SE460792B - Metod foer framstaellning av tvaerbunden hyaluronsyragel, tvaerbunden gel framstaelld enligt denna metod, blandning av tvaerbunden hyaluronsyra gel med annan hydrofil polymer samt kompositioner som innehaaller denna gel - Google Patents

Description

»- 460 792 anges i exempel 4 nedan.

Enligt en aspekt av uppfinningen avser denna höggradigt sväll-_ da geler av tvärbunden hyaluronsyra.

Enligt en annan aspekt avser uppfinningen blandade tvärbundna geler av hyaluronsyra och andra hydrofila polymerer.

Enligt ännu en annan aspekt avser uppfinningen tvärbundna ge- iler av hyaluronsyra och andra polymerer som är fyllda med olika substanser.

Uppfinningen avser även tvärbundna geler av hyaluronsyra som innehåller substanser med låg molekylvikt vilka är kovalent bundna vid makromolekylerna.

Enligt ytterligare en annan aspekt avser uppfinningen olika preparat som innehåller tvärbundna hyaluronsyrageler.

'Uppfinningen avser slutligen metoder för framställning av -produkterna enligt uppfinningen. 7Föreliggande uppfinning grundar sig på iakttagelsen att di- Évinylsulfon (DVS) lätt reagerar med HA i alkaliska vatten- âlösnïngar vid rumstemperatur, d.v.s. cirka 200 C, varigenom ;de tillhandahåller tvärbundna HA-geler. Med beteckningen HA .menas häri hyaluronsyra och dess salter, såsom natrium-, ïkalium-, magnesium- och kalciumsalter etc. Dessa geler sväl- _ler i vatten och vattenhaltiga medier. Svällningsförhållandet beror på graden av tvärbindning av gelen. Det har visat sig 'att graden av tvärbindning kan regleras genom ändring av :flera faktorer, inklusive molekylvikten hos hyaluronsyran, :dess koncentration i reaktionsblandningen, alkalikoncentra~ ~tionen och förhållandet polymer/DVS. Reaktionen är mycket snabb och i många fall kan en stark gel erhållas inom några ,minuter. Svällningsförhållandet för dessa geler kan vara från V20 upp till 8000 och mer, beroende på reaktionsparametrarna. ~ z *”?n~ 460m Det har även visat sig att svällningsförhållandet hos tvär-W““ bundna HA-geler är väsentligt större än svällningsförhålland Et hos tvärbundna geler av andra polysackarider som erhållits vid samma reaktionsbetingelser. Detta kan troligen förklaras ge- nom de unika egenskaperna hos HA (i jämförelse med andra polysackarider) och dess vattenlösningar. Vi har funnit att en stor molekyl av HA i vatten bildar en mycket flexibel, lång godtycklig spiral, vilken tar upp en extrem volym i lösningen. Den specifika volymen hos en hydratiserad HA-mo- lekyl i en fysiologisk saltlösning är exempelvis cirka 2 til 6 x 103 ml/g. Detta innebär att i en vattenlösning av HA med låg koncentration inträffar ett steriskt exklusionsfenomen som väsentligt påverkar inte bara de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos lösningen utan även reaktionen mellan HA och substanser med låg molekylvikt. Med andra ord påverkar egenskaperna hos HA~lösningarna graden av tvärbindning och beteendet hos den tvärbundna gelen på ett sätt som är helt olikt vad som helst som inträffar med andra polysackarider.

Vi har även funnit att denna unika egenskap hos HA att ge yhöggradigt svällda tvärbundna geler kan användas för att :åstadkomma modifiering av egenskaperna hos tvärbundna geler, ,framställda av blandningar av HA och andra hydrofila polyme- Årer. Dessa polymerer inkluderar andra polysackarider, synte- tiska och naturliga, sàsom hydroxietylcellulosa, karboxi- metylcellulosa, xantangummi, kondroitinsulfat, heparin, pro- iteiner av olika slag, såsom kollagen, elastin, albumin, ¿en globulin etc., sulfaterade proteiner, såsom keratinsulfat och sulfaterade aminoglykosaminoglykaner, syntetiska vatten- *lösliga polymerer, såsom polyvinylalkohol och dess sampoly- imerisat, sampolymerisat av poly~(hydroxetyl)metakrylat och liknande. Man kan med andra ord använda vilken polymer som 'helst som är löslig i vatten eller alkaliska vattenlösningar och innehåller grupper som kan reagera med DVS, nämligen hydroxyl, amino eller sulfy-hydrylgrupper, för att erhålla höggradigt svällda tvärbundna blandade geler av HA. l 792 - ^ ii. 460 792 Vi har vidare funnit att användbara produkter lätt kan erhål-“ las genom att tvärbindningsreaktionen av HA genomföras i när- varo av substanser med låg molekylvikt, vilka innehåller reaktiva grupper av de nämnda typerna.

En annan typ av material enligt föreliggande uppfinning år en tvärbunden hydrofil gel som är fylld med olika i vatten olösliga substanser, inklusive kolväten, såsom vaselin; en olja eller ett fett, såsom bivax, kokosolja eller lanolin, pigment, såsom kaolin, järn(III)oxid; olösliga färgämnen, polymerer, såsom polyeten, polytetrafluoroeten etc.rI denna typ av produkt immobiliseras fina partiklar av ett fyllmedel i ett gelnätverk eller i vad vi kallar en "polymerbur".

Denna sistnämnda produkt kan vara mycket användbar för åt~ skilliga ändamål, vilka kommer att diskuteras närmare i det följande.

De förfaranden enligt vilka de här beskrivna produkterna erhållas kommer nu att beskrivas mer detaljerat.

För att erhålla en tvärbunden HA-gel löses ett prov av natriumhyaluronat eller hyaluronsyra från godtycklig källa .i utspädd alkalisk lösning. Molekylvikten hos HA kan vara ifrån 50 000 upp till 8 x lO6 och ännu högre. Molekylvikten ipåverkar reaktionen - ju högre molekylvikten är desto större 'är möjligheten att erhålla en tvärbunden gel.

Alkalikoncentrationen i reaktionsblandningen kan vara från 0,005 M till 0,5 M och högre. Den lägre gränsen dikteras av nödvändigheten att hålla mediets pH vid ett värde som inte E -är lägre än 9, och den övre gränsen genom hydrolys av HA i len alkalisk lösning. En minskning i alkalikoncentrationen , resulterar vanligen i geler med ett större svällningsför- ' § hållande, troligen på grund av att en liten mängd DVS deltar É i tvärbindningsreaktionen. I ~Koncentrationen av HA i utgångslösningen kan variera från Mugg-f. - 460 l vikt-% upp till 8 vikt-% och högre. När koncentrationen ligger under den lägre gränsen, kan en tvärbunden gel inte erhållas ens vid ett lågt HA/DVS-förhållande. När koncentra~ tionen är alltför hög blir lösningen så viskös, att det är svårt att hantera den. HA-koncentrationen påverkar svällnings- beteendet hos gelerna väsentligt (fig. l). Det visade sig, att formen för kurvan för svällningsförhållandet - HA-kon- centrationens beroende är i huvudsak densamma för olika 'HA/DVS-förhållanden men ju lägre detta förhållande är (d.v.s. ¿mer DVS i blandningen) ju mindre är svällningsförhållandet 'för den tvärbundna gelen vid samma koncentration av HAli utgångsblandningen.

Vi har funnit att HA/DVS i reaktionsblandningen är en annan parameter som lätt kan användas för att reglera svällnings- jförhållandet hos den tvärbundna BA-gelen. En ökning av för- 792 lhållandet resulterar i höggradigt svällda mjuka geler (sväll- 3 ïningsförhàllandet är cirka 4000 och högre), under det att :hårda och mindre svällda geler erhållas, när detta förhållan- T §ae minskas. HA/nvs-viktförhållanaet kan ligga mellan 1s=1 ¿och 1:5 och lägre. ÉTvärbindningsreaktionen genomföras vanligen vid rumstempera- štur, d.v.s. cirka 200 C, men den kan genomföras vid en lägre :eller högre temperatur, om så önskas. Man bör emellertid :hålla i minnet, att HA kan försämras relativt snabbt i alka~ Éliska lösningar vid förhöjda temperaturer och, om en sådan šförsämring inträffar, kan minskningen i molekylvikt påverka iegenskaperna hos de erhållna gelerna. ÉTvärbindningsreaktionen är relativt snabb och starka geler Ébildas vanligen inom flera minuter när HA~koncentrationen äär tillräckligt hög och HA/DVS~förhållandet'är lågt. Även vid élåg HA-koncentration i reaktionsblandningen börjar emellertid ígelbildningen vanligen vid 5 - 10 minuter efter tillsättning .av DVS. Vi har funnit att en timme i flertalet fall är till- firäcklig för att fullborda tvärbindningsreaktionen. x vän. ~ ...v '460 792 , Ett annat sätt att kontrollera svällningsförhållandet hos tvärbundna HA-geler innefattar tillsättning av neutralt salt till reaktionsblandningen. Vi har funnit att svällningsför- hållandet hos de geler, som erhållas i närvaro av vattenlös- liga neutrala salter, såsom kloriderna, sulfaterna, fosfa- terna och acetaterna av alkalimetaller, minskar med en ök- ning av saltkoncentrationen. Ett salt kan användas i en kon- centration upp till 20 vikt-% och högre, beroende på saltets egenskaper och dess effekt på lösligheten av HA i reaktions- Äblandningen. lFör att erhålla tvärbundna geler av andra hydrofila polymerer ikan man använda samma reaktionsbetingelser som för HA. Sväll- ningsförhållandet för dessa geler kan lätt kontrolleras ge- -nom iblandning av HA i gelstrukturen. När de blandade gelerna erhållas, kan sammansättningen hos polymerblandningen varierad inom ett brett intervall beroende på svällningsförhållandet hos den önskade tvärbundna gelen. Den föredragna halten av VHA i blandningen är från 5 till 95 vikt-%.

Tvärbundna geler av HA eller andra polymerer eller blandade Qtvärbundna geler, fyllda med inerta substanser, erhållas šgenom införlivning av dessa substanser i reaktionsblandningen gföre tillsättningen av DVS. Dessa inerta substanser är före- íträdesvis i vatten olösliga vätskor eller fasta substanser.

:Exempel på sådana substanser är vaselin och kaolin. För att àerhålla en fylld tvärbunden gel emulgerar eller dispergerar :man en vald substans (baserat på hänsynstagande till de §önskade egenskaperna hos gelen) i en alkalisk lösning av HA Éeller någon annan polymer eller blandning av HA med en annan ipolymer eller polymerer och DVS tillsättes till blandningen. ÉMängden DVS och de andra parametrarna vid reaktionen väljas Éberoende på de önskade egenskaperna hos gelen. Den relativa ëmängden fyllmedel i gelen kan variera inom ett brett inter- ïvall och ligger mellan l och 95 vikt-%, räknat på den totala lmängden av polymerer och fyllmedel, företrädesvis mellan 5 §@ch 90 vikt-s. f ä f i 1 l i ß Y I I i å š z Tvärbundna geler som innehåller substanser med låg molekyl-WWW vikt, såsom läkemedel, färgämnen och andra ämnen, kovalent bundna vid det makromolekylära nätverket erhållas företrädes- vis genom att de angivna substanserna iblandas i en lösning av HA eller HA och andra polymerer före tillsättningen av DVS. Ett exempel på en sådan substans är karminsyra, en av FDA godkänd substans för användning i livsmedel och läkeme- delspreparat.

Det är troligen närvaron av en glykosidisk molekyldel av karminsyramolekylen som deltar i tvärbindningsreaktionen med DVS. Givetvis kan ett stort antal substanser användas för erhållande av en modifierad tvärbunden gel av det här slaget.

Det enda väsentliga kännetecknet hos dessa substanser är att de innehåller kemiska grupper med aktiva väteatomer som är reaktiva i förhållande till DVS. Mängden av sådana substanser med låg molekylvikt, som kan användas vid reaktionen, beror tpå den önskade halten av denna substans i galen. Denna mängd § spå polymerhalten i gelen, företrädesvis 5 till 90 vikt-%. šßftersom det är känt att HA är en biologiskt tolererbar po- Élymer såtillvida att den inte förorsakar något immunsvar Éeller någon annan typ av reaktion då den införes i en män- ÉniskokrOPP: kan de.tvärbundna HA-gelerna användas för olika 'medicinska ändamål. De tvärbundna geler som modifierats med :andra polymerer eller substanser med låg molekylvikt kan an- ¿nenter vilka kvarhåller och avger vatten i dessa preparat. äpelvis funnit att heparin som införts i en tvärbunden HA-gel :bibehåller sin antitrombogena verkan. kan ligga inom intervallet från l till 99 vikt-%, beräknat É Den tvärbundna hyaluronsyra och de blandade geler som erhål- lits enligt uppfinningen kan användas för många ändamål. Vi har funnit att dessa i hög grad svällda geler är mycket använd+ bara i kosmetiska preparat och de kan betraktas som kompo- vändas som organ för avgivning av läkemedel. Vid har exem- 4sdd792 v 1"* ' "' ^ Kàhäkínfšnlšmní 460 792 Vi har även funnit att tvärbundna geler av HA kan sänka has-~~ tigheten för frigöringen av en substans med låg molekylvikt som är dispergerad däri men inte kovalent bunden vid gelens makromolekylära matris.

Den tvärbundna hyaluronsyran (ensam eller sampolymeriserad med andra polyanjoniska eller neutrala polymerer) bildar en molekylär bur. I denna bur kan hydrofila eller hydrofoba mo- lekyler med olika farmakologiska eller biologiska effekter dispergeras. Sålunda utgör buren en depå för dessa substan- ser med olika molekylstorlek. De substanser som ingår i den molekylära buren avges till omgivningen genom diffusion.

Avgivningsprocessen kontrolleras genom sådana faktorer som Qexklusionsvolymeffekten och porstorleken hos den molekylära buren och genom den ömsesidiga molekylära verkan mellan det _polymera nätverket och den däri ingående substansen. Den mo- ilekylära buren bildar sålunda en depå för kontrollerad ad- ministration av läkemedel eller andra substanser till huden öeller andra vävnader.

:Det finns en ytterligare egenskap hos de tvärbundna HA-ge1er- :na som gör dem potentiellt mycket användbara som organ för kavgivning av läkemedel. Svällningsförhållandet mellan dessa Ågeler i vatten beror i huvudsak på saltkoncentrationen i šmediet och minskar flera gånger med en ökning i saltkoncent- §ration. Detta innebär att en gel som svällt i vatten drar šihop sig väsentligt då den införas i kroppen (på grund av den Énormala salthalten i kroppsvätskorna och -vävnaderna) och gavger sålunda sitt innehåll, d.v.s. ett införlivat läkemedel, Étill kroppsvävnaden.

¿De tvärbundna gelerna som fyllts med olika substanser kan Qäven användas i kosmetiska preparat. En gel med däri ingående 1vaselin ger exempelvis alla fördelarna med användning av vase-I lin i kosmetiska preparat utan den obehagliga feta känsla _som vanligen iakttas hos vaselinhaltiga preparat. i š I i 1 3 É f s s i i i r i , « 1 I r :Föreliggande uppfinning beskrives mer detaljerat i följandewwf exempel, i vilka alla delar är viktdelar såvida inte något.anf: nat särskilt angivits. Dessa exempel anges endast för att åskådliggöra uppfinningen och är inte avsedda att begränsa uppfinningen såsom denna beskrives i patentkraven.

Exempel l a Detta exempel åskådliggör effekten av varierande HA-molekyl- vikt på tvärbindningsreaktionen. '0,34l0 g natriumhyaluronat som erhållits från tuppkammar .(gränsviskositet i 0,15 M lösning av NaCl/Q /3850, molekyl- vikt cirka 2,5 x 106) blandades med s,1s4o g 0,2 M Neon» lösning och gav en 4-viktprocentig lösning efter omröring i V30 minuter. Sedan rördes 0,072l g DVS in i lösningen. Vikt- förhållandet HA/DVS var cirka 4,7. En stark gel bildades inom cirka l5 minuter. Gelen lämnades l timme och sattes psedan till en liter destillerat vatten. Gelen fick svälla i ivatten över natten. Den bröts sedan till små partiklar genom :kraftig omröring i vatten. Gelpartiklarna frånfiltrerades och tvättades flera gånger med vatten. Färglösa, vattenklara 460 792 i k 2 ípartiklar erhölls. För bestämning av gelens svällningsförhål- É šlande centrifugerades ett prov som vägde cirka l g i ett iglasfilter vid ett varvtal av 3000 per minut under två timmar.

§De partiklar som fanns kvar på filtret hydrolyserades sedan šmed 2ml lN HZSO4-lösning under tre timmar vid 95 - 98° C. ïDen erhållna klara lösningen neutraliserades efter kylning :med 2 ml lN Na0H-lösning och glukuronsyrahalten bestämdes §enligt karbazolmetoden (An Automated Method For The Determina- :tion Of Hexuronic Acids, Analytical Biochemistry, 2, 517-558 Ä/1965/). HA~halten i utgångsgelen beräknades och svällnings- :förhållandet uttrycktes som 100//HA/%, vari /HA/% är en pro- Écent HA i den svällda gelen. ' 1 < :Den erhållna gelens svällningsförhållande i vatten var 820. íExemplet upprepades med undantag av att lösningen av HA i :alkali hölls vid rumstëmperatur 24 timmar. Detta ledde till i r i 460 792 A10 en HA-hydrolys. Gränsviskositeten /q/ hos polymeren var 10647 vilket motsvarade en molekylvikt av cirka 0,5 x 106. En tvär- bunden gel kunde inte erhållas från denna polymer vid det ovan använda HA/DVS-förhållandet.

Exemplet med försämrad HA upprepades men det använda HA/DVS- förhållandet var cirka 2. En tvärbunden gel erhölls som hade ett svällningsförhållande i vatten av 2910.

Exemgel 2 1Det här exemplet åskådliggör alkalikoncentrationens effekt på tvärbindningen av HA.

Ett prov av HA med en molekylvikt av cirka 3 x 106 löstes i en beräknad mängd av 0,2 M Na0H-lösning och gav en 4-prócen- tig viskös lösning, som försattes med DVS i en mängd som tillhandahöll ett HA/DVS-förhållande av cirka 5:1. Tvärbind- Vningen och behandlingen av gelen genomfördes på det sätt som :beskrivit i föregående exempel. Gelens svällningsförhållande É vi vatten var 990. fExemplet upprepades men alkalikoncentrationen var 0,01 M. ÉEn gel erhölls med ett svällningsförhàllande i vatten av í3640. En minskning av alkalikoncentrationen i reaktions- iblandningen resulterar sålunda i en gel med väsentligt större Ésvällning 1 vatten.

:ExemEel 3 šDet här exemplet åskådliggör effekten av en varierande HA- ïkoncentration i utgångsblandningen på svällningsbeteendet :hos den erhållna gelen. A 'Åtta lösningar av natriumhyaluronat i 0,2 M natriumhydroxid- lösning bereddes varvid HA-koncentrationen var 2,0, 3,0, 2,5; lösning försattes med en beräknad mängd av DVS så att vikt- förhållandet HA/DVS blev cirka 1 (molförhållande cirka 0,33). 1 Ešudi. _ _.. ,V...,._\,....> .u . ll De tvärbundna gelerna erhölls på det sätt som beskrivits i ""“ föregående exempel och behandlas i enlighet därmed. Sväll- ningsförhållandet bestämdes för varje prov och angavs gra- fiskt som en funktion av utgångskoncentrationen av HA. Re- sultaten visas i fig. 1.

Exempel 4 Det här exemplet åskådliggör effekten av ett varierande HA/DVS-förhållande på den erhållna gelens svällningsbeteende.

Sex lösningar av natriumhyaluronat i 0,2 M natriumhydroxid- lösning bereddes med en koncentration av 4,0 vikt-%. Varje lösning försattes med en beräknad mängd DVS så att följande HA/DVS-förhållanden erhölls: 0,2, 0:3: 0,5» 1,0, 1,5 0Ch 2,0 mol per mol. De tvärbundna gelerna erhölls och behandlades på samma sätt som beskrivits i föregående exempel. Sväll- ningsförhållandet bestämdes för varje prov och angavs gra- fiskt som en funktion av HA/DVS-förhållandet i reaktions- ïblandningen. Resultaten visas i fig. 2.

WflmmQ§l=5 Det:&är exemplet åskådliggör effekten av mæürfiumkfioriä i ¿reaktionsblandningen på svällningsförhâïlandst*hosfdsn tvär- šbundna galen.

;Två prover av den tvärbundna HA-galen bereddes med använd- :ning av det ovan beskrivna förfarandet. Natriumhyaluronat- j 'koncentrationen i 0,2 M natriumhydroxid var 4 vikt-%. HA/DVS-, }förhållandet var cirka 5:1 och reaktionstiden l timme. Den :andra reaktionsblandningen försattes med natriumklorid i en lsådan mängd att saltkoncentrationen blev 1,0 M. Svällnings- Éförhållandet hos den första gelen var 2380, under det att f äden gel som erhölls i närvaro av salt hade ett svällningsför- :hållande i vatten av 650. 460 792 460 792 12 Exemgel 6 Det här exemplet åskådliggör tvärbindningen av hydroxietyl- cellulosa me: användning av DVS.

O,43l2 g lufttorr hydroxietylcellulosa (Cellosize QP-l00O0O(3, Union Carbide) löstes under omröring i 10,3 g 0,2 N natrium- hydroxid för att ge en 4-viktprocentig lösning. 0,0855 g DVS rördes in i denna lösning (viktförhållandet polymer/DVS var cirka 5:1) och blandningen fick stå en timme vid rums- temperatur. En tvärbunden gel erhölls som bearbetades på 'samma sätt som i exempel l. För bestämning av polymerkon- centrationen i gelen och således svällningsförhållandet in- fördes ett vägt prov av gelen i aceton, hölls över natten, _tvättades flera gånger med aceton och torkades i en vakuum- ugn vid 500 C till konstant vikt. Den erhållna gelens sväll- ningsförhållande var 43, vilket är väsentligt mindre än för tvärbunden HA-gel som erhållits vid samma reaktionsbetingelserï Exemgel 7 ,Det här exemplet åskådliggör tvärbindningen av xantangummi :med användning av DVS. ÉO,4935 g lufttorrt xantangummi (Kelzan(EëYKelco) löstes i 11,3 g o,2 M natriumhyaroxlaiösnlng för att ge en"4-vikt- procentig lösning. Denna lösning försattes med 0,07l8 g DVS ¿(viktförhâllandet polymer/DVS var cirka 7:1). Blandningen :hölls vid rumstemperatur en timme. Den slutligen erhållna :tvärbundna gelen infördes i en stor volym vatten, lämnades :att svälla över natten och bröts till små bitar, vilka tvät- Ãtades mycket väl med vatten.

:Gelens svällningsförhållande, bestämt enligt viktmetoden :som beskrivits i föregående exempel, var 526, vilket är vä- sentligt mindre än för tvärbunden HA-gel som erhållits vid samma reaktionsbetingelser. 4en 792 13 Exemgel 8 Det här exemplet åskådliggör tvärbindningen av en katjonisk vattenlöslig cellulosapolymer med användning av DVS. 0,S483 g av en katjonisk cellulosapolymer som erhållits ge- nom kemisk modifiering av hydroxietylcellulosa (Polymer Ucare.flRGâ Union Carbide) löstes i l3,7l g 0,2 M natrium- hydroxidlösning och gav en 4-viktprocentig lösning, som för- sattes med 0,0849 9 DVS (förhållandet polymer/DVS var cirka 6,5:IY. Rsaktionsblanäningen fick stå en timme vid rnmstemw peratur och den erhållna gelen bearbetades och analyserades såsom beskrivits i det föregående exemplet. Gelens sväll- ningsförhållande i vatten var 386, vilket är väsentligt mindre: än svällningsförhållandet för en tvärbunden HA-gel som er- hållits vid samma reaktionsbetingelser.

Exemgel 9 fDet här exemplet åskådliggör tvärbindningen av karboximetyl- :cellulosa med användning av DVS. :0,4703 g karboximetylcellulosa-natriumsalt (9H 4F, Hercules) löstes i 11,76 g 0,2 M NaOH och gav en 4-viktprocentig lös- ning som försattes med 0,065l g DVS (polymer/DVS-förhållan- det var cirka 7:1). Reaktionsblandningen hölls en timme vid šrumstemperatur och den erhållna gelen bearbetades och analy- serades på samma sätt som beskrivits i det föregående exemp- let. Svällningsförhållandet i vatten var 893, vilket är mer än de som erhålles för andra cellulosapolymerer men mindre än för tvärbunden HA-gel.

¿ Exemgel 10 ~ 13 hessa exemçel åskådliggör hlendade tvärbundna geler som fram-, 'ställts av HA och karboximetylcellulosa och effekten av HA- halten på gelernas svällningsförhållande.

§I varje exempel löstes natriumhyaluronat och karboximetyl- .se . føsflïfi “'“**“Wía= “ = *ü 46o 792 14 cellulosa 9H4F i 0,2 M natriumhydroxidlösning i sådana mängder att man fick specifika förhållanden mellan de båda polymerer- na. I samtliga fall var den totala polymerkoncentrationen 4 vikt-% och polymer/DVS~förhållandet var cirka 5:1. Gelerna 3 erhölls och bearbetades på ovan beskrivet sätt. Polymerhal- ten i gelerna bestämdes på i exempel l beskrivet sätt, med undantag av att hexosaminkoncentrationen (i stället för glukoronsyra) bestämdes enligt en känd metod (A Rapid Proce- rdurefor the Estimation of Amino Sugars on a Micro Scale, Analytical Biochemistry 15, l67-171 /1966/) i hydrolysatet.

Polymerhalten beräknades från HA-koncentrationen och förhål- landet mellan de båda polymererna. _ É HA-halt 1 utgångs- svallqingsförhåilanae § blandningen, vikt-% i vatten 1 I :exempel 10 70 8196 'exempel ll 50 6757 i :exempel 12 20 lll7 ; ¿exempel 13 0 623 É Såsom framgår av dessa data resulterar en ökning i HA-halten i utgångsblandningen i en ökning i svällningsförhållandet hos de erhållna gelerna.

Exemgel 14 Det här exemplet åskådliggör blandade tvärbundna geler som erhållits av HA och kollagen. 4 =O,253l g torrt natriumhyaluronat löstes i 2,5 ml 0,1 M Énatriumhydroxidlösning. 0,063 g kollagen som erhållits från íhuman navelsträng löstes i 2,3 ml O,l M ättiksyra och de :båda lösningarna kombinerades. Den totala polymerkoncentra- i âtionen var 6 vikt-% och viktförhållandet HA/kollagen var W j fcirka 4:1. 0,05 g torr RCl löstes i den blandade lösningen * :och DVS rördes in i reaktionsblandningen i en mängd som gav fett förhållande polymer /DVS av cirka 5:1. Reaktionsbland- » wwWMqwW,-~«yww~ '1- 15 ningen hölls vid rumstemperatur en timme och den erhållna gelen behandlades på ovan beskrivet sätt. Polymerhalten i den svällda gelen beräknades från HA-halten, som bestämdes genom glukuronsyraanalys. En stark och elastisk gel erhölls som hade ett svällningsförhållande i vatten av 321.

/ Exempel l5 < Det här exemplet åskådliggör en blandad tvärbdšden HA-kollagen- gel med en högre halt kollagen och ett lägre s ällningsför~ .hållande än den gel som beskrivits i exempel 14.

O,2544 g natriumhyaluronat löstes i 3,5 ml 0,2 M natrium- hydroxidlösning. 0,ll92 g kollagen som erhållits från human navelsträng löstes i 1,5 ml 0,2 M ättiksyralösning och lös- ningarna kombinerades. Den totala polymerkoncentrationen var 7,5 vikt-% och viktförhållandet HA/kollagen var cirka 2:1. 0,05 g natriumklorid löstes i den blandade lösningen som försattes med 0,ll89 g DVS och sålunda gav ett viktför- hållande polymer/DVS av cirka 3:1. Gelen erhölls och bearbe- tades på det i föregående exempel beskrivna sättet. En stark 'gel erhölls med svällningsförhållandet 35.

Exempel 16 äDet här exemplet åskådliggör en blandad tvärbunden gel av V fHA och heparin. Ä0,2968 g torrt natriumhyaluronat löstes i 6,92 g 0,2 M ínatriumhydroxidlösning och gav en 4-viktprocentig lösning, ísom försattes med 0,0503 g heparin. Heparinhalten, beräknad ipå basis av den totala mängden polymerer, var 14,5 vikt-%. :0,0590 g DVS rördes in i blandningen. Reaktionen genomfördes íunder en timme vid rumstemperatur. Den erhållna gelen bear- I 'betades som beskrivits i föregående exempel. Svällningsför- hållandet hos gelen var 625. . . . ___, åwrqspwæ *wflwwrvpwywc m., 4eo 792L Exempel 17 Det här exemplet åskådliggör en tvärbunden hydroxietylcellu- losagel fylld med vaselin.

O,5292 g torr hydroxietylcellulosa löstes i 10,58 g 1 M nat- riumhydroxidlösning och 1,058 g vit vaselin rördes in i lösningen. Vaselin/polymerförhållandet var cirka 2. En lös- ning av 0,l77l g DVS i 1,0 g 1 M natriumhydroxidlösning sat- tes till emulsionen under kraftig omröring. Reaktionsbland- ningen lämnades en timme vid rumstemperatur och den erhållna gelen behandlades på det sätt som beskrivits i ovanstående exempel. För bestämning av vaselinhalten i gelen kokades ett gelprov med 2 ml l N H2SO4 3 timmar vid 95° C. Sedan tillsattes 2 ml 1 N NaOH till blandningen och därefter 4.ml ^xy1en för extraktion av vaselinen. Extraktet torkades i vakuum och återstoden vägdes. Den beräknade vaselinhalten i gelen var 6 vikt-%.

;ExemEe1 18 3Det här exemplet åskådliggör en blandad HA-karboximetyl- lcellulosagel fylld med vaselin. §0,l830 g torrt natriumhyaluronat och samma mängd karboxi- imetylcellulosa löstes i 9,1 g 0,2 N natriumhydroxidlösning och gav en 4-viktprocentig lösning av polymer. 0,3660 g vaselin rördes in i lösningen och 0,0730 DVS sattes till den erhållna emulsionen under kraftig omröring. Polymer/DVS- 'förhållandet var cirka 5:1. Reaktionsblandningen lämnades en timme vid rumstemperatur. Den erhållna gelen bearbetades på det sätt som beskrivits i det föregående exemplet. Sväll- Éningsförhållandet hos gelen, bestämt genom hexosaminhalt, 'var 738 och vaselinhalten, bestämd såsom i föregående exem- pel, var 0,1 vikt-%.

»Exempel 19 'Det här exemplet åskådliggör en tvärbunden HA-gel, fylld med 1 lexempel med en HA-koncentration i 0,2 M NaOH av 4 vikt-%; 17 kaolin. 0,2700 g torrt natriumhyaluronat löstes i en mängd 0,2 N natriumhydroxidlösning som var tillräcklig för att en 4-viktprocentig lösning av polymeren skulle erhållas. 0,5400 g kaolin rördes in i lösningen. 0,0540 g DVS sattes till suspensionen och reaktionsblandningen lämnades en timme vid rumstemperatur. Den bildade gelen fick svälla i en stor volym vatten. Den höggradigt svällda gelen bröts till små partiklar genom att tvingas genom en spruta med en nål. Par- tiklarna tvättades väl med vatten. Mjölkvita, höggradigt svällda partiklar erhölls. Koncentrationen av fast material i gelen var 0,064 vikt-%.

Exempel 20 Det här exemplet åskådliggör en tvärbunden HA-gel som inne- håller karminsyra, kovalent bunden vid det makromolekylära ~nätverket. ,0,20 g torrt natriumhyaluronat och 0,04 g karminsyra löstes i 5,0 ml 0,2 M natriumhydroxidlösning och gav en cirka }4~viktprocentig lösning av polymer. 0,40 g DVS sattes till :lösningen (polymer/DVS-förhållandet var 1:2) och blandningen ílämnades en timme vid rumstemperatur. Den erhållna gelen Äbearbetades såsom beskrivits i föregående exempel.

,Rödfärgade genomsynliga gelpartiklar erhölls och färgen för- fsvann inte ens efter omsorgsfull tvättning med vatten. Sväll- ningsförhållandet i vatten, bestämt enligt viktmetoden, var jll5.

:Exempel 2l :Det här exemplet åskådliggör effekten av saltkoncentration i vatten på svällningsbeteendet hos en tvärbunden HA-gel.

En tvärbunden HA-gel erhölls såsom beskrivits i föregående 4601792 i 1 Å í å | I l l l å l z 'v __-.. l 460 792 18 HA/DVS-förhållande 5:1, vid rumstemperatur en timme. Gelpar- tiklarna hälldes i vatten och en vattenlösning av natrium- klorid med olika koncentrationer och svällningsförhållandena bestämdes. Följande resultat erhölls: NaCl-koncentration, M svällningsförhållande vatten 990 0,05 413 0,15 384 0,50 _ 219 1,00 176 Exempel 22 Det här exemplet åskådliggör den biologiska aktiviteten hos en blandad_tvärbunden HA-heparingel.

.Fina partiklar av den blandade tvärbundna HA-heparingelen som framställts enligt exempel l6 blandades med normal human plasma i mängder som gav koncentrationer av tvärbunden HA ¿av 0,01, 0,02 och 0,04 % och provernas koaguleringstid öka~ ide 1,4, 2,8 respektive 5,0 gånger. Identiska konoentrationer- lev tvårbnndna gelpartiklar utan heparin hade inte någon ef- Qfekt på koaguleringstiden.

¿Dessa data visar att heparin inte förlorar sin förmåga att ïhämma crombinkatalyseraa fibrinbiianing när aan införlivas :i en tvärbunden gelstruktur. §§šÉEEÉÄ_åå ÄDet här exemplet åskådliggör en produkt som innehåller tvär- šbundna HA-gelpartiklar och är användbar för kosmetiska pre- äparat.

:En tvärbunden HA-gel bereddes på det i exempel l beskrivna sättet vid följande reaktionsbetingelser: HA-koncentration 3,0 vikt-%, natriumhydroxidkoncentration 0,2 M, HA/DVS-för- É . viktdelar: ingredienser blandning blandning blandning 1 2 3 tvärbunden gel 90 80 75 Hyalærm ® (l-procentig lösning av natrium- i hyaluronat) 5 2 14 É Polyox ® l-procentig i I lösning i vatten 5 4 ll ívatten ~ 14 - Alla dessa preparat gav intryck av att vara homogena viskösa 'vätskor även om de var heterogena på grund av ingrediensernas pegenskaper. Då de anbringades på huden gav de. en mycket -mjuk, silkig känsla.

:Exempel 24 460 792 19 hållande cirka 3:1, rumstemperatur, tid en timme. Gelen fick ' svälla i en stor volym vatten över natten och bröts sedan sönder till små partiklar genom att tvingas genom en spruta med en nål (gauge l8~l/2) och sedan genom en spruta med en nål (gauge 25-l/2). Partiklarna tvättades väl med vatten. E Optiskt klara, färglösa partiklar erhölls. Gelens svällnings- förhållande var l980. HA-koncentrationen i de filtrerade gel~ partiklarna var 0,025 vikt-%. Dessa partiklar användes i blandningar med polyetenoxid med hög molekylvikt (Polyox:G9 Coagulant, Union Carbide) och lösligt natriumhyaluronat (Hyalderm ®, Biomatrix, Inc.) med följande sammansättning: f Ä i | | I l \ | i 'x l | iDet här exemplet åskådliggör en fukttillförande ögonkräm i I I ísom innehåller en tvärbunden HA-gel enligt uppfinningen. å ' 1. š i I å I .i -._.._,.____ I > - 'iv YÉEÉR *F 460 792 20 \ vikt-% A. Carbopol®940 (B.F. Goodrlch) 0,4 blandning nr 3 (exempel 23) 10,0 vatten 83,3 AB. Volpo® -3 (Groda, Inc.) 1,0 Volpo -5 (Croda, Inc.) 0,5 Solulan®C-24 (Amerchol Co.) 1,8 Roban gg 1,0 CrodamolC)PMP (Groda, Inc.) 0,5 GlucmnC)E~l0 (Americhol) “ 0,7 konserveringsmedel 0,3 C. trietanolamin 0,4 _ doftämne » 0,1 !Detta preparat framställes i separata steg på följande sätt: Del A i blandningen bereddes genom dispergering av Carbopol @Di.vatten och följande omröring i de andra kompo- nenterna. Alla komponenterna i del B blandades tillsammans voch uppvärmdes till 70° C. Delarna A och B komblnerades :sedan och trietanolaminen och doftämnet tillsattes. Den er- vhållna krämen var stabil och slät och hade goda fukttillfö- drande egenskaper och en utmärkt känsla på huden.

¿Exempel 25 §Det här exemplet åskådliggör användningen av den med §vaselin fyllda tvärbundna gelen i en handkräm. 460 792 21 dvikt-% A. Carbopolaë 0,25 karboximetylcellulosa 9H4F, 1-procentig vattenlösning 2,00 produkt enligt exempel 18 60,00 vatten ' 36,70 B. Robane QÖ 0,20 Cochin ® 0,10 konserveringsmedel 0,30 C. trietanølamin 0,25 doftämne 0,20 Det här preparatet framställdes på samma sätt som beskrivits É Ai föregående exempel. Den erhållna lotiønen hade utmärkta 'fukttillförande egenskaper och gav inte fet känsla på huden. Éserna identifieras på följande sätt: * Solulan ® C-24 ïCrodamol()PMP í Glucam ® E-l0 i 1 Oleth-5 (polyetylenglykoleter av oleylalkohol) Oleth-3 (polyetylenglykoleter av oleylalkohol) Choleth-24 (polyetylenglykol- eter av kolesterol) (propoxylerat myristylpropionat) PPG-3 myristyleterpropionat metyl~gluceth-10 (polyetylen- glykoleter av metylglukos) rue.. __, i ._..ll_ ___ 460 792 22 Exemgel 26 Det här exemplet åskådliggör den långsamma frigöringen av en substans med låg molekylvikt som är dispergerad i en matris av tvärbunden hyaluronsyra.

I det här försöket användes en med radioaktiv isotop märkt eubstans. hydroxitryptamin-binoxolat. 5-/1,2-3H(N)/~. 5 /ul av en 40 /iM lösning av substansen blandades med 5 /al tvärbundna HA-gelpartiklar (Ha-koncentrationen i gelen 0,131 %) och vatten. Blandningarna infördes i dialysrör och dialyserades mot 0,15 M NaCl~lösning under 24 timmar. För blandningen med den märkta substansen och den tvärbundna galen lämnades 54 % av utgångsmängden av det märkta materia- let i dialysröret. Under det att endast lO~% fanns kvar för vattenlësningen. Detta visar att den tvärbundna gelen av HA minskar hastigheten för frigöring av substansen med låg molekylvikt med en faktor av mer än 5 gånger. variationer och modifikationer kan givetvis göras utan att ,man fràngår idén och ramen för uppfinningen.

Claims (30)

ii 4eo 192 23 PATENTKRAV
1. l. Metod för framställning av en tvärbunden gel av hyaluron- syra, klä n n e t e c k n a d av att natriumhyaluronat i en utspädd alkalisk vattenlösning vid ett pH, som inte är lägre än cirka 9, underkastas en tvärbindningsreaktion med divinylsulfon vid cirka120°C, varvid viktförhållandet mellan natriumhyaluronat och divinylsulfon är från l5:l till l:5.
2. 2. Metod enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a d av att natriumhyaluronatet har en molekylvikt av cirka 50 000 till cirka s x 106.
3. 3. Metod enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k,n a d av att koncentrationen av natriumhyaluronat i reaktionsbland- ningen är l - 8 vikt-%.
4. 4. Metod enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a d av att den dessutom innefattar tillsättning av en alkali~ metallklorid, -sulfat, -fosfat eller -acetat till reaktions- blandningen i en mängd som är tillräcklig för att en kon- centration av cirka 20 vikt-% skall uppnås i blandningen.
5. 5. Metod för framställning av en blandad tvärbunden gel av hyaluronsyra och minst en annan hydrofil polymer med en funktionell grupp, som har förmåga att reagera med_divinylf sulfon, k ä nin e t e c k n a d av att en blandning av natriumhyaluronat och nämnda andra hydrofila polymer i en utspädd alkalisk vattenlösning vid ett pH, som inte är lägre än cirka 9, underkastas en tvärbindningsreaktion med divinyl- sulfon vid cirka 20°C, varvid viktförhållandet mellan natriumhyaluronat och divinylsulfon är från l5:l till l:5.
6. 6. Metod enligt patentkravet 5, k ä n n e t e c k n a d av att den andra hydrofila polymeren är en naturlig eller syntetisk polysaokarid, vald ur den grupp som består av hydroxietylcellulosa, karboximetylcellulosa, xantangummi, 460» 792 24 kondroitinsulfat och heparin, ett protein valt ur den grupp som består av kollagen, elastin, albumin, ett globulin, keratinsulfat, en sulfaterad aminoglukosaminoglykan och en syntetisk vattenlöslig polymer.
7. 7. _Metod enligt patentkravet 5, k ä n n e t e c k n a d av att natriumhyaluronatet har en molekylvikt av cirka 50 000 _ . 6 till cirka 8 x 10 .
8. 8. Metod enligt patentkravet 5, k ä n n e t e c k n a d av att den kombinerade koncentrationen av natriumhyaluronat och de andra hydrofila polymererna i reaktionsblandningen är l till 8 vikt-% och att natriumhyaluronatet utgör mellan 5 och 95 % av den totala vikten,
9. 9. Metod enligt patentkravet 5, k ä n n e t e c k n a d av att den innefattar tillsättning av en alkalimetallklorid, -sulfat, -fosfat eller -acetat till reaktionsblandningen i en mängd som är tillräcklig för att en koncentration av upp till \ cirka 20 vikt-% skall uppnås i blandningen. _ g
10. 10. Metod för framställning av en tvärbunden gel av hyaluron- syra eller en blandad tvärbunden gel av hyaluronsyra och minst en annan hydrofil polymer med en funktionell grupp, som har förmåga att reagera med divinylsulfon, varvid endera av dessa dessutom innehåller en inert, i vatten olöslig substans, k ä n n e t e c k n a d av att natriumhyaluronat eller en blandning av natriumhyaluronat och nämnda andra hydrofila polymer i en utspädd alkalisk vattenlösning vid ett pH som inte är lägre än cirka 9, vilken lösning har försatts med en inert, i vatten olöslig substans, underkastas en tvär- bindningsreaktion med divinylsulfon vid cirka 20°C, varvid viktförhållandet mellan natriumhyaluronat och divinylsulfon är från l5:l till 1:5.
11. ll. Metod enligt patentkravet 10, k ä n n e t e c k n a d av att den inerta, i vatten olösliga substansen är ett kol- 460 792 25 väte, en olja eller fett, ett pigment, polyeten eller poly- tetrafluoreten.
12. 12. Metod enligt patentkravet ll, k ä n n e t e c k n a d av att kolvätet är vaselin, oljan eller fettet är bivax, , kokosolja eller lanolin och pigmentet är kaolin, järn(III)- É oxid eller ett olösligt färgämne.
13. 13. Metod enligt patentkravet 10, k ä n n e t e c k n a d av att natrinmhyaluronatet har en molekylvikt av cirka 50'000 till cirka s x 106.
14. l4. Metod enligt patentkravet l0, k ä n n e t e c k n a d av att koncentrationen av natriumhyaluronat eller blandningen av natriumhyaluronat och den andra hydrofila polymeren är l till 8 vikt-% och att den inerta, i vatten olösliga sub- stansen finns närvarande i en mängd av l till 95 vikt-%, räknat på den totala vikten av polymerer plus inert, i vatten olöslig substans.
15. 15. Metod enligt patentkravet 10, k ä n n e t e c k n a d av att denfldessutom innefattar tillsättning av en alkali- metallklorid, -sulfat, -fosfat eller -acetat till reaktions- blandningen i en mängd som är tillräcklig för att en kon- centration av cirka 20 vikt-% skall uppnås i blandningen.
16. 16. Metod för framställning av en tvärbunden gel av hyaluron- syra eller en blandad tvärbunden gel av hyaluronsyra och minst en andra hydrofil polymer med en funktionell grupp, som har förmåga att reagera med divinylsulfon, varvid endera av dessa dessutom inkluderar en substans med låg molekylvikt, som är kovalent bunden vid det makromolekylära nätverket, k ä n n e t e c k n a d av att natriumhyaluronat eller en blandning av natriumhyaluronat och nämnda andra hydrofila polymer i en utspädd alkalisk vattenlösning vid ett pH som inte är lägre än cirka 9, vilken lösning har försatts med Å en substans med låg molekylvikt och med en funktionell grupp med aktiva väteatomer, som är reaktiv i tornållande till divinylsnlfon, underkastas en tvarbindningsreaktion med divinylsulfon vid cirka 20°C, varvid viktförhållandet mellan natriumhyaluronat och divinylsulfon är från l5:l till l:5,
17. l7. Metod enligt patentkravet lö, k ä n n e t e c k n a d av att substansen med låg molekylvikt är ett läkemedel.
18. 18. Metod enligt patentkravet 16, k ä n n e t e c k n a d av att substansen med låg molekylvikt är en karminsyra.
19. 19. Metod enligt patentkravet 16, k ä n n e t e c k n a d av att natriumhyaluronatet har en molekylvikt av cirka 50 000 till cirka s x 106. '
20. 20. Metod enligt patentkravet 16, k ä n n e t e c k n a d av att koncentrationen av natriumhyaluronat eller blandningen av natriumhyaluronat och den andra hydrofila polymeren är 1 till 8 vikt-% och att suistansen med låg molekylvikt finns närvarande i en mängd av l till 95 vikt~%, räknat på den totala vikten av polymerer plus inert, i vatten olöslig substans. W
21. 21. Metod enligt patentkravet 16, k ä n n e t etc k n a d av att den innefattar tillsättning av en alkalimetallklorid, -sulfat, -fosfat eller -acetat till reaktionsblandningen i en mängd som är tillräcklig för att en koncentration av cirka 20 vikt~% skall uppnås i blandningen. ' N
22. 22. Tvärbunden gel av hyaluronsyra, framställd enligt metoden enligt patentkravet l.
23. 23. Blandad tvärbunden gel av hyaluronsyra och minst en annan hydrofil polymer med en funktionell grupp, som har förmåga att reagera med divinylsulfon, framställd enligt metoden enligt patentkravet 5, k ä n n e t e c k n a d av att den kombinerade koncentrationen av natriumhyaluronat och den ® 460 792 ' 27 andra hydrofila polymeren är l till 8 vikt-% och att natrium- hyaluronatet utgör från 5 till 95 % av den totala vikten.
24. 24. Gel enligt patentkravet 23, k ä n n e t e c k n a d av att den andra hydrofila polymeren är en naturlig eller syntetisk polysackarid, vald ur den grupp som består av hydroxietylcellulosa, karboximetylcellulosa, xantangummi, kondroitinsulfat och heparin, ett protein valt ur den grupp som består av kollagen, elastin, albumin, ett globulin, à keratinsulfat, en sulfaterad aminoglukosaminoglykan och en syntetisk vattenlöslig polymer.
25. 25. Tvärbunden gel av hyaluronsyra eller en blandad tvärbun- den gel av hyaluronsyra och minst en annan hydrofil polymer med en funktionell grupp, som har förmåga att reagera med divinylsulfon, och vilken dessutom innefattar en inert, i vatten olöslig'substans, framställd enligt metoden enligt patentkravet lO, k ä n n e t e c k n a d av att koncent- rationen av natriumhyaluronat eller blandningen av natrium- hyaluronat och den andra hydrofila polymeren är l till 8 vikt-% och att den inerta, i vatten olösliga substansen finns närvarande i en mängd av 1 till 95 vikt-%, räknat på den totala vikten av polymerer plus inert, i vatten olöslig substans. I
26. 26. Gel enligt patentkravet 25, k ä n n e t e c k n a d av att den inerta, i vatten olösliga substansen är ett kol- väte, en olja eller ett fett, ett pigment, polyeten eller polytetrafluoreten.
27. 27. Gel enligt patentkravet 26, k ä n n e t e c k n a d av att kolvätet är vaselin, oljan eller fettet är bivax, kokosolja eller lanolin och pigmentet ärßkaolin, järn(III)- oxid eller ett olösligt färgämne.
28. 28. Tvärbunden gel av hyaluronsyra eller en blandad tvär- bunden gel av hyaluronsyra och minst en annan hydrofil 460 792 ~ 28 polymer med en funktionell grupp, som har förmåga att reagera med divinylsulfon, och vilken dessutom innefattar en substans med låg molekylvikt, som är kovalent bunden vid det makro- molekylåra nätverket, framställd enligt patentkravet 16; k ä n n e t e c k n a d av att koncentrationen av natrium- hyaluronat eller blandningen av natriumhyaluronat och den andra hydrofila polymeren är l till 8 vikt-% och att substan- sen med låg molekylvikt finns närvarande i en mängd av l till 95 vikt-%, räknat på polymerens totala vikt. n
29. 29. Gel enligt patentkravet 28, k ä n n e t e c k n-a d av att substansen med låg molekylvikt är ett läkemedel.
30. 30. Gel enligt patentkrav-t 28, k ä n n e t e c k n a d av att substansen med låg molekylvikt är karminsyra. i 4 l . lmyll 4 ñ_ ä, I wñ*