behandling af dette dipeptid med 2-oxo-4-phenylsmørsyre i nærværelse af natriumcyanoborhydrid resulterer i dannelsen af N- (l-carboxy-3-phenylpropyl)-L-(S-benzylcysteinyl)-L-prolin som en blanding af isomere.

10 B. N-^l-carbgxy-3-phenylpro2yl|-L-cysteinyl-L-grglin

Behandling af N-(l-carboxy-3-phenylpropyl)-L-S-benzylcysteinyl-L-prolinet, fremstillet under A, med natrium i væskeformig ammoniak giver den ønskede forbindelse.

EKSEMPEL 116 15 N-a-jl-carbgxy-3-phenylpr9pYlj.-L-grnithYl-L-prgl.in N- S-t-BOC-L-ornithyl-L-prolin og 2-oxo-4-phenylsmørsyre kondenseres i natriumcyanoborhydrid på den i eksempel 54 beskrevne måde. Beskyttelsesgruppen fjernes fra produktet under anvendelse af ethylacetat, som er 4 N i gasformig hydrogen-20 chlorid. Det rå diastereomere HCl-salt adsorberes på stærkt sur ionbytterharpiks og elueres med en 2 pct.'s vandig py-ridinopløsning. Massespektret viser en molekylarion ved 355 m/e for produktet -36. NMR-spektret er i overensstemmelse med strukturen.

25 EKSEMPEL 117

Nz5liliSi“carbgethoxy-3-phenYlgrogyl22L-lysYl-L-grolin

Ethyl-2-oxo-4-phenylbutyrat (2,58 g) og N-£-t-Boc-L-lysyl-L-prolin (859 mg) opløses i absolut ethanol (50 ml), til hvilken der er sat molekylsigter knust til en størrelse på 30 5 Å (2,0 g). Efter endt reaktion fjernes sigterne ved fil trering. Efter inddampning opløses filtratresten i vand, der ekstraheres med ether og adsorberes på stærkt sur ionbyt-

DK 165455 B

84 terharpiks. Eluering med 2 pct.'s pyridin i vand giver 639 mg råt beskyttet produkt, N-a-(l-carboethoxy-3-phenylpropyl)-N-£.-t-Boc~L-lysyl-L-prolin. Beskyttelsesgruppen fjernes med ethylacetat, som er 4 N i gasformig hydrogenchlorid. Det resul-5 terende HCl-salt adsorberes på stærkt sur ionbytterharpiks og elueres med 2 pct.'s pyridin til opnåelse af 270 mg produkt. Massespektret viser en molekylarion ved 678 m/e for det di-silylerede materiale +1. NMR er i overensstemmelse med strukturen. Kromatografi giver den ønskede isomere.

10 EKSEMPEL 118 N-a:;ll:;carbgxy-3-phenylprqgy!y -N-fc-N-fcdimethyl-L-lysyl-L-EEoiii} Ν-α-t-Boc-N-£-Cbz-L-lysy1-L-prolin-benzylester methyleres reduktivt i formaldehyd/10 pct.'s Pd/C, 40 psi H2. a-t-Boc-be-15 skyttelsesgruppen spaltes med ethylacetat, som er 4 N i gasformig hydrogenchlorid. På den i eksempel 54 beskrevne måde kondenseres 2-oxo-4-phenylsmØrsyre og N-£-N- i-dimethyl-L-lysyl-L-prolin-hydrochlorid i nærværelse af natriumcyanobor-hydrid. Massespektret viser en molekylarion ved 415 for pro-20 duktet -18. NMR-spektret er i overensstemmelse med strukturen.

EKSEMPEL 119 N-g-[1-(S)-carbgxy-3-phenylprqpyl]-L-lysyl-L-prolin N-a-(l-carboxy-3-phenylpropyl)-L-lysyl-L-prolin, en blanding af diastereomere fremstillet som beskrevet i eksempel 57 B, 25 renses ved gelfiltreringskromatografi i methanol (LH 20).

XAD-2 søjlen fremstillet som beskrevet i eksempel 25 er bragt i ligevægt ved 53°C med 0,1 M NH^OH indeholdende 4 pct. aceto-nitril. Den isomere blanding fra det foregående (250 mg) opløses i 10 ml af samme opløsningsmiddel og sættes til søjlen.

30 Når søjlen elueres med dette opløsningsmiddel, kommer den første isomere ud i volumenområdet 320 - 360 ml eluat. Den anden isomere kommer ud i området 450 - 540 ml eluat. Mellemfraktionerne indeholder en blanding af isomere. Når fraktio- 85 ner indeholdende den første isomere frysetørres, opnås 72 mg fnugget hvidt fast stof. Dette er den mere aktive isomere og SSS-konfigurationen ved analogi med den mere aktive isomere af N-a-(l-carboxy-3-phenylpropyl)-L-alanyl-L-prolin, som 5 ved røntgenanalyse er vist at have SSS-konfiguration. Ved tyndtlagskromatografi på silicagel i 1:1:1:1 ethylacetat: n-butanolsvand:eddikesyre giver dette faste stof en enkelt plet, der har en R^-værdi på 0,43. 300 MHz NMR-spektret viser en triplet for methin-proton-#' til phenylsubstituenten ved 3,40 10 ppm. Når fraktionerne indeholdende den anden isomere frysetørres, opnås 72 mg hvidt fnugget fast stof. Dette faste stof giver ved tyndtlagskromatografi en enkelt plet med R^-værdien 0,39. 300 MHz-NMR-spektret viser tripletten for methin-proton-r til phenylsubstituenten ved 3,61 ppm.

15 EKSEMPEL 120 N-a-(1-carboxy-3-phenylpropyl)-N-£-acetyl-L-lysyl-L-prolin På den i eksempel 54 beskrevne måde kondenseres 2-oxo-4-phenyl-smørsyre og N-£~acetyl-L-lysyl-L~prolin i nærværelse af natri-umcyanoborhydrid til opnåelse af N-a-(l-carboxy-3-phenylpro-20 pyl)-N- fc-acetyl-L-lysyl-L-prolin. NMR-spektret er i overensstemmelse med strukturen. Massespektret viser en molekylar-ion ved 663 for det trisilylerede materiale.

EKSEMPEL 121

Nz^ziiz25E^2XYl3-phenylDrogyl)_-L-arginYl-L-2rolin 25 Det nødvendige dipeptid fremstilles ved DCC-kondensation af Ν-α-t-Boc-N-tø-nitro-L-arginin og L-prolin-benzylester-hydro-chloridsalt. ^-t-Boc-beskyttelsesgruppen fjernes på sædvanlig måde med 4 N HC1 i ethylacetat, og den resulterende N-tø-nitro-L-arginyl-L-prolin-benzylester kondenseres med 2-oxo-4-phenyl-30 smørsyre på den i eksempel 54 beskrevne måde.

Reaktionen giver et ret lavt udbytte (25-33 pct.) af N-a-(l-carboxy-3-phenylpropyl)-N-^nitro-L-arginyl-L-prolin-benzyl-

DK 165455 B

86 ester. Denne forbindelse (159 mg) opløses i en opløsning (2,5 ml) af eddikesyre/vand/methanol (84 pct., 8 pct., 8 pct.) og hydrogeneres ved 276 kPa, stuetemperatur og over 130 mg 10 pct.'s palladium-på-kul til samtidig fjernelse af Φ-nitro-5 og benzylester-beskyttelsesgrupperne. Katalysatoren frafiltre-res, og filtratet inddampes til et glas (94 mg), hvoraf den vand opløselige del frysetørres til et fnugget hvidt fast stof (90 mg). Dette faste stof er acetatsaltet for det ønskede produkt og overføres til den frie base ved at absorbere det på 10 en stærkt sur ionbytterharpiks, vaske med vand efterfulgt af eluering med 2 pct.'s pyridin i vand. Frysetørring af produktrige fraktioner giver 60 mg N-a-(l-carboxy-3-phenylpropyl)-L-arginyl-L-prolin. NMR-spektret er i overensstemmelse med strukturen. Massespektret viser en molekylarion ved 793 15 for det pentasilylerede produkt.

EKSEMPEL· 122 N- (l-carbgxy-3-phenylpropyl)_-L-histidyl-I,-grolin På den i eksempel 54 beskrevne måde kondenseres 2-oxo-4-phenyl-smørsyre og L-histidyl-L-prolin i nærværelse af natriumcyano-20 borhydrid til opnåelse af N-(l-carboxy-3-phenylpropyl)-L-histidyl-L-prolin. Produktet renses ved gelfiltreringskromatografi i methanol (LH-20). NMR-spektret er i overensstemmelse med strukturen. Massespektret viser en molekylarion ved 657 for det disilylerede materiale.

25 EKSEMPEL· 123

NraiIiz£§tboxy-2-^3-indolyliethyl],-L-lysyl-L-prglin På den i eksempel 54 beskrevne måde kondenseres indol-3-pyrudruesyre med N-£-t-Boc-L-lysyl-L-prolin i nærværelse af natriumcyanoborhydrid. £-t-Boc-beskyttelsesgruppen fjernes fra 30 produktet med 4 N HC1 i ethylacetat. Det resulterende hydro-chlorid absorberes på "Dowex" 50 (H+) og elueres med 2 pct.'s pyridin i vand. Frysetørring af produktrige fraktioner giver '87

DK 165455 B

den frie base som et let brunt fnugget fast stof. NMR-spek-tret er i overensstemmelse med strukturen. Massespektret viser en molekylarion ved 718 for tetrasilyleret materiale.

EKSEMPEL 124 5 N3«;^l-carboethoxy-4-methYl2entyl2-L-lysyl-L-grolin 2-oxo-4-methyl-ethylpentanoat (2,75 g) og N-£-t-Boc-L-lysyl-L-prolin (2,75 g) opløses i 150 ml ethanol indeholdende 16 g molekylsigter 4A på pulverform. Der hydrogeneres ved 40 psi, stuetemperatur, og over 1 g 10 pct.'s palladium-på-kul. Efter 10 optagelse af 1 mol hydrogen filtreres der gennem filterhjælp, katalysatoren vaskes omhyggeligt på filterkagen med ethanol. Opløsningsmidlet inddampes til opnåelse af 5,87 g olie. Olien suspenderes i vand, pH indstilles til 8,5, og der ekstraheres med ethylacetat (3 x 60 ml) til fjernelse af neutrale mate-15 rialer. pH for det vandige lag indstilles til 7, der mættes med natriumchlorid, og produktet ekstraheres med ethylacetat (3 x 100 ml). Produktopløsningen tørres over vandfri magnesiumsulfat. Ethylacetat afdampes til opnåelse af 4,38 g rå N-a-(l-carboethoxy-4-methylpentyl)-N- fc-t-Boc-L-lysyl-L-prolin.

20 t-Boc-beskyttelsesgruppen fjernes på sædvanlig måde med 4 N HC1 i ethylacetat. Det resulterende hydrochlorid overføres 1 den frie base med stærkt sur ionbytterharpiks (eluering med 2 pct.'s pyridin i vand). Produktrige fraktioner frysetørres til opnåelse af 2,1 g hygroskopt skørt fast stof. NMR-spek- 25 tret er i overensstemmelse med strukturen for N-a-(1-carbo- ethoxy-4-methylpentyl)-L-lysyl-L-prolin. Massespektret giver en spids ved 472 for det monosilylerede molekyle i plus 1.

EKSEMPEL 125 N-a-(l-carboxy-4-methylpentyl)-L-lysyl-L-prolin 30 N-a- (l-carboethoxy-4-methylpentyl)-L-lysyl-L-prolin hydroly seres til den tilsvarende carboxylsyre ved omrøring i en vandig opløsning af natriumhydroxid (2,5 ækvivalenter) ved stuetemperatur i flere dage. Reaktionsblandingen syrnes til pH 5, absorberes på stærkt sur ionbytterharpiks og elueres med 2 '88

DK 165455 B

pct.'s pyridin i vand. Den produktrige fraktion frysetørres til opnåelse af N-(l-carboxy-4-methylpentyl)-L-lysyl-L-pro-lin som et hvidt fnugget fast stof. NMR-spektret er i overensstemmelse med strukturen. Massespektret viser en molekylar-5 ion ved 516 for det disilylerede materiale.

EKSEMPEL 126 M-g-r( l-carboxy-3-phenylpropyl) -L-leucyl-L-tryptophan På den i eksempel 54 beskrevne måde kondenseres 2-oxo-4-phenylsmørsyre og L-Leucyl-L-tryptophan i nærværelse af natrium-10 cyanoborhydrid. Produktet frysetørres fra en blanding af dioxan/vand, da det kun er lidt opløseligt i vand. NMR-spektret er i overensstemmelse med strukturen. Massespektret giver en molekylarion ved 695 for det trisilylerede materiale.

EKSEMPEL 127 15 En typisk tablet indeholder N-(1(S)-ethoxycarbonyl-3-phenyl- propyl)-L-alanyl-L-prolin (25 mg), præ-gelatineret stivelse USP (82 mg), mikrokrystallinsk cellulose (82 mg) og magnesium-stearat (1 mg). På lignende måde kan for eksempel N-(1(S) -carboxy-3-phenylpropyl)-L-lysyl-L-prolin (20 mg) formuleres 20 i stedet for N-(l(S)-ethoxycarbonyl-3-phenylpropyl)-L-alanyl-L-prolin med præparatet af præ-gelatineret stivelse, mikro- ' krystallinsk cellulose og magnesiumstearat som beskrevet i det foregående.

En kombinationstablet, med et diuretica, såsom hydrochlor-25 thiazid, indeholder typisk N-(l(S)-ethoxycarbonyl-3-phenyl- propyl)-L-alanyl-L-prolin (7,5 mg), hydrochlorthiazid (50 mg), prægelatineret stivelse USP (82 mg), mikrokrystallinsk cellulose (82 mg) og magnesiumstearat (1 mg). Tabletter·med for eksempel N-(1(S)-carboxy-3-phenylpropyl)-L-lysyl-L-prolin 30 (5 mg) og hydrochlorthiazid (50 mg) fremstilles ved at anven de førstnævnte forbindelse i stedet for N-(l(S)-ethoxycarbonyl- 3-phenylpropyl i det i det foregående beskrevne præparat.

Claims (45)

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af dipeptidderi-5 vater med den almene formel I eller farmaceutisk acceptable salte deraf

0 R1 R3 R1 R2 0 I I I I 6 in R-C-C-NH-CH-C-N-C-C-R I I I I H OH hvori R er hydroxy, lavere alkoxy, aryl-(lavere alkoxy), aryl-(lavere alkylamino) eller hydroxylamino, 15 R* er hydrogen, ligekædet eller forgrenet lavere alkyl, carboxy-(lavere alkyl), (lavere alkylthio)-(lavere alkyl), aryl-(lavere alkyl), indolyl-(lavere alkyl), amino-(lavere alkyl), arylthio-(lavere alkyl), halogenaryl-(la-vere alkyl) eller aryloxy-(lavere alkyl), 3 R er lavere alkyl, hydroxy-(lavere alkyl), phenyl- (lavere alkyl), imidazolyl-(lavere alkyl), amino-(lavere alkyl) eller halogen-(lavere alkyl), 25 4 R er hydrogen eller lavere alkyl, 5 R er lavere alkyl, phenyl-(lavere alkyl), indolyl- (lavere alkyl) eller guanidino-(lavere alkyl), eller wv 5 2 R og R sammen danner en alkylenbro med 2-4 carbonatomer, en alkylenbro med 2-3 carbonatomer og et svovlatom, en alkylenbro med 3-4 carbonatomer og en dobbeltbinding eller en sådan alkylenbro substitueret med hydroxy eller lavere alkoxy, og DK 165455B ί R er hydroxy, lavere alkoxy eller amino, kendetegnet ved, at man 5 a) omsætter en keton med formlen

0 R1 R - C - C = 0 II 10 hvori R1 og R har de ovenfor angivne betydninger, og hvori reaktive grupper i R1 eventuelt er beskyttede, med et dipeptid med formlen:

15 R3 R4 R5 0 I I I 6 H0N -CH-C-N-C-C-R III

2. I

0 H 3 4 5 6 hvori R , R , R og R har de ovenfor angivne betydnin- 3 5 20 ger, og hvori reaktive grupper i R og R eventuelt er beskyttede, i nærværelse af et reduktionsmiddel, efterfulgt om nødvendigt af fjernelse af eventuelle beskyttelsesgrupper, og om ønsket fremstilling af et salt deraf på i og for sig kendt måde og, om ønsket, isolering af den 25 biologisk mere aktive isomere ved kromatografi eller fraktioneret krystallisation, eller b) omsætter en keton med formlen

30. R1 R - C - C = 0 II hvori R og R^ er som defineret i det foregående, idet R 35 dog er forskellig fra hydroxy, og hvori reaktive grupper i R1 eventuelt er beskyttede, med en aminosyre eller be- skyttet aminosyre med formlen: R3 H^NCH - COOH IV 5 3 hvori R er som defineret i det foregående, i nærværelse af et reduktionsmiddel til dannelse af et mellemprodukt med formlen: 10

0 R1 R3

1. I R - C - CH - NHCHC00H V 15 efterfulgt af kobling af mellemproduktet med en aminosyre eller et beskyttet aminosyrederivat med formlen: R4 R5 I I 6 HN - C - C0R° VI

20 I H 1 3 4 5 6 hvori R, R , R , R , R og R er som defineret i det fo-fi regående, idet R er forskellig fra hydroxy, og hvori re-69 aktive grupper i R eventuelt er beskyttede, til opnåelse af en forbindelse med formlen I, hvori R og R® ikke er hydroxy, efterfulgt om nødvendigt af fjernelse af eventuelle beskyttelsesgrupper og om ønsket overføring af R og/eller R6 i hydroxylgrupper ved hydrolyse eller hydro-genering af det tilsvarende forstadium, og om ønsket fremstilling af et salt deraf på i og for sig kendt måde, og om ønsket isolering af den biologisk mere aktive isomere ved kromatografi eller fraktioneret krystallisation, eller 35 DK 165455 B c) omsætter en amin med formlen:

0 R1 ' I R - C - C - NH, VII

5 I 2 H hvori R og R^ er som defineret i det foregående, og hvori Ί reaktive grupper i R kan være beskyttet, med en keton med formlen: R3 0 R4 R5 I 1 I ! 6 0=C-C-N-C- COR VIII

15 H 3 4 5 6 hvori R , R , R og R er som defineret i det foregående, 3 5 og hvori reaktive grupper i R og R eventuelt er beskyt-2q tede, efterfulgt om nødvendigt af fjernelse af eventuelle beskyttelsesgrupper, eller om ønsket udførelse af reaktionen trinvis ved at kondensere forbindelsen VII, hvor R ikke er hydroxy, med en ketonsyre med formlen: 25 r3

25 I

0. C - COOH IX 3 hvori R er som defineret i det foregående, og reaktive 3 grupper i R eventuelt er beskyttede, til opnåelse af: wU O R1 R3 I I RC - C - NHCHCOOH X H 35 1 3 hvori R, R og R er som defineret i det foregående, og kondenserer forbindelsen X med et aminosyrederivat med formlen:

5 R4 R5 I I 6 HN - C - COR° VI H 10 4 5 6 hvori R , R og R er som defineret i det foregående, 6 5 idet R ikke er hydroxy, og hvori reaktive grupper i R eventuelt er beskyttede, efterfulgt om nødvendigt af fjernelse af eventuelle beskyttelsesgrupper, til opnåelse £ af en forbindelse, hvori R og R ikke er hydroxy, og om 15 g ønsket overføring af R og/eller R i hydroxy ved hydrolyse eller hydrogenering af det passende forstadie og yderligere, om ønsket, fremstilling af et salt deraf på konventionel måde og, hvis det er ønsket, isolering af den biologisk mere aktive isomere ved kromatografi eller fraktioneret krystallisation, eller d) omsætter et dipeptid med formlen: R3 R4 R5 0

25. I I I 6 H„N -CH-C-N-C-C-R III

2. I O H hvori R3, R4, R3 og R3 er som defineret i det foregående, 30 o c og hvori reaktive grupper i R og R eventuelt er beskyttede, med en forbindelse med formlen: 35 DK 165455 B R1 X - C - COR XI H 5 hvori R og R^ er som defineret i det foregående, og hvori reaktive grupper i R·*- eventuelt er beskyttede, og hvor X er chlor, brom, iod eller en sulfonyloxygruppe, efterfulgt om nødvendigt af fjernelse af eventuelle beskyttel-sesgrupper, eller om ønsket omsætning af forbindelsen XI, hvori R ikke er OH, med et aminosyrederivat med formlen: R3 H0NCH - COOH IV 15 ^ 3 hvori R er som defineret i det foregående, og reaktive grupper eventuelt er beskyttede, til dannelse af et mellemprodukt med formlen: 20 13 R1 R'* I I RCO - C - NHCH - COOH X H 25 og derpå omsætning af mellemproduktet med et aminosyrederivat med formlen: R4 R5

30 HN - C - COR6 VI H 35 4 5 6 hvori R , R og R er som defineret i det foregående, 6 5 idet R ikke er OH, og hvori reaktive grupper i R eventuelt er beskyttede, efterfulgt om nødvendigt af fjernelse af eventuelle beskyttelsesgrupper, til dannelse af en 5 forbindelse I, og om ønsket fremstilling af et salt deraf på konventionel måde, og om ønsket isolering af den biologisk mere aktive isomere ved kromatografi eller fraktioneret krystallisation, eller 10 e) omsætter et aminosyrederivat med formlen:

0 R1 R - C - C - NH, VII I 2 15 " hvori R og R* er som defineret i det foregående, og hvori reaktive grupper i R1 eventuelt kan være beskyttede, med et α-substitueret acylaminosyrederivat med formlen:

20 R3 0 R4 R5 I * I I 6 X-CH-C-N-C- C0R° XII H 25 3 4 5 6 hvori X, R , R , R og R er som defineret i det foregå- 3 ende, og hvori aktive grupper i R kan være beskyttede, efterfulgt af fjernelse af eventuelle beskyttelsesgrupper, om nødvendigt, til dannelse af det ønskede produkt, eller om nødvendigt omsætning af en aminosyreester VII, hvor R ikke er hydroxyl, med en «-substitueret syre med formlen: R3

35 X - CH-C00H XIII 3 DK 165455 E hvor R kan indeholde hensigtsmæssig beskyttelse for en reaktiv gruppe, til opnåelse af en mellemproduktester med formlen;

5 R1 R1 2 I I RCO - C - NHCH - COOH X H 10 og derpå omsætning af dette mellemprodukt med en aminosyre med formlen; R4 R5 I I 6 HN - C - COR VI

15 I 6 5 hvori R ikke er hydroxyl, og R kan indeholde hensigtsmæssige beskyttelsesgrupper for en reaktiv gruppe, efter-20 fulgt af fjernelse af beskyttelsesgrupperne, om nødvendigt, til opnåelse af en forbindelse med formlen I, og om g ønsket overføring af R og/eller R i hydroxy ved hydrolyse eller hydrogenering af det passende forstadie, og endvidere, om ønsket, fremstilling af et salt deraf på i 25 og for sig kendt måde, og yderligere, om ønsket, isolering af den biologisk mere aktive isomere ved kromatografi eller fraktioneret krystallisation. 35 Fremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af en 2 30 forbindelse med formlen; DK 165455B

0 CH, CH,

1 I 2 I 3 /—I CoHK0-C - CH - NH - CH - C - N *5 i \_ 5. i COOH kendetegnet ved, at omsætter en keton med formlen: 10 ™2C6H5 CH, C2H5OOC-C = o 15 med et dipeptid med formlen CH~ I d /—1

20 H2N - CH - C-\l

0 COOH i nærværelse af et reduktionsmiddel til opnåelse af det 25 ønskede produkt og isolerer den biologisk mere aktive dias tereoi somere ved kromatografi eller fraktioneret krystallisation. 1 35 Fremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af en 30 forbindelse med formlen: DK 165455E o ch2ch2c6h5 (ch2)4 j- HO-C-C - NH - CH - C - N I

5. O ir^COOH kendetegnet ved, at man omsætter en keton ch2ch2c6h5

10 HOOC-OO med et beskyttet dipeptid med formlen 15 (CH0),-NH-t-Boc I 2 4 i—1 H2N - ch - c - Ni COOH 20 hvori t-Βοσ er en t-butyloxycarbonyl gruppe, i nærværelse af et reduktionsmiddel til opnåelse af den beskyttede form for det ønskede produkt, som derpå omsættes med et hensigtsmæssigt surt middel til opnåelse af det ønskede 25 produkt.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af en forbindelse med formlen: 30 35 DK 165455 B fVC6H5 f2

0 CH- (CH-). O

1 I 2 i 2 I /—j C2HgOC - CH - NH - CH - C - N_

5 COOH kendetegnet ved, at man omsætter en keton med formlen: 10 f2'C6H5

0 CH-

1 I 2 C2H50 - c - c - o 15 med et beskyttet dipeptid med formlen: NH - t-Boc on (<rH2>4 _,

20. I H2N - CH - C - N J

0 I COOH hvor t-Boc er en t-butyloxycarbonyl gruppe, i nærværelse af et reduktionsmiddel til opnåelse af den beskyttede form for det ønskede produkt, hvorpå dette omsættes med et hensigtsmæssigt surt reagens til opnåelse af det ønskede produkt. 30

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af en forbindelse med formlen: 35 DK 165455 I f2-®- C1 Γ2 o ch9 (CH9). * I 2 \ i—i HO - C - CH - NH - CH - C - N J

5 COOH kendetegnet ved, at man omsætter en keton med formlen: CHL-r^S- Cl

10 I 2 \=/ 0 ch9

1 I 2 H0-C-C=0 med et beskyttet dipeptid med formlen: 15 NH-t-Boc (?H2>4 I 2 4 i—1 h2n-ch-c-nI on O I

20 COOB hvori t-Boc er en t-butyloxycarbonyl gruppe, i nærværelse af et reduktionsmiddel til opnåelse af den beskyttede form for det ønskede produkt, som dernæst omsættes med et 25 hensigtsmæssigt surt reagens til opnåelse af det ønskede produkt.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der fremstilles 30 N-(1(S)-carboxy-3-phenylpropyl)-L-alanyl-L-prolin 35 DK 165455B N- (1(S)-ethoxycarbonyl-3-phenylpropyl)-L-alanyl-L-prolin eller maleatsaltet deraf N- (1 (S)-ethoxycarbonyl)-4-methylpentyl-L-alanyl-L-prolin 5 N-(1(S)-carboxy-5-aminopentyl)-L-alanyl-L-prolin N-a-(1(S)-carboxy-3-phenylpropyl)-L-lysyl-L-prolin

10 N-a-(1(S)-ethoxycarbonyl-3-phenylpropyl)-L-lysyl-L-prolin N-a-[1(S)-carboxy-3-(3-indolyl)-propyl]-L-lysyl-L-prolin N-a-[1(S)-carboxy-3-(4-chlorphenyl)-propyl]-L-lysyl-L-15 prolin N-a-[1(S)-carboxy-2-phenylthioethyl]-L-lysyl-L-prolin N-a-[1(S)-carboxy-3-(4-chlorphenyl)-propyl]-L-lysyl-L-4a-20 methoxyprolin eller N-a-[1(S)-carboxy-5-aminopentyl]-L-lysyl-L-prolin. 25 30 35