WO2013069634A1 - 発酵法による目的物質の製造法 - Google Patents

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山本　洋子
和輝 山田
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    • C12Y301/01068—Xylono-1,4-lactonase (3.1.1.68)
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    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01082—Xylonate dehydratase (4.2.1.82)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a target substance such as L-amino acid by a fermentation method using a microorganism, and more particularly to a method for producing the target substance by a fermentation method using xylose as a raw material.
  • L-glutamic acid is mainly produced by fermentation using a so-called coryneform bacterium belonging to the genus Brevibacterium, Corynebacterium, and Microbacterium, or L-glutamic acid-producing bacteria or mutants thereof (for example, refer nonpatent literature 1).
  • Examples of methods for producing L-glutamic acid by fermentation using other strains include methods using microorganisms such as Bacillus, Streptomyces, and Penicillium (see, for example, Patent Document 1), Pseudomonas, Arthrobacter, A method using microorganisms such as Serratia and Candida (for example, see Patent Document 2), a method using microorganisms such as Bacillus and Aerobacter aerogenes (currently Enterobacter aerogenes) (for example, see Patent Document 3), A method using a mutant of Escherichia coli (for example, see Patent Document 4) is known.
  • a method for producing L-glutamic acid using a microorganism belonging to the genus Klebsiella, Erwinia, Pantoea, or Enterobacter is also disclosed (see, for example, Patent Documents 5 to 7).
  • Patent Document 8 enhancing the expression of a gene encoding an L-amino acid biosynthetic enzyme
  • Patent Document 10 enhancing the inflow of a carbon source into the L-amino acid biosynthetic system
  • biomass raw materials such as starch and fats are mainly used at present, but in the future, non-edible part raw materials, specifically cellulose / hemicellulose, lignin, etc. Migration is necessary.
  • Non-Patent Documents 11 and 12 It is known that Escherichia coli preferentially assimilate glucose when such a mixed sugar of 5 monosaccharides and 6 monosaccharides is used as a raw material for amino acid fermentation or the like. As a result, two-stage growth (dioxy-) ) Or a phenomenon in which growth is delayed (Non-Patent Documents 2 and 3).
  • Non-Patent Document 6 examples in which the pathway is expressed in Escherichia coli are known.
  • An object of the present invention is to provide a microorganism that can efficiently produce a target substance such as L-glutamic acid in a medium containing xylose, and a method for producing the target substance using the microorganism.
  • the present inventors have aimed at breeding development of amino acid-producing bacteria having the ability to assimilate 5 monosaccharides and 6 monosaccharides, and utilize the pathway from xylose via xylonic acid to 2-ketoglutaric acid, We examined breeding development. As a result, the present inventors have found that a microorganism that has expressed this pathway can efficiently assimilate xylose, and has completed the present invention. That is, the present invention is as follows.
  • a target substance by culturing bacteria having the ability to produce the target substance in a medium containing xylose as a carbon source, producing and accumulating the target substance in the medium, and collecting the target substance from the medium
  • the target substance is 2-ketoglutaric acid or a derivative thereof
  • the bacterium has the ability to produce xylonic acid from xylose and imparts or enhances xylonate dehydratase activity, 2-keto-3-deoxyxylonate dehydratase activity, and 2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase activity A method characterized by that.
  • the bacterium has been introduced in such a way that genes encoding xylonate dehydratase, 2-keto-3-deoxyxylonate dehydratase, and 2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase can be expressed. Said method, characterized in that the enzyme activity is imparted or enhanced.
  • the genes encoding each of xylonate dehydratase, 2-keto-3-deoxyxylonate dehydratase, and 2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase are Caulobacter, Escherichia, Agrobacterium, Hervaspyram, Actino The method as described above, which is derived from a microorganism belonging to the genus Planes, Capriavidas, Pseudomonas, Zoberia, Thermobacillus, Arthrobacter, Azospirillum, Halomonas, Bacillus, or Aspergillus.
  • the bacterium can produce xylonic acid from xylose by any of the following: (A) imparted or enhanced xylose dehydrogenase activity or xylose dehydrogenase and xylonolactonase activity, or (B) It has glucose dehydrogenase activity that can catalyze the reaction of producing xylonic acid from xylose.
  • the glucose dehydrogenase uses pyrroloquinoline quinone as a coenzyme, and the bacterium has the ability to produce pyrroloquinoline quinone, or is cultured in a medium containing pyrroloquinoline quinone, so that glucose dehydrogenase activity is obtained. Said method.
  • the bacterium can produce xylonic acid from xylose by introducing xylose dehydrogenase or a gene encoding each of xylose dehydrogenase and xylonolactonase in an expressible form. (7) The method as described above, wherein the bacterium is further modified so that the activity of 2-ketoglutarate dehydrogenase is reduced. (8) The method as described above, wherein the bacterium is further modified so that the activity of succinate dehydrogenase is reduced. (9) The method as described above, wherein the bacterium is an enteric bacterium or a coryneform bacterium.
  • the 2-ketoglutaric acid derivative is selected from the group consisting of L-glutamic acid, L-glutamine, L-arginine, L-citrulline, L-ornithine, L-proline, putrescine, and ⁇ -aminobutyric acid.
  • the method which is a substance.
  • E1- ⁇ KG, M9- ⁇ KG, M9-Xyl, and E1-Xyl represent M9 minimal medium and E1 synthetic medium each containing 2-ketoglutaric acid or xylose as a single carbon source.
  • Atu, Hse, Amis, and Aor represent Agrobacterium tumefaciens, Herbaspirillum seropedicae, Actinoplanes missouriensis, and Aspergillus oryzae, respectively.
  • Art, Atu, Cne, Zga, Tco, and Selo represent Arthrobacter globiformis, Agrobacterium tumefaciens, Cupriavidus necator, Zobellia galactanivorans, Thermobacillus composti, and Pseudomonas elodea, respectively.
  • Hbo and Abr represent Halomonas boliviensis and Azospirillum brasilense, respectively.
  • a bacterium having the ability to produce a target substance is cultured in a medium containing xylose as a carbon source, the target substance is produced and accumulated in the medium, and the target substance is collected from the medium.
  • a manufacturing method comprising: The target substance is 2-ketoglutaric acid or a derivative thereof, The bacterium has the ability to produce xylonic acid from xylose and has xylonate dehydratase activity, 2-keto-3-deoxyxylonate 2-keto-3-deoxyxylonate dehydratase activity, and 2-ketoglutarate semi A method characterized by imparting or enhancing aldehyde dehydrogenase activity.
  • the target substance is 2-ketoglutaric acid ( ⁇ -ketoglutaric acid, ⁇ KG) or a derivative thereof.
  • derivatives of 2-ketoglutaric acid include L-glutamic acid, L-glutamine, L-arginine, L-citrulline, L-ornithine, L-proline, putrescine, and ⁇ -aminobutyric acid.
  • Target substance-producing ability means that when the bacterium used in the present invention is cultured in a medium, the target substance can be produced to such an extent that it can be recovered from the cells or the medium. Preferably, it has the ability to produce a larger amount of the target substance than a wild strain or an unmodified strain cultured under the same conditions.
  • the bacterium may be capable of producing two or more kinds of target substances.
  • the target substance includes a free form and / or a salt thereof, for example, sulfate, hydrochloride, carbonate, ammonium salt, sodium salt, potassium salt.
  • the bacterium of the present invention has the ability to produce xylonic acid from xylose, and has a xylonate dehydratase activity, a 2-keto-3-deoxyxylonate dehydratase activity, and a 2-ketoglutarate. Bacteria imparted or enhanced semialdehyde dehydrogenase activity.
  • the bacterium of the present invention does not inherently have xylonate dehydratase activity, 2-keto-3-deoxyxylonate dehydratase activity, and 2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase activity, but has been imparted with these enzyme activities. It may be a bacterium and inherently has these enzyme activities, but may be a bacterium that has enhanced these enzyme activities.
  • the ability to produce xylonic acid from xylose is, for example, 1) imparting or enhancing xylose dehydrogenase activity, or 2) having glucose dehydrogenase activity capable of catalyzing a reaction for producing xylonic acid from xylose, Is achieved by either or both.
  • microorganisms corresponding to 1) include Escherichia bacteria and coryneform bacteria
  • examples of microorganisms corresponding to 2) include Pantoea bacteria.
  • 1) in addition to the xylose dehydrogenase activity, xylonolactonase may be further strengthened. The bacteria belonging to each genus will be described later.
  • Xylonic acid produced from xylose is converted to 2-ketoglutarate by xylonate dehydratase, 2-keto-3-deoxyxylonate dehydratase, and 2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase.
  • the pathway to 2-ketoglutarate by xylonate dehydratase, 2-keto-3-deoxyxylonate dehydratase, and 2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase is also called WeimbergWepathway (J. Biol. Chem., 236: 629-636).
  • NXA Novel Xylose Assimilation
  • Whether the bacterium has a Weimberg pathway or whether this pathway has been introduced depends on the xylonate dehydratase, 2-keto-3-deoxyxylonate dehydratase and 2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase of the bacterial extract. This can be determined by measuring enzyme activity or by confirming that xylonic acid accumulated in a strain not retaining Weimberg pathway is assimilated. In addition, in addition to each of the above enzymes, whether or not the bacterium retains the NXA pathway and whether or not the pathway has been introduced is determined by measuring the enzyme activity of xylose dehydrogenase and / or xylonolactonase. be able to. These enzyme activities can also be determined by measuring xylonic acid produced from xylose.
  • xylonate dehydratase is an enzyme that reversibly catalyzes the following reaction (EC 4.2.1.82): D-xylo-aldonate dehydratase, D-xylonate hydrdehydratase, and D-xylonate Also called hydro-lyase.
  • Xylonate dehydratase activity can be determined by, for example, mixing a D-xylonic acid solution and a test sample and reacting them, and then adding a reaction stop solution consisting of a 1% semicarbazide hydrochloride aqueous solution and a 1.5% sodium acetate aqueous solution. Can be measured by stopping the reaction and measuring the absorption at 250 nm of the diluted solution (Dahms, AS, et al., Methods Enzymol. 1982; 90 Pt E: 302-5)
  • 2-keto-3-deoxy-xylonate dehydratase is an enzyme that reversibly catalyzes the following reaction (EC 4.2.1.-).
  • the 2-keto-3-deoxyxylonate dehydratase activity can be measured by, for example, mixing a 2-keto-3-deoxyxylonic acid solution as a substrate with a test sample and then reacting it, and then reacting with 2-keto-3-deoxyxy It can be measured by measuring the decrease in ronic acid.
  • 2-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase is an oxidoreductase that reversibly catalyzes the following reaction (EC 1.2.1.26).
  • the 2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase activity can be measured, for example, by measuring the reduction of NAD (P).
  • the activity of the enzyme can be measured by adding 2-ketoglutaric acid semialdehyde to a mixed solution of pyrophosphate (pH 8.5), NAD (P) and a test sample and measuring absorption at 340 nm. (Adams, E., et al, (1967) J. Biol. Chem. 242, 1802-1814).
  • Xylose dehydrogenase (D-xylose-1-dehydrogenase) is one of the interconverting enzymes of pentose and glucuronic acid, and is an oxidoreductase that reversibly catalyzes the next reaction (EC1. 1.1.175).
  • the D-xylose-1-dehydrogenase activity can be measured, for example, by mixing xylose, a test sample, and NAD (P), reacting them, and measuring the absorption at 340 nm (Stephens, C. et al. al., J. Bacteriol., 2007, 189 (5): 181-2185).
  • Caulobacter crescentus xylose dehydrogenase may catalyze the activity of D-xylose ⁇ xylonic acid.
  • xylonolactonase is an enzyme that reversibly catalyzes the following reaction (EC 3.1.1.68).
  • Xylonolactonase activity can be measured, for example, by mixing and reacting xylonolactone with a test sample and quantifying the remaining xylonolactone by the hydroxamate method (Appl. Microbiol. Biotechnol). , 29: 375-379, 1988; Appl. Microbiol., Biotechnol., 27: 333-336, 1988).
  • the gene encoding each enzyme of xylonate dehydratase, 2-keto-3-deoxyxylonate dehydratase, and 2-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase may be any microorganism that has a Weimberg pathway.
  • genus Caulobacter for example, genus Caulobacter, genus Escherichia, genus Agrobacterium, genus Herbaspirillum, genus Actinoplanes, genus Cupriavidus, genus Pseudomonas, Bacteria belonging to the genus Zobellia, Thermobacillus, Arthrobacter, Azospirillum, Halomonas, Bacillus, etc., or filaments belonging to the genus Aspergillus They include genes derived from microorganisms and the like.
  • Caulobacter crecentus is an example of a Caulobacter bacterium.
  • CB-15 and CB-13 strains are known as Caulobacter crescentus. ATCC 19089 and ATCC33532, respectively, American Type Culture Collection (address PO Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America) Is saved.
  • NA-1000 strain J. Bacteriol., 192: 3678-88 (2010)
  • K31 strain can also be used.
  • the genome sequences of Caulobacter crescentus CB15 strain, NA1000 strain, and K31 strain are registered as GenBank Accession Nos. AE005673, CP001340, and CP000927, respectively.
  • the xylose dehydrogenase gene derived from Caulobacter crescentus and the 2-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase gene may be described as ccrxylB and ccrxylA, respectively.
  • bacteria belonging to the genus Escherichia such as the yjhG gene and yagF gene of Escherichia coli may be used.
  • the yjhG gene of Escherichia coli is shown in SEQ ID NO: 34
  • the yagF gene is shown in SEQ ID NO: 36.
  • xylonate dehydratase xylD gene homologues belonging to the genus Agrobacterium, Hervaspyrimum, Actinoplanes, Aspergillus, for example, Agrobacterium tumefaciens, Herbaspirillum seropedicae, Actinoplanes missouriensis, Aspergillus oryzae may be used.
  • bacteria belonging to the genus Agrobacterium, Pseudomonas, Zoberia, Thermobacillus, Arthrobacter, such as Agrobacterium tumefaciensA, Cupriavidus necator, Pseudomonas elodea, Zobellia XylX gene homologues of galactanivorans, Thermobacillus composti, Arthrobacter globiformis may be used.
  • bacterial genes belonging to the genus Azospirillum, Halomonas, Bacillus such as Azospirillum brasilense, xylA gene homolog of Halomonas boliviensis, or ycbD of Bacillus subtilis may be used.
  • Table 11 shows the nucleotide sequences of the above genes and the amino acid sequences encoded by them.
  • the genes of the five enzymes of the NXA pathway have an operon structure.
  • the base sequence of the operon is registered in GenBank with the accession number of AAK22808_Caulobacter_crescentus.
  • SEQ ID NO: 23 shows the base sequence of this operon.
  • the amino acid sequences of 2-keto-3-deoxyxylonate dehydratase, 2-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase, xylose dehydrogenase, and xylonolactonase encoded by the same operon are shown in SEQ ID NOs: 24-27, respectively.
  • nucleotide sequence of the xylD gene in the operon and the amino acid sequence of xylonate dehydratase encoded thereby are shown in SEQ ID NOs: 28 and 29, respectively.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 28 corresponds to positions 5509 to 7296 of SEQ ID NO: 23.
  • positions 1175 to 1177 are described as start codons.
  • Two initiation codons for xylD have also been proposed, and positions 1 to 3 or 13 to 15 of SEQ ID NO: 28 may be used as initiation codons. If positions 13-15 are the start codon, the amino acid sequence of the xylonate dehydratase of SEQ ID NO: 29 begins at Leu at position 5.
  • Glucose dehydrogenase is originally an enzyme that reversibly catalyzes the following reactions (EC 1.1.1.119). “Glucose dehydrogenase that can catalyze a reaction that produces xylonic acid from xylose” refers to pyrroloquinoline quinone. By using a coenzyme, it means an enzyme that can convert D-xylose into D-xylonolactone.
  • the pyrroloquinoline quinone may be produced according to the ability inherent to the microorganism or may be added to the medium (Appl Environ Microbiol. 2009 May; 75 (9) 2784-2791).
  • ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase activity refers to oxidative decarboxylation of ⁇ -ketoglutarate (2-oxoglutarate) and succinyl-CoA (succinyl- It means the activity of catalyzing the reaction to produce CoA).
  • ⁇ -KGDH is also called oxoglutarate dehydrogenase or 2-oxoglutarate dehydrogenase.
  • sucA and sucB of Pantoea ananatis As a gene encoding ⁇ -KGDH of enterobacteria, the base sequence of sucA and sucB of Pantoea ananatis and the sucC gene existing downstream and the amino acid sequence of each subunit are disclosed in EP2100957A1.
  • the sucA, sucB and sucC genes encoding Escherichia coli ⁇ -KGDH are disclosed in Genbank NP_415254 and NP_415255, respectively.
  • the E1o subunit is encoded by the odhA gene (registered as NCgl1084 of GenBank Accession No. NC_003450, also called the sucA gene), and the E3 subunit is encoded by the lpd gene (GenBank Accession No. Y16642).
  • the E2o subunit is encoded by the odhA gene as a bifunctional protein together with the E1o subunit (see Usuda et al., Microbiology 1996 142, 3347-3354), or GenBank Accession No. It is presumed to be encoded by a gene registered as NCgl2126 of NC_003450. Therefore, in the present invention, the odhA gene is a gene that encodes the E1o subunit, but may also encode E2o.
  • Nucleotide sequence of Brevibacterium lactofermentum odhA gene and amino acid sequence of E1o subunit (WO2006 / 028298), nucleotide sequence of NCgl2126 of GenBank Accession No. NC_003450 and amino acid sequence of E2o subunit encoded by the same sequence
  • the nucleotide sequence of NCgl1084 of GenBank Accession No. NC — 003450 and the sequence of the E1o subunit encoded by the same sequence are disclosed in EP2100957A1.
  • genes encoding each of ⁇ -KGDH subunits and gene clusters containing them may be collectively referred to as “genes encoding ⁇ -KGDH”.
  • Succinate dehydrogenase (hereinafter sometimes referred to as “SDH”) is an enzyme that reversibly catalyzes the following reaction of EC: 1.3.99.1.
  • the SDH activity means an activity that catalyzes this reaction.
  • SDH is composed of three or four subunit structures depending on the microbial species, and the activity can be reduced or eliminated by modifying at least one of these proteins so that they do not function normally. .
  • SDH is composed of the following subunits (the name of the gene that encodes the subunits in parentheses), and depending on the species, membrane anchor protein is encoded by sdhC alone or by sdhC and sdhD. There is.
  • SDHA flavor protein subunit
  • SDHB Fe-S protein subunit
  • SDHC membrane anchor protein
  • sdhC membrane anchor protein
  • SDHD membrane anchor protein
  • the SDH subunit complex may have both SDH and fumarate reductase activities.
  • the SDH subunit complex of coryneform bacteria has both SDH and fumarate reductase activities (WO2005 / 021770).
  • SDH activity can be confirmed by measuring reduction of 2,6-dichloroindophenol (DCIP) as an index.
  • DCIP 2,6-dichloroindophenol
  • genes encoding SDH of coryneform bacteria include the sdh operon of Corynebacterium glutamicum (GenBank accession No.NCgl0359 (sdhC) NCgl0360 (sdhA) NCgl0361 (sdhB)), and the sdh operon of Brevibacterium flavum (Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2005-095169, EP1672077A1, WO2008 / 075483) discloses a sequence.
  • the activity of an enzyme that takes xylose into cells may be enhanced.
  • the enzyme that incorporates xylose into cells include D-xylose permease
  • examples of the gene encoding D-xylose permease include the xylE gene.
  • the nucleotide sequence of the xylE gene derived from Escherichia coli encoding D-xylose permease and the amino acid sequence encoded by the same gene are shown in SEQ ID NOs: 30 and 31, respectively.
  • xylose isomerase xylA
  • xylB xylulose kinase
  • xylonic acid may accumulate in the medium, and it is desirable to further enhance the activity of xylonate dehydratase particularly in Escherichia coli.
  • the activity is preferably enhanced by 10 ⁇ mol / min / mg-protein or more, desirably 15 ⁇ mol / min / mg-protein or more, more desirably 17 ⁇ mol / min / mg-protein or more.
  • the enzyme activity can be imparted by introducing a gene encoding the enzyme into the microorganism. If the microorganism has the activity of the target enzyme, introduce a foreign gene encoding the target enzyme, increase the copy number of the endogenous gene encoding the target enzyme, or The target enzyme activity can be increased by increasing the expression level of the gene by modifying an expression control sequence such as a promoter.
  • “introducing a target enzyme gene” means not only introducing a target enzyme gene into a microorganism that does not originally have a target enzyme activity, but also introducing a foreign gene into a microorganism having the enzyme activity. It also includes introducing an endogenous gene into a microorganism having the target enzyme activity and increasing the expression level of the endogenous target enzyme gene.
  • the gene is cloned on an appropriate vector, and a host microorganism is transformed using the obtained vector.
  • the vector used for transformation include a plasmid capable of autonomous replication with the microorganism used.
  • pUC19, pUC18, pBR322, RSF1010, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, pSTV28, pSTV29, pTWV228, pTWV229 (pHSG, pSTV, and pTWV are Takara).
  • PMW119, pMW118, pMW219, pMW218 (pMW is available from Nippon Gene), and the like.
  • plasmids for coryneform bacteria include pAM330 (JP 58-67699 A), pHM1519 (JP 58-77895 JP), pSFK6 (see JP 2000-262288 A), pVK7 (US) Patent Application Publication No. 2003-0175912), pAJ655, pAJ611, pAJ1844 (JP 58-192900), pCG1 (JP 57-134500), pCG2 (JP 58-35197), Examples thereof include pCG4, pCG11 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-183799), pHK4 (Japanese Patent Laid-Open No. 5-7491).
  • a transformation method for example, a method of increasing the permeability of DNA by treating recipient cells with calcium chloride as reported for Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162), as described for Bacillus subtilis, a method of preparing competent cells from cells at the growth stage and introducing DNA (Duncan, C. H. , Wilson, G. A. and Young, F. E .., 1997. Gene 1: 153-167).
  • DNA-receptive cells such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, can be placed in a protoplast or spheroplast state that easily incorporates recombinant DNA and the recombinant DNA is introduced into the DNA-receptor.
  • DNA-receptive cells such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast
  • transformation of microorganisms can also be performed by an electric pulse method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-207791).
  • introduction of the target enzyme gene can be achieved by introduction onto the chromosome of the host microorganism.
  • a method of random introduction onto a chromosome using a transposon or Mini-Mu JP-A-2-109985, US Pat. No. 5,882,888, EP805867B1
  • chromosomal DNA It is also possible to carry out homologous recombination using the sequence present in multiple copies as a target.
  • a sequence present in multiple copies on chromosomal DNA repetitive DNA and inverted repeats present at the end of a transposable element can be used.
  • the target gene can be introduced onto the chromosome by using the Red driven integration method (WO2005 / 010175).
  • transduction using phages such as P1 phage, and introduction of a target gene onto a chromosome using a conjugation transfer vector are also possible.
  • a target enzyme gene can be introduced by targeting a gene unnecessary for target substance production. In this way, one or more copies of the target enzyme gene can be introduced into the target sequence.
  • the expression of the target enzyme gene can be enhanced by substituting an expression control sequence such as a promoter of the target enzyme gene with an appropriate strength on the chromosomal DNA or plasmid.
  • an expression control sequence such as a promoter of the target enzyme gene with an appropriate strength on the chromosomal DNA or plasmid.
  • thr promoter, lac promoter, trp promoter, trc promoter, pL promoter, tac promoter and the like are known as frequently used promoters.
  • variants of the tac promoter PtacA promoter, PtacB promoter
  • Methods for assessing promoter strength and examples of strong promoters are described in Goldstein and Doi's paper (Goldstein, M. A. and Doi R. H.1995. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105- 128).
  • the promoter for expressing these genes may be any promoter that functions in the microorganism used, and the promoter of the gene itself used. Or may be modified.
  • the expression level of the gene can also be controlled by appropriately selecting a promoter that functions strongly in the microorganism to be used, or by bringing the ⁇ 35 and ⁇ 10 regions of the promoter closer to the consensus sequence.
  • Whether or not the activity of the target enzyme has been enhanced can be confirmed by comparing the activity of the target enzyme between the modified strain and the parent or non-modified strain. If the enzyme activity of the modified strain is higher than that of the parent strain or non-modified strain, the activity of the enzyme is enhanced. When the parent strain does not have the activity of the target enzyme, the activity of the enzyme is enhanced if the activity of the target enzyme can be detected in the modified strain.
  • the target enzyme gene is a PCR method using the above sequence information, or an oligonucleotide prepared based on gene or protein sequence information known in the microorganism as a primer, or an oligonucleotide prepared based on the sequence information. It can be obtained from a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library of a microorganism holding the target enzyme by a hybridization method using a probe.
  • the target enzyme and the gene encoding the same may be homologs or artificially modified substances thereof, or proteins having conservative mutations or those encoding the same, as long as the enzyme activity is retained. .
  • a homolog, an artificially modified substance, a protein having a conservative mutation or a gene encoding them as described above is referred to as a conservative variant.
  • the conservative variant of the target enzyme is, for example, a protein having a sequence including substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acids at one or several positions in the amino acid sequence of each enzyme. May be.
  • “One or several” amino acid residues vary depending on the position of the protein in the three-dimensional structure of the protein and the type of amino acid residue, but specifically, preferably 1-20, more preferably 1-10, Preferably 1 to 5 are meant.
  • a typical conservative mutation is a conservative substitution.
  • Conservative substitution is a polar amino acid between Phe, Trp, and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between Leu, Ile, and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid. In this case, between Gln and Asn, when it is a basic amino acid, between Lys, Arg, and His, when it is an acidic amino acid, between Asp and Glu, when it is an amino acid having a hydroxyl group Is a mutation that substitutes between Ser and Thr.
  • substitutions considered as conservative substitutions include substitution from Ala to Ser or Thr, substitution from Arg to Gln, His or Lys, substitution from Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or Gln, Cys to Ser or Ala, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp Substitution, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution, Ile to Leu, Met, Val or Phe substitution, Leu to Ile, Met, Val or Phe substitution, Substitution from Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, substitution from Met to Ile, Leu, Val or Phe, substitution from Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, Ser to Thr or Ala Substitution, substitution from Trp to Phe or Tyr, substitution
  • amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions as described above include naturally occurring mutations (mutants or variants) such as those based on individual differences or species differences of the microorganism from which the gene is derived. Also included by Such a protein can be modified, for example, by site-directed mutagenesis, so that the amino acid residue at a specific site of the encoded protein contains a substitution, deletion, insertion or addition. Can be obtained by:
  • the protein having the conservative mutation as described above is, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more with respect to the entire amino acid sequence. It may be a protein having a homology of at least%, particularly preferably at least 99%, and having a function equivalent to that of a wild-type protein. In the present specification, “homology” may refer to “identity”.
  • the wild-type target enzyme gene is not limited to genes such as Caulobacter crescentus and haloferax volcanii, as long as it encodes the amino acid sequence as described above, and any codon is replaced with an equivalent codon. It may be.
  • the wild-type gene hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence of each of the enzyme genes described above or a probe that can be prepared from the complementary sequence, and encodes a protein having a function equivalent to that of the wild-type target enzyme.
  • It may be DNA.
  • stringent conditions refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • highly homologous DNAs for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the conditions include washing once, more preferably 2 to 3 times at a salt concentration and temperature corresponding to 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more preferably 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • a part of the complementary sequence of each gene can be used.
  • Such a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared on the basis of a known gene sequence as a primer and a DNA fragment containing these base sequences as a template.
  • hybridization washing conditions include 50 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • Microorganisms used in the present invention may inherently have the target substance-producing ability, or may have been imparted with the target substance-producing ability by breeding utilizing a mutation method or recombinant DNA technology. Good.
  • microorganism used in the present invention examples include bacteria, for example, microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae such as Escherichia, Pantoea, and Enterobacter, and Coryneforms such as Corynebacterium glutamicum and Brevibacterium lactofermentum.
  • bacteria for example, bacteria and Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis.
  • the “coryneform bacterium” has been conventionally classified into the genus Brevibacterium, but includes bacteria that are currently classified into the genus Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 ( 1991)), and Brevibacterium spp. Closely related to Corynebacterium sp. Examples of such coryneform bacteria include the following.
  • strains can be exemplified.
  • Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
  • Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511 Corynebacterium carnae ATCC15991 Corynebacterium glutamicum ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
  • Corynebacterium herculis ATCC13868 Brevibacterium divaricatam ATCC 14020 Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067 Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 (Corynebacterium glutamicum ATCC13869) Brevibacterium rose ATCC 13825 Brevi
  • the microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae belongs to the genus Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erbinia, Salmonella, Morganella, etc., as long as it has the ability to produce the target substance.
  • the parent strain of the genus Escherichia is not particularly limited. Specific examples include those described in the book by Neidhardt et al. (Neidhardt, FC et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington DC, 1029 table 1). Is available. Among them, for example, Escherichia coli is mentioned. Specific examples of Escherichia coli include Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) and Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) derived from the prototype wild type K12 strain.
  • Pantoea bacteria, Erbinia bacteria, Enterobacter bacteria are bacteria classified as ⁇ -proteobacteria, and are taxonomically closely related (J Gen Appl Microbiol 1997 Dec; 43 (6) 355-361, International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997, p1061-1067).
  • some bacteria belonging to the genus Enterobacter have been reclassified as Pantoea agglomerans or Pantoea dispersa by DNA-DNA hybridization experiments or the like.
  • Pantoea ananas bacteria belonging to the genus Ervinia have been reclassified as Pantoea ananas and Pantoea Stuarti (See International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993; 43 (1) .p.162-173). Pantoea Ananas was later reclassified as Pantoea Ananatis.
  • Enterobacter bacteria examples include Enterobacter agglomerans (currently reclassified as Pantoea ananatis, etc.), Enterobacter aerogenes, and the like.
  • Enterobacter agglomerans currently reclassified as Pantoea ananatis, etc.
  • Enterobacter aerogenes examples include Enterobacter aerogenes, and the like.
  • strains exemplified in European Patent Application Publication No. 952221 can be used.
  • a representative strain of the genus Enterobacter is Enterobacter agglomerans ATCC 12287 (currently reclassified as Pantoea Ananatis).
  • Pantoea Ananatis AJ13355 (FERM BP-6614) (European Patent Application Publication No. 0952221)
  • Pantoea Ananatis AJ13356 (FERM BP-6615) (European Patent Application Publication No. 0952221)
  • Pantoea Ananatis AJ13355 strain is a strain isolated from soil in Iwata City, Shizuoka Prefecture as a strain that can grow on a medium containing L-glutamic acid and a carbon source at low pH.
  • a strain selected from the same strain as a low-viscosity substance-producing mutant strain is SC17 strain (US Pat. No. 6,596,517).
  • L-glutamic acid-producing bacteria of Pantoea ananatis include SC17sucA / RSFCPG + pSTVCB strain, AJ13601 strain, NP106 strain, and NA1 strain.
  • the SC17sucA / RSFCPG + pSTVCB strain is derived from the SC17sucA strain (US Pat. No.
  • 6,596,517) which is a sucA gene-deficient strain derived from the SC17 strain, the citrate synthase gene (gltA) derived from Escherichia coli, And a plasmid RSFCPG containing the glutamate dehydrogenase gene (gdhA) and a plasmid pSTVCB containing the citrate synthase gene (gltA) derived from Brevibacterium lactofermentum.
  • the AJ13601 strain was selected from the SC17sucA / RSFCPG + pSTVCB strain as a strain resistant to a high concentration of L-glutamic acid at low pH.
  • the NP106 strain is a strain obtained by removing the plasmid RSFCPG + pSTVCB from the AJ13601 strain (WO2010 / 027045).
  • AJ13601 was established on August 18, 1999 at the Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry, Ministry of International Trade and Industry (present name: National Institute of Technology and Evaluation, Patent Biological Deposit Center Address Postal Code 305-8566 East of Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan 1-chome, 1-address, 1-center, 6), deposited under the deposit number FERM P-17516, transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on July 6, 2000, and given the deposit number FERM BP-7207.
  • the strain was identified as Enterobacter agglomerans when it was isolated and deposited as Enterobacter agglomerans, but has been reclassified as Pantoea ananatis by 16S rRNA sequencing.
  • the NA1 strain is a strain corresponding to the NP106 strain having RSFPPG (WO2008 / 020654) having a structure in which the gltA gene of RSFCPG is replaced with a methyl citrate synthase gene (prpC) (WO2010 / 027045).
  • Examples of the genus Erwinia include Erwinia amylobola and Erwinia carotobola
  • examples of the genus Klebsiella include Klebsiella planticola. Specifically, the following strains are mentioned. Elvinia amylobola ATCC15580 strain Elvinia carotobola ATCC15713 strain Klebsiella planticola AJ13399 strain (FERM BP-6600) (European Patent Application Publication No. 955368) Klebsiella planticola AJ13410 strain (FERM BP-6617) (European Patent Application Publication No. 955368)
  • an auxotrophic mutant an analog-resistant strain of the target substance, or a metabolically controlled mutant, or create a recombinant strain with enhanced expression of the target substance biosynthetic enzyme.
  • methods that have been adopted for breeding amino acid-producing bacteria such as coryneform bacteria or Escherichia bacteria can be applied (Amino Acid Fermentation, Society Publishing Center, Inc., published on May 30, 1986, first edition, 77 to 100).
  • the auxotrophy, analog resistance, metabolic control mutation and other properties imparted may be singly or may be two or more.
  • the target substance biosynthetic enzyme whose expression is enhanced may be used alone or in combination of two or more.
  • imparting properties such as auxotrophy, analog resistance, and metabolic regulation mutation may be combined with enhancement of biosynthetic enzymes.
  • the parent strain or the wild strain is subjected to normal mutation treatment, that is, irradiation with X-rays or ultraviolet rays, or N-methyl- Among the mutant strains obtained by treatment with N'-nitro-N-nitrosoguanidine, etc., and exhibiting auxotrophy, analog resistance, or metabolic control mutations, and having the ability to produce target substances
  • normal mutation treatment that is, irradiation with X-rays or ultraviolet rays, or N-methyl-
  • the mutant strains obtained by treatment with N'-nitro-N-nitrosoguanidine, etc., and exhibiting auxotrophy, analog resistance, or metabolic control mutations, and having the ability to produce target substances Can be obtained by selecting
  • the target substance-producing bacterium can also be obtained by enhancing the enzyme activity of the biosynthetic enzyme of the target substance by genetic recombination.
  • Examples of the method for imparting or enhancing the target substance-producing ability by breeding include a method of modifying so as to enhance the expression of a gene encoding an enzyme involved in target substance biosynthesis.
  • enzymes involved in L-glutamate biosynthesis include, for example, glutamate dehydrogenase (gdhA), glutamine synthetase (glnA), glutamate synthase (gltBD), aconite hydratase (acnA, acnB), citrate synthase (gltA), Phosphoenolpyruvate carboxylase (ppc), pyruvate carboxylase, pyruvate dehydrogenase (aceEF, lpdA), pyruvate kinase (pykA, pykF), phosphoenolpyruvate synthase (ppsA), enolase (eno), phosphoglycerum mutase ( pgmA, pgmI), phosphoglycerate kinase (pgk), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapA), trio
  • microorganisms modified to enhance expression of citrate synthase gene, pyruvate dehydrogenase gene, and / or glutamate dehydrogenase gene include WO00 / 18935 pamphlet, European patent application publication 1010755 specification. And the like.
  • the modification for imparting L-glutamic acid-producing ability may be performed by reducing or eliminating the activity of an enzyme that catalyzes a reaction that branches off from the biosynthetic pathway of L-glutamic acid to produce another compound.
  • the enzyme that catalyzes the reaction branched from the biosynthetic pathway of L-glutamic acid to produce compounds other than L-glutamic acid include 2-oxoketoglutarate dehydrogenase, succinate dehydrogenase, isocitrate lyase, acetohydroxy acid synthase, acetolactate
  • Examples include synthase, formate acetyltransferase, lactate dehydrogenase, glutamate decarboxylase, 1-pyrroline dehydrogenase, and acetyl-CoA-hydrolase (WO2006 / 057450).
  • a mutation that reduces or eliminates the activity of the enzyme in the cell is applied to the gene of the enzyme on the genome by a usual mutation treatment method or gene recombination technique. What is necessary is just to introduce.
  • Such mutations can be introduced by, for example, deleting a gene encoding an enzyme on the genome by genetic recombination or modifying an expression regulatory sequence such as a promoter or Shine-Dalgarno (SD) sequence. Achieved.
  • a modified gene in which a partial sequence of the target gene is modified so that it does not produce a normally functioning enzyme is prepared, and a bacterium belonging to the family Enterobacteriaceae is transformed with the DNA containing the gene.
  • a bacterium belonging to the family Enterobacteriaceae is transformed with the DNA containing the gene.
  • the gene replacement using such homologous recombination is a method called “Red-driven integration” (Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.
  • a method for conferring L-glutamic acid-producing ability in coryneform bacteria a method for amplifying the yggB gene (NCgl 1221; NP_600492. Reports small-conductance ... [gi: 19552490]) and introducing a mutation into the coding region It is also possible to use a method for introducing the mutated yggB gene (WO2006 / 070944).
  • D-xylulose-5-phosphate phosphoketolase D-xylulose-5-phosphate phosphoketolase
  • fructose-6-phosphate phosphoketolase fructose-6- Examples thereof include a method of introducing a gene encoding phosphate (phosphoketolase) (collectively referred to as phosphoketolase).
  • phosphoketolase a gene encoding phosphate
  • the following microorganisms may be mentioned as microorganisms having increased phosphoketolase activity (WO2006 / 016705).
  • Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 ⁇ sucA (pVK9-xfp), Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 ⁇ sucA (pVK9-PS2_xpkA)
  • the ability to produce L-glutamic acid can also be imparted by enhancing the activity of 6-phosphogluconate dehydratase activity, 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase activity, or both of these activities.
  • Examples of microorganisms that have increased 6-phosphogluconate dehydratase activity and 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase activity include the microorganisms disclosed in JP-A-2003-274988.
  • L-glutamic acid-producing ability can also be imparted by amplifying the Lh-glutamic acid excretion gene yhfK, ybjL gene (WO2005 / 085419, WO2008 / 133161).
  • the L-glutamic acid-producing microorganism used in the present invention has an ability to accumulate L-glutamic acid in an amount exceeding the saturation concentration of L-glutamic acid in a liquid medium when cultured under acidic conditions (hereinafter referred to as acidic conditions).
  • Microorganisms having the ability to accumulate L-glutamic acid For example, by obtaining a strain having improved resistance to L-glutamic acid under a low pH environment by the method described in European Patent Publication No. 1078989, the ability to accumulate L-glutamic acid in an amount exceeding the saturation concentration can be imparted. it can.
  • Other methods for imparting or enhancing L-glutamic acid-producing ability include a method for imparting resistance to organic acid analogs and respiratory inhibitors, and a method for imparting sensitivity to cell wall synthesis inhibitors.
  • a method of imparting monofluoroacetic acid resistance Japanese Patent Laid-Open No. 50-113209
  • a method of imparting adenine resistance or thymine resistance Japanese Patent Laid-Open No. 57-065198
  • a method of weakening urease Japanese Patent Laid-Open No. 52-038088
  • a method for imparting resistance to malonic acid Japanese Patent Laid-Open No.
  • Brevibacterium flavum AJ3949 (FERMBP-2632; see JP 50-113209) Corynebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736; see JP 57-065198) Brevibacterium flavum AJ11355 (FERM P-5007; see JP-A-56-1889) Corynebacterium glutamicum AJ11368 (FERM P-5020; see JP 56-1889) Brevibacterium flavum AJ11217 (FERM P-4318; see JP-A-57-2689) Corynebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319; see JP-A-57-2689) Brevibacterium flavum AJ11564 (FERM P-5472; see JP 56-140895 A) Brevibacterium flavum AJ11439 (FERM P-5136; see JP-A-56-35981) Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004; see J
  • microorganism having L-glutamine producing ability include bacteria having enhanced glutamate dehydrogenase activity, bacteria having enhanced glutamine synthetase (glnA) activity, and bacteria having a disrupted glutaminase gene (European Patent Application Publication Nos. 1229121 and 1424398). Issue description). Enhancement of glutamine synthetase activity can also be achieved by destruction of glutamine adenyltransferase (glnE) or PII regulatory protein (glnB).
  • glnE glutamine adenyltransferase
  • glnB PII regulatory protein
  • strains belonging to the genus Escherichia and having a mutant glutamine synthetase in which the tyrosine residue at position 397 of glutamine synthetase is substituted with another amino acid residue can also be exemplified as suitable L-glutamine producing bacteria (US patent application) Publication No. 2003-0148474).
  • Brevibacterium flavum AJ11573 (FERM P-5492; JP 56-161495 A) Brevibacterium flavum AJ11576 (FERM BP-10381; JP 56-161495) Brevibacterium flavum AJ12212 (FERM P-8123; JP 61-202694)
  • bacteria having L-proline-producing ability examples include Escherichia coli NRRL B-12403 and NRRL B-12404 (British Patent 2075056), VKPM B-8012 (U.S. Patent Publication 2002-0058315), Germany, and Germany.
  • Examples include plasmid mutants disclosed in Japanese Patent No. 3127361 and strains carrying plasmid mutants disclosed in Bloom FR et al. (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34).
  • preferable microorganisms having L-proline-producing ability include Escherichia coli 702 strain (VKPMB-8011) and 702 strains which are resistant to 3,4-dehydroxyproline and azatidine-2-carboxylate.
  • 702ilvA strain VKPMB-8012 strain which is an ilvA-deficient strain of Escherichia coli, Escherichia coli having enhanced activity of proteins encoded by b2682, and b2683, b1242, or b3434 genes (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-300874) .
  • a DL-3,4-dehydroproline resistant strain As a L-proline-producing bacterium of coryneform bacteria, a DL-3,4-dehydroproline resistant strain (FERM BP-1219, US Pat. No. 4,224,409) has a citrate synthase activity of 1.4 times or more of its parent strain. Examples include elevated strains (FERM P-5332, FERM P-5333, FERM P-5342, FERMP-5343, Patent No. 1426823) and strains imparted with acetic acid requirement (FERM P-5931).
  • Microorganisms capable of producing L-arginine include ⁇ -methylmethionine, p-fluorophenylalanine, D-arginine, arginine hydroxamic acid, AEC (S- (2-aminoethyl) -cysteine), ⁇ -methylserine, ⁇ -2 -Escherichia coli mutants having resistance to thienylalanine or sulfaguanidine (see JP-A-56-106598) and the like. Also, Escherichia coli 237 strain (Russian Patent Application No.
  • L-arginine biosynthesis enzymes include N-acetylglutamate synthase (argA), N-acetylglutamylphosphate reductase (argC), ornithine acetyltransferase (argJ), N-acetylglutamate kinase (argB), acetyl One or more selected from ornithine transaminase (argD), acetylornithine deacetylase (argE) ornithine carbamoyltransferase (argF), argininosuccinate synthase (argG), argininosuccinate lyase (argH) carbamoyl phosphate synthase (carAB) Is mentioned.
  • argA N-acetylglutamate synthase
  • argC N-acetylglutamylphosphate reductase
  • argJ ornithine acetyltrans
  • the L-arginine-producing bacterium of the coryneform bacterium is not particularly limited as long as it has L-arginine-producing ability, but a coryneform bacterium wild strain; sulfa drug, 2-thiazolealanine or ⁇ -amino- ⁇ -hydroxyvaleric acid Coryneform bacterium having resistance to drugs such as: Coryneform bacterium having L-histidine, L-proline, L-threonine, L-isoleucine, L-methionine or L-tryptophan requirement in addition to 2-thiazolealanine resistance (Japanese Patent Laid-Open No.
  • coryneform bacterium resistant to ketomalonic acid, fluoromalonic acid or monofluoroacetic acid Japanese Patent Laid-Open No. 57-18989
  • coryneform bacterium resistant to argininol Japanese Patent Laid-open No. Sho 62 -24075
  • a coryneform bacterium having resistance to X-guanidine X is a fatty acid or fatty chain derivative
  • Coryneform bacteria having L-arginine-producing ability include mutants resistant to 5-azauracil, 6-azauracil, 2-thiouracil, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-azacytosine, 6-azacytosine and the like; Mutants resistant to hydroxamate, 2-thiouracil, mutants resistant to arginine hydroxamate and 6-azauracil (JP 49-126819); mutants resistant to histidine analogs or tryptophan analogs (JP A Sho) No.
  • Brevibacterium flavum AJ11169 (FERM P-4161) Brevibacterium lactofermentum AJ12092 (FERM P-7273) Brevibacterium flavum AJ11336 (FERM P-4939) Brevibacterium flavum AJ11345 (FERM P-4948) Brevibacterium lactofermentum AJ12430 (FERM BP-2228)
  • ArgR which is an arginine repressor
  • a strain with increased intracellular glutamine synthetase activity can be used.
  • L-citrulline and L-ornithine share the same biosynthetic pathway as L-arginine, and N-acetylglutamate synthase (argA), N-acetylglutamylphosphate reductase (argC), ornithine acetyltransferase (argJ), N- These productivity can be imparted by increasing the enzyme activities of acetylglutamate kinase (argB), acetylornithine transaminase (argD), and acetylornithine deacetylase (argE). (Pamphlet of International Publication 2006-35831)
  • GABA ⁇ -aminobutyric acid
  • putrescine-producing bacteria examples include 4-hydroxybutyrate reductase; succinyl-CoA reductase (aldehyde forming); and 4-hydroxybutyrate dehydrogenase enhanced strain (WO2011047101), gamma-aminobutyraldehyde dehydrogenase enhanced strain (FEBS Lett. 2005 Aug 1 ; 579 (19): 4107-12.) Can be used.
  • a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other organic micronutrients such as amino acids and vitamins as necessary can be used. Either synthetic or natural media can be used.
  • the carbon source as long as it contains xylose, other carbon sources such as glucose, glycerol, fructose, sucrose, maltose, mannose, galactose, arabinose, starch hydrolysate, molasses and other sugars can be used.
  • Organic acids such as acids and alcohols such as ethanol can be used alone or in combination with other carbon sources.
  • the mixing ratio of xylose and other carbon source may be any, but xylose: other carbon source (weight ratio) is preferably 1: 0.1 to 100, more preferably 1: 0.1 to 10, more The ratio is preferably 1: 0.1 to 5, more preferably 1: 1 to 5, and still more preferably 1: 1 to 3.
  • concentration of the carbon source in the medium any concentration may be used as long as it is suitable for producing the target substance.
  • concentration of carbon source in the medium is preferably about 0.1 w / v% to 50 w / v%, more preferably about 0.5 w / v% to 40 w / v%, particularly preferably 1 w / v% to 30 w / v%. Degree.
  • Xylose or a mixture of 6 monosaccharides such as xylose and glucose can be obtained from underutilized sources of biomass. These 5 monosaccharides and 6 monosaccharides can be released from plant biomass by steam and / or concentrated acid hydrolysis, dilute acid hydrolysis, hydrolysis using enzymes such as cellulase, or alkaline treatment.
  • the substrate is a cellulosic material, cellulose can be hydrolyzed into sugars simultaneously or individually and used for production of the target substance.
  • the cellulosic material is pre-hydrolyzed to separate the 5 monosaccharides, followed by hydrolysis with cellulose, steam, acid, alkali, cellulase or combinations thereof. Thus, it is preferable to produce 6 monosaccharides.
  • the xylose contained in the medium in the present invention may be supplied by allowing microorganisms to have a conversion pathway from glucose, galactose, and arabinose and converting each hexose into xylose (D-xylose).
  • ammonia, urea, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate such as ammonium acetate, nitrate, or the like can be used.
  • Organic micronutrients include amino acids, vitamins, fatty acids, nucleic acids, and peptone, casamino acids, yeast extracts, soybean protein breakdown products, etc. containing these, and auxotrophic mutations that require amino acids for growth. When using a strain, it is preferable to supplement the required nutrients.
  • inorganic salts phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts and the like can be used.
  • Cultivation is preferably performed with aeration while controlling the fermentation temperature at 20 to 45 ° C. and the pH at 3 to 9.
  • an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas or the like can be used for pH adjustment.
  • the target substance is accumulated in the culture solution or in the microbial cells.
  • the target substance is L-glutamic acid
  • using a liquid medium adjusted to conditions under which L-glutamic acid is precipitated culture is performed so that L-glutamic acid is generated and accumulated while being precipitated in the medium.
  • conditions under which L-glutamic acid precipitates include pH 5.0 to 4.0, preferably pH 4.5 to 4.0, more preferably pH 4.3 to 4.0, and particularly preferably pH 4.0. Can do.
  • the pH is preferably 5.0 to 4.0, more preferably 4.5 to 4.0. More preferably, it is 4.3 to 4.0.
  • cultivation by the said pH may be the whole period of culture
  • the target substance to be collected may contain microbial cells, medium components, moisture, and microbial metabolic byproducts in addition to the target substance.
  • the purity of the collected target substance is 50% or more, preferably 85% or more, particularly preferably 95% or more (JP1214636B, USP 5,431,933, 4,956,471, 4,777,051, 4946654, 5,840,358, 6,238,714, US2005 / 0025878).
  • the method for collecting the target substance from the culture solution after the completion of the culture may be performed according to a known recovery method. For example, conventionally known ion exchange resin methods (Nagai, H.
  • LBGM9 LB medium supplemented with minimal medium components (glucose 5 g / L, magnesium sulfate 2 mM, monopotassium phosphate 3 g / L, sodium chloride 0.5 g / L, ammonium chloride 1 g / L, disodium phosphate 6 g / L)
  • Zone A Glucose 40 g / L MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.5 g / L Zone B (NH 4 ) 2 SO 4 20 g / L KH 2 PO 4 2 g / L NaCl 0.5 g / L Yeast extract 2 g / L CaCl 2 ⁇ 7H 2 O 0.25 g / L FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 20 mg / L MnSO 4 ⁇ nH 2 O 20 mg / L Trace element * 4 ml / l L-Lys 200 mg / L DL-Met 200 mg / L DAP 200 mg / L Zones A and B are separately autoclaved at 120 ° C.
  • MSII-Xylose medium Glucose (40 g / L) in MSII-Glucose medium replaced with xylose (40 g / L).
  • MSII-GX medium Glucose in MSII-Glucose medium (40 g / L) replaced with a mixture of glucose (20 g / L) and xylose (20 g / L).
  • MSII-SX medium Glucose (40 g / L) in MSII-Glucose medium replaced with a mixture of sucrose (20 g / L) and xylose (20 g / L).
  • [CM-Dex medium] Polypeptone 10 g / L Yeast extract 10 g / L Glucose 5 g / L KH 2 PO 4 1 g / L Urea 3 g / L MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.4 g / L FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.01 g / L MnSO 4 ⁇ 5H 2 O 0.01 g / L Bean filtrate (soybean hydrolyzate) 1.2 g / L (TN) Adjust to pH 7.5 using KOH.
  • C. crescentus The genome of C. crescentus is about 4 Mb, and five genes form an operon structure (Journal of Bacteriology, 189: 2181-2185, 2007). From C. crescentus, genomes were extracted from a publicly available genome strain (CB-15 (ATCC19089), available from ATCC), and cloning of each gene and expression vector construction were attempted. An expression vector was constructed using the Clontech In-Fusion Cloning Kit. The following four DNA fragments were amplified by PCR using chromosomal DNA of C. crescentus CB-15 (ATCC 19089) as a template for i), ii), and iii), and pMW119 as a template for iv). The parentheses indicate the primers used for PCR.
  • tac promoter sequence (hereinafter referred to as “Ptac”) (PtwvPtacf: SEQ ID NO: 1, 0823Ptacr: SEQ ID NO: 2) ii) Fragment containing xylX, ccrxylA, ccrxylB, and xylC (Ptac0823f: SEQ ID NO: 3, 0819r: SEQ ID NO: 4) iii) xylD and about 120 bp downstream (0819f: SEQ ID NO: 5, 219cc0819r: SEQ ID NO: 6) iv) pMW119 / SmaI (219f: SEQ ID NO: 7, 219r: SEQ ID NO: 8)
  • a fragment Ptac_xylXccrAccrBC to which these PCR products were bound was amplified by PCR using the purified PCR products of i) and ii) as templates and PtwvPtacf and 0819r as primers.
  • the obtained Ptac_xylXccrAccrBC and the PCR products of iii) and iv) were subjected to In-Fusion reaction using Clontech In-Fusion Cloning Kit, and E. ⁇ ⁇ coli JM109 strain was transformed with the reaction product.
  • the desired plasmid pMW119Ptac_ccrNXA was obtained from the body.
  • the ccrNXA operon containing Ptac was amplified using pMW119Ptac_ccrNXA as a template and PtwvPtacf and 219CC0819r as primers.
  • the amplified product and pTWV228 digested with SmaI were subjected to In-Fusion reaction, and the E. ⁇ coliEJM109 strain was transformed with the reaction product, and the target plasmid pTWV228Ptac_ccrNXA was obtained from the transformant.
  • pUT-MuKm carrying kanamycin-resistant Mini-Mu on pUT399 pUT399 has an R6K origin of replication, contains the mob region necessary for conjugation transmission, and replicates in strains without the pir gene It is a plasmid that cannot be obtained (available from Biomedal: R. Simon., Et al., BIO / TECHNOLOGY NOVEMBER 1983, 784-791, US Pat. No. 7090998).
  • pCE1134 Japanese Patent Laid-Open No. 2-109985
  • MudII1734 which carries a Km resistance gene and a lacXYZ gene in a Mini-Mu unit.
  • a DNA fragment lacking the lacXYZ region was prepared from the Mini-Mu unit of pCE1134 by the following method and cloned into pUT399.
  • pCE1134 As a template and using primers attL-F (SEQ ID NO: 9) and nptII-R (SEQ ID NO: 10), a fragment containing MuCts, a Km resistance gene, which is a repressor of the MuAB gene encoding the left end and transposase Obtained by PCR. Similarly, a fragment containing right end was obtained using pCE1134 as a template and primers attR-F (SEQ ID NO: 11) and attR-R (SEQ ID NO: 12).
  • RSF_Red_TER (US20090286290A1, WO2008 / 075483), a helper plasmid, was introduced into E. coli JM109 having pTWV228Ptac_ccrNXA, and 50 ml LB (containing 1 mM IPTG, 100 mg / L ampicillin, 25 mg / L chloramphenicol) The culture was continued at 37 ° C. until the OD660 value reached 0.4.
  • the RSF_Red_TER is a helper plasmid for causing ⁇ -dependent integration ( ⁇ Red method), and can induce the expression of gam, bet and exo genes of ⁇ by the lacI gene.
  • the plasmid also contains a levansucrase gene (sacB), which allows the plasmid to be removed from the cells in a medium containing sucrose. It also contains a chloramphenicol resistance gene.
  • the cells cultured as described above were collected, centrifuged twice with 10% glycerol solution, and suspended in 1 mL 10% glycerol solution. Thereafter, the ntpII fragment obtained above was transformed by electroporation, and the transformant was selected on an LB agar medium containing 40 mg / L kanamycin. The obtained transformant was inoculated on LB (containing 1 mM IPTG, 10% sucrose, 40 mg / L kanamycin) agar medium and cultured at 37 ° C overnight to obtain a single clone.
  • the obtained transformant was unable to grow on an LB agar medium containing 100 mg / L ampicillin, and it was confirmed that the ampicillin resistance gene of pTWV228Ptac_ccrNXA was replaced with a kanamycin resistance gene.
  • the obtained plasmid was designated as pTWVPtac_ccrNXA_Km.
  • CC0819-01F_4691-88-7 (SEQ ID NO: 17), CC0819-01R_5659-9-1 (SEQ ID NO: 18), and CC0819-02F_5659-9-2 (SEQ ID NO: 17) using the genomic DNA of C. crescentus CB-15 as a template
  • the fragments of 1130 bp and 653 bp were amplified by PCR using primers No. 19) and CC0819-02R_4691-88-10 (SEQ ID NO: 20), respectively.
  • pSTV28-Ptac-Ttrp was digested with SmaI according to a conventional method.
  • the DNA fragment of the xylD gene and the vector DNA fragment were subjected to In-Fusion reaction, E. coli JM109 strain was transformed with the reaction product, and the target plasmid, pSTVPtac_xylD_Ttrp, was obtained from the transformant.
  • pSTVPtac_xylD_Ttrp was obtained from the transformant.
  • pSTV28-Ptac-Ttrp was constructed as follows.
  • a DNA fragment (PtacTtrp) having the sequence of tac promoter and trp terminator having the sequence of SEQ ID NO: 32 was synthesized and ligated between KpnI-BamHI of the pMW219 vector to obtain pMW219-Ptac-Ttrp. Equal amounts of pSTV28 and pMW219-Ptac-Ttrp, each digested with KpnI and BamHI, were mixed, and after ligation reaction, JM109 was transformed, and a plasmid was extracted from colonies showing Cm resistance.
  • the obtained plasmid was confirmed to have one band at about 400 bp and 3 kb fragment length expected by double digestion with KpnI and BamHI (exactly 389 bp and 2994 bp), and pSTV28-Ptac- Got Ttrp.
  • the glutamic acid yield from xylose via the NXA pathway is about 86%. It can be estimated that there is.
  • Example 2 Introduction of the NXA pathway into Escherichia coli (1) Expression of the NXA pathway in E. coli Using an isocitrate dehydrogenase deficient strain ( ⁇ icd) that is an enzyme in the TCA cycle and produces ⁇ KG from isocitrate.
  • ⁇ icd isocitrate dehydrogenase deficient strain
  • Table 4 shows the results of growth complementation in the plasmid and icd gene-deficient strain constructed.
  • C. crescentus-derived NXA pathway operon xylX, ccrxylA, ccrxylB, xylC, xylD
  • a plasmid pMW119Ptac_ccrNXA produced in Example 1
  • xylose as a single carbon source. It was confirmed to grow in a medium (plate) (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
  • strains were cultured in a flask in an MS medium supplemented with glucose (40 g / L), xylose (40 g / L), or glucose and xylose (20 g / L each) as a carbon source. Culture was performed for 24 hours in a medium containing only glucose as a carbon source, and for 48 hours in another medium. The results are shown in FIG. Reference numerals 325, 425, and 513 attached to the strain names shown in the figure indicate clone numbers.
  • the control strain (MG1655 ⁇ sucA / pMW119) accumulates 15 to 16 g / L of L-glutamic acid
  • L-glutamic acid in the ccrNXA operon expression strain (MG1655 ⁇ sucA / pMW119Ptac_ccrNXA)
  • Accumulation was around 12 g / L, and accumulation and yield of L-glutamic acid tended to decrease.
  • xylose alone as the carbon source By-products were analyzed for organic acids and xylonic acid. As a result, it was found that acetic acid and xylonic acid were mainly accumulated.
  • Xylose taken up into cells can be used for both E. coli-specific xylose utilization system and NXA pathway, but it is the first enzyme of xylose isomerase (XylA) and the first enzyme of NXA pathway Possibility that a certain amount is used in the intrinsic system due to the difference in activity or substrate specificity of xylose dehydrogenase (XDH), and the metabolic flux through the NXA pathway is low.
  • XylA xylose isomerase
  • XDH xylose dehydrogenase
  • MG1655 ⁇ sucA was subjected to E. coli inherent xylose by the ⁇ -Red method.
  • the MG1655 ⁇ sucA ⁇ xylA strain was obtained by deleting the activated gene xylA.
  • PMW119Ptac_ccrNXA was introduced into the same strain to obtain a ccrNXA operon expression strain lacking xylA.
  • FIG. 3 shows the results of L-glutamic acid culture when a ccrNXA operon expression strain deficient in xylA was cultured in the same manner as in (3).
  • ccrNXA indicates pMW119Ptac_ccrNXA, and the subsequent numbers indicate clone numbers.
  • the vector control strain of the ⁇ sucA ⁇ xylA strain cannot assimilate xylose and can form cells and produce L-glutamic acid only from glucose, whereas in the ccrNXA operon expression strain, xylose consumption and L-glutamic acid considered to be derived from xylose Production was seen.
  • the amount of L-glutamic acid accumulation did not reach that of the model strain ( ⁇ sucA strain), and xylonic acid, which is a metabolic intermediate of the NXA pathway, was accumulated. This result suggests that the metabolic flux of the entire NXA pathway may be insufficient.
  • no by-product of ⁇ KG was observed, it was considered that the supply of NADPH necessary for the expression of GDH activity was not a problem at this stage.
  • a ccrNXA operon expression vector was constructed using a medium copy type vector.
  • the ccrNXA operon containing the tac promoter region was amplified using pMW119Ptac_ccrNXA as a template and PtwvPtacf (SEQ ID NO: 1) and 0819r (SEQ ID NO: 4) as primers.
  • pTWV228 was digested with SmaI, In-Fusion reaction was performed with the PCR fragment of the ccrNXA operon containing the tac promoter region, E.
  • coli JM109 strain was transformed with the reaction product, and the desired plasmid pTWVPtac_ccrNXA was obtained from the transformant .
  • This plasmid was introduced into the MG1655 ⁇ sucA strain, and the obtained strain was cultured in the same manner as in (3).
  • the results are shown in FIG.
  • “ ⁇ sucA” represents the MG1655 ⁇ sucA strain
  • “/ pTWV” and “/ v” represent pTWV228, respectively.
  • PTWV110 to pTWV119 indicate the clone numbers of pTWV228Ptac_ccrNXA.
  • the XDH activity increased about 7 times compared to the low copy expression vector-introduced strain. It has not been confirmed how xylose is distributed in the actual cells at the junction of xylose isomerase (XylA) and XDH unique to E. coli, and XDH activity, the first enzyme of the NXA pathway, is still insufficient. It was also possible that However, there is a possibility that any of the NXA pathways or a plurality of enzymes may be rate-limiting due to the fact that even if the XDH activity increases, the effect of improving L-glutamic acid accumulation cannot be found, and xylonic acid accumulation, etc. It was.
  • Plasmids pSTVPtac_xylD_Ttrp, pSTVPtac_xylX_Ttrp, and pSTVPtac_ccrxylA_Ttrp that individually express xylD, xylX, and ccrxylA genes were prepared as follows.
  • pSTV28-Ptac-xylX-Ttrp is a plasmid obtained by cloning xylX excluding the SfiI site into pUC18, pUC18-xylX as a template, xylX-IFS-5742-10-1 (SEQ ID NO: 38), and xylX-IFA-
  • An xylX fragment was prepared by PCR using 5742-10-2 (SEQ ID NO: 39) as a primer and cloned into pSTV28-Ptac-Ttrp digested with SmaI by the in-fusion cloning method.
  • pSTV28-Ptac-ccrxylA-Ttrp is a plasmid obtained by cloning ccrxylA excluding the SfiI site into pUC18, pUC18-ccrxylA as a template, xylA_IFS_5742-10-3 (SEQ ID NO: 40), and xylA_IFA_5742-10-4 (SEQ ID NO: A ccrxylA fragment was prepared by PCR using 41) as a primer and cloned into pSTV28-Ptac-Ttrp digested with SmaI by the in-fusion cloning method.
  • pSTV28-Ptac-xylD-Ttrp is a plasmid obtained by cloning xylD excluding the SfiI site into pUC18, pUC18-xylD as a template, xylD_IFS_5742-10-5 (SEQ ID NO: 42), xylD_IFA_5742-10-6 (SEQ ID NO: 43) ) was prepared by PCR using primers and cloned by in-fusion cloning method into pSTV28-Ptac-Ttrp digested with SmaI.
  • the plasmids pUC18-xylX, pUC18-ccrxylA, and pUC18-xylD were prepared as follows. CC0823-01F_4691-87-1 (SEQ ID NO: 44), CC0823-01R_4691-87-2 (SEQ ID NO: 45), and CC0823-02F_4691-87-3 (SEQ ID NO: 45) using the genomic DNA of C. crescentus CB-15 as a template No. 46) and CC0823-02R_4691-87-4 (SEQ ID NO: 47) were used as primers to amplify 900 bp and 280 bp fragments, respectively.
  • CC0822-01F_4691-87-5 (SEQ ID NO: 48), CC0822-01R_5659-8-7 (SEQ ID NO: 49), CC0822-02F_5659-8-8 (SEQ ID NO: 48) using the genomic DNA of C.
  • these two fragments were ligated by crossover PCR using the two fragments of 11v02 and 12v02 as a template and CC0822-01F_4691-87-5 and CC0822-02R_5659-8-9 as primers.
  • these two fragments were ligated by crossover PCR using two fragments of 13v02 and 14v02 as templates and CC0822-03F_5659-8-12 and CC0822-04R_5659-8-13 as primers.
  • These two fragments and the above-mentioned 15v02 fragment were ligated by the inNvitro assemble method (Nature Methods 6 (5), 343-345, 2009).
  • the ligated fragment was amplified by PCR using CC0822-01F_4691-87-5 and CC0822-05R_4691-87-14 as primers. Subsequently, the SfiI site is removed and the ccrxylA gene is inserted by assembling pUC18 digested with SmaI and the above ligated fragment by the in vitro assemble method (Nature Methods 6 (5), 343-345, 2009). PUC18-ccrxylA was obtained.
  • CC0819-01F_4691-88-7 (SEQ ID NO: 17), CC0819-01R_5659-9-1 (SEQ ID NO: 18), and CC0819-02F_5659-9-2 (sequence) No. 19) and CC0819-02R_4691-88-10 (SEQ ID NO: 20) were used as primers to amplify fragments of 1130 bp and 653 bp, respectively. Subsequently, by assembling pUC18 digested with SmaI and the above two amplified fragments by the in vitro assemble method (Nature Methods 6 (5), 343-345, 2009), the SfiI site was removed and the xylD gene was removed. The inserted pUC18-xylD was obtained.
  • ccrNXA operon expression strain (MG1655 ⁇ sucA / pTWV228Ptac_ccrNXA) and strains carrying plasmids that individually express the xylD, xylX, and ccrxylA genes (MG1655 ⁇ sucA / pSTVPtac_xylD_Ttrp, MG1655 ⁇ sucA / pSTVPtactp
  • the crude enzyme extract derived from the ccrNXA operon expression strain was added with the crude enzyme extract derived from a vector-bearing strain or a single expression strain of each gene of xylD, xylX, and ccrxylA, and the ⁇ KG production activity from xylonic acid was measured. .
  • Table 6 “1110” attached to the strain name indicates the clone number.
  • xylate dehydratase (XylD) encoded by the xylD gene may be the rate-limiting point on the NXA pathway constructed by heterologous expression in E.coli.
  • ccrNXA operon expression strain As it may be possible to improve the metabolic flux of the entire pathway by further enhancing the expression of the xylD gene in the ccrNXA operon expression strain from the measurement of enzyme activity
  • an xylD gene expression-enhanced strain was constructed, and L-glutamic acid production culture evaluation using glucose and xylose as carbon sources was performed.
  • ccrNXA operon expression strains MG1655 ⁇ sucA / pMW119Ptac_ccrNXA and MG1655 ⁇ sucA / pTWV228Ptac_ccrNXA were used. The culture was performed in the same manner as (3).
  • Peftu (Pst) (SEQ ID NO: 58) and Peftu_Rv (SEQ ID NO: 59) to obtain a fragment containing the Peftu sequence.
  • PCR reaction was performed using PrimeSTAR HS polymerase according to the protocol attached to the enzyme.
  • PCR was performed using pTWV228Ptac_ccrNXA as a template and primers Peftu_xylXABCD_fw (SEQ ID NO: 60) and Peftu_xylXABCD_rv (SEQ ID NO: 61) to obtain a fragment containing the XylXABCD sequence of C. crescentus.
  • primers Peftu_xylXABCD_fw (SEQ ID NO: 60) and Peftu_xylXABCD_rv (SEQ ID NO: 61) to obtain a fragment containing the XylXABCD sequence of C. crescentus.
  • PrimeSTAR GXL polymerase was used, and the PCR reaction was performed according to the protocol attached to the enzyme.
  • pVK9 has a blunt-ended AvaII site in pHSG299 (Takara Bio) and inserts a blunt-ended fragment excised from BamHI and KpnI in a coryneform bacterium contained in pHK4 (JP 05-007491).
  • Shuttle vector Japanese Patent Laid-Open No. 2007-97573, US Patent Application Publication No. 20050196846,.
  • coli JM109 was transformed with the in-fusion reaction solution. Transformants were selected on an agar medium in which kanamycin was added to LB medium to a final concentration of 50 mg / L. The objective plasmid pVK9Peftu_ccrNXA was obtained from the obtained transformant.
  • the xylose-utilizing ability and L-glutamic acid-producing ability of the obtained transformant were verified by culturing using a Sakaguchi flask.
  • the CM-Dex agar medium supplemented with kanamycin to a final concentration of 25 mg / L was scraped by 1/6 plate of the transformed cells cultured overnight at 31.5 ° C and overlaid with 20 ml of Glc medium.
  • the cells were cultured with shaking at 31.5 ° C. and 120 ° C. for 24 hours.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of C. glutamicum ATCC13869 strain as a template and primers PmsrA (Pst) (SEQ ID NO: 62) and PmsrAR (SEQ ID NO: 63) to obtain a fragment containing the PmsrA sequence.
  • PCR was performed using pTWV228Ptac_ccrNXA as a template and primers PmsrA_xylD_fw (SEQ ID NO: 64) and Peftu_xylXABCD_rv to obtain a fragment containing the C. crescentus xylD gene sequence.
  • PCR reaction was performed using PrimeSTAR HS polymerase according to the protocol attached to the enzyme.
  • the PmsrA fragment obtained above and the fragment containing the xylD gene were mixed with the shuttle vector pVS7 treated with PstI and BamHI (construction method is shown below), and then in accordance with the protocol of Clontech In-fusion HD Cloning Kit.
  • E. ⁇ ⁇ coli JM109 was transformed with this reaction solution.
  • Transformants were selected on an agar medium in which spectinomycin was added to LB medium to a final concentration of 25 mg / L.
  • the target plasmid pVS7PmsrA_xylD was obtained from the obtained transformant.
  • PVS7 is a plasmid in which the chloramphenicol resistance gene of pVC7 (JP 2000-201692, EP1004671) is replaced with a spectinomycin resistance gene.
  • the spectinomycin resistance gene can be obtained by preparing plasmid pDG1726 from Escherichia coli ECE101E strain commercially available from the Bacillus-Genetic-Stock-Center (BGSC) and removing it from the plasmid as a cassette.
  • the spectinomycin resistance gene was amplified by PCR using pDG1726 as a template and primers SpcR-F (SEQ ID NO: 65) and SpcR-R (SEQ ID NO: 66).
  • the obtained gene fragment was mixed with SmaI-treated pVC7 and subjected to ligation reaction according to the protocol of Ligation Mix ⁇ Mighty Mix> from Takara Bio Inc., and E. coli JM109 was transformed with this reaction solution. Transformants were selected on an agar medium in which spectinomycin was added to LB medium to a final concentration of 25 mg / L. From the obtained transformant, pVC7-spc in which a spectinomycin resistance gene was inserted into pVC7 was obtained.
  • PCR was performed using pVC7-spc as a template and primers spc (GTG start) -F (SEQ ID NO: 67) and spc (stop) -R (SEQ ID NO: 68) to amplify the spectinomycin resistance gene.
  • PCR was performed using pVC7 as a template and primers Spc-pVC7-Cm-F (SEQ ID NO: 69) and Spc-pVC7-Cm-R (SEQ ID NO: 70) to remove the chloramphenicol resistance gene from pVC7
  • This DNA fragment was obtained.
  • This DNA fragment was mixed with the spectinomycin resistance gene DNA fragment prepared from pVC7-spc as described above, and an in-fusion reaction was performed according to the protocol of ClontechCIn-fusion HD Cloning Kit. Was transformed into E. coli JM109. Transformants were selected on an agar medium in which spectinomycin was added to LB medium to a final concentration of 25 mg / L. PVS7 was obtained from the obtained transformant.
  • the resulting DNA fragment was inserted into pVK9Peftu_ccrNXA in vitro according to the protocol of Epicentre's Ez-Tn5 TM Custom Transposome Construction Kit to transform E. coli DH5 ⁇ .
  • Transformants were selected on an LB agar medium supplemented with kanamycin and spectinomycin at final concentrations of 50 mg / L and 25 mg / L, respectively.
  • a plasmid in which the insertion position of the Spc-PmsrA_xylD sequence was not on the Peftu_ccrNXA sequence was identified as pVK9Peftu_ccrNXA + D.
  • Example 4 Substitution of NXA pathway gene
  • glutamic acid is converted from xylose through NXA pathway using genes xylX, ccrxylA, ccrxylB, xylC, and xylD of known bacteria C. crescentus that have reported NXA pathway. It was shown that can be generated.
  • homolog genes of xylD, xylX, and ccrxylA were obtained from species other than C. crescentus, and it was verified whether they could be substituted for C. crescentus genes.
  • the species shown in Table 11 was selected as a gene source.
  • the Gene symbol (GenBank) of each gene is shown.
  • Table 12 shows the base sequence of each gene and the sequence number in the sequence table of the amino acid sequence encoded by them.
  • “original” indicates the base sequence of the natural gene
  • “after optimization” indicates the base sequence in which the codon is optimized in accordance with the codon usage of E. coli.
  • the enzymes encoded by the xylD, xylX, and xylA gene homologues may be referred to as XylD, XylX, and XylA, respectively.
  • a DNA fragment except xylD was amplified by PCR using pTWVPtac_ccrNXA_Km as a template and Ptac_xylXABC_F (SEQ ID NO: 111) and Ptac_xylXABC_R (SEQ ID NO: 112) as primers.
  • the PCR product was subjected to In-Fusion reaction according to the protocol of Clontech In-fusion HD Cloning Kit, E. coli JM109 strain was transformed with the reaction product, and the target plasmid pTWVPtac_ccrNXA_ ⁇ xylD_Km was obtained from the transformant.
  • PTWVPtac_ccrNXA_ ⁇ xylX_Km is Ptac_xylABCD_F (SEQ ID NO: 113) and Ptac_xylABCD_R (SEQ ID NO: 114), pTWVPtac_ccrNXA_ ⁇ ccrxylA_Km is Ptac_xylXBCD_F (SEQ ID NO: 115) and Ptac_yl is the same as Ptac_yl
  • ananatis NA1 strain was transformed with pTWVPtac_ccrNXA_ ⁇ xylX_Km or pTWVPtac_ccrNXA_ ⁇ ccrxylA_Km to construct P. ananatis NA2 ⁇ xylX strain and P. ananatis NA2 ⁇ ccrxylA strain.
  • coli MG1655 amplifies the yjhG fragment by PCR using yjhG_F (SEQ ID NO: 117) and yjhG_R (SEQ ID NO: 118) as primers, and digests with SmaI
  • yjhG_F SEQ ID NO: 117
  • yjhG_R SEQ ID NO: 118
  • PSTV28-Ptac-yagF-Ttrp was prepared in the same manner as described above using yagF_F (SEQ ID NO: 119) and yagF_R (SEQ ID NO: 120) as primers.
  • the plasmid pSTV28-Ptac-xylD (Hse) -Ttrp for xylD (Hse) expression was prepared as follows. A DNA fragment (Ptac-xylD (Hse) -Ttrp) having sequences of tac promoter, xylD (Hse) and trp terminator is synthesized and ligated to pUC57 vector (purchased from Thermo Fisher Scientific) digested with EcoRV. As a result, pUC57-Ptac-xylD (Hse) -Ttrp was obtained. When synthesizing the DNA fragment, codon optimization was performed so that it was suitable for expression in E. coli.
  • the xylD (Atu) expression plasmid pSTV28-Ptac-xylD (Atu) -Ttrp was prepared as follows. A DNA fragment (Ptac-xylD (Atu) -Ttrp) containing tac promoter, xylD (Atu) and trp terminator sequences was synthesized and ligated to pJET1.2 vector (purchased from Thermo Fisher Scientific) digested with EcoRV As a result, pJET1.2-Ptac-xylD (Atu) -Ttrp was obtained. When synthesizing the DNA fragment, codon optimization was performed so that it was suitable for expression in E. coli.
  • Plasmids pSTV28-Ptac-xylX (Atu) -Ttrp and pSTV28-Ptac-xylA (Hbo) -Ttrp expressing each of xylX (Atu) and xylA (Hbo) were also prepared in the same manner.
  • xylX (Art) expression plasmid pSTV28-Ptac-xylX (Art) -Ttrp was prepared as follows.
  • a DNA fragment (Ptac-xylX (Art) -Ttrp) having sequences of tac promoter, xylX (Art) and trp terminator was synthesized and ligated to pCC1 vector (purchased from Epicentre) digested with EcoRV. Ptac-xylX (Art) -Ttrp was obtained. When synthesizing the DNA fragment, codon optimization was performed so that it was suitable for expression in E. coli.
  • L-glutamic acid accumulation was 6.9 g / L in the P. ananatis NA2 xylD-introduced strain with pSTV28-Ptac-Ttrp, whereas other transformed strains had L from 11.1 g / L to 23.1 g / L. -Glutamic acid accumulated. It was considered that L-glutamic acid was hardly produced from xylose in the strain into which pSTV28-Ptac-Ttrp was introduced, and L-glutamic acid was produced from xylose through the NXA pathway in other transformed strains. In other words, it was shown that xylD can be replaced by any xylD homolog derived from any species other than C. crescentus.
  • ananatis NA2 ⁇ xylX strain by electroporation was transformed.
  • For the culture of each transformant use a plate medium supplemented with LBGM9 to a final concentration of 40 mg / L, tetracycline to a final concentration of 12.5 mg / L, and chloramphenicol to a final concentration of 25 mg / L. did.
  • the cells of each transformed strain cultured overnight at 34 ° C were scraped into 1/6 plate and inoculated into a thick test tube with 5 ml of MSII-SX medium. After culturing at 120 ° C. for 48 hours, the amount of L-glutamic acid (Glu) accumulated was measured. The results are shown in FIG.
  • L-glutamic acid accumulation was 8.7 g / L in p.Vananatis NA2 ⁇ xylX with pSTV28-Ptac-Ttrp introduced, whereas other transformed strains had L from 20.5 g / L to 27.8 g / L. -Glutamic acid accumulated. It was considered that L-glutamic acid was hardly produced from xylose in the strain into which pSTV28-Ptac-Ttrp was introduced, and L-glutamic acid was produced from xylose through the NXA pathway in other transformed strains. In other words, it was shown that xylX can be replaced by any xylX homolog derived from any species other than C. crescentus.
  • L-glutamic acid accumulation was 1.0 g / L in the P. ananatis ⁇ ccrxylA introduced with pSTV28-Ptac-Ttrp, whereas other transformed strains had L- between 18.1 g / L and 30.7 g / L. Glutamic acid accumulated. It was considered that L-glutamic acid was hardly produced from xylose in the strain into which pSTV28-Ptac-Ttrp was introduced, and L-glutamic acid was produced from xylose through the NXA pathway in other transformed strains. That is, it was shown that xylA can be replaced by a ccrxylA homolog derived from any species other than C. crescentus.
  • a target substance can be efficiently produced by a fermentation method using a xylose raw material.

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Abstract

　目的物質である２－ケトグルタル酸又はその誘導体を生産する能力を有し、キシロースからキシロン酸を生成する能力を有し、かつ、キシロネートデヒドラターゼ活性、２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドラターゼ活性、及び、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を付与又は増強された細菌を、炭素源としてキシロースを含む培地で培養して、目的物質を該培地中に生成蓄積させ、該培地より目的物質を採取することにより、目的物質を製造する。

Description

発酵法による目的物質の製造法
　本発明は、微生物を用いた発酵法によるＬ－アミノ酸等の目的物質の製造法に関し、詳しくは、キシロースを原料として発酵法により目的物質を製造する方法に関する。
　細菌を用いた発酵法によってＬ－アミノ酸等の目的物質を製造するには、野生型細菌（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節
変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。
　例えば、Ｌ－グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌のＬ－グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（例えば、非特許文献１参照）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ－グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献１参照）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献２参照）、バチルス属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物を用いる方法（例えば、特許文献３参照）、エシェリヒア・コリの変異株を用いる方法（例えば、特許文献４参照）等が知られている。また、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントエア属、エンテロバクター属に属する微生物を用いたＬ－グルタミン酸の製造法も開示されている（例えば、特許文献５～７参照）。
　近年は、目的物質の発酵生産に組換えＤＮＡ技術を用いることが行われている。例えば、Ｌ－アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増強すること（特許文献８、特許文献９）、又はＬ－アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強すること（特許文献１０）によって、細菌のＬ－アミノ酸生産性を向上させることが行われている。
　従来、発酵法による物質の工業生産においては、炭素源として糖類、すなわち、グルコース、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物等が使用されてきたが、多少高価であり、近年では、植物由来のバイオマス原料等の使用も進められている。
　このようなバイオマス原料として、現在はスターチ、油脂等の可食部原料の使用が主であるが、将来的には、非可食部原料、具体的には、セルロース・ヘミセルロース、リグニンなどへの移行が必要である。非可食部バイオマスのセルロース・ヘミセルロースは、熱や酸などを用いる前処理行程、セルラーゼ酵素による糖化処理行程等を経て、５単糖、６単糖の糖へと変換され、発酵の原料として用いることができる（特許文献１１、１２）。このような５単糖、６単糖の混合糖をアミノ酸発酵等の原料とした場合、エシェリヒア・コリは、グルコースを優先的に資化することが知られており、結果、二段階増殖（ジオキシー）を示したり、生育が遅延する現象が確認されている（非特許文献２、３）。
　エシェリヒア・コリにおいては、xylA遺伝子がコードするキシロースイソメラーゼ、xylB遺伝子がコードするキシルロキナーゼによるキシロース資化経路が知られており、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカムに導入し、キシロースからＬ－アミノ酸を生産できることが知られている（非特許文献５、特許文献１３、非特許文献７）。
　一方、このような従来知られていた経路を経由せず、キシロースからキシロン酸を経由し、２－ケトグルタル酸へ５段階で至る経路がカウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）やハロフェラックス・ボルカニイ（Haloferax volcanii）に存在することが報告されている（非特許文献６）。また、該経路をエシェリヒア・コリで発現させた例が知られている（非特許文献８、特許文献１４）。
米国特許第３，２２０，９２９号明細書 米国特許第３，５６３，８５７号明細書 特公昭３２－９３９３号公報 特開平５－２４４９７０号公報 特開２０００－１０６８６９号公報 特開２０００－１８９１６９号公報 特開２０００－１８９１７５号公報 米国特許第５，１６８，０５６号明細書 米国特許第５，７７６，７３６号明細書 米国特許第５，９０６，９２５号明細書 特表平９－５０７３８６号公報 特表平１１－５０６９３４号公報 欧州特許第１５７７３９６号明細書 米国特許第７,９２３,２２６号明細書
明石邦彦ら著　アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５～２１５頁、１９８６年 Nichols N.N. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001 Jul;56(1-2):120-125 Gonzalez, R., Biotechnol. Prog. 2002 Jan-Feb;18(1):6-20 Song S. et al., J. Bacteriol. 1997 Nov;179(22):7025-7032 Tao H., et al., J. Bacteriol. 2001 May;183(10):2979-2988 Stephens, C. et al., J. Bacteriol. 2007 Mar;189(5): 2181-2185 Gopinath, V. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011 Jul 28 Huaiwei,L et al.,Bioresour Technol. 2011 Aug 22
　本発明は、キシロースを含む培地において、効率よくＬ－グルタミン酸等の目的物質を生産できる微生物、及びそれを用いた目的物質の製造法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、５単糖、６単糖資化能を持つアミノ酸生産菌の育種開発を目的とし、キシロースからキシロン酸を経由し、２－ケトグルタル酸へ至る経路を利用して、微生物の育種開発について検討を行った。その結果、本経路を発現させた微生物が、効率よくキシロースを資化し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）目的物質を生産する能力を有する細菌を、炭素源としてキシロースを含む培地で培養して、目的物質を該培地中に生成蓄積させ、該培地より目的物質を採取する、目的物質の製造方法であって、
　前記目的物質は２－ケトグルタル酸又はその誘導体であり、
　前記細菌はキシロースからキシロン酸を生成する能力を有し、かつ、キシロネートデヒドラターゼ活性、２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドラターゼ活性、及び、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を付与又は増強されたことを特徴とする方法。
（２）前記細菌は、キシロネートデヒドラターゼ、２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドラターゼ、及び、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを各々コードする遺伝子が発現可能な形態で導入されたことにより、これらの酵素活性が付与又は増強されたことを特徴とする、前記方法。
（３）キシロネートデヒドラターゼ、２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドラターゼ、及び、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの各々をコードする遺伝子が、カウロバクター属、エシェリヒア属、アグロバクテリウム属、ヘルバスピリラム属、アクチノプラネス属、カプリアビダス属、シュードモナス属、ゾベリア、サーモバチルス属、アースロバクター属、アゾスピリラム属、ハロモナス属、バチルス属、又はアスペルギルス属に属する微生物由来である、前記方法。
（４）前記細菌は、下記のいずれかによりキシロースからキシロン酸を生成することができることを特徴とする、前記方法：
　（Ａ）キシロースデヒドロゲナーゼ活性または、キシロースデヒドロゲナーゼ及びキシロノラクトナーゼ活性を付与又は増強されている、又は、
　（Ｂ）キシロースからキシロン酸を生成する反応を触媒し得るグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する。
（５）前記グルコースデヒドロゲナーゼはピロロキノリンキノンを補酵素とし、かつ、前記細菌は、ピロロキノリンキノン生産能を有するか、又は、ピロロキノリンキノンを含有する培地で培養されることにより、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、前記方法。
（６）前記細菌は、キシロースデヒドロゲナーゼ、または、キシロースデヒドロゲナーゼ及びキシロノラクトナーゼを各々コードする遺伝子が発現可能な形態で導入されたことにより、キシロースからキシロン酸を生成することができる、前記方法。
（７）前記細菌は、さらに２－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が低下するように改変されたことを特徴とする、前記方法。
（８）前記細菌は、さらにコハク酸デヒドロゲナーゼの活性が低下するように改変されたことを特徴とする、前記方法。
（９）前記細菌が腸内細菌又はコリネ型細菌であることを特徴とする、前記方法。
（１０）前記細菌がパントエア属細菌であることを特徴とする、前記方法。
（１１）前記細菌がパントエア・アナナティスであることを特徴とする、前記方法。
（１２）前記細菌がエシェリヒア属細菌であることを特徴とする、前記方法。
（１３）前記細菌がエシェリヒア・コリであることを特徴とする、前記方法。
（１４）前記細菌がコリネバクテリウム属細菌であることを特徴とする、前記方法。
（１５）前記細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムであることを特徴とする、前記方法。
（１６）前記２－ケトグルタル酸誘導体が、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－オルニチン、Ｌ－プロリン、プトレッシン、及び、γ－アミノ酪酸からなる群より選択される物質であるである、前記方法。
icd遺伝子欠損株を利用したC. crescentus由来NXAオペロン発現株生育相補試験の結果を示す図。E1-αKG、M9-αKG、M9-Xyl、E1-Xylは、各々２－ケトグルタル酸又はキシロースを単一炭素源として含むM9最小培地及びE1合成培地を示す。 E.coli ccrNXAオペロンを発現するE. coli Ｌ－グルタミン酸生産菌のＬ－グルタミン酸生産培養の結果を示す図。 E. coli固有のキシロース資化経路欠損株を宿主としたccrNXAオペロン発現株によるＬ－グルタミン酸生産培養の結果を示す図。 中コピー型ベクターを用いたccrNXAオペロン発現株によるＬ－グルタミン酸生産培養の結果を示す図。 各種微生物由来のxylDホモログ遺伝子発現株によるＬ－グルタミン酸生産培養の結果を示す図。Atu、Hse、Amis、Aorは、各々Agrobacterium tumefaciens、Herbaspirillum seropedicae、Actinoplanes missouriensis、Aspergillus oryzaeを表す。 各種微生物由来のxylXホモログ発現株によるＬ－グルタミン酸生産培養の結果を示す図。Art、Atu、Cne、Zga、Tco、Seloは、各々Arthrobacter globiformis、Agrobacterium tumefaciens、Cupriavidus necator、Zobellia galactanivorans、Thermobacillus composti、Pseudomonas elodeaを表す。 各種微生物由来のxylAホモログ発現株によるＬ－グルタミン酸生産培養の結果を示す図。Hbo、Abrは、各々Halomonas boliviensis、Azospirillum brasilenseを表す。
　本発明は、目的物質を生産する能力を有する細菌を、炭素源としてキシロースを含む培地で培養して、目的物質を該培地中に生成蓄積させ、該培地より目的物質を採取する、目的物質の製造方法であって、
　前記目的物質は２－ケトグルタル酸又はその誘導体であり、
　前記細菌はキシロースからキシロン酸を生成する能力を有し、かつ、キシロネートデヒドラターゼ活性、２－ケト－３－デオキシキシロネート２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドラターゼ活性、及び、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を付与又は増強されたことを特徴とする方法である。
　目的物質は、２－ケトグルタル酸（α－ケトグルタル酸、αKG）又はその誘導体である。２－ケトグルタル酸の誘導体としては、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－オルニチン、Ｌ－プロリン、プトレッシン、及びγ－アミノ酪酸が挙げられる。
　「目的物質生産能」とは、本発明に用いる細菌を培地に培養したときに、前記目的物質を細胞又は培地から回収できる程度に生産する能力を有することをいう。好ましくは、同条件で培養された野生株又は非改変株よりも、多量の目的物質を生産する能力を有することをいう。細菌は、２種類以上の目的物質の生産能を有するものであってもよい。
　また、前記目的物質は、フリー体及び/またはその塩、たとえば硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩を含む。
＜１＞本発明の細菌
　本発明の細菌は、キシロースからキシロン酸を生成する能力を有し、かつ、キシロネートデヒドラターゼ活性、２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドラターゼ活性、及び、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を付与又は増強された細菌である。
　本発明の細菌は、キシロネートデヒドラターゼ活性、２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドラターゼ活性、及び、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を本来的に有さないが、これらの酵素活性を付与された細菌であってもよく、これらの酵素活性を本来的に有しているが、これらの酵素活性を増強された細菌であってもよい。
　キシロースからキシロン酸を生成する能力は、例えば、
１）キシロースデヒドロゲナーゼ活性を付与あるいは増強すること、又は
２）キシロースからキシロン酸を生成する反応を触媒し得るグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有すること、
のいずれか又は両方によって達成される。
　１）に該当する微生物としては、エシェリヒア属細菌、コリネ型細菌が、２）に該当する微生物としては、パントエア属細菌等が挙げられる。
　１）に関してはキシロースデヒドロゲナーゼ活性に加えてさらにキシロノラクトナーゼを強化してもよい。
　各属に属する細菌については、後述する。
　キシロースから生成されるキシロン酸は、キシロネートデヒドラターゼ、２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドラターゼ、及び、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼにより、２－ケトグルタル酸に変換される。キシロネートデヒドラターゼ、２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドラターゼ、及び、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼにより、２－ケトグルタル酸に至る経路は、Weimberg pathwayとも呼ばれている（J. Biol. Chem., 236: 629-636）。本明細書では、Weimberg pathway、及び、Weimberg pathwayに加えて、キシロースデヒドロゲナーゼ及び/またはキシロノラクトナーゼによりキシロースからキシロン酸に至る経路を含めて、NXA（Novel Xylose Assimilation）経路と記載することがある。
　細菌がWeimberg pathwayを有しているか、又は同経路が導入されたか否かは、細菌抽出物のキシロネートデヒドラターゼ、２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドラターゼ、及び、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性を測定するか、あるいは、Weimberg pathwayを保持していない株では蓄積されるキシロン酸を資化していることを確認することによって、決定できる。また、細菌がNXA経路を保持しているか、又同経路が導入されたか否かは、前記各酵素に加えて、キシロースデヒドロゲナーゼ、及び/またはキシロノラクトナーゼの酵素活性を測定することによって決定することができる。また、これらの酵素活性は、キシロースから生成するキシロン酸を測定することによっても決定できる。
　本発明において、キシロネートデヒドラターゼ（xylonate dehydratase）とは、次の反応を可逆的に触媒する酵素であり（EC4.2.1.82）、D-xylo-aldonate dehydratase、D-xylonate dehydratase、and D-xylonate hydro-lyaseとも呼ばれる。
　D-キシロン酸 → ２－デヒドロ－３－デオキシ-D-キシロネート ＋ H２O
　キシロネートデヒドラターゼ活性は、例えば、D-キシロン酸溶液と被検試料を混合して反応させた後、1% セミカルバジド塩酸塩（semicarbazide hydrochloride）水溶液と1.5%酢酸ナトリウム水溶液からなる反応停止液を加えて反応を停止させ、希釈液の250nmにおける吸収を測定することにより、測定することができる（Dahms, A.S., et al., Methods Enzymol. 1982;90 Pt E:302-5）
 本発明において、２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドラターゼ（2-keto-3-deoxy-xylonate dehydratase）とは、以下の反応を可逆的に触媒する酵素である（EC4.2.1.-）。
　２－デヒドロ３－デオキシ-D-キシロネート → 
　　　 ２－オキソグルタル酸セミアルデヒド ＋H２O
　２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドラターゼ活性は、例えば、基質である２－ケト－３－デオキシキシロン酸溶液と被検試料を混合して反応させた後、２－ケト－３－デオキシキシロン酸の減少を測ることにより、測定することができる。
　本発明において、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（2-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenase）とは、以下の反応を可逆的に触媒する酸化還元酵素である（EC1.2.1.26）
　2-オキソグルタル酸セミアルデヒド ＋ NAD(P) → 2-オキソグルタル酸 ＋ NAD(P)H
　２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、例えばNAD(P)の還元を測定することにより活性測定が可能である。例えば、ピロリン酸(pH8.5)、NAD(P)と被検試料の混合液に、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドを加え、340nmにおける吸収を測定することにより、同酵素の活性を測定することができる（Adams, E., et al, (1967) J. Biol. Chem. 242, 1802-1814）。
　キシロースデヒドロゲナーゼ（D-キシロース-1-デヒドロゲナーゼ、D-xylose 1-dehydrogenase）は、ペントースとグルクロン酸の相互変換酵素の一つで、次の反応を可逆的に触媒する酸化還元酵素である（EC1.1.1.175）。
　D-キシロース + NAD(P)＋ → D-キシロノラクトン ＋ NAD(P)H ＋ H＋ 
　D-キシロース-1-デヒドロゲナーゼ活性は、例えば、キシロース、被検試料、及びNAD(P)を混合して反応させ、340nmにおける吸収を測定することにより、測定することができる（Stephens, C. et al., J. Bacteriol., 2007, 189(5):181-2185）。
なお、カウロバクター・クレセンタスのキシロースデヒドロゲナーゼは、D-キシロース→キシロン酸の活性を触媒することがある。
　本発明において、キシロノラクトナーゼ（xylonolactonase）とは、以下の反応を可逆的に触媒する酵素である（EC3.1.1.68）。
　D-キシロノラクトン → D-キシロン酸
　キシロノラクトナーゼ活性は、例えば、キシロノラクトンと被検試料を混合して反応させ、残存するキシロノラクトンをヒドロキサメイト法により定量することにより、測定することができる（Appl. Microbiol. Biotechnol., 29:375-379, 1988; Appl. Microbiol., Biotechnol., 27:333-336, 1988）。
　キシロネートデヒドラターゼ、２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドラターゼ、及び、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの各酵素をコードする遺伝子は、Weimberg pathwayを有している微生物のものであればいずれもよいが、例えば、カウロバクター（Caulobacter）属、エシェリヒア（Escherichia）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、ヘルバスピリラム（Herbaspirillum）属、アクチノプラネス（Actinoplanes）属、カプリアビダス（Cupriavidus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ゾベリア（Zobellia）属、サーモバチルス（Thermobacillus）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、アゾスピリラム（Azospirillum）属、ハロモナス（Halomonas）属、バチルス（Bacillus）属などに属する細菌、又はアスペルギルス（Aspergillus）属に属する糸状菌等の微生物由来の遺伝子が挙げられる。
　カウロバクター属細菌としては、カウロバクター・クレセンタスが挙げられる。
　カウロバクター・クレセンタスとしては、CB-15株、CB-13株が知られており、それぞれATCC 19089、ATCC33532として、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America）に保存されている。また、NA-1000株（J. Bacteriol., 192:3678-88 (2010)）、K31株も使用することが可能である。
　カウロバクター・クレセンタスCB15株、NA1000株、K31株のゲノム配列は、それぞれ、GenBank Accession Nos. AE005673、CP001340、CP000927として登録されている。
　カウロバクター・クレセンタスCB15株、NA1000株、及びK31株由来の各酵素の遺伝子は、GenBankに下記のGene symbolで登録されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　尚、カウロバクター・クレセンタス由来のキシロースデヒドロゲナーゼ遺伝子、及び２－ケトグルタリックセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、各々ccrxylB、ccrxylAと記載することがある。
　さらに、NXA経路（Novel Xylose Assimilation）の酵素としては、カウロバクター属以外に、例えば、Hypocrea jecorina (Trichoderma ressei)のxylose dehydrogenase（FEMS Microbiol Lett. 277, 249-254 (2007)；Bacillus subtilis のycbD (2-ketoglutaric Semialdehyde Dehydrogenase, typeIII)；Pseudomonas putidaの2-ketoglutaric Semialdehyde Dehydrogenase, typeII）、Azospirillum brasilenseの2-ketoglutaric Semialdehyde Dehydrogenase, typeI、typeII, typeIII（以上、J. Bac. Chem., 282, 6685-6695, 2007）、及びこれらのホモログが挙げられる。
　特に、キシロネートデヒドラターゼに関しては、エシェリヒア属細菌、例えばエシェリヒア・コリのyjhG遺伝子、yagF遺伝子を用いてもよい。エシェリヒア・コリのyjhG遺伝子は配列番号３４に、yagF遺伝子は配列番号３６に示す。また、キシロネートデヒドラターゼに関しては、アグロバクテリウム属、ヘルバスピリラム属、アクチノプラネス属、アスペルギルス属に属する微生物、例えばAgrobacterium tumefaciens、Herbaspirillum seropedicae、Actinoplanes missouriensis、Aspergillus oryzaeのxylD遺伝子ホモログを用いてもよい。
　また、２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドロターゼに関しては、アグロバクテリウム属、シュードモナス属、ゾベリア属、サーモバチルス属、アースロバクター属に属する細菌、例えばAgrobacterium tumefaciensA、Cupriavidus necator、Pseudomonas elodea、Zobellia galactanivorans、Thermobacillus composti、Arthrobacter globiformisのxylX遺伝子ホモログを用いてもよい。
　さらに、２－ケトグルタリックセミアルデヒドデヒドロゲナーゼに関しては、アゾスピリラム属、ハロモナス属、バチルス属に属する細菌の遺伝子、例えばAzospirillum brasilense、Halomonas boliviensisのxylA遺伝子ホモログ、又はBacillus subtilis のycbDを用いてもよい。
　上記の各遺伝子の塩基配列及びそれらがコードするアミノ酸配列は、表１１に示す。
　後述するように、カウロバクター・クレセンタスでは、NXA経路の５つの酵素の遺伝子は、オペロン構造を有している。同オペロンの塩基配列は、GenBankにAAK22808_Caulobacter_crescentusのaccession No.で登録されている。配列番号２３に、同オペロンの塩基配列を示す。同オペロンによりコードされる２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドラターゼ、２－ケトグルタリックセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、キシロースデヒドロゲナーゼ、及び、キシロノラクトナーゼのアミノ酸配列を、各々配列番号２４～２７に示す。また、同オペロン中のxylD遺伝子の塩基配列及びそれによってコードされるキシロネートデヒドラターゼのアミノ酸配列を、各々配列番号２８及び２９に示す。配列番号２８の塩基配列は、配列番号２３の5509～7296位に相当する。
　尚、xylXの開始コドンとして２箇所が提唱されているが、配列番号２３では1175～1177位を開始コドンとして記載した。xylDの開始コドンも2箇所提唱されており、配列番号２８の1～3位、あるいは13～15位を開始コドンとして使用してもよい。13～15位が開始コドンの場合は、配列番号２９のキシロネートデヒドラターゼのアミノ酸配列は、5位のLeuから始まる。
　グルコースデヒドロゲナーゼは、本来、以下の反応を可逆的に触媒する酵素であるが（EC1.1.1.119）、「キシロースからキシロン酸を生成する反応を触媒し得るグルコースデヒドロゲナーゼ」とは、ピロロキノリンキノンを補酵素とすることにより、D-キシロースをD-キシロノラクトンに変換することができる酵素を意味する。
　β-D-グルコース + NADP → D-グルコノ-1,5-ラクトン + NADPH + H＋
　ピロロキノリンキノンは、微生物がもともと有する能力により生産されてもよいし、培地中に添加されてもよい（Appl Environ Microbiol. 2009 May;75(9) 2784-2791）。
　本発明においては、２－ケトグルタル酸またはその誘導体を生産する細菌として、２－ケトグルタル酸の分解経路を弱化あるいは消失させておくことが望ましい。２－ケトグルタル酸の分解経路の弱化又は消失としては、α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ及び/またはコハク酸デヒドロゲナーゼの活性を弱化あるいは消失させておくことが望ましい。本発明において、α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下、「α-KGDH」ということがある）活性とは、α－ケトグルタル酸（２－オキソグルタル酸）を酸化的に脱炭酸し、サクシニル－CoA(succinyl-CoA)を生成する反応を触媒する活性を意味する。上記反応は、α-KGDH（E1o：α－ketoglutarate dehydrogenase, EC:1.2.4.2）、ジヒドロリポアミドＳ－サクシニルトランスフェラーゼ（E2o：dihydrolipoamide-S-succinyltransferase; EC:2.3.1.61）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（E3：dihydrolipoamide dehydrogenase; EC:1.8.1.4）の３種の酵素によって触媒される。すなわち、これらの３種類のサブユニットはそれぞれ以下の反応を触媒し、これら３つの反応を合わせた反応を触媒する活性をα-KGDH活性という。α-KGDH活性の確認は、Shiioらの方法（Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric.Biol.Chem.,44(8),1897-1904,1980）に従って測定することができる。
  E1o: 2-oxoglutarate + [dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] lipoyllysine = [dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] S-succinyldihydrolipoyllysine + CO2
  E2o：CoA + enzyme N6-(S-succinyldihydrolipoyl)lysine = succinyl-CoA + enzyme N6-(dihydrolipoyl)lysine
  E3: protein N6-(dihydrolipoyl)lysine + NAD+ = protein N6-(lipoyl)lysine + NADH
 + H+
　なお、α-KGDHは、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（oxoglutarate dehydrogenase）、２-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（2-oxoglutarate dehydrogenase）とも呼ばれる。
　腸内細菌科、例えばパントエア・アナナティスでは、この３種それぞれの酵素活性を有するサブユニットタンパク質が複合体を形成している。そして、各サブユニットは各々sucA、sucB及びlpdによってコードされ、sucA、sucB遺伝子は、サクシネートデヒドロゲナーゼアイロン－スルファープロテイン遺伝子（sdhB）の下流に存在している（米国特許第6,331,419号）。尚、同特許には、これらの遺伝子はエンテロバクター・アグロメランスAJ13355の遺伝子として記載されているが、同菌株は、後にパントエア・アナナティスに再分類されている。
　腸内細菌のα-KGDHをコードする遺伝子として、パントエア・アナナティスのsucA、sucB及び下流に存在するsucC遺伝子の塩基配列及び各サブユニットのアミノ酸配列は、EP2100957A1に開示されている。また、エシェリヒア・コリのα-KGDHをコードするsucA、sucB及びsucC遺伝子は、それぞれGenbank NP_415254, NP_415255に開示されている。
　また、コリネ型細菌では、E1oサブユニットはodhA遺伝子（sucA遺伝子とも呼ばれるGenBank Accession No. NC_003450のNCgl1084として登録されている）によってコードされ、E3サブユニットはlpd遺伝子（GenBank Accession No. Y16642）によってコードされている。一方、E2oサブユニットは、E1oサブユニットとともに２機能性タンパク質としてodhA遺伝子にコードされているか（Usuda et al., Microbiology 1996 142, 3347-3354参照）、あるいはodhA遺伝子とは別のGenBank Accession No. NC_003450のNCgl2126として登録されている遺伝子によってコードされていると推測されている。従って、本発明においては、odhA遺伝子は、E1oサブユニットをコードする遺伝子であるが、併せてE2oをコードしていてもよい。
　ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのodhA遺伝子の塩基配列及びE1oサブユニットのアミノ酸配列（WO2006/028298）、上記GenBank Accession No. NC_003450のNCgl2126の塩基配列及び同配列によりコードされるE2oサブユニットのアミノ酸配列、及び、上記GenBank Accession No.NC_003450のNCgl1084の塩基配列及び同配列によりコードされるE1oサブユニットの配列は、EP2100957A1に開示されている。
　本発明においては、α－KGDHサブユニットの各々をコードする遺伝子、及びそれらを含む遺伝子クラスターを総称して、「α－KGDHコードする遺伝子」ということがある。
　コハク酸デヒドロゲナーゼ（以下、「SDH」と記載することがある）は、EC:1.3.99.1の以下の反応を可逆的に触媒する酵素である。本発明において、SDH活性とは、この反応を触媒する活性を意味する。
　コハク酸 ＋ FAD → フマル酸 ＋ FADH２
　SDHは、微生物種によって、３つまたは４つのサブユニット構造から構成されており、これらのうち少なくとも１種のタンパク質を正常に機能しないように改変することによって活性を低下又は欠失させることができる。具体的には、SDHは以下のサブユニット（カッコ内はサブユニットをコードする遺伝子名）から構成されており、種によってはmembrane anchor proteinをsdhC単独で、あるいはsdhCとsdhDでコードしているものがある。
　SDHA：flavoprotein subunit (sdhA)
　SDHB：Fe-S protein subunit (sdhB)
　SDHC：membrane anchor protein (sdhC）
　SDHD：membrane anchor protein (sdhD)
　また、SDHサブユニット複合体は、SDHとフマル酸レダクターゼ両方の活性を有している場合がある。例えば、コリネ型細菌のSDHサブユニット複合体は、SDHとフマル酸レダクターゼの両方の活性を有している（WO2005/021770）。
　SDH活性の確認は、2,6-dichloroindophenol（DCIP）の還元を指標として測定することで行うことができる。具体的な方法はTatsuki Kurokawa and Junshi Sakamoto, Arch Microbiol (2005) 183: 317-324に記載されている。
　本発明においては、SDHサブユニットの各々をコードする遺伝子、及びそれらを含むオペロンを総称して「SDHをコードする遺伝子」ということがある。
　腸内細菌のSDHをコードする遺伝子として、パントエア・アナナティスの遺伝子の塩基配列及び各サブユニットは、WO2008/075483に開示されている。
　コリネ型細菌のSDHをコードする遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムのsdhオペロン（GenBank accession No.NCgl0359（sdhC） NCgl0360(sdhA) NCgl0361(sdhB)）、及びブレビバクテリウム・フラバムのsdhオペロン（特開2005-095169号、EP1672077A1、WO2008/075483）の配列が開示されている。
　α-KGDH、SDHの活性を低下、又は欠損させるには、後述のＬ－グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性の低下について記載した方法を適用することができる。
　さらに本発明の微生物としては、キシロースを細胞内に取り込む酵素の活性が強化されていてもよい。
　キシロースを細胞内に取り込む酵素としては、Ｄ－キシロースパーミアーゼが挙げられ、Ｄ－キシロースパーミアーゼをコードする遺伝子としてはxylE遺伝子が挙げられる。Ｄ－キシロースパーミアーゼをコードするエシェリヒア・コリ由来のxylE遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、各々配列番号３０、３１に示す。
　さらに本発明の微生物としては、キシロースイソメラーゼ（xylA）及びまたはキシルロースキナーゼ(xylB)を弱化させておくことが望ましい。また、エシェリヒア・コリのキシロースイソメラーゼ（xylA）、キシルロースキナーゼ(xylB)遺伝子は、NC000913.1　gi:16131436,16131435にそれぞれ開示されている。
　さらに本発明においては、キシロン酸が培地中に蓄積することがあり、特にエシェリヒア・コリにおいては、キシロネートデヒドラターゼの活性をさらに強化することが望ましい。例えば活性として10μmol/min/mg-protein以上、望ましくは15μmol/min/mg-protein以上、さらに望ましくは17μmol/min/mg-protein以上強化されることが好ましい。
　次に、微生物に目的酵素の活性を付与するか、又は微生物の目的酵素の活性を増大させる方法を説明する。
　微生物が、元来目的酵素の活性を有していない場合は、同酵素をコードする遺伝子を同微生物に導入することによって同酵素活性を付与することができる。また、微生物が目的酵素の活性を有している場合は、目的酵素をコードする外来遺伝子を導入するか、目的酵素をコードする内因性の遺伝子のコピー数を増大させるか、又は目的酵素遺伝子のプロモーター等の発現制御配列を改変するなどして、同遺伝子の発現量を増大させることによって、目的酵素活性を増大させることができる。本発明において、「目的酵素遺伝子を導入する」とは、元来目的酵素活性を有していない微生物に目的酵素遺伝子を導入するのみならず、該酵素活性を有している微生物に外来遺伝子を導入すること、及び、目的酵素活性を有している微生物に内因性遺伝子を導入し、内因性の目的酵素ゼ遺伝子の発現量を増大させることも含む。
　目的酵素遺伝子を導入するには、例えば、同遺伝子を適当なベクター上にクローニングし、得られたベクターを用いて宿主微生物を形質転換する。
　形質転換に用いるベクターとしては、使用する微生物で自律複製可能なプラスミドが挙げられる。例えば、腸内細菌群に属する微生物の中で自律複製可能なプラスミドとして、pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29、pTWV228、pTWV229（pHSG、pSTV、pTWVはタカラバイオ社より入手可能）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可能）等が挙げられる。また、コリネ型細菌用のプラスミドとしては、pAM330(特開昭58-67699号公報)、pHM1519(特開昭58-77895号公報)、pSFK6 (特開2000-262288号公報参照）、pVK7(米国特許出願公開明細書2003-0175912)、pAJ655、pAJ611、pAJ1844(特開昭58-192900号公報)、pCG1(特開昭57-134500号公報)、pCG2（特開昭58-35197号公報）、pCG4、pCG11（特開昭57-183799号公報）、pHK4（特開平5-7491号公報）などが挙げられる。
　形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリK-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）などが挙げられる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、微生物の形質転換を行うこともできる。
　また、目的酵素遺伝子の導入は、宿主微生物への染色体上への導入によっても達成できる。微生物の染色体上に目的酵素遺伝子を導入するためには、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入する方法（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）や、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行うことも可能である。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、Redドリブンインテグレーション法(WO2005/010175)を使用することにより、目的遺伝子を染色体上に導入することも可能である。また、P１ファージ等のファージを用いたtransductionや、接合伝達ベクターによる染色体上への目的遺伝子の導入も可能である。また、WO03/040373に記載されているように、目的物質生産に不要な遺伝子を標的にして目的酵素遺伝子を導入することも可能である。このような方法で標的配列に、目的酵素遺伝子を１コピー又は多コピー導入することができる。
　染色体上にこれらの遺伝子が転移したことの確認は、目的遺伝子又はその一部と相補的な配列を持つプローブを用いて、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
　目的遺伝子が導入されるコピー数は、１コピー以上であればいずれでもよいが、２コピー以上、より好ましくは３コピー以上、さらに好ましくは５コピー以上であることが好ましい。目的遺伝子の中でも、特にキシロネートデヒドラターゼ遺伝子は、２コピー以上導入されることが好ましい。
　さらに目的酵素遺伝子は、下述するように、プロモーター等の発現調節配列の置換、変異と組み合わせることによって、活性を至適化することが可能である。特に、キシロネートデヒドラターゼ遺伝子は、前記の多コピー化に代えて、又は多コピー化と併せて、発現調節配列の置換、変異により高発現させることが好ましい。
　目的酵素遺伝子の発現量を増大させる方法としては、染色体DNA上またはプラスミド上において、目的酵素遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を適切な強さのものに置換することによって同遺伝子の発現を増強させる方法が挙げられる。例えば、thrプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、pLプロモーター、tacプロモーター等がよく用いられるプロモーターとして知られている。また、後記実施例で使用しているtacプロモーターのバリアント(PtacAプロモーター、PtacBプロモーター)も使用することができる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、GoldsteinとDoiの論文（Goldstein, M. A. and Doi R. H.1995. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128）等に記載されている。
　また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、適切な強度のものに改変することも可能である。発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。エシェリヒア・コリや、パントエア・アナナティスに用いることが出来る、温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばWO 99/03988号国際公開パンフレットに記載の温度感受性プラスミドpMAN997やその誘導体等が挙げられる。また、λファージのレッド・リコンビナーゼ（Red recombinase）を利用した「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法によっても、発現調節配列の置換を行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、上述したような遺伝子のコピー数を高める方法と組み合わせてもよい。
　さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによって、翻訳量を向上させることが可能である。
　上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターは使用する微生物において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。使用する微生物で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの－35、－10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。
　目的酵素の活性が増強したかどうかの確認は、改変株と親株又は非改変株の目的酵素の活性を比較することによって行うことができる。改変株の酵素活性が親株あるいは非改変株より上昇していれば、同酵素の活性が増強されている。また、親株が目的酵素の活性を有さない場合は、改変株で目的酵素の活性が検出できれば、同酵素の活性が増強されている。
　目的酵素遺伝子は、上記の配列情報、又は、その微生物において公知の遺伝子又はタンパク質の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCR法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、目的酵素を保持する微生物の染色体DNA又は染色体DNAライブラリーから、取得することができる。
　また、目的酵素、及びそれをコードする遺伝子は、酵素活性を保持している限り、それらのホモログや人為的改変体等、又は保存的変異を有するタンパク質又はそれをコードするものであってもよい。
　上記のようなホモログ、人為的改変体、又は保存的変異を有するタンパク質又はそれらをコードする遺伝子を、保存的バリアントと記載する。
　目的酵素の保存的バリアントとしては、例えば前記各酵素のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質であってもよい。
　「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは1～20個、より好ましくは1～10個、さらに好ましくは1～5個を意味する。また、保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸
性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。このようなタンパク質は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように野生型遺伝子の塩基配列を改変することによって取得することができる。
　さらに、上記のような保存的変異を有するタンパク質は、アミノ酸配列全体に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、野生型タンパク質と同等の機能を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）」は、「同一性」（identity）を指すことがある。
　野生型の目的酵素遺伝子は、上記のようなアミノ酸配列をコードするものであれば、カウロバクター・クレセンタスやハロフェラックス・ボルカニイ等の遺伝子に限らず、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。
　また、野生型遺伝子は、前記の各酵素遺伝子の相補配列又はその相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、野生型の目的酵素と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２～３回洗浄する条件が挙げられる。
　プローブとしては、各遺伝子の相補配列の一部を用いることもできる。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
　上記した各タンパク質の保存的バリアント及びそれをコードする遺伝子に関する記載は、後述の目的物質生産菌について記載した他の遺伝子についても同様に適用される。
　本発明に用いる微生物は、本来的に目的物質生産能を有するものであってもよいし、変異法や組換えＤＮＡ技術などを利用した育種により目的物質生産能を付与されたものであってもよい。
　本発明に使用される微生物としては、細菌、例えばエシェリヒア属、パントエア属、エンテロバクター属等の腸内細菌科に属する微生物や、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌が挙げられるが、これらに制限されない。
　本発明において、「コリネ型細菌」とは、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に分類された細菌も含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
　コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
　コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
　コリネバクテリウム・アルカノリティカム
　コリネバクテリウム・カルナエ
　コリネバクテリウム・グルタミカム
　コリネバクテリウム・リリウム
　コリネバクテリウム・メラセコーラ
　コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス (コリネバクテリウム・エフィシエンス)
　コリネバクテリウム・ハーキュリス
　ブレビバクテリウム・ディバリカタム
　ブレビバクテリウム・フラバム
　ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
　ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
　ブレビバクテリウム・ロゼウム
　ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
　ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
　コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
　ブレビバクテリウム・アルバム
　ブレビバクテリウム・セリヌム
　ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
　具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
　コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムATCC13870
　コリネバクテリウム・アセトグルタミカムATCC15806
　コリネバクテリウム・アルカノリティカムATCC21511
　コリネバクテリウム・カルナエATCC15991
　コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
　コリネバクテリウム・リリウムATCC15990
　コリネバクテリウム・メラセコーラATCC17965
　コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスAJ12340(FERM BP-1539)
　コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
　ブレビバクテリウム・ディバリカタムATCC14020
　ブレビバクテリウム・フラバムATCC13826, ATCC14067
　ブレビバクテリウム・インマリオフィラムATCC14068
　ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869（コリネバクテリウム・グルタ
ミカムATCC13869）
　ブレビバクテリウム・ロゼウムATCC13825
　ブレビバクテリウム・サッカロリティカムATCC14066
　ブレビバクテリウム・チオゲニタリスATCC19240
　コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC6871、ATCC6872
　ブレビバクテリウム・アルバムATCC15111
　ブレビバクテリウム・セリヌムATCC15112
　ミクロバクテリウム・アンモニアフィラムATCC15354
　これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC:住所　P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1,United States of America）より分譲を受けることができる。すなわち、各菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる（http://www.atcc.org/）。各菌株に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、AJ12340株は、1987年10月27日付けで通商省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター　住所 郵便番号305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）にFERM BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。
　腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネラ属、モルガネラ属などに属し、目的物質を生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはNCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock）。腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌を用いることが望ましい。
　エシェリヒア属細菌の親株としては、特に限定されないが、具体的にはナイトハルトらの著書（Neidhardt, F.C.et al.,Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1029 table 1） に挙げられるものが利用できる。その中では、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
　特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ－プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J Gen Appl Microbiol 1997 Dec;43(6) 355-361、International Journal of Systematic Bacteriology,Oct. 1997,p1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)等に再分類されているものがある。(International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989;39(3).p.337-345, )また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology,Jan 1993;43(1).p.162-173 参照）。尚、パントエア・アナナスは、後にさらにパントエア・アナナティスに再分類されている。
　エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）（現在はパントエア・アナナティス等に再分類されている）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株（現在はパントエア・アナナティスに再分類されている）が挙げられる。
　パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
　パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
　パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
　尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開0952221号明細書にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
　パントエア・アナナティスAJ13355株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ－グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。また、同株から粘性物質低生産変異株として選択された株が、SC17株である（米国特許第6,596,517号）。AJ13355株は、平成10年2月19日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、平成11年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。また、SC17株は、プライベート番号AJ416が付与され、平成２１年２月４日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター　住所 郵便番号305-8566　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11091が付与されている。
　さらに、パントエア・アナナティスのＬ－グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA株（米国特許第6,596,517号）に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（prpC）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ－グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である（WO2010/027045）。AJ13601株は、1999年8月18日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター　住所 郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
　NA1株は、前記RSFCPGのgltA遺伝子をメチルクエン酸シンターゼ遺伝子（prpC）に置き換えた構造を有するRSFPPG（WO2008/020654）を持つNP106株に相当する株である（WO2010/027045）。
　エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
　エルビニア・アミロボーラ　ATCC15580株
　エルビニア・カロトボーラ　ATCC15713株
　クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開955368号明細書)
　クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開955368号明細書)
　以下、上記のような微生物に目的物質生産能を付与する方法、又は上記のような微生物の目的物質生産能を増強する方法について述べる。
　目的物質生産能を付与するには、栄養要求性変異株、目的物質のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、目的物質の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７～１００頁参照）。ここで、目的物質生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強される目的物質生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
　目的物質生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつ目的物質生産能を有するものを選択することによって得ることができる。また目的物質生産菌は、遺伝子組換えによって、目的物質の生合成系酵素の酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。
　以下、目的物質生産能を付与する方法、及び目的物質生産能が付与された微生物について例示する。
　育種によって目的物質生産能を付与または増強するための方法としては、例えば、目的物質生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変する方法を挙げることができる。例えば、Ｌ－グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンターゼ(gltBD)、アコニット酸ヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルビン酸キナーゼ(pykA, pykF)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセルムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)、フルトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）などが挙げられる。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。
　上記の遺伝子の発現の増強は、前述のNXA経路の酵素活性の増強について記載した方法により行うことができる。
　上記酵素遺伝子のうち、クエン酸シンターゼ遺伝子、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された微生物としては、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載された微生物が例示できる。
　Ｌ－グルタミン酸生産能を付与するための改変は、Ｌ－グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることにより行ってもよい。Ｌ－グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ－グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、２－オキソケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１－ピロリンデヒドロゲナーゼ、アセチルCoA ハイドロラーゼ（WO2006/057450）などが挙げられる。
　目的酵素の活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法又は遺伝子組換え技術によって、ゲノム上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。このような変異の導入は、例えば、遺伝子組換えによって、ゲノム上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、ゲノム上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一～二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分、あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（J. Biol. Chem. 272:8611-8617（1997））。また、コード領域の全体又は一部が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子でゲノム上の正常遺伝子を置換すること、又はトランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
　例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで腸内細菌科に属する細菌に形質転換し、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号, ロシア出願2006134574号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
　さらに、コリネ型細菌においてＬ－グルタミン酸生産能を付与する方法として、yggB遺伝子(NCgl 1221；NP_600492. Reports small-conductance...[gi:19552490])を増幅する方法、コード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法を用いることも可能である（WO2006/070944）。
　また、Ｌ－グルタミン酸生産能を向上させる方法として、Ｄ－キシルロースー５－リン酸フォスフォケトラーゼ（D-xylulose-5-phosphate phosphoketolase ）及び/又はフルクトース－６－リン酸ホスホケトラーゼ（fructose-6-phosphate phosphoketolase）をコードする遺伝子（これらを併せてホスホケトラーゼと呼ぶ）を導入する方法が挙げられる。　例えば、ホスホケトラーゼ活性が上昇した微生物としては、以下の微生物が挙げられる（WO2006/016705）。
　ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869ΔsucA(pVK9-xfp)、
　ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869ΔsucA(pVK9-PS2_xpkA)
　Ｌ－グルタミン酸生産能は、６－ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性を増強させることによっても付与することが出来る。６－ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性、２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性を上昇させた微生物としては、特開2003-274988に開示された微生物を挙げることが出来る。また、L-グルタミン酸生産能は、L-グルタミン酸排出遺伝子であるyhfK,ybjL遺伝子を増幅することによっても付与することができる（WO2005/085419, WO2008/133161）。
　また、本発明に用いるＬ－グルタミン酸生産微生物としては、酸性条件下で培養したときに液体培地中にＬ－グルタミン酸の飽和濃度を越える量のＬ－グルタミン酸を蓄積する能力（以下、酸性条件下でのＬ－グルタミン酸蓄積能ということがある）を有する微生物を用いることができる。例えば、欧州公開公報1078989号記載の方法により、低ｐＨ環境下でＬ－グルタミン酸に対する耐性が向上した菌株を取得することにより、飽和濃度を超える量のＬ－グルタミン酸を蓄積する能力を付与することができる。
　Ｌ－グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や、細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼを弱化させる方法（特開昭52-038088）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平4-88994）などが挙げられる。
　このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
　ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949　(FERMBP-2632；特開昭50-113209参照)
　コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FERM P-5736；特開昭57-065198参照)
　ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007；特開昭56-1889号公報参照)
　コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P-5020；特開昭56-1889号公報参照)
　ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318；特開昭57-2689号公報参照)
　コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM P-4319；特開昭57-2689号公報参照)
　ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472；特開昭56-140895公報参照)
　ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136；特開昭56-35981号公報参照)
　コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004；特開平04-88994号公報参照)
　ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426（FERM P-5123；特開平56-048890号公報参照）
　コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440（FERM P-5137；特開平56-048890号公報参
照）
　ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796（FERM P-6402；特開平58-158192号公報参照）
　Ｌ－グルタミン生産能を有する微生物として好ましい例は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を強化した細菌、グルタミンシンセターゼ（glnA）活性を強化した細菌、グルタミナーゼ遺伝子を破壊した細菌である（欧州特許出願公開1229121号、1424398号明細書）。グルタミンシンセターゼの活性増強は、グルタミンアデニニルトランスフェラーゼ（glnE）の破壊、PII制御タンパク質（glnB）の破壊によっても達成できる。また、エシェリヒア属に属し、グルタミンシンセターゼの397位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有する菌株も好適なＬ－グルタミン生産菌として例示できる（米国特許出願公開第2003-0148474号明細書）。
　Ｌ－グルタミン生産能を付与または増強する別の方法として、6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン耐性を付与する方法 (特開平3-232497)、プリンアナログ耐性及びメチオニンスルホキシド耐性を付与する方法(特開昭61-202694)、α-ケトマレイン酸耐性を付与する方法（特開昭56-151495）などが挙げられる。Ｌ－グルタミン生産能を有するコリネ型細菌の具体例として、以下の微生物が挙げられる。
　ブレビバクテリウム・フラバムAJ11573 (FERM P-5492；特開昭56-161495)
　ブレビバクテリウム・フラバムAJ11576 (FERM BP-10381；特開昭56-161495)
　ブレビバクテリウム・フラバム AJ12212 (FERM P-8123；特開昭61-202694)
　Ｌ－プロリン生産能を有する微生物としては、例えば、Ｌ－プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ－グルタミルキナーゼを保持する細菌やＬ－プロリン分解系が弱化した細菌が挙げられる。Ｌ－プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ－グルタミルキナーゼをコードするDNAを用いて細菌を改変する方法は、Dandekar, A.M., Uratsu, S.L., J. Bacteriol., 170, 12, 5943-5 (1988)に開示されている。また、Ｌ－プロリン分解系が弱化した細菌を得る方法としては、例えば、プロリンデヒドロゲナーゼ遺伝子に酵素活性を低下させる変異を導入する方法が挙げられる。Ｌ－プロリン生産能を有する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ NRRL B-12403株及びNRRL B-12404株 (英国特許 2075056), VKPM B-8012株 (米国特許公開2002-0058315), および、ドイツ特許3127361号に開示されたプラスミド変異体やBloom F.R. らの文献 (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34) に開示されたプラスミド変異体を保持する菌株などが挙げられる。
　また、Ｌ－プロリン生産能を有する微生物として好ましいものは、3,4-デヒドロキシプロリン、及びアザチジン－２－カルボキシレートに耐性な株であるエシェリヒア・コリ702株（VKPMB-8011）や、702株のilvA欠損株である702ilvA株（VKPMB-8012株）や、b2682およびb2683、b1242又はb3434遺伝子にコードされるタンパク質の活性を増強したエシェリヒア・コリ等も挙げられる（特開2002－300874号公報）。
　コリネ型細菌のＬ－プロリン生産菌としては、ＤＬ－３，４－デヒドロプロリン耐性株（FERM BP-1219.米国特許4224409号公報）、クエン酸合成酵素活性がその親株の１．４倍以上に上昇した株（FERM P-5332、FERM P-5333、FERM P-5342、FERMP-5343　特許1426823号）、酢酸要求性が付与された株（FERM P-5931）が挙げられる。
　Ｌ－アルギニン生産能を有する微生物としては、α－メチルメチオニン、ｐ－フルオロフェニルアラニン、Ｄ－アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、ＡＥＣ（Ｓ－（２－アミノエチル）－システイン）、α－メチルセリン、β－２－チエニルアラニン、又はスルファグアニジンに耐性を有するエシェリヒア・コリ変異株（特開昭56-106598号公報参照）等が挙げられる。また、Ｌ－アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し、かつ、高い活性を有するＮ－アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するＬ－アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ237株（ロシア特許出願第2000117677号）も、好適なＬ－アルギニン生産株である。同株は、2000年４月10日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika）にVKPM B-7925の受託番号で寄託され、2001年５月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。237株の誘導体で、酢酸資化能を向上させたＬ－アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ382株（特開2002-017342号公報）を用いることもできる。エシェリヒア・コリ382株は、2000年４月10日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）にVKPM B-7926の受託番号で寄託されている。
　またＬ－アルギニン生産能を有する微生物として、Ｌ－アルギニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現量を向上させた微生物を用いることが出来る。例えば、Ｌ－アルギニン生合成系酵素しては、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ－アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）から選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。N-アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）は、野生型の１５位～１９位に相当するアミノ酸配列が置換されたＬ－アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型の遺伝子を用いるとより好適である（欧州出願公開1170361号明細書）。
　コリネ型細菌のＬ－アルギニン生産菌としては、Ｌ－アルギニン生産能を有するものであれば特に制限されないが、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２－チアゾールアラニン又はα－アミノ－β－ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２－チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－プロリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニンまたはＬ－トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特開昭54-44096号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭57-18989号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特開昭62-24075号）；または、Ｘ－グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平2-186995号）等が挙げられる。
　また、Ｌ－アルギニン生産能を有するコリネ型細菌は、５－アザウラシル、６－アザウラシル、２－チオウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－アザシトシン、６－アザシトシン等に耐性な変異株；アルギニンヒドロキサメート、２－チオウラシルに耐性な変異株、アルギニンヒドロキサメート及び６－アザウラシルに耐性な変異株（特開昭49-126819号）；ヒスチジンアナログ又はトリプトファンアナログに耐性な変異株（特開昭52-114092号）；メチニオン、ヒスチジン、スレオニン、プロリン、イソロイシイン、リジン、アデニン、グアニンまたはウラシル（またはウラシル前駆体）の少なくとも一つに要求性を有する変異株（特開昭52-99289号参）；アルギニンヒドロキサメートに耐性な変異株（特公昭51-6754号）；コハク酸要求性又は核酸塩基アナログに耐性な変異株（特開昭58-9692号）；アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求する変異株（特開昭52-8729号）；アルギニン、アルギニンヒドロキサメート、ホモアルギニン、Ｄ－アルギニン、カナバニン耐性、アルギニンヒドロキサメート及び６－アザウラシル耐性の変異株（特開昭53-143288号）；及び、カナバニン耐性の変異株（特開昭53-3586号）等として育種することができる。
　Ｌ－アルギニン生産能を有するコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
　ブレビバクテリウム・フラバムAJ11169（FERM P-4161）
　ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12092（FERM P-7273）
　ブレビバクテリウム・フラバムAJ11336（FERM P-4939）
　ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345（FERM P-4948）
　ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12430（FERM BP-2228）
　さらにアルギニンリプレッサーであるArgRを欠損した株(米国特許出願公開2002-0045223号、細胞内のグルタミンシンテターゼ活性を上昇させた株（米国特許出願公開2005-0014236号公報）を使用することが出来る。
　Ｌ－シトルリン、Ｌ－オルニチンもＬ－アルギニンと生合成経路が共通しており、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ－アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）の酵素活性を上昇させることによってこれらの生産能を付与することができる。（国際公開2006-35831号パンフレット）
　γ－アミノ酪酸（GABA; gamma-aminobutiric acid）生産菌としては、グルタミン酸デカルボキシラーゼの活性を増強した株（Microb Cell Fact. 2010 Nov 12;9:85. Amino Acids. 2010 Nov;39(5):1107-16　US20100324258号公報）を用いることが出来る。
　プトレッシン生産菌としては、4-hydroxybutyrate reductase; succinyl-CoA reductase (aldehyde forming); and 4-hydroxybutyrate dehydrogenaseを強化した株（WO2011047101号公報）、gamma-aminobutyraldehyde dehydrogenaseを強化した株（FEBS Lett. 2005 Aug 1;579(19):4107-12.）を用いることが出来る。
＜２＞目的物質の製造方法
　上記のような細菌を、炭素源としてキシロースを含む培地で培養して、目的物質を該培地中に生成蓄積させ、該培地より目的物質を採取することにより、目的物質を製造することができる。
　培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。
　炭素源としては、キシロースを含む限り、他の炭素源、例えばグルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、アラビノース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。
　キシロースと他の炭素源との混合比率はいずれもよいが、キシロース：他の炭素源（重量比）は、好ましくは１：０．１～１００、より好ましくは１：０．１～１０、より好ましくは１：０．１～５、より好ましくは１：１～５、さらに好ましくは１：１～３である。
　培地中の炭素源の濃度としては、目的物質を製造するのに適した濃度であればどのような濃度で用いてもかまわない。培地中の炭素源濃度としては、好ましくは0.1w/v%～50w/v%程度、より好ましくは0.5w/v%～40w/v%程度、特に好ましくは1w/v%～30w/v%程度である。
　キシロース、又はキシロースとグルコースのような６単糖との混合物は、バイオマスの十分に利用されていない供給源から得ることができる 。これらの５単糖、６単糖は、蒸気および／または濃酸加水分解、希酸加水分解、セルラーゼのような酵素を用い加水分解、又はアルカリ処理により、植物バイオマスから遊離され得る。基質がセルロース系材料である場合、セルロースは同時にまたは個々に糖に加水分解されて、目的物質の生産に用いることができる。ヘミセルロースは一般にセルロースよりも糖へ加水分解され易いため、セルロース系材料を予め加水分解して５単糖を分離し、続いて蒸気、酸、アルカリ、セルラーゼまたはそれらの組合せによる処理によりセルロースを加水分解して、６単糖を生成させることが好ましい。
　さらに本発明における培地中に含まれるキシロースは、微生物にグルコース、ガラクトース、アラビノースからの変換経路を保有させて、各ヘキソースからキシロース（D-キシロース）に変換させることによって供給してもよい。
　窒素源としては、アンモニア、ウレア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。
　培養は、好ましくは、発酵温度２０～４５℃、ｐＨを３～９に制御し、通気培養を行う。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。このような条件下で、好ましくは１０時間～１２０時間程度培養することにより、培養液中又は菌体内に目的物質が蓄積される。
　また、目的物質がＬ－グルタミン酸である場合、Ｌ－グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ－グルタミン酸を析出させながら生成、蓄積させるように培養を行うことも出来る。Ｌ－グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０～４．０、好ましくはｐＨ４．５～４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３～４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。尚、酸性条件下での生育の向上、及び、効率的なＬ－グルタミン酸の析出を両立するためには、ｐＨは好ましくは５．０～４．０、より好ましくは４．５～４．０、さらに好ましくは４．３～４．０であることが望ましい。尚、上記ｐＨでの培養は、培養の全期間であってもよく、一部であってもよい。
　採取される目的物質は、目的物質以外に微生物菌体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物を含んでいてもよい。採取された目的物質の純度は、50％以上、好ましくは85％以上、特に好ましくは95%以上である (JP1214636B, USP 5,431,933, 4,956,471, 4,777,051, 4946654, 5,840,358, 6,238,714, US2005/0025878))。
　培養終了後の培養液から目的物質を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、従来より周知となっているイオン交換樹脂法（Nagai,H.et al.:Separation Science and Technology, 39(16),3691-3710）、膜分離法（特開平9-164323号、特開平9-173792号）、晶析法(WO2008/078448、WO2008/078646）、その他の方法を組み合わせることにより、目的物質を採取できる。
　また、目的物質が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出した目的物質は、培地中に溶解している目的物質を晶析した後に、併せて単離してもよい。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
　以下の実施例で使用した培地組成を以下に示す。
〔LB培地〕
　バクトトリプトン 10g/L、酵母エキス　5 g/L、NaCl　5 g/L、pH 7.0
〔LBGM9〕
　LB培地に、最少培地成分（グルコース5g/L、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g/L、塩化ナトリウム0.5g/L、塩化アンモニウム1g/L、リン酸2ナトリウム6g/L）を添加したもの
〔MSII-Glucose培地 〕
Ａ区
　グルコース                 40 g/L
　MgSO４・7H２O                0.5 g/L
Ｂ区
　(NH４)２SO４                  20 g/L
　KH２PO４                     2 g/L
　NaCl                       0.5 g/L
　酵母エキス                 2 g/L
　CaCl２・7H２O                0.25 g/L
　FeSO４・7H２O                20 mg/L
　MnSO４・nH２O                20 mg/L
　Trace element※             4 ml/l
　L-Lys                      200 mg/L
　DL-Met                     200 mg/L
　DAP                        200 mg/L
　Ａ区、Ｂ区を、別々に120℃、20分オートクレーブした後混合する。
※Trace element
　CaCl２・2H２O               0.66 g/L
　ZnSO４・7H２O               0.18 g/L
　CuSO４・5H２O               0.16 g/L
　MnSO４・4H２O               0.15 g/L
　CoCl２・6H２O               0.18 g/L
　H３BO３                     0.10 g/L
　Na２MoO４                   0.30 g/L
〔MSII-Xylose培地〕
　MSII-Glucose培地のグルコース(40 g/L)をキシロース(40 g/L)に置換したもの。
〔MSII-GX培地〕
　MSII-Glucose培地のグルコース(40 g/L)を、グルコース(20 g/L)とキシロース(20 g/L)の混合物に置換したもの。
〔MSII-SX培地〕
　MSII-Glucose培地のグルコース(40 g/L)を、スクロース(20 g/L)とキシロース(20 g/L)の混合物に置換したもの。
〔E1合成培地〕
Ａ区 
　NH４Cl                       20mM
　MgSO４・7H２O                 2mM
　Na２HPO４                     40mM
　KH２PO４                      30mM
　CaCl２                       0.01mM
　FeSO４・7H２O                 0.01mM
　MnSO４・4-5H２O               0.01mM
　Citrate                     5mM
　pH Free 
　フィルター滅菌
Ｂ－１区
　炭素源                      50(又は100)mM
　フィルター滅菌
Ｂ－２区
　チアミン-HCl                1mM
　フィルター(0.22μm)滅菌後、B-1に添加
Ｃ区
　MES-NaOH(pH6.8)             50mM
　フィルター(0.22μm)滅菌
Ａ～Ｃ区は全て５倍濃度の溶液を調製し、Stock solutionとする。
〔CM-Dex培地〕
ポリペプトン            10 g/L
酵母エキス              10 g/L
グルコース              5 g/L
KH2PO4                   1 g/L
尿素                    3 g/L
MgSO4・7H2O              0.4 g/L
FeSO4・7H2O              0.01 g/L
MnSO4・5H2O              0.01 g/L
豆ろ液（大豆加水分解物） 1.2 g/L（T-N）
　
KOHを用いてpH 7.5に調整。
〔Glc培地〕
グルコース              80 g/L
(NH4)2SO4                30 g/L
KH2PO4                   1 g/L
MgSO4・7H2O              0.4 g/L
FeSO4・7H2O              0.01 g/L
MnSO4・5H2O              0.01 g/L
ビタミンB1              200 μg/L
ビオチン                 60 μg/L
豆ろ液（大豆加水分解物） 0.48 g/L (T-N)
　
KOHを用いてpH 8.0に調整。
〔Xyl培地（ビオチン制限）〕
　Glc培地のグルコース（80 g/L）をキシロース（80 g/L）に置換し、さらにビオチンを除いたもの。
〔ＭＳ培地〕
Ａ区
　グルコース or キシロース   40 g/L
グルコースとキシロース(1:1)  40g/L 
　MgSO４・7H２O                1 g/L
Ｂ区
　(NH４)２SO４                  20 g/L
　KH２PO４                     1 g/L
　酵母エキス                 2 g/L
　FeSO４・7H２O                10 mg/L
　MnSO４・nH２O                10 mg/L
　Ａ区、Ｂ区を、別々に120℃、20分オートクレーブした後混合し、局方炭酸カルシウム50g/Lを加える。
〔実施例１〕パントエア・アナナティスへのNXA経路の導入
（１）NXA経路導入用プラスミドpTWV228Ptac_ccrNXAの構築
　NXA経路が報告されている公知の細菌として、C. crescentus（Stephens, C. et al., J. Bacteriol. 2007, 189(5):181-2185）が知られている。C.crescentuのNXA経路の各酵素をコードする遺伝子の取得にあたり、以下の方法を採用した。
　C. crescentusのゲノムは約4Mbであり、５つの遺伝子がオペロン構造を成している（Journal of Bacteriology, 189:2181-2185, 2007）。C. crescentusから、ゲノム公開菌株（CB-15(ATCC19089)。ATCCから入手可能）からゲノムを抽出し、各遺伝子のクローニングと発現ベクター構築を試みた。
　Clontech In-Fusion Cloning Kitを利用し、発現ベクターの構築を行った。
　以下の４つのDNA断片を、i)、ii)、iii)についてはC. crescentus CB-15（ATCC19089）の染色体DNAを鋳型として、iv)についてはpMW119を鋳型として、PCRにて増幅した。カッコ内は、PCRに用いたプライマーを示す。
 i) tacプロモーター配列（以下、「Ptac」と記載する）（PtwvPtacf：配列番号１、0823Ptacr：配列番号２）
 ii) xylX、ccrxylA、ccrxylB、及びxylCを含む断片（Ptac0823f：配列番号３、0819r：配列番号４）
 iii) xylDとその下流約120bp領域（0819f：配列番号５、219cc0819r：配列番号６）
 iv) pMW119/SmaI（219f：配列番号７、219r：配列番号８）
　続いて、精製したi)、ii)のPCR産物を鋳型とし、PtwvPtacf及び0819rをプライマーとして、これらのPCR産物が結合した断片Ptac_xylXccrAccrBCをPCRにて増幅した。得られたPtac_xylXccrAccrBCと、前記iii)及びiv)のPCR産物の３者を、Clontech In-Fusion Cloning Kitを用いてIn-Fusion反応し、反応物でE. coli JM109株を形質転換し、形質転換体より目的のプラスミドpMW119Ptac_ccrNXAを取得した。
　次に、pMW119Ptac_ccrNXAを鋳型に、PtwvPtacf及び219CC0819rをプライマーとして、Ptacを含むccrNXAオペロンを増幅した。得られた増幅産物と、SmaIで消化したpTWV228をIn-Fusion反応し、反応物でE. coli JM109株を形質転換し、形質転換体より目的のプラスミドpTWV228Ptac_ccrNXAを取得した。
（２）pUT399にカナマイシン耐性Mini-Muを搭載したプラスミドpUT-MuKmの構築
　pUT399は、R6Kの複製起点を有し、接合伝達に必要なmob領域を含んでおり、pir遺伝子を持たない菌株では複製出来ないプラスミドである（Biomedal社から入手可能：R. Simon., et al., BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER 1983, 784-791参照、米国特許第7090998号）。
　pCE1134（特開平2-109985号公報）は、MudII1734を含むプラスミドであり、Mini-Muユニット内にKm耐性遺伝子とlacXYZ遺伝子を搭載している。以下の方法により、pCE1134のMini-Muユニット内からlacXYZ領域を欠失したDNA断片を調製し、pUT399にクローニングした。
　pCE1134を鋳型として、プライマーattL-F（配列番号９）とnptII-R（配列番号１０）を用いて、left endとトランスポゼースをコードするMuAB遺伝子のリプレッサーであるMuCts、Km耐性遺伝子を含む断片をPCRにより取得した。また同様にpCE1134を鋳型として、プライマーattR-F（配列番号１１）とattR-R（配列番号１２）を用いて、right endを含む断片を取得した。これら２断片を鋳型として、プライマーattL-FとattR-Rを用いてcross over PCRを行い、得られた約2.3kbの断片をpUT399のSmaIサイトに導入した。こうしてプラスミドpUT-MuKmを得た。
　上記のよにうして構築したMini-Muユニットは、転移ユニット内にKm耐性遺伝子とクローニングサイトとして８塩基認識のNotIサイトを持つため、種々の遺伝子がクローニング可能である。
（３）pTWV228Ptac_ccrNXAの薬剤耐性遺伝子の置換
　pTWV228Ptac_ccrNXAのアンピシリン耐性遺伝子を、λRed法によりカナマイシン耐性遺伝子に置換した。
　pUT_MuKmを鋳型として、プライマーAp-Km-fw（配列番号１３）とAp-Km-rv（配列番号１４）を用いて、カナマイシン耐性遺伝子を含む配列（ntpII断片）を増幅した。
　PCR反応はPrimeSTAR HS polymerase（タカラバイオ）を用い、同酵素に付属のプロトコルに従って行った。
　pTWV228Ptac_ccrNXAを有するE. coli JM109に、ヘルパープラスミドであるRSF_Red_TER(US20090286290A1、WO2008/075483)を導入し、50 ml LB (1 mM IPTG、100 mg/L アンピシリン、25 mg/Lクロラムフェニコールを含む)培地で37℃で OD660値が0.4になるまで培養した。
　上記RSF_Red_TERは、λ依存的インテグレーション（Red-driven integration）を起こさせる（λRed法）ためのヘルパープラスミドであり、lacI遺伝子によってλのgam、bet及びexoの各遺伝子の発現を誘導することができる。また、同プラスミドはレバンスクラーゼ遺伝子（sacB）を含んでおり、この遺伝子により、スクロースを含む培地で細胞からプラスミドを脱落させることができる。また、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含んでいる。
　前記のようにして培養した菌体を集菌後、10%グリセロール溶液で2回遠心洗浄し、1 mL 10%グリセロール溶液に懸濁した。その後、上記で得られたntpII断片でエレクトロポレーション法により形質転換し、40 mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地で、形質転換体を選抜した。得られた形質転換体をLB (1 mM IPTG、10%スクロース、40 mg/Lカナマイシンを含む) 寒天培地に植え継ぎ、37℃で一晩培養し、単一クローンを取得した。得られた形質転換体が、100 mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地上で生育できないことを確認し、pTWV228Ptac_ccrNXAのアンピシリン耐性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換したことを確認した。得られたプラスミドをpTWVPtac_ccrNXA_Kmとした。
（４）xylDを含むプラスミドの構築
　Clontech In-Fusion Cloning Kitを利用し、構築を行った。
　まず、それぞれの遺伝子をpUC18にクローニングしたプラスミドを鋳型とし、xylD_IFS_5742-10-5（配列番号１５）とxylD_IFS_5742-10-6（配列番号１６）をプライマーとして、xylDを、含むDNA断片をPCRにて増幅した。具体的には以下の方法で、SfiIサイトを除去したpUC18にクローニングした。
　C. crescentus CB-15株のゲノムDNAを鋳型とし、CC0819-01F_4691-88-7（配列番号１７）及びCC0819-01R_5659-9-1（配列番号１８）、並びにCC0819-02F_5659-9-2（配列番号１９）及びCC0819-02R_4691-88-10（配列番号２０）をプライマーとするPCRによって、各々1130 bp、及び653 bpの断片を増幅した。続いて、in vitro assemble法（Nature Methods 6(5), 343-345, 2009）で、SmaIで消化したpUC18と、上記２つの増幅断片をアセンブルすることで、SfiIサイトが除去され、xylD遺伝子が挿入されたpUC18-xylDを得た。
　一方、pSTV28-Ptac-Ttrpを常法に従ってSmaIにて消化した。xylD遺伝子のDNA断片とベクターDNA断片とをIn-Fusion反応し、反応物でE. coli JM109株を形質転換し、形質転換体より目的のプラスミド、pSTVPtac_xylD_Ttrpを取得した。
　pSTV28-Ptac-Ttrpは、以下のようにして構築した。
　配列番号３２の配列を有するtacプロモーター及びtrpターミネーターの配列を有するＤＮＡ断片（PtacTtrp）を合成し、pMW219ベクターのKpnI-BamHI間に連結することにより、pMW219-Ptac-Ttrpを得た。KpnI及びBamHIで各々消化したpSTV28とpMW219-Ptac-Ttrpを等量混合し、ライゲーション反応後、JM109を形質転換し、Cm耐性が示されたコロニーよりプラスミドを抽出した。得られたプラスミドについて、KpnIとBamHIによるdouble digestionにより想定される断片長約400 bpと3 kb（正確には389 bpと2994 bp）に1本ずつバンドがあることを確認し、pSTV28-Ptac-Ttrpを得た。
（４）NXA経路が導入されたパントエア・アナナティスによるＬ－グルタミン酸生産
　上記pTWVPtac_ccrNXA_Kmで、エレクトロポレーション法（米国特許6682912号参照）によりP. ananatis NA1株を形質転換した。pTWVPtac_ccrNXA_Kmを導入した株はLBGM9にカナマイシンを終濃度40 mg/Lとなるように添加したプレート培地を使用した。
　薬剤を添加したLBGM9プレートにて、34℃で一晩培養したP. ananatis NA1株、及び各形質転換株の菌体を1/6プレート分かきとり、MSII-Xylose、又はMSII-GX培地5 mlを張り込んだ太試験管に植菌し、34℃、120rpmにて48時間培養し、残糖、Ｌ－グルタミン酸（Glu）、及びキシロン酸の蓄積量を測定した。結果を表２、表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　P. ananatis NA1株をグルコースとキシロースの混合炭素源（MSII-GX培地）で培養した時には、グルタミン酸収率は25.7%であった（表２）。この時、キシロン酸の蓄積が観察され、キシロースはほとんどキシロン酸に変換されることが示唆された。P. ananatis NA1株においてキシロン酸の蓄積が観察されたことは、P. ananatisのグルコースデヒドロゲナーゼの活性によるものと推測される。
　一方、P. ananatis NA1株にpTWVPtac_ccrNXA_Kmを導入した株では、グルコースとキシロースの混合炭素源（MSII-GX培地）で培養した時に、親株と比較して非常に高いグルタミン酸収率を示した（収率69.9%）。親株において、キシロースからグルタミン酸がほとんど生成されないことを考慮し、pTWVPtac_ccrNXA_Km導入株のグルコースからのグルタミン酸収率が親株と同等であると仮定すると、キシロースからNXA経路を介したグルタミン酸収率は86%程度であると見積もることができる。実際に、キシロースを単一炭素源として培養した時には（MSII-Xylose）、pTWVPtac_ccrNXA_Km導入株は、収率80%でGluを生成した（表３）。
〔実施例２〕エシェリヒア・コリへのNXA経路の導入
（１）E. coliにおけるNXA経路発現
　TCAサイクル中の酵素であり、イソクエン酸からαKGを生成するイソクエン酸デヒドロゲナーゼの欠損株(Δicd)を用い、キシロースを単一炭素源とした最小培地での生育相補によるNXA経路の発現を試みた。icd遺伝子欠損株はαKGを生成できないため、キシロースを単一炭素源とした最小培地では生育できないが、NXA経路の導入によりキシロースからαKGを生成することができれば、同培地に生育可能となる。
　具体的にはKeio Collection株のicd遺伝子欠損株であるJW1122株（http://cgsc.biology.yale.edu/Person.php?ID=99553、E. coli Genetic Resource Center at Yale CGSC, The Coli Genetic Stock Centerより入手可能）を宿主菌株とし、プラスミドによりNXA経路を導入、発現させることにより、NXA経路がE. coliでも機能し得るか否か検討した。
　表４に構築したプラスミドとicd遺伝子欠損株における生育相補の結果を示した。C. crescentus由来のNXA経路オペロン(xylX, ccrxylA, ccrxylB, xylC, xylD)とtacプロモータを組み合わせたプラスミドpMW119Ptac_ccrNXA（実施例１で作製）を導入した菌株が、キシロースを単一炭素源としたM9最小培地(プレート)（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）において生育することを確認した。
　同様の検討を液体培養でも行った。36連培養装置を用い、経時的にキシロース又はαKGを単一炭素源として含むM9最小培地及びE1合成培地での生育(O.D.)を測定した。結果を図１に示した。プレートでの培養と同様に、ベクターコントロール株がキシロース単一炭素源のM9やE1培地で生育しないのに対し、NXA経路導入株では良好に生育した。これらの結果は、本菌株がキシロースをNXA経路由来で資化することにより生育したこと、即ち、C. crescentus由来NXA経路がE. coliにおいても機能したものであると考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（２）E. coli Ｌ－グルタミン酸生産株でのNXA経路発現
　E. coli Ｌ－グルタミン酸生産菌株として、αKGDH欠損株であるMG1655ΔsucA（米国特許出願公開第20050106688号）を用いた。同菌株に、pMW119Ptac_ccrNXA、又はコントロールとしてpMW119を導入して、MG1655ΔsucA/pMW119Ptac_ccrNXA、及び、MG1655ΔsucA/pMW119を得た。これらの菌株を、炭素源としてグルコース（40g/L）、キシロース（40g/L）、又はグルコース及びキシロース（各20g/L）を添加したMS培地でフラスコ培養した。炭素源としてグルコースのみを含む培地では24時間、他の培地では48時間培養した。結果を図２に示す。図に記載された菌株名に付された325、425、及び513は、クローン番号を示す。
　炭素源をグルコース及びキシロースの混合系とした場合、コントロール菌株（MG1655ΔsucA/pMW119）がＬ－グルタミン酸を15～16g/L蓄積するのに対し、ccrNXAオペロン発現株（MG1655ΔsucA/pMW119Ptac_ccrNXA）でのＬ－グルタミン酸蓄積は12g/L前後となり、Ｌ－グルタミン酸の蓄積、収率は低下する傾向が見られた。炭素源としてキシロース単独の場合も同様であった。副生物について、有機酸類及びキシロン酸について分析を行った。その結果、主に酢酸とキシロン酸が蓄積していることが分かった。
（３）E. coliにおけるNXA経路の律速点解析
　上記のとおり、E. coli Ｌ－グルタミン酸生産株では、ccrNXAオペロン発現株の培養上清中にNXA経路の中間体であるキシロン酸が検出されたことから、取り込まれたキシロースの一部がNXA経路を経由している可能性が高いと考えられた。また以下の課題が推測された。
i) 菌体内に取り込まれたキシロースはE. coli固有のキシロース資化系とNXA経路両方が利用可能であるが、固有系最初の酵素であるキシロースイソメラーゼ(XylA)とNXA経路最初の酵素であるキシロースデヒドロゲナーゼ(XDH)の活性あるいは基質特異性の差で、一定量が固有系に利用され、NXA経路を経由する代謝フラックスの流量が少ないという可能性。
ii) NXA経路上に律速点あるいは未同定のバイパス経路があり、αKGが生成されていない可能性。
　i)については、ccrNXAオペロン発現ベクターを低コピー型(pMW119)から中コピー型(pTWV228)に変更することによりNXA経路の各酵素量を増加させ、NXA経路への基質の引き込み量を増加させることで改善できる可能性が考えられた。
　ii)については、律速点の解析とその結果を基にした育種改良を行うことにより改善できる可能性が考えられた。
　以上のことから、
a) E. coli固有キシロース資化経路欠損株(ΔsucAΔxylA)を宿主とし、かつccrNXAオペロンを発現させ、強制的に炭素フラックスがNXA経路を経由する菌株の構築と培養評価、及び、b)　中コピー型ベクターを用いたccrNXAオペロン発現ベクターの構築と、その発現ベクターを用いた菌株の構築、及び培養評価、並びに
c)　律速点の解析、を実施した。
　プライマーxylA-H1P1-5742-5-1（配列番号２１）、及びxylA-H2P2-5742-5-2（配列番号２２）を用いて、MG1655ΔsucAから、λ-Red法により、E. coli　固有キシロース資化遺伝子xylAを欠損させ、MG1655ΔsucAΔxylA株を得た。同菌株にpMW119Ptac_ccrNXAを導入して、xylAを欠損したccrNXAオペロン発現株を得た。
　図３に、xylAを欠損したccrNXAオペロン発現株を、（３）と同様にして培養した際のＬ－グルタミン酸培養結果を示す。図３中、「ccrNXA」はpMW119Ptac_ccrNXAを示し、それに続く数字はクローン番号を示す。
　ΔsucAΔxylA株のベクターコントロール株がキシロースを資化できず、グルコースからのみ菌体形成とＬ－グルタミン酸生産ができるのに対し、ccrNXAオペロン発現株においては、キシロースの消費とキシロース由来と考えられるＬ－グルタミン酸生産が見られた。一方で、Ｌ－グルタミン酸蓄積量はモデル菌株（ΔsucA株）には及ばないこと、及び、NXA経路の代謝中間体であるキシロン酸が蓄積していることがわかった。この結果から、NXA経路全体の代謝フラックス量が不足している可能性が示唆された。また、αKGの副生がみられなかったことから、GDHの活性発現に必要なNADPHの供給はこの段階では問題になっていないことが考えられた。
　続いて、中コピー型ベクターを用いてccrNXAオペロン発現ベクターを構築した。pMW119Ptac_ccrNXAを鋳型とし、PtwvPtacf（配列番号１）と0819r（配列番号４）をプライマーとして、tacプロモータ領域を含むccrNXAオペロンを増幅した。pTWV228をSmaIにて消化し、tacプロモータ領域を含むccrNXAオペロンのPCR断片と共にIn-Fusion反応を行い、反応物でE. coli JM109株を形質転換し、形質転換体より目的のプラスミドpTWVPtac_ccrNXAを取得した。このプラスミドをMG1655ΔsucA株に導入し、得られた株を（３）と同様にして培養を行った。結果を図４に示した。図中、「ΔsucA」はMG1655ΔsucA株を、「/pTWV」及び「/v」はpTWV228を保持していることを、各々示す。また、pTWV110～pTWV119は、pTWV228Ptac_ccrNXAのクローン番号を示す。
　グルコースのみを炭素源とした場合では、中コピー型ccrNXAオペロン発現株はコントロール株とほぼ同等のＬ－グルタミン酸を蓄積した一方で、グルコース及びキシロースの混合培養系では、Ｌ－グルタミン酸蓄積はむしろ低下する傾向が見られた。また兄弟株間での成績にもばらつきが見られた。考えられる理由の一つに中コピー型発現ベクターの脱落が考えられた。また、これまでの菌株と同様にキシロン酸の蓄積が観察された。
　ccrNXAオペロンのコピー数増加により、NXA経路の各酵素の活性が増加しているかを確認するため、NXA経路の最初の酵素であるXDH活性を測定した。結果を表５に示した。表５に記載された菌株の「7513」、及び「1110」は、各々クローン番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　中コピー発現ベクター導入株では、低コピー発現ベクター導入株に比べて、XDH活性が約７倍に上昇していた。E. coli固有のキシロースイソメラーゼ(XylA)とXDHの分岐点で実際の菌体内でどのようにキシロースが分配されているかについては未確認であり、依然としてNXA経路の最初の酵素であるXDH活性が不足している可能性も考えられた。しかし、XDH活性が上昇してもＬ－グルタミン酸蓄積向上等の効果が見出せないことや、キシロン酸の蓄積等から、NXA経路のいずれか、又は複数の酵素が律速となっている可能性が考えられた。
　そこで、NXA経路の律速点についての解析を行った。代謝中間体としてキシロン酸が蓄積したことから、少なくともキシロースからキシロン酸に至るまでの代謝経路よりも、キシロン酸からαKGに至る経路に律速点があると考えた。また、ccrNXAオペロンの構造上、キシロースからキシロン酸に至る経路はオペロンの三番目と四番目に位置する遺伝子によりコードされているのに対し、キシロン酸からαKGに至る経路はオペロンの一番目、二番目、五番目に位置する遺伝子によりコードされている。XDHはオペロンの三番目に位置し、その活性はin vitroで検出できているが、オペロンの五番目に位置する遺伝子によりコードされる酵素（XylD）の活性が検出できれば、NXAオペロン全体が転写、翻訳されていることの傍証にもなると考えた。そこで、キシロン酸からαKGに至る３つの反応のうちのいずれかが律速点であると推測し、以下のような実験を行った。
　xylD、xylX、及び、ccrxylA遺伝子を各々単独発現するプラスミドpSTVPtac_xylD_Ttrp、pSTVPtac_xylX_Ttrp、及びpSTVPtac_ccrxylA_Ttrpを、以下のようにして作製した。
　pSTV28-Ptac-xylX-Ttrpは、SfiIサイトを除いたxylXをpUC18にクローニングしたプラスミドであるpUC18-xylXを鋳型とし、xylX-IFS-5742-10-1（配列番号３８）、及びxylX-IFA-5742-10-2（配列番号３９）をプライマーに用いたPCRによりxylX断片を作製し、SmaIで消化したpSTV28-Ptac-Ttrpにin-fusion cloning法でクローニングすることで作製した。
　pSTV28-Ptac-ccrxylA-Ttrpは、SfiIサイトを除いたccrxylAをpUC18にクローニングしたプラスミドであるpUC18-ccrxylAを鋳型とし、xylA_IFS_5742-10-3（配列番号４０）、及びxylA_IFA_5742-10-4（配列番号４１）をプライマーに用いたPCRによりccrxylA断片を作製し、SmaIで消化したpSTV28-Ptac-Ttrpにin-fusion cloning法でクローニングすることで作製した。
　pSTV28-Ptac-xylD-Ttrpは、SfiIサイトを除いたxylDをpUC18にクローニングしたプラスミドであるpUC18-xylDを鋳型とし、xylD_IFS_5742-10-5（配列番号４２）、xylD_IFA_5742-10-6（配列番号４３）をプライマーに用いたPCRによりxylD断片を作製し、SmaIで消化したpSTV28-Ptac-Ttrpにin-fusion cloning法でクローニングすることで作製した。
　上記プラスミドpUC18-xylX、pUC18-ccrxylA、pUC18-xylDは、各々以下のようにして作製した。
　C. crescentus CB-15株のゲノムDNAを鋳型とし、CC0823-01F_4691-87-1（配列番号４４）及びCC0823-01R_4691-87-2（配列番号４５）、並びにCC0823-02F_4691-87-3（配列番号４６）及びCC0823-02R_4691-87-4（配列番号４７）をプライマーとするPCRによって、各々900bp、及び280bpの断片を増幅した。続いて、in vitro assemble法（Nature Methods 6(5), 343-345, 2009）で、SmaIで消化したpUC18と、上記２つの増幅断片をアセンブルすることで、SfiIサイトが除去され、xylX遺伝子が挿入されたpUC18-xylXを得た。
　C. crescentus CB-15株のゲノムDNAを鋳型とし、CC0822-01F_4691-87-5（配列番号４８）及びCC0822-01R_5659-8-7（配列番号４９）、CC0822-02F_5659-8-8（配列番号５０）及びCC0822-02R_5659-8-9（配列番号５１）、CC0822-03F_5659-8-10（配列番号５２）及びCC0822-03R_5659-8-11（配列番号５３）、CC0822-04F_5659-8-12（配列番号５４）及びCC0822-04R_5659-8-13（配列番号５５）、並びにCC0822-05F_5659-8-14（配列番号５６）及びCC0822-05R_4691-87-14（配列番号５７）をプライマーとするPCRによって、各々11v02（175 bp）、12v02（325 bp）、13v02（260 bp）、14v02（193 bp）、及び15v02（544 bp）の５つの断片を増幅した。次に、11v02、及び12v02の２断片を鋳型とし、CC0822-01F_4691-87-5、及びCC0822-02R_5659-8-9をプライマーとするクロスオーバーPCRにより、これらの２断片を連結した。同様に、13v02、及び14v02の２断片を鋳型とし、CC0822-03F_5659-8-12、及びCC0822-04R_5659-8-13をプライマーとするクロスオーバーPCRにより、これらの２断片を連結した。これらの２断片と、上記15v02断片を、in vitro assemble法（Nature Methods 6(5), 343-345, 2009）で連結した。得られた連結断片を鋳型とし、CC0822-01F_4691-87-5、及びCC0822-05R_4691-87-14をプライマーに用いたPCRにより、連結断片を増幅した。続いて、in vitro assemble法（Nature Methods 6(5), 343-345, 2009）で、SmaIで消化したpUC18と、上記連結断片をアセンブルすることで、SfiIサイトが除去され、ccrxylA遺伝子が挿入されたpUC18-ccrxylAを得た。
　C. crescentus CB-15株のゲノムDNAを鋳型とし、CC0819-01F_4691-88-7（配列番号１７）及びCC0819-01R_5659-9-1（配列番号１８）、並びにCC0819-02F_5659-9-2（配列番号１９）及びCC0819-02R_4691-88-10（配列番号２０）をプライマーとするPCRによって、各々1130 bp、及び653 bpの断片を増幅した。続いて、in vitro assemble法（Nature Methods 6(5), 343-345, 2009）で、SmaIで消化したpUC18と、上記２つの増幅断片をアセンブルすることで、SfiIサイトが除去され、xylD遺伝子が挿入されたpUC18-xylDを得た。
　ccrNXAオペロン発現株（MG1655ΔsucA/pTWV228Ptac_ccrNXA）と、上記xylD、xylX、ccrxylA遺伝子をそれぞれ単独発現するプラスミドを保持する株（MG1655ΔsucA/pSTVPtac_xylD_Ttrp、MG1655ΔsucA/pSTVPtac_xylX_Ttrp、及びMG1655ΔsucA/pSTVPtac_ccrxylA_Ttrp）より粗酵素抽出液を調製し、ccrNXAオペロン発現株由来の粗酵素抽出液に、ベクター保持株、又はxylD、xylX、ccrxylAの各遺伝子の単独発現株由来の粗酵素抽出液を各々加え、キシロン酸からのαKG生成活性を測定した。結果を表６に示した。表６中、菌株名に付された「1110」は、クローン番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　xylD遺伝子単独発現株の粗酵素抽出液を添加した系において、αKG生成活性の上昇が観察された。この結果から、xylD遺伝子がコードするキシロネートデヒドラターゼ（XylD）が、E. coliにて異種発現により構築したNXA経路上の律速点である可能性が示唆された。
　酵素活性の測定から、ccrNXAオペロン発現株において、xylD遺伝子の発現をさらに強化することで経路全体の代謝フラックスが改善する可能性があることから、xylD遺伝子発現ベクターをccrNXAオペロン発現株に導入することにより、xylD遺伝子発現強化株を構築し、グルコース及びキシロースを炭素源としたＬ－グルタミン酸生産培養評価を実施した。ccrNXAオペロン発現株としては、MG1655ΔsucA/pMW119Ptac_ccrNXAと、MG1655ΔsucA/pTWV228Ptac_ccrNXAを用いた。
培養は（３）と同様にして行った。
　結果を表７に示した。xylD遺伝子発現強化株において、Ｌ－グルタミン酸蓄積及び収率が大幅に向上し、Ｌ－グルタミン酸蓄積はコントロール株15～16g/Lに対して23～25g/L、対消費糖収率はコントロール株37～40%に対して57～60%に達した。なお、代謝中間体であるキシロン酸は、xylD遺伝子発現強化株では見られなかった。一方、xylD遺伝子発現強化の効果は、中コピー型のccrNXAオペロン発現ベクターを搭載した発現株でのみ見られ、低コピー型ベクターによる発現株では見られなかった。これらの結果から、ベクターのコピー数増加によるNXA経路全体の活性増加とxylD遺伝子発現再強化による本経路の律速点の解消が、Ｌ－グルタミン酸生成量の向上につながったと考えられた。なお、xylD遺伝子発現強化株のキシロン酸からのαKG生成活性を測定したところ、強化前に比べて約10倍上昇していた(表８)。表７、表８に記載された菌株名に付された「1110」、「17」、「19」は、各々クローン番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
〔実施例３〕コリネバクテリウム・グルタミカムへのNXA経路の導入
（１）NXA経路導入用プラスミドpVK9Peftu_ccrNXAの構築
　エロンゲーションファクターTu（EF-Tu）遺伝子tufのプロモーター配列（WO2008114721、配列番号３３、以下、「Peftu」と記載する。）の下流にxylDを連結した配列を有するプラスミドを、Clontech In-Fusion Cloning HD Kit（Clontech社）を利用して構築した。まず、C. glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型に、プライマーPeftu(Pst)（配列番号５８）とPeftu_Rv（配列番号５９）を用いてPCRを行い、Peftu配列を含む断片を得た。PCR反応はPrimeSTAR HS polymeraseを用い、同酵素に付属のプロトコルに従って行った。
　また、pTWV228Ptac_ccrNXAを鋳型として、プライマーPeftu_xylXABCD_fw（配列番号６０）とPeftu_xylXABCD_rv（配列番号６１）を用いてPCRを行い、C. crescentusのxylXABCD配列を含む断片を得た。PCR反応にはPrimeSTAR GXL polymeraseを用い、同酵素に付属のプロトコルに従ってPCR反応を行った。
　続いて、前述で得られたPeftu断片とxylXABCDを含む断片を、PstIとBamHIで処理したpVK9と混合し、Clontech In-fusion HD Cloning Kitのプロトコルに従ってin-fusion反応を行った。pVK9は、pHSG299（タカラバイオ）のAvaII部位を平滑末端化し、pHK4(特開平05-007491)に含まれるコリネ型細菌内で自律複製可能な領域をBamHIおよびKpnIで切り出し平滑末端化した断片を挿入したシャトルベクターである（特開2007-97573、米国特許出願公開20050196846号）。前記in-fusion反応液でE. coli JM109を形質転換した。形質転換体はLB培地にカナマイシンを終濃度50 mg/Lとなるように添加した寒天培地で選抜した。得られた形質転換体より、目的のプラスミドpVK9Peftu_ccrNXAを取得した。
（２）NXA経路が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムによるＬ－グルタミン酸生産
　上記pVK9Peftu_ccrNXAで、電気パルス法（特開平2-207791）によりC. glutamicum ATCC13869株を形質転換した。pVK9Peftu_ccrNXAを導入した株は、CM-Dex培地にカナマイシンを終濃度25 mg/Lとなるように添加した寒天培地を使用して選抜した。また、対照株として、pVK9でC. glutamicum ATCC13869株を形質転換した株も同様の手法により選抜した。
　得られた形質転換株のキシロース資化能およびL-グルタミン酸生産能を、坂口フラスコを用いた培養を行うことにより検証した。カナマイシンを終濃度25 mg/Lとなるように添加したCM-Dex寒天培地にて、31.5℃で一昼夜培養した形質転換株の菌体を1/6プレート分かきとり、Glc培地20 mLを張り込んだ坂口フラスコに植菌し、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウム1 gを添加した後、31.5℃、120 rpmにて24時間振とう培養した。得られた培養液1 mLを、Xyl培地（ビオチン制限）20 mLを張り込んだ坂口フラスコに植菌し、予め乾熱滅菌しておいた炭酸カルシウム1 gを添加した後、31.5℃、120 rpmで73時間振とう培養を行った。結果を表９に示した。
　C. glutamicum ATCC13869株にpVK9を導入した株はXyl培地でほとんど増殖せず、L-グルタミン酸生産も観察されなかった。一方、C. glutamicum ATCC13869株にpVK9Peftu_ccrNXAを導入した株は、Xyl培地で増殖し、L-グルタミン酸を蓄積した。この結果から、コリネ型細菌にNXA経路を導入することにより、キシロース資化能が向上し、さらにキシロースからL-グルタミン酸が生成されることを見出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（３）xylD遺伝子発現再強化株の構築
　pVK9Peftu_ccrNXAを保持するC. glutamicum ATCC13869株では、キシロン酸が蓄積したことから、xylD遺伝子産物の活性が不足していることが推察された。そこで、pVK9Peftu_ccrNXAプラスミド上にxylD遺伝子をさらに1コピー導入することにより、xylD遺伝子が再強化されたNXA経路発現用プラスミドを構築することとした。
（４）xylD遺伝子発現用プラスミドpVS7PmsrA_xylDの構築
　msrA（peptide methionine sulfoxide reductase A）遺伝子のプロモーター配列（以下、「PmsrA」と記載する）の下流に、C. crescentusのxylD遺伝子を連結した配列を有するプラスミドを、Clontech In-Fusion Cloning HD Kitを利用して構築した。
　まず、C. glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型に、プライマーPmsrA(Pst)（配列番号６２）とPmsrAR（配列番号６３）を用いてPCRを行い、PmsrA配列を含む断片を得た。また、pTWV228Ptac_ccrNXAを鋳型として、プライマーPmsrA_xylD_fw（配列番号６４）とPeftu_xylXABCD_rvを用いてPCRを行い、C. crescentusのxylD遺伝子配列を含む断片を得た。PCR反応はPrimeSTAR HS polymeraseを用い、同酵素に付属のプロトコルに従って行った。
　続いて、前述で得られたPmsrA断片とxylD遺伝子を含む断片を、PstIとBamHIで処理したシャトルベクターpVS7（構築方法は以下に示す）と混合し、Clontech In-fusion HD Cloning Kitのプロトコルに従ってin-fusion反応を行った後、この反応液でE. coli JM109を形質転換した。形質転換体はLB培地にスペクチノマイシンを終濃度25 mg/Lとなるように添加した寒天培地で選抜した。得られた形質転換体より、目的のプラスミドpVS7PmsrA_xylDを取得した。
　pVS7はpVC7(特開2000-201692、EP1004671)のクロラムフェニコール耐性遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子に置換されたプラスミドである。スペクチノマイシン耐性遺伝子はバチルス ジェネチック ストック センター(BGSC)より市販されているエシェリヒア・コリECE101Ｅ株から、プラスミドpDG1726を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。pDG1726を鋳型として、プライマーSpcR-F（配列番号６５）とSpcR-R（配列番号６６）を用いてPCRによりスペクチノマイシン耐性遺伝子を増幅した。得られた遺伝子断片を、SmaI処理したpVC7と混合し、タカラバイオ株式会社のLigation Mix <Mighty Mix>のプロトコルに従ってライゲーション反応を行い、この反応液でE. coli JM109を形質転換した。形質転換体はLB培地にスペクチノマイシンを終濃度25 mg/Lとなるように添加した寒天培地で選抜した。得られた形質転換体より、pVC7にスペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されたpVC7-spcを取得した。さらに、pVC7-spcを鋳型として、プライマーspc(GTG start)-F（配列番号６７）とspc(stop)-R（配列番号６８）を用いてPCRを行い、スペクチノマイシン耐性遺伝子を増幅した。
　一方、pVC7を鋳型として、プライマーSpc-pVC7-Cm-F（配列番号６９）とSpc-pVC7-Cm-R（配列番号７０）を用いてPCRを行い、pVC7からクロラムフェニコール耐性遺伝子が除去されたDNA断片を得た。該DNA断片と、上記にてpVC7-spcより調製されたスペクチノマイシン耐性遺伝子のDNA断片とを混合し、Clontech In-fusion HD Cloning Kitのプロトコルに従ってin-fusion反応を行った後、この反応液でE. coli JM109を形質転換した。形質転換体はLB培地にスペクチノマイシンを終濃度25 mg/Lとなるように添加した寒天培地で選抜した。得られた形質転換体より、pVS7を取得した。
（５）xylD遺伝子再強化プラスミドpVK9Peftu_ccrNXA+Dの構築
　pVS7PmsrA_xylDを鋳型として、プライマーME_Spc_fw（配列番号７１）とME_Peftu_xylXABCD_rv（配列番号７２）を用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子（Spc）とPmsrA_xylDを含むDNA断片を増幅した。得られたDNA断片を、Epicentre社のEz-Tn5TMCustom Transposome Construction Kitのプロトコルに従い、in vitroでpVK9Peftu_ccrNXAに挿入し、E. coli DH5αを形質転換した。形質転換体はカナマイシンとスペクチノマイシンを終濃度でそれぞれ50 mg/L、25 mg/Lとなるように添加したLB寒天培地で選抜した。得られた形質転換体からプラスミドを抽出し、プラスミド上のSpc-PmsrA_xylD配列周辺の塩基配列を確認することにより、Spc-PmsrA_xylD配列の挿入箇所がPeftu_ccrNXA配列上ではないことが確認されたプラスミドをpVK9Peftu_ccrNXA+Dとした。
（６）xylD遺伝子が再強化されたNXA経路導入株のＬ－グルタミン酸生産
　電気パルス法にてC. glutamicum ATCC13869株にpVK9Peftu_ccrNXA+Dを導入し、カナマイシン25 mg/Lを含むCMDex寒天培地に塗布した。31.5℃にて培養後生育してきた株について、（２）と同様の方法でL-グルタミン酸生産能を検証した。その結果を表１０に示す。
　pVK9Peftu_ccrNXA+Dを保持する株では、pVK9Peftu_ccrNXAを保持する株と比較して、D-キシロン酸の蓄積量が少なく、一方で、より多くのL-グルタミン酸が蓄積された。このことから、xylD遺伝子を再強化することにより、より効率的にNXA経路を介してD-キシロースからL-グルタミン酸を生産させることができることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
〔実施例４〕
（１）NXA経路遺伝子の代替
　以上の実施例では、NXA経路が報告されている公知の細菌C. crescentusの遺伝子xylX、ccrxylA、ccrxylB、xylC、xylDを利用し、NXA経路を介してキシロースからグルタミン酸を生成できることを示した。以下の実施例ではC. crescentus以外の生物種からxylD、xylX、ccrxylAのホモログ遺伝子を取得し、C. crescentusの遺伝子と代替可能であるかどうかを検証した。遺伝子源として表１１に示す生物種を選択した。併せて各遺伝子のGene symbol（GenBank）を示した。また、表１２に各遺伝子の塩基配列及びそれらにコードされるアミノ酸配列の配列表における配列番号を示した。表１２中、「オリジナル」は天然型遺伝子の塩基配列を、「最適化後」は、E. coliのコドン出現頻度（codon usage）に併せてコドンを最適化した塩基配列を、各々示す。
　尚、以下の記載において、xylD、xylX、及びxylAの各遺伝子ホモログがコードする酵素を、各々XylD、XylX、XylAと記載することがある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
（２）XylD、XylX、XylA活性検出用プラスミドpTWVPtac_ccrNXA_ΔxylD_Km、pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylX_Km、pTWVPtac_ccrNXA_ΔccrxylA_Kmの構築
　Clontech In-Fusion Cloning Kitを利用し、構築を行った。
　まず、pTWVPtac_ccrNXA_Kmを鋳型とし、Ptac_xylXABC_F（配列番号１１１）とPtac_xylXABC_R（配列番号１１２）をプライマーとして、xylDを除くDNA断片をPCRにて増幅した。PCR産物をClontech In-fusion HD Cloning Kitのプロトコルに従ってIn-Fusion反応し、反応物でE. coli JM109株を形質転換し、形質転換体より目的のプラスミドpTWVPtac_ccrNXA_ΔxylD_Kmを取得した。
　pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylX_KmはPtac_xylABCD_F（配列番号１１３）とPtac_xylABCD_R（配列番号１１４）を、pTWVPtac_ccrNXA_ΔccrxylA_KmはPtac_xylXBCD_F（配列番号１１５）とPtac_xylXBCD_R（配列番号１１６）をプライマーとして、上記と同様の手法により構築した。
（３）XylD、XylX、XylA活性検出用パントエア・アナナティスの構築
　上記pTWVPtac_ccrNXA_ΔxylD_Kmで、エレクトロポレーション法によりP. ananatis NA1株を形質転換した。構築した株をP. ananatis NA2 ΔxylDとした。P. ananatis NA2 ΔxylDの培養には、LBGM9にカナマイシンを終濃度40 mg/L、テトラサイクリンを終濃度12.5 mg/Lとなるように添加したプレート培地を使用した。
　同様にpTWVPtac_ccrNXA_ΔxylX_KmあるいはpTWVPtac_ccrNXA_ΔccrxylA_KmでP. ananatis NA1株を形質転換し、P. ananatis NA2 ΔxylX株、P. ananatis NA2 ΔccrxylA株を構築した。
（４）xylD、xylX、xylAホモログ発現プラスミドの構築
　yjhG、yagF発現用プラスミドpSTV28-Ptac-yjhG-Ttrp、pSTV28-Ptac-yagF-Ttrpは以下のようにして作製した。
　pSTV28-Ptac-yjhG-Ttrpは、E. coli MG1655株のゲノムDNAを鋳型とし、yjhG_F（配列番号１１７）及びyjhG_R（配列番号１１８）をプライマーに用いたPCRによりyjhG断片を増幅し、SmaIで消化したpSTV28-Ptac-TtrpにIn-Fusion cloning法でクローニングすることで作製した。
　　pSTV28-Ptac-yagF-Ttrpは、yagF_F（配列番号１１９）及びyagF_R（配列番号１２０）をプライマーに用い、上記と同様の手法により作製した。
　xylD（Hse）発現用プラスミドpSTV28-Ptac-xylD(Hse)-Ttrpは、以下のようにして作製した。tacプロモーター、xylD(Hse)及びtrpターミネーターの配列を有するＤＮＡ断片（Ptac-xylD(Hse)-Ttrp）を合成し、EcoRVで消化したpUC57ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社から購入）に連結することにより、pUC57-Ptac-xylD(Hse)-Ttrpを得た。DNA断片を合成する際にE. coliでの発現に適するようコドン最適化を実施した。EcoRIとKpnIで各々消化したpSTV28とpUC57-Ptac-xylD(Hse)-Ttrpを等量混合し、ライゲーション反応後、JM109を形質転換し、Cm耐性が示されたコロニーよりプラスミドを抽出し、pSTV28-Ptac-xylD(Hse)-Ttrpを得た。
　xylD（Amis）、xylD（Aor）、xylX（Cne）、xylX（Zga）、xylX（Tco）、xylA（Abr）、ycbDの各々を発現するプラスミドpSTV28-Ptac-xylD(Amis)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylD(Aor)-Ttrp 、pSTV28-Ptac-xylX(Cne)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Zga)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Tco)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylA(Abr)-Ttrp、pSTV28-Ptac-ycbD-Ttrpも、同様の手法で作製した。ただし、YcbDについてはコドン最適化を実施していない。
　xylD（Atu）発現用プラスミドpSTV28-Ptac-xylD(Atu)-Ttrpは、以下のようにして作製した。tacプロモーター、xylD(Atu)及びtrpターミネーターの配列を有するＤＮＡ断片（Ptac-xylD(Atu)-Ttrp）を合成し、EcoRVで消化したpJET1.2ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社から購入）に連結することにより、pJET1.2-Ptac-xylD(Atu)-Ttrpを得た。DNA断片を合成する際にE. coliでの発現に適するようコドン最適化を実施した。EcoRIとKpnIで各々消化したpSTV28とpJET1.2-Ptac-xylD(Atu)-Ttrpを等量混合し、ライゲーション反応後、JM109を形質転換し、Cm耐性が示されたコロニーよりプラスミドを抽出し、pSTV28-Ptac-xylD(Atu)-Ttrpを得た。
　xylX（Atu）、xylA（Hbo）の各々を発現するプラスミドpSTV28-Ptac-xylX(Atu)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylA(Hbo)-Ttrpも同様の手法で作製した。
　xylX（Art）発現用プラスミドpSTV28-Ptac-xylX(Art)-Ttrpは、以下のようにして作製した。tacプロモーター、xylX(Art)及びtrpターミネーターの配列を有するＤＮＡ断片（Ptac-xylX(Art)-Ttrp）を合成し、EcoRVで消化したpCC1ベクター(Epicentre社より購入)に連結することにより、pCC1-Ptac-xylX(Art)-Ttrpを得た。DNA断片を合成する際にE. coliでの発現に適するようコドン最適化を実施した。EcoRIとKpnIで各々消化したpSTV28とpCC1-Ptac-xylX(Art)-Ttrpを等量混合し、ライゲーション反応後、JM109を形質転換し、Cm耐性が示されたコロニーよりプラスミドを抽出し、pSTV28-Ptac-xylX(Art)-Ttrpを得た。
（５）XylDホモログの活性検出
　pSTV28-Ptac-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylD-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylD(Atu)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylD(Hse)-Ttrp、pSTV28-Ptac-yjhG-Ttrp、pSTV28-Ptac-yagF-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylD(Amis)-TtrpあるいはpSTV28-Ptac-xylD(Aor)-Ttrpで、エレクトロポレーション法（米国特許6682912号参照）によりP. ananatis NA2 ΔxylD株を形質転換した。各形質転換株の培養には、LBGM9にカナマイシンを終濃度40 mg/L、テトラサイクリンを終濃度12.5 mg/L、クロラムフェニコールを終濃度25 mg/Lとなるように添加したプレート培地を使用した。
　薬剤を添加したLBGM9プレートにて、34℃で一晩培養した各形質転換株の菌体を1/6プレート分かきとり、MSII-SX培地5 mlを張り込んだ太試験管に植菌し、34℃、120 rpmにて48時間培養し、Ｌ－グルタミン酸（Glu）の蓄積量を測定した。結果を図５に示す。
　P. ananatis NA2 ΔxylDにpSTV28-Ptac-Ttrpを導入した株ではＬ－グルタミン酸蓄積量は6.9 g/Lであったのに対し、他の形質転換株では11.1 g/L～23.1 g/LのＬ－グルタミン酸が蓄積した。pSTV28-Ptac-Ttrpを導入した株ではキシロースからＬ－グルタミン酸がほとんど生成されず、他の形質転換株ではNXA経路を介してキシロースからＬ－グルタミン酸が生成されたと考えられた。すなわち、xylDはC. crescentus以外のいずれの生物種由来のxylDホモログでも代替可能であることが示された。
（６）XylXホモログの活性検出
　pSTV28-Ptac-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Art)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Atu)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Cne)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Zga)-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylX(Tco)-TtrpあるいはpSTV28-Ptac-xylX(Selo)-Ttrpで、エレクトロポレーション法によりP. ananatis NA2 ΔxylX株を形質転換した。各形質転換株の培養には、LBGM9にカナマイシンを終濃度40 mg/L、テトラサイクリンを終濃度12.5 mg/L、クロラムフェニコールを終濃度25 mg/Lとなるように添加したプレート培地を使用した。
　薬剤を添加したLBGM9プレートにて、34℃で一晩培養した各形質転換株の菌体を1/6プレート分かきとり、MSII-SX培地5 mlを張り込んだ太試験管に植菌し、34℃、120 rpmにて48時間培養し、Ｌ－グルタミン酸（Glu）の蓄積量を測定した。結果を図６に示す。
　P. ananatis NA2 ΔxylXにpSTV28-Ptac-Ttrpを導入した株ではＬ－グルタミン酸蓄積量は8.7 g/Lであったのに対し、他の形質転換株では20.5 g/L～27.8 g/LのＬ－グルタミン酸が蓄積した。pSTV28-Ptac-Ttrpを導入した株ではキシロースからＬ－グルタミン酸がほとんど生成されず、他の形質転換株ではNXA経路を介してキシロースからＬ－グルタミン酸が生成されたと考えられた。すなわち、xylXはC. crescentus以外のいずれの生物種由来のxylXホモログでも代替可能であることが示された。
（７）XylAホモログの活性検出
　pSTV28-Ptac-Ttrp、pSTV28-Ptac-ccrxylA-Ttrp、pSTV28-Ptac-ycbD-Ttrp、pSTV28-Ptac-xylA(Hbo)-TtrpあるいはpSTV28-Ptac-xylA(Abr)-Ttrpで、エレクトロポレーション法によりP. ananatis NA2 ΔccrxylA株を形質転換した。各形質転換株の培養には、LBGM9にカナマイシンを終濃度40 mg/L、テトラサイクリンを終濃度12.5 mg/L、クロラムフェニコールを終濃度25 mg/Lとなるように添加したプレート培地を使用した。
　薬剤を添加したLBGM9プレートにて、34℃で一晩培養した各形質転換株の菌体を1/6プレート分かきとり、MSII-SX培地5 mlを張り込んだ太試験管に植菌し、34℃、120 rpmにて48時間培養し、Ｌ－グルタミン酸（Glu）の蓄積量を測定した。結果を図７に示す。
　P. ananatis ΔccrxylAにpSTV28-Ptac-Ttrpを導入した株ではＬ－グルタミン酸蓄積量は1.0 g/Lであったのに対し、他の形質転換株では18.1 g/L～30.7 g/LのＬ－グルタミン酸が蓄積した。pSTV28-Ptac-Ttrpを導入した株ではキシロースからＬ－グルタミン酸がほとんど生成されず、他の形質転換株ではNXA経路を介してキシロースからＬ－グルタミン酸が生成されたと考えられた。すなわち、xylAはC. crescentus以外のいずれの生物種由来のccrxylAホモログでも代替可能であることが示された。
　本発明により、キシロース原料を用いて、発酵法により目的物質を効率よく製造することができる。

Claims (16)

  1. 　目的物質を生産する能力を有する細菌を、炭素源としてキシロースを含む培地で培養して、目的物質を該培地中に生成蓄積させ、該培地より目的物質を採取する、目的物質の製造方法であって、
    　前記目的物質は２－ケトグルタル酸又はその誘導体であり、
    　前記細菌はキシロースからキシロン酸を生成する能力を有し、かつ、キシロネートデヒドラターゼ活性、２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドラターゼ活性、及び、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を付与又は増強されたことを特徴とする方法。
  2. 　前記細菌は、キシロネートデヒドラターゼ、２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドラターゼ、及び、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを各々コードする遺伝子が発現可能な形態で導入されたことにより、これらの酵素活性が付与又は増強されたことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 　キシロネートデヒドラターゼ、２－ケト－３－デオキシキシロネートデヒドラターゼ、及び、２－ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、カウロバクター属、エシェリヒア属、アグロバクテリウム属、ヘルバスピリラム属、アクチノプラネス属、カプリアビダス属、シュードモナス属、ゾベリア、サーモバチルス属、アースロバクター属、アゾスピリラム属、ハロモナス属、バチルス属、又はアスペルギルス属に属する微生物由来である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記細菌は、下記のいずれかによりキシロースからキシロン酸を生成することができることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法：
    　（Ａ）キシロースデヒドロゲナーゼ活性または、キシロースデヒドロゲナーゼ及びキシロノラクトナーゼ活性を付与又は増強されている、又は、
    　（Ｂ）キシロースからキシロン酸を生成する反応を触媒し得るグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する。
  5. 　前記グルコースデヒドロゲナーゼはピロロキノリンキノンを補酵素とし、かつ、前記細菌は、ピロロキノリンキノン生産能を有するか、又は、ピロロキノリンキノンを含有する培地で培養されることにより、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記細菌は、キシロースデヒドロゲナーゼ、または、キシロースデヒドロゲナーゼ及びキシロノラクトナーゼを各々コードする遺伝子が発現可能な形態で導入されたことにより、キシロースからキシロン酸を生成することができる、請求項４に記載の方法。
  7. 　前記細菌は、さらに２－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が低下するように改変されたことを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記細菌は、さらにコハク酸デヒドロゲナーゼの活性が低下するように改変されたことを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記細菌が腸内細菌又はコリネ型細菌であることを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　前記細菌がパントエア属細菌であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記細菌がパントエア・アナナティスであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記細菌がエシェリヒア属細菌であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  13. 　前記細菌がエシェリヒア・コリであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記細菌がコリネバクテリウム属細菌であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
  15. 　前記細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムであることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記２－ケトグルタル酸誘導体が、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－オルニチン、Ｌ－プロリン、プトレッシン、及び、γ－アミノ酪酸からなる群より選択される物質である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
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