CN104530460A - 糖基化高分子材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
糖基化高分子材料及其制备方法,所述制备方法是以二乙烯基砜为偶联剂化学连接高分子材料和糖的方法,所述的高分子材料含羟基。本发明的方法采用天然糖(包括单糖和寡糖)作为糖基化底物,不需要先行对糖分子进行化学修饰,可操作性强、重现性高、适用性广;该方法所涉及的反应均在水溶液中进行,条件温和,环境友好;所制备的糖基化高分子膜在蛋白质水平和细胞水平均具有良好的糖生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种高分子材料化学糖基化的方法及应用,尤其涉及一种基于天然糖对高分子膜化学糖基化的方法及其应用。
技术背景
高分子的糖基化赋予了高分子材料糖的生物活性,被用以模仿和探索糖参与的细胞黏附、生长和分化以及病毒的传播和阻断等诸多生物学过程。近年来,糖基化高分子材料已被广泛应用于细胞培养、生物芯片、药物输送、免疫应答和抗垢材料等生物医药领域。其中化学合成的糖基化高分子材料由于其化学结构明确、糖基化程度和机械性能可控,已逐步取代天然培养基质成为新兴的细胞培养基质。糖基化高分子材料业成为了优化培养条件和认识细胞/材料作用机理的重要工具和手段。
材料的糖基化可以归纳为本体糖基化和表面糖基化两类方法。本体糖基化是由含有糖基侧链的单体聚合合成或者在高分子本体材料上引入糖基。由此制备的糖基化材料的糖基含量相对高,但是该类方法合成、纯化步骤繁琐,不适于非化学专业实验室的操作。表面糖基化是通过对材料表面枝解或吸附修饰引入糖基,合成、纯化步骤相对较少,适于更大范围的应用。
近年来,糖基化高分子材料的应用促进了表面糖基化方法的发展。然而,现有方法通常需要先行对糖分子进行化学修饰。例如,专利CN 200610053524使用一类乙酰基保护的糖分子(例如甘露糖五乙酸酯、半乳糖五乙酸酯、乳糖八乙酸酯等)对羟基化聚丙烯亲和膜进行化学糖基化的方法。该方法需要先行制备羟基化聚丙烯亲和膜和乙酰基保护的糖,两者反应之后再进行化学去保护。专利CN 200810059174使用一类叠氮基修饰的糖分子(例如2-叠氮乙基-β-甘露糖、1-叠氮-α-甘露糖、1-叠氮乳糖等)对炔基修饰的丙烯腈纳米纤维进行化学糖基化的方法。该方法需要先行制备含有羧基的丙烯腈高分子纳米材料和叠氮基修饰的糖,通过偶联反应在羧基上引入炔基后利用“点击化学”与含叠氮基的糖分子反应。迄今为止,尚缺乏一种直接使用天然糖对高分子膜进行化学糖基化的方法。
本发明提供的基于天然糖对高分子膜化学糖基化的方法,采用天然糖(包括单糖和寡糖)作为糖基化底物,不需要先行对糖分子进行化学修饰,可操作性强、重现性高、适用性广。而且,该方法涉及的反应均在水溶液中进行,条件温和,环境友好;所制备的糖基化高分子膜在蛋白质水平和细胞水平均具有良好的糖生物活性。
发明内容
本发明以二乙烯基砜为偶联剂,通过将高分子膜在二乙烯基砜溶液中浸泡对高分子膜进行活化,从而在高分子膜中引入乙烯基砜基团。引入的乙烯基砜基团在温和条件下可以与天然糖反应,从而实现高分子膜化学糖基化。
在此基础上,本发明的目标之一,在于提供一种糖基化高分子材料的制备方法,是以二乙烯基砜为偶联剂化学连接高分子材料和糖的方法,所述的高分子材料含羟基。
另一方面,提供上述方法所制备的糖基化高分子材料也是本发明的目的之一。
上述本发明的该方法可以采用天然糖为糖基化底物,不需要先行对糖分子进行化学修饰,可操作性强、重现性高、适用性广;该方法所涉及的反应均在水溶液中进行,条件温和,环境友好;所制备的糖基化高分子膜在蛋白质水平和细胞水平均具有良好的糖生物活性。
附图说明
本发明附图7幅,其中:
图1是甘露糖糖基化pHEMA膜结构示意图。
图2是pHEMA膜,DVS活化pHEMA膜和甘露糖糖基化pHEMA膜全反射红外表征图。
图3是乳糖糖基化pHEMA膜结构示意图。
图4是pHEMA膜,DVS活化pHEMA膜和乳糖糖基化pHEMA膜全反射红外表征图谱。
图5是Con A-HRP和PNA-HRP蛋白在pHEMA膜,甘露糖糖基化pHEMA膜和乳糖糖基化pHEMA膜表面的吸附情况。
图6是巨噬细胞在pHEMA膜、DVS活化pHEMA膜和甘露糖糖基化pHEMA膜上的黏附和材料毒性情况。
图7是乳糖糖基化pHEMA膜上单位数量HepG2细胞每两天白蛋白相对分泌量。
具体实施方式
本发明提供一种糖基化高分子材料及其制备方法。所述的糖基化高分子材料的制备方法,是以二乙烯基砜为偶联剂化学连接高分子材料和糖的方法,其中,高分子材料含羟基。
具体实施方式中,所述的高分子材料选自聚乙烯醇(PVA)、聚丙三醇(PG)、聚甲基丙烯酸‐2‐羟乙酯(pHEMA)、聚甲基丙烯酸‐2‐羟丙酯、壳聚糖、环糊精、淀粉和海藻酸。优选聚乙烯醇(PVA)、聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯(pHEMA)和聚甲基丙烯酸-2-羟丙酯。最优选聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯(pHEMA)。
具体实施方式中,所述的糖选自单糖或寡糖。其中对单糖和寡糖应按照本领域的一般定义来理解。所述的糖优选甘露糖、半乳糖、葡萄糖、核糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、海藻糖和支链淀粉。尤其优选甘露糖、半乳糖和乳糖。
具体实施方式中,所述的高分子材料是高分子块体材料、高分子溶液材料或高分子膜。尤其优选高分子膜。所述高分子膜可通过涂覆法制备,涂覆法具体包括如下步骤:
a.将高分子材料溶于有机溶剂制备高分子溶液;
所述有机溶剂选自低沸点极性溶剂;举例但不限于乙醇、甲醇、丙酮或其混合溶剂;
所述高分子溶液浓度0.01~0.1g/ml,优选0.01~0.05g/ml;
b.将步骤a所制备的高分子溶液涂覆于载体表面,挥发溶剂,制得高分子膜;
所述载优选疏水性衬底或经疏水性修饰的载体,举例但不限于酶标板,细胞板,硅片,玻璃片等。
更为具体的实施方式中,本发明所述的糖基化高分子材料及其制备方法包括如下步骤:
(1)高分子材料与二乙烯基砜接触,0~40℃活化1~10小时;
其中,优选将高分子材料浸入0.1~2mol/L的二乙烯基砜溶液中进行活化,更优选二乙烯基砜溶液浓度为0.5~1mol/L;再者,所述的二乙烯基砜溶液优选以丙酮体积含量为0%~20%的丙酮-水体系为溶剂,尤其优选5%~20%的丙酮-水混合物。此外,所述的二乙烯基砜溶液优选pH≥11,更优选pH 11~12;活化反应温度优选20~30℃;活化反应时间优选2~4小时。
(2)步骤(1)所得活化高分子材料与糖接触,0~40℃反应2~20小时。
其中,优选将活化高分子材料浸入浓度为0.05~0.25g/ml的糖-水溶液进行反应。其中所述的糖-水溶液浓度优选0.1~0.2g/ml。进一步优选,所述的糖-水溶液pH≥9.5,优选pH 10~11。此外,所述的反应温度优选20~30℃;反应时间优选8~12小时。
进一步具体的实施方式中,上述本发明的糖基化高分子材料及其制备方法包括如下步骤:
(1)将高分子材料浸入浓度为0.5~1.5mol/L、pH 11~12的二乙烯基砜溶液中,于20~30℃活化2~4小时后用去离子水冲洗;所述二乙烯基砜溶液的溶剂为丙酮体积含量5%~20%的丙酮-水混合物;
(2)步骤(1)所得活化高分子材料浸入浓度为0.1~0.2g/ml、pH 10~11的糖-水溶液中,于20~30℃反应8~12小时后用去离子水冲洗,室温晾干。
以下具体实施例为对本发明内容的进一步说明,不应当理解为对本发明的任意形式的限定。
实施例1.甘露糖糖基化聚2-甲基丙烯酸羟乙酯膜(pHEMA膜)的制备
甘露糖糖基化pHEMA膜结构示意如图1所示,制备方法为:
将pHEMA(0.05g,Mw 200,000~300,000)加入到乙醇(1ml)中,37℃混匀制备pHEMA溶液。将pHEMA溶液涂覆在氯丙基三甲氧基硅烷处理的硅片表面上,室温干燥得到pHEMA膜。将二乙烯基砜(DVS),丙酮,碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(0.5M,pH=11)按体积比1:1:8混合均匀制备DVS溶液。将pHEMA膜浸泡在DVS溶液中室温活化2小时后取出,用去离子水冲洗3次。将DVS活化的pHEMA膜浸泡在甘露糖溶液(0.2g/ml,pH=10)中,室温反应12小时后取出,用去离子水冲洗3次,室温干燥即制得甘露糖糖基化pHEMA膜。各步骤处理后得到的pHEMA膜均采用全反射红外进行表征,如图2所示,特征峰归属见表1。由图可知,经过DVS活化之后,pHEMA膜红外图谱在3050cm-1处出现了乙烯基碳碳双键的C-H伸缩振动峰,并且在1380cm-1附近出现了砜基的S=O伸缩振动峰,表明经过DVS活化,pHEMA膜中成功引入了乙烯基砜基团。经过甘露糖糖基化之后,pHEMA膜红外图谱在3050cm-1处的碳碳双键的C-H伸缩振动峰消失,在890cm-1和840cm-1附近出现分别代表β构型糖苷键和α构型糖苷键C-H弯曲振动峰,表明经过糖基化反应,pHEMA膜中成功引入了糖分子。在870cm-1和807cm-1附近出现较弱的吸收峰,为甘露糖的特征吸收峰,表明pHEMA膜中引入的糖分子为甘露糖。
表1.pHEMA膜、DVS活化pHEMA膜和甘露糖糖基化pHEMA膜全反射红外特征峰
编号 | 波数(cm-1) | 特征峰归属 |
1 | 3350 | pHEMA O-H伸缩振动峰 |
2 | 3050 | 碳碳双键C-H伸缩振动峰 |
3 | 1650 | pHEMA C=O伸缩振动峰 |
4 | 1380 | 乙烯砜基S=O伸缩振动峰 |
5 | 890 | β构型糖苷键C-H弯曲振动峰 |
6 | 840 | α构型糖苷键C-H弯曲振动峰 |
实施例2.以乳糖为例,基于寡糖对聚2-甲基丙烯酸羟乙酯(pHEMA)膜糖基化
乳糖糖基化pHEMA膜结构示意如图3所示,通过如下方法制备:
将pHEMA(0.05g,Mw 200,000~300,000)加入到乙醇(1ml)中,37℃混匀制备pHEMA溶液。将pHEMA溶液涂覆在氯丙基三甲氧基硅烷处理的硅片表面上,室温干燥制备pHEMA膜。将二乙烯基砜(DVS),丙酮,碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液(0.5M,pH=11)按体积比1:1:8混合均匀制备DVS溶液。将pHEMA膜浸泡在DVS溶液中室温活化2小时后取出,用去离子水冲洗3次。将DVS活化pHEMA膜浸泡在乳糖溶液(0.1g/ml,pH=10)中室温反应12小时后取出,用去离子水冲洗3次,室温干燥即制得乳糖糖基化pHEMA膜。各步骤处理后得到的pHEMA膜均采用全反射红外进行表征,如图4所示,特征峰归属见表2。由图可知,经过DVS活化之后,pHEMA膜红外图谱在3050cm-1处出现了乙烯基碳碳双键的C-H伸缩振动峰,并且在1380cm-1附近出现了砜基的S=O伸缩振动峰,表明经过DVS活化,pHEMA膜中成功引入了乙烯基砜基团。经过乳糖糖基化之后,pHEMA膜红外图谱在3050cm-1处的碳碳双键的C-H伸缩振动峰消失,在890cm-1和840cm-1附近分别出现代表β构型糖苷键和α构型糖苷键C-H弯曲振动峰,表明经过糖基化反应,pHEMA膜中成功引入了乳糖分子。
表2.pHEMA膜、DVS活化pHEMA膜和乳糖糖基化pHEMA膜全反射红外特征峰
编号 | 波数(cm-1) | 特征峰归属 |
1 | 3350 | pHEMA O-H伸缩振动峰 |
2 | 3050 | 碳碳双键C-H伸缩振动峰 |
3 | 1650 | pHEMA C=O伸缩振动峰 |
4 | 1380 | 乙烯砜基S=O伸缩振动峰 |
5 | 890 | β构型糖苷键C-H弯曲振动峰 |
6 | 840 | α构型糖苷键C-H弯曲振动峰 |
实施例3.甘露糖和乳糖糖基化pHEMA膜的蛋白质水平生物活性
将pHEMA(0.2g,Mw 200,000~300,000)加入到乙醇(4ml)中,37℃混匀得到pHEMA溶液。在96孔酶标板中每孔滴加40μL pHEMA溶液,室温干燥得到pHEMA涂覆的96孔酶标板。按实施例1和实施例2所述步骤对pHEMA膜进行甘露糖糖基化和乳糖糖基化。糖基化完成后加入100μL巯基-聚乙二醇溶液(1mmol/L,pH=7.5)室温反应30分钟封闭残留的乙烯基砜基团。分别在含pHEMA膜和两种糖基化高分子膜的孔板内加入100μL植物血凝素蛋白-辣根过氧化物酶偶联物。实验采用的两种血凝素蛋白是伴刀豆球蛋白(Concanavalin,Con A)和花生凝集素(Peanut agglutinin,PNA),分别能够特异性识别甘露糖基团和乳糖基团。加入植物血凝素蛋白-辣根过氧化物酶偶联物的孔板37℃孵育2小时,吸出蛋白溶液并用缓冲液冲洗3次。采用Pierece公司QuantaBluTM Flurogenic PeroxidaseSubstrate试剂盒测定孔板上蛋白吸附情况。测定方法如下:在酶标板每孔加入100μL辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)荧光发色底物,37℃孵育10分钟后加入100μL终止液。用酶标仪在激发波长230nm,发射波长450nm条件下测定各孔的荧光强度。荧光强度越高,表明孔板上吸附的蛋白越多。每个实验重复3-5次,结果如图5所示。由图可知,pHEMA膜对两种蛋白的吸附量都较低,表明pHEMA膜是一种抗蛋白吸附膜。在甘露糖糖基化的pHEMA膜表面Con A-HRP蛋白吸附量明显高于PNA-HRP蛋白吸附量,而在乳糖糖基化的pHEMA膜表面的PNA-HRP蛋白吸附量明显高于Con A-HRP蛋白吸附量。该结果表明由实施例1和实施例2制备的甘露糖和乳糖糖基化pHEMA膜具备特异性识别和吸附相应的植物血凝素蛋白,而且非特异性蛋白吸附量小。以上实验说明经过本方法制备的糖基化高分子膜在蛋白水平具有糖生物活性。
实施例4.甘露糖糖基化pHEMA膜的细胞黏附和材料毒性实验
将pHEMA(0.2g,Mw 200,000~300,000)加入到乙醇(4ml)中,37℃混匀得到pHEMA溶液。在96孔细胞板中每孔滴加40μL pHEMA溶液,室温干燥得到pHEMA聚合物涂覆的96孔细胞板。按实施例1条件对pHEMA膜进行甘露糖修饰。糖基化完成后加入100μL巯基-聚乙二醇溶液(1mmol/L,pH=7.5)室温反应30分钟封闭残留的乙烯基砜基团。分别在含pHEMA膜,DVS活化pHEMA膜和甘露糖糖基化pHEMA膜的孔板内以每孔20,000细胞的密度接种巨噬细胞(raw264.7,细胞膜具有甘露糖受体,对甘露糖基团有特异性识别)。接种细胞的孔板在37℃,5%CO2条件下无血清培养4小时,去除培养液并用缓冲液冲洗3次。使用Thermo Fisher公司PierceTM Hoechst 33342 Fluorescent Stain和LifeTechonologies公司Viability/Cytotoxity Kit(Invitrogen L3224,含Calcein AM和EthD-1)对孔板中细胞染色,其中,Hoechst 33342针对细胞核,呈蓝色荧光;CalceinAM针对活细胞,呈绿色荧光;EthD-1针对死细胞,呈红色荧光。具体步骤如下:向孔板内加入100μL Hoechst 33342(1μg/ml)和Invitrogen L3224(2μmol/L)混合液,37℃孵育20分钟后弃去染色液并用缓冲液冲洗3次。使用倒置荧光显微镜分别在461nm,515nm和590nm波长下观测,结果如图6所示。由图可知,细胞在pHEMA膜上几乎没有黏附(图6a-c),表明pHEMA材料具备抗细胞黏附特性。细胞在DVS活化pHEMA膜上虽然有大量黏附(图6d),然而存在大量死亡细胞(图6f),表明细胞可以在DVS活化pHEMA膜上黏附,但该种材料细胞毒性较高,能够在短期内杀死细胞,不适于细胞体外培养。细胞在甘露糖糖基化pHEMA膜上有大量黏附(图6g),并且活细胞数目(图6h)明显高于死细胞数目(图6i),表明甘露糖糖基化pHEMA膜可以用于巨噬细胞的初期黏附,并且该种材料细胞毒性低,短期内不会造成细胞死亡。综上,该实验结果证明甘露糖糖基化高分子膜能够引起细胞的特异性粘附,并且具有细胞毒性低的特点。因此,本方法制备的甘露糖糖基化高分子膜在细胞水平具有糖生物活性。
实施例5.乳糖糖基化pHEMA膜的细胞生理活性实验
白蛋白是由肝脏细胞合成并分泌的一类蛋白质,白蛋白分泌量也成为评价肝细胞生理活性的一项重要指标。在本实施例中,我们在乳糖糖基化pHEMA膜上接种了HepG2肝癌细胞并测定了一段时间内单位细胞数量的人源白蛋白分泌量,用以评价乳糖糖基化pHEMA膜上细胞的生理活性。具体实验步骤如下:
将pHEMA(0.2g,Mw 200,000~300,000)加入到乙醇(4ml)中,37℃混匀得到pHEMA溶液。在96孔细胞板中每孔滴加40μL pHEMA溶液,室温干燥得到pHEMA聚合物涂覆的96孔细胞板。按实施例2条件对pHEMA膜进行乳糖糖基化。糖基化完成后加入100μL巯基-聚乙二醇溶液(1mmol/L,pH=7.5)室温反应30分钟封闭残留的乙烯基砜基团。分别在未处理孔板和含乳糖糖基化pHEMA膜的孔板中以每孔10,000细胞的密度接种HepG2人类肝癌细胞(细胞膜具有去唾液酸糖蛋白受体,对乳糖基团有特异性识别)。接种细胞的孔板使用含有10%血清的1640培养基在37℃,5%CO2条件下培养15天。每隔两天测定孔板内细胞数量和白蛋白分泌量,测定之后弃去培养基,并加入200μl新鲜培养基继续培养。
测定孔板内细胞数量的方法如下:使用东仁化学Cell Counting Kit-8(CCK-8)测定孔板内细胞数量。将CCK-8染色液和培养基以体积比1:9配置混合溶液,弃去待测孔中培养基并用缓冲液清洗2次。在待测孔中加入100μl混合溶液,37℃孵育2小时后用酶标仪于450nm处测定该孔的吸光度。吸光度越高,表明孔板中活细胞数量越多。
测定孔板内细胞白蛋白分泌量的方法如下:使用abcam公司Albumin Human ELISA Kit检测孔板内肝癌细胞分泌的人源白蛋白含量。取50μl培养基加入待测孔,室温孵育2小时后弃去培养基并用PBS缓冲液冲洗3次。向待测孔中加入50μl生物素化白蛋白抗体溶液,室温孵育30分钟后弃去上清液并用PBS缓冲液冲洗3次。向待测孔中加入50μl链霉亲和素-过氧化物酶偶联物(Streptavidin-Peroxidase,链霉亲和素能特异性识别和结合生物素),室温孵育30分钟后弃去上清液并用缓冲液冲洗3次。向待测孔中加入100μl发光底物,室温孵育20分钟后加入100μl终止液。使用酶标仪于490nm处测定该孔的吸光度。吸光度越高,表明孔板中HepG2细胞分泌的人源白蛋白越多。
为消除细胞增殖对实验结果的影响,细胞白蛋白分泌量测定实验测得的吸光度被除以细胞数量测定实验测得的吸光度,得到单位吸光度对应细胞数量(单位数量)的白蛋白相对分泌量。图7给出培养第1、3、7、11和15天单位数量细胞的白蛋白相对分泌量。由图可知,使用乳糖糖基化pHEMA膜培养的HepG2细胞能够分泌白蛋白,而且单位数量细胞的白蛋白相对分泌量有先增大后逐步进入平台区的趋势。该实验结果表明,乳糖糖基化pHEMA膜不仅能黏附HepG2肝癌细胞,而且黏附的细胞有良好的生理活性,能正常分泌蛋白质。因此,本方法制备的乳糖糖基化高分子膜在细胞水平具有糖生物活性。
Claims (10)
1.糖基化高分子材料的制备方法,其特征在于是以二乙烯基砜为偶联剂化学连接高分子材料和糖的方法,所述的高分子材料含羟基。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的高分子材料选自聚乙烯醇、聚丙三醇、聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯、聚甲基丙烯酸-2-羟丙酯、壳聚糖、环糊精、淀粉和海藻酸。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的高分子材料选自聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯和聚甲基丙烯酸-2-羟丙酯。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的糖选自单糖或寡糖。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的糖选自甘露糖、半乳糖、葡萄糖、核糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、海藻糖和支链淀粉。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)高分子材料与二乙烯基砜接触,0~40℃活化1~10小时;
(2)步骤(1)所得活化高分子材料与糖接触,0~40℃反应2~20小时。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中高分子材料浸入0.1~2mol/L的二乙烯基砜溶液中进行活化。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的步骤(2)中,活化高分子材料浸入浓度为0.05~0.25g/ml的糖-水溶液进行反应。
9.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将高分子材料浸入浓度为0.5~1.5mol/L、pH 11~12的二乙烯基砜溶液中,于20~30℃活化2~4小时后用去离子水冲洗;所述二乙烯基砜溶液的溶剂为丙酮体积含量5%~20%的丙酮-水混合物;
(2)步骤(1)所得活化高分子材料浸入浓度为0.1~0.2g/ml、pH 10~11的糖-水溶液中,于20~30℃反应8~12小时后用去离子水冲洗,室温晾干。
10.权利要求1~9中任一权利要求的方法所制备的糖基化高分子材料。
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FANG CHENG等: "A Versatile Method for Functionalizing Surfaces with Bioactive Glycans", 《BIOCONJUGATE CHEM》 * |
TOMOMITSU HATAKEYAMA等: "An Assay for Lectin Activity Using Microtiter Plate with Chemically Immobilized Carbohydrates", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 * |
王汉奇等: ""乙烯基砜表面化学反应动力学研究"", 《中国化学会第29届学术年会》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN108503565A (zh) * | 2018-04-04 | 2018-09-07 | 大连理工大学 | 一种新型生物芯片基片,其制备方法及应用 |
WO2019192058A1 (zh) * | 2018-04-04 | 2019-10-10 | 大连理工大学 | 一种新型生物芯片基片,其制备方法及应用 |
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |